KR101720961B1 - 다능성 세포의 분화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람 배아 줄기 세포(hESC) 또는 유도된 다능성 세포(iPSC)와 같은 다능성 세포의 시험관내 유지, 증식, 배양 및/또는 상기 세포의 조혈 전구 세포 또는 내피 세포로의 분화를 위한 방법을 제공한다. 상기 다능성 세포는 한정된 조건하에서 유지되고 분화될 수 있다. 따라서, 다능성 세포의 조혈 전구 세포 또는 내피 세포로의 분화를 위한 특정 양태에서 마우스 공급 세포 또는 혈청의 사용이 요구되지 않는다. 수득한 조혈 전구 세포는 다양한 골수 또는 림프 계통으로 추가로 분화될 수 있다.

Description

다능성 세포의 분화{Differentiation of pluripotent cells}
본원은 2009년 2월 27일자로 출원된 미국 출원 제61/156,304호에 대한 우선권을 주장하고 이의 내용은 포기 없이 전문이 참조로서 본원에 분명히 인용된다.
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 의약 분야에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 배아 줄기 세포로부터 조혈 선조 세포를 제조하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
조혈 줄기 세포 및 선조 세포의 상당한 의학적 잠재력 때문에 다능성 줄기 세포로부터 조혈 선조 세포의 분화 방법을 개선시키기 위한 많은 연구가 수행되어 왔다. 사람 성인에서, 주로 골수에 존재하는 소수의 조혈 줄기 세포는 활발하게 분열하는 조혈 (CD34+) 선조 세포의 이종성 집단을 생성하고 상기 선조 세포는 혈액계의 모든 세포로 분화한다. 그러나, 상기 CD34+ 마커는 다른 세포 유형, 특히, 내피 세포(혈관) 또한 CD34를 발현하기 때문에 조혈 세포에 대한 부정확한 정의이다. 다른 마커, 예를 들어, CD43 마커를 또한 사용하여 조혈 선조 세포의 확인을 도와줄 수 있다(예를 들어, Kadaja-Saarepuu et al., 2007; Vodyanik et al., 2006). 성인 사람에서, 조혈 선조세포는 증식하고 분화하여 매일 수천억개의 성숙한 혈액 세포를 생성시킨다. 조혈 선조 세포는 또한 척수에 존재한다. 시험관내에서, 사람 배아 줄기 세포는 배양에서 무한 증식할 수 있고 따라서 적어도 원칙적으로, 결함 또는 결손된 사람 조직을 대체하기 위해 세포 및 조직을 공급할 수 있다.
마우스 섬유아세포와 같은 공급 세포주와 사람 다능성 세포 (pluripotent cell)의 배양은 이전에 공동 배양 동안에 종 상호간의 노출과 연관된 예상치 않은 형질전환의 위험성을 제공한다. 사람 다능성 줄기 세포 배양의 목적 중 하나는 궁극적으로 사람 신체로 이식될 수 있는 조직을 생성시키는 것이기 때문에, 줄기 세포가 또 다른 종의 세포에 노출되지 않거나 또 다른 종의 세포를 배양하기 위해 사용된 배지에 노출되지 않는 것이 매우 바람직할 수 있다. 따라서, 어떠한 공동 배양 단계도 없이 사람 다능성 줄기 세포의 조혈계로의 분화를 허용하는 배양 조건을 한정하여 사람 다능성 줄기 세포로부터 사람 조혈 선조 세포의 생성을 위한 기술을 계속적으로 개발하는 것이 매우 중요하다.
분화 배지 중에 혈청의 사용이 특정 결점 및 제한을 부여할 수 있다. 문헌[참조: Chadwick et al. (2003)]에 나타낸 바와 같이 혈청은 상이한 배치에 걸친 혈청의 조성에 대해(예를 들어, 성장 인자 등의 존재 및/또는 농도의 변화에 대해) 불확실성을 제공하는 동물 생성물이다. 이들 불확실성은 또한 실험에 걸쳐 생성된 조혈 세포 비율의 변화 가능성을 증가시킬 수 있다. 추가로, 혈청의 사용은 임상적 개발, 추가로 복잡한 상업화 공정 동안에 상당한 조절 문제점을 제공할 수 있다.
현재, 세포를 또 다른 동물 종 기원의 물질에 노출시키는 것 없이 다능성 줄기 세포를 조혈 선조 세포로 분화시키는 방법의 필요성이 명백히 존재한다. 다능성 세포의 유지 및 분화와 연관된 복잡성으로 인해 현재 얼마나 다양한 다능성 세포가 다양한 한정 배지 (defined medium) 중에 방치된 후 마우스 공급 세포 상에서의 방치와 비교하여 성장 인자에 대한 후속적 노출에 반응할 수 있는지는 명백하지 않다. 명백하게, 다능성 세포를 조혈 전구 세포로 분화시키는 방법을 개선할 필요가 있다.
본원에서 한정된 조건하에 조혈 전구 세포 또는 내피 세포로 증식되고/되거나 유지되는 다능성 세포의 시험관내 분화 방법이 제공된다. 이들 방법으로 한정된 조건하에 수행될 수 있는 공정을 제공함에 의해 당업계의 한계를 극복한다. 따라서, 이들 방법은 예를 들어, 피검체(예를 들어, 사람 환자)에 투여될 수 있는 조혈 전구 세포(HPC) 또는 추가의 분화된 골수 또는 골수계를 생성시키는데 유리하게 사용될 수 있고 마우스 섬유아세포 및/또는 혈청과 같은 동물 생성물에 노출된 세포의 사용과 연관된 임상적 우려를 감소시킨다.
본 발명의 한 측면은 다능성 세포를 조혈 전구 세포 또는 내피 세포로 분화시키는 방법으로서, (a) 실질적으로 분화되지 않은 다수의 다능성 세포를, 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 제1 한정 배지에서 배양하거나 유지시키는 단계, (b) BMP4, VEGF, IL-3, Flt3 리간드 및 GMCSF가 본질적으로 없는 제2 한정 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계, (c) 다수의 상기 세포의 증식 또는 분화의 촉진에 충분한 양의 BMP4 및 VEGF를 포함하는 제3 한정 배지에서 상기 세포를 배양하는 단계, 및 (d) 다수의 상기 세포의 증식 또는 분화의 촉진에 충분한 양의 (1) IL-3 및 Flt3 리간드, 또는 (2) VEGF, FGF-2 또는 FGF-2 모사체, 및 IGF를 포함하는 제4 한정 배지에서 세포를 배양시키는 단계의 연속 단계를 포함하여, 다수의 상기 다능성 세포가 조혈 전구 세포 또는 내피 세포로 분화되는 방법에 관한 것이다. 특정 양태에서, 상기 조합 (1)을 사용하여 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 상기 조합 (2)를 사용하여 내피 세포 또는 내피 선조 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 제2 한정 배지는 FGF-2, IL6, SCF 및/또는 TPO가 부재이거나 실질적으로 부재일 수 있다. 제3 한정 배지는 또한 FGF-2(예를 들어, 약 5 내지 50 ng/ml 또는 약 10 내지 25 ng/ml) 또는 FGF-2 모사체를 포함할 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 제3 배지에 FGF-2의 함유는 다능성 세포의 조혈 전구 세포로의 분화 효율을 증가시킬 수 있다. 특정 양태에서, 제4 한정 배지는 GMCSF, 또는 IL-6, SCF 또는 TPO 중 하나 이상을 추가로 포함한다. 특정 양태에서, 제4 한정 배지는 세포의 분화를 촉진시키기에 충분한 양의 (1) IL-3, Flt3 리간드 및 GMCSF, 또는 (2) IL-3, Flt3 리간드, SCF, IL-6 및 TPO를 포함한다. 제3 한정 배지 및/또는 제4 한정 배지는 추가로 BIT9500 또는 혈청 대체물 3 (Serum Replacement 3)을 포함할 수 있다. 상기 방법은 BIT9500 또는 혈청 대체물 3을 포함하는 한정 배지에서 세포를 배양함을 포함할 수 있다. 세포 중 적어도 일부는 단계 (b) 전에 적어도 부분적으로 분리되거나 실질적으로 개별화될 수 있다. 상기 세포는 트립신과 같은 효소를 사용하여 실질적으로 개별화될 수 있다. 상기 세포는 개별화시킴에 이어서 ROCK 억제제 및 트립신 억제제(예를 들어, 대두 트립신 억제제)와 접촉시킬 수 있다. 상기 ROCK 억제제는 HA-100, H-1152 및 Y-27632로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 다수의 다능성 세포는 배상체(embryoid body)(EB)를 형성할 수 있다. 응집체당 약 200 내지 약 1000개의 세포를 사용하여 상기 EB 중 하나 이상을 생성할 수 있다. 상기 방법은 20% 미만의 산소 대기압 또는 약 5% 미만의 산소 대기압에서 세포를 배양함을 포함할 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 저산소 조건, 예를 들어, 약 5% 대기 O2와 같은 조건하에서 세포 분화는 예를 들어, 조혈 및/또는 내피 전구 세포로의 세포 분화를 증가시킬 수 있다.
특정 양태에서, 상기 세포는 부분적으로 또는 실질적으로 적어도 1회 재응집할 수 있다. 상기 세포는 제3 한정 배지에서 배양 후 및 제4 한정 배지에서 배양 전 또는 배양 동안에 재응집할 수 있다. 상기 재응집은 상기 세포를 트립신 또는 TRYPLE에 노출시킴을 포함할 수 있다. 상기 세포는 재응집에 이어서 ROCK 억제제에 노출될 수 있거나 상기 세포는 재응집에 이어서 ROCK 억제제가 본질적으로 부재인 배지에서 배양할 수 있다. 상기 방법은 추가로 약 20% 미만의 산소 대기압에서 세포를 배양함을 포함할 수 있고, 여기서 응집체당 약 200 내지 약 1000개의 세포를 사용하여 다수의 배상체(EB)를 생성시킨다. 제1 한정 배지는 TeSR, mTeSR 또는 mTeSR1을 포함할 수 있다. 단계 (a)는 매트릭스 피복된 표면 상에서 세포를 배양함을 포함할 수 있다. 상기 매트릭스는 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 폴리라이신, 트롬보스폰딘 또는 Matrigel™을 포함할 수 있다. 제2 한정 배지는 TeSR-GF 또는 X-vivo15 배지를 포함할 수 있다. 제2 한정 배지는 추가로 약 0.1 ng/ml의 TGF-β 및 약 20 ng/ml의 FGF-2를 포함할 수 있다. 단계 (b)는 약 12시간 내지 약 3일 기간 동안 세포를 배양함을 포함할 수 있다. 단계 (c)는 약 4 내지 약 8일 기간 동안 세포를 배양하거나 분화시킴을 포함할 수 있다. 단계 (d)는 약 4일 이상 또는 약 4일 내지 약 8일 기간 동안 세포를 배양함을 포함할 수 있다. 다수의 다능성 세포는 다능 조혈세포 또는 골수 선조 세포로 분화될 수 있다. 특정 양태에서, 골수 선조 세포는 CD31, CD43 및 CD45를 공동 발현한다. 상기 골수 선조 세포는 공통 골수 선조세포일 수 있다. 제3 한정 배지는 약 10-50 ng/ml의 BMP4 및 약 10-50 ng/ml의 VEGF를 포함한다. 특정 양태에서, 제3 한정 배지는 추가로 10-50 ng/ml의 FGF-2를 포함한다. 제3 한정 배지는 약 25 ng/ml의 BMP4 및 약 25 ng/ml의 VEGF를 포함한다. 제4 한정 배지는 약 5-25 ng/ml의 IL-3 및 약 10-50 ng/ml의 Flt3 리간드를 포함할 수 있다. 제4 한정 배지는 추가로 약 5-25 ng/ml의 GMCSF, 또는 약 10-100 ng/ml 또는 약 10-50 ng/ml TPO, 약 10-100 ng/ml의 SCF, 약 5-25 ng/ml의 IL-6 및 약 5-25 ng/ml의 IL-3을 포함할 수 있다. 제4 한정 배지는 약 10 ng/ml의 IL-3, 약 25 ng/ml의 Flt3 리간드, 및 약 10 ng/ml의 GMCSF를 포함할 수 있다. 다수의 조혈 전구 세포는 CD43, CD34, CD31 및 CD45를 포함하는 목록으로부터 선택된 2개 이상의 세포 마커를 발현할 수 있다. 다수의 조혈 전구 세포는 CD34, CD43, CD45 및 CD31을 발현할 수 있다. 특정 양태에서, 조혈 전구 세포는 다능 조혈 전구 세포이고 CD34, CD43, CD45 및 CD31을 공동 발현한다.
조혈 전구 세포 중 하나 이상은 골수 세포 또는 림프 세포로 분화될 수 있다. 골수 세포는 대식세포, 비만 세포, 적혈구, 거핵세포/혈소판, 수지상 세포 또는 다형성 핵 과립구(예를 들어, 호중구, 호염구, 호중구, 단핵구 또는 대식세포)일 수 있다.
특정 양태에서, 제5 한정 배지를 사용하여 특정 세포 유형으로의 세포의 분화를 추가로 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 다양한 배지를 사용하여 예를 들어, 적아세포, NK 세포 또는 T 세포와 같은 보다 분화된 세포 유형으로의 조혈 전구 세포의 분화를 촉진시킬 수 있다. 상기 방법은 적아세포로의 다수 세포의 분화를 촉진시키기에 충분한 양의 IL-3, IL-6, SCF, EPO 및 TPO로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 제5 한정 배지에서 다수의 상기 세포를 배양함을 추가로 포함할 수 있다. 다수의 세포는 NK 세포로의 세포의 분화를 촉진시키기에 충분한 양의 IL-7, SCF 및 IL-2로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 제5 한정 배지에서 배양된다. 상기 방법은 T 세포로의 세포의 분화를 촉진시키기에 충분한 양의 IL-7, SCF 및 IL-2로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 Notch 리간드를 포함하는 제5 한정 배지에서 상기 다수의 세포를 배양함을 추가로 포함할 수 있다. 상기 Notch 리간드는 Notch 리간드를 과발현하는 기질 세포에 의해 생성되는 Fc 키메라 Notch DLL-I 리간드 또는 Notch 리간드일 수 있다. 특정 양태에서, 티모신 알파, 티모페닌 또는 티모신 B4와 같은 흉선 펩타이드를 사용하여 T 세포로의 세포의 분화를 추가로 촉진시킬 수 있다(문헌참조: 예를 들어, Peng et al., 2008). 특정 양태에서, 다수의 상기 세포는 조혈 전구 세포를 포함한다. 제3 한정 배지는 세포의 증식 또는 추가의 분화를 촉진시키기에 충분한 양의 SCF, IL-6, G-CSF, EPO, TPO, FGF2, IL-7, IL-11, IL-9, IL-13, IL-2 또는 M-CSF로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다. 제4 한정 배지는 세포의 증식 또는 추가의 분화를 촉진시키기에 충분한 양의 SCF, IL-6, G-CSF, EPO, TPO, FGF2, BMP4, VEGF, IL-7, IL-11, IL-9, IL-13, IL-2 또는 M-CSF로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 방법은 세포의 증식 또는 추가의 분화를 촉진시키기에 충분한 양의 SCF, IL-6, G-CSF, EPO, TPO, FGF2, IL-7, IL-11, IL-9, IL-13, IL-2 또는 M-CSF로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 제5 한정 배지에서 세포를 배양함을 포함할 수 있다.
상기 다능성 세포는 바람직하게 포유동물 다능성 세포이다. 특정 양태에서, 다능성 세포는 사람 다능성 세포, 예를 들어, 사람 배아 줄기 세포(hESC) 또는 유도된 다능성 세포(iPSC)일 수 있다. 상기 hESC는 H1, H9, hES2, hES3, hES4, hES5, hES6, BG01, BG02, BG03, HSF1, HSF6, H1, H7, H9, H13B 및 H14로 이루어진 목록으로부터 선택될 수 있는 세포를 포함한다. 상기 iPSC는 iPS6.1, iPS 6.6, iPS, iPS 5.6, iPS iPS 5.12, iPS 5.2.15, iPS iPS 5.2.24, iPS 5.2.20, iPS 6.2.1, iPS-Bl-SONL, iPS-Bl-SOCK, iPS-TiPS 1EE, iPS-TiPS IB, iPS-KiPS-5 및 iPS 5/3-4.3으로 이루어진 목록으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 방법에 따라 분화되거나 본원에 기재된 방법에 따라 분화된, 분리된 조혈 전구 세포로부터 유래된 조혈 전구 세포에 관한 것이다. 상기 조혈 전구 세포는 CD34, CD43, CD45 및 CD31 중 2개, 3개 또는 모두를 발현할 수 있다. 그러나, 본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 방법에 따라 분화된 골수 세포, 골수 선조세포 또는 조혈 전구 세포로부터 유래된 공통 골수 선조세포에 관한 것이다. 상기 골수 세포는 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판 및 수지상 세포로부터 이루어진 목록으로부터 선택될 수 있다. 특정 양태에서, 골수 세포는 적혈구이다. 골수 세포, 골수 선조세포 또는 공통 골수 선조세포는 약제학적 제제에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 방법에 따라 분화된 조혈 전구 세포로부터 유래된 림프 세포에 관한 것이다. 상기 림프 세포는 T-세포, B-세포 또는 천연 킬러 세포일 수 있다. 상기 림프 세포는 약제학적 제제에 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기재된 방법에 따라 분화된 내피 세포, 내피 전구 세포 또는 중배엽 세포에 관한 것이다. 다양한 그룹의 내피 세포가 본원에 기재된 방법을 통해 생성될 수 있을 것으로 예상된다. 상기 내피 세포는 림프 또는 혈관(예를 들어, LYVE1 또는 포도플라넘을 발현하는), 혈관 동맥(예를 들어, Notch 1 및 Notch, Jagged 1 및 Jagged 2를 발현하는), 혈관 정맥(예를 들어, EphB4, Lefty 1 및 Lefty 2를 발현하는) 또는 기관-특이적 내피 세포(예를 들어, 내피 세포, 신장 세포, 폐 또는 혈액내 세포 및 혈뇌 장벽 세포)와 같은 특정 내피 세포 유형일 수 있다. 형태학적으로, 상기 내피 세포는 연속성, 천공성 또는 불연속성일 수 있다.
본원에 사용된 "세포를 개별화시키는"은 예를 들어, 기계적 분리 또는 트립신 또는 TrypLETM과 같은 단백질분해 효소의 노출 결과로서 소수 그룹의 세포 또는 개별 세포로의 세포들의 해리 또는 분리를 언급한다. 특정 양태에서, 개별화된 배양물은 여전히 소형 세포 무리, 예를 들어, 약 2 내지 10개의 세포를 포함하는 세포 무리를 포함할 수 있다.
배지는 성장 인자가 배지에 부재이거나 성장 인자가 배지 중에 임의의 실질적인 세포의 증식 및/또는 분화를 촉진시키기에 불충분한 양으로 배지에 존재하거나 검출가능한 한계치 미만의 농도로 존재하는 경우 성장 인자가 "본질적으로 없는" 것으로 언급된다. 그럼에도 불구하고 성장 인자가 본질적으로 없는 배지는 배지에 미량의 성장 인자를 포함하는 것으로 인지된다.
청구항 및/또는 명세서에 사용되는 경우, 용어 "억제하는", "감소시키는" 또는 "예방" 또는 임의의 이들 용어의 변형어는 목적하는 결과를 달성하기 위한 측정가능한 감소 또는 완전한 억제를 포함한다.
명세서 및/또는 청구항에 사용되는 용어 "효과적인"은 목적하거나, 예상되거나 의도된 결과를 달성하기 위해 적절한 것을 의미한다.
청구항 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 연계하여 사용되는 경우, 부정관사 "a" 또는 "an"의 사용은 "하나"를 의미하지만 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 의미와 일맥상통한다.
본 명세서에서 논의된 임의의 양태는 발명의 임의의 방법 또는 조성물 및 이와 반대와 관련하여 수행될 수 있는 것으로 고려된다. 추가로, 본 발명의 조성물을 사용하여 발명의 방법을 달성할 수 있다.
본원 전반에 걸친 용어 "약"은 수치가 장치, 수치를 결정하기 위해 사용되는 방법에 대한 고유 오차 변화값 또는 연구 피검체 중에서 존재하는 변화를 포함함을 나타내기 위해 사용된다.
청구항에서 용어 "또는"의 사용은 명백히 언급되지 않는 경우 단지 대용을 언급하기 위한 "및/또는"을 의미하기 위해 사용되거나 상기 대용은 상호 배타적이지만 본원의 기재 내용은 단지 대용 및 "및/또는"을 언급하는 정의를 지지한다.
본 명세서 및 청구항에 사용된 용어 "포함하는" (및 포함하는(comprise)" 및 "포함하는(comprises)"과 같은 임의의 형태의 포함하는), "갖는" ("갖는(having)" 및 "갖는(has)"과 같은 임의의 형태의 갖는), "포함하는(including)"("포함하는(includes)" 및 "포함하는(include)"과 같은 임의의 형태의 포함하는) 또는 "함유하는"("함유하는(contains)" 및 "함유하는(contain)"과 같은 임의의 형태의 함유하는)은 포괄적이거나 개방형이고 추가의 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 예는 본 발명의 특정 양태를 나타내지만, 본 발명의 취지 및 범위내에서 다양한 변화 및 변형이 상기 상세한 기재로부터 당업자에게 자명할 것이기 때문에, 단지 설명을 목적으로 주어진 것으로 이해되어야만 한다.
하기의 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 상기 발명은 본원에 제공된 특정 양태에 대한 상세한 설명과 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조로 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1: 계대 50(A) 및 40(B)에서 H1 hESC의 조혈 분화(8일, 12일 및 16일의 경우 n=3 실험).
도 2: 한정 예비조건화 배지로의 노출은 조혈 분화를 개선시킨다. 한정된 조건에서 유지되고 mTESR을 사용한 Matrigel 피복된 플레이트 상의 공급 세포 부재 성장에 적응된 hESC 및 iPSC를 사용하였다.
도 3: 배상체(EB) 크기는 CD43 발현과 상관관계가 있다.
도 4: 저산소는 조혈 분화를 촉진한다.
도 5: 다능성 세포의 단일 세포 현탁액으로부터 조혈 전구 세포의 생성 효율.
도 6: 스피너(spinner) 플라스크를 사용한 HPC 및 다양한 계통 특이적 세포 유형의 EB 분화 및 생성에 대한 개요.
도 7: 96웰 포맷에서 hESC의 EB 분화.
도 8: iPSC 유래된 내피 세포의 자기 분류(magnetic sorting) 전 및 후의 대표적인 유동 세포측정 분석.
도 9: EB 분화 배지에서 FGF-2 보충은 hESC(H1) 및 다양한 iPSC 세포주에서 조혈 전구 세포(HPC)의 생성을 증가시켰다.
도 10: 50 ng/ml의 BMP4, 50 ng/ml의 VEGF 및 25 ng/ml의 FGF-2를 함유하는 EB 분화 배지의 존재하에 다양한 iPS 세포주의 분화.
도 11: 성장 인자가 보충된 EB 기본 배지를 사용한, 조혈 전구 세포(HPC)로의 hESC (H1) 및 iPS (SONL) 세포주의 분화를 보여준다. 증가된 분화는 IL-3 및 Flt-3 함유 배지에 SCF, IL-6 및 TPO가 보충되는 경우 관찰되었다.
도 12: HPC로의 다능성 세포의 분화 효율의 증가는 (H1) 및 iPS(SONL) 세포주에서 변형된 EB2 조합(D)과 함께 관찰되었다. 배지에 보충된 성장 인자가 제시되어 있다. Serum Replacer 3 (Sigma-Aldrich)는 분화 과정에서 혈청 대용물로서 BIT-9500(Stem Cell Technology)를 능가하는 것으로 관찰되었다.
도 13: 정상 산소("N") 상태 및 저산소("H") 상태하에 iPS 세포 기원의 HPC의 생성. 미분화된 세포주는 정상 산소 상태 및 저산소 상태하에 유지하고 분화는 정상 산소 상태 또는 저산소 상태하에 수행하였다. 예를 들어, "H-N"은 상기 세포를 저산소 상태하에 유지하고 정상 산소 상태하에 분화시켰음을 나타낸다.
본원은 다능성 세포(예를 들어, 사람 배아 줄기 세포(hESC) 또는 유도된 다능성 세포(iPSC))의 조혈 전구 세포 및/또는 내피 세포로의 시험관내 분화를 위한 방법을 제공한다. 상기 다능성 세포는 한정된 조건하에 유지되고, 증식되고 분화되고 따라서 마우스 공급 세포 또는 혈청의 사용은 다능성 세포의 조혈 전구 세포 및/또는 내피 세포로의 분화를 위해 요구되지 않는다. 상기 수득한 조혈 전구 세포는 추가로 다양한 골수(예를 들어, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호염구, 호산구, 적혈구, 거핵세포/혈소판 또는 수지상 세포) 또는 림프(예를 들어, T-세포, B-세포 또는 천연 킬러 세포) 계통으로 분화될 수 있다. 다능성 세포는 다능성 세포의 분화 전에 한정된 조건하에 실질적으로 미분화된 상태로 증식되고 유지될 수 있다(예를 들어, TeSR 배지를 사용하여).
특히, 본 발명자는 특정 성장 인자가 특히 한정된 조건하에서 유지된 다능성 세포의 분화를 위해 중요함을 발견하였다. 특정 양태에서, 다능성 세포는 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시키기 위해 여러 한정 배지에 연속적으로 노출될 수 있다. 제1 한정 배지(예를 들어, TeSR 배지) 중의 본질적으로 미분화된 상태로의 다능성 세포의 배양 및 유지 후 상기 세포는 BMP4, VEGF, IL-3, Flt3 리간드 또는 GMCSF를 함유하지 않거나 본질적으로 함유하지 않는 제2 한정 배지에 노출될 수 있다. 이어서 상기 세포는 조혈 분화를 촉진시키기 위해 BMP4, VEGF, IL-3, Flt3 리간드 및 GMCSF를 포함하는 제3 한정 배지에 노출될 수 있다. 또는, 상기 세포는 BMP4 및 VEGF, 및 임의로 FGF-2를 포함하는 제3 한정 배지에 노출될 수 있고 이어서 IL-3, Flt3 리간드 및 GMCSF를 포함하는 제4 배지에 노출될 수 있다. 본 발명자는 BMP4 및 VEGF를 포함하는 제3 한정 배지로의 연속적 노출에 이어서 IL-3, Flt3 리간드 및 GMCSF를 포함하는 제4 배지로의 노출이 놀랍게도 조혈 전구 세포의 생성을 상당히 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 제3 한정 배지 중에 FGF-2의 함유는 놀랍게도 다능성 세포의 조혈 전구 세포로의 분화를 증가시켰다. 또한 저산소 상태(예를 들어, 5% O2 대기압에의 노출), 세포의 적어도 부분적인 재응집(예를 들어, 트립신 또는 TrypLE™를 사용한) 및/또는 배상체의 형성에서 한정된 범위의 세포를 사용한 응집체의 형성(예를 들어, 응집체당 약 200 내지 1000개 세포)을 또한 사용하여 조혈 전구 세포로의 분화를 추가로 촉진시킬 수 있다.
I. 배아 줄기 세포의 제조 및 유지
다능성 세포는 조혈 분화 전에 다양한 방법을 사용하여 미분화된 상태로 배양되고 유지될 수 있다. 특정 양태에서, 다능성 세포는 TeSR 배지와 같은 한정, 공급-독립적 배양 시스템을 사용하여 본질적으로 미분화된 상태로 배양되고 유지될 수 있다. 또는 한정된 조건을 사용할 수 있고, 예를 들어, 다능성 세포는 섬유아세포 공급 세포 또는 섬유아세포 공급 세포에 노출된 배지 상에서 배양하여 미분화된 상태로 줄기 세포를 유지시킬 수 있다.
공급 독립적 배양 시스템 및 배지를 사용하여 hESC 또는 iPSC와 같은 다능성 세포를 배양하고 유지시킬 수 있다. 이들 방법은 사람 배아 줄기 세포가 마우스 섬유아세포 "공급 층"에 대한 필요 없이 본질적으로 미분화된 상태로 유지되도록 할 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 다양한 변형을 상기 방법에 가하여 목적하는 바와 같이 비용 등을 감소시킬 수 있다.
실질적으로 임의의 다능성 또는 사람 배아 줄기 세포주가 본원에 기재된 바와 같은 한정된 조건하에서 조혈 선조 세포로 분화될 수 있는 것으로 예상된다. 예를 들어, 사람 배아 줄기 세포주 H1, H9, hES2, hES3, hES4, hES5, hES6, BG01, BG02, BG03, HSF1, HSF6, H1, H7, H9, H13B 및/또는 H14 등은 본원에 기재된 방법을 통해 조혈 전구 세포로 분화될 수 있다. 후속적으로 유용할 수 있는 줄기 세포주가 또한 본원에 기재된 방법을 통해 조혈 전구 세포로 분화될 수 있을 것으로 예상된다. 사람 다능성 세포는 바람직하게 특정 양태에서 사용될 수 있지만 몇몇 경우에 또한 조혈 분화를 위해, 포유동물, 마우스, 영장류 등과 같은 다른 다능성 세포를 사용할 수 있다.
사람 배아 줄기 세포 뿐만 아니라, iPS 세포는 본원에 기재된 방법을 통해 배양되고/되거나 분화될 수 있다. iPS 세포는 줄기 세포처럼 작용하는 재프로그램화된 체세포이다(문헌참조: Takahashi et al, 2007; Takahashi et al, 2007; Nakagawa et al, 2007). 당업자에 의해 인지되는 용어 "다능성 세포"는 천연적으로 존재하거나 배반포로부터 유래된 세포 및 줄기 세포로 분화되거나 체세포형 상태로 복귀되도록 유도된 세포 둘다를 포함한다(문헌참조: 예를 들어, Nakagawa et al, 2007; Yu et al, 2007).
A. TeSR 배지
TeSR 배지는 미분화된 사람 배아 줄기 세포를 배양하기 위해 사용될 수 있는 한정 배지이다. TeSR 배지는 TeSR1 배지 및 mTeSR 배지 둘다를 포함한다. TeSR은 bFGF, LiCl, γ-아미노부티르산(GABA), 피페콜산 및 TGFβ를 포함하고 TeSR을 사용하는 다양한 방법은 이전에 예를 들어, 본원에 전문이 참조로서 인용되는 문헌[참조: U.S. 특허원 제2006/0084168호 및 Ludwig et al. (2006a; 2006b)]에 기재되어 있다.
TeSR 배지는 전형적으로 무기염, 미량의 무기물, 에너지 기질, 지질, 아미노산, 비타민, 성장 인자 및 단백질, 및 기타 성분을 포함한다. TeSR1 배지에 대한 완전한 제형은 하기 표 1에 나타낸다.
Figure 112011074239247-pct00001
상기 제형 중에 특정 성분은 또한 연구 또는 비용 절감을 위해 TeSR의 사용을 촉진시키기 위해 대체될 수 있다. 예를 들어, 상기 배지 mTeSR1을 TeSR1 대신 사용할 수 있고 하기의 방식에서 TeSR1과는 상이하다: 소 혈청 알부민(BSA)은 사람 혈청 알부민을 대체할 수 있고 클로닝된 제브라피쉬 기본 섬유아세포 성장 인자(zbFGF)는 bFGF를 대체할 수 있다. TeSR1은 예를 들어, 전문이 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Ludwig et al. (2006)]에 기재되어 있다.
"TeSR-GF" 또는 "mTeSR-GF"는 bFGF 및 TGF-β가 결핍된 TeSR 배지를 언급한다. "EB 기본 배지"는 다음을 함유하는 배지를 언급한다: 약 20% BIT9500(제조원: Stem Cell Technologies) 또는 혈청 대체물 3 (Serum Replacement 3)(Sigma-Aldri ch, St. Louis, MO), 약 1% NEAA, 약 1 mM L-글루타민, 약 0.1 mM 머캅토에탄올, 약 0.75% BSA, 및 약 50 ug/ml 아스코르브산이 보충된 IMDM. 본원에 사용된 용어 "TeSR 배지"는 TeSR1 배지, TeSR2 배지 또는 mTeSR 배지를 포함한다. TeSR2 배지는 TeSR2 배지가 사람화된 것을 제외하고는 본질적으로 TeSR1 배지와 동일하다. TeSR1 배지, TeSR2 배지 또는 mTeSR 배지는 본원에 기재된 방법에 사용될 수 있다.
1. 성장 인자 함량이 감소된 한정 배지의 예비조건화
TeSR 배지 및 MatrigelTM 또는 피브로넥틴과 같은 매트릭스 성분을 포함하는 2차원 배양 시스템에서 다능성 세포의 배양 및/또는 유지 후, 및 조혈 분화 전에, 다능성 세포는 성장 인자가 감소되거나, 본질적으로 제거되거나 또는 결핍된 한정 배지에 유리하게 노출되거나 배양될 수 있고 특정 양태에서, 상기 배지에는 TGF-β 및/또는 FGF-2가 보충될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 성장 인자 수준이 감소된 TeSR 배지(예를 들어, 약 0.1 ng/mL TGF-β 및 약 20 ng/mL FGF-2가 보충되었지만 모든 다른 비-인슐린 성장 인자 결핍된)를 사용하여 예를 들어, 조혈 세포로의 분화를 촉진시키기 위한 추가의 성장 인자에 노출시키기 전에 세포를 배양하거나 "예비조건화"시킬 수 있다.
이러한 "예비조건화" 배양 단계는 약 12시간 내지 약 7일 이상의 기간 동안 다능성 세포를 배양함을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 상기 예비조건화 단계는 약 1일 내지 약 7일 동안, 약 1일 내지 약 3일 동안 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 또는 본원에 유도가능한 임의의 범위의 기간 동안 세포를 배양함을 포함할 수 있다. 하기의 실시예에 나타낸 바와 같이, 약 1 내지 약 3일의 예비조건화는 배양은 다능성 세포의 후속적 조혈 분화를 상당히 개선시키는데 충분할 수 있다.
예비조건화 배양에 사용된 한정 배지는 FGF-2 및/또는 TGF-β를 포함할 수 있다. 전형적으로, 예비조건화 배양에 보충된 FGF-2 및/또는 TGF-β의 양은 본질적으로 미분화된 상태로 세포를 유지하기 위해 사용된 한정 배지와 비교하여 감소될 수 있다. 특정 양태에서, 약 10 pg/mL 내지 약 5 ng/mL, 또는 약 0.05 ng/mL 내지 약 0.5 ng/mL, 또는 본원에 유도가능한 임의의 범위의 TGF-β는 예비조건화 배양 동안에 한정 배지에 포함될 수 있다. 다양한 양태에서, 약 1 ng/mL 내지 약 100 ng/mL, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 또는 약 10 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 또는 약 20 ng/mL의 FGF-2는 예비조건화 배양 동안에 한정 배지에 포함될 수 있다. FGF-2는 재조합적으로 제조된 사람 또는 제브라피쉬 FGF-2일 수 있다.
B. 매트릭스 성분
매트릭스 성분은 실질적으로 또는 본질적으로 미분화된 상태로 다능성 세포를 배양하고 유지하기 위한 한정 배지에 유리하게 포함될 수 있다. 적합한 반-고체 매트릭스 중에 배양되는 경우, 콜로니-형성 세포(CFC)로 불리우는 개별 선조세포는 구분된 세포 클러스터 또는 콜로니를 형성하도록 증식할 수 있다. CFC 분석은 영양물 및 사이토킨이 보충된 메틸셀룰로스 또는 콜라겐과 같은 반고체 배지로 세포 현탁액을 부과하고 이어서 예를 들어, 약 37℃에서 항온처리함에 의해 수행할 수 있다.
다양한 매트릭스 성분을 사용하여 hESC 또는 iPSC와 같은 다능성 세포를 배양하고 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 IV, 피브로넥틴, 라미닌 및 비트로넥틴을 조합적으로 사용하여 전문이 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Ludwig et al. (2006)]에 기재된 바와 같은 배아 세포 배양 및 유지를 위한 고형 지지체를 제공할 수 있다.
Matrigel™을 또한 사용하여 다능성 세포의 세포 배양 및 유지를 위한 기질을 제공할 수 있다. Matrigel™은 마우스 종양 세포에 의해 분비되는 젤라틴성 단백질 혼합물이고 제조원[BD Biosciences (New Jersey, USA)]으로부터 시판된다. 상기 혼합물은 많은 조직에서 발견되는 복잡한 세포외 환경과 유사하고 세포 생물학자가 세포 배양용 기질로서 사용한다. Matrigel™을 사용한 한정 배지에서 사람 배아 줄기 세포 배양 및 유지를 위한 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Ludwig et al. (2006)]에 기재되어 있고, 이를 사용하여 조혈 분화 전에 다능성 세포를 배양할 수 있다. 당업자에게 공지된 바와 같이 사람 배아 줄기 세포의 배양 및 유지를 위한 추가의 방법은 본 발명과 함께 사용될 수 있는 것으로 인지된다.
II. ES 세포의 씨딩 및 분화
다능성 세포는 조혈 분화 전에 부분적으로, 본질적으로 또는 완전히 분리되거나 개별화될 수 있다. 다능성 세포는 배양된 조직으로부터 분리된 세포 클럼프(clump)로서 또는 조혈 분화를 촉진시키기 위한 개별화된 세포로서, 단일 콜로니 또는 클론 그룹으로서 씨딩될 수 있다. 다능성 세포는 기계적 또는 효소적 방법, 예를 들어, 다능성 세포를 포함하는 조직의 트립신 또는 TrypLE™로의 노출을 사용하여 본질적으로 개별 세포를 개별화하거나 분리시킬 수 있다. 단백질 가수분해 효소를 사용하여 배양 표면으로부터 세포를 해리시키고 세포 자체를 분리할 수 있다. 분화를 위해 ES 세포를 개별화하는데 사용될 수 있는 효소는 Accutase™에서 발견되는 것들과 같은 효소 혼합물 뿐만 아니라 트립신과 같은 세린 프로테아제를 포함한다.
다능성 세포는 본질적으로 개별(또는 분산된) 세포로서 씨딩 배지에 첨가하거나 씨딩할 수 있다. 특정 양태에서, 분산된 ES 세포는 저 접착 표면과 같은 표면 상에 ml당 약 0.5 내지 3백만의 세포 밀도로 씨딩 배지에 씨딩한다. 특정 양태에서, 상기 씨딩 배지는 한정 배지이다. 표준 무균 세포 배양과 양립할 수 있는, 본질적으로 임의의 물질은 배양 표면으로 사용될 수 있지만 특정 양태에서 저 접착 표면이 유리하게 사용될 수 있는 것으로 인지된다. 상기 씨딩 배지는 TeSR 배지 또는 mTeSR 배지, 매트릭스 성분 및 ROCK 억제제를 포함할 수 있다.
다능성 세포는 ROCK 억제제, 프로테아제 억제제(예를 들어, 트립신 억제제) 및/또는 PKC 억제제의 존재 또는 부재하에 씨딩 배지에 배양되거나 이에 노출될 수 있고 상기 세포는 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 한정 배양 배지에서 저산소 대기하에 배양될 수 있다. 특정 양태에서, 대두 트립신 억제제(예를 들어, 약 0.25 mg/mL 내지 0.5 mg/ml)는 씨딩 배지에 포함될 수 있다. 상기 씨딩 배지 및 한정 배양 배지에는 각각 공급 세포가 부재이거나 본질적으로 부재이다. 추가로 분화된 세포는 후속적으로 수거될 수 있다. 예를 들어, 조혈 전구 세포 또는 CD34+ 세포는 씨딩 후 약 8일 내지 약 12일 이상 또는 약 6일 내지 약 9일 동안 배양될 수 있다.
임의로, 폴리 비닐 알콜 (PVA)은 배상체(EB)의 형성 동안에 ROCK 억제제를 포함하는 배지에 포함될 수 있다. 본 발명자는 PVA가 ROCK 억제제를 포함하는 배지에서 EB의 형성을 위해 요구되지 않지만 PVA는 EB 형성 동안에 배지(예를 들어, 감소된 수준의 TGF-β 및 FGF-2 이외에 다른 성장 인자가 결핍된 TeSR 배지)에 포함될 수 있는 것으로 관찰하였다. TrypLE™ 또는 다른 효소적 분해를 사용하여 ROCK 억제제 및/또는 트립신 억제제(및/또는, 임의로 PVA)로의 노출 전 및 EB 형성 전에 다능성 세포를 실질적으로 개별화시키거나 분리시킬 수 있다.
III. 조혈 전구 세포로의 다능성 세포의 분화
다능성 세포를 부분적으로, 본질적으로 또는 완전히 해리시키거나 개별화시킨 후, 상기 세포는 조혈 분화를 촉진시키기 위해 한정 배지에서 추가로 배양할 수 있다. 특정 조합의 성장 인자가 조혈 전구세포 및 조혈 세포 계통으로의 다능성 세포의 분화를 실질적으로 촉진시킬 수 있는 것으로 발견되었다. 추가로 특정 조합의 성장 인자의 후속적 적용을 사용하여 다능성 세포의 분화를 추가로 촉진시킬 수 있는 것으로 발견되었다. 특정 양태에서, 특정 조합의 성장 인자는 다능성 세포의 조혈 분화를 위해 중요하다. 예를 들어, 본원에서 BMP4, VEGF, Flt3 리간드, IL-3 및 GMCSF의 조합을 사용하여 조혈 분화를 촉진시킬 수 있는 것으로 나타났다. 특정 양태에서, 발명자는 BMP4 및 VEGF(및 임의로 FGF-2)를 포함하는 제1 배지로 세포 배양물의 후속적 노출에 이어서 Flt3 리간드, IL-3 및 GMCSF를 포함하는 제2 배지에서의 배양이 놀랍게도 다능성 세포의 조혈 전구 세포 및 조혈 세포로의 분화를 증가시킬 수 있음을 발견하였다. 예를 들어, 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 상기 연속 노출은 한정된 조건하에서 동일한 기간 상에서 생성된 조혈 전구 세포의 수를 대략적으로 2배 증가시켰다. 추가로, BMP4 및 VEGF를 함유하는 배지에서 FGF-2 (50 ng/ml)의 함유는 다능성 세포로부터의 조혈 전구 세포의 생성 효율을 2배 증가시켰다.
다능성 세포의 조혈 전구 세포로의 분화는 한정되거나 한정되지 않는 조건을 사용하여 수행할 수 있다. 일반적으로, 한정된 조건이, 수득한 세포가 사람 피검체로 투여되어야만 하는 양태에서 바람직할 수 있는 것으로 인지될 것이다. 조혈 줄기 세포는 한정된 조건(예를 들어, TeSR 배지 및 MatrigelTM과 같은 매트릭스 성분을 사용하여) 하에서 다능성 줄기 세포로부터 배양될 수 있고 조혈 세포는 다능성 세포로부터 유래된 배상체로부터 생성될 수 있다. 다른 양태에서, 다능성 세포는 OP9 세포 또는 마우스 배아 섬유아세포 상에서 공동 배양될 수 있고 후속적으로 분화될 수 있다.
다능성 세포는 분화 과정의 일부로서 배상체를 형성하도록 할 수 있다. 분화를 유도하기 위해 "배상체(EB)" 또는 성장 세포의 클러스터의 형성은 일반적으로 사람 다능성 줄기 세포의 EB로의 시험관내 응집을 포함하고 내배엽, 외배엽 및 중배엽 기원을 나타내는 다중 조직 유형으로의 사람 다능성 줄기 세포의 자발적 및 무작위 분화를 가능하게 한다. 따라서 3차원 EB를 사용하여 일부 분획의 조혈 세포 및 내피 세포를 생성시킬 수 있다.
EB는 하기의 프로토콜을 사용하여 형성될 수 있다. Matrigel™ 피복된 플레이트 상에서 공급 부재 성장에 적응된 미분화된 hESC 또는 iPSC는 약 37℃에서 약 10분 동안의 콜라게나제 IV(1mg/ml) 처리를 사용하여 컨플루언스(confluence) 시점에 수거할 수 있다. 상기 웰은 배양 후 콜라게나제 부재이도록 세척될 수 있고 EB는 EB 기본 배지에서 웰을 박리시킴에 의해 형성될 수 있다. 상기 배지는 다음 날 상이한 사이토킨 제형을 함유하는 EB 분화 배지로 변화시킬 수 있다.
EB 형성을 촉진하기 위해, 상기 세포를 약 20% BIT9500(제조원: Stem Cell Technologies) 또는 혈청 대체물 3(Serum Replacement 3), 약 1% NEAA, 약 1 mM L-글루타민 및 약 0.1 mM 머캅토에탄올, 약 0.75% BSA 및 약 50ug/ml 아스코르브산이 보충된 IMDM을 함유하는 "EB 기본 배지"에서 밤새 배양 동안 저 접착 플레이트로 이전시킬 수 있다. 다음 날, 상기 세포를 각각의 웰로부터 수거하고 원심분리시킬 수 있다. 상기 세포를 이어서 약 50 ng/ml의 골 형성 인자(BMP-4), 약 50 ng/ml의 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 약 25 ng/ml의 줄기 세포 인자 (SCF), 약 25 ng/ml의 Flt-3 리간드 (Flt-3L), 약 10 ng/ml 인터류킨-3 (IL-3), 약 10 ng/ml의 인터류킨-6 (IL-6), 약 20 ng/ml의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 약 20 ng/ml의 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 약 0.2 U/ml 에리트로포이에틴 (EPO), 약 25 ng/ml 트롬보포이에틴(TPO) 및 약 25 ng/ml의 FGF-2가 보충된 EB 기본 배지로 이루어진 "EB 분화 배지"에 재현탁시킬 수 있다. 상기 배지는 4일마다 EB를 15ml의 튜브에 이전시키고 응집체가 약 5분 동안 침강하도록 함에 의해 변화시킬 수 있다. 특정 양태에서, EB 분화 배지는 약 BMP4 (예를 들어, 약 50 ng/ml), VEGF (예를 들어, 약 50 ng/ml), 및 임의로 FGF-2 (예를 들어, 약 25-75 ng/ml 또는 약 50 ng/ml)를 함유할 수 있다. 상기 상청액을 흡인시키고 새로운 분화 배지로 대체할 수 있다. 또는 상기 세포에 2일마다 새로운 배지를 절반 공급할 수 있다. 상기 세포는 분화 과정 동안에 상이한 시점에서 수거할 수 있다.
조혈 전구 세포는 한정 배지를 사용하여 다능성 줄기 세포로부터 배양할 수 있다. 한정 배지를 사용한 다능성 세포의 조혈 CD34+ 줄기 세포로의 분화를 위한 방법은 예를 들어, 포기 없이 전문이 본원에 참조로서 인용되는 미국 출원 제61/015,813호에 기재되어 있다. 이들 방법은 본 발명과 함께 사용될 수 있는 것으로 인지된다.
예를 들어, 한정 배지를 사용하여 조혈 CD34+ 분화를 유도할 수 있다. 상기 한정 배지는 성장 인자 BMP-4, VEGF, Flt3 리간드, IL-3 및/또는 GMCSF를 함유할 수 있다. 다능성 세포는 BMP4, VEGF 및 임의로 FGF-2를 포함하는 제1 한정 배지에서 배양될 수 있고 이어서 (Flt3 리간드, IL-3 및 GMCSF) 또는 (Flt3 리간드, IL-3, IL-6 및 TPO)를 포함하는 제2 배지에서 배양할 수 있다. 제1 및 제2 배지는 또한 SCF, IL-6, G-CSF, EPO, FGF-2 및/또는 TPO 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 실질적으로 저산소 조건(예를 들어, 20% O2 미만)은 추가로 조혈 또는 내피 분화를 촉진시킬 수 있다.
세포는 실질적으로 기계적 또는 효소적 수단(예를 들어, 트립신 또는 TrypLETM을 사용하여)을 통해 개별화시킬 수 있다. ROCK 억제제(예를 들어, H1152 또는 Y-27632)는 또한 배지에 포함될 수 있다. 이들 방법은 예를 들어, 로봇 자동화를 사용하여 자동화될 수 있다.
다능성 세포의 조혈 전구 세포로의 분화를 위한 한정된 방법의 사용이 특정 경우에 바람직할 수 있지만 한정되지 않는 방법이 다양한 양태로 사용될 수 있다. 사람 ESC로부터 조혈 줄기 세포의 분화를 위한 한가지 한정되지 않은 방법은 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 공급 층 또는 마우스 또는 마우스 기질 세포주 OP9과 같은 공급 세포 상에서 ESC를 배양함을 포함하고 이는 CD34+로의 강한 분화를 유도한다. 간략히 설명하면, ESC는 성장 인자의 존재하에 MEF 상에서 성장할 수 있고 MEF는 기질 및 가능하게는 세포에 대한 일부 영양물을 제공한다. 한정된 조건과는 대조적으로 OP9 세포의 사용은 일반적으로 CD34+ 분화를 유도하기 위한 기타 성장 인자를 요구하지 않는다. 이들 프로세싱이 발생하는 기작은 완전히 이해되지 않는다. 상기 방법은 또한 특정 성장 인자 및 혈청과 조합하여 사용할 수 있다(Wang, 2007). MEF는 또한 흔히 사람 ESC를 배양하고 유지하기 위해 사용된다. 하기 프로토콜과 같이, 마우스 배아 섬유아세포 상에서의 배양을 사용하는 방법은 FBS 대신 Knockout™ 혈청 대용물을 포함하도록 변형시킬 수 있다.
하기 한정되지 않은 프로토콜은 다능성 세포의 조혈 세포로의 분화를 위해 사용될 수 있다. H1 세포는 통상적으로 MEF 상에 유지시킬 수 있고 이어서 1 x 105 세포/웰(1웰은 9.6cm2이다)로 αMEM + 20% 한정된 FBS + 100 ng/ml TPO 중에 거의 컨플루언트한 OP9 기질 세포상으로 계대된다. 세포에 새로운 배지를 2일 및 4일째에 공급할 수 있다. 7일째에 세포는 콜라게나제 IV를 사용하여 새로운 OP9 세포상으로 1:3으로 분할될 수 있다. 세포에는 8일 및 10일째에 새로운 배지를 공급할 수 있다. 11일째에 세포는 단일 세포를 수득하기 위해 콜라게나제 IV에 이어서 트립신/EDTA를 사용하여 새로운 OP9 세포상으로 1:1로 분할될 수 있고 상기 배지는 αMEM + 10% 한정된 FBS + 100 ng/ml TPO로 변화될 수 있다. 세포에는 14일 내지 16일째로부터 매일 1ml의 추가의 배지를 첨가함에 의해 영양 공급될 수 있다. 특정 양태에서, OP9 세포가 관여하는 분화 방법은 구체적으로 전문이 참조로서 인용되는 문헌[참조: Gaur et al. 2006]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
IV . 골수 또는 림프 계통으로의 조혈 전구 세포의 분화
적혈구, 과립구, 대식세포 및 거핵세포를 포함하는 세포 계통으로 조혈 전구 줄기 세포를 추가로 분화시키기 위해 다양한 방법이 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 이들 방법은 적혈구 분화 배지, 메틸셀룰로스 및 거핵세포 분화 배지의 사용을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 조혈 선조 세포는 또한 내피 세포로 분화될 수 있거나 혈관을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
이들 세포 계통은 다양한 의학적 치료 및 응용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 적혈구 계통은 혈액 이식체에 대한 혈액 생산에 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 내피 세포는 국부적 허혈을 치료하기 위해 사용될 수 있는 새로운 혈관을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 특정 양태에서, 본 발명에 따라 분화된 조혈 세포는 겸상 적혈구 빈혈증과 같은 질환을 치료하기 위해 투여될 수 있다(문헌참조: Hanna et al., 2007).
시험관내 분석 시스템은 적혈구, 과립구, 단핵구-대식세포 및 거핵세포 골수 세포 계통의 다중 잠재적 선조세포 및 계통 제한된 선조세포를 정량하기 위해 개발되었다. 콜로니 형성 세포(CFC)는 콜로니내에서 조혈 계통 세포 중 하나 이상의 유형의 형태적 인지를 기초로 분류되고 열거될 수 있다. 콜로니 평가 및 열거는 광학현미경에 의해 또는 개별 콜로니를 플러킹(plucking)하고 이어서 세포화학적 및 면역세포화학적 방법을 사용하여 세포를 염색시킴에 의해 원위치에서 수행될 수 있다. 한천, 아가로스, 메틸셀룰로스, 콜라겐 및 피브린 응고를 포함하는 다양한 겔화제가 CFC 분석을 위해 사용되었다.
A. 적혈구 분화
조혈 선조 세포는 예를 들어, 적혈구 분화 배지를 사용하여 적혈구 세포로 분화될 수 있다. 적혈구 분화 배지는 무혈청 또는 한정 배지일 수 있고 상기 배지는 SCF, EPO, TPO, 인슐린, 덱사메타손 또는 하이드로코르티손 및 트랜스페린을 함유할 수 있다(문헌참조: Slukvin et al., 2007).
하기의 프로토콜을 사용하여 조혈 전구 세포를 적혈구 세포로 분화시킬 수 있다. 적혈구 선조세포는 하이드로코르티손(10-6M), 홀로트랜스페린 및 엑사이트(EXCYTE)를 함유하는 배지에 IL-3, FLT-3, SCF 및 TPO로부터 유래된 조혈 전구 세포를 위치시킴에 의해 생성될 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 100만개의 hESC는 2백만개의 적혈구 선조세포를 생성시킬 수 있다.
B. 메틸셀룰로스
메틸셀룰로스를 사용하여 조혈 선조 세포로부터 적혈구, 대식세포 및/또는 과립구의 분화를 유도할 수 있다. 메틸셀룰로스는 양호한 광학적 투명성으로 안정한 겔을 형성하는 비교적 불활성의 중합체이다. 태아 소 혈청(FBS), 소 혈청 알부민(BSA), 2-머캅토에탄올, 인슐린, 트랜스페린 및 재조합 사이토킨을 함유하는 화합물이 보충된 배양 배지 또는 콜로니 자극 인자의 공급원으로부터 조건화된 배지에서 일반적으로 0.9 내지 1.2%의 최종 농도로 사용된다. 세포의 메틸셀룰로스 분화를 포함하는 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Kaufman et al. (2001)]에 기재되어 있다.
메틸셀룰로스계 배지는 다른 유형의 반고체 매트릭스보다 적혈구 계통 세포의 성장을 보다 양호하게 하여 동일한 배양내에서 적혈구, 과립구, 단핵구 및 다중 잠재적 CFC의 분석을 가능하게 한다. 거핵세포 선조세포는 적합하게 보충된 콜라겐계 배지에서 배양되고 구체적으로 면역세포화학적 염색을 사용하여 확인된다.
C. 거핵세포 분화
조혈 전구 세포는 추가로 거핵세포로 분화될 수 있다. 체내에서, 거핵세포는 골수에서 발견되고 과정으로부터 혈소판 또는 세포 상에 형성하는 전구혈소판을 생성한다. 사람 체내에서 거핵세포는 단지 골수 세포의 소분획이지만 특정 질환에 반응하여 수적으로 10배까지 증가할 수 있다. 체내에서, 거핵세포는 전형적으로 다음과 같이 조혈 세포로부터 분화한다: 혈구모세포는 거핵모세포로 분화하고 거핵모세포는 이어서 전구거핵세포로 분화하며 이는 이어서 거핵세포로 분화한다.
다양한 배지 및 방법을 사용하여 다능성 세포 또는 조혈 전구 세포를 거핵세포로 분화시킬 수 있다. 예를 들어, 포기 없이 전문이 본원에 참조로서 인용된 미국 특허 2007/0077654에 기재된 바와 같이 다능성 세포를 거핵세포로 분화시키기 위한 방법 및 배지를 본 발명에 사용할 수 있다.
성장 인자는 우선적으로 거핵세포 분화 배지에 함유된다. 예를 들어, 거핵세포 분화 배지는 FLT-3 리간드, 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 인터류킨-3 (IL-3) 및 인터류킨-6 (IL-6) 중 1개, 2개, 3개, 4개 또는 모두를 함유할 수 있다. 특정 양태에서, SCF만이 거핵세포 분화 배지에 함유될 수 있다. 다른 양태에서, SCF는 IL-3 및/또는 IL-6 중 하나 또는 둘다와 조합하여 사용할 수 있다. 다양한 양태에서, FLT-3 리간드 및/또는 TPO는 본 발명의 거핵세포 분화 배지로부터 제외될 수 있다.
조혈 세포는 하기의 프로토콜을 통해 거핵세포로 분화될 수 있다. 거핵세포는 조혈 전구 세포를 (100ng/ml TPO, SCF, FLT-3, 20% BIT9500) 함유 배지에 위치시킴에 의해 생성될 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 1백만개의 hESC는 6만개의 거핵세포를 생성시킬 수 있다.
거핵세포 분화 배지를 사용하여 거핵세포의 생성을 유도할 수 있다. 거핵세포의 생성을 위한 다양한 제품 및 방법이 WO2006/050330에 기재된 바와 같이 보고되었고 본 발명에 사용될 수 있다. 추가로, Megacult™은 제조원[Stem Cell Technologies]으로부터 시판되고 거핵세포를 생성하고/분화시키기 위해 사용될 수 있다. 다양한 양태에서, 트롬보포에이틴 (TPO), 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 6 (IL-6) 및/또는 줄기 세포 인자는 거핵세포 분화 배지에 함유될 수 있다. 세포의 거핵세포 분화를 위한 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Kaufman et al. (2001)]에 기재되어 있다.
D. 내피 세포 분화
조혈 세포는 또한 내피 세포로 분화될 수 있다. 내피 세포는 예를 들어, 동물 또는 사람 피검체로의 이식을 위해 하기의 프로토콜을 사용하여 생성될 수 있다. 사람 ES 세포 유래 CD31+ 세포는 7일 내지 10일 동안 EGM™-2 배지(Lonza, Switzerland) 또는 50 ng/mL의 rhVEGF 및 5 ng/mL의 rhFGF-2를 갖는 분화 배지에서 배양될 수 있다.
내피 세포의 추가의 증식 및 분화를 위해, 분리된 CD31+ 세포는 VEGF, FGF, EGF, IGF, 아스코르브산 및 FBS를 함유하는 내피 분화 배지(Lonza 카탈로그 #CC3202) 또는 50ng/ml의 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 및 FGF-2 (예를 들어, 50 ng/ml 제브라피쉬 FGF-2)를 함유하는 분화 배지에서 배양될 수 있다. 세포는 2 내지 3주 동안 배양될 수 있다.
하기의 프로토콜을 사용하여 내피 분화를 유도할 수 있다. 내피 세포의 증식 및 분화를 위해, 분리된 CD34+ 세포는 EGM-2MV 배지(Cambrex)에서 젤라틴 피복된 웰(1.5 내지 2 x 104 세포/cm2) 상에 씨딩될 수 있다. 젤라틴이 전형적으로 콜라겐 I-피복된 웰보다는 덜 확장성이지만 콜라겐 I-피복된 웰 (BD labware)이 또한 사용될 수 있다. CD34+ 세포는 내피 성장 인자, hVEGF165 (50ng/mL) 및 FGF-2 (5 ng/mL)를 함유하는 hESC 분화 배지에서 배양될 수 있다. 약 7일 내지 10일의 배양 후, 부착 세포는 트립신 처리에 의해 수거될 수 있고 분석을 위해 사용될 수 있다.
내피 세포는 매트리겔 플러그를 이미지화하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 하기의 프로토콜을 사용하여 세포를 이미지화할 수 있고; hESC 또는 iPSC로부터 유래된 내피 세포(EC)는 Matrigel에 현탁될 수 있으며(예를 들어, 1ml 중 약 1백만개의 세포) SCID 베이지(Beige) 마우스에 피하내로 주사된다. 이어서 FITC 덱스트란은 매트리겔 플러그를 제거하기 14일 전에 정맥내 주사될 수 있다. 상기 플러그를 수거하고 형광 이미지화 기술을 사용한 이미지화에 적용할 수 있으며 상기 플러그는 신생혈관 형성의 존재 또는 부재에 대해 분석될 수 있다.
E. 비만 세포 생성
조혈 전구 세포는 비만 세포로 추가로 분화될 수 있다. 다능성 세포의 줄기 세포 인자 (SCF), IL-6, IL-3, IL-4, IL-9 및/또는 IL-10으로의 노출은 비만 세포 분화를 촉진시킬 수 있다.
특정 양태에서, 하기의 프로토콜을 사용하여 비만 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 조혈 세포는 먼저 조혈 전구 세포를 (100ng/ml TPO, SCF, FLT-3, 20% BIT9500)함유 배지 "MK3"에 위치시킴에 의해 거핵세포로 분화될 수 있다. 비만 세포는 후속적으로 상기 전구세포를 MK3 증식에 이어서 50 ng/ml SCF, 50ng/ml IL-6 함유 배지에서 전구세포를 증식시킴에 의해 생성될 수 있다.
다양한 양태에서, 제대혈 또는 말초혈의 비만 세포로의 분화 방법을 또한 사용하여 거핵세포 분화를 촉진시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Schernthaner et al. (2001)]은 다양한 시점에서 IL-6 또는 (IL-4, IL-6 및 IL-10)과 조합된 SCF를 사용하여 제대혈 선조세포를 비만 세포로 분화시키기 위한 방법을 기재하고 있다. 문헌[참조: Lappalainen et al. (2007)]은 다양한 기간 동안 첨가된 SCF 및 다른 사이토킨 (IL-3, IL-6, IL-9 및 IL-4)를 사용하여 세포를 배양함에 의해 말초혈을 비만 세포로 분화시키기 위한 방법을 기재하고 있다. 이들 방법 중 어느 하나가 본 발명에서 성공적으로 사용될 수 있는 것으로 예상된다.
F. 대식세포 및 수지상 세포
조혈 전구 세포는 수지상 세포로 추가로 분화될 수 있다. 예를 들어, 조혈 전구 세포는 8일 동안 200 ng/ml GMCSF 함유 배지에 위치할 수 있다. 이어서 이들 세포는 2주 동안 M-CSF (10 ng/ml) 및 IL-1β (20 ng/ml) 함유 배지에 세포를 위치시킴에 의해 대식세포로 분화시킬 수 있거나 (20 ng/ml GMCSF, 20 ng/ml IL-4)에 세포를 위치시킴에 의해 수지상 세포로 분화시킬 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 1백만개의 hESC는 약 20만개 내지 250만개의 수지상 세포 및 50만개 내지 250만개의 대식세포를 생성시킬 수 있다.
V. 다능성 세포의 내피 세포로의 분화
다능성 세포, 예를 들어, iPSC 또는 hESC는 본 발명의 다양한 양태에서 내피 세포로 분화될 수 있다. 내피 세포가 혈관의 일부를 구성하므로 이들 세포는 특히 혈관 또는 내피 세포에 대한 화합물의 효과, 약리학 또는 독성을 결정하기 위해 화합물을 스크리닝하거나 시험하기 위해 유용할 수 있다. 상기 내피 세포는 또한 하기의 성질 중 하나 이상을 사용한 평가 또는 확인을 위해 사용될 수 있다: 혈관수축 또는 혈관확장, 혈압 조절, 혈액 응고(예를 들어, 혈전증 또는 피브린 용해), 죽상경화증, 혈관형성 또는 염증의 촉진 또는 감소 및/또는 장벽 기능(예를 들어, 화합물의 혈뇌 장벽 기능 또는 수송)에 대한 효과. 상기 내피 세포는 또한 관상 동맥 질환, 진성 당뇨병, 고혈압 또는 고콜레스테롤혈증을 촉진시키거나 감소시킬 수 있는 화합물을 스크리닝하거나 확인하기 위해 유용할 수 있다.
특정 양태에서, 다능성 세포는 TGF (예를 들어, 약 0.1 ng/ml) 및 FGF (예를 들어, 20 ng/ml)가 보충된 한정 배지(예를 들어, TeSR 배지)에서 약 12시간 내지 36시간 또는 약 24시간 동안에 예비조건화될 수 있다. 이어서 상기 세포는 예를 들어, 약 37℃에서 약 5분 동안 TrypLE 처리를 사용하여 컨플루언스 시점에서 수거할 수 있다. 상기 세포는 (예를 들어, 약 20% BIT9500 (Stem Cell Technologies) 또는 혈청 대체물 3 (Serum Replacement-3)™, 약 1% NEAA, 약 1 mM L-글루타민, 약 0.1 mM 머캅토에탄올, 약 0.75% BSA, 약 50 ug/ml 아스코르브산, 및 ROCK 억제제, 예를 들어, 1 μM의 H-1152가 보충된 IMDM 함유) EB 기본 배지에서 수거될 수 있다. 이어서 세포는 저-접착 배양 표면 또는 플레이트, 생물 반응기 또는 회전 플라스크 등에서 배양될 수 있다.
약 12 내지 24시간 배양 후, 세포를 수거하고 BMP-4 (예를 들어, 50ng/ml), VEGF (예를 들어, 50ng/ml) 및 FGF-2 (예를 들어, 50 ng/ml)가 보충된 EB 기본 배지에서 재현탁시킬 수 있다. 상기 배지는 약 4일째에 새로운 배지로 적어도 부분적으로 대체될 수 있다. EB 분화의 약 7일째에, 상기 세포를, EGM-2MV, Lonza 카탈로그 #CC3202와 같은 내피 분화 배지에 위치시킬 수 있다. 특정 양태에서, 내피 분화 배지는 VEGF, FGF, EGF, IGF, 아스코르브산 및/또는 FBS 중 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 모두를 함유한다. 이어서, 내피 세포는 예를 들어, 배양 10일째에 수거할 수 있다. 하나 이상의 세포 마커, 예를 들어, CD31 및/또는 CD 105는 MACS 또는 FACS를 사용한 세포 집단으로부터 내피 세포 집단을 실질적으로 정제하기 위해 사용될 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 내피 세포는 본 발명의 특정 양태에서 iPSC 또는 hESC로부터 성공적으로 생성될 수 있다. 내피 세포를 확인하거나 실질적으로 정제하기 위해 사용될 수 있는 세포 마커는 CD31, CD105, CD144 (VE-캐드헤린), CD106, CD146, 및 Z01 (치밀한 이음부 단백질)를 포함한다.
VI. 저산소 및 분화
특정 양태에서, 실실적으로 저산소 조건을 사용하여 다능성 세포의 조혈 선조 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 당업자에 의해 인지되는 바와 같이, 약 20.8% 미만의 대기 산소 함량은 저산소인 것으로 간주된다. 배양 중의 사람 세포는 주위 대기와 비교하여 산소 함량이 감소된 대기 조건에서 성장할 수 있다. 이러한 상대적 저산소는 배양 배지에 노출된 대기 산소를 감소시킴에 의해 달성할 수 있다. 배아 세포는 전형적으로, 주위 수준의 이산화탄소와 함께 약 1% 내지 약 6%의 대기 산소의 감소된 산소 조건하에서 생체내 발육한다. 특정 이론에 국한될 필요 없이, 저산소 조건은 특정 배아 발육 조건의 한 측면을 모방할 수 있는 것으로 예상된다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 특정 양태에서 저산소 조건을 사용하여 iPSC 또는 hESC와 같은 다능성 세포의 보다 분화된 세포 유형(예를 들어, 조혈 전구 세포)으로의 추가 분화를 촉진시킬 수 있다.
하기의 저산소 조건을 사용하여 다능성 세포의 조혈 선조 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 양태에서, 약 20% 미만, 약 19% 미만, 약 18% 미만, 약 17% 미만, 약 16% 미만, 약 15% 미만, 약 14% 미만, 약 13% 미만, 약 12% 미만, 약 11% 미만, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만의 대기 산소 함량을 사용하여 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 양태에서, 저산소 대기는 약 5% 산소 가스를 포함한다.
VII. 한정 배양 배지
본원에 기재된 바와 같이, 하나 이상의 한정 배양 배지는 조혈 전구 세포로의 다능성 세포의 분화를 촉진시키는데 유리하게 사용될 수 있고 특히 혈청 및 마우스 공급 층과 같은 동물 제품의 제거는 세포의 동물 제품 노출과 관련된 위험성을 감소시킬 수 있고 보다 안전하게 사람 피검체에 투여될 수 있는 세포의 생성을 가능하게 한다. 통상적인 줄기 세포 배양 발달은 줄기 세포의 다양한 세포 유형으로의 분화를 위해 혈청 제품 및 마우스 공급 층에 의존해왔고 이들 통상적인 과정은 분화가 수행될 수 있는 규모를 제한했고 생물학적 가변성 및 잠재적인 오염을 증가시켰으며 유용함을 입증할 수 있는 해독적 치료법에서의 ES 세포의 사용을 방해했다.
특히, 본 발명자는 동시에 또는 연속적으로 배지에 포함되는 매우 제한된 수의 사이토킨(예를 들어, 임의로 GMCSF, IL-3. IL-6, TPO 및/또는 FGF-2와 조합된 BMP4, VEGF, FLT-3 및 IL-3)을 포함하는 한정 배양 배지로의 다능성 세포의 노출이 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시키는데 사용될 수 있음을 밝혔다. 놀랍게도, 세포 배양 배지에서 단독의 BMP-4 및 단독의 VEGF가 조혈 세포 분화를 촉진시키지 않았지만 세포 배양 배양 배지에서 BMP4 및 VEGF 둘다의 함유는 공동상승작용하고 특정 양태에서 조혈 세포로의 전구 세포의 분화를 촉진시키는데 필요하다는 것이 밝혀졌다. BMP4 및 VEGF와 함께 한정 배지에 FGF-2의 함유는 다능성 세포의 분화를 촉진시킬 수 있고, 예를 들어, 하기 실험에서 예시된 바와 같이 상기 배지에 FGF-2의 함유는 다능성 세포로부터 조혈 전구 세포(HPC)의 생성 효율을 2배 이상 증가시켰다.
본 발명자는 추가로 특정 양태에서, (BMP4, VEGF 및 임의로 FGF-2)의 제1 조합으로 전구 세포의 연속적 노출에 이어서 (FLT-3, IL-3 및 GMCSF) 또는 (FLT-3, IL-3, TPO, IL-3 및 IL-6)으로의 세포의 노출이 놀랍게도 동일한 시간에 걸쳐 상기 사이토킨 모두에 세포를 동시에 노출시키는 것과 비교하여 분화(예를 들어, 조혈 전구 세포로의 분화)를 추가로 촉진시킬 수 있음을 밝혔다. 상기 세포는 후속적인 성장 인자로의 세포의 노출을 촉진시키거나 개선시키기 위해 (BMP4 및 VEGF)로의 노출 후 및 (FLT-3 및 IL-3)으로의 노출 전에 재응집하도록 방치될 수 있다. 임의의 특정 이론에 국한되는 것 없이 상기 재응집 단계는 조혈 전구 세포로의 세포의 분화를 추가로 촉진시킬 수 있는 것으로 예상된다.
배양 배지는 전형적으로 추가의 영양물, 아미노산, 항생제, 완충제 등을 함유한다. 특정 양태에서, 한정 배양 배지는 하기 표 1에 열거된 성분들 중 하나 이상을 함유한다. 하기의 배양 배지는 약 25 ng/ml의 Flt-3, 약 10 ng/ml의 IL-3 및 약 10 ng/ml의 GMCSF를 함유할 수 있다. 분화 방법이 항생제의 부재하에 세포에 대해 수행될 수 있지만 상기 배지는 하나 이상의 항생제를 함유할 수 있다. 하기 실시예에 예시된 바와 같이, IMDM 배양 배지에 혈청 대체물 3(Serum Replacement 3)의 함유는 다능성 세포의 분화를 촉진시키고 증가시킨다.
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A. 성장 인자
다양한 성장 인자를 사용하여 다능성 세포의 조혈 전구 세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 한정 배양 배지는 예를 들어, (BMP-4 및 VEGF) 또는 (BMP-4, VEGF, FLT-3, IL-3 및 GMCSF)와 같은 1개, 2개 또는 그 이상의 성장 인자를 함유할 수 있다.
본 발명의 한정 배양 배지에 포함될 수 있는 성장 인자는 BMP-4, VEGF, bFGF, 줄기 세포 인자 (SCF), Flt3 리간드, 인터류킨 3 (IL-3), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 9 (IL-9), 인터류킨 11 (IL-11), 인슐린 관련 성장 인자 1 (IGF1), 인슐린 관련 성장 인자 2 (IGF2), 에리트로포이에틴 (EPO), 트롬보포이에틴 (TPO), 과립구-대식세포-콜로니-자극 인자 (GMCSF 또는 GM-CSF), 및 과립구 콜로니-자극 인자 (GCSF 또는 G-CSF)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 한정 배양 배지는 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 상기 인자를 함유할 수 있고, 예를 들어, 다른 성장 인자가 세포의 분화를 증가시키거나 분화 상태를 조절하기 위해 한정 배지에 함유될 수 있다. 특정 양태에서, 한정 배지는 적어도 (BMP-4 및 VEGF, 및 임의로 FGF-2) 또는 (FLT-3, IL-3 및 GMCSF)를 함유할 수 있고; 이들 양태에서, 필요한 것은 아니지만 하나 이상의 추가의 성장 인자가 상기 한정 배지에 함유될 수 있다. 예를 들어, GMCSF는 분화 과정 제2 단계에서 약 25ng/ml의 TPO 또는 SCF를 사용하여 대체될 수 있다. 다양한 양의 상기 인자를 사용하여 세포 반응(예를 들어, 문헌(참조: Yamamura et al, 2008; Fadilah et al., 2007; Bashey et al., 2007)에 기재된 양으로) 세포 반응을 자극할 수 있다. 예를 들어, 약 1-50 ng/mL, 약 5-25 ng/mL 또는 약 10 ng/mL의 TPO가 세포 증식 또는 세포 분화를 촉진시키기 위해 함유될 수 있다. 다양한 양태에서, SCF는 약 5-100 ng/mL, 약 10-50 ng/mL, 또는 약 25 ng/mL의 농도로 한정 배지에 함유될 수 있다. 다양한 양태에서, IL-6은 약 5-50 ng/mL, 약 5-25 ng/mL, 또는 약 10 ng/mL의 농도로 한정 배지에 함유될 수 있다. 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF)는 조혈 전구 세포로부터 과립구를 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
1. BMP -4
골 형성 단백질-4 (BMP-4)은 골 형성 단백질 및 복부 중배엽 유도인자 그룹의 구성원이다. BMP는 성인 사람 골수(BM)에서 발현되고 골 리모델링 및 성장을 위해 중요하다. 특정 양태에서, BMP4의 함유는 단지 배양에서 처음 2 내지 3일 동안만 요구되고 이후 시간에서는 분화에 치명적 영향을 주는 것 없이 상기 시스템으로부터 제거될 수 있다.
BMP-4는 조혈 선조 세포의 증식 및 분화 잠재력의 조절을 위해 중요하다(문헌참조: Bhardwaj et al., 2001; Bhatia et al., 1999; Chadwick 2003). 추가로, BMP-4는 사람 태아, 신생아 및 성인 조혈 선조 세포에서 조기 조혈 세포 발육을 조절할 수 있다(문헌참조: Davidson and Zon, 2000; Huber et al., 1998; Marshall et al., 2000). 예를 들어, BMP-4는 성인 및 신생아 공급원으로부터 고도로 정제된 초기 사람 조혈 세포의 증식 및 분화를 조절할 수 있고(문헌참조: Bhatia et al, 1999), BMP-4는 사람 배아 줄기 세포에서의 조혈 분화를 촉진시킬 수 있다 (문헌참조: Chadwick, 2003).
BMP-4는 약 5-100 ng/mL, 약 20-100 ng/mL, 약 20-50 ng/mL, 약 10-30 ng/mL, 약 15-30 ng/mL, 약 20-30 ng/mL, 또는 본원에 유도가능한 임의의 범위의 농도로 한정 배양 배지에 함유될 수 있다. 특정 양태에서, BMP-4는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 약 50 ng/mL의 농도로 한정 배양 배지에 함유된다.
2. VEGF
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 배아 순환계의 형성 및 혈관 형성에 관여하는 중요한 시그날 전달 단백질이다. VEGF는 혈관 내피 및 다른 세포 유형(예를 들어, 뉴런, 암 세포, 신장 상피 세포)을 포함하는 다양한 세포 유형에 영향을 줄 수 있다. 시험관내에서, VEGF는 내피 세포 유사분열생식 및 세포 이동을 자극할 수 있다. VEGF 기능은 또한 암, 당뇨병, 자가면역 질환 및 안구 혈관 질환을 포함하는 다양한 형태의 질환 상태에서 중요한 것으로 나타났다.
VEGF는 약 10-100 ng/mL, 약 20-100 ng/mL, 약 10-50 ng/mL, 약 15-30 ng/mL, 약 20-30 ng/mL, 약 20-50 ng/mL, 또는 본원에 유도될 수 있는 임의의 범위의 농도로 한정 배양 배지에 함유될 수 있다. 특정 양태에서, VEGF는 약 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 약 50 ng/mL의 농도로 한정 배양 배지에 함유된다.
3. FGF -2
또한 bFGF 또는 FGF-2로 언급되기도 하는 기본 섬유아세포 성장 인자는 사지 및 신경계 발육, 상처 치유 및 종양 성장을 포함하는 다양한 생물학적 과정에 연관된 성장 인자이다. 이전의 연구는 bFGF가 사람 배아 줄기 세포의 공급-독립적 성장을 지지하기 위해 사용되어 왔지만(문헌참조: Ludwig et al., (2006)) 조혈 세포 발육 또는 생존에 영향을 주지 않음을 지적했다(문헌참조: Ratajczak et al., 1996.), 특정 양태에서, bFGF는 분화를 유도하는데 요구되지 않고 따라서 다양한 양태에서 이것은 본 발명의 배지에 함유되거나 제외될 수 있다.
bFGF는 약 5 내지 약 100 ng/mL, 5 내지 약 50 ng/mL, 약 5 내지 약 25 ng/mL, 약 25 내지 약 50 ng/mL, 또는 본원에서 유도될 수 있는 임의의 범위의 농도로 한정 배양 배지에 함유될 수 있다. 특정 양태에서, bFGF는 약 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 약 75 ng/mL의 농도로 한정 배양 배지에 함유된다. 이들 농도는 특히, 미분화되거나 실질적으로 미분화된 상태로 다능성 세포의 유지를 위해 사용되는 배지를 위해 유용할 수 있다. 다양한 양태에서, FG2 (예를 들어, 약 100 ng/ml에서)는 다능성 세포의 유지를 위해 사용될 수 있다. 조혈 분화를 촉진시키기 위해, 세포는 약 5-50 ng/ml의 농도에서 FGF2에 노출될 수 있다.
본 발명자는 다양한 양태에서, 보다 낮은 농도의 bFGF가 조혈 분화 전에 "예비조건화" 배양 단계에서 한정 배지에 함유될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 약 5 ng/mL 내지 약 50 ng/mL, 약 10 ng/mL 내지 약 30 ng/mL, 약 15 ng/mL 내지 약 25 ng/mL, 약 50 ng/mL 미만, 약 40 ng/mL 미만, 약 30 ng/mL 미만, 또는 약 10, 15, 20, 25, 또는 30 ng/mL의 bFGF가 세포의 조혈 전구 세포의 분화 전에 다능성 세포의 예비조건화 배양에서 한정 배지에 함유될 수 있다. 특정 양태에서, 성장 인자 부재하에 bFGF (예를 들어, 약 25-75 ng/mL 또는 약 50 ng/ml) 또는 FGF-2 및 0.1 ng/mL의 TGF-β가 보충된 TeSR 배지가 조혈 분화 전에 다능성 세포의 예비조건화 배양에 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 상기 예비조건화 단계는 후속적 조혈 분화를 촉진시키는데 필수일 수 있다.
다능성 세포가 예비조건화된 후(예를 들어, 성장 인자 없이 약 1일 동안 TGF-β 및 FGF-2가 보충된 TeSR 배지에서), 이어서 세포는 BMP4, VEGF 및 FGF-2 (예를 들어, 약 25-50 ng/ml로)를 포함하는 EB 분화 배지에 위치시킬 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, FGF-2의 함유는 hESC 또는 iPSC와 같은 다능성 세포의 조혈 전구 세포로의 분화 효율을 2배 이상 증가시킬 수 있다.
특정 양태에서, 다른 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어, 산성 FGF (aFGF), FGF4, FGF9, FGF17 또는 FGF18이 예를 들어, 상기된 농도로 bFGF를 대체할 수 있거나 이와 함께 함유될 수 있는 것으로 고려된다. 또는, FGF-2 모사 화합물은 실질적으로 또는 본질적으로 동일한 효과를 나타내기 위해 FGF-2를 대체할 수 있다. FGF-2 모사체는 FGF-2 모사 펩타이드, 항체 및 소분자를 포함한다. 예를 들어, 합성 펩타이드 F2A4-K-NS는 시험관내 및 생체내에서 FGF-2의 효과와 유사하고(문헌참조: Lin et al., 2006) 본 발명의 다양한 양태에서 FGF-2를 대체할 수 있다.
FG 루프 (FGL) 펩타이드는 본 발명의 특정 양태에서 사용될 수 있는 FGF-2 모사체의 또 다른 예이다. FGL은 FGFR1에 대한 NCAM의 결합 부위의 일부를 나타내는 제2 F3 모듈의 NCAM에서 15개 아미노산 서열이다. FGL은 FGFR1과 결합하여 이를 활성화시키고 신경돌기 돌출을 자극하는 것으로 나타났다(문헌참조: Kiselyov et al., 2003).
BioSET F2A 펩타이드는 또한 FGF-2를 대체할 수 있다. BioSET F2A 펩타이드는 천연 사람 FGF-2 성장 인자의 합성 모사체이다. BioSET F2A 펩타이드 및 F2A4-KNS 펩타이드는 제조원[FYI Tornier, Inc., 또는 BioSurface Engineering Technologies, Inc. ("BioSET")]으로부터 시판된다. FGF-2 모사 화합물의 조합이 본 발명의 다양한 형태에서 FGF-2를 대체할 수 있는 것으로 고려된다.
4. IL -3
인터류킨-3 (IL-3)은 다능 조혈 세포의 생존, 증식 및 분화에 관여하는 조혈 성장 인자이다. 사람을 포함하는 5종의 포유동물에서, IL-3을 암호화하는 유전자가 분리되었고 성숙한 재조합 단백질을 생성하도록 발현된다. 사람 IL-3 유전자는 2개의 보존된 시스테인 잔기 및 2개의 잠재적인 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는 133개 아미노산의 단백질을 암호화한다(문헌참조: Wagemaker et al., 1990).
특정 양태에서, IL-3은 2.5 내지 약 50 ng/mL, 2.5 내지 약 50 ng/mL, 약 5 내지 약 50 ng/mL, 약 5 내지 약 25 ng/mL, 약 5 내지 약 15 ng/mL, 또는 본원에 유도될 수 있는 임의의 범위의 농도로 본 발명의 배양 배지에 함유된다. 특정 양태에서, IL-3은 약 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 약 30 ng/mL의 농도로 한정 배양 배지에 함유된다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, Flt3 리간드 및 IL-3은 다능성 세포의 조혈 전구 세포의 분화에 대해 공동상승작용을 나타낼 수 있다. 특정 양태에서, IL-3의 함유는 다능성 세포의 분화를 촉진시키기 위해, 다능성 세포의 배양에서 처음 약 1 내지 3주 동안 또는 배지 배양의 약 5일 내지 약 7일 동안 배지에 함유되고 이후 시간에 이것은 분화에 대해 거의 또는 본질적으로 치명적인 영향 없이 시스템으로부터 제거될 수 있다.
5. FLT3 리간드
또한 FLT-3 리간드로서 언급되기도 하는 Flt3 리간드는 FLT3에 대한 내인성 리간드이다. FLT3은 미성숙 조혈 선조 세포에 의해 발현되는 수용체 티로신 키나제이다. FLT3에 대한 리간드는 막관통 또는 가용성 단백질이고 조혈 및 골수 기질 세포를 포함하는 다양한 세포에 의해 발현되며 다른 성장 인자와 조합하여 Flt3 리간드는 줄기 세포, 골수 및 골수 선조 세포, 수지상 세포 및 천연 킬러 세포의 증식 및 발육을 자극할 수 있다. 수용체의 활성화는 조혈 세포에서 증식, 생존 및 다른 과정을 조절하는 상이한 시그날 전달 경로에 관여하는 것으로 공지된 다양한 주요 어댑터 단백질의 티로신 인산화를 유도한다. FLT3 및 FLT3에 영향을 주는 돌연변이는 또한 백혈병의 예후 및 치료와 같은 병리학적 질환에 중요하다(문헌참조: Drexler et al., 2004).
특정 양태에서, Flt3 리간드는 5 내지 약 100 ng/mL, 5 내지 약 50 ng/mL, 약 10 내지 약 30 ng/mL, 약 15 내지 약 30 ng/mL, 약 20 내지 약 30 ng/mL, 또는 본원에서 유도될 수 있는 임의의 범위의 농도로 본 발명의 배양 배지에 함유된다. 특정 양태에서, Flt3 리간드는 약 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 약 50 ng/mL의 농도로 한정 배양 배지에 함유된다. 특정 양태에서, Flt3 리간드는 다능성 세포의 분화를 촉진시키기 위해 다능성 세포의 배양에서 처음 대략 1 내지 3주 동안 또는 배지 배양에서 약 5일 내지 약 7일 동안 배지에 함유되고 이후 시간에 이것은 분화에 대해 거의 또는 본질적으로 치명적 영향을 주는 것 없이 상기 시스템으로부터 제거될 수 있다.
6. 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자
GM-CSF 또는 GMCSF로서 약칭되기도 하는 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자는 대식세포, T 세포, 비만 세포, 내피 세포 및 섬유아세포에 의해 분비되는 단백질이다. GMCSF는 백혈구 세포 성장 인자로서 기능할 수 있고 GMCSF는 과립구(호중구, 호산구 및 호염구) 및 단핵구를 생성하도록 줄기 세포를 자극할 수 있다. 단핵구는 순환계로부터 벗어나 대식세포로 성숙할 수 있다. 따라서, GMCSF는 면역/염증 캐스케이드에서의 역할을 수행할 수 있고 이에 의한 소수의 대식세포의 활성화는 이들의 수를 신속하게 증가시킬 수 있고 이는 감염에 맞서기 위해 중요한 과정이다. GMCSF의 활성 형태는 전형적으로 동종이량체로서 세포외의 생체내에서 발견된다. GMCSF는 또한 효모 세포에서 발현되는 경우 몰그라모스팀(molgramostim) 또는 사그라모스팀(Leukine)으로도 언급된다. 특정 양태에서, 재조합적으로 생성된 성장 인자를 사용하여 다능성 세포의 조혈 분화를 촉진시킬 수 있다.
특정 양태에서, GMCSF는 약 2.5 내지 약 100 ng/mL, 2.5 내지 약 50 ng/mL, 약 5 내지 약 50 ng/mL, 약 5 내지 약 25 ng/mL, 약 5 내지 약 15 ng/mL, 또는 본원에 유도될 수 있는 임의의 범위의 농도로 본 발명의 배양 배지에 함유된다. 특정 양태에서, GMCSF는 약 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 약 30 ng/ml의 농도로 한정 배양 배지에 함유된다. 특정 양태에서, GMCSF 리간드는 다능성 세포의 분화를 촉진시키기 위해 다능성 세포의 배양에서 처음 대략 1 내지 3주 동안 또는 배지 배양에서 약 5일 내지 약 7일 동안 배지에 함유되고 이후 시간에 이것은 분화에 대해 거의 또는 본질적으로 치명적 영향을 주는 것 없이 상기 시스템으로부터 제거될 수 있다.
7. 줄기 세포 인자
줄기 세포 인자(SCF)는 CD117 (c-Kit)와 결합하는 사이토킨이다. SCF는 또한 "KIT 리간드", "c-kit 리간드" 또는 "강철 인자(steel factor)"로서도 공지되어 있다. SCF는 2가지 형태로 존재한다: 세포 표면 결합된 SCF 및 가용성 (또는 유리된) SCF. 가용성 SCF는 전형적으로 메탈로프로테아제에 의한 표면 결합된 SCF의 절단에 의해 생체내에서 생성된다. SCF는 조혈 줄기 세포 및 기타 조혈 선조 세포의 생존, 증식 및 분화를 위해 중요할 수 있다. 생체내에서, SCF는 적혈구 시리즈에서 가장 조기의 적혈구 전구세포인 BFU-E (파열-형성 유닛-적혈구(burst-forming unit-erythroid)) 세포를 CFU-E(콜로니-형성 유닛-적혈구)로 변화시킬 수 있다.
특정 양태에서, SCF는 약 5 내지 약 100 ng/mL, 5 내지 약 50 ng/mL, 약 10 내지 약 30 ng/mL, 약 15 내지 약 30 ng/mL, 약 20 내지 약 30 ng/mL, 또는 본원에서 유도가능한 임의의 범위의 농도로 본 발명의 배양 배지에 함유된다. 특정 양태에서, SCF는 약 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 약 50 ng/mL의 농도로 한정 배양 배지에 함유된다.
8. IL -6
인터류킨-6 (IL-6)은 염증 촉진 사이토킨이다. 생체내에서, IL-6은 T-세포 및 대식세포에 의해 분비되고 염증을 유도하는 외상 또는 다른 조직 손상에 대한 면역 반응을 자극한다. IL-6은 또한 특정 세균에 반응하는 역할을 수행할 수 있고 골아세포는 생체내에서 IL-6을 분비하여 골아세포 형성을 자극한다. 사람에서, 많은 혈관 중막의 평활근 세포는 염증 촉진 사이토킨으로서 IL-6을 생성할 수 있고 IL-6은 열의 중요한 생체내 매개체이다.
특정 양태에서, IL-6은 약 2.5 내지 약 100 ng/mL, 2.5 내지 약 50 ng/mL, 약 5 내지 약 50 ng/mL, 약 5 내지 약 25 ng/mL, 약 5 내지 약 15 ng/mL 또는 본원에 유도가능한 임의의 범위의 농도로 본 발명의 배양 배지에 함유된다. 특정 양태에서, IL-6은 약 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 또는 약 30 ng/mL의 농도로 한정 배양 배지에 함유된다.
9. TPO
트롬보포이에틴, 또는 TPO는 간 및 신장에 의해 생체내에서 주로 생성되는 당단백질 호르몬이고 골수에서 혈소판의 생체내 생성에 관여한다. 특정 양태에서, TPO는 약 2.5 내지 약 100 ng/mL, 5 내지 약 75 ng/mL, 약 10 내지 약 50 ng/mL, 약 15 내지 약 35 ng/mL, 약 25 ng/ml, 또는 본원에서 유도가능한 임의의 범위의 농도로 본 발명의 배양 배지내에 함유된다. 특정 양태에서, TPO는 약 2.5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 약 50 ng/mL의 농도로 한정 배양 배지에 함유된다.
B. 매트릭스 성분
배양 배지는 피브로넥틴 또는 RGD 펩타이드와 같은 하나 이상의 매트릭스 성분을 함유할 수 있다. 어떠한 이론에 얽매이지 않으면서, 매트릭스 성분은 배아 줄기 세포의 성장을 위한 고형 지지체를 제공할 수 있다. 특정 양태에서, 매트릭스 성분은 배양 표면에 적용될 수 있고 세포를 배지에 씨딩하기 전에 배양물과 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 세포는, 세포를 클럼프 또는 개별 세포로 물리적으로 분리하기 전 및 조혈 전구 세포로의 분화를 유도하기 전에 피브로넥틴 또는 Matrigel™으로 피복된 플레이트 상의 한정 배지(예를 들어, TeSR 배지)에서 배양할 수 있다.
콜라겐(예를 들어, 콜라겐 IV), 라미닌, 비트로넥틴, Matrigel™, 젤라틴, 폴리라이신, 트롬보스폰딘 (예를 들어, TSP-1, -2, -3, -4 및/또는 -5), 및/또는 ProNectin-F™을 포함하는 다양한 매트릭스 성분을 사용하여 다능성 세포를 배양할 수 있다. 특정 양태에서, TeSR을 사용하여 이전에 배양된 세포와 함께 단지 Matrigel™, 콜라겐 IV, 또는 라미닌의 사용은 세포 생존성에 대한 가능한 부작용으로 인해 회피될 수 있지만 이들 조성물은 다른 매트릭스 성분과 함께 유리하게 사용될 수 있다. 이들 매트릭스 성분의 배합은 세포 성장 및 세포 생존성을 위해 추가의 이득을 제공할 수 있다. 특정 양태에서, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이상의 상기 매트릭스 성분을 사용하여 예를 들어, 조혈 분화 전에 세포를 배양할 수 있다.
1. RGD 펩타이드
RGD 펩타이드는 한정 세포 배양 배지에서 매트릭스 성분으로서 사용될 수 있다. RGD 펩타이드는 Arg-Gly-Asp(RGD) 서열을 함유하는 접착 단백질이고 특정 RGD 펩타이드는 세포 접착, 이동 및 성장에 중요한 역할을 수행할 수 있다. 특정 이론에 얽매이지 않고 RGD 펩타이드는 피브로넥틴과 유사하게 배앙 줄기 세포에 대한 물리적 기질을 제공하여 배아 줄기 세포의 분화 및 성장을 가능하게 한다. 특정 양태에서, 합성 RGD 펩타이드는 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
RGD 펩타이드는 예를 들어, 약 0.05-0.2 mg/mL 또는 약 0.1 mg/mL의 농도로 한정 배양 배지에 함유될 수 있다. 특정 양태에서, 프로넥틴(ProNectin) F를 사용하여 세포 배양을 위한 표면을 피복시킬 수 있다. 프로넥틴 F (PnF)는 아르기닌-글라이신-아스파르트산(RGD)의 13개 부위를 함유하는 시판되는 RGD 펩타이드이다.
C. ROCK 억제제 및 PKC 억제제
본 발명의 또 다른 추가의 측면에서, 세포의 분리 후(예를 들어, 세포 집단의 이탈(splitting) 후 또는 EB 형성 전) ES 세포 아폽토시스를 감소시키거나 생존을 촉진시키는 분자와 같은 추가의 배지 성분이 ES 세포 성장 배지에 함유될 수 있다. 한정 배양 배지를 사용하여 ES 세포를 씨딩하거나, 배양하거나, 유지하거나 분화시킬 수 있고 Rho-독립적 키나제 (ROCK)의 억제제 및/또는 단백질 키나제 C(PKC)의 억제제를 함유할 수 있다. 특정 양태에서, ROCK 억제제 및/또는 PKC 억제제를 사용하여 개별화 후 다능성 세포의 생존 및 분화 효율을 증진시킬 수 있다. 특정 양태에서, ROCK 억제제 및/또는 PKC 억제제는 TeSR 또는 mTeSR 배지 및 매트릭스 성분을 포함하는 씨딩 배지에 함유될 수 있다.
특정 양태에서, 한정 배지 배양은 하나 이상의 Rho-연합된 키나제(ROCK) 억제제, 예를 들어, Y-27632 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다. 추가로, 몇몇 측면에서, 한정 배지는 HA-100을 포함할 수 있다:
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또는 이의 유도체.
HA-100 또는 Y-27632는 약 1-15 μM, 5-15 μM, 1-30 μM, 5-30 μM, 또는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 μM, 또는 본원에 유도가능한 임의의 범위의 농도로 ES 세포 성장 배지에 존재할 수 있다. 특정 양태에서, HA-100 또는 Y-27632는 약 10-20 μM로 ES 세포 성장 배지에 존재한다.
본 발명에 따른 ES 세포 성장 배지에 함유될 수 있는 다른 ROCK 억제제는 H-1152 ((S)-(+)-2-메틸-1-[(4-메틸-5-이소퀴놀리닐)설포닐]호모피페라진)을 포함한다. H-1152는 HA-100보다 약 10배 초과의 효능을 나타낸다. 따라서, H-1152는 예를 들어, 약 0.1-10μM, 약 0.5-5 μM, 약 1-3 μM, 또는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 또는 5 μM, 또는 본원에서 유도가능한 임의의 범위의 농도로 ES 세포 성장 배지에 존재할 수 있다. 특정 양태에서, HA-100은 약 1 μM로 ES 세포 성장 배지에 존재한다. H-1152는 HA-100과 유사하지만 10배 낮은 농도로 96웰 플레이트에서 개별화된 사람 ES 세포의 매우 효율적인 씨딩을 가능하게 한다. 또한 세포 군집으로 계대된 개별화된 HES 세포는 웰당 보다 균일한 세포 밀도를 가능하게 하고 이는 세포 기반 소분자 스크리닝을 위한 엄격한 전제 조건이다. 따라서 H-1152는 본 발명에 따른 자동화 세포 배양을 포함하는 ES 세포 기반 소분자 스크리닝을 위한 프로토콜에서 사용될 수 있다. H-1152는 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참조: Ikenoya et al. (2002) and Sasaki et al. (2002)]에 이전에 보고되었다.
Figure 112011074239247-pct00004
ES 세포 성장 배지에 함유될 수 있는 다른 ROCK 억제제는 Y-27632, N-(4-피리딜)-N'-(2,4,6-트리클로로페닐)우레아, 3-(4-피리딜)-1H-인돌, 글리실-H1152 ((S)-(+)-2-메틸-4-글라이실-1-(4-메틸이소퀴놀리닐-5-설포닐)호모피페라진) 및/또는 HA1100 (하이드록시파우스딜)을 포함한다. Y-27632 ((R)-(+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드)는 제조원[Sigma-Aldrich]으로부터 시판되고 이전에 보고되었다[문헌참조: Maekawa et al., 1999; Davies et al., 2000)].
Figure 112011074239247-pct00005
세포 생존을 촉진시키기 위해 사용될 수 있는 예시적인 ROCK 억제제는 HA100, H1152, (+)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-1-(피리딘-4-일아미노카보닐)사이클로헥산 디하이드로-클로라이드 1수화물 (예를 들어, WO00078351, WO00057913), 이미다조피리딘 유도체(예를 들어, US7348339), 치환된 피리미딘 및 피리딘 유도체(예를 들어, US6943172) 및 치환된 이소퀴놀린-설포닐 화합물(예를 들어, EP00187371)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
PKC 억제제는 ROCK 억제제와 함께 사용되거나 ROCK 억제제의 대용물로서 사용될 수 있는 것으로 예상된다. 예를 들어, PKC 억제제를 사용하여 예를 들어, 조혈 전구 세포로의 분화 전에 다능성 세포의 분리 또는 개별화 후 세포 생존을 촉진시킬 수 있다. 사용될 수 있는 PKC 억제제는 예를 들어, V5 펩타이드(예를 들어, US7459424), 폴리믹신 B, 칼포스틴 C, 팔미토일-DL-카르니틴, 스테아로일카르니틴, 헥사데실포스포콜린, 스타우로스포린 및 이의 유도체, 상기바마이신; 사핀골, D-에리트로-스핑고신; 켈레리트린 클로라이드, 멜리틴; 데쿠알리늄 클로라이드; 엘라그산, HBDDE, 1-O-헥사데실-2-O-메틸-rac-글리세롤, 하이퍼신, K-252, NGIC-J, 플로레틴, 피세아타놀, 타목시펜 시트레이트, 치환된 피페라진 및 티아진(예를 들어, US6815450)를 포함한다.
D. 다른 성분
한정 배양 배지는 또한 영양물, 아미노산, 항생제, 완충제 등과 같은 추가의 성분을 함유할 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 한정 배양 배지는 비필수 아미노산, L-글루타민, 펜-스트렙(Pen-strep) 및 모노티오글리세롤을 함유할 수 있다.
BIT 9500 (제조원: StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canada)은 또한 본 발명의 한정 배양 배지에 예를 들어, 약 10% 내지 약 30%의 양으로 또는 약 20%의 양으로 함유될 수 있다. BIT 9500은 이스코브의 MDM(Iscove's MDM)에서 소 혈청 알부민, 인슐린 및 트랜스페린(BIT)의 예비 시험된 배치를 함유한다. BIT 9500은 50 mg/mL의 소 혈청 알부민(NaHCO3로 완충시킴), 50 μg/mLrh 인슐린, 1 mg/mL의 사람 트랜스페린(철 포화됨)을 함유한다. 특정 양태에서, KOSR은 한정 배지가 요구되지 않는 양태에서 BIT 9500을 대체할 수 있다. KOSR은 시판되는 비한정 배지(제조원: Gibco/Invitrogen, 카탈로그 # 10828)이고 이전에 문헌[참조: WO98/30679]에 보고되었다.
상기된 바와 같은 BIT의 사용은 HIT로 대체될 수 있고; HIT는 혈청 알부민과 같은 성분들이 사람 성분(예를 들어, 사람 혈청 알부민)인 것을 제외하고는 BIT에 대해 기재된 조성을 포함한다. 예를 들어, HIT의 사용은 가능한 감염 등의 위험이 우려되는 양태에서 바람직할 수 있다.
혈청 대체물 3(Serum Replacement 3) (제조원: Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)은 또한 BIT 9500을 대체할 수 있다. 혈청 대체물 3은 단지 사람 단백질(즉, 사람 혈청 알부민, 사람 트랜스페린, 사람 재조합 인슐린)을 함유한다. 혈청 대체물 3은 성장 인자, 스테로이드 호르몬, 글루코코르티코이드, 세포 접착 인자, 검출가능한 Ig 또는 마이토겐을 함유하지 않는다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 혈청 대체물 3의 함유는 특정 양태에서 분화를 추가로 촉진시킬 수 있다.
다양한 양태에서, 한정 배양 배지는 하나 이상의 비타민, 미네랄, 염, 지질, 아미노산 또는 다른 성분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 한정 배지는 예를 들어, TeSR에 함유되는 바와 동일하거나 이에 상응하는 농도로 TeSR 배지에 존재하는 하나 이상의 성분을 함유할 수 있다.
VIII . 세포의 분리
배아 줄기 세포로부터 조혈(예를 들어, CD34+, CD43+) 전구 세포 또는 내피 세포(예를 들어, CD31+)의 제조 후, 추가로 또는 실질적으로 분화된 세포(예를 들어, 조혈 전구 세포, 내피 세포 등)의 하나 이상의 아집단을 세포 집단으로부터 실질적으로 정제하거나 분리하는 것이 바람직할 수 있다. FACS 또는 자기 활성화된 세포 분류와 같은 유동 세포 측정기를 사용한 세포의 분리 방법을 사용하여 이종성 세포 집단으로부터 조혈 세포를 분리할 수 있다.
A. 자기 활성화된 세포 분류 ( MACS )
CD34+, CD43+, CD31+, 및/또는 CD45+ 세포는 자기 활성화된 세포 분류기(MACS)를 사용하여 분화된 hESC로부터 분리될 수 있다. MACS는 전형적으로 자기 비드와 함께 항-CD34 항체와 같은 항체를 사용하여 칼럼 상에서 세포를 분리한다. MACS는 특정 양태에서, FACS에 비해, FACS와 연관된 세포의 레이저 조사로 인해 세포에 대해 보다 온화할 수 있고 세포 생존성 및 통합성에 유리한 영향을 미칠 수 있다.
다양한 MACS 제품이 시판되고 있고, 제조업자의 지침에 따라 사용될 수 있는 MACS MicroBeads™ 칼럼 또는 AutoMACS™ (제조원: Miltenyi Biotec, CA, USA)을 포함한다. PBS/0.5% BSA (EDTA 부재)는 세포 분리용 완충제로서 사용될 수 있다. 몇몇 실험에서, Dead Cell Removal Kit(제조원: Miltenyi Biotec)를 사용하여 CD34+ 세포의 분리 전에 죽은 세포를 제거할 수 있다. 반복적인 MACS 칼럼이 필요에 따라 사용될 수 있다.
B. FACS
형광 활성화된 세포 분류(FACS)를 또한 사용하여 CD34+ 세포를 분리할 수 있다. FACS는 예를 들어, 세포를 분리하기 위한 형광 태그를 포함하는 항-CD34 항체가 결합되어 있어 세포가 나타내는 정도 또는 형광성을 사용한다. 이러한 방식으로 FACS를 사용하여 이종성 세포 집단으로부터 조혈 CD34+ 세포를 분리할 수 있다.
예를 들어, 하기의 프로토콜을 사용하여 FACS를 수행하여 조혈 세포를 정량할 수 있다. 세포는 1% FBS 또는 0.5% BSA를 함유하는 PBS 중에서 제조할 수 있고, CD31-PE (클론 WM-59), CD34-APC (클론 581, 8G12), CD45-FITC (클론 HI30) (이 모두의 제조원: BD PharMingen), 및 KDR-PE (클론 89106) (제조원: R&D system)와 같은 조합된 모노클로날 항체(mAb)와 함께 4℃에서 15분 내지 30분 동안 표지시킨다. 특이적 항체에 대해 1:50 희석물을 사용할 수 있고 IgG 대조군에 대해 1:200 희석물을 사용할 수 있다. 상기 샘플은 FACSCalisbur™ (제조원: Becton-Dickson, New Jersey, U.S.A.)에 의해 분석할 수 있다.
IX . 생물반응기 및 로롯 자동화
줄기 세포의 배양 및 배아 줄기 세포 기원의 조혈 선조 세포의 분화를 위한 하나 이상의 단계는 자동화될 수 있다. 로봇 또는 다른 자동화를 사용한 방법의 자동화는 세포의 제조, 배양 및 분화를 위해 보다 효율적이고 경제적인 방법을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 로봇 자동화는 사람 배아 줄기 세포, 계대, 배지의 첨가, 분화 배지의 첨가, 분화 배지에서의 배양 및 예를 들어, 자기 분리 또는 FACS를 사용한 세포 유형의 분리중 하나 이상과 연계하여 사용될 수 있다.
생물반응기는 또한 본 발명과 연계하여 사용하여 본 발명에 따른 세포(예를 들어, 사람 배아 줄기 세포, CD34+ 세포, 조혈 세포 등)를 배양, 유지 및/또는 분화시킬 수 있다. 생물반응기는 증가된 양의 세포를 제조하기 위해 공정의 "스케일 업"을 가능하게 한다는 이점을 제공한다. 다양한 생물반응기가 본 발명에 사용될 수 있고 배치 생물반응기, 유가식 생물반응기, 연속 생물반응기(예를 들어, 연속 교반 탱크 반응기 모델) 및/또는 물질환경조절 장치(chemostat)를 포함한다.
예를 들어, 스피너 플라스크를 사용하여 다능성 세포의 유지 및/또는 분화를 위한 방법을 스케일 업하여 증가된 수의 세포의 생성을 가능하게 한다. 특정 양태에서, 하기의 프로토콜을 사용하여 스피너 플라스크에서 EB 형성을 촉진시킬 수 있다: 미분화된 hESC 및 iPSC는 Matrigel 피복된 플레이트 상에서 공급 유리 성장에 적응될 수 있고 예를 들어, 약 37℃에서 약 5분 동안 TrypLE 처리를 사용하여 컨플루언스 시점에서 수거될 수 있다. 상기 세포는 약 20% BIT9500 (제조원: Stem Cell Technologies) 또는 혈청 대체물 3(Serum Replacement-3) (제조원: Sigma Aldrich), 약 1% NEAA, 약 1 mM L-글루타민, 및 약 0.1 mM 머캅토에탄올, 약 0.75% BSA, 약 50 ug/ml의 아스코르브산 및 약 1μM ROCK 억제제 (예를 들어, H-1152)가 보충된 IMDM를 함유하는 EB 기본 배지에서 수거될 수 있다. 이어서 상기 세포는 ml당 약 50만개 내지 2백만개의 세포의 밀도로 스피너 플라스크(예를 들어, 125ml Corning)에 위치할 수 있다. 상기 스피너는 밤새 30 내지 40rpm으로 설정하여 EB 형성을 촉진시킬 수 있다. 또는 상기 세포는 저 접착 플레이트에서 24시간 동안 정적 조건하에 놓일 수 있다. 일반적으로 세포 밀도 및/또는 스피너 플라스크 움직임 속도는 사용되는 특정 스피너 플라스크 또는 생물반응기에 따라 다양할 수 있는 것으로 인지된다. 약 12시간 내지 24시간 배양 후, 세포는 예를 들어, 약 60RPM의 속도로 회전시키면서 스피너 플라스크에서 자기 교반 플랫폼 상에서 ROCK 억제제 없이 사이토킨을 함유하는 EB 분화 배지에 놓일 수 있다. 스피너 플라스크의 측면 캡은 가스 전달을 가능하게 하기 위해 느슨하게 할 수 있다. 상기 세포는 약 50 ng/ml 골 형성 인자(BMP-4), 약 50 ng/ml 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 약 25 ng/ml 제브라피쉬 FGF-2가 보충된 EB 기본 배지에 놓을 수 있다. 분화 약 4일째에 스피너 플라스크가 현탁된 EB 응집체가 15 내지 20분 동안 플라스크 기저부에 침강하도록 방치함에 의해 세포가 공급될 수 있다. 이어서 소비된 배지는 흡인 제거될 수 있다(예를 들어, 약 20ml가 125ml 스피너에 유지되도록 하면서). 이어서 상기 세포는 약하게 와동시키고 약 50ng/ml 골 형성 인자(BMP-4), 약 50 ng/ml, 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 약 25 ng/ml 제브라피쉬 FGF-2를 함유하는 새로운 배지를 세포에 첨가할 수 있다. 상기 스피너 플라스크는 전체 조혈 분화 공정을 거쳐 약 40 내지 60rpm의 속도로 설정할 수 있지만 실질적으로 보다 높거나 낮은 회전 속도가 사용될 수 있다. 분화 약 5일 내지 6일째에, 상기 소비된 배지는 상기한 바와 같이 흡인 제거하고 세포는 예를 들어, (1) 약 25 ng/ml의 Flt-3 리간드, 약 10 mg/ml의 IL-3 및 약 10 ng/ml의 GMCSF, 또는 (2) 약 25 ng/ml의 Flt-3 리간드, 약 25 ng/ml의 SCF, 약 25 ng/ml의 TPO, 약 10 ng/ml IL-3, 및 약 10 ng/ml IL-6가 보충된 EB 기본 배지에 위치시킬 수 있다. 소비된 배지는 상기된 바와 같이 약 8일 및 10일째에 흡인 제거될 수 있다. EB 배양물은 분화 약 12일째에 수거할 수 있다. 세포는 표면 마커 (예를 들어, CD34+, CD45+, CD43+, CD41+, CD235a+, CD31+)의 표현형 발현을 위해 염색시켜 집단의 조혈 선조세포 함량을 정량할 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 이들 방법은 다양한 세포 계통(예를 들어, 적혈구, 거핵세포, 대식세포, 수지상 세포, 비만 세포, 과립구)를 생성시키는데 성공적으로 사용될 수 있고 유사한 결과는 iPS 세포 또는 hESC를 사용하여 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용하기 위해 구체적으로 고려되는 로봇 자동화는 예를 들어, 제조원(Tecan (CA, USA))으로부터 구입할 수 있다. 로봇은 샘플간의 캐리 오버(carry-over)를 최소화하기 위해 캡-천공 프로브 및 1회용 팁과 같은 액체 핸들링 도구를 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 로봇은 세포를 배양하기 위해(예를 들어, hESC의 유지 또는 성장 동안에, hESC의 조혈 세포로의 분화 동안에 또는 조혈 세포의 적혈구 등과 같은 후속 계통으로의 분화 동안에) 하나 이상의 생물반응기와 연계하여 사용될 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 조혈 전구 세포의 유지 및 생성을 위한 조건은 Tecan Cellerity™ 시스템(산업적 관련 로봇 플랫폼)을 사용하여 적어도 부분적으로 또는 완전히 자동화될 수 있다. Tecan Cellerity™은 Tecan 액체 핸들링 로봇(Freedom EVO 200), 500 Roboflasks™에 대한 용량을 갖는 자동화 배양기(Storex500), 배지 저장 냉장기, 세덱스(Cedex) 세포 계수기, 현탁 세포의 증식 및 씨딩을 위한 스피너 플라스크 및 핸들 플레이트 및 8-채널 고정된 팁 피펫에 대한 ROMA 로봇 암(arm)이 장착된다. EB 분화 프로토콜의 일부, 본질적으로 전부 또는 전부가 자동화될 수 있다. 예를 들어, 분화 12일째에 상기 세포는 Tecan Cellerity 시스템에 의해 수거될 수 있고 마커의 세포 표면 염색을 위해 수동으로 세척될 수 있다. 염색 후, 상기 세포는 Accuri 유동 세포 측정기에 연결된 하이퍼사이트(Hypercyt)를 사용하여 분석할 수 있다. 상기 방법은 조혈 전구세포 집단의 고속 처리 스크리닝을 위해 사용될 수 있다. 특정 양태에서, 미분화된 hESC 또는 iPSC는 예를 들어, 상기된 방법을 통해 Matrigel™ 피복된 로보플라스크(Corning)을 사용하여 로봇 상에서 배양될 수 있다. EB의 유지, 씨딩, 공급 및/또는 수거는 예를 들어, Tecan Cellerity™ 시스템을 사용하여 부분적으로 또는 완전히 자동화될 수 있다. 상기 로봇은 스피너 플라스크 또는 생물반응기를 함유할 용량을 갖고 대량의 세포를 생성시키는데 사용될 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 방법을 소형화화거나 "스케일 다운"하는데 유용할 수 있다. 이들 방법은 특히 예를 들어, 방법이 세포의 특정 계통에 대한 탈분화 또는 분화를 촉진시킬 수 있는 화합물의 고속 처리 스크리닝을 포함하는 경우 유용할 수 있다. 고속 처리 스크리닝은 또한 후보 물질의 하나 이상의 성질(예를 들어, 독성, 분화를 촉진시키거나 감소시키는 능력 등)을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법의 소형화는 저 접착 플레이트(예를 들어, 96웰 플레이트)의 사용 및/또는 낮은 산소(예를 들어, 약 25% O2 또는 약 5% O2) 조건하에서의 세포의 배양을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 하기의 방법을 사용할 수 있다: Matrigel 피복된 플레이트 상에서 공급 부재 성장에 적응된 미분화된 hESC 또는 iPSC는 약 0.1 ng/ml TGF 및 약 20 ng/ml 제브라피쉬 FGF가 보충된, 성장 인자가 부재인 TeSR을 사용하여 24시간 동안 예비조건화시킬 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 약 37℃에서 약 5분 동안의 TrypLE 처리를 사용하여 컨플루언스 시점에 수거될 수 있다. 상기 세포는 약 20% BIT9500 또는 혈청 대체물 3(Serum Replacement-3), 약 1% NEAA, 약 1 mM L-글루타민, 및 약 0.1 mM 머캅토에탄올, 약 0.75% BSA, 약 50 μg/ml 아스코르브산 및 약 1μM ROCK 억제제 (예를 들어, H-1152)가 보충된 IMDM을 함유하는 EB 기본 배지에서 수거될 있다. EB 형성을 개시하기 위해, 상기 세포는 ROCK 억제제를 함유하는 EB 기본 배지에서 웰당 약 10만개의 세포의 밀도로 저 접착 96웰 플레이트에 놓일 수 있다. 사용되는 세포의 정확한 농도는 유사한 효과를 달성하기 위해 다양할 수 있는 것으로 평가된다. EB 형성은 또한 낮은 O2 조건하에서 상기 플레이트를 배양함에 의해 촉진시킬 수 있다. 약 12시간 내지 24시간 후 상기 세포는 약 50 ng/ml 골 형성 인자 (BMP-4), 약 50 ng/ml 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 약 25 ng/ml 제브라피쉬 FGF-2를 함유하는 EB 분화 배지에 놓일 수 있다. 배지 약 300 μl는 예를 들어, 96웰 플레이트에서 웰당 사용될 수 있다. 분화 약 3 내지 4일째에, 상기 세포는 소비된 배지의 용적의 절반을 서서히 제거하고(예를 들어, 100 내지 150 μl) 동일 용적의 새로운 배지를 첨가함에 의해 절반이 공급될 수 있다. 분화 약 5-6일째에, 소비된 배지는 상기된 바와 같이 흡인제거될 수 있고 상기 세포는 예를 들어, (1) 약 25 ng/ml의 Flt-3 리간드, 약 10 mg/ml의 IL-3 및 약 10 ng/ml의 GMCSF, 또는 (2) 약 25 ng/ml의 Flt-3 리간드, 약 25 ng/ml의 SCF, 약 25 ng/ml의 TPO, 약 10 ng/ml의 IL-3, 및 약 10 ng/ml IL-6을 함유하는 배지가 보충된 EB 기본 배지에 놓일 수 있다. 분화 EB 배양은 상기된 바와 같이 분화 약 8일 및 10일째에 새로운 배지가 절반 공급될 수 있다. EB 배양은 분화 약 12일째에 수거될 수 있다. 하기 실시예에 나타낸 바와 같이, 이들 방법은 다양한 세포 계통(예를 들어, 적혈구, 거핵세포, 대식세포, 수지상 세포, 비만 세포, 과립구)를 생성시키는데 성공적으로 사용될 수 있고 유사한 결과는 iPS 세포 또는 hESC를 사용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 방법은 단일 세포가 플레이트에 접착하도록 세포를 유도하기 위해 배지에 ROCK 억제제 HA100 및/또는 H1152를 포함시키고 로봇 자동화를 사용하는 단일 세포 분석에 사용될 수 있다. 로봇 상에 배양 시스템으로 소분자 HA100 또는 H1152 또는 Y-27632를 첨가하여 ES, hESC 및 iPS 세포를 포함하는 다능성 세포의 가변성을 크게 개선시킬 수 있다. 특정 양태에서, TeSR 배지에서 다능성 세포의 생존은 특히 세포가 단백질분해적으로 또는 기계적으로 클럼프로 분리되거나 개별화된 후 ROCK 억제제 또는 PKC 억제제의 함유로 개선될 수 있다. ROCK 억제제는 개별화된 hES 세포가 표면에 부착하여 성장하는 것을 촉진시킬 수 있다. 조혈 전구 세포 또는 특이적 조혈 계통으로의 분화 뿐만 아니라 다능성 세포의 유지 또는 증식 과정의 일부 또는 전부가 자동화될 수 있다. 자동화된 방법 전부 중 일부는 한정된 조건을 사용할 수 있다.
X. 키트
본 발명은 또한 본 발명에 따라 사용하기 위한 키트를 고려한다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 밀봉된 바이알에서 본원에 기재된 바와 같은 분화 배지를 포함할 수 있다. 상기 키트는 다능성 줄기 세포, 선조 세포, 조혈 선조 세포 또는 내피 선조 세포와 같은 세포를 포함할 수 있다.
상기 키트는 또한 조혈 선조 세포 또는 내피 선조 세포와 같은 선조 세포를 생성하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 또한, 상기 지침서는 조혈 세포, 내피 세포, 비만 세포, 수지상 세포, 거핵 세포, 과립구, 대식세포 또는 적혈구를 생성시키는 것에 관한 것일 수 있다.
적합한 키트는 적합한 용기 및 튜브, 바이알 및 수축 포장되고 블로우 성형된 패키지를 포함하는 패키징 재료에서 본 발명에 따라 사용하기 위한 다양한 시약을 포함한다. 본 발명에 따라 키트에 함유되기에 적합한 재료는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 한정 배지 및 하나 이상의 세포(여기서, 세포는 다능성 세포 또는 본원에 기재된 방법에 따라 적어도 부분적으로 분화된 다능성 세포이다)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 바람직한 양태에서, 다수의 다능성 세포 또는 적어도 부분적으로 분화된 세포는 본 발명에 따른 키트에 포함된다.
XI. 스크리닝 분석
본 발명은 다능성 줄기 세포의 선조 세포로의 분화를 촉진시키는 능력에 대한 후보 물질을 확인하기 위해 유용한 스크리닝 분석과 같은 스크리닝 분석을 고려한다. 예를 들어, 조혈 세포, 조혈 전구 세포, 및/또는 내피 세포를 사용하여 후보 물질의 약리학 및/또는 독성학을 평가할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 방법을 통해 분화된 세포를 사용한 스크리닝 방법을 사용하여 세포에 영향을 줄 수 있는 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 완화시킬 수 있는 치료학적 화합물을 확인할 수 있다. 다른 양태에서, 상기 분화된 세포는 세포내 독성을 유발하는 화합물을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 또는, 상기 스크리닝 방법은 세포를, 세포의 분화 또는탈분화를 촉진시킬 수 있는 후보 물질에 노출시킴을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "후보 물질"은 다능성 줄기 세포의 선조 세포로의 분화를 촉진시키는 임의의 물질을 언급한다. 후보 물질은 천연적으로 존재하는 화합물의 단편 또는 일부를 포함할 수 있거나 단지 비활성인 공지된 화합물들의 활성 조합물로서 발견될 수 있다. 하나의 양태에서, 후보 물질은 소분자이다. 또 다른 양태에서, 후보 물질은 작은 유기 분자, 펩타이드 또는 이의 단편, 펩타이드형 분자, 핵산, 폴리펩타이드, 펩타이드모사체, 탄수화물, 지질, 단백질, 효소, 염, 아미노산, 비타민, 매트릭스 성분, 억제제, 항생제, 항체, 항체 단편, 미네랄, 지질 또는 다른 유기(탄소-함유) 또는 무기 분자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
XII. 약제학적 제제
본원에 기재된 방법을 통해 분화되거나 본원에 기재된 방법을 통해 분화된 세포로부터 유래된 세포는 약제학적 제제에 함유되고 사람 환자와 같은 피검체에 투여될 수 있다. 상기 약제학적 제제는 특정 양태에서 비경구적으로 또는 정맥내로 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효량의 하나 이상의 조혈, 골수 또는 적혈구 세포 또는 약제학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산되는 추가의 제제를 포함한다. 용어 "약제학적으로 또는 약리학적으로 허용되는"은 적합하게는 예를 들어 사람과 같은 동물에 투여되는 경우 부작용, 알레르기 또는 다른 부적합한 반응을 유발하지 않는 분자 실체 및 조성물을 언급한다. 하나 이상의 조혈, 골수 또는 적혈구 세포 또는 추가의 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물의 제조는 본원에 참조로서 인용되는 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed., by University of the Sciences in Philadelphia]에 예시된 바와 같이 본원의 기재 관점에서 당업자에게 공지되어 있다. 더욱이, 동물(예를 들어, 사람) 투여에 대해 상기 제제는 기관[FDA Office of Biological Standards]에 의해 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열성, 일반적인 안전성 및 정제 표준을 충족해야만 하는 것으로 이해된다. 일반적으로, 상기 약제학적 제제는 전형적으로 제형에 존재하는 조혈, 골수 또는 적혈구 세포의 생존성을 촉진시키도록 제형화되는 것으로 평가된다. 예를 들어, 특정 양태에서, 상기 조성물은 사람 환자에 대한 정맥내 투여용 용액내 적혈구 세포를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 약제학적 유효량의 선조 세포, 조혈 세포 또는 내피 세포를 피검체에 투여함에 의해 질환, 장애 또는 손상을 치료하는 방법을 추가로 고려한다. 본 발명에 따른 상기 조성물의 투여는 표적 조직이 상기 경로를 통해 가용한 한 임의의 일반적인 경로를 통한 것이다. 이것은 정맥내 주사, 척수내 주사 또는 뇌, 표피내, 피하, 근육내 또는 복강내 방법을 포함하는 전신 또는 비경구 방법에 의한 투여를 포함한다. 치료제의 성질에 따라 투여는 또한 경구, 비강, 협측, 질내 또는 국소적 수단을 통한 것일 수 있다.
본원에 기재된 방법에 의해 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 혈관 질환 또는 장애, 면역학적 질환 또는 장애, 신경 질환 또는 장애, 혈관 질환 또는 장애, 또는 손상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
XIII . 실시예
하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 양태를 입증하기 위해 포함된다. 당업자는 후속 실시예에 기재된 기술이 본 발명의 수행에서 양호하게 기능하는 것으로 본 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내고 따라서 본 발명의 수행을 위해 바람직한 모드를 구성하는 것으로 고려될 수 있는 것으로 인지해야만 한다. 그러나, 당업자는 본원의 기재 관점에서 많은 변화가 기재된 특정 양태에서 만들어질 수 있고 여전히 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 수득할 수 있는 것으로 인지해야만 한다.
실시예 1
EB의 제조: Matrigel™ 피복된 플레이트 상에서 공급 부재 성장에 적응된 미분화된 hESC 및 iPSC는 37℃에서 10분 동안 콜라게나제 IV(1mg/ml) 처리를 사용하여 컨플루언스 시점에 수거하였다. 상기 웰은 배양 후에 콜라게나제가 없도록 세척하고 EB 기본 배지에서 웰을 박리시켜 EB를 형성하였다. 상기 배지는 다음 날 상이한 사이토킨 제형을 함유하는 EB 분화 배지로 갈아주었다.
Matrigel™ 피복된 플레이트 상에 공급 부재 성장에 적응된 미분화된 hESC 및 iPSC는 37℃에서 6분 동안 TrypLE™ 처리를 사용하여 컨플루언스 시점에서 수거하였다. 웰내 TrypLE™는 1μM ROCK 억제제, 대두 트립신 억제제 (0.25mg/ml)를 함유하는 "EB 기본 배지"를 사용하여 중화시켰다. 상기 세포를 수거하고 1μM ROCK 억제제, 대두 트립신 억제제 (0.25mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 세척하였다. 상기 세포를 계수하여 생존성을 조사하고 1μM ROCK 억제제, 대두 트립신 억제제 (0.25mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 저 접착 플레이트에 분주하였다. 상기 배지는 다음 날 상이한 사이토킨 제형을 함유하는 EB 분화 배지로 갈아주었다.
EB 형성 및 분화 프로토콜: 상기 언급된 효소를 사용한 EB 형성을 촉진시키기 위해 상기 세포를 20% BIT9500 (Stem Cell Technologies), 1% NEAA, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM 머캅토에탄올 (전부 제조원(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로부터 구입됨), 0.75% BSA, 50ug/ml 아스코르브산이 보충된 IMDM을 함유하는 "EB 기본 배지"에서 밤새 배양을 위해 6웰 저 접착 플레이트에 이전시켰다. 다음 날 세포를 각각의 웰로부터 수거하고 원심분리하였다. 상기 세포를 하기의 성장 인자 및 사이토킨이 보충된 EB 기본 배지로 이루어진 "EB-분화 배지"에 재현탁시켰다: 50 ng/ml의 골 형성 인자(BMP-4), 50 ng/ml의 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 25 ng/ml의 줄기 세포 인자(SCF); 25 ng/ml의 Flt-3 리간드(Flt-3L), 10 ng/ml의 인터류킨-3 (IL-3), 10 ng/ml의 인터류킨-6 (IL-6), 20 ng/ml의 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF 또는 GCSF); 20 ng/ml의 과립구 대식세포, 콜로니 자극 인자(GM-CSF 또는 GMCSF), 0.2U/ml의 에리트로포이에틴 (EPO), 25 ng/ml의 트롬보포이에틴(TPO) (전부 제조원(R&D Systems, Minneapolis, MN)으로부터 구입됨), 및 25 ng/ml의 제브라피쉬 FGF-2. 상기 배지는 EB 배지를 15ml 튜브로 이전시키고 응집체가 5분 동안 침강하도록 함에 의해 4일마다 갈아주었다. 상기 현탁액을 흡인 제거하고 새로운 분화 배지로 대체하였다. 또한 2일마다 상기 세포에 새로운 배지를 절반 공급하였다. 상기 세포를 분화 과정 동안에 상이한 시점에서 수거하고 표현형은 유동 세포측정에 의해 평가하고 기능적 능력은 CFU 분석을 사용하여 평가하였다.
유동 세포 측정: 세포를 각각의 웰/조건으로부터 수거하고 배지로 1회 세척하였다. 상기 세포 펠릿은 37℃ 배양기에서 5 내지 10분 동안 TrypLE™ 또는 0.5% 트립신을 사용하여 분해함에 이어서 배지로 세척하고 70-μm 세포 스트레이너(strainer)를 통해 통과시켰다. 상기 세포를 PBS-FBS 함유 FACS 완충액 중에 재현탁시키고 세포 생존성을 평가하기 위해 계수하고 플루오로크롬 접합된 모노클로날 항체로 염색시켰다: 항-사람 CD43 (1G10), 항-사람 CD31 (WM-59), 항-사람 CD41 (HIP8); 항-사람 CD45 (HI30) 및 항-사람 CD34 (581, 8G12) (BD Biosciences San Jose, CA); 항-사람 flk-1 (89106), (제조원(R&D Systems, Minneapolis, MN)). 비생존 세포는 7-아미노액티노마이신 D (7-AAD, BD Biosciences)로 배제하였다. 생존 세포 분석은 FACSCalibur™ 또는 Accuri 유동 세포측정기 및 Cell Quest 소프트웨어 상에서 수행하였다.
클론형성 조혈 선조세포 분석 ( CFU 분석): EB는 TryplE 또는 0.5% 트립신/EDTA를 사용하여 단일 세포 현탁액에 분산시켰다. 생존 세포를 정량하고 분주(ml당 50,000-300,000개 세포)하고, 줄기 세포 인자 (SCF) 50 ng/mL, 에리트로포이에틴 (EPO) 3 U/mL, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 10 ng/mL, 인터류킨-3 (IL-3) 10 ng/mL를 함유하는 사람 메틸셀룰로스 완전 배지(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 사용하여 조혈 CFC에 대한 습화된 챔버에서 분석하였다. 14일 후, 상기 콜로니를 이들의 방법에 따라 스코어링하고 분주된 105 세포당 콜로니를 정량하였다. 혈청 함유 또는 혈청 부재 MethoCult™ 배지 (Stem Cell Technologies)를 사용하여 콜로니를 생성시킬 수 있다.
사이토프스핀 : 세포를 제조업자의 지침에 따라 고정시키고 Wright-Giemsa 시약(Hema 3 스타틴; Fisher Scientific, Hampton, NH)으로 염색시켰다.
실시예 2
배상체(EB)로 명명되는 클러스터로 유도된 사람 배아 줄기 세포(hESC) 또는 iPSC의 시험관내 응집은 내배엽, 중배엽 및 외배엽 계통을 나타내는 세포의 분화를 가능하게 한다. EB 형성을 위한 상기 확률 과정(stochastic process)은 외인성 성장 인자의 첨가에 의해 조혈 전구 세포 유형을 생성하도록 조정할 수 있다.
본 발명자는 분화의 9일 내지 13일간에 세포 표면 상에 CD43+, CD34+, CD31+ 및 CD45+을 발현하는 조혈 전구 세포를 생성시키는 5개 필수 사이토킨 세트와 함께 신규한 공급 부재 및 무혈청 한정 EB계 조혈 분화 프로토콜을 확립하였다. 전구 세포 유형을 생성시키는 효율은 2개의 사람 hESC 및 4개의 iPSC에 대해 5 내지 8%이었다. 분화 과정 동안에 응집체당 200개 내지 1000개 세포, 저산소 및 재응집 단계를 사용하여 형성된 EB는 조혈 전구 세포 유형의 생성을 선호한다.
상기 방법은 5개의 사이토킨의 존재하에 16일 내지 24일 배양간의 배양 후 세포 표면 상에 CD31, CD43 및 CD45를 공동 발현하는 골수 선조 세포를 효율적으로 생성시킬 수 있다. 또한, 조혈 전구 세포가 분리될 수 있고 각각의 특정 계통의 세포에 대한 특화된 사이토킨 풍부 배지 제형에 놓이는 경우 거핵세포, 적혈구 및 골수 계통(예를 들어, 미성숙 내지 성숙한 다형성 핵 과립구, 대식세포, 수지상 세포)으로 추가로 분화시킬 수 있다.
배아 줄기 세포
미분화된 사람 배아 줄기 세포주(hESC) 및 유도된 다능성 줄기 세포주(iPSC)는 15% KO-혈청 보충물 (Invitrogen), 1% 비필수 아미노산(NEAA), 1mM L-글루타민(전부 제조원(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로부터 구입됨), 0.1 mM β-머캅토에탄올 (Sigma-Aldrich, St. Louis)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)/햄(Ham's) F-12 배지 (F12)에서 조사된 쥐 배아 섬유아세포(MEF)를 공동 배양하여 유지시켰다. 상기 배지에 hESC의 경우 4 ng/ml의 제브라피쉬 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를, 그리고 iPSC의 경우 100ng/ml 사람 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 보충하였다.
미분화된 hESC 및 iPSC는 조사된 마우스 배아 섬유아세포 상에 성장시키거나 MEF-조건화된 배지(MEF-CM) 또는 mTeSR 배지를 사용하여 유지된 Matrigel™-피복된 플레이트 상에서의 공급 부재 성장에 적응시키고 이를 EB 분화 프로토콜을 위한 출발 물질로서 사용하였다.
분화 전 세포의 예비조건화
상기 세포는 mTeSR 배지를 사용한 매트리겔 피복된 플레이트 상에 유지되는 hESC 및 iPSC이고 분화 개시전에 예비조건화 단계에 적용하였다. 예비조건화 단계는 1 내지 3일로 다양하다.
0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2이 보충된 X-vivo 15 (Cambrex), 또는 0.1ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2가 보충된 성장 인자가 없는 mTeSR ("mTeSR-GF")은 EB 분화 개시 전에 예비조건화 단계를 위해 사용하였다.
EB 형성을 위한 세포의 수거
방법 1: MEF 상에서 성장하거나 매트리겔-피복된 플레이트 상에 공급 부재 성장에 적응된 미분화된 hESC 및 iPSC는 37℃에서 10분 동안 콜라게나제 IV(1mg/ml)을 사용하여 컨플루언스 시점에 수거하였다. 배양 후 상기 웰은 콜라게나제가 없도록 세척하였고 상기 EB는 EB 기본 배지에서 웰을 박리시켜 형성하였다. 상기 배지는 다음날 상이한 사이토킨 제형을 함유하는 EB 분화 배지로 갈아주었다.
방법 2: Matrigel™ 피복된 플레이트 상의 공급 부재 성장에 적응된 미분화된 hESC 및 iPSC는 37℃에서 6분 동안 TrypLETM 처리를 사용하여 컨플루언스 시점에서 수거하였다. 상기 웰내 TrypLETM는 1 μM ROCK 억제제 (H-1152) 또는 10μM ROCK 억제제 (Y-27632) 대두 트립신 억제제(0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지를 사용하여 중화시켰다. 상기 세포를 수거하고 1μM -10 μM ROCK 억제제, 대두 트립신 억제제(0.25-0.5 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 세척하였다. 대두 트립신 억제제는 트립신이 세포를 개별화시키기 위해 사용되는 경우 포함시켰다. TrypLE가 세포를 개별화시키는데 사용되는 경우, 대두 트립신 억제제가 배제될 수 있다. 상기 세포는 생존성을 조사하기 위해 계수하였고 1μM -10 μM ROCK 억제제, 대두 트립신 억제제(0.25-0.5 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 저 접착 플레이트에 분주하였다. 상기 배지는 다음날 상이한 사이토킨 제형을 함유하는 EB 분화 배지로 갈아주었다.
EB 형성 및 분화 프로토콜
상기 언급된 효소를 사용한 EB 형성을 촉진시키기 위해, 상기 세포는 20% BIT9500 (Stem Cell Technologies), 1% NEAA, 1 mM L-글루타민, 및 0.1 mM 머캅토에탄올(전부 제조원(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로부터 구입함), 0.75% BSA, 50 ug/ml 아스코르브산이 보충된 IMDM 함유 mTeSR 배지 또는 EB 기본 배지에서 밤새 배양 동안 6웰 저 접착 플레이트로 이전시켰다. 다음 날, 상기 세포는 각각의 웰로부터 수거하고 원심분리하였다. 상기 세포를 EB 분화 배지에 재현탁시켰다. EB 분화 배지는 하기의 성장 인자 및 사이토킨이 보충된 EB 기본 배지로 이루어진다: 50 ng/ml 골 형성 인자(BMP-4), 50 ng/ml의 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 25 ng/ml의 줄기 세포 인자(SCF); 25 ng/ml의 Flt-3 리간드 (Flt-3L), 10 ng/ml의 인터류킨-3 (IL-3), 10 ng/ml의 인터류킨-6 (IL-6), 20 ng/ml의 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF); 20 ng/ml의 과립구 대식세포, 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 0.2 U/ml의 에리트로포이에틴 (EPO), 25 ng/ml의 트롬보포이에틴 (TPO) (전부 제조원(R&D Systems, Minneapolis, MN)으로부터 구입함), 및 25 ng/ml의 제브라피쉬 FGF-2. 상기 배지는 4일마다 EB를 15ml 튜브로 이전시키고 응집체가 5분 동안 침강되도록 함에 의해 갈아주었다. 현탁액을 흡인 제거하고 새로운 분화 배지로 대체하였다. 또는 상기 세포에는 2일마다 새로운 배지를 절반 공급하였다. 상기 세포는 분화 과정 동안에 상이한 시점에서 수거하고 표현형은 유동 세포측정으로 분석하고 기능적 능력은 CFU 분석을 사용하여 분석하였다.
상기 배지는 EB를 15ml 튜브로 이전시키고 응집체가 5분 동안 침강하도록 함에 의해 4일마다 갈아주거나 48시간마다 절반의 배지를 갈아주었다. 현탁액을 흡인 제거하고 새로운 분화 배지로 대체하였다.
결과
mTesR에 적응된 hESC로부터 mTESR 배지 중에서 제조된 EB는 조사된 마우스 배아 섬유아세포 상에 유지되거나 mTeSR 대신 MEF 조건화된 배지를 사용하여 유지된 Matrigel™-피복된 플레이트 상에 공급 부재 성장에 적응된 hESC 및 iPSC로부터 제조된 EB와 비교하여 16일의 분화 후 조혈 전구세포의 보다 낮은 빈도(<4%)를 나타내었다. 후자 조건은 10 내지 15% 조혈 전구 세포간에 생성되었다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, mTeSR 배지에서 보다 고수준의 TGF-β는 대부분의 원시 줄기/선조 세포에 대해 우선적인 성장 억제 효과를 나타낼 수 있다.
사이토킨의 존재는 hESC 및 iPSC 둘다에 대해 무혈청 조혈 분화 과정을 구동시키는데 필수적인 것으로 관찰되었다. 초기 사이토킨 제형은 BE 분화 배지에 열거된 11개 사이토킨을 함유하였다. 조혈 전구 세포의 빈도는 혈청 및 사이토킨 부재하에 0.5 내지 2%이고 사이토킨 부재 및 혈청 존재하에 2 내지 10%였다. 조혈 전구 세포의 빈도는 분화 16일을 초과한 시점에서 혈청의 부재 및 사이토킨의 부재하에 10 내지 40%였고 사이토킨을 함유하는 배지로 혈청의 첨가는 전구 세포를 약간 증가시켰다. 따라서, 무혈청 사이토킨 풍부 EB 분화 배지는 조사된 마우스 배아 섬유아세포 상에 유지된 hESC 및 iPSC 뿐만 아니라 MEF-CM을 사용하여 예비조건화된 mTeSR 배지를 사용하여 매트리겔 피복된 플레이트 상에 유지된 hESC 및 iPSC로부터 조혈 전구 세포를 생성시킬 수 있었다.
EB 분화 16일 내지 18일의 분화 말기에 세포의 주요 표현형은 CD45+, CD43+ 및 CD31+ 세포였다. CFU 분석은 과립구(예를 들어, 호산구, 호염구, 호중구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 비만세포)를 생성시킬 수 있는 골수 전구세포의 존재를 밝혔다.
도 1은 계대 50회 (A) 및 40회 (B)에서 H1 ESC의 조혈 분화를 나타낸다. hESC 둘다는 mTeSR을 사용한 10회 계대를 위해 Matrigel™ 상에 유지시켰다. hESC는 조혈 분화의 개시 전에 MEF-CM을 사용하여 3일 동안 예비조건화시켰다. 상기 세포는 콜라게나제를 사용하여 수거하였고 EB는 무혈청 사이토킨 풍부 배지를 사용하여 분화시켰다. 상기 EB 세포는 조혈 전구 세포 유형 (CD43, CD34, CD45, CD31 및 CD41)의 존재에 대해 상이한 시점에서 유동 세포측정에 의해 분석하였다. 값은 3개의 개별 실험의 평균 SEM을 나타낸다.
감소된 양의 FGF-2 및 TGF-β와 함께 한정 배지에서의 세포의 예비조건화는 조혈 분화를 개선시켰다. 도 2는 mTESR을 사용하여 유지된 Matrigel™ 상의 공급 부재 성장에 적응된 hESC 및 iPSC에 대한 한정 예비조건화 배지로의 노출이 후속 조혈 분화를 증강시킴을 보여준다. 보다 구체적으로, Matrigel™ 피복된 플레이트 상의 공급 부재 성장에 적응된 H1 hESC는 MEFCM 또는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2이 보충된 X-vivo 15, 또는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2가 보충된 mTeSR(성장 인자 부재)을 사용하여 3일 동안 예비조건화시켰다. 상기 예비조건화 배지는 매일 3일 동안 갈아주었다. 상기 세포는 콜라게나제를 사용하여 수거하였고 EB는 EB 기본 배지에서 박리시켜 형성되었다. 상기 세포는 EB 기본 배지로의 분주 24시간 후 11개 사이토킨을 함유하는 EB 분화 배지로 이전시켰다. 상기 세포는 분화 12일째에 수거하고 세포의 표현형은 유동 세포측정기로 정량하였다.
예비조건화 시간 프레임은 1일 정도로 단축될 수 있지만 여전히 조혈 분화를 개선시키는 것으로 추가로 관찰되었다. 낮은 수준의 TGF-β (0.1 ng/ml) 및 FGF-2 (20 ng/ml)이 보충된 성장 인자 부재의 mTeSR은 바람직한 예비조건화 배지이다. 예비조건화의 이로운 효과가 또한 트립신(예를 들어, TrypLETM)을 사용하여 개별화되거나 작은 클럼프로 분리된 EB에 대해 관찰될 것으로 예상된다.
실시예 3
조혈 전구세포는 hESC 및 iPSC의 단일 세포 현탁액으로부터 제조하였다. 단일 세포 현탁액 또는 개별화된 세포는 트립신 분해에 의해 제조하였다.
단일 세포로부터 EB를 제조하기 위해 사용되는 방법
mTESR을 사용하여 매트리겔 상에 유지된 공급 부재 성장에 적응된 hESC 및 iPSC는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2를 함유하는 mTesR-GF의 존재하에 3일 동안 예비조건화시켰다. 단일 세포로부터의 분화를 개시하기 위해, 배양물을 6분 동안 TrypLE™ 셀렉트(Select)(Invitrogen)로 처리하고 세포 현탁액을 (1) 단순한 EB 기본 배지, (2) PVA 함유 EB 기본 배지, (3) 0.5% PVA 및 1 μM H1152 또는 10 μM Y27632 ROCK 억제제를 함유하는 EB 기본 배지, 또는 (4) 단지 1uM의 H1152 ROCK 억제제를 함유하는 EB 기본 배지에서 수거하였다. 상기 세포를 수거하고 1회 세척하고 37℃에서 저 접착 플레이트 상에 각각의 배지 제형에 분주하였다. 상기 EB 형성 상태는 위상차현미경 하에 18 내지 24시간 후 조사하였다.
Figure 112011074239247-pct00006
조혈 분화를 위해 요구되는 사이토킨
사이토킨 매트릭스 실험 프로토콜: mTESR을 사용하여 유지되는 매트리겔 상의 공급 부재 성장에 적응된 hESC는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2를 함유하는 X-vivo-15의 존재하에 3일 동안 예비조건화시켰다. 세포는 37℃에서 6분 동안 TrypLE를 사용하여 수거하였다. TrypLE™는 1μM ROCK 억제제 (H-1152), 대두 트립신 억제제(0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지를 사용하여 중화시켰다. 상기 세포를 1μM ROCK 억제제 및 대두 트립신 억제제(0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 1회 세척하였다. 상기 세포를 1μM ROCK 억제제 및 대두 트립신 억제제 (0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 저 접착 플레이트에 분주하였다. 다음 날에 상기 배지를 상이한 사이토킨 제형을 함유하는 EB 기본 배지로 갈아주었다.
사용되는 사이토킨의 농도는 다음과 같다: 25 ng/ml BMP-4, 25 ng/ml VEGF, 25 ng/ml SCF, 25 ng/ml Flt-3L, 10 ng/ml IL-3, 10 ng/ml IL-6, 20 ng/ml G-CSF; 20 ng/ml GM-CSF, 0.2 U/ml EPO, 10 ng/ml TPO 및 10 ng/ml 제브라피쉬 FGF-2.
사용되는 사이토킨 조합은 하기의 표 3에 열거된다. EB 배양물에 2일마다 새로운 분화 배지를 절반 공급하였다. 상기 EB 배양물을 분화 8일, 12일 및 17일째에 수거하였다. 상기 EB 배양물은 모든 세포를 회전 침강시키고 상기 EB를 TrypLE™ 또는 0.5% 트립신으로 분해하여 수거하였다. 선조 세포 유형의 표현형은 유동 세포 측정기로 분석하고 상기 세포를 CFU 분석용 메틸셀룰로스 배지에 분주하였다. "FLT3"은 하기 Flt3 리간드를 언급한다.
[표 3]
Figure 112011074239247-pct00007
상기 상이한 조합의 결과는 하기 표 4에 제공한다. 하기 열거한 바와 같이, 이들 상이한 조합의 성장 인자에서 배양으로부터 비롯된 세포를 평가하여 다양한 세포 표면 마커의 발현을 결정하였다.
Figure 112011074239247-pct00008
EB 사이토킨 혼합물 중의 11개 사이토킨 중에서 5개의 사이토킨 세트(BMP4, VEGF, IL-3, Flt-3, GMCSF)가 특히 무혈청 조혈 분화 프로토콜을 구동하기 위해 효과적이거나 필수적인 것으로 확인되었다. 5개의 사이토킨 중에 BMP-4 및 VEGF가 EB 분화 동안에 모든 시점에서 상당한 역할을 하는 것으로 나타났지만 GMCSF 및 IL-3이 EB 분화의 후반 단계 동안에 역할을 하는 것으로 나타났다.
콜로니 형성 분석은 조혈 분화의 각각의 시점 말기에 수행하였다. CFU 분석은 모든 시점에서 11개 사이토킨 칵테일로서 5개 사이토킨 조합이 총 콜로니 중 상당수를 산출하는 것으로 나타났다. GEMM 콜로니의 빈도수(105개의 세포당 3개 내지 5개)는 EB 분화의 12일째에 11개 사이토킨과 5개 사이토킨 조합으로 상응하였다. 5개 사이토킨을 함유하는 상기 EB 분화 배지를 사용하여 hESC 및 iPSC로부터 조혈 전구 세포를 성공적으로 생성하였다.
5개의 사이토킨을 함유하는 EB 분화 배지는 hESC 및 iPSC로부터 조혈 전구 세포를 생성시키는데 충분하였다. mTESR을 사용하여 유지된 Matrigel™ 상의 공급 부재 성장에 적응된 hESC 및 iPSC는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2를 함유하는 mTesR-GF 또는 X-vivo 15의 존재하에 3일 동안 예비조건화시켰다.
조혈 분화를 위해 사용되는 사이토킨에 대한 농도 결정
실험적 프로토콜: mTESR을 사용하여 유지된 매트리겔 상의 공급 부재 성장에적응된 hESC는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2를 함유하는 mTeSR-GF의 존재하에 3일 동안 예비조건화시켰다. 37℃에서 6분 동안 TrypLE™을 사용하여 세포를 수거하였다. TrypLE™은 1μM ROCK 억제제 및 대두 트립신 억제제(0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지를 사용하여 중화시켰다. 상기 세포를 1μM ROCK 억제제(H-1152), 대두 트립신 억제제(0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 1회 세척하였다. 상기 세포를 ml당 100만개의 세포의 세포 밀도로 1μM ROCK 억제제, 대두 트립신 억제제(0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 저 접착 플레이트에 분주하였다. 다음 날 상기 배지를 상이한 농도로 5개 사이토킨을 함유하는 EB 기본 배지로 갈아주었다. 사용되는 사이토킨의 농도는 다음과 같다: BMP-4, VEGF, SCF, FLT-3 리간드는 50-25 ng/ml의 범위이고; IL-3, GM-CSF는 10-20 ng/ml 범위이다.
상기 EB 배양물에 2일마다 새로운 분화 배지를 절반 공급하였다. 상기 EB 배양물은 분화의 9일 및 12일째에 수거하였다. 상기 EB 배양물은 모든 세포를 회전 침강시키고 EB를 TrypLE™ 또는 0.5% 트립신으로 분해시켜 수거하였다. 선조 세포 유형의 표현형은 유동 세포 측정기로 분석하고 세포는 CFU 분석을 위해 메틸셀룰로스 배지에 분주하였다.
결과 (5개 사이토킨 용량 매트릭스)
상기 결과는 조혈 전구 세포의 생성을 구동시키는 대략 최적 용량의 5개의 필수 사이토킨이 25 ng/ml의 BMP4, VEGF 및 Flt-3 리간드, 및 10 ng/ml의 IL-3 및 GMCSF임을 나타낸다. 상기 조합의 사이토킨은 EB 분화 12일째에 다능 GEMM 콜로니(105 세포당 3 내지 5개)를 생성시키는 조혈 전구세포를 생성시킬 수 있다.
EB 배양물의 재응집은 조혈을 증강시킨다
무혈청 12일째 EB 분화 프로토콜은 추가로 분화 프로토콜 동안에 재응집 단계를 포함시킴에 의해 최적화시켰다.
실험 프로토콜: mTESR을 사용하여 유지된 매트리겔 상의 공급 부재 성장에 적응된 hESC는 0.1 ng/ml TGF 및 20 ng/ml FGF-2를 함유하는 mTeSR-GF의 존재하에 2일 동안 예비조건화시켰다. 상기 세포는 37℃에서 6분 동안 TrypLE를 사용하여 수거하였다. TrypLE™는 1μM ROCK 억제제를 함유하는 EB 기본 배지를 사용하여 중화시켰다. 상기 세포는 1μM ROCK 억제제, 대두 트립신 억제제(0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 1회 세척하였다. 상기 세포를 12 내지 24시간 동안 1 μM ROCK 억제제 (H-1152) 및 대두 트립신 억제제 (0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 저 접착 플레이트에 분주하였다.
다음 날 상기 배지를 BMP-4 및 VEGF 둘다를 25 ng/ml로 함유하는 EB 기본 배지로 갈아주었다. 상기 세포는 제1 세트의 사이토킨 중에서 4, 5 또는 6일 동안 분화시켰다. 상기 EB 배양물을 이어서 2개 사이토킨으로 첫번째 펄스 후 추가로 4, 5 또는 6일 동안 IL-3/GMCSF/FLT-3 리간드에 노출시켰다. 제1 세트의 사이토킨에서 다른 세트로 이전 동안에 한개 세트의 EB를 TrypLE™를 사용하여 분해시키고 제2 배지에서 재응집하도록 방치하면서 다른 세트를 탈응집 단계 없이 제2 배지에 첨가하였다. 분화 과정 전반에 걸쳐 상기 EB 배양물에 2일마다 새로운 분화 배지를 절반 공급하였다. 상기 EB 배양물은 EB 분화 9일, 10일, 11일 및 14일째에 수거하였다. 실험 말기에 EB 배양물은 모든 세포를 회전 침강시키고 EB를 TrypLE™ 또는 0.5% 트립신으로 분해시켜 수거하였다. 선조 세포 유형의 표현형은 유동 세포 측정기로 분석하고 상기 세포를 CFU 분석을 위해 메틸 셀룰로스에 위치시켰다.
결과
EB 배양물의 부분적 재응집은 조혈 분화를 증강시켰다. 처음 4 내지 5일 동안 BMP4 및 VEGF의 존재에 이어서 다음 7 내지 8일 동안 IL-3/Flt3 리간드/GMCSF의 첨가로 CD43+, CD34+, CD45+, 및 CD31+을 발현하는 최다 조혈 전구세포(>10%)를 수득하였다.
콜로니 형성 분석 결과는 유동 세포 측정 분석으로 수득된 데이터와 유사했다. 처음 4 내지 5일 동안 BMP4 및 VEGF로 펄스됨에 이어서 다음 7 내지 8일 동안 IL-3/FLT3 리간드/GMCSF의 첨가로 상기 EB 배양물은 최고의 콜로니 형성 단위를 나타내었다. 총 CFU 값은 재응집 단계 후 >100에서부터 250까지 상승하였다. GEMM 함유 콜로니의 빈도수는 105 세포당 3 내지 5개에서 105 세포당 15개 내지 20개로 증가하였다.
실시예 4
EB 크기는 조혈 분화에 영향을 미칠 수 있다
mTESR을 사용하여 유지된 매트리겔 상의 공급 부재 성장에 적응된 hESC는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2를 함유하는 mTeSR-GF의 존재하에 2일 동안 예비조건화시켰다. 세포를 37℃에서 6분 동안 TrypLE를 사용하여 수거하였다. TrypLE™은 10 μM Y-27632 ROCK 억제제, 대두 트립신 억제제(0.25mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지를 사용하여 중화시켰다. 상기 세포는 1μM ROCK 억제제, 대두 트립신 억제제(0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 1회 세척하였다.
생존 세포 수를 측정하고 목적하는 세포 수를 제조업자의 지침에 따라 AggreWell™ 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다: 1.2 x 105 세포를 분주하여 100개 세포의 응집체 EB가 생성되도록 하였고; 2.4 x 105 세포를 분주하여 200개 세포 응집체 EB가 생성되도록 하였고; 6 x 105 세포를 분주하여 500개 세포 응집체 EB가 생성되도록 하였고; 1.2 x 106 세포를 분주하여 1000개 세포 응집체 EB가 생성되도록 하였고; 2.4 x 106 세포를 분주하여 2000개 세포 응집체 EB가 생성되도록 하였고; 3.6 x 106 세포를 분주하여 2000개 세포 응집체 EB가 생성되도록 하였고; 4.8 x 106 세포를 분주하여 2000개 세포 응집체 EB가 생성되도록 하였다.
상기 세포를 18 내지 24시간 동안 1μM ROCK 억제제 (H-1152), 대두 트립신 억제제 (0.25mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 AggreWell™ (제조업자의 지침을 사용하여)에 분주하여 EB가 형성되도록 하였다. 상기 세포를 저 접착 플레이트로 이전시키고 다양한 세포 수를 사용하여 형성된 EB의 크기를 측정하기 위해 사진을 촬영하였다.
상기 EB 배양물은 5개 사이토킨 (BMP4/VEGF/IL-3/FLT-3 리간드/GMCSF)를 함유하는 배지에서 분화시켰다. 상기 EB 배양물에 2일마다 모든 5개의 사이토킨을 함유하는 새로운 분화 배지를 절반 공급하였다. 상기 EB 배양물은 분화 11일째에 수거하였다. 실험 말기에, EB 배양물은 모든 세포를 회전 침강시키고 EB를 TrypLE™ 또는 0.5% 트립신으로 분해함에 의해 수거하고 CD43 값은 유동 세포측정기로 정량하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, EB 크기와 CD43 발현 간의 상관관계가 관찰되었다.
한정된 세포수를 함유하는 H1 hESC 응집체를 18 내지 24시간 동안 EB 기본 배지에서 AggreWell™ 플레이트(제조업자의 지침을 사용한 줄기 세포 기술)에 형성시켰다. 상기 세포를 이후에 저 접착 플레이트로 이전시키고 상이한 세포수(μM)에 의해 생성된 EB 크기는 현미경 상에 스케일 막대를 사용하여 기록하였다. EB를 포함하는 세포수 및 EB의 응집체 크기는 분화 개시 전에 정량하였다. 상기 EB 배양물은 11일 동안 BMP4/VEGF/IL-3/FLT-3 리간드/GMCSF의 존재하에 분화시켰다. 실험 말기에 EB 배양물은 TrypLE™을 사용하여 EB를 개별화시킴으로써 수거하고 CD43 값은 유동 세포측정기로 정량하였다.
결과
조혈 분화를 위한 최적의 세포수는 100-250 μm 사이로 측정되는 응집체당 200개 내지 1000개의 세포이다. 1000 μm 초과로 측정되는 보다 큰 세포수 응집체(>2000)는 조혈 전구 세포의 생성을 촉진시키지 않았다.
실시예 5
저산소 조건은 조혈 분화를 증강시킨다
mTeSR를 사용하여 유지된 매트리겔 상에 공급 부재 성장에 적응된 H1 hESC는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20ng/ml FGF-2를 함유하는 mTeSR-GF의 존재하에 2일 동안 예비조건화시켯다. 세포를 TrypLE™를 사용하여 수거하고 12 내지 24시간 동안 100만개의 세포의 세포 밀도로 1μM ROCK 억제제 (H-1152) 및 대두 트립신 억제제(0.25mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 저 접착 플레이트에 분주하였다.
상기 EB 배양물을 5개 사이토킨(BMP4/VEGF/IL-3/FLT-3 리간드/GMCSF)를 함유하는 배지에서 분화시켰다. 상기 EB 배양물에 2일마다 모든 5개의 사이토킨을 함유하는 새로운 분화 배지를 절반 공급하였다. 상기 EB 배양물을 재응집 단계 없이 분화의 8일, 12일 및 16일째에 수거하였다. 실험 말기에 EB 배양물은 모든 세포를 회전 침강시키고 EB를 TrypLE™ 또는 0.5% 트립신으로 분해하여 수거하고 조혈과 관련된 다양한 표면 마커의 표현형 발현을 유동 세포 측정기로 정량하였다.
결과
EB 배양물은 고산소 조건과 비교하여 저산소 조건하에서 높은 %의 CD43, CD31, CD45, CD34 발현 세포를 생성시켰다. 상기 효과는 EB 분화 8일 후에 보다 명백하였다. 총 세포 수는 상기 2개 조건하에서 유사하였다.
매트리겔 피복된 플레이트 상에 공급 부재 성장에 적응된 H1 hESC는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2가 보충된 mTeSR-GF를 사용하여 2일 동안 예비조건화시켰다. 상기 세포는 ROCK 억제제의 존재하에 TrypLE™를 사용하여 수거하였다. 상기 EB는 저산소 (5% CO2) 및 고산소 (20% O2) 조건하에 VEGF, BMP4, IL-3, GMCSF, 및 Flt-3 리간드를 함유하는 EB 분화 배지로 이전시켰다. 상기 세포는 분화 8일, 11일 및 16일째에 수거하고 세포의 표현형은 유동 세포 측정으로 정량하였다.
조혈 전구세포를 생성시키는 효율
mTeSRTM을 사용하여 유지된 Matrigel™ 상에 공급 부재 성장에 적응된 hESC 및 iPSC는 0.1 ng/ml TGF 및 20 ng/ml FGF-2를 함유하는 mTeSR-GF의 존재하에 2일 동안 예비조건화시켰다. 상기 세포는 TrypLE™를 사용하여 수거하였다. 생존 세포 수를 평가하고 상기 세포를 ml당 100만개 세포의 밀도로 분주하였다.
상기 세포는 24시간 동안 1μM ROCK 억제제 (H-1152) 및 대두 트립신 억제제 (0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 저 접착 플레이트에 분주하였다. 상기 EB 배양물은 2단계 분화 과정으로 분화시키기 위해 유도하였다. 상기 배양물을 저산소 조건하에서 4일 동안 BMP4 및 VEGF를 함유하는 배지에 위치시켰다. 상기 EB 배양물은 분화의 5일째에 TrypLE를 사용하여 재응집시키고 저산소 조건하에서 추가로 7일 동안 (1) IL-3, FLT-3 리간드, GMCSF; (2) IL-3, FLT-3 리간드, SCF; 또는 (3) IL-3, FLT-3 리간드, TPO와 함께 제2 분화 배지에 위치시켰다. 상기 EB 배양물에는 2일마다 새로운 분화 배지를 절반 공급하였다. 상기 EB 배양물은 분화 12일째에 수거하였다. 실험 말기에, EB 배양물은 모든 세포를 회전 침강시키고 EB를 TrypLE™ 또는 0.5% 트립신으로 분해하여 수거하였다. 실험 말기에 총 생존 세포수를 평가하였다. 조혈과 관련된 다양한 표면 마커의 표현형 발현은 유동 세포 측정으로 정량하였다. 조혈 전구 세포(CD43+/CD34+)의 % 및 절대 수를 정량하였다. 따라서, 조혈 전구 세포의 생성 효율은 초기 세포 수를 분화 실험 말기에 생성된 조혈 전구세포 수로 나누어 결정하였다.
결과: hESC 및 iPSC로부터 2단계 EB 분화 프로토콜을 사용한 조혈 전구세포 집단을 생성시키는 효율은 5 내지 8%인 것으로 관찰되었다. 결과는 도 5에 나타낸다.
실시예 6
상기 EB 분화 프로토콜을 사용하여 생성된 조혈 전구 세포는 적혈구 전구세포, 거핵세포, 대식세포, 단핵구 및 수지상 세포를 생성시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, mTESR을 사용하여 유지된 매트리겔 상의 공급 부재 성장에 적응된 H1 hESC 및 iPSC는 0.1ng/ml TGF 및 20ng/ml FGF-2를 함유하는 mTeSR-GF의 존재하에 2일 동안 예비조건화시켰다. 세포는 TrypLE를 사용하여 수거하였다. 생존 세포 수는 모든 세포주에 대해 평가하였다.
상기 세포는 24시간 동안 1μM ROCK 억제제 (H-1152) 및 대두 트립신 억제제(0.25 mg/ml)를 함유하는 EB 기본 배지에서 저 접착 플레이트에 ml당 100만개의 세포의 세포 밀도로 분주하였다. 상기 EB 배양물은 2단계 분화 과정으로 분화시키기 위해 유도하였다. 상기 배양물은 4일 동안 BMP4 및 VEGF를 함유하는 배지에 위치시켰다. 상기 EB 배양물은 5일째 TrypLE 상에서 재응집시키고 추가로 7일 동안 (1) IL-3, FLT-3 리간드, GMCSF; (2) IL-3, FLT-3 리간드, SCF, 또는 (3) IL-3, FLT-3, TPO와 함께 제2 분화 배지에 위치시켰다. 상기 EB 배양물에 2일마다 새로운 배지를 절반 공급하였다. 전체 12일 분화는 저산소 조건하에서 수행하였다. 상기 EB 배양물은 분화 12일째에 수거하였다. 실험 말기에, EB 배양물은 모든 세포를 회전 침강시키고 EB를 TrypLE™ 또는 0.5% 트립신으로 분해하여 수거하였다. 실험 말기에 총 세포 수를 평가하였다. 100만개의 hESC는 80,000개의 조혈 전구 세포를 생성시킬 수 있다.
IL-3, FLT-3 GMCSF 세트 (1)로부터 유래된 전구세포는 200 ng/ml GMCSF를 함유하는 배지에 8일 동안 위치시켰다. 이들 세포는 추가로 (1) 세포를 2주 동안 M-CSF (10ng/ml) 및 IL-1β (20ng/ml) 함유 배지에 위치시켜 대식세포로 분화시키거나 (2) 세포를 20ng/ml GMCSF 및 20ng/ml IL-4를 함유하는 배지에 위치시킴에 의해 수지상 세포로 분화시켰다. 100만개의 hESC는 20만개의 수지상 세포를 생성시킬 수 있다. 모든 계통의 분화 실험은 비-저산소(약 20%) 산소 농도에서 수행하였다.
거핵세포는 (100ng/ml, TPO, SCF, FLT-3, 20% BIT9500)를 함유하는 배지 MK3에 IL-3, FLT-3 리간드, SCF 세트 (2)로부터 유래된 전구 세포를 위치시킴에 의해 제조하였다. 비만 세포는 MK3 증식에 이어서 5 ng/ml SCF, 5ng/ml IL-6 함유 배지에서 전구세포를 증식시켜 제조하였다. 100만개의 hESC는 6만개 내지 120만개의 거핵세포를 생성시킬 수 있다. 상기 계통 분화 실험을 비-저산소(약 20%) 산소 농도에서 수행하였다.
적혈구 선조세포는 하이드로코르티손 (10-6M) 할로트랜스페린, ExCyte를 함유하는 배지에 IL-3, FLT-3 SCF TPO로부터 유래된 전구세포를 위치시킴에 의해 생성시켰다. 상기 계통 분화 실험은 정상 산소(약 20% 산소) 조건하에서 수행하였다. 사람 AB 혈청의 보충 및 저산소 조건은 적혈구 선조세포의 수율을 증강시켰다. 이들 방법을 사용하여 배양에서 100만개의 hESC를 약 100만개의 적아세포로 증식시켰다.
스피너 플라스크를 사용한 EB 분화 프로토콜의 스케일 업
세포는 먼저 분화 전에 예비조건화시켰다. 매트리겔 피복된 플레이트 상에서 공급 부재 성장에 적응된 미분화된 hESC 및 iPSC는 0.1 ng/ml TGF 및 20 ng/ml 제브라피쉬 FGF가 보충된, 성장 인자가 없는 TeSR을 사용하여 24시간 동안 별도로 예비조건화시켰다.
상기 세포는 37℃에서 5분 동안 TrypLE™ 처리를 사용하여 컨플루언스 시점에서 수거하였다. 상기 세포는 20% BIT9500(Stem Cell Technologies), 또는 혈청 대용물 3 ( Sigma Aldrich), 1% NEAA, 1 mM L-글루타민, 및 0.1 mM 머캅토에탄올 (전부 제조원(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로부터 시판됨), 0.75% BSA, 50 μg/ml 아스코르브산 및 1μM ROCK 억제제 (H-1152)가 보충된 IMDM을 함유하는 EB 기본 배지에서 수거하였다.
이어서 상기 세포는 ml당 50만개 내지 200만개의 세포의 밀도로 125ml의 코닝 스피너 플라스크에 위치시켰다. 상기 스피너는 밤새 30 내지 40 rpm으로 설정하여 EB 형성을 촉진시켰다. 또한 상기 세포는 저 접착 플레이트에서 24시간 동안 정적 조건하에서 저 접착 코닝 플라스크에 위치시킬 수 있다. 세포의 개선된 생존율은 세포가 처음 12 내지 24시간 동안 배양되는 경우 관찰되었다. 12 내지 24시간 후 상기 세포를 속도가 60RPM인 스피너 플라스크에서 자기 교반 플랫폼 상에서 ROCK 억제제 없이 사이토킨 함유 EB 분화 배지에 위치시켰다. EB는 스피너 플라스크가 처음 12 내지 24시간 동안 25 내지 30 RPM으로 유지되고 후속 분화를 위해 40 내지 60으로 증가되는 경우 생성되었다. 스피너 플라스크의 측면 캡은 가스 전달을 가능하게 하기 위해 느슨하게 하였다. 상기 세포를 50ng/ml 골 형성 인자 (BMP-4), 50ng/ml, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 25 ng/ml 제브라피쉬 FGF-2가 보충된 EB 기본 배지에 위치시켰다.
분화 4일째에, 상기 세포는 현탁된 EB 응집체가 15 내지 20분 동안 플라스크의 바닥에 침강하도록 하기 위해 세포 배양 후드에서 스피너 플라스크를 설정함에 의한 공급된 세포이다. 소비된 배지는 흡인 제거하였다(125ml의 스피너에 대해 잔류하는 대략 20 mL). 상기 세포는 약하게 와동시키고 50 ng/ml 골 형성 인자 (BMP-4), 50 ng/ml, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 및 25 ng/ml의 제브라피쉬 FGF-2를 함유하는 새로운 배지를 상기 세포에 첨가하였다. 상기 스피너 플라스크는 조혈 분화의 전체 공정을 거쳐 60rpm의 속도로 설정하였다.
분화 5일 내지 6일째에, 소비된 배지는 상기된 바와 같이 흡인 제거하고 세포를 (1) 25 ng/ml의 Flt-3 리간드, 10 mg/ml의 IL-3 및 10 ng/ml의 GMCSF, 또는 (2) 25 ng/ml의 Flt-3 리간드, 25 ng/ml의 SCF, 25 ng/ml의 TPO, 10 ng/ml의 IL-3, 및 10 ng/ml의 IL-6가 보충된 EB 기본 배지에 위치시켰다. 소비된 배지는 상기된 바와 같이 8일째 및 10일째에 흡인 제거하였다.
상기 EB 배양물은 분화 12일째에 수거하였다. 총 세포 수는 분석 말기에 정량하였다. 상기 세포는 표면 마커(CD34+, CD45+, CD43+, CD41+, CD235a+, CD31+)의 표현형 발현에 대해 염색하여 집단의 조혈 선조세포 함량을 정량하였다. 표 5는 H1 ES 세포를 사용한 다양한 세포 밀도로 생성된 스피너 데이터를 요약한다. 유사한 결과는 iPS 세포를 사용하여 수득하였다. 스피너 플라스크에서 EB 분화 과정의 개요 및 수득된 결과는 도 6에 나타낸다. 상기 조혈 선조세포는 적아세포, 거핵세포, 수지상 세포, 비만 세포, 과립구 및 대식세포를 포함하는, 상이한 계통에 속하는 다양한 세포 유형을 생성시킬 수 있다.
Figure 112011074239247-pct00009
실시예 7
96웰 플레이트를 사용한 EB 분화의 축소 모형화
매트리겔 피복된 플레이트 상에 공급 부재 성장에 적응된 미분화된 hESC 및 iPSC는 0.1ng/ml TGF 및 20ng/ml 제브라피쉬 FGF가 보충된, 성장 인자 부재의 TeSR을 사용하여 24시간 동안 별도로 예비조건화시켰다. 상기 세포를 37℃에서 5분 동안 TrypLE 처리를 사용하여 컨플루언스 시점에 수거하였다. 상기 세포는 20% BIT9500 (Stem Cell Technologies) 또는 혈청 대체물 3(Serum Replacement-3) (Sigma Aldrich), 1% NEAA, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM 머캅토에탄올(전부 제조원(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로부터 구입함), 0.75% BSA, 50 μg/ml 아스코르브산 및 1 μM ROCK 억제제 (H-1152)가 보충된 IMDM을 함유하는 EB 기본 배지에서 수거하였다.
상기 세포를 ROCK 억제제를 함유하는 EB 기본 배지에서 웰당 10만 세포의 밀도로 저 접착 96웰 플레이트에 위치시켰다. EB 형성은 분주된 세포를 저산소(5% O2) 조건하에서 배양하여 촉진시켰다. 12 내지 24시간 후 세포는 50 ng/ml 골 형성 인자 (BMP-4), 50 ng/ml, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 25 ng/ml 제브라피쉬 FGF-2를 함유하는 EB 분화 배지에 위치시켰다. 약 300 μl의 배지를 96웰 플레이트의 웰당 사용하였다.
분화 3 내지 4일째 세포는 소비된 배지 절반 용적(100 내지 150 μl)을 서서히 제거함에 의해 절반 공급되고 50 ng/ml 골 형성 인자(BMP-4), 50 ng/ml 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 25 ng/ml 제브라피쉬 FGF-2를 함유하는 동등한 용적의 새로운 배지를 세포에 첨가하였다.
분화 5 내지 6일째에 소비된 배지를 상기한 바와 같이 흡인 제거하고 세포를 (1) 25 ng/ml의 Flt-3 리간드, 10 mg/ml의 IL-3 및 10 ng/ml GMCSF, 또는 (2) 25 ng/ml의 Flt-3 리간드, 25 ng/ml의 SCF, 25 ng/ml의 TPO, 10 ng/ml IL-3, 및 10 ng/ml IL-6을 함유하는 배지가 보충된 EB 기본 배지에 위치시켰다. 상기한 바와 같이 분화 8일 및 10일째에 분화 EB 배양물에 새로운 배지를 절반 공급하였다.
상기 EB 배양물은 분화 12일째에 수거하였다. 총 세포 수는 분석 말기에 정량하였다. 상기 세포는 표면 마커(CD34+, CD45+, CD43+, CD41+, CD235a+, CD31+)의 표현형 발현을 위해 염색시켜 집단의 조혈 선조세포 함량을 정량하였다. H1 ES 세포를 사용하여 생성된 데이터는 도 7에 요약한다. 유사한 결과는 iPS 세포를 사용하여 수득하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 100000개의 세포를 저 접착 96웰 플레이트에 분주하였다. 상기 세포를 처음 4 내지 5일 동안에 저산소 (5% O2) 조건하에서 사이토킨 (BMP4/VEGF/FGF)의 존재하에 분화시키고 이어서 분화 7 내지 8일째에 저산소(5% O2) 조건하에 사이토킨 (SCF/FLt-3/TPO/IL-3/IL-6)의 존재하에 분화시켰다. 상기 세포는 분화 12일 후에 수거하고 HPC는 유동 세포측정기로 정량하였다.
실시예 8
로봇 자동화
Tecan Cellerity 시스템(산업적 관련 로봇 플랫폼)을 사용한 조혈 전구 세포의 유지 및 생성 조건. 분화 12일째 실시예 8에 사용된 프로토콜을 기준으로, 상기 세포는 Tecan Cellerity 시스템에 의해 수거하고 마커의 세포 표면 염색을 위해 수동으로 세척하였다. 염색 후, 상기 세포는 Accuri 유동 세포 측정기에 연결된 Hypercyt를 사용하여 분석하였다.
실시예 9
다능성 세포로부터 내피 세포의 생성
매트리겔 피복된 플레이트 상에 공급 부재 성장에 적응된 미분화된 hESC 및 iPSC는 0.1ng/ml TGF-β 및 20ng/ml 제브라피쉬 FGF-2가 보충된, 성장 인자 부재의 TeSR을 사용하여 24시간 동안 별도로 예비조건화시켰다. 상기 세포를 37℃에서 5분 동안 TrypLE 처리를 사용하여 컨플루언스 시점에 수거하였다. 상기 세포는 20% BIT9500 (Stem Cell Technologies) 또는 혈청 대체물 3(Serum Replacement-3) (Sigma Aldrich), 1% NEAA, 1 mM L-글루타민 및 0.1 mM 머캅토에탄올(전부 제조원(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로부터 구입함), 0.75% BSA, 50 μg/ml 아스코르브산 및 1 μM ROCK 억제제 (H-1152)가 보충된 IMDM을 함유하는 EB 기본 배지에서 수거하였다. 상기 세포는 ml당 100만 내지 200만 세포의 밀도로 EB 형성을 촉진시키기 위해 저 접착 플레이트에 위치시켰다.
EB 분화를 유도하기 위해 하기의 프로토콜을 사용하였다. 12 내지 24시간 후 상기 세포를 플레이트로부터 수거하고 5분 동안 1000rpm에서 회전 침강시켰다. 상기 세포는 50 ng/ml 골 형성 인자 (BMP-4), 50 ng/ml 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 50 ng/ml 제브라피쉬 FGF-2가 보충된 EB 기본 배지에 재현탁시켰다.
EB 분화의 4일째에, 상기 세포는 플레이트를 기울임에 의해 침강하도록 하였다. 상청액 배지 절반을 흡인제거하고 50 ng/ml 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 50 ng/ml의 제브라피쉬 FGF-2를 각각 함유하는 새로운 배지로 대체하였다.
EB 분화 7일째에, 상기 EB 배양물을 VEGF, FGF, EGF, IGF, 아스코르브산 및 FBS를 함유하는 내피 분화 배지(Lonza 카탈로그 #CC3202, Basel, Switzerland) 또는 50 ng/ml 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 및 50 ng/ml 제브라피쉬 FGF-2를 함유하는 새로운 분화 배지에 위치시켰다.
상기 세포는 분화 10일째에 내피 세포의 존재에 대해 분석하였다. 세포를 수거하고 원뿔 튜브에서 회전 침강시켰다. 상기 세포 펠릿은 37℃에서 5분 동안 TrypLE™ 셀렉트 또는 0.5% 트립신을 사용하여 분해하였다. 상기 세포는 FACS 완충액을 함유하는 PBS-FBS에 재현탁시키고 세포 수 및 생존성 상태를 측정하였다. 상기 세포는 형광색소 접합된 모노클로날 항체 항-사람 CD31(WM-59) 및 항-사람 CD105로 염색시켰다. 비-생존 세포는 프로피디움 요오다이드(50 μg/ml)로 배제하였다. 생존 세포 분석은 FACSCaliburTM 또는 AccuriTM 유동 세포 측정기 상에서 수행하였다. 도 8은 EB 분화 10일째에 CD31+ 세포의 생성을 도시한다.
내피 세포의 정제: EB는 단일 세포 현탁액에 분산시키고 제조업자의 지침에 따라 항-CD31 MicroBeads(Milenyi 카탈로그 #130-091-935)를 사용하여 정제하였다. 자기 분류 후 수득한 집단은 내피 세포의 정제된 집단(CD31+ CD105+)을 생성시켰다. 상기 내피 세포는 아세틸화된 LDL의 흡수, 본 빌레브란트 인자 염색의 발현 및 마트리겔 튜브 형성 분석을 위해 시험하였다. 매트리겔 튜브 형성 분석은 iPSC로부터 유래된 내피 세포의 성공적인 생성을 나타냈다.
실시예 10
EB 분화 배지에 FGF-2의 함유는 조혈 전구 세포 분화의 효율을 증가시킬 수 있다.
hESC 및 iPSC의 분화는 하기의 조건하에서 별도로 평가하였다. 세포를 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2가 보충된, 성장 인자의 부재하에 TeSR에서 1일 동안 예비조건화시켰다. EB를 ml당 100만개 세포의 세포 밀도로 1μM ROCK 억제제가 보충된 EB 기본 배지(20% BIT-9500, 0.75% BSA, 50 μg/ml의 아스코르브산, 글루타민, NEAA 및 0.1 mM 모노티오글리세롤이 보충된 IMDM)에서 제조하였다.
12시간 내지 24시간 후, 상기 세포는 다음의 변형된 EB 분화 배지중 하나에 위치시켰다: (A) 25 ng/ml BMP4, 25 ng/ml VEGF, 0 ng/ml FGF-2; (B) 25 ng/ml BMP4, 25 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-2; (C) 50 ng/ml BMP4, 50 ng/ml VEGF, 25 ng/ml FGF-2. 분화 과정 전반에 걸쳐 상기 EB 배양물에 4일마다 절반 공급되었다. 상기 EB 배양물은 부분적으로 분화 4일 내지 5일 사이에 재응집시켰다. 이어서 상기 EB 배양물은 25 ng/ml FLt-3 리간드, 10 ng/ml IL-3 및 10 ng/ml의 GMCSF를 함유하는 배지에 위치시켰다. 상기 EB 배양물에 분화 과정 전반에 걸쳐 4일마다 절반 공급하였다
상기 EB 배양물은 분화 12일째에 수거하고 CD34, CD43, CD45, CD31, CD41, 및 CD235a (Gly-a)의 발현 %를 정량하였다. HPC 생성 효율은 EB 분화 12일째의 CD34+/CD43+ 이중 양성 세포의 절대 수를 ES/iPS 세포 수로 나누어 측정하였다.
결과: EB1 분화에 FGF-2의 보충은 상기 과정 효율을 iPSC(iPS-SONL)에서 6%로부터 12%로 및 hESC(H1 ES 세포)에서 8%로부터 21%로 증가시켰다. 도 9는 hESC(H1) 및 iPSC(SONL) 세포주에서 FGF 보충의 효율 증가를 요약한다. 도 10은 (50ng/ml BMP4, 50ng/ml VEGF 및 25ng/ml의 FGF-2)를 함유하는 변형된 EB1 배지의 존재하에 다양한 iPS 세포주의 전체 분화를 보여준다.
실시예 11
EB 분화 배지에 TPO , IL -6 및 IL -3의 함유
hESC 및 iPSC는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2가 보충된, 성장 인자 부재의 TeSR에서 1일 동안 별도로 예비조건화시켰다. 이어서 세포를, ml당 100만 내지 200만개 세포의 세포 밀도로 1 μM ROCK 억제제(H-1152)가 보충된 EB 기본 배지 (20% BIT-9500, 0.75% BSA, 50 μg/ml의 아스코르브산, 글루타민, NEAA 및 0.1 mM 모노티오글리세롤이 보충된 IMDM)에서 배양시킴에 의해 EB를 생성하였다. 12-24 시간 후, 상기 세포는 50 ng/ml BMP4, 50 ng/ml VEGF, 25 ng/ml FGF-2가 보충된 EB 기본 배지에 위치시켰다. 상기 EB 배양물은 분화 과정 전반에 걸쳐 4일마다 절반 공급하였다. 상기 EB 배양물은 분화 4 내지 5일째에 부분적으로 재응집시켰다.
상기 EB 배양물은 이어서 (A) 25 ng/ml Flt-3 리간드, 10 ng/ml GMCSF, 10 ng/ml IL-3; (B) 100 ng/ml Flt-3 리간드, 100 ng/ml SCF, 100 ng/ml TPO, 10 ng/ml IL-3, 10 ng/ml IL-6; (C) 50 ng/ml Flt-3 리간드, 50 ng/ml SCF, 50 ng/ml TPO, 10 ng/ml IL-3, 10 ng/ml IL-6; 또는 (D) 25 ng/ml Flt-3 리간드, 25 ng/ml SCF, 25 ng/ml TPO, 10 ng/ml IL-3, 10 ng/ml IL-6이 보충된 EB 기본 배지인 제2 EB 배지("EB2")에서 배양하였다.
상기 EB 배양물은 분화 과정 전반에 걸쳐 4일마다 절반 공급하고 EB 배양물은 분화 12일째에 수거하였다. CD34, CD43, CD45, CD31, CD41, 및 CD235a (Gly-a)의 각각을 발현하는 세포 %를 정량하였다. 조혈 전구 세포(HPC) 생성 효율은 분화 12일째에 CD34+/CD43+ 이중 양성 세포의 절대 수를 ES/iPS의 출발 세포 수로 나누어 측정하였다.
결과: EB2 배지에 TPO, IL-6 및 SCF의 보충은 iPS-SONL의 경우 15%로부터 55%로 HPC 생성 효율을 추가로 증가시켰다. H1 ES 세포는 21%로부터 28%로의 증가를 나타냈다. 도 11에 나타낸 바와 같이, HPC로의 분화 증가는 hESC (H1) 및 iPS (SONL) 세포주에서 상기 변형된 EB2 배지를 사용하여 관찰하였다. 도 12는 (H1) 및 iPS (SONL) 세포주에서 변형된 EB2 조합 (D)을 사용한 효율 증가를 나타낸다. Serum Replacer 3(Sigma)은 분화 과정에서 혈청 대용물로서 BIT-9500을 능가하는 것으로 관찰되었다.
실시예 12
분화 배양 조건에서 저산소 및 정상 산소의 평가
mTeSR을 사용한 매트리겔 피복된 플레이트 상의 공급 부재 성장에 적응된 미분화된 hESC 및 iPSC는 5회 이상의 계대 동안 5% O2(저산소) 및 20% O2(정상 산소) 조건의 존재하에 유지시켰다.
EB 분화는 하기의 조건하에 평가하였다:
(A) 정상 산소 조건하에서 유지된 미분화된 세포 및 정상 산소 조건하에서 12일 동안의 EB 분화("N-N");
(B) 정상 산소 조건하에서 유지된 미분화된 세포 및 저산소 조건하에서 12일 동안 EB 분화("N-H");
(C) 저산소 조건하에서 유지된 미분화된 세포 및 정상 산소 조건하에서 12일 동안 EB 분화("H-N");
(D) 저산소 조건하에서 유지된 미분화된 세포 및 저산소 조건하에서 12일 동안 EB 분화("H-H").
세포는 0.1 ng/ml TGF-β 및 20 ng/ml FGF-2가 보충된, 성장 인자 부재의 TeSR에서 1일 동안 예비조건화시켰다. 12 내지 24시간 후에 상기 세포는 상기 실시예에 기재된 바와 같이, ml당 100만 세포의 세포 밀도로 50 ng/ml BMP4, 50 ng/ml VEGF, 25 ng/ml FGF-2를 함유하는 변형된 EB 기본 배지에 위치시켰다. 상기 EB 배양물은 분과 과정 전반에 걸쳐 4일마다 절반 공급하였다. 상기 EB 배양물은 분화 4 내지 5일 사이에 부분적으로 재응집시켰다. 이어서 상기 EB 배양물은 25 ng/ml Flt-3 리간드, 25 ng/ml SCF, 25 ng/ml TPO, 10 ng/ml IL-3, 10 ng/ml IL-6이 보충된 EB 기본 배지에서 추가로 배양하였다. 상기 EB 배양물은 분화 과정 전반에 걸쳐 4일마다 절반 공급하였다.
상기 EB 배양물은 분화 12일째에 수거하고 CD34, CD43, CD45, CD31, CD41, 및 CD235a (Gly-a) 각각을 발현하는 세포의 %를 정량하였다. HPC 생성 효율은 EB 분화 12일째에 CD34+/CD43+ 이중 양성 세포의 절대 수를 ES/iPS 세포의 출발 수로 나누어 측정하였다.
결과: 도 13은 정상 산소 및 저산소 조건에서 iPS 세포 기원의 HPC 생성을 보여준다. 상기 EB 분화는 정상 산소 조건 뿐만 아니라 저산소 조건하에서 수행하였다. EB 분화가 저산소 조건하에서 수행되는 경우 보다 높은 HPC 수준이 관찰되었다. 저산소 조건하에서 미분화된 ES/iPS 세포의 유지는 분화 과정에 어떠한 유의적인 이득도 부가하지 않았다. 글리코포린 A 발현 세포는 정상 산소 조건하에서 감소되었다.
* * *
본원에 기재되고 청구된 방법 및 조성물 모두는 본원의 기재 관점에서 과도한 실험 없이 제조될 수 있고 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 바람직한 양태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어남이 없이 본원에 기재된 방법 및 조성물 및 방법의 단계 또는 방법 단계의 순서에 변화가 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적으로 및 생리학적으로 둘다 관련된 특정 제제가 본원에 기재된 제제를 대체할 수 있고 동일하거나 유사한 결과가 달성됨은 자명할 것이다. 당업자에게 자명한 모든 그러한 유사한 대체 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 정의된 본 발명의 취지, 범위 및 개념내에 있는 것으로 간주된다.
참조문헌
하기의 참조문헌은 이들이 본원에 제시된 것들에 보충적인 예시적 과정 또는 다른 세부사항을 제공하는 정도로 본원에 참조로서 인용된다.
Figure 112011074239247-pct00010
Figure 112011074239247-pct00011

Claims (66)

  1. 다능성 세포 (pluripotent cell)를 조혈 전구 세포로 분화시키는 방법으로서,
    a) 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 제1 한정 배지 (defined medium)에서 다수의 미분화된 다능성 세포를 배양하거나 유지시키는 단계;
    b) BMP4, VEGF, IL-3, Flt3 리간드 및 GMCSF가 부재이거나 외부로부터 첨가가되지 않은 제2 한정 배지에서 12시간 내지 7일의 기간 동안 상기 세포를 배양하여, 상기 세포를 분화를 위해 예비조건화시키는 단계로서, 상기 제2 한정 배지가 10 pg/ml 내지 5 ng/ml의 TGF-β 및 1 ng/ml 내지 100 ng/ml의 FGF-2를 추가로 포함하는 단계;
    c) 10-50 ng/ml의 BMP4 및 10-50 ng/ml의 VEGF를 포함하는 제3 한정 배지에서 상기 세포를 배양하여, 다수의 상기 세포의 분화를 촉진하는 단계; 및
    d) 5-25 ng/ml의 IL-3 및 10-50 ng/ml Flt3 리간드를 포함하는 제4 한정 배지에서 상기 세포를 배양하여, 다수의 상기 세포를 증식하고 분화를 촉진하는 단계
    를 연속적 단계로 포함하여, 다수의 상기 다능성 세포가 조혈 전구 세포로 분화되고, 이때 상기 다능성 세포는 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC) 또는 사람 배아 줄기 세포 (hESC)인, 다능성 세포를 조혈 전구 세포로 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제3 한정 배지가 FGF-2, 또는 펩타이드 F2A4-K-NS, FG 루프 (FGL) 펩타이드 및 BioSET F2A 펩타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 FGF-2 모사체를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제4 한정 배지가 IL-3, Flt3 리간드 및 GMCSF를 포함하거나, IL-3, Flt3 리간드를 IL-6, SCF 또는 TPO 중 하나 이상과 포함하는, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제4 한정 배지가 혈청 대체물 3 (Serum Replacement 3)을 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다능성 세포가 유도된 다능성 줄기 세포 (iPSC)인, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포 중 적어도 일부를 단계 (b) 전에 적어도 부분적으로 분리하거나, 또는 개별화하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포를 효소를 사용하여 개별화하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 개별화 후에 상기 세포를 ROCK 억제제 및 트립신 억제제와 접촉시키는, 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다능성 세포를 트립신 또는 TRYPLETM에 노출시키는, 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 다능성 세포를 재응집 후에 ROCK 억제제가 외부로부터 첨가되지 않은 배지에서 배양하는, 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방법이 20% 미만의 산소 대기압에서 상기 다능성 세포를 배양함을 추가로 포함하고, 응집체당 200개 내지 1000개의 세포를 사용하여 다수의 배상체(EB)를 생성시키는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 매트릭스로 피복된 표면상에서 상기 세포를 배양함을 포함하는, 방법.
  13. 제1항, 제2항 및 제12항 중의 어느 한 항에 있어서,
    i) 상기 제2 한정 배지가 TeSR-GF 또는 X-vivo15TM 배지를 포함하는 특징,
    ii) 상기 제2 한정 배지가 0.1 ng/ml의 TGF-β 및 20 ng/ml의 FGF-2를 추가로 포함하는 특징,
    iii) 단계 (b)가 12시간 내지 3일의 기간 동안 상기 세포를 배양함을 포함하는 특징,
    iv) 단계 (c)가 4 내지 8일의 기간 동안 상기 세포를 배양하거나 분화시킴을 포함하는 특징,
    v) 단계 (d)가 4일 이상의 기간 동안 상기 세포를 배양함을 포함하는 특징,
    vi) 다수의 상기 다능성 세포가 골수 선조 세포로 분화되는 특징,
    vii) 상기 골수 선조 세포가 CD31, CD43 및 CD45를 공동-발현하는 특징,
    viii) 상기 제3 한정 배지가 10-50 ng/ml의 BMP4 및 10-50 ng/ml의 VEGF를 포함하는 특징,
    ix) 상기 제3 한정 배지가 10-50 ng/ml의 FGF-2를 추가로 포함하는 특징,
    x) 상기 제4 한정 배지가 5-25 ng/ml의 IL-3 및 10-50 ng/ml의 Flt3 리간드를 포함하는 특징, 또는
    xi) 상기 제4 한정 배지가 5-25 ng/ml의 GMCSF를 추가로 포함하거나, 10-100 ng/ml의 TPO, 10-100 ng/ml의 SCF, 5-25 ng/ml의 IL-6 및 5-25 ng/ml의 IL-3을 추가로 포함하거나, 5-25 ng/ml의 GMCSF, 10-100 ng/ml의 TPO, 10-100 ng/ml의 SCF, 5-25 ng/ml의 IL-6 및 5-25 ng/ml의 IL-3을 추가로 포함하는 특징
    중의 하나 이상을 가지는 방법.
  14. 제1항, 제2항 및 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제3 한정 배지가 50 ng/ml의 BMP4, 50 ng/ml의 VEGF를 포함하고, 25 ng/ml의 FGF-2를 추가로 포함하는, 방법.
  15. 제1항, 제2항 및 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 제4 한정 배지가 10 ng/ml의 IL-3, 25 ng/ml의 Flt3 리간드 및 20 ng/ml의 GMCSF를 포함하고, 10 ng/ml의 IL-6, 25 ng/ml의 SCF 및 25 ng/ml의 TPO를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제1항, 제2항 및 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 다수의 상기 조혈 전구 세포가 CD43, CD34, CD31 및 CD45를 포함하는 목록으로부터 선택된 2개 이상의 세포 마커를 발현하는, 방법.
  17. 제1항, 제2항 및 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 전구 세포 중 하나 이상이 적혈구 세포, 골수 세포 또는 림프 세포로 분화되는, 방법.
  18. 제1항, 제2항 및 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 제5 한정 배지에서 다수의 상기 세포를 배양함을 포함하는 방법으로서, 이때 상기 제5 한정 배지가
    IL-3, IL-6, SCF, EPO 및 TPO로 이루어진 목록으로부터 선택되는 하나 이상의 성장 인자를 다수의 상기 세포의 증식 및 적아세포로의 분화를 촉진시키기에 충분한 양으로 포함하거나
    SCF, IL-6, G-CSF, EPO, TPO, FGF2, IL-7, IL-11, IL-9, IL-13, IL-2 또는 M-CSF로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 상기 세포의 증식 및 추가의 분화를 촉진시키기에 충분한 양으로 포함하거나,
    IL-7, SCF 및 IL-2로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 상기 세포의 증식 및 NK 세포로의 분화를 촉진시키기에 충분한 양으로 포함하는, 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 방법이 제5 한정 배지에서 다수의 상기 세포를 배양함을 추가로 포함하는 방법으로서, 이때 상기 제5 한정 배지가 Fc 키메라 Notch DLL-1 리간드, 그리고 IL-7, SCF 및 IL-2로 이루어진 목록으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자를 상기 세포의 증식 및 T 세포로의 분화를 촉진시키기에 충분한 양으로 포함하는, 방법.
  20. 제1항, 제2항 및 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 다능성 세포가 포유동물 다능성 세포인, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 다능성 세포가 사람 다능성 세포인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 사람 다능성 세포가 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)인, 방법.
  23. 제1항에 있어서, 단계 b)에서, 상기 제2 한정 배지가 0.05 ng/ml 내지 0.5 ng/ml의 TGF-β 및 5 ng/ml 내지 50 ng/ml의 FGF-2를 포함하는, 방법.
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