CN113549687B - mPGES-2作为预防和/或治疗肾脏疾病的药物靶点的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了mPGES‑2作为预防和/或治疗肾脏疾病的药物靶点的应用。本发明首次提出mPGES‑2是顺铂诱导的急性肾损伤的药物靶点。实验表明，mPGES‑2敲除可以显著降低由顺铂诱导的急性肾损伤小鼠血清中尿素氮和肌酐的水平，明显减轻由顺铂诱导的急性肾损伤小鼠肾组织形态损伤，同时显著改善了急性肾损伤小鼠肾脏中线粒体功能并减少了细胞凋亡。这些结果说明敲除mPGES‑2可改善顺铂诱导的急性肾损伤，表明mPGES‑2可以作为预防和/或治疗顺铂诱导的急性肾损伤的靶点，对今后此类疾病的药物开发及预防和/或治疗有非常重要的意义。

Description

mPGES-2作为预防和/或治疗肾脏疾病的药物靶点的应用

技术领域

本发明具体涉及mPGES-2(微粒体前列腺素E合成酶-2，microsomalprostaglandin E synthase-2)作为治疗和/或预防顺铂诱导的急性肾损伤的药物靶点的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

急性肾脏损伤(AKI)已经成为一个主要的公共健康问题，已经影响到全球数百万患者，并导致生存率下降和加快潜在的慢性肾脏疾病(CKD)进程。急性肾损伤可由直接或间接的肾脏损伤引起，包括各种形式的休克、严重的心脏和肝脏疾病、输尿管梗阻、肾毒性药物和毒素等。铂类抗肿瘤药物是广泛使用的抗肿瘤药，用于多种恶性肿瘤的临床治疗，其使用与严重肾毒性的显著增加密切相关。约1/3接受顺铂治疗的病人可发生急性肾损伤，严重影响了顺铂的临床使用。铂类抗肿瘤药物引起AKI主要与其对肾近端小管上皮细胞的损伤作用相关，主要机制包括药物的吸收转运、肾近端小管上皮细胞氧化应激、细胞凋亡及炎症反应等多个方面。目前，临床上尚没有特异性针对急性肾损伤的药物，开发针对肾脏保护作用的药物或者靶点是当前研究的热点和难点。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种mPGES-2作为预防和/或治疗肾脏疾病的药物靶点的应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了mPGES-2作为靶点在开发或筛选或制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物中的应用。

进一步的，所述肾脏疾病为铂类抗肿瘤药物诱导的急性肾损伤。

进一步的，所述铂类抗肿瘤药物为顺铂。

进一步的，所述药物能够抑制mPGES-2的表达。

进一步的，所述药物至少具有下列的任一种功能：降低顺铂诱导的急性肾损伤中BUN和/或SCr的水平、降低顺铂诱导的急性肾损伤中的水平、改善顺铂诱导的急性肾损伤中肾组织形态损伤、改善顺铂诱导的急性肾损伤中线粒体功能、减少急性肾损伤中细胞凋亡。

本发明实施例还提供了mPGES-2作为靶点在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物筛选模型中的应用。

进一步的，所述肾脏疾病为铂类抗肿瘤药物诱导的急性肾损伤。

进一步的，所述铂类抗肿瘤药物为顺铂。

进一步的，所述药物能够抑制mPGES-2的表达。

进一步的，所述药物至少具有下列的任一种功能：降低顺铂诱导的急性肾损伤中BUN和/或SCr的水平、降低顺铂诱导的急性肾损伤中的水平、改善顺铂诱导的急性肾损伤中肾组织形态损伤、改善顺铂诱导的急性肾损伤中线粒体功能、减少急性肾损伤中细胞凋亡。

进一步的，在前述的应用之中，所述靶点敲除后能够显著降低急性肾损伤小鼠血清中BUN和SCr的水平。

进一步的，在前述的应用之中，所述靶点敲除后能够显著改善肾组织形态损伤。

进一步的，在前述的应用之中，所述靶点敲除后能够显著改善急性肾损伤中线粒体功能。

进一步的，在前述的应用之中，所述靶点敲除后能够减少急性肾损伤中细胞凋亡。

本发明中所述的mPGES-2蛋白在肾脏中主要与血红素(heme)结合时生成丙二醛(MDA)。MDA是脂质过氧化的标志性产物，在多种诱因导致的急性肾损伤中显著上调，并被作为急性肾损伤氧化应激失衡的重要标志物。有研究表明mPGES-2主要表达在肾脏的小管上皮细胞，但其是否参与急性肾损伤的发生发展尚不清楚。

本发明首次提出mPGES-2是顺铂等铂类抗肿瘤药物诱导的急性肾损伤的药物靶点。经实验表明，mPGES-2敲除可以显著降低急性肾损伤小鼠血清中BUN和SCr的水平，明显减轻急性肾损伤小鼠肾组织形态损伤，同时显著改善急性肾损伤中线粒体的功能和减少细胞凋亡。这些实验结果说明敲除mPGES-2对顺铂诱导的急性肾损伤具有显著的改善作用，进而表明mPGES-2可以作为预防和/或治疗急性肾损伤的靶点，对今后此类疾病的药物开发及预防和/或治疗有非常重要的意义。

附图说明

图1为本发明实施例中顺铂诱导的急性肾损伤的mPGES-2野生型(WT)小鼠与mPGES-2敲除型(KO)小鼠血清中SCr的水平。

图2为本发明实施例中顺铂诱导的急性肾损伤模型中mPGES-2WT小鼠与KO小鼠血清中BUN的水平。

图3a-图3b分别为本发明实施例中顺铂诱导的急性肾损伤模型中mPGES-2WT与KO小鼠肾组织H＆E染色结果图及肾损伤分数统计图。

图4为顺铂诱导的急性肾损伤模型中mPGES-2 WT与KO小鼠肾组织的线粒体裂变标志物Fis1的mRNA的表达水平。

图5a-图5b分别为顺铂诱导的急性肾损伤模型中mPGES-2 WT与KO小鼠肾组织的cytochrome C的免疫组化图及统计图。

图6a-图6b分别为顺铂诱导的急性肾损伤模型中mPGES-2 WT与KO小鼠肾组织的TUNEL染色结果图及统计图。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验动物：本实施例所用的mPGES-2杂合小鼠由江苏集萃药康生物科技有限公司用CRISPR Cas9技术获得，并于徐州医科大学通过mPGES-2+/-杂交产生得到mPGES-2野生型(WT)小鼠与mPGES-2敲除型(KO)小鼠。

顺铂诱导的小鼠急性肾损伤模型的构建方法为：将mPGES-2野生型(WT)小鼠与mPGES-2敲除型(KO)小鼠分成两组，并分别对每只小鼠腹腔注射给予20mg/kg的顺铂一次，72h后取材观察相应的指标。

试剂：BUN试剂盒购自南京建成生物工程研究所，SCr试剂盒购自英国BioassaysSystems公司。TUNEL试剂盒购自大连美仓公司。

实施例1生化指标测定

BUN和SCr的检测：处死小鼠前采集血液，3000g离心15分钟。收集分离出的上层血清，按照说明书操作(南京建成生物科技有限公司的BUN检测试剂盒、Bioassays Systems公司的SCr试剂盒)。

实施例2 H＆E染色对肾脏组织病理学观察

具体的实验方法包括：

1、石蜡切片制备

(1)组织标本的固定：取实施例1中的各组小鼠的肾皮质组织于4％多聚甲醛中室温固定24小时，纱布包裹，标记，流水冲洗过夜；

(2)脱水与透明：将脱水盒放进脱水机内依次梯度酒精进行脱水，75％酒精4h，85％酒精2h，90％酒精2h，95％酒精1h，无水乙醇I 30min，无水乙醇II 30min，醇苯5-10min，二甲苯I 5-10min，二甲苯II 5-10min；

(3)浸蜡与包埋：65°融化石蜡I 1h，65°融化石蜡II 1h，65°融化石蜡III 1h。将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；

(4)切片及展片：切片机5μm厚度切片，50℃水浴展片，捞片贴片于清洁载玻片上，60℃烘箱烤片过夜。切片完成后做好标记，保存待用。

2、H＆E染色

(1)脱蜡和复水：切片二甲苯脱蜡两次(15分钟/次)，分别于100％、95％、90％、80％、70％、50％酒精中各脱水5分钟，最后入蒸馏水中复水3分钟；

(2)苏木素染色：切片置于苏木素染液中染色15分钟，自来水冲洗3分钟，盐酸酒精(70％酒精99ml+浓盐酸1 ml)分色10秒；

(3)返蓝及脱水：自来水冲洗10分钟使其变为蓝色。将切片依次置于50％、70％、80％、90％酒精中各脱水5分钟；

(4)伊红复染：1％伊红染液染色2分钟，95％酒精和100％酒精中分别3分钟脱水分色至界限清楚；

(5)透明与封片：二甲苯透明3分钟后，中性树胶封片；

(6)封片后放入50℃烘箱烘干，光镜下观察肾组织病理学结构的变化。

实施例3TUNEL染色观察肾小管细胞凋亡。

(1)固定：取出冰冻切片，并回温至室温。在组织固定液或4％多聚甲醛(配制于新鲜的PBS)中浸泡，室温下固定30分钟。

(2)洗涤：轻轻吸干多余液体，并将切片浸没在PBS或HBSS中，室温孵育10-15分钟。

按此步骤重复洗涤一次，然后轻轻吸干多余液体。此时可用石蜡笔或疏水笔在样品周围描绘样品分布的轮廓，以便后续操作。在实验过程中，切勿使样品干燥，处理好的样本应放于湿盒中保持湿润。

(3)通透：浸于含0.3％Triton X-100的PBS中，室温孵育30分钟进行通透处理。

(4)洗涤：在PBS或HBSS中浸没洗涤样本2-3次，并用滤纸轻轻吸干多余液体。处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

(5)配制TUNEL检测液：参考表1配制适当量的TUNEL检测液，即用即配，注意避光。

表1准备用于实验的和可选阳性对照反应的TUNEL检测液

组分	体积(μl/50μl体系)
		TdT Enzyme(10×)	5
FITC-12-dUTP Labeling Mix	45

(6)在样本上滴加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。

(7)PBS洗涤2-3次。

(8)DIPA染细胞核，室温下孵育10分钟。PBS洗涤2-3次。

(9)用抗荧光衰减封片剂封片后，在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范围为515-565nm。

实施例4免疫组织化学染色

(1)烘片：将石蜡切片放置在60℃烘箱中烘片至少60分钟；

(2)脱蜡：将烘好片的石蜡切片完全浸入二甲苯中进行脱蜡处理：二甲苯120分钟，二甲苯I120分钟；

(3)水化：将脱蜡好的石蜡切片依次、完全浸入不同浓度乙醇中进行水化处理：100％乙醇10分钟，95％乙醇5分钟，90％乙醇5分钟，85％乙醇5分钟，70％乙醇5分钟，自来水或PBS润洗石蜡切片数次；

(4)抗原修复：在高压锅中加入适量枸橼酸钠抗原修复液，将润洗好的石蜡切片没入枸橼酸钠抗原修复液中(液面没过组织)，将高压锅放入微波炉中加热10分钟至抗原修复液煮沸，打开锅盖检查有无气泡(有气泡表示枸橼酸钠抗原修复液已沸腾)，盖好锅盖后继续加热5分钟后打开锅盖在室温下自然冷却，一般约30分钟；

(5)PBS漂洗修复好的石蜡切片3次，每次5分钟；

(6)封闭内源性过氧化氢酶：采用3％的双氧水完全浸没石蜡切片，室温下避光封闭30分钟后，PBS漂洗石蜡切片3次，每次5分钟；

(7)封闭内源性抗原：采用0.1％PBST配制的5％BSA抗原封闭液，室温封闭60分钟；

(8)一抗孵育：滴加0.1％PBS稀释好的一抗工作液，4℃过夜，PBS漂洗3次，每次5分钟；

(9)二抗孵育：滴加适量HRP标记过的对应种属的二抗工作液，室温孵育60分钟；

(11)DAB显色：按照厂家的试剂使用说明配制1×DAB显色液，滴加至甩干的石蜡组织上，反应一段时间，显微镜下观察显色情况，及时用自来水终止染色，并用自来水润洗石蜡切片数次；

(12)苏木精复染：将润洗过的石蜡切片没入苏木精染液中10-20秒，随后用自来水清洗苏木精染液，后采用pH值为7.2-7.4的PBS浸泡石蜡切片10分钟；

(13)组织脱水：按下列步骤进行组织脱水，70％乙醇5分钟，85％乙醇5分钟，90％乙醇5分钟，95％乙醇5分钟，100％乙醇10分钟，100％乙醇10分钟；

(14)石蜡透明：按以下步骤进行组织透明，二甲苯I20分钟，二甲苯II20分钟；

(15)封片：滴加适量树脂封片，注意赶出所有气泡；

实施例5RNA提取及实时定量PCR

根据试剂使用说明书，使用TRIzol(Invitgen)从肾皮质和细胞中提取总RNA。用PrimeScript逆转录酶系统(Takara Biotechnology)合成cDNA，用于逆转录聚合酶链反应(Takara Biotechnology)。qRT-PCR与SYBR Green Master Mix(V Azyme)在QuantStudio3实时PCR系统(应用生物系统)上一式两份进行。每一基因的表达均归一化为内控基因GAPDH的表达。

数据分析：

采用SPSS 16.0软件统计分析实验数据，两组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以平均值±标准误(Mean±SEM)表示，当P＜0.05时，认为有统计学意义。

实验结果说明：

1、mPGES-2敲除对急性肾损伤小鼠肾功能指标SCr和BUN的影响

血清中肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)是机体内重要的评价肾功能的指标，用于评判是否发生肾脏损伤及损伤的严重程度。如图1-图2所示，WT小鼠给予顺铂之后SCr和BUN明显升高，但敲除mPGES-2后SCr和BUN水平显著降低。因此，抑制mPGES-2对顺铂诱导的急性肾损伤小鼠的肾功能具有保护作用。

2、mPGES-2敲除对急性肾损伤小鼠肾脏组织形态的影响

取顺铂处理的WT小鼠和KO小鼠的肾组织进行切片染色后，显微镜下观察肾皮质组织结构。如图3a-图3b所示，顺铂处理的WT小鼠其肾小管细胞出现明显肿胀，近曲小管刷状缘丢失，管腔充血，大量肾小管细胞死亡。而敲除mPGES-2后显著改善了急性肾损伤小鼠的肾组织形态损伤，表明抑制mPGES-2对急性肾损伤小鼠的肾组织形态具有保护和改善作用。

3、mPGES-2敲除对急性肾损伤小鼠肾脏线粒体功能的影响

肾小管上皮细胞丰富了线粒体，线粒体损伤会导致氧化应激、炎症甚至凋亡等反应的发生，在急性肾损伤的发生发展具有重要的作用。如图4及图5a-图5b所示，与顺铂处理的WT小鼠相比，敲除mPGES-2后，线粒体分裂蛋白1 (Fis1)的mRNA表达增加，细胞内细胞色素C表达降低，表明抑制mPGES-2改善了急性肾损伤小鼠肾脏中线粒体功能。

4、mPGES-2敲除对急性肾损伤小鼠肾脏组织中细胞的凋亡的影响。

急性肾损伤小鼠的肾脏组织中小管上皮细胞大量凋亡从而造成肾脏损伤。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒包含高纯度的脱氧核苷酸末端转移酶(TdT)，该酶可将生物素化的脱氧核苷酸结合到片段化DNA上，后续通过显色反映凋亡细胞。如图6a-图6b所示，顺铂处理的WT小鼠肾脏皮质出现大量的阳性染色，提示细胞凋亡较多，而敲除mPGES-2显著降低了TUNEL阳性细胞数，表明抑制mPGES-2减少了急性肾损伤小鼠肾脏中细胞凋亡。

以上实验结果说明敲除mPGES-2可改善顺铂诱导的急性肾损伤，表明mPGES-2可以作为预防和/或治疗顺铂诱导的急性肾损伤的靶点。

尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。

Claims (1)

1.mPGES-2作为靶点在制备用于预防和/或治疗肾脏疾病的药物中的应用，所述肾脏疾病为顺铂诱导的急性肾损伤，所述药物能够抑制mPGES-2的表达。

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