CN111207987A

CN111207987A - 一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法

Info

Publication number: CN111207987A
Application number: CN202010174436.8A
Authority: CN
Inventors: 宋益哲; 曹易照; 欧镇生; 粱德灿; 李景秋; 刘靖; 凌伊; 王慧; 陈小锋; 李文佳
Original assignee: Dongguan Dongyangguang Biopharmaceutical Research And Development Co Ltd; Sunshine Lake Pharma Co Ltd
Current assignee: Dongguan Dongyangguang Biopharmaceutical Research And Development Co Ltd; Sunshine Lake Pharma Co Ltd; Guangdong HEC Pharmaceutical
Priority date: 2020-03-13
Filing date: 2020-03-13
Publication date: 2020-05-29

Abstract

本发明涉及一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法，该方法包括如下步骤：对三维悬浮细胞团进行预处理后，浸入石蜡液中包埋切片，进行抗原修复，再进行免疫荧光染色。本发明提供的方法细胞团内部细胞染色充分，结果准确，可以观察悬浮细胞团整体的蛋白表达和分布情况，且仅需要普通的荧光显微镜即可进行样本观察。

Description

一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学及相关检测领域，具体涉及一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法。

背景技术

免疫荧光技术(Immunofluorescence technique)是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，该方法将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

目前，有关3D悬浮细胞团(球)的免疫荧光染色方法主要包括：(1)离心法；缺陷是离心会造成部分细胞团损失、细胞受到损害、散掉变形，细胞团内部细胞染色不充分。(2)借助染色装置染色法；缺陷是去除残留液体不完全或细胞团容易变干，一个装置只能做一组样品，浪费试剂和抗体。并且，以上方法均需要借助价格昂贵的激光共聚焦显微镜观察染色结果，细胞团内部细胞染色效果无法判断。

如果直接使用经典石蜡包埋技术进行3D悬浮细胞团包埋后的免疫荧光染色，则会出现染色效果差、背景很深或染不上色、细胞团切片容易从玻片上脱落等问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的3D悬浮细胞团(球)免疫荧光染色技术的缺陷，提供了一种石蜡包埋3D悬浮细胞团的免疫荧光染色方法。本发明通过改进石蜡包埋前样品的预处理方法、石蜡切片后样品的抗原修复方法等，最终获得了可以成功进行石蜡包埋3D悬浮细胞团免疫荧光染色的技术方案。

具体而言，本发明提供一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法，该方法包括如下步骤：对三维悬浮细胞团进行预处理后，浸入石蜡液中包埋切片，进行抗原修复，再进行免疫荧光染色。

本发明所述细胞团可以是从动物体内取出的或人工培养的悬浮细胞团。

作为本发明的一种具体实施方式，所述细胞团为人胚胎干细胞细胞团，或是由人胚胎干细胞分化所得细胞的细胞团。

本发明所述预处理包括依次进行的：固定、脱水以及透明。

作为本发明的一种优选实施方式，所述固定采用3～5％甲醛溶液，在室温固定0.5～1.5h。

作为本发明的一种优选实施方式，所述脱水依次采用浓度为65～75％、85～95％、100％的乙醇逐级进行。每次孵育时间4～6min。

作为本发明的一种优选实施方式，所述透明包括：将脱水后的细胞团在二甲苯中进行至少一次孵育，优选为2～4次，每次孵育时间4～6min。透明完成后，需晾干细胞团。

本发明将预处理后的细胞团浸入石蜡液中包埋。作为本发明的一种优选实施方式，将细胞团浸入温度57～60℃的石蜡液，使其均匀分散沉入石蜡液的底部；浸蜡的时间优选为8～12min。

本发明所述切片的厚度优选为3～20μm。

本发明提供的方法在切片后，优选将载有细胞团的玻片烘干，然后脱蜡复水。

所述烘干的目的是去除切片中的水分，让切片更加粘牢在玻片上。作为本发明的一种优选实施方式，所述烘干是将切好的片子置于40～45℃的烘箱中烘干。所述烘干时间优选为8～16小时。

所述脱蜡复水的目的是便于染色，如果脱蜡不彻底，会使切片不易着色。作为本发明的一种优选实施方式，所述脱蜡包括：在二甲苯中浸泡至少一次，每次4～6min。作为本发明的一种优选方案，所述复水依次采用浓度为100％、85～95％、65～75％的乙醇逐级进行，每次2～4min。

本发明提供的方法需在进行荧光染色前进行抗原修复，以便于石蜡包埋的细胞团能够被充分上色。

作为本发的一种优选方案，所述抗原修复采用的修复液为浓度0.05～0.15M、pH8.8～9.2的EDTA溶液。

作为本发明的一种优选方案，所述抗原修复包括如下步骤：将载有细胞团的玻片置于抗原修复液中，95～100℃加热15～25min，再置于快速0～4℃冷却5～15min。

经过抗原修复后，可以对细胞团进行免疫荧光染色。所述免疫荧光染色可采用本领域的常规方法，包括透化，封闭、一抗孵育、二抗孵育等步骤。

与现有技术相比，本发明提供的方法具有包括如下多方面的显著优势：本发明提供的方法在整个过程中可保持细胞团的完整，实验结果准确性；根据细胞大小及需求选择不同切片厚度更有利于染色充分，染色效果更好，特别是细胞团内部的细胞染色更充分；染色步骤直接在玻片上进行，操作简单，节约试剂和抗体；可一次切多张片子进行多种组合染色，也可做单个细胞团的多张切片的多种染色；石蜡包埋细胞团样品易保存且保存时间非常久，且保存过程中还可以随时根据需求进行切片；根据需求切好的片子还可以做免疫组化染色；结果观察只需要普通荧光显微镜即可，无需价格昂贵的激光共聚焦显微镜。

附图说明

图1为实施例1中3D细胞团石蜡切片结果示意图；

图2为实施例1中石蜡包埋3D细胞团免疫荧光染色结果示意图；SOX2/TRA-1-60(20X显微镜)；

图3为实施例2中石蜡包埋3D细胞团免疫荧光染色结果示意图；NKX6.1/C-peptide(20X显微镜)；

图4为对比例1中石蜡包埋3D细胞团免疫荧光染色结果示意图；PAOA(20X显微镜)。

图5为对比例2中普通离心法进行3D细胞团免疫荧光染色结果示意图；SOX2/TRA-1-60(20X普通倒置荧光显微镜)。

具体实施方式

具体而言，本发明提供一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法，该方法主要包括以下步骤：

1.三维悬浮细胞团预处理；

2.石蜡包埋制片；

3.免疫荧光染色。

步骤1细胞团预处理包括细胞团的：1.1固定，1.2脱水，1.3透明；常规的细胞前处理步骤往往不能直接应用于三维悬浮细胞团，如细胞团固定液的选择以及固定时间，细胞团脱水和透明的时间把控。若采用常规的10％福尔马林固定液固定细胞团，则细胞质染色效果较差。若固定时间太久将会屏蔽抗原表位，影响抗原抗体结合。若脱水时间太长，可使得细胞团收缩变脆，影响切片。若透明时间不足，则影响石蜡进入，不能切片；若透明时间太长，则使细胞团收缩变硬变脆，切片易碎。

步骤2石蜡包埋制片包括：2.1浸蜡包埋，2.2切片，2.3烘干烤片，2.4脱蜡，2.5复水，2.6抗原修复；需做好烘干烤片的温度以及时间把控，抗原修复液和方法的选择。若切片的烘干烤片的温度、时间把控不准确，容易导致玻片上的切片脱落，影响后续检测。

步骤3对细胞团进行免疫荧光染色。所述免疫荧光染色可采用本领域的常规方法，包括透化、封闭、一抗孵育、二抗孵育等步骤。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：石蜡包埋3D细胞团免疫荧光染色

一、实验材料

细胞：人胚胎干细胞H9

试剂：75％酒精、细胞培养基、Matrigel、PBS、4％甲醛固定液、Triton X-100、无水乙醇、二甲苯、EDTA、PBS、Goat Serum、抗体、dH₂O、DAPI

设备：细胞培养箱(Thermo 150i)、超净工作台(苏州安泰)、Beckman离心机(X-15R)、细胞计数仪(Countstar)、倒置显微镜(Leica DM IL LED)、倒置荧光显微镜(LeicaDM i8)、轨道摇床(Chemglass)、4度冰箱(海尔HYC390)、负20度冰箱(海尔)、负压吸引器(鱼跃)、移液枪、微波炉、石蜡包埋机、石蜡切片机、自动脱蜡复水仪、制冰机

二、实验方法

1.细胞团样品准备

将细胞以合适密度传代至低吸附6孔板(Corning,3471)中，将6孔板置于轨道摇床上以合适的转速进行细胞培养。待细胞团粒径长至大小合适时，取200个左右的细胞团进行免疫荧光实验。

2.固定

收集细胞团加入固定液(4％甲醛溶液)室温固定1h。

3.脱水

固定后的细胞团须由低浓度至高浓度的乙醇逐级脱水。70％乙醇进行脱水，室温孵育5min。弃去70％乙醇，依次加入95％乙醇(孵育5min)，95％乙醇(孵育3min)，100％乙醇(孵育5min)，100％乙醇(孵育4min)，100％乙醇(孵育5min)室温条件下进行细胞团的脱水。

4.透明

弃去100％乙醇，加入二甲苯进行细胞团透明，室温孵育5min。重复上述二甲苯透明步骤3次，每次5min。透明完成后，将细胞团晾干。

5.浸蜡包埋

将细胞团转移至液体石蜡中浸蜡10min。

6.切片

将蜡块置于切片机上进行切片，一般细胞团的切片厚度为3-20um。

7.烘干烤片

将切好的片子置于42度烘箱中烘干烤片过夜(8-16h)，目的是去除切片中的水分，让切片更加粘牢在玻片上。

8.脱蜡

二甲苯室温浸泡切片5min，重复3次。

9.复水

100％乙醇浸泡切片3min，2次；95％乙醇浸泡切片2min，1次；70％乙醇浸泡切片2min，1次。

10.抗原修复

配制抗原修复液：0.1M EDTA(pH 9.0)。微波炉加热EDTA抗原修复液到100℃，将装有玻片的玻片架放入煮沸的EDTA修复液中，加热20min。加热完后取出容器放置冰水中快速冷却10min左右。

11.透化

疏水笔圈住细胞团，细胞团样品加透化液(PBS+0.1％Triton X-100)室温孵育15min。

12.封闭

细胞团样品加封闭液(PBS+10％Goat Serum)室温孵育1h。

13.孵育一抗

一抗采用anti-TRA-1-60(host:mouse IgM)；anti-SOX2(host:rat)均为1:100稀释使用。抗体稀释液用1％Goat Serum(PBS)配制，细胞团样品加入抗体后置于4度冰箱孵育过夜。

14.孵育二抗

PBS洗3遍。二抗采用Alexa

594goat anti-mouse IgM；Alexa

488donkey anti-rat均为1:250稀释使用，细胞团样品加入抗体后室温避光孵育40min。

16.染核

PBS洗3遍。DAPI染核室温孵育10min。

17.封片观察

指甲油进行封片处理。使普通倒置荧光显微镜进行样本观察并拍照，分析。

三、实验结论

3D细胞团石蜡切片结果如图1所示。

20X显微镜下石蜡包埋3D细胞团免疫荧光染色—SOX2/TRA-1-60结果如图2所示。由图片可以看出，人胚胎干细胞H9表达SOX2/TRA-1-60正常，石蜡包埋3D细胞团免疫荧光染色方法成功建立。

实施例2：石蜡包埋3D细胞团免疫荧光染色

一、实验材料

细胞：人胚胎干细胞H9分化的类胰岛细胞团

试剂：75％酒精、细胞培养基、Matrigel、PBS、4％甲醛固定液、Triton X-100、无水乙醇、二甲苯、EDTA、PBS、Goat Serum、抗体、dH2O、DAPI

设备：细胞培养箱(Thermo 150i)、超净工作台(苏州安泰)、Beckman离心机(X-15R)、细胞计数仪(Countstar)、倒置显微镜(Leica DM IL LED)、倒置荧光显微镜(LeicaDM i8)、轨道摇床(Chemglass)、4度冰箱(海尔HYC390)、负20度冰箱(海尔)、负压吸引器(鱼跃)、移液枪(eppendorf)、微波炉、石蜡包埋机、石蜡切片机、自动脱蜡复水仪、制冰机

二、实验方法

具体实验方法同实施例1。区别仅在于，其中抗体使用情况为：

一抗：Rat anti-Insulin；Mouse anti-NKX6.1均为1:100稀释使用。

二抗：Anti-rat Alexa 488；Anti-mouse Alexa 555均为1:500稀释使用。

三、实验结论

20X显微镜下石蜡包埋3D细胞团免疫荧光染色—NKX6.1/C-peptide结果如图3所示。由图片可以看出，人胚胎干细胞H9分化的类胰岛细胞团表达NKX6.1/C-peptide正常，石蜡包埋3D细胞团免疫荧光染色方法成功建立。

对比例1：非改进(经典)石蜡包埋技术3D细胞团免疫荧光染色

一、实验材料

细胞：LX-2与HepG2共培养细胞

试剂：75％酒精、细胞培养基、Matrigel、PBS、10％中性甲醛溶液(NBF)、含0.025％Triton X-100的TBS、无水乙醇、二甲苯、EDTA、PBS、Goat Serum、抗体、dH₂O、DAPI

二、实验方法

1.细胞团固定、脱水、透明、包埋和切片

细胞团固定在10％中性甲醛溶液(NBF)中，固定时间在18-24小时之间。固定后进行脱水和透明，然后将细胞团包埋于石蜡中，用切片机切成5-20微米的切片。，室温过夜脱水并干燥。

2.脱蜡复水

(1)二甲苯：2X 3分钟

(2)二甲苯与无水乙醇1:1混匀：3分钟

(3)无水乙醇：2X 3分钟

(4)95％乙醇：3分钟

(5)70％乙醇：3分钟

(6)50％乙醇：3分钟

(7)将切片浸入PBS 5分钟；

(8)将切片浸入蒸馏水中直至抗原修复。

3.抗原修复

热修复液Tris/EDTA缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，0.05％吐温-20，pH 9.0)。将样品置于抗原修复液中煮沸维持20分钟。取出容器放置水中冷却10分钟。

4.透化、封闭

在含0.025％Triton X-100的TBS中漂洗玻片2×5分钟。用含10％正常血清、1％BSA的TBS(100-400uL)室温封闭2小时。

5.一抗孵育

使用含1％BSA的TBS稀释一抗；滴加100-400μl一抗至每张切片，于湿盒内4℃过夜孵育；其中一抗使用情况为：Rat anti-PAOA为1:100稀释使用。

7.二抗孵育

使用含1％BSA的TBS稀释二抗；滴加100-400μl一抗至每张切片，室温下孵育30min-1h；在TBS中漂洗3X 5分钟。二抗：Anti-ratAlexa 488为1:500稀释使用。

8.染核

加DAPI室温孵育10min。

9.封片观察

三、实验结论

20X显微镜下石蜡包埋3D细胞团免疫荧光染色—PAOA结果如图4所示。虽然PAOA抗体经过在2D平面细胞中的免疫荧光染色验证效果很好，但由图4可以看出，使用该方法进行LX-2与HepG2共培养3D细胞团免疫荧光染色效果很不理想，DAPI和PAOA染色均很模糊，背景非常高，不能判断PAOA蛋白在细胞中的表达情况。

对比例2：普通离心法进行3D细胞团免疫荧光染色

一、实验材料

细胞：人胚胎干细胞H9

试剂：75％酒精、细胞培养基、Matrigel、PBS、4％甲醛固定液、Triton X-100、PBS、Goat Serum、抗体、dH₂O、DAPI

设备：细胞培养箱、超净工作台、离心机、细胞计数仪、倒置显微镜、倒置荧光显微镜、轨道摇床、4度冰箱、负20度冰箱、负压吸引器、移液枪、微波炉、石蜡包埋机、石蜡切片机、自动脱蜡复水仪、制冰机

二、实验方法

1.细胞团样品准备

将细胞以合适密度传代至低吸附孔板中，适时取细胞团进行免疫荧光实验。

2.固定

收集细胞团，固定液(4％甲醛溶液)室温固定细胞团样品1h。

3.透化

细胞团样品加透化液(PBS+0.1％Triton X-100)室温孵育15min。

4.封闭

细胞团样品加封闭液(PBS+10％Goat Serum)室温孵育1h。

5.孵育一抗

6.孵育二抗

PBS洗3遍。二抗采用Alexa

594goat anti-mouse IgM；Alexa

7.染核

PBS洗3遍。DAPI染核，室温孵育10min。

8.封片观察

三、实验结论

20X普通倒置荧光显微镜下观察常规离心法进行3D细胞团免疫荧光染色—SOX2/TRA-1-60结果如图5所示。由图片可以看出，人胚胎干细胞H9中SOX2/TRA-1-60染色非常不清晰，很难分辨细胞中蛋白表达水平和表达丰度等，且无法观察细胞团内部细胞的蛋白表达情况。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种石蜡包埋三维悬浮细胞团的免疫荧光染色方法，其特征在于，包括如下步骤：对三维悬浮细胞团进行预处理后，浸入石蜡液中包埋切片，进行抗原修复，再进行免疫荧光染色。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理包括依次进行的：固定、脱水以及透明。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定采用3～5％甲醛溶液，在室温固定0.5～1.5h。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述脱水依次采用浓度为65～75％、85～95％、100％的乙醇逐级进行；

优选地，所述脱水包括：将固定后的细胞团在65～75％的乙醇中孵育4～6min，再在85～95％的乙醇中孵育至少一次，每次孵育4～6min，再在100％的乙醇中孵育至少一次，每次孵育4～6min。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述透明包括：将脱水后的细胞团在二甲苯中进行至少一次孵育，每次孵育时间4～6min。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的方法，其特征在于，切片后，将载有细胞团的玻片烘干，然后脱蜡复水。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述烘干为在40～45℃下烘干8～16h。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗原修复采用的修复液为0.05～0.15M、pH8.8～9.2的EDTA溶液。

9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于，所述抗原修复包括如下步骤：将载有细胞团的玻片置于抗原修复液中，95～100℃加热15～25min，再快速置于0～4℃冷却5～15min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞团是人胚胎干细胞细胞团，或是由人胚胎干细胞分化所得细胞的细胞团。