CN105424450A - 悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置，属于对测试用样品着色的方法，所述染色方法包括以下步骤：细胞球和培养基的分离、固定液固定、Triton？X-100通透细胞、封闭液封闭、抗目的蛋白的一抗工作液的加入、抗一抗的荧光二抗工作液的加入、DAPI染液染色细胞核。染色装置包括细胞小室和套装于细胞小室下端外部的染色套件。本发明悬浮细胞球免疫荧光染色方法具有高效、简便等优点，节约抗体用量，节约实验成本，节约人力和时间，在不改变免疫荧光染色基本原理、实验人员不需特别培训的基础上，得到准确可靠的实验结果，避免细胞球在实验操作过程中的丢失，提高实验的成功率，提高效率。
Description
技术领域
本发明属于一种对测试用样品着色的方法，具体涉及一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置。
背景技术
免疫荧光染色技术是常用细胞与分子生物学实验方法，它应用抗原-抗体反应原理，以荧光物质标记抗体而进行抗原定位，用于观察目的蛋白的表达以及蛋白间是否存在共定位或共表达关系。
对于多见的贴壁细胞免疫荧光染色，常用且普遍采用的是使细胞“爬片”于多聚赖氨酸包被的载体表面，然后进行经典的染色操作。然而对于在干细胞研究中常用的悬浮细胞球，因为它不贴壁，所以在经典的实验操作过程中极易造成细胞球的丢失。尽管现有文献报道使用多聚赖氨酸包被的盖玻片即可将悬浮细胞球粘附于盖玻片[1~3]，但实际操作结果并非如此，即使使用多聚赖氨酸包被的盖玻片，仍仅有10%~20%细胞球会粘附于盖玻片表面，且其中95%以上的细胞球会在经典操作过程中丢失，最终导致样本量过少而实验失败。
针对悬浮细胞的不贴壁性，现有文献报道了多种可用于悬浮细胞球的免疫荧光染色方法。
中国专利文献CN102288471B公开了一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法，该方法适用于悬浮细胞，完成实验至少需要10次以上细胞离心，此种方法不仅耗费时间和人力，而且将此种方法应用于悬浮细胞球时，由于细胞球的内层细胞和外层细胞表型不同，多次离心可使外层细胞脱离，损坏细胞球的结构和细胞组成，致最终检测的细胞球构成与实验操作前不同，影响实验结果的准确性。
还有文献报道用含10%血清培养基培养2h~4h可有助于细胞球粘附于盖玻片[1,2,4~6]。此种方法虽然克服了细胞球的不贴壁性，但细胞球需要在无血清条件下培养才能维持其表型，有血清培养会促进细胞球细胞分化[7]，改变其表型，干扰最终实验结果。且根据实验观察，细胞球于10%血清培养基培养30分钟即出现明显形态变化，细胞球外层细胞脱离细胞球并贴壁，说明细胞球已经发生表型改变，细胞组成由于有血清培养而被破坏。
Geraldo,S.等人研究发现将细胞球固定于胶原蛋白凝胶中确实可以保证细胞球不丢失[8]，但此种方法仍然存在缺陷：首先，凝胶中的胶原蛋白纤维会起到遮挡作用，影响共聚焦显微镜的激发光强度和穿透距离；其次，为了达到同样的染色效果，染色过程中需要抗体工作液浓度加倍甚至三倍，并延长抗体孵育时间，增加了消耗的时间和实验经费[9]。
Guerrero-Cazares,H.等人研究将细胞球应用OCT包埋剂包埋制成冰冻组织切片再行免疫荧光染色[10]，此种方法的缺点在于需要冰冻切片机，冰冻组织的切片需要具备专业技术的人员制备，且切片的过程中难以找到有细胞球的层面针对性取材，实验步骤繁琐，耗费时间很长。
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发明内容
本发明是为了克服现有技术中存在的悬浮细胞球不贴壁生长难以制样以及现有悬浮细胞球免疫荧光染色方法存在的各种缺点而提出的，其目的是提供一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置。
本发明的技术方案是：
一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
（i）组合细胞小室和染色套件，取细胞球悬液加入细胞小室，弃染色套件内培养基，清洗细胞球；
（ii）向细胞小室中加入组织细胞固定液固定，弃染色套件内液体，清洗细胞球；
（iii）向细胞小室中加入TritonX-100通透细胞，弃染色套件内液体，清洗细胞球；
（iv）向细胞小室中加入封闭液封闭，孵育，弃染色套件内液体；
（v）向细胞小室中加入抗目的蛋白的一抗工作液，孵育，恢复至室温，回收染色套件内一抗工作液，清洗细胞球；
（vi）向细胞小室中加入抗一抗的荧光二抗工作液，孵育，弃染色套件（2）内液体，清洗细胞球；
（vii）向细胞小室中加入DAPI染液染色细胞核，弃染色套件内液体，清洗细胞球。
所述清洗细胞球的方法为重组细胞小室和染色套件，向细胞小室中加入200ulPBS清洗细胞球，静置5min，拔下染色套件，弃染色套件内PBS，重复操作三次。
所述步骤（vii）完成染色后，重组细胞小室和染色套件，向细胞小室中加入150ulPBS，置于湿盒中4℃避光保存。
所述步骤（ii）中组织细胞固定液为多聚甲醛，多聚甲醛的加入量为100ul，其质量浓度为4%，多聚甲醛固定时间为10min。
所述步骤（iii）中TritonX-100的加入量为100ul，其质量浓度为0.2%，TritonX-100通透细胞的时间为10min。
所述步骤（iv）中封闭液为山羊血清，山羊血清的加入量为100ul，其质量浓度为2%。
所述步骤（vi）中抗一抗的荧光二抗工作液的加入量为100ul。
所述步骤（vii）DAPI染液的加入量为100ul，DAPI染液染色细胞核的时间为5min。
所述步骤（iv）中孵育的方法为置于湿盒中于37℃下孵育1h；所述步骤（v）中孵育的方法为置于湿盒中4℃孵育过夜；所述步骤（vi）中孵育的方法为于湿盒中37℃避光孵育2h。
一种悬浮细胞球免疫荧光染色装置，包括细胞小室，所述细胞小室为上端敞口的圆台型结构，细胞小室的底面为有机材料膜，还包括套装于细胞小室下端外部的染色套件，染色套件是中空且上端敞口的圆台型结构，中部形成内底，内底为下陷的圆锥面。
本发明的有益效果是：
本发明悬浮细胞球免疫荧光染色方法具有高效、简便、快速等优点，节约抗体，节约实验成本，节约人力和时间，在不改变免疫荧光染色基本原理、实验人员不需特别培训的基础上，得到准确可靠的实验结果，避免细胞球在实验操作过程中的丢失，提高实验的成功率，提高效率。
附图说明
图1本发明中染色装置的结构示意图。
其中：
1细胞小室2染色套件
3内底4挂件
5缺口。
具体实施例
下面结合说明书附图及实施例对本发明悬浮细胞球免疫荧光染色方法及染色装置进行详细说明：
如图1所示，一种悬浮细胞球免疫荧光染色装置，包括细胞小室1，所述细胞小室1为上端敞口的圆台型结构，上缘均布多个弧形缺口5，且沿细胞小室1的外圆周壁均布多个挂件4，弧形缺口5与挂件4交错分布，细胞小室1的底面为有机材料膜，其特征在于：还包括套装于细胞小室1下端外部的染色套件2，染色套件2是中空且上端敞口的圆台型结构，中部形成内底3，内底3为下陷的圆锥面。
所述内底3到染色套件2顶端的垂直距离小于等于细胞小室1外部的挂件4下缘到细胞小室1底面的垂直距离。
所述染色套件2的上端内径与细胞小室1下端外径紧配合。
所述染色套件2采用具有韧性的材料制成，满足染色套件2套装于细胞小室1下端外部时，染色套件2与细胞小室紧配合，能够达到将上室内液体吸至下室的目的。
实施例1
一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，所述染色方法包括以下步骤：
（i）组合细胞小室1和染色套件2，取细胞球悬液加入细胞小室1内，静置，拔下染色套件2，弃染色套件2内培养基；
（ii）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入200ulPBS清洗细胞球，静置5min，拔下染色套件2，弃染色套件2内PBS，重复操作三次；
（iii）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入100ul质量浓度为4%的多聚甲醛固定10min，拔下染色套件2，弃染色套件2内液体；
（iv）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入200ulPBS清洗细胞球，静置5min，拔下染色套件2，弃染色套件2内PBS，重复操作三次；
（v）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入100ul质量浓度为0.2%的TritonX-100通透细胞10min，拔下染色套件2，弃染色套件2内液体；
（vi）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入200ulPBS清洗细胞球，静置5min，拔下染色套件2，弃染色套件2内PBS，重复操作三次；
（vii）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入100ul质量浓度为2%的山羊血清封闭，将细胞小室1和染色套件2置于湿盒中，于37℃下孵育1h，拔下染色套件2，弃染色套件2内液体；
（viii）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入抗目的蛋白的一抗工作液，将细胞小室1和染色套件2置于湿盒中，于4℃下孵育过夜，待恢复至室温，拔下染色套件2，回收染色套件2内一抗工作液以备下次使用；
（ix）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入200ulPBS清洗细胞球，静置5min，拔下染色套件2，弃染色套件2内PBS，重复操作三次；
（x）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入100ul抗一抗的荧光二抗工作液，置于湿盒中，于37℃下避光孵育2h，拔下染色套件2，弃染色套件2内液体；
（xi）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入200ulPBS清洗细胞球，静置5min，拔下染色套件2，弃染色套件2内PBS，重复操作三次；
（xii）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入100ulDAPI染液染色细胞核5min，拔下染色套件2，弃染色套件2内液体；
（xiii）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入200ulPBS清洗细胞球，静置5min，拔下染色套件2，弃染色套件2内PBS，重复操作三次；
（xiv）重组细胞小室1和染色套件2，向细胞小室1中加入150ulPBS，置于湿盒中4℃避光保存；
（xv）用阔口枪头移液枪轻轻吹打细胞小室1内液体，吸取80ul细胞球悬液，滴于洁净的载玻片上或玻璃底培养皿内，激光共聚焦显微镜镜下观察。
拔下套件和弃套件内液体应操作迅速，避免长时间使小室上室内细胞球处于无液体浸润状态。
本发明提供的悬浮细胞球免疫荧光染色方法抗体用量少，可以回收抗体，节约实验经费；不改变免疫荧光染色基本步骤，便于科研人员掌握；细胞球不丢失，保证所有细胞球实验操作从始至终保留；在最大程度上保证细胞球结构组成完整，因为无需离心合其他复杂操作；节约实验时间，应用此方案制备样品最多仅需2天；不改变细胞球细胞的表型，染色装置结构简单、制造成本低，使用方便，利于推广应用；内底呈圆锥面设计有利于液体的聚集；染色套件采用具有韧性的材料制成能够达到将上室内液体吸至下室的目的。
Claims (10)
1.一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，其特征在于：所述染色方法包括以下步骤：
（i）组合细胞小室（1）和染色套件（2），取细胞球悬液加入细胞小室（1），弃染色套件（2）内培养基，清洗细胞球；
（ii）向细胞小室（1）中加入组织细胞固定液固定，弃染色套件（2）内液体，清洗细胞球；
（iii）向细胞小室（1）中加入TritonX-100通透细胞，弃染色套件（2）内液体，清洗细胞球；
（iv）向细胞小室（1）中加入封闭液封闭，孵育，弃染色套件（2）内液体；
（v）向细胞小室（1）中加入抗目的蛋白的一抗工作液，孵育，恢复至室温，回收染色套件（2）内一抗工作液，清洗细胞球；
（vi）向细胞小室（1）中加入抗一抗的荧光二抗工作液，孵育，弃染色套件（2）内液体，清洗细胞球；
（vii）向细胞小室（1）中加入DAPI染液染色细胞核，弃染色套件（2）内液体，清洗细胞球。
2.根据权利要求1所述的一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，其特征在于：所述清洗细胞球的方法为重组细胞小室（1）和染色套件（2），向细胞小室（1）中加入200ulPBS清洗细胞球，静置5min，拔下染色套件（2），弃染色套件（2）内PBS，重复操作三次。
3.根据权利要求1所述的一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，其特征在于：所述步骤（vii）完成染色后，重组细胞小室（1）和染色套件（2），向细胞小室（1）中加入150ulPBS，置于湿盒中4℃避光保存。
4.根据权利要求1所述的一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，其特征在于：所述步骤（ii）中组织细胞固定液为多聚甲醛，多聚甲醛的加入量为100ul，其质量浓度为4%，多聚甲醛固定时间为10min。
5.根据权利要求1所述的一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，其特征在于：所述步骤（iii）中TritonX-100的加入量为100ul，其质量浓度为0.2%，TritonX-100通透细胞的时间为10min。
6.根据权利要求1所述的一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，其特征在于：所述步骤（iv）中封闭液为山羊血清，山羊血清的加入量为100ul，其质量浓度为2%。
7.根据权利要求1所述的一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，其特征在于：所述步骤（vi）中抗一抗的荧光二抗工作液的加入量为100ul。
8.根据权利要求1所述的一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，其特征在于：所述步骤（vii）DAPI染液的加入量为100ul，DAPI染液染色细胞核的时间为5min。
9.根据权利要求1所述的一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法，其特征在于：所述步骤（iv）中孵育的方法为置于湿盒中于37℃下孵育1h；所述步骤（v）中孵育的方法为置于湿盒中4℃孵育过夜；所述步骤（vi）中孵育的方法为于湿盒中37℃避光孵育2h。
10.应用权利要求1所述的一种悬浮细胞球免疫荧光染色方法的染色装置，包括细胞小室（1），所述细胞小室（1）为上端敞口的圆台型结构，细胞小室（1）的底面为有机材料膜，其特征在于：还包括套装于细胞小室（1）下端外部的染色套件（2），染色套件（2）是中空且上端敞口的圆台型结构，中部形成内底（3），内底（3）为下陷的圆锥面。
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