CN104744588A - 一种用于制备抗体的抗原预处理方法 - Google Patents

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郑美云
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本发明公开的是一种用于制备抗体的抗原预处理方法，涉及免疫学技术领域。该方法采用抗原修复液处理纯化后的抗原蛋白。本发明的目的是在于针对免疫组化技术的特点以及现有技术存在的不足，提供的抗原预处理方法，具有操作简便、生产成本低等优点。本发明根据免疫组化的关键步骤：抗原修复，选择相应的抗原修复液处理抗原，有针对性地设计可应用于免疫组化的抗原预处理方法，即根据抗原的处理方式选择抗体的免疫组化的修复方式；本方法操作简便、生产成本低，为制备应用于免疫组化的抗体提供了一条新颖有效的途径。

Description

一种用于制备抗体的抗原预处理方法
技术领域
    本发明公开的是一种用于制备抗体的抗原预处理方法，涉及免疫学技术领域。
背景技术
免疫组化技术是20世纪70年代初Sterb Berger在酶标法的基础上以免疫学的抗原抗体反应为理论基础发展起来的一门方法学，是对组织和细胞内的特定抗原或抗体(多肽和蛋白质)进行定位、定性或定量检测的一门技术。免疫组化技术在生物学领域尤其是在基础医学和临床研究中发挥着极其重要的作用，其技术的引入改变了对肿瘤的诊断和分类的研究深度，使其从细胞水平提高到了生物化学水平、分子水平，大大提高了肿瘤诊断的准确性和灵敏度，为肿瘤的治疗打下了良好的基础。免疫组织化学技术目前主要的应用于临床检测，包括以下几个方面：（1）良性和恶性肿瘤的诊断与鉴定；（2）肿瘤分期；（3）肿瘤来源的鉴定；（4）区分组织器官交界处肿瘤；（5）发现微小转移灶；（6）感染性疾病的诊断；（7）指导肿瘤的治疗。
抗体是至今为止医疗分子发展十分迅速的一类免疫效应分子，在生物医学领域疾病诊治中得到广泛应用。发展至今，抗体的制备技术可以归纳为三个发展阶段，即多克隆抗血清、单克隆抗体和第三代基因工程抗体。当今市场上应用于免疫组化领域的抗体主要有多克隆抗血清和单克隆抗体，主要是鼠多抗、鼠单抗、兔单抗。制备高特异性、高灵敏性抗体的关键是抗原的选择。目前免疫老鼠的抗原分为人工合成的免疫原、从组织中提取的蛋白以及基因工程表达的蛋白，抗原的预处理一般是进行蛋白纯化。免疫组化技术需要准确定位抗原在组织的表达位置，因此抗体或抗原的设计应更具有针对性。只进行简单的蛋白纯化步骤得到的抗原缺乏针对性和目的性，将其作为免疫原制备的抗体在免疫组化技术的应用上经常存在抗体的定位不准确、特异性较差现象。鉴于此，在WB、ELISA技术上应用良好的优质抗体大多不能够适用于免疫组化技术。通过结合已有的抗原预处理方法和免疫组化的操作流程，本发明技术采用抗原修复液进一步预处理抗原，为制备适用于免疫组化的抗体奠定基础。
发明内容
    本发明的目的在于针对免疫组化技术的特点以及现有技术存在的不足，提供一种用于制备抗体的抗原预处理方法，具有操作简便、生产成本低等优点。
本发明的一种用于制备抗体的抗原预处理方法，是采用抗原修复液处理纯化后的抗原蛋白。
所述抗原修复液为EDTA缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液。
三种抗原修复液均为常规抗原修复液，选用任一种抗原修复液预处理后的抗原蛋白均可用于免疫动物，获得抗血清，或产生抗体的浆细胞，用于制备针对抗原的单克隆抗体。
所述的EDTA缓冲液处理抗原蛋白操作如下：在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1 mol/L、pH值为7.0-10.0的EDTA缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，50-120℃处理30s-30min。
更优选地，所述的EDTA缓冲液处理抗原蛋白操作如下：在抗原蛋白溶液中加入0.01 mol/L，pH8.0-9.0的EDTA缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，80-100℃处理15-25min。
所述的柠檬酸缓冲液处理抗原蛋白操作如下：在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1 mol/L、pH值为4.0-7.0的柠檬酸缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，50-120℃处理30s-30min。
更优选地，所述的柠檬酸缓冲液处理抗原蛋白操作如下：在抗原蛋白溶液中加入0.01 mol/L，pH5.0-6.0的柠檬酸缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，100-120℃处理60s-120s。
所述的Tris缓冲液处理抗原蛋白操作如下：在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1 mol/L、pH值为6.0-9.0的Tris缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，50-120℃处理30s-30min。
更优选地，所述的Tris缓冲液处理抗原蛋白操作如下：在抗原蛋白溶液中加入0.01 mol/L，pH值为7.0-8.0的的Tris缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，80-100℃处理15-25min。
本发明与现有技术相比，具有如下优点：
根据免疫组化的关键步骤：抗原修复，选择相应的抗原修复液处理抗原，有针对性地设计可应用于免疫组化的抗原预处理方法，即根据抗原的处理方式选择抗体的免疫组化的修复方式；本方法操作简便、生产成本低，为制备应用于免疫组化的抗体提供了一条新颖有效的途径。
附图说明
图1为EDTA抗原修复液处理组抗体免疫组化染色图；其中A: 空白对照；B: 阴性对照；C: pH值为7.0的EDTA抗原修复液处理组；D: pH值为8.0的EDTA抗原修复液处理组；E: pH值为9.0的EDTA抗原修复液处理组；F: pH值为10.0的EDTA抗原修复液处理组。
图2为柠檬酸抗原修复液处理组抗体免疫组化染色图；其中A: 空白对照；B: 阴性对照；C: pH值为4.0的柠檬酸抗原修复液处理组；D: pH值为5.0的柠檬酸抗原修复液处理组；E: pH值为6.0的柠檬酸抗原修复液处理组；F: pH值为7.0的柠檬酸抗原修复液处理组。
图3为Tris抗原修复液处理组抗体免疫组化染色图；其中A: 空白对照；B: 阴性对照；C: pH值为6.0的Tris抗原修复液处理组；D: pH值为7.0的Tris抗原修复液处理组；E: pH值为8.0的Tris抗原修复液处理组；F: pH值为9.0的Tris抗原修复液处理组。
具体实施方式
实施例1
在抗原蛋白溶液一（膜蛋白）中分别加入0.01 mol/L、pH值为7.0、8.0、9.0、10.0的EDTA缓冲液，抗原蛋白溶液一终浓度为1mg/mL，100℃处理20min。
分别用抗原修复液处理和未处理的抗原蛋白免疫老鼠，免疫三次后，ELISA检测血液抗体效价，检测效价达106，用抗体稀释剂将抗体稀释1000倍后进行免疫组化实验（《免疫组化试验手册》）。本实验以采用未处理抗原蛋白免疫的老鼠作为阴性对照，未免疫的空白老鼠作为空白对照。免疫组化染色结果如图1所示。
由图1可以看出，A图空白对照为免疫组化阴性结果，B图阴性对照的免疫组化染色结果膜蛋白定位模糊且染色弥散，从C、D、E、F图的比较来看，pH值为8.0、9.0的EDTA缓冲液处理组的免疫组化染色定位清晰、着色明显，非特异性染色少，故确定其为最佳条件。
实施例2
在抗原蛋白溶液二（膜蛋白）中分别加入0.01 mol/L、pH值为4.0、5.0、6.0、7.0的柠檬酸缓冲液，抗原蛋白终浓度为1mg/mL，120℃处理90s。
分别用抗原修复液处理和未处理的抗原蛋白免疫老鼠，免疫三次后，ELISA检测血液抗体效价，检测效价达106，用抗体稀释剂将抗体稀释1000倍后进行免疫组化实验。本实验以采用未处理抗原蛋白免疫的老鼠作为阴性对照，未免疫的空白老鼠作为空白对照。免疫组化染色结果如图2所示。
由图2可以看出，A图空白对照为免疫组化阴性结果，B图阴性对照的免疫组化染色结果膜蛋白定位模糊且染色弥散，从C、D、E、F图的比较来看，pH值为5.0、6.0的柠檬酸缓冲液处理组的免疫组化染色定位清晰、着色明显，非特异性染色少，故确定其为最佳条件。
实施例3
在抗原蛋白溶液三（膜蛋白）中分别加入0.01 mol/L、pH值为6.0、7.0、8.0、9.0的Tris缓冲液，抗原蛋白溶液三终浓度为1mg/mL，100℃处理20min。
分别用抗原修复液处理和未处理的抗原蛋白免疫老鼠，免疫三次后，ELISA检测血液抗体效价，检测效价达106，用抗体稀释剂将抗体稀释1000倍后进行免疫组化实验。本实验以采用未处理抗原蛋白免疫的老鼠作为阴性对照，未免疫的空白老鼠作为空白对照。免疫组化染色结果如图3所示。
由图3可以看出，A图空白对照为免疫组化阴性结果，B图阴性对照的免疫组化染色结果膜蛋白定位模糊且染色弥散，从C、D、E、F图的比较来看，pH值为8.0、9.0的Tris缓冲液处理组的免疫组化染色定位清晰、着色明显，非特异性染色少，故确定其为最佳条件。

Claims (8)

1.一种用于制备抗体的抗原预处理方法，其特征在于：采用抗原修复液处理纯化后的抗原蛋白。
2.根据权利要求1所述用于制备抗体的抗原预处理方法，其特征在于：所述抗原修复液为EDTA缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液。
3.根据权利要求2所述用于制备抗体的抗原预处理方法，其特征在于：所述EDTA缓冲液的处理条件为：在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1 mol/L、pH值为7.0-10.0的EDTA缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，50-120℃处理30s-30min。
4.根据权利要求3所述用于制备抗体的抗原预处理方法，其特征在于：所述EDTA缓冲液的处理条件为：在抗原蛋白溶液中加入0.01 mol/L、pH值为8.0-9.0的EDTA缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，80-100℃处理15-25min。
5.根据权利要求2所述用于制备抗体的抗原预处理方法，其特征在于：所述柠檬酸缓冲液的处理条件为：在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1 mol/L、pH值为4.0-7.0的柠檬酸缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，50-120℃处理30s-30min。
6.根据权利要求5所述用于制备抗体的抗原预处理方法，其特征在于：所述柠檬酸缓冲液的处理条件为：在抗原蛋白溶液中加入0.01 mol/L、pH值为5.0-6.0的柠檬酸缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL， 100-120℃处理60s-120s。
7.根据权利要求2所述用于制备抗体的抗原预处理方法，其特征在于：所述Tris缓冲液的处理条件为：在抗原蛋白溶液中加入0.01-0.1 mol/L、pH值为6.0-9.0的Tris缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，50-120℃处理30s-30min。
8.根据权利要求7所述用于制备抗体的抗原预处理方法，其特征在于：所述Tris缓冲液的处理条件为：在抗原蛋白溶液中加入0.01 mol/L、pH值为7.0-8.0的Tris缓冲液，抗原蛋白终浓度为0.01-200mg/mL，80-100℃处理15-25min。
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