JP2022172252A - 造血移植片の改善方法 - Google Patents
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Abstract
Description
多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞、すなわち、造血移植に適した造血幹細胞
の同定および選択に関する。
/化学療法の終生治療効果を担うヒトの骨髄(BM)および血液内の希少な細胞である。
これらの細胞は、BM、動員末梢血またはヒト臍帯血を含むいくつかの供給源から採取さ
れることができる。臍帯血は、いくつかの利点、すなわち、HLA適合の必要性の減少お
よび移植片対宿主病のリスクの減少を提供する。しかし、HSCの操作における進歩にも
かかわらず、その数は、多くの場合、同種異系移植には不十分なままであり、得られた細
胞は、新たに単離されたHSCと比較して多系統および生着可能性の減少を示す。これら
の知見に基づけば、非造血源からの移植可能HSCの生成が、再生医療における主要目標
の1つとなっている。
再プログラミング、または、ヒト多能性幹細胞からの分化のいずれかを使用する、多数の
プロトコルが開発された(WahlsterおよびDaley、Nature cell
biology、2016、18、1111-1117)。多くの場合、癌遺伝子をコ
ードするプラスミドの導入または非GMPグレードのフィーダー細胞の受容細胞への利用
は、臨床応用についてのそれらの使用を不可能にする。結局、これらのプロトコルの多く
は、真の移植可能臍帯血または成人HSCに近い表面表現型を有する細胞の集団の産生を
目指し、戦略は、乏しい生着可能性を有する細胞を生成することしか実証していない。
向上させる産物および方法が依然として必要とされている。
体的には、本発明は、インビボでの長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞を
取得および選択する方法を提供する。本発明は、HSC移植についての細胞の供給源とし
て、多能性幹細胞、具体的には人工多能性幹細胞の使用への道を開く。
再生が可能な造血幹細胞の細胞の集団を濃縮するインビトロの方法に関し、前記方法は、
a)造血幹細胞、好ましくは初期原始造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、お
よび、
b)細胞表面抗原CD135および/またはCD110の発現に基づいて、前記集団の
細胞を選別すること、および、
c)CD135+および/またはCD110+である細胞を回収すること
を含む。
て選別され、ステップc)において、回収された細胞は、CD110+である。任意でス
テップb)において、細胞は、細胞表面抗原CD135の発現に基づいてさらに選別され
得、ステップc)において、回収された細胞は、CD110+CD135+であり得る。
NR)の発現に基づいて細胞を選別すること、および、APLNR+である細胞を回収す
ることを含み得る。
/もしくは脾臓から得られる造血幹細胞を含み得、ならびに/または、不死化造血幹細胞
を含み得る。
は、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞、より好ましくは人工多能性幹細胞から選択され
る、多能性幹細胞のインビトロ分化から得られる造血幹細胞を含み得る。
多能性幹細胞、好ましくは、胚様体(EB)の形成を誘導する人工多能性幹細胞を提供
すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地中でEBを培養すること
、
EBを液体培養培地で培養し、多能性幹細胞を造血細胞内系統に分化すること、および
EB細胞を解離すること
を含み得、
それによって、ステップa)で提供される細胞の集団を得る。
FMS様チロシンキナーゼ3(FLT3)リガンド、骨形成タンパク質4(BMP4)、
血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン6(
IL6)、インターロイキン1(IL-1)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およ
びインスリン様成長因子1(IGF1)を含む。
しくは17日間、液体培養培地で培養される。
が可能な造血幹細胞のマーカとしてのCD135および/またはCD110の使用に関す
る。
細胞移植片に関し、細胞の少なくとも10%は、CD135+および/またはCD110
+造血幹細胞である。それはまた、本発明の方法に従って調製される造血細胞移植片に関
する。
急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨
髄増殖性疾患、慢性リンパ性白血病、若年性慢性骨髄性白血病、神経芽細胞腫、卵巣癌お
よび生殖細胞腫瘍などの悪性疾患、または、自己免疫疾患、アミロイドーシス、再生不良
性貧血、発作性夜間血色素尿症、ファンコーニの貧血、ブラックファン・ダイアモンド貧
血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリ
ッチ症候群および先天性代謝異常などの非悪性疾患の処置に使用するための本発明の造血
細胞移植片に関する。
は血清アルブミン、ならびに(ii)トランスフェリンまたはその代替物、インスリンま
たはその代替物、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシ
ンキナーゼ3リガンド(FLT3-L)、骨形成タンパク質4(BMP4)、血管内皮成
長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン6(IL6)、
インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およびインスリン
様成長因子1(IGF1)を含む液体細胞培養培地、好ましくは(i)血漿、血清および
/または血小板溶解物、ならびに(ii)トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子(
SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT
3-L)、骨形成タンパク質4(BMP4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インター
ロイキン3(IL3)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)
、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およびインスリン様成長因子1(IGF1)を含
む液体細胞培養培地に関する。
10~100ng/mLのSCF、好ましくは10~50ng/mLのSCF;
10~100ng/mLのTPO、好ましくは10~50ng/mLのTPO;
100~500ng/mLのFLT3-L、好ましくは250~350ng/mLのF
LT3-L;
10~100ng/mLのBMP4、好ましくは10~50ng/mLのBMP4;
50~300ng/mLのVEGF、好ましくは150~250ng/mLのVEGF
;
10~100ng/mLのIL3、好ましくは20~80ng/mLのIL3;
10~100ng/mLのIL6、好ましくは20~80ng/mLのIL6;
1~20ng/mLのIL1、好ましくは1~10ng/mLのIL1;
10~200ng/mLのGCSF、好ましくは50~150ng/mLのGCSF;
および/または、
10~150ng/mLのIGF1、好ましくは10~100ng/mLのIGF1;
を含み得る。
10~100ng/mLのSCF、好ましくは10~50ng/mLのSCF;
10~100ng/mLのTPO、好ましくは10~50ng/mLのTPO;
10~100ng/mLのFLT3-L、好ましくは10~50ng/mLのFLT3
-L;
50~300ng/mLのBMP4、好ましくは150~250ng/mLのBMP4
;
50~300ng/mLのVEGF、好ましくは150~250ng/mLのVEGF
;
10~100ng/mLのIL3、好ましくは20~80ng/mLのIL3;
10~100ng/mLのIL6、好ましくは20~80ng/mLのIL6;
1~20ng/mLのIL1、好ましくは1~10ng/mLのIL1;
10~200ng/mLのGCSF、好ましくは50~150ng/mLのGCSF;
および/または、
1~20ng/mLのIGF1、好ましくは1~10ng/mLのIGF1;
を含む。
ン、好ましくは血漿、血清および/または血小板溶解物、ならびに(ii)インスリンま
たはその代替物、およびトランスフェリンまたはその代替物、好ましくはインスリンおよ
びトランスフェリンを含み得る。具体的には、液体培養培地はさらに、
1%~20%の血漿もしくは血清、好ましくは2%~10%の血漿もしくは血清;また
は0.1%~2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%~1%の血小板溶解物;および
5μg/mL~20μg/mL、好ましくは8μg/mL~12μg/mLのインスリ
ン;および
10μg/mL~100μg/mLのトランスフェリン、好ましくは30μg/mL~
60μg/mLのトランスフェリン;および
を含み得る。
、造血細胞移植片の産生のための、本発明の液体細胞培養培地の使用に関する。
生時に産生される。内皮から造血への移行(EHT)に続き、これらの造血ECは、HS
Cを含む造血細胞(HC)に分化し、循環に入り、胎児の肝臓で増幅され、定着の決定的
な部位であるBMに到達する。発生的造血のこれらの初期ステップは、胚様体(EB)の
培養、特に、造血ECの生成およびHCの出芽に完全に反復する。
向づける、1ステップのベクターフリーおよびストロマフリーのシステム手順を開発した
。標準プロトコルにおいてCD34+CD45+前駆細胞が10日目(D)におけるバー
ストEBからl4日目まで出現したが、本発明者によって適用される培養条件により、D
17胚様体が提供され、バーストのない明確に定義されたコンパクトな球状構造が示され
、したがって、分化プロセスの劇的な遅延を評価した。これらの培養条件は、同様の分化
効能を有する、例えばエピソームまたはレトロウイルスの、それらの再プログラミングプ
ロトコルによって異なる、3つの異なるhiPSC細胞株に適用され、したがって方法の
頑丈さが示された。
が可能な造血幹細胞のトランスクリプトームの生命情報科学分析に基づき、本発明者らは
本明細書中で、高生着能力だけでなく堅牢で長期自己再生能力をも示す初期原始造血幹細
胞のサブ画分を同定し、これらの細胞を造血移植についての理想的な供給源とした。本発
明者らは、Fms様チロシンキナーゼ3受容体(FLT3またはCD135)、および/
またはトロンボポエチン受容体(MPLまたはCD110)および/またはアペリン受容
体(APLNR)の発現によってこのサブ画分を特徴付けることができることを見出した
。
くはインビトロの方法に関し、方法は、
a)造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および
b)細胞表面抗原CD135および/もしくはCD110、ならびに/またはアペリン
受容体(APLNR)の発現に基づいて、好ましくは細胞表面抗原CD110に基づいて
、前記集団の細胞を選別すること、および
c)CD135+および/もしくはCD110+ならびに/またはAPLNR+、好ま
しくはCD110+である細胞を回収すること
を含む。
能である造血幹細胞についての細胞の集団を濃縮する方法、好ましくはインビトロの方法
に関し、方法は、
a)造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および
b)細胞表面抗原CD135および/もしくはCD110、ならびに/またはアペリン
受容体(APLNR)の発現に基づいて、好ましくは細胞表面抗原CD110に基づいて
、前記集団の細胞を選別すること、および
c)CD135+、CD110+および/またはAPLNR+、好ましくはCD110
+である細胞を回収すること
を含む。
、造血移植片として使用され得る、または、前記移植片の効力を改善するために造血移植
片(例えば、骨髄または臍帯血移植)に含まれるか、もしくは添加され得る。
へのサイトカインFlt3リガンド(FLT3L)の結合により活性化されたクラスII
I受容体チロシンキナーゼを指す。ヒトでは、この遺伝子はFLT3遺伝子(遺伝子ID
:2322)によってコードされる。活性化時に、CD135は、骨髄中の造血細胞のア
ポトーシス、増殖、および分化に関与する過程において、複数の細胞質エフェクター分子
をリン酸化および活性化する。この受容体の構成的活性化をもたらす突然変異は、急性骨
髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病をもたらす。
タンパク質としても知られるトロンボポエチン受容体を指す。ヒトでは、CD110は、
MPL(骨髄増殖性白血病ウイルス)癌遺伝子(遺伝子ID:4352)によってコード
される。CD110は、2つの細胞外サイトカイン受容体ドメインおよび2つの細胞内サ
イトカイン受容体ボックスモチーフを有する、635アミノ酸膜貫通ドメインである。そ
のリガンド、すなわちトロンボポエチンは、巨核球形成および血小板形成の主要な調節因
子であることが示された。
ンと結合するGタンパク質共役受容体を指す。この受容体は、グルコース代謝において、
胚および腫瘍血管新生において、および、ヒト免疫不全ウイルスコレセプターとして、心
血管系および中枢神経系にて関与することが示された。ヒトでは、この受容体は、APL
NR遺伝子(遺伝子ID:187)によってコードされる。
に使用するエクスビボでの細胞産物を指す。造血細胞移植片は、動員末梢血、胎盤血、臍
帯血、羊水、骨髄、肝臓および/または脾臓から得られた造血幹細胞、ならびに、不死化
HSC、ならびに/または、多能性幹細胞(例えば、人工多能性幹細胞)および/もしく
は胚性幹細胞の分化から得られたHSCを含み得る。
始HSCを含む。
再生の両方の能力を有する細胞を指す。多能性は、すべての機能的血液細胞、例えばB細
胞、T細胞、NK細胞、リンパ樹状細胞、骨髄樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、巨核
球および赤血球細胞に分化する能力である。自己再生は、分化せずにHSC自体を生じさ
せる能力である。
SCの前駆体であって多能性および自己再生の両方の能力を有するHSCを指す。初期原
始HSCは、内皮から造血への移行が可能な造血内皮に属し、CD34-/CD45-ま
たはCD34+/CD45-であり得る。初期原始HSCはまた、CXCR4を発現し得
、および/または、初期造血コミットメント(例えばHOXB4、c-MYCおよびMI
TF)、自己再生(例えばHOXA9、ERGおよびRORA)および幹細胞性(例えば
SOX4およびMYB)に関与する遺伝子のアップレギュレーションを示し得、および/
または、長期培養開始細胞(LTC-IC)、すなわち、骨髄(BM)ストロマでの5~
8週間(35~60日)の培養の後、コロニー形成単位細胞(CFU)を生成することが
できるHSCであり得る(MillerおよびEaves、Methods Mol M
ed.2002;63:123-41)。いくつかの好ましい実施形態では、用語「初期
原始HSC」は、CD34-/CD45-またはCD34+/CD45- LTC-IC
細胞を指す。いくつかの他の実施形態において、用語「初期原始HSC」はまた、CD3
4+/CD45+またはCD34-/CD45+ LTC-IC細胞を指し得る。
および/もしくは脾臓から得られるHSC、不死化HSC、多能性幹細胞ならびに/また
は胚性幹細胞を含み得る。
水、骨髄、肝臓および/または脾臓から得られる細胞、好ましくは、末梢血、胎盤血、臍
帯血および/または骨髄から得られる細胞を含む、またはそれらからなる。具体的には、
ステップa)で提供される細胞の集団は、末梢血、胎盤血、臍帯血、羊水、骨髄、肝臓ま
たは脾臓から得られる細胞の集団、好ましくは、末梢血、胎盤血、臍帯血または骨髄から
得られる細胞の集団であり得る。
れるプロセスを介して血液から収集され得る。末梢幹細胞の収率は、末梢循環へのドナー
の骨髄からの幹細胞の遊走を刺激する化合物の投与でブーストされ得る。このような化合
物は、例えば顆粒球コロニー刺激因子、またはMozobil(プレリキサフォル)を含
む。このような処置の後、末梢血は通常、「動員末梢血」と命名される。
大型針を通して、被験体の大きな骨、典型的には骨盤から取り出される。
得られ得る。臍帯血または胎盤血は、成人の血液中に通常、見られるよりもHSCの濃度
が高い。
くは、動員末梢血、骨髄、臍帯血または胎盤血のサンプルである。
はヒト不死化HSCを含む、またはそれらからなる。HSCは、β-カテニンのレトロウ
イルス媒介遺伝子導入などの当業者に公知の任意の方法を用いて不死化され得る(Tem
plinら、Exp Hematol.2008 Feb:36(2)204-15)。
しくは、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞から選択されるもの、より好ましくは、人工
多能性幹細胞のインビトロ分化から得られるHSCを含む、またはそれらからなる。
は、胚性幹細胞は、非ヒト胚性幹細胞である。別の実施形態では、胚性幹細胞は、方法自
体またはいずれの関連作用もヒト胚の破壊を含まないとの条件で、ヒト胚性幹細胞である
。
持することができる、または、外胚葉、内胚葉および中胚葉の3つのすべての胚葉由来の
系統に沿って成熟するように方向づけられることができる。hESCは、インビトロでの
不確定の増殖能を有し、造血細胞運命に分化することが示され、種々の分化手順を用いて
赤血球、骨髄、およびリンパ系統を生じさせる(Bhatia、Hematology
Am Soc Hematol Educ Program.2007:11-6)。
iPSC)の分化から、好ましくはヒトiPSCの分化から得られるHSCを含む、また
は、それらからなる。
知られるプロセスによって、細胞を多能性にするのに少数の特定の遺伝子の導入を必要と
するのみである。遺伝子の種々の組み合わせにより、Oct4/Sox2/Nanog/
Lin28またはOct4/Sox2/KLF/cMycなどの細胞を多能性にすること
が示された。iPSCの使用の1つの利点は、胚細胞使用の完全回避できることで、した
がって、それに伴うすべての倫理的問題の完全回避である。
好ましくは、iPSCは、処置すべき被験体、具体的にはこの被験体の線維芽細胞に由来
する。
ulatovら(Cell Stem Cell.2013 Oct 3;13(4):
10.1016)またはSandlerら(Nature.2014 Jul 17;5
11(7509):312-8)に記載された任意の方法などの、当業者に公知の任意の
方法を使用して、HSC、より具体的には初期原始HSCに分化され得る。
多能性幹細胞、具体的にはiPSCまたは胚性幹細胞、好ましくはヒトiPSCまたは
ヒト胚性幹細胞、より好ましくはヒトiPSCを提供すること、
胚様体(EB)の形成を誘導すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地でEBを培養すること、
および
EB細胞を解離すること
をさらに含み、
それにより、本発明の方法のステップa)で提供される上記のような細胞の集団を取得
する。
得る。例えば、多能性幹細胞は、コラゲナーゼIVで処理され、液体培養培地中の低接着
プレートに移され得る。
胚様体を培養することによって得られる。この液体培養培地は、胚様体の形成中に使用さ
れる培養培地と同じであり得る。
り(例えば、Lapillonneら、haematological、2010;95
(10)、Doulatovら、Cell Stem Cell.2013、13(4)
を参照)、本発明において使用することができる。
地が、バーストなしに明確に定義されたコンパクトな球状構造を呈する分化した胚様体を
提供することを見出した。したがって、特定の実施形態において、内皮造血系統への多能
性幹細胞の分化を誘発する培養培地は、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TP
O)、FMS様チロシンキナーゼ3(FLT3)リガンド、骨形成タンパク質4(BMP
4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキ
ン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)
およびインスリン様成長因子1(IGF1)を含む。この培養培地はさらに、血漿、血清
、血小板溶解物、血清アルブミン、トランスフェリンもしくはその代替物、および/また
はインスリンもしくはその代替物、好ましくは(i)血漿、血清、および/または血小板
溶解物、ならびに(ii)トランスフェリンおよびインスリンを含み得る。
以下に説明する本発明の培養培地である。
しくは17日間、液体培養培地で培養される。好ましい実施形態では、胚様体は、14~
19日間、より好ましくは15~18日間、さらに好ましくは17日間、以下に説明され
る本発明の液体培養培地中で培養される。
ベーション、または当業者に公知の任意の他の方法により、解離される。
には初期原始HSCを含み、本発明の方法のステップa)で提供され得る。
によって、例えば、Liuら、Methods Mol Biol.2013;946:
241-56に記載のような長期培養開始細胞(LTC-IC)アッセイを用いて、評価
され得る。
には、細胞は、必要に応じてDMSOなどの低温保存剤の存在下で、長期間、凍結保存さ
れることができる。
な集団の細胞は、細胞表面抗原CD135および/もしくはCD110の発現、ならびに
/またはAPLNRの発現に基づいて選別される。
た基準に従ってグループに細胞を分離する操作を指す。蛍光活性化細胞選別(FACS)
または磁気活性化細胞選別(MACS)を含むがこれらに限定されない、指定された基準
に従って細胞を分離する当業者に公知の任意の方法が使用され得る。本明細書で使用する
場合、特定のタンパク質、例えば細胞表面抗原「の発現に基づく選別」との表現は、前記
タンパク質を発現する細胞および前記タンパク質を発現しない細胞を分離する操作を指す
。好ましい実施形態において、CD135、CD110またはAPLNRの発現は、細胞
の表面で検出される。しかし、mRNAを検出する方法(例えばRT-PCR)などの、
当業者に公知であって、この発現の検出を可能にする任意の他の方法が使用され得る。
細胞表面抗原CD135およびCD110の発現、ならびに、必要に応じてAPLNR
の発現、または、
細胞表面抗原CD135の発現、ならびに、必要に応じてAPLNRおよびCD110
の発現、または、
細胞表面抗原CD135の発現、および、必要に応じてAPLNRの発現、または、
細胞表面抗原CD135の発現、および、必要に応じてCD110の発現、または、
細胞表面抗原CD110の発現、および、必要に応じてAPLNRの発現、または、
細胞表面抗原CD110の発現、および、必要に応じて細胞表面抗原CD135の発現
、または、
細胞表面抗原CD110の発現、ならびに、必要に応じてAPLNRおよびCD135
の発現、または、
細胞表面抗原CD135およびCD110の発現、ならびに、APLNRの発現、また
は、
細胞表面抗原CD135の発現、および、APLNRの発現、または、
細胞表面抗原CD110の発現、および、APLNRの発現。または、
APLNRの発現、ならびに、必要に応じて細胞表面抗原CD135およびCD110
の発現、または、
APLNRの発現、および、必要に応じて細胞表面抗原CD135の発現、または、
APLNRの発現、および、必要に応じて細胞表面抗原CD110の発現
に基づいて選別され得る。
現に基づいて選別される実施形態では、これらのマーカのそれぞれに基づく選択は、同時
または任意の順序で、連続的であり得る。
/またはCD110、好ましくはCD135またはCD110の発現に基づいて選別され
る。好ましい実施形態では、ステップb)において、細胞は、細胞表面抗原CD110の
発現、必要に応じて細胞表面抗原CD135の発現に基づいて選別される。これらの実施
形態では、方法はさらに、ステップb)の前、後、またはそれと同時に、APLNRの発
現に基づいて細胞を選別することを含み得る。
び/またはAPLNR+である細胞を回収する。
の発現を指す。例えば、CD135+細胞は、細胞表面抗原CD135を発現する細胞で
あり、CD110+/APLNR+細胞は、細胞表面抗原CD110およびAPLNRを
発現する細胞である。逆に、用語「-」は、好ましくは細胞表面での、関心対象のマーカ
の発現の欠如を指す。例えば、CD135-細胞は、細胞表面抗原CD135を発現しな
い細胞であり、CD110+/APLNR-細胞は、細胞表面抗原CD110を発現する
がAPLNRを発現しない細胞である。
たは同時であり得る。
CD110+細胞、APLNR+細胞、CD135+/CD110+細胞、CD135+
/APLNR+細胞、CD110+/APLNR+細胞、またはCD135+/CD11
0+/APLNR+細胞であり得る。好ましくは、細胞は、CD110+細胞、CD13
5+/CD110+細胞、CD110+/APLNR+細胞、またはCD135+/CD
110+/APLNR+細胞である。
用され得る。
R+ HSCについての細胞産物を濃縮するために、CD135、CD110および/ま
たはAPLNRの発現に基づく、いくつかの連続する選別ステップを含み得る。
SOなどの低温保存剤の存在下で、短期または長期にわたって凍結保存され得る。
よび自己再生が可能である、造血幹細胞を同定および/または選択する方法、好ましくは
インビトロの方法に関し、方法は、
a)造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および、
b)細胞表面抗原CD135および/もしくはCD110の発現、ならびに/またはア
ペリン受容体(APLNR)の発現について、好ましくは、細胞表面抗原CD110の発
現について前記細胞を評価すること、および、
c)CD135+および/もしくはCD110+ならびに/またはAPLNR+、好ま
しくはCD110+である細胞を同定および/または選択すること
を含む。
の態様に包含される。
ン受容体(APLNR)の発現は、FACS、MACS、免疫組織化学、ウェスタンブロ
ット、タンパク質もしくは抗体アレイ、RT-PCRまたはトランスクリプトームアプロ
ーチなどの当業者に公知の任意の方法によって評価され得る。
れば、ステップb)およびc)は、連続的または同時であり得る。例えば、FACSまた
はMACSを使用すると、発現の検出および選択は同時であり得る。
または選択された細胞は、造血移植片として使用され得、前記移植片の効力を改善するた
めに造血移植片に含まれ、またはそれに添加され得る(例えば、骨髄または臍帯血移植)
。
法、好ましくはインビトロ方法に関し、方法は、
多能性幹細胞、具体的にはiPSCまたは胚性幹細胞、好ましくはヒトiPSCまたは
ヒト胚性幹細胞、より好ましくはヒトiPSCを提供すること、
胚様体(EB)形成を誘導すること、
内皮造血系統への多能性幹細胞の分化を誘発する液体培養培地でEBを培養すること、
EB細胞を解離すること、
細胞表面抗原CD135および/もしくはCD110、ならびに/またはアペリン受容
体(APLNR)の発現に基づいて、好ましくは細胞表面抗原CD110に基づいて解離
EB細胞を選別すること、および、
CD135+、CD110+および/またはAPLNR+、好ましくはCD110+で
ある細胞を回収すること
を含む。
の態様に包含される。
ち、長期多系統生着および自己再生が可能である造血幹細胞を指す。
(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3(FLT3)リ
ガンド、骨形成タンパク質4(BMP4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロ
イキン3(IL3)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)、
顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およびインスリン様成長因子1(IGF1)を含む
。この培養培地はさらに、血漿、血清、血小板溶解物、血清アルブミン、トランスフェリ
ンもしくはその代替物、および/またはインスリンもしくはその代替物、好ましくは(i
)血漿、血清および/または血小板溶解物、ならびに(ii)トランスフェリンおよびイ
ンスリンを含み得る。
以下で説明される本発明の培養培地である。
しくは17日間、液体培養培地で培養される。好ましい実施形態では、胚様体は、14~
19日間、より好ましくは15~18日間、さらに好ましくは17日間、以下で説明され
る本発明の液体培養培地で培養される。
+ HSCは、インビボでの多系統造血再構成および自己再生をサポートする長期多能H
SCであり、したがって、HSC移植についての細胞の優れた供給源を構成する。
体的には、長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞のマーカとしてのCD13
5、CD110および/またはAPLNRの使用に関する。
たは造血移植結果および/もしくは性能を予測するためのマーカとしての、CD135、
CD110および/またはAPLNRの使用に関する。
に関し、方法は、CD135、CD110および/またはAPLNRを発現するHSCの
存在または不在、好ましくはCD110を発現するHSCの存在または不在、すなわち、
長期多系統生着および自己再生が可能な細胞の存在または不在について、造血細胞移植片
を評価することを含み、前記細胞の不在は、低効力または効力欠如を示す。逆に、CD1
35、CD110および/またはAPLNRを発現するHSCの存在は、良好な効力を示
すと考えることができる。
の能力、具体的には、移植の際にインビボでの多系統造血再構成および自己再生を提供す
る、すなわち、移植患者における免疫造血系を再生する造血細胞産物の能力を指す。
果、CD135、CD110および/またはAPLNRを発現するHSCをまったく含ま
ない造血細胞移植片は、移植に使用されるべきではない。
、方法は、CD135、CD110および/またはAPLNRを発現する、好ましくはC
D110を発現するHSCの存在または不在を造血細胞移植片において検出することを含
み、前記細胞の不在は、予後不良、すなわち、移植不全のリスクが高いことを示す。逆に
、CD135、CD110および/またはAPLNRを発現するHSCの存在は、予後良
好を示すものと考えることができる。
植不全の高リスク、すなわち、移植が移植患者における免疫造血系を再生できない高リス
クを指す。逆に、用語「予後良好」は、患者の生存率増加および移植成功確率増加、すな
わち、移植が移植患者における免疫造血系の再生を可能にする確率の増加を指す。
の方法に関し、方法は、CD135、CD110および/またはAPLNRを発現する、
好ましくはCD110を発現するHSCの存在または不在を造血細胞移植片において検出
することを含み、前記細胞の不在は、乏しい移植可能性、すなわち移植不全の高リスクを
示す。逆に、CD135、CD110および/またはAPLNRを発現するHSCの存在
は、良好な移植可能性、すなわち移植成功確率の増加を示すものと考えることができる。
は、当業者に公知のまたは上述の任意の方法によって評価され得る。例えば、CD135
+、CD110+および/またはAPLNR+細胞は、蛍光活性化細胞選別(FACS)
、磁気活性化細胞選別(MACS)、またはCD135、CD110またはAPLNRに
対して向けられた抗体を使用する任意の免疫学的検査を使用して検出され得る。CD13
5、CD110またはAPLNRに対するモノクローナル抗体は市販されている。
は造血細胞移植片の生着可能性を予測する方法は、総生存有核細胞数(TNC)のカウン
ト、および/または生存可能なCD34+細胞総数の測定、および/または刺激性成長因
子を補充したメチルセルロースベース培養培地中で造血細胞コロニーを産生可能な機能性
前駆細胞の数の測定(CFUアッセイ)、および/またはLTC-IC頻度の測定などの
、日常的に当業者によって使用される任意の他の表現型または機能的アッセイを含み得る
。
に関する。
70%がCD135+、CD110+および/またはAPLNR+造血幹細胞、好ましく
はCD110+造血幹細胞である造血細胞移植片と、薬学的に許容可能なキャリアとに関
する。好ましくは、造血細胞移植片の細胞の少なくとも70%、75%、80%、85%
、90%、95%または99%が、CD135+、CD110+および/またはAPLN
R+造血幹細胞、好ましくはCD110+造血幹細胞である。より好ましくは、造血細胞
移植片の細胞の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%または99
%が、CD135+および/またはCD110+ HSC、好ましくCD110+ HS
Cである。
公知のまたは本明細書に記載の任意の方法を用いて容易に決定され得る。
ける使用について欧州薬局方などの規制機関または認知された薬局方による承認を意味す
る。用語「キャリア」または「賦形剤」は、細胞が投与される希釈剤、アジュバント、キ
ャリア、またはビヒクルを指す。当技術分野で公知のように、薬学的に許容可能な賦形剤
は、比較的に不活性な物質、好ましくは当業者に公知の注射可能な物質である。
の態様に包含される。
される造血における欠陥に関連するさまざまな障害の処置に使用するため、具体的には、
悪性または非悪性疾患の処置のための、本発明の造血細胞移植片に関する。
陥に関連する障害の処置のため、具体的には、悪性または非悪性疾患の処置のために、医
薬を調製するための本発明の造血細胞移植片の使用に関する。
欠陥に関連する障害の処置のため、具体的には、悪性または非悪性疾患の処置のための方
法に関し、方法は、それを必要とする被験体において、その被験体に有効量の本発明の造
血細胞移植片を投与することを含む。
陥に関連する障害の処置のため、具体的には、悪性または非悪性疾患の処置のための方法
に関し、方法は、それを必要とする被験体において、上述した本発明の方法による造血細
胞移植片の効力を評価すること、および、効力が良好であれば被験体に有効量の前記造血
細胞移植片を投与することを含む。
て、または本発明の造血細胞移植片について、上述したすべての実施形態はまた、この態
様に包含される。
、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、骨髄異
形成症候群、骨髄増殖性障害、慢性リンパ球性白血病、若年性慢性骨髄性白血病、神経芽
細胞腫、卵巣癌および生殖細胞腫瘍が挙げられる。
、再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿症、ファンコーニの貧血、ブラックファン・ダイ
アモンド貧血、重症型サラセミア、鎌状赤血球貧血、重症複合免疫不全症、ウィスコット
・アルドリッチ症候群および先天性代謝異常が挙げられる。
、成人、子供、および出生前段階のヒトを含むヒトを指す。
患の治療、防止、予防および遅滞などの患者の健康状態を改善することを意図する任意の
行為を指す。特定の実施形態では、そのような用語は、疾患または疾患に関連する症状の
改善または根絶を指す。他の実施形態では、この用語は、そのような疾患を有する被験体
への1つ以上の治療薬の投与に起因する疾患の拡散または悪化を最小限にすることを指す
。いくつかの実施形態では、この用語は、移植患者における免疫造血系の再生を指し得る
。
である被験体に投与される造血細胞移植片の量を意図する。いくつかの実施形態では、こ
の用語は、移植患者における免疫造血系を再生するのに必要な造血細胞移植片の量を指し
得る。
される疾患に応じて、造血細胞移植片におけるCD135+、CD110+および/また
はAPLNR+細胞の割合に応じて変化し得る。
5~6.106のCD135+、CD110+および/またはAPLNR+細胞/患者体
重kgを投与する。特定の実施形態では、105~106、好ましくは1.105~5.
105のCD135+および/またはCD110+細胞、好ましくはCD110+細胞/
患者体重kgを投与する。別の具体的な実施形態では、106~107、好ましくは3.
106~8.106のAPLNR+細胞/患者体重kgを投与する。
放射線療法または手術などの他の療法と組み合わせて使用され得る。
疫系を刺激する治療処置を指す。それは、(例えば、癌ワクチンを投与することによる)
特定の抗原を有する患者の免疫、サイトカインなどの免疫系を刺激する分子の投与、また
は薬物などの治療抗体の投与を含む。
ンマ線、アルファ粒子、ベータ粒子、光子、電子、中性子、放射性同位元素、および電離
放射線の他の形態などのさまざまな種類の放射線の使用を含む複数の種類の放射線療法を
指すために当技術分野で一般に使用される用語である。具体的には、放射線療法を、幹細
胞移植の前に骨の痛みを緩和するためにまたは全身照射のために、骨髄の外に広がってい
るかもしれない疾患を治療するために使用することができる。
ルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、シタラビン、アスパラギ
ナーゼ、エトポシド、テニポシド、メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロホスフ
ァミド、プレドニゾン、デキサメタゾン、ブスルファン、ヒドロキシ尿素またはインター
フェロンアルファ、または任意の他の関連する化学療法を含み得る。
る場合、「同種異系移植」は、遺伝的にレシピエントとは非同一であるが同じ種であるド
ナーに由来または起因する細胞の移植を指す。「自家移植」は、同じ被験体に由来または
起因する細胞の移植を指す。ドナーおよびレシピエントが同一の人である。「同系移植」
は、レシピエントと遺伝的に同一であるドナーに由来または起因する細胞の移植を指す。
され、HSC、具体的にはCD135+、CD110および/またはAPLNR+細胞は
、処置される被験体に起因する人工多能性幹細胞に由来する。
が意図され、HSC、具体的にはCD135+、CD110および/またはAPLNR+
細胞は、胎盤血または臍帯血に由来する。
造血系統への分化プロセスが遅延される液体細胞培養培地を開発した。この培養培地は、
したがって、GMPグレード培養条件下での、インビボでの長期多系統生着および自己再
生が可能な初期原始造血幹細胞、すなわちCD135+、CD110+および/またはA
PLNR+ HSCの産生および選択を可能とする。
び/または血清アルブミン、ならびに(ii)トランスフェリンまたはその代替物、イン
スリンまたはその代替物、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS
様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3-L)、骨形成タンパク質4(BMP4)、血
管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン6(I
L6)、インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およびイ
ンスリン様成長因子1(IGF1)を含む、または本質的にそれらからなる液体細胞培養
培地に関する。好ましくは、液体細胞培養培地は、(i)血漿、血清および/または血小
板溶解物、ならびに(ii)トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子(SCF)、ト
ロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3-L)、骨
形成タンパク質4(BMP4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(
IL3)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロ
ニー刺激因子(GCSF)およびインスリン様成長因子1(IGF1)を含む、または本
質的にそれらからなる。
胞、より具体的にはヒト細胞の成長を維持しやすいベース培養培地を含む、任意の培養培
地、具体的には、任意の液体培養培地に関する。ベース培養培地は、当業者に公知である
。
溶解物および/または血清アルブミン、好ましくは血漿、血清および/または血小板溶解
物、ならびに(ii)トランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン
、インスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、幹細胞因子(SCF)、トロン
ボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3-L)、骨形成
タンパク質4(BMP4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL
3)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロニー
刺激因子(GCSF)およびインスリン様成長因子1(IGF1)を含み、任意の他のサ
イトカインまたは成長因子を含まない培養培地を指す。
よび/または血清アルブミン、好ましくは血漿、血清および/または血小板溶解物、なら
びに、(ii)トランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、イン
スリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエ
チン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3-L)、骨形成タンパ
ク質4(BMP4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL3)、
インターロイキン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロニー刺激因
子(GCSF)およびインスリン様成長因子1(IGF1)が付加されたベース培養培地
として、グルタミンまたはグルタミン含有ペプチドで必要に応じて補完されたイスコフ改
変ダルベッコ培地(IMDM)を含む。
好ましくは8μg/mL~12/mL、さらにより好ましくは約10μg/mLのインス
リンを含む。好ましい実施形態では、インスリンは、ヒトインスリン、好ましくはヒト組
換えインスリンである。
公知の任意の化合物とすることができる。具体的には、この代替物は、小分子またはアプ
タマー作用物資などの任意のインスリン受容体作用物資とすることができる。小分子イン
スリン受容体作用物資は、例えば、Qiangら、Diabetes.2014 Apr
;63(4):1394-409に記載され、アプタマー作用物資は、例えば、Yunn
ら、Nucleic Acids Res.2015 Sep 18;43(16):7
688-701に記載されている。好ましくは、インスリンは、Wongら、Cytot
echnology.2004 Jul;45(3):107-15に記載されているよ
うに、亜鉛塩で置換される。亜鉛塩の例としては、これらに限定されないが、塩化亜鉛、
硝酸亜鉛、臭化亜鉛または硫酸亜鉛が挙げられる。好ましい実施形態では、インスリン代
替物は亜鉛塩である。インスリン代替物の濃度は、前記化合物の性質に依存し、当業者に
よって容易に決定することができる。
リン、好ましくは30μg/mL~60μg/mLのトランスフェリン、さらにより好ま
しくは約45μg/mLのトランスフェリンを含む。好ましい実施形態では、トランスフ
ェリンは、鉄飽和ヒトトランスフェリン、好ましくは組換え鉄飽和ヒトトランスフェリン
である。
ことが当業者に公知の任意の化合物とすることができる。具体的には、トランスフェリン
は、クエン酸第二鉄、硝酸第二鉄または硫酸第一鉄などの鉄キレート剤または無機の鉄塩
で置換され得る。適切な鉄キレート剤の例としては、これらに限定されないが、エチレン
ジアミン四酢酸(EDTA)、グリコールエーテルシアミン四酢酸(エグタジン酸)(E
GTA)、メシル酸デフェロキサミン、ジメルカプロールまたはペンテト酸(DPTA)
が挙げられる。トランスフェリン代替物の濃度は、前記化合物の性質に依存し、当業者に
よって容易に決定することができる。
漿、血清および/または血小板溶解物、より好ましくは血漿または血清または血小板溶解
物または血清アルブミン、さらにより好ましくは血漿または血清または血小板溶解物を含
み得る。培養培地は、1%~20%の血漿または血清、好ましくは2%~10%の血漿ま
たは血清、より好ましくは約5%の血漿または血清を含み得る。好ましい実施形態におい
て、血漿または血清は、ヒト血漿または血清である。あるいは、またはさらに、培養培地
は、0.1%~2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%~1%の血小板溶解物、より好
ましくは約0.5%の血小板溶解物を含み得る。好ましい実施形態では、血小板溶解物は
、ヒト血小板溶解物である。あるいは、またはさらに、培養培地は、0.1%~2%の血
清アルブミン、好ましくは0.5%~1%の血清アルブミンを含み得る。好ましい実施形
態において、血清アルブミンは、ヒト血清アルブミンである。
好ましくは10ng/mL~50ng/mLのSCF、さらにより好ましくは約24ng
/mLのSCFを含む。好ましい実施形態では、SCFは、ヒトSCF、好ましくは組換
えヒトSCFである。
好ましくは10ng/mL~50ng/mLのTPO、さらにより好ましくは約21ng
/mLのTPOを含む。好ましい実施形態では、TPOは、ヒトTPO、好ましくは組換
えヒトTPOである。
、より好ましくは10ng/mL~50ng/mLのFLT3-L、さらにより好ましく
は約21ng/mLのFLT3-Lを含む。好ましい実施形態では、FLT3-Lは、ヒ
トFLT3-L、好ましくは組換えヒトFLT3-Lである。
り好ましくは150ng/mL~250ng/mLのBMP4、さらにより好ましくは約
194ng/mLのBMP4を含む。好ましい実施形態では、BMP4は、ヒトBMP4
、好ましくは組換えヒトBMP4である。
り好ましくは150ng/mL~250ng/mLのVEGF、さらにより好ましくは約
200ng/mLのVEGFを含む。好ましい実施形態では、VEGFは、ヒトVEGF
、好ましくは組換えヒトVEGF、より好ましくは組換えヒトVEGF-A165である
。
好ましくは20ng/mL~80ng/mLのIL3、さらにより好ましくは約50ng
/mLのIL3を含む。好ましい実施形態では、IL3は、ヒトIL3、好ましくは組換
えヒトIL3である。
好ましくは20ng/mL~80ng/mLのIL6、さらにより好ましくは約50ng
/mLのIL6を含む。好ましい実施形態では、IL6は、ヒトIL6、好ましくは組換
えヒトIL6である。
しくは1ng/mL~10ng/mLのIL1、さらにより好ましくは約5ng/mLの
IL1を含む。好ましい実施形態では、IL1は、ヒトIL1、好ましくは組換えヒトI
L1である。
り好ましくは50ng/mL~150ng/mLのGCSF、さらにより好ましくは約1
00ng/mLのGCSFを含む。好ましい実施形態では、GCSFは、ヒトGCSF、
好ましくは組換えヒトGCSFである。
ましくは1ng/mL~10ng/mLのIGF1、さらにより好ましくは約5ng/m
LのIGF1を含む。好ましい実施形態では、IGF1は、ヒトIGF1、好ましくは組
換えヒトIGF1である。
1%~20%の血漿もしくは血清、好ましくは2%~10%の血漿もしくは血清、また
は、0.1%~2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%~1%の血小板溶解物、または
、0.1%~2%の血清アルブミン、好ましくは0.5%~1%の血清アルブミン、およ
び/または、
5μg/mL~20μg/mLのインスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン
、好ましくは8μg/mL~12/mLのインスリンまたはその代替物、好ましくはイン
スリン、および/または、
10μg/mL~100μg/mLのトランスフェリンまたはその代替物、好ましくは
トランスフェリン、好ましくは30μg/mL~60μg/mLのトランスフェリンまた
はその代替物、好ましくはトランスフェリン、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのSCF、好ましくは10ng/mL~50ng/
mLのSCF、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのTPO、好ましくは10ng/mL~50ng/
mLのTPO、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのFLT3-L、好ましくは10ng/mL~50
ng/mLのFLT3-L、および/または、
100ng/mL~500ng/mLのBMP4、好ましくは150ng/mL~25
0ng/mLのBMP4、および/または、
50ng/mL~300ng/mLのVEGF、好ましくは150ng/mL~250
ng/mLのVEGF、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのIL3、好ましくは20ng/mL~80ng/
mLのIL3、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのIL6、好ましくは20ng/mL~80ng/
mLのIL6、および/または、
1ng/mL~20ng/mLのIL1、好ましくは1ng/mL~10ng/mLの
IL1、および/または、
10ng/mL~200ng/mLのGCSF、好ましくは50ng/mL~150n
g/mLのGCSF、および/または、
1ng/mL~20ng/mLのIGF1、好ましくは1ng/mL~10ng/mL
のIGF1
を含む。
1%~20%の血漿もしくは血清、好ましくは2%~10%の血漿もしくは血清、また
は、0.1%~2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%~1%の血小板溶解物、および
/または、
5μg/mL~20μg/mLのインスリン、好ましくは8μg/mL~12μg/m
Lのインスリン、および/または、
10μg/mL~100μg/mLのトランスフェリン、好ましくは30μg/mL~
60μg/mLのトランスフェリン、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのSCF、好ましくは10ng/mL~50ng/
mLのSCF、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのTPO、好ましくは10ng/mL~50ng/
mLのTPO、および/または、
100ng/mL~500ng/mLのFLT3-L、好ましくは250ng/mL~
350ng/mLのFLT3-L、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのBMP4、好ましくは10ng/mL~50ng
/mLのBMP4、および/または、
50ng/mL~300ng/mLのVEGF、好ましくは150ng/mL~250
ng/mLのVEGF、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのIL3、好ましくは20ng/mL~80ng/
mLのIL3、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのIL6、好ましくは20ng/mL~80ng/
mLのIL6、および/または、
1ng/mL~20ng/mLのIL1、好ましくは1ng/mL~10ng/mLの
IL1、および/または、
10ng/mL~200ng/mLのGCSF、好ましくは50ng/mL~150n
g/mLのGCSF、および/または、
10ng/mL~150ng/mLのIGF1、好ましくは10ng/mL~100n
g/mLのIGF1
を含む。
1%~20%の血漿もしくは血清、好ましくは2%~10%の血漿もしくは血清、また
は、0.1%~2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%~1%の血小板溶解物、および
/または、
5μg/mL~20μg/mLのインスリン、好ましくは8μg/mL~12μg/m
Lのインスリン、および/または、
10μg/mL~100μg/mLのトランスフェリン、好ましくは30μg/mL~
60μg/mLのトランスフェリン、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのSCF、好ましくは10ng/mL~50ng/
mLのSCF、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのTPO、好ましくは10ng/mL~50ng/
mLのTPO、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのFLT3-L、好ましくは10ng/mL~50
ng/mLのFLT3-L、および/または、
100ng/mL~500ng/mLのBMP4、好ましくは150ng/mL~25
0ng/mLのBMP4、および/または、
50ng/mL~300ng/mLのVEGF、好ましくは150ng/mL~250
ng/mLのVEGF、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのIL3、好ましくは20ng/mL~80ng/
mLのIL3、および/または、
10ng/mL~100ng/mLのIL6、好ましくは20ng/mL~80ng/
mLのIL6、および/または、
1ng/mL~20ng/mLのIL1、好ましくは1ng/mL~10ng/mLの
IL1、および/または、
10ng/mL~200ng/mLのGCSF、好ましくは50ng/mL~150n
g/mLのGCSF、および/または、
1ng/mL~20ng/mLのIGF1、好ましくは1ng/mL~10ng/mL
のIGF1
を含む。
しくは血清または約0.5%の血小板溶解物、および(ii)約10μg/mLのインス
リン、約45μg/mLのトランスフェリン、約22ng/mLのSCF、約20ng/
mLのTPO、約300ng/mLのFLT3-L、約22ng/mLのBMP4、約2
00ng/mLのVEGF、約50ng/mLのIL3、約50ng/mLのIL6、約
5ng/mLのIL1、約100ng/mLのGCSFおよび約50ng/mLのIGF
1を含む。
もしくは血清または約0.5%の血小板溶解物、および(ii)約10μg/mLのイン
スリン、約45μg/mLのトランスフェリン、約24ng/mLのSCF、約21ng
/mLのTPO、約21ng/mLのFLT3-L、約194ng/mLのBMP4、約
200ng/mLのVEGF、約50ng/mLのIL3、約50ng/mLのIL6、
約5ng/mLのIL1、約100ng/mLのGCSFおよび約5ng/mLのIGF
1を含む。
、好ましくは0.5U/mL~5U/mLのヘパリン、より好ましくは2U/mL~4U
/mLのヘパリン、さらにより好ましくは約3U/mLのヘパリンを含む。
または分化のための、胚様体の分化のための、造血細胞移植片の産生のための、本発明の
液体細胞培養培地の使用に関する。
造血系統に細胞をコミットさせる細胞特性の培養培地中で培養される細胞による獲得を指
す。本明細書で使用する場合、用語「造血系統の細胞」は、哺乳動物の、具体的にはヒト
の血液中に見出される細胞を指す。
らびに、CD135+、CD110+および/またはAPLNR+ HSCなどの初期原
始HSCを含むHSCの成長および/または分化について特に有用である。
、それらが本明細書の明白な教示と矛盾しない程度において、すべての図および表を含め
、その全体が参照として援用される。
材料および方法
hiPSC増幅
本研究は、3つの異なるhiPSC株:レトロウイルスベクターおよびトムソンの組み
合わせで再プログラムされたFD136-25(Oct4、Sox2、Nanogおよび
Lin28の内因性発現);エピソームで再プログラムされたPci-1426およびP
ci-1432株(Phenocell社)(Sox2、Oct4、KLF、cMyc)
、を用いて行った。hiPSCは、TESR2培地(Stem Cell Techno
logies社、Bergisch Gladbach、Germany)において、C
ellStart(Invitrogen社、Carlsbad、USA)で維持し、細
胞を、TRYpleセレクト(Invitrogen社)での標準クランプ継代を使用し
て5日ごとに新たにコーティングされたプレート上に1:6で継代した。
24時間後、細胞を、24ng/mLのSCF、21ng/mLのTPO、21ng/
mLのFLT3L、194ng/mLのBMP4、200ng/mLのVEGF、50n
g/mLのIL3、50ng/mLのIL6、5ng/mLのIL1、100ng/mL
のGCSF、5ng/mLのIGF1を含む分化培地に移した(PeproTech社、
Neuilly-sur-seine、フランス)。培地は1日おきに交換された。EB
は、15、16、17日目に解離させた。
示された時間において、1×105の解離EB細胞または3×l04の異種移植レシピ
エントBMからの細胞を、SCF、IL-3、EPOおよびGM-CSFの存在下で3m
Lの完全メチルセルロース培地中に播種した(PeproTech社、Neuilly-
sur-seine、フランス)。G-CSFがまたマウス前駆細胞を刺激するので、そ
れは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)で置換された。混合物のア
リコート(1mL)を2回、1つの30mmシャーレに分配し、14日間、加湿チャンバ
中で維持した。コロニー形成細胞(CFC)は、14日目にスコアリングされた。
長期培養開始細胞(LTC-IC)アッセイを、EBについて17日目に、対照CD3
4+について0日目に、15~100,000細胞/ウェルで、前述のように実施した(
例えば、MillerおよびEaves、Hematopoietic Stem Ce
ll Protocols、Methods in Molecular Medici
neシリーズのVolume 63 pp123-141を参照されたい)。絶対LTC
-ICカウントは、ポアソン統計を用いて37%の陰性ウェルをもたらす細胞濃度に相当
した。
擬似微小管形成のために、細胞を、成長因子低減マトリゲル(Corning社)およ
びEGM2培地(Lonza社)での培養に移した。
)で培養し、数回分割し、最初の継代後、ゼラチンはもはや必須ではなくなった。
BM細胞または解離EBの染色を、100μLの染色バッファ(2%FBSを含有する
PBS)中の2×105細胞について、暗所において室温で20分間、各抗体の5:10
0希釈で行った。データ収集は、Becton Dickinson CantoIIサイ
トメータで行った。
1.750 106D16単一細胞またはhEPCおよび1.750 106hMSC
を、100μlのマトリゲルフェノールレッドフリーおよび成長因子低減し(Corni
ng社)と混合し、ヌードマウスの背中に皮下注入した(2つの異なるプラグ/マウス)
。対照も同様に行ったが、3.5 106hMSCまたはD16単一細胞またはhEPC
sであった:各条件についてn=3。2週間後、マウスを犠牲にし、マトリゲルプラグを
切開し、パラフィン切片用に加工した。切片を、脱パラフィンし、水和させ、マッソント
リクローム、ヘマトキシリンでの核染色を含む3色プロトコル、酸性フクシン/キシキジ
ンポンソーでの細胞質染色およびライトグリーンSFでのコラーゲン染色(すべてVWR
社から)で、または、ヒトフォンヴィレブランド因子(Dako社)で染色し、染色をヒ
ストグリーン基質(Abcys社)で発色させ、Fast nuclear red(D
ako Cytomation社)で対比染色し、脱水し、マウントし、または、一次抗
体としてのhCD31(R&DSystem社)および二次抗体としてのロバ抗ウサギC
y3(Jackson Immuno Reseach社)およびDAPIを用い、フル
オロマウントGでマウントした。
上記のように、細胞を抗体hAPJ-APCで染色した。選別は、Moflo AST
RIOS Beckman Coulter社装置上で実行され、純度は98.1%のA
PLNR陽性細胞であった。
NOD/SCID-LtSz-scid/scid(NOD/SCID)またはNOD
.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Wjl/SzJ(NSG)またはFoxn
1-/-ヌードマウス(Charles River社、L’Arbresle、フラン
ス)を、IRSN動物介護施設で飼育した。すべての実験および手順は、動物実験につい
てのフランス農務省規制を遵守して行われ、地元倫理委員会によって承認された。
.115Gy/分)で細胞注入の24時間前に、致死量未満で照射した。実験間の整合性
を確保するために、雄マウスのみを用いた。移植前に、マウスをケタミンおよびキシラジ
ンの腹腔内注射で一時的に鎮静させた。細胞(0.4×106/マウス)を、28.5ゲ
ージのインスリン針を用い、100μLの容量で眼窩後部注射により移植した。合計14
0匹のマウスを、この研究に使用した。
3つの異なるhiPSC株のD17細胞の生着可能性について:
70匹のNSGマウスを次のように使用した:30匹の一次レシピエント、30匹の二
次レシピエントおよび対照としての10匹。
よび16匹の二次レシピエント、3匹の三次レシピエントおよび対照としての9匹。
APLNR+およびAPLNR-集団の生着可能性について:10匹のNOD-SCI
Dマウスを使用し、3匹のNOD-SCIDを対照とした。
マウスを12、18または20週で屠殺した。大腿骨、脛骨、肝臓、脾臓および胸腺を
除去した。単一細胞懸濁液を標準的なフラッシングによって調製し、1×106個の細胞
を含むアリコートを総容積200μLの染色緩衝液で染色した。
3、hCD43クローンDFT1、hCD34クローン581(Beckman Cou
lter社)およびhCD45クローン5B1、mCD45クローン30F11(Mil
tenyi社)。
、多系統を、次のヒトマーカを用いて評価した:hCD3クローンUCHT1、hCD4
クローン13B8.2、hCD8クローンB9.11、hCD14クローンRMO52、
hCD15クローン80H5、hCD19クローンJ3-119、hCD20クローンB
9E9、hCD41クローンP2、hCD61クローンSZ21、hCD43クローンD
FT1、hCD34-APC、hCD71クローンYDJ1.2.2(すべてBeckm
an Coulter社、ブレア、USAの抗体から)、CD45クローン5B1(Mi
ltenyi社)、CD235aクローンGA-R2(Becton-Dickinso
n社)。
能にした。多系統可能性を、次のヒトマーカを用いて評価した:hCD3クローンUCH
T1、hCD4クローン13B8.2、hCD8クローンB9.11、hCD14クロー
ンRMO52、hCD15クローン80H5、hCD19クローンJ3-119、hCD
20クローンB9E9、hCD41クローンP2、hCD61クローンSZ21(すべて
Beckman Coulter社、ブレア、USAの抗体から)。
イトメータで得た。
3匹のマウスの血液をプールしてhCD2マイクロビーズ選別(Miltenyi社)
を可能にし、TCRαβおよびTCRγδの存在を、次のヒトマーカを用いてフローサイ
トメトリによって評価した:TCRαβクローンIP26AおよびTCRγδクローンI
MMU510(すべてBeckman Coulter社、ブレア、USAの抗体から)
。
man Coulter社、両方とも1μg/mL)で補完したかまたはしていない細胞
培養培地中に播種した。5日後、細胞を採取し、抗hCD3クローンUCHT1で染色し
、BDCantoIIサイトメータにて分析した。FlowJo分析ソフトウェアを使用
して、CD3+T細胞上でゲートし、重ね合わせヒストグラムプロットを生成した。
man Coulter社、ブレア、USAの抗体から)でマークした。
3匹を致死量以下に照射したNOD/SCIDマウスにそれぞれ、300万のAPLN
R陽性細胞を皮下注射した。奇形腫は、FDAガイドライン(材料および方法)による2
ヶ月のフォローアップ後には発見されなかった。
、BM、肝臓および腸)の顕微鏡分析後(140匹/140匹のマウス)に、いずれのマ
ウスにおいてもまったく腫瘍は肉眼で検出されなかった。
総mRNAを、RNAミニキット(Qiagen社、クルタブフ、フランス)を用いて
単離した。mRNA完全性を、バイオアナライザー2100(Agilent Tech
nologies社、マッシー、フランス)で確認した。cDNAを、スーパースクリプ
ト(Life Technologies社、カールスバード、USA)での逆転写によ
り構築した。TaqManPCRマスターミックス(Life Technologie
s社)および選択された遺伝子(下記の表を参照)についての特異的プライマー(App
lied BioSystems社、カールスバード、USA)を配列検出システム(Q
uantStudio12K FlexReal-TimePCRシステム、Life
Technologies社)とともに用いて、PCRアッセイを実施した。各サンプル
において、各標的遺伝子の蛍光PCR信号は、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒ
ド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)の蛍光シグナルに正規化された。
GA2およびhGAPDHを測定することによって評価した。マウスBMにおけるCFC
ポスト移植およびグロビン型発現から、我々は、Taqmanプローブを使用して、ベー
タ、ガンマおよびイプシロングロビンを測定した。
すべての統計は、Rソフトウェア3.1.1(2014年7月10日)(Rコアチーム
社、2013)、INGENUITYおよびSAMソフトウェアを用いて決定した。デー
タは、階層的クラスタリングおよびPCAで表現されている。
第1の移植可能HSCは、内皮細胞(EC)の特殊化集団から胚発生時に産生され、造
血内皮と呼ばれる。内皮造血移行(EHT)に続き、これらの造血ECは、HSCを含む
造血細胞(HC)に分化し、循環に入り、胎児の肝臓で増幅され、定着の決定的な部位で
あるBMを実現する。発達上の造血のこれらの初期ステップは、胚様体(EB)の培養、
特に、造血ECの生成およびHCの出芽に完全に繰り返される。
フリーおよび間質フリーのシステム手順を開発した。すべてのサイトカインおよび成長因
子は、任意の必要性を満たすために、0日目(D)から培養期間の最後まで存在する。多
くの研究は、14D長プロトコルを使用し、EBにおける造血バーストの存在に基づいて
D11~14間の細胞を単離する。本発明者らは、D17においてもバーストを得ること
なく、したがって、分化プロセスの劇的な遅延を評価した(図1A)。これらの培養条件
は、同様の分化効力を有する、例えばエピソームまたはレトロウイルスの、それらの再プ
ログラミングプロトコルによって異なる、3つの異なるhiPSC細胞株に適用され、し
たがって方法の頑丈さが示された。
性遺伝子の発現について、およびキーとなる内皮および造血特異的遺伝子の49個につい
て、CD34+臍帯血HSCの分子プロファイルを参照としつつ、D3、7、9、13、
15、16および17におけるqRT-PCRによってEB細胞を分析した。階層的クラ
スタリング分析(図1B)は、2つの主要なグループ、すなわち、CD34+臍帯血細胞
に関連したもの、およびEB細胞に関連したもの、の存在を示した(D3~17日目)。
後者は、2つの異なるクラスタに分割される:初期EB細胞(D3~13)を含むもの、
および、D13~15の間のバランスポイントの存在を示唆する後期EB細胞(D15~
17)を包含するもの。qPCRパターンのより徹底した分析により、D13がCD30
9(VEGFR2)mRNA発現に基づくECコミットメントの点として同定され、D1
6がRUNX1 mRNA発現に基づく推定造血内皮コミットメントの点とされた(図1
C)。ITGA2(インテグリンアルファ-2)およびCEBPA(CCAATエンハン
サー結合タンパク質アルファ)などの造血細胞特異的マーカも、RUNXl発現の開始に
合わせてD16からアップレギュレートされた。D17細胞は、HC特異的遺伝子の発現
の増加によって示されるように、CD34+細胞プロファイルに向かって収束する傾向を
示した(データは示さず)。バランスポイントを確認するために、本発明者らは、ECマ
ーカとしてCD309の、初期HCマーカとしてMPL、CKITおよびITGA2の表
面発現についてフローサイトメトリによって細胞集団を分析した。q-PCR分析(図1
C)に合わせて、フローサイトメトリ分析は、D13~17のCD309の減少およびI
TGA2、CKITおよびMPLの増加を確認した(図1D)。彼らはさらに、D15~
17細胞における初期造血コミットメントに関するアペリン受容体(APLNR)の発現
を示す細胞集団を同定し、その中で、サブ画分は、運動およびホーミング受容体CXCR
4の発現を徐々に獲得した(図1E)。
EB細胞の内皮および造血可能性を評価した(図2A)。内皮コロニー形成細胞(CFC
-EC)(図2A1)、擬似微小管(図2A2)およびEC様細胞(図2A3)を生成す
るその能力によって明らかにされるように、D15細胞は、強力な内皮形成可能性を示し
たが、造血形成能力を欠いており、クローン原性コロニーを生成することができず、長期
培養開始細胞の非常に低い頻度を示した。対照的に、D17細胞は、内皮可能性は欠けて
いたが、造血能の有意な増加を示し(図2A4、A5)、この期間内の造血コミットメン
トの開始が確認された。
細胞(hMSC)を含むまたは含まない細胞を免疫無防備Foxn1-/-(ヌード)マ
ウスに皮下移植することによってインビボで調査された(図2B)。移植後2週間で、ヒ
トCD31+細胞およびフォン・ヴィレブランド+細胞から作られたヒト血管構造(図2
C、D)が、D16細胞および(/)hMSCを含む移植片において検出された。QRT
PCRは、D16細胞/hMSCで作られた移植片において、そして予想通り、内皮前
駆細胞/hMSCで作られた移植片において、hVEGFR2、hENG(ENDOGL
IN)、hPECAM-1の発現を明らかにした(データは示していない)。また、D1
6細胞/hMSCプラグが、ヒトベータ、ガンマおよびイプシロングロビン転写物を発現
する一方、D16細胞のみのプラグは、成熟のブロックを示すヒトイプシロングロビン転
写物を発現するのみであった。D16細胞はしたがって、インビトロの結果に合わせてバ
ランスされた内皮造血パターンを示した。
グレイ)した8週齢の免疫無防備マウスに20週間にわたって4×105個の細胞を移植
し、続いて、20週間の追加期間にわたって同様に処理した免疫無防備レシピエントに困
難な二次移植を行った(図3A)。ヒトHCの存在は、hCD34、hCD43およびh
CD45のそれらの表面発現を介して定量化された(図3B、C、D)。多系統ヒト造血
は、30匹/30匹の一次レシピエントマウスにおいて明らかであり(図3C)、総マウ
スBM単核細胞間で、平均20.3+/-2.9%のhCD45+細胞となり、すなわち
、通常、NSGマウスにおけるヒトHC生着について陽性と考えられる0.1%の閾値の
203倍であり(Tourinoら、The hematology journal:
the official journal of the European Hae
matology Association/EHA2、108-116(2001))
、12.2+/-1.5%のhCD43+および7.29+/-1.0%のhCD34+
であった(図3C)。hCD45+BM集団内で、いくつかのヒトHC系統は、B細胞(
CD19+CD45+)、T細胞(CD3+CD45+、CD4+CD45+)、マクロ
ファージ(CD14+CD45+、CD15+CD45+)(図3E、図S3H)、およ
び赤血球前駆細胞/前駆体(CD235a+CD45+)(図示せず)を含むことが検出
された。選別されたhCD45+末梢血細胞は、移植細胞の末梢化を示す同じ多系統パタ
ーンを示した。移植細胞のヒト起源が、CD45、CD15、MPO、ITGA2および
GAPDH遺伝子についてヒト特異的プライマーを用いたq-PCRによって確認された
(n=30/30)。ヒト特異的クローン原性アッセイは、第1のレシピエントマウスか
ら単離されたBM細胞上で行われ、CFU-GEMM、BFU-EおよびCFU-GMコ
ロニー(図3G1、2、3)に分配された104個の総BM細胞(図3F)から17.5
+/-4.3クローンとの全体的頻度を明らかにした。サイトスピン分析は、成熟マクロ
ファージ、ヒスチオモノサイト、骨髄球および赤芽球の存在を明らかにした(図3H1、
2、3)。一次レシピエントの7.106個のBM細胞は、二次(n=30)レシピエン
トに免疫試験され、および(図3B、D)、NOD-SCIDマウスの場合には最終的に
三次レシピエント(n=3)免疫試験をされた(データは示さず)。ヒトCD45+細胞
は、単核BM細胞の12.6+/-3.9%を示し(図3B、D)、持続的再構成能力を
示した。多系統生着は、30匹/30匹マウスにおいて見出された(図3E)。ヒトCF
Cの全体的なクローニング効率は、104個の総マウスBM細胞の5.5+/-3.1%
であり、堅牢で長期の自己再生能力(図3F-H)を示した。移植された細胞のヒト起源
は、上記のように確認された。
の能力を分析し、インビボでヘモグロビンスイッチングを行い、T細胞の表現型および機
能性を試験した。一次および二次レシピエントの両方からの移植細胞は、高いβ(それぞ
れ39.51+/-4.95および36.61+/-5.86)およびγグロビン(それ
ぞれ57.49+/-3.95および61.39+/-4.86)の量を示すヒト赤血球
前駆体を生成することができた一方、εグロビンはそれぞれ総グロビンの3.0+/-1
.2%、2.1+/-1.1%に劇的に減少した(図3I)。胚性サイレンシングおよび
成人グロビン発現の活性化は、決定的な赤血球の指標である。末梢血単離hCD2+T細
胞は、ヒトT細胞能力の成熟を評価する多量のTCRαβ(図3J)および非常に少量の
TCRγδを示した。hCD3およびhCD28刺激の下で、CSFE標識によって測定
されるように、胸腺および脾臓細胞を、それらのインビトロの能力拡大について試験した
。5日後、hCD3+発現にてゲートされた胸腺(図3K)および脾臓(データは示して
いない)細胞は、高い増殖能力を示し、それによって、ヒトT細胞の機能性を実証した。
胞のパーセンテージに対する、報告された培養起端におけるEBのAPLNR+細胞のパ
ーセンテージを示す。本発明者らは、APLNR+および-集団を選別し、NOD-SC
IDモデルにおいてインビボでそれらの生着能力を比較した。APLNR+細胞は、正常
に18週間後に造血を再構成した(図4B)。移植されたマウス6匹/6匹において、ヒ
トCD45+細胞は、マウスBMにおける単核細胞の6.6+/-1.9%を占め、3.
4+/-2.5%がhCD43+であり、1.1+/-0.4%がhCD34+であった
(図4B、図5)。BM細胞のフローサイトメトリ分析は、ヒト多系統表現型を明らかに
した(データは示していない)。D17のAPLNR+細胞は、任意のCD45+細胞を
保有せず、したがって再構成能力がhCD45+コミット前駆細胞の存在によるものでは
なかったことを示した(図4C)。対照的に、APLNR-細胞は、マウスBM中の0.
08+/-0.01%hCD45+細胞を伴う4匹/4匹マウスでは、有意なレベルの生
着に失敗した(図4Bおよび図5)。興味深いのは、APLNR+画分は、マウスで説明
したENG+/TIE+/CKIT+(図4C)の均質な集団が決定的造血を増強するこ
とを示した。
造血内皮または造血コミットメントを表す遺伝子セットの発現に関して、APLNR+お
よび-細胞の分子プロファイルを、hiPSCの分子プロファイルおよび対照CD34+
HSCと比較した。研究される49個のmRNAのセットを変数として用い、6つの細胞
集団を観察として用いる、ΔCtによって表されるときの遺伝子発現レベルの主成分分析
(PCA)(図4D)は、第1の成分が、同様に因子「造血分化」に対応し、分散の44
.9%を占めることを明らかにした。移植可能性に関わる特性をさらに明らかにすること
を目指して、彼らはPCAによってAPLNR+、D17およびHSC集団を、APLN
R-およびhiPSC集団と比較した。分散の19.23%を占める第3の成分は、集団
をそれらの移植可能性によって異なる2つのグループに分離した(図4E)。遺伝子発現
および応答変数間の関係の強さを測定する統計SAM試験は、内皮遺伝子をそれらの間で
移植できないグループにおいて有意によりアップレギュレートされる8つの遺伝子(FD
R<10%)をTEK、PECAM、およびKDRと指摘した(図4F)。
生をサポートする長期多能HSCの生成は、初期分化細胞を通過して、EHTを受けてA
PLNRを発現することを示した。これらの実験は、GMPグレード培養条件の下で行わ
れ、それによって、HSC移植についての細胞の優先的供給源として多能性幹細胞の使用
に道を開いた。
材料および方法
hiPSC増幅、EB分化、ヒト細胞生着の評価、T細胞の成熟および機能性アッセイ
、定量的PCRを、上述のように行った。
解離されたEB細胞を、抗体CD110-PE(MPL)またはCD135-PE(F
LT3)で染色し、そしてPEマイクロビーズ(Miltenyi社)で再染色し、最終
的にMACS(登録商標)細胞分離装置で選別した。
NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Wjl/SzJ(NSG)(Ch
arles River社、ラルブレル、フランス)を、IRSN動物介護施設で飼育し
た。すべての実験および手順は、動物実験についてのフランス農務省規制を遵守して行わ
れ、地元倫理委員会によって承認された。
.115Gy/分)で細胞注入の24時間前に、致死量未満に照射した。実験間の整合性
を確保するために、雄マウスのみを用いた。移植前に、マウスをケタミンおよびキシラジ
ンの腹腔内注射で一時的に鎮静させた。MPL+またはFLT3+細胞(104/マウス
)を、28.5ゲージのインスリン針を用い、100μLの容量で後眼窩注射により移植
した。
3つの異なるhiPSC株のD17細胞の生着可能性について:
50匹のNSGマウスを次のように使用した:25匹の一次レシピエント、25匹の二
次レシピエント。
バイオインフォマティクス分析を、R環境ソフトウェア バージョン3.0.2で行っ
た。公開利用可能なトランスクリプトームデータセットが、遺伝子発現オムニバス(GE
O)データベースで、正規化されたマトリックス(GSEフォーマット:遺伝子発現マト
リックス)としてダウンロードされた(http://www.ncbi.nlm.ni
h.gov/geo/)。
多能性細胞(IPSC:人工多能性細胞)の分化に由来するscid再増殖細胞(SR
C)を良好に特徴付けるために、本発明者らは、行われる一次または二次移植の成功への
異種移植能力を考慮してトランスクリプトームのサンプルを分析した。トランスクリプト
ームシリーズは統合され、一次異種移植能力のみを有するIPSCのグループ(グループ
GI、n=3)、ならびに、一次および二次異種移植能力を有するIPSCのグループ(
グループGIおよびGII、n=3)と比較して、造血幹細胞(CD34+CD38-C
D90+の表現型を有するHSC、n=3)を選別する対照グループを構築した。バッチ
効果の数学的補正後、一方向ANOVA(分散分析、p値1E-4未満)の教師あり分析
を、3つの定義サンプルグループ(HSC、GI、GI&II)間で行った。教師なし主
成分分析を、グループ間の5859個の差次的遺伝子上で行い、主要マップ(図6)上で
4.75E-8のp値を有するサンプルのグループを有意に識別することができた。これ
らの結果は、一次および/または二次移植を与える能力を考慮すると選択遺伝子がSRC
-IPSCの異種移植表現型の研究に潜在的に関連があることを示唆している。また、ト
ランスクリプトームデータセットに関連するバッチ効果は、この教師なし分析の間に表現
型グループ判別に影響を与えないことを示した。各異種移植グループとHSCグループと
の間のマイクロアレイ有意分析(SAM)による教師あり分析を、SRC-IPSCの各
グループ内のHSCバイオマーカを発見するために行った。リレーショナルサーコスプロ
ット(図7)において、HSCバイオマーカのより大きな多様性が、GIグループよりも
GI&GIIグループについて見出された。GI&GIIグループについてのこの特定の
多様性は、中胚葉、多能性幹細胞およびIPSCなどの機能カテゴリを構成した。GIグ
ループについてのバイオマーカの特異性は、骨芽細胞および脂肪細胞などのより間葉系の
表現型に関係する。他の方法では、共通のバイオマーカは、造血前駆細胞、赤芽球前駆細
胞、CD34+細胞、骨髄およびCD14+細胞などの造血系統でより多く発見された。
SRC-IPSCの特性におけるHSC発現プロファイル(CD34+38-90+)の
影響を見るために、SRC-IPSCグループを比較するための教師あり分析にHSCグ
ループが導入された。教師なし分類によって行われる発現ヒートマップは、各異種移植S
RC-IPSCグループが、いくつかのHSC関連バイオマーカ、すなわち、SRC-I
PSCのGIグループとの関係でのHSCバイオマーカ、SRC-IPSCのGIおよび
GIIグループとの関係でのHSCバイオマーカを発現することを示した(データは示さ
ず)。SRC-IPSCの各グループにおいて濃縮されたHSCバイオマーカを比較する
ベン図は、共通に任意の遺伝子を示した(図8)。GIおよびGII能力を有するSRC
-IPSC細胞は、GIグループ:FLT3(CD135)およびMPL(CD110)
と比較していくつかの細胞表面分子を特に発現した。
る抗体が利用可能であるMPLおよびFLT3受容体をより具体的に研究することにした
。
者らは、スクリーニングを行い、そして、10,000細胞/NSG免疫抑制マウス(F
LT3についてn=15およびMPLについてn=15)を移植した(図9)。20週後
、マウスを屠殺し、その骨髄、脾臓、肝臓および胸腺ならびに血液サンプルを調べた。
T3+集団について12.6+/-0.7%のhCD45+およびMPL+集団について
9.9+/-1.7%)(図10)、すべての造血系統からのヒト細胞が見つかった。ヒ
ト赤血球は、βグロビンを産生することが見出され、血液循環Tリンパ球は、その表面に
TCRγδを発現し、胸腺または脾臓からのリンパ球は、活性化後にインビトロ増殖する
ことができ、FLT3+またはMPL+細胞の決定的造血を可能とする基礎となった。
各一次マウスについて、700万個の骨髄細胞を、二次マウスに移植した。20週後、
これらの二次マウスを屠殺し、上記のように分析した。
-3.4%のhCD45+およびMPL+集団について9.8+/-2.1%)(図10
)、多系統が示され、ヒト移植細胞は、決定的な造血が可能であった。
LT3またはMPLを発現する細胞は、インビボでの長期多系統生着および自己再生が可
能である。
Claims (16)
- (i)血漿、血清、血小板溶解物および/または血清アルブミン、ならびに(ii)トランスフェリンまたはその代替物、好ましくはトランスフェリン、インスリンまたはその代替物、好ましくはインスリン、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3-L)、骨形成タンパク質4(BMP4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およびインスリン様成長因子1(IGF1)を含む液体細胞培養培地。
- (i)血漿、血清および/または血小板溶解物、ならびに(ii)トランスフェリン、インスリン、幹細胞因子(SCF)、トロンボポエチン(TPO)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(FLT3-L)、骨形成タンパク質4(BMP4)、血管内皮成長因子(VEGF)、インターロイキン3(IL3)、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン1(IL1)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)およびインスリン様成長因子1(IGF1)を含む、請求項1に記載の液体細胞培養培地。
- 10~100ng/mLのSCF、および/または、
10~100ng/mLのTPO、および/または、
10~100ng/mLのFLT3-L、および/または、
50~300ng/mLのBMP4、および/または、
50~300ng/mLのVEGF、および/または、
10~100ng/mLのIL3、および/または、
10~100ng/mLのIL6、および/または、
1~20ng/mLのIL1、および/または、
10~200ng/mLのGCSF、および/または、
1~20ng/mLのIGF1、
を含む、請求項1または2に記載の液体細胞培養培地。 - 10~50ng/mLのSCF、および/または、
10~50ng/mLのTPO、および/または、
10~50ng/mLのFLT3-L、および/または、
150~250ng/mLのBMP4、および/または、
150~250ng/mLのVEGF、および/または、
20~80ng/mLのIL3、および/または、
20~80ng/mLのIL6、および/または、
1~10ng/mLのIL1、および/または、
50~150ng/mLのGCSF、および/または、
1~10ng/mLのIGF1、
を含む、請求項1または2に記載の液体細胞培養培地。 - 1%~20%の血漿または血清、好ましくは2%~10%の血漿または血清を含む、請求項1~4のいずれかに記載の液体細胞培養培地。
- 0.1%~2%の血小板溶解物、好ましくは0.2%~1%の血小板溶解物を含む、請求項1~5のいずれかに記載の液体細胞培養培地。
- 0.1%~2%の血清アルブミン、好ましくは0.5%~1%の血清アルブミンを含む、請求項1~6のいずれかに記載の液体細胞培養培地。
- 5μg/mL~20μg/mLのインスリンまたはその代替物であり好ましくはインスリン、好ましくは8μg/mL~12μg/mLのインスリンまたはその代替物であり好ましくはインスリンを含む、請求項1~7のいずれかに記載の液体細胞培養培地。
- 10μg/mL~100μg/mLのトランスフェリンまたはその代替物であり好ましくはトランスフェリン、好ましくは30μg/mL~60μg/mLのトランスフェリンまたはその代替物であり好ましくはトランスフェリンを含む、請求項1~8のいずれかに記載の液体細胞培養培地。
- 血漿又は血清を含み、さらにヘパリン、好ましくは0.5U/mL~5U/mLのヘパリンを含む、請求項1~9のいずれかに記載の液体細胞培養培地。
- 造血系統の細胞の成長および/または分化のため、胚様体の分化のため、および/または、造血細胞移植片の産生のための、請求項1~10のいずれかに記載の液体細胞培養培地の使用。
- フィーダー細胞の不在時における請求項11に記載の液体細胞培養培地の使用。
- 造血細胞移植片を調製する、または長期多系統生着および自己再生が可能な造血幹細胞の細胞の集団を濃縮する、インビトロの方法であって、前記方法は、
a)造血幹細胞を含む細胞の集団を提供すること、および
b)細胞表面抗原CD135および/またはCD110の発現に基づいて、前記集団の細胞を選別すること、および
c)CD135+および/またはCD110+である細胞を回収することを含み、
前記方法は、さらに、ステップa)の前に、
多能性幹細胞を提供すること、
胚様体(EB)の形成を誘導すること、
請求項1~9の何れかに記載の液体細胞培養培地中でEBを培養すること、および
EB細胞を解離すること、を含み、
それによって、ステップa)で提供される細胞の前記集団を得る、方法。 - ステップb)の前、後、またはそれと同時に、アペリン受容体(APLNR)の前記発現に基づいて細胞を選別すること、および、APLNR+である細胞を回収することをさらに含む、請求項13に記載の方法。
- 前記多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞または胚性幹細胞、より好ましくは人工多能
性幹細胞から選択される、請求項13又は14に記載の方法。 - 前記多能性幹細胞は、14~19日間、好ましくは15~18日間、より好ましくは1
7日間、前記液体細胞培養培地で培養される、請求項13~15のいずれかに記載の方法。
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