CN105296428A - 一种提高诱导多能干细胞的体外分化造血效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高诱导多能干细胞体外分化为造血干细胞效率的方法，该方法是将OP9与iPSCs体外共培养，同时分化培养基中添加了SCF、BMP4、IL-3、IL-6和TPO等营养因子。本发明方法使CD34+CD43+双阳性率上升至15.3％，分化效率明显上调，说明添加了正向调节因子可诱导iPSCs向造血干细胞分化，仅通过添加细胞因子方法即可方便快捷的提高分化效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种提高诱导多能干细胞(iPS细胞)体外分化为造血干细胞效率的方法。
背景技术
血液病是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，其常表现为贫血、出血、发热等症状。
我国儿童恶性癌症的发病率呈上升趋势，截止2014年的数据显示，儿童恶性肿瘤中，白血病的发病率居第一位，约占三分之一。对于恶性血液系统疾病而言，临床上的化疗效果往往不甚理想。自从二十世纪中期Thomas教授首先开展了造血干细胞移植以来，造血干细胞移植广泛地被应用于血液病的临床治疗中，已经成为治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、重型再障等病的有效手段之一。
目前造血干细胞的主要来源是脐带血、骨髓和外周血。造血干细胞移植主要分为自体和异体造血干细胞移植两种。尽管自体移植具有无移植排斥、移植物抗宿主病等并发症的优点，但自体造血干细胞(HSC)中残留存在的肿瘤细胞可能导致移植后疾病复发；相反，异体移植虽然远期疗效优于自体移植且复发率低，但是配型效率极低，来源有限，从而限制了异基因HSC移植的临床应用。
因此，目前迫切寻求更为安全、成本较低、来源稳定简单的造血干细胞资源。而胚胎干细胞和iPS细胞定向分化为造血干细胞技术的研究有望解决这一难题。
研究表明，小鼠、猴子和人的胚胎干细胞(ESCs)在体外都可以被诱导造血分化。由于胚胎干细胞及其衍生物存在取材困难、免疫排斥、伦理道德等问题，而iPS细胞不存在上述问题，因此其成为很好的研究对象并有望应用于临床。
iPS细胞被称为全能性细胞，在体外能被诱导分化成多种来自各个胚层的细胞，例如造血细胞、神经前体细胞、心肌细胞和生殖细胞衍生的细胞等。iPS细胞这一特性将可能为揭示造血干细胞的发生过程提供一个较好的研究平台，同时可帮助深入了解各类血液病的发病机制并为其治疗带来曙光。
目前，已有多种体外诱导方法被报道，例如：与基质细胞共培养法、拟胚体形成法及单层诱导等方法。但是，何种方法效率最高并没有严格的报道。这对于未来医学个体化干细胞治疗来说，缺乏了体外分化为造血干细胞的准则。因此更加亟需规范的准则。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高诱导多能干细胞(iPS细胞)体外分化为造血干细胞效率的方法，该方法使用OP9与iPSCs体外共培养，通过鸡尾酒式添加法添加细胞因子，旨在提高体外造血分化效率。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种提高诱导多能干细胞(iPS细胞)体外分化为造血干细胞效率的方法，包括以下步骤：
(1)将OP9细胞(小鼠骨髓基质细胞)培养至过密状态；
(2)将iPS细胞用PBS洗涤2遍后加入Dispase(分散酶)消化，待克隆的边界出现轻微卷缩后吸走Dispase，再加入DMEM/F12培养基，用枪头将克隆吹散至成均匀块状，然后移至离心管中待其自然沉降，弃上清，加入分化培养基；
(3)将已培养至过密状态的OP9细胞的培养基也更换为分化培养基；然后将步骤(2)得到的iPS细胞接种到OP9细胞中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养一天后，第二天全部换液将死细胞及未贴壁细胞去除，之后隔天对半换液以提高分化效率，在第14天收取造血干细胞；
步骤(1)所用的培养基是α-MEM培养基加入20％胎牛血清；
本发明所述的分化培养基是α-MEM培养基加入10％胎牛血清、100umol/L硫代甘油(MTG)，以及加入40ng/ml的干细胞因子(stemcellfactor，SCF)、20ng/ml的骨形态发生蛋白4(BMP4)、20ng/ml的白细胞介素-3(IL-3)、20ng/ml的白细胞介素-6(IL-6)和20ng/ml的血小板生成素(TPO)；
本发明所述的诱导多能干细胞是用从外周血分离出的单个核细胞利用Invitrogen的仙台病毒重编程试剂盒(A16517)诱导而成。
本发明利用外周血单核细胞(PBMCs)为原材料的iPSCs(诱导多能干细胞)作为研究造血分化体系的细胞。在对照组中仅使用常规报道的分化培养基，而实验组中添加SCF、TPO、BMP4、IL-3、IL-6因子。干细胞因子(stemcellfactor，SCF)是一种通过锚定并且表达与所有HSC表面的酪氨酸受体c-kit而发挥作用的因子，c-kit的表达将引起HSC扩增数量增多。血小板生成素(TPO)被认为是巨核细胞系特异性生长因子，属于特异性作用细胞因子，可以维持巨核细胞增殖、分化、成熟及形成有功能的血小板等。骨形态发生蛋白4(BMP4)能够激活Wnt3a和上调Cdx和Hox基因，诱导腹侧后面中胚层的形成，进一步促进中胚层直接向造血方向分化。白细胞介素-3(IL-3)被称为肥大细胞生长因子，主要由激活的T淋巴细胞产生，能够刺激多能造血干细胞的增殖与分化，白细胞介素-6(IL-6)是一类多功能细胞因子，可以诱导细胞增殖分化等。综上所述，所添加的因子均对造血干细胞生成起正向调节作用。
CD34和CD43分子表达于早期造血干/祖细胞、内皮细胞和胚胎成纤维细胞的表面，占血细胞总数量低于5％。两者相配合用于体外检测造血干/祖细胞的生成率。
本发明相比于现有技术具有如下优点和效果：
本发明方法的分化培养基添加了若干种营养因子，可观察到，CD34+单阳性率上升到37.1％(对照组为18％)，分化效率明显上调；说明添加了正向调节因子可诱导iPSCs向造血干细胞分化，仅通过添加细胞因子方法即可方便快捷的提高分化效率。
附图说明
图1是流式检测CD34+率的结果图，从左至右分别是阴性组、对比例、实施例。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例
一种提高诱导多能干细胞(iPS细胞)体外分化为造血干细胞效率的方法，包括以下步骤：
(1)将OP9细胞(小鼠骨髓基质细胞)60mm培养皿中培养至过密状态；所用的培养基是α-MEM培养基加入20％胎牛血清；
(2)将iPS细胞用PBS洗涤2遍后加入Dispase(分散酶)消化，待克隆的边界出现轻微卷缩后吸走Dispase，再加入2mlDMEN/F12培养基，用1ml枪头将克隆吹散至成均匀块状，然后移至15ml离心管中待其自然沉降，弃上清，加入1ml分化培养基(置于35mm培养皿中，约106个细胞)；
(3)将已培养至过密状态的OP9细胞的培养基也更换为分化培养基；然后将步骤(2)得到的iPS细胞接种到OP9细胞中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养一天后，第二天全部换液将死细胞及未贴壁细胞去除，之后隔天对半换液以提高分化效率，在第14天收取造血干细胞；
所用的分化培养基是α-MEM培养基加入10％胎牛血清、100umol/L硫代甘油(MTG)，以及加入40ng/ml的干细胞因子(stemcellfactor，SCF)、20ng/ml的骨形态发生蛋白4(BMP4)、20ng/ml的白细胞介素-3(IL-3)、20ng/ml的白细胞介素-6(IL-6)和20ng/ml的血小板生成素(TPO)。
对比例
一种提高诱导多能干细胞(iPS细胞)体外分化为造血干细胞效率的方法，所用的分化培养基是α-MEM培养基加入10％胎牛血清、100umol/L硫代甘油(MTG)，其他的操作同实施例。
阴性组
阴性组是做流式细胞仪必须要用的一个组别，用以区别阴阳性。具体操作就是使用普通ips，即未进行造血分化实验的细胞或者是虽进行分化实验但是并不用流式抗体染色的细胞。
实施例和对比例共培养第14天的细胞用PBS洗涤2遍后先用1mg/ml的胶原酶Ⅳ消化20min，再用0.25％的胰酶消化15-20min，然后中止消化。吹打细胞呈单细胞悬液；收集细胞到15ml离心管中1000r/min离心5min，丢弃上清后用1ml含2％血清的流式buffer重悬，再过一次100um的无菌细胞筛网，加入抗体CD34-PE-CY7和CD45-APC，4℃30min后用流式buffer清洗。然后以5×106/ml的密度重悬细胞，使用流式仪AriaⅢ检测，FACSDiva软件分析其分化效率。
结果如图1所示，流式细胞分析发现对比例CD34+CD43+双阳性率为5.6％，而在实验例中可观察到，双阳性率上升至15.3％，分化效率明显上调。说明添加了正向调节因子可诱导iPSCs向造血干细胞分化。
以上结果说明iPSCs与OP9共培养可向造血方向分化，且在分化培养基中添加适当的细胞因子可有效提高造血分化效率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种提高诱导多能干细胞体外分化为造血干细胞效率的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将OP9细胞培养至过密状态；
(2)将iPS细胞用PBS洗涤2遍后加入分散酶消化，待克隆的边界出现轻微卷缩后吸走分散酶，再加入DMEN/F12培养基，用枪头将克隆吹散至成均匀块状，然后移至离心管中待其自然沉降，弃上清，加入分化培养基；
(3)将已培养至过密状态的OP9细胞的培养基也更换为分化培养基；然后将步骤(2)得到的iPS细胞接种到OP9细胞中，在37℃、5％CO2的培养箱中培养一天后，第二天全部换液将死细胞及未贴壁细胞去除，之后隔天对半换液以提高分化效率，在第14天收取造血干细胞；
所述的分化培养基是α-MEM培养基加入10％胎牛血清、100umol/L硫代甘油，以及加入40ng/ml的干细胞因子、20ng/ml的骨形态发生蛋白4、20ng/ml的白细胞介素-3、20ng/ml的白细胞介素-6和20ng/ml的血小板生成素。
2.根据权利要求1所述的提高诱导多能干细胞体外分化为造血干细胞效率的方法，其特征在于：步骤(1)所用的培养基是α-MEM培养基加入20％胎牛血清。
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