JP2023540212A - ヒト卵黄嚢様造血細胞を生成するための組成物および方法 - Google Patents

ヒト卵黄嚢様造血細胞を生成するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

提供されるのは、Ｔリンパ系統細胞またはそれから分化した細胞を発生させることができるＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を特異化するために、卵黄嚢様造血前駆細胞を作製する方法である。該方法は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養組成物と接触させてＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生させること；および任意選択で、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を単離することを含む。【選択図】図２２

Description

関連出願
この特許協力条約出願は、２０２０年８月２５日に出願された米国特許仮出願第６３／０６９，９０４号の優先権の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本明細書で提供されるのは、胚性幹細胞および誘導多能性幹細胞を含む多能性幹細胞からのヒト卵黄嚢様造血細胞の製造および使用のための方法および組成物である。
配列表の組み込み
２０２１年８月２５日に作成された配列表「Ｐ６２８４２ＰＣ００＿ＳＴ２５」（５，０１７バイト）が参照により本明細書に組み込まれる。
マウスの胚性造血は、それらの系統分化能および時空間的組織化が異なる別個のプログラムからなる。造血幹細胞（ＨＳＣ）の生成の前に、卵黄嚢は、原始、赤芽球骨髄球前駆細胞（ＥＭＰ）およびリンパ球系前駆細胞（ＬＭＰ）プログラムとして知られる、３種のプログラムを開始させる。これらのプログラムは、長期多系列造血には寄与しないが、それらの自然免疫細胞の子孫は種をまき、発達期および成体期を通して存続する。これらの集団は、臓器特異的機能を実行し、恒常性を維持する。
モデル生物による研究に基づくと、卵黄嚢は、多様な系統分化能を有する集団を発生させる。これらの集団の多くは、成体型プログラム（ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｐｒｏｇｒａｍ）から産生されたものとは差異がある。これらの差異のいくつかは、その酸素の要求などの発生段階の胚特有のニーズを反映しているが、一方、他の差異は、これらの細胞が胚形成の初期段階を越えて機能することを示す。系統追跡および移植研究は実際に、卵黄嚢が、それらが存続して全生涯を通じて機能する種々の臓器に種をまく特異化された組織常在性免疫細胞の発生源であることを示した（Ｅｐｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｇｅｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８ａ；Ｇｅｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８ｂ；Ｇｉｎｈｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｇｏｍｅｚ Ｐｅｒｄｉｇｕｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８；Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。多くの成体組織は、卵黄嚢およびＨＳＣ由来細胞の間でバランスを取っている。これらの細胞の完全な機能は、完全には理解されていないが、モデル生物を用いた研究は、これらの卵黄嚢由来細胞は、臓器再生で中心的な役割を果たすことを示した（Ａｕｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｌａｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
マウスの造血は、造血幹細胞（ＨＳＣ）とは別に、多様な系統を一緒に産生する別個のプログラムにより卵黄嚢中で開始される。最初に発生する原始プログラムは、限定的な分化能を有し、胚齢（Ｅ）７、０に前駆細胞の一過性集団を発生させる。これらの大部分は、赤血球系統への細胞分化が決まっている。赤血球に加えて、原始造血はまた、マクロファージおよび巨核球も生成する。原始造血の開始後、第２のプログラムである赤芽球骨髄球前駆細胞（ＥＭＰ）プログラムが胚齢Ｅ８．２５に出現し、赤血球、マクロファージおよび巨核球系統に加えて、顆粒球およびマスト細胞を含む系統拡張セットを生成する。ＥＭＰは、原始造血前駆細胞上では発現しないマーカーであるＣＤ４１、Ｋｉｔ、ＣＤ１６／３２（ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ）、ＣＤ３４およびＣＤ４５の同時発現により特定および単離できる（ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。クローン分析は、ＥＭＰ造血は、この段階で産生される一連の系統を産生できるＣＤ４１＋Ｋｉｔ＋ＣＤ１６／３２＋多能性前駆細胞を含むことを示した（ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。最近、この集団はまた、ＮＫ細胞も発生させることができることを示した（Ｄｅｇｅ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。原始およびＥＭＰプログラムは、共通系統を共有するが、いくつかの産生された最終段階細胞では、差異がある。例えば、原始赤血球は、それらのＥＭＰ対応物より大きく、胚性εγおよびβＨ１グロビンが優勢であることを特徴とするグロビン発現パターンを示す。対照的に、ＥＭＰ由来赤血球は、成体型のβグロビンが主に発現し、低いレベルのβ Ｈ１グロビンと共に大部分がβである（ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５；ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１１；Ｐａｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６）。
Ｔリンパ球分化能を有する前駆細胞は、胎生期の胸腺臓器中で、またはＯＰ９間質細胞との培養で、早くも胚齢Ｅ９．０に卵黄嚢中で検出された（Ｈｕａｎｇ ａｎｄ Ａｕｅｒｂａｃｈ，１９９３；Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。間質細胞系培養は、発生の同じ段階でＢ細胞前駆細胞を特定した（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。胚齢Ｅ９．０でのＥＭＰおよびリンパ球前駆細胞の存在にもかかわらず、これらの系統間のクローン関連性は確立されていない。
卵黄嚢造血は、成体型プログラムによるＨＳＣの生成の前に、単に発生段階の胚を支援するように機能するのみであると長らく考えられていた。マウスの系統追跡実験は、ミクログリア、クッパー細胞および肺胞マクロファージを含む成体における組織常在性マクロファージの集団は、ＨＳＣ非依存性卵黄嚢由来前駆細胞から発生することが示された（Ｇｉｎｈｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，２０１０；Ｇｏｍｅｚ Ｐｅｒｄｉｇｕｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。これらのマクロファージ前駆細胞は、発生中の臓器に種をまき、成人期を通して自身を維持する組織常在性集団を生成する（Ｍａｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。さらに最近の追跡研究は、成体に対する卵黄嚢造血プログラムの寄与は、マスト細胞（Ｇｅｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８ａ；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１８）およびＴ細胞（Ｇｅｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８ｂ）の亜集団を含むことを示した。開発の初期段階でのヒト組織に対する限られた取り扱いを考慮すると、ヒト胎児造血系の構成は、マウスに対するものよりも遙かに理解されていない。５週目のヒト卵黄嚢の研究は、ヒト原始造血を示す胚性（ＨＢＥ；ε）グロビンを発現する大きな有核赤血球を特定した。この段階での卵黄嚢および肝臓のコロニー形成前駆細胞分化能の分析は、顆粒球および赤血球前駆細胞の存在を示した。これらの赤血球のコロニー内の細胞は、胚性（ＨＢＥ；ε）および胎生（ＨＢＧ１／２；ＡγおよびＧγ）グロビンの組み合わせを発現し、それらは、ＥＭＰ由来前駆細胞のヒト等価物が起源であることを示唆する。類似のグロビン発現パターンは、６週目の肝臓中に存在する赤芽球中で検出された（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９８６；Ｐｅｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５；Ｐｅｓｃｈｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。Ｃａｒｎｅｇｉｅ Ｓｔａｇｅ １２（約３０日目）卵黄嚢中で赤血球、マクロファージおよび顆粒球分化能を有する希な多能性前駆細胞の検出（Ｂｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）は、ヒトにおけるＥＭＰプログラムのさらなる証拠を提供した。ヒト卵黄嚢のリンパ球前駆細胞の詳細な分析は存在しない。発生中の肝臓および胸腺に関する研究は、Ｖδ２遺伝子セグメントの発現を特徴とするγδ Ｔ細胞のサブセットが５週目に存在し、１２週以前には主要なＴリンパ球集団であることを示した（Ｈａｙｎｅｓ ａｎｄ Ｈｅｉｎｌｙ，１９９５；ＭｃＶａｙ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｎｇ，１９９６）。Ｖδ２＋Ｔ細胞の比率は、この時間を過ぎるとこれらの組織が減少し、それらは、胎生期血液中で、４０週までに、Ｖδ１＋Ｔ細胞で構成される第２の波に取って代わられる（Ｄｉｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。
ヒト卵黄嚢の欠乏のために、異なる造血プログラムと、それらの特異化を調節する経路との間の関係性などのヒト胎児胚性造血の最初期段階を特徴付ける努力は、これらの発生ステップをモデル化するために、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）系に変わった（Ｄｉｔａｄｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
それらの前駆細胞の一過性の性質および初期発生段階での出現を考慮すると、ヒト胚芽中でのこれらのプログラムの特定および研究は可能ではなかった。
血液系統前駆細胞を生成する方法および組成物が望ましい。
本明細書では、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２、およびアクチビンＡの同時添加が、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）分化の４日目に、ヒト卵黄嚢原始およびＥＭＰ／リンパ球造血を示す血液細胞系統を生成する能力を呈するＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉が高度に富む培養物の生成を促進することが示される。２４時間以内に、中胚葉は、分化の５日目に、ノッチ依存性内皮造血転換（ＥＨＴ）を受けて、原始プログラムの造血前駆細胞を生成する造血内皮細胞（ＨＥＣ）を発生させる。原始プログラムは、原始赤血球、マスト細胞およびマクロファージ系統を発生させることが示される。分化の６日目の原始造血前駆細胞出現にと同時に、第２のＨＥＣ集団が、ＣＤ４５の発現によりそれらの原始対応物から区別できる多能性造血前駆細胞を発生させることが示される。多能性造血前駆細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－により規定される集団中で富化されている。多能性前駆細胞プログラムは、赤血球、マスト細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞およびＴリンパ系統を発生させる。
従って、ある態様は、Ｔリンパ系統細胞またはそれから分化した細胞を発生させることができるＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ－／＋中胚葉細胞を産生する方法を含み、該方法は：
多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、ＢＭＰ受容体アゴニスト（ＢＭＰＲＡ）および任意選択のＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）を含むＰＳＣ培養組成物と接触させて、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を産生すること；
ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養組成物と接触させて、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ－／＋中胚葉細胞を産生すること、を含む。
示したように、本明細書で記載のように、ＣＤ２３５ａ／ｂ＋ならびにＣＤ２３５ａ／ｂ－を含む特異化されたＫＤＲ＋中胚葉は、卵黄嚢血液細胞系統を提供できる。
ある実施形態では、ＰＳＣは、約３日間、少なくとも３日間または最大３日間、中胚葉特異化培養組成物と接触させられる。
ある実施形態では、多能性幹細胞および／またはＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団は、胚様体の形態である。ある実施形態では、胚様体は、多能性系の中胚葉特異化培養組成物との接触の前に、約１８時間にわたり軌道振盪により調製された。ある実施形態では、ＢＭＰＲＡおよび／またはＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニストは、ＢＭＰ４である。ある実施形態では、ＦＧＦ受容体アゴニストは、ＦＧＦ２であるか、またはこれを含む。ある実施形態では、アクチビン受容体アゴニストは、アクチビンＡである。ある実施形態では、多能性幹細胞は、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞、任意選択で、ヒト誘導多能性幹細胞である。
ある実施形態では、方法は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ－／＋中胚葉細胞を、ＶＥＧＦおよび任意選択でＦＧＦ２を含む造血内皮細胞（ＨＥＣ）培養組成物、ならびに任意選択で、１種または複数の造血サイトカインをと接触させて、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣを得ることをさらに含む。
ある実施形態では、方法は、原始前駆細胞培養組成物中でＣＤ３４＋ＫＤＲ＋造血内皮細胞（ＨＥＣ）を培養し、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を得ることをさらに含む。
ある実施形態では、方法は、原始前駆細胞培養組成物中でＣＤ４３＋造血前駆細胞を培養し、原始プログラム系統細胞を得ることをさらに含む。
ある実施形態では、１種または複数の原始プログラム系統細胞が単離される。
ある実施形態では、方法は、ＣＤ４３＋造血前駆細胞をマクロファージ許容カクテルと培養し、マクロファージ細胞を単離することをさらに含む。ある実施形態では、方法は、ＣＤ４３＋造血前駆細胞をマスト細胞許容カクテルと培養し、マスト細胞を単離することをさらに含む。
ある実施形態では、方法は、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を赤血球細胞許容カクテルと培養し、原始赤血球を単離することをさらに含む。
ある実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２である。
ある実施形態では、ＢＭＰＲＡはＢＭＰ４である。
ある実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣを一定期間培養し、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを単離することをさらに含む。
ある実施形態では、一定期間は、約１日である。
ある実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを、ノッチアゴニストを含む多能性前駆細胞（ＭＰＰ）培養組成物と接触させて、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、任意選択で、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－および／またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋造血前駆細胞を得ることをさらに含む。
ある実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞を増殖させることをさらに含む。
ある実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞または増殖させたＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞を接触させて、多能性系統細胞を得ることをさらに含む。
ある実施形態では、１種または複数の多能性プログラム系統細胞が単離される。
ある実施形態では、マクロファージ細胞が単離される。
ある実施形態では、マスト細胞が単離される。
ある実施形態では、多能性プログラム系統赤血球が単離される。
ある実施形態では、顆粒球が単離される。
ある実施形態では、Ｔリンパ球が単離され、例えば、Ｔリンパ球は、γ／δ、αβ、特にＶδ２、またはこれらの組み合わせであり得る。
ある実施形態では、ノッチアゴニストは、ノッチリガンドである。ある実施形態では、ノッチリガンドは、培養プレートまたはビードなどの足場を経由して提供される。
例えば、ＤＬ４結合組織培養プレートおよびビーズは、例えば、Ｔｒｏｔｍａｎ－Ｇｒａｎｔ，ｅｔ ａｌ ２０２１に記載の方法を用いて作製でき、ノッチシグナル伝達を誘導するための血清／間質不含方法を提供できる。
ある実施形態では、１種または複数の種類の単離細胞が組成物中に懸濁される。
ある実施形態では、組成物はゲルを含む、または無菌の浸透圧的にバランスした流体溶液である。
ある実施形態では、組成物は１種または複数の他の種類の細胞を含む。
ある態様では、１種または複数の種類の細胞、任意選択で、本明細書で記載の方法を用いて生成された１種または複数の種類の単離細胞を含む細胞集団も提供される。
ある態様では、１種または複数の種類の細胞、任意選択で、本明細書で記載の方法および担体を用いて生成された１種または複数の種類の単離細胞を含む組成物も提供される。
ある実施形態では、組成物は、ゲル、心筋細胞または肝細胞を含む。
ある実施形態では、組成物は、浸透圧的にバランスした流体溶液を含む。
ある実施形態では、組成物は、無菌である。
別の態様では、ゲルおよび１種または複数の種類の細胞、任意選択で、記載の方法を用いて生成された単離細胞または前記を含む組成物を含む細胞移植片も提供される。
別の態様では、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養添加物が提供される。
ある実施形態では、特異化培養添加物は、約５００ｍＬの溶液中で、ＢＭＰ４が０．５～約１００ｎｇ／ｍＬを与えるのに十分な量であり、ＦＧＦ２が０．５～１００ｎｇ／ｍＬを与えるのに十分な量であり、およびアクチビンＡが０．５～１００ｎｇ／ｍｌを与えるのに十分な量であり、好ましくは、比率は、約１０：５：６または約１０：５：２または約１０：５：６～約１０：５：２である。
また、好適な基本培地、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを、任意選択で、本明細書で記載の濃度または比率で含む中胚葉特異化培養組成物が提供される。
ある実施形態では、中胚葉特異化培養添加物または組成物は、本明細書で記載の方法で使用するためのものである。
別の態様では、本明細書で記載の添加物または組成物を含むキットも提供される。
別の態様では、対象に前駆細胞または成熟細胞を投与する方法も提供され、該方法は、本明細書で記載の方法を用いて生成された細胞集団、前記細胞集団を含む組成物細胞移植片を投与することを含む。
ある態様は、Ｔリンパ系統細胞またはそれから分化した細胞を発生させることができるＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生する方法を含み、該方法は：
多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、ＢＭＰ受容体アゴニスト（ＢＭＰＲＡ）および任意選択のＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）を含むＰＳＣ培養組成物と接触させて、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を産生すること；
ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養組成物と接触させて、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生すること、を含む。
ある実施形態では、ＰＳＣは、約３日間、少なくとも３日間または最大３日間、中胚葉特異化培養組成物と接触させられ；
多能性幹細胞および／またはＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団は、胚様体の形態であり；および／または
多能性幹細胞は、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞、任意選択で、ヒト誘導多能性幹細胞である。
ある実施形態では、ＢＭＰＲＡおよび／またはＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニストはＢＭＰ４であり；ＦＧＦ受容体アゴニストはＦＧＦ２であるか、またはこれを含み、および／またはアクチビン受容体アゴニストはアクチビンＡである。
ある実施形態では、方法は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を、ＶＥＧＦおよび任意選択でＦＧＦ２を含む造血内皮細胞（ＨＥＣ）培養組成物、ならびに任意選択で、１種または複数の造血サイトカインと接触させて、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋造血内皮細胞（ＨＥＣ）を得ることをさらに含み；および任意選択で：
原始前駆細胞培養組成物中でＣＤ３４＋ＫＤＲ＋造血内皮細胞（ＨＥＣ）を培養し、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を得ること；または
ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣを一定期間培養し、任意選択で、約１日間でＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを単離すること、をさらに含む。
ある実施形態では、方法は、原始前駆細胞培養組成物中でＣＤ４３＋造血前駆細胞を培養し、原始プログラム系統細胞を得て、任意選択で、１種または複数の原始プログラム系統細胞が単離されることをさらに含み；
方法は、ＣＤ４３＋造血前駆細胞をマクロファージ許容カクテルと培養し、マクロファージ細胞を単離することをさらに含み；
方法は、ＣＤ４３＋造血前駆細胞をマスト細胞許容カクテルと培養し、マスト細胞を単離することをさらに含み；または
方法は、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を赤血球細胞許容カクテルと培養し、原始赤血球を単離することをさらに含む。
ある実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２であり、および／またはＢＭＰＲＡはＢＭＰ４である。
ある実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを、ノッチアゴニストを含む多能性前駆細胞培養組成物と接触させて、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、任意選択で、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－および／またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋造血前駆細胞を得ること、および任意選択で、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞を増殖させること、をさらに含む。
ある実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞または 増殖させたＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞を接触させて、多能性系統細胞を得ること、および任意選択で、１種または複数の多能性プログラム系統細胞を単離することをさらに含み、任意選択で、マクロファージ細胞が単離され、マスト細胞が単離され、赤血球細胞が単離され、顆粒球が単離され、またはＴリンパ球が単離され、任意選択で、単離Ｔリンパ球は、γ／δ、α／β、Ｔリンパ球、任意選択で、Ｖγ２［Ｍｉｃｈａｅｌによると、これはＶδ２であるはずである？］Ｔリンパ球である。
ある実施形態では、ノッチアゴニストは、ノッチリガンドであり、任意選択で、ノッチリガンド結合組織培養プレートまたはビード経由で提供される。
ある実施形態では、１種または複数の種類の単離細胞が組成物中に懸濁され、任意選択で、組成物はゲルを含むか、または無菌の浸透圧的にバランスされた流体溶液であり、および／または組成物は、１種または複数の他の種類の細胞を含む。
さらなる態様は、細胞集団または１種または複数の種類の細胞、任意選択で、１種または複数の種類の本明細書で記載の単離細胞を含む組成物を含み、組成物は、担体、ゲル、および／または浸透圧的にバランスされた流体溶液を含み、任意選択で、組成物は無菌であり、任意選択で、細胞集団または組成物は、心筋細胞または肝細胞を含む。
別の態様は、ゲルまたは足場、任意選択で、ポーチを含む細胞移植片、および本明細書で記載の方法により調製された１種または複数の種類の単離細胞、または本明細書で記載の細胞集団または組成物を含む。
さらなる態様は、中胚葉特異化培養添加物または培養組成物またはキットを含み、これらは：
ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、任意選択で、ＢＭＰ４、
ＦＧＦ受容体アゴニスト、任意選択で、ＦＧＦ２、および
アクチビン受容体アゴニスト、任意選択で、アクチビンＡを含み；
任意選択で、約５００ｍＬの溶液中で、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、任意選択でＢＭＰ４が０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬを与えるのに十分な量であり、ＦＧＦ受容体アゴニスト、任意選択でＦＧＦ２が０．５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬを与えるのに十分な量であり、およびアクチビン受容体アゴニスト、任意選択でアクチビンＡが０．５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌを与えるのに十分な量であり、好ましくは、ＢＭＰ４：ＦＧＦ２：アクチビンＡを、約１０：５：６または約１０：５：２または約１０：５：６～約１０：５：２の比率で含み、または
中胚葉特異化培養組成物は、造血前駆細胞に好適な基本培地をさらに含む。
ある実施形態では、中胚葉特異化培養添加物または組成物は、本明細書で記載の方法で使用するためのものである。
薬物を調製するための、本明細書で記載の細胞集団または組成物、細胞移植片、中胚葉特異化培養添加物または組成物の使用も提供される。
本開示の他の特徴および利点は、下記詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、詳細な説明および具体的実施例は、本開示の実施形態を示してはいるが、この詳細な説明から、本開示の趣旨および範囲内での様々な変更および修正が当業者には明らかであり、したがって、これらは実例として与えられているにすぎないことを理解されたい。
これと共に含まれる図面は、本明細書の物品および方法の種々の実施例を例示するためのものであり、教示されるものの範囲を多少なりとも限定することを意図するものではない。添付図面の説明は以下の通りである。
ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉の誘導。Ａ）分化の１日目のＢＭＰ４、ＦＧＦ２およびアクチビンＡ（Ａ）の添加によるｈＰＳＣからの中胚葉特異化の略図である。Ｂ）分化の３および４日目のＫＤＲおよびＣＤ２３５ａ／ｂ発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）分化の３日目のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞の比率の定量化を示す（ｎ＝３）。分散分析。６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡに対して、＊Ｐ＜０．０５および＊＊Ｐ＜０．０１。Ｄ）分化の４日目のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞の比率の定量化を示す（ｎ＝３）。分散分析。６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡに対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ｈＰＳＣからの原始プログラムの出現。Ａ）ＢＭＰ４、ＦＧＦ２およびアクチビンＡの添加とそれに続くＶＥＧＦ、ＦＧＦ２および造血サイトカインの存在下での培養によるｈＰＳＣからの造血分化の略図である。Ｂ）分化の６日目～１５日目のＣＤ４３およびＣＤ４５発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）示した日数での培養液中の５００，０００個の入力Ｈ１ ｈＥＳＣから生成されたＣＤ４３＋およびＣＤ４５＋細胞の総数の定量化を示す（ｎ＝４）。分散分析。分化の６日目の示した集団に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｄ）５００，０００個のＨ１ ｈＥＳＣの入力を基準にした分化の６日目～１５日目に生成されたコロニー形成前駆細胞数を示す（ｎ＝３）。分散分析。分化の９日目の示した系統に対して、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（黒＝全コロニー）。Ｅ）分化の６日目～１５日目に生成された赤血球前駆細胞の分布を示す（ｎ＝３）。分散分析。それぞれ、小さいおよび大きい赤血球コロニー形態に対して、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ならびに、＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１。Ｆ）小さい赤血球のコロニーのＨＢＥ、ＨＢＧおよびＨＢＢ βグロビン発現のパーセンテージのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝３）。分散分析。示したβグロビン遺伝子に対して、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＫＤＲ＋中胚葉の造血系統分化能。Ａ）分化の４日目のＣＤ２３５ａ／ｂ発現に基づいてＫＤＲ＋中胚葉を単離するために使用したゲーティング戦略を示す。Ｂ）ＫＤＲ＋画分から生成された集団における５日間にわたるＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）５日間にわたる培養で、６２，５００個の４日目のＫＤＲ＋細胞から生成された総細胞数およびＣＤ４３＋細胞数の定量化を示す（ｎ＝３）。分散分析。示した試料に対して、＊＊Ｐ＜０．０１。Ｄ）６２，５００個の４日目のＫＤＲ＋細胞の５日間の培養後のコロニー形成前駆細胞数を示す（ｎ＝３）。分散分析。有意差なし。Ｅ）分化の４日目のＫＤＲ＋集団のＢＬ－ＣＦＣ発生頻度を示す（ｎ＝３）。ｔ検定。有意差なし。 分化の５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞のキャラクタリゼーション。Ａ）分化の４日目～６日目のＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｂ）分化の４日目～６日目のＫＤＲおよびＣＤ３４発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）分化の５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋集団（灰色）中のＫＩＴ、ＣＤ１４４、ＣＤ３１およびＣＤ４５発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。黒色線：未染色細胞。Ｄ）分化の５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋および無選別集団中のＳＣＬ／ＴＡＬ１およびＲＵＮＸ１ａ／ｂ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝３）。ｔ検定。＊Ｐ＜０．０５。 造血内皮細胞中間体を経由した原始プログラムの変化。Ａ）分化の５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋集団の単離に使用されたゲーティング戦略（灰色）を示す。Ｂ）５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋単離細胞から生成された集団におけるＣＤ３４およびＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）７日間にわたる培養の５日目の６２，５００個のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞から生成された総細胞数およびＣＤ４３＋細胞数の定量化を示す（ｎ＝４～５）。分散分析。培養の１日後の示した集団に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｄ）７日間にわたる培養の５日目の６２，５００個のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞から生成されたコロニー形成前駆細胞数を示す（ｎ＝４～５）。分散分析。培養の４日後の示した系統に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１（黒色＝全コロニー）。Ｅ）４日間にわたる培養の５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋集団由来の単層培養物の代表的位相差画像を示す。スケールバー＝５０μｍ。Ｆ）２０，０００個の５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞から生成した単層培養における４日間の総細胞数およびＣＤ４３＋細胞数の定量化を示す（ｎ＝３）。ｔ検定。培養の２日後の示した集団に対して、＊Ｐ＜０．０５。 原始プログラムの発生中のノッチシグナル伝達。Ａ）５日間の培養に続く、５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋および事前選別された集団中のノッチ受容体発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝３）。ｔ検定。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１．Ｂ）５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞の単層培養の７日間のノッチ標的遺伝子発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝３）。分散分析。１日目の培養に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ノッチシグナル伝達は、原始プログラムの造血細胞の生成のために必要である。Ａ）ノッチ阻害剤、ＧＳＩの存在または非存在下での５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞の単層培養の４日間にわたるノッチ標的遺伝子発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝３）。分散分析。ステージ一致試料に対して、＊＊Ｐ＜０．０１。Ｂ）ノッチ阻害剤、ＧＳＩの存在または非存在下での５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞から生成された集団の代表的位相差画像を示す。Ｃ）ノッチ阻害剤、ＧＳＩの存在または非存在下、単層で培養した５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞から生成された集団のＣＤ３４およびＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｄ）ノッチ阻害剤、ＧＳＩの存在または非存在下で培養した２０，０００個の５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞から生成された総細胞数およびＣＤ４３＋細胞数の定量化を示す（ｎ＝３）。分散分析。ステージ一致集団に対して、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｅ）ノッチ阻害剤、ＧＳＩの存在または非存在下で示した時間培養した２０，０００個の５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞から生成されたコロニー形成前駆細胞数を示す（ｎ＝３）。分散分析。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 分化の６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞のキャラクタリゼーション。Ａ）分化の６日目のＣＤ４３およびＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｂ）６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団（灰色）のＫＤＲ、ＫＩＴ、ＣＤ１４４、ＣＤ３１およびＣＤ４５発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。黒色線：未染色細胞。Ｃ）６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－および事前選別集団中のＳＣＬ／ＴＡＬ１およびＲＵＮＸ１ａ／ｂ発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝３）。ｔ検定。＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＣＤ３４およびＣＤ４３発現を基準にして分化の６日目での２種の造血プログラムの分離。Ａ）６日目のＣＤ４３＋およびＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団のＦＡＣＳベース単離のためのゲーティング戦略。Ｂ）分化の６日目に単離されたＣＤ４３＋およびＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞から生成された集団のＣＤ３４およびＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）６２，５００個の６日目ＣＤ４３＋またはＣＤ３４＋ＣＤ４３－単離細胞から生成された総細胞数およびＣＤ４３＋細胞数の定量化を示す（ｎ＝５）。ｔ検定および分散分析。示したように、ステージ一致試料に対して、または同じ試料内で培養の１日後に対して、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｄ）６２，５００個の６日目ＣＤ４３＋またはＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞から生成された集団中のコロニー形成前駆細胞数を示す（ｎ＝５）。ｔ検定および分散分析。示したように、ステージ一致試料に対して、または同じ試料内で培養の１日後に対して、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（黒＝全コロニー）。Ｅ）Ｄ中で観察された系統の分布。分散分析。ステージ一致試料に対して、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｆ）Ｄ中で観察された赤血球の前駆細胞の分布。分散分析。それぞれ、小さいおよび大きい赤血球コロニー形態に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１、ならびに、＃Ｐ＜０．０５および＃＃Ｐ＜０．０１。 ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣは、ＣＤ４５＋造血前駆細胞を発生させる。Ａ）６日目のＣＤ４３＋およびＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞から生成された集団のＣＤ３４およびＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｂ）６日目のＣＤ４３＋およびＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞から生成された集団中の６日間にわたるＣＤ４５＋細胞の比率の定量化を示す。分散分析。ステージ一致集団に対して、＊＊＊Ｐ＜０．００１。Ｃ）６日目のＣＤ４３＋およびＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞から生成された集団中の６日間にわたるＣＤ４５＋細胞の数の定量化を示す（ｎ＝５）。分散分析。ステージ一致試料に対して、＊＊Ｐ＜０．０１。Ｄ）６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞から生成されたＣＤ３４およびＣＤ４５集団のＦＡＣＳベース単離のために使用されたゲーティング戦略を示す。５日間にわたり細胞を凝集体として培養した。Ｅ）Ｄに示す単離ＣＤ３４およびＣＤ４５集団中でのコロニー形成前駆細胞発生頻度を示す（ｎ＝３）。分散分析。示した系統および集団に対して、＊Ｐ＜０．０５および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｆ）Ｅで観察された骨髄前駆細胞の分布を示す。Ｇ）６日間の培養後の６日目のＣＤ４３＋集団由来の赤血球のコロニーおよび６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団の培養の５日後に生成されたＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＫＩＴ＋細胞のＨＢＥ、ＨＢＧおよびＨＢＢ βグロビン発現のパーセンテージのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝４～１２）。示したβグロビンまたは試料に対して、＊＊＜Ｐ０．０１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣは、Ｔリンパ球分化能を有する。Ａ）ＯＰ９－ＤＬ４細胞との３０日の培養後に、６日目のＣＤ４３＋またはＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団から由来の細胞上のＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ４およびＣＤ８発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｂ）ＯＰ９－ＤＬ４細胞と４０日間培養した６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団から生成されたＣＤ４５＋細胞上のＣＤ３、ＴＣＲαβおよびＴＣＲγδ発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）Ｂに記載の４０日目のＣＤ４５＋集団中のＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋およびＣＤ３＋ＴＣＲγδ＋細胞の比率の定量化を示す（ｎ＝４）。ｔ検定。有意差なし。 ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉は、Ｔリンパ系統を発生させる。Ａ）分化の４日目のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋集団のＦＡＣＳベース単離に使用されたゲーティング戦略を示す。Ｂ）３日間の培養に続く、４日目のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋由来集団のＣＤ３４およびＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）ＯＰ９－ＤＬ４細胞との３０日間の培養後にＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞（Ｂに示す）から生成されたＣＤ４５＋ＣＤ５６－集団のＣＤ４およびＣＤ８発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。 Ｔリンパ球の分析。Ａ）ｈＰＳＣ由来の６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞またはＣＤ３４＋臍帯血細胞の、ＯＰ９－ＤＬ４との示した日数の間の培養から生成されたＣＤ４５＋集団におけるＣＤ３発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｂ）ｈＰＳＣ由来の６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞またはＣＤ３４＋臍帯血細胞の、ＯＰ９－ＤＬ４との示した日数の間の培養から生成されたＣＤ４５＋集団におけるＣＤ３＋細胞の比率の定量化を示す（ｎ＝３）。分散分析。培養の２５日目に対して、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。示したステージ一致試料に対して、＃Ｐ＜０．０５および＃＃Ｐ＜０．０１。Ｃ）ｈＰＳＣ由来の６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞またはＣＤ３４＋臍帯血細胞の、ＯＰ９－ＤＬ４細胞との示した日数の間の培養から生成されたＣＤ４５＋ＣＤ３＋集団におけるＴＣＲγδおよびＴＣＲαβ発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｄ）ｈＰＳＣ由来の６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞またはＣＤ３４＋臍帯血細胞の、ＯＰ９－ＤＬ４との示した日数の間の培養から生成されたＣＤ４５＋ＣＤ３＋集団におけるＴＣＲγδ＋およびＴＣＲαβ＋細胞の比率の定量化を示す（ｎ＝３）。分散分析。培養の２５日目に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。示したステージ一致試料に対して、＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１。Ｅ）ｈＰＳＣ由来の６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞またはＣＤ３４＋臍帯血細胞の、ＯＰ９－ＤＬ４細胞との示した日数の間の培養から生成されたＣＤ４５＋ＣＤ３＋集団におけるＴＣＲＶδ２およびＴＣＲＶγ９発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｆ）ｈＰＳＣ由来の６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞またはＣＤ３４＋臍帯血細胞の、ＯＰ９－ＤＬ４細胞との示した日数の間の培養から生成されたＣＤ４５＋ＣＤ３＋集団におけるＴＣＲＶδ１発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｇ）ｈＰＳＣ由来の６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞またはＣＤ３４＋臍帯血細胞の、ＯＰ９－ＤＬ４との示した日数の間の培養から生成されたＣＤ４５＋ＣＤ３＋集団におけるＴＣＲＶδ２＋およびＴＣＲＶδ１＋細胞の比率の定量化を示す（ｎ＝３）。分散分析。示した系統一致試料に対して、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。示したステージ一致試料に対して、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０１および＃＃＃＃Ｐ＜０．０００１。 Ｔリンパ球前駆細胞の分析。Ａ）ＯＰ９－ＤＬ４細胞との１２日間の培養後に、ｈＰＳＣ由来の６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞またはＣＤ３４＋臍帯血細胞から生成されたＣＤ４５＋集団のＣＤ３４、ＣＤ７およびＣＤ７発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｂ）ＯＰ９－ＤＬ４との１２日間の培養後に、ｈＰＳＣ由来の６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞またはＣＤ３４＋臍帯血細胞から生成されたＣＤ３４＋ＣＤ７＋およびＣＤ３４－ＣＤ７＋ＣＤ４５＋集団のいずれかにおけるＣＤ５＋細胞の比率の定量化を示す（ｎ＝４）。分散分析。示した集団に対して、＊Ｐ＜０．０５および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ６日目のＣＤ４３＋およびＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣ由来造血細胞のキャラクタリゼーション。Ａ）ＯＰ９－ＤＬ４細胞との５日間の培養後に生成された６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－由来集団のＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０およびＣＤ７発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｂ）６日目のＣＤ４３＋集団のＣＤ４５、ＣＤ９０およびＣＤ７発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。黒色線：未染色細胞。 ＣＤ９０の発現およびＣＤ７の非存在は、多系統分化能を有するＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞集団を示す。Ａ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－およびＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋集団のＮＫ細胞およびＴリンパ球前駆細胞発生頻度の限界希釈分析を示す（ｎ＝２）。Ｂ）ＨＵＶＥＣ－Ｅ４ＯＲＦ１細胞との４日間の培養後に、２５個のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋細胞から生成されたＣＤ４５＋細胞の数の定量化を示す。グラフ内の数字は、細胞数の平均倍率変化を示す（ｎ＝９）。ｔ検定。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｃ）ＨＵＶＥＣ－Ｅ４ＯＲＦ１細胞との４日間の培養後に、２５個のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋細胞から生成されたＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞の数の定量化を示す。グラフ内の数字は、細胞数の平均倍率変化を示す（ｎ＝９）。ｔ検定。＊＊Ｐ＜０．０１。Ｄ）ＯＰ９－ＤＬ４細胞との８日間の培養後に、２５個のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋細胞から生成されたＣＤ４５＋細胞の数の定量化を示す。グラフ内の数字は、細胞数の平均倍率変化を示す（ｎ＝１２）。ｔ検定。有意差なし。Ｅ）ＮＫ細胞、Ｔリンパ球、骨髄および赤血球子孫を発生させたウェル（灰色）を表すヒートマップを示す。Ｆ）Ｅに示す４種全ての系統を生成したウェルの比率の定量化を示す。 ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－集団は、多能性造血前駆細胞を含む。Ａ）造血クローンを生成した単一のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－細胞を播種されたウェルの比率の定量化を示す。Ｂ）ＣＤ５６、ＣＤ７、ＣＤ４およびＣＤ８発現の代表的フローサイトメトリー分析および単一のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－細胞から生成されたＮＫ細胞、Ｔリンパ球、骨髄および赤血球系統を特定する明視野像を示す。Ｃ）造血クローンを発生させた全ての細胞のＮＫ細胞、Ｔリンパ球、骨髄および赤血球系統分化能のまとめを示す（ｎ＝６０）。Ｄ）ｈＰＳＣ由来原始、ＭＰＰ、成熟および臍帯血前駆細胞から生成された赤血球コロニー中のＨＢＥ、ＨＢＧおよびＨＢＢ βグロビン発現のパーセンテージのＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝５～３５）。分散分析。示した試料に対して、＊＊＜Ｐ０．０１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ｈＰＳＣ由来多能性造血前駆細胞の生着能。Ａ）ＣＤ３４＋臍帯血細胞の移植の４週後のレシピエントの骨髄中の細胞のヒトＣＤ４５、ＣＤ１９およびＣＤ１１ｂ発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｂ）ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－多能性前駆細胞の移植の４週後のレシピエントの骨髄中の細胞のヒトＣＤ４５発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）移植の４週後のマウス骨髄中のヒトＣＤ４５＋の比率の定量化を示す（ｎ＝２～４）。 原始および多能性前駆細胞プログラムは、ＡＬＤＨ＋前駆細胞から発生しない。Ａ）ＯＰ９－ＤＬ４細胞との５日間の培養後、６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－から生成されたＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－集団中のＡＬＤＨの代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｂ）分化の３および４日目の原始／ＭＰＰおよび成熟集団中のＣＤ２３５ａ／ｂ発現およびＡＬＤＨ活性の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）分化の５および６日目の原始／ＭＰＰおよび成熟集団中のＣＤ３４発現およびＡＬＤＨ活性の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｄ）原始／ＭＰＰ誘導集団における分化の０日目～６日目のＡＬＤＨ１Ａ２およびＣＹＰ２６Ａ１発現のＲＴ－ｑＰＣＲ分析を示す（ｎ＝５）。分散分析。示した試料に対して、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＣＨＯＰ１０ＷＴ ｉＰＳＣからの卵黄嚢造血系統の生成。Ａ）分化の４日目のＫＤＲおよびＣＤ２３５ａ／ｂ発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｂ）分化の４日目のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞の比率の定量化を示す（ｎ＝３）。分散分析。示した試料に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。Ｃ）分化の６日目～１２日目の集団のＣＤ４３およびＣＤ４５発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｄ）分化の６日目～１２日目の集団中の総細胞ならびにＣＤ４３＋およびＣＤ４５＋の全細胞の細胞数の定量化を示す（ｎ＝３）。分散分析。分化の６日目の示した集団に対して、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＣＨＯＰ１０ＷＴ ｉＰＳＣから生成されたＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉の造血系統分化能。Ａ）分化の４日目のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋集団のＦＡＣＳベース単離に使用されたゲーティング戦略を示す。Ｂ）４日目のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞から生成された凝集体集団のＣＤ３４およびＣＤ４３発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。Ｃ）６２，５００個の４日目のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞から生成された総細胞数およびＣＤ４３＋細胞数の定量化を示す（ｎ＝３）。分散分析。有意差なし。Ｄ）５日間にわたる培養後、４日目の６２，５００個のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞から生成されたコロニー形成前駆細胞数を示す（ｎ＝３）。分散分析。有意差なし。Ｅ）ＯＰ９－ＤＬ４との３０日間の培養後に、４日目のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞から生成されたＣＤ４５＋ＣＤ５６－集団のＣＤ４およびＣＤ８発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。 多能性幹細胞を用いたヒト卵黄嚢造血発生のモデルを示す概略図である。 卵黄嚢造血細胞様前駆細胞からのマクロファージ分化。Ａ）ＩＬ３、ＳＣＦおよびＭＣＳＦの添加とそれに続くＭＣＳＦの存在下での２週間の培養による、造血前駆細胞からのマクロファージ分化の略図である。Ｂ）Ａに記載の条件での２週間の培養後に生成された集団中の、ＣＤ４５、ＣＤ６８、ＣＤ６４、ＣＤ１６３、ＣＤ１４およびＣＤ１１ｂ発現の代表的フローサイトメトリー分析を示す。
請求された主題の実施形態の実施例を提供するために、種々の工程、生成物および使用について以下で記載される。以下に記載のいずれの実施形態も、請求項を何ら限定するものではなく、いずれの請求項も以下に記載のものとは異なる工程または生成物を包含してよい。請求項は、以下に記載のいずれか１つの生成物または工程の特徴の全てを有する生成物または工程に、または以下に記載の複数または全ての方法もしくは生成物似共通な特徴に限定されるものではない。以下に記載のいずれの主題も、および本特許出願の発行により許諾されないそれに対する排他的な権利も、別の保護手段、例えば、継続出願の主題であってもよく、および出願者、発明者または所有者は、本明細書におけるその開示によりこのようないずれの主題も、中途で止める、請求権を放棄する、または公衆に共有財産として提供することを意図するものではない。
卵黄嚢由来造血前駆細胞細胞の前駆細胞は、誕生後単離できない。試験および実現されるべき卵黄嚢様造血細胞の場合、ＰＳＣが、これらの前駆細胞を調製するための唯一の供給源である。
発明者らは、以前に、Ｗｎｔシグナル伝達の適切にステージ分類した阻害が、卵黄嚢造血を示す赤血球および骨髄分化能を呈するｈＰＳＣからＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ＋中胚葉の集団を誘導することを示した（Ｓｔｕｒｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。しかし、この中胚葉は、Ｔリンパ系統を発生させず、マウス卵黄嚢の完全な発生能を再現しないことを示唆した。
この障害を克服し、これらの前駆細胞集団を取り扱うために、発明者らは、本明細書で、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの卵黄嚢造血プログラムを生成するために、生物学的に誘導された発生プロトコルを確立した。発明者らは、ヒト原始プログラムは、第１の造血細胞の生成の前に、造血内皮細胞（ＨＥＣ）として知られる前駆細胞を介して変化することを確定した。発明者らは、原始造血細胞の出現にと同時に、第２のＨＥＣ集団が、ＥＭＰプログラムの前駆細胞を発生させることを示した。発明者らは、個の第２のＨＥＣ集団はまた、ＬＭＰプログラムの発生を示す、Ｔリンパ球分化能を含む。クローン分析により、共通の造血前駆細胞由来のＥＭＰおよびＬＭＰプログラムが明らかになり、ヒトでは、多能性細胞から発生する統合された卵黄嚢プログラムが定義された。インビトロ法は、組織常在性免疫細胞の使用を含む、疾患モデル化および再生医療適用のための前駆細胞源を提供する。
特に、発明者らは、シグナル伝達作用の組み合わせ、例えば、アクチビンＡ、ＢＭＰ４およびＦＧＦ２シグナル伝達が、原始およびＥＭＰ造血プログラムを発生させるＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉を誘導することを示す。両プログラムは、造血内皮細胞（ＨＥＣ）中間体を介して変化し、全ての造血プログラムがこの共通の変化を共有するという証拠を提供することが明らかになった。詳細分析は、ＥＭＰ造血を発生させるＨＥＣはまた、Ｖδ２＋系統を含む、γδおよびαβ Ｔ細胞も生成することを示した。クローン分析により、本明細書では、このＨＥＣ由来集団が、赤血球、骨髄、ＮＫおよびＴ細胞子孫を生成できるＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－多能性造血前駆細胞を含むことが示される。マウス卵黄嚢ＥＭＰ集団の分析により、それが、Ｔ細胞分化能も有し、骨髄、赤血球およびＴ細胞子孫を生成できる二能性および多能性前駆細胞を含むことが明らかになった。
Ｉ．定義
別に定めのない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者により通常、理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別義が要求されない限り、単数用語は複数を含むものとし、複数用語は単数を含むものとする。例えば、用語「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」は、単一細胞ならびに複数細胞または細胞集団を含み、「アゴニスト（ａｎ ａｇｏｎｉｓｔ）」は、単一アゴニストまたはアゴニストの組み合わせを含む、等々。一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、分子生物学、およびタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連しておよびそれらの技術に関連して使用される命名法は、当業界においてよく知られており、通常使用されるものである（例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２０１２を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「約（ａｂｏｕｔ）」、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」、および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などの程度の用語は、最終結果が大きく変化しないような適度な量の修飾された用語のずれを意味する。これらの程度を示す用語は、少なくとも±５％のずれが修飾される用語の意味を打ち消すことがない場合には、修飾された用語はその程度のずれを含むと解釈すべきである。
本明細書で細胞に対して使用される場合、用語「単離された」は、培地を実質的に不含および／または例えば、細胞表面受容体に基づいて、例えば、本明細書で記載のＦＡＣＳまたはＭＡＣＳにより、特定の細胞型を濃縮することを意味する。例えば、単離は、約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％純粋である集団を含み得る。
本明細書で使用される場合、および加えて、当該技術分野において理解されるように、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、臨床成績を含む有益または望ましい結果を得るための手法である。有益な、または望ましい臨床結果としては、検出可能であってもそうでなくても、１種または複数の症状または状態の軽減または回復、疾患の程度の減少、疾患の安定化（すなわち、悪化しない）状態、疾患の蔓延の防止、疾患進行の遅延化または緩徐化、疾患状態の回復または緩和、および寛解（部分的または全体の）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けていない場合の予測生存期間に比べて、生存期間の延長を意味してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「多能性幹細胞」は、３つの生殖細胞層の細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。多能性はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現により明らかにされる。本明細書で使用するために好適な多能性細胞には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞が挙げられる。
本明細書で使用される場合、用語「造血前駆細胞」は、ＣＤ４３および／またはＣＤ４５を発現する任意の細胞を意味する。例えば、原始造血前駆細胞は、ＣＤ４３の発現で定義されるが、一方、多能性造血前駆細胞またはＭＰＰは、ＣＤ４５の発現により定義される。これらの細胞は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋および／またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－を含む、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋としてマークされた集団中で高度に濃縮されている。
本明細書で使用される場合、用語「Ｔリンパ球前駆細胞」は、次のＣＤ３４、ＣＤ７およびＣＤ５中の２つの発現またはＣＤ４およびＣＤ８の同時発現により定義されるＣＤ４５＋集団が濃縮されている細胞を意味する。
本発明の方法により産生できる血液細胞は、細胞表面マーカーにより定義および／または単離できる。例えば、成熟Ｔリンパ球は、ＣＤ４５、ＣＤ３およびＴＣＲの発現により定義され；ＮＫ細胞は、ＣＤ４５およびＣＤ５６の発現により定義され；マクロファージは、ＣＤ４５、ＣＤ６８、ＣＤ６４、ＣＤ１６３、ＣＤ１１ｂおよび／またはＣＤ１４の発現により定義され；赤血球前駆細胞は、ＣＤ４３およびＣＤ２３５ａ／ｂの発現により定義され；マスト細胞およびマスト細胞前駆細胞は、ＣＤ４５およびＫＩＴの発現により定義され；および顆粒球は、ＣＤ４５、ＣＤ１５およびＣＤ３１の発現により定義される。
本明細書で使用される場合、用語「造血サイトカイン」は、分化を促進するサイトカインおよび成長因子を意味し、限定されないが、サイトカイン：ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、ＥＰＯ、ＩＧＦ１、ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ならびにＧＭ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦなどが挙げられる。他のサイトカインまたは成長因子ならびに本明細書で記載以外の他の組み合わせも使用できる。
本明細書で使用される場合、用語「ＢＭＰＲＡ」または「ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト」は、受容体を介してＢＭＰシグナル伝達を活性化でき、ＳＭＡＤリン酸化を誘導できる任意の分子を意味する。これには、限定されないが、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２およびＢＭＰ７ならびにそれらの活性複合体および／または活性フラグメント、好ましくは、ヒトＢＭＰ４活性コンジュゲートおよびその活性フラグメントが含まれる。
用語「ＢＭＰ４」は、骨形成タンパク質４を意味し、限定されないが、ヒトＢＭＰ４（例えば、ユニプロット受入番号Ｐ１２６４４）、ならびにｃｈｉｍｐ（チンパンジー）ＢＭＰ４などの非ヒトサイトカイン、および全てのその天然起源バリアントが含まれ、これらのいずれかのＢＭＰシグナル伝達を活性化できる活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ＦＧＦ受容体アゴニスト」は、ＦＧＦ受容体を介してＦＧＦシグナル伝達を活性化できる任意の分子を意味する。これは、限定されないが、ＦＧＦ２を含む。
用語「ＦＧＦ２」は、基本的ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）とも呼ばれる繊維芽細胞増殖因子２を意味し、限定されないが、ヒトＦＧＦ２（例えば、ユニプロット受入番号Ｐ０９０３８）、ならびにｃｈｉｍｐ（チンパンジー）ＦＧＦ２などの非ヒトサイトカイン、および全てのその天然起源バリアントが含まれ、ＦＧＦシグナル伝達を活性化できるこれらのいずれかの活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「アクチビン受容体アゴニスト」は、その受容体、ＡＬＫ４（ユニプロット受入番号：Ｐ３６８９６）、ＡＬＫ７（ユニプロット受入番号：Ｑ８ＮＥＲ５）ＡＣＴＲＩＩＡ（ユニプロット受入番号：Ｐ２７０３７）および／またはＡＣＴＲＩＩＢ（ユニプロット受入番号：Ｑ１３７０５）、の１つを介して結節シグナル伝達を活性化できる任意の分子を意味する。これには、限定されないが、アクチビンＡおよび／または結節、好ましくはヒトアクチビンＡおよび／またはヒト結節ならびにそれらのいずれかのコンジュゲートおよび／または活性フラグメントが含まれる。
用語「アクチビンＡ」または「Ａｃｔ Ａ」は、例えば、全ての形態のアクチビンＡを意味し、ヒトアクチビンＡ（ユニプロット受入番号：Ｐ０８４７６）ならびに非ヒトサイトカイン、およびそれらの全ての天然起源バリアントが含まれ、結節シグナル伝達を活性化できるそれらのいずれかの活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ノッチアゴニスト」は、ノッチシグナル伝達を活性化できる任意の分子を含む。これには、限定されないが、Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ（ＤＬ）１、２および４、およびジャグド（Ｊａｇ）１、２ならびに非ヒトタンパク質、およびそれらの全ての天然起源バリアントが含まれ、およびそれらのいずれかの活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ノッチ」は、例えば、ノッチ１（ユニプロット受入番号：Ｐ４６５３１）、ノッチ２（ユニプロット受入番号：Ｑ０４７２１）、ノッチ３（ユニプロット受入番号：Ｑ９ＵＭ４７）および／またはノッチ４（ユニプロット受入番号：Ｑ９９４６６）およびそれらの天然起源バリアント、好ましくはヒトノッチが含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ＢＭＰ受容体アゴニスト（ＢＭＰＲＡ）および任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤を含むＰＳＣ培養組成物」は、ＢＭＰ４などのＢＭＰ受容体アゴニスト（ＢＭＰＲＡ）およびＹ－２７６３２などのＲＯＣＫ阻害剤を含む多能性幹細胞に好適する基本培地を意味する。ＧＳＫ４２９２８６Ａ、ファスジルおよびチアゾビビンなどの他のＲＯＣＫ阻害剤も使用できる。それは、１種または複数の他の成分、例えば、本明細書、例えば、実施例１で記載の１種または複数の他の成分を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、用語「ＢＭＰ４Ｒ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養組成物」は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４などの基本培地およびＢＭＰ４などのＢＭＰ４Ｒ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ２などのＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビンＡなどのアクチビン受容体アゴニストを含む組成物を意味する。それは、１種または複数の他の成分、例えば、本明細書、例えば、実施例１で記載の１種または複数の他の成分を含んでもよい。
本明細書で使用される場合、用語「ＶＥＧＦを含むＨＥＣ培養組成物」は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４またはα－ＭＥＭなどの基本培地およびＶＥＧＦを意味し、任意選択で、ＦＧＦ２などのＦＧＦ受容体アゴニストおよびＩＬ－６および／またはＩＬ－１１などの１種または複数の造血サイトカインを含む組成物を含む。それは、１種または複数の他の成分、例えば、本明細書、例えば、実施例１で記載の１種または複数の他の成分を含んでもよい。
用語「ＶＥＧＦ」は、血管内皮細胞増殖因子、例えば、ＶＥＧＦＡ（例えば、ユニプロット受入番号：Ｐ１５６９２）、ならびに非ヒトサイトカイン、およびそれらの全ての天然起源バリアントを意味し、ＶＥＧＦシグナル伝達を活性化できるそれらのいずれかの活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントを含むヒトＶＥＧＦファミリーメンバーを含む。
用語「ＩＬ－６」は、インターロイキン－６、例えば、ヒトＩＬ－６（例えば、ユニプロット受入番号：Ｐ０５２３１）、ならびに非ヒトサイトカイン、およびこれらの全ての天然起源、バリアント、ＩＬ－６シグナル伝達を活性化できるそれらのいずれかの活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントを意味する。
用語「ＩＬ－１１」は、インターロイキン－１１、例えば、ヒトＩＬ－１１（例えば、ユニプロット受入番号：Ｐ２０８０９）、ならびに非ヒトサイトカイン、およびこれらの全ての天然起源、バリアントを意味し、ＩＬ－１１シグナル伝達を活性化できるそれらのいずれかの活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントを含む。
本明細書で使用される場合、用語「６日目の細胞」または「分化の６日目」は、例えば、少なくとも１５％、少なくとも２５％、少なくとも３０％または１５％～６０％のＣＤ３４＋ＣＤ４３－を含み、多能性前駆細胞経路に従って進むように分化できる細胞を意味する、またはＣＤ３４＋ＣＤ４３＋で、原始である細胞を意味する。図２Ａに示すように、６日目の細胞は、本明細書で記載のように、ＰＳＣから出発した分化の６日後である細胞を意味する。ＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞は、例えば、分化の７日目に単離されてもよい。
本明細書で使用される場合、用語「原始前駆細胞培養組成物」は、造血前駆細胞に好適する基本培地を含む組成物を意味し、ＶＥＧＦおよび任意選択で、ＦＧＦ２、１種または複数の造血サイトカインを含む。原始前駆細胞培養組成物は、ＨＥＣ培養組成物と同じ組成物であり得る。
用語「ＥＰＯ」は、エリスロポエチンを意味し、例えば、ヒトＥＰＯ（例えば、ユニプロット受入番号：Ｐ０１５８８）、ならびに非ヒトサイトカイン、およびこれらの全ての天然起源そのバリアントを含み、ＥＰＯシグナル伝達を活性化できるそれらのいずれかの活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントを含む。
用語「ＩＧＦ１」は、インスリン様成長因子１、例えば、ヒトＩＧＦ１（例えば、ユニプロット受入番号：Ｐ０５０１９）、ならびに非ヒトサイトカイン、およびこれらの全ての天然起源バリアントを意味し、ＩＧＦ１シグナル伝達を活性化できるこれらのいずれかの活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントを含む。
用語「ＳＣＦ」は、ＫＩＴリガンド（ＫＬ）としても知られる幹細胞因子、例えば、ヒトＳＣＦ（例えば、ユニプロット受入番号：Ｐ２１５８３）、ならびに非ヒトサイトカイン、およびこれらの全ての天然起源バリアントを意味し、ＫＩＴシグナル伝達を活性化できるそれらの活性コンジュゲートおよび／または成分を含む。
例えば、基本培地は、例えば、供給されたままで、または部分的にＩＭＤＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１２２０００３６）で希釈して、ＩＴＳ－Ｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５１５０００５６）、追加のグルタミン、アスコルビン酸、モノチオグリセロールおよびトランスフェリンをさらに補充して使用できる、商業的に入手可能なＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１０６３９０１１）であり得る。ＧＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＳＴＥＭｄｉｆｆ ＡＰＥＬ２、ＳＴＥＭｓｐａｎ ＳＦＥＭ ＩＩ、α－ＭＥＭおよびＸ－ＶＩＶＯなどの他の基本培地。他のサプリメントも使用できる。
本明細書で使用される場合、用語「多能性前駆細胞培養組成物」または「ＭＰＰ培養組成物」は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４またはα－ＭＥＭなどの基本培地および１種または複数の造血サイトカインを含む組成物を意味する。例えば、多能性前駆細胞培養組成物は、ＯＰ９－ＤＬ４細胞などのノッチリガンド供給細胞源を用いる場合に使用できる。このような例では、多能性前駆細胞培養組成物は、血清およびＳＣＦ、ＩＬ７およびＦＬＴ３Ｌなどの造血サイトカインを含み得る。
用語「ＩＬ７」は、インターロイキン－７、例えば、ヒトＩＬ７（ユニプロット受入番号：Ｐ１６８７１）、ならびに非ヒトサイトカイン、およびこれら全ての天然起源バリアントを意味し、ＩＬ７シグナル伝達を活性化できるこれらの活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントを含む。
用語「ＦＬＴ３Ｌ」は、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド、例えば、ヒトＦＬＴ３Ｌ（ユニプロット受入番号：Ｐ４９７７１）、ならびに非ヒトサイトカイン、およびこれら全ての天然起源バリアントを意味し、ＦＬＴ３シグナル伝達を活性化できるこれらの活性コンジュゲートおよび／または活性フラグメントを含む。
用語「マスト系統細胞」は、限定されないが、ＣＤ４５およびＫＩＴの発現により定義される細胞を意味する。
用語「ＮＫ系統細胞」は、限定されないが、ＣＤ５６、例えば、ＣＤ４５、ＣＤ７およびＣＤ５６の発現により定義される細胞を意味する。
用語「原始赤血球系統細胞」は、限定されないが、ＣＤ４３およびＣＤ２３５ａ／ｂの発現により定義される細胞を意味する。
用語「マクロファージ系統細胞」は、限定されないが、ＣＤ４５、ならびに、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１４の１つまたは複数の発現により定義される細胞を意味する。
用語「顆粒球系統細胞」は、限定されないが、ＣＤ４５およびＣＤ１５ならびに任意選択でＣＤ３１の発現により定義される細胞を意味する。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。好適な担体は、本分野の標準的な参考テキストである、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。この文献は、参照により本明細書に組み込まれる。このような担体または希釈剤の任意選択の例としては、限定されないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が挙げられる。
本開示の範囲の理解において、本明細書で使用される場合、用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその派生語は、示された特徴、要素、成分、基、整数、および／またはステップの存在を指定するが、示されていない特徴、要素、成分、基、整数、および／またはステップの存在を排除しない、開放型用語であることが意図されている。前述はまた、用語の、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」およびそれらの派生語などの類似の意味を有する単語にも当てはまる。最後に、本明細書で使用される場合、「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」などの程度の用語は、最終結果が大きく変化しないような適度な量の修飾された用語のずれを意味する。これらの程度を示す用語は、少なくとも±５％または±１０％のずれが修飾される用語の意味を打ち消すことがない場合には、修飾された用語はその程度のずれを含むと解釈すべきである。
本明細書における終端点による数値範囲の列挙には、その範囲内に含まれる全ての数および小数部が包含される（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４、および５が包含される）。全ての数およびその端数が「約」という用語によって修飾されるとみなされることも理解されるべきである。
本明細書および添付された特許請求の範囲において用いられるとき、単数形（「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」）は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数の指示物を含む。このように、例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」を含有する組成物は、２つ以上の化合物の混合物を含む。用語「または」は、別段の明確な指示がない限り、通常、「および／または」を包含する意味で用いられることにも留意されたい。
特定のセクションで記載される定義および実施形態は、当業者により理解され得るように適切に本明細書で記載される他の実施形態に適用可能であることが意図されている。例えば、次の節では、開示の異なる態様がより詳細に定義される。そのように定義されたそれぞれの態様は、別義が明確に指示されない限り、任意のその他の態様と組み合わせてもよい。特に、好ましいまたは有利であるとして示されている任意の特徴を、好ましいまたは有利であるとして示されているその他の任意の特徴と組み合わせてもよい。
ＩＩ．方法および組成物
モデル生物発生の分析は、胚性造血が、時空間的組織化および系統分化能が異なる別個のプログラムからなることを示した。長い間、急速に発生中の初期胚芽の酸素要求などの造血必要条件を満たすことを主に考えられて来たが、過去数十年にわたる研究は、卵黄嚢造血プログラムの子孫が胎児および成体の組織常在性免疫細胞集団に寄与するという強力な証拠を提供した。これらの免疫細胞集団は、不可欠な組織特異的恒常的機能を果たし、それらの調節不全は、疾患に繋がり得る。本明細書で記載されるのは、ｈＰＳＣ分化を用いた、ヒト原始、ＥＭＰおよびＬＭＰ造血プログラムの生成および調節のための方法および組成物である。記載される方法は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉から、これらの胚性造血プログラムの造血前駆細胞を生成するための効率的プロトコルを提供する。発明者らは、ヒト原始プログラムの生成におけるノッチの調節的役割を明らかにした。加えて、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉は、Ｔリンパ球分化能を有する前駆細胞を発生させることができることが示され、この系統は、ＮＫ細胞、Ｔリンパ球、ＥＭＰ赤血球および骨髄分化能を有する多能性造血前駆細胞から発生することが示される。まとめると、これらの知見は、ヒトＥＭＰおよびＬＭＰプログラムに繋がり、ヒトの共通の卵黄嚢由来多能性前駆細胞（ＭＰＰ）プログラムの証拠を提供する。
発明者らは、多能性幹細胞から、ヒト卵黄嚢様造血細胞を作製するためのインビトロ培養法を特定した。
従って、一態様は、Ｔリンパ系統細胞またはそれから分化した細胞を発生させることができるＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生する方法を含み、該方法は：
多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、ＢＭＰ受容体アゴニスト（ＢＭＰＲＡ）および任意選択のＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）を含むＰＳＣ培養組成物と接触させて、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を産生すること；およびＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養組成物と接触させて、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生すること、を含む。
種々の実施形態では、ＰＳＣ培養組成物はＲｉを含む。
中胚葉特異化培養組成物との接触またはそれを用いた処理は、細胞に原始線条（ＰＳ）を介して進行し、中胚葉を産生することを指示する。
特異化培養組成物により産生された細胞集団は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋およびＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞を含む。本明細書で示すように、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋集団は、造血運命を発生させる多数の中胚葉細胞を含む。ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ－細胞を除去する必要はない。
ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団の、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養組成物との接触は、示したアゴニストへの細胞集団の同時曝露を可能にする。これらのアゴニストは、培養組成物がＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団と接触する前に、培養組成物に添加できる。あるいは、これらのアゴニスト（および／または他の成分）を欠く特異化培養組成物は、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団と接触させて、アゴニスト（またはそれらの１種または複数）をその後に添加できる。
いくつかの実施形態では、例えば、ｈＰＳＣ培養のための実施例１で記載の１つまたは複数のステップまたは試薬を用いて、ＰＳＣが培養される。
ある実施形態では、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団は、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養組成物と、約３日間、少なくとも３日間または最大３日間、接触させられる。例えば、約３日間は、６４時間～８０時間ぐらいの時間を含んでもよい。少なくとも３日間は、少なくとも６４時間を含んでもよく、最大３日間は、最大８０時間を含んでもよい。
中胚葉特異化培養組成物は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地、ＧＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＲＰＭＩ、ＳＴＥＭＳｐａｎ ＳＦＥＭ、ＳＴＥＭｄｉｆｆ ＡＰＥＬ２および／またはＸ－ＶＩＶＯなどの好適な基本培地を含む。基本培地に応じて、１種または複数のサプリメントを添加し得る。
多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であり得る。多能性幹細胞は、胚性細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、例えば、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）であり得る。
一実施形態では、多能性幹細胞は、ＰＳＣ培養組成物と接触させる場合、および／またはＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団は、中胚葉特異化培養組成物と接触させる場合、胚様体（ＥＢ）の形態である。胚様体は、多能性幹細胞および／またはＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を培養して細胞を凝集させることにより得ることができる。
例えば、実施例１で示すように、胚様体は、得られた集団を中胚葉特異化培養組成物と接触させる前に、ＢＭＰＲＡおよびＲｉを含むＰＳＣ培養組成物中で約１８時間にわたり軌道振盪することより調製できる。
実施例に記載のように、分化培養物は、低酸素状態で維持でき、例えば、胚様体として形成された後、ＰＳＣなどの細胞は、中胚葉特異化培養組成物と３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２で接触させられる。
従って、いくつかの実施形態では、１つまたは複数の培養ステップが低酸素状態で実施され、任意選択で、低酸素状態は、５％ＣＯ２および５％Ｏ２、および／または低酸素誘導因子（ＨＩＦ）プロリルヒドロキシラーゼ（ＰＨＤ）阻害剤（ＨＩＦ－ＰＨＤＩ）の添加の細胞培養インキュベーター環境である。種々のＨＩＦ－ＰＨＤＩが既知である。一実施形態では、ＨＩＦ－ＰＨＤＩは、三環式トリアゾール化合物、任意選択で、ＨＩＦ１ａシグナル伝達も高めるＩＯＸ２、ＩＯＸ４、ＤＭＯＧまたは類似化合物である。別の実施形態では、ＨＩＦ－ＰＨＤＩは、ダプロデュスタット、モリデュスタット、ロキサデュスタット、バダデュスタットおよびデシデュスタットから選択される。
方法が胚様体の形成を伴う場合、プロトコルの最初の日は、胚様体の形成である。ＰＳＣは、ＰＳＣ培地中で約１６～２４時間、例えば、１８時間培養して、胚様体（ＥＢ）を形成し、ＥＢ（例えば、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団）は、中胚葉特異化培養組成物中で、胚様体の形成後約３日間処理される、または分化プロトコルの４日目と呼ばれる条件で処理される。約３日は、例えば、±１０％の日数、例えば、２．７日～約３．３日を含む。
本明細書で示すように、ＢＭＰ４などのＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ２などのＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビンＡなどのアクチビン受容体アゴニストの同時使用は、Ｔリンパ系統細胞を生成できるＫＤＲ＋中胚葉細胞を産生する。ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞および／またはＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ－中胚葉細胞などのＫＤＲ中胚葉を使用できる。
ＢＭＰＲＡまたはＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニストは、ＢＭＰ４などのＢＭＰＲ１／Ｒ２シグナル伝達を活性化する任意の分子または組み合わせであり得る。その他のものとしては、ＢＭＰ２、および／またはＢＭＰ７が含まれる。
一実施形態では、ＢＭＰＲＡまたはＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニストは、ＢＭＰ４であるか、またはこれを含む。ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団と接触される組成物中のＢＭＰ４の濃度は、約０．５～１００ｎｇ／ｍＬ、または１．１～９９．９ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬの任意の０．１ｎｇ／ｍＬ増分の濃度である。一実施形態では、濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４である。
ＦＧＦ受容体アゴニストは、ＦＧＦ２などのＦＧＦ受容体を活性化する任意の分子であり得る。
ＦＧＦ受容体アゴニストは、好ましくはＦＧＦ２（ｂＦＧＦとも呼ばれる）であるが、ＫＤＲ＋特異化、例えば、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋特異化を促進する任意のＦＧＦまたはＦＧＦ類似体であり得る。ＦＧＦ２の場合のＦＧＦ受容体アゴニストは、約０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬの濃度、または１．１～９９．９ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、約１ｎｇ／ｍＬ～約３０ｎｇ／ｍＬの任意の０．１ｎｇ／ｍＬ増分の濃度で供給され得る。
アクチビン受容体アゴニストは、その受容体の１種、ＡＬＫ４、ＡＬＫ７、ＡＣＴＲＩＩＡおよび／またはＡＣＴＲＩＩＢ、例えば、アクチビンＡまたは結節を介して結節シグナル伝達を活性化する任意の分子であり得る。
一実施形態では、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団と接触させる組成物中のアクチビンＡの濃度は、約０．２ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬまたは約１０ｎｇ／ｍＬである。例えば、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニストおよびＦＧＦ受容体アゴニストの比率が維持される、より高い濃度でも使用できる。
いくつかの実施形態では、アクチビンＡの濃度は、約２ｎｇ／ｍＬより高く、８ｎｇ／ｍＬより低い。最適濃度は、例えば、実施例に記載のような、例えば、用量設定実験を用いて決定できる。一例として、一定の濃度ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）の存在下で、異なる量のアクチビンＡ（例えば、０～１０ｎｇ／ｍＬの２ｎｇ／ｍＬ増分による量）が分化の１日目に培養液に添加される。約３日後、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞のパーセンテージが定量化される。最適濃度は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞の最も高い発生頻度を与える条件である。追加して、または代わりに、分化の９日目まで継続される培養液中のＣＤ４３＋細胞の比率を評価できる。異なる濃度のアクチビンＡがより多くの数の目的の細胞を生ずる場合、どちらかの濃度、またはより低い方の濃度を使用し得る。
一実施形態では、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストの比率は、約１０：５：６または約１０：５：２または約１０：５：６～１０：５：２である。例えば、特定の薬剤の濃度は、約１０：５：６または約１０：５：２または約１０：５：６～１０：５：２の比率で使われるＢＭＰ４、ＦＧＦ２およびアクチビンＡに対して類似の効果を与える濃度であり得る。
前述のように、多能性幹細胞は、任意の多能性幹細胞株またはその由来源であり得るか、または誘導多能性幹細胞であり得る。発明者らは、患者からの細胞由来の胚性幹細胞株および誘導多能性幹細胞を使用した。誘導多能性幹細胞（すなわち、非多能性細胞、通常は成体細胞から人工的に誘導された（例えば、誘導または完全逆転による）多能性幹細胞）の作製方法は、既知である。例えば、１種または複数の遺伝子（限定されないが、ＳＯＸ２（遺伝子ＩＤ；６６５７）、ＫＬＦ４（遺伝子ＩＤ；９３１４）、ｃＭＹＣ（遺伝子ＩＤ；４６０９）、ＮＡＮＯＧ（遺伝子ＩＤ；７９９２３）、ＬＩＮ２８／ＬＩＮ２８Ａ（遺伝子ＩＤ；７９７２７）と組み合わせたＰＯＵ４Ｆ１／ＯＣＴ４（遺伝子ＩＤ；５４６０）を含む）の発現の誘導によるｉＰＳＣ。例えば、これは、限定されないが、これらの遺伝子を発現するレンチウイルスおよびセンダイウイルスを含むウィルスを用いて達成できる。誘導多能性幹細胞の作製方法は、米国特許第７，６８２，８２８号、および同第８，０５８，０６５号に記載の方法を含む。これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ編集ｉＰＳ細胞の作製方法も、既知である。よく使われる細胞は、末梢血単核球および皮膚線維芽細胞である。理由は、これらが入手可能なためである。
図１および２０を参照すると、出発集団がＨ１ ＥＳＣである場合、６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用、または出発集団がＣＨＯＰＷＴ１０ヒトｉＰＳＣ株である場合、２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用が、３０％を超える細胞がＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋である細胞集団を産生したことを示す。従って、いくつかの実施形態では、使用したアクチビン受容体アゴニストの濃度は、約３日間の中胚葉特異化培養組成物との接触後、少なくとも３０％のＫＤＲ＋中胚葉、例えば、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生する濃度または比率である。
いくつかの実施形態では、方法は、ＫＤＲ＋中胚葉、例えば、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を、ＶＥＧＦおよび任意選択でＦＧＦ２などのＦＧＦ受容体アゴニスト、ならびに任意選択で、ＩＬ－６およびＩＬ－１１などの造血サイトカインを含むＨＥＣ培養組成物と接触させて、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋造血内皮細胞（ＨＥＣ）を得ることをさらに含む。本明細書で示すように、ほとんどの造血中胚葉は、ＣＤ２３５ａ／ｂ＋であるが、いくつかのＣＤ２３５ａ／ｂ－細胞が存在する。ＨＥＣを生成する場合、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ－細胞を除去する必要はない。
例えば、図４および５で示したように、発明者らは、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞は、例えば、ＫＤＲ、ＣＤ３４、ＫＩＴ、ＣＤ１４４、および／またはＣＤ３１を発現するＨＥＣに更に分化できることを示す。
実施例で示すように、ＨＥＣは、５日目（ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞の約１日後）に出現する。ＨＥＣは、約６日目から検出が始まるＣＤ４３＋造血前駆細胞を循環する原始経路に沿って分化する細胞を含む。例えば、細胞が胚様体中に存在するとき、ＨＥＣ細胞中に存在するノッチリガンドは、例えば、この経路に沿って分化するために必要なノッチシグナルを提供し、例えば、マスト細胞、マクロファージおよび原始型赤血球を産生できる（図２２参照）。
実施例で示すように、ＣＤ３４＋ＦＤＲ＋ＨＥＣは、ノッチアゴニストの由来源を与える凝集体として培養できる。
ＣＤ４３－であるＨＥＣはまた、約６日目に存在し、ＣＤ４５＋造血前駆細胞を循環して多能性前駆細胞経路に沿って発生できるＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞も含む。６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣは、単離、および任意選択で、凝集させることができ、ならびに、ＶＥＧＦおよび任意選択で、ＦＧＦ受容体アゴニストおよび任意選択で、１種または複数の造血サイトカイン、およびいくつかの実施形態では、例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋造血細胞および本明細書でさらに記載されるように、最終的にＴリンパ細胞、ＮＫ細胞、顆粒球、マクロファージおよび多能性型赤血球を得るための外部ノッチ活性化源と共に培養できる。
いくつかの実施形態では、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞は、ＶＥＧＦおよび任意選択で、ＦＧＦ受容体アゴニストおよび１種または複数の造血サイトカインを含むＨＥＣ培養組成物と、少なくとも０．５日、０．７５日または少なくともまたは約１日間、接触させられる。原始経路の血液前駆細胞が６日目またはその近傍で出現するので、インキュベーションは通常、２日間または１．５日間未満で、分化の６日目以前である。６日目またはその近傍で出現する原始造血前駆細胞は、ＣＤ４３＋の発現に基づいて単離できる。これらの前駆細胞は、本明細書で示すように、例えば、赤血球、マクロファージおよびマスト細胞系統を発生させる。
ＨＥＣ培養組成物は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地などの好適な基本培地を含み、それに、ＶＥＧＦおよび任意選択で、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびＩＬ－６および／またはＩＬ－１１などの１種または複数の造血サイトカインを添加できる。
実施例で示すように、ＨＥＣは、分化して、原始系統造血前駆細胞および多能性系統造血前駆細胞を提供できる。
例えば、原始系統前駆細胞が望ましい場合、方法は、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣを、ＶＥＧＦおよび任意選択で、ＦＧＦ受容体およびＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、ＩＧＦ１および／またはＥＰＯなどの１種または複数の造血サイトカインを含む原始前駆細胞培養組成物と接触させて、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を得るためのノッチアゴニストシグナルを提供することができる。原始前駆細胞培養組成物は、ＨＥＣ培養組成物と類似または同じであり得る。原始前駆細胞培養は、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、ＩＧＦ１および／またはＥＰＯなどの造血因子、ならびにＧＭ－ＣＳＦまたはＭ－ＣＳＦなどの他の因子を含んでもよい。
一実施形態では、方法は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、ＢＭＰ受容体アゴニスト（ＢＭＰＲＡ）および任意選択で、ＲＯＣＫ阻害剤ＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）を含むＰＳＣ培養組成物と接触させて、好ましくは、ＰＳＣはＰＳＣ培養組成物とＥＢ（これは、０～１日目と呼ばれ得る）を形成するための方式で培養して、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を産生すること；ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ２受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニスト、好ましくはＢＭＰ４、ＦＧＦ２およびアクチビンＡ、を含む中胚葉特異化培養組成物と接触させて、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生すること（例えば、１～４日目に）；ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を、ＶＥＧＦおよび任意選択で、ＦＧＦ２などのＦＧＦ受容体アゴニストおよび任意選択で、好ましくはＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＩＬ６、およびＩＬ－１１などの１種または複数の造血サイトカインを含むＨＥＣ培養組成物と接触させて、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋造血内皮細胞（ＨＥＣ）を得ること（例えば、４～６日目に）；および
ｉ）例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＥＰＯ、ＩＧＦ１およびＳＣＦを含む原始前駆細胞培地中でＨＥＣ細胞を増殖および／または分化させること；または
ｉｉ）ＣＤ３４＋ＣＤ４３－陰性細胞を単離し、多能性前駆細胞（ＭＰＰ）培地中で、任意選択で、ノッチリガンドの存在下で、ＨＥＣ細胞を増殖および／または分化させること、を含む。
ステップｉ）およびｉｉ）は、例えば、図２２に示す異なる血液細胞に分化する造血前駆細胞を産生する。
図２および４を参照すると、細胞が原始前駆細胞培養組成物中で培養されると、ＣＤ４３を発現している細胞が、早くも分化の６日目に出現する（例えば、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣを原始前駆細胞培養組成物と約１日間接触させる場合）ことが示される。このような細胞の数は、時間の経過ととも、例えば、少なくとも９日目まで増大し（図２参照）、１５日後（例えば、造血サイトカインを用いた処理の１１日後）でさえ、維持される。前駆細胞は、２０日後、さらには２４日後であっても存在し得るが、それらの数は少ない可能性がある。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣは、例えば、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、およびＩＬ－６、ＩＬ－１１などの造血サイトカインを含む原始前駆細胞培養組成物と、少なくとも１日間、または約２日間、その後、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、およびＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、ＩＧＦ１および／またはＥＰＯなどの造血サイトカインと、追加で、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日または１２日間、もしくはそれより長く、例えば、所望数のＣＤ４３＋細胞が得られるまで、接触させられる。
例えば、ＣＤ７＋前駆細胞は、６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣをノッチ由来源（例えば、ＯＰ９－ＤＬ４細胞）との培養の約１２日後に生成された（例えば、ＰＳＣとの開始から１８日）。ＣＤ７＋細胞は、抗ＣＤ７抗体および例えば、ＦＡＣＳを用いて単離できる。同様に、他の細胞型も、細胞表面マーカーの存在に基づいて単離できる。
より多くの数の前駆細胞が好ましい場合には、接触は、例えば、４日未満、５日未満または６日未満であり得る。より多くの成熟細胞が好ましい場合には、接触は、例えば、６日超であり得る。例えば、図９で示されるように、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２および造血サイトカインとの培養で、ＣＤ４３＋集団は時間と共に増大し、コロニー形成前駆細胞は３日目～６日目に減少した。
原始前駆細胞培養組成物は、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地などの好適な基本培地、およびＶＥＧＦおよび任意選択で、１種または複数のＦＧＦ２およびＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、ＩＧＦ１および／またはＥＰＯなどの造血サイトカインを含み得る。
実施例で示すように、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣの接触は、種々の原始プログラムの系統を発生させた。
一実施形態では、方法は、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を培養し、マクロファージ細胞を生成することをさらに含む。例えば、実施例で示すように、ＣＤ４３＋造血前駆細胞は、段階特異的因子を使用して、マクロファージ運命に分化できる。ＣＤ４３＋細胞は任意選択で、例えば、分化の９日目に単離され、ＭＣＳＦ、ＩＬ３およびＳＣＦを補充した原始前駆細胞培地中で培養される。ＧＭ－ＣＳＦも添加できる。実施例で示すように、培養の約３日後、細胞を収集し、ＭＣＳＦを補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で培養した。培地は、分化の残部のために、３日毎に交換し、４０日まで培養した。培養は通常、培養の１３日後（例えば、ＭＣＳＦ添加後）、ＣＤ４５＋ＣＤ６８＋ＣＤ１４＋マクロファージを高度に富化した。
マクロファージ系統は、例えば、６日目後、１５日目の前、例えば、６または９または１２日目（例えば、ＰＳＣから）を含む任意の日までの間に、単離されたＣＤ４３＋造血前駆細胞から分化できる。
例えば、ＣＤ４３＋細胞は、分化の９日目に単離し、例えば、ＳＣＦ、ＩＬ３およびＭＣＳＦを用いて約３日間処理できる。３日後、細胞を取り出して、ＭＣＳＦのみを含む培地に移すことができる。
原始マクロファージ（骨髄細胞系列とも呼ばれる）は、細胞が４～６日の期間の間に成熟するに伴い、ＣＤ４５発現を習得する。
一実施形態では、方法は、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を培養し、マスト系統細胞を生成することをさらに含む。マスト系統細胞の前駆細胞は、例えば、６日目に出現し始める。ＩＬ３およびＳＣＦなどのマスト細胞誘導因子を加えて、産生されるマスト細胞の数を増大させることができる。いくつかの実施形態では、マスト細胞系統は単離される。
別の実施形態では、方法は、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を培養し、原始赤血球を生成することをさらに含む。原始赤血球系統細胞の前駆細胞は、例えば、分化の６日目に出現し始める。ＥＰＯ、ＳＣＦ、ＩＬ３およびＩＧＦ１などの赤血球誘導因子を加えて、産生される赤血球の数を増大させることができる。いくつかの実施形態では、赤血球の細胞系統は単離される。実施例で示すように、分化の６日目に出現するＣＤ４３＋集団に加えて、発明者らは、ＨＥＣ／内皮細胞マーカーＫＤＲ、ＫＩＴ、ＣＤ１４４およびＣＤ３１を共発現し、多能性前駆細胞系統の細胞を生成するために使用できるＣＤ４５－集団、例えば、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＤ４５－集団を特定した。従って、いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣをＨＥＣ培地中で一定期間培養し、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞を産生することをさらに含む。これらのＨＥＣ細胞は、ＥＢまたは接着細胞中に存在し得る。
原始経路の前駆細胞は、取り出すことができる、および／または６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞は、例えば、ＦＡＣＳにより単離できる。細胞がＥＢ中に存在する、あるいは、凝集している場合、例えば、ＦＡＣＳによる単離の前に、任意選択で、本明細書で記載のように、細胞は脱凝集される。
ＨＥＣがＨＥＣ培地中で培養される期間は、約１日～約２日であり、細胞は、分化の６日目と呼ばれる時点で単離できる。細胞は、例えば、本明細書で記載のように、例えば、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳにより単離できる。
単離されると、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、ＳＣＦ、ＩＬ－７、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＧＦ１および／またはＥＰＯなどの１種または複数の造血サイトカイン、および任意選択で、ノッチアゴニストを含む多能性前駆細胞培養組成物と接触させて、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞、任意選択で、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－および／またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋造血前駆細胞を得ることができる。
ある実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－細胞を単離することを含む。本明細書で記載のように、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－細胞は、赤血球、骨髄、ＮＫ細胞およびＴリンパ球分化能を有する多能性造血前駆細胞である。
いくつかの実施形態は、ノッチアゴニストの添加を用いる。一実施形態では、ノッチアゴニストは、例えば、リガンド発現細胞株により供給されるノッチリガンド（例えば、Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ（ＤＬ）およびジャグド（Ｊａｇ））である。ノッチは、例えば、多能性前駆細胞培養組成物と接触したＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣが、ＯＰ９－ＤＬ４、ＯＰ９－ＤＬ１、ＯＰ９－ＪＡＧ１、ＭＳ５－ＤＬ４、ＭＳ５－ＤＬ１もしくはＭＳ５－ＪＡＧ１などのノッチ発現細胞株上、または接着あるいは固定化ノッチリガンドを含む培養プレートまたはビードなどの足場上で成長する場合に、得ることができる。ノッチリガンドは、ビード結合ノッチリガンド（例えば、ＤＬ４リガンド）であってよい。足場固定化ノッチリガンドを用いる手法は、例えば、血清または間質細胞を必要としない。
例えば、細胞株は、細胞株を、ノッチリガンド発現ウィルスを用いて形質導入することにより作製できる。Ｔ細胞を作製するための固定化ＤＬ４を含むキットも、例えば、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手できる。
ノッチリガンド発現細胞と接触させる場合、ＣＤ４３－ＨＥＣは、基本培地がα－ＭＥＭであり、造血サイトカインがＩＬ７、ＦＬＴ３ＬおよびＳＣＦであるＭＰＰおよび血清中で接触させることができる。
いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ４５＋細胞を単離することをさらに含む。ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞は、ＭＰＰ経路の造血前駆細胞であるか、これを含む。
ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血細胞は、例えば、図２２で示すように、多能性系統の細胞を生成するために使用できる。
例えば、図１０で示すように、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＤ４５－ＨＥＣを、示した因子を有するＭＰＰ中で培養することにより、ＭＰＰ経路の種々の系統細胞のための前駆体細胞が得られる。いくつかの実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＫＩＴ＋、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＫＩＴ－、ＣＤ３４－ＣＤ４５＋またはＣＤ３４－ＣＤ４５－細胞を単離することをさらに含む。前記細胞は、例えば、ＨＥＣのＯＰ９－ＤＬ４細胞との培養により得られるノッチリガンドの存在下で、ＨＥＣをＭＰＰ中で培養後の、例えば、３日、４日または５日後に検出できる。
いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞（例えば、分化の６日目）を、最大または約５日間培養（例えば、１１日の全培養）して、ＭＰＰ造血前駆細胞が得られる。
実施例で示されるように、方法は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞、任意選択で、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－造血前駆細胞を、１種または複数の造血サイトカインおよび任意選択で、ノッチアゴニストを含む多能性前駆細胞培養組成物と接触させて、多能性系統細胞を得ることを含む。
例えば、マクロファージ、マスト細胞および赤血球のために本明細書で記載の因子を用いて、望ましい細胞型に向けて直接分化方向を指示するために、種々の因子をさらに加えることができる。
本明細書で記載の方法はまた、ＮＫ前駆細胞およびＮＫ成熟細胞を生成するためにも使用できる。例えば、ＭＰＰ培養組成物は、ＮＫ分化を促進するＩＬ７およびＦＬＴ３Ｌなどの１種または複数の因子を含めることができる。ＮＫ細胞は、ＯＰ９－ＤＬ４細胞との約１５日間の培養で検出可能である。
本明細書で記載の方法はまた、顆粒球前駆細胞および顆粒球成熟細胞を生成するためにも使用できる。例えば、ＭＰＰ培養組成物は、顆粒球分化を促進するＧＣＳＦなどの１種または複数の因子を含めることができる。顆粒球前駆細胞は、例えば、６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣの単離の２日後に検出できる。
本明細書で記載の方法はまた、リンパ球前駆細胞およびＴ系統成熟細胞を生成するためにも使用できる。例えば、ＭＰＰ培養組成物は、細胞分化を促進するＩＬ７およびＦＬＴ３Ｌなどの１種または複数の因子を含めることができる。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、例えば、６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣとＯＰ９－ＤＬ４細胞との約２５日間の培養で検出可能である。
実施例で示すように、方法は、目的のＴＣＲを発現している特定のＴ細胞サブセットを産生するために使用できる。異なるＴＣＲ＋Ｔ細胞サブセットを含む培養は、図１３に示される。
いくつかの実施形態では、方法は、１種または複数の多能性プログラム系統細胞を単離することをさらに含む。例えば、特定の系統は、単離された系統であるか、系統の組み合わせであり得る。
一実施形態では、マクロファージ系統細胞が単離される。
一実施形態では、マスト系統細胞が単離される。
一実施形態では、多能性プログラム系統赤血球が単離される。本明細書で記載のように、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣ由来の赤血球は、ＰＣＲによりアッセイされる場合、主に胎生期のβグロビンを発現する。
一実施形態では、顆粒球が単離される。
図１１を参照すると、発明者らは、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団は、ノッチリガンドを用いて長期間、例えば、少なくともまたは約５日間にわたり、分化され得るＴリンパ系統前駆体を含むことを示す。例えば、ＣＤ７は、Ｔリンパ球分化の初期マーカーである。これは、ＯＰ９－ＤＬ４細胞との約５日間の培養で認められる。成熟（ＣＤ３＋）リンパ球は、例えば、約２５日までに認められる。例えば、１ヶ月間のノッチアゴニスト受容体刺激は、リンパ球前駆細胞を産生し、追加の１０日間の培養は、αβまたはγδ ＴＣＲ＋リンパ球を産生した。従って、ある実施形態では、方法は、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣの長期間培養、および任意選択で、Ｔリンパ系統細胞の単離を含む。長期間培養は、要望前駆細胞または成熟細胞集団が得られるまで、例えば、少なくとも２５日、少なくとも３０日、少なくとも３５日、少なくとも４０日、少なくとも４５日、またはさらに長期であり得る。
Ｖδ２ ＴＣＲを発現したＴ細胞は、ＭＰＰプログラムの前駆細胞により開始されたノッチリガンド（例えば、ＯＰ９－ＤＬ４）培養物から単離され得ることも本明細書で示される。一実施形態では、Ｖδ２ ＴＣＲ Ｔ細胞が単離される。
ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞は、ノッチアゴニスト受容体への曝露の前に凝集させることができ、これは、図１２に示すように、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞の発生頻度を増大させる。
いくつかの実施形態では、ノッチアゴニストは、ノッチリガンドである。
インキュベーションの時間は、出発集団、因子の濃度などの種々の要因に応じて変化し得る。時間は、例として与えられている。目的の細胞型の出現は、実施例に記載のように、ＦＡＣＳ、ＰＣＲなどのアッセイにより、および／またはコロニー形成アッセイを用いて監視できる。
方法はまた、１種または複数の原始またはＭＰＰプログラム系統細胞、任意選択で、特定の細胞表面受容体または受容体の組み合わせを発現している集団を単離することも含み得る。これらは、単離される目的の細胞に応じて、単一系統または複数系統を特定し得る。目的の前駆細胞または成熟細胞（原始または多能性経路により産生された細胞）はまた、例えば、ＦＡＣＳ、磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）により、および／または親和性試薬を用いて単離できる。
例えば、赤血球の前駆細胞は、ＣＤ４３および／またはＣＤ２３５ａ／ｂに対する親和性試薬を用いて単離でき；マスト細胞前駆細胞は、ＣＤ４３、ＣＤ４５および／またはＫＩＴを用いて単離でき；マクロファージ前駆細胞は、ＣＤ４３および／またはＣＤ４５を用いて、および例えば、ＣＤ３１および／またはＣＤ３４を用いて単離でき；および巨核球前駆細胞は、ＣＤ４１を用いて単離できる。
マクロファージは、ＦＡＣＳ、磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）により、および／またはＣＤ４５＋、ＣＤ６８＋、および／またはＣＤ１４＋を標的にする親和性試薬を用いて単離できる。他の成熟細胞に対する例は、本明細書で記載される。
実施例で示すように、異なる分化段階の細胞は、ＦＡＣＳによりアッセイでき、任意選択で、本明細書で記載のマーカーを用いてＦＡＣＳおよび／または親和性試薬により、またはＰＣＲにより単離できる。分化が進行中であることを確認するために使用できる遺伝子およびプライマー配列の例は、表１．１に示されている。
いくつかの実施形態では、１種または複数の種類の単離細胞が組成物中に再懸濁される。いくつかの実施形態では、特定の細胞、例えば、特定のマーカーまたはマーカーセットを発現している細胞が単離される。
本明細書で記載の細胞は、ゲル、例えば、ヒドロゲルなどの組成物中に、任意選択で、心筋細胞または肝細胞などの別の細胞型と組み合わせて、再懸濁できる。ゲルは生体適合性であるのが好ましい。
本明細書で記載の細胞はまた、生理食塩水（例えば、０．９％生理食塩水）などの無菌浸透圧的にバランスされた流体溶液またはナトリウム、カリウムおよび塩化物を含むバランスされたクリスタロイド溶液（例えば、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ）などの他の生体適合性流体、または本明細書で記載のもの、任意選択で、基本培地を含み、および／または追加の成分を含む培地である組成物中に再懸濁できる。凍結溶液として有用な他の溶液、例えば、ＣｒｙｏＳｔｒｏ ＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓによるカタログ番号２１０１０２の動物不含凍結培地）も含めることができる。
使用できる方法の詳細は、実施例で提供される。記載される１つまたは複数のステップは、本明細書に記載の方法に好適するとして使用できる。
特定の細胞表面マーカーを含む細胞は、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）精製により、および／またはマーカー特異的親和性試薬を用いて単離できる。例えば、親和性試薬は、ビーズに結合させ得る。いくつかの実施形態では、方法は、１回または複数回の精製ラウンド、例えば、１回または複数のＦＡＣＳ精製、または例えば、細胞表面発現パターンに基づく親和性ビーズを含む。
一実施形態では、ビーズは、磁性ベースの細胞分離のための磁気ビーズ、任意選択で、超常磁性であるポリスチレン球状ビーズである。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の富化ステップが実施される。
一実施形態では、集団は、単離集団、および／またはインビトロ産生集団である。例えば、ある態様は、本明細書で記載の方法によりインビトロで産生された細胞を含む。
本明細書で記載のように、方法は、特定の細胞型が富化されている細胞集団を産生した。ある実施形態では、方法は、少なくとも３０％、少なくとも３５％、または少なくとも４０％または少なくとも５０％の目的の細胞型を含む集団の産生を伴う。他の実施形態では、細胞は単離して、例えば、より多くの数の、例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の、１種または複数の本明細書で記載のマーカーを発現している細胞を得ることができる。
本明細書で記載の種々の成分は、培地に毎日添加できる、および／またはその成分を含む培地を、毎日補充できる。他の実施形態では、成分または成分を含む培地は、２週毎に、または特定の培養期間、例えば、最大６日の間に１回のみ、添加される。
例えば、いくつかの成分の添加は、培地中の細胞への直接添加により、または成分を含む新しい培地で培地を置換することにより、行うことができる。いくつかのステップのための成分は、例えば、１～３日目には毎日、および４日目または６日目以後は２日毎に置換できる。典型的には、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培地は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋に対し、１日目に添加され、特異化ステップ中（例えば、１日目～３日目）は変更されない。
方法は、例えば、全ての培地を除去すること、および分化の段階に応じて、特定の成分を含む培地と置換することを含み得る。
別の態様は、本明細書で記載の方法により産生された１種または複数の種類の細胞を含む細胞集団である。一実施形態では、集団は、本明細書で記載の方法ステップ後に単離される。例えば、本明細書で記載の方法を用いて生成されるＣＤ３４＋ＣＤ７＋Ｔリンパ球前駆細胞は、最初は、臍帯血から生成されたＴリンパ系統細胞とは異なり、ＣＤ５陰性である。
ある実施形態では、細胞集団は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７造血前駆細胞を含む。
ある実施形態では、細胞集団は、ＣＤ４５＋ＣＤ５６＋ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞を含む。
別の実施形態では、細胞集団は、Ｖδ２ Ｔ細胞を含む。
ある実施形態では、細胞集団は、精製された集団である。ある実施形態では、細胞集団は、末梢血から単離されていない。ある実施形態では、細胞集団は、ｉＰＳＣから産生される。別の実施形態では、細胞集団は、少なくとも１ｘ１０７個の細胞を含む。ある実施形態では、細胞集団は、ヒト細胞である。
本明細書で考察したように、Ｖδ２ Ｔ細胞を単離することは、それらが成体中では希であるために、容易に可能ではなかった。本発明の方法は、例えば、少なくとも１ｘ１０７個のＶδ２ Ｔ細胞を含む方法および組成物を提供する。
ある実施形態では、細胞集団は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％またはそれより多くの、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７造血前駆細胞などの特定の集団含む精製された細胞集団である。
さらなる態様は、記載の１種または複数の種類の細胞（例えば、細胞集団）および／または単離細胞（例えば、単離細胞集団）および任意選択で、担体または希釈剤を含む組成物である。
好適な希釈剤としては、例えば、例えば、基本培地、および本明細書で記載の１種または複数の成分（例えば、培地に添加される１種または複数の因子）を含む培地、または例えば、血清、血清代用品または血清補充剤および／またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールメチルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの好適な凍結保護物質を含む凍結培地などの培地を含む、好適な培地が挙げられる。いくつかの実施形態では、希釈剤は、無菌である。
一実施形態では、担体は薬学的に許容可能な担体である。
ある実施形態では、組成物は、ヒドロゲルなどのゲルであり、細胞は、ゲル中またはゲル上に存在する。ゲルは生体適合性であるのが好ましい。いくつかの実施形態では、組成物は液体である。例えば、組成物は、細胞に好適する希釈剤、任意選択で、細胞培地または他の浸透圧的にバランスされた栄養液を含み得る。本明細書で記載の、および／または本明細書記載の方法を用いて産生された細胞および細胞集団は、心筋細胞または肝細胞などの別の細胞型と組み合わせて、組成物中で混合できる。細胞は、例えば、ポーチ中に包含する、または足場上に含めることができる。
インビトロ産生細胞または細胞集団は、無菌バイアルなどのバイアル中に含み得る。
特定の実施形態では、組成物はゲルを含む。
組成物はまた、浸透圧的にバランスした流体溶液を含み得る。
いくつかの実施形態では、組成物は無菌である。例えば、細胞は、無菌条件下で増殖させて、無菌の溶液またはゲル中で懸濁できる。
組成物は、それを必要とする対象への投与を目的にし得る。
別の態様は、ゲル、および本明細書で記載の１種または複数の種類の単離細胞を、任意選択で、心筋細胞または幹細胞と組み合わせて含む、細胞移植組成物である。
さらなる態様は、下記を含む中胚葉特異化培養添加物である：
ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、
ＦＧＦ受容体アゴニスト、および
アクチビン受容体アゴニスト。
一実施形態では、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニストは、ＢＭＰ４である。
一実施形態では、ＦＧＦ受容体アゴニストは、ＦＧＦ２である。
一実施形態では、アクチビン受容体アゴニストは、アクチビンＡ、任意選択で、ヒトアクチビンＡである。
別の実施形態では、アクチビン受容体アゴニストは、結節、好ましくはヒト結節である。
別の実施形態では、約５００ｍＬの溶液中で、ＢＭＰ４は０．５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍＬを与えるのに十分な量であり、ＦＧＦ２は０．５ｎｇ／ｍｌ～約１００ｎｇ／ｍＬを与えるのに十分な量であり、およびアクチビンＡは０．５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌを与えるのに十分な量であり、好ましくは、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２およびアクチビンＡの比率は約１０：５：６または約１０：５：２または約１０：５：６～約１０：５：２である。
中胚葉特異化培養組成物は、下記を含む：
造血前駆細胞に好適な基本培地、
ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、
ＦＧＦ受容体アゴニスト、および
アクチビン受容体アゴニスト。
本明細書で記載の中胚葉特異化培養添加物または組成物は、本明細書で記載の方法またはキットでの使用が目的の場合もある。
また、本明細書で記載の細胞、細胞集団、添加物または組成物を含むキット、または前記細胞または細胞集団、本明細書で記載の細胞を産生するための１種または複数の誘導成分または特異化成分および／または本明細書で記載の１種または複数の細胞を産生するための説明書を含むバイアルも提供される。
キットは、例えば、本明細書で産生される１種または複数の細胞（任意選択で、凍結培地に入れて、ドライアイスまたは液体窒素などの冷却剤中で梱包して）、マトリゲルまたは等価なＥＣＭ被覆プレート、基本増殖培地、本明細書で記載の１つまたは複数の成分（例えば、ＦＧＦ２、アクチビンＡおよびＢＭＰ４）、単離抗体および／または、例えば、ＦＡＣＳで使用するための定量化抗体、を含み得る。
本明細書で記載の方法、組成物用添加物およびキットは、別の方法では達成できないはずの前記前駆細胞集団を産生し、組織常在性免疫細胞の機能を調べるために使用できる。
ＩＩＩ．用途および使用
インビトロおよびインビボ使用も他の態様で提供される。
本明細書で記載のインビトロ産生細胞は、候補薬物を予備選抜するスクリーニングアッセイで使用できる。
従って、一態様は、下記を含むスクリーニングアッセイである：
本明細書で記載の方法により産生された細胞集団を試験薬剤と接触させること；
ビークル対照で処理した細胞集団と比較して、試験薬剤の毒性などの目的の読み出した情報を測定すること。
インビトロ細胞は、例えば、民族性特異的薬理学試験および薬物有害反応の予防を可能にする、純粋なまたはプールされたヒトＰＳＣ由来背景に対するヒト薬物毒性のための薬物候補を試験するために；および／または結合および排出特性および改善された体内分布および循環半減期のための生物学的薬物候補（例えば、モノクローナル抗体、サイトカイン、小分子、など）の試験および最適化のために使用できる。
いくつかの実施形態では、インビトロ産生細胞は、動物モデルでヒトインビトロ産生細胞を追跡するための蛍光マーカー、発光マーカーなどのマーカーを含むヒト出発細胞から産生される。動物は、例えば、マウスまたはラットなどのげっ歯類である。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または類似の蛍光強化型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、ＲＦＰ、ＣＦＰ、などのタンパク質の動物中での追跡のためにヒト細胞に導入できる。
前駆細胞は、組織常在性マクロファージを得るために使用できる。
マクロファージ前駆細胞の、星状膠細胞などの神経系細胞との培養（Ｈａｅｎｓｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｐａｎｄｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）により、または脳で発現されることが既知であるＩＬ３４およびＴＧＦβなどのサイトカインおよび成長因子の存在下での培養（Ａｂｕｄ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｄｏｕｖａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｍｕｆｆａｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６）により、ｈＰＳＣからミクログリアを生成するプロトコルが存在する。従って、本明細書で記載のマクロファージ前駆細胞を用いて、ミクログリアを生成できる。ある実施形態では、方法は、マクロファージ前駆細胞を神経系細胞、任意選択で、神経成長因子および／またはＩＬ３４および／またはＴＧＦβなどのサイトカインを含む神経培地中の星状膠細胞と接触させることをさらに含む。別の態様は、本明細書で記載のように調製され、単離された、例えば、本明細書で記載の細胞集団から、例えば、ＣＤ４３および／またはＣＤ４５、例えば、ＣＤ３１および／またはＣＤ３４を用いてミクログリア細胞を生成するために、単離されたマクロファージ前駆細胞の使用である。
類似の手法は、組織常在性マクロファージの他の集団を生成するために実施でき、例えば、マクロファージ前駆細胞を心筋細胞、心臓線維芽細胞／心外膜、および／または心内膜と培養することは、分化心臓マクロファージを誘導するためにおよびそれらの特異化を誘導する調節機序を特定するために使用し得る。
本明細書で記載の方法はまた、卵黄嚢様Ｔ細胞を作製するためにも使用できる。多能性前駆細胞プログラムは、Ｔ細胞を発生させる。マウスでの研究は、卵黄嚢由来Ｔ細胞が、皮膚中で生涯にわたり存在する特異化されたＴ細胞集団をユニークに発生させることを示した。同様に、Ｔ細胞（Ｖδ２）集団は、ヒト胎児発生において豊富である。本明細書で記載の分化プロトコルは、これらの細胞の発生源を提供する。Ｖδ２集団は、ＭＰＰプログラムの前駆細胞により開始された、例えば、ノッチリガンド、例えば、ＯＰ９－ＤＬ４、培養物から単離され、将来の移植または、例えば、ＣＡＲによる修飾のために使用前に凍結保存され得る。形質転換Ｖδ２は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫を発生させ、これは、極めて高悪性度であり、根治療法は存在しない。ｈＰＳＣ由来Ｖδ２の移植は、悪性細胞の置換（同種ＨＳＣ移植の有無、化学療法またはキメラ抗原受容体修飾）による根治療法を提供し得る。これらの細胞はまた、抗菌活性を有し、抗生物質耐性感染症を治療するために使用できる。加えて、Ｔ調節細胞は、胎生期に豊富である。ｈＰＳＣ由来Ｔ細胞は、移植後の免疫寛容の誘導に使用し得る、これらの細胞の濃縮源であり得る。
従って、本明細書で記載の方法を用いて調製された細胞（例えば、集団、成熟またはＶδ２＋Ｔリンパ球などのサブセット）、ならびに添加物および移植のため、癌を治療するため、免疫不全（例えば、Ｔ細胞免疫不全）を治療するため、または抗生物質耐性感染症を治療するため、などの薬物を調製するための添加物および／または細胞を含む組成物の使用も提供される。
マウスでの研究は、Ｖγ３＋Ｔリンパ球は、発生の早期に出現し、成体皮膚における樹枝状表皮Ｔ細胞（ＤＥＴＣ）集団の一因となることを示した。この細胞集団は、生涯にわたり存続し、ＨＳＣ由来子孫からの寄与は、最小限である（Ｇｅｎｔｅｋ ｅｔ ａｌ．，２０１８ｂ；Ｈａｖｒａｎ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，１９８８，１９９０）。マウス卵黄嚢が、ＯＰ９－ＤＬ１細胞との培養後に、Ｖγ３＋Ｔリンパ球を発生させるという実例（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）は、この系統がＬＭＰプログラムの一部として生成されることを示唆する。ヒト発生では、Ｖγ９＋Ｖδ２＋Ｔリンパ球が、発生の初期段階のＴ細胞レパートリーで優位になり（Ｄｉｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｈａｙｎｅｓ ａｎｄ Ｈｅｉｎｌｙ，１９９５；Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８；ＭｃＶａｙ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｎｇ，１９９６）、それらがマウスＶγ３＋細胞に相当することを示す。発明者らは本明細書で、ＭＰＰ集団がγδおよびαβＴリンパ球の両方を発生させ、これは、Ｅ９．５マウス卵黄嚢の分化能（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，２０１２）と一致することを示すことができた。前述のように、発明者らは、Ｖδ２＋Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋Ｖδ２）を単離することができた。
従って、方法は、成熟Ｔ細胞またはその特異的サブセットを産生および使用するために使用できる。
ある実施形態では、成熟Ｔ細胞または特異的サブセットは、γδ Ｔ細胞である。別の実施形態では、成熟Ｔ細胞または特異的サブセットは、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋細胞である。本明細書で考察したように、他の成熟Ｔ細胞およびサブセットも意図されている。
また、別の態様では、細胞療法が提供される。インビトロ産生細胞は、医薬組成物として産生および調製できる。
いくつかの実施形態では、ｈＰＳＣ由来Ｔ系統細胞を使って、特定の種類のリンパ腫である免疫不全症を治療するために使用できる（例えば、Ｖδ２原発性皮膚性γδ Ｔ細胞リンパ腫は、特に高悪性度であり、これらの細胞は、移植後に、ＨＳＣにより置換され得ない）。Ｖδ２細胞またはＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＴＣＲαβ＋細胞などのＴ細胞系統細胞も、ＣＡＲ－Ｔ細胞の調製に有用であり得る。例えば、γδ Ｔ細胞は、αβＴ細胞より早く機能し、これは通常、白血病／固形腫瘍のためのＣＡＲ－Ｔ細胞療法で使用される。
本明細書では、同様に、ＭＰＰ由来ＣＤ７＋ＣＤ３４＋リンパ球前駆細胞が、それらのＣＤ５発現において臍帯血由来細胞とは異なり、卵黄嚢およびＨＳＣ由来Ｔリンパ系統が分化する最初期段階を特定できる可能性があることも示される。
一実施形態では、方法は、本明細書で記載の方法によりインビトロで産生された細胞集団、または前記細胞を含む組成物を、それを必要としている対象に導入することを含む。一実施形態では、細胞集団または組成物は、注射により対象に導入される。別の実施形態では、細胞集団または組成物は、心筋細胞および／または肝細胞などの肝臓細胞と共に免疫隔離装置、血管移植装置、またはＶｉａＣｙｔｅのＥｎｃａｐｔｒａ（登録商標）細胞送達システムなどの多細胞移植装置などの細胞移植装置中に含まれる。
従って、対象に前駆細胞を投与する方法も含まれ、該方法は、本明細書で記載の細胞集団、前記細胞を含む組成物または前記細胞を含む細胞移植片を、それを必要としている対象に投与することを含む。
種々の疾患および状態が治療できる。
胚齢Ｅ８．５のＣｓｆ１ｒ発現細胞にＢＲＡＦ変異を特異的に誘導する画期的な研究は、これらのマウスが神経変性疾患を発症したので、機能障害性卵黄嚢前駆細胞がミクログリアで疾患を起こし得ることを示した（Ｍａｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。卵黄嚢造血前駆細胞は、組織常在性免疫細胞を発生させるので、他の疾患も同様に、これらの胚性前駆細胞の変異により引き起こされる可能性がある。トリソミー２１の個体から生成したｉＰＳＣの造血分化の分析は、巨核球性および骨髄細胞系統を犠牲にして高められた原始赤血球生成を示した（Ｃｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。同様に、巨核球コロニー形成前駆細胞の発生頻度は、トリソミー２１のｉＰＳＣから生成したＥＭＰ様集団中で増大した（Ｍａｃｌｅａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。これらの研究は、卵黄嚢プログラム由来の調節不全造血細胞は、ダウン症候群の個体における小児科の白血病症例に関与する可能性があることを示す。さらに、小児科のＢ細胞白血病に共通するＥＴＶ６－ＲＵＮＸ１融合を有するｈＰＳＣ（Ｓｈｕｒｔｌｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，１９９５）が、Ｂ細胞発生を完了できない実例（Ｂｏｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８）は、これらの白血病のサブセットが同様に卵黄嚢前駆細胞起源を有し得ることを示唆する。卵黄嚢プログラムの子孫から発生する血液悪性腫瘍の開始は、小児科の設定に限定されない可能性がある。原発性皮膚性γδ Ｔ細胞リンパ腫（ＰＣＧＤＴＬ）は、γδ Ｔリンパ系統由来の高悪性度クラスの成体リンパ腫である（Ｔｒｉｐｏｄｏｅｔ ａｌ．，２００９で概説されている）。ＰＣＧＤＴＬの別個の亜型の内で、脂肪織炎亜型は、悪性のＶδ２＋細胞から生成され、Ｖδ１＋細胞中で開始されるものなどの他のＰＣＧＤＴＬより悪い予後を有する（Ｄａｎｉｅｌｓ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。Ｖδ２＋Ｔリンパ球は、ヒト発生の初期段階で特異化される（Ｈａｙｎｅｓ ａｎｄ Ｈｅｉｎｌｙ，１９９５；Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８；ＭｃＶａｙ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｎｇ，１９９６）ので、卵黄嚢由来前駆細胞中の変異は、ヒトの生涯にわたり蓄積し、最終的にこの癌を引き起こす可能性がある。ＭＰＰプログラムから生成されるＴリンパ系統の分析は、悪性細胞を、療法に対して高感受性にすると思われる調節機序の特定を促進し得る。
従って、別の態様では、本明細書で記載の細胞は、疾患を評価するためのモデルを提供する。例えば、ゲノミクス研究で特定された推定リンパ腫反応開始変異は、野生型ｈＰＳＣにおいて改変されることにより、追加の変異がこれらのリンパ腫が発生するにつれてどのように蓄積されるかをより良く説明し得る。あるいは、これらの細胞は既に患者のリンパ腫の全ての遺伝子変異を含むはずなので、ＰＣＧＤＴＬ患者由来ｉＰＳＣは分化され得る。成体の末梢血から単離されたＶδ２＋Ｔリンパ球は、異なる種類の癌細胞をインビトロおよびインビボで効率的に死滅させることができるので、ＭＰＰ由来リンパ系細胞は、治療潜在力も有し得る（Ｈｏｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１８で概説されている）。
本明細書で記載の方法は、卵黄嚢様赤血球細胞を作製して、それを必要としている対象に移植するために使用できる。第２の卵黄嚢造血プログラム（マウスにおけるＥＭＰプログラムと呼ばれ、いまでは、ヒトにおける卵黄嚢多能性前駆細胞プログラムとして定義される）は、胚性および胎生のβグロビンを発現するが、成体のβグロビンは発現しない、赤血球の系統を発生させる。
本明細書で記載の方法はまた、卵黄嚢様マクロファージを作製するためにも使用できる。２つの卵黄嚢造血プログラム（原始および卵黄嚢多能性前駆細胞プログラム）は、組織に種をまき、生涯を通して存続するマクロファージを発生させる。マウスでは、これらのマクロファージは、心筋梗塞（ＭＩ）に対する修復応答のために不可欠である。ｈＰＳＣ由来マクロファージの心臓への移植（心筋細胞の有無の場合について）は、ＭＩまたは心不全を経験した患者の利益になり得る。マクロファージは、それらの環境を再構築することが知られ、マクロファージと他の細胞（ｈＰＳＣ由来または由来でない細胞）との同時移植が生着を促進し得ることを示す。マクロファージはまた、それらの線維性組織の再構築能力により、肝線維症の患者のために有益であることが明らかになり得る。
身体における卵黄嚢由来マクロファージの広範な分布は、改変された移植ｈＰＳＣ由来マクロファージがカーゴ（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、サイトカイン、など）を別の組織に送達するために使用し得ることも示す。これらのマクロファージはまた、悪性細胞を認識し、破壊する（例えば、キメラ抗原受容体と一緒に）ように改変し得る。この能力は、末梢血から単離された単球から分化したマクロファージを用いて、２つのモデル実質臓器癌モデルで実証された（Ｋｌｉｃｈｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。卵黄嚢（原始およびＭＰＰプログラム）の子孫が主要な組織常在性マクロファージの起源であることを考慮すると、ｈＰＳＣ由来マクロファージはまた、その組織が本拠地であり、悪性細胞を破壊するはずである。卵黄嚢は強力なクッパー細胞源であるので、ｈＰＳＣ由来マクロファージはまた、肝線維症を修正するために使用し得る。これは、末梢血から単離された単球から分化したマクロファージを使用する前臨床試験および進行中の臨床試験から予測される（Ｈａｉｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７；Ｍｏｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
従って、一実施形態では、本明細書で記載の方法を用いて生成されたマクロファージ細胞および／またはそれらの前駆細胞は、心筋梗塞を罹患しているまたは罹患したことがある対象、または肝線維症の対象に投与される。細胞治療の実施形態の場合、本明細書で記載の細胞集団、組成物または移植片が投与され得る。
本明細書で記載の方法はまた、卵黄嚢様ＮＫ細胞を作製するためにも使用できる。多能性前駆細胞集団は、ＮＫ細胞を発生させる。マウスにおける系統追跡は、マウス卵黄嚢内に含まれる細胞は、発生の後期に肝臓ＮＫ細胞を発生させ、これは、肝臓の全生涯を通して存続する組織常在性ＮＫ細胞であり得ることを示した。卵黄嚢由来ＮＫ細胞の移植は、固体臓器移植後の免疫寛容を誘導するのを助ける、または異なる種類の悪性腫瘍を治療する療法として機能する。予備試験であるが、末梢血から単離されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾ＮＫ細胞は、ＣＤ１９＋白血病を治療するための試験中である（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。ｈＰＳＣ由来ＮＫ細胞もまた、固形腫瘍を治療するために活発に試験中である（ＮＣＴ０３８４１１０）。
従って、一態様は、ＣＡＲ修飾ＮＫ細胞を調製するために、本明細書で記載の方法を用いて生成されたＮＫ細胞またはＮＫ前駆細胞を使用することを含む。
従って、一態様は、例えば、前記細胞を含む細胞または組成物または細胞移植片を、それを必要としている対象に投与することにより、固形腫瘍を治療するために、本明細書で記載の方法を用いて生成されたＮＫ細胞またはＮＫ前駆細胞を使用することを含む。
卵黄嚢造血プログラムの誘導物は、いくつかの疾患に繋がるが、これらの集団の喪失はまた、悪い結果になる場合がある。未確定の潜在能を持つクローン造血（ＣＨＩＰ）は、他の血液学的異常を欠く個体における造血クローンの漸進的支配の結果である（Ｊａｉｓｗａｌ ａｎｄ Ｅｂｅｒｔ，２０１９で概説されている）。ＣＨＩＰは、将来の血液悪性腫瘍のリスクに関連するが、ＣＨＩＰの個体はまた、心臓血管疾患を発症する素因を有する。ＣＨＩＰの個体の支配的な造血クローンは一般に、ＴＥＴ２に変異を有する（Ｇｅｎｏｖｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４；Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。興味深いことに、マウスＴｅｔ２欠損ドナー細胞の骨髄移植は、レシピエントの大動脈の動脈硬化病変を増大させ（Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、ＨＳＣ誘導物が疾患を促進することを示す。レシピエントマウスの心臓のマクロファージの分析は、Ｔｅｔ欠損マクロファージが、炎症に関連する、Ｉｌ１ＢおよびＩｌ６を含むサイトカインを発現することを示した（Ｊａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。変異体ＨＳＣ由来マクロファージの蓄積は、通常、組織恒常性を維持する卵黄嚢由来組織常在性心臓マクロファージ集団を犠牲にする可能性がある。これは、ヒト原始およびＭＰＰプログラムから生成したマクロファージの心臓への全身的または直接的な移植が、変異体マクロファージの炎症促進反応を抑制することにより、ＣＨＩＰの個体の心臓血管疾患のリスクを最小化するのを助ける可能性を高める。
細胞治療はまた、患者の体力・状態を保つのに有効な支持的細胞治療でもあり得る。例えば、本明細書で記載の細胞は、心筋細胞と共に投与できる。
卵黄嚢由来マクロファージの移植はまた、他の心臓の病状の患者にも有益であり得る。これらの細胞は、卵黄嚢由来心臓マクロファージが、傷害後の新生児マウスの心臓の心筋再生のために必要であるという実例により示されるように、治療可能性を有する（Ａｕｒｏｒａ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。この系統はまた、心筋梗塞（ＭＩ）に続く線維症を抑制する（Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｌａｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，２０１４）ので、成体にも有益であることも示された。これは、ｈＰＳＣ由来マクロファージ単独または心筋細胞と一緒の移植がＭＩ後の患者の結果を改善し得ることを示唆する。原始およびＭＰＰ由来マクロファージの前臨床試験は、心筋梗塞のげっ歯類モデル、例えば、ＬＡＤ結紮、クライオインジャリー、など、またはげっ歯類の心筋梗塞の確立されたモデルで実施できる。
卵黄嚢由来マクロファージの適用は、心臓に限定されない。肝疾患のマウスモデルを用いた試験は、ｈＥＳＣ由来マクロファージの移植が、線維症を顕著に低減させ、肝臓再生応答を活性化することを示した（Ｈａｉｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。これらの知見は、末梢血単球から分化したマクロファージを用いた肝硬変の患者の臨床試験に繋がった（Ｍｏｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。
前述のように、卵黄嚢由来マクロファージの利用はまた、新規動物モデルを含む新規疾患モデルの確立に対する機会を提供する。これは、脳での、ｈＰＳＣ由来ミクログリアが、アルツハイマー病をモデル化するためのヒトＭＣＳＦタンパク質を発現する免疫不全のマウスの脳へ移植される試験で開拓された（Ｈａｓｓｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９；Ｍａｎｃｕｓｏ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。これらの動物での前臨床試験、または類似の試験は、マクロファージの治療潜在能力を試験するために不可欠である。マウスＭＣＳＦリガンドのヒトＭＣＳＦ受容体に対する低い親和性は、標準ＮＳＧマウス中で、マクロファージの不十分な生着を生じる。従って、ヒトＭＣＳＦを発現する特異化動物または細胞がこれらの問題を試験するために必要である。
ＩＶ．実施例
実施例１
方法
ｈＰＳＣ培養
Ｈ１ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）株（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）およびＣＨＯＰＷＴ１０ヒトｉＰＳＣ株（Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）をこの試験で使用した。０．１％のゼラチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）コート組織培養プレートを用いて、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、非必須アミノ酸（１ｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、β－メルカプトエタノール（５５μＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびノックアウト血清リプレースメント（２０％、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を含むｈＥＳＣ培地中の照射したマウス胚性線維芽細胞（ｉＭＥＦ）上でｈＰＳＣを維持した。ＦＧＦ２（Ｈ１：１５ｎｇ／ｍＬおよびＣＨＯＰＷＴ１０：１０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した培地を、分化の前に、７日間にわたり毎日交換した。ｈＰＳＣのマイコプラズマを通常の方法で試験した。ｈＰＳＣを正常酸素圧条件（３７℃、５％ＣＯ２）で維持した。
ｈＰＳＣからの造血分化
造血系統へのｈＰＳＣの分化は、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、トランスフェリン（１５０μ／ｍＬ、ＲＯＣＨＥ）、モノチオグリセロール（５０μｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）および、例えば、下記に記載の他の段階特異的因子を補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で実施された。分化培養物は、別段の指示がない限り、低酸素条件（３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）で維持した。０日目に、集密度８０～９０％のｈＰＳＣ培養物をＴｒｙｐＬＥを用いて、３７℃で３分間処理した。その後８０～９０％のＴｒｙｐＬＥを吸引し、培養物を３７℃でさらに２分間インキュベートした。ｈＰＳＣの小さいクラスター（５個の細胞／クラスター）を緩やかなピペット操作により生成し、ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（１０μＭ）およびＢＭＰ４（１ｎｇ／ｍＬ）を含む４ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地（Ｇｉｂｃｏ）に、５００，０００個の細胞／ｍＬの濃度で移した。胚様体（ＥＢ）を、軌道振盪装置（Ｈ１：７０ＲＰＭ；ＣＨＯＰＷＴ１０：６０ＲＰＭ）上の６０ｍｍのペトリ皿中に、１８時間にわたり生成した。分化の１日目に、ＥＢを４０ＲＣＦで５分間の遠心分離により収集し、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）およびアクチビンＡ（Ｈ１：６ｎｇ／ｍＬ；ＣＨＯＰＷＴ１０：２ｎｇ／ｍＬ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で培養した。分化の期間中、培養物を５％ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）処理組織培養プレート中、静的条件下で維持した。分化の４日目（例えば、中胚葉特異化培養組成物と共に培養の３日後に）に、ＥＢを１５０ＲＣＦで５分間の遠心分離により収集し、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ１１（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で培養した。分化の６日目以降から、培養物をＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ１１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ１（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＥＰＯ（４Ｕ／ｍＬ）を含むＳｔｅｍＰｒｏ－３４中で維持した。その後、培地を、分化期間中、２日毎に補充した。成体型プログラムを誘導するために、１日目のＥＢを４０ＲＣＦで５分間の遠心分離により収集し、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で培養した。分化の２日目に、ＥＢを１５０ＲＣＦで５分間の遠心分離により収集し、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）およびＳＢ４３１５４２（６μＭ、ＴＯＣＲＩＳ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で培養した。分化の３日目に、ＥＢを１５０ＲＣＦで５分間の遠心分離により収集し、ＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ１１（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で培養した。分化の６日目以降から、培養物を上述のように維持した。組換え因子はヒトであり、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
マクロファージ分化
マクロファージ運命へのＣＤ４３＋造血前駆細胞分化は、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）、トランスフェリン（１５０μｇ／ｍＬ、ＲＯＣＨＥ）、モノチオグリセロール（５０μｇ／ｍＬ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）および他の段階特異的因子を補充した２５％のＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で実施された。サプリメントの添加の前に、ＳｔｅｍＰｒｏ－３４基本培地をＩＭＤＭ中で希釈した。マクロファージ分化培養物は、別段の指示がない限り、正常酸素圧条件（３７℃、５％ＣＯ２）で維持した。分化の期間中、培養物を５％ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）処理組織培養プレート中、静的条件下で維持した。分化の９日目に単離した２，０００，０００個のＣＤ４３＋細胞を、ＭＣＳＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ３（５０ｎｇ／ｍＬ）およびＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を補充した２５％のＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で培養した。培養の３日後、２００ＲＣＦで５分間の遠心分離により細胞を収集し、ＭＣＳＦを補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中で培養した。培地は、分化の残部のために、３日毎に交換し、下流アッセイでそれらの使用の前に、４０日まで培養した。培養は通常、培養の１３日後、ＣＤ４５＋ＣＤ６８＋ＣＤ１４＋マクロファージを高度に富化した。
フローサイトメトリーおよび細胞選別
分化の９日目の前のＥＢ、単層培養物および細胞選別後凝集した培養物をトリプシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で５分間、３７℃で剥がした。分化の９日目以降から、ＥＢ培養物をトリプシンで５分間、３７℃で剥がした後、コラゲナーゼＩＩ型（０．２％、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）中、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、５，０００，０００個の細胞／ｍＬ以下の濃度で、暗所中、３０分間、４℃で染色した。フローサイトメトリーのために、細胞を、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、ＦＣＳ（２％、Ｗｉｓｅｎｔ）およびＤＮアーゼＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を補充したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で染色した。蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）のために、細胞を染色、選別し、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）およびＤＮアーゼＩを補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中に収集した。ＳｉｃｋＫｉｄｓ／ＵＨＮ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙで、Ｉｎｆｌｕｘ（ＢＤ）、ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ）、ＡｒｉａＩＩＩ（ＢＤ）およびＭｏＦｌｏ（Ｂｅｃｋｍａｎ－Ｃｏｕｌｔｅｒ）セルソーターを用いて細胞を１００μｍノズルを通して細胞を選別した。その後、選別細胞をカウントし、２５０，０００個の細胞／ｍＬで、分化の日に適切な組換え因子を補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中に再懸濁させた。選別細胞を凝集させるために、２５０μＬの単細胞懸濁液を５％ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）処理２４ウェル組織培養プレートの個別のウェルに移した。７５０μＬの補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地を、選別の１日後に加えた。単層培養物を生成するために、８０μＬの単細胞懸濁液を、２５％マトリゲル被覆１２ウェル組織培養プレートの個別のウェル中の補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地中にスポットした。１日後、１ｍＬの補充したＳｔｅｍＰｒｏ－３４培地を加えた。
ＯＰ９－ＤＬ４共培養物から造血細胞を単離するために、ヒト細胞を磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）により単離した。培養物をトリプシンで５分間、３７℃で剥がし、Ｍｏｕｓｅ Ｃｅｌｌ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｃｏｃｋｔａｉｌ（１：５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて、１００，０００，０００個の細胞／ｍＬで１５分間、暗所中、４℃で染色した。ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上でＭＡＣＳ後に、通過画分を、２％ＦＣＳおよびＤＮアーゼＩを補充したカルシウムおよびマグネシウム不含ＰＢＳ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中の蛍光標識抗体で３０分間、４℃下、暗所で染色した。細胞を選別し、２％ＦＣＳおよびＤＮアーゼＩを補充したカルシウムおよびマグネシウム不含ＰＢＳ中に収集した、または１５０μＬの補充した培地および間質細胞（該当する場合）を含む９６ウェル組織培養プレートのウェル中に堆積させた。
マクロファージを生成する細胞を単離するために、分化の９日目の培養物由来のＣＤ４３＋細胞を通常、使用した。９日目の培養物中の多数のコロニー形成前駆細胞は、それらを、マクロファージを分化させるために有用な出発集団にした。ＣＤ４３＋細胞をＭＡＣＳにより単離した。９日目の培養物からの単細胞懸濁液を１００，０００，０００個の細胞／ｍＬで、ＣＤ４３マイクロビーズ（１：５、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を用いて１５分間、暗所中、４℃で染色した。ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）上のＭＡＣＳ後、結合画分を将来のマクロファージ運命への分化のために、０．５ｍＬのバイアル当り２，０００，０００個の細胞で、ＣｒｙｏＳｔｏｒ－１０（ＢｉｏＬｉｆｅ）凍結培地中で凍結保存した。
以下の抗体を使用した：ＫＤＲ－ＰＥ（３：２０、クローン８９１０６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＫＤＲ－Ｂｉｏｔｉｎ（１：１０、クローン８９１０６、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）ＣＤ２３５ａ／ｂ－ＡＰＣ（１：１００、クローンＨＩＲ２／ＧＡ－Ｒ２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ３４－ＰＥ－Ｃｙ７（１：１００、クローン４Ｈ１１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ３４－ＡＰＣ（１：１００、クローン８Ｇ１２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ３４－ＦＩＴＣ（１：１００、クローン８Ｇ１２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４３－ＰＥ（３：１００、クローン１Ｇ１０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４３－ＦＩＴＣ（１：１０、クローン１Ｇ１０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４３－ＡＰＣ－Ｈ７（１：１００、クローン１Ｇ１０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４５－ｅＦｌｕｏｒ４５０（１：５０、クローンＨＩ３０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ４５－ＡＰＣ－Ｃｙ７（３：１００、クローン２Ｄ１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４５－ＢＶ６０５（１：５０、クローンＨＩ３０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１１７－ＡＰＣ（１：５０、クローン１０４Ｄ２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１１７－ＰＥ（１：５０、クローン１０４Ｄ２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１４４－ＡＰＣ（３：１００、クローンＢＶ９、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ３１－ＦＩＴＣ（３：２０、クローンＷＭ５９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ３１－ＰＥ（３：１００、クローンＷＭ５９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ９０－ＡＰＣ（１：１０００、クローン５Ｅ１０、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ７－ＰＥ（７：１００、クローンＭ－Ｔ７０１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ７－ＡＰＣ（３：１００、クローン１２４－１Ｄ１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ５６－ｅＦｌｕｏｒ４５０（１：５０、クローンＴＵＬＹ５６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ５６－ＡＰＣ（３：１００、クローンＢ１５９、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ５－ＦＩＴＣ（１：１０、クローンＵＣＨＴ２、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ７（１：５０、クローンＳＫ３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ８－ＰＥ（１：２０、クローンＨＩＴ８ａ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ３－ＦＩＴＣ（１：５０、クローンＵＣＨＴ１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＴＣＲαβ－ＡＰＣ（３：１００、クローンＩＰ２６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＴＣＲγδ－ＰＥ（５：１００、クローンＩＭＭＵ５１０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＴＣＲγδ－ＢＶ４２１（２：１００、クローンＢ１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９－ＰＥ－Ｃｙ７（１：５０、ＳＪ２５Ｃ１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ１１ｂ－ＡＰＣ（１：５０、クローンＶＩＭ１２、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＴＣＲ Ｖγ９－ＡＰＣ（１：５０、Ｂ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＴＣＲ Ｖδ２－ＢＶ４２１（１：５０、Ｂ６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＴＣＲ Ｖδ１－ＡＰＣ（２：１００、ＲＥＡ１７３、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、ＣＤ６８－ＰＥ－Ｃｙ７（２：１００、Ｙ１／８２Ａ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１４－ＰＥ（２：１００、Ｍ５Ｅ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１６３－ＢＶ４２１（２：１００、ＧＨＩ／６１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＤ６４－ＡＰＣ－Ｃｙ７（５：１００、１０．１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。ビオチン標識抗体による染色は、ストレプトアビジン－ＢＶ４２１（１：１００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）またはストレプトアビジン－ＰＥ－Ｃｙ７（１：２００、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で検出された。
アルデヒド脱水素酵素活性を試験した実験では、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ ａｓｓａｙを使用した（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）。細胞を、ＢＳＡ（０．１％）およびＢＡＡＡ基質（０．１２μｇ／ｍＬ）を含むＡｌｄｅｆｌｕｏｒ ａｓｓａｙ緩衝液中で、３７℃で６０分間インキュベートした。その後細胞を、ＦＣＳ（２％）、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ ａｓｓａｙ緩衝液（１０％）を補充した氷冷ＩＭＤＭ中で洗浄し、上述の種々の細胞表面マーカーに対する抗体で染色した。アルデヒド脱水素酵素阻害剤、ＤＥＡＢ（０．７５ｎＭ）処理試料を陰性対照として使用した。
フローサイトメトリーおよび細胞選別データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を用いて解析した。
定量的リアルタイムＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＲＮアーゼ不含ＤＮアーゼによる処理を含んだＲＮＡｑｕｅｏｕｓ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて調製した。ｃＤＮＡへの逆転写をｉＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて実施した。ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＣＦＸ３８４ Ｔｏｕｃｈ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）でＲＴ－ｑＰＣＲを実施した。ＴＢＰに対するΔＣｔとして遺伝子発現を評価した。グロビン分析の場合には、ＡＴＣＢに対するΔＣｔとして遺伝子発現を評価した。ＧＡＧＥＢ１プロモーターに対するプライマーを用いてゲノムＤＮＡ量を評価した。プライマー配列を表１．１に記載している。
Figure 2023540212000002
血管芽細胞コロニー形成アッセイ
１０，０００～２０，０００個の細胞を、ＦＣＳ（１０％）、Ｄ４Ｔ内皮細胞調整培地（２０％）（ＳｔｅｍＰｒｏまたは類似の培地で置換できる）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、アスコルビン酸（２５μｇ／ｍＬ、トランスフェリン（１５０μｇ／ｍＬ）、モノチオグリセロール（３３μｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ１１（５ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＳＢ４３１５４２（６μＭ）を補充した１％のメチルセルロース（１％、Ｓｈｉｎ－Ｅｔｓｕ）中に播種することにより、血管芽細胞コロニー形成潜在能力を評価した。定量化の前に、培養物を低酸素条件（３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２）で６日間維持した。
造血コロニー形成アッセイ
１００～８０，０００個の細胞（例えば、追加の５日間で分化した６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞由来の選別集団からの１００個の細胞および無選別培養物の分化の１５日目からの最大８０，０００個の細胞）を、血漿由来血清（１５％、Ａｎｉｍａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、タンパク質不含ハイブリドーマ培地ＩＩ（５％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、アスコルビン酸（２５μｇ／ｍＬ）トランスフェリン（１５０μｇ／ｍＬ）、モノチオグリセロール（３３μｇ／ｍＬ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ３（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ１１（５ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＥＰＯ（４ユニット／ｍＬ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１ｎｇ／ｍＬ）、Ｍ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ１（２５ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）を含むメチルセルロース（１％）中に播種することにより、コロニー形成前駆細胞数を定量化した。定量化の前に、培養物を正常酸素圧条件（３７℃、５％ＣＯ２）で９～１４日間維持した。
Ｔリンパ球分化のためのＯＰ９－ＤＬ４共培養
Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ４（ＯＰ９－ＤＬ４）（Ｓｃｈｍｉｔｔ ａｎｄ Ｚｕｎｉｇａ－Ｐｆｌｕｃｋｅｒ，２００２，２００６）を恒常的に発現するＯＰ９間質細胞をＴリンパ球分化能のアッセイに使用した。共培養物を正常酸素圧条件（３７℃、５％ＣＯ２）で維持した。０．１％ゼラチン処理組織培養プレートを用いて、１～２５０，０００個の細胞をＯＰ９－ＤＬ４細胞と共に、ペニシリン／ストレプトマイシン（１％）、ＦＣＳ（２０％、ＨｙＣｌｏｎｅ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、ＩＬ７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＦＬＴ３Ｌ（５ｎｇ／ｍＬ）を補充したαＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。共培養の開始時に、ＳＣＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）を含め、４～６日後に除去した。激しいピペット操作および４０μｍストレーナーの通過により、４～６日毎に培養物を新しいＯＰ９－ＤＬ４細胞に移した。示した段階で培養物をフローサイトメトリーにより分析し、１０個を越えるＣＤ４５＋ＣＤ５６－ＣＤ４＋ＣＤ８＋イベントが観察される場合、陽性の採点をした。
造血細胞増殖のためのＨＵＶＥＣ－Ｅ４ＯＲＦ１共培養
Ｅ４ＯＲＦ１を発現するように改変されたヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（ＨＵＶＥＣ－Ｅ４ＯＲＦ１）を使用して、造血細胞増殖アッセイを行った。共培養物を正常酸素圧条件（３７℃、５％ＣＯ２）で維持した。コラーゲン１型（０．３ｍｇ／ｍＬ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）処理組織培養プレートを用いて、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、ＴＰＯ（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＬＴ３Ｌ（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ３（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ７（２０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ６（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充したＳＴＥＭＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）中で、２５個の細胞をＨＵＶＥＣ－Ｅ４ＯＲＦ細胞と共に培養した。示した段階で培養物をフローサイトメトリーにより分析した。
造血多能性前駆細胞アッセイ
６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞と開始したＯＰ９－ＤＬ４との共培養物から５日後に造血細胞を単離した単一細胞を、ＡｒｉａＩＩ－ＲＩＴＴセルソーターのインデックスソーティング情報を保持している９６ウェルプレートのウェル中に選別した。外周部ウェルを選別から除外した。ペニシリン／ストレプトマイシン（１％、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＳＣＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＦＬＴ３Ｌ（５ｎｇ／ｍＬ）を補充したαＭＥＭ中で細胞を培養した。共培養物を正常酸素圧条件（３７℃、５％ＣＯ２）で維持した。４日後、培養物をトリプシンで剥がし、３０％の培養物をメチルセルロースに移し、上述のように、赤血球－骨髄分化能を評価した。培養物を１４日後にスコア化し、赤血球コロニーを、上述のようなＲＴ－ｑＰＣＲによるβグロビン発現分析のために採取した。ＯＰ９－ＤＬ４細胞はＧＦＰを発現するので、コロニーは蛍光下で可視化され、それらのヒト同一性が確認された。培養物の残留画分を新しいＯＰ９－ＤＬ４細胞に播種し、上述のように、ＮＫおよびＴ細胞分化能を評価した。培養物をトリプシンで剥がし、追加の１２～１４日間にわたり、２週毎に、新しいＯＰ９－ＤＬ４に移したＯＰ９－ＤＬ４共培養物をフローサイトメトリーにより分析した。１０個を超えるＣＤ４５＋ゲートイベント（Ｔ：ＣＤ７＋ＣＤ５６－ＣＤ４＋ＣＤ８＋、ＮＫ：ＣＤ５６＋ＣＤ７＋）は、陽性ウェルと呼ばなければならない。
造血細胞異種移植
大学保健ネットワーク動物福祉委員会により承認された施設ガイドラインに従って動物実験を実施した。出生後３日目のＮＯＤ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを、凍結保存ＣＤ３４臍帯血（２５，０００個の細胞、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびｈＰＳＣ由来ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－細胞（４，０００～９，０００個の細胞）を用いた肝内移植の１日前に、１００ｃＧｙで照射した。移植の４週後、マウスを安楽死させ、大腿骨をＩＭＤＭ中で４０μｍのフィルターを通してフラッシングし、骨髄を収集した。抗体染色の前に、細胞を抗マウスＣＤ１６／３２（１：２０、クローン９３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と共に４℃で１０分間インキュベートした。確実にヒト細胞を特定するために、２種のヒト特異的ＣＤ４５抗体クローンを使用した。
定量化および統計解析
全てのデータは平均±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）として示されている。統計学的分析は、図のタイトルに示されているように、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８またはＲ統計計算環境で実施した。
実施例２
以前の試験は、ＢＭＰ４およびＦＧＦ２、および低レベルのアクチビンＡまたはＷｎｔ阻害剤、ＩＷＰ２の連続添加が、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ＋（ここでは、使用した抗体クローンの特異性と一致するように、ＣＤ２３５ａ／ｂと呼ばれる）原始造血細胞およびＥＭＰ様プログラムのいくつかの系統を発生させる中胚葉の生成を促進することが示された。しかし、この中胚葉は、リンパ系細胞を生成する何らの能力も示さず（Ｓｔｕｒｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、マウス卵黄嚢で観察された全領域の造血分化能を有さないことを示唆する。これらの知見は、マウスおよびヒトの造血発生が異なるか、または以前の試験のＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉が適切に特異化されなかったことを示している可能性がある。濃度および同時処理の効果を評価した。分化の１日目（図１ａ）からのＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）の存在下でのアクチビンＡの濃度（０～１０ｎｇ／ｍＬ）を評価した。ＣＤ２３５ａ／ｂ＋の発生頻度は、アクチビンＡの用量依存的に増大し、その濃度が６ｎｇ／ｍＬを越えると、発生頻度は頭打ちになった。大部分の細胞は、分化の３日目にはＫＤＲを発現しなかった（図１ｂおよび１ｃ）が、それらは、分化の４日目までに、その発現を上方制御した（例えば、アクチビンＡ、ＦＧＦ２およびＢＭＰ４による同時処理の３日後）。これらの条件下では、細胞は、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２および６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで誘導された細胞は、一貫して、３０％を超えるＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞を含む培養物を発生させた（図１ｂおよび１ｄ）。
ＢＭＰ４、ＦＧＦ２および６ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで誘導された培養物の造血分化能を評価した。ＥＢは、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２および造血サイトカインの存在下で培養され（図２ａ）、９日間にわたり３日間隔で、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４３およびＣＤ４５の発現により標識された造血細胞の出現に関し分析された。造血細胞は、分化の６日目に存在し、培養の次の９日間から分化の１５日目までの間に数が増大し（図２ｂおよび２ｃ）、原始造血プログラムの増殖および成熟を示す。造血細胞が原始プログラムに属するかどうかを正式に判定するために、メチルセルロース培養物でコロニー形成前駆細胞分化能をアッセイした。コロニー形成前駆細胞の数は、分化の６日目～９日目で急速に増大し、その後、次の６日間にわたり減少した（図２ｄ）。赤芽球の小さいコンパクトな赤芽球コロニーを生成した赤血球の前駆細胞が、培養物の優位を占めた（図２ｄおよび２ｅ）。ＲＴ－ｑＰＣＲは、これらのコロニー内の細胞は、主に胚性βグロビン、ＨＢＥを発現する（図２ｆ）ことを明らかにし、それらがヒト原始赤血球系統であることを確証した。
さらなる実験を、原始造血細胞がＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉から発生することを確認するために行った。ＫＤＲ＋集団のＣＤ２３５ａ／ｂ＋およびＣＤ２３５ａ／ｂ－画分を、分化の４日目にＦＡＣＳにより単離し、それらをＶＥＧＦ、ＦＧＦ２および造血サイトカインの存在下で５日間培養した（図３ａ）。２つのＫＤＲ＋集団は、培養の５日間にわたり数が増大したＣＤ４３＋造血細胞を生成した（図３ｂおよび３ｃ）。集団は同等の数のコロニー形成前駆細胞を生成し、その大部分は、原始赤芽球の小さいコロニーを発生させた（図３ｄ）。血管芽細胞分化能の分析は、ＢＬ－ＣＦＣの発生頻度が、ＫＤＲ＋集団の間で同等であることを明らかにした（図３ｅ）。しかし、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ－Ｂ細胞に比べて、より高いＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞の比率を考慮すると、ＢＬ－ＣＦＣの大部分は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋集団内に含まれる。２つのＫＤＲ＋集団中の原始赤血球の前駆細胞およびＢＬ－ＣＦＣの存在は、両方が原始造血分化能を有することを示す。これは、原始造血が、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉に制限されないか、または４日目のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋集団が３日目のＣＤ２３５ａ／ｂを発現した中胚葉から発生したことを示唆する。まとめると、これらのデータは、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉が原始プログラムの前駆細胞を発生させることを示す。
原始プログラムは、造血内皮細胞中間体を介して変化する
ＣＤ４３の発現をフローサイトメトリーで監視し、原始造血細胞が出現する最初期段階を特定した。図４ａに示すように、ＣＤ４３＋細胞は、分化の６日目に最初に観察された。ＣＤ４３＋細胞の出現の前の、２４時間前の培養物の分析は、血管マーカー、ＫＤＲ、ＣＤ３４、ＫＩＴ、ＣＤ１４４およびＣＤ３１の発現を含み、造血マーカー、ＣＤ４３またはＣＤ４５を欠く、ＨＥＣの表面マーカー表現型を示す集団の存在を明らかにした（図４ｂおよび４ｃ）。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析はまた、ＨＥＣ、ＲＵＮＸ１およびＳＣＬ／ＴＡＬ１に関連する２種の転写因子がＫＤＲ＋ＣＤ３４＋集団で発現することを示し（図４ｄ）、この集団が、原始プログラムの造血細胞を発生させるＨＥＣを含むという解釈をさらに裏付ける。
ＫＤＲ＋ＣＤ３４＋集団は、分化の５日目にＦＡＣＳにより単離され、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２および造血サイトカインの存在下で、７日間、細胞が凝集体として培養された（図５ａ）。ＣＤ４３＋造血細胞の小集団は１日後、培養期間中に次第に豊富になった（図５ｂおよび５ｃ）。メチルセルロース中のコロニー形成前駆細胞分化能の分析は、原始プログラムに特徴的な、小さい赤血球コロニーを主に発生させる凝集体内で一過性の前駆細胞活性を示した（図５ｄ）。原始プログラムは、ＨＥＣ中間体を介して変化するという追加の証拠を得るために、５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋集団をマトリゲル上に播種し、内皮造血転換（ＥＨＴ）を可視化した。接着性単層は、丸い非接着性ＣＤ４３＋造血細胞を急速に発生させる１日以内の培養で形成された（図５ｅおよび５ｆ）。
原始プログラムは、ノッチシグナル伝達に依存する
マウス胚性造血の試験は、ノッチシグナル伝達が、原始およびＥＭＰプログラムの発生に必要とされないが、ＨＳＣの生成には不可欠であることを示した（Ｈａｄｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ノッチ受容体（ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３、ノッチ４）の発現が解析され、分化の５日目にノッチ１およびノッチ４がＫＤＲ＋ＣＤ３４＋集団で発現されることが明らかになった（図６ａ）。この経路が原始造血のために必要かどうかを判定するために、単離ＫＤＲ＋ＣＤ３４＋細胞をＶＥＧＦ、ＦＧＦ２および造血サイトカインの存在下で凝集体として培養した。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析は、この知見を確認し、培養の最初の２日間の間にノッチ標的遺伝子、ＨＥＳ１、ＨＥＹ１およびＨＥＹ２の高レベルの発現を示し、原始プログラムの出現がノッチにより調節されることを示唆する。発現レベルは、培養の次の５日の間に低下し、原始造血細胞の生成および増殖と一致した（図６ｂ）。５日目のＫＤＲ＋ＣＤ３４＋集団は、ノッチシグナル伝達を阻害するγセクレターゼ阻害剤（ＧＳＩ）の存在下でも培養された。ＧＳＩ処理は、ノッチ標的遺伝子（ＨＥＳ１、ＨＥＹ１およびＨＥＹ２：図７ａ）の発現を減らし、経路の阻害を確証した。マウスモデルと対照的に、ＣＤ４３＋造血細胞およびコロニー形成前駆細胞の数はＧＳＩの存在下で減少し（図７ｂ～７ｄ）、ノッチシグナル伝達がヒト原始プログラムの生成には必要であることを強く示唆する。
より広範な造血系統分化能を有する第２の造血内皮細胞集団の特定
分化の６日目に出現するＣＤ４３＋造血細胞に加えて、ＥＢはまた、ＨＥＣ／内皮細胞マーカー、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＣＤ１４４およびＣＤ３１を共発現する、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＣＤ４５－集団を含んだ（図８ａおよび８ｂ）。ＲＴ－ｑＰＣＲ分析はまた、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団が、ＨＥＣ転写因子ＲＵＮＸ１およびＳＣＬ／ＴＡＬ１を発現し（図８ｃ）、ＨＥＣの存在を示唆することを示した。
分化の６日目のＣＤ４３＋およびＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団の造血分化能の特性を明らかにするために、その集団をＦＡＣＳにより単離し、細胞をＶＥＧＦ、ＦＧＦ２および造血サイトカインの存在下で凝集体として６日間培養した（図９ａ）。ＣＤ４３＋集団を培養は、初期３日にわたり増殖し、その後は安定した（図９ｂおよび９ｃ）。造血細胞の数は培養の間、継続的に増大したが、コロニー形成前駆細胞の数は、培養の３日目～６日目の間に減少し（図９ｄ）、原始プログラムの疲弊を示唆する。対照的に、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団から生成した培養物は、培養の１日以降、培養の６日間にわたりサイズが増大する、小さいＣＤ４３＋集団を発生させた（図９ｂおよび９ｃ）。コロニー形成前駆細胞の総数もまた、この時間中、増大した（図９ｄ）。コロニー亜型の分析は、ＣＤ４３＋由来集団中で、全ての段階において赤血球系統の優位を示した。対照的に、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－由来集団は、培養の１日目～３日目に、よりバランスされた赤血球のおよび骨髄前駆細胞の分布を示した。赤血球系統は、培養の６日のあいだ優勢であった（図９ｅ）。コロニー形態の分析は、ＣＤ４３＋集団は、概ね小さい赤芽球コロニーを発生させることを示した。対照的に、大きな赤血球コロニーを発生させたコロニー形成細胞は、培養の１日～３日目で、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞由来の集団中で豊富であった。培養の６日後、小さい赤血球コロニーを生成したコロニー形成前駆細胞が優勢であり（図９ｆ）、培養の初期段階では、大きなコロニーを発生させた前駆細胞が起源であった可能性がある。
ＣＤ４５は、ＥＭＰ、ＬＭＰおよび成体型プログラムの造血前駆細胞上で発現するが、マウスの原始プログラムではそうではなく（Ｆｅｒｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００３）、６日目のＣＤ４３＋およびＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団から生成した細胞上のＣＤ４５の発現が監視された。ＣＤ４３＋集団由来の培養物は、培養の６日後、小さいＣＤ４５＋集団を含み、これは、おそらく、原始プログラムの成熟骨髄細胞である。対照的に、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団から生成した培養物は、新たに出現したＥＭＰの可能性がある多数のＣＤ４５＋細胞を含んでいた（図１０ａ～１０ｃ）。これを試験するために、培養の５日後、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団由来の次の画分：ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＫＩＴ＋、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＫＩＴ－、ＣＤ３４－ＣＤ４５＋およびＣＤ３４－ＣＤ４５－細胞をＦＡＣＳにより単離し、それらのコロニー形成前駆細胞分化能をアッセイした（図１０ｄ）。ＫＩＴは、マウスＥＭＰ上で発現されるので、含められた（Ｆｅｒｋｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，２００３；ＭｃＧｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｍｉｋｋｏｌａ ｅｔ ａｌ．，２００３）。ＣＤ３４－ＣＤ４５－集団は、それらがＣＤ４５を下方制御した段階まで成熟された、混入した原始赤血球前駆細胞およびＥＭＰ由来赤血球前駆細胞の組み合わせの可能性がある小さい赤血球コロニー形成前駆細胞中で高度に富化された。ＣＤ４５＋集団中の大部分の前駆細胞は、マスト細胞およびマクロファージ系統の集団であった（図１０ｅおよび１０ｆ）。顆粒球前駆細胞もまた、これらの培養物中で検出された。赤血球系統細胞もこの集団により生成されたが、それらは、混合赤血球－骨髄コロニーに大きく関連していた。これらのコロニーのＲＴ－ｑＰＣＲは、６日目のＣＤ４３＋集団から生成したコロニーに比べて、高レベルの胎生期のβグロビン、ＨＢＧの発現を示し（図１０ｇ）、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＫＩＴ＋由来赤血球細胞がヒトＥＭＰ系統に特有のものであることを示す。まとめると、これらの知見は、ヒト原始およびＥＭＰプログラムに繋がる発生能を示す別個のＣＤ３４＋細胞集団の出現を明らかにする。
ＥＭＰ様分化能を有するプログラム出現を考慮すると、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団を、それが同様にＴリンパ球前駆細胞を含むかどうかを知るために評価した。６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－およびＣＤ４３＋の両集団を、ヒトＴ細胞発生に必要なノッチシグナル伝達のレベルを与えるように改変されたＯＰ９－ＤＬ４細胞と共に培養した（Ｍｏｈｔａｓｈａｍｉ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。図１１ａに示すように、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団は、ＯＰ９－ＤＬ４細胞との培養の１か月後、ＣＤ４５＋ＣＤ５６－ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔリンパ球前駆細胞を生成したが、ＣＤ４３＋集団では生成しなかった。追加の１０日間の培養後に、αβまたはγδ ＴＣＲ＋リンパ球が検出された（図１１ｂおよび１１ｃ）。Ｔリンパ系統がＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋卵黄嚢様中胚葉から生成されたことを確認するために、この集団を単離し、凝集体として３日間培養し、その後、それらをＯＰ９－ＤＬ４細胞上に播種した（図１２ａおよび１２ｂ）。３日間の凝集体培養中に、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞は、約８５％のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞からなる集団を生成した。１か月の培養後の分析は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋リンパ球前駆細胞の存在が明らかにし、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉がＴリンパ系統を発生させることを示す（図１２ｃ）。このＴリンパ系統が臍帯血造血前駆細胞から生成したものとは異なるかどうかを判定するために、ＴＣＲ遺伝子の発現を、ＣＤ３＋リンパ球中で比較した。ＣＤ３＋リンパ球は、２５日目からのｈＰＳＣおよび臍帯血由来の培養物中で検出され、それらの発生頻度は、培養の次の１５日にわたり増大した（図１３ａおよび１３ｂ）。ＣＤ３＋細胞中では、培養の初期段階で、γδ Ｔリンパ球がＴＣＲ＋集団の優位を占めた。培養が進行するに伴い、αβＴリンパ球が両培養物中の主要なＴＣＲ＋集団になった（図１３ｃおよび１３ｄ）。ヒト胚芽では、初期発生段階で、ｔｃｒｄｖ２（Ｖδ２）を発現するγδリンパ球が豊富である。この系統は、発生の後期で、Ｖδ１リンパ球により取って代わられ（Ｄｉｍｏｖａ ｅｔ ａｌ．，２０１５；Ｈａｙｎｅｓ ａｎｄ Ｈｅｉｎｌｙ，１９９５；Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８８；ＭｃＶａｙ ａｎｄ Ｃａｒｄｉｎｇ，１９９６）、これは、おそらく、卵黄嚢Ｔリンパ球新生から、ｈｓｃｓから生成されたものへの変化に対応すると思われる。この解釈と一致して、ＣＤ３＋リンパ球中のＶδ１およびＶδ２発現のフローサイトメトリー分析は、Ｖδ２がｈＰＳＣ由来Ｔ細胞上の優勢なＴＣＲＤＶ受容体発現であるが、Ｖδ１発現Ｔ細胞は、臍帯血細胞から生成した優位集団であることを示した（図１３ｅ～１３ｇ）。Ｔリンパ球発生における差異が培養の初期段階で明らかであるかどうかを判定するために、ＣＤ７＋前駆細胞の表面マーカー発現を培養の１２日後に分析した。理由は、これがリンパ球拘束の最初期段階の１つであるためである。臍帯血由来細胞の分析は、ＣＤ５が、分化しているＣＤ７＋ＣＤ３４＋Ｔリンパ球前駆細胞集団上に発現されることを示した。対照的に、ｈＰＳＣ由来ＣＤ７＋ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ５－であった（図１４）。まとめると、これらの知見は、ＢＭＰ４、ＦＧＦ２およびアクチビンＡで誘導されたＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉は、原始、ＥＭＰおよびＴリンパ球分化能を含み、マウス卵黄嚢の造血分化能を概ね反映していることを示す。これらの試験はまた、ｈＰＳＣ由来Ｔリンパ球が成熟臍帯血前駆細胞から生成したものとは異なる場合があるという証拠を提供する。
赤血球－骨髄およびＴリンパ球前駆細胞は、多能性造血前駆細胞から生成される
マウスおよびｈＰＳＣ由来ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣ集団が赤血球、骨髄およびリンパ球分化能を含むという実例におけるＥＭＰとＬＭＰプログラムの間の時間的に密接な関連は、これらの系統が共通の多能性前駆細胞から発生するという可能性を高めた。この前駆細胞を探索するために、６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－細胞をＯＰ９－ＤＬ４細胞と共に５日間培養して、ＥＨＴを開始させた後、発生中の造血集団の、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９０およびＣＤ７を含む造血前駆細胞のマーカーを発現する細胞の存在を解析した。これらの解析から、別個のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－およびＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋集団を特定した（図１５ａ）。ＣＤ９０およびＣＤ７は６日目のＣＤ４３＋原始造血集団中で発現されたが、これらの細胞はＣＤ４５を発現しなかった（図１５ｂ）。ＣＤ９０＋ＣＤ７－またはＣＤ９０－ＣＤ７＋ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋亜集団中でリンパ球前駆細胞の発生頻度が単一細胞のクローン分析を実施するのに十分高いかどうかを判定するために、限界希釈分析を行った。これらの試験は、ＮＫ（ＣＤ９０＋ＣＤ７－；１：１６およびＣＤ９０－ＣＤ７＋；１：８２）およびＴリンパ球（ＣＤ９０＋ＣＤ７－；１：２６およびＣＤ９０－ＣＤ７＋；１：７３）前駆細胞の発生頻度は、ＣＤ９０＋ＣＤ７＋集団中でより高いことを示した（図１６ａ）。２つのＣＤ３４＋ＣＤ４５＋亜集団の増殖能を、細胞をＨＵＶＥＣ－Ｅ４ＯＲＦ１内皮細胞と共に培養することにより測定し、造血前駆細胞の増殖を裏付けることが示された（Ｓｅａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００８）。そのより高い造血前駆細胞発生頻度と一致して、共培養の４日後に、ＣＤ９０＋ＣＤ７－集団は、ＣＤ９０－ＣＤ７＋集団よりも優位に多くの総ＣＤ４５＋およびより多くのＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞を発生された（図１６ｂおよび１６ｃ）。これらのデータは、クローン分析のためにＣＤ９０＋ＣＤ７－集団が好適な標的集団であり、ＨＵＶＥＣ－Ｅ４ＯＲＦ１内皮細胞が造血前駆細胞を効率的に増殖させることができることを示唆する。ＨＵＶＥＣ－Ｅ４ＯＲＦ１細胞は、造血増殖を裏付けたが、ＮＫ細胞およびＴリンパ球分化能は、培養（物）の４日後に両方のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋亜集団から失われた（データは示さず）。比較すると、ＯＰ９－ＤＬ４細胞との８日間の培養は、より少ないＣＤ４５＋造血細胞を産生した（図１６ｄ）が、前駆細胞にリンパ球分化能を維持させることを可能にした。ＯＰ９－ＤＬ４細胞との短期培養が多系列造血を支援するかどうかを判定するために、２５個のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－細胞をＯＰ９－ＤＬ４間質上で４日間培養後、メチルセルロース中の３０％の培養物の赤血球および骨髄前駆細胞をアッセイし、残りの細胞のリンパ球分化能を新しいＯＰ９－ＤＬ４細胞との共培養によりアッセイした。試験した１２ウェル中の６個（５０％）がリンパ球、赤血球および骨髄の子孫を発生させた（図１６ｅおよび１６ｆ））。これらのデータは、ＯＰ９－ＤＬ４細胞との４日間の共培養が、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－集団の多系列造血分化能を維持することを示す。
ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－集団が多能性造血前駆細胞を含むかどうかを判定するために、単一細胞をＦＡＣＳによりＯＰ９－ＤＬ４細胞上に堆積させた。４日後、培養物を回収し、上述のように、赤血球、骨髄およびリンパ球分化能をアッセイした。６３７個の選別したＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－細胞から、６０個の細胞（９．４％）が造血クローンを産生した（図１７ａ）。６０個のクローンの内の、１０個（１６．７％）がＮＫ細胞、Ｔリンパ球、赤血球および骨髄の子孫を含み（図１７ｂおよび１７ｃ）、多能性造血前駆細胞が、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－集団中に含まれていたことを示す。残りの５０個のクローンは、おおむね、リンパ球（２０％）または赤血球－骨髄（２５％）運命に限定された。各クローンから生成された赤血球コロニーのβグロビン発現を、原始および成体型プログラム由来の赤血球コロニーと比較した。ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－前駆細胞から生成した赤血球コロニーは、原始赤血球細胞のコロニーよりも、より低レベルの胚性βグロビン、ＨＢＥ、より高レベルの胎生期βグロビン、ＨＢＧを発現し、およびｈＰＳＣ由来成熟前駆細胞から生成したコロニーよりも、より高レベルのＨＢＥおよびより低レベルのＨＢＧを発現した（図１７ｄ）。この中間体パターンは、マウスでのＥＭＰ由来赤血球細胞で観察されたβグロビン発現パターンと一致する。まとめると、これらのデータは、６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣは、多能性造血前駆細胞を発生させて、そうすることにより、赤血球、骨髄およびリンパ球分化能を示すヒト多系列卵黄嚢プログラムを決定することを示す。これらの知見を考慮すると、マウス卵黄嚢での造血プログラムを説明するために使用されるＥＭＰおよびＬＭＰ用語は、ヒト卵黄嚢のために、多能性前駆細胞プログラム（ＭＰＰ）に改訂できる。
多能性造血前駆細胞の生着能
ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－集団中の多能性造血前駆細胞の存在を考慮して、この集団を、胚齢Ｅ９．５マウスの卵黄嚢で特定されたもの（Ｙｏｄｅｒ ａｎｄ Ｈｉａｔｔ，１９９７；Ｙｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ａ；Ｙｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７ｂ）と類似の生着可能な前駆細胞を含むかどうかを知るために、評価した。これを試験するために、４，０００～９，０００個のｈＰＳＣ由来ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－細胞を照射したＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）新生児マウスの肝臓に移植した。クローン分析に基づくと、移植集団は、３７５～８５０個の造血前駆細胞を含み、その内の６２～１４０個の細胞は、多能性であった。ＣＤ３４＋臍帯血細胞を対照として移植した。移植の４週後のレシピエントの骨髄の分析は、ＣＤ３４＋臍帯血細胞を受けた動物においてのみ、生着を示した（図１８）。
造血発生中のアルデヒド脱水素酵素活性
マウス造血発生の試験は、ＨＳＣの特異化のために、Ｒａｌｄｈ２により媒介されたＲＡシグナル伝達が必要であり、ＡＧＭ由来ＨＳＣは、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ ａｓｓａｙを用いてこの活性に基づいて単離できることを示した（Ｃｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。ヒトでの試験はまた、臍帯血ＨＳＣがＡｌｄｅｆｌｕｏｒ活性に基づいて単離できることを示した（Ｆａｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３；Ｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）。ＲＡシグナル伝達がヒト卵黄嚢プログラムの特異化および発生に寄与し得るかどうかを判定するために、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－細胞、ならびに中胚葉（分化の３日目および４日目）およびそれらが生成されたＨＥＣ含有集団（分化の５日目および６日目）のＡｌｄｅｆｌｕｏｒ ａｓｓａｙによりＡＬＤＨを測定した。Ａｌｄｅｆｌｕｏｒは、蛍光を発する分子であり、アルデヒド脱水素酵素（Ｒａｌｄｈ２を含むがこれに限定されない）により触媒される反応で非蛍光前駆体から生成される。
図１９ａ～１９ｃに示されるように、ほとんどの集団は、ＡＬＤＨ＋細胞を含まなかった。ＡＬＤＨ＋細胞が分化の６日目に検出されたが、それらは、ＣＤ３４－画分に限られており、これは、非造血集団である可能性がある（図１９ｃ）。対照的に、成熟運命に特異化された集団は、分化の３～６日目を通して、容易に検出可能なＡＬＤＨ集団を含んでいた（図１９ｂおよび１９ｃ）。分化の０日目～６日目にＡＬＤＨ１Ａ２（Ｒａｌｄｈ２をコードする）の発現も分析された。ＡＬＤＨ１Ａ２は、培養のこれらの段階を通して低レベルで一貫して発現しており（図１９ｄ）、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ ａｓｓａｙで検出されるための十分な酵素活性を生成するには低すぎると推定されることが明らかになった。ＡＬＤＨ１Ａ２のパターンとは対照的に、ＲＡの分解に関与する酵素であるＣＹＰ２６Ａ１の発現は、分化の３日目に鋭いピークを示した（図１９ｄ）。まとめるとこれらの知見は、ＲＡシグナル伝達は、ヒト原始またはＭＰＰプログラムの生成に関与しないことを示唆する。むしろ、分化の３日目のＣＹＰ２６Ａ１の高レベルの発現は、ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉が外来性のＲＡシグナル伝達から保護されていることを示唆する。
ヒト多能性幹細胞株からの造血発生
ヒト卵黄嚢造血プログラムの生成のためのプロトコルが他のｈＰＳＣ株に広く適用可能であるかどうかを判定するために、健康なドナーの末梢血から生成したｉＰＳＣ株（ＣＨＯＰ１０ＷＴ）（Ｍａｇｕｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，２０１６）を試験した。ｈＰＳＣ株は、サイトカインに対するそれらの応答性が異なる場合があり、そのため、分化の１日目～４日目のＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＦＧＦ２（５ｎｇ／ｍＬ）の存在下でのアクチビンＡ（０～１０ｎｇ／ｍＬ）の濃度を調製し、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉の誘導を最適化した。２または４ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで誘導した集団は、分化の４日目に、最高の比率のＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋細胞を生成した（図２０ａおよび２０ｂ）。２ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡで誘導された中胚葉は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２および造血サイトカインの存在下で分化され、集団の造血分化能が評価された。ＣＤ４３＋造血細胞は、分化の６日目に出現し、追加の分化の６日目にわたり数が増大し（図２０ｃおよび２０ｄ）、Ｈ１ ｈＥＳＣを用いた以前の試験で観察されたパターン（図２ｂおよび２ｃ）と一致した。これらの知見は、異なるｈＰＳＣ株でのＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉の誘導は、異なる濃度のアクチビンＡを必要とし、この団火事のプロトコルを各株に対して最適化することの重要性を強調することを示す。
ＣＨＯＰ１０ＷＴ ｉＰＳＣから生成したＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉の、原始プログラムおよびＴリンパ系統を発生させるその能力を評価した。ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞は、ＦＡＣＳにより単離され、細胞が、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２および造血サイトカインの存在下で、凝集体として培養された（図２１ａ）。ＣＤ３４＋ＣＤ４３－集団は、培養の１日後に出現し、ＣＤ４３＋造血細胞の出現に先行し、この細胞は、培養のその後の段階を通して生成した（図２１ｂおよび２１ｃ）。培養の５日後のコロニー形成分化能の分析は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉が原始プログラムを発生させることを確証した（図２１ｄ）。Ｔリンパ球前駆細胞は、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋由来細胞のＯＰ９－ＤＬ４細胞との１か月間の培養後に観察された（図２１ｅ）。まとめると、これらのデータは、本明細書で記載のＢＭＰ４、ＦＧＦ２およびアクチビンＡをベースにしたプロトコルを用いて、異なるｈＰＳＣ株からの原始赤血球およびＴリンパ球分化能を有するＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉を生成することができることを示す。
ヒト卵黄嚢造血プログラムの発生に関して本明細書で記載される。これらの系統は、特定の濃度のＢＭＰ４、ＦＧＦ２およびアクチビンＡで誘導されたＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉から生成される。２４時間以内に、この中胚葉は、造血前駆細胞を産生するためにノッチ依存性ＥＨＴを直ぐに受ける原始ＨＥＣを生成する。これらの細胞は、原始赤血球、マスト細胞およびマクロファージの子孫を発生させる。原始造血前駆細胞が出現するにつれて、第２のＨＥＣ集団が存在する。これらのＨＥＣは、ＥＨＴを受けて、ＣＤ４５の発現に基づいて、原始前駆細胞から識別できる多能性造血前駆細胞を発生させる。これらのＭＰＰは、ＥＭＰ赤血球、マスト細胞、マクロファージ、顆粒球、ＮＫ細胞およびリンパ球分化能を示し、ＥＭＰおよびＬＭＰプログラムを統合する。モデルの概略図を図２２に示す。
これらの系統の治療可能性を考慮して、マクロファージ中で高度に富化されている培養物を生成するプロトコルが開発された。このプロトコルでは、３日間にわたり、造血前駆細胞が増殖され、ＳＣＦ、ＩＬ３およびＭＣＳＦを含む培地中でマクロファージ運命に拘束される。その後、ＳＣＦおよびＩＬ３が培養物から回収され、培養物中でマクロファージ前駆細胞の成熟を可能にする（図２３ａ）。１３～１５日後、ＣＤ４５、ＣＤ６８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ６４およびＣＤ１６３の発現で特定されたマクロファージは、培養物で優勢な系統であった（図２３ｂ）。
実施例３
Ｔ系統細胞分化の生成
ｉＰＳＣを、ＢＭＰ受容体アゴニスト（ＢＭＰＲＡ）および任意選択のＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）を含むＰＳＣ培養組成物で約１日間処理し、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を産生する。その後、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養組成物で追加の約３日間（分化の４日目）処理して、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生する。
いくつかの実施形態では、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を、例えば、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＩＬ－６およびＩＬ－１１中で少なくとも２日間培養して、６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを産生する。いくつかのさらに他の実施形態では、６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを、ＳＣＦ、ＩＬ－７およびＦＬＴ３Ｌ中で、ノッチリガンド、任意選択で、ＤＬ４またはＯＰ９－ＤＬ４細胞などの固定化ノッチリガンドを含む足場と共に約５日間さらに培養して、６＋５日目のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋前駆細胞を得る。
Ｔ細胞の集団を生成するために、上記細胞を、Ｄｅｌｔａ－ｌｉｋｅ ４（ＯＰ９－ＤＬ４）を恒常的に発現する間質細胞と共培養した。共培養物を正常酸素圧条件（３７℃、５％ＣＯ２）で維持する。上記細胞（４日目のＫＤＲ＋中胚葉、６日目のＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣまたは６＋５日目のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋前駆細胞）を、例えば、ゼラチン処理組織培養プレートの、抗生物質、ＦＣＳ（２０％、ＨｙＣｌｏｎｅ）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）、ＩＬ７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＦＬＴ３Ｌ（５ｎｇ／ｍＬ）を補充したαＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）などの好適な培地中で、ＯＰ９－ＤＬ４細胞と共に培養する。ＳＣＦ（３０ｎｇ／ｍＬ）を共培養の開始時に含め、４～６日後に除去できる。３～４週かけて、激しいピペット操作および４０μｍストレーナーの通過により、４～６日毎に培養物を新しいＯＰ９－ＤＬ４細胞に移す。ＣＤ４５、ＣＤ３、および汎ＴＣＲαβ、汎ＴＣＲγδまたはＶδ２の１種を含む、確立された系統マーカーを用いて、目的のＴ細胞を特定する。例えば、Ｖδ２ Ｔ細胞を単離するために、ＣＤ４５、ＣＤ３およびＶδ２に対する抗体の組み合わせを使用できる。抗体を磁気粒子に結合させ、磁気的に単離できる。あるいは、細胞をＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）により単離できる。
Figure 2023540212000003
Figure 2023540212000004
Figure 2023540212000005

Claims (66)

  1. Ｔリンパ系統細胞またはそれから分化した細胞を発生させることができるＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生する方法であって、
    多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、ＢＭＰ受容体アゴニスト（ＢＭＰＲＡ）および任意選択のＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）を含むＰＳＣ培養組成物と接触させて、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を産生すること；
    前記ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養組成物と接触させて、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生すること、
    を含む方法。
  2. ＰＳＣが、約３日間、少なくとも３日間または最大３日間、前記中胚葉特異化培養組成物と接触させられる、請求項１に記載の方法。
  3. 前記多能性幹細胞および／または前記ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団が、胚様体の形態である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記胚様体が、前記多能性幹細胞および／または前記ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団の中胚葉特異化培養組成物との接触の前に、約１８時間にわたり軌道振盪により調製される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＢＭＰＲＡおよび／またはＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニストがＢＭＰ４である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記ＦＧＦ受容体アゴニストがＦＧＦ２を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記アクチビン受容体アゴニストがアクチビンＡである、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞、任意選択で、ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記方法が、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ－／＋中胚葉細胞を、ＶＥＧＦおよび任意選択でＦＧＦ２を含むＨＥＣ培養組成物、ならびに任意選択で、１種または複数の造血サイトカインと接触させて、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋造血内皮細胞（ＨＥＣ）を得ることをさらに含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記方法が、原始前駆細胞培養組成物中でＣＤ３４＋ＫＤＲ＋造血内皮細胞（ＨＥＣ）を培養し、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を得ることをさらに含む、請求項９に記載の方法。
  11. 前記方法が、原始前駆細胞培養組成物中で前記ＣＤ４３＋造血前駆細胞を培養し、原始プログラム系統細胞を得ることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記１種または複数の原始プログラム系統細胞が単離される、請求項１に記載の方法。
  13. 前記方法が、前記ＣＤ４３＋造血前駆細胞をマクロファージ許容カクテルと培養し、マクロファージ細胞を単離することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記方法が、前記ＣＤ４３＋造血前駆細胞をマスト細胞許容カクテルと培養し、マスト細胞を単離することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記方法が、前記ＣＤ４３＋造血前駆細胞を赤血球細胞許容カクテルと培養し、原始赤血球を単離することをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
  16. 前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記ＢＭＰＲＡがＢＭＰ４である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記方法が、前記ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣを一定期間培養し、ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを単離することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
  19. 一定期間が、約１日である、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記方法が、前記ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを、ノッチアゴニストを含む多能性前駆細胞培養組成物と接触させて、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、任意選択で、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－および／またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋造血前駆細胞を得ることをさらに含む、請求項１８または１９に記載の方法。
  21. 前記方法が、前記ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞を増殖させることをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記方法が、前記ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞または前記増殖させたＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞を接触させて、多能性系統細胞を得ることをさらに含む、請求項２０または２１に記載の方法。
  23. 前記１種または複数の原始プログラム系統細胞が単離される、請求項２２に記載の方法。
  24. マクロファージ細胞が単離される、請求項２３に記載の方法。
  25. マスト細胞が単離される、請求項２３に記載の方法。
  26. 多能性プログラム系統赤血球が単離される、請求項２３に記載の方法。
  27. 顆粒球が単離される、請求項２３に記載の方法。
  28. Ｔリンパ球が単離され、任意選択で、前記単離Ｔリンパ球がγ／δ、α／β、Ｔリンパ球、Ｖδ２ Ｔリンパ球である、請求項２３に記載の方法。
  29. 前記ノッチアゴニストが、ノッチリガンドであり、任意選択で、ノッチリガンド結合組織培養プレートまたはビード経由で供給される、請求項２０～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. １種または複数の種類の前記単離細胞が組成物中に再懸濁される、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記組成物が、ゲルを含むか、または無菌の浸透圧的にバランスした流体溶液である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記組成物が、１種または複数の他の種類の細胞を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  33. １種または複数の種類の前記細胞、任意選択で、請求項１～２９のいずれか１項に記載の１種または複数の種類の前記単離細胞を含む細胞集団。
  34. １種または複数の種類の前記細胞、任意選択で、請求項１～２９のいずれか１項に記載の１種または複数の種類の前記単離細胞および担体を含む組成物。
  35. 前記組成物が、ゲル、心筋細胞または肝細胞を含む、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記組成物が、浸透圧的にバランスされた流体溶液を含む、請求項３４に記載の組成物。
  37. 前記組成物が無菌である、請求項３４～３６のいずれか１項に記載の組成物。
  38. ゲルまたは足場、任意選択でポーチ、および請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法に従って調製された１種または複数の種類の単離細胞、請求項３３に記載の細胞集団または請求項３４～３７のいずれか１項に記載の組成物を含む細胞移植片。
  39. 中胚葉特異化培養添加物であって：
    ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、
    ＦＧＦ受容体アゴニスト、および
    アクチビン受容体アゴニスト、
    を含む添加物。
  40. 前記ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニストがＢＭＰ４である、請求項３９に記載の中胚葉特異化培養添加物。
  41. 前記ＦＧＦ受容体アゴニストがＦＧＦ２である、請求項３９に記載の中胚葉特異化培養添加物。
  42. 前記アクチビン受容体アゴニストがアクチビンＡである、請求項３９に記載の中胚葉特異化培養添加物。
  43. 約５００ｍＬの溶液中で、前記ＢＭＰ４が０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬを与えるのに十分な量であり、前記ＦＧＦ２が０．５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬを与えるのに十分な量であり、および前記アクチビンＡが０．５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌを与えるのに十分な量であり、好ましくは、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストの比率、任意選択で、ＢＭＰ４：ＦＧＦ２：アクチビンＡの比率が、約１０：５：６または約１０：５：２または約１０：５：６～約１０：５：２である、請求項４０～４２のいずれか１項に記載の中胚葉特異化培養添加物。
  44. 中胚葉特異化培養組成物であって、
    造血前駆細胞に好適な基本培地、
    ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、
    ＦＧＦ受容体アゴニスト、および
    アクチビン受容体アゴニスト、
    を含む組成物。
  45. 前記ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニストがＢＭＰ４である、請求項４４に記載の中胚葉特異化培養組成物。
  46. 前記ＦＧＦ受容体アゴニストがＦＧＦ２である、請求項４４に記載の中胚葉特異化培養組成物。
  47. 前記アクチビン受容体アゴニストがアクチビンＡである、請求項４４に記載の中胚葉特異化培養組成物。
  48. 請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法で使用するための、請求項３９～４７のいずれか１項に記載の中胚葉特異化培養添加物または組成物。
  49. 請求項３９～４７のいずれか１項に記載の添加物または組成物を含むキット。
  50. 対象に前駆細胞を提供する方法であって、請求項３３に記載の細胞集団、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の組成物または請求項３８に記載の細胞移植片を投与することを含む、方法。
  51. 薬物の調製のための、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法に従って調製された細胞、請求項３３に記載の細胞集団、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の組成物、請求項３８に記載の細胞移植片、請求項３９～４８のいずれか１項に記載の中胚葉特異化培養添加物または中胚葉特異化培養組成物の使用であって、任意選択で、前記薬物が本開示で記載の使用のためである、使用。
  52. Ｔリンパ系統細胞またはそれから分化した細胞を発生させることができるＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生する方法であって、
    多能性幹細胞（ＰＳＣ）を、ＢＭＰ受容体アゴニスト（ＢＭＰＲＡ）および任意選択のＲＯＣＫ阻害剤（Ｒｉ）を含むＰＳＣ培養組成物と接触させて、ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を産生すること；
    前記ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団を、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、ＦＧＦ受容体アゴニストおよびアクチビン受容体アゴニストを含む中胚葉特異化培養組成物と接触させて、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を産生すること、
    を含む方法。
  53. 前記ＰＳＣを、約３日間、少なくとも３日間または最大３日間、前記中胚葉特異化培養組成物と接触させ；
    前記多能性幹細胞および／または前記ＢＭＰＲＡ－Ｒｉ細胞集団が、胚様体の形態であり；および／または
    前記多能性幹細胞が、胚性幹細胞または誘導多能性幹細胞、任意選択で、ヒト誘導多能性幹細胞である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ＢＭＰＲＡおよび／または前記ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニストがＢＭＰ４であり；前記ＦＧＦ受容体アゴニストがＦＧＦ２であるか、またはこれを含み、および／または前記アクチビン受容体アゴニストがアクチビンＡである、請求項５２または５３に記載の方法。
  55. 前記方法が、ＫＤＲ＋ＣＤ２３５ａ／ｂ＋中胚葉細胞を、ＶＥＧＦおよび任意選択でＦＧＦ２を含むＨＥＣ培養組成物、ならびに任意選択で、１種または複数の造血サイトカインと接触させて、ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋造血内皮細胞（ＨＥＣ）を得ることをさらに含み、
    原始前駆細胞培養組成物中で前記ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋造血内皮細胞（ＨＥＣ）を培養し、ＣＤ４３＋造血前駆細胞を得ること；または
    前記ＣＤ３４＋ＫＤＲ＋ＨＥＣを一定期間培養し、任意選択で、約１日間でＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを単離すること、
    をさらに含む、請求項５２～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記方法が、前記原始前駆細胞培養組成物中で前記ＣＤ４３＋造血前駆細胞を培養し、原始プログラム系統細胞を得ることであって、任意選択で、前記１種または複数の原始プログラム系統細胞が単離されることをさらに含み；
    前記方法が、ＣＤ４３＋造血前駆細胞をマクロファージ許容カクテルと培養すること、およびマクロファージ細胞を単離することをさらに含み；
    前記方法が、前記ＣＤ４３＋造血前駆細胞をマスト細胞許容カクテルと培養すること、およびマスト細胞を単離することをさらに含み；または
    前記方法が、前記ＣＤ４３＋造血前駆細胞を赤血球細胞許容カクテルと培養すること、および原始赤血球を単離することをさらに含む、
    請求項５５に記載の方法。
  57. 前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ－２７６３２であり、および／または前記ＢＭＰＲＡがＢＭＰ４である、請求項５２～５６のいずれか１項に記載の方法。
  58. 前記方法が、前記ＣＤ３４＋ＣＤ４３－ＨＥＣを、ノッチアゴニストを含む多能性前駆細胞培養組成物と接触させて、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋、任意選択で、ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０＋ＣＤ７－および／またはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋ＣＤ９０－ＣＤ７＋造血前駆細胞を得ること、および任意選択で、前記ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞を増殖することをさらに含む、請求項５６または５７に記載の方法。
  59. 前記方法が、前記ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞または増殖させたＣＤ３４＋ＣＤ４５＋造血前駆細胞を接触させて、多能性系統細胞を得ること、および任意選択で、１種または複数の多能性プログラム系統細胞を単離することをさらに含み、任意選択で、マクロファージ細胞が単離され、マスト細胞が単離され、赤血球細胞が単離され、顆粒球が単離され、またはＴリンパ球が単離され、任意選択で、前記単離Ｔリンパ球が、γ／δ、α／β、Ｔリンパ球、任意選択で、Ｖγ２［Ｍｉｃｈａｅｌによると、これはＶδ２であるはずである？］Ｔリンパ球である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ノッチアゴニストが、ノッチリガンドであり、任意選択で、ノッチリガンド結合組織培養プレートまたはビード経由で供給される、請求項５８～５９のいずれか１項に記載の方法。
  61. １種または複数の種類の単離細胞が組成物中に懸濁され、任意選択で、前記組成物がゲルを含むか、または無菌の浸透圧的にバランスされた流体溶液であり、および／または前記組成物が、１種または複数の他の種類の細胞を含む、請求項５２～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 請求項５２～６１のいずれか１項に記載の１種または複数の種類の前記細胞、任意選択で、１種または複数の種類の前記単離細胞、を含む細胞集団または組成物であって、前記組成物が、担体、ゲル、および／または浸透圧的にバランスされた流体溶液を含み、任意選択で、前記組成物が無菌であり、任意選択で、前記細胞集団または組成物が、心筋細胞または肝細胞を含む、細胞集団または組成物。
  63. ゲルまたは足場、任意選択でポーチ、および請求項５２～６１のいずれか１項に記載の方法に従って調製された１種または複数の種類の単離細胞、または請求項６２に記載の細胞集団もしくは組成物を含む細胞移植片。
  64. 中胚葉特異化培養添加物または培養組成物またはキットであって、
    ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、任意選択で、ＢＭＰ４、
    ＦＧＦ受容体アゴニスト、任意選択で、ＦＧＦ２、および
    アクチビン受容体アゴニスト、任意選択で、アクチビンＡを含み；
    任意選択で、約５００ｍＬの溶液中で、ＢＭＰＲ１／Ｒ２アゴニスト、任意選択でＢＭＰ４が０．５ｎｇ／ｍＬ～約１００ｎｇ／ｍＬを与えるのに十分な量であり、ＦＧＦ受容体アゴニスト、任意選択でＦＧＦ２が０．５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬを与えるのに十分な量であり、およびアクチビン受容体アゴニスト、任意選択でアクチビンＡが０．５ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍｌを与えるのに十分な量であり、好ましくは、ＢＭＰ４：ＦＧＦ２：アクチビンＡを、約１０：５：６または約１０：５：２または約１０：５：６～約１０：５：２の比率で含み、または
    前記中胚葉特異化培養組成物が、造血前駆細胞に好適な基本培地をさらに含む、
    中胚葉特異化培養添加物または培養組成物またはキット。
  65. 請求項に記載の方法で使用するための、請求項５２～６１のいずれか１項に記載の方法で使用するための請求項３９～４８のいずれか１項に記載の中胚葉特異化培養添加物または組成物。
  66. 薬物を調製するための、請求項５２に記載の組成物の細胞集団または組成物、または請求項６３に記載の細胞移植片、請求項６４または６５に記載の中胚葉特異化培養添加物または組成物、の使用。

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