CN110864939A - 一种蛋白质提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蛋白质提取方法和应用，具体涉及一种从石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法和应用。本发明采用无毒的TO透明剂替换了有毒的二甲苯，安全环保；利用高温煮沸法对蛋白质进行提取处理，避免了常规操作的组织冻融裂解或超声破碎所致的低丰度蛋白质降解丢失；采用金属浴加热置换抗原修复液加微波加热的抗原修复步骤，配合嵌套筛网小室的使用，使得操作简单易行，并可较好地保证组织切片的完整性。本发明既提高了石蜡组织总蛋白质的提取量，又增加了对低丰度蛋白质的检测灵敏性；整体操作流程简单易行省时，安全无毒价廉。

Description

一种蛋白质提取方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种蛋白质提取方法和应用，涉及一种从石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法和应用，具体涉及一种定性与半定量测定由福尔马林固定石蜡包埋的已存档人或动物组织块中总蛋白质水平的方法和应用。

背景技术

目前临床外科手术切除的病变组织标本，绝大多数是由各级医院的病理科收集，先经多聚甲醛固定石蜡包埋，再经切片后，进行HE和免疫组织化学染色，显微镜下观察分析，并可将剩余组织样品归档永久保存。

目前疾病蛋白组学的临床基础研究和功能验证的取材样本多依赖于手术切除后的新鲜组织或冰冻组织。但是，如果保护措施不能及时实施，或标本处理过程经历反复冻融，其组织细胞中的蛋白质则会迅速降解，实验结果难以精准。另外，现有常规蛋白质提取和表达检测的技术是不能提供既往病变和罕见疾病追踪调查所需的样本数据。然而，唯有石蜡包埋组织细胞中的蛋白质可提供此类有用信息。随着科学技术的创新发展，已开发的商品化试剂盒能从近期存档的石蜡包埋组织中提取基因组DNA和小片段RNA，突破了分子生物学研究对DNA和RNA半定量与定量检测分析时需准备新鲜或速冻组织标本的瓶颈。但是，目前尚无从石蜡包埋组织中提取总蛋白质后，再分别检测其内含特异性蛋白质的各自表达水平的成熟、通用的方法

蛋白质印迹法(Western blot)是利用电泳将从组织/细胞中提取的不同分子量的蛋白质在凝胶上分离，再转移固定到固相支持物NC膜/PVDF膜上。然后，运用抗原-抗体特异性免疫反应，检测某一已知抗原的蛋白质表达量。此技术现已广泛用于观察分析特定基因在组织/细胞中的蛋白质表达、抗原/抗体活性、以及蛋白互作的调控关系等，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中最常用的实验方法之一。只是该方法所需从细胞培养或手术后新鲜/冰冻组织的样本中提取大量的蛋白质，目前仍无法从福尔马林固定石蜡包埋的微小组织块中提取足够量的总蛋白质用于此实验。

CN1803828A公开了一种石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，涉及生物技术领域，尤其涉及蛋白质提取技术。该发明所述的石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法含有以下步骤:首先将石蜡包埋组织块切片，然后使用有毒性的二甲苯脱蜡，再用乙醇水化，最后加入裂解液和核酸酶离心分离得到。该方法虽从石蜡包埋组织中提取出蛋白质，但所用试剂对人体健康有毒，且蛋白质提取总量少，很难满足多种蛋白组学方法对微量样本的需求，故一直未能推广使用。

因此，提供一种能从多年归档的、包括罕见疾病的，可追踪病变发展的微量石蜡包埋组织中安全、稳定、简便、有效地提取适量总蛋白质的整套技术流程，具有重要意义和广阔的应用前景。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种能从微量石蜡包埋组织中提取较大量总蛋白质的简单、安全、可行的方法。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种从石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，包括如下步骤：

(1)将石蜡包埋组织块处理为组织切片；

(2)对步骤(1)所得组织切片进行脱蜡处理；

(3)对步骤(2)脱蜡处理后的组织切片进行乙醇梯度水化处理；

(4)将步骤(3)处理后的组织切片清洗，离心，弃去上清液；

(5)在步骤(4)所得组织沉淀物中添加组织细胞裂解液，再进行金属浴；

(6)对步骤(5)所得混合物离心，取上清即为蛋白质；

其中，组织细胞裂解液为RIPA和脱氧胆酸钠盐的组合，所述组织细胞裂解液中的脱氧胆酸钠盐的质量分数为1.5-4％。

本发明脱蜡步骤简易省时，采用高温煮沸法对蛋白进行处理，避免常规操作的反复冻融和超声破碎，操作简单，所提蛋白质数量和质量均佳，通过对组织细胞裂解液的调整，提高总蛋白质的提取量，可以从较小的组织体积中获取较大的蛋白质总量，增加了对低丰度表达抗原的检测灵敏性。

所述脱氧胆酸钠盐的质量分数为1.5-4％，例如可以是1.5％、1.8％、2％、2.2％、2.4％、2.5％、2.8％、3％、3.2％、3.5％、3.6％、3.8或4％，优选为1.5-3％，进一步优选为2％。

本发明中，RIPA裂解液购于上海碧云天生物技术有限公司，发明人在实验过程中发现，虽然RIPA裂解液中已包含1％脱氧胆酸钠盐，但组合配比RIPA和脱氧胆酸钠盐，在RIPA中额外添加0.5-3％的脱氧胆酸钠盐使得脱氧胆酸钠盐在裂解液中的终浓度为1.5-4％可以有助于细胞裂解，使得裂解效果更好，蛋白提取总量显著增加。

优选地，步骤(1)所述组织切片的厚度为10-30μm，优选为28μm。

所述切片厚度为10-30μm，例如可以是10μm、12μm、15μm、18μm、20μm、22μm、25μm、28μm或30μm，优选为28μm。

优选地，步骤(2)之前还包括将步骤(1)所得的组织切片置于嵌套筛网小室。

本发明中，将组织切片置于下端面为筛网的嵌套筛网小室中，与6、12或24孔板配套使用，使小室与孔内液体互通，并浸没组织切片。由于切片相对固定于嵌套筛网小室，不易产生大距离位移，不易被水流冲击或由于多次钳夹转移而导致受损破碎。另外，易转移，易淋干。同时，还可保证操作的统一处理与标准流程，增加了实验的可靠性与可重复性。

优选地，步骤(2)所述脱蜡处理所用脱蜡剂为TO透明剂。

本发明所用的脱蜡剂为无毒性的TO透明剂，脱蜡效果稳定，且脱蜡效率等同于通用试剂二甲苯，可避免后者有毒物质对人体的损伤，以及对环境的污染。

优选地，所述脱蜡处理的时间为每次5-15min，例如可以是5min、8min、10min、12min或15min，优选为10min。

优选地，所述脱蜡处理的次数为2-5次，例如可以是2次、3次、4次或5次，优选为3次。

本发明中，在所述脱蜡处理条件下可有效脱去组织切片上的石蜡，省时效佳，且无毒性。

优选地，步骤(2)所述乙醇梯度水化处理具体步骤为：

(1’)将步骤(2)所得切片浸入无水乙醇，时间为3-8min，优选为5min；

(2’)将步骤(1’)所得切片浸入95％乙醇，时间为3-8min，优选为5min；

(3’)将步骤(2’)所得切片浸入75％乙醇，时间为3-8min，优选为5min；

(4’)将步骤(3’)所得切片浸入蒸馏水，时间为3-8min，优选为5min。

优选地，步骤(1’)和步骤(4’)独立地进行1-3次，优选为2次。

本发明中，先将石蜡组织切片置于嵌套筛网小室中，然后将脱蜡用TO透明剂、梯度脱水乙醇和蒸馏水等依次按操作步骤适量(2-3mL)加入已标记的孔板中；每一步均需将筛网小室安置于对应标记的孔板的孔内，使组织切片浸入液体中，并完全展开；移至下一个步骤时，需先淋干嵌套筛网小室中的液体，再将孔板的孔内液体置换，然后将已置入组织切片的、已标记的嵌套筛网小室对应插入12孔板。

优选地，步骤(5)之前还包括将切片淋干称重。

本发明中，组织切片置于嵌套筛网小室中进行脱蜡、乙醇梯度水化以及蒸馏水漂洗步骤，需要对切片进行称重时，用小匙将组织切片从嵌套筛网小室底部轻轻刮下移动到称重用的1.5mLEP管中，后续步骤不再放回嵌套筛网小室，而在EP管中进行。

优选地，步骤(4)所述清洗所用的溶液为PBS缓冲液。

本发明中，组织切片称重后使用PBS缓冲液进行清洗，PBS即磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)，具有盐平衡、可调整至适宜的pH缓冲作用，可保护生物蛋白质的结构及生物特性。而蒸馏水不具有盐平衡作用，生理盐水不具有调整pH的作用，故首选PBS进行组织细胞样本的清洗。

优选地，步骤(4)所述清洗次数为1-3次，例如可以是1次、2次或3次，优选为2次。

优选地，步骤(4)所述清洗时间为每次3-10min，例如可以是3min、5min、8min或10min，优选为5min。

优选地，步骤(4)所述离心的转速为12000-14000rpm，例如可以是12000rpm、12500rpm、13000rpm、13500rpm或14000rpm，优选为14000rpm。

优选地，步骤(4)所述离心的时间为3-5min，例如可以是3min、4min或5min，优选为5min。

优选地，步骤(5)所述组织沉淀物与组织细胞裂解液的质量体积比为1:5-20mg/μL，例如可以是1:5mg/μL、1:7mg/μL、1:10mg/μL、1:12mg/μL、1:15mg/μL、1:17mg/μL、或1:20mg/μL，优选为1:10mg/μL。

本发明中，PBS清洗离心后弃上清液，在所得组织沉淀物中加入组织细胞裂解液，当组织沉淀物与裂解液的质量体积比在1:5-20mg/μL范围内，能有效地将细胞组织快速、充分地裂解，并增加组织总蛋白质的提取量。

优选地，步骤(5)所述金属浴的温度为95-100℃，例如可以是95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或100℃，优选为100℃。

本发明中，以金属浴加热裂解组织细胞蛋白质的步骤代替抗原修复液和微波加热的步骤，操作简便，且同样具有解甲醛固定所致的分子交联的效应。

优选地，步骤(5)所述金属浴的时间为20-40min，例如可以是20min、25min、30min、35min或40min，优选为30min。

优选地，步骤(6)所述离心的转速为10000-14000rpm，例如可以是10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm或14000rpm，优选为14000rpm。

优选地，步骤(6)所述离心的时间为15-40min，例如可以是15min、20min、25min、30min、35min或40min，优选为20min。

优选地，步骤(6)所述离心的温度为4℃。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

(1)将石蜡包埋组织块去除多余石蜡，将组织切成厚度为10-30μm的切片，然后置于嵌套筛网小室中；

(2)将步骤(1)所述组织切片浸入TO透明剂脱蜡，脱蜡处理2-5次，每次浸泡8-15min；

(3)对步骤(2)所得组织切片进行乙醇梯度水化处理，先将切片浸入无水乙醇中水化1-3次，每次3-8min，再浸入95％乙醇3-8min，然后浸入75％乙醇3-8min，最后浸入蒸馏水1-3次，每次3-8min；

(4)将步骤(3)所得组织切片淋干，收集于已称重的1.5mL EP管中，用PBS清洗切片，12000-14000rpm离心3-5min，弃去上清液，差量法计算切片的重量；

(5)在步骤(4)所得组织沉淀物中添加组织细胞裂解液，使得组织沉淀物与组织细胞裂解液的质量体积比为1:5-20mg/μL，然后进行95-100℃金属浴20-40min；

(6)对步骤(5)所得混合物进行离心，4℃，10000-14000rpm离心15-40min，取上清即为蛋白质；

其中，组织细胞裂解液为RIPA和脱氧胆酸钠盐的组合，所述组织细胞裂解液中的脱氧胆酸钠盐的质量分数为1.5-4％。

本发明中，通过调整RIPA裂解液的组成成分，配合嵌套筛网小室的使用，实现从微量组织切片中高效快速提取足够量的蛋白质进行下游实验，以增加对低丰度表达抗原的检测灵敏性。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的方法提取得到的蛋白质。

本发明提供的蛋白提取方法可用于对归档石蜡包埋组织进行总蛋白质提取，所得蛋白数量和质量与从新鲜组织中提取得到的相似，成功实现对微量归档石蜡包埋组织块的适量总蛋白质提取。

第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的组织总蛋白质，可用于蛋白质免疫印迹实验、免疫沉淀实验、免疫共沉淀实验、单维度蛋白电泳实验、双维度蛋白电泳实验、蛋白芯片实验或质谱分析等任意一种或至少两种的组合蛋白组学实验的用途。

与蛋白质提取的现有技术相比，本发明具有如下明显优点：

(1)本发明组织细胞裂解与抗原修复合二为一，操作简单易行、安全便宜。采用金属浴煮沸法对蛋白质进行处理，即避免了常规组织蛋白质提取操作时可能会反复冻融或/和超声破碎，又采用金属浴取代抗原加热修复常用的抗原修复液与微波炉加热。此法所提取的蛋白质在数量和质量可与从手术切除新鲜组织中所提取的相似。通过对组织细胞裂解液的调整，可以增加从微型组织块中获得的总蛋白质量(例如：用10mg样本可提取出359.63μg的蛋白质)，即增加了对低丰度表达抗原的检测灵敏性和归档微型组织蛋白质的应用范围；

(2)本发明所用脱蜡溶剂为无毒性的TO透明剂，以代替常规使用的、对人体有毒性的二甲苯溶剂，有利于操作者的健康，可降低对环境的污染，且无须使用昂贵的化学通风柜，大大降低实验成本；

(3)本发明的蛋白质提取过程，借助嵌套筛网小室同时对数片组织切片进行统一的标准化处理，能够有效地保护组织切片的完整性，防止煮沸过程和转移过程中切片的破碎，同时处理多个切片省时省力，且实验平行性好，提取质量和数量稳定；

(4)本发明可根据抗原表达量的多少确定合适的切片厚度和片数，方便需求者设计所需的样本用量，同时提取出的蛋白质足以进行后续蛋白组学实验。并可对微型组织总蛋白质进行半定量检测，而不仅仅是定性检测；

(5)本发明采用金属浴加热方法裂解组织细胞，以暴露细胞蛋白质因福尔马林固定所引起的分子交联。此法取代了细胞反复冻融/超声破碎、抗原修复液处理和微波炉加热的步骤，省略了大量的时间和试剂耗材，克服了对抗原修复步骤的依赖，使得步骤更简单，更安全和蛋白质提取效果更佳。

附图说明

图1为本发明中蛋白印迹实验结果，其中A为对比例1所得蛋白质进行实验；B为对比例2所得蛋白质进行实验；C为对比例3所得蛋白质进行实验；D为实施例1所得蛋白质进行实验；

图2为本发明中嵌套筛网小室配合12孔板的结构示意图，其中1为嵌套筛网小室，2为12孔板。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1

一种从石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，具体包括如下步骤：

(1)将石蜡包埋组织块去除多余石蜡，切成厚度为28μm的组织切片，然后置于嵌套筛网小室(如图2所示)中；

(2)将步骤(1)所述切片浸入TO透明剂脱蜡，脱蜡处理3次，每次浸泡10min；

(3)对步骤(2)所得组织切片进行乙醇梯度水化处理，先将组织切片浸入无水乙醇中水化2次，每次5min，再浸入95％乙醇5min，然后浸入75％乙醇5min，最后浸入蒸馏水2次，每次5min；

(4)将步骤(3)所得组织切片淋干，收集于已称重的1.5mL EP管中，用PBS将组织切片清洗2次，每次5min，14000rpm离心5min，弃去上清液，差量法计算组织切片的重量；

(5)在步骤(4)所得组织沉淀物中添加1:10mg/μL的组织细胞裂解液，然后进行100℃金属浴30min；

(6)对步骤(5)所得混合物进行离心，4℃，14000rpm离心30min，取上清即为蛋白质；

其中，组织细胞裂解液为RIPA和脱氧胆酸钠盐的组合，所述组织细胞裂解液中的脱氧胆酸钠盐的质量分数为2％。

实施例2

(1)将石蜡包埋组织块去除多余石蜡，切成厚度为20μm的组织切片，然后置于嵌套筛网小室中；

(2)将步骤(1)所述组织切片浸入TO透明剂脱蜡，脱蜡处理4次，每次浸泡12min；

(3)对步骤(2)所得组织切片进行乙醇梯度水化处理，先将组织切片浸入无水乙醇中水化3次，每次5min，再浸入95％乙醇5min，然后浸入75％乙醇5min，最后浸入蒸馏水3次，每次4min；

(4)将步骤(3)所得组织切片淋干，收集于已称重的1.5mL EP管中，用PBS将组织切片清洗2次，每次8min，14000rpm离心5min，弃去上清液，差量法计算切片的重量；

(5)在步骤(4)所得组织沉淀物中添加1:15mg/μL的组织细胞裂解液，然后进行100℃金属浴35min；

(6)对步骤(5)所得混合物进行离心，4℃，14000rpm离心25min，取上清即为蛋白质；

其中，组织细胞裂解液为RIPA和脱氧胆酸钠盐的组合，所述组织细胞裂解液中的脱氧胆酸钠盐的质量分数为2.5％。

实施例3

(1)将石蜡包埋组织块去除多余石蜡，切成厚度为10μm的组织切片，然后置于嵌套筛网小室中；

(2)将步骤(1)所述组织切片浸入TO透明剂脱蜡，脱蜡处理2次，每次浸泡15min；

(3)对步骤(2)所得组织切片进行乙醇梯度水化处理，先将组织切片浸入无水乙醇中水化1次，每次8min，再浸入95％乙醇3min，然后浸入75％乙醇5min，最后浸入蒸馏水3次，每次3min；

(4)将步骤(3)所得组织切片淋干，收集于已称重的1.5mL EP管中，用PBS将组织切片清洗1次，每次10min，13000rpm离心5min，弃去上清液，差量法计算切片的重量；

(5)在步骤(4)所得组织沉淀物中添加1:5mg/μL的组织细胞裂解液，然后进行95℃金属浴40min；

(6)对步骤(5)所得混合物进行离心，4℃，12000rpm离心15min，取上清即为蛋白质；

其中，组织细胞裂解液为RIPA和脱氧胆酸钠盐的组合，所述组织细胞裂解液中的脱氧胆酸钠盐的质量分数为1.5％。

实施例4

(1)将石蜡包埋组织块去除多余石蜡，切成厚度为30μm的组织切片，然后置于嵌套筛网小室中；

(2)将步骤(1)所述组织切片浸入TO透明剂脱蜡，脱蜡处理5次，每次浸泡5min；

(3)对步骤(2)所得组织切片进行乙醇梯度水化处理，先将组织切片浸入无水乙醇中水化3次，每次3min，再浸入95％乙醇8min，然后浸入75％乙醇3min，最后浸入蒸馏水1次，每次8min；

(4)将步骤(3)所得组织切片淋干，收集于已称重的1.5mL EP管中，用PBS将组织切片清洗3次，每次3min，12000rpm离心5min，弃去上清液，差量法计算切片的重量；

(5)在步骤(4)所得组织沉淀物中添加1:20mg/μL的组织细胞裂解液，然后进行98℃金属浴20min；

(6)对步骤(5)所得混合物进行离心，4℃，10000rpm离心40min，取上清即为蛋白质；

其中，组织细胞裂解液为RIPA和脱氧胆酸钠盐的组合，所述组织细胞裂解液中的脱氧胆酸钠盐的质量分数为4％。

实施例5

与实施例1相比，除了切片厚度为5μm之外，其他条件同实施例1。

实施例6

与实施例1相比，除了切片厚度为40μm之外，其他条件同实施例1。

实施例7

与实施例1相比，除了步骤(5)中组织沉淀物与组织细胞裂解液的质量体积比1:20mg/μL之外，其他条件同实施例1。

实施例8

与实施例1相比，除了步骤(5)中组织沉淀物与组织细胞裂解液的质量体积比1:25mg/μL之外，其他条件同实施例1。

实施例9

与实施例1相比，除了不使用嵌套筛网小室之外，其他条件同实施例1。

对比例1

与实施例1相比，除了将金属浴替换为高温高压抗原修复法的常规操作方法之外，其他条件同实施例1。

高温高压抗原修复法步骤如下：置组织切片于含适量柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)的塑料片盒中，在微波炉加热至沸腾约15min，自然冷却至室温。然后用PBS(～pH7.4)洗3次，每次5min。

对比例2

与实施例1相比，除了不额外添加脱氧胆酸钠盐，其中RIPA裂解液中脱氧胆酸钠盐终浓度为1％之外，其他条件同实施例1。

对比例3

与实施例1相比，除了脱氧胆酸钠盐终浓度4.5％之外，其他条件同实施例1。

蛋白提取测试

分别使用实施例1-9以及对比例1-3所述蛋白提取方法，调整切片数量，使得样本总量大致相当，记录样本重量及提取得到的蛋白质总量，结果如表1所示。

表1从石蜡包埋组织细胞中提取的蛋白质总量

由表1可知，比较实施例1与实施例5-6可以看出，组织切片厚度对蛋白提取的影响，使用相同的方法，切片过薄容易破碎丢失，切片过厚不易解链组织细胞内部的分子交联，均降低蛋白提取总量；比较实施例1与实施例7-8可知，加入裂解液后沉淀的质量浓度过低或过高均降低蛋白提取量，裂解液的加入量与蛋白提取总量不成线性关系；比较实施例1与实施例9可知，将切片置于嵌套筛网小室可有效防止脱蜡及梯度水化过程对切片完整性的损伤，没有嵌套筛网小室的保护固定作用，微量的组织切片很容易破碎，影响后续蛋白提取过程；比较实施例1与对比例1可知，金属浴替代常规的抗原修复液加微波加热的抗原修复步骤，能取得更好的效果，蛋白提取量更大，且抗原特异性辨认度更高，同时简化了提取步骤，省时快捷；比较实施例1与对比例2-3可知，脱氧胆酸钠盐的含量对蛋白提取的影响，添加量过少或过多均显著降低蛋白提取量。

蛋白质印迹实验(Western blot)

将实施例1与对比例1-3进行蛋白质印迹实验，测定半定量蛋白质的表达水平，具体步骤如下：

(1)SDS-PAGE采用12％的分离胶和5％的浓缩胶，蛋白上样量30g。

(2)电泳条件：先80V电压跑胶30min，后120V电压跑胶60min。

(3)转膜条件：采用NC膜300mA恒定电流转膜60min。

(4)一抗：4℃孵育过夜。

(5)二抗：室温孵育60min。

(6)ECL化学发光显影，结果见图1。

由图1可知，比较实施例1(D)与对比例1(A)、对比例2(B)和对比例3(C)所得蛋白质进行蛋白质印迹实验的结果，实施例1(D)所提取得到的蛋白质满足蛋白质印迹实验，且对于Akt、P53、GPADH、Bcl-2或Bax蛋白的检测敏感性均高于对比例1(A)、对比例2(B)和对比例3(C)，能从微量样本中提取足量蛋白进行蛋白质印迹等下游实验。

综上所述，本发明用TO透明剂脱蜡安全简便。用高温煮沸法可避免蛋白常规处理时因操作需要进行的反复冻融或超声破碎，两者均可导致一些低丰度蛋白质降解丢失。用金属浴加热代替抗原修复液加微波处理的步骤，操作简单安全省时，且所提蛋白质数量和质量均佳。通过对组织细胞裂解液的调整，发现在RIPA裂解液中额外添加0.5-3％的脱氧胆酸钠盐可显著提高总蛋白质的提取量，可以从较小的组织体积中获取较大的蛋白质总量，增加了对低丰度表达抗原的检测灵敏性，所提取的蛋白量满足下游实验的需求。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加，具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种从石蜡包埋组织中提取蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将石蜡包埋组织块处理为组织切片；

(2)对步骤(1)所得组织切片进行脱蜡处理；

(3)对步骤(2)脱蜡处理后的组织切片进行乙醇梯度水化处理；

(4)将步骤(3)处理后的组织切片清洗，离心，弃去上清液；

(5)在步骤(4)所得组织沉淀物中添加组织细胞裂解液，再进行金属浴；

(6)对步骤(5)所得混合物离心，取上清即为蛋白质；

其中，组织细胞裂解液为RIPA和脱氧胆酸钠盐的组合，所述组织细胞裂解液中的脱氧胆酸钠盐的质量分数为1.5-4％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织细胞裂解液中的脱氧胆酸钠盐的质量分数为1.5-3％，优选为2％；

优选地，步骤(1)所述切片的厚度为10-30μm；

优选地，步骤(2)之前还包括将步骤(1)所得的切片置于嵌套筛网小室。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述脱蜡处理所用脱蜡剂为TO透明剂；

优选地，所述脱蜡处理的时间为每次5-15min，优选为10min；

优选地，所述脱蜡处理的次数为2-5次，优选为3次。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述乙醇梯度水化处理具体步骤为：

(1’)将步骤(2)所得切片浸入无水乙醇，时间为3-8min，优选为5min；

(2’)将步骤(1’)所得切片浸入95％乙醇，时间为3-8min，优选为5min；

(3’)将步骤(2’)所得切片浸入75％乙醇，时间为3-8min，优选为5min；

(4’)将步骤(3’)所得切片浸入蒸馏水，时间为3-8min，优选为5min；

优选地，步骤(1’)和步骤(4’)独立地进行1-3次。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述组织沉淀物与组织细胞裂解液的质量体积比为1:5-20mg/μL，优选为1:10mg/μL。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述金属浴的温度为95-100℃，优选为100℃。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，步骤(5)所述金属浴的时间为20-40min，优选为30min。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)将石蜡包埋组织块去除多余石蜡，将组织切成厚度为10-30μm的切片，然后置于嵌套筛网小室中；

(2)将步骤(1)所述组织切片浸入TO透明剂脱蜡，脱蜡处理2-5次，每次浸泡8-15min；

(3)对步骤(2)所得组织切片进行乙醇梯度水化处理，先将切片浸入无水乙醇中水化1-3次，每次3-8min，再浸入95％乙醇3-8min，然后浸入75％乙醇3-8min，最后浸入蒸馏水1-3次，每次3-8min；

(4)将步骤(3)所得组织切片淋干，收集于已称重的1.5mL EP管中，用PBS清洗切片，12000-14000rpm离心3-5min，弃去上清液，差量法计算切片的重量；

(5)在步骤(4)所得组织沉淀物中添加组织细胞裂解液，使得组织沉淀物与组织细胞裂解液的质量体积比为1:(5-20)mg/μL，然后进行95-100℃金属浴20-40min；

(6)对步骤(5)所得混合物进行离心，4℃，10000-14000rpm离心15-40min，取上清即为蛋白质；

其中，组织细胞裂解液为RIPA和脱氧胆酸钠盐的组合，所述组织细胞裂解液中的脱氧胆酸钠盐的质量分数为1.5-4％。

9.一种如权利要求1-8任一项所述的方法提取得到的蛋白质。

10.一种如权利要求9所述的蛋白质用于蛋白质免疫印迹实验、免疫沉淀实验、免疫共沉淀实验、单维度蛋白电泳实验、双维度蛋白电泳实验、蛋白芯片实验或质谱分析任意一种或至少两种的蛋白组学实验的用途。

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