KR102660814B1 - 조혈 이식체의 개선 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조혈 세포 이식체를 제조하거나 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 조혈 줄기 세포에 대한 세포의 집단을 농축시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 조혈 줄기 세포를 포함하는 조혈 이식체 뿐만 아니라 치료요법에서 이들의 용도에 관한 것이다.
Description
발명의 분야
본 발명은 의약 분야, 특히 사람 조혈 이식체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생(self-renewal)할수 있는 조혈 줄기 세포, 즉, 조혈 이식술(hematopoietic transplantation)에 적합한 조혈 줄기 세포의 확인 및 선택에 관한 것이다.
발명의 배경
조혈 줄기 세포(HSC)는 혈액 질환에서 또는 방사선/화학치료요법 후 동종이계 조혈 세포 이식술의 장기간 치유 효과에 관여하는 사람 골수(BM) 및 혈액 속의 희귀 세포이다. 이러한 세포는 BM, 동원된 말초 혈액(mobilized peripheral blood) 또는 사람 제대 혈액으로부터 수거될 수 있다. 제대 혈액은 몇가지 장점, 즉, HLA 일치에 대한 감소된 필요성 및 이식체 대 숙주 질환의 감소된 위험을 제공한다. 그러나, HSC의 조작에 있어서의 진전에도 불구하고, 이들의 수는 동종이계 이식술에 흔히 불충분하게 남아있고 수득되는 세포는 새로이 분리한 HSC와 비교하여 감소된 다중계통 및 이식 잠재능을 나타내었다. 이러한 발견을 기반으로 하여, 비-조혈 공급원으로부터 이식가능한 HSC를 생성하는 것은 재생 의약에 있어서 주요 목표 중 하나인 것으로 여겨진다.
세포 융합, 전사 인자의 강화된 발현을 통한 분화된 세포의 재프로그래밍(reprogramming), 또는 사람 다능성 줄기 세포로부터의 직접적인 분화를 포함하는 다수의 세포형의 직접적인 전환을 사용하는 다수의 프로토콜이 개발되었다(Wahlster 및 Daley, Nature cell biology, 2016, 18, 1111-1117). 많은 경우에, 종양유전자(oncogene)를 암호화하는 플라스미드의 도입 또는 비 GMP-등급의 배양보조세포(GMP-grade feeder cell)의 수용체 세포내로의 활용은 임상 적용을 위한 이들의 사용을 불가능하게 한다. 최종적으로, 많은 이러한 프로토콜은 불량한 이식 잠재능을 지닌 세포를 생산하는 것으로 입증된 전략인, 진짜의(bona fide) 이식가능한 제대 혈액 또는 성체 HSC에 근접한 표면 표현형을 지닌 세포 집단을 생산하는 것을 목표로 한다.
결과적으로, 이식된 세포의 향상된 이식 잠재능(engraftment potential) 및 개선된 골수 대체를 포함하는, 조혈 이식술 효능을 개선시키는 생성물 및 방법에 대한 요구가 남아있다.
발명의 요약
본 발명은 조혈 이식술 효능을 개선시키는 생성물 및 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 특히, 본 발명은 생체내(in vivo)에서 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 조혈 줄기 세포를 수득하고 선택하는 방법을 제공한다. 본 발명은 HSC 이식술을 위한 세포의 공급원으로서, 다능성 줄기 세포, 및 특히 유도된 다능성 줄기 세포의 사용을 위한 방법을 개시하고 있다.
따라서, 본 발명은 조혈 세포 이식체를 준비하거나 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 조혈 줄기 세포에 대한 세포의 집단을 농축시키는 시험관내(in vitro) 방법에 관한 것이며, 상기 방법은
a) 조혈 줄기 세포, 바람직하게는 원시의 초기 조혈 줄기 세포(early primitive hematopoietic stem cell)를 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계, 및
b) 세포 표면 항원 CD135 및/또는 CD110의 발현을 기반으로 상기 집단의 세포를 분류하는 단계, 및
c) CD135+ 및/또는 CD110+인 세포를 회수하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 단계 b)에서, 세포는 세포 표면 항원 CD110의 발현을 기반으로 하여 분류되며, 단계 c)에서, 회수된 세포는 CD110+이다. 임의로, 단계 b)에서, 세포는 세포 표면 항원 CD135의 발현을 기반으로 하여 추가로 분류되며, 단계 c)에서, 회수된 세포는 CD110+ CD135+일 수 있다.
방법은 단계 b) 이전에, 후에 또는 이와 동시에, 아펠린 수용체(apelin receptor: APLNR)의 발현을 기반으로 하여 세포를 분류하고 APLNR+인 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
단계 a)에서 제공된 세포의 집단은 말초 혈액, 태반 혈액, 제대 혈액, 골수, 간 및/또는 비장으로부터 수득된 조혈 줄기 세포를 포함할 수 있고/있거나 불멸화된 조혈 줄기 세포를 포함할 수 있다.
대안적으로, 또는 추가로, 단계 a)에서 제공된 세포의 집단은 바람직하게는 유도된 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포, 보다 바람직하게는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 선택된, 다능성 줄기 세포의 시험관내 분화로부터 수득된 조혈 줄기 세포를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 단계 a) 전에,
다능성 줄기 세포, 바람직하게는 유도된 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계,
배아체(embryoid body: EB) 형성을 유도하는 단계,
다능성 줄기 세포의 엔도-조혈 계통(endo-hematopoeitic lineage)으로의 분화를 개시하는(triggering) 액체 배양 배지 속에서 EB를 배양하는 단계, 및
EB 세포를 분리하는 단계,
이에 의해 단계 a)에서 제공된 세포의 집단을 수득하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 액체 배양 배지는 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FMS-유사 타이로신 키나제 3(FLT3) 리간드, 골 혈성 단백질 4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 1(IL1), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1)를 포함한다.
바람직하게는, 다능성 줄기 세포는 액체 배양 배지 속에서 14 내지 19일 동안, 바람직하게는 15 내지 18일 동안, 보다 바람직하게는 17일 동안 배양된다.
다른 양태에서, 본 발명은 이식, 및 특히 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 조혈 줄기 세포의 마커로서 CD135 및/또는 CD110의 용도에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 세포 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조혈 세포 이식체에 관한 것이며, 여기서 세포의 적어도 10%는 CD135+ 및/또는 CD110+ 조혈 줄기 세포이다. 이는 또한 본 발명의 방법에 따라 제조된 조혈 세포 이식체에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상증후군, 골수증식성 장애, 만성림프구성 백혈병, 청소년(juvenile) 만성 골수성 백혈병, 신경모세포종, 난소암 및 생식세포 종양, 또는 비-악성 질환, 예를 들면, 자가면역 장애, 아밀로이드증(amyloidosis), 무형성빈혈(aplastic anemia), 발작성야간혈색뇨, 판코니 빈혈(Fanconi's anemia), 블랙팬-다이아몬드 빈혈(Blackfan-Diamond anemia), 종증성 지중해 빈혈, 겸상 적혈구성 빈혈, 중증 복합병 면역결핍증, 비스코트-알드리히 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome) 및 선천성 대사장애증(inborn errors of metabolism)과 같은 악성 질환의 치료시 사용하기 위한 본 발명의 조헐 세포 이식체에 관한 것이다.
조혈 줄기 세포 이식체는 자가의(autologous), 동계 또는 동종이계 이식술에 사용될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한 (i) 혈장, 혈청, 혈소판 분해물 및/또는 혈청 알부민, 및 (ii) 트랜트페린 또는 이의 대체제(substitute), 인슐린 또는 이의 대체제, 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FMS-유사 타이로신 키나제 3 리간드(FLT3-L), 골 혈성 단백질 4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 1(IL1), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1)를 포함하는 액체 세포 배양 배지, 바람직하게는 (i) 혈장, 혈청 및/또는 혈소판 분해물, 및 (ii) 트랜스페린, 인슐린, 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FMS-유사 타이로신 키나제 3 리간드(FLT3-L), 골 형성 단백질 4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 1(IL1), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1)를 포함하는 액체 세포 배양 배지에 관한 것이다.
특히, 액체 세포 배양 배지는
- 10 내지 100 ng/mL의 SCF, 바람직하게는 10 내지 50 ng/mL의 SCF;
- 10 내지 100 ng/mL의 TPO, 바람직하게는 10 내지 50 ng/mL의 TPO;
- 100 내지 500 ng/mL의 FLT3-L, 바람직하게는 250 내지 350 ng/mL의 FLT3-L;
- 10 내지 100 ng/mL의 BMP4, 바람직하게는 10 내지 50 ng/mL의 BMP4;
- 50 내지 300 ng/mL의 VEGF, 바람직하게는 150 내지 250 ng/mL의 VEGF;
- 10 내지 100 ng/mL의 IL3, 바람직하게는 20 내지 80 ng/mL의 IL3;
- 10 내지 100 ng/mL의 IL6, 바람직하게는 20 내지 80 ng/mL의 IL6;
- 1 내지 20 ng/mL의 IL1, 바람직하게는 1 내지 10 ng/mL의 IL1;
- 10 내지 200 ng/mL의 GCSF, 바람직하게는 50 내지 150 ng/mL의 GCSF; 및/또는
- 10 내지 150 ng/mL의 IGF1, 바람직하게는 10 내지 100 ng/mL의 IGF1을 포함한다.
바람직하게는, 액체 세포 배양 배지는
- 10 내지 100 ng/mL의 SCF, 바람직하게는 10 내지 50 ng/mL의 SCF;
- 10 내지 100 ng/mL의 TPO, 바람직하게는 10 내지 50 ng/mL의 TPO;
- 10 내지 100 ng/mL의 FLT3-L, 바람직하게는 10 내지 50 ng/mL의 FLT3-L;
- 50 내지 300 ng/mL의 BMP4, 바람직하게는 150 내지 250 ng/mL의 BMP4;
- 50 내지 300 ng/mL의 VEGF, 바람직하게는 150 내지 250 ng/mL의 VEGF;
- 10 내지 100 ng/mL의 IL3, 바람직하게는 20 내지 80 ng/mL의 IL3;
- 10 내지 100 ng/mL의 IL6, 바람직하게는 20 내지 80 ng/mL의 IL6;
- 1 내지 20 ng/mL의 IL1, 바람직하게는 1 내지 10 ng/mL의 IL1;
- 10 내지 200 ng/mL의 GCSF, 바람직하게는 50 내지 150 ng/mL의 GCSF; 및/또는
- 1 내지 20 ng/mL의 IGF1, 바람직하게는 1 내지 10 ng/mL의 IGF1을 포함한다.
액체 배양 배지는 또한 (i) 혈장, 혈청, 혈소판 분해물 및/또는 혈청 알부민, 바람직하게는 혈장, 혈청 및/또는 혈소판 분해물, 및 (ii) 인슐린 또는 이의 대체제, 및 트랜스페린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 인슐린 및 트랜스페린을 추가로 포함할 수 있다. 특히, 액체 배양 배지는 또한
- 1% 내지 20%의 혈장 또는 혈청, 바람직하게는 2% 내지 10%의 혈장 또는 혈청; 또는 0.1% 내지 2% 혈소판 분해물, 바람직하게는 0.2% 내지 1% 혈소판 분해물; 및
- 5 μg/mL 내지 20 μg/mL의 인슐린, 바람직하게는 8μg/mL 내지 12 μg/mL; 및
- 10 μg/mL 내지 100μg/mL의 트랜스페린, 바람직하게는 30 μg/mL 내지 60 μg/mL의 트랜스페린을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 조혈 계통의 세포의 성장 및/또는 분화, 배아체의 분화, 조혈 세포 이식체의 생산을 위한, 본 발명의 액체 세포 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1: hiPSC-유래된 세포의 특성화. (A) 실험식. HiPSC를 성장 인자 및 사이토킨의 연속된 존재하에서 17일 동안에 걸쳐 EB로 분화하였다. EB 세포를 q-PCR 및 유동 세포계산 분석법을 사용하여 상이한 시점에서 특성화하였다. 영상은 각각 D13 및 17에서 대표적인 EB를 나타낸다. (B) D3, D7, D9, D13, D15 및 D17 EB에서 및 CD34+ 제대 혈액 세포내에서 시간에 따른 내피, 조혈발생성(hemogenic) 내피 및 조혈 세포의 49개 유전자 특성의 세트의 발현을 요약하는 계층적 클러스터링(Hierarchical clustering). (C) D13으로부터 17 EB까지의 세포 분화의 EHT 균형을 대표하는 유전자에 있어서 Q-PCR 패턴. 각각의 유전자의 경우, 배 변화(fold change)는 6회의 실험의 평균 +/- SEM이다. (D) D13에서 및 EB 배양물 중 17개에서 사람 CD309, ITGA2, MPL 및 CKIT의 유동 세포계산 분석법. (E) EB 배양의 D7로부터 17일까지 APLNR 및 CXCR4의 발현의 유동 세포계산 분석법.
도 2: D15와 D17 사이의 기능성 내피-조혈 프로파일링. (A) 시간에 따른 EB내 내피(1-3) 및 조혈(4-5) 선조세포의 존재를 입증하는 시험관내 시험. 분리된 D15-17 EB 세포는 (1) CFC-EC, (2) 슈도-미소관(pseudo-microtubule), (3) 수회 계대배양(passage)할 수 있는 EC-유사 세포, (4) CFC, 및 (5) LTC-IC를 생성한다. (B) D16 세포의 내피능을 조사하기 위한 생체내 시험용 실험 개략도. (C) D16 세포/hMSC 플러그 단락. 마손 3색 염색(Masson's trichrome staining). (D) D16 세포/hMSC 플러그 단락. 사람 폰 빌레블란트 인자(사람 von Willebrand factor)+ 세포(청색) 면역염색. (E) D16 세포/hMSCs 플러그 단락 사람 CD31+ 세포(적색).
도 3: 면역약화된 NSG 마우스에서 D17 EB 세포의 생체내 이식. (A) 실험 설계. (B) 1차 수용체내 사람 대 마우스 CD45+ 세포 이식의 대표적인 유동 세포계산 분석법. (C-D) 1차(C) 또는 2차(D) 마우스 골수에서 20주후 이식체내에서 hCD34+ hCD43+ hCD45+ 세포의 퍼센트. 데이타는 평균 +/- SEM이다. (E) 1차 및 2차 수용체내에서 사람 조혈 계통 분포. 수는 100%로 표준화한다. (F) 1차 및 2차 수용체로부터 단리된 BM 세포에서 클론원성 시험(Clonogenic test). CFU-GM, BFU-E 및 CFU-GEMM 콜로니의 빈도. (G) 1차 및 2차 BM 수용체로부터 CFU-GEMM (1), BFU-E (2) 및 CFU-GM (3)의 대표적인 콜로니. (H) 사이토스핀. 1차 및 2차 수용체에서 수행된 클론원성 시험으로부터 단리된 세포의 메이 그륀발트-김자 염색법(May Gruenwald-Geimsa staining). 성숙한 대식구(1), 조직단구(2), 골수구(2) 및 적혈모세포(3). (I) CB CD34+ 적혈구 배양물속에서 사람 글로빈 발현, 1차 및 2차 수용체로부터의 BM 및 1차 수용체의 BM으로부터의 BFU-E. 데이타는 평균 +/- SEM이다. (J) 사람 T 세포의 성숙. hCD2+ 말초 혈액 분류된 세포를 hTCR αβ 및 hTCR γδ에 대한 항체로 염색하였다. (K) 사람 T 세포의 기능성. 전체 흉선 집단은 D0에서 표지되고 hCD3+ (녹색)에서 게이트된(gated) CFSE이다. D5에서, 자극되지 않은 집단은 적색인 반면 자극된 모 집단은 청색이다.
도 4: APLNR+ 집단의 기능성 및 분자 특성화. (A) 이식 18주 후, NOD-SCID BM 1차 수용체내에서 hCD45+ 세포의 퍼센트에 대한 접종물내 APLNR+ 세포의 퍼센트 사이의 상관관계. (B) APNLR+(n=6, 청색 점) 및 APNLR-(n=4, 적색 점) 집단의 이식능재구성 잠재능을 함유하는 세포는 APLNR+ 집단내에 있다. 데이타는 이식 18주 후, 사람 이식의 평균 +/- SEM 퍼센트로서 나타낸다. (C) CD45, TIE, ENG 및 CKIT 항-사람 항체를 사용한 APLNR+ 집단의 조합 유동 세포계산 분석. (D) 변수로서 49 mRNA의 세트 및 관찰로서 6개의 세포 집단을 사용한 PCA. PC1 대 PC2 점수를 플롯팅한다. PC1 치수는 44.9%의 변화를 설명하는 특성 <<조혈성 분화>>에 상응할 수 있다. HiPSC는 주요 축으로부터 구분된다. (E) 변수로서 49 mRNA의 세트 및 이식 효능이 부여되거나 부여되지 않은 집단을 사용한 PCA. 19.23%의 변화를 설명하는 PC3 치수는 2개 그룹을 구분한다. (F) 2개 그룹의 구분을 허용하는 8개 유전자의 열 지도(heat map).
도 5: APLNR+ 및 - 집단의 특성화. D17 APLNR-(좌측) 또는 + 세포 분획으로 이식된 마우스 BM에서 hCD45 및 hCD43 발현의 대표적인 프로파일.
도 6: 자율적인 원리 성분 분석을 기본 맵에서 4.75E-8의 p-값을 지닌 유의적으로 차별화된 샘플에 대해 허용된 그룹들 사이의 5859의 차등적인 유전자에서 수행하였다.
도 7: 각각의 이종-기관이식 그룹과 HSC 그룹 사이의 미세배열(SAM)에 대한 유의성 분석(Significance analysis)에 의한 감독 분석을 설명하는 서코스플롯(Circosplot)을 SRCs-INPCs의 각각의 그룹내 유효한 발견된(order found) HSC 생물마커에서 수행하였다.
도 8: 일반적인 임의의 그룹을 나타낸 SPC-IPSC의 각각의 그룹에서 농축된 HSC 생물마커와 비교한 벤 다이어그램(Venn diagram).
도 9: 면역약화된 NSG 마우스에서 분류된 D17 EB 세포의 생체내 이식의 실험적 설계.
도 10: 1차 또는 2차 마우스 골수 20주 후 이식체내에서 hCD34+ hCD43+ hCD45+ 세포의 퍼센트, 데이타는 평균 +/- SEM이다.
도 1: hiPSC-유래된 세포의 특성화. (A) 실험식. HiPSC를 성장 인자 및 사이토킨의 연속된 존재하에서 17일 동안에 걸쳐 EB로 분화하였다. EB 세포를 q-PCR 및 유동 세포계산 분석법을 사용하여 상이한 시점에서 특성화하였다. 영상은 각각 D13 및 17에서 대표적인 EB를 나타낸다. (B) D3, D7, D9, D13, D15 및 D17 EB에서 및 CD34+ 제대 혈액 세포내에서 시간에 따른 내피, 조혈발생성(hemogenic) 내피 및 조혈 세포의 49개 유전자 특성의 세트의 발현을 요약하는 계층적 클러스터링(Hierarchical clustering). (C) D13으로부터 17 EB까지의 세포 분화의 EHT 균형을 대표하는 유전자에 있어서 Q-PCR 패턴. 각각의 유전자의 경우, 배 변화(fold change)는 6회의 실험의 평균 +/- SEM이다. (D) D13에서 및 EB 배양물 중 17개에서 사람 CD309, ITGA2, MPL 및 CKIT의 유동 세포계산 분석법. (E) EB 배양의 D7로부터 17일까지 APLNR 및 CXCR4의 발현의 유동 세포계산 분석법.
도 2: D15와 D17 사이의 기능성 내피-조혈 프로파일링. (A) 시간에 따른 EB내 내피(1-3) 및 조혈(4-5) 선조세포의 존재를 입증하는 시험관내 시험. 분리된 D15-17 EB 세포는 (1) CFC-EC, (2) 슈도-미소관(pseudo-microtubule), (3) 수회 계대배양(passage)할 수 있는 EC-유사 세포, (4) CFC, 및 (5) LTC-IC를 생성한다. (B) D16 세포의 내피능을 조사하기 위한 생체내 시험용 실험 개략도. (C) D16 세포/hMSC 플러그 단락. 마손 3색 염색(Masson's trichrome staining). (D) D16 세포/hMSC 플러그 단락. 사람 폰 빌레블란트 인자(사람 von Willebrand factor)+ 세포(청색) 면역염색. (E) D16 세포/hMSCs 플러그 단락 사람 CD31+ 세포(적색).
도 3: 면역약화된 NSG 마우스에서 D17 EB 세포의 생체내 이식. (A) 실험 설계. (B) 1차 수용체내 사람 대 마우스 CD45+ 세포 이식의 대표적인 유동 세포계산 분석법. (C-D) 1차(C) 또는 2차(D) 마우스 골수에서 20주후 이식체내에서 hCD34+ hCD43+ hCD45+ 세포의 퍼센트. 데이타는 평균 +/- SEM이다. (E) 1차 및 2차 수용체내에서 사람 조혈 계통 분포. 수는 100%로 표준화한다. (F) 1차 및 2차 수용체로부터 단리된 BM 세포에서 클론원성 시험(Clonogenic test). CFU-GM, BFU-E 및 CFU-GEMM 콜로니의 빈도. (G) 1차 및 2차 BM 수용체로부터 CFU-GEMM (1), BFU-E (2) 및 CFU-GM (3)의 대표적인 콜로니. (H) 사이토스핀. 1차 및 2차 수용체에서 수행된 클론원성 시험으로부터 단리된 세포의 메이 그륀발트-김자 염색법(May Gruenwald-Geimsa staining). 성숙한 대식구(1), 조직단구(2), 골수구(2) 및 적혈모세포(3). (I) CB CD34+ 적혈구 배양물속에서 사람 글로빈 발현, 1차 및 2차 수용체로부터의 BM 및 1차 수용체의 BM으로부터의 BFU-E. 데이타는 평균 +/- SEM이다. (J) 사람 T 세포의 성숙. hCD2+ 말초 혈액 분류된 세포를 hTCR αβ 및 hTCR γδ에 대한 항체로 염색하였다. (K) 사람 T 세포의 기능성. 전체 흉선 집단은 D0에서 표지되고 hCD3+ (녹색)에서 게이트된(gated) CFSE이다. D5에서, 자극되지 않은 집단은 적색인 반면 자극된 모 집단은 청색이다.
도 4: APLNR+ 집단의 기능성 및 분자 특성화. (A) 이식 18주 후, NOD-SCID BM 1차 수용체내에서 hCD45+ 세포의 퍼센트에 대한 접종물내 APLNR+ 세포의 퍼센트 사이의 상관관계. (B) APNLR+(n=6, 청색 점) 및 APNLR-(n=4, 적색 점) 집단의 이식능재구성 잠재능을 함유하는 세포는 APLNR+ 집단내에 있다. 데이타는 이식 18주 후, 사람 이식의 평균 +/- SEM 퍼센트로서 나타낸다. (C) CD45, TIE, ENG 및 CKIT 항-사람 항체를 사용한 APLNR+ 집단의 조합 유동 세포계산 분석. (D) 변수로서 49 mRNA의 세트 및 관찰로서 6개의 세포 집단을 사용한 PCA. PC1 대 PC2 점수를 플롯팅한다. PC1 치수는 44.9%의 변화를 설명하는 특성 <<조혈성 분화>>에 상응할 수 있다. HiPSC는 주요 축으로부터 구분된다. (E) 변수로서 49 mRNA의 세트 및 이식 효능이 부여되거나 부여되지 않은 집단을 사용한 PCA. 19.23%의 변화를 설명하는 PC3 치수는 2개 그룹을 구분한다. (F) 2개 그룹의 구분을 허용하는 8개 유전자의 열 지도(heat map).
도 5: APLNR+ 및 - 집단의 특성화. D17 APLNR-(좌측) 또는 + 세포 분획으로 이식된 마우스 BM에서 hCD45 및 hCD43 발현의 대표적인 프로파일.
도 6: 자율적인 원리 성분 분석을 기본 맵에서 4.75E-8의 p-값을 지닌 유의적으로 차별화된 샘플에 대해 허용된 그룹들 사이의 5859의 차등적인 유전자에서 수행하였다.
도 7: 각각의 이종-기관이식 그룹과 HSC 그룹 사이의 미세배열(SAM)에 대한 유의성 분석(Significance analysis)에 의한 감독 분석을 설명하는 서코스플롯(Circosplot)을 SRCs-INPCs의 각각의 그룹내 유효한 발견된(order found) HSC 생물마커에서 수행하였다.
도 8: 일반적인 임의의 그룹을 나타낸 SPC-IPSC의 각각의 그룹에서 농축된 HSC 생물마커와 비교한 벤 다이어그램(Venn diagram).
도 9: 면역약화된 NSG 마우스에서 분류된 D17 EB 세포의 생체내 이식의 실험적 설계.
도 10: 1차 또는 2차 마우스 골수 20주 후 이식체내에서 hCD34+ hCD43+ hCD45+ 세포의 퍼센트, 데이타는 평균 +/- SEM이다.
발명의 상세한 설명
첫번째 이식가능한 HSC를 조혈발생성 내피로 불리는 내피 세포(EC)의 구체화된 집단으로부터 배아 발달 동안 생산한다. 내피 대 조혈 이전(endothelial-to-hematopoietic transition: EHT) 후, 이러한 조혈발생성 EC는 HSC를 포함하는 조혈 세포(HC)로 분화되어, 순환계로 들어가서 태아 간내에서 증식하고, 이들의 체류의 최종 부위인 BM을 획득한다. 발달적 조혈과정의 이러한 조기 단계, 특히 조혈발생성 EC의 생성 및 HC의 버딩(budding)은 배아체(EB) 배양물에서 충분히 반복된다.
본원에서 본 발명자들은 사람 유도된 다능성 줄기 세포(hiPSC)의 엔도-조혈 계통으로의 분화를 지시하는 1 단계의, 벡터-유리되고 기질-유리된 시스템 과정을 개발하였다. 표준 프로토콜에서 CD34+CD45+ 선조세포(progenitor)가 (D) 10일 부터 14일까지 버스팅(bursting) EB로부터 나타났지만, 본 발명자들이 적용한 배양조건은 버스트없이 잘 정의된, 조밀한(compact) 구체 구조를 나타냄으로써 차등화 공정에서 놀라운 지연을 평가하는 D17 배아체를 제공하였다. 이러한 배양 조건은 이들의 재프로그래핑 프로토콜, 예컨대, 에피좀성 또는 레트로바이러스성에 의해 구별되는 3개의 상이한 hiPSC 세포주에 적용하였으며, 따라서, 유사한 차등화 효능은 방법의 견고함을 입증한다.
이러한 차등화된 배아체 세포뿐만 아니라 1차 이식 만을 또는 1차 및 2차 이식을 할 수 있는 조혈 줄기 세포의 전사체의 생물정보학적 분석을 기반으로, 본원의 본 발명자들은 고 이식능을 나타낼 뿐 아니라 또한 풍부하고 연장된 자가-재생능을 나타내는 원시의 초기 조혈 줄기 세포의 소-분획을 확인하고, 이들 세포를 조혈 이식술을 위한 이상적인 공급원이 되도록 하였다. 이들은, 이러한 소-분획이 Fms-유사 타이로신 키나제 3 수용체(FLT3 또는 CD135), 및/또는 트롬보포이에틴 수용체(MPL 또는 CD110) 및/또는 아펠린 수용체(APLNR)의 발현에 의해 특성화될 수 있음을 밝혀내었다.
따라서, 제1 양태에서, 본 발명은
a) 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계, 및
b) 세포 표면 항원 CD135 및/또는 CD110, 및/또는 아펠린 수용체(APLNR)의 발현을 기반으로 하여, 바람직하게는, 세포 표면 항원 CD110을 기반으로 하여, 상기 집단의 세포를 분류하는 단계, 및
c) CD135+ 및/또는 CD110+ 및/또는 APLNR+인, 바람직하게는 CD110+인 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 조혈 세포 이식체를 제조하는 방법, 바람직하게는 시험관내 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한
a) 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계, 및
b) 세포 표면 항원 CD135 및/또는 CD110, 및/또는 아펠린 수용체(APLNR)의 발현을 기반으로 하여, 바람직하게는 세포 표면 항원 CD110을 기반으로 하여, 상기 집단의 세포를 분류하는 단계, 및
c) CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+인, 바람직하게는 CD110+인 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 조혈 이식술에 적합한, 즉, 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 조혈 줄기 세포용 세포의 집단을 농축시키는 방법, 바람직하게는 시험관내 방법에 관한 것이다.
CD135+ 및/또는 CD110+ 및/또는 APLNR+ 회복된 세포는 조혈 이식체로서 사용될 수 있거나 상기 이식체의 효능을 개선시키기 위하여 조혈 이식체(예컨대, 골수 또는 제대 혈액 이식)에 포함되거나 가해질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CD135" 또는 "FLT3"은 세포외 도메인에 대한 사이토킨 Flt3 리간드(FLT3L)의 결합에 의해 활성화된 제III 부류 수용체 타이로신 키나제에 관한 것이다. 사람에서, 이러한 유전자는 FLT3 유전자(유전자 확인번호: 2322)에 의해 암호화된다. 활성화시, CD135는 골수 내 조혈 세포의 세포자멸사, 증식, 및 분화에 포함된 경로에서 다수의 세포질성 효과기 분자를 포스포릴화하여 활성화시킨다. 이러한 수용체의 구성적 활성화를 생성하는 돌연변이는 급성 골수 백혈병 및 급성 림프모구 백혈병을 생성한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CD110" 또는 "MPL"은 골수증식성 백혈병 단백질로서 또한 공지된 트롬보포이에틴 수용체를 지칭한다. 사람에서, CD110은 MPL(골수증식성 백혈병 바이러스) 종양유전자(유전자 확인번호: 4352)에 의해 암호화된다. CD110은 2개의 세포외 사이토킨 수용체 도메인 및 2개의 세포내 사이토킨 수용체 박스 모티프(motif)를 지닌, 635개의 아미노산 막관통 도메인(transmembrane domain)이다. 이의 리간드, 즉, 트롬보포이에틴은 거대핵세포형성 및 혈소판 형성의 주요 조절인자인 것으로 밝혀졌다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "APLNR"는 아펠린 수용체, 즉, 아펠린에 결합하는 G 단백질-커플링된 수용체를 지칭한다. 이러한 수용체는 심혈관 및 중추 신경계에서, 글루코즈 대사시, 배아 및 종양 혈관형성시 및 사람 면역결핍성 바이러스 공수용체로서 관련된 것으로 밝혀졌다. 사람에서, 이러한 수용체는 APLNR 유전자(유전자 확인번호: 187)에 의해 암호화된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조혈 세포 이식체" 또는 "조혈 이식체"는 조혈 이식술에 사용될 생체외(ex vivo) 세포 생성물을 지칭한다. 조혈 세포 이식체는 동원된 말초 혈액, 태반 혈액, 제대 혈액, 양수, 골수, 간 및/또는 비장으로부터 수득된 조혈 줄기 세포 뿐만 아니라 불멸화된 HSC 및/또는 다능성 줄기 세포(예컨대, 유도된 다능성 줄기 세포) 및/또는 배아 줄기 세포로부터 수득된 HSC를 포함할 수 있다.
단계 a)에서 제공된 세포의 집단은 조혈 줄기 세포(HSC) 및, 특히 조기의 원시 HSC를 포함한다.
바람직하게는, 단계 a)에서 제공된 세포의 집단은 사람 세포의 집단이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"는 다능성 및 자가-재생 둘 다의 능력을 지니는 세포를 지칭한다. 다능성은 모든 기능성 혈액 세포, 예컨대, B 세포, T 세포, NK 세포, 림프구 수지 세포, 골수 수지 세포, 과립구, 대식구, 거핵구 및 적혈구로 분화하는 능력이다. 자가-재생은 분화없이 HSC 자체를 생성하는 능력이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조기의 원시 HSC(early primitive HSC)"는 CD34+/CD45+ HSC의 전구체인 HSC를 지칭하며 다능성 및 자가-재생 둘 다의 능력을 지닌다. 조기의 원시 HSC는 내피의 조혈성 이전할 수 있는 조혈발생성 내피세포에 속하며 CD34-/CD45- 또는 CD34+/CD45-일 수 있다. 조기의 원시 HSC는 또한 CXCR4를 발현하고/하거나 조기 조혈성 투입(early hematopoietic commitment)(예컨대, HOXB4, c-MYC 및 MITF), 자가-재생(예컨대, HOXA9, ERG 및 RORA) 및 줄기성(stemness)(예컨대, SOX4 및 MYB)에 관련된 유전자의 상향-조절을 나타내고/내거나 장기간 배양-개시 세포(LTC-IC), 즉, 골수(BM) 기질에서 5 내지 8주(35 내지 60일) 배양 후 콜로니-형성 단위-세포(CFU)를 생성할 수 있는 HSC일 수 있다(Miller 및 Eaves, Methods Mol Med. 2002;63:123-41). 일부 바람직한 구현예에서, 용어 "조기의 원시 HSC"는 CD34-/CD45- 또는 CD34+/CD45- LTC-IC 세포를 지칭한다. 일부 다른 구현예에서, 용어 "조기의 원시 HSC"는 또한 CD34+/CD45+ 또는 CD34-/CD45+ LTC-IC 세포를 지칭한다.
단계 a)에 제공된 세포의 집단은 말초 혈액, 태반 혈액, 제대 혈액, 양수, 골수, 간 및/또는 비장으로부터 수득된 HSC, 불멸화된 HSC, 다능성 줄기 세포 및/또는 배아 줄기 세포를 포함할 수 있다.
구현예에서, 단계 a)에 제공된 세포의 집단은 말초 혈액, 양수, 골수, 간 및/또는 비장으로부터 수득된 세포, 바람직하게는 말초 혈액, 태반혈액, 제대 혈액 및/또는 골수로부터 수득된 세포를 포함하거나 이로 이루어진다. 특히, 단계 a)에서 제공된 세포의 집단은 말초 혈액, 태반 혈액, 제대 혈액, 양수, 골수, 간 또는 비장으로부터 수득된 세포의 집단, 바람직하게는 말초 혈액, 태반 혈액, 제대 혈액 또는 골수로부터 수득된 세포의 집단일 수 있다.
HSC는 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 언급된 본원의 상기의 상이한 공급원으로부터 수득될 수 있다.
예를 들면, 말초 혈액 줄기 세포는 전체 혈액 샘플에서 발견될 수 있거나 분리반출법(apheresis)으로 공지된 공정을 통해 혈액으로부터 수집될 수 있다. 말초 줄기 세포 수율은 공여체의 골수로부터의 줄기 세포의 말초 순환으로의 이주를 자극하는 화합물의 투여로 증강시킬 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들면, 과립구-콜로니 자극 인자 또는 MozobilTM(플레릭사포르)을 포함한다. 이러한 처리 후 말초 혈액은 일반적으로 "동원된 말초 혈액"으로 명명된다.
HSC는 또한 대상체의 골수로부터 수득될 수 있다. 이러한 경우에, HSC는 골의 중심에 이르는 거대 침(needle)을 통해, 대상체의 거대 뼈, 전형적으로 골반으로부터 제거된다.
제대 혈액 또는 태반 혈액은 모체가 출생 후 그녀의 영아의 제대 및 태반을 기증하는 경우 수득될 수 있다. 제대 또는 태반 혈액은 성체 혈액에서 일반적으로 발견되는 것 보다 높은 농도의 HSC를 갖는다.
보다 특수한 구현예에서, 단계 a)에서 제공된 세포의 집단은 말초 혈액, 바람직하게는 동원된 말초 혈액, 골수, 제대 혈액 또는 태반 혈액의 샘플이다.
다른 구현예에서, 단계 a)에서 제공된 세포의 집단은 불멸화된 HSC, 바람직하게는 사람 불멸화된 HSC를 포함하거나 이로 이루어진다. HSC는 베타-카테닌의 레트로바이러스-매개된 유전자 전달과 같은 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 불멸화시킬 수 있다(Templin et al. Exp Hematol. 2008 Feb;36(2):204-15).
추가의 구현예에서, 단계 a)에서 제공된 세포의 집단은 바람직하게는 유도된 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포, 보다 바람직하게는 유도된 다능성 줄기 세포로부터 선택된 다능성 줄기 세포의 시험관내 분화로부터 수득된 HSC를 포함하거나, 이로 이루어진다.
사람 배아 줄기 세포로부터 HSC를 생산하는 것은 윤리적 과제를 충족시킬 수 있다. 구현예에서, 배아 줄기 세포는 비-사람 배아 줄기 세포이다. 다른 구현예에서, 배아 줄기 세포는 사람 배아 줄기 세포이며 단, 방법 자체 또는 임의의 관련된 작용은 사람 배아의 파괴를 포함하지 않는다.
배아 줄기 세포는 이식전 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래된다. 배아 줄기 세포는 분화되지 않은 상태를 유지할 수 있거나 모든 3개의 배엽인, 외배엽, 내배엽 및 중배엽으로부터 유래되는 계통을 따라 성숙하도록 지시될 수 있다. hESC는 시험관내에서 무기한의 증식 능력을 지니며, 조혈 세포 파멸로 차별화되어, 다양한 분화 과정을 사용하여 적혈구, 골수구, 및 림프구 계통을 생성하는 것으로 밝혀졌다(Bhatia, Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007:11-6).
바람직한 구현예에서, 단계 a)에서 제공된 세포의 집단은 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)의 분화로부터, 바람직하게는 사람 iPAC의 분화로부터 수득된 HSC를 포함하거나, 이로 이루어진다.
iPSC는 재프로그래밍으로 알려진 공정에 의해, 비-다능성 세포, 전형적으로 성체 체세포로부터 유래되며, 여기서 소수의 특수한 유전자 만의 도입은 세포를 다능성으로 되도록 하는데 필수적이다. 유전자의 다양한 조합은 세포가 Oct4/Sox2/Nanog/Lin28 또는 Oct4/Sox2/KLF/cMyc와 같은 다능성으로 되도록 함이 밝혀졌다. iPSC의 사용의 하나의 이점은 배아 세포 모두의 사용 및 따라서 이의 임의의 윤리 문제를 피하는 것이다.
iPSC는 치료될 대상체(기관이식 환자) 또는 다른 대상체로부터 수득될 수 있다. 바람직하게는, iPSC는 치료될 대상체로부터의 세포;, 특히 이러한 대상체의 섬유아세포로부터 유래된다.
다능성 줄기 세포, 및 특히 iPSC 또는 배아 줄기 세포는 Bathia(supra), Doulatov et al. (Cell Stem Cell. 2013 Oct 3; 13(4): 10.1016) 또는 Sandler et al. (Nature. 2014 Jul 17;511(7509):312-8)에 기술된 임의의 방법과 같은 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여, HSC, 또는 보다 특히 조기의 원시 HSC내로 분화될 수 있다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 방법은 또한 단계 a) 전에,
다능성 줄기 세포, 특히 iPSC 또는 배아 줄기 세포, 바람직하게는 사람 iPSC 또는 사람 배아 줄기 세포, 보다 바람직하게는 사람 iPSC를 제공하는 단계,
배아체(EB) 형성을 유도하는 단계,
다능성 줄기 세포의 엔도-조혈 계통으로의 분화를 개시하는 액체 배양 배지 속에서 EB를 배양하는 단계, 및
EB 세포를 해리시키는 단계,
이에 의해 본 발명의 방법의 단계 a) 및 상술한 바와 같이 제공된 세포의 집단을 수득하는 단계를 추가로 포함한다.
다능성 줄기 세포로부터 배아체의 형성은 기술자에게 공지된 임의의 프로토콜에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 다능성 줄기 세포는 콜라게나제 IV로 처리하고 액체 배양 배지 속에서 저 부착 플레이트로 이전될 수 있다.
다능성 줄기 세포의 엔도-조혈 계통으로의 분화는 이후 배아체를 상기 분화를 개시하는 액체 배양 배지내에서 배양함으로써 수득된다. 이러한 액체 배양 배지는 배아체의 형성 동안 사용된 배양 배지와 동일할 수 있다.
다능성 줄기 세포의 엔도-조혈 계통으로의 분화를 개시하는 수개의 배양 배지가 기술되어 있으며(참고: 예컨대, Lapillonne et al., haematological, 2010; 95(10), Doulatov et al., Cell Stem Cell. 2013, 13(4)) 본 발명에서 사용될 수 있다.
그러나, 본 발명자들은 사이토킨 및 성장 인자의 특수한 조합을 포함하는 배양 배지가 버스트(burst)없이 잘 정의된 조밀한 구체 구조를 나타낸 분화된 배아체를 제공함을 밝혀내었다. 따라서, 특수한 구현예에서, 다능성 줄기 세포의 엔도-조혈 계통으로의 분화를 개시하는 배양 배지는 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FMS-유사 타이로신 키나제 3(FLT3) 리간드, 골형성 단백질 4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 1(IL1), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1)를 포함한다. 이러한 배양 배지는 또한 혈장, 혈청, 혈소판 분해물, 혈청 알부민, 트랜스페린 또는 이의 대체제 및/또는 인슐린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 (i) 혈장, 혈청 및/또는 혈소판 분해물, 및 (ii) 트랜스페린 및 인슐린을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 다능성 줄기 세포의 엔도-조혈 계통으로의 분화를 개시하는 배양 배지는 본 발명의 배양 배지이며 이후 기술되어 있다.
바람직하게는, 배아체는 액체 배양 배지 속에서 14 내지 19일 동안, 보다 바람직하게는 15 내지 18일 동안, 및 심지어 보다 바람직하게는 17일 동안 배양된다. 바람직한 구현예에서, 배아체는 본 발명의 액체 배양 배지 속에서 배양되며 이후 14 내지 19일 동안, 보다 바람직하게는 15 내지 18일 동안, 및 심지어 보다 바람직하게는 17일 동안 배양된다.
분화된 배아체는 이후 예를 들면, 콜라게나제 B 및 세포 해리 완충액, 또는 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 해리된다.
본원의 실험 단락에서 입증되는 바와 같이, 해리된 세포의 집단은 HSC, 및 특히 조기의 원시 HSC를 포함하며, 본 발명의 방법의 단계 a)에서 제공될 수 있다.
HSC를 포함하는 세포의 집단내 조기의 원시 HSC의 존재는 당해 분야의 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들면, Liu et al. Methods Mol Biol. 2013;946:241-56에 기술된 바와 같은 장기간 배양 개시 세포(LTC-IC) 검정을 사용하여 평가할 수 있다.
조기의 원시 HSC를 포함하는, HSC는 본 발명의 방법에서 사용되기 전에 저장될 수 있다. 특히, 세포는 임의로 DMSO와 같은 동결-보존제의 존재하에서, 연장된 기간 동안 동결보존될 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 b)에서, 단계 a)에서 제공되고 상기 기술된 바와 같은 집단의 세포는 세포 표면 항원 CD135 및/또는 CD110의 발현, 및/또는 APLNR의 발현을 기반으로 분류된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 세포의 "분류"는 머커 발현과 같이 규정된 기준에 따라 세포를 그룹으로 분리하는 작동을 지칭한다. 형광성 활성화된 세포 분류(FACS) 또는 자기-활성화된 세포 분류(MACS)를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 규정된 기준에 따라 세포를 분리하는 기술자에게 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 표현 특수한 단백질, 예컨대, 세포 표면 항원"의 발현을 기반으로 하는 분류"는 상기 단백질을 발현하는 세포 및 상기 단백질을 발현하지 않는 세포를 분리하는 작동을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, CD135, CD110 또는 APLNR의 발현은 세포의 표면에서 검출된다. 그러나, 구체적인 mRNA(예컨대, RT-PCR)을 검출하는 방법과 같이, 기술자에게 공지되고 이러한 발현의 검출을 허용하는 임의의 다른 방법을 사용할 수 있다.
세포는
- 세포 표면 항원 CD135 및 CD110의 발현, 및 임의로 APLNR의 발현; 또는
- 세포 표면 항원 CD135의 발현, 및 임의로 APLNR 및 CD110의 발현; 또는
- 세포 표면 항원 CD135, 및 임의로 APLNR의 발현; 또는
- 세포 표면 항원 CD135의 발현, 및 임의로 CD110의 발현; 또는
- 세포 표면 항원 CD110의 발현, 및 임의로 APLNR의 발현; 또는
- 세포 표면 항원 CD110의 발현, 및 임의로 세포 표면 항원 CD135의 발현; 또는
- 세포 표면 항원 CD110의 발현, 및 임의로 APLNR 및 CD135의 발현; 또는
- 세포 표면 항원 CD135 및 CD110의 발현, 및 APLNR의 발현; 또는
- 세포 표면 항원 CD135의 발현 및 APLNR의 발현; 또는
- 세포 표면 항원 CD110의 발현 및 APLNR의 발현; 또는
- APLNR의 발현, 및 임의로 세포 표면 항원 CD135 및 CD110의 발현; 또는
- APLNR의 발현, 및 임의로 세포 표면 항원 CD135의 발현; 또는
- APLNR의 발현, 및 임의로 세포 표면 항원 CD110의 발현을 기반으로 하여 분류될 수 있다.
세포가 2개 또는 3개의 마커, 예컨대, CD135, CD110 및 APLNR의 발현을 기반으로 분류되는 구현예에서, 각각의 이러한 마커를 기반으로 하는 선택은 동시 또는 임의의 순서로 순차적일 수 있다.
특수한 구현예에서, 단계 b)에서 세포는 세포 표면 항원 CD135 및/또는 CD110, 바람직하게는 CD135 또는 CD110의 발현을 기반으로 하여 분류된다. 바람직한 구현예에서, 단계 b)에서 세포는 세포 표면 항원 CD110의 발현, 및 임의로 세포 표면 항원 CD135의 발현을 기반으로 하여 분류된다. 이러한 구현예에서, 방법은 단계 b) 이전에, 후에 또는 이와 동시에, APLNR의 발현을 기반으로 하여 세포를 분류함을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 c)에서, CD135+ 및/또는 CD110+ 및/또는 APLNR+인 세포가 회수된다.
바람직한 구현예에서, CD110+인 세포가 회수된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "+"는 바람직하게는 세포 표면에서, 목적한 마커의 발현을 지칭한다. 예를 들면, CD135+ 세포는 세포 표면 항원 CD135를 발현하는 세포이며, CD110+/APLNR+ 세포는 세포 표면 항원 CD110 및 APLNR을 발현하는 세포이다. 대조적으로, 용어 "-"는 바람직하게는 세포 표면에서 목적한 마커의 발현의 결여를 지칭한다. 예를 들면, CD135- 세포는 세포 표면 항원 CD135를 발현하지 않는 세포이며, CD110+/APLNR- 세포는 세포 표면 항원 CD110을 발현하고 APLNR을 발현하지 않는 세포이다.
세포를 분류하는데 사용된 방법에 따라서, 단계 b) 및 c)는 순차적이거나 동시일 수 있다.
분류 단계 동안 사용된 마커에 따라서, 회수된 세포는 CD135+ 세포, CD110+ 세포, APLNR+ 세포, CD135+/CD110+ 세포, CD135+/APLNR+ 세포, CD110+/APLNR+ 세포, 또는 CD135+/CD110+/APLNR+ 세포일 수 있다. 바람직하게는, 세포는 CD110+ 세포, CD135+/CD110+ 세포, CD110+/APLNR+ 세포 또는 CD135+/CD110+/APLNR+ 세포이다.
이러한 세포는 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있으며 HSC 이식법에 사용될 수 있다.
경우에 따라서, 본 발명의 방법은 CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+ HSC에 대한 세포 생성물을 농축시키기 위하여 CD135, CD110 및/또는 APLNR의 발현을 기반으로 한 수개의 연속적인 분류 단계를 포함할 수 있다.
임의로, 사용 전에, 이러한 세포는 분류될 수 있으며, 특히 임의로 DMS와 같은 동결-보존제의 존재하에서, 단기간 또는 연장된 기간 동안 동결보존될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한
a) 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계, 및
b) 세포 표면 항원 CD135 및/또는 CD110의 발현, 및/또는 아펠린 수용체(APLNR)의 발현, 바람직하게는 세포 표면 항원 CD110의 발현에 대해 상기 세포를평가하는 단계, 및
c) CD135+ 및/또는 CD110+ 및/또는 APLNR+, 바람직하게는 CD110+인 세포를 확인하고/하거나 선택하는 단계를 포함하는, 조혈 이식술에 적합한, 즉, 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 조혈 줄기 세포를 확인하고/하거나 선택하기 위한 방법, 바람직하게는 시험관내 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조혈 세포 이식체를 제조하는 방법을 위한 상술한 모든 구현예가 또한 이러한 양태에 포함된다.
세포 표면 항원 CD135 및/또는 CD110의 발현, 및/또는 아펠린 수용체(APLNR)의 발현은 FACS, MACS, 면역조직화학, 웨스턴-블롯(Western-blot), 단백질 또는 항체 배열, RT-PCR과 같은 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 또는 전사체 접근법에 의해 평가할 수 있다.
CD135, CD110 또는 APLNR의 발현을 평가하는데 사용된 방법에 따라서, 단계 b) 및 c)는 순차적이거나 동시일 수 있다. 예를 들면, FACS 또는 MACS를 사용하는 경우, 발현 및 선택의 검출은 동시일 수 있다.
CD135+ 및/또는 CD110+ 및/또는 APLNR+ 확인되고/되거나 선택된 세포는 조혈 이식체로서 사용될 수 있거나 조혈 이식체의 효능을 개선시키기 위하여 조혈 이식체(예컨대, 골수 또는 제대 혈액 이식)에 가해질 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 또한
다능성 줄기 세포, 특히 iPSC 또는 배아 줄기 세포, 바람직하게는 사람 iPSC 또는 사람 배아 줄기 세포, 보다 바람직하게는 사람 iPSC를 제공하는 단계,
배아체(EB) 형성을 유도하는 단계,
다능성 줄기 세포의 엔도-조혈 계통으로의 분화를 개시하는 액체 배양 배지 속에서 EB를 배양하는 단계,
EB 세포를 해리시키는 단계,
세포 표면 항원 CD135 및/또는 CD110, 및/또는 아펠린 수용체(APLNR)의 발현을 기반으로 하여, 바람직하게는 세포 표면 항원 CD110을 기반으로 하여 해리된 EB 세포를 분류하는 단계, 및
CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+, 바람직하게는 CD110+인 세포를 회수하는 단계를 포함하는, 다능성 줄기 세포로부터 이식가능한 HSC를 생산하는 방법, 바람직하게는 시험관내 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조혈 세포 이식체를 제조하는 방법을 위한 상술한 모든 구현예는 또한 이러한 양태에 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이식가능한 HSC"는 조혈 이식술에 적합한, 즉, 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 조혈 줄기 세포를 지칭한다.
바람직하게는, 다능성 줄기 세포의 엔도-조혈 계통으로의 분화를 개시하는 배양 배지는 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FMS-유사 타이로신 키나제 3(FLT3) 리간드, 골 형성 인자 단백질 4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 1(IL1), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1)를 포함한다. 이러한 배양 배지는 또한 혈장, 혈청, 혈소판 분해물, 혈청 알부민, 트랜스페린 또는 이의 대체제 및/또는 인슐린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 (i) 혈장, 혈청 및/또는 혈소판 분해물, 및 (ii) 트랜스페린 및 인슐린을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 다능성 줄기 세포의 엔도-조혈 계통으로의 분화를 개시하는 배양 배지는 본 발명의 및 이후 기술된 배양 배지이다.
바람직하게는, 배아체는 액체 배양 배지 속에서 14 내지 19일 동안, 보다 바람직하게는 15 내지 18일 동안, 및 심지어 보다 바람직하게는 17일 동안 배양된다. 바람직한 구현예에서, 배아체는 본 발명 및 이후 기술된 액체 배양 배지 속에서 14 내지 19일 동안, 보다 바람직하게는 15 내지 18일 동안, 및 심지어 보다 바람직하게는 17일 동안 배양된다.
본원에 입증된 바와 같이, CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+ HSC는 생체내에서 다중계통 조혈 재구성 및 자가-재생을 뒷받침하는 장기간 다능성 HSC이며, 이에 따라 HSC 이식술용 세포의 탁월한 공급원을 구성한다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 조혈 이식술에 적합한, 즉 이식, 및 특히 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 조혈 이식술용으로 적합한 조혈 줄기 세포의 마커로서 CD135, CD110 및/또는 APLNR의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 조혈 세포 이식체의 잠재능을 평가하기 위한 마커로서 및/또는 조혈 이식체 결과 및/또는 성능을 예측하기 위한 마커로서 CD135, CD110 및/또는 APLNR의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 CD135, CD110 및/또는 APLNR을 발현하는 HSC의 존재 또는 부재에 대해, 바람직하게는 CD110을 발현하는 HSC의 존재 또는 부재, 즉, 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 세포의 존재 또는 부재에 대해 조혈 세포 이식체를 평가하는 단계를 포함하는, 조혈 세포 이식체의 잠재능을 평가하는 방법, 바람직하게는 시험관내 방법에 관한 것이며, 상기 세포의 부재는 낮은 잠재능 또는 잠재능의 결여의 지표이다. 역으로, CD135, CD110 및/또는 APLNR을 발현하는 HSC의 존재는 양호한 잠재능의 지표로 고려될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "잠재능"은 제공된 결과에 영향을 미치는 세포 생성물의 특이적인 능력, 및 특히 이식술시, 생체내 다중-계통 조혈 재구성 및 자가-재생을 제공하는, 즉, 기관이식 환자 내에서 면역-조혈 시스템을 재생시키는 조혈 세포 생성물의 능력을 지칭한다.
잠재능이 낮거나 결여된 조혈 세포 이식체의 이식물은 이식체 실패를 야기할 수 있다. 결과적으로, CD135, CD110 및/또는 APLNR을 발현하는 임의의 HSC를 포함하지 않는 조혈 세포 이식체는 이식술에 사용되지 않아야 한다.
본 발명은 조혈 세포 이식체에서 CD135, CD110 및/또는 APLNR을 발현하는, 바람직하게는 CD110을 발현하는 HSC의 존재 또는 부재를 조혈 세포 이식체내에서 검출하는 단계를 포함하는, HSC 이식의 결과를 예측하는 방법, 바람직하게는 시험관내 방법에 관한 것이며, 상기 세포의 부재는 불량한 예후, 즉, 이식체 실패의 고 위험의 지표이다. 역으로, CD135, CD110 및/또는 APLNR를 발현하는 HSC의 존재는 양호한 예후의 지표로 고려될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "불량한 예후"는 감소된 환자 생존 및/또는 이식체 실패의 고 위험, 즉, 이식술이 기관이식 환자내에서 면역-조혈 시스템을 생성하는데 실패하는 고 위험을 지칭한다. 역으로, 용어 "양호한 예후"는 증가된 환자 생존 및 이식술의 성공의 증가된 가능성, 즉, 이식술이 기관이식 환자내에서 면역-조혈 시스템의 재생을 허용하는 증가된 가능성을 지칭한다.
본 발명은 CD135, CD110 및/또는 APLNR을 발현하는, 바람직하게는 CD110을 발현하는 HSC의 존재 또는 부재를 조혈 세포 이식체내에서 검출하는 단계를 포함하는 조혈 세포 이식체의 이식 잠재능을 예측하는 방법, 바람직하게는 시험관내 방법에 관한 것이며, 상기 세포의 부재는 불량한 이식 잠재능, 즉, 이식체 실패의 고 위험의 지표이다. 역으로, CD135, CD110 및/또는 APLNR을 발현하는 HSC의 부재는 양호한 이식 잠재능, 즉, 이식술의 성공의 증가된 가능성의 지표로서 고려될 수 있다.
CD135, CD110 및/또는 APLNR을 발현하는 HSC의 존재 또는 부재는 기술자에게 공지되거나 상기 기술된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+ 세포는 형광성 활성화된 세포 분류(FACS), 자기-활성화된 세포 분류(MACS), 또는 CD135, CD110 또는 APLNR에 대해 지시된 항체를 사용한 임의의 면역검정을 사용하여 검출할 수 있다. CD135, CD110 또는 APLNR에 대해 지시된 모노클로날 항체는 상업적으로 이용가능하다.
조혈 세포 이식체의 잠재능을 평가하거나, HSC 이식술의 결과를 예측하거나, 상술한 바와 같은 조혈 세포 이식체의 이식 잠재능을 예측하는 방법은 또한 살아있는 핵화된 세포(TNC)의 총 수를 계수하고/하거나 살아있는 CD34+ 세포의 총 수를 측정하고/하거나, 살아있는 CD34+ 세포의 총 수를 측정하고/하거나 자극성 성장 인자(CFU 검정)가 보충된 메틸셀룰로즈-기반 배양 배지 속에서 조혈 세포의 콜로니를 생산할 수 있는 기능성 선조 세포의 수를 측정하고/하거나, LTC-IC 빈도를 측정하는 것과 같은 기술자에 의해 통상적으로 사용된 임의의 다른 표현형 또는 기능성 검정을 추가로 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 임의의 방법에 따라 제조된 조혈 세포 이식체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 조혈 세포 이식체에 관한 것이며, 여기서 적어도 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 70%의 세포는 CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+ 조혈 줄기 세포, 바람직하게는 CD110+ 조혈 줄기 세포, 및 약제학적으로 허용되는 담체이다. 바람직하게는, 조혈 세포 이식체의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 세포는 CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+ 조혈 줄기 세포, 바람직하게는 CD110+ 조혈 줄기 세포이다. 보다 바람직하게는, 조혈 세포 이식체의 적어도 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 세포는 CD135+ 및/또는 CD110+ HSC, 바람직하게는 CD110+ HSC이다.
CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+ HSC의 비율은 기술자에게 공지되거나 본원에 기술된 임의의 방법을 사용하여 용이하게 측정할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는"은 동물 및/또는 사람에서 사용하기 위해, 규제 기관 또는 유럽 약전(European Pharmacopeia)과 같은 인식된 약전에 의해 승인됨을 의미한다. 용어 "담체 또는 "부형제"는 함께 세포가 투여되는 희석제, 보조제, 담체, 또는 비히클을 지칭한다. 당해 분야에 잘 공지된 바와 같이, 약제학적으로 허용되는 부형제는 비교적 불활성인 물질, 바람직하게는 기술자에게 잘 공지된 주사가능한 물질이다.
본 발명의 조혈 세포 이식체를 제조하는 방법을 위한 상술된 모든 구현예는 또한 이러한 양태에 포함된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질환, 상태에 의해 유발된 조혈에 있어서의 결핍증과 관련된 장애의 치료, 또는 골수형성 치료, 특히 악성 또는 비-악성 질환의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 조혈 세포 이식체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 질환, 상태에 의해 유발된 조혈에 있어서의 결핍증과 관련된 다양한 장애의 치료, 또는 골수형성 치료, 특히 악성 또는 비-악성 질환의 치료용 의약을 제조하기 위한, 본 발명의 조혈 세포 이식체의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본 발명의 조혈 세포 이식체를 투여함을 포함하여, 상기 대상체에서 질환, 상태에 의해 유발된 조혈에 있어서의 결핍증과 관련된 장애의 치료, 또는 골수형성 치료, 특히 악성 또는 비-악성 질환을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상술된 본 발명의 방법에 따른 조혈 세포 이식체의 잠재능을 평가하는 단계 및, 잠재능이 양호한 경우, 이를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 상기 조혈 세포 이식체를 투여함을 포함하여, 상기 대상체에서 질환, 상태에 의해 유발된 조혈에 있어서의 결핍증과 관련된 다양한 장애의 치료, 또는 골수형성 치료, 특히 악성 또는 비-악성 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조혈 세포 이식체를 제조하는 방법을 위한, 조혈 세포 이식체의 잠재능을 평가하기 위한 또는 본 발명의 조혈 세포 이식체를 위한 상술한 모든 구현예가 또한 이러한 양태에 포함된다.
악성 질환(malignant diseases)의 예는 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종, 호지킨 질환, 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상 증후군, 골수증식성 장애, 만성 림프성 백혈병, 청소년 만성 골수성 백혈병, 신경모세포종, 난소암 및 생식세포 종양을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
비-악성 질환의 예는 자가면역 장애, 아밀로이드증, 무형성빈혈, 발작성야간혈색뇨, 판코니 빈혈, 블랙팬-다이아몬드 빈혈, 종증성 지중해 빈혈, 겸상 적혈구성 빈혈, 중증 복합병 면역결핍증, 비스코트-알드리히 증후군 및 선천성 대사장애증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
용어 "대상체" 또는 "환자"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 심지어 보다 바람직하게는 성인, 어린이 및 태아 단계의 사람을 포함하는 사람을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하다" 또는 "치료하는"은 질환의 치료요법, 방지, 예방 및 지연과 같은 환자의 건강 상태를 완화시키기 위해 의도된 임의의 작용을 지칭한다. 특정의 구현예에서, 이러한 용어는 질환 또는 질환과 관련된 장애의 완화 또는 근절에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 이러한 용어는 이러한 질환을 지닌 대상체에게 하나 이상의 치료제의 투여로부터 야기되는 질환의 확산 또는 악화를 최소화시킴을 지칭한다. 일부 구현예에서, 이러한 용어는 기관이식 환자에서 면역-조혈 시스템의 재생을 지칭할 수 있다.
"치료학적 유효량"은 상기 정의한 바와 같은 악성 또는 비-악성 질환의 치료를 구성하기에 충분한 대상체에게 투여된 조혈 세포 이식체의 양을 의도한다. 일부 구현예에서, 이러한 용어는 기관 이식 환자에서 면역-조혈 시스템을 재생시키는데 필수적인 조혈 세포 이식체의 양을 지칭할 수 있다.
치료학적 유효량은 환자의 생리학적 데이타(예컨대, 연령, 체격, 및 체중) 및 치료될 질환에 따른, 조혈 세포 이식체내 CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+ 세포의 비율에 따라 변할 수 있다.
구현예에서, 104 내지 107, 바람직하게는 105 내지 107, 및 보다 바람직하게는 3.105 내지 6.106, CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+ 세포/kg의 환자의 체중이 투여된다. 특수한 구현예에서, 환자의 체중 kg당 105 내지 106, 바람직하게는 1.105 내지 5.105의, CD135+ 및/또는 CD110+ 세포, 바람직하게는 CD110+ 세포가 투여된다. 다른 특수한 구현예에서, 106 내지 107, 바람직하게는 3.106 내지 8.106의, APLNR+ 세포/kg의 환자의 체중이 투여된다.
본 발명에 따른 조혈 세포 이식체는 치료될 질환에 따라, 다른 화학치료요법, 면역치료요법, 방사선치료요법, 또는 수술과 같은 다른 치료요법과 함께 사용될 수 있다.
용어 "면역치료요법"은 악성 종양 세포 또는 질환에 관여하는 세포를 공격하는 환자의 면역계를 자극시키는 치료학적 치료를 지칭한다. 이는 특이적인 항원을 사용한 환자의 면역화(예컨대, 암 백신을 투여함으로써), 사이토킨과 같은 면역계를 자극시키는 분자의 투여, 또는 약물로서 치료학적 항체의 투여를 포함한다.
용어 "방사선치료요법'은 내부 및 외부 방사선 치료요법, 방사선면역치료요법을 포함하는 다수 유형의 방사선 치료요법, 및 X-선, 감마선, 알파 입자, 베타 입자, 양성자, 전자, 중성자, 방사선동위원소, 및 다른 형태의 이온화 방사선을 포함하는 다양한 유형의 방사선의 사용을 지칭하기 위해 당해 분야에서 일반적으로 사용된 용어이다. 특히, 방사선 치료요법은 골수 외부에 확산될 수 있는 질환을 치료하거나, 골 통증을 경감시키거나 줄기 세포 이식 전에 전체 신체 조사(irradiation)를 위해 사용될 수 있다.
화학치료요법은 악성 질환을 치료하는데 사용될 수 있으며, 예를 들면, 빈크리스틴, 다우노루비신, 독소루비신, 이다루비신, 미톡산트론, 사이타라빈, 아스파라기나제, 에토포시드, 테니포시드, 머캅토푸린, 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 프레드니손, 덱사메타손, 부설판, 하이드록시우레아 또는 인터페론 알파, 또는 임의의 다른 관련된 화학치료요법을 포함할 수 있다.
조혈 세포 이식체는 자가의, 동계 또는 동종이계 이식술에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "동종이계 이식술"은 수용체와 유전적으로 동일하지 않지만 동일한 종의 공여체로부터 유래되거나 기원한 세포의 이식술을 지칭한다. "자가의 이식술"은 동일한 대상체로부터 유래되거나 기원한 세포의 이식술을 지칭한다. 공여체 및 수용체는 동일한 대상체로부터 유래되거나 기원한 세포의 이식술을 지칭한다. 공여체 및 수용체는 동일한 사람이다. "공계 이식술"은 수용체와 유전적으로 동일한 공여체로부터 유래되거나 기원한 세포의 이식술을 지칭한다.
특수한 구현예에서, 조혈 세포 이식체는 자가 이식술 및 HSC에 사용되는 것으로 의도되며, 특히 CD135+, CD110 및/또는 APLNR+ 세포는 치료될 대상체로부터 기원한 유도된 다능성 줄기 세포로부터 유래된다.
다른 특수한 구현예에서, 조혈 세포 이식체는 동종이계 이식술 및 HSC에 사용되는 것으로 의도되며, 특히 CD135+, CD110 및/또는 APLNR+ 세포는 태반 또는 제대 혈액으로부터 유래된다.
실험 단락에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 액체 세포 배양 배지를 개발하였으며, 여기서 다능성 줄기 세포로부터 수득된 골수체의 엔도-조혈 계통으로의 분화 공정은 지연된다. 따라서, 이러한 배양 배지는 생체내에서 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 조기의 원시 조혈 줄기 세포, 즉, GMP-등급 배양 조건 하에서 CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+ HSC를 생산 및 선택하도록 한다.
따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 또한 (i) 혈장, 혈청, 혈소판 분해물 및/또는 혈청 알부민, 및 (ii) 트랜스페린 또는 이의 대체제, 인슐린 또는 이의 대체제, 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FMS-유사 타이로신 키나제 3 리간드(FLT3-L), 골 형태형성 단백질 4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 1(IL1), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1)를 포함하거나, 이로 이루어진 액체 세포 배양 배지에 관한 것이다. 바람직하게는, 액체 세포 배양 배지는 (i) 혈장, 혈청 및/또는 혈소판 분해물, 및 (ii) 트랜스페린, 인슐린, 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FMS-유사 타이로신 키나제 3 리간드(FLT3-L), 골 형태형성 단백질 4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 1(IL1), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1)를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어진다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 배양 배지"는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포, 보다 특히 사람 세포의 성장을 지속시키기 쉬운 기본 배양 배지를 포함하는 임의의 배양 배지, 특히 임의의 액체 배양 배지에 관한 것이다. 기본 배양 배지는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "로 필수적으로 이루어진"은 (i) 혈장, 혈청, 혈소판 분해물 및/또는 혈청 알부민, 바람직하게는 혈장, 혈청 및/또는 혈소판 분해물, 및 (ii) 트랜스페린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 트랜스페린, 인슐린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 인슐린, 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FMS-유사 타이로신 키나제 3 리간드(FLT3-L), 골 형태형성 단백질 4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 1(IL1), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1)를 포함하는 배양 배지를 지칭하며, 임의의 다른 사이토킨 또는 성장 인자를 포함하지 않는다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 배양 배지는 여기에 (i) 혈장, 혈청, 혈소판 분해물 및/또는 혈청 알부민, 바람직하게는 혈장, 혈청 및/또는 혈소판 분해물, 및 (ii) 트랜스페린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 트랜스페린, 인슐린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 인슐린, 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FMS-유사 타이로신 키나제 3 리간드(FLT3-L), 골 형태형성 단백질 4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 1(IL1), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1)이 첨가된 기본 배양 배지로서, 글루타민 또는 글루타민-함유 펩타이드가 임의로 보충된 이스코브스 개질된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium: IMDM)를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 5 μg/mL 내지 20 μg/mL의 인슐린, 보다 바람직하게는 8μg/mL 내지 12 μg/mL, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 10μg/mL의 인슐린을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 인슐린은 사람 인슐린, 바람직하게는 사람 재조합 인슐린이다.
인슐린 대체제는 세포 배양 배지 속에서 인슐린과 동일한 기능을 충족시키는 기술자에게 공지된 임의의 화합물일 수 있다. 특히, 이러한 대체제는 소 분자 또는 앱타머 효능제(aptamer agonist)와 같은 임의의 인슐린 수용체 효능제일 수 있다. 소 분자 인슐린 수용체 효능제는 예를 들면, Qiang et al. Diabetes. 2014 Apr;63(4):1394-409에 기술되어 있으며, 앱타머 효능제는 예를 들면, Yunn et al. Nucleic Acids Res. 2015 Sep 18;43(16):7688-701에 기술되어 있다. 바람직하게는, 인슐린은 Wong et al. Cytotechnology. 2004 Jul;45(3):107-15에 기술된 바와 같은 아연 염으로 대체된다. 아연 염의 예는 염화아연, 질산아연, 브롬화아연 또는 황산아연을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 인슐린 대체제는 아연 염이다. 인슐린 대체제의 농도는 상기 화합물의 특성에 의존하며 기술자에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 10 μg/mL 내지 100μg/mL의 트랜스페린, 바람직하게는 30 μg/mL 내지 60 μg/mL의 트랜스페린, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 45 μg/mL의 트랜스페린을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 트랜스페린은 철-포화된 사람 트랜스페린, 바람직하게는 재조합 철-포화된 사람 트랜스페린이다.
트랜스페린 대체제는 세포 배양 배지 속에서 트랜스페린과 동일한 기능을 충족시키는 기술자에 의해 공지된 임의의 화합물일 수 있다. 특히, 트랜스페린은 철 킬레이터(iron chelator) 또는 시트르산철, 질산철 또는 황산철과 같은 무기 철 염으로 대체될 수 있다. 적합한 철 킬레이터의 예는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 에그타즈산(EGTA), 데페록사민 메실레이트, 디머카프롤 또는 펜테트산(DPTA)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 트랜스페린 대체제의 농도는 상기 화합물의 특성에 의존하며 기술자에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
트랜스페린 대체제의 농도는 상기 화합물의 특성에 의존하여 기술자에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
배양 배지는 혈장, 혈청, 혈소판 분해물 및/또는 혈청 알부민, 바람직하게는 혈장, 혈청 및/또는 혈소판 분해물, 보다 바람직하게는 혈장 또는 혈청 또는 혈소판 분해물 또는 혈청 알부민, 및 심지어 보다 바람직하게는 혈장 또는 혈청 또는 혈소판 분해물을 포함할 수 있다. 배양 배지는 1% 내지 20%의 혈장 또는 혈청, 바람직하게는 2% 내지 10%의 혈장 또는 혈청, 및 보다 바람직하게는 약 5%의 혈장 또는 혈청을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 혈장 또는 혈청은 사람 혈장 또는 혈청이다. 대안적으로, 또는 또한, 배양 배지는 0.1% 내지 2% 혈소판 분해물, 바람직하게는 0.2% 내지 1% 혈소판 분해물, 및 보다 바람직하게는 약 0.5% 혈소판 분해물을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 혈소판 분해물은 사람 혈소판 분해물이다. 대안적으로, 또는 또한, 배양 배지는 0.1% 내지 2% 혈청 알부민, 바람직하게는 0.5% 내지 1% 혈청 알부민을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 혈청 알부민은 사람 혈청 알부민이다.
바람직하게는 본 발명의 배양 배지는 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 SCF, 보다 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 SCF, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 24 ng/mL의 SCF를 포함한다. 바람직한 구현예에서, SCF는 사람 SCF, 바람직하게는 재조합 사람 SCF이다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 TPO, 보다 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 TPO, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 21 ng/mL의 TPO를 포함한다. 바람직한 구현예에서, TPO는 사람 TPO, 바람직하게는 재조합 사람 TPO이다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 FLT3-L, 보다 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 FLT3-L, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 21 ng/mL의 FLT3-L을 포함한다. 바람직한 구현예에서, FLT3-L는 사람 FLT3-L, 바람직하게는 재조합 사람 FLT3-L이다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 50 ng/mL 내지 300 ng/mL의 BMP4, 보다 바람직하게는 150 ng/mL 내지 250 ng/mL의 BMP4, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 194 ng/mL의 BMP4를 포함한다. 바람직한 구현예에서, BMP4는 사람 BMP4, 바람직하게는 재조합 사람 BMP4이다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 50 ng/mL 내지 300 ng/mL의 VEGF, 보다 바람직하게는 150 ng/mL 내지 250 ng/mL의 VEGF, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 200 ng/mL의 VEGF를 포함한다. 바람직한 구현예에서, VEGF는 사람 VEGF, 바람직하게는 재조합 사람 VEGF, 및 보다 바람직하게는 재조합 사람 VEGF-A165이다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 IL3, 보다 바람직하게는 20 ng/mL 내지 80 ng/mL의 IL3, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 50 ng/mL의 IL3를 포함한다. 바람직한 구현예에서, IL3은 사람 IL3, 바람직하게는 재조합 사람 IL3이다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 IL6, 보다 바람직하게는 20 ng/mL 내지 80 ng/mL의 IL6, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 50 ng/mL의 IL6을 포함한다. 바람직한 구현예에서, IL6은 사람 IL6, 바람직하게는 재조합 사람 IL6이다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 1 ng/mL 내지 20 ng/mL의 IL1, 보다 바람직하게는 1 ng/mL 내지 10 ng/mL의 IL1, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 5 ng/mL의 IL1을 포함한다. 바람직한 구현예에서, IL1은 사람 IL1, 바람직하게는 재조합 사람 IL1이다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 10 ng/mL 내지 200 ng/mL의 GCSF, 보다 바람직하게는 50 ng/mL 내지 150 ng/mL의 GCSF, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 100 ng/mL의 GCSF를 포함한다. 바람직한 구현예에서, GCSF는 사람 GCSF, 바람직하게는 재조합 사람 GCSF이다.
바람직하게는, 본 발명의 배양 배지는 1 ng/mL 내지 10 ng/mL의 IGF1, 보다 바람직하게는 1 ng/mL 내지 10 ng/mL의 IGF1, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 5 ng/mL의 IGF1을 포함한다. 바람직한 구현예에서, IGF1은 사람 IGF1, 바람직하게는 재조합 사람 IGF1이다.
특수한 구현예에서, 본 발명의 액체 세포 배양 배지는
- 1% 내지 20%의 혈장 또는 혈청, 바람직하게는 2% 내지 10%의 혈장 또는 혈청; 또는 0.1% 내지 2% 혈소판 분해물, 바람직하게는 0.2% 내지 1% 혈소판 분해물; 또는 0.1% 내지 2% 혈청 알부민, 바람직하게는 0.5% 내지 1% 혈청 알부민; 및/또는
- 5 μg/mL 내지 20 μg/mL의 인슐린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 인슐린, 바람직하게는 8μg/mL 내지 12 μg/mL의 인슐린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 인슐린; 및/또는
- 10 μg/mL 내지 100μg/mL의 트랜스페린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 트랜스페린, 바람직하게는 30 μg/mL 내지 60 μg/mL의 트랜스페린 또는 이의 대체제, 바람직하게는 트랜스페린; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 SCF, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 SCF; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 TPO, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 TPO; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 FLT3-L, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 FLT3-L; 및/또는
- 100 ng/mL 내지 500 ng/mL의 BMP4, 바람직하게는 150 ng/mL 내지 250 ng/mL의 BMP4; 및/또는
- 50 ng/mL 내지 300 ng/mL의 VEGF, 바람직하게는 150 ng/mL 내지 250 ng/mL의 VEGF; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 IL3, 바람직하게는 20 ng/mL 내지 80 ng/mL의 IL3; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 IL6, 바람직하게는 20 ng/mL 내지 80 ng/mL의 IL6; 및/또는
- 1 ng/mL 내지 20 ng/mL의 IL1, 바람직하게는 1 ng/mL 내지 10 ng/mL의 IL1; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 200 ng/mL의 GCSF, 바람직하게는 50 ng/mL 내지 150 ng/mL의 GCSF; 및/또는
- 1 ng/mL 내지 20 ng/mL의 IGF1, 바람직하게는 1 ng/mL 내지 10 ng/mL의 IGF1을 포함한다.
바람직하게는, 배지는 이러한 특징 모두를 충족한다.
다른 특수한 구현예에서, 본 발명의 액체 세포 배양 배지는
- 1% 내지 20%의 혈장 또는 혈청, 바람직하게는 2% 내지 10%의 혈장 또는 혈청; 또는 0.1% 내지 2% 혈소판 분해물, 바람직하게는 0.2% 내지 1% 혈소판 분해물; 및/또는
- 5 μg/mL 내지 20 μg/mL의 인슐린, 바람직하게는 8μg/mL 내지 12 μg/mL; 및
- 10 μg/mL 내지 100μg/mL의 트랜스페린, 바람직하게는 30 μg/mL 내지 60 μg/mL의 트랜스페린; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 SCF, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 SCF; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 TPO, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 TPO; 및/또는
- 100 ng/mL 내지 500 ng/mL의 FLT3-L, 바람직하게는 250 ng/mL 내지 350 ng/mL의 FLT3-L; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 BMP4, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 BMP4; 및/또는
- 50 ng/mL 내지 300 ng/mL의 VEGF, 바람직하게는 150 ng/mL 내지 250 ng/mL의 VEGF; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 IL3, 바람직하게는 20 ng/mL 내지 80 ng/mL의 IL3; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 IL6, 바람직하게는 20 ng/mL 내지 80 ng/mL의 IL6; 및/또는
- 1 ng/mL 내지 20 ng/mL의 IL1, 바람직하게는 1 ng/mL 내지 10 ng/mL의 IL1; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 200 ng/mL의 GCSF, 바람직하게는 50 ng/mL 내지 150 ng/mL의 GCSF; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 150 ng/mL의 IGF1, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 IGF1을 포함한다.
바람직하게는, 배지는 이러한 특징 모두를 충족시킨다.
다른 특수한 구현예에서, 본 발명의 액체 세포 배양 배지는
- 1% 내지 20%의 혈장 또는 혈청, 바람직하게는 2% 내지 10%의 혈장 또는 혈청; 또는 0.1% 내지 2% 혈소판 분해물, 바람직하게는 0.2% 내지 1% 혈소판 분해물; 및/또는
- 5 μg/mL 내지 20 μg/mL의 인슐린, 바람직하게는 8μg/mL 내지 12 μg/mL의 인슐린; 및/또는
- 10 μg/mL 내지 100μg/mL의 트랜스페린, 바람직하게는 30 μg/mL 내지 60 μg/mL의 트랜스페린; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 SCF, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 SCF; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 TPO, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 TPO; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 FLT3-L, 바람직하게는 10 ng/mL 내지 50 ng/mL의 FLT3-L; 및/또는
- 100 ng/mL 내지 500 ng/mL의 BMP4, 바람직하게는 150 ng/mL 내지 250 ng/mL의 BMP4; 및/또는
- 50 ng/mL 내지 300 ng/mL의 VEGF, 바람직하게는 150 ng/mL 내지 250 ng/mL의 VEGF; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 IL3, 바람직하게는 20 ng/mL 내지 80 ng/mL의 IL3; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 100 ng/mL의 IL6, 바람직하게는 20 ng/mL 내지 80 ng/mL의 IL6; 및/또는
- 1 ng/mL 내지 20 ng/mL의 IL1, 바람직하게는 1 ng/mL 내지 10 ng/mL의 IL1; 및/또는
- 10 ng/mL 내지 200 ng/mL의 GCSF, 바람직하게는 50 ng/mL 내지 150 ng/mL의 GCSF; 및/또는
- 1 ng/mL 내지 20 ng/mL의 IGF1, 바람직하게는 1 ng/mL 내지 10 ng/mL의 IGF1을 포함한다.
바람직하게는, 배지는 이러한 특징 모두를 충족시킨다.
다른 특수한 구현예에서, 본 발명의 액체 세포 배양 배지는 (i) 약 5%의 혈장 또는 혈청 또는 약 0.5% 혈소판 분해물, 및 (ii) 약 10 μg/mL의 인슐린, 약 45 μg/mL의 트랜스페린, 약 22 ng/mL의 SCF, 약 20 ng/mL의 TPO, 약 300 ng/mL의 FLT3-L, 약 22 ng/mL의 BMP4, 약 200 ng/mL의 VEGF, 약 50 ng/mL의 IL3, 약 50 ng/mL의 IL6, 약 5 ng/mL의 IL1, 약 100 ng/mL의 GCSF 및 약 50 ng/mL의 IGF1을 포함한다.
추가의 특수한 구현예에서, 본 발명의 액체 세포 배양 배지는 (i) 약 5%의 혈장 또는 혈청 또는 약 0.5% 혈소판 분해물, 및 (ii) 약 10 μg/mL의 인슐린, 약 45 μg/mL의 트랜스페린, 약 24 ng/mL의 SCF, 약 21 ng/mL의 TPO, 약 21 ng/mL의 FLT3-L, 약 194 ng/mL의 BMP4, 약 200 ng/mL의 VEGF, 약 50 ng/mL의 IL3, 약 50 ng/mL의 IL6, 약 5 ng/mL의 IL1, 약 100 ng/mL의 GCSF 및 약 5 ng/mL의 IGF1을 포함한다.
배양 배지가 혈장 또는 혈청을 포함하는 구현예에서, 이는 유리하게는 헤파린, 바람직하게는 0.5 U/mL 내지 5 U/mL의 헤파린, 보다 바람직하게는 2 U/mL 내지 4 U/mL의 헤파린, 및 심지어 보다 바람직하게는 약 3 U/mL의 헤파린을 포함한다.
본 발명은 또한 특히 공급자 세포(feeder cell)의 부재하에서, 조혈 계통의 세포의 성장 및/또는 분화를 위한, 배아체의 분화를 위한, 조혈 세포 이식체의 생산을 위한 본 발명의 액체 세포 배양 배지의 용도에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "성장"은 배양된 세포의 증식을 지칭하며 용어 "분화"는 세포를 조혈 계통으로 인도하는 세포 특성의 배양 배지 속에서 배양된 세포에 의한 획득을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "조혈 계통의 세포"는 포유동물, 특히 사람의 혈액내에 발견될 세포를 지칭한다.
본 발명의 세포 배양 배지는 배아 줄기 세포 및 iPSC와 같은 다능성 줄기 세포, 배아체, 및 CD135+, CD110+ 및/또는 APLNR+ HSC와 같은 조기의 원시 HSC를 포함하는 HSC의 성장 및/또는 분화에 특히 유용하다.
본원에 지칭되거나 언급된 모든 특허, 특허원, 가특허원, 및 공보는 이들이 본 명세서의 명쾌한 교시와 불일치하지 않는 정도까지, 모든 도 및 표를 포함하는 이들의 전문을 참고로 포함된다.
다음의 실시예는 설명 목적을 위해서 및 제한없이 제공된다.
실시예
실시예 1
물질 및 방법
hiPSC 증폭
연구를 3개의 상이한 hiPSC 계통을 사용하여 수행하였다: 레트로바이러스 벡터 및 톰슨 조합(Thomson's combination)을 사용하여 재프로그래밍된 FD136-25(Oct4, Sox2, Nanog and Lin28의 내인성 발현); 에피좀(Sox2, Oct4, KLF, cMyc)으로 재프로그래밍된 Pci-1426 및 Pci-1432 계통(Phenocell). hiPSC를 TESR2 배지(Stem Cell Technologies, 독일 베르기슈 글라드바흐 소재) 속에서 CellStart (Invitrogen, 미국 칼스바드 소재) 상에서 유지시키고 세포를 트라이플 셀렉트(TRYple select)(Invitrogen)를 사용한 표준 클럼프 계대배양을 사용하여 5일마다 새로이 코팅된 플레이트 위에 1:6으로 계대배양하였다.
EB 분화
24시간 후, 세포를 24 ng/mL의 SCF, 21 ng/mL의 TPO, 21 ng/mL의 FLT3L, 194 ng/mL의 BMP4, 200 ng/mL의 VEGF, 50 ng/mL의 IL3, 50 ng/mL의 IL6, 5 ng/mL의 IL1, 100 ng/mL의 GCSF, 5 ng/mL의 IGF1(PeproTech, 프랑스 네울리-수-세인 소재)을 함유하는 분화 배지내로 이전시켰다. 배지를 격일마다 교환하였다. EB를 15, 16 및 17일째에 해리하였다.
콜로니 검정
나타낸 시간에, 1x105개의 해리된 EB 세포 또는 이종기관이식된 수용체 BM으로부터의 3x104개의 세포를 SCF, IL-3, EPO 및 GM-CSF(PeproTech, 프랑스 네울리-수-세인 소재)의 존재하에서 3 mL의 완전 메틸셀룰로즈 배지내로 플레이팅하였다. G-CSF는 또한 마우스 선조세포를 자극하므로, 이를 과립구-대식구 콜로니-자극 인자(GM-CSF)로 대체시켰다. 혼합물의 분취량(1 mL)을 하나의 30 mm짜리 디쉬(dish)에 2회 분배시키고 14일 동안 습윤화된 챔버(chamber) 속에 유지시켰다. 콜로니-형성 세포(CFC)를 14일째에 기록하였다.
장기간 배양-개시 세포 검정
장기간 배양-개시 세포(LTC-IC) 검정을 앞서 기술한 바와 같이(참고: 예컨대, Miller and Eaves, Hematopoietic Stem Cell Protocols, Volume 63 of the series Methods in Molecular Medicine pp 123-141), 17일째에 15 내지 100,000 세포/웰에서 EB에 대해 및 0일째에 대조군 CD34+에 대해 수행하였다. 절대 LTC-IC 수(count)는 세포 농도에 상응하여, 푸아송 통계(Poisson statistics)를 사용하여 37% 음성 웰을 수득하였다.
슈도-미세관(Pseudo-microtubule) 및 EPC-유사 세포
슈소-미세관 형성을 위해, 세포를 EGM2 배지(Lonza) 내 성장 인자 감소된 매트리겔(Corning)에 이동시켰다.
EPC-유사 세포 생성을 위해, 세포를 우선 젤라틴 위에 플레이팅하고 EBM2(Lonza) 속에서 배양하고 수회 분할하고, 제1의 계대배양 후 젤라틴은 더 이상 필수적이지 않았다.
유동 세포분석법
BM 세포 또는 해리된 EB의 염색을 5:100 희석의 각각의 항체가 들어있는 100 μL의 염색 완충액(2% FBS를 함유하는 PBS) 속에서, 20분 동안 실온에서 암실 속에서 2x105개의 세포를 사용하여 수행하였다. 데이타 획득을 벡톤 디킨슨 칸토(Becton Dickinson Canto) II 세포분석기에서 수행하였다.
혈관형성 잠재능의 생체내 분석
1.750 106개의 D16 단일 세포 또는 hEPC 및 1.750 106개의 hMSC를 100mL의 매트리겔 페놀 레드 프리(Matrigel phenol red free) 및 감소된 성장 인자(growth factor reduced)(Corning)와 혼합하고 누드 마우스의 등에 피하 주사하였다(2개의 상이한 플러그/마우스). 조절을 유사하게 그러나 3.5 106개의 hMSC 또는 D16 단일 세포 또는 hEPC를 사용하여; 각각의 조건 n=3에 대해 수행하였다. 2주 후에, 마우스를 희생시키고, 매트리겔 플러그를 절개하고 파라핀 단면화를 위해 진행시켰다. 단면을 탈파라핀화하고, 수화시키고 헤마톡실린을 사용한 핵 염색, 산 푸치신(fuchsin)/크시키딘 폰세우(xykidine ponceau)를 사용한 염색 및 라이트 그린 에스에프(Light Green SF)를 사용한 콜라겐 염색(모두 VWR로부터 입수)을 포함하는 3-색 프로토콜인, 매송 트리크롬(Masson's trichrome)의 사용과 상관없이; 또는 사람 폰 빌레브란트 인자(Von Willebrand factor)(Dako)의 사용과 상관없이, 염색하고, 염색을 히스토그린 기질(Abcys)을 사용하여 전개하고 패스트 뉴클리어 레드(Fast nuclear red)(DakoCytomation)로 역염색(counter staining)하고, 탈수화하고 고정시키거나, 1차 항체로서 hCD31(R&D system) 및 2차 항체로서 당나귀 항-토끼 Cy3(Jackson ImmunoResearch) 및 DAPI를 사용하는 것에 상관없이 플루오로마운트(fluoromount) G를 사용하여 고정시켰다.
APLNR 양성 세포의 분류
세포를 상술한 바와 같이 항체 hAPJ-APC를 사용하여 염색하였다. 분류를 모플로 아스트리오스 벡크만 코울터(Moflo ASTRIOS Beckman Coulter) 장치를 사용하여 수행하였으며 순도는 98.1% APLNR 양성 세포이었다.
마우스 이식술
NOD/SCID-LtSz-scid/scid(NOD/SCID) 또는 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 또는 Foxn1-/- 누드 마우스(Charles River, 프랑스 라브레슬 소재)를 IRSN 동물 보호 시설에 가두었다. 모든 실험 및 과정을 동물 실험을 위한 프랑스 농업 규제 부서에 따라 수행하고 지역 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
6 내지 8주령 및 멸균 조건 하에 길러진 마우스를 137Cs 공급원(2.115 Gy/min) 으로부터의 2.5 Gray를 사용하여 세포 주사 24시간 전에 치사량 이하로 조사하였다. 실험 사이의 일관성을 보증하기 위하여, 수컷 마우스만을 사용하였다. 이식술 이전에, 마우스를 케타민 및 크실라진의 복강내 주사로 일시적으로 진정시켰다. 세포(마우스당 0.4 x106)를 28.5 게이지(gauge)의 인슐린 침을 사용하여 100 μL의 용적으로 눈뒤(retro-orbital) 주사로 이식시켰다.
3개의 상이한 hiPSC 계통에서 D17 세포의 이식 잠재능에 대해:
70 NSG 마우스를 다음과 같이 사용하였다: 30마리의 1차 수용체, 30마리의 2차 수용체 및 대조군으로서 10마리.
48 NOD-SCID 마우스를 다음과 같이 사용하였다: 20마리의 1차 수용체 및 16마리의 2차 수용체, 3차 수용체 및 대조군으로서 9마리.
APLNR+ 및 APLNR- 집단의 이식 잠재능의 경우: 10마리의 NOD-SCID 마우스 및 대조군으로서 3마리의 NOD-SCID를 사용하였다.
내피 및 조혈 잠재능의 생체내 평가를 9마리의 누드 마우스에서 프로브하였다(probed).
사람 세포 이식의 평가
마우스를 12, 18 또는 20주째에 희생시켰다. 대퇴골, 경골, 간, 비장 및 흉선을 제거하였다. 단일 세포 현탁액을 표준 플러싱(standard flushing)으로 제조하고 1x106개의 세포를 함유하는 분취량을 200μL의 총 용적의 염색 완충액 속에서 염색하였다.
샘플을 다음의 마커를 사용하여 이식 평가를 위해 염색하였다: hCD45 클론 J33, hCD43 클론 DFT1, hCD34 클론 581(Beckman Coulter) 및 hCD45 클론 5B1, mCD45 클론 30F11(Miltenyi).
BM을 혼주시켜 hCD45 마이크로비드 농축(Miltenyi)을 허용하고, 다중계통을 다음의 사람 마커를 사용하여 평가하였다. hCD3 클론 UCHT1, hCD4 클론 13B8.2, hCD8 클론 B9.11, hCD14 클론 RMO52, hCD15 클론 80H5, hCD19 클론 J3-119, hCD20 클론 B9E9, hCD41클론 P2, hCD61클론 SZ21, hCD43 클론 DFT1, hCD34-APC, hCD71 클론 YDJ1.2.2(모두 Beckman Coulter antibodies로부터 구입, 미국 브레아(Brea) 소재), CD45 클론 5B1(Miltenyi), CD235a 클론 GA-R2(Becton-Dickinson).
혈액 샘플을 혼주시켜 hCD45 마이크로비드 분류(Miltenyi)를 허용하였다. 다중계통 잠재능을 다음의 사람 마커를 사용하여 평가하였다: hCD3 클론 UCHT1, hCD4 클론 13B8.2, hCD8 클론 B9.11, hCD14 클론 RMO52, hCD15 클론 80H5, hCD19 클론 J3-119, hCD20 클론 B9E9, hCD41클론 P2, hCD61클론 SZ21(모두 Beckman Coulter antibodies로부터 구입, 미국 브레아 소재).
주사되지 않은 마우스 BM을 비-특이적인 염색을 위한 대조군으로서 사용하였다.
보상을 항-마우스 Ig를 사용하는 FMO 방법으로 수행하고 데이타를 비디 칸토(BD Canto) II 세포분석기에서 수행하였다.
T-세포 성숙 및 기능성 검정
3마리의 마우스의 혈액을 혼주시켜 hCD2 마이크로비드 분류(Miltenyi)를 허용하고, TCR αβ 및 TCR γδ의 존재를 다음의 사람 마커를 사용하여 유동 세포분석법으로 평가하였다: TCR αβ 클론 IP26A 및 TCR γδ 클론 IMMU510(모두 Beckman Coulter antibodies로부터 구입, 미국 브레아 소재).
흉선 및 비장 세포를 단리하고, CFSE를 표지시키고 hCD3 및 hCD28(Beckman Coulter, 둘 다 1mg/ml)이 보충되거나 보충되지 않은 세포 배양 배지 속에 씨딩(seeding)하였다. 5일 후, 세포를 수거하고 항-hCD3 클론 UCHT1로 염색시키고 BD 칸토 II 세포분석기에서 분석하였다. FlowJo 분석 소프트웨어를 사용하여 CD3+ T-세포 상에 게이팅하고 오버레이 히스토그램 플롯(overlaid histogram plot)을 생성하였다.
흉선세포의 존재를 평가하기 위해, 흉선 세포를 hCD1A 클론 BL6(Beckman Coulter antibodies로부터 구입, 미국 브레아 소재)으로 표시하였다.
APLNR 세포 안전성의 평가
3회 치사량 이하로 조사된 NOD/SCID 마우스에게 3백만개의 APLNR 양성 세포를 각각 피하 주사하였다. FDA 안내서(물질 및 방법)에 따른 후처리 2개월 후 기형종은 발견되지 않았다.
또한, 기관의 분석 후(140마리/140마리의 마우스) 또는 상이한 조직(뇌, 폐, 신장, BM, 간 및 위)의 현미경 분석 후(140마리/140마리의 마우스) 임의의 마우스에서 육안으로 종양이 검출되지 않았다.
정량적 PCR
총 mRNA를 RNA 미니키트(Qiagen, 프랑스 코르타보유 소재)를 사용하여 단리하였다. mRNA 통합성을 바이오분석기(Bioanalyzer) 2100(Agilent Technologies, 프랑스 마씨 소재)에서 점검하였다. cDNA를 Superscript(Life Technologies, 미국 칼스바드 소재)를 사용한 역 전사로 작제하였다. PCR 검정을 TaqMan PCR 마스터 믹스(master mix)(Life Technologies) 및 선택된 유전자에 대한 특이적인 프라이머(Applied BioSystems, 미국 칼스바드 소재)를 서열 검출 시스템(QuantStudioTM 12K 플렉스 실시간 PCR 시스템(Flex Real-Time PCR System), Life Technologies)과 함께 사용하여 수행하였다(참고: 하기 표). 각각의 샘플에서 각각의 표적 유전자의 형광성 PCR 신호를 하우스키핑(housekeeping) 유전자 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH)의 형광성 신호에 대해 표준화하였다.
마우스 BM으로부터의 mRNA의 사람 기원을 hCD45, hCD15, hMPO, hITGA2 및 hGAPDH를 측정함으로써 평가하였다. 마우스 BM에서 이식 및 글로빈 유형 발현 후 CFC로부터, 본 발명자들은 태크만 프로브(Taqman probe)를 사용하여 베타, 감마 및 엡실론 글로빈을 측정하였다.
대조군을 제대 혈액 CD34+로부터 생성된 배양된 적혈 모세포이었다.
통계적 분석
모든 통계학을 R 소프트웨어 3.1.1(2014-07-10)(R Core Team, 2013), INGENUITY 및 SAM 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. 데이타를 계층적 클러스터링(hierarchical clustering) 및 PCA를 사용하여 나타낸다.
결과
제1의 이식가능한 HSC를 조혈발생성 내피로 불리는 내피 세포(EC)의 구체화된 집단으로부터 배아 발달 동안 생산한다. 내피-대-조혈 전이(EHT) 후, 이러한 조혈발생성 EC는 HSC를 포함하는 조혈 세포(HC)로 분화하고, 순환으로 들어가서, 태아 간내에서 증폭하여 이들의 명확한 체류 부위인, BM를 획득한다. 이러한 발달적 조혈작용(hematopoiesis)의 조기 단계는 배아체(EB) 배양물, 특히 조혈발생성 EC의 생성 및 HC의 버딩(budding)에서 충분히 반복된다.
본 발명자들은 hiPSC를 엔도-조혈 계통으로의 분화를 지시하는 1 단계의, 벡터-유리된 및 기질-유리된 시스템 과정을 개발하였다. 모든 사이토킨 및 성장 인자는 임의의 요구를 충족시키기 위해 배양 기간의 0일째(D)로부터 말기까지 존재한다. 많은 연구는 14일 길이의 프로토콜을 사용하여, EB에서 조혈 버스트의 존재를 기반으로 11일 내지 14일 사이에 세포를 단리한다. 본 발명자들은 17일째에도 버스트를 수득하지 않았으므로 분화 과정에서 현저한 지연을 평가하였다(도 1a). 이러한 배양 조건을 3개의 상이한 hiPSC 세포주에 적용하여 이들의 재프로그래밍 프로토콜에 의해, 예컨대, 유사한 분화능을 지닌 에피좀성 또는 레트로바이러스성으로 차등화시킴으로써 이러한 방법의 견고성을 입증하였다.
조혈발생성 EC/조기의 HC 개입의 지점을 측정하는 것을 목표로, 본 발명자들은 EB 세포를 qRT-PCR에 의해 3, 7, 9, 13, 15, 16 및 17일째에 다능성 유전자의 발현 및 49개의 주요 내피- 및 조혈-특이적인 유전자에 대해 CD34+ 제대 혈액 HSC의 분자 프로파일을 참고로 하여 분석하였다. 계층적 클러스터링 분석(도 1b)은 2개의 주요 그룹의 존재를 나타내었으며, 그룹 중 하나는 CD34+ 제대 혈액 세포와 관련되어 있고 다른 것은 EB 세포와 관련되어 있다(3일 내지 17일). 후자를 2개의 명백한 집단으로 나눈다: 하나는 조기의 EB 세포(3일 내지 13일)를 포함하고 다른 하나는 말기EB 세포(15일 내지 17일)를 포함하며 13일 내지 15일 사이의 균형점의 존재를 시사한다. 더욱이 qPCR 양식의 깊은 분석에서 CD309(VEGFR2) mRNA 발현을 기반으로 EC 개입의 지점으로서 13일에 및 RUNX1 mRNA 발현을 기반으로 추정된 조혈발생성 내피 개입의 지점으로서 16일에 확인하였다(도 1c). 조혈-특이적인 마커를 또한 RUNX1 발현의 시작을 유지시 ITGA2(인테그린 알파-2) 및 CEBPA(CCAAT 인핸서 결합 단백질 알파)와 같이 16일로부터 상향-조절되었다. 17일째 세포는 HC-특이적인 유전자의 증가된 발현으로 나타난 바와 같이 CD34+ 세포 프로파일을 향한 수렴 경향성을 나타내었다(데이타는 나타내지 않음). 균형점을 확인하기 위하여, 본 발명자들은 EC 마커로서 CD309 및 조기의 HC 마커로서 MPL, CKIT 및 ITGA2의 표면 발현에 대해 유동 세포분석법에 의해 세포 집단을 분석하였다. 유동 세포분석법은 13일 내지 17일째의 CD309의 감소 및 q-PCR 분석을 사용한 유지시 ITGA2, CKIT 및 MPL의 증가(도 1d)를 입증하였다(도 1c). 이들을 15일 내지 17일째 세포에서 조기의 조혈 개입과 관련된 APELIN 수용체(APLNR)의 발현을 나타내는 세포 집단 및, 상기 날짜 이내에서, 이동(locomotion) 및 호밍(homing) 수용체 CXCR4의 발현을 점진적으로 획득한 소-분획을 추가로 확인하였다(도 1e).
이들을 다음에 전용 시험관내 기능 시험을 사용하여 15, 16 및 17일째에 EB 세포의 내피 및 조혈 효능을 평가하였다(도 2a). 15일째 세포는 내피 콜로니-형성 세포(CFC-EC)(도 2a1), 슈도-미세관(도 2a2) 및 EC-유사 세포(도 2a3)를 생성하는 이들의 능력에 의해 나타난 바와 같이 강력한 내피-형성 잠재능을 나타내었지만, 조혈-형성능을 결여하였으므로, 클론원성 콜로니를 생성할 수 없었고 매우 낮은 빈도의 장기간 배양-개시 세포를 나타내었다. 대조적으로, 17일째 세포는 내피 잠재능을 결여하였지만 조혈능에 있어서 유의적인 증가를 나타내었고(도 2a4, a5), 이러한 기간내의 조혈 개입의 시작을 입증하였다.
D16 균형 지점은 세포를 사람 중간엽 줄기 세포(hMSC)의 존재 또는 부재하에서 매트리겔(Matrigel)(감소된 성장 인자) 플러그 속에서 면역약화된 Foxn1-/-(누드) 마우스내에 피하 이식함으로써 생체내에서 프로브화하였다(도 2b). 이식 2주 후, 사람 CD31+ 세포 및 폰 빌레브란트+ 세포로 제조된 사람 혈관 구조(도 2c, d)를 D16 세포 및 (/) hMSC를 함유하는 이식체내에서 검출하였다. QRT PCR은 16일째 세포/hMSC로 제조된 이식체내에서 및 예측한 바와 같이, 내피 선조세포/hMSC로 제조된 이식체내에서 hVEGFR2, hENG(ENDOGLIN), hPECAM-1의 발현을 나타내었다(데이타는 나타내지 않음). 더욱이, D16 세포/hMSC 플러그는 사람 베타, 감마 및 엡실론 글로빈 전사체를 발현하였지만, D16 세포 단독의 플러그는 사람 엡실론 글로빈 전사체 만을 발현하였으며 성숙의 차단을 나타내었다. 따라서 16일째 세포는 시험관내 결과와 일치하게 균형된 내피-조혈 양식을 나타내었다.
17일째 세포가 가장 강력한 조혈 능력을 나타내었으므로, 본 발명자들은 4Х105개의 세포를 치사량 이하로 조사된(3.5 gray) 8주령의 면역약화된 마우스에게 20주의 기간에 걸쳐 이식한 후 추가로 20주의 기간에 걸쳐 유사하게 처리한 면역약화된 수용체에서 제2의 이식술을 챌린징(challenging)하였다(도 3a). 사람 HC의 존재를 hCD34, hCD43 및 hCD45의 이들의 표면 발현을 통해 정량화하였다(도 3b, c, d). 다중계통 사람 조혈작용이 30마리/30마리의 1차 수용체 마우스에서 명백하였으며(도 3c), 전체 마우스 BM 단핵화된 세포 중에서 평균 20.3 +/- 2.9%의 hCD45+ 세포, 즉 NSG 마우스에서 사람 HC 이식에 대해 양성인 것으로 일반적으로 고려된 0.1%의 역치(threshold)의 203배(Tourino et al., The hematology journal:the official journal of the European Haematology Association/EHA 2, 108-116 (2001)), 및 12.2 +/- 1.5% hCD43+ 및 7.29 +/- 1.0% hCD34+이었다(도 3c). hCD45+ BM 집단 내에서, B 세포(CD19+CD45+), T 세포(CD3+CD45+, CD4+CD45+), 대식구(CD14+CD45+, CD15+CD45+)(도 3e, 도 s3h) 및 적혈구 선조세포/전구체(CD235a+CD45+)(나타내지 않음)를 포함하는, 수개의 사람 HC 계통을 검출하였다. 분류된 hCD45+ 말초 혈액 세포는 이식된 세포의 말초화(peripheralization)를 나타내는 동일한 다중계통 양식을 나타내었다. 이식된 세포의 사람 기원은 CD45, CD15, MPO, ITGA2 및 GAPDH 유전자에 대한 사람-특이적인 프라이머를 사용하여 q-PCR에 의해 확인하였다(n=30/30). 제1의 수용체 마우스로부터 단리한 BM 세포에서 수행한 사람-특이적인 클론원성 검정은 CFU-GEMM, BFU-E 및 CFU-GM 콜로니(도 3g1, 2, 3)내로 분배된 104개의 총 BM 세포(도 3f) 중 17.5 +/- 4.3 클론의 전체 빈도를 나타내었다. 사이토스핀 분석은 성숙한 대식구, 조직단구, 골수구 및 적혈 모세포의 존재를 나타내었다(도 3h1, 2, 3). 1차 수용체의 7.106개의 BM 세포를 제2의(n=30) 수용체에서 챌린지하고(도 3b, d) NOD-SCID 마우스의 경우에 궁극적으로 제3의 수용체(n=3)에서 챌린지하였다(데이타는 나타내지 않음). 사람 CD45+ 세포는 12.6 +/- 3.9 %의 단핵화된 BM 세포(도 3b, d)를 나타내었으며, 이는 지속된 재구성능을 나타낸다. 다중계통 이식은 30마리/30마리의 마우스에서 발견되었다(도 3e). 사람 CFC의 전체 클로닝 효능은 104개의 전체 마우스 BM 세포에서 5.5 +/- 3.1%이었으며, 이는 풍부하고 장기적인 자가-재생능을 시사한다(도 3f-h). 이식된 세포의 사람 기원은 상기와 같이 확인되었다.
이식된 세포의 기능성을 보증하기 위하여, 본 발명자들은 마우스 골수로부터 사람 적혈구 전구체의 능력을 분석하여, 생체내에서 헤모글로빈 스위칭(hemoglobin switching)을 겪도록 하고 T 세포의 표현형 및 기능성을 시험하였다. 1차 및 2차 수용체 둘다로부터 이식된 세포는 다량의 β(각각 39.51+/-4.95 및 36.61+/-5.86) 및 γ 글로빈(각각 57.49+/-3.95 및 61.39+/-4.86)을 나타내는 사람 적혈구 선조세포를 생성할 수 있었지만 ε 글로빈은 각각 전체 글로빈의 3.0 +/-1.2% 및 2.1 +/- 1.1%로 현저히 감소하였다(도 3i). 배아의 사일런싱(Silencing) 및 성체 글로빈 발현의 활성화는 다량의 TCRαβ(도 3j) 및 성숙하는 사람 T 세포 능력을 평가하는 매우 소량의 TCRγδ을 나타내는 명확한 적혈구 말초 혈액-단리된 hCD2+ T 세포의 특징이다. 흉선 및 비장 세포를 hCD3 및 hCD28 자극 하에서, CSFE-표지화에 의해 측정된 바와 같은, 이들의 확장하는 시험관내 능력을 시험하였다. 5일 후, hCD3+ 발현에 게이팅된 흉선(도 3k) 및 비장(데이타는 나타내지 않음) 세포는 확장하는 높은 능력을 나타냄으로써 사람 T 세포의 기능성을 입증하였다.
도 4a는 이식 18주 후 1차 NOD-SCID 수용체에서 hCD45+ 세포의 퍼센트에 대해 보고된 배양 초기에서 EB에 있어서의 APLNR+ 세포의 퍼센트를 나타낸다. 본 발명자들은 APLNR+ 및 - 집단을 분류하고 NOD-SCID 모델에서 생체내에서 이들의 이식 능력을 비교하였다. APLNR+ 세포는 18주 후 조혈작용을 성공적으로 재구성하였다(도 4b). 사람 CD45+ 세포는 마우스 BM에서 6.6 +/- 1.9%의 단핵화된 세포를 나타내었고, 3.4 +/- 2.5%는 hCD43+이었으며 1.1 +/- 0.4%는 6마리/6마리의 이식된 마우스에서 hCD34+이었다(도 4b, 도 5). BM 세포의 유동 세포분석법 분석은 사람 다중계통 표현형을 나타내었다(데이타는 나타내지 않음). D17 APLNR+ 세포는 임의의 CD45+ 세포를 지니지 않았으므로 재구성 능력이 hCD45+ 수임된(committed) 선조세포의 존재에 기인하지 않았음을 나타낸다(도 4c). 대조적으로, APLNR- 세포는 마우스 BM내에서 0.08 +/- 0.01% hCD45+ 세포를 지닌 4마리/4마리의 마우스에서 유의적인 수준으로 이식하는데 실패하였다(도 4b 및 5). 흥미롭게도, APLNR+ 분획은 명확한 조혈을 향상시키기 위해 마우스에 기술된 ENG+/TIE+/CKIT+의 상동 집단(homogenous population)을 나타내었다(도 4c).
APNLR+ 집단을 추가로 특성화하기 위해, 본 발명자들은 APLNR+ 및 - 세포의 분자 프로파일을 다능성 상태를 나타내는 유전자 세트의 발현 및 내피, 조혈발생성 내피 또는 조혈성 개입과 관련하여 hiPSC의 분자 프로파일 및 대조군 CD34+ HSC의 것과 비교하였다. 변수로서 연구된 49개의 mRNA의 세트 및 관찰로서 6개의 세포 집단을 사용하여 △Ct로 나타낸 바와 같이 유전자 발현 수준의 기본적인 성분 분석(PCA)(도 4d)은 제1 성분이, "조혈 차등화" 인자에 적절히 상응하여, 44.9%의 변화로 고려되었다. 이식 잠재능에 관여하는 특성을 추가로 나타낼 목적으로, 이들을 PCA에 의해 APLNR- 및 hiPSC 집단에 대한 APLNR+, D17 및 HSC 집단을 비교하였다19.23%의 변화로 고려된 제3 성분은 집단을 이들의 이식 잠재능에 의해 차등화되는 2개 그룹으로 분리하였다(도 4e). 유전자 발현과 다양한 반응 사이의 관계의 강도를 측정하는 통계적인 SAM 시험은 이들 중에서 이식할 수 없는 그룹내에서 유의적으로 보다 상향-조절되는 8개의 유전자(FDR<10%)를 TEK, PECAM, 및 KDR로서의 내피 유전자로 지적하였다(도 4f).
이러한 발견을 기반으로 하여, 본 발명자들은 다중계통 조혈 재구성 및 생체내 자가-재생을 뒷받침하는 장기간 다능성 HSC의 생성이 EHT를 겪고 APLNR을 발현하는 조기 분화된 세포를 통과함을 나타내었다. 이러한 실험을 GMP-등급의 배양 조건 하에서 수행함으로써, HSC 이식술을 위한 세포의 우선순위의 공급원으로서 다능성 줄기 세포의 용도에 대한 길을 열었다.
실시예 2
물질 및 방법
hiPSC 증폭, EB 분화, 사람 세포 이식의 평가, T 세포 성숙 및 기능성 검정, 정량적 PCR을 상술한 바와 같이 수행하였다.
세포 분류
해리된 EB 세포를 항체 CD110-PE(MPL) 또는 CD135-PE(FLT3)로 염색한 다음 PE-마이크로비드(Miltenyi)로 재-염색하고 최종적으로 MACS® 세포 분리 장치를 사용하여 분류하였다.
마우스 이식술
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)(Charles River, 프랑스 라브레슬 소재)를 IRSN 동물 보호 시설에 가두었다. 모든 실험 및 과정을 동물 실험을 위한 프랑스 농업부의 규제에 부합하도록 수행하였으며 지역 윤리 위원회에 의해 승인되었다.
6 내지 8주령의 멸균 상태에서 성장시킨 마우스에게 세포 주사 24시간 전에 137Cs 공급원(2.115 Gy/min)으로부터 3.5 Gray을 사용하여 치사량 이하로 조사하였다. 실험 사이의 일관성을 보증하기 위하여, 수컷 마우스만을 사용하였다. 이식술 전에, 마우스에게 케타민 및 크실라진의 복강내 주사로 일시적으로 진정시켰다. MPL+ 또는 FLT3+ 세포(마우스당 104개)를 28.5 게이지의 인슐린 침을 사용하여 100 μL의 용적으로 눈뒤 주사로 이식시켰다.
3개의 상이한 hiPSC 계통에서 D17 세포의 이식 잠재능에 대해:
50 NSG 마우스를 다음과 같이 사용하였다: 25마리의 1차 수용체, 25마리의 2차 수용체.
생물정보학
생물정보학 분석을 R 환경 소프트웨어 버젼 3.0.2에서 수행하였다. 공공의 이용가능한 전사체 데이타세트를 데이타베이스 유전자 발현 옴니부스(Gene Expression Omnibus: GEO) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 표준화된 매트릭스(GSE 양식: 유전자 발현 매트릭스)로서 다운로드하였다.
결과
다능성 세포(IPSC: 유도된 다능성 세포)의 분화로부터 수득되는 scid 재생 세포(SRC)를 보다 더 잘 특성화하기 위하여, 본 발명자들은 수행된 1차 또는 2차 기관이식 성공에 대한 이들의 이종기관이식 능력을 고려하여 전사체 샘플을 분석하였다. 전사체 계열을 합하여 1차 이종-이식술 능력 만을 지닌 IPSC의 그룹(그룹 GI, n-3) 및 1차 및 2차 이종-기관이식 능력을 지닌 IPSC의 그룹(그룹 GI&GII, n=3)에 대해 비교한 분류하는 조혈 줄기 세포(HSC, 표현형: CD34+CD38-CD90+를 지님, n=3)의 대조군 그룹을 구축하였다. 배치-효과(batch-effect)의 수학적 상관관계 후, 1원 ANOVA(변량 분석, 1E-4 미만의 p-값) 감독 분석을 3개의 정의된 샘플 그룹(HSC, GI, GI&II) 사이에서 수행하였다. 감독되지 않은 기본 성분 분석을 주요 맵(map)에서 4.75E-8의 p-값을 지닌 유의적으로 구별된 샘플 그룹에 대해 허용된 그룹 사이의 5859개의 상이한 유전자에서 수행하였다(도 6). 이러한 결과는 선택된 유전자가 1차 및/또는 2차 이식물을 제공하는 이들의 능력을 고려하여 SRC-IPSC의 이종-기관이식 표현형을 연구하기 위해 잠재적으로 관련되어 있음을 시사한다. 더욱이, 전사체 데이타세트와 관련된 배치-효과는 이러한 감독되지 않은 분석 동안 표현형 그룹 구별에 있어 영향이 없음을 나타내었다. 각각의 이식체 그룹과 HSC 그룹 사이의 미세배열(SAM)에 대한 유의성 분석에 의한 감독된 분석을 수행하여 SRCs-IPSCs의 각각의 그룹에서 HSC 생물마커를 발견하였다. 상관 서코스플롯(relational circosplot)(도 7)에서, 보다 큰 다양성의 HSC 생물마커가 GI 그룹보다는 GI&GII 그룹에 대해 발견되었다. GI&GII 그룹에 대한 이러한 특이적인 다양성은 다음과 같은 기능성 범주를 포함하였다: 중배엽, 다능성 줄기 세포 및 IPSC. GI 그룹에 대한 생물마커의 특이성은 골아세포 및 지방세포와 같은 보다 중간엽인 표현형에 영향을 미쳤다. 다른 방식으로, 일반적인 생물마커는 다음과 같은 조혈 계통에서 발견되었다: 조혈 선조세포, 적혈모세포 선조세포, CD34+ 세포, 골수 및 CD14+ 세포. SRC-IPSC의 특성화에 있어서 HSC 발현 프로파일(CD34+38-90+)의 영향력을 알기 위하여, HSC 그룹을 감독된 분석에 도입시켜 SRC-IPSC 그룹을 비교하였다. 감독되지 않은 분류에 의해 수행된 발현 열 맵(heat map)은 각각의 이종-기관이식 SRC-IPSC 그룹이 일부 HSC 관련된 생물마커를 발현하였음을 나타내었다: SRC-IPSC의 GI 그룹과 관련된 HSC 생물마커, SRC-IPSC의 GI&GII 그룹과 관련된 HSC 생물마커(데이타는 나타내지 않음). SRC-IPSC의 각각의 그룹에서 농축된 HSC 생물마커와 비교한 벤 다이어그램은 일반적으로 임의의 유전자를 나타내었다(도 8). GI&GII 능력을 갖는 SRC-IPSC 세포는 GI 그룹: FLT3(CD135) 및 MPL(CD110)와 비교한 바와 같이 일부 세포 표면 분자를 구체적으로 발현하였다.
이러한 인 실리코(in silico) 연구를 기반으로 하여, 본 발명자들은 이에 대해 이들의 면역자기성 스크리닝을 허용하는 항체rk 이용가능한 MPL 및 FLT3 수용체를 보다 특이적으로 연구하는 것을 결정하였다.
적절한 배지에서 EB내 hiPSC 분화 17일 후(참고: 실시예 1), 본 발명자들은 스크리닝을 수행하였고 10.000개의 세포/NSG 면역약화된 마우스(FLT3의 경우 n=15 및 MPL의 경우 n=15)를 이식하였다(도 9). 20주 후, 마우스를 희생시키고 이들의 골수, 비장, 간 및 흉선 뿐만 아니라 혈액 샘플을 연구하였다.
집단 둘 다(FLT3+ 및 MPL+ 세포)에 대해, 고 수준의 이식이 수득되었으며(FLT3+ 집단의 경우 12.6 +/- 0.7%의 hCD45+ 및 MPL+ 집단의 경우 9.9 +/- 1.7%)(도 10) 조혈 계통 모두로부터의 사람 세포가 발견되었다. 사람 적혈 세포는 β-글로빈을 생산하는 것으로 밝혀졌으며, 혈액을 순환하는 T 림프구는 이들의 표면에서 TCRγδ를 발현하였고 흉선 또는 비장으로부터의 림프구는 활성화 후 시험관내 증식할 수 있었으며, 이는 FLT3+ 또는 MPL+ 세포는 명확하게 조혈작용할 수 있음을 뒷받침해준다.
각각의 1차 마우스의 경우, 수백만의 골수 세포를 2차 마우스에서 이식하였다. 20주 후, 이러한 2차 마우스를 희생시키고 전술한 바와 같이 분석하였다.
모든 2차 마우스는 고 수준의 이식(FLT3+ 집단의 경우 15.2 +/- 3.4%의 hCD45+ 및 MPL+ 집단의 경우 9.8 +/- 2.1%)을 나타내었으며(도 10), 입증된 다중계통, 및 사람 이식된 세포는 명확한 조혈작용을 할 수 있었다.
따라서, 본 발명자의 프로토콜에 따라 hiPSC 분화를 통해 수득되고 이들의 표면에 FLT3 또는 MPL를 발현하는 세포는 생체내에서 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생을 할 수 있다.
Claims (20)
- 조혈 세포 이식체를 제조하거나 장기간 다중계통 이식 및 자가-재생할 수 있는 조혈 줄기 세포에 대한 세포의 집단을 농축(enriching)시키는 시험관내(in vitro) 방법으로서, 상기 방법이
a) 조혈 줄기 세포를 포함하는 세포의 집단을 제공하는 단계, 및
b) 세포 표면 항원 CD135 또는 CD110의 발현을 기반으로 하여 상기 집단의 세포를 분류하는 단계, 및
c) CD135+ 또는 CD110+인 세포를 회수하는 단계를 포함하고,
상기 방법이, 상기 단계 a) 이전에,
다능성 줄기 세포를 제공하는 단계,
배아체(embryoid body: EB) 형성을 유도하는 단계,
다능성 줄기 세포의 엔도-조혈 계통(endo-hematopoeitic lineage)으로의 분화를 개시하고, 줄기 세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), FMS-유사 타이로신 키나제 3(FLT3) 리간드, 골 형성 단백질 4(BMP4), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 1(IL1), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF) 및 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF1)를 포함하는, 액체 배양 배지 속에서 EB를 배양하는 단계, 및
EB 세포를 분리하는 단계,
이에 의해 단계 a)에서 제공되는 세포의 집단을 수득하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 단계 b)에서 세포가 세포 표면 항원 CD110의 발현을 기반으로 하여 분류되며, 단계 c)에서 회수된 세포가 CD110+인 방법.
- 제2항에 있어서, 단계 b)에서, 세포가 세포 표면 항원 CD135의 발현을 기반으로 하여 추가로 분류되고, 단계 c)에서, 회수된 세포가 CD110+ CD135+인 방법.
- 제1항에 있어서, 아펠린 수용체(apelin receptor: APLNR)의 발현을 기반으로 하여 세포를 분류하고 APLNR+인 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 유도된 다능성 줄기 세포 또는 배아 줄기 세포로부터 선택되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 유도된 다능성 줄기 세포인 방법.
- 제1항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 액체 배양 배지 속에서 14 내지 19일 동안 배양되는 방법.
- 제1항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 액체 배양 배지 속에서 15 내지 18일 동안 배양되는 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 조혈 세포 이식체.
- 제9항에 있어서,
악성 질환(malignant disease)의 치료시 사용하기 위한 조혈 세포 이식체. - 제10항에 있어서, 상기 악성 질환이 다발성 골수종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수형성이상증후군, 골수증식성 장애, 만성림프구성 백혈병, 청소년 만성 골수성 백혈병, 신경모세포종, 난소암 및 생식세포 종양(germ-cell tumors)으로부터 이루어진 군에서 선택되는, 조혈 세포 이식체.
- 제9항에 있어서, 비-악성 질환(non-malignant disease)의 치료시 사용하기 위한, 조혈 세포 이식체.
- 제12항에 있어서, 상기 비-악성 질환이 자가면역 장애, 아밀로이드증(amyloidosis), 무형성빈혈(aplastic anemia), 발작성야간혈색뇨, 판코니 빈혈(Fanconi's anemia), 블랙팬-다이아몬드 빈혈(Blackfan-Diamond anemia), 종증성 지중해 빈혈, 겸상 적혈구성 빈혈, 중증 복합병 면역결핍증, 비스코트-알드리히 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome) 및 선천성 대사장애증으로 구성된 군에서 선택되는, 조혈 세포 이식체.
- 제10항에 있어서, 상기 이식체가 자가의(autologous), 동계(syngeneric) 또는 동종이계(allogeneric) 이식술에 사용되는 조혈 세포 이식체.
- 제12항에 있어서, 상기 이식체가 자가의, 동계 또는 동종이계 이식술에 사용되는 조혈 세포 이식체.
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