CN115003800A

CN115003800A - 治疗血管疾病的方法

Info

Publication number: CN115003800A
Application number: CN202080075675.6A
Authority: CN
Inventors: 樱井渚; M·弥罗特索; N·普拉萨恩; A·辛格; R·兰沙
Original assignee: Ocata Therapeutics Inc
Current assignee: Astellas Institute for Regenerative Medicine
Priority date: 2019-08-28
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2022-09-02
Also published as: JP2022547832A; KR20220054359A; IL290892A; TW202122577A; EP4022042A1; CA3151637A1; WO2021041592A9; WO2021041592A1; US20220280572A1; WO2021041592A8; AU2020337929A1

Abstract

本发明提供用由多能干细胞体外获得的血源性内皮细胞(HE)治疗血管疾病的方法。本发明还提供产生HE的组合物和方法。

Description

治疗血管疾病的方法

相关申请

本申请根据35U.S.C.§119(e)的规定要求2019年8月28日提交的美国临时申请第62/892,712号的优先权，将其全部内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明涉及用通过多能干细胞的体外分化获得的血源性内皮细胞治疗血管疾病的方法。

背景技术

心血管疾病是一类涉及心脏或血管的疾病，是全世界死亡的主要原因。仅在美国，就有约8400万人患有心血管疾病，几乎每三个人中就有一人死于心血管疾病。

肺高压(PH)是一种以主肺动脉压增加为特征的疾病。PH的一种致命形式是肺动脉高压(PAH)，通常在诊断后平均2.8年内导致死亡。PAH的特点是血管收缩和肺血管重塑。现有的标准疗法可能会改善患者的生活质量和预后，但通常不能直接阻止致病性重塑过程，有时可能会有严重的副作用。

外周动脉疾病(PAD)是除脑循环和冠状动脉循环以外的动脉的异常狭窄和阻塞。严重肢体缺血(CLI)是PAD的一种严重形式，导致下肢动脉的严重堵塞。CLI与主要肢体丧失、心肌梗塞、中风和死亡有关。迄今为止，对CLI没有有效的治疗方法。

冠状动脉疾病是最常见的心血管疾病形式，是由于心脏动脉粥样硬化导致心肌的血流和氧气减少而引起的。冠状动脉疾病患者经常接受球囊血管成形术或支架来清除闭塞的动脉。有些人以高费用和高风险接受了冠状动脉搭桥手术。

因此，需要有更好的方法来治疗和预防血管疾病。

发明内容

本发明提供一种治疗血管疾病的方法，包括给予对象包含通过多能干细胞的体外分化获得的血源性内皮细胞(HE)的组合物。

在一个实施方式中，血管疾病选自冠状动脉疾病(例如动脉硬化、动脉粥样硬化、以及动脉、小动脉和毛细血管的其他疾病或损伤或相关不适)、心肌梗塞(例如急性心肌梗塞)、组织性心肌梗塞、缺血性心脏病、心律失常、左心室扩张、栓塞、心力衰竭、充血性心力衰竭、心内膜下纤维化、左心室或右心室肥大、心肌炎、慢性冠状动脉缺血、扩张型心肌病、再狭窄、心律失常、心绞痛、高血压(例如肺高压、肾小球高压、门静脉高压)、心肌肥大、外周动脉疾病(包括严重肢体缺血)、脑血管疾病、肾动脉狭窄、主动脉瘤、肺心病、心律不齐、炎症性心脏病、先天性心脏病、风湿性心脏病、糖尿病血管疾病和内皮肺损伤疾病(例如急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS))。在一个具体实施方式中，血管疾病是肺高压。在另一个实施方式中，血管疾病是肺动脉高压。

在本文所述的任何方法的一个实施方式中，对象的平均肺(动脉)压有所降低。

本发明还提供一种增加肺动脉中的血流的方法，包括给予对象包含通过多能干细胞的体外分化获得的HE的组合物。在一个实施方式中，对象有肺高压。在一个具体实施方式中，对象有肺动脉高压。

本发明还提供一种降低对象血压的方法，包括给予对象包含通过多能干细胞的体外分化获得的HE的组合物。在一个实施方式中，对象有肺高压。在一个具体实施方式中，对象有肺动脉高压。在另一个实施方式中，血压是舒张压。在又一个实施方式中，血压是收缩压。在一个具体实施方式中，血压是平均肺(动脉)压。此外，通过本发明的任何方法，对象的血压可降低至少20％。

在一个实施方式中，本文所述的多能干细胞是胚胎干细胞。在一个实施方式中，本文所述的多能干细胞是诱导性多能干细胞。

在又一个实施方式中，本文所述的HE通过在没有甲基纤维素的情况下将多能干细胞在附着条件下在分化培养基中培养而获得。在另一个实施方式中，本文所述的HE通过不形成胚胎体的情况下的多能干细胞的体外分化而获得。

在本文提供的任何方法中，对象可以是人。此外，本文所述的多能干细胞可以是人多能干细胞。此外，本文所述的HE可以是人HE。

本文所述的HE可以对选自miRNA-126、mi-RNA-24、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p、miRNA-335、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少一种微RNA(miRNA)呈阳性。在一个实施方式中，HE对(i)miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335和/或(ii)hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p呈阳性。在另一个实施方式中，HE对(i)miRNA-126、miRNA-24、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335和/或(ii)hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p呈阳性。在一个实施方式中，HE对miRNA-214呈阳性。

在任一个实施方式中，本文所述的HE可以对选自miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-223和miRNA-142-3p的至少一种miRNA呈阴性。在一个实施方式中，HE对miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。在另一个实施方式中，HE对miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。

在一个实施方式中，HE对miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335呈阳性，对miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。

在一个实施方式中，本文所述的任何HE表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD144、CD34、CXCR4、CD146、Tie2、CD140b、CD90、CD271和CD105的至少一种细胞表面标志物。在一个实施方式中，本发明的HE表达CD146、CXCR4、CD309/KDR、CD90和CD271。在另一个实施方式中，本发明的HE表达CD146。在一个实施方式中，本发明的HE表达CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD144、CD34和CD105。

在一个实施方式中，HE表现出有限的或检测不到的选自CD34、CXCR7、CD43和CD45的至少一种细胞表面标志物。在另一个实施方式中，HE表现出有限的或检测不到的CXCR7、CD43和CD45。在另一个实施方式中，HE表现出有限的或检测不到的CD43和CD45。

在一个实施方式中，本发明的HE是CD43(-)、CD45(-)和/或CD146(+)。在另一个实施方式中，HE表达CD31、钙调理蛋白(CNN1)和NG2，并因此具有分化为内皮细胞(CD31+)、平滑肌细胞(Calponin+)和/或周细胞(NG2+)的潜力。

在一个实施方式中，将表达CD144(VECAD)的HE从本发明的HE分离。在一个实施方式中，分离出的表达CD144(VECAD)的HE细胞还表达CD31和/或CD309/KDR(FLK-1)。在另一个实施方式中，分离出的表达CD144(VECAD)的HE细胞还表达表22和表23中所列的至少一种基因。在另一个实施方式中，分离出的表达CD144(VECAD)的HE细胞还表达选自PLVAP、GJA4、ESAM、EGFL7、KDR/VEGFR2和ESAM的至少一种细胞标志物。在一个实施方式中，分离出的表达CD144(VECAD)的HE细胞还表达选自SOX9、PDGFRA和EGFRA的至少一种细胞标志物。在另一个实施方式中，分离出的表达CD144(VECAD)的HE细胞还表达选自KDR/VEGFR2、NOTCH4、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的至少一种细胞标志物。在一个实施方式中，包含从本发明的HE中分离出的表达CD144(VECAD)的HE的组合物基本上缺乏CD144(VECAD)阴性HE。

因此，本发明还提供一种包含通过本文所述的多能干细胞的体外分化获得的HE的组合物。本发明还提供一种药物组合物，其包含通过本文所述的多能干细胞的体外分化获得的HE和药学上可接受的运载体。

附图说明

图1是产生HE的示例性方法的概述。

图2是产生成血管细胞(HB)的示例性方法的概述。

图3是从ES细胞分化的过程中，细胞中的PDGFRa、HAND1、FOXF1、APLNR、PECAM/CD31表达的柱状图(第-1天)。测试的时间点为第-1天(ES细胞)、第2天(D2)、第4天(D4)和第6天(D6)。

图4A显示在分化过程的第6天获得的J1-HE细胞(红色，左栏)和GMP1-HE细胞(蓝色，右栏)中的CD31、CD43、CD34、KDR、CXCR4、CD144、CD146和CD105表达的图。

图4B显示在分化过程的第6天获得的J1-HE细胞和GMP1-HE细胞中的CD31、VECAD、CD34、FLK1(KDR)、CD105、CD146、CD43、CXCR4、CD140b(PDGFRb)和NG2的图。红色是被染色的，灰色是未染色的对照。

图5显示根据CD31阳性(红色)和阴性(蓝色)细胞进行门控的J1-HE和GMP1-HE群体，及其各自的FLK1/CD309、CD144/VECAD、CD34、CD105和CD43表达的图。

图6显示用CD31、NG2或CNN1抗体染色的GMP-1衍生的HE的代表性图像(下图)。HUVEC细胞用作对比(上图)。

图7是来自HUVEC细胞、J1 hESC、J1-HE或J1-HB的miRNA的TSNE图。

图8显示了HB(VPC1)和HE(VPC2)对sugen-缺氧诱导的PAH大鼠存活率的影响。

图9A显示通过对HUVEC、iPSC(GMP1)和GMP1-HE进行无监督聚类而得的9个聚类。

图9B显示HUVEC、iPSC(GMP1)和GMP1-HE(“VPC-饲养细胞活性”)在9个聚类中各自的百分比。

图9C显示HUVEC、iPSC(GMP1)和GMP1-HE(“VPC-饲养细胞活性”)的不同聚类。

图10显示通过VECAD/CDH5的表达鉴定出的三个聚类。

图11A显示用载剂(对照培养基)、西地那非(阳性对照)、J1-HE(2.5×10⁶个细胞)和GMP1-HE(2.5×10⁶个细胞)治疗的MCT大鼠，以及未经MCT治疗的对照(Cont(Nx))的右心室收缩压(RVSP)。

图11B显示用载剂(对照培养基)、西地那非(阳性对照)、J1-HE(2.5×10⁶个细胞)和GMP1-HE(2.5×10⁶个细胞)治疗的MCT大鼠，以及未经MCT治疗的对照(Cont(Nx))的Fulton指数(RV/LV+S)。

图11C显示用载剂(对照培养基)、西地那非(阳性对照)、J1-HE(2.5×10⁶个细胞)和GMP1-HE(2.5×10⁶个细胞)治疗的MCT大鼠，以及未经MCT治疗的对照(Cont(Nx))的肺血管阻力指数(PVR)。

图11D显示用载剂(对照培养基)、西地那非(阳性对照)、J1-HE(2.5×10⁶个细胞)和GMP1-HE(2.5×10⁶个细胞)治疗的MCT大鼠，以及未经MCT治疗的对照(Cont(Nx))的增厚小血管的数量。

图12A显示用载剂(阴性对照)、J1-HE(250万个细胞)和GMP1-HE(250万个细胞)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的平均肺动脉压(mPAP)。

图12B显示用载剂(阴性对照)、J1-HE(250万个细胞)和GMP1-HE(250万个细胞)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的右心室收缩压(RVSP)。

图12C显示用载剂(阴性对照)、J1-HE(250万个细胞)和GMP1-HE(250万个细胞)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的Fulton指数(RV/LV+S)。

图12D显示用载剂(阴性对照)、J1-HE(250万个细胞)和GMP1-HE(250万个细胞)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的心输出量。

图13A显示用载剂(阴性对照)、GMP1-HE(100万个细胞)、GMP1-HE(250万个细胞)、GMP1-HE(500万个细胞)和西地那非(阳性对照)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的平均肺动脉压(mPAP)。

图13B显示用载剂(阴性对照)、GMP1-HE(100万个细胞)、GMP1-HE(250万个细胞)、GMP1-HE(500万个细胞)和西地那非(阳性对照)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的右心室收缩压(RVSP)。

图13C显示用载剂(阴性对照)、GMP1-HE(100万个细胞)、GMP1-HE(250万个细胞)、GMP1-HE(500万个细胞)和西地那非(阳性对照)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的Fulton指数(RV/LV+S)。

图13D显示用载剂(阴性对照)、GMP1-HE(100万个细胞)、GMP1-HE(250万个细胞)、GMP1-HE(500万个细胞)和西地那非(阳性对照)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的心输出量。

图14A显示用载剂(阴性对照)、GMP1-HE(100万个细胞)、GMP1-HE(250万个细胞)和GMP1-HE(500万个细胞)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的肺组织的组织学图像。

图14B显示用载剂(阴性对照)、GMP1-HE(100万个细胞)、GMP1-HE(250万个细胞)、GMP1-HE(500万个细胞)和西地那非(阳性对照)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的肺血管壁厚。

图14C显示用载剂(阴性对照)、GMP1-HE(100万个细胞)、GMP1-HE(250万个细胞)、GMP1-HE(500万个细胞)和西地那非(阳性对照)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的肌肉型、半肌肉型和非肌肉型肺血管的百分比。

图15A显示用载剂(阴性对照)、J1-HE(250万个细胞)和GMP1-HE(250万个细胞)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的肺组织的组织学图像。

图15B显示用载剂(阴性对照)、J1-HE(250万个细胞)和GMP1-HE(250万个细胞)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的肺血管壁厚。

图15C显示用载剂(阴性对照)、J1-HE(250万个细胞)和GMP1-HE(250万个细胞)治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的肌肉型、半肌肉型和非肌肉型肺血管的百分比。

图16A显示未经Sugen处理的大鼠(Nx对照)的正常肺的显微CT扫描图像。

图16B显示用载剂(阴性对照)治疗的SuHx大鼠的肺的显微CT扫描图像。

图16C显示用100万个GMP-1HE细胞治疗的SuHx大鼠的肺的显微CT扫描图像。

图16D显示用500万个GMP-1HE细胞治疗的SuHx大鼠的肺的显微CT扫描图像。

图16E显示用西地那非治疗的SuHx大鼠的肺的显微CT扫描图像。

图17显示未分选的HE细胞(“未分选”)以及根据VECAD表达进行分选后的VECAD阴性(-部分)和VECAD阳性(+部分)细胞中的CD31和VECAD的表达。

图18A显示用载剂(阴性对照)、未分选的GMP1-HE和分选的VECAD+GMP1-HE治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的平均肺动脉压(mPAP)。

图18B显示用载剂(阴性对照)、未分选的GMP1-HE和分选的VECAD+GMP1-HE治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的右心室收缩压(RVSP)。

图18C显示用载剂(阴性对照)、未分选的GMP1-HE和分选的VECAD+GMP1-HE治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的Fulton指数(RV/LV+S)。

图18D显示用载剂(阴性对照)、未分选的GMP1-HE和分选的VECAD+GMP1-HE治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的心输出量。

图18E显示用载剂(阴性对照)、未分选的GMP1-HE和分选的VECAD+GMP1-HE治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的肺组织的组织学图像。

图18F显示用载剂(阴性对照)、未分选的GMP1-HE和分选的VECAD+GMP1-HE治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的肺血管壁厚。

图18G显示用载剂(阴性对照)、未分选的GMP1-HE和分选的VECAD+GMP1-HE治疗的Sugen处理大鼠，以及未经Sugen处理的对照(Nx)的肌肉型、半肌肉型和非肌肉型肺血管的百分比。

图19显示J1-HE、GMP1-HE和HUVEC细胞中CD31+/VECAD+群体的FLK1/KDR表达。

具体实施方式

为了可以更好地理解本发明，首先定义某些术语。还应注意，每当提到一个参数的数值或数值范围时，其都将介于所提到的数值之间的数值和范围也作为本发明的一部分。

在以下描述中，出于解释的目的，为了提供对本发明的透彻理解，陈述了许多具体的数字、材料和配置。但是，对本领域技术人员显而易见的是，本发明可以在没有这些具体细节的情况下实施。在一些情况下，众所周知的特征可以被省略或简化，以避免模糊本发明。此外，说明书中提及的短语如“一个实施方式”或“一种实施方式”是指关于该实施方式中描述的具体特征、结构或性质包括在本发明的至少一个实施方式中。在说明书中不同地方出现的短语如“在一个实施方式中”不一定需要涉及所有相同的实施方式。

如本文所用，冠词“一个”和“一种”是指一种或一种以上的(即至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”是指一个元素或多于一个元素。

术语“包括”或“包含”在本文中用于指代在本公开中必不可少的组合物、方法及其各自的成分，但也可以包括未指明的元素，无论是否是必需的。

如本文所用，“多能干细胞”泛指能够在体外延长增殖或几乎无限增殖，同时维持其未分化状态，表现出正常的核型(如染色体)，并且有能力在适当条件下分化为所有三个生殖层(即外胚层、中胚层和内胚层)的细胞。多能干细胞通常在功能上定义为如下所述的干细胞：(a)在移植到免疫缺陷(SCID)小鼠中时能够诱发畸胎瘤；(b)能够分化为所有三个生殖层的细胞类型(如能够分化为外胚层、中胚层和内胚层细胞类型)；以及(c)表达胚胎干细胞的一种或多种标志物(如Oct4、碱性磷酸酶、SSEA-3表面抗原、SSEA-4表面抗原、nanog、TRA-1-60、TRA-1-81、SOX2、REX1等)。在某些实施方式中，多能干细胞表达选自OCT-4、碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的一种或多种标志物。示例性的多能干细胞可以用例如本领域已知的方法生成。

多能干细胞包括但不限于：胚胎干细胞、诱导性多能干细胞(iPS)、胚胎衍生的细胞(EDC)、成人干细胞、造血细胞、胎儿干细胞、间充质干细胞、产后干细胞或胚胎生殖细胞。在一个实施方式中，多能干细胞是哺乳动物多能干细胞。在另一个实施方式中，多能干细胞是人多能干细胞，包括但不限于：人胚胎干(hES)细胞、人诱导性多能干(iPS)细胞、人成人干细胞、人造血细胞、人胎儿干细胞、人产后干细胞、人多潜能干细胞或人胚胎生殖细胞。在一个实施方式中，多能干细胞是人胚胎干细胞。在另一个实施方式中，多能干细胞是人诱导性多能干细胞。在另一个实施方式中，多能干细胞可以是被列入人多能干细胞登记册hPSCreg的多能干细胞。多能干细胞可以通过遗传修饰或其他方式的修饰来增加寿命、效力、归巢，防止或减少同种免疫反应，或向由这种多能细胞分化出的细胞递送所需的因子。

多能干细胞可以来自任何物种。胚胎干细胞已经成功地从例如小鼠、多种非人类灵长类动物和人中衍生出来，并且已经从许多其他物种生成了胚胎干细胞样细胞。因此，本领域的技术人员可以从任何物种生成胚胎干细胞和胚胎衍生干细胞，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物(小鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛、羊等)、犬科动物(家狗和野狗)、猫科动物(家猫和野猫，如狮子、老虎、猎豹)、兔、仓鼠、沙鼠、松鼠、豚鼠、山羊、大象、熊猫(包括大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸等)等。

如本文所用，“胚胎”或“胚”泛指尚未植入母体宿主子宫膜的发育中的细胞团。“胚胎细胞”是从胚胎中分离出来的或包含在胚胎中的细胞。这也包括早在两细胞阶段就获得的卵裂球，以及聚集的卵裂球。

如本文所用，“胚胎干细胞”(ES细胞)泛指来自胚泡或桑椹胚的内细胞团、已作为细胞系连续地传代的细胞。ES细胞可以从卵细胞与精子或DNA的受精、核移植、孤雌生殖、或通过产生HLA区域具有纯合性的ES细胞的方法获得。ES细胞也可以指从通过精子和卵细胞融合、核移植、孤雌生殖、或将染色质重编程并随后将重编程的染色质纳入质膜以产生细胞而产生的合子、卵裂球或胚泡阶段的哺乳动物胚胎衍生的细胞，可选择性地不破坏胚胎的其余部分。胚胎干细胞，无论其来源或用于产生它们的特定方法，可以根据以下一个或多个特征来鉴定：(i)分化为所有三个生殖层的细胞的能力，(ii)至少表达Oct-4和碱性磷酸酶，以及(iii)移植到免疫力低下的动物中时产生畸胎瘤的能力。

如本文所用，“胚胎衍生的细胞”(EDC)泛指桑椹胚衍生的细胞、囊胚衍生的细胞(包括内细胞团、胚盾或上胚层的细胞)、或早期胚胎(包括原始内胚层、外胚层和中胚层及其衍生物)的其他多能干细胞。“EDC”还包括卵裂球和来自聚集的单个卵裂球或不同发育阶段的胚胎的细胞团，但不包括已作为细胞系传代的人胚胎干细胞。

如本文所用，“诱导性多能干细胞”或“iPS细胞”泛指通过重编程体细胞而获得的多能干细胞。iPS细胞可以通过在体细胞中表达或诱导表达一组因子(“重编程因子”)而产生，例如Oct 4(有时称为Oct 3/4)、Sox2、Myc(例如c-Myc或任何Myc变体)、Nanog、Lin28和KLF4。在一个实施方式中，重编程因子包括Oct 4、Sox2、c-Myc和Klf4。在另一个实施方式中，重编程因子包括Oct 4、Sox2、Nanog和Lin28。在某些实施方式中，在体细胞中表达至少两种重编程因子，以成功地将体细胞重编程。在另一些实施方式中，在体细胞中表达至少三种重编程因子，以成功地将体细胞重编程。在另一些实施方式中，在体细胞中表达至少四种重编程因子，以成功地将体细胞重编程。在另一个实施方式中，在体细胞中表达至少五种重编程因子，以成功地将体细胞重编程。在又一个实施方式中，在体细胞中表达至少六种重编程因子，例如Oct 4、Sox2、c-Myc、Nanog、Lin28和Klf4。在另一些实施方式中，鉴定其他重编程因子，并将其单独或与一种或多种已知的重编程因子组合使用，以将体细胞重编程为多能干细胞。

iPS细胞可以使用胎儿、产后、新生儿、少年或成年体细胞来生成。体细胞可包括但不限于：成纤维细胞、角质细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、器官和组织细胞，以及各种血细胞，包括但不限于造血细胞(如造血干细胞)。在一个实施方式中，体细胞是成纤维细胞，例如真皮成纤维细胞、滑膜成纤维细胞或肺成纤维细胞，或非成纤维的体细胞。

iPS细胞可以从细胞库获得。或者，IPS细胞可以通过本领域已知的方法新生成。iPS细胞可以使用来自特定患者或匹配供体的材料专门生成，目的是生成组织匹配的细胞。在一个实施方式中，iPS细胞可以是通用的供体细胞，基本上没有免疫原性。

诱导性多能干细胞可以通过在体细胞中表达或诱导表达一种或多种重编程因子而产生。可以通过用病毒载体、如逆转录病毒载体或慢病毒载体进行感染，在体细胞中表达重编程因子。也可以使用CRISPR/Talen/锌指核酸酶(XFN)。也可以使用非整合型载体、如附加型质粒或RNA，在体细胞中表达重编程因子。当使用非整合型载体表达重编程因子时，可使用电穿孔、转染或用载体转化体细胞的方式在细胞中表达这些因子。例如，在小鼠细胞中，使用整合性病毒载体表达四种因子(Oct3/4、Sox2、c-myc和KLF4)就足以重新编程体细胞。在人细胞中，使用整合性病毒载体表达四种因子(Oct3/4、Sox2、NANOG和Lin28)就足以重新编程体细胞。

可以通过使体细胞与至少一种诱导重编程因子表达的药剂、如小有机分子药剂接触，来诱导重编程因子的表达。

体细胞也可以使用组合方法进行重编程，其中表达重编程因子(例如使用病毒载体、质粒等)，并诱导重编程因子的表达(例如使用小有机分子)。

一旦在细胞中表达或诱导了重编程因子，就可以对细胞进行培养。随着时间的推移，培养皿中出现了具有ES特征的细胞。该细胞可以根据例如ES细胞的形态，或根据可选择或可检测的标志物的表达来选择和传代培养。可以培养细胞以产生类似于ES细胞的细胞培养物。

为了确认iPS细胞的多能性，可以用一种或多种多能性试验对细胞进行测试。例如，可以测试细胞的ES细胞标志物的表达；可以评价细胞移植到SCID小鼠中时产生畸胎瘤的能力；可以评价细胞分化产生所有三个生殖层的细胞类型的能力。

iPS细胞可以来自任何物种。这些iPS细胞已经用小鼠和人细胞成功地生成。此外，iPS细胞已经用胚胎、胎儿、新生儿和成人组织成功地生成。因此，人们可以使用来自任何物种的供体细胞容易地生成iPS细胞。因此，人们可以从任何物种生成iPS细胞，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿类动物(小鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛、羊等)、狗(家狗和野狗)、猫(家猫和野猫，如狮子、老虎、猎豹)、兔、仓鼠、山羊、大象、熊猫(包括大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸等)等。

当细胞被定性为对某一给定标志物呈“阳性”或“+”时，它可能是该标志物的低(lo)、中(int)和/或高(hi)表达者，这取决于该标志物在细胞表面或细胞群体中的存在程度，其中该术语与荧光强度或细胞颜色分选过程中使用的其他颜色有关。lo、int和hi的区别将在所分选的特定细胞群体上使用的标志物的背景下理解。当细胞被定性为对某一给定标志物呈“阴性”或“-”时，它意味着一个细胞或细胞群体可能不表达该标志物，或者该标志物可能被该细胞或细胞群体以相对非常低的水平表达，并且当被可检测地标记时，它产生的信号非常低。

在本发明的一个实施方式中，如果相对于对照组，标志物的表达水平大于60％、70％、80％或90％，则该细胞或细胞群体被定性为表达高(hi)水平的该标志物。在另一个实施方式中，如果相对于对照组，标志物的表达水平在约20％、30％、40％、50％到约60％之间，则该细胞或细胞群体被定性为表达中(int)水平的该标志物。在又一个实施方式中，如果相对于对照组，标志物的表达水平在约2％、5％、10％或15％到约20％之间，则该细胞或细胞群体被定性为表达低(lo)水平的该标志物。在又一个实施方式中，如果相对于对照组，标志物的表达水平小于约2％、1.5％、1％或0.5％，则该细胞或细胞群体被定性为对该标志物呈阴性。在另一个实施方式中，如果相对于对照组，标志物的表达水平为lo或小于约2％、1.5％、1％或0.5％，则该细胞或细胞群体被定性为对该标志物呈阴性。“对照”可以是本领域技术人员所熟知的用于比较目的的任何对照或标准，可以包括阴性对照或阳性对照。

如本文所用，“治疗”或“处理”是指治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进、影响、预防或推迟疾病或病症的发作或者疾病或病症的症状。在血管修复的背景下，术语“治疗”或“处理”包括修复、替换、增强、改善、抢救、重新填充或再生血管组织。

如本文所用，“成血管细胞”或“HB”是指通过多能干细胞的体外分化获得的细胞，其至少能够分化为造血细胞和内皮细胞。在一个实施方式中，可以根据例如美国专利第9,938,500号；美国专利第9,410,123号；和WO2013/082543中描述的方法从多能干细胞体外生成成血管细胞，所有这些文献的全部内容都通过引用纳入本文。此外，成血管细胞可以根据下述实施例2中描述的方法从多能干细胞体外生成。在一个具体实施方式中，通过如下方式从多能干细胞体外生成成血管细胞：首先在低粘附或非粘附条件下从多能干细胞获得胚胎体，并在包含甲基纤维素的培养系统中培养胚胎体，为细胞形成母细胞创造三维环境。在一个实施方式中，成血管细胞可以在常氧条件下(如5％CO₂和20％O₂)由多能干细胞生成。成血管细胞也可以根据其他结构和功能特性进行表征，包括但不限于某些DNA、RNA、microRNA或蛋白质的表达或缺乏表达。

在一个实施方式中，成血管细胞对选自CD31/PECAM1、CD144/VE-cadh、CD34、CD43和CD45的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或至少五种细胞表面标志物呈阳性。在一个实施方式中，HB对CD31、CD43和CD45呈阳性。在另一个实施方式中，HB对CD43和CD45呈阳性。在又一个实施方式中，HB对选自CD309/KDR、CXCR4、CXCR7、CD146、Tie2、CD140b、CD90和CD271的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8种细胞表面标志物的表达水平低或呈阴性。在另一个实施方式中，HB对CD146的表达水平低或呈阴性。在另一个实施方式中，HB对Tie2、CD140b、CD90和CD271的表达水平低或呈阴性。在又一个实施方式中，HB对CD146、Tie2、CD140b、CD90和CD271的表达水平低或呈阴性。在又一个实施方式中，HB对CD43和CD45呈阳性，对CD146、Tie2、CD140b、CD90和CD271的表达水平低或呈阴性。

在另一个实施方式中，成血管细胞对选自miRNA-126、miRNA-24、miRNA-223和miRNA-142-3p的至少1种、至少2种、至少3种或至少4种miRNA呈阳性。在一个实施方式中，成血管细胞对miRNA-126、miRNA-24、miRNA-223和miRNA-142-3p呈阳性。在又一个实施方式中，成血管细胞对选自miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p和mi-RNA-335的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种或至少8miRNA呈阴性。在一个实施方式中，成血管细胞对miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p和mi-RNA-335呈阴性。在又一个实施方式中，成血管细胞对miRNA-126、miRNA-24、miRNA-223和miRNA-142-3p呈阳性，对miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p、and mi-RNA-335呈阴性。

如本文所用，“血源性内皮细胞”或“HE”是指通过多能干细胞的体外分化获得的细胞，并且有能力分化为内皮细胞、平滑肌、周细胞、造血细胞和间充质细胞系。HE可用于治疗本文定义的血管疾病。在一个实施方式中，可以根据WO 2014/100779和美国专利第9,993,503号中描述的方法从多能干细胞体外生成HE，所有这些文献的全部内容都通过引用纳入本文。在另一个实施方式中，可以根据下述实施例1中描述和图1所示的方法从多能干细胞体外生成HE。

在一个具体实施方式中，可以在不形成胚胎体、或者不使用包含甲基纤维素的培养系统的情况下，从多能干细胞中体外生成HE。在一个实施方式中，多能干细胞是iPS或ES细胞。多能干细胞可以在饲养细胞层上培养，优选人饲养细胞层，或在无饲养细胞的条件下例如在细胞外基质如

上培养。多能干细胞可以在常氧条件(如5％CO₂和20％O₂)下培养。为了分化为HE，多能干细胞可以在缺氧条件(如5％CO₂和5％O₂)下和粘附条件下在分化培养基中培养。粘附条件可以包括在细胞外基质如

纤连蛋白、明胶和IV型胶原蛋白上培养细胞。分化培养基可以包括基本培养基，例如

II造血干细胞扩展培养基(西格玛(Sigma)公司)、伊斯科夫改良达尔伯克培养基(IMDM)、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)、或任何其他已知的基本培养基。分化培养基可以进一步包含诱导多能干细胞分化为HE的因子，例如骨形态发生蛋白4(BMP4)、血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。多能干细胞可以在分化培养基中培养约1-12天，或约2-10天，或约3-8天，或约4、5、6、7或8天，或直到多能干细胞分化为HE。在一个具体实施方式中，多能干细胞在分化培养基中培养约6天或更长。

在一个实施方式中，HE可以根据某些结构和功能特性进行表征，包括但不限于某些DNA、RNA、microRNA或蛋白质的表达或缺乏表达。在一个实施方式中，本文所述的任何HE表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD144、CD34、CXCR4、CD146、Tie2、CD140b、CD90、CD271和CD105的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或至少11种细胞表面标志物。在一个实施方式中，本发明的HE表达CD146、CXCR4、CD309/KDR、CD90和CD271。在另一个实施方式中，本发明的HE表达CD146。在另一个实施方式中，HE表达CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD144、CD34和CD105。

在一个实施方式中，HE表现出有限的或检测不到的选自CD34、CXCR7、CD43和CD45的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种细胞表面标志物。在另一个实施方式中，HE表现出有限的或检测不到的CXCR7、CD43和CD45。在另一个实施方式中，HE表现出有限的或检测不到的CD43和CD45。

在一个实施方式中，本发明的HE是CD43(-)、CD45(-)和/或CD146(+)。在另一个实施方式中，HE表达CD31、钙调理蛋白(CNN1)和NG2，并因此具有进一步分化为内皮细胞(CD31+)、平滑肌细胞(Calponin+)和/或周细胞(NG2+)的潜力。

在一个实施方式中，将表达CD144(VECAD)的HE从本发明的HE分离。在一个实施方式中，分离出的表达CD144(VECAD)的HE细胞还表达CD31和/或CD309/KDR(FLK-1)。在另一个实施方式中，分离出的表达CD144(VECAD)的HE细胞还表达选自表22或表23中所列细胞标志物的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种或至少12种细胞标志物。在本发明的一个实施方式中，分离出的表达CD144(VECAD)的HE细胞表达选自PLVAP、GJA4、ESAM、EGFL7、KDR/VEGFR2和ESAM的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种或至少5种细胞标志物。在一个实施方式中，分离出的表达CD144(VECAD)的HE细胞还表达选自SOX9、PDGFRA和EGFRA的至少一种、至少两种或至少三种细胞标志物。在另一个实施方式中，分离出的表达CD144(VECAD)的HE细胞还表达选自KDR/VEGFR2、NOTCH4、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种细胞标志物。在一个实施方式中，包含从本发明的HE中分离出的表达CD144(VECAD)的HE的组合物基本上缺乏CD144(VECAD)阴性HE。在一个实施方式中，包含表达CD144(VECAD)的HE的组合物包含至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％或20％的表达CD144(VECAD)的HE。在一个实施方式中，包含表达CD144(VECAD)的HE的组合物包含少于1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的CD144(VECAD)阴性HE。

在另一个实施方式中，本发明的HE对选自miRNA-126、mi-RNA-24、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p、miRNA-335(miRNA-335-5p和/或miRNA-335-3p)、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种microRNA(miRNA)呈阳性。在一个实施方式中，HE对miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335(miRNA-335-5p和/或miRNA-335-3p)呈阳性。在另一个实施方式中，HE对miRNA-126、mi-RNA-24、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335(miRNA-335-5p和/或miRNA-335-3p)呈阳性。在一个实施方式中，HE对miRNA-214呈阳性。在另一个实施方式中，HE对hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p呈阳性。据鉴定，hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p与美国临时申请第62/892,724号及其PCT申请中描述的J1和meso 3D VPC2细胞相比，在HE群体中独特表达，这两份文献都通过引用纳入本文。

在任一实施方式中，本文所述的HE可以对选自miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-223和miRNA-142-3p的至少1种、至少2种、至少3、至少4种、至少5种或至少6种miRNA呈阴性。在一个实施方式中，HE对miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。在另一个实施方式中，HE对miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。

在一个实施方式中，HE对miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335(miRNA-335-5p和/或miRNA-335-3p)呈阳性，对miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。

在一个实施方式中，HE是遗传修饰的。HE可以是遗传修饰的，以使其表达据信或旨在促进细胞所提供的治疗反应的基因产物。例如，HE可以通过遗传修饰来表达和/或来自细胞的异源蛋白质，例如血管内皮生长因子(VEGF)及其同种型、成纤维细胞生长因子(FGF，酸性和碱性)、血管生成素-1及其他血管生成素、红细胞生成素、血红素加氧酶、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)或TGF-β超级家族的其他成员(包括BMP 1、2、4、7及其受体MBPR2或MBPR1)、肝脏生长因子(散射因子)、缺氧诱导因子(HIF)、内皮型一氧化氮合酶、前列腺素I合酶、Krupple样因子(KLF-2、4及其他)、以及任何其他有助于促进针对血管疾病的治疗反应的异源蛋白质。

如本文所用，“血管疾病”是指心、肺和/或血管(动脉、静脉和毛细血管)的任何异常状况或损伤。血管疾病包括但不限于：心包(即心包)、心脏瓣膜(如瓣膜不全、瓣膜狭窄、风湿性心脏病、二尖瓣脱垂、主动脉瓣反流)、心肌(冠状动脉疾病、心肌梗塞、心力衰竭、缺血性心脏病、心绞痛)、血管(如动脉硬化、动脉瘤)或静脉(如静脉曲张、痔疮)的疾病、病症和/或损伤。如本文所用，血管疾病也包括但不限于：冠状动脉疾病(例如动脉硬化、动脉粥样硬化、以及动脉、小动脉和毛细血管的其他疾病或损伤或相关不适)、心肌梗塞(例如急性心肌梗塞)、组织性心肌梗塞、缺血性心脏病、心律失常、左心室扩张、栓塞、心力衰竭、充血性心力衰竭、心内膜下纤维化、左心室或右心室肥大、心肌炎、慢性冠状动脉缺血、扩张型心肌病、再狭窄、心律失常、心绞痛、高血压(例如肺高压、肾小球高压、门静脉高压)、心肌肥大、外周动脉疾病(包括严重肢体缺血)、脑血管疾病、肾动脉狭窄、主动脉瘤、肺心病、心律不齐、炎症性心脏病、先天性心脏病、风湿性心脏病、糖尿病血管疾病和内皮肺损伤疾病(例如急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS))。血管疾病可以由先天缺陷、遗传缺陷、环境影响(如饮食影响、生活方式、压力等)以及其他缺陷或影响造成。

在一个实施方式中，血管疾病是肺高压(PH)。肺高压包括肺动脉高压(PAH)、左心病的肺动脉高压、伴有肺病和/或慢性缺氧的肺高压、慢性动脉阻塞，以及机制不明或多因素的肺高压，例如结节病、组织细胞增多症X、淋巴管瘤病和肺血管压迫。见Galie等人，欧洲心脏杂志(European Heart Journal)2016；37(1):67-119。在一个具体实施方式中，血管疾病是PAH。

示例性治疗用途

本发明的HE可用于治疗血管疾病。因此，本发明提供一种通过给予对象包含本发明HE的组合物来治疗对象中的血管疾病的方法。在一个实施方式中，血管疾病包括但不限于：心包(即心包)、心脏瓣膜(即瓣膜不全、瓣膜狭窄、风湿性心脏病、二尖瓣脱垂、主动脉瓣反流)、心肌(冠状动脉疾病、心肌梗塞、心力衰竭、缺血性心脏病、心绞痛)、血管(即动脉硬化、动脉瘤)或静脉(即静脉曲张、痔疮)的疾病、病症和/或损伤。在另一些实施方式中，血管疾病也包括但不限于：冠状动脉疾病(例如动脉硬化、动脉粥样硬化、以及动脉、小动脉和毛细血管的其他疾病或相关不适)、心肌梗塞(例如急性心肌梗塞)、组织性心肌梗塞、缺血性心脏病、心律失常、左心室扩张、栓塞、心力衰竭、充血性心力衰竭、心内膜下纤维化、左心室或右心室肥大、心肌炎、慢性冠状动脉缺血、扩张型心肌病、再狭窄、心律失常、心绞痛、高血压、心肌肥大、外周动脉疾病(包括严重肢体缺血)、脑血管疾病、肾动脉狭窄、主动脉瘤、肺心病、心律不齐、炎症性心脏病、先天性心脏病、风湿性心脏病、糖尿病血管疾病和内皮肺损伤疾病(例如急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS))。

在一个实施方式中，血管疾病是肺高压(PH)。在一个具体实施方式中，血管疾病是PAH。

本发明的HE也可用于治疗血管疾病的症状。例如，HE可用于治疗心肌梗塞、慢性冠状动脉缺血、动脉硬化、充血性心力衰竭、扩张型心肌病、再狭窄、冠状动脉疾病、心力衰竭、心律失常、心绞痛、动脉粥样硬化、高血压、严重肢体缺血、外周血管疾病、肺高压或心肌肥大的症状。对血管疾病的一种或多种症状的治疗可赋予临床益处，例如减少以下一种或多种症状：气短、液体潴留、头痛、头晕、胸痛、左肩或手臂疼痛和心室功能障碍。

本发明的HE可以表现出某些特性，有助于减少和/或最大限度地减少损害，促进损害后的血管修复和再生。这些包括例如合成和分泌刺激新血管形成的生长因子的能力，合成和分泌刺激细胞存活和增殖的生长因子的能力，增殖和分化为直接参与新血管形成的细胞的能力，植入受损心肌和抑制疤痕形成(胶原沉积和交联)的能力，以及增殖和分化为血管系细胞的能力。在一个实施方式中，本发明的HE能够进行血管修复。在一个实施方式中，在正常情况下，HE有助于损伤后祖细胞的补充。在另一个实施方式中，本发明的HE能够归巢到血管损伤的部位，并促进再内皮化和防止新内膜形成。因此，本发明的HE可用于治疗因损伤或炎症或疾病而受损的血管组织。

用本发明的HE的治疗效果可以通过但不限于以下临床措施之一来证明：增加心脏射血分数，降低心力衰竭率，减少梗塞物尺寸，减少相关的发病率(肺水肿、肾衰竭、心律失常)，改善运动耐力或其他生活质量指标，并降低死亡率。细胞疗法的效果可能在手术后的数天到数周内显现出来。然而，有益效果可能早在手术后数小时就能观察到，并且可能持续数年。

根据本文描述的方法，用本发明的HE治疗的对象通常已被诊断为患有或疑似患有血管疾病，或有患血管疾病的风险。血管疾病可以被诊断和/或监测，通常由医生使用标准的方法进行。“对象”和“患者”在本文可互换使用，是指任何脊椎动物，包括哺乳动物、啮齿类动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。在一个具体实施方式中，对象是灵长类动物。在另一个实施方式中，对象是人。

在一个实施方式中，本发明的方法可以与现有的血管疗法一起实施，以有效治疗血管疾病。本发明的方法和组合物包括与非生物和/或生物药物的同时或相继治疗。非生物和/或生物药物的非限制性例子包括：镇痛剂，如非甾体抗炎药、阿片类受体激动剂和水杨酸盐；抗感染剂，如抗蠕虫药、抗厌氧菌药、抗生素、氨基糖苷类抗生素、抗真菌类抗生素、头孢类抗生素、大环内酯类抗生素、各种β-内酰胺类抗生素、青霉素类抗生素、喹诺酮类抗生素、磺胺类抗生素、四环素类抗生素、抗分枝杆菌药、抗结核抗分枝杆菌药、抗原虫药、抗疟疾抗原虫药、抗病毒药、抗逆转录病毒药、杀芥螨药、抗炎剂、皮质类固醇抗炎剂、止痒剂/局部麻醉剂、外用抗感染药、抗真菌外用抗感染药、抗病毒外用抗感染药；电解剂和肾脏剂，如酸化剂、碱化剂、利尿剂、碳酸酐酶抑制剂利尿剂、循环利尿剂、渗透性利尿剂、保钾利尿剂、噻嗪类利尿剂、电解质补充剂和排尿酸剂；酶类，如胰酶和溶栓酶；胃肠道药，如止泻剂、胃肠道消炎剂、胃肠道抗炎剂、抗酸剂抗溃疡剂、胃酸泵抑制剂抗溃疡剂、胃粘膜抗溃疡剂、H2-阻断剂抗溃疡剂、胆石溶解剂、助消化药、催吐药、泻药和大便软化剂、以及胃肠蠕动促进剂；常规麻醉剂，如吸入麻醉剂、卤代吸入麻醉剂、静脉麻醉剂、巴比妥类静脉麻醉剂、苯二氮

类静脉麻醉剂和阿片类激动剂静脉麻醉剂；激素和激素调节剂，如堕胎药、肾上腺剂、皮质类固醇肾上腺剂、雄激素、抗雄激素；免疫生物制剂，如免疫球蛋白、免疫抑制剂、类毒素和疫苗；局部麻醉剂，如酰胺类局部麻醉剂和酯类局部麻醉剂；肌肉骨骼药，如抗痛风抗炎剂、皮质类固醇抗炎剂、金化合物抗炎剂、免疫抑制抗炎剂、非甾体抗炎药(NSAIDs)、水杨酸盐抗炎剂、矿物质；以及维生素，如维生素A、维生素B、维生素C、维生素D、维生素E和维生素K。

给药

如本文所述，本发明的HE可以通过多种途径给药，包括通过静脉或动脉输注(包括逆行流输注)或通过直接注射到心脏或外周组织的全身给药。全身给药、特别是通过外周静脉通路的全身给药，依靠心脏的自然灌注和血管内皮祖细胞靶向损伤部位的能力而具有微创性优势。细胞可以通过一次性推注、通过缓慢输注、或通过相隔数小时的交错系列施用来注射，或在细胞被适当储存的情况下，在数天或数周后注射。细胞也可以通过使用导管插入术来施用，如此，通过使用气囊来管理心肌血流，细胞通过心脏的第一道关口得到了加强。与外周静脉通路一样，细胞可以通过导管一次性推注或分多次小量注射。细胞也可以通过心外膜注射直接施用于心肌。这可以在开胸手术(如冠状动脉旁路移植手术)或放置心室辅助装置的情况下，在直接可视条件下使用。可以采用配备针头的导管，以心内膜的方式将细胞直接递送入心肌，这将使直接施用的侵入性降低。

在一个实施方式中，递送途径包括通过标准外周静脉导管、中心静脉导管或肺动脉导管进行静脉内递送。在另一些实施方式中，细胞可以通过冠状动脉内的途径递送，通过目前接受的方法进入。细胞的流动可以通过位于患者脉管系统内的远端和近端气囊的连续充气/放气来控制，从而创造临时的无流区，促进细胞的植入或细胞治疗作用。在另一个实施方式中，细胞可以通过心内膜(心腔内表面)的方法递送，这可能需要使用相容的导管以及对预期目标组织进行成像或检测的能力。或者，细胞可以通过心外膜(心脏外表面)的方法递送。这种递送可以通过开胸手术时的直接可视化或通过需要专门的细胞递送工具的胸腔镜方式来实现。此外，细胞可以通过以下途径，单独或与上述一种或多种方式相结合进行递送：皮下、肌肉内、气管内、舌下、逆行冠状动脉灌注、冠状动脉旁路机械、体外膜氧合(ECMO)设备和通过心包开窗。

在一个实施方式中，细胞以血管内推注或定时输注的方式给予患者。

组合物

本发明提供包含HE的组合物。在某些实施方式中，组合物包含至少1×10³个HE。在另一个实施方式中，组合物包含至少1×10⁴个HE。在另一个实施方式中，组合物包含至少1×10⁵、至少1×10⁶、至少1×10⁷或至少1×10⁸个HE。该组合物可以包含其他本领域已知的添加剂，以加强、控制或以其他方式引导预期的治疗效果。

在一个实施方式中，本发明的组合物进一步包含生物相容性基质，例如固体支持基质、生物粘合剂或敷料，或生物支架，或用于3D生物打印的生物墨水。生物相容性基质可以通过支持和/或引导植入细胞的命运来促进体内组织工程学。生物相容性基质的非限制性例子包括：可吸收和/或不可吸收的固体基质材料，如小肠粘膜下层(SIS)，例如来源于猪(及其他SIS来源)；交联或非交联海藻酸盐、水胶体、泡沫、胶原蛋白凝胶、胶原蛋白海绵、聚乙醇酸(PGA)网、聚乳酸(PGL)网、絮、泡沫敷料、生物粘附剂(如纤维蛋白胶和纤维蛋白凝胶)、去表皮后的死皮等同物、水凝胶、白蛋白、多糖、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸(PLGA)、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、乙烯乙酸乙烯酯、聚乙烯醇等。

本发明的HE可以配制成药物组合物，包含HE和药学上可接受的运载体。药学上可接受的运载体是本领域公知的，包括盐水、水性缓冲溶液、溶剂、分散介质或其任何组合。药学上可接受的运载体的非限制性例子包括：糖，例如乳糖/葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如乙基纤维素、乙酸纤维素和羧甲基纤维素钠；粉末状胶黄芪；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；和药物制剂中使用的其它无毒相容性物质。在一个实施方式中，药学上可接受的运载体在制造和储存条件下稳定。在一个实施方式中，本发明的HE是在WO 2017/031312中描述的GS2培养基中配制的，其全部内容通过引用纳入本文。

本发明进一步提供包含HE的冷冻保存组合物。所述冷冻保存组合物还可以包含冷冻保存剂。冷冻保存剂是本领域已知的，包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、甘油等。冷冻保存组合物也可以包含等渗溶液，如细胞培养基。

通过以下的实施例对本发明进行进一步的说明，这并不意味对本发明进行任何方式的限制。本申请全文中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请以及附图的全部内容均在此通过引用纳入本文。

实施例

实施例1：血源性内皮细胞(HE)的生成

血源性内皮细胞由人胚胎干细胞(hESC)或人诱导性多能干细胞(iPSC)产生，如图1所示。hESC(如J1 hESC)或iPSC(如GMP-1iPSC)在mTeSR1(干细胞技术(StemcellTechnology)公司)+1％青霉素/链霉素中、在6孔板中的人真皮成纤维细胞饲养细胞上培养4天，每天更换培养基。铺板用于使hESC或iPSC分化(第-1天)，从6孔板的每个孔中去除mTeSR1培养基。每孔用2mL的DMEM/F12(Gibco)或D-PBS清洗，吸出DMEM/F12或D-PBS，并在每孔中加入1mL的无酶

细胞解离缓冲液(CDB)。将板在常氧CO₂培养箱(5％CO₂/20％O₂)内孵育约5-8分钟，直到细胞呈现出分离的形态。然后用移液器小心地去除CDB，不干扰松散的附着细胞。在每孔中加入2mL的mTeSR1并收集在收集管中，以收集细胞。用另外2mL的mTeSR1轻轻地清洗孔中的剩余细胞，并转移到收集管中。将管以120×g离心3分钟，并去除培养基。将细胞以400,000个细胞/10mL的最终密度重悬在含有终浓度为10μM的Y-27632(Stemgent)的mTeSR1培养基中。将10mL的细胞悬浮液转移到IV型胶原蛋白包被的10cm板中。将板在常氧的培养箱中放置过夜。

次日(第0天)，将mTeSR1/Y-27632培养基从每个10cm板中轻轻去除，替换成10mL的BVF-M培养基[

II造血干细胞扩展培养基(西格玛公司)；25ng/mL BMP4(Humanzyme)；50ng/mL VEGF165(Humanzyme)；50ng/mL FGF2(Humanzyme)]。将板在缺氧室(5％CO₂/5％O₂)内孵育2天。

第2天，吸出培养基，在每个10cm板中加入10-12mL的新鲜BVF-M。

第4天，再次吸出培养基，在每个10cm板中加入10-15mL的新鲜BVF-M。

第6天，收获细胞用于移植和/或用于进一步测试。吸出每块板上的培养基，通过加入10mL的D-PBS(Gibco)并吸出D-PBS来清洗板。将5mL的StemPro Accutase(Gibco)加入每个10cm板中，并在常氧CO₂培养箱(5％CO₂/20％O₂)中孵育3-5分钟。细胞用5mL移液器移取5次，然后用P1000移液器移取约5次。然后通过30μM细胞过滤器过滤细胞，并转移到收集管中。每个10cm板再次用10mL的EGM2培养基(龙沙(Lonza)公司)或

II造血干细胞扩展培养基(西格玛公司)冲洗，并将细胞通过30μM细胞过滤器，收集到收集管中。将管以120-250g离心5分钟。然后用EGM2培养基或

II造血干细胞扩展培养基(西格玛公司)重悬细胞并计数。计数后，将细胞离心沉降下来(250×g，5分钟)，用冷冻培养基(10％DMSO+热失活FBS)以3×10⁶个细胞/mL的浓度重悬。为了创建冷冻储备料，将细胞悬浮液等分为每个冷冻小瓶2mL FBS(海克隆(Hyclone)公司)和DMSO(西格玛公司)(6×10⁶个细胞/2mL/小瓶)。

实施例2：成血管细胞(HB)的生成

成血管细胞由人胚胎干细胞(如J1 hESC)或人诱导性多能干细胞(如GMP-1 iPSC)产生，如图2所示。将在mTeSR1(干细胞技术(Stemcell Technology)公司)+1％青霉素/链霉素中、在6孔板中的人真皮成纤维细胞饲养细胞上培养的hESC或iPSC从孔中取出，方法是将每孔与含有4mg/mL的IV型胶原酶(Gibco)的DMEM/F12(Gibco)一起在37℃(5％CO₂/20％O₂)的培养箱中孵育约10分钟，直到细胞从板上分离。从每孔中去除含有IV型胶原酶的DMEM/F12，用DMEM/F12清洗，并在每孔中加入2mL的mTeSR1，必要时用细胞刮刀将细胞与孔分离。将细胞悬浮液转移到锥形管中，每孔用2mL的mTeSR1再次清洗，并转移到锥形管中。将管以300×g离心2分钟，去除上清。将细胞团重悬在BV-M培养基[

II造血干细胞扩展培养基(西格玛公司)；25ng/mL BMP4(Humanzyme)；50ng/mL VEGF165(Humanzyme)]中，并以每孔约750,000-1,200,000个细胞的密度铺在超低附着表面6孔板(康宁)上。将板在常氧CO₂培养箱中放置48小时，以使胚胎体形成(第0-2天)。然后收集每个孔中的培养基和细胞，并以120-300g离心3分钟。去除一半的上清，替换成含有50ng/mL bFGF的2mL BV-M。因此，细胞悬浮液中bFGF的终浓度为约25mg/mL。将4mL的细胞悬浮液铺在超低附着表面6孔板的每个孔上，并在常氧CO₂培养箱中再放置48小时(第2-4天)，以使胚胎体继续形成。

第4天，将胚胎体收集到15mL管中，以120-300×g离心2分钟，用D-PBS清洗，并使用StemPro Accutase(Gibco)解聚成单细胞悬浮液。用FBS(海克隆公司)使Accutase失活，并将单细胞通过细胞过滤器，离心，并以约1×10⁶个细胞/mL重悬在Stemline II培养基(西格玛公司)中。将约3×10⁶个细胞在30mL的Methocult BGM培养基[MethoCult^TM SF H4536(无EPO)(干细胞技术公司)；青霉素/链霉素(Gibco)；ExCyte细胞生长补充剂(1:100)(密理博(Millipore)公司)；50ng/mL Flt3配体(PeproTech)；50ngm/ml VEGF(Humanzyme)；50ng/mLTPO(PeproTech)；30ng/mL bFGF(Humanzyme)]中混合，重新铺在超低附着表面10cm皿(康宁)上，并在常氧CO₂培养箱中孵育7天(第4-11天)，以使其形成成血管细胞。

第11天，收获成血管细胞用于移植和/或用于进一步测试。通过用D-PBS(Gibco)稀释甲基纤维素来收集成血管细胞。将细胞混合物以300×g离心两次，每次15分钟，并重悬在30mL的EGM2 BulletKit培养基(龙沙公司)或StemlineII中，并对细胞进行计数和冷冻，如上所述。

实施例3：细胞标志物分析

通过FACS分析，对根据实施例1在第6天收获的HE和根据实施例2在第11天收获的成血管细胞(HB)进行内皮细胞标志物、血液/造血标志物和周细胞标志物分析。简而言之，将收获的细胞重悬在50uL的FACS缓冲液(2％FBS/PBS)中，密度为100k/管。根据表1加入流式细胞术抗体，在4℃下孵育20分钟。然后向每管中加入1mL的FACS缓冲液，以250×g离心5分钟。将细胞重悬在每管200uL的不含碘化丙啶(PI)的FACS缓冲液中。样品在MACS定量分析仪10(MACS Quant Analyzer 10)(Miltenyi Biotec：130-096-343)上分析。HUVEC用作阳性对照，HDF或未分化的hESC用作阴性对照。此外，HUVEC用作单一染色(SS)对照，以作补偿。

表1.MACS定量分析仪10用的抗体染色表

或者，用SONY SA3800光谱分析仪进行FAC分析。简而言之，将收获的细胞重悬在100uL的FACS缓冲液(2％FBS/PBS)中，密度为100-200k/管。根据表2加入流式细胞术抗体，在4℃下孵育20分钟。然后向每管中加入1mL的FACS缓冲液，以300×g离心5分钟。将细胞重悬在每管100μL的含或不含PI(用FACS缓冲液1：1000稀释)的FACS缓冲液中。样品在SONYSA3800光谱分析仪上分析。HUVEC用作阳性对照，未分化的hESC用作阴性对照。

表2.SONY SA3800光谱分析仪用的抗体染色表

管编号		FITC	PE	APC	PI
						1	未染色	-	-	-	-
2	仅PI	-	-	-	+
						3	CD31 FITC	+	-	-	-
4	CD31 PE	-	+	-	-
						5	CD31 APC	-	-	+	-
6	染色1	CD34	CD31	CD144	+
						7	染色2	CD43	CD45	CD184	+
8	染色3	CD146	NG2	PDGFRb	+
						9	染色4	CD146	CXCR7	CD309	+

结果

如表3-4所示，HB对血液标志物CD43和CD45以及内皮细胞标志物CD31、CD144和CD34均呈阳性，但Tie2、CD140b、CD90和CD271的表达水平较低或检测不到。

反之，如表3-4所示，HE对CD146、CXCR4和Flk1(CD309/KDR)以及周细胞/间充质标志物CD90和CD271呈阳性，但对血液/造血标志物CD43和CD45呈阴性。

表3.衍生自J1和GMP1细胞系的HB和HE上的细胞表面标志物汇总，在MACS定量分析仪10和/或SONY SA3800光谱分析仪上分析)。

表4.J1衍生的HB和HE的细胞表面标志物汇总，在MACS定量分析仪10上分析。

分化过程中各种细胞中的细胞标志物表达的时程显示，细胞上调了中胚层系的标志物，PDGFRA和APLNR的表面表达在第2天达到峰值。随后，这些标志物的表达下降，这与第6天血管细胞的标志物CD31的增加有关(图3)。光学显微镜检查表明，该分化方法产生了一种细胞混合物，其中细胞显示出内皮或间充质形态。

对第6天产生的HE细胞的进一步表征显示，大多数细胞是CD146+，表达VECAD+(CD144+)或CD140B+(PDGFRB+)，但没有造血标志物CD43和CD45，表明该方案产生了不同的血管和血管周围细胞。对第6天产生的HE细胞进行了针对CD31、CD43、CD34、KDR(FLK1)、CXCR4、CD144、CD146、CD105、CD140b(PDGFRb)和NG2的额外表征，见图4A和4B。

根据CD31表达鉴定出的推定血管内皮部分对FLK1/CD309[也称为VEGFR2]、VECAD、CD34和CD105呈阳性(图5)。当在第6天将HE细胞转移到支持血管内皮细胞生长的培养基中并在常氧条件下再经过5-7天时，CD31、CD34和FLK1/CD309(VEGFR2)的表达维持或增加。

实施例4：HE表达内皮、平滑肌和周细胞标志物

如下所述用免疫细胞化学(ICC)进行额外的分析，使用HUVEC作为对照。将HE铺板至少24小时，然后用含Ca2+和Mg2+的D-PBS(Gibco)清洗两次。然后用4％PFA(电子显微镜科学(Electron Microscopy Science)公司)在室温下固定细胞10分钟。固定后，用含Ca2+和Mg2+的D-PBS清洗细胞5分钟，共三次。然后用含有5％正常山羊血清(细胞信号转导技术(Cell Signaling Technology)公司)的1×Perm/Wash缓冲液(BD)处理细胞一小时。吸出Perm/Wash/Blocking缓冲液后，用含有Perm/Wash/Blocking缓冲液的一抗(人CD31，1:50，英杰(Invitrogen)公司；人NG2，1:50，PD药物(PD Pharmagen)公司；人Calponin，1:100，密理博(Millipore)公司)处理细胞过夜。次日，用Perm/Wash缓冲液清洗细胞5分钟，共三次。然后用含有Perm/Wash/Blocking缓冲液的二抗和DAPI(DAPI，1:1000，英杰公司；山羊抗Ms-Cy3，山羊抗Rb-Alexaflour488)在室温下处理细胞1小时。用Perm/Wash缓冲液清洗细胞5分钟，共三次，用Keyence BZ-X710(Keyence)捕获图像。如图6所示，HEs表达内皮(CD31)、平滑肌(Calponin)和周细胞标志物(NG2)，因此有能力分化为内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞。此外，当在第6天将HE细胞转移到支持周细胞生长的培养基中时，CD140B的表达略有下降，而NG2、CD90、CD73、CD44和CD274的表达维持或增加(数据未显示)。

实施例5：单细胞miRNA谱

如下所述，针对J1衍生的HB和HE进行了使用单细胞qRT-PCR分析的额外分析，以评价与多能性或血管细胞属性相关的96种microRNA的表达水平。订购了96种人miRNA的TaqMan基因表达试验(应用生物系统(Applied Biosystems)公司)。通过将25μL的20XTaqman检测试剂与25μL的2X检测上样试剂(Fluidigm)混合来制备10X检测试剂，最终储备料体积为50μL。准备了66,000～250,000个细胞/mL范围内的细胞等分试样(冷冻或新鲜收获的)。将细胞与LIVE/DEAD染色液(LIVE/DEAD活力/细胞毒性试剂盒)在室温下孵育10分钟。然后清洗细胞，悬浮在培养基中并通过40μm过滤器过滤。使用细胞计数仪对细胞进行计数，以确定活力和细胞浓度。将细胞(60μL)与悬浮试剂(40μL)(Fluidigm)以3:2的比例混合，制备细胞混合液。将6μL的细胞悬浮混合液装入已打底的C1 Single-Cell AutoprepIFC微流控芯片，其用于中等细胞(10-17μm)或大细胞(17-25μm)，然后在Fluidigm C1仪器上使用“STA：细胞上样(1782x/1783x/1784x)”脚本处理该芯片。该步骤在96个捕获室中各自捕获一个细胞。然后将芯片转移到Keyence显微镜上，扫描每个腔室，以对捕获的单细胞数量、细胞的活/死状态和捕获的双细胞/细胞聚集体进行评分。为了在C1上进行细胞裂解、逆转录和预扩增，根据制造商的方案，将收获试剂(Harvest reagent)、裂解最终混合物(Lysis final mix)、RT最终混合物(RT final mix)和预扩增混合物(Preamp mix)加入C1芯片的指定孔中。然后将IFC置于C1中，并使用“STA:miRNA Preamp(1782x/1783x/1784x)”脚本。cDNA的收获安排在次日上午完成。将cDNA从C1芯片的每个腔室转移到新的96孔板上，该板预载有12.5μL的C1DNA稀释试剂。根据制造商的说明书，为每个实验准备管对照，例如无模板对照和阳性对照。使用96.96Dynamic Array^TM IFC和BioMark^TM HD系统对预扩增的cDNA样品进行qPCR分析。在JUNO仪器中处理IFC引物，然后加载cDNA样品混合物和10X检测试剂，按照制造商的方案进行。然后将IFC放入Biomark^TM HD系统，使用“GE96×96miRNAStandard v1.pcl”方案进行PCR。使用Fluidigm公司提供的Real-Time PCR分析软件进行数据分析。将死细胞、重复试样等从分析中去除，并使用基于线性导数基线(LinearDerivative Baseline)和用户检测器Ct阈值(User Detector Ct Threshold)的方法进行分析。数据在热图(Heatmap)视图中查看，并以CSV文件形式导出。然后用“R”软件进行“离群点识别(Outlier Identification)”分析，得出“FSO”文件，然后按照说明书进行“自动分析”。

表5：miRNA标志物谱

结果

如图7所示，与未分化的胚胎干细胞(J1)、人血管细胞(HUVEC)和J1衍生的HB细胞相比，J1-HE细胞具有独特的miRNA表达谱。miRNA标志物的具体例子示于表5。

实施例6：向内皮细胞的体外分化和血管管道形成

在体外进一步测试从J1和GMP-1衍生的HE和HB分化为内皮细胞的能力。将大约30万个HE细胞和50-60万个HB重悬在18mL的EGM2或Vasculife VEGF培养基试剂盒(生命线细胞技术(Lifeline Cell Tech)公司)中，并将3mL的重悬液等分到纤连蛋白包被的6孔板(康宁)的每个孔中。培养两天后，更换培养基并加入新鲜EGM2或Vasculife VEGF培养基。当细胞达到约60-70％融合度时拍摄图片。HB(在第5天)和HE(在第3天)在纤连蛋白包被的板上向内皮系分化，并且都显示出特征性的内皮细胞鹅卵石形态(数据未显示)。

为了测试血管管道形成，在拍完照片后收获细胞。简而言之，每孔用D-PBS清洗，并在每孔中加入1mL的StemPro Accutase(Gibco)，在37℃下孵育3-5分钟。通过移液器将培养物移取数次，从而产生单细胞悬浮液。用EGM2培养基或Vasculife VEGF培养基洗板，并转移到锥形管中，以250g离心5分钟。使用Nexcelom Cellometer K2进行细胞计数。

在NuncTM 4孔板(赛默飞世尔科技(Thermo Scientific)公司)的每个孔中加入250μL基底膜Matrigel(康宁)，并将板在RT下孵育30分钟。将收获的HB和HE以每孔约5.0×10⁴个细胞的密度接种到250μL的EGM2培养基或Vasculife VEGF培养基中。在铺板2-3小时后，将培养基替换成含有AcLDL(分子探针(Molecular Probes)公司)的250μL的新鲜培养基(5μL的AcLDL加245μL的培养基)。然后，板在常氧条件下孵育过夜。孵育24小时后，去除含有AcLDL的培养基，用D-PBS洗板3次，并加入250μL的新鲜EGM2培养基或Vasculife VEGF培养基/孔。最后，用Keyence显微镜在4倍放大倍率下对每个孔拍摄显微照片。HB和HE都在Matrigel上形成了血管样网络(数据未显示)。

实施例7：肺动脉高压模型中的体内研究

这项研究的目的是评估血源性内皮细胞对大鼠中由Sugen-缺氧(SuHx)诱导的肺动脉高压(PAH)的影响。该研究还评价了血源性内皮细胞对治疗裸大鼠中由SuHx诱导的肺动脉高压(PAH)的潜在功效。大鼠中由SuHx诱导的肺高压是一个有据可查的模型，有助于研究降压药对患有肺高压的大鼠的肺动脉压和右心室重塑的影响。

物种

雄性裸(RNU)大鼠(查尔斯河实验室(Charles River Laboratories))，招募至研究中时体重在200～250克之间。

测试物

VPC1＝如上所述在实施例2中制备的J1-HB

VPC2＝如上所述在实施例1中制备的J1-HE

载剂(阴性对照)

蒸馏无菌水

Sugen溶液的制备

在第0天制备10mg/mL的Sugen在DMSO中的溶液用于给药。

实验步骤

根据动物的体重，将动物在治疗组之间随机均匀分配。

将第2至第8组的动物(见表6)置于sugen/缺氧/常氧方案中21天。第1组的动物接受DMSO(sugen的载剂)的注射，并置于采用相同方案的缺氧/常氧中。每天观察这些动物的行为和总体健康状况的任何变化。

在第1天或第9天，按照表6中的计划和描述，给予测试物或载剂进行治疗。自由进食和饮水。每天观察动物的行为和总体健康状况。每周记录体重。

在手术当天，用2％至2.5％的异氟烷USP(Abbot实验室，加拿大蒙特利尔)在氧气中的混合物将大鼠麻醉。连续记录血液动力学和功能参数(全身动脉血压、右心室血压、肺动脉血压、氧饱和度和心率)5分钟或直到肺动脉压信号消失，以先到者为准。

然后对大鼠进行放血，用0.9％NaCl冲洗肺循环。将肺和心脏全部从胸腔中取出。将肺(左叶)用10％NBF充气。将左叶准备在载玻片上进行组织病理学分析。切开心脏以测量右心室和左心室(包括中隔)的湿重，作为Fulton指数的一部分。

表6：治疗组的分配和治疗信息

数据分析

心率。通过连接在动物左前爪上的N-595脉搏血氧仪(Nonin，马萨诸塞州普利茅斯)测量心率。使用Clampfit 10.2.0.14(轴突仪器公司(Axon Instrument Inc.)，美国加利福尼亚州福斯特城[现为分子仪器公司(Molecular Devices Inc.)])中的光标读数，以每分钟心跳数(bpm)为单位测量从脉搏血氧仪得出的心率值。

饱和度(SO₂)。血氧饱和度(SO₂)是连接在动物左前爪上的脉搏血氧仪(Nonin，，马萨诸塞州普利茅斯)信号的读数。使用Clampfit 10.2.0.14中的光标读数，以百分比(％)为单位测量饱和度值。

动脉血压。在整个实验过程中，通过动脉内液体填充导管(AD仪器(ADInstruments)公司，美国科罗拉多州科罗拉多斯普林斯)连续记录动脉血压。使用Clampfit10.2.0.14中的光标读数，以mmHg为单位测量舒张压和收缩压值。用以下公式计算平均动脉血压值:

平均动脉压＝舒张压+(收缩压–舒张压)/3

脉压以收缩压和舒张压读数之差计算。

心室和肺血压。通过心室内液体填充导管(AD仪器(AD Instruments)公司，美国科罗拉多州科罗拉多斯普林斯)记录右心室和肺血压。使用Clampfit 10.2.0.14中的光标读数，以mmHg为单位测量舒张压和收缩压值。

用以下公式计算平均心室和肺血压值:

平均心室或肺压＝舒张压+(脉压)/3

Fulton指数。在生理记录结束时，将每个动物的肺和心脏取出。剖开心脏，将右心室与带中隔的左心室分开，分别称重。然后用以下公式计算Fulton指数：

统计学分析。数值以平均值±SEM(平均值的标准误差)表示。在Microsoft Excel2007中在所有的实验条件下进行单因素方差分析和重复非配对斯氏t检验，将治疗组与对照组、健康动物或Sugen-缺氧动物(载剂)进行比较。p≤0.05时认为差异有显著性。

在所有结果中，*表示该值与常氧对照组(第1组)有显著差异，而**表示该值与SuHx对照组(第2组)有显著差异。换言之，*表示动物与健康动物有显著差异，而**表示动物与没有从任何治疗中受益的完全患病动物有显著差异。

结果

Sugen+缺氧(SuHx)诱导的PAH大鼠模型是广泛用于研究肺动脉高压的模型。Sugen是VEGF受体拮抗剂，已知会引起肺内皮病变，在这项研究使用的暴露水平(单剂量20mg/kg)下，最初会损害肺脉管系统中约50％的内皮细胞。发生受损的内皮细胞和血管细胞的重塑以及血管收缩，阻塞肺小动脉，从而限制通过肺动脉的血流，增加肺动脉压。通过肺动脉的血流的减少和肺动脉压的增加使得右心室后负荷增加，导致SuHx处理的大鼠出现明显的右心室肥大，并且在患有PAH的临床患者中观察到。

在这项研究中，所有仅有SuHx+载剂的动物都如预期那样发展为中度至重度PAH。患病的动物表现出PAH模型的所有特征。与健康动物相比，SuHx动物的肺压(收缩压、舒张压和平均值)在统计学上更高(表7、8和9)。值为41.2mmHg(表9)，SuHx+载剂动物的平均肺压比健康动物高3倍，对应于中/重度肺动脉高压的较高范围。

表7：VPC1和VPC2对sugen-缺氧诱导的PAH大鼠的肺收缩压的影响

表8：VPC1和VPC2对sugen-缺氧诱导的PAH大鼠的肺舒张压的影响

表9：VPC1和VPC2对sugen-缺氧诱导的PAH大鼠的平均肺压的影响

肺压的增加导致右心室后负荷升高，从而导致右心室(RV)肥大，直接表现为SuHx载剂组的Fulton指数(右心室与左心室之比)比常氧健康组(第1组)高2.7倍(表10)。PAH的特点是短期的右心室肥大，期间心肌厚度显著增加，随后是长期的右心室膨胀，同时伴有右心室纤维化。在21天的研究期内，就大鼠模型而言一般不足以观察到显著的右心室膨胀。在这项研究中，Fulton指数的增加清楚地表明右心室的显著肥大。这些数据还表明，细胞注射对右心肥大的发展没有影响。

表10：VPC1和VPC2对sugen-缺氧诱导的PAH大鼠的Fulton指数的影响

脉压高于收缩压的25％时被认为是正常的。对于正常组，脉压是收缩压的26％。(表11)。对于SuHx+载剂动物，脉压下降到收缩压的22％。认为Sugen-缺氧诱导的PAH不会影响心肌收缩力；然而，PAH引起的气体交换不良会对左心室造成双相缺氧效应，最终会演变为慢性缺氧，失去收缩强度。

表11：VPC1和VPC2对sugen-缺氧诱导的PAH大鼠的脉压的影响

氧饱和度(SO₂)在95-100％之间被认为是正常的。在对照组中，SO₂为98.6％；在载剂组中下降到88.4％(表12)，证实了肺出现的高血压对全身的氧合有影响。

表12：VPC1和VPC2对sugen-缺氧诱导的PAH大鼠的SO₂的影响

在21天的整个研究过程中，正常健康大鼠增重68克，而SuHx-载剂动物平均增重21克(表13)。在体重增加更慢的情况下，器官重量的增加也应该相对较小；然而，重塑和炎症/水肿有助于增加器官重量，因此，测量肺重量是估计炎症/水肿以及重塑的一个基本但快速的手段。载剂治疗的大鼠的肺比正常大鼠重1.8倍(表14)。肺重量的明显增加表明重要的肺水肿、栓塞或纤维化，这些也都是PAH的特征。SuHx诱导的PAH的特点是最初的肺脉管系统的血管收缩，一些肺重量的增加可归因于此(血管平滑肌肥大)。

表13：VPC1和VPC2对sugen-缺氧诱导的PAH大鼠的重量增加的影响

表14：VPC1和VPC2对sugen-缺氧诱导的PAH大鼠的肺重量的影响

经测量，SuHx+载剂的存活率为80％；10只动物中有2只在手术日之前死亡(图8)。这与该模型中RNU大鼠的内部历史死亡率相符。

VPC1。VPC1以2种不同剂量进行了测试；250万个细胞和500万个细胞。每种剂量在第1天注射给一组动物(分别为第3组和第5组)，在第9天注射给一组动物(分别为第6组和第8组)。与SuHx非治疗组相比，所有测试的剂量都没有引起肺压(收缩压、舒张压和平均值)的统计学上的显著变化(表7、8和9)。因此，没有一种VPC1剂量能显著防止Fulton指数的增加(表10)，这表明VPC1可能不能防止与PAH相关的右心室(RV)肥大。

通过VPC1治疗，与载剂组相比，脉压、平均动脉压和心率都没有变化(表11、9和15)。

表15：VPC1和VPC2对sugen-缺氧诱导的PAH大鼠的心率的影响

阴性对照SuHx组的SO₂为88％，这一数值低于正常的饱和范围(95至100％)(表12)。在第1天用2.5M和5M个VPC1细胞治疗的组的SO₂分别为93％和92％，比阴性对照组略高(表12)。在第9天用5M个VPC1细胞治疗的组中，SO₂为95％(表12)，这在被认为是正常和健康动物的范围内。

与载剂组相比，VPC1治疗组的相对肺重量没有改变(表14)，这表明VPC1可能不能防止肺纤维化和/或相关水肿。

在21天的整个研究过程中，正常健康大鼠增重68克，而仅SuHx(载剂组)的动物平均增重21克(表13)。接受VPC1治疗的动物没有比载剂组增加更多重量(表13)。

用载剂治疗的组的存活率为80％，而在第1天用2.5M个VPC1细胞和在第9天用5M个VPC1细胞治疗的组的存活率为100％(图8)。

存活率以及动物的总体健康和生理参数表明，在第1天或第9天注射剂量为250万个细胞的VPC1对大鼠中由SuHx诱导的PAH没有显著影响。在第9天注射剂量为500万个的细胞似乎提供了一个小的益处，表现为血红蛋白的氧饱和度增加和动物的存活率提高。

应注意，动物没有因为注射了VPC1而表现出任何不耐受或不良反应。笼边观察没有发现动物有任何不适，除了与PAH相关的症状外。

VPC2。VPC2以250万个细胞的剂量进行了测试。细胞在第1天注射给一组动物(第4组)，在第9天注射给一组动物(第7组)。

与载剂动物相比，在第1天用VPC2治疗的组的收缩压、舒张压和平均肺压在统计学上更低(分别降低22％、24％和23％)(表7、8和9)。这表明，在第1天注射250万个VPC2细胞使得通过肺动脉的血流更好，这是通过防止组织的重塑和/或防止由sugen-缺氧及其对内皮细胞的损害引起的肺动脉血管收缩实现的。

然而，Fulton指数增加(表10)，表明VPC2对动物血液动力学的影响不足以防止与PAH相关的右心室(RV)肥大。此外，经VPC2治疗的组(在第1天或第9天)与仅用载剂治疗的组相比，脉压、平均动脉压和心率没有统计学差异(表11、9和15)。

阴性对照SuHx组的SO₂为88％，这一数值低于正常的饱和范围(95至100％)。在第1天用2.5M个VPC2治疗的组的SO₂恢复到正常值范围，这在统计学上和临床上都有很大的益处(表12)。

与载剂组相比，用VPC2治疗的组的相对肺重量没有统计学显著性(表14)。

接受VPC2的动物的重量增加与接受载剂的动物没有区别(表13)。仅用载剂治疗的组的存活率为80％，而在第1天或第9天用250万个VPC2细胞治疗的组的存活率为100％(图8)，表明VPC2在一定程度上保护了患有PAH的动物。

肺压的降低、更好的饱和度以及动物更高的存活率表明，VPC2对大鼠中由SuHx诱导的PAH有一些益处。

讨论

这项肺动脉高压研究涉及RNU大鼠，已经发现在这些实验条件下，RNU大鼠会出现非常严重和快速的PAH形式。发现这项研究中使用的最终实验条件能引起动物的严重肺血液动力学损伤，同时在21天内保持死亡率低于20％。

疾病进展的迅速性和短短3周后症状的严重性令人担忧；由于疾病进展如此之快，对动物产生任何治疗效果都是重大的挑战。虽然可以想象，一种强大的血管扩张剂可以防止疾病的发作及其早期进展，但这项研究中的测试物的作用机制并不被这样的快速研究所看好。

尽管如此，在第1天注射250万个VPC 2细胞使得收缩压、舒张压和平均肺压都有所降低，后者从41.2mmHg下降到31.6mmHg，是统计学上显著的益处，更重要的是，让动物的平均肺压恢复到正常体力活动仍有可能的范围(25至35mmHg)。结合氧饱和度的增加，这表明在第1天给予250万个VPC 2细胞可以显著改善肺血液动力学，消除导致临床PAH患者中的慢性缺血和肺重塑的持续缺氧。

此外，对研究的功能终点的检查显示了VPC 1和VPC 2之间的差异。在所有情况下，在第1天以250万的密度注射VPC 2细胞所产生的结果都比在同一天注射250万个VPC 1细胞的结果更佳。这是令人惊讶的，因为HB以前被证明在小鼠后肢缺血模型和小鼠心肌梗塞模型中具有效果。见美国专利第9,938,500号。此外，考虑到肺血液动力学和所有其他功能参数的测量，在第1天注射250万个VPC 2细胞比在第9天注射250万个VPC 2细胞产生更好的效果。

综上，这项研究证明了VPC2(HE)细胞在涉及RNU大鼠的极富侵略性且快速诱导的PAH综合征中的功效。虽然有一些报道显示免疫缺陷患者中的PAH的严重程度更高，但像这项研究中诱导的PAH这样快速和严重的进展在临床上是闻所未闻的。如果有更多的时间和不那么极端的肺动脉高压，那么可以预计与单次静脉内注射VPC 2细胞(HE)相关的功能益处将比目前的数据集所提示的更加有利。

实施例8：组织病理学分析

肺动脉高压(PAH)的特点是肺动脉压的明显和持续升高。在动物模型中，由于肺病或其他原因导致的氧气供应减少，慢性肺泡缺氧会导致肺血管阻力持续增加和肺高压。有多种因素参与PAH的病理生物学，其中持续的血管收缩和肺血管壁的重塑似乎是最重要的。虽然血管收缩是平滑肌细胞对各种刺激的可逆反应，但它在维持血管壁各层的重塑方面是必要的，并最终导致对管腔直径的更永久性限制。

在这项研究中，对实施例7中测试的动物的各种参数进行分析，以确定所测试的血源性内皮细胞是否干扰了结构性病变的发展，这是PAH模型中的肺血管变化的特点。

材料和方法

对从每个实验组(如表6所示)的每只大鼠收获的左肺叶进行灌注，用10％福尔马林固定，然后送到IRIC(免疫学和癌症研究所，加拿大魁北克省蒙特利尔市)制作切片，用于组织病理学分析。

切开左叶中部的横向切面并包埋入石蜡中，以5μm的厚度切片，封片并用苏木精和伊红(H&E)染色。

在尼康Eclipse T100显微镜上在200倍放大倍率下观察每个切片。对于每个肺，随机选择最少10个不重叠的视野。使用尼康DS-Fi1数码相机(采用尼康NIS Elements 4.30)拍摄显微照片。摄影师对给予大鼠的治疗和感兴趣的特征是不知情的。对于10个视野，对每个区域拍摄并保存一张对焦良好的显微照片。对每个视野中发现的所有血管进行分析，从最大的到最小的都要分析，在血管的大小上没有门槛或限制。

鉴定出腺泡内血管，即肺的气体交换区域内的血管，其与肺泡、肺泡管和呼吸道支气管有关。所有与末端支气管有关的血管和所有较大的气道都被排除。

通过测量横切管腔的最长轴，根据管腔直径将血管分为三个尺寸组；小(10-50微米)、中(50～100微米)或大(>100微米)。使用“Infinity Analyze 5.0.3.”，在管腔的最宽处测量直径，垂直于血管的长轴进行测量。管腔位于内部弹性层的内缘之间，即内部弹性层不构成管腔的一部分，但被认为是血管壁的一部分。

每条血管也被分类为非肌肉型、半肌肉型或肌肉型。

完全肌肉型：完全(>90％的周长)被染色识别的平滑肌层以及内部和外部弹性层所包围。在肌肉化的血管中，外直径的测量位置与非肌肉化的血管中内直径的测量位置相同，从外缘一直到外部弹力层的对侧外缘。

部分肌肉型：有一部分周长不完全地(10-90％的周长)被平滑肌的新月体和两个弹性层所包围。在部分肌肉化的血管中，外直径的测量位置与非肌肉化的血管中内直径的测量位置相同，从该位置处的外缘一直到最外部弹力层的对侧外缘(无论这是内部还是外部弹力层)。

非肌肉型：血管的全部周长(<10％)为一个弹性层而没有明显的平滑肌层。

分析

数值以平均值±SEM(平均值的标准误差)表示。对所有实验条件进行重复非配对斯氏t检验，比较以下各组：

将SuHx组(阴性对照)动物与健康动物(常氧对照)进行比较，以确认成功诱导疾病。治疗组与阴性对照动物(SuHx)比较。p≤0.05时认为差异有显著性。

在所有结果中，*表示该值与对照(无SuHx)组有显著差异，而**表示该值与阴性对照(SuHx)组有显著差异。

结果

Sugen的影响

Sugen的注射引起小肺中膜和外膜的增厚与严重的动脉病变的组合，包括同心新内膜和复杂的丛状病变。观察到两种复杂病变形成的模式：一种是病变在血管腔内形成，另一种是病变凸出于血管外(类似于动脉瘤)。Sugen诱导的PAH的第三个结构性后果在疾病进展的很后期才出现，包括在肺实质内出现纤维化。临床前Sugen诱导的PAH本身并不是一个纤维化的模型，但仔细检查后期的包埋和染色的组织可以对纤维化进行可靠的定性。纤维化的出现表明不可逆转的PAH，例如在长期患病的患者中观察到的。可悲的是，这些患者往往对目前针对PAH的血管扩张剂疗法没有反应。

选择小肺动脉和小动脉的壁厚、血管的分类、这些动脉周围的增殖细胞(祖细胞)群体以及动脉管腔的相对直径，以确定健康肺和PAH肺之间可观察到的形态学变化的严重程度。肺中的单核炎性细胞(肺泡巨噬细胞)和白细胞(淋巴细胞样细胞和嗜酸性粒细胞的聚类)浸润，肺中的间质/肺泡水肿和纤维化，以及丛状病变，也被用作肺的病理生理状态的指标。

组织病理学变化的严重程度，例如中膜动脉的增厚、“祖细胞”向小动脉外膜中的浸润及肺泡巨噬细胞向肺实质中的浸润、肺泡水肿和纤维化以及丛状病变的形成，从0到3评分，其中0＝无，1＝轻度，2＝中度，3＝重度。

将表6所示的用VPC1和VPC2治疗的SuHx诱导的PAH大鼠以及阴性对照动物的肺的动脉尺寸、管腔直径、小动脉有无肌肉化的情况汇编起来。

阴性对照大鼠

如预期的那样，对照组(常氧)动物的肺组织主要由非肌肉型小动脉构成(88.3％)(表16、17和18)。反之，阴性对照(SuHx)动物的肺组织主要由肌肉型小动脉构成(83.9％)(表16、17和18)。这一观察与在Sprague-Dawley大鼠的56天Sugen-缺氧模型中观察到的增生一致。注射Sugen后11天的达到17％氧的缺氧足以引起持续的肺血管平滑肌(VSM)收缩，导致VSM肥大和增生，其中VSM细胞的繁殖使正常的非肌肉型小动脉转变为部分或全部肌肉化的小动脉。这会增加壁厚，减小这些血管的管腔空间。此外，由于肺平滑肌的重塑，接下来的10天在常氧环境中，肺中仍然保持着缺氧状态。研究的缺氧期的特点是内皮迅速增殖，从而产生不同程度的丛状病变。在第21天结束时，这些病变往往会大到足以完全闭塞小直径的小动脉。

表16：VPC1和VPC2对SuHx诱导的PAH大鼠的非肌肉型血管百分比的影响

表17：VPC1和VPC2对SuHx诱导的PAH大鼠的肌肉型血管百分比的影响

表18：VPC1和VPC2对SuHx诱导的PAH大鼠的半肌肉型血管百分比的影响

在对照(常氧)组中，大多数血管(≈88％)被表征为“小”尺寸(直径小于50微米)，并且主要是非肌肉型的(表16、17和18)。近12％的血管被描述为“中等”大小，而其余极少数血管被认为是“大”。通过SuHx诱导PAH改变了血管的厚度，导致血管的尺寸分布发生偏移(在研究结束时，≈60％-被表征为小血管，38％为中等血管，其余为大血管)。SuHx诱导的变化在血管内肌肉层的增厚上很明显(如表19、20和21所示)；与对照(常氧)组动物相比，小尺寸和中等尺寸的肺血管的肌肉组织分别明显增加了16％至42％和20％至33％。大血管的壁厚没有显著变化。

表19：VPC1和VPC2对SuHx诱导的PAH大鼠的小血管壁厚的影响

表20：VPC1和VPC2对SuHx诱导的PAH大鼠的中等血管壁厚的影响

表21：VPC1和VPC2对SuHx诱导的PAH大鼠的大血管壁厚的影响

壁厚的增加减少了动脉的管腔直径，增加了右心室必须通过泵出来抵抗的肺动脉压(右心室后负荷)。

在健康、非诱导的动物中没有观察到丛状病变。反之，用Sugen诱导但没有从任何治疗中受益的动物表现出2级和3级丛状病变，相当于中度(2级)到重度的内皮过度生长，一些血管腔完全闭塞(3级)。除了人PAH所特有的丛状病变外，没有从治疗中受益的动物还表现出纤维化和间质/肺泡水肿的迹象。

VPC1

VPC1以2种不同剂量进行了测试；250万个细胞和500万个细胞。每种剂量在第1天注射给一组动物，在第9天注射给一组动物。

正如PAH诱导改变血管的尺寸分布一样，用VPC1治疗也会改变血管的尺寸分布。与仅SuHx大鼠相比，VPC1略微增加了“小”尺寸血管，减少了“中等”尺寸血管(数据未显示)。

与载剂治疗的大鼠相比，在第1天用2.5M和5M个VPC1细胞治疗的大鼠的小肺血管的壁厚(主要由平滑肌层的厚度决定)在统计学上更低。中等和大血管的壁厚没有明显变化(表19、20和21)。在第9天用VPC1治疗对血管壁厚没有任何影响。

在第1天用2.5和5M个VPC1细胞治疗的动物中的肌肉型血管百分比显著降低；从阴性对照SuHx处理的动物的83.9％降到VPC1治疗的动物的64％和69％(表16、17和18)。

在第9天注射相同剂量的VPC1对肺组织中的肌肉型血管百分比没有统计学上的显著影响。

此外，在第1天用VPC1治疗的组中观察到的肺泡巨噬细胞浸润、水肿/纤维化和肺动脉病变都比载剂动物更低。在第1天用VPC1治疗的组中，丛膜病变被归类为轻度/中度(得分1至2)。

VPC2

VPC2以250万个细胞的剂量进行了测试。细胞在第1天注射给一组动物，在第9天注射给一组动物。

正如PAH诱导改变血管的尺寸分布一样，在第1天用VPC2治疗也会改变血管的尺寸分布。与仅SuHx大鼠相比，在第1天注射VPC2增加了“小”尺寸血管的数量，减少了“中等”尺寸血管。在第1天用VPC2治疗使得“小”尺寸血管与“中”尺寸和“大”尺寸血管的比例非常接近于在常氧完全健康的大鼠中观察到的比例。

与载剂治疗的大鼠相比，第1天用2.5M个VPC2细胞治疗的大鼠的小肺血管的壁厚在统计学上更小。在第9天给予VPC2对血管壁厚没有任何影响。中等和大血管的壁厚没有明显变化(表19、20和21)。在第9天用VPC2治疗对血管壁厚没有任何影响。

在第1天用VPC2治疗的动物中的肌肉型血管百分比显著降低；从载剂治疗的动物的83.9％降到VPC2治疗的动物的45％。因此，非肌肉型血管的比例从7％增加到46％。第9天的VPC2对肌肉型血管没有显著影响。见表16、17和18。

这些结果证实了功能上的发现，即用VPC2治疗的动物中SuHx诱导的动物的PAH症状要轻得多。VPC2防止了SuHx诱导的PAH大鼠模型中的肺血管重塑。

此外，在VPC2治疗的动物中观察到的肺泡巨噬细胞浸润、水肿/纤维化和肺动脉病变都远远低于阴性对照SuHx动物，被归类为无/轻度(得分0至1)，这表明VPC2能防止与PAH相关的肺变化的发生。

这项研究证明了VPC2(HE)在RNU大鼠中极富侵略性且快速诱导的PAH综合征中的功能以及结构上的高效性。

实施例9：HE含有一个独特的血管内皮部分，即VECAD+

上述流式细胞术和转录物分析表明，通过HE分化方案似乎生成了重要的血管内皮成分。为了更好地定义PSC衍生的EC样细胞和成熟的EC之间的异同，我们进行了单细胞RNA测序，比较了HE、HUVEC和未分化的iPSC(GMP1)。

无监督聚类显示在测试的细胞类型中有9个聚类(图9A)。正如预期的那样，未分化的iPSC与HE细胞(“VPC-饲养细胞活性”)和HUVEC(图9B和9C)的聚类明显不同。HE组织成多个聚类，但总的来说，其群体在很大程度上可以与iPSC和HUVEC分开。当查询血管内皮细胞的特定标志物的表达时，通过VECAD/CDH5的存在鉴定了三个聚类(聚类2、4和5)(图10)。聚类2和4主要由HUVEC组成，而聚类5由HE细胞组成(图9B)。鉴于聚类5似乎是由VECAD+细胞组成的，对聚类5的VECAD+HE细胞与其他聚类的细胞进行了差异基因表达分析以作比较，发现聚类5有很强的血管内皮特征，这一点从差异表达最大的基因的功能中可以看出(表22)。聚类5中50个最明显上调的基因中有许多是具有已知血管表达和活性的基因，包括PLVAP、GJA4、ESAM、EGFL7、KDR/VEGFR2、ESAM和VECAD(CDH5)(表22)。基因本体论分析表明，在最富集的路径中，有EC迁移、内皮发育、出芽式血管生成和其他EC相关过程。同样，基因集富集分析揭示了对内皮发育和功能重要的途径，包括TGF-β信号转导和缺氧。

聚类分析也显示，HE细胞与HUVEC有很大不同。聚类5中HUVEC的贡献最小，但不是零，聚类2和4主要由HUVEC组成，HE表现形式较少(<15％)(图9B)。将聚类5与主要由HUVEC组成的聚类进行差异基因表达分析以作比较，发现聚类5中的VECAD+HE细胞是未成熟的EC或祖EC(表23)。在VECAD+HE细胞中表达较高的基因有SOX9、PDGFRA和EGFRA，它们是作为终末分化EC的前身的复制性血管源性血管祖细胞的标志物。最近的研究(Kutikhin,A.G.等人，Cells 9:876(2020))比较了内皮细胞集落形成细胞(ECFC)和成熟的血管源性内皮细胞(EC)，鉴定出了KDR/VEGFR2、NOTCH4以及I型和IV型胶原亚基是ECFC富集的因子，与HUVEC相比，这些转录物在聚类5的VECAD+HE细胞中同样上调，尽管其他ECFC富集的基因如CD34在HE细胞中并不高。尽管HE细胞和HUVEC都表达VECAD/CDH5和PECAM1/CD31，但HUVEC的水平更高，这又与HE细胞是一种更不成熟的或祖EC样细胞相一致。利用VECAD+HE细胞和HUVEC之间差异表达的基因集进行的基因本体论分析表明，最富集的途径是甾醇生物合成、蛋白激酶A信号转导、消化道和心室发育。与iPSC相比，基因集富集分析显示，差异表达的基因与对内皮发育和稳态重要的途径有关，如MTORC1、WNT和TGF-β信号。综上所述，单细胞RNA测序显示了与HUVEC相似的HE聚类，其拥有真正的EC的品质，但也拥有暗示不成熟或祖细胞表型的独特特征。

表22.与其他聚类的细胞相比，聚类5中50个最明显上调的基因

表23.与HUVEC细胞相比，聚类5中100个最明显上调的基因

实施例10：HE减轻肺动脉高压大鼠模型中的血液动力学参数和血管重塑

用野百合碱(MCT)处理啮齿动物会诱导血管阻力和心脏功能障碍(Rabinovitch,M.Toxicol Pathol 19,458-469(1991))，而Sugen/缺氧模型会诱导上述临床标志物以及丛状病变的形成，这是人类晚期疾病的临床标志(Ciuclan,L.等人，Am J Respir Crit CareMed 184,1171-1182(2011))。

在MCT大鼠中，用衍生自J1-ESC和GMP-1iPSC的HE进行治疗都可以减轻PAH的症状。简而言之，在第0天给予rnu/rnu大鼠单剂量的MCT(50mg/kg，ip)。三天后，将大鼠分为载剂组、J1-HE组和GMP-1HE组，并通过静脉内注射给予对照培养基或细胞(2.5×10⁶个)。作为阳性对照，另一组在其饮用水中给予高剂量的西地那非(约15mg/kg/天)。在第28天，通过右心和左心导管插入术进行血液动力学分析。正如预期的那样，载剂治疗的大鼠显示出右心室收缩压(RVSP)、Fulton指数和肺血管阻力指数(PVR指数)的增加(图11A-C)。用J1-HE治疗的大鼠的RVSP和PVR指数值较低(图11A和11C)。用GMP-1-HE治疗的大鼠的RVSP、Fulton指数和PVR指数值较低(图11A-C)。组织学分析显示，与载剂治疗的大鼠相比，J1-HE和GMP-1-HE组的大鼠中增厚的血管较少，这一点通过量化而证实(图11D)。

接下来，在PAH的Sugen/缺氧模型中再次测试PSC衍生的HE。在这些研究中，将rnu/rnu大鼠置于sugen/缺氧/常氧条件下21天。在第0天给予大鼠单剂量的Sugen，然后在第1天静脉内注射载剂、J1-HE或GMP-1-HE，用量为100万、250万或500万个细胞。作为额外的对照，另一组以口服方式给予西地那非(50mg/kg)，每天两次。与载剂治疗相比，用J1-HE和GMP-1-HE(每次注射250万个)治疗的大鼠显示出mPAP、RVSP和Fulton指数下降，心脏功能如搏出量和心输出量改善(图12A-D)。此外，GMP-1-HE以剂量依赖的方式提高其在肺血液动力学、RV重塑、心脏功能方面的功效(图13A-D)。肺组织的组织学分析显示，在Sugen/缺氧模型中，对照与J1-HE或GMP-1-HE治疗的大鼠之间存在差异(图14A-C和图15A-C)。与载剂治疗相比，在HE治疗的动物中可以观察到较少的丛状病变(图14A和15A)。与载剂治疗的动物相比，HE治疗的动物的肺血管壁厚也有所减少(图14B和15B)。HE治疗组的动物被归类为肌肉型和半肌肉型的肺血管的百分比低于载剂治疗(图14C和15C)。最后，与载剂治疗的动物相比，HE治疗的肺的免疫细胞浸润较少(数据未显示)。

对来自Sugen/缺氧模型的HE和载剂治疗的大鼠的肺进行的全转录组分析支持了生理学数据，表明HE治疗减轻了病理性血管重塑。在第21天收集大鼠肺的RNA，并进行差异基因表达分析。通过细胞治疗而下调≥1.25倍的基因的通路分析表明，与平滑肌细胞发育、免疫细胞系统浸润和炎症等有关的基因有所减少。相反地，通过细胞治疗而上调≥1.25倍的基因与有利的代谢状态有关，即有利于氧化磷酸化，其扰动与PAH疾病状态有关。综上所述，这些数据表明，HE在每次注射250万至500万个的剂量范围内，通过降低血管阻力、血管重塑和心脏肥大来保护PAH模型的大鼠。

实施例11：HE恢复肺的微脉管系统

据报道，内皮祖细胞在MCT处理的肺中保留微脉管系统(Zhao等人，Cir.Res.96:442-450(2005))。因此，对用Nx对照、载剂、西地那非以及100万和500万个GMP1-HE细胞治疗的SuHx模型的肺进行显微CT扫描。显微CT扫描显示，正常肺的远端小动脉床填充均匀，毛细血管灌注模式均匀(图16A)。反之，用载剂治疗的SuHx肺显示出远端小动脉床狭窄和毛细血管闭塞(图16B)。用500万个HE细胞(图16D)而不是用100万个HE细胞(图16C)进行的治疗保留了微脉管系统，可通过注射造影剂观察到。使用500万个HE细胞的情况下，肺微脉管系统的外观有明显的改善，小动脉连续性得以保留，毛细血管灌注增强(图16D)。西地那非的治疗显示出毛细血管灌注的适度改善(图16E)。

实施例12：HE含有一个独特的血管内皮部分，该部分有治疗活性

HE的单细胞分析以及上述VECAD+HE部分和HUVEC之间的相似性表明，也许这个亚群可能是赋予HE在PAH中的治疗效果的活性成分。为了检验这一点，使用Sugen/缺氧模型，用250万个“整块”或未分选的HE细胞和250万个通过磁分选VECAD+细胞从“整块”HE细胞中纯化出来的VECAD+HE细胞进行了另一项研究(图17)。对VECAD+细胞进行分选的部分显示，大多数也表达CD31(图17)。与载剂治疗的动物相比，VECAD+HE改善了临床测量值：mPAP(图18A)、RVSP(图18B)、RV重塑(图18C)和心输出量(图18D)。与载剂治疗相比，肺脉管系统也得以保持，丛状病变较少(图18E)，壁厚减少(图18F)，血管肌肉化减少(图18G)。通过递送真正的成熟内皮细胞HUVEC，也获得了类似的结果。

当J1-HE和GMP1-HE中的VECAD+/CD31+群体被分析为表达FLK1/KDR时，可知HE包含CD31+/VECAD+/FLK1+的群体(图19)。

等同方案

本领域的技术人员将认识到，或能够仅采用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方式的许多等同方案。这些等同方案旨在被以下权利要求所涵盖。本申请全文中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容均通过引用纳入本文。

Claims

1.一种治疗患有或疑似患有血管疾病的对象中的血管疾病的方法，包括给予对象包含通过多能干细胞的体外分化获得的血源性内皮细胞(HE)的组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中，血管疾病选自冠状动脉疾病(例如动脉硬化、动脉粥样硬化、以及动脉、小动脉和毛细血管的其他疾病或损伤或相关不适)、心肌梗塞(例如急性心肌梗塞)、组织性心肌梗塞、缺血性心脏病、心律失常、左心室扩张、栓塞、心力衰竭、充血性心力衰竭、心内膜下纤维化、左心室或右心室肥大、心肌炎、慢性冠状动脉缺血、扩张型心肌病、再狭窄、心律失常、心绞痛、高血压(例如肺高压、肾小球高压、门静脉高压)、心肌肥大、外周动脉疾病(包括严重肢体缺血)、脑血管疾病、肾动脉狭窄、主动脉瘤、肺心病、心律不齐、炎症性心脏病、先天性心脏病、风湿性心脏病、糖尿病血管疾病、内皮肺损伤疾病(例如急性肺损伤(ALI)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS))。

3.如权利要求1所述的方法，其中，血管疾病是肺高压。

4.如权利要求1所述的方法，其中，血管疾病是肺动脉高压。

5.如权利要求1所述的方法，其中，对象的平均肺(动脉)压有所降低。

6.一种增加患有或疑似患有血管疾病的对象的肺动脉中的血流的方法，包括给予对象包含通过多能干细胞的体外分化获得的HE的组合物。

7.如权利要求6所述的方法，其中，对象有肺高压。

8.如权利要求6所述的方法，其中，对象有肺动脉高压。

9.一种降低患有或疑似患有血管疾病的对象的血压的方法，包括给予对象包含通过多能干细胞的体外分化获得的HE的组合物。

10.如权利要求9所述的方法，其中，对象有肺高压。

11.如权利要求9所述的方法，其中，对象有肺动脉高压。

12.如权利要求9所述的方法，其中，血压是舒张压。

13.如权利要求9所述的方法，其中，血压是收缩压。

14.如权利要求9所述的方法，其中，血压是平均肺(动脉)压。

15.如权利要求9～14中任一项所述的方法，其中，对象的血压降低至少20％。

16.如权利要求1～15中任一项所述的方法，其中，HE对选自miRNA-126、mi-RNA-24、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p、miRNA-335、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少一种微RNA(miRNA)呈阳性。

17.如权利要求16所述的方法，其中，HE对(i)miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335和/或(ii)hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p呈阳性。

18.如权利要求16所述的方法，其中，HE对(i)miRNA-126、miRNA-24、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335和/或(ii)hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p呈阳性。

19.如权利要求16所述的方法，其中，HE对miRNA-214呈阳性。

20.如权利要求1～19中任一项所述的方法，其中，HE对选自miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-223和miRNA-142-3p的至少一种miRNA呈阴性。

21.如权利要求20所述的方法，其中，HE对miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。

22.如权利要求20所述的方法，其中，HE对miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。

23.如权利要求1～22中任一项所述的方法，其中，HE表达选自CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD144、CD34、CXCR4、CD146、Tie2、CD140b、CD90、CD271和CD105的至少一种细胞表面标志物。

24.如权利要求23所述的方法，其中，HE表达CD146、CXCR4、CD309/KDR、CD90和CD271。

25.如权利要求23所述的方法，其中，HE表达CD146。

26.如权利要求23所述的方法，其中，HE表达CD144(VECAD)。

27.如权利要求26所述的方法，其中，HE表达选自CD31、CD309/KDR(FLK-1)、PLVAP、GJA4、ESAM、EGFL7、KDR/VEGFR2和ESAM的至少一种细胞标志物。

28.如权利要求26或27所述的方法，其中，HE还表达选自SOX9、PDGFRA和EGFRA的至少一种细胞标志物。

29.如权利要求26～28中任一项所述的方法，其中，HE还表达选自KDR/VEGFR2、NOTCH4、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的至少一种细胞标志物。

30.如权利要求23所述的方法，其中，HE表达CD31/PECAM1、CD309/KDR、CD144、CD34和CD105。

31.如权利要求1～29中任一项所述的方法，其中，HE表现出有限的或检测不到的选自CD34、CXCR7、CD43和CD45的至少一种细胞表面标志物。

32.如权利要求1～31中任一项所述的方法，其中，HE表现出有限的或检测不到的CXCR7、CD43和CD45。

33.如权利要求1～31中任一项所述的方法，其中，HE表现出有限的或检测不到的CD43和CD45。

34.如权利要求1～33中任一项所述的方法，其中，HE是CD43(-)、CD45(-)和CD146(+)。

35.如权利要求1～34中任一项所述的方法，其中，多能干细胞是胚胎干细胞。

36.如权利要求1～34中任一项所述的方法，其中，多能干细胞是诱导性多能干细胞。

37.如权利要求1～36中任一项所述的方法，其中，HE通过在没有甲基纤维素的情况下将多能干细胞在附着条件下在分化培养基中培养而获得。

38.如权利要求1～37中任一项所述的方法，其中，HE通过不形成胚胎体的情况下的多能干细胞的体外分化而获得。

39.如权利要求1～38中任一项所述的方法，其中对象是人。

40.如权利要求1～39中任一项所述的方法，其中，多能干细胞是人多能干细胞。

41.如权利要求1～40中任一项所述的方法，其中HE是人HE。

42.一种组合物，包含通过多能干细胞的体外分化获得的HE，其中，HE是CD43(-)、CD45(-)和CD146(+)。

43.一种组合物，包含通过多能干细胞的体外分化获得的HE，其中，HE对选自miRNA-126、mi-RNA-24、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p、miRNA-335、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少一种微RNA(miRNA)呈阳性。

44.如权利要求43所述的组合物，其中，HE对(i)miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335和/或(ii)hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p呈阳性。

45.如权利要求43所述的组合物，其中，HE对(i)miRNA-126、miRNA-24、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335和/或(ii)hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p呈阳性。

46.如权利要求43所述的组合物，其中，HE对miRNA-214呈阳性。

47.如权利要求42～46中任一项所述的组合物，其中，HE对选自miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-223和miRNA-142-3p的至少一种miRNA呈阴性。

48.如权利要求47所述的组合物，其中，HE对miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。

49.如权利要求47所述的组合物，其中，HE对miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。

50.如权利要求43～49中任一项所述的组合物，其中，HE是CD43(-)、CD45(-)和CD146(+)。

51.一种组合物，包含通过多能干细胞的体外分化获得的HE，其中，HE表达CD144(VECAD)。

52.如权利要求51所述的组合物，其中，HE还表达选自CD31、CD309/KDR(FLK-1)、PLVAP、GJA4、ESAM、EGFL7、KDR/VEGFR2和ESAM的至少一种细胞标志物。

53.如权利要求51或52所述的组合物，其中，HE还表达选自SOX9、PDGFRA和EGFRA的至少一种细胞标志物。

54.如权利要求51～53中任一项所述的组合物，其中，HE还表达选自KDR/VEGFR2、NOTCH4、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的至少一种细胞标志物。

55.如权利要求51～54中任一项所述的组合物，其中，组合物基本上缺乏CD144(VECAD)阴性HE细胞。

56.一种药物组合物，包含通过多能干细胞的体外分化获得的HE和药学上可接受的运载体，其中，HE是CD43(-)、CD45(-)和CD146(+)。

57.一种药物组合物，包含通过多能干细胞的体外分化获得的HE和药学上可接受的运载体，其中，HE对选自miRNA-126、mi-RNA-24、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p、miRNA-335、hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p的至少一种微RNA(miRNA)呈阳性。

58.如权利要求57所述的药物组合物，其中，HE对(i)miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335和/或(ii)hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p呈阳性。

59.如权利要求57所述的药物组合物，其中，HE对(i)miRNA-126、miRNA-24、miRNA-196-b、miRNA-214、miRNA-199a-3p和miRNA-335和/或(ii)hsa-miR-11399、hsa-miR-196b-3p、hsa-miR-5690和hsa-miR-7151-3p呈阳性。

60.如权利要求57所述的药物组合物，其中，HE对miRNA-214呈阳性。

61.如权利要求57～60中任一项所述的药物组合物，其中，HE对选自miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-223和miRNA-142-3p的至少一种miRNA呈阴性。

62.如权利要求61所述的药物组合物，其中，HE对miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。

63.如权利要求61所述的药物组合物，其中，HE对miRNA-367、miRNA-302a、miRNA-302b、miRNA-302c、miRNA-223和miRNA-142-3p呈阴性。

64.如权利要求57～63中任一项所述的药物组合物，其中，HE是CD43(-)、CD45(-)和CD146(+)。

65.一种药物组合物，包含通过多能干细胞的体外分化获得的HE和药学上可接受的运载体，其中，HE表达CD144(VECAD)、CD31和CD309/KDR(FLK-1)。

66.如权利要求65所述的药物组合物，其中，HE还表达选自CD31、CD309/KDR(FLK-1)、PLVAP、GJA4、ESAM、EGFL7、KDR/VEGFR2和ESAM的至少一种细胞标志物。

67.如权利要求65或66所述的药物组合物，其中，HE还表达选自SOX9、PDGFRA和EGFRA的至少一种细胞标志物。

68.如权利要求65～67中任一项所述的药物组合物，其中，HE还表达选自KDR/VEGFR2、NOTCH4、I型胶原蛋白和IV型胶原蛋白的至少一种细胞标志物。

69.如权利要求65～68中任一项所述的药物组合物，其中，组合物基本上缺乏CD144(VECAD)阴性HE细胞。

70.如权利要求26～41中任一项所述的方法，其中，HE表达(i)CD144(VECAD)和(ii)CD31和/或CD309/KDR(FLK-1)。

71.如权利要求26～41或70中任一项所述的方法，其中，HE表达表22和表23中所列的至少一种基因。

72.如权利要求51～54中任一项所述的组合物，其中，HE表达(i)CD144(VECAD)和(ii)CD31和/或CD309/KDR(FLK-1)。

73.如权利要求51～54或72中任一项所述的组合物，其中，HE表达表22和表23中所列的至少一种基因。

74.如权利要求65～69中任一项所述的药物组合物，其中，HE表达(i)CD144(VECAD)和(ii)CD31和/或CD309/KDR(FLK-1)。

75.如权利要求65～69或74中任一项所述的药物组合物，其中，HE表达表22和表23中所列的至少一种基因。