JP6344821B2 - 造血前駆体の集団および造血前駆体のための幹細胞を富化する方法 - Google Patents
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Description
本願は、2011年11月21日に出願された米国仮特許出願第61/562,094号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
本発明は、造血前駆体(hematopoietic progenitor)の集団、および造血前駆体のための幹細胞の集団を富化するための方法に関する。
ヒト多能性幹細胞(PSC)、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)から造血幹細胞(HSC)を生成できるということは、移植のための患者にマッチした幹細胞の無制限数の生成およびヒト造血発生およびヒト造血疾患を研究するための新規インビトロモデルの誘導を可能にする。hPSCを血清ベースの培地中で間質細胞とともに共培養することによるか、またはh規定の無血清培地において特定のモルフォゲンで該PSCの分化を誘導することによるか、のいずれかによって、hPSCから造血系統の細胞を得ることが可能であるということは、多くの研究から示されてきた(Chadwick et al., 2003; Davis et al., 2008; Kaufman et al., 2001; Kennedy et al., 2007; Ledran et al., 2008; Ng et al., 2005; Pick et al., 2007; Vodyanik et al., 2006; Yu et al., 2010; Zambidis et al., 2005)。これらのアプローチは、広い範囲の造血前駆体を生じるが、このような培養物の後代を免疫無防備状態のマウスへと移植することは、代表的には、骨髄系統にしばしば制限される低レベルの生着を生じた(Lu et al., 2009; Tian et al., 2006; Wang et al., 2005)。これらの知見から、造血分化(hematopoietic differentiation)のために使用する条件は、HSCの発生を支援しないことが示唆される。hPSCからHSCを生成することにおける失敗に寄与する大きな要因は、少なくとも2つの別個のプログラム(そのうちの一方のみが、HSCを生じる)からなる胚性造血系の複雑さである。
無血清培養物において特定のモルフォゲンで誘導したhESCおよびhiPSCから二次造血プログラムの開始を記録するためのT細胞潜在能の使用が、本明細書で記載される。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法であって、該方法は、
a.造血分化を、ヒト胚性幹細胞もしくはヒト人工多能性幹細胞の集団において誘導する工程;
b.該集団を、CD43、ならびにCD34、CD31およびCD144のうちの少なくとも1つの発現に基づいて選別する工程;ならびに
c.CD34 + CD43 − 、CD31 + CD43 − およびCD144 + CD43 − のうちの少なくとも1つである画分を選択する工程、
を包含する、方法。
(項目2)
造血分化を誘導する工程は、無血清で行われる、項目1に記載の方法。
(項目3)
造血分化を誘導する工程は、間質なしで行われる、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記造血分化を誘導する工程は、0日目〜4日目の間に、前記集団をBMP4とともに培養する工程を包含する、項目1〜3のいずれか1項に記載の方法。
(項目5)
前記造血分化を誘導する工程は、1日目〜8日目の間に、前記集団をbFGFとともに培養する工程を包含する、項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記造血分化を誘導する工程は、3日目〜13日目の間もしくは4日目〜9日目の間に、前記集団を、VEGF、DKK、IL−6およびIL−11のうちの少なくとも1つ、ならびに/またはこれらの組み合わせとともに培養する工程を包含する、項目1〜5のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記造血分化を誘導する工程は、4日目〜13日目の間もしくは6日目〜9日目の間に、前記集団をSCFおよびEPOのうちの少なくとも一方とともに培養する工程を包含する、項目1〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記造血分化を誘導する工程は、6日目〜13日目の間もしくは8日目〜9日目の間に、前記集団を、TPO、Flt−3およびIL−3のうちの少なくとも1つ、ならびに/またはこれらの組み合わせとともに培養する工程を包含する、項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記造血分化を誘導する工程は、前記集団を、最大1ng/mlまでのアクチビンA、好ましくは、約0.3ng/ml、およびさらに好ましくは、約0ng/mlとともに培養する工程を包含する、項目1〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記造血分化を誘導する工程は、アクチビン/ノーダルシグナル伝達を阻害する工程を包含する、項目1〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
アクチビン/ノーダルシグナル伝達を阻害する工程は、前記集団を、アクチビン/ノーダルインヒビターとともに培養する工程を包含する、項目10に記載の方法。
(項目12)
前記インヒビターは、SB−431542である、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記インヒビターは、分化の1.5日目〜5日目の間もしくは2日目〜4日目の間、または分化の約1.75日目に、細胞の培養物に添加される、項目11〜12のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記選別する工程は、分化の約6日目〜約13日目もしくは約7日目〜約10日目の間に行われる、項目1〜13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記集団は、CD43およびCD34の発現に基づいて選別され、前記選択される画分は、CD34 + CD43 − である、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記集団は、CD43およびCD31の発現に基づいて選別され、前記選択される画分は、CD31 + CD43 − である、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記集団は、CD43およびCD144の発現に基づいて選別され、前記選択される画分は、CD144 + CD43 − である、項目1〜14のいずれか1項に記載の方法。
(項目18)
前記画分は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%の造血前駆体を含む、項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
項目1〜18のいずれか1項に記載の方法を使用して得られる、造血前駆体の集団。
(項目20)
造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法であって、該方法は、造血分化の間にアクチビン/ノーダルシグナル伝達を阻害する工程を包含する、方法。
(項目21)
前記アクチビン/ノーダルシグナル伝達を阻害する工程は、前記集団を、アクチビン/ノーダルインヒビター、好ましくは、SB−431542とともに培養する工程を包含する、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記集団は、1μM〜10mMの間、1μM〜1mM、もしくは約6μMの前記アクチビン/ノーダルインヒビターとともに培養される、項目21に記載の方法。
(項目23)
造血前駆体のために、造血分化を受けている幹細胞の集団を富化するためのアクチビン/ノーダルインヒビターの使用。
(項目24)
前記アクチビン/ノーダルインヒビターは、SB−431542である、項目21に記載の使用。
ヒト多能性幹細胞(PSC)からの造血幹細胞の効率的生成は、分化の間の二次造血プログラムの適切な特殊化に依存する。本発明者らは、無血清培養および間質なしの培養において特定のモルフォゲンで誘導したヒト胚性および人工PSCからの二次造血の開始を追跡するためにTリンパ球潜在能を使用した。本発明者らは、このプログラムが、CD34、VE−カドヘリン、GATA2、LMO2およびRUNX1の発現を含む血液生成内皮細胞の特徴を有する前駆体集団から発生することを示す。T細胞とともに、これらの前駆体は、骨髄系細胞および赤血球系細胞(erythroid cell)を生成する能力を示す。分化の初期ステージの間のアクチビン/ノーダルシグナル伝達の操作から、二次造血前駆体集団の発生は、この経路に依存しないことが明らかにされ、そのことにより、それが一次造血から区別された。まとめると、これらの知見から、PSCからTリンパ系前駆体を生成することは可能であること、および、この系統は、その出現がヒト二次造血の開始のしるしである集団から発生するということが実証される。
(ヒトES細胞およびiPS細胞の維持および分化)
hESC系H1(Thomson et al., 1998)および再プログラムされたヒトiPS細胞系(MSC−iPS1; (Park et al., 2008))を、この研究において使用した。それらを、以前に記載されるとおり(Kennedy et al., 2007)、hESC培地中の照射したマウス胚性線維芽細胞上で維持した。分化の前に、上記細胞を、hESC培地中、マトリゲル(BD Biosciences, Bedford, MA)上で24〜48時間にわたって培養することによって、フィーダーを除去した。EBを生成するために、hPSCを、コラゲナーゼB(1mg/ml; Roche, Indianapolis, IN)で20分間にわたって、続いて、短時間のトリプシン−EDTA(0.05%)工程で処理した。細胞を、細胞スクレイパーで穏やかに剥がして、小さな集合物(10〜20細胞)を形成させた。集合物を、ペニシリン/ストレプトマイシン(10ng/mL)、L−グルタミン(2mM)、アスコルビン酸(1mM)、モノチオグリセロール(MTG, 4×10−4M; Sigma)、およびトランスフェリン(150μg/mL)を補充したStemPro−34(Invitrogen)中に再懸濁した。BMP−4(10ng/mL)、bFGF(5ng/mL)、アクチビンA、6μM SB−431542、VEGF(15ng/mL)、Dkk(150ng/mL)、IL−6(10ng/mL)、IGF−1(25ng/mL)、IL−11(5ng/mL)、SCF(50ng/mL)、EPO(2U/mL 最終)、TPO(30ng/mL)、IL−3(30ng/mL)およびFlt−3L(10ng/mL)を、示されるように添加した。培養物を、5% CO2/5% O2/90% N2環境において最初の8日間にわたって維持し、次いで、5% CO2/空気環境へと移した。全ての組換え因子はヒトであり、R&D Systems(Minneapolis, MN)から購入した。
Delta−like 4を発現するようにレトロウイルスで形質導入したOP9細胞(OP9−DL4)を生成し、ペニシリン/ストレプトマイシンおよび20% FBSを補充したα−MEM培地(OP9培地)中で、先に記載されるように(La Motte−Mohs et al., 2005; Schmitt et al., 2004)維持した。5〜10×104の選別したヒトEB由来サブセットを、OP9−DL4細胞を含む6ウェルプレートの個々のウェルに添加し、rhFlt−3L(5ng/mL)およびrhIL−7(5ng/mL)(Peprotech, Rocky Hill, NJ)を補充したOP9培地中で培養した。rhSCF(100ng/mL)を、最初の8日間のみにわたって添加した。5日間ごとに、共培養物を、激しくピペッティングし、40μm細胞ストレーナーを通して間質細胞を除去することによって、新鮮なOP9−DL4細胞の上に移した。
選別した細胞を、24ウェルプレート中のVEGF(5ng/mL)、TPO(30ng/mL)、SCF(50ng/mL)、Flt3(10ng/mL)、IL−11(5ng/mL)、およびBMP−4(10ng/mL)を含むOP9培地中、照射したOP9−DL1単層上で7日間にわたって、2×104細胞/ウェルの濃度で培養した。細胞を上記のように採取した。
選別した集団を、25×104細胞/mLで6日目の培地に再懸濁し(図1A)そして50μLを、低クラスター96ウェルプレートのウェルに添加した。翌日、1条件あたり2ウェルをプールし、1mLの培地を添加した低クラスター24ウェルプレートへと移した。24時間後、8日目の培地を上記ウェルに添加し、正常酸素条件(normoxic condition)に移した。
SB処理CD34++CD43−細胞を、OP9−DL4細胞上で37〜40日間にわたって共培養した。刺激のときに、共培養物を、12ウェルプレートの個々のウェル中の新鮮なOP9−DL4細胞上に播種した。全てのウェルに2ng/mL rhIL−7およびrhIL−2を補充したOP9培地を与え、刺激したウェルに、5μg/mL α−CD3(クローンHIT3a)mAbおよび1μg/mL α−CD28(クローン28.2)mAbを添加した。4日間の後に、フローサイトメトリーを行った。
以下の抗体を、これらの研究のために使用した:CD3−APC(クローンUCHT1)、CD4−APC−EFluor750(クローンRPA−T4)、CD5−PE−Cy7(クローンL17F12)、CD7−FITC(クローンM−T701)、CD8−eFluor−650 NC(クローンRPA−T8)、CD31−FITC(クローンWM59)、CD33−FITC(クローンHIM 3−4)、CD34−APC(クローン8G12)、CD34−PE−CY7(クローン4H11)、CD41−APC(クローンHIP8)、CD42b−PE(クローンHIP1)、CD43−PE(クローン1G10)、CD45−APC−eFluor750(クローン2D1)またはCD45−PacificBlue(クローンH130)、CD56−PE−Cy7(クローンB159)、CD90−APC(クローン5E10)、CD117−APC(クローン104D2)、CD144−PE(クローン123413)、KDR−PE(クローン89106)、TCRγδ−FITC(クローン11F2)、TCRαβ−PE(クローンT10B9.1A−31)。染色した細胞を、示された時点において、LSRII(BD Biosciences)フローサイトメーターを使用して分析した。データ分析を、FlowJoソフトウェアを使用して行った。Tリンパ系研究については、生細胞および6−ジアミジノ−2−フェニルインドール(DAPI)取り込みの欠如に対してゲーティングし、続いて、CD45を発現する細胞に対してゲーティングすることによって、分析を行った。全ての抗体を、以下を除いて、BD Biosciences(San Diego, CA)から購入した:CD8 eFluor−650 NCおよびCD34−PE−CY7をeBioscience(San Diego, CA)から購入し、KDRをR&D systemsから購入した。細胞を、Sick Kids/UHNフローサイトメトリー施設においてFACSAriaTMII(BD)セルソータ−で選別した。
アクチビンA誘導性EBもしくはSB処理EBのいずれかから単離したCD34+CD43−細胞の限界希釈アッセイ(LDA)を、連続希釈によって行った。CD34+CD43−を、FACS Ariaセルソータ−を使用して上記EB集団から選別し、上記アクチビンA処理サブセットのうちの10000(n=22)、3000(n=54)、1000(n=57)、300(n=84)もしくは100(n=90)の細胞、または上記SB処理サブセットのうちの10000(n=21)、3000(n=54)、1000(n=60)、300(n=83)、100(n=114)もしくは30(n=48)の細胞を、OP9−DL4細胞を含む96ウェルプレートの個々のウェルへと入れた。前駆体を16日間にわたって培養し、その後、採取およびフローサイトメトリー分析を行った。CD45+CD7+ CD43+CD5+細胞の存在をスコア付けした。前駆体頻度を、ポワソンモデルに適用される最尤法(Groth, 1982)によって決定した。
5×103〜2.5×104の選別した細胞もしくは2.5×104〜5.0×104の非分画EB集団のいずれかを、以前に詳細に記載されるように(Kennedy et al., 2007)、特定のサイトカインを含む1% メチルセルロースに蒔くことによって、造血コロニー潜在能の分析を行った。赤芽球、赤芽球/骨髄系細胞および骨髄系細胞(マクロファージもしくはマスト細胞のいずれか)からなるコロニーを、10〜14日間の後に定量化した。
総RNAを、RNAqueous RNA Isolation Kit(Ambion)で調製し、RNase非含有DNase(Qiagen)で処理した。100ng〜1μg RNAを、ランダムヘキサマーおよびオリゴ(dT)を使用して、Superscript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)でcDNAへと転写した。リアルタイム定量的PCRを、MasterCycler EP RealPlex(Eppendorf)で行った。全ての実験を、SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix(Sigma)を使用して三連にて行った。オリゴヌクレオチド配列は、要求に応じて入手可能である。遺伝子発現を、コントロール(ACTB)に対するDeltaCtとして評価した。
分化の2日目にDMSO、アクチビンA、および/もしくはSBを添加して30分間後に、ウェルを採取し、RIPA緩衝液を使用して氷上で溶解した。タンパク質を、SDS−PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に転写し、Smad2抗体(Cell Signaling, 1:1000)およびホスホ−Smad2抗体(Millipore, 1:1000, Ser 465/467)で一晩プローブした。膜を、LI−COR Biosciences Odyssey画像化システムを使用してスキャンした。
ゲノムDNAを、Qiagen DNeasy Blood and Tissueキットを使用して、アクチビンA処理もしくはSB処理したCD34+CD43−/OP9−DL4共培養物から単離した。ゲノムDNA(200ng)を、30サイクル(95℃において1分間;66℃において2分間;および72℃において5分間)にわたって、1.5mM MgCl2、1U Taq Polymerase、10mM dNTP、および以前に公開されたプライマーの各々400nM(Timmermans et al., 2009)を含む25μL 反応緩衝液中でポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅し、Dβ2−Jβ2 T細胞レセプター遺伝子再配列を検出した。PCR生成物を、293T線維芽細胞およびヒト出生後胸腺細胞(PNT)を、それぞれ、生殖細胞系列コントロールおよび再配列コントロールとして使用して、アガロースゲル電気泳動を使用して分離した。
(hESCの無血清および間質なしでの造血分化)
無血清条件および間質なしの条件下での二次造血プログラムの前駆体を生成するために、本発明者らは、BMP−4、アクチビンA、bFGFおよびVEGFと、造血サイトカインとを一緒にした、最適化ステージ特異的組み合わせを有する既知組成培地中で、胚様体(EB)としてH1 hESCの分化を誘導した(図1A)。この誘導スキームでは、コロニー形成細胞が分化の6日目程度の早さで検出された。それらの数は、次の3日間にわたってわずかに増え、次いで、分化の11日目まで劇的に増え、その後、15日目まで低レベルへと下降した(図1B)。これらのステージで検出された前駆体の大部分は、赤芽球に限定されたが、多分化能性赤芽球−骨髄系細胞および骨髄系コロニー形成細胞の両方がまた、少数ではあったものの存在した。赤芽球前駆体およびそれらの発生の一時的なパターンが優勢であることは、この早期の造血集団がヒト一次造血を代表し得ることを示唆する。
分化の9日目において観察されたプロフィール(図2A)は、Timmermans et al. (2009)がT細胞前駆体を同定したステージにもっともよく似ているので、本発明者らは次に、コロニーアッセイおよび表面マーカー発現によって、造血潜在能に関してこのステージからの異なるCD34/CD43画分を分析した。全ての赤芽球、骨髄系および赤芽球/骨髄系前駆体をCD43+画分へと分離し(図2B)、より早期の研究からの知見(Timmermans et al., 2009; Vodyanik et al., 2006)を確認した。P1(CD34+CD43−)もP5(CD34−CD43−)も、いかなるコロニー形成細胞をも含まなかった。CD43+前駆体から生成される赤芽球コロニーの大部分は、小型で密集した形態であり、高レベルのε−グロビンおよび非常に低レベルのβ−グロビンを発現する大きな有核細胞を含んだ(図6D, E)。このことは、それらが原始赤芽球(primitive erythroblast)であることを示した。
本発明者らは次に、規定した条件下で生成した原始赤芽球集団がCD34+中間体に由来するかどうかを決定することを対象にした。なぜなら、以前の研究から、血清誘導性培養物において生成した最も早期のhESC由来の造血細胞がCD34+前駆体から発生することを示したからである(Vodyanik et al., 2006)。この問題に対処するために、本発明者らは、分化の6日目(CD43+CD41a+CD235a+原始集団の増殖より前のステージ)での前駆体を分析した。この段階において検出されたCD34+CD43−集団およびより小さいCD34+CD43+集団の両方(図2D)を選別し、再集合させ、さらに3日間にわたって培養し(合計で9日目)、その後、分析した。CD34+CD43+由来の集団全体が、CD43を発現し、これらの細胞の大部分が、CD41aおよびCD235aを共発現した(図2D,下側パネル)。対照的に、CD34+CD43−由来の集団のうちの50%のみがCD43を発現し、これらのうち、約60%が、CD41aおよびCD235aを共発現した(中央パネル)。これらの差異と一致して、CD34+CD43+集団は、CD34+CD43−集団より13倍多くの前駆体を生成し(図2E)、その大部分は、原始赤芽球であった。CD34+CD43−集団は、主に骨髄系前駆体を生じた。まとめると、これらのデータから、ヒト一次造血は、分化培養において6日目程度の早さで出現するCD34+前駆体から発生し、CD43の共発現によって同定され得ることが明らかに実証される。
RT−qPCR分析から、SOX17(これは、マウスESC分化モデルにおいて二次造血の出現を規定する(Irion et al., 2010))は、P1細胞において最高のレベルで発現し、P2細胞においてより低い程度で発現し、P3およびP4の原始集団では全く発現しないことが明らかとなった(図2F)。LMO2およびGATA2は、全ての集団において発現したのに対して、GATA1発現は、赤芽球前駆体を最高頻度で含んだP4由来の集団において最高であった。
アクチビン/ノーダルシグナル伝達は、mESC分化培養における一次造血において役割を果たすことは公知であり(Nostro et al., 2008; Pearson et al., 2008)、本発明者らのここでの以前の知見は、それが赤芽球前駆体の早期の変動(wave)に必要とされることを示した(図1C)ので、本発明者らは次に、本発明者らが、上記経路の適切にステージ設定した(staged)阻害を介してCD43+/CD41a+/CD235a+集団全体の発生を選択的にブロックし得るかどうかを決定することを対象とした。分化の最初の24時間以内に添加すると、アクチビン/ノーダルインヒビターであるSBは、原始線条/中胚葉形成のためのこの経路の公知の要件(Conlon et al., 1994)と一致して、分化の5日目に検出したKDR+CD34+造血性中胚葉集団の誘導を完全にブロックした(図4A)。しかし、SBの添加を遅らせて分化の2日目〜4日目の間に添加した場合、KDR+集団およびCD34+集団は通常どおりに発生し、アクチビンA誘導性集団におけるものとサイズが類似であった(図4C)。ウェスタンブロット分析から、2日目のEBにおいてホスホ−SMAD2の存在が示された。このことは、内因性アクチビン/ノーダルシグナル伝達がこのステージにおいて活発であることを示した(図4B)。デンシトメトリーからは、ホスホ−SMAD2のレベルは、SB処理後に有意に低下することが確認された。このことは、SBがアクチビン/ノーダルシグナル伝達をブロックしたことを示した。9日目のEBの分析から、2日目〜4日目の間のこの経路の阻害は、CD43+集団の発生を完全にブロックするが、CD34+細胞に影響を及ぼさないようであることが明らかになった(図4C)。9日目でのCD43+集団の完全な阻害は、分化の2日目でのSBの添加に依存した。なぜなら、3日目まで遅らせたところ、いくらかのCD43+細胞の発生を生じたからである(図9)。大きなCD43+集団は、培養の12日目までのSB処理EBから発生した。しかし、アクチビンA誘導性EBに由来するものとは対照的に、これらの細胞は、CD41aもCD235aも発現しなかったが、CD45は発現した(図4C)。SB処理CD43+集団のマーカープロフィールは、培養の12日目〜16日目の間に変化しなかった。9日目に予測したように、アクチビンA誘導性集団の大部分は、CD41aおよびCD235aを共発現した。
b 個々のウェルを、CD45+CD43+CD7++CD5+染色に基づいてT細胞の存在についてスコア付けした。ポワソンモデルに適用される最尤法を介して統計分析を行った。
上記アクチビンA誘導性(示されず)およびSB処理の二次CD34+集団は、CD31、KDRおよびVE−CAD(HE上で見いだされるマーカー)((Tavian et al., 2010)において総説される)、ならびにCD90およびCD117(CD34+ 臍帯血由来のHSC上で見いだされるマーカー)(図6A;(Doulatov et al., 2010; Notta et al., 2011))を共発現する。しかし、これらの集団は、CD45を発現しなかった。上記集団がT細胞潜在能に加えて骨髄系潜在能および赤芽球潜在能を示したかどうかを決定するために、上記細胞を、造血性サイトカインの存在下でOP9−DL1間質細胞上で培養した。造血細胞の増殖のために通常使用される野生型OP9細胞(Feugier et al., 2005)ではなく、OP9−DL1細胞を使用した。なぜなら、本発明者らは、それらがより多数の赤芽球前駆体の発生を支援することを見いだしたからである(示さず)。共培養の7日間の後に、アクチビンA誘導性CD34+細胞は、CD43+CD45+集団、ならびにCD41a+小集団を生成した。これらのCD41a+細胞のうちのいくつかでのCD42bの共発現は、それらが発生している巨核球を表すことを示唆する。SB処理CD34+細胞は、有意なレベルのCD41aもしくはCD235aを発現しないCD43+CD45+集団を生じた(図6B)。
上記の定向分化アプローチが、他のヒト多能性幹細胞系に適用され得るかどうかを決定するために、本発明者らは、図1Aにおけるように、iPSC系MSC−iPS1(Park et al., 2008)を誘導した。図7(A,B)に示されるように、分化は、予測したCD34+/CD43+集団およびCD34+/CD41+集団、ならびに赤芽球、赤芽球/骨髄系および骨髄系前駆体の範囲の発生をもたらした。2日目〜4日目の間のSBの添加は、hESC系で認められるように、CD41+/CD43+集団ならびに赤芽球および赤芽球−骨髄系前駆体の発生を阻害した。さらに、アクチビンA分化条件もしくはSB分化条件のいずれかによって生成したCD34+細胞は、CD3を共発現し(図7C)、Dβ2−Jβ2 TCR再配列を示した(図8)CD4+CD8+ T細胞を生成した。まとめると、これらの結果からは、T細胞発生およびアクチビン/ノーダルシグナル伝達のステージ設定した操作の組み合わせは、hiPSC培養物における二次造血前駆体を同定および富化し、該二次造血前駆体を一次造血前駆体から区別するために使用し得ることが実証される。
Claims (12)
- 造血前駆体のための幹細胞の集団を富化する方法であって、該方法は、
a.造血分化を、ヒト胚性幹細胞もしくはヒト人工多能性幹細胞の集団において誘導する工程;
b.該集団を、CD43およびCD34の発現に基づいて選別する工程;ならびに
c.CD34+CD43−である画分を選択する工程、
を包含し、前記造血分化を誘導する工程は、分化の2日目〜4日目にアクチビン/ノーダルシグナル伝達を阻害する工程を包含する、方法。 - 造血分化を誘導する工程は、無血清で行われる、請求項1に記載の方法。
- 造血分化を誘導する工程は、間質なしで行われる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記造血分化を誘導する工程は、分化の0日目〜4日目の間に、前記集団をBMP4とともに培養する工程を包含する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記造血分化を誘導する工程は、分化の1日目〜8日目の間に、前記集団をbFGFとともに培養する工程を包含する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記造血分化を誘導する工程は、分化の4日目〜9日目の間に、前記集団を、VEGF、DKK、IL−6およびIL−11とともに培養する工程を包含する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記造血分化を誘導する工程は、分化の6日目〜9日目の間に、前記集団をSCFおよびEPOとともに培養する工程を包含する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記造血分化を誘導する工程は、分化の8日目〜9日目の間に、前記集団を、TPO、Flt−3およびIL−3とともに培養する工程を包含する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- アクチビン/ノーダルシグナル伝達を阻害する工程は、前記集団を、アクチビン/ノーダルインヒビターとともに培養する工程を包含する、請求項1に記載の方法。
- 前記インヒビターは、SB−431542である、請求項9に記載の方法。
- 前記選別する工程は、分化の6日目〜13日目もしくは7日目〜10日目の間に行われる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記画分は、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%もしくは100%の造血前駆体を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
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