CN116832051A - 新型抗氧化抗炎和促脂质代谢协同纳米给药系统 - Google Patents

新型抗氧化抗炎和促脂质代谢协同纳米给药系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型的共载EGCG和miR‑223的脂质体递送体系lip@EGCG/miR‑223，公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它细胞摄取效率，公开了它在基因水平和蛋白水平上上调ABCA1的效率，公开了它在体外细胞模型上抗氧化抗炎和促脂质外排作用，进一步公开了它对AS小鼠模型体内靶向性的作用、体内促脂质外排作用、抑制新生血管生成、抑制巨噬细胞蓄积以及体内抗炎作用，进而公开了它体内安全性。

Description

新型抗氧化抗炎和促脂质代谢协同纳米给药系统
技术领域
本发明涉及一种共载EGCG和miR-223的新型递送体系lip@EGCG/miR-223，及制备方法，纳米结构，属于生物医药学领域。涉及它的细胞摄取，涉及它的体外抗氧化抗炎和促脂质外排作用，涉及它上调ABCA1基因和蛋白的表达水平，进一步涉及基于ApoE-/-建立动脉粥样硬化鼠的靶向作用与生长抑制作用，涉及其组织安全性相关指标。进而公开了它作为非病毒载体在动脉粥样硬化的基因治疗药物中的应用。属于生物医药学领域。
背景技术
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性疾病，炎症是动脉粥样硬化发生和发展的重要诱因，抗氧化抗炎也是目前AS治疗的重要研究方向。
在AS炎症环境的诱导下单核细胞不断向病变部位蓄积，并且分化为巨噬细胞，炎症性巨噬细胞不断摄取被氧化的脂质而形成泡沫细胞，进而形成脂质斑块。因此，消除脂质斑块对于治疗AS具有重要意义。
表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是一种天然多酚类化合物，具有优异的抗氧化抗炎作用,有潜质成为治疗AS的重要药物。但是EGCG分子稳定性差，在储存和给药过程中容易分解而失效，此外，如何将EGCG有效递送至作用部位也是应用过程中需要解决的问题。
近年来研究发现，microRNA(miRNA)在调节脂质代谢方面具有重要作用。作为miRNA家族中的一员，miR-223可以通过上调ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassettetransporter A1,ABCA1)的水平促进脂质外排。但是裸miR-223因其分子量大和带负电的特性很难被递送至细胞内，且容易被体内核酸酶降解而失活，因此需要安全有效的载体用于miR-223的递送。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有靶向性的治疗动脉粥样硬化的基因药物递送系统：lip@EGCG/miR-223。
本发明所述的载药系统，由上调AS病变部位巨噬细胞内ABCA1水平的miR-223和具有抗氧化抗炎作用的药物表没食子儿茶素没食子酸酯的EGCG制备而成。
本发明所述的靶向基因药物递送系统，DOTAP与miR-223的质量比为1：0.75。
本发明所述的载药系统lip@EGCG/miR-223，为脂质体结构。
本发明的另一个目的在于提供载药系统lip@EGCG/miR-223的制备方法。
本发明所述的制备方法，包括以下步骤：阳离子脂质DOTAP和miR-223结合，通过优化的薄膜水化法制备脂质体。
优选的，本发明所述载药系统的制备方法，包括以下步骤：
1)制备DOTAP-miR-223复合物：取DOTAP溶于氯仿，混合后加入甲醇混匀，加入miR-223和氯仿，离心提取含有DOTAP-miR-223复合物的有机相；
2)制备lip@EGCG/miR-223：向DOTAP-miR-223复合物中加入PI、DSPE-PEG2k、吐温-80、chol和氯仿，旋蒸去除有机相，再加入EGCG旋转水化，超声得到脂质体。
进一步优选的，
步骤1)制备DOTAP-miR-223复合物：
(1)取miR-223离心，溶于DEPC水中，取DOTAP，溶于的氯仿中，混合后加入甲醇，轻轻混匀以形成单相；其中DOTAP:miR-223＝2-8:1-6,w/w；
(2)随后加入DEPC水溶液和氯仿以形成两个独立的相；
(3)离心提取，得到含有DOTAP-miR-223复合物的有机相。
步骤2)制备lip@EGCG/miR-223：向DOTAP-miR-223复合物中加入PI、DSPE-PEG2k、吐温-80、胆固醇和氯仿，旋蒸去除有机相，再加入EGCG水溶液旋转水化，超声得到脂质体。
更进一步优选的，载药系统的制备方法，包括以下步骤：
1)制备DOTAP-miR-223复合物的方法，步骤如下：
(1)取miR-223离心，溶于DEPC水中，取DOTAP(DOTAP:miR-223＝4:3,w/w比)，溶于的氯仿中，混合后加入甲醇，轻轻混匀以形成单相；
(2)室温下，摇床上孵育后，加入DEPC水和氯仿以形成两个独立的相；
(3)离心提取，得到含有DOTAP-miR-223复合物的有机相；
2)制备lip@EGCG/miR-223的方法，步骤如下：
(1)向提取的DOTAP-miR-223复合物有机相中加入PI，DSPE-PEG2k，吐温-80，chol，转入旋蒸瓶中，再加入氯仿；
(2)旋蒸以除去有机相，瓶壁上形成一层薄膜；
(3)取EGCG溶于DEPC水中，将EGCG的水溶液加入旋蒸瓶中，旋转水化，水浴超声；
(4)先过微孔滤膜，然后通过聚碳酸酯膜收集，即得脂质体。
根据实施例之一，本发明所述的载药系统，制备方法如下：
1)制备DOTAP-miR-223复合物
(1)取miR-223 0.033mg(1OD)离心2min(1500g)后，溶于200μL的DEPC水中，取DOTAP 0.044mg(DOTAP:miR-223＝4:3,w/w比)，溶于200μL的氯仿中，混合后加入400μL甲醇，轻轻混匀以形成单相。
(2)室温下，摇床上孵育30min后，加入200μL DEPC水和200μL氯仿以形成两个独立的相。
(3)以800g离心8min后，提取含有DOTAP-miR-223复合物的有机相。
2)制备lip@EGCG/miR-223
(1)向提取的DOTAP-miR-223复合物有机相中加入PI 0.117mg，DSPE-PEG2k0.167mg，吐温-80 0.167mg，chol 0.217mg，转入旋蒸瓶中，再加入1mL氯仿。
(2)40℃下旋蒸20min以除去有机相，瓶壁上形成一层薄膜。
(3)取2mg EGCG溶于1mL DEPC水中，将EGCG的水溶液加入旋蒸瓶中，旋转水化30min。水浴超声5min，然后探头超声2min(功率：25％，超3s停3s)。
(4)先过0.22μm的微孔滤膜，然后通过100nm的聚碳酸酯膜挤出10次收集制得的脂质体。
本发明的另一个目的还在于提供载药系统在制备抑制动脉粥样硬化的药物中的应用
本发明的目的还在于提供载药系统lip@EGCG/miR-223在制备体外抗氧化抗炎的药物中的应用。
本发明的目的还在于评价载药系统lip@EGCG/miR-223的药物摄取效率。
本发明的目的还在于评价载药系统lip@EGCG/miR-223的细胞毒和细胞抑制作用。
本发明的目的还在于评价载药系统lip@EGCG/miR-223上调ABCA1基因和蛋白的作用。
本发明的目的还在于评价载药系统lip@EGCG/miR-223靶向性至AS病变部位，消除脂质斑块的作用。
对说明书中出现的以下词语作进一步的解释：
EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯
miRNA：大小为21-23个核苷酸的非编码RNA
miR-223：miRNA家族中的一员
ABCA1：ATP结合盒转运蛋白A1
DOX：阿霉素
lip：liposome，脂质体
lip@EGCG/miR-223：共包载EGCG和miR-223的脂质体药物载体
DOTAP：阳离子脂质
DEPC：焦碳酸二乙酯
PI：碘化丙啶
DSPE-PEG2k：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000
chol：胆固醇
PDI：聚合物分散性指数
ELISA：酶联免疫吸附测定
Cy5：花青染料荧光标记
PBS：phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液
EDTA：乙二胺四乙酸
MTT：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐
DMSO：二甲基亚砜
Real Time-qPCR：实时定量逆转录-聚合酶链式反应
OD值：光密度值。
附图说明：
图1.lip@EGCG/miR-223的作用机制示意图。
图2.不同DOTAP负载miR-223比例的琼脂糖凝胶电泳图。
图3.lip@EGCG/miR-223的粒径和zeta电位值。
图4.lip@EGCG/miR-223的透射电镜图像.
图5.裸miR-223和lip@EGCG/miR-223对RNase A的稳定性。
图6.细胞摄取。(A)游离cy5-mir-223的细胞摄取和lip@EGCG/Cy5-miR-22染色2、4和6小时LysoTracker绿色。细胞核用Hoechst 33342染色(蓝色)。(B)根据(A)使用ImageJ(n＝3)分析Cy5强度。(C)利用ImageJ(n＝3)根据(A)进行重叠系数分析。
图7.lip@EGCG/miR-223的体外抗氧化作用。
图8.含有不同浓度EGCG的lip@EGCG/miR-223处理后的荧光图像。
图9.ELISA法检测典型炎性因子IL-1β水平。
图10.ELISA法检测典型炎性因子MCP-1水平。
图11.ELISA法检测典型炎性因子TNF-α水平。
图12巨噬细胞的ORO染色。
图13不同配方处理的Raw 264.7细胞ABCA1-mRNA水平。
图14不同配方处理的Raw 264.7细胞ABCA1蛋白水平。
图15(A)Cy5-miR-223的荧光图像。(B)lip@EGCG/Cy5-miR-223的荧光图像。
图16主动脉ORO染色
图17主动脉冷冻切片。
图18主动脉CD31免疫组化染色图像。
图19主动脉CD68免疫组化染色图像及使用ImageJ分析CD68阳性区域比例。
图20主动脉IL-1β和TNF-α免疫组化染色图像及使用ImageJ分析IL-1β和TNF-α阳性区域比例。
图21末次注射后主要脏器的H&E染色。
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明所述的产品及其制备方法作进一步阐述,但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1制备lip@EGCG/miR-223
1测定DOTAP负载miR-223比例
制备样品
将DOTAP和miR-223按照1:1.5,1:1.25,1:1,1:0.75,1:0.5的质量比混合，加入200μL甲醇混匀，室温静置30min，加入100μL氯仿和100μL DEPC水，离心(800g,8min)，吸取上层水相，待用。
实验步骤
称取0.5g琼脂糖于烧杯中，加入5mL TBE(10×)和45mL超纯水，置于微波炉内中火加热2min将琼脂糖完全溶化。稍冷却后加入GelRedTM核酸凝胶染料4μL(10000×)，搅匀，倒入电泳仪模具中，插入梳子，凝固后备用。取30mL TBE(10×)和270mL超纯水，混合均匀后倒入电泳槽中作为电泳液。取出凝固后的琼脂糖凝胶，置于电泳槽中。取不同质量比的DOTAP-miR-223储备液15μL及5μL的Loading buffer(5×)，混匀，每孔加样20μL。打开电源，将电压设置成120V，时间设置为30min。从电泳槽中取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪中观察并拍照。
实验结果
从图2中可以看出，随着DOTAP与miR-223质量比的增加，miR-223条带的强度逐渐降低，当DOTAP与miR-223的质量比为1：0.75时，miR-223的条带完全消失，这表明此时miR-223被完全阻滞到上样孔中，DOTAP完全负载miR-223。根据此结果，我们确定了DOTAP与miR-223的最佳质量比为1：
0.75，用于后续实验。
2制备DOTAP-miR-223
(1)取miR-223 0.033mg(1OD)离心2min(1500g)后，溶于200μL的DEPC水中；取DOTAP 0.044mg(DOTAP:miR-223＝4:3,w/w比)，溶于200μL的氯仿中，混合后加入400μL甲醇，轻轻混匀以形成单相；
(2)室温下，摇床上孵育30min后，加入200μL DEPC水和200μL氯仿以形成两个独立的相；
(3)以800g离心8min后，提取含有DOTAP-miR-223复合物的有机相；
3制备lip@EGCG/miR-223
(1)向提取的DOTAP-miR-223有机相中加入PI 0.117mg，DSPE-PEG2k 0.167mg，吐温-80 0.167mg，chol 0.217mg，转入旋蒸瓶中，再加入1mL氯仿；
(2)40℃下旋蒸20min以除去有机相，瓶壁上形成一层薄膜；
(3)取2mg EGCG溶于1mL DEPC水中，将EGCG的水溶液加入旋蒸瓶中，旋转水化30min。水浴超声5min，然后探头超声2min(功率：25％，超3s停3s)；
(4)先过0.22μm的微孔滤膜，然后通过100nm的聚碳酸酯膜挤出10次。收集制得的脂质体，置于4℃冰箱保存待用。
实施例2 lip@EGCG/miR-223粒径和电位的测定
实验方法
将制得的lip@EGCG/miR-223稀释5-10倍后超声半小时使其完全分散，通过纳米粒度仪测定其粒径及Zeta电位。
实验结果
从图3可以看出，制得的lip@EGCG/miR-223的粒径为91.28±2.28nm，zeta电位为-36.21±1.82mV。结果表明，根据上述方法制备的lip@EGCG/miR-223具有较小的粒径，这将使lip@EGCG/miR-223更容易靶向至AS病变部位，这是因为AS发生时，动脉内膜之间的空间比较狭窄，因此粒径小的药物系统更容易进入。此外，制备的lip@EGCG/miR-223带负电，这确保了lip@EGCG/miR-223在体内和体外都具有较高的稳定性和较小的细胞毒性。
实施例3透射电镜观察lip@EGCG/miR-223的表面形态
实验方法
将提前制备好的lip@EGCG/miR-223稀释25倍后超声使其完全分散。取磷钨酸0.2g溶于10mL蒸馏水中，配置成2％的磷钨酸溶液，并用1mol/L的NaoH溶液调pH至7。用镊子夹取一片铜网，用移液枪吸取lip@EGCG/miR-223溶液，滴一滴至铜网上，静置2-3min。然后用移液枪吸取磷钨酸染色液，滴一滴至铜网上，染色2-3min后，用滤纸吸去多余磷钨酸染液，再滴一滴蒸馏水水至铜网上洗去多余染液，重复3次。将样品置于37℃烘箱中过夜，并在透射电镜下观察并拍照。
实验结果
如图4所示，通过透射电镜观察到制得的lip@EGCG/miR-223呈圆球形，粒径在100nm左右，形态均匀。
实施例4 EGCG包封率的测定
实验方法
(1)将制得的lip@EGCG/miR-223溶液1mL加入超滤管中，稀释至4mL，超速离心30min(1600g)，然后浓缩至250μL。收集滤液，备用；
(2)称取EGCG 1mg，用蒸馏水溶解后定容至10mL，配制成浓度为0.1mg/mL的EGCG母液；
(3)精密吸取EGCG母液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.6ml于2ml容量瓶中，用纯水定容得到浓度分别为0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.08mg/ml的EGCG标准溶液；
(4)利用紫外分光光度计在波长276nm处从低浓度向高浓度分别测定其吸光度。以溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线；
(5)同样条件下测定滤液的吸光度，并通过标准曲线确定游离EGCG浓度及lip@EGCG/miR-223中的EGCG浓度，根据以下公式计算EGCG的包封率。
EE％＝(脂质体中EGCG的含量/EGCG的总含量)×100％
实验结果
表1不同浓度EGCG的吸光度
EGCG的标准曲线回归方程为y＝32.595x-0.1793(R2＝0.9997)，线性关系良好。由EGCG标准曲线和游离EGCG的吸光度求得lip@EGCG/miR-223中EGCG包封率为81.1％，表明lip@EGCG/miR-223能有效包载EGCG。
实施例5 miR-223包封率的的测定
实验方法
(1)将制得的lip@EGCG/miR-223溶液1mL加入超滤管中，稀释至4mL，超速离心30min(1600g)，然后浓缩至250μL。收集滤液，备用；
(2)取Cy5-miR-223基因0.4OD溶于40μL DEPC水中(25μM)，稀释至1ml,得到浓度为1μM的Cy5-miR-223母液；
(3)用Cy5-miR-223母液配置成浓度分别为1.25nM、2.5nM、5nM、10nM、20nM、40nM的Cy5-miR-223标准溶液，注意避光；
(4)通过荧光分光光度计测定各组浓度下Cy5-miR-223的荧光强度，并以DEPC水作为空白对照(Ex＝650nm,Em＝670nm)。以溶液浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线；
(5)同样条件下测定滤液的荧光强度，并通过标准曲线确定滤液中和lip@EGCG/Cy5-miR-223中Cy5-miR-223的浓度，根据以下公式计算Cy5-miR-223的包封率。
EE(％)＝(脂质体中miR-223/miR-223的总含量)×100％
实验结果
表2 Cy5-miR-223在不同浓度下的荧光强度
Cy5-miR-223的标准曲线回归方程为y＝65.427x-71.153(R2＝0.9997)，线性关系良好。由Cy5-miR-223的标准曲线和游离Cy5-miR-223的荧光强度求得lip@EGCG/Cy5-miR-223中Cy5-miR-223包封率为98.8％，表明lip@EGCG/miR-223能有效包载miR-223。
实施例6 lip@EGCG/miR-223抗RNase A稳定性实验
1 RNase A对miR-223降解性实验
实验方法
(1)将1OD(33μg)miR-223离心2min(1500g)后小心打开，用250μLDEPC水将miR-223充分溶解，配置成10μmol/L的溶液。称量5.6mg的EDTA溶解于3mL的水中，配置成5mM的EDTA溶液。用DEPC水配制浓度为0.8mg/mL的肝素钠溶液；
(2)吸取7.5μL的miR-223(1μg)加至离心管中，再加入7.5μL的RNase A溶液(10μg/mL)及5mL的Loading buffer(5×)，充分混合均匀后，分别在反应0min、5min、15min、30min、45min、60min后，加入EDTA溶液以
终止RNase A对miR-223的降解；
(3)将各个时间点的样品用移液枪点在琼脂糖凝胶加样孔中，每孔上样20μL，进行电泳。设置电泳条件为：电压120V，时间30min；
(4)电泳结束后，在电泳成像仪中观察并拍照。
2 lip@EGCG/miR-223抗RNase A降解性实验
实验方法
(1)吸取7.5μL lip@EGCG/miR-223水溶液(含miR-223 1μg)加至离心管中，再加入7.5μL RNase A溶液(10μg/mL)及5mL的Loading buffer(5×)，充分混合均匀；
(2)分别在反应0h、0.5h、1h、1.5h、2h、4h、6h后，加入EDTA溶液以终止RNase A对miR-223的降解，然后加入20μL肝素钠溶液，置于37℃烘箱内反应30min以取代lip@EGCG/miR-223载体中的miR-223；
(3)将各个时间点的样品用移液枪点在琼脂糖凝胶加样孔中，每孔上样20μL，进行电泳。设置电泳条件为：电压120V，时间30min；
(4)电泳结束后，在电泳成像仪中观察并拍照。
实验结果实验结果由图5可以看出，未经载体负载的游离的miR-223在与RNase A作用5min内荧光条带已经消失，表明此时miR-223被RNase A全部降解，而经lip@EGCG/miR-223负载后的miR-223在与RNase A混合6h时，仍能观察到明亮的荧光条带，证明lip@EGCG/miR-223可以有效负载miR-223，并使miR-223不被核酸酶降解，对miR-223起到很好的保护作用。
实施例7激光共聚焦实验考察lip@EGCG/miR-223细胞摄取情况和溶酶体逃逸能力
1 lip@EGCG/miR-223细胞摄取情况
实验方法
选择处于对数生长期的RAW 264.7细胞，以2×105个/mL的密度接种于激光共聚焦小皿中(1mL)，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育12h。待细胞贴壁后，弃去培养基，分别加入Naked Cy5-miR-223含药培养基(阴性对照组)和lip@EGCG/Cy5-miR-223含药培养基(给药组)，转染0、2、4、6h。弃去各含药培养基，用PBS缓冲液清洗三次后，向两组激光共聚焦小皿中各加入Hoechst 33342工作液1mL，染色15min后弃去染色液，用PBS缓冲液清洗三次，然后在每皿中加入少量PBS缓冲液防止细胞风干。在激光共聚焦显微镜下观察细胞摄取情况。
2 lip@EGCG/miR-223溶酶体逃逸能力的考察
实验方法
选择处于对数生长期的RAW 264.7细胞，以2×105个/mL的密度接种于激光共聚焦小皿中(1mL)，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育12h。待细胞贴壁后，弃去培养基，分别加入Naked Cy5-miR-223含药培养基(阴性对照组)和lip@EGCG/Cy5-miR-223含药培养基(给药组)，转染0、2、4、6h。弃去各含药培养基，用PBS缓冲液清洗三次后，向两组激光共聚焦小皿中各加入LysoTracker Green工作液1mL，染色30min后弃去染色液，用PBS缓冲液清洗三次，然后在每皿中加入少量PBS缓冲液防止细胞风干。在激光共聚焦显微镜下观察溶酶体逃逸情况。
实验结果
由图6可以看出，随着孵育时间的增加，游离Cy5-miR-223和lip@ECGC/Cy5-miR-223处理组中Cy5的红色荧光均增加。然而，在4h和6h时，lip@EGCG/Cy5-miR-223组的红色荧光强度明显高于游离Cy5-miR-223组，如图6B ImageJ分析的结果一样。此外，还通过ImageJ分析了miR-223和溶酶体的重叠系数。图6C所示，对于游离Cy5-miR-223处理组，重叠系数一直较低且随着实验时间的延长略有增加，表明游离miR-223很难被细胞摄取且会被困在溶酶体中。lip@EGCG/Cy5-miR-223组的重叠系数在2h时相对较高，但在4h和6h时显著降低。这表明lip@EGCG@Cy5-miR-223被溶酶体摄取，并能快速从溶酶体中逃逸。结果表明，lip@EGCG/miR-223不仅可以有效将miRNA递送到细胞中，还可以促进miRNA从溶酶体中逃逸，在细胞质中发挥基因治疗作用。
实施例8 lip@EGCG/miR-223体外抗氧化抗炎作用考察
1溶液水平抗氧化作用的考察
实验方法
用2mL甲醇将lip@EGCG/miR-223配制成浓度分别为0μg/mL,10μg/mL,20μg/mL,50μg/mL,100μg/mL和200μg/mL的溶液(按EGCG计算)，然后加入1mL新鲜配制的DPPH·溶液(100μg/mL)，在室温下黑暗环境中反应30min。随后，用紫外分光光度计测定517nm处的吸光度，根据以下公式计算DPPH·清除率(I)。
Ao：未加待测溶液时DPPH·的吸光度
Aj：待测溶液的吸光度
Ai：加入待测溶液后DPPH·的吸光度
实验结果由图7可知，DPPH·的清除速率随着lip@EGCG/miR-223中EGCG浓度的增加而增加。同样，DPPH·甲醇溶液的颜色随着EGCG浓度的增加而逐渐变浅，最后由紫色变为淡黄色，这表明lip@EGCG/miR-223表现出优异的DPPH自由基清除能力。
2细胞水平抗氧化作用的考察
实验方法
(1)配制实验试剂
完全培养基：向450mL的DMEM培养基中加入50mL的胎牛血清(FBS)和5mL双抗(青霉素和链霉素)混和均匀后，分装至50mL离心管中，密封后于4℃保存备用。
不完全培养基：取50mL DMEM培养基于50mL离心管中，密封后于4℃保存备用。
胰酶：将胰酶分装至10mL/份,密封后置于-20℃保存备用。
PBS缓冲液：按照说明将PBS粉末用超纯水配制成pH 7.4的PBS缓冲液，高压灭菌后，分装至50mL离心管中，密封后于4℃保存备用。
LPS母液：按照说明用新鲜DMEM培养基将LPS配制成浓度为500μg/mL的溶液。
DCFH-DA溶液：按照说明用无血清DMEM培养基将DCFH-DA稀释成50μM的溶液。
(2)配制给药溶液
阴性对照组：不加LPS，不加药，加相同体积的空白培养基
阳性对照组：加LPS，不加药
低浓度实验组：LPS+lip@EGCG/miR-223(10μg/mL)
中浓度实验组：LPS+lip@EGCG/miR-223(50μg/mL)
高浓度实验组：LPS+lip@EGCG/miR-223(100μg/mL)
(3)在12孔板中，以2×105个/孔的密度接种并在37℃培养箱中培养RAW264.7细胞12h，待其贴壁后，小心吸取各孔中的培养基，对五个组分别进行如下处理：阴性对照组加入1mL空白培养基；除阴性对照组外，其余各组每孔中加入40μL的LPS母液(500μg/mL)，再添加DMEM培养基至1mL，使LPS最终浓度为20μg/mL。将细胞放入37℃培养箱中孵育。8h后，吸去各孔中的细胞培养基，然后在阴性对照组和阳性对照组中各加入1mL空白培养基，在低浓度实验组、中浓度实验组和高浓度实验组中分别加入含EGCG 10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL的lip@EGCG/miR-223溶液，在37℃细胞培养箱中孵育。4h后，吸去各孔中细胞培养基，用PBS清洗一遍，在各组中分别加入提前用无血清DMEM培养基稀释过的50μM的DCFH-DA溶液1mL，孵育30min。弃去含有DCFH-DA的细胞培养基，用PBS清洗三遍后，于每孔中加入1mL PBS浸润，然后通过荧光倒置显微镜观察各组细胞的荧光强度并拍照记录。
实验结果
如图8所示，与阴性对照组相比，用LPS刺激过的细胞(阳性对照组)的荧光强度显著增强，这表明氧化应激模型构建成功。此外，随着lip@EGCG/miR-223中EGCG浓度的升高，巨噬细胞内荧光强度逐渐减弱，当EGCG浓度增加到100μg/mL时，荧光强度最弱，与阴性对照组的荧光强度相似，表明lip@EGCG/miR-223有效降低了巨噬细胞中ROS的产生，并存在浓度依赖性，也从侧面表明lip@EGCG/miR-223具有优异的抗氧化能力。
3体外抗炎作用的考察
实验方法
(1)配制实验试剂
完全培养基：向450mL的DMEM培养基中加入50mL的胎牛血清(FBS)和5mL双抗(青霉素和链霉素)。充分混匀后，分装至50mL离心管中，密封后于4℃保存备用。
不完全培养基：取50mL DMEM培养基于50mL离心管中，密封后于4℃保存备用。
胰酶：将胰酶分装至10mL/份,密封后置于-20℃保存备用。
PBS缓冲液：将PBS粉末按照说明书用蒸馏水溶解，配成PBS缓冲液，高压灭菌后，分装至50mL离心管中，密封后于4℃保存备用。
LPS母液：按照说明用新鲜DMEM培养基将LPS配制成浓度为500μg/mL的溶液。
(2)配制给药溶液
阴性对照组：不加LPS，不加药，加相同体积的空白培养基
阳性对照组：加LPS，不加药
实验组a：LPS+游离EGCG(100μg/mL)
实验组b：LPS+lip@EGCG(100μg/mL)
实验组c：LPS+lip@EGCG/miR-223(100μg/mL)
(3)细胞转染
按之前细胞培养方法培养RAW 264.7细胞，取处于对数生长期的细胞，胰酶消化后用细胞计数板计数，稀释成2×105个/mL的细胞悬液备用。吸取细胞悬液0.5mL加入到提前准备好的24孔板中，使每孔中细胞个数为1×105个。将24孔板放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育12h，待其贴壁后，准备给药。小心吸取各孔中的培养基，对五个组分别进行如下处理(每组设置3个复孔)：阴性对照组加入0.5mL空白培养基；除阴性对照组外，其余各组每孔中加入20μL的LPS母液(500μg/mL)，再添加DMEM培养基至0.5mL，使LPS最终浓度为20μg/mL。将细胞放入37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育。8h后，吸去各孔中的细胞培养基，然后在阴性对照组和阳性对照组中各加入0.5mL空白培养基，在实验组a、实验组b和实验组c中各加入含EGCG浓度为100μg/mL的游离EGCG、lip@EGCG和lip@EGCG/miR-223溶液。在37℃、5％CO2的细胞培养箱中孵育6h，使药物充分转染细胞。6h后，吸出各孔含药培养基备用，替换成等体积的DMEM完全培养基，继续培养42h。将各孔中含药培养基转移至15mL离心管中，离心(1000rpm，4℃，5分钟)，取上清液，通过ELISA测定上清液中典型炎症细胞因子的水平，包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)
(4)细胞总蛋白的提取与测定
总蛋白提取：以下所有操作均置于冰上进行。
待转染结束后，用移液枪将24孔板各孔内的细胞悬液吸去，然后用事先保存在4℃冰箱的PBS缓冲溶液清洗3次后，在每孔中加入0.5mL预冷的PBS缓冲溶液。用细胞刮刀小心地刮下细胞，将刮下的含有细胞的PBS溶液转移至1.5mL无酶离心管中离心，设置离心条件为3000rpm，4℃，5min。离心完成后，弃去上清液，并于每管中加入125μL的RIPA裂解液，涡旋振荡混合均匀后，再置于冰上充分反应30分钟。反应完全后，离心，设置离心条件为12000rpm，4℃，10min。离心完成后，小心吸取上清液转移至1.5mL无酶离心管中，置于-80℃冰箱中保存，备用。
牛血清蛋白(BCA)法测定总蛋白浓度：
蛋白标准品的准备:将1.2mL蛋白标准品制剂加入到一管蛋白标准品(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/mL的蛋白标准溶液，进一步稀释成浓度为0.5mg/mL的终溶液。
BCA工作液的配制:取BCA试剂盒中的10mL工作液A和0.2mL工作液B混合(体积比50:1)，配制BCA工作液备用。BCA工作液在24小时内稳定。蛋白浓度的检测：
a.将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μL，相当于标准品浓度分别为0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL。
b.加20μL样品到96孔板的样品孔中。
c.各孔加入200μL BCA工作液，37℃培养箱放置30min。
d.反应结束后使用酶标仪测定各孔在562nm处的OD值。
e.根据标准曲线计算出样品的总蛋白浓度。
(5)ELISA法测定炎症因子的浓度
检测前的准备工作：
1)将试剂盒从冰箱中取出，于室温条件下放置20min。
2)配制洗涤液：将洗涤液(20×)用双蒸水稀释至1×。
3)标准品的稀释：
IL-1β：将标准品稀释成120、60、30、15、7.5、0pg/mL共六个标准品浓度；
MCP-1：将标准品稀释成24、12、6、3、1.5、0pg/mL共六个标准品浓度；
TNF-α：将标准品稀释成2000、1000、500、250、125、62.5pg/mL共六个标准品浓度。
洗涤方法：
每孔洗涤液为300μL，注入30s后吸出，洗板5次，最后一次洗板完成后将板倒扣在厚吸水纸上适当用力拍干。
操作步骤：
加样：设置标准品孔、样品孔和空白孔。标准品中格各加入不同浓度的标准品50μL，样品孔加入待测样品10μL，再加入样品稀释液40μL，再(样品最终稀释度为五倍)。空白孔加入样本稀释液50μL(空白孔不加样品及酶标试剂)，加样将样品加于酶孔板底部，尽量不要接触到孔壁，轻轻摇匀。
加酶：每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体100μL，空白孔除外。
温育：用封板膜封板后，置于37℃恒温箱中温育60min。
洗涤：揭掉封板膜，将液体倒掉，每孔加满洗涤液(350μL)，静置30s后倒去，如此重复5次，拍干。
显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃恒温箱中避光孵育15min。
终止：每孔加入终止液50μL，终止反应(此时蓝色立即转为黄色)。
测定：以空白孔调零，在450nm波长处依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min内进行。
实验结果
表3 BCA标准品的OD值(n＝3)
表4不同蛋白样品的总浓度(n＝3)
表5 IL-1β标准品OD值。(n＝3)
表6 mcp-1标准品的OD值。(n＝3)
表7 TNF-α标准品OD值。(n＝3)
表8 IL-1β相对水平。(n＝3)
/>
表9 MCP-1相对水平。(n＝3)
表10 TNF-α相对水平。(n＝3)
采用ELISA法测定了三种典型炎性细胞因子(IL-1β、MCP-1和TNF-α)的水平。首先用BCA法检测了各组样品细胞的总蛋白浓度，结果如表4所示，然后利用ELISA试剂盒测定了各组三种典型炎症因子(IL-1β、MCP-1和TNF-α)的相对水平，结果如图9-11所示，与阴性对照组相比，阳性对照组炎症因子水平显著升高，表明炎症模型构建成功。而当用lip@EGCG或lip@EGCG/miR-223治疗时，炎症因子的水平显著减少。与阳性对照相比，lip@EGCG组的IL-1β、MCP-1和TNF-α的相对水平分别为0.624、0.880和0.312，相对低于游离EGCG组。表明当EGCG被包封在脂质体中时，抗炎作用得到改善，这可能是由于脂质体的保护增强了RAW264.7细胞的摄取。lip@EGCG/miR-223组的炎症因子水平分别为0.562、0.744和0.212，表明与miR-223共载对动脉粥样硬化有更好的治疗效果。这些结果表明，lip@EGCG/miR-223在体外具有优异的抗炎作用。
实施例9 lip@EGCG/miR-223体外促脂质外排作用考察
实验方法
(1)配制给药溶液
阴性对照组：不加ox-LDL，不加药，加相同体积的空白培养基
阳性对照组：加ox-LDL，不加药
实验组a：ox-LDL+游离miR-223(10μg/mL)
实验组b：ox-LDL+lip@miR-223(10μg/mL)
实验组c：ox-LDL+lip@EGCG/miR-223(10μg/mL)
上述实验组中lip@EGCG/miR-223的浓度按miR-223计算。
(2)在12孔板中，以2×105个/孔的密度接种并在37℃培养箱中培养RAW 264.7细胞12h，待其贴壁后，小心吸取各孔中的培养基，对五个组分别进行如下处理：阴性对照组加入1mL空白培养基；除阴性对照组外，其余各组每孔中加入含氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)25μg/mL的DMEM培养基1mL。将细胞放入37℃培养箱中孵育。48h后，吸去各孔中的细胞培养基，然后在阴性对照组和阳性对照组中各加入1mL空白培养基，在实验组a、实验组b和实验组c中各加入含miR-223浓度为10μg/mL的游离miR-223、lip@miR-223和lip@EGCG/miR-223溶液，在37℃细胞培养箱中孵育8h。吸去各孔中的含药培养基，用PBS清洗一遍，分别加入4％组织细胞固定液1mL进行固定，4℃孵育30min，然后以PBS清洗三遍，加入稀释的油红O溶液1mL，室温孵育20min后再用PBS清洗一遍，分别加入1mL PBS缓冲液浸润细胞，荧光显微镜明场下进行拍照观察。
实验结果
由图12可以看出，在阴性对照组的细胞中染色最浅，而在阳性对照组的细胞中染色最深，表明经ox-LDL诱导后产生了大量的泡沫细胞，显著增加了RAW 264.7细胞中的脂质摄取水平。游离miR-223组抑制泡沫细胞形成的能力有限，而lip@miR-223组和lip@EGCG/miR-223组泡沫细胞明显减少，且两组抑制泡沫细胞形成的能力相似，表明EGCG和miR-223的共递送对miR-223的治疗效果没有影响。总的来说，lip@EGCG/miR-223可以通过抑制泡沫细胞的形成来发挥促进脂质外排效果。
实施例10 lip@EGCG/miR-223在基因水平上上调ABCA1的效率评价
实验方法
(1)配置给药溶液
阴性对照组：加相同体积的空白培养基
阳性对照组：Lipo/miR-223(2μg/mL)
实验组a：游离miR-223(2μg/mL)
实验组b：lip@EGCG/miR-223(2μg/mL)
上述实验组中lip@EGCG/miR-223的浓度按miR-223计算。
(2)细胞转染
在37℃、5％CO2培养箱中培养RAW 264.7细胞，取处于对数生长期的细胞，消化后使用细胞计数板计数，使细胞浓度为2×105个/mL，用移液枪吸取1mL备用的细胞悬浮液加入到12孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞孵育箱中培养12h，待其贴壁后，准备给药。小心吸出原有细胞培养基。分别加入配制好的各组含药培养基1mL。阴性对照组只加入相同体积的完全培养基。放入37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，使药物充分转染细胞。6h后，小心吸去各孔中的含药培养基，PBS清洗两遍后，换成等体积的完全培养基，继续放入37℃、5％CO2培养箱中孵育42小时。
(3)RNA提取与浓度测定
RNA提取时操作台界面需要使用RNA酶清除剂擦拭干净，整个操作过程需要使用无酶枪头。
转染结束后，从细胞培养箱中取出12孔板，小心吸去细胞培养基，每孔中加入1mLTrizol裂解液，吹打均后，转移到无酶EP管中，再静置10min，使细胞完全裂解。用移液枪吸取0.1mL氯仿至无酶EP管中，剧烈振摇15s，室温下静置3min后，离心15min(4℃，12000rpm)。小心吸取上层的水相转移到另一个无酶EP管中，每管加入0.25mL异丙醇，混合均匀后，室温静置10分钟，然后离心(4℃，12000rpm)15min，可见RNA白色沉淀在EP管底部。弃去上清液，加入0.5mL 75％的乙醇来洗涤RNA沉淀，混匀后，离心(4℃，12000rpm)15min，重复洗涤三次，弃去上清液，晾干备用。吸取30μL DEPC水复溶RNA，吹打均匀并超声使RNA完全溶解，55℃水浴15分钟，冷却至室温后，转移至无酶EP管中，置于-80℃冰箱中保存。采用Nanodrop-1000测定总RNA浓度，首先用DEPC水校正，校正后吸取2μL RNA溶液滴在上样池中，选择核酸RNA-measure测定OD260/OD280值和浓度值。
(4)逆转录并测定cDNA浓度
逆转录RNA上样量为2μg，由已知的RNA浓度，计算出逆转录所需的RNA上样体积。试剂盒中提供的基因特异性逆转录引物是10μM的储存液，使用时稀释10倍成1μM逆转录引物工作液。分别将10μM目标基因逆转录引物储存液和10μM内参逆转录引物(GAPDH)储存液用无酶水稀释至2μM，两种引物等比混合成1μM逆转录工作液。在无RNase的离心管中混合下列试剂进行预变性：
加热70℃，5min后，马上置于冰盒上；按照下表提供的20μL逆转录反应体系混合下列其他试剂：
运行mRNA逆转录程序：42℃45分钟，85℃5分钟，4℃保存。逆转录反应85℃5分钟结束后立即将cDNA产物取出，快速置冰上冷却。设定PCR上样量为50ng，同测定RNA浓度的方法，使用Nano drop1000测定逆转录得到的cDNA浓度，稀释cDNA溶液到25ng/μl。混匀cDNA并且从中吸取2μL(20μL体系)作为定量PCR的模板。
(5)Real Time-PCR扩增
使用前混匀并低速离心，确保2×Real-time PCR Master Mix、50×ROXReferenceDye、引物、模板完全溶解，所有的试剂都在管底或板孔底部。置于冰上进行Real Time PCR反应液的配制：
实时定量PCR反应程序
以GAPDH为内参，运用2-ΔΔCt法相对定量各组mRNA的量。实验结果通过SPSS软件进行统计学检验，采用配对样本的t检验对样品组和实验组进行统计学分析。上述实验重复3次。
实验结果
表11不同样品的总RNA浓度(n＝3)
表12不同样品的cDNA浓度(n＝3)
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表13不同样品ABCA1-mRNA相对水平(n＝3)
由图13可以得出，游离miR-223组与对照组相比，ABCA-mRNA的相对水平没有显著性差异，而lip@EGCG/miR-223组和Lipo/miR-223与对照组相比，均有显著性差异，表明游离miR-223上调ABCA-mRNA的水平有限，lip@EGCG/miR-223和Lipo/miR-223均能有效上调ABCA1-mRNA的表达，且上调效率分别为226.7％±8.9％和188.4％±18.4％。
实施例11 lip@EGCG/miR-223在蛋白水平上上调ABCA1的效率评价
实验方法
(1)配制给药溶液
阴性对照组：加相同体积的空白培养基
阳性对照组：Lipo/miR-223(2μg/mL)
实验组a：游离miR-223(2μg/mL)
实验组b：lip@EGCG/miR-223(2μg/mL)
上述实验组中lip@EGCG/miR-223的浓度按miR-223计算。
(2)细胞转染
在37℃、5％CO2培养箱中培养RAW 264.7细胞，取处于对数生长期的细胞，消化后使用细胞计数板计数，使细胞浓度为1×105个/mL，等待备用。用移液枪吸取0.5mL备用的细胞悬浮液加入到24孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞孵育箱中培养12h，待其贴壁后，准备给药。小心吸出原有细胞培养基，注意枪头不要触碰到板底部，否则容易造成细胞数量误差。分别加入配制好的各组含药培养基0.5mL。阴性对照组只加入相同体积的完全培养基。放入37℃、5％CO2培养箱中孵育6h，使药物充分转染细胞。6h后，小心吸去各孔中的含药培养基，PBS清洗两遍后，换成等体积的完全培养基，继续放入37℃、5％CO2培养箱中孵育42小时。
(3)按照前述方法提取细胞总蛋白
(4)ELISA法测定ABCA1的浓度
试剂盒从冰箱中取出后应置于室温(25-28℃)平衡20mi。配制洗涤液：将洗涤液(20×)用双蒸水稀释至1×。取5个洁净的1.5mL的离心管，每管预先加入150μL的标准品稀释液，并将400pg/mL的原倍标准品进行倍比稀释，最终得到200、100、50、25、12.5、共五个标准品浓度。计算并确定一次实验所需的预包被板条数。
加样：设置标准品孔、样品孔和空白孔。标准品中格各加入不同浓度的标准品50μL，样品孔中先加入样品稀释液40μL，再加入待测样品10μL(样品最终稀释度为五倍)。空白孔加入样本稀释液50μL(空白孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)，加样将样品加于酶标板孔底部。
温育：用封板膜封板后，置于37℃恒温箱中温育30min。
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
加酶：每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体50μL，空白孔除外。
温育：用封板膜封板后，置于37℃恒温箱中温育30min。
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。
显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃恒温箱中避光孵育10min。
终止：每孔加入终止液50μL，终止反应(此时蓝色立即转为黄色)。
测定：以空白孔调零，在450nm波长处依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15min内进行。
实验结果
表14不同样品的总蛋白浓度(n＝3)
表15 ABCA1标准品的OD值。(n＝3)
表16 ABCA1相对水平。(n＝3)
结果如图14所示，游离miR-223组与对照组相比，ABCA-protein的相对水平没有显著性差异，而lip@EGCG/miR-223组和Lipo/miR-223与对照组相比，均有显著性差异，表明游离miR-223上调ABCA-protein的水平有限，lip@EGCG/miR-223和Lipo/miR-223均能有效上调ABCA-protein的表达，且上调效率分别为276.1％±17.8％和272.3％±17％，两者作用效果相当。
实施例12 lip@EGCG/miR-223体内靶向性考察
实验方法
(1)AS小鼠模型的建立
订购约8周龄的ApoE-/-小鼠，以高脂饲料(20％脂肪，20％糖和1.25％胆固醇)喂养8周，然后采用尾静脉注射的方式给药，每四天给药一次，共给药五次，11周后处死。
(2)实验分组
本实验采用Cy5荧光染料对miR-223进行标记，并注意避光保存。
阴性对照组：每只小鼠以1mg/kg的Cy5-miR-223给药量注射游离Cy5-miR-2230.2mL；
实验组：每只小鼠以1mg/kg的Cy5-miR-223给药量注射lip@EGCG/Cy5-miR-2230.2mL。
(3)AS小鼠荧光成像实验
阴性对照组和实验组AS小鼠尾静脉分别注射Cy5-miR-223和lip@EGCG/Cy5-miR-223，给药8h后，对小鼠采取腹腔注射0.2ml 10mg/ml的水合氯醛氯化钠溶液处死，然后对小鼠进行解剖，分离主动脉和心、肝、脾、肺、肾，通过荧光成像系统成像，进行拍照，观察药物分布，并选择主动脉、肾脏区域进行荧光强度的测定。
实验结果
表17 Cy5-miR-223和lip@EGCG/Cy5-miR-223处理器官的荧光强度
结果从图15中可以看出：在游离Cy5-miR-223组中，荧光主要集中在肾脏中，而在其他器官中几乎不可见。然而，lip@EGCG/Cy5-miR-223组中，肾脏以及心脏和主动脉中均可观察到强烈的荧光强度。这表明游离的Cy5-miR-223主要经肾脏排泄，而几乎不能进入AS病变部位发挥治疗效果，而经脂质体包载的Cy5-miR-223可以有效地在AS病变部位蓄积。
从表中可以看出：游离Cy5-miR-223组心脏和主动脉/肾脏的荧光强度比值为6.27％，而lip@EGCG/Cy5-miR-223组心脏和主动脉/肾脏的荧光强度比值高达66.1％，表明经脂质体包载后的Cy5-miR-223在心脏和主动脉的分布比例显著提高，也表明了lip@EGCG/Cy5-miR-223可以有效递送至AS病变部位。
实施例13 lip@EGCG/miR-223体内药效学考察
实验方法
(1)AS模型小鼠的建立
订购约8周龄的ApoE-/-小鼠，以高脂饲料(20％脂肪，20％糖和1.25％胆固醇)喂养8周，然后采用尾静脉注射的方式给药，每四天给药一次，共给药五次，11周后处死。
(2)实验分组
对照组：每只小鼠注射0.2mL 5％葡萄糖溶液；
游离miR-223+EGCG组：每只小鼠注射0.2mL miR-223与EGCG的混合溶液(miR-223给药量为1mg/kg，EGCG给药量为10mg/kg)；
实验组：每只小鼠以1mg/kg的Cy5-miR-223给药量注射lip@EGCG/Cy5-miR-2230.2mL。
(3)主动脉油红O染色实验
解剖小鼠时，先灌注20ml的PBS溶液，排除血管中的血液，再灌注20ml的4％多聚甲醛以固定血管组织，然后分离与心脏相连的主动脉，将主动脉保存在4％多聚甲醛中，于4℃放置固定2天。用精细镊子剔除主动脉外附着的组织，清洗主动脉。配制油红O染液：0.2g油红O加40ml异丙醇溶解得到油红O溶液，以油红O溶液∶超纯水＝3∶2配制10ml油红O工作液，过0.45μm的滤膜待用。用精细剪刀将主动脉纵向打开，用昆虫针固定，在血管内侧表面滴加2ml油红O工作液，使血管浸泡在染液中，室温下染色30min。弃去染液，用70％乙醇分化血管，清洗血管至未被染色的组织变透明。将染色的血管平铺在滤纸上，拍照。
(4)油红O切片染色实验
4％多聚甲醛固定后的已脱水组织于恒冷箱内切片，厚5μm。用60％的异丙醇清洗切片。在密闭容器内使用油红O染液避光染色15min。用60％的异丙醇清洗以除去多余的染液，水洗三次。苏木素染液染细胞核2min。水洗至细胞核蓝化5-10min。擦去多余水分，甘油明胶封固。取景拍照，脂类物质为红色，细胞核为蓝色。
(5)免疫组化染色实验
石蜡切片脱蜡至水：将三组的切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85％乙醇5min-75％乙醇5min，然后用蒸馏水清洗。
抗原修复：将组织切片放入盛满EDTA抗原修复缓冲液(pH8.0)的修复盒中，并置于蒸锅内进行抗原修复。温度达到95℃后计时30min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切片不能干燥。自然冷却后，将载玻片放入PBS(pH7.4)中，在脱色摇床上摇晃洗涤3次，每次洗涤5min。
阻断内源性过氧化物酶：将切片放入3％过氧化氢溶液中，室温下孵育10min。
画圈：将载玻片放入PBS(pH7.4)中，在脱色摇床上摇晃洗涤3次，每次5min，切片稍微干燥后用组化笔在组织周围画圆圈(防止抗体流走)。
血清封闭:在圆圈内滴加5％BSA，并于室温下孵育30min。
加一抗：弃去BSA溶液，在切片上滴加用PBS配好的一抗，将切片置于潮湿的容器内，然后放入4℃冰箱过夜。(潮湿容器中加少量水防止抗体蒸发)。
加二抗：将载玻片放入PBS(pH7.4)中在脱色摇床上摇晃洗涤3次，每次5min，切片稍微干燥后滴加与一抗匹配的二抗(GoatAnti-Rabbit IgG/Bio)，室温条件下孵育1h。
洗涤：将载玻片放入PBS(pH7.4)中在脱色摇床上摇晃洗涤3次，每次5min。
孵育HRP：切片稍微干燥后滴加稀释后的Streptavidin/HRP antibody覆盖组织，室温条件下孵育30min。
洗涤：将载玻片放入PBS(pH7.4)中在脱色摇床上摇晃洗涤3次，每次5min。
DAB显色：去除PBS液，每张切片加50-200μL新鲜配制的DAB溶液，显微镜观察。
复染核：显色完全后，用蒸馏水冲洗，然后用苏木素复染，1％盐酸酒精分化，再用蒸馏水冲洗，氨水返蓝，蒸馏水冲洗。
透明、封片：切片经过95％乙醇Ⅰ中脱水5min，95％乙醇Ⅱ中脱水5min，无水乙醇Ⅰ中脱水5min，无水乙醇Ⅱ中脱水5min，二甲苯Ⅰ中透明5min，二甲苯Ⅱ中透明5min，中性树胶封固。
拍照：切片于显微镜下观察并采集图像(苏木素染出来的细胞核为蓝色，阳性表达为棕黄色)。
实验结果
体内促脂质外排作用如图16、17所示，对照组具有较大的ORO染色区域，表明经高脂肪喂养过的小鼠主动脉形成了明显的脂质斑块。相比之下，游离EGCG+miR-223组斑块面积略有减少，而lip@EGCG/miR-223组斑块面积显著减少。游离的EGCG和miR-223治疗动脉粥样硬化的效果有限，因为EGCG分子不稳定，而且口服利用率低，而裸miR-223难以进入细胞中且容易被核酸酶降解，而被脂质体包载的EGCG和miR-223可以克服这个缺点，更好地发挥AS治疗作用。这些结果表明，lip@EGCG/miR-223能通过促进脂质外排作用抑制动脉粥样硬化斑块的进展。
体内促血管正常化作用从图18可以看出，对照组以及游离EGCG和miR-223处理组CD31染色水平显着高于lip@EGCG/miR-223处理组。而且与lip@EGCG/miR-223组相比，对照组观察到更多的微血管生成。这些结果证明lip@EGGC/miR-223可以通过抑制新生血管形成来促进血管的正常化。
lip@EGCG/miR-223的体内作用机制根据图19、20得知，与对照组和游离EGCG和miR-223组相比，lip@EGCG/miR-223组在主动脉血管中显示出最低水平的巨噬细胞。结果表明，lip@EGCG/miR-223可以有效降低巨噬细胞的数量，防止巨噬细胞的蓄积。与对照组和游离EGCG+miR-223组相比，lip@EGCG/miR-223组显著降低了IL-1β和TNF-α的表达，这表明lip@EGCG/miR-223表现出优异的抗炎活性。由于动脉粥样硬化已被广泛报道为一种慢性炎症性疾病，lip@EGCG/miR-223的突出抗炎作用使其成为治疗AS的很有前景的药物。
实施例15 lip@EGCG/miR-223体内安全性考察
实验方法
(1)AS模型小鼠的建立
订购约8周龄的ApoE-/-小鼠，以高脂饲料(20％脂肪，20％糖和1.25％胆固醇)喂养8周，然后采用尾静脉注射的方式给药，每四天给药一次，共给药五次，11周后处死。
(2)实验分组
对照组：每只小鼠注射0.2mL 5％葡萄糖溶液；游离miR-223+EGCG组：每只小鼠注射0.2mL miR-223与EGCG的混合溶液(miR-223浓度为1mg/kg，EGCG浓度为10mg/kg)；
实验组：每只小鼠注射0.2mL含miR-223浓度为1mg/kg的lip@EGCG/miR-223。
(3)AS小鼠器官病理组织学考察
本实验采用苏木精-伊红(HE)染色法，对AS小鼠体内各重要器官进行病理组织学观察。
取材与固定：将三组小鼠取出的心、肝、脾、肺、肾，清洗干净后，完全浸入到预先配置好的组织固定液中固定24h，以保持组织本来的形态结构。
脱水透明：蒸馏水冲洗三次，每次10min，然后用梯度乙醇作为脱水剂脱去组织切片中的水分，70％乙醇中脱水2h，80％乙醇中脱水2h，90％乙醇中脱水1h，100％乙醇中脱水1h。然后将组织切片依次浸泡于三个二甲苯中30min。
浸蜡包埋：将各组切片置于石蜡中浸泡1h，使石蜡充分进入组织切片内。
切片：将预冷的蜡块固定在石蜡切片机上，利用石蜡切片机对各蜡块进行连续切片，每片厚度5μm。用镊子夹起石蜡片，以正面放入展片箱中，其水温45℃左右。将石蜡片粘附于载玻片上，放在空气中稍微晾干，再置于60℃烤片机上烤2h，等待染色。
脱蜡至水：将石蜡切片放入二甲苯Ⅰ中10min-二甲苯Ⅱ中10min-二甲苯Ⅲ中10min-无水乙醇Ⅰ中5min-无水乙醇Ⅱ中5min-90％乙醇中5min-80％乙醇中5min-70％乙醇中5min梯度脱蜡。
HE染色：自来水冲洗5min后，苏木精染色50min，用流水冲洗至细胞核变蓝，1％盐酸酒精溶液分化30s，除去背景，自来水冲洗，然后1％氨水溶液返蓝1min，流水冲洗数秒后，伊红溶液染色2min。将石蜡切片依次放入70％乙醇5min-80％乙醇5min-90％乙醇5min-无水乙醇Ⅰ中5min-无水乙醇Ⅱ中5min-二甲苯Ⅰ中5min-二甲苯Ⅱ中10min。
观察：将切片从二甲苯中拿出来用中性树胶进行封片，将组织切片置于显微镜下观察拍照。
实验结果
根据图21可知，在三组的主要器官切片中均未观察到明显的病理特征，这表明lip@EGCG/miR-223对小鼠的主要器官没有毒性，安全性良好。

Claims (10)

1.一种具有靶向性的抗动脉粥样硬化基因药物递送系统，lip@EGCG/miR-223。
2.权利要求1所述的药物递送系统，其特征在于，由EGCG和miR-223制备而成。
3.权利要求1所述的载药系统，其特征在于，为脂质体结构。
4.权利要求1所述的药物递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：阳离子脂质DOTAP和miR-223结合，通过优化的薄膜水化法制备脂质体。
5.权利要求1所述的载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备DOTAP-miR-223复合物：取DOTAP溶于氯仿，混合后加入甲醇混匀，加入miR-223和氯仿，离心提取含有DOTAP-miR-223复合物的有机相；
2)制备lip@EGCG/miR-223：
向DOTAP-miR-223复合物中加入PI、DSPE-PEG2k、吐温-80、chol和氯仿，旋蒸去除有机相，再加入EGCG旋转水化，超声得到脂质体。
6.权利要求5所述的载药系统的制备方法，其特征在于，步骤1)制备DOTAP-miR-223复合物：
(1)取miR-223离心，溶于DEPC水中，取DOTAP，溶于的氯仿中，混合后加入甲醇，轻轻混匀以形成单相；其中DOTAP:miR-223＝2-8:1-6,w/w；
(2)随后加入DEPC水溶液和氯仿以形成两个独立的相；
(3)离心提取，得到含有DOTAP-miR-223复合物的有机相。
7.权利要求5所述的载药系统的制备方法，其特征在于，步骤2)制备lip@EGCG/miR-223：向DOTAP-miR-223复合物中加入PI、DSPE-PEG2k、吐温-80、胆固醇和氯仿，旋蒸去除有机相，再加入EG CG水溶液旋转水化，超声得到脂质体。
8.权利要求5所述的载药系统的制备方法，特征在于：阳离子脂质DOTAP与miR-223的质量比为1：0.75。
9.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备DOTAP-miR-223复合物的方法，步骤如下：
(1)取miR-223离心，溶于DEPC水中，取DOTAP(DOTAP:miR-223＝4:3,w/w比)，溶于的氯仿中，混合后加入甲醇，轻轻混匀以形成单相；
(2)室温下，摇床上孵育后，加入DEPC水和氯仿以形成两个独立的相；
(3)离心提取，得到含有DOTAP-miR-223复合物的有机相；
2)制备lip@EGCG/miR-223的方法，步骤如下：
(1)向提取的DOTAP-miR-223复合物有机相中加入PI，DSPE-PEG2k，吐温-80，chol，转入旋蒸瓶中，再加入氯仿；
(2)旋蒸以除去有机相，瓶壁上形成一层薄膜；
(3)取EGCG溶于DEPC水中，将EGCG的水溶液加入旋蒸瓶中，旋转水化，水浴超声；
(4)先过微孔滤膜，然后通过聚碳酸酯膜收集，即得脂质体。
10.权利要求1所述的载药系统在制备抑制动脉粥样硬化的药物中的应用。
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