JP2022121432A - 血管コロニー形成細胞および非生着血管細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
a)ヒト多能性幹細胞を無血清培地中に含む細胞培養物を、当該多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、(b)少なくとも2つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に添加し、無血清培地中での当該培養物の培養を継続するステップであって、当該成長因子は、当該胚様体培養物中でヒト血管コロニー形成細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、を含み、当該幹細胞、胚様体および血管コロニー形成細胞は、当該方法のステップ(a)および(b)にわたり無血清培地内で成長させられ、ステップ(b)における当該少なくとも2つの成長因子は、BMP4およびVEGFを含む、方法を提供する。
ある特定の実施形態において、本発明は、上述の方法により産生されるヒト造血幹細胞を提供する。
本発明は、ヒト多能性幹細胞からヒト血管コロニー形成細胞を生成および増幅するための方法、ヒト血管コロニー形成細胞を含む製剤および組成、血管コロニー形成細胞から部分的または完全に分化した様々な細胞型を産生する方法、血管コロニー形成細胞を治療的に使用する方法、および血管コロニー形成細胞から部分的または完全に分化した種々の細胞型を治療的に使用する方法を提供する。
本発明は、ヒト多能性幹細胞、またはヒト胚盤胞または割球に由来するヒト血管芽細胞を生成および増幅するための方法を提供する。そのように産生した血管芽細胞は、精製および/または単離することができる。
本発明のある態様は、血管芽細胞の生体外での増幅に関する。ある実施形態では、本発明の方法によって増幅される血管芽細胞は、上述のようにヒト胚幹細胞に由来する初期胚様体から得られる。
本発明のヒト血管芽細胞を生成および増幅する方法の開始点として使用されるヒト胚幹細胞は、ヒト胚幹細胞のライブラリに由来してもよく、それぞれヒト集団に存在する少なくとも1つのMHC対立遺伝子の半接合またはホモ接合である。ある実施形態では、幹細胞の当該ライブラリの各メンバーは、ライブラリの残りのメンバーに関して異なるMHC対立遺伝子の群に対し半接合またはホモ接合である。ある実施形態では、幹細胞のライブラリは、ヒト集団に存在するすべてのMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である。本発明の文脈では、1つ以上の組織適合性抗原遺伝子に対しホモ接合である幹細胞は、1つ以上(および一部の実施形態では、すべての)そのような遺伝子に対しヌル欠損である細胞を含む。遺伝子座に対するヌル欠損とは、遺伝子が当該座においてヌルであることを意味し、すなわち、当該遺伝子の両対立遺伝子が削除されるか、または不活性化されることを意味する。すべてのMHC遺伝子に対してヌル欠損である幹細胞は、当該技術分野において知られる標準方法、例えば、遺伝子標的および/またはヘテロ接合性の消失(LOH)によって産生され得る。例えば、米国特許公開第US20040091936号、第US20030217374号、および第US20030232430号、および米国仮出願第60/729,173を参照し、それらすべての開示は、ここで参照することにより本明細書に組み込まれる。
ある態様では、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を提供する。これらの細胞は、様々な治療使途および他の使途を有する固有の原始細胞型である。さらに、本細胞型は、少なくとも造血および/または内皮系統の発達を研究するための重要なツールを提供する。したがって、本発明は、ヒト血管コロニー形成細胞を含む様々な製剤(医薬製剤を含む)および組成、ならびに血管コロニー形成細胞から部分的または末端的に分化した1つ以上の細胞型を含む製剤(医薬製剤を含む)および組成を企図する。
本発明のある実施形態では、哺乳類(ヒトを含む)血管芽細胞を増幅して商業量に到達させ、様々な治療用途および臨床的応用において使用される。特定の実施形態では、血管芽細胞を増幅して、約10,000~4,000,000個(またはそれ以上)台の細胞数に到達させる。これらの細胞数は、初期調製の開始から3~4日以内に到達され得る。したがって、本発明は、多数の血管芽細胞を含む製剤に関し、当該製剤は、少なくとも10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、または4,000,000個の細胞を含む。
上述のように、血管コロニー形成細胞は、成熟内皮または造血細胞のある特性が欠如している。しかしながら、これらの血管コロニー形成細胞または血管芽細胞は、様々なマーカー、例えば、CD71+、GATA-1およびGATA-2タンパク質、CXCR-4、ならびにTPOおよびEPO受容体によって識別され得る。追加の実施形態では、血管芽細胞はLMO-2を発現する。血管芽細胞は、他のマーカーの発現の非存在または低発現によって追加として特徴付けられ得る。したがって、血管芽細胞は、CD34-、CD31-、およびKDR-であり得る。さらなる実施形態では、血管芽細胞は、CD34-、CD31-、KDR-、およびCD133-であり得る。
本発明の方法および細胞製剤は、血管芽派生細胞にも関する。本発明によって生成および増幅したヒト血管芽細胞、および本発明の方法によって増幅した哺乳類血管芽細胞は、造血細胞(造血幹細胞(HSC))または内皮細胞、ならびにこれら2つの系統においてさらに分化される細胞を得るように、生体外で分化されてもよい。これらの細胞は、以下に記載される治療用途および商業用途において、後に使用することができる。
本発明は、以前に識別された血管芽細胞および血管コロニー形成細胞の一部の特性を共有する、新規の細胞集団を提供する。しかしながら、本明細書に説明する新規細胞集団は、免疫不全動物に投与する際に、骨髄に生着しないという点において明らかに異なる。この新規前駆細胞集団は、基本発生生物学および幹細胞生物学の研究に有用であり、分化細胞型を生体外および生体内で部分的および完全に生成するのに有用であり、治療法の開発に有用である。さらに、これらの細胞をスクリーニングアッセイに使用して、例えば、(i)非生着血管細胞の増幅を促進する因子または条件、および(ii)非生着血管細胞からの1つ以上の分化細胞型の生成を促進する因子または条件を識別することができる。識別した因子および条件は、細胞ベースおよび無細胞治療物質の産生、培地および製剤の産生、および発生生物学および幹細胞生物学の研究において使用することができる。
本発明は、非生着血管細胞、非生着血管細胞を含む組成および製剤、非生着血管細胞を産生および増幅する方法、非生着血管細胞から分化細胞型を産生する方法、および非生着血管細胞またはそこから派生する細胞を治療的に使用する方法を提供する。
ある態様では、本発明は、ヒト非生着血管細胞を提供する。これらの細胞は、多様な治療上の使用および他の使用を有する、特有の原子細胞型である。さらに、この細胞型は、少なくとも造血系の発達を研究するための重要なツールを提供する。したがって、本発明は、ヒト非生着血管細胞を含む様々な製剤(医薬製剤を含む)および組成物、ならびに非生着血管細胞から部分的または完全に分化した1つ以上の細胞型を含む製剤(医薬製剤を含む)および組成物を企図する。いずれの特定の理論にも束縛されることなく、これらの細胞は、多数の造血細胞型を生成する能力を維持する、明確に異なる(血管コロニー形成細胞よりも)若干より特化した幹細胞集団を表す。
本発明のある実施形態では、哺乳類(ヒトを含む)非生着血管細胞を増幅して商用量に到達させ、様々な治療用途および臨床的応用において使用する。特定の実施形態では、非生着血管細胞を約10,000~4,000,000個(以上)の細胞数に到達させる。これらの細胞数は、初期調製を開始する3~4日内に到達され得る。したがって、本発明は、多量の非生着血管細胞を含む製剤に関し、当該製剤は、少なくとも10,000、50,000、100,000、500,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、または4,000,000個の細胞を含む。
細胞ベースの治療法
ヒト血管芽細胞および非生着血管細胞は、造血または内皮細胞に生体内で分化する能力を有するが、これら2つの細胞型のうちのいずれかが必要とされるか、または処置を改善する細胞ベースの処置においてそれらを使用することができる。さらに、血管芽細胞系細胞および非生着血管系細胞(すなわち、造血細胞および/または内皮細胞)を含む任意の治療法または処置で患者を処置することができる。以下の節では、本発明の方法によって生成および増幅した、または本発明の方法によって増幅した、本発明のヒト血管芽細胞および非生着血管細胞を使用する方法について説明する。
本発明の別の態様は、輸血に適した造血細胞を産生する方法を提供する。そのような細胞および方法は、多数の使途を有するが、特に重要な使途は、輸血用の血液の利用可能性を改善することにおける使途である。ある好適な実施形態では、本発明は、血管芽細胞/血管コロニー形成単位または非生着血管細胞から分化した赤血球細胞を提供する。そのような分化した赤血球細胞は、輸血に使用することができる。
(a)ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)当該血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップを含む。
(a)ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)当該血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップと、
(c)当該分化造血細胞を用いて輸血を行うステップと、を含む。
(a)胚様体への当該胚幹細胞の分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下、無血清培地においてヒト胚幹細胞を含む細胞培養物を培養するステップと、
(b)少なくとも1つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に添加し、無血清培地において当該培養物を培養し続けるステップであって、当該成長因子は、当該胚様体培養物においてヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であるステップと、
(c)当該ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップと、
(d)当該分化造血細胞を用いて輸血を行うステップと、を含む。
(a)胚様体への当該多能性幹細胞の分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下、無血清培地においてヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を培養するステップと、
(b)少なくとも1つの成長因子を、胚様体を含む当該培養物に添加し、無血清培地において当該培養物を培養し続けるステップであって、当該成長因子は、当該胚様体培養物において、ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であるステップと、
(c)当該胚様体を単細胞に分解するステップと、
(d)少なくとも1つの成長因子を、当該単細胞を含む当該培養物に添加し、無血清培地において当該培養物を培養し続けるステップであって、当該成長因子は、当該単細胞を含む当該培養物において、ヒト血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であるステップと、
(e)当該血管コロニー形成細胞または非生着血管細胞を分化造血細胞に分化するステップと、
(f)当該分化造血細胞を用いて輸血を行うステップと、を含む。
本発明の方法によって生成および増幅したヒト血管芽細胞、または本発明の方法によって増幅したヒト血管芽細胞は、免疫寛容を誘導するように使用することができる。免疫寛容は、それがなければ起こるであろう、例えば、被移植者への非自己MHC抗原(例えば、移植片および寛容血管芽細胞と共有される抗原)の導入に応答して起こる、移植片の被移植者の免疫応答の阻害を意味する。したがって、寛容は、免疫抑制剤を使用して誘発され得る広範な免疫阻害ではなく、特定のドナー抗原によって誘導される免疫応答の阻害を意味する。寛容は、体液性、細胞性、または体液性および細胞性両方の応答が関与し得る。寛容は、既存の成熟ドナー反応性T細胞の排除および/または不活性化、ならびに新規開発したドナー反応性T細胞の長期(例えば、生涯)排除および/または不活性化を含み得る。
本発明の他の態様は、遺伝子治療における、血管芽細胞、非生着血管細胞、またはそこから分化した造血あるいは内皮細胞、または次に、これらの細胞からさらに分化した細胞の使用に関する。本発明の哺乳類血管芽細胞または非生着血管細胞の調製物を使用して、治療遺伝子の遺伝子産生物による処置に適した状態を有する患者に治療遺伝子を送達してもよい。血管芽細胞および非生着血管細胞は、血管形成(例えば、虚血性組織における側副の形成を誘導するVEGF)、造血(例えば、赤血球の産生を誘導するエリトロポエチン)、血管機能(例えば、動脈瘤を修復するように血管平滑筋の増殖を誘導する成長因子)、または血液細胞機能(例えば、出血を低減する凝固因子)、または成長ホルモン等の分泌タンパク質のコードに関与または影響する治療遺伝子を送達するのに特に有用である。遺伝子治療の方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Andersonらによる米国特許第5,399,346号を参照。遺伝子材料を送達するための生体適合カプセルは、Baetgeらによる国際公開第WO95/05452号に記載されている。遺伝子を骨髄由来細胞に転移させる方法も既に報告されている(Gordonらの米国特許第6,410,015号を参照)。治療遺伝子は、疾患予防または処置に関与する遺伝子産生物またはタンパク質をコード化する遺伝子、または疾患予防または処置に関与する細胞調節作用を有する遺伝子等の臨床的有用性を有するいかなる遺伝子でもあり得る。遺伝子産生物は、患者における欠陥または欠損遺伝子産生物、タンパク質、または細胞調節作用を代用してもよく、それによって患者における疾患または状態の予防または処置を可能にする。
本発明のある態様は、商業量に到達するようなヒト血管芽細胞および非生着血管細胞の増幅に関する。特定の実施形態では、ヒト血管芽細胞および非生着血管細胞は、大規模で産生され、必要に応じて保管され、病院、医師、または他の医療施設に供給される。患者が、例えば、虚血または血管損傷等の兆候を呈するか、または造血再構成を必要とすると、ヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を、時宜を得た方法で発注および提供することができる。したがって、本発明は、商業規模で細胞を取得するように、ヒト血管芽細胞および非生着血管細胞を生成および増幅する方法、当該方法から派生したヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を含む細胞製剤細胞、ならびにヒト血管芽細胞または非生着血管細胞を病院および医師に提供する(すなわち、産生、任意選択で保管、および販売する)方法を提供する。さらに、血管芽系細胞または非生着血管系細胞は、生体外で産生され、任意選択で保管され、病院および医師に販売されてもよい。
本明細書に記載される効率的かつ再生可能に多数の血管芽細胞を生成する方法に基づいて(Lu et al.Nat Methods 2007;4:501-509、Lu et al.Regen Med 2008;3:693-704も参照)、発明者らは、さらに血管芽細胞プラットホームを使用し、hESCを、血管芽細胞前駆体を通して、赤血球細胞へと大規模に(約1010~1011個の細胞/6ウェル皿hESC)分化したが、これは以前に報告されたものよりも千倍以上効率的である。
材料および方法
hESCの培養
hESC系WA01(H1)、HUES3、およびMA01を、以前に説明されているように使用および維持した(6)。簡潔には、hESCを、完全hESC培地中のマイトマイシンC処理マウス胎児線維芽細胞(MEF)で成長させた。hESCは、0.05%トリプシン-0.53mM EDTAを使用して、コンフルエンスに達する前に3~5日ごとに継代した。支持細胞なしの培養のために、次いで細胞を、Ludwigら(7、8)の処方に基づく完全Modified TESR(商標)1(mTESR(商標)1)培地(Stem Cell Technologies,Inc)中のhESC-qualified Matrigelマトリックス(BD Biosciences)で成長させた。製造者が推奨する説明に従って細胞を維持する。簡潔には、細胞が約90%コンフルエンスに達した時、通常5~7日ごとに、1:3から1:6の範囲の分割比でそれらを継代した。細胞をディスパーゼ(1mg/ml BD、Biosciences)で処理し、37℃で3~5分間インキュベートしてコロニーの採取を始めた。コロニーをDMEM/F12(Mediatech)で洗浄し、ディスパーゼ溶液を除去した。組織培養プラスチックからコロニーを遊離させるために、ウェルをDMEM/F12で被覆し、コロニーのすべてが移動するまで静かに剥がした。コロニーを円錐管に移し、ウェルをDMEM/F12で洗浄し、細胞をプールしてウェル内のいかなる残留物も回収した。それらを5分間1000rpmで遠心分離した。細胞ペレットをTESR(商標)1培地に再懸濁させ、ウェルあたりmTESR(商標)1培地2mlでMatrigel被覆6ウェルプレートに移した。細胞を5%CO2下で37℃で維持し、mTESR(商標)1培地を毎日補充した。
Oct-4およびTra-1-60発現に関し、支持細胞なしのhESCコロニーを、免疫蛍光を使用して分析した。細胞を4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、PBSで洗浄し、PBS中5%Normal Goat Serum(Vector Labs)、1%BSA(Sigma)および0.2%Triton-X-100(Sigma)で30分間室温でブロックした。ブロッキング溶液中、Oct-4に対する一次抗体(Santa Cruz Biotechnology)またはTra-1-60(Millipore/Chemicon)で、細胞を一晩4℃でインキュベートし、PBSで洗浄し、ブロッキング溶液中、ビオチン共役二次抗体(Jackson Immunoresearch Labs)で、45分間室温でインキュベートした。さらなる洗浄後、細胞をAlexa954共役ストレプトアビジン(Invitrogen/Molecular Probes)で15分間室温でインキュベートし、続いてPBS中での長時間の最終洗浄を行った。DAPIを含むProlong Gold(Invitrogen/Molecular Probes)中に細胞を入れた。
MEFで培養したhESCを血管芽細胞に誘導するために、80~90%コンフルエントなプレートを0.05%トリプシン消化により分離した。支持細胞なしのhESCを血管芽細胞に分化させるために、上述のプロトコルを使用して85~90%コンフルエントな細胞をMatrigelマトリックスから採取した。両方の条件からの細胞を、以前に説明されているように(2)、BMP-4、VEGF、およびbFGFの異なる用量のStemline II(Sigma)培地内で、Ultra-Low皿(Corning、NY)上に播種した。48時間後に、異なる実験条件に依存して、同じサイトカインまたは同じ培地とSCF、FLT3リガンド(FL)およびTPO(20ng/ml、R&D System)を含有する新鮮な培地で培地の半分を置き換えた。3.5日後、EBを回収し、0.05%トリプシンで分離した。細胞を22ゲージ針および40μm細胞濾過器に通すことにより単細胞懸濁液を得、遠心分離により回収し、50~100μlのStemlineII培地に再懸濁させた。以前に説明されたように(2)細胞(0.75×105から1×105)を芽細胞成長培地(BGM)2.5mlと混合し、Ultra-Low皿に播種して37℃でインキュベートした。MEFおよび支持細胞なしhESCの両方から得られた芽細胞コロニーを、播種から3~4日後に観察し、そのすぐ後に急速増幅した。芽細胞(BC)は、本試験において6日目の芽細胞コロニーから得られた細胞として定義される。
潜在的BC前駆体表面マーカーCD31、CD34、KDR、CXCR-4、D133、ACE、PCLP1、PDGFRα、Tie-2、Nrp-2、TPO-RおよびbFGFR-1を、細胞濃縮のために選択した。抗体はすべてマウスモノクローナルIgGアイソタイプであり、CD31およびCD34(Dako Cytomation)、KDRおよびTPO-R(R&D Systems,Inc.)、CXCR-4(Abcam Inc.)、Nrp-2、ACE、PCLP1およびPDGFRα(Santa Cruz Biotechnology)、Tie-2(Cell Signaling Technology,Inc.)、bFGFR-1(Zymed Laboratories)、ならびにCD133(Miltenyi Biotech)である。抗体カクテルのアセンブリをEasySep「Do-it-Yourself」Selection Kit(Stem Cell Technologies)により行った。EBから得られた細胞懸濁液を、1200rpmで4分間遠心分離し、2%FBS/1mMEDTA緩衝液を含むPBSに1~2×106細胞/100μlの濃度で再懸濁した。細胞を異なる抗体カクテルと15分間室温で混合し、次いでEasySep Nanoparticleとともに室温でさらに10分間インキュベートした。上澄みを捨てた後陽性選択細胞を分離し、細胞を有する管をMagnetホルダに設置した。抗体選択陽性細胞(1×105)を2.5mlのBGMと混合し、芽細胞コロニー発達のために播種した。
RNeasy Micro Kit(Qiagen)を使用して、製造者のプロトコルに従い、全RNAをEBまたは未分化hESCから抽出した。CDNAは、BD SMART PCR CDNA Synthesis Kit(BD Biosciences)を使用して、取扱説明書に従い合成した。リアルタイムRT-PCR(qRT-PCR)は、FullVelocity SYBR Green QPCR Master Mix(Stratagene)を使用して行った。反応については、各反応につき以下の成分で3回行う設定とした。テンプレート50ng、各プライマーおよび1×Masterミックス0.2マイクロモル。使用したプライマーの遺伝子特異的配列を表1にリストするが、アニール温度はすべてのプライマーに対して55℃である。増幅およびリアルタイムデータ収集は、MxProバージョン3.0ソフトウェアを備えるStratagene Mx3005Pで行った。以下のサイクル条件を使用した:95℃で10分間の1サイクル、続いて95℃で30秒間、55℃で1分間、72℃で30秒間の40サイクル、続いて95℃で1分間、55℃で30秒間および95℃で30秒間の最終サイクル。各標的遺伝子の相対定量を、ΔΔCT法(9)を使用してβ-アクチン(ΔCT)へのサイクル閾値(CT)正規化に基づき行った。リアルタイム定量PCRおよび2(-デルタデルタC(T))法(9)を使用した相対遺伝子発現データの分析では、実験試料における検査した各遺伝子のΔCTを未分化hESC対照試料(ΔΔCT)の平均ΔCTと比較した。次いで発現の倍数の変化を2-ΔΔCTとして計算した。マイナスの倍数差データは、以下の式を用いて線形の「発現の倍数変化」値に変換した。発現の線形倍数変化=-(1/発現の倍数変化)。
すべてのデータは、平均±標準誤差として示した。GraphPad Prism、バージョン4、ソフトウェア(GraphPad Software,Inc.、San Diego、CA)を使用して、対応のないt検定により集団間比較を行った。p<0.05を統計的に有意とみなした。
血管芽細胞の発達にはBMP-4およびVEGFの両方が必要とされる
血管芽細胞および造血系へのhESC分化を誘導するための無血清系は、以前に説明されている(2、10)。BMP-4、VEGF、および初期造血サイトカインのカクテルを使用したが、個々の因子の絶対要件および最適濃度は検査しなかった。将来の研究および臨床的応用のための血管芽細胞の生成に必要な費用および労力を削減するために、発明者らは、VEGF、BMPおよび3つの初期造血サイトカイン(TPO、FLおよびSCF)の最小要件およびhESCからの芽細胞コロニーの効果的な発達に対する効果を具体的に検査した。無血清条件下では、芽細胞コロニーの発達にはBMP-4が絶対的に必要であることが判明した。EB形成の間の培地へのBPM-4の添加がないと芽細胞コロニーは得られず、hESCからの芽細胞コロニーの形成に対するBMP-4の明確な用量反応効果が観察された(図1A)。さらに、BMP-4は、BMPファミリーの他のメンバーにより置換することができなかった。BMP-2およびBMP-7単体、またはこの2つの組み合わせは、BC発達を促進しなかった。さらに、BMP-4を含有するEB培地へのBMP-2およびBMP-7の添加は、効果を示さない(10ng/ml)か、または(20ng/ml)芽細胞コロニー発達(図1B)を阻害した。しかしながら、芽細胞コロニー成長培地(BGM)へのBMP-4、およびBMP-2および/またはBMP-7の添加は、芽細胞コロニーの発達に対しいかなる効果も有さず、これは、BMP-4のみが中胚葉/血管芽細胞特定段階を促進するが、BCの成長および増幅は促進しないことを示唆している。同様に、VEGF165がEB形成培地から排除されると、芽細胞コロニーは発達しなかった。VEGF165は、用量依存的に芽細胞コロニーの発達を促進することが判明した(図1C)。唯一KDRおよびFLT1受容体に結合することができるVEGFメンバーのアイソフォームであるVEGF121 (11)は、hESCからの芽細胞コロニーの発達の促進においてVEGF165の代替として使用することができ、無血清条件下で最適な用量である50ng/mlのVEGF165またはVEGF121がEB培地に添加された場合、ほぼ同数の芽細胞コロニー(68±5対67±12)が発達した。しかしながら、BMP-4と対照的に、VEGFがBGM中に存在しない場合、芽細胞コロニーは得られず、中胚葉/血管芽細胞特定における初期段階ならびにBCの成長および増幅においてVEGFが重要な役割を担うことを示している。
bFGFはhESCからの血管芽細胞の成長を促進するが、特化は促進しない
以前の研究では、初期分化の間のbFGFの添加が、マウスおよびヒトESC造血発生を促進することが示されている(12、13、14、5)。したがって、EB分化段階中におけるbFGFの添加がhESCからの芽細胞コロニー形成を向上させるかどうかを調査した。EB形成中のbFGFの添加は、芽細胞コロニーの発達に効果を有さず、実際には、より高い用量(40ng/ml)においては、複数のhESC系からの芽細胞コロニーの形成を阻害した(図2Aおよび図3)。一方、BGMへのbFGFの添加は、芽細胞コロニーの発達を大きく促進した(図2A、図3)。bFGFを添加しなかったBGMと比較して、芽細胞コロニーの数(p<0.001)およびBCの総数の両方が大きく増加した。BGM中最適用量(20ng/ml)でのbFGFでは、芽細胞コロニーはより大きく、より健全であり、我々は一貫して、6日間の成長後、約1×108個のBCを高品質WA01 hESC(約1.2×107個の細胞)の1つの6ウェルプレートから採取し、これはbFGFの添加なしでBGMから得られたものより8±1倍高い。
hESCからの血管芽細胞の堅調な生成が支持細胞なしで維持された
MEF支持細胞上に維持されたhESCが非ヒトシアル酸N-グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)を含有すること(15、7、8)、およびNeu5Gcの動物源はヒト補体との潜在的な免疫原性反応をもたらし得ることが報告されている。MEF支持細胞層上でのhESCの培養は、動物Neu5Gcの完全排除を阻止し、これらの条件下に維持されたhESC系から生成された血管芽細胞の潜在的な臨床的応用への懸念をもたらしている。したがって我々は、MEF支持細胞なしで維持されたhESCから血管芽細胞が生成され得るかどうかを決定することにした。材料および方法の項に記載のように、hESC-qualifiedMatrigelマトリックスで被覆された平板上で、ディスパーゼで3つのhESC系を継代し、mTESR培地内に維持した。それらの未分化状態を、Oct-4およびTra-1-60抗体の発現およびコロニー形態に対する免疫蛍光染色により確認した(図4A~4H)。これらの細胞を回収し、上述の最適化された条件を使用したBCの発達に使用した。興味深いことに、同数のEB細胞が播種された場合、MEF支持細胞上で培養されたhESCと比較して、支持細胞なしhESCで極めてより多数のBCが観察された(図4I、p<0.05)。これらの結果は、試験された3つのhESC系WA01、MA01およびHUES-3すべてに対して観察された(データは示されていない)。
血管芽細胞の発達に対するBMP-4およびVEGFの効果の基礎となる機構
hESCからの血管芽細胞の発達に対するBMP-4およびVEGFの効果の基礎となる分子機構を精査するために、発明者らは、BMP-4およびVEGFの各因子を含む、および含まない、ならびにそれらの組み合わせを含むStemline II培地中で形成された3.5日齢のEBにおける血管芽細胞の発達に関連する遺伝子の発現を比較した。遺伝子発現は、リアルタイムRT-PCR(qRT-PCR)により分析し、未分化hESCにおけるそれらのレベルと比較した。いかなる因子もなしに形成されたEBは、未分化hESCより高いレベルのhESCのマーカーOCT-4を発現した。EB培地へのVEGFの添加は、OCT-4発現の中程度の下方制御をもたらしたが、一方BMP-4またはBMP-4およびVEGFの添加は、OCT-4発現の大幅な低下をもたらした(p<0.0005、図5)。OCT-4発現に対するBMP-4およびVEGFの相加効果はなかった。中胚葉細胞において発現する最初期マーカーであるT-ブラキュリ遺伝子の発現は、BMP-4およびVEGFの両方を含有する培養物から得られたEB(これはその発現の大幅な増加を示す(p<0.0005))を除き、すべての試料において下方制御された。CD31およびLMO2に対しても同様の発現パターンが観察され、BMP-4およびVEGF(p<0.0005)の組合せに暴露されたEBにのみ、大幅に増加した発現レベルが検出された。最も研究されたVEGF受容体のうちの1つであるKDRは、すべてのhESC系に発現することが示されているが(4、5)、その発現は、外生要因が添加されていない培地、およびBMP-4またはVEGF単体が添加された培地から得られたEBにおいて劇的に下方制御された。しかしながら、hESCからの血管芽細胞の効率的な発達を促進した条件であるBMP-4およびVEGF(p<0.002)の存在下で形成されたEBにおいて、KDR発現の中程度であるが有意な増加が観察された。驚くべきことに、最近の報告とは対照的に(14)、すべての条件において形成されたEBでMixLおよびSCL/TAL-1遺伝子の発現の実質的な低下が検出された。1つの可能な説明は、異なる無血清培地中での成長が、これらの遺伝子における異なる発現パターンをもたらしたということである。それにもかかわらず、これらの結果は、hESCからの中胚葉/血管芽細胞の特化および発達には、BMP-4およびVEGFの両方が必要であることを示唆しており、芽細胞コロニーの発達の結果と一致している(図1)。
芽細胞の前駆体の表面マーカーの同定
我々の原法(2)では、定義された因子を添加した1%メチルセルロース中に3.5日目のEB細胞を再播種することにより、BCを生成した。この方策は、造血および内皮細胞を形成する可能性を有するBCを同定する場合に重要であり、またhESCからBCを生成する場合に再現可能である。しかしながら、この手法は、標準的な組織培養インキュベータ中の皿を使用し、したがって大量生産のための回転式生物反応器に適合させることができない。この制限は、主に、3.5日目のEBからの細胞は外生であり、未分化hESCを含む(細胞のごく一部がBC前駆体である)ことに起因する。したがって、この外生集団を液体培養物中に再播種することは、未分化hESCからの二次EBの形成を含むすべての細胞の成長をもたらし、臨床的応用における使用の可能性を排除する。しかしながら、BCの前駆体のマーカー(複数可)を同定することができれば、BCの大量生産のための回転式生物反応器に適合された液体培養物中に、精製された前駆体を播種することができる。したがって我々は、中胚葉誘導体の発生と関連した12の細胞表面分子を選択した。対応する抗体を使用して、3.5日目のEBからの細胞を濃縮し、濃縮された細胞を芽細胞コロニー形成能について分析した。図6に示されるように、3.5日目のEBからのKDR+細胞は、未分画対照細胞(p<0.01)よりも3倍多い芽細胞コロニーを生成したが、これは以前の研究(5)と一致している。我々はまた、CD31+およびCD34+濃縮集団の播種後に芽細胞コロニーの中程度の増加(約1.5倍)を認めたが、この増加は統計的優位性に達しなかった。他のすべての濃縮された集団は、未分画対照細胞と比較して同量以下の芽細胞コロニーを産生したが、これはBC前駆体がこれらの分子を発現しないことを示している。試験されたすべての抗体の未結合(通過した)細胞もまた、未分画細胞と同様の数の芽細胞コロニーを形成したが、これは、KDR+、CD34+およびCD31+細胞でも、芽細胞コロニーを形成することができる細胞の非常に限定された部分を示すことを示唆している。
ヒトES細胞からのヒト血管コロニー形成細胞の生成
ヒトES細胞培養。この試験において使用されたhES細胞系は、Advanced Cell Technologyで得られた以前に説明されたHIおよびH9(WA01およびWA09としてNIH登録)ならびに4つの系(MA01、MA03、MA40およびMA09)である。未分化ヒトES細胞は、80%コンフルエンスに達するまで完全hES培地中で不活性化(マイトマイシンC処理)マウス胎児線維芽(MEF)細胞上で培養した(Klimanskaya & McMahon;Approaches of derivation and maintenance of human ES cells:Detailed procedures and alternatives,in Handbook of Stem Cells.Volume 1:Embryonic Stem Cells,ed.Lanza,R.et al.(Elsevier/Academic Press,San Diego,2004)。次いで未分化hES細胞を0.05%トリプシン-0.53mM EDTA(Invitrogen)で2~5分間分離し、1,000rpmで5分間の遠心分離により回収した。
異なる細胞型:非生着血管細胞の増幅
上記および第11/787,262号に詳説されているように、約4~7日の増幅後に血管コロニー形成細胞を生成した。ある特定の条件下で、7日間を超えるEBのさらなる培養により、大量の異なる細胞型が産生された。全体に記載のように、この異なる前駆細胞型は、非生着血管細胞と呼ばれる。
ヒトiPSCからの効率的な血管芽細胞生成
高品質iPSCの生成
発明者らの予備的研究のいくつかにおいては、それらは、最適化されたhESC分化条件を使用して、ヒトIMR90(図12c)および成人4-3iPSC(データは示されていない)から血管芽細胞コロニーを生成産生することができる。それらの効率はhESCと比較すると大幅に低いが、それらはヒトiPSCの血管芽細胞分化能を明確に示す。観察される低効率は、複数の因子に起因し得、そのうちの1つはiPSCの品質である。発明者らはこれを、血管芽細胞の高効率生成のための最重要因子の1つとして観察した。高品質hESC培養物は、顕微鏡下で見られるように、約80%のコンフルエンスを有するが互いに接してはいない、分化の最小限の兆候とともに密な境界線を有するコロニーで構成される。それらは、中程度の速度で成長する、つまり、1:3分割継代hESCは、ほぼすべての細胞における多分化能マーカーの陽性染色とともに、3~5日でコンフルエンスに達する。高品質hESCは、通常、多数のEB細胞を生成する(例えば2×106個の高品質hESCは3.5日後に約2~3×106個のEB細胞を生成する)。高品質iPSCを得るための重要な段階には以下が含まれる。(1)トリプシンによる継代対コラゲナーゼによる継代。発明者らは、機械的に継代した培養物からの最初の適応を行った後、hESCを日常的にトリプシン/EDTAで継代することができることを示した(Klimanskaya et al.Approaches of derivation and maintenance of human ES cells:Detailed procedures and alternatives.In:Lanza Rea,ed.Handbook of Stem Cells.Volume 1:Embryonic Stem Cells.New York,USA:Elsevier/Academic Press,2004:437-449.)。発明者らの経験では、トリプシンは、より小さい細胞塊(2~5細胞)およびより均一に分散した同様のサイズのコロニーを形成する単細胞を産生するため、広く使用されているコラゲナーゼIVより良好に機能し、コロニー間の時期尚早の接触を排除して自然分化を制限するが、一方コラゲナーゼ継代は、より広範囲の分化を示し、より低い分割比で継代されるか、またはクラスタの所望の密度に達する前に継代される必要がある、より大規模なコロニーをもたらす。全体的に、トリプシン/EDTA継代は、コラゲナーゼよりも3~4倍速く培養を拡大し、均質な細胞集団を得る能力を提供する。これらの観察はまたヒトiPSCに対しても有効となり得る。発明者らの実験は、ヒトiPSCをトリプシン消化に適応させることができ、これらの細胞は20を超える継代後も未分化状態を維持することを示した;(2)マウス胎児線維芽細胞(MEF支持細胞)または支持細胞なしでの維持:hESCおよびiPSCの長期維持にはMEF支持細胞が必要であった。MEF支持細胞層上でのhESCおよびiPSCの培養は、動物成分の完全排除を阻止し、これらの条件下に維持されたhESCおよびiPSCから生成された誘導体の潜在的な臨床的応用への懸念をもたらしている。したがって、第1の段階は、血管芽細胞がmTESR培地中のMatrigelマトリックス上で維持されたhESCから生成され得るかどうかを決定するために行われた。発明者らは、MEF支持細胞上で培養されたhESCと比較して、試験された3つのhESC系、WA01、MA01およびHuES-3すべてに対し同数のEB細胞が播種された場合(p<0.05)大幅に多数(3倍の増加)の血管芽細胞が支持細胞なしhESCで生成されたことを実証した(Lu et al.Regen Med 2008;3:693-704)。発明者は、次いで、上記支持細胞なしの系におけるヒトiPSCの培養の実験を開始し、支持細胞なしの条件下で維持されたヒトiPSCは、Nanog、Oct-4、SSEA-4、およびTra-1-60の多分化能マーカーを発現した(図11)。支持細胞なしの条件からのヒトiPSCsが高効率で血管芽細胞に分化するかどうかを試験する。
iPSCは、細胞分化後およびEB形成中において低い生命力を示し、この現象はhESCにおいても観察される。選択的Rho関連キナーゼ(ROCK)阻害剤Y-27632の無血清EB形成培地への添加が、hESCのアポトーシスを防止し、EB形成を高め、分化を促進することが示されている(Watanabe et al.Nat Biotechnol 2007;25:681-686)。実験では、無血清EB形成および分化培地へのY-27632の添加が、対照培地よりも、ヒトiPS(IMR90)-1細胞からのEBの良好な形成をもたらすことが示された、つまり、Stemline II培地およびサイトカインのみにおけるEBは、通常比較的小さく、24時間後に多くの死細胞を伴い、一方Y-27632を添加した培地におけるEBは滑らかで大きく、より少ない死細胞がその回りを囲んでおり(図12aおよび12b)、より健康的なEBが形成されることを示している。芽細胞コロニー形成のための播種後、Y-27632で処理されたEBからの細胞は、Y-27632処理なしのEBから得られた細胞よりも大幅に多く健康的な芽細胞コロニーを発達させ(図12cおよび12d)、2倍を超える数の血管芽細胞を生成した。以前の研究はまた、本明細書に記載のEB形成系において使用されるStemline II培地を含むほぼすべての細胞培養培地における成分であるインスリンが、恐らくはPI3K/Aktシグナル経路を介したhESC中胚葉分化の有効な阻害剤であることを示している。PI3K/Aktシグナル経路の阻害は、無血清条件下でのhESCの中胚葉分化を向上させた(Freund et al.Stem Cells 2008;26:724-733)。結果は、EB形成および分化培地へのPI3K/Aktシグナル経路阻害剤の添加が、MA09 hESCからの血管芽細胞の形成を大幅に増加させることを示した。対照からの皿と比較して、PI3K/Akt阻害剤で処理した皿からは血管芽細胞の2.5倍を超える増加が得られた。同様に、EB形成中における、PI3K/Aktシグナル経路阻害剤のみ、またはそれとY-27632の添加もまた、対照よりも多く健康的なiPS(IMR90)-1からの芽細胞コロニーをもたらし(図12e)、PI3K/Art阻害剤処理EBならびにPI3K/Art阻害剤およびROCK阻害剤処理EBにおいて、それぞれ2.1倍および2.6倍多い血管芽細胞を産生した。次いで、血管芽細胞を精製し、造血または内皮細胞分化の条件下で播種した。図12f~12jに示されるように、これらの細胞は、適切な条件下での播種後、造血細胞および内皮細胞の両方に分化した。
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上記発明を実施するための形態において、本発明の様々な実施形態を説明した。これらの説明は上記実施形態を直接的に説明しているが、当業者は、本明細書に示され説明された具体的実施形態の修正および/または変形を着想し得ることが理解される。本説明の範囲内に包含される任意のそのような修正もまた、本発明に含まれることが意図される。特記しない限り、明細書および特許請求の範囲における単語および語句には、元々の意味、および該当する技術分野(複数可)における当業者にとって習慣的な意味が付与されることが、発明者の意図するところである。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕
ヒト血管コロニー形成細胞を生体外で生成および増幅するための方法であって、
(a)ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、
(b)少なくとも2つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中でヒト血管コロニー形成細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
を含み、前記多能性幹細胞、胚様体および血管コロニー形成細胞は、前記方法のステップ(a)および(b)にわたり無血清培地中で成長させられ、
ステップ(b)における前記少なくとも2つの成長因子は、BMP4およびVEGFを含む、方法。
〔2〕
ヒト血管コロニー形成細胞を生体外で生成および増幅するための方法であって、
(a)ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、
(b)少なくとも2つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中でヒト血管コロニー形成細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
(c)前記胚様体は、単細胞に分割され、
(d)少なくとも1つの成長因子を、前記単細胞を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記単細胞を含む前記培養物中でヒト血管コロニー形成細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
を含み、前記多能性幹細胞、胚様体および血管コロニー形成細胞は、前記方法のステップ(a)~(d)にわたり無血清培地中で成長させられ、
ステップ(b)における前記少なくとも2つの成長因子は、BMP4およびVEGFを含む、方法。
〔3〕
前記多能性幹細胞は、胚幹細胞である、前記〔1〕または〔2〕に記載の方法。
〔4〕
前記成長因子は、ホメオボックスタンパク質またはその機能性変異体もしくは活性変異体を含むタンパク質である、前記〔1〕または〔2〕に記載の方法。
〔5〕
前記ホメオボックスタンパク質は、HOXB4タンパク質、またはその機能性変異体もしくは活性変異体を含む、前記〔4〕に記載の方法。
〔6〕
前記成長因子は、ステップ(b)にわたり複数回、ステップ(b)における前記培養物に添加される、前記〔4〕または前記〔5〕に記載の方法。
〔7〕
前記成長因子は、ステップ(b)および(d)にわたり複数回、ステップ(b)および(d)における前記培養物に添加される、前記〔4〕または前記〔5〕に記載の方法。
〔8〕
前記タンパク質は、1日1回添加される、前記〔6〕または前記〔7〕に記載の方法。
〔9〕
前記タンパク質は、1日おきに1回添加される、前記〔6〕または前記〔7〕に記載の方法。
〔10〕
前記〔1〕に記載の方法により作製される、単離血管コロニー形成細胞。
〔11〕
前記〔2〕に記載の方法により作製される、単離血管コロニー形成細胞。
〔12〕
前記成長因子は、血管内皮成長因子(VEGF)、骨形態形成タンパク質(BMP)、幹細胞因子(SCF)、FLt-3L(FL)、トロンボポエチン(TPO)、およびエリスロポエチン(EPO)からなる群から選択される、前記〔1〕~〔5〕のいずれか一項に記載の方法。
〔13〕
前記血管内皮成長因子(VEGF)もしくは骨形態形成タンパク質(BMP)、またはその両方は、ステップ(a)において細胞培養の0~48時間以内に添加される、前記〔6〕に記載の方法。
〔14〕
前記幹細胞因子(SCF)、FLt-3L(FL)、もしくはトロンボポエチン(TPO)、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ(a)の開始から48~72時間以内に前記培養物に添加される、前記〔6〕に記載の方法。
〔15〕
前記成長因子は、ステップ(a)の開始から48~72時間以内にステップ(b)に添加される、前記〔4〕~〔5〕のいずれか一項に記載の方法。
〔16〕
前記成長因子は、ステップ(a)の開始48~72時間以内に培養ステップ(b)に添加される、前記〔5〕に記載の方法。
〔17〕
エリスロポエチン(EPO)をステップ(b)に添加するステップをさらに含む、前記〔1〕に記載の方法。
〔18〕
エリスロポエチン(EPO)をステップ(b)および(d)に添加するステップを含む、前記〔2〕に記載の方法。
〔19〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞を前記培養物から精製するステップをさらに含む、前記〔1〕~〔3〕のいずれか一項に記載の方法。
〔20〕
前記血管コロニー形成細胞を精製する前記ステップは、抗CD71抗体による免疫親和性カラムクロマトグラフィーを使用するステップを含む、前記〔13〕に記載の方法。
〔21〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞を前記培養物から単離するステップをさらに含む、前記〔1〕~〔3〕のいずれか一項に記載の方法。
〔22〕
前記血管コロニー形成細胞を単離する前記ステップは、前記血管コロニー形成細胞をサイズおよび/または形態により単離するステップを含む、前記〔15〕に記載の方法。
〔23〕
前記成長因子は、HOXB4およびタンパク質導入ドメイン(PTD)を含む融合タンパク質である、前記〔4〕~〔5〕のいずれか一項に記載の方法。
〔24〕
前記PTDおよび前記HOXB4は、リンカーを介して共役される、前記〔23〕に記載の方法。
〔25〕
前記タンパク質導入ドメイン(PTD)は、TATタンパク質、その機能性変異体または活性断片である、前記〔23〕に記載の方法。
〔26〕
前記HOXB4は、哺乳類HOXB4である、前記〔5〕に記載の方法。
〔27〕
前記哺乳類HOXB4は、マウスまたはヒトHOXB4である、前記〔26〕に記載の方法。
〔28〕
前記哺乳類HOXB4は、ヒトHOXB4である、前記〔27〕に記載の方法。
〔29〕
前記HOXB4は、全長タンパク質を含む、前記〔5〕に記載の方法。
〔30〕
前記HOXB4は、配列番号1または配列番号3のアミノ酸配列を含む、前記〔29〕に記載の方法。
〔31〕
前記PTDは、配列番号14のアミノ酸配列を有するTATポリペプチドの1つ以上の複製を含む、前記〔23〕に記載の方法。
〔32〕
前記TATタンパク質は、配列番号14のアミノ酸配列を含む、前記〔25〕に記載の方法。
〔33〕
ヒト多能性幹細胞を含む前記細胞培養物は、ヒト胚幹細胞のライブラリから得られ、前記ヒト胚幹細胞のライブラリは、そのそれぞれが、ヒト集団に存在する少なくとも1つのMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である幹細胞を含み、前記幹細胞のライブラリのぞれぞれの幹細胞は、前記ライブラリの残りの幹細胞と比べて異なる組のMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合であり、前記方法は、そのそれぞれが、ヒト集団に存在する少なくとも1つのMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である血管コロニー形成細胞のライブラリを生成し、前記幹細胞のライブラリのそれぞれの幹細胞は、前記ライブラリの残りの幹細胞と比べて異なる組のMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である、前記〔1〕~〔3〕のいずれか一項に記載の方法。
〔34〕
前記ヒト胚幹細胞のライブラリは、ヒト集団に存在するすべてのMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である幹細胞を含み、前記方法は、ヒト集団に存在するすべてのMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である血管コロニー形成細胞を含む血管コロニー形成細胞のライブラリを生成する、前記〔33〕に記載の方法。
〔35〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞を、前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト造血幹細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、培養するステップをさらに含む、前記〔1〕~〔3〕のいずれか一項に記載の方法。
〔36〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞を、前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト内皮細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、培養するステップをさらに含む、前記〔1〕~〔3〕のいずれか一項に記載の方法。
〔37〕
前記条件は、前記ヒト血管コロニー形成細胞をフィブロネクチン被覆培養皿上で培養することを含む、前記〔35〕に記載の方法。
〔38〕
前記培養物は、少なくとも1×10 6 個のヒト血管コロニー形成細胞を含む、前記〔1〕~〔3〕のいずれか一項に記載の方法。
〔39〕
前記培養物は、少なくとも2×10 6 個のヒト血管コロニー形成細胞、少なくとも3×10 6 個のヒト血管コロニー形成細胞、および少なくとも4×10 6 個のヒト血管コロニー形成細胞から選択される数量を含む、前記〔32〕に記載の方法。
〔40〕
前記〔1〕、〔2〕、〔17〕、または〔18〕の方法により調製される、ヒト血管コロニー形成細胞。
〔41〕
少なくとも1×10 6 個のヒト血管コロニー形成細胞を含む、ヒト血管コロニー形成細胞の溶液。
〔42〕
前記溶液は、対象に注射可能である、前記〔41〕に記載の溶液。
〔43〕
前記溶液は、冷凍に好適である、前記〔41〕に記載の溶液。
〔44〕
前記溶液は、少なくとも2×10 6 個のヒト血管コロニー形成細胞、少なくとも3×10 6 個のヒト血管コロニー形成細胞または少なくとも4×10 6 個のヒト血管コロニー形成細胞を含む、前記〔41〕に記載の溶液。
〔45〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞は、少なくとも造血または内皮細胞に分化することができる、前記〔41〕に記載の溶液。
〔46〕
血管コロニー形成細胞、造血細胞または内皮細胞の投与により処置され得る疾患の処置用の医薬の製造のための、前記〔41〕~〔45〕のいずれか一項に記載の溶液の使用。
〔47〕
投与を必要とする患者にヒト血管コロニー形成細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)前記〔1〕~〔39〕のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト血管コロニー形成細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔48〕
前記血管コロニー形成細胞は、支持細胞なしで培養することにより作製される、前記〔47〕に記載の方法。
〔49〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、前記〔48〕に記載の方法。
〔50〕
投与を必要とする患者にヒト造血幹細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)前記〔1〕~〔39〕のいずれか一項に記載の方法により作製される血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト血管コロニー形成細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔51〕
前記血管コロニー形成細胞は、支持細胞なしで培養することにより作製される、前記〔50〕に記載の方法。
〔52〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、前記〔51〕に記載の方法。
〔53〕
投与を必要とする患者にヒト内皮細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)前記〔1〕~〔39〕のいずれか一項に記載の方法により作製される血管コロニー形成細胞を供給するステップと、 (c)前記ヒト血管コロニー形成細胞を、ヒト内皮細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト内皮細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔54〕
前記血管コロニー形成細胞は、支持細胞なしで培養することにより作製される、前記〔53〕に記載の方法。
〔55〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、前記〔54〕に記載の方法。
〔56〕
処置を必要とする患者における造血幹細胞障害を処置する方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)前記〔1〕~〔39〕のいずれか一項に記載の方法により作製される血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト血管コロニー形成細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔57〕
前記血管コロニー形成細胞は、支持細胞なしで培養することにより作製される、前記〔56〕に記載の方法。
〔58〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、前記〔57〕に記載の方法。
〔59〕
処置を必要とする患者における内皮細胞障害を処置する方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)前記〔1〕~〔39〕のいずれか一項に記載の方法により作製される血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト血管コロニー形成細胞を、ヒト内皮細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト内皮細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔60〕
前記血管コロニー形成細胞は、支持細胞なしで培養することにより作製される、前記〔59〕に記載の方法。
〔61〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、前記〔60〕に記載の方法。
〔62〕
前記内皮細胞障害は、心筋梗塞、脳梗塞、アテローム性動脈硬化および虚血からなる群から選択される、前記〔56〕~〔61〕のいずれか一項に記載の方法。
〔63〕
前記虚血は、脳、四肢、心臓、肺、皮膚および目に生じる、前記〔62〕に記載の方法。
〔64〕
ヒト造血幹細胞を生体外で産生するための方法であって、
(a)前記〔1〕~〔39〕のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(b)前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト造血幹細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、前記ヒト血管コロニー形成細胞を成長させるステップと、を含む方法。
〔65〕
前記〔64〕に記載の方法により産生されるヒト造血幹細胞。
〔66〕
ヒト内皮細胞を生体外で産生するための方法であって、
(a)前記〔1〕~〔39〕のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(b)前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト内皮細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、前記ヒト血管コロニー形成細胞を成長させるステップと、を含む方法。
〔67〕
前記〔66〕に記載の方法により産生されるヒト内皮細胞。
〔68〕
前記〔33〕または前記〔34〕に記載の方法により作製されるヒト血管コロニー形成細胞のライブラリ。
〔69〕
ヒトの患者にヒト造血幹細胞またはヒト内皮細胞を投与することを含む、処置を必要とする前記患者を処置する方法であって、
(a)前記患者を選択するステップと、
(b)前記患者の細胞の表面上に発現したMHCタンパク質を同定するステップと、
(c)前記〔68〕に記載のヒト血管コロニー形成細胞のライブラリを提供するステップと、
(d)前記患者の細胞上の前記患者のMHCタンパク質と一致するヒト血管コロニー形成細胞を選択するステップと、
(e)ステップ(d)において同定された前記ヒト血管コロニー形成細胞を、必要に応じて、ヒト造血幹細胞、内皮細胞またはその両方に分化させるステップと、
(f)ステップ(e)からの前記ヒト造血幹細胞、内皮細胞またはその両方の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔70〕
前記方法は、地域の施設において行われる、前記〔69〕に記載の方法
〔71〕
前記地域の施設は、病院である、前記〔70〕に記載の方法。
〔72〕
血管コロニー形勢細胞を増幅させるための方法であって、BMP4およびVEGFまたはその機能性同等物もしくは活性断片を、前記血管コロニー形成細胞の増殖を補助するのに十分な量で含むタンパク質の存在下で、無血清培地中の哺乳類血管コロニー形成細胞を成長させることを含む、方法。
〔73〕
前記血管コロニー形成細胞は、臍帯血、末梢血または骨髄から濃縮、精製または単離される、前記〔72〕に記載の方法。
〔74〕
前記血管コロニー形成細胞は、ヒト血管コロニー形成細胞である、前記〔72〕に記載の方法。
〔75〕
前記血管コロニー形成細胞は、少なくとも1×10 6 個の血管コロニー形成細胞に達するように生体外で成長させられる、前記〔72〕に記載の方法。
〔76〕
前記無血清培地は、ホメオボックスタンパク質、その機能性同等物または活性断片をさらに含む、前記〔72〕に記載の方法。
〔77〕
ホメオボックスたんぱく質、その機能性同等物または活性断片は、HOXB4タンパク質またはその機能性同等物もしくは活性断片である、前記〔76〕に記載の方法。
〔78〕
前記HOXB4は、哺乳類HOXB4である、前記〔77〕に記載の方法。
〔79〕
前記哺乳類HOXB4は、マウスまたはヒトHOXB4である、前記〔78〕に記載の方法。
〔80〕
前記哺乳類HOXB4は、ヒトHOXB4である、前記〔79〕に記載の方法。
〔81〕
前記HOXB4は、全長タンパク質を含む、前記〔77〕に記載の方法。
〔82〕
前記HOXB4は、配列番号1または配列番号3のアミノ酸配列を含む、前記〔77〕に記載の方法。
〔83〕
前記無血清培地は、HOXB4およびタンパク質導入ドメイン(PTD)を含む融合タンパク質をさらに含む、前記〔72〕に記載の方法。
〔84〕
前記タンパク質導入ドメイン(PTD)は、TATタンパク質、その機能性同等物または活性断片である、前記〔83〕に記載の方法。
〔85〕
前記TATタンパク質は、配列番号14のアミノ酸配列を含む、前記〔84〕に記載の方法。
〔86〕
前記PTDは配列番号14のアミノ酸配列を有するTATポリペプチドの1つ以上の複製を含む、前記〔83〕に記載の方法。
〔87〕
ヒトの被移植者においてドナー同種移植片に対する寛容性を誘導する方法であって、
(a)T細胞共刺激を阻害する薬剤を前記被移植者に投与するステップと、
(b)前記〔1〕に記載の方法により生成されたヒト血管コロニー形成細胞を、前記被移植者に導入するステップであって、前記血管コロニー形成細胞は、ドナーに対して一致する、ステップと、
(c)前記同種移植片を前記被移植者に移植するステップであて、前記ヒト血管コロニー形成細胞は、前記被移植者における前記同種移植片に対する寛容性を誘導する、ステップと、を含む方法。
〔88〕
T細胞共刺激を阻害する前記薬剤は、CD40リガンド-CD40相互作用を阻害する薬剤である、前記〔87〕に記載の方法。
〔89〕
前記方法は、CD28-B7相互作用を阻害する薬剤を投与するステップをさらに含む、前記〔87〕に記載の方法。
〔90〕
前記方法は、胸腺照射またはT細胞除去もしくは不活性化のステップを含まない、前記〔87〕~〔89〕に記載の方法。
〔91〕
前記方法は、前記被移植者に、胸腺照射を施すステップをさらに含む、前記〔87〕~〔89〕のいずれか一項に記載の方法。
〔92〕
前記方法は、前記被移植者に、T細胞を除去または不活性化する処置を施すステップをさらに含む、前記〔87〕~〔89〕のいずれか一項に記載の方法。
〔93〕
前記方法は、前記被移植者に、胸腺照射と、T細胞を除去または不活性化する処置とを施すステップをさらに含む、前記〔87〕~〔89〕のいずれか一項に記載の方法。
〔94〕
ヒトの被移植者においてドナー同種移植片に対する寛容性を誘導する方法であって、
(a)前記被移植者において胸腺空間を形成するステップと、
(b)前記被移植者においてT細胞を除去または不活性化するステップと、
(c)前記〔1〕に記載の方法により生成されたヒト血管コロニー形成細胞を、前記被移植者に導入するステップであって、前記人血管コロニー形成細胞は、ドナーに対して一致する、ステップと、
(d)前記同種移植片を前記被移植者に移植するステップと、
を含み、前記ヒト血管コロニー形成細胞は、前記被移植者における前記同種移植片に対する寛容性を誘導する、方法。
〔95〕
前記胸腺空間は、前記被移植者に、胸腺照射、ステロイド、コルチコステロイド、ブレキナール、および免疫抑制化学物質または薬品から選択される少なくとも1つの処置を施すことにより形成される、前記〔94〕に記載の方法。
〔96〕
前記胸腺空間は、前記被移植者に胸腺照射を施すことにより形成される、前記〔94〕に記載の方法。
〔97〕
前記胸腺空間は、前記被移植者に免疫抑制化学物質または薬品を投与することにより形成される、前記〔94〕に記載の方法。
〔98〕
前記胸腺空間は、前記被移植者にシクロスポリンを投与することにより形成される、前記〔94〕に記載の方法。
〔99〕
前記被移植者に、複数の血管コロニー形成細胞の投与が提供される、前記〔87〕または前記〔94〕に記載の方法。
〔100〕
前記寛容性は、全身照射により形成される造血空間なしで誘導される、前記〔87〕または前記〔94〕に記載の方法。
〔101〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞および前記同種移植片は、同じドナーから得られる、前記〔87〕または前記〔94〕に記載の方法。
〔102〕
前記ヒト血管コロニー形成細胞および前記同種移植片は、異なるドナーから得られる、前記〔87〕または前記〔94〕に記載の方法。
〔103〕
少なくとも1つ以上の造血細胞型を産生するように分化することができる、ヒト非生着血管細胞であって、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有さない、血管細胞。
〔104〕
前記血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞を特徴付けるタンパク質のうち、すべてではないがその一部を発現する、前記〔103〕に記載の非生着血管細胞。
〔105〕
前記血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞の1つ以上の特徴を有する、前記〔103〕に記載の非生着血管細胞。
〔106〕
前記血管細胞は、他の血管細胞に緩く接着する、前記〔103〕に記載の非生着血管細胞。
〔107〕
前記ヒト血管細胞は、CD34、CD31、KDRおよびCD133から選択される1つ以上のタンパク質を発現しない、前記〔104〕に記載の非生着血管細胞。
〔108〕
前記ヒト血管細胞は、LMO2およびGATA2タンパク質を発現する、前記〔104〕に記載の非生着血管細胞。
〔109〕
前記宿主が、哺乳動物である、前記〔103〕から〔108〕のいずれか一項に記載の非生着血管細胞。
〔110〕
前記哺乳動物がヒトである、前記〔109〕に記載の非生着血管細胞。
〔111〕
少なくとも1つ以上の造血細胞型を産生するように分化することができるヒト非生着血管細胞の実質的に精製された集団を含む細胞培養物であって、前記血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有さない、細胞培養物。
〔112〕
胚由来細胞から分化したヒト非生着血管細胞を含む細胞培養物であって、前記非生着血管細胞は、少なくとも1つ以上の造血細胞型を産生するように分化することができ、前記血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有さない、細胞培養物。
〔113〕
前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞を特徴付けるタンパク質のうち、すべてではないがその一部を発現する、前記〔111〕または〔112〕に記載の細胞培養物。
〔114〕
前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞の特徴のうち1つ以上を有する、前記〔111〕または〔112〕に記載の細胞培養物。
〔115〕
前記血管細胞は、他の血管細胞に緩く接着する、前記〔111〕または〔112〕に記載の非生着血管細胞。
〔116〕
前記ヒト血管細胞は、CD34、CD31、KDRおよびCD133から選択される1つ以上のタンパク質を発現しない、前記〔113〕に記載の細胞培養物。
〔117〕
前記ヒト血管細胞は、LMO2およびGATA2タンパク質を発現する、前記〔113〕に記載の細胞培養物。
〔118〕
前記〔103〕~〔110〕のいずれか一項に記載の非生着血管細胞から分化した造血細胞を含む細胞培養物。
〔119〕
少なくとも1×10 6 個のヒト非生着血管細胞、少なくとも2×10 6 個のヒト非生着血管細胞、少なくとも3×10 6 個のヒト非生着血管細胞、または少なくとも4×10 6 個のヒト非生着血管細胞を含む、ヒト非生着血管細胞の溶液。
〔120〕
前記ヒト非生着血管細胞は、少なくとも1つ以上の造血細胞型を産生するように分化することができ、前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有さない、前記〔119〕のいずれかに記載の溶液。
〔121〕
前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞を特徴付けるタンパク質のうち、すべてではないがその一部を発現する、前記〔120〕に記載の溶液。
〔122〕
前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞の1つ以上の特徴を有する、前記〔120〕に記載の溶液。
〔123〕
前記血管細胞は、他の血管細胞に緩く接着する、前記〔120〕に記載の溶液。
〔124〕
前記ヒト血管細胞は、CD34、CD31、KDRおよびCD133から選択される1つ以上のタンパク質を発現しない、前記〔121〕に記載の溶液。
〔125〕
前記ヒト血管細胞は、LMO2およびGATA2タンパク質を発現する、前記〔121〕に記載の溶液。
〔126〕
前記溶液は、対象に注射可能であるか、または冷凍に好適である、前記〔119〕~〔125〕のいずれかに記載の溶液。
〔127〕
非生着血管細胞または造血細胞の投与により処置され得る疾患の処置用の医薬の製造のための、前記〔119〕~〔125〕のいずれか一項に記載の溶液の使用。
〔128〕
少なくとも1つ以上の造血細胞型を産生するように分化することができるヒト非生着血管細胞の実質的に精製された集団を含む医薬調製物であって、前記血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有さない、医薬調製物。
〔129〕
前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞を特徴付けるタンパク質のうち、すべてではないがその一部を発現する、前記〔128〕に記載の医薬調製物。
〔130〕
前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞の特徴のうち1つ以上を有する、前記〔128〕に記載の医薬調製物。
〔131〕
前記血管細胞は、他の血管細胞に緩く接着する、前記〔128〕に記載の医薬調製物。
〔132〕
前記ヒト血管細胞は、CD34、CD31、KDRおよびCD133から選択される1つ以上のタンパク質を発現しない、前記〔129〕に記載の医薬調製物。
〔133〕
前記ヒト血管細胞は、LMO2およびGATA2タンパク質を発現する、前記〔129〕に記載の医薬調製物。
〔134〕
前記調製物は、少なくとも1×10 6 個のヒト非生着血管細胞を含む、前記〔128〕~〔133〕に記載の医薬調製物。
〔135〕
前記調製物は、少なくとも5×10 6 個のヒト非生着血管細胞を含む、前記〔134〕に記載の医薬調製物。
〔136〕
前記〔1〕~〔110〕のいずれかに記載のヒト非生着血管細胞の凍結保存調製物。
〔137〕
前記調製物は、少なくとも1×10 6 個のヒト非生着血管細胞、少なくとも2×10 6 個のヒト非生着血管細胞、少なくとも3×10 6 個のヒト非生着血管細胞、少なくとも4×10 6 個のヒト非生着血管細胞、または少なくとも5×10 6 個のヒト非生着血管細胞を含む、前記〔136〕に記載の凍結保存調製物。
〔138〕
ヒト非生着血管細胞を生体外で生成および増幅するための方法であって、
(a)胚由来細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記胚由来細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、
(b)少なくとも1つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップと、
を含み、前記成長因子は、前記胚様体培養物中でヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であり、
前記胚様体は、10~13日間培養され、
前記胚由来細胞、胚様体および非生着血管細胞は、前記方法のステップ(a)および(b)にわたり無血清培地中で成長させられる、方法。
〔139〕
ヒト非生着血管細胞を生体外で生成および増幅するための方法であって、
(a)ヒト胚由来細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記胚由来細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、
(b)少なくとも1つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中でヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
(c)前記胚様体は、単細胞に分割され、
(d)少なくとも1つの成長因子を、前記単細胞を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記単細胞を含む前記培養物中でヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
を含み、前記単細胞の培養物は、10~13日間培養され、
前記胚由来細胞、胚様体および非生着血管細胞は、前記方法のステップ(a)~(d)にわたり無血清培地中で成長させられる、方法。
〔140〕
前記胚由来細胞は、胚幹細胞である、前記〔138〕または〔139〕に記載の方法。
〔141〕
前記成長因子は、ホメオボックスタンパク質またはその機能性変異体もしくは活性変異体を含むタンパク質である、前記〔138〕または〔139〕に記載の方法。
〔142〕
前記ホメオボックスタンパク質は、HOXB4タンパク質、またはその機能性変異体もしくは活性変異体を含む、前記〔141〕に記載の方法。
〔143〕
前記成長因子は、血管内皮成長因子(VEGF)、骨形態形成タンパク質(BMP)、幹細胞因子(SCF)、FLt-3L(FL)、トロンボポエチン(TPO)、およびエリスロポエチン(EPO)からなる群から選択される、前記〔138〕~〔142〕のいずれか一項に記載の方法。
〔144〕
前記血管内皮成長因子(VEGF)もしくは骨形態形成タンパク質(BMP)、またはその両方は、ステップ(a)において細胞培養の0~48時間以内に添加される、前記〔143〕に記載の方法。
〔145〕
前記幹細胞因子(SCF)、FLt-3L(FL)、もしくはトロンボポエチン(TPO)、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ(a)の開始から48~72時間以内に前記培養物に添加される、前記〔143〕に記載の方法。
〔146〕
前記成長因子は、ステップ(a)の開始48~72時間以内に培養ステップ(b)に添加される、前記〔141〕~〔142〕に記載の方法。
〔147〕
エリスロポエチン(EPO)をステップ(b)に添加するステップをさらに含む、前記〔138〕に記載の方法。
〔148〕
エリスロポエチン(EPO)をステップ(b)および(d)に添加するステップを含む、前記〔139〕に記載の方法。
〔149〕
前記ヒト非生着血管細胞を前記培養物から精製するステップをさらに含む、前記〔138〕~〔140〕のいずれか一項に記載の方法。
〔150〕
前記ヒト非生着血管細胞を前記培養物から単離するステップをさらに含む、前記〔138〕~〔140〕のいずれか一項に記載の方法。
〔151〕
前記成長因子は、HOXB4およびタンパク質導入ドメイン(PTD)を含む融合タンパク質である、前記〔141〕~〔142〕のいずれか一項に記載の方法。
〔152〕
前記PTDおよび前記HOXB4は、リンカーを介して共役される、前記〔151〕に記載の方法。
〔153〕
前記タンパク質導入ドメイン(PTD)は、TATタンパク質、その機能性変異体または活性断片である、前記〔151〕に記載の方法。
〔154〕
前記HOXB4は、哺乳類HOXB4である、前記〔142〕に記載の方法。
〔155〕
前記哺乳類HOXB4は、マウスまたはヒトHOXB4である、前記〔154〕に記載の方法。
〔156〕
前記HOXB4は、全長タンパク質を含む、前記〔142〕に記載の方法。
〔157〕
前記非生着血管細胞のヒト造血細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、前記非生着血管細胞を培養するステップをさらに含む、前記〔138〕~〔140〕のいずれか一項に記載の方法。
〔158〕
前記培養物は、少なくとも1×10 6 個のヒト非生着血管細胞、少なくとも2×10 6 個のヒト非生着血管細胞、少なくとも3×10 6 個のヒト非生着血管細胞、または少なくとも4×10 6 個のヒト非生着血管細胞を含む、前記〔138〕~〔140〕のいずれか一項に記載の方法。
〔159〕
前記〔138〕、〔139〕、〔147〕、または〔148〕に記載の方法により産生されるヒト非生着血管細胞。
〔160〕
ヒト造血細胞を生体外で産生するための方法であって、
(a)前記〔138〕~〔148〕のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(b)前記ヒト非生着血管細胞のヒト造血幹細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、前記ヒト非生着血管細胞を成長させるステップと、を含む方法。
〔161〕
前記〔160〕に記載の方法により産生されるヒト造血幹細胞。
〔162〕
投与を必要とする患者にヒト非生着血管細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)前記〔138〕~〔148〕のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を供給するステップと、 (c)前記ヒト非生着血管細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔163〕
投与を必要とする患者にヒト非生着血管細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)少なくとも10,000個の細胞の量のヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト血管コロニー形成細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔164〕
前記ヒト非生着血管細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、前記〔163〕に記載の方法。
〔165〕
投与を必要とする患者にヒト造血幹細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)前記〔138〕~〔148〕のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト非生着血管細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔166〕
投与を必要とする患者にヒト造血幹細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)少なくとも10,000個の細胞の量のヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト非生着血管細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔167〕
前記ヒト非生着血管細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、前記〔166〕に記載の方法。
〔168〕
処置を必要とする患者における造血幹細胞障害を処置する方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)前記〔138〕~〔148〕のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト非生着血管細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔169〕
処置を必要とする患者における造血幹細胞障害を処置する方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)少なくとも10,000個の細胞の量のヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト非生着血管細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。
〔170〕
前記ヒト非生着血管細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、前記〔169〕に記載の方法。
〔171〕
非生着血管細胞から分化造血細胞を生体外で産生するための方法であって、
(a)ヒト非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)前記非生着血管細胞を分化造血細胞に分化させるステップと、を含む方法。
〔172〕
前記〔171〕に記載の方法により産生される分化造血細胞。
〔173〕
生体外でヒト非生着血管細胞から分化した造血細胞を使用して輸血を行うための方法であって、
(a)ヒト非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)前記非生着血管細胞を分化造血細胞に分化させるステップと、
(c)前記分化造血細胞で輸血を行うステップと、を含む方法。
〔174〕
非生着血管細胞から分化造血細胞を生体外で産生するための方法であって、
(a)前記〔138〕~〔148〕のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)前記非生着血管細胞を分化造血細胞に分化させるステップと、を含む方法。
〔175〕
前記〔174〕に記載の方法により産生される分化造血細胞。
〔176〕
生体外でヒト非生着血管細胞から分化した造血細胞を使用して輸血を行うための方法であって、
(a)前記〔138〕~〔148〕のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)前記非生着血管細胞を分化造血細胞に分化させるステップと、
(c)前記分化造血細胞で輸血を行うステップと、を含む方法。
〔177〕
前記多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、前記〔1〕、〔2〕、〔17〕、または〔18〕に記載の方法。
〔178〕
前記多能性肝細胞は、誘導された多能性肝細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、前記〔64〕に記載の方法。
〔179〕
前記多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、前記〔66〕に記載の方法。
〔180〕
前記多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、 前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、前記〔138〕、〔139〕、〔147〕、または〔148〕に記載の方法。
〔181〕
前記多能性肝細胞は、誘導された多能性肝細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、前記〔160〕に記載の方法。
〔182〕
前記多能性肝細胞は、誘導された多能性肝細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、前記〔171〕に記載の方法。
〔183〕
前記多能性肝細胞は、誘導された多能性肝細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、前記〔174〕に記載の方法。
Claims (183)
- ヒト血管コロニー形成細胞を生体外で生成および増幅するための方法であって、
(a)ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、
(b)少なくとも2つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中でヒト血管コロニー形成細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
を含み、前記多能性幹細胞、胚様体および血管コロニー形成細胞は、前記方法のステップ(a)および(b)にわたり無血清培地中で成長させられ、
ステップ(b)における前記少なくとも2つの成長因子は、BMP4およびVEGFを含む、方法。 - ヒト血管コロニー形成細胞を生体外で生成および増幅するための方法であって、
(a)ヒト多能性幹細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記多能性幹細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、
(b)少なくとも2つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中でヒト血管コロニー形成細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
(c)前記胚様体は、単細胞に分割され、
(d)少なくとも1つの成長因子を、前記単細胞を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記単細胞を含む前記培養物中でヒト血管コロニー形成細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
を含み、前記多能性幹細胞、胚様体および血管コロニー形成細胞は、前記方法のステップ(a)~(d)にわたり無血清培地中で成長させられ、
ステップ(b)における前記少なくとも2つの成長因子は、BMP4およびVEGFを含む、方法。 - 前記多能性幹細胞は、胚幹細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記成長因子は、ホメオボックスタンパク質またはその機能性変異体もしくは活性変異体を含むタンパク質である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ホメオボックスタンパク質は、HOXB4タンパク質、またはその機能性変異体もしくは活性変異体を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記成長因子は、ステップ(b)にわたり複数回、ステップ(b)における前記培養物に添加される、請求項4または請求項5に記載の方法。
- 前記成長因子は、ステップ(b)および(d)にわたり複数回、ステップ(b)および(d)における前記培養物に添加される、請求項4または請求項5に記載の方法。
- 前記タンパク質は、1日1回添加される、請求項6または請求項7に記載の方法。
- 前記タンパク質は、1日おきに1回添加される、請求項6または請求項7に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法により作製される、単離血管コロニー形成細胞。
- 請求項2に記載の方法により作製される、単離血管コロニー形成細胞。
- 前記成長因子は、血管内皮成長因子(VEGF)、骨形態形成タンパク質(BMP)、幹細胞因子(SCF)、FLt-3L(FL)、トロンボポエチン(TPO)、およびエリスロポエチン(EPO)からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血管内皮成長因子(VEGF)もしくは骨形態形成タンパク質(BMP)、またはその両方は、ステップ(a)において細胞培養の0~48時間以内に添加される、請求項6に記載の方法。
- 前記幹細胞因子(SCF)、FLt-3L(FL)、もしくはトロンボポエチン(TPO)、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ(a)の開始から48~72時間以内に前記培養物に添加される、請求項6に記載の方法。
- 前記成長因子は、ステップ(a)の開始から48~72時間以内にステップ(b)に添加される、請求項4~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記成長因子は、ステップ(a)の開始48~72時間以内に培養ステップ(b)に添加される、請求項5に記載の方法。
- エリスロポエチン(EPO)をステップ(b)に添加するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- エリスロポエチン(EPO)をステップ(b)および(d)に添加するステップを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞を前記培養物から精製するステップをさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血管コロニー形成細胞を精製する前記ステップは、抗CD71抗体による免疫親和性カラムクロマトグラフィーを使用するステップを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞を前記培養物から単離するステップをさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血管コロニー形成細胞を単離する前記ステップは、前記血管コロニー形成細胞をサイズおよび/または形態により単離するステップを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記成長因子は、HOXB4およびタンパク質導入ドメイン(PTD)を含む融合タンパク質である、請求項4~5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PTDおよび前記HOXB4は、リンカーを介して共役される、請求項23に記載の方法。
- 前記タンパク質導入ドメイン(PTD)は、TATタンパク質、その機能性変異体または活性断片である、請求項23に記載の方法。
- 前記HOXB4は、哺乳類HOXB4である、請求項5に記載の方法。
- 前記哺乳類HOXB4は、マウスまたはヒトHOXB4である、請求項26に記載の方法。
- 前記哺乳類HOXB4は、ヒトHOXB4である、請求項27に記載の方法。
- 前記HOXB4は、全長タンパク質を含む、請求項5に記載の方法。
- 前記HOXB4は、配列番号1または配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記PTDは、配列番号14のアミノ酸配列を有するTATポリペプチドの1つ以上の複製を含む、請求項23に記載の方法。
- 前記TATタンパク質は、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項25に記載の方法。
- ヒト多能性幹細胞を含む前記細胞培養物は、ヒト胚幹細胞のライブラリから得られ、前記ヒト胚幹細胞のライブラリは、そのそれぞれが、ヒト集団に存在する少なくとも1つのMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である幹細胞を含み、前記幹細胞のライブラリのぞれぞれの幹細胞は、前記ライブラリの残りの幹細胞と比べて異なる組のMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合であり、前記方法は、そのそれぞれが、ヒト集団に存在する少なくとも1つのMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である血管コロニー形成細胞のライブラリを生成し、前記幹細胞のライブラリのそれぞれの幹細胞は、前記ライブラリの残りの幹細胞と比べて異なる組のMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒト胚幹細胞のライブラリは、ヒト集団に存在するすべてのMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である幹細胞を含み、前記方法は、ヒト集団に存在するすべてのMHC対立遺伝子に対し半接合またはホモ接合である血管コロニー形成細胞を含む血管コロニー形成細胞のライブラリを生成する、請求項33に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞を、前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト造血幹細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、培養するステップをさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞を、前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト内皮細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、培養するステップをさらに含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記条件は、前記ヒト血管コロニー形成細胞をフィブロネクチン被覆培養皿上で培養することを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記培養物は、少なくとも1×106個のヒト血管コロニー形成細胞を含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養物は、少なくとも2×106個のヒト血管コロニー形成細胞、少なくとも3×106個のヒト血管コロニー形成細胞、および少なくとも4×106個のヒト血管コロニー形成細胞から選択される数量を含む、請求項32に記載の方法。
- 請求項1、2、17、または18の方法により調製される、ヒト血管コロニー形成細胞。
- 少なくとも1×106個のヒト血管コロニー形成細胞を含む、ヒト血管コロニー形成細胞の溶液。
- 前記溶液は、対象に注射可能である、請求項41に記載の溶液。
- 前記溶液は、冷凍に好適である、請求項41に記載の溶液。
- 前記溶液は、少なくとも2×106個のヒト血管コロニー形成細胞、少なくとも3×106個のヒト血管コロニー形成細胞または少なくとも4×106個のヒト血管コロニー形成細胞を含む、請求項41に記載の溶液。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞は、少なくとも造血または内皮細胞に分化することができる、請求項41に記載の溶液。
- 血管コロニー形成細胞、造血細胞または内皮細胞の投与により処置され得る疾患の処置用の医薬の製造のための、請求項41~45のいずれか一項に記載の溶液の使用。
- 投与を必要とする患者にヒト血管コロニー形成細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)請求項1~39のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト血管コロニー形成細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 前記血管コロニー形成細胞は、支持細胞なしで培養することにより作製される、請求項47に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、請求項48に記載の方法。
- 投与を必要とする患者にヒト造血幹細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)請求項1~39のいずれか一項に記載の方法により作製される血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト血管コロニー形成細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 前記血管コロニー形成細胞は、支持細胞なしで培養することにより作製される、請求項50に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、請求項51に記載の方法。
- 投与を必要とする患者にヒト内皮細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)請求項1~39のいずれか一項に記載の方法により作製される血管コロニー形成細胞を供給するステップと、 (c)前記ヒト血管コロニー形成細胞を、ヒト内皮細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト内皮細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 前記血管コロニー形成細胞は、支持細胞なしで培養することにより作製される、請求項53に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、請求項54に記載の方法。
- 処置を必要とする患者における造血幹細胞障害を処置する方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)請求項1~39のいずれか一項に記載の方法により作製される血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト血管コロニー形成細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 前記血管コロニー形成細胞は、支持細胞なしで培養することにより作製される、請求項56に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、請求項57に記載の方法。
- 処置を必要とする患者における内皮細胞障害を処置する方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)請求項1~39のいずれか一項に記載の方法により作製される血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト血管コロニー形成細胞を、ヒト内皮細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト内皮細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 前記血管コロニー形成細胞は、支持細胞なしで培養することにより作製される、請求項59に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、請求項60に記載の方法。
- 前記内皮細胞障害は、心筋梗塞、脳梗塞、アテローム性動脈硬化および虚血からなる群から選択される、請求項56~61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記虚血は、脳、四肢、心臓、肺、皮膚および目に生じる、請求項62に記載の方法。
- ヒト造血幹細胞を生体外で産生するための方法であって、
(a)請求項1~39のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(b)前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト造血幹細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、前記ヒト血管コロニー形成細胞を成長させるステップと、を含む方法。 - 請求項64に記載の方法により産生されるヒト造血幹細胞。
- ヒト内皮細胞を生体外で産生するための方法であって、
(a)請求項1~39のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト血管コロニー形成細胞を供給するステップと、
(b)前記ヒト血管コロニー形成細胞のヒト内皮細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、前記ヒト血管コロニー形成細胞を成長させるステップと、を含む方法。 - 請求項66に記載の方法により産生されるヒト内皮細胞。
- 請求項33または請求項34に記載の方法により作製されるヒト血管コロニー形成細胞のライブラリ。
- ヒトの患者にヒト造血幹細胞またはヒト内皮細胞を投与することを含む、処置を必要とする前記患者を処置する方法であって、
(a)前記患者を選択するステップと、
(b)前記患者の細胞の表面上に発現したMHCタンパク質を同定するステップと、
(c)請求項68に記載のヒト血管コロニー形成細胞のライブラリを提供するステップと、
(d)前記患者の細胞上の前記患者のMHCタンパク質と一致するヒト血管コロニー形成細胞を選択するステップと、
(e)ステップ(d)において同定された前記ヒト血管コロニー形成細胞を、必要に応じて、ヒト造血幹細胞、内皮細胞またはその両方に分化させるステップと、
(f)ステップ(e)からの前記ヒト造血幹細胞、内皮細胞またはその両方の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 前記方法は、地域の施設において行われる、請求項69に記載の方法
- 前記地域の施設は、病院である、請求項70に記載の方法。
- 血管コロニー形勢細胞を増幅させるための方法であって、BMP4およびVEGFまたはその機能性同等物もしくは活性断片を、前記血管コロニー形成細胞の増殖を補助するのに十分な量で含むタンパク質の存在下で、無血清培地中の哺乳類血管コロニー形成細胞を成長させることを含む、方法。
- 前記血管コロニー形成細胞は、臍帯血、末梢血または骨髄から濃縮、精製または単離される、請求項72に記載の方法。
- 前記血管コロニー形成細胞は、ヒト血管コロニー形成細胞である、請求項72に記載の方法。
- 前記血管コロニー形成細胞は、少なくとも1×106個の血管コロニー形成細胞に達するように生体外で成長させられる、請求項72に記載の方法。
- 前記無血清培地は、ホメオボックスタンパク質、その機能性同等物または活性断片をさらに含む、請求項72に記載の方法。
- ホメオボックスたんぱく質、その機能性同等物または活性断片は、HOXB4タンパク質またはその機能性同等物もしくは活性断片である、請求項76に記載の方法。
- 前記HOXB4は、哺乳類HOXB4である、請求項77に記載の方法。
- 前記哺乳類HOXB4は、マウスまたはヒトHOXB4である、請求項78に記載の方法。
- 前記哺乳類HOXB4は、ヒトHOXB4である、請求項79に記載の方法。
- 前記HOXB4は、全長タンパク質を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記HOXB4は、配列番号1または配列番号3のアミノ酸配列を含む、請求項77に記載の方法。
- 前記無血清培地は、HOXB4およびタンパク質導入ドメイン(PTD)を含む融合タンパク質をさらに含む、請求項72に記載の方法。
- 前記タンパク質導入ドメイン(PTD)は、TATタンパク質、その機能性同等物または活性断片である、請求項83に記載の方法。
- 前記TATタンパク質は、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項84に記載の方法。
- 前記PTDは配列番号14のアミノ酸配列を有するTATポリペプチドの1つ以上の複製を含む、請求項83に記載の方法。
- ヒトの被移植者においてドナー同種移植片に対する寛容性を誘導する方法であって、
(a)T細胞共刺激を阻害する薬剤を前記被移植者に投与するステップと、
(b)請求項1に記載の方法により生成されたヒト血管コロニー形成細胞を、前記被移植者に導入するステップであって、前記血管コロニー形成細胞は、ドナーに対して一致する、ステップと、
(c)前記同種移植片を前記被移植者に移植するステップであて、前記ヒト血管コロニー形成細胞は、前記被移植者における前記同種移植片に対する寛容性を誘導する、ステップと、を含む方法。 - T細胞共刺激を阻害する前記薬剤は、CD40リガンド-CD40相互作用を阻害する薬剤である、請求項87に記載の方法。
- 前記方法は、CD28-B7相互作用を阻害する薬剤を投与するステップをさらに含む、請求項87に記載の方法。
- 前記方法は、胸腺照射またはT細胞除去もしくは不活性化のステップを含まない、請求項87~89に記載の方法。
- 前記方法は、前記被移植者に、胸腺照射を施すステップをさらに含む、請求項87~89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、前記被移植者に、T細胞を除去または不活性化する処置を施すステップをさらに含む、請求項87~89のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法は、前記被移植者に、胸腺照射と、T細胞を除去または不活性化する処置とを施すステップをさらに含む、請求項87~89のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトの被移植者においてドナー同種移植片に対する寛容性を誘導する方法であって、
(a)前記被移植者において胸腺空間を形成するステップと、
(b)前記被移植者においてT細胞を除去または不活性化するステップと、
(c)請求項1に記載の方法により生成されたヒト血管コロニー形成細胞を、前記被移植者に導入するステップであって、前記人血管コロニー形成細胞は、ドナーに対して一致する、ステップと、
(d)前記同種移植片を前記被移植者に移植するステップと、
を含み、前記ヒト血管コロニー形成細胞は、前記被移植者における前記同種移植片に対する寛容性を誘導する、方法。 - 前記胸腺空間は、前記被移植者に、胸腺照射、ステロイド、コルチコステロイド、ブレキナール、および免疫抑制化学物質または薬品から選択される少なくとも1つの処置を施すことにより形成される、請求項94に記載の方法。
- 前記胸腺空間は、前記被移植者に胸腺照射を施すことにより形成される、請求項94に記載の方法。
- 前記胸腺空間は、前記被移植者に免疫抑制化学物質または薬品を投与することにより形成される、請求項94に記載の方法。
- 前記胸腺空間は、前記被移植者にシクロスポリンを投与することにより形成される、請求項94に記載の方法。
- 前記被移植者に、複数の血管コロニー形成細胞の投与が提供される、請求項87または請求項94に記載の方法。
- 前記寛容性は、全身照射により形成される造血空間なしで誘導される、請求項87または請求項94に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞および前記同種移植片は、同じドナーから得られる、請求項87または請求項94に記載の方法。
- 前記ヒト血管コロニー形成細胞および前記同種移植片は、異なるドナーから得られる、請求項87または請求項94に記載の方法。
- 少なくとも1つ以上の造血細胞型を産生するように分化することができる、ヒト非生着血管細胞であって、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有さない、血管細胞。
- 前記血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞を特徴付けるタンパク質のうち、すべてではないがその一部を発現する、請求項103に記載の非生着血管細胞。
- 前記血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞の1つ以上の特徴を有する、請求項103に記載の非生着血管細胞。
- 前記血管細胞は、他の血管細胞に緩く接着する、請求項103に記載の非生着血管細胞。
- 前記ヒト血管細胞は、CD34、CD31、KDRおよびCD133から選択される1つ以上のタンパク質を発現しない、請求項104に記載の非生着血管細胞。
- 前記ヒト血管細胞は、LMO2およびGATA2タンパク質を発現する、請求項104に記載の非生着血管細胞。
- 前記宿主が、哺乳動物である、請求項103から108のいずれか一項に記載の非生着血管細胞。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項109に記載の非生着血管細胞。
- 少なくとも1つ以上の造血細胞型を産生するように分化することができるヒト非生着血管細胞の実質的に精製された集団を含む細胞培養物であって、前記血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有さない、細胞培養物。
- 胚由来細胞から分化したヒト非生着血管細胞を含む細胞培養物であって、前記非生着血管細胞は、少なくとも1つ以上の造血細胞型を産生するように分化することができ、前記血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有さない、細胞培養物。
- 前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞を特徴付けるタンパク質のうち、すべてではないがその一部を発現する、請求項111または112に記載の細胞培養物。
- 前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞の特徴のうち1つ以上を有する、請求項111または112に記載の細胞培養物。
- 前記血管細胞は、他の血管細胞に緩く接着する、請求項111または112に記載の非生着血管細胞。
- 前記ヒト血管細胞は、CD34、CD31、KDRおよびCD133から選択される1つ以上のタンパク質を発現しない、請求項113に記載の細胞培養物。
- 前記ヒト血管細胞は、LMO2およびGATA2タンパク質を発現する、請求項113に記載の細胞培養物。
- 請求項103~110のいずれか一項に記載の非生着血管細胞から分化した造血細胞を含む細胞培養物。
- 少なくとも1×106個のヒト非生着血管細胞、少なくとも2×106個のヒト非生着血管細胞、少なくとも3×106個のヒト非生着血管細胞、または少なくとも4×106個のヒト非生着血管細胞を含む、ヒト非生着血管細胞の溶液。
- 前記ヒト非生着血管細胞は、少なくとも1つ以上の造血細胞型を産生するように分化することができ、前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有さない、請求項119のいずれかに記載の溶液。
- 前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞を特徴付けるタンパク質のうち、すべてではないがその一部を発現する、請求項120に記載の溶液。
- 前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞の1つ以上の特徴を有する、請求項120に記載の溶液。
- 前記血管細胞は、他の血管細胞に緩く接着する、請求項120に記載の溶液。
- 前記ヒト血管細胞は、CD34、CD31、KDRおよびCD133から選択される1つ以上のタンパク質を発現しない、請求項121に記載の溶液。
- 前記ヒト血管細胞は、LMO2およびGATA2タンパク質を発現する、請求項121に記載の溶液。
- 前記溶液は、対象に注射可能であるか、または冷凍に好適である、請求項119~125のいずれかに記載の溶液。
- 非生着血管細胞または造血細胞の投与により処置され得る疾患の処置用の医薬の製造のための、請求項119~125のいずれか一項に記載の溶液の使用。
- 少なくとも1つ以上の造血細胞型を産生するように分化することができるヒト非生着血管細胞の実質的に精製された集団を含む医薬調製物であって、前記血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有さない、医薬調製物。
- 前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞を特徴付けるタンパク質のうち、すべてではないがその一部を発現する、請求項128に記載の医薬調製物。
- 前記非生着血管細胞は、宿主において骨髄に生着し複製する能力を有するヒト血管コロニー形成細胞の特徴のうち1つ以上を有する、請求項128に記載の医薬調製物。
- 前記血管細胞は、他の血管細胞に緩く接着する、請求項128に記載の医薬調製物。
- 前記ヒト血管細胞は、CD34、CD31、KDRおよびCD133から選択される1つ以上のタンパク質を発現しない、請求項129に記載の医薬調製物。
- 前記ヒト血管細胞は、LMO2およびGATA2タンパク質を発現する、請求項129に記載の医薬調製物。
- 前記調製物は、少なくとも1×106個のヒト非生着血管細胞を含む、請求項128~133に記載の医薬調製物。
- 前記調製物は、少なくとも5×106個のヒト非生着血管細胞を含む、請求項134に記載の医薬調製物。
- 請求項1~110のいずれかに記載のヒト非生着血管細胞の凍結保存調製物。
- 前記調製物は、少なくとも1×106個のヒト非生着血管細胞、少なくとも2×106個のヒト非生着血管細胞、少なくとも3×106個のヒト非生着血管細胞、少なくとも4×106個のヒト非生着血管細胞、または少なくとも5×106個のヒト非生着血管細胞を含む、請求項136に記載の凍結保存調製物。
- ヒト非生着血管細胞を生体外で生成および増幅するための方法であって、
(a)胚由来細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記胚由来細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、
(b)少なくとも1つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップと、
を含み、前記成長因子は、前記胚様体培養物中でヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量であり、
前記胚様体は、10~13日間培養され、
前記胚由来細胞、胚様体および非生着血管細胞は、前記方法のステップ(a)および(b)にわたり無血清培地中で成長させられる、方法。 - ヒト非生着血管細胞を生体外で生成および増幅するための方法であって、
(a)ヒト胚由来細胞を含む細胞培養物を、無血清培地中で、前記胚由来細胞の胚様体への分化を誘導するのに十分な量の少なくとも1つの成長因子の存在下で培養するステップと、
(b)少なくとも1つの成長因子を、胚様体を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記胚様体培養物中でヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
(c)前記胚様体は、単細胞に分割され、
(d)少なくとも1つの成長因子を、前記単細胞を含む前記培養物に添加し、無血清培地中での前記培養物の培養を継続するステップであって、前記成長因子は、前記単細胞を含む前記培養物中でヒト非生着血管細胞を増幅するのに十分な量である、ステップと、
を含み、前記単細胞の培養物は、10~13日間培養され、
前記胚由来細胞、胚様体および非生着血管細胞は、前記方法のステップ(a)~(d)にわたり無血清培地中で成長させられる、方法。 - 前記胚由来細胞は、胚幹細胞である、請求項138または139に記載の方法。
- 前記成長因子は、ホメオボックスタンパク質またはその機能性変異体もしくは活性変異体を含むタンパク質である、請求項138または139に記載の方法。
- 前記ホメオボックスタンパク質は、HOXB4タンパク質、またはその機能性変異体もしくは活性変異体を含む、請求項141に記載の方法。
- 前記成長因子は、血管内皮成長因子(VEGF)、骨形態形成タンパク質(BMP)、幹細胞因子(SCF)、FLt-3L(FL)、トロンボポエチン(TPO)、およびエリスロポエチン(EPO)からなる群から選択される、請求項138~142のいずれか一項に記載の方法。
- 前記血管内皮成長因子(VEGF)もしくは骨形態形成タンパク質(BMP)、またはその両方は、ステップ(a)において細胞培養の0~48時間以内に添加される、請求項143に記載の方法。
- 前記幹細胞因子(SCF)、FLt-3L(FL)、もしくはトロンボポエチン(TPO)、またはこれらの任意の組み合わせは、ステップ(a)の開始から48~72時間以内に前記培養物に添加される、請求項143に記載の方法。
- 前記成長因子は、ステップ(a)の開始48~72時間以内に培養ステップ(b)に添加される、請求項141~142に記載の方法。
- エリスロポエチン(EPO)をステップ(b)に添加するステップをさらに含む、請求項138に記載の方法。
- エリスロポエチン(EPO)をステップ(b)および(d)に添加するステップを含む、請求項139に記載の方法。
- 前記ヒト非生着血管細胞を前記培養物から精製するステップをさらに含む、請求項138~140のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヒト非生着血管細胞を前記培養物から単離するステップをさらに含む、請求項138~140のいずれか一項に記載の方法。
- 前記成長因子は、HOXB4およびタンパク質導入ドメイン(PTD)を含む融合タンパク質である、請求項141~142のいずれか一項に記載の方法。
- 前記PTDおよび前記HOXB4は、リンカーを介して共役される、請求項151に記載の方法。
- 前記タンパク質導入ドメイン(PTD)は、TATタンパク質、その機能性変異体または活性断片である、請求項151に記載の方法。
- 前記HOXB4は、哺乳類HOXB4である、請求項142に記載の方法。
- 前記哺乳類HOXB4は、マウスまたはヒトHOXB4である、請求項154に記載の方法。
- 前記HOXB4は、全長タンパク質を含む、請求項142に記載の方法。
- 前記非生着血管細胞のヒト造血細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、前記非生着血管細胞を培養するステップをさらに含む、請求項138~140のいずれか一項に記載の方法。
- 前記培養物は、少なくとも1×106個のヒト非生着血管細胞、少なくとも2×106個のヒト非生着血管細胞、少なくとも3×106個のヒト非生着血管細胞、または少なくとも4×106個のヒト非生着血管細胞を含む、請求項138~140のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項138、139、147、または148に記載の方法により産生されるヒト非生着血管細胞。
- ヒト造血細胞を生体外で産生するための方法であって、
(a)請求項138~148のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(b)前記ヒト非生着血管細胞のヒト造血幹細胞への分化を誘導するのに好適な条件下で、前記ヒト非生着血管細胞を成長させるステップと、を含む方法。 - 請求項160に記載の方法により産生されるヒト造血幹細胞。
- 投与を必要とする患者にヒト非生着血管細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)請求項138~148のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を供給するステップと、 (c)前記ヒト非生着血管細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 投与を必要とする患者にヒト非生着血管細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)少なくとも10,000個の細胞の量のヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト血管コロニー形成細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 前記ヒト非生着血管細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、請求項163に記載の方法。
- 投与を必要とする患者にヒト造血幹細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)請求項138~148のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト非生着血管細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 投与を必要とする患者にヒト造血幹細胞を投与するための方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)少なくとも10,000個の細胞の量のヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト非生着血管細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 前記ヒト非生着血管細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、請求項166に記載の方法。
- 処置を必要とする患者における造血幹細胞障害を処置する方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)請求項138~148のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト非生着血管細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 処置を必要とする患者における造血幹細胞障害を処置する方法であって、
(a)それを必要とする患者を選択するステップと、
(b)少なくとも10,000個の細胞の量のヒト非生着血管細胞を供給するステップと、
(c)前記ヒト非生着血管細胞を、ヒト造血幹細胞に分化させるステップと、
(d)前記ヒト造血幹細胞の一部またはすべてを、前記患者に投与するステップと、を含む方法。 - 前記ヒト非生着血管細胞は、10,000個から400万個の細胞の量である、請求項169に記載の方法。
- 非生着血管細胞から分化造血細胞を生体外で産生するための方法であって、
(a)ヒト非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)前記非生着血管細胞を分化造血細胞に分化させるステップと、を含む方法。 - 請求項171に記載の方法により産生される分化造血細胞。
- 生体外でヒト非生着血管細胞から分化した造血細胞を使用して輸血を行うための方法であって、
(a)ヒト非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)前記非生着血管細胞を分化造血細胞に分化させるステップと、
(c)前記分化造血細胞で輸血を行うステップと、を含む方法。 - 非生着血管細胞から分化造血細胞を生体外で産生するための方法であって、
(a)請求項138~148のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)前記非生着血管細胞を分化造血細胞に分化させるステップと、を含む方法。 - 請求項174に記載の方法により産生される分化造血細胞。
- 生体外でヒト非生着血管細胞から分化した造血細胞を使用して輸血を行うための方法であって、
(a)請求項138~148のいずれか一項に記載の方法により作製されるヒト非生着血管細胞を提供するステップと、
(b)前記非生着血管細胞を分化造血細胞に分化させるステップと、
(c)前記分化造血細胞で輸血を行うステップと、を含む方法。 - 前記多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、請求項1、2、17、または18に記載の方法。 - 前記多能性肝細胞は、誘導された多能性肝細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、請求項64に記載の方法。 - 前記多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、請求項66に記載の方法。 - 前記多能性幹細胞は、誘導された多能性幹細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、 前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、請求項138、139、147、または148に記載の方法。 - 前記多能性肝細胞は、誘導された多能性肝細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、請求項160に記載の方法。 - 前記多能性肝細胞は、誘導された多能性肝細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、請求項171に記載の方法。 - 前記多能性肝細胞は、誘導された多能性肝細胞(iPSC)であり、
前記iPSCは、トリプシンで継代され、
前記iPSCは、マウス胎児線維芽細胞(MEF)で維持されるか、もしくは支持細胞なしで維持され、ならびに/または、
無血清胚様体培地および/もしくは分化培地にY-27632が添加される、請求項174に記載の方法。
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