CN110950951A

CN110950951A - 抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110950951A
Application number: CN201911397741.7A
Authority: CN
Inventors: 李恢波; 彭永辉; 李玲玲; 邓晓; 黄信超
Original assignee: Fuzhou Jiehe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Fuzhou Jiehe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-04-03
Anticipated expiration: 2039-12-30
Also published as: CN110950951B

Abstract

发明人提供了一种抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体和细胞株，其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。发明人还用EDTA对幽门螺旋杆菌蛋白进行了水浴处理，并以此为免疫原对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系13F1F6,以及由该细胞系所分泌的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达幽门螺旋杆菌的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗幽门螺杆菌单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori，简称Hp)是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，有1-2个微小弯曲，菌体长2-4μm，宽0.5-1.0μm，只有一条环状染色体，革兰氏阴性需氧杆菌。电子显微镜下菌体一端或两端可有多根带鞘鞭毛，运动活泼，通常在粘液层下面，粘膜上皮细胞，在胃小凹内及腺腔内，呈不均匀的集团状分布。Hp是慢性胃炎、胃十二指肠溃疡的重要致病因素，与十二指肠溃疡、胃癌、胃腺癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤发生密切相关，故可用作胃部组织炎症是否Hp感染的常用诊断指标。

Hp致病机制包括：Hp的定植、毒素引起的胃黏膜损害、宿主的免疫应答介导的胃黏膜损伤以及Hp感染后胃泌素和生长抑素调节失衡所致的胃酸分泌异常等，涉及炎症、免疫、泌酸、氧化等多方面，有毒力因子、细胞因子、自由基、毒力基因等多种Hp致病因子参与。Hp毒力因子主要有尿素酶、粘附素、超黏附因子、脂多糖、磷脂酶A的过氧化氢酶。Hp感染进而引发一系列症状并不是单一的一种毒力因子作用的结果，具体的致病机制还有待进一步的阐明。Hp存在许多菌种变异，这些变异决定了细菌的毒力和致病性。最近研究认为，菌株与宿主之间的多样性是由于多株菌株感染而不是单一菌株导致宿主体内的遗传多样化(Torres J,Backert S.Pathogenesis of Helicobacter pyloriinfection.Helicobacter 2008；13Suppl 1:13-17)。对同一位点上基因多态性所导致的蛋白表达水平及活性的差异，逐渐成为Hp感染宿主临床结局的一种新解释。

数据统计显示全球约50％成年人感染Hp，另相关医学研究表明慢性活动性胃炎达到了95％的Hp感染率。Hp已被列为引起胃癌肯定的致癌原，于1994年被国际癌症研究中心列为Ⅰ类致癌物质。因此检测该菌感染具有重要的现实意义。但在相关肿瘤检测当中，在免疫组织化学上的检测尚无相关报告。本发明尝试将抗Hp单克隆抗体应用于免疫组织化学上的检测，便于病理结果的准确诊断。

发明内容

发明人提供了一种抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

优选的，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列所编码。

优选的，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.16206的小鼠杂交瘤细胞系分泌。所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系13F1F6，所述细胞系的分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2018年07月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

优选的，所述单克隆抗体特异性识别幽门螺旋杆菌。

优选的，所述单克隆抗体为小鼠IgG_2b亚型单克隆抗体。

发明人还提供了一种抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体的制备方法，用于免疫小鼠的抗原蛋白为用EDTA缓冲液进行水浴处理的幽门螺旋杆菌全菌体蛋白。

优选的，所述EDTA缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为8.0-9.0，水浴温度为85℃-100℃。

本发明还提供了一株分泌抗幽门螺旋杆菌的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系13F1F6，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.16206。

发明人还提供了上述任一所述的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体，在免疫检测中的用途。

优选的，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，上述技术方案用EDTA对幽门螺旋杆菌蛋白进行了水浴处理，并以此为免疫原对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞系13F1F6,以及由该细胞系所分泌的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达幽门螺旋杆菌的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为纯化后Hp单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；

图2为胃炎组织免疫组化染色结果图，左为对照抗体Thermo兔多抗、右为13F1F6抗体。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

具体实施方式中所用0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)：称取氯化钠8g，磷酸氢二钠3.58g，磷酸二氢钾0.2g，氯化钾0.27g，调节pH7.4，高压灭菌。

具体实施方式中所用的包被缓冲液：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，pH9.6,加蒸馏水定容至1L。

具体实施方式中所用的稀释缓冲液(0.01M PBST，pH7.4)：称取Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，KH₂PO₄0.2g，NaCl 8.0g，KCl 0.27g，Tween-200.5mL，2％BSA，加蒸馏水定容至1L。

具体实施方式中所用的洗涤缓冲液为0.01M Tris.HCl-Tween 20，pH7.4。

具体实施方式中所用的封闭液：采用包被缓冲液配制的3％-5％脱脂牛奶。

具体实施方式中所用的终止液(2M H₂SO₄)：蒸馏水178.3mL，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7mL。

具体实施方式中HAT储存液：用10mL RPMI-1640不完全培养基溶解一小瓶HAT培养基添加剂。

具体实施方式中所用的HAT培养基：按照1mL HAT储存液:50mL RPMI-1640完全培养基的比例配制。

具体实施方式中所用的HT储存液：用10mL RPMI-1640不完全培养基溶解一小瓶HT培养基添加剂。

具体实施方式中所用的HT培养基：按照1mLHAT储存液:50mL RPMI-1640完全培养基的比例配制。

具体实施方式中所用的饱和硫酸铵：称取69.7g硫酸铵固体，蒸馏水定容至100mL，调pH至7.2-7.4。

具体实施方式中所用的NaAc-HAc缓冲液(pH4.0，0.06M)：称取NaAc固体4.92g，蒸馏水定容至1L，用HAc调pH至4.0。

实施例1幽门螺旋杆菌抗原预处理

一、幽门螺旋杆菌培养和菌体蛋白制备

将用哥伦比亚血琼脂培养基成功培养的Hp菌株NCTC11637刮下，溶于20ml PBS缓冲液中，10000rpm离心5min，取菌泥，用生理盐水重悬，加入菌悬液0.5％的甲醛溶液，37℃灭活24h，生理盐水洗涤三次后，调整菌液浓度为2×10⁸cfu/ml，得到灭活Hp菌悬液，通过超声裂解，获得Hp全菌体蛋白，并利用BCA法测得全菌体蛋白浓度，-20℃冻存备用。

二、用EDTA缓冲液修复全菌体蛋白：

由于加入甲醛溶液灭活的过程中，HP菌体蛋白会发生交联，遮蔽蛋白位点，发生免疫原性减弱的情况，用EDTA修复可解开交联，恢复蛋白的二级结构，进而提高菌体蛋白的免疫原性。

在Hp全菌体蛋白溶液中加入0.01mol/L、pH值为9.0的EDTA缓冲液，95℃水浴20s-30min，得到HP抗原蛋白溶液，其中Hp全菌体蛋白的终浓度为0.01mg/mL。

实施例2 13F1F6杂交瘤细胞系的建立

一、免疫动物

将实施例1中获得的HP抗原蛋白溶液对6-8周龄的Balb/c雌性小鼠进行腹部多点注射免疫，注射剂量为100μgHP抗原蛋白/只。首次免疫将HP抗原蛋白溶液与等体积的完全弗氏佐剂(CFA)混合，充分乳化后进行免疫；后每间隔2周，将HP抗原蛋白与等体积的不完全弗氏佐剂(IFC)均匀混合并充分乳化后进行加强注射，免疫3次；最后在融合前3天直接用100μgHP抗原蛋白溶液加强免疫小鼠。此外，以PBS与弗氏佐剂/弗氏不完全佐剂乳化混合物作为空白对照。

二、细胞融合

1、饲养层细胞的制备

细胞融合前24h，将未免疫的Balb/c小鼠摘除眼球采血，分离血清，作为抗体检测时的阴性对照血清；然后颈部脱位处死小鼠，于75％酒精中浸泡10min进行消毒，然后放入超净工作内，滤去部分小鼠表面酒精后，将小鼠以腹部朝上的形式固定于解剖板上，无菌剪开腹部皮肤，用无菌镊子夹起皮肤，暴露腹膜，用酒精棉球擦拭腹膜进行消毒。用一次性的无菌注射器吸取10mL的RPMI-1640不完全培养液，缓慢注入进小鼠腹腔，注意避免刺破消化肠道，右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1min，随后反复抽吸注入的培养基直至吸入注射器内的RPMI-1640不完全培养液泛黄为止。在1000rpm/min离心10min，弃上清，取5mlRPMI-1640完全培养液重悬细胞，并调整细胞浓度达到2×10⁵个/ml。将饲养细胞悬液加入96孔板，每孔一滴，置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2、骨髓瘤细胞SP2/0的制备：

提前2周复苏骨髓瘤细胞SP2/0，并扩大培养，收集足够对数生长期的SP2/0细胞，用适量不完全培养基润洗1次后，重悬于30mL不完全培养基并计数待用。

3、脾淋巴细胞的制备：

将上述免疫雌性Balb/c小鼠摘除眼球采血作为阳性对照血清；颈部脱位处死小鼠，于75％酒精中浸泡10min进行消毒，然后放入超净工作内，滤去部分小鼠表面酒精后，将小鼠以腹部朝上的形式固定于解剖板上，无菌取出脾脏并用RPMI-1640不完全培养基洗涤数遍，无菌镊子清除周围结缔组织；将脾脏置于无菌的细胞筛网中，用注射器内芯轻轻研磨脾脏，直至脾细胞充分渗出，研磨过程中注意保持脾脏细胞湿润；吸取30mL不完全培养基冲洗并制备脾细胞悬液，将其转移至50mL离心管中，1500rpm离心5min，弃上清；加入15mL不完全培养基重悬脾细胞并计数，取1×10⁸个细胞待用。

4、细胞融合

将收集的脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞按照5:1的重量比例混合，1000rpm/min离心10min；弃尽上清，用手轻弹离心管底部，使细胞保持松散；吸取1mL37℃预热的50％的PEG融合剂，1min内逐滴滴加融合剂，整个过程是边旋转边加入PEG融合剂，同时轻柔抖动离心管，使细胞与融合剂充分混合；旋转同时加入25mL、37℃预热RPMI-1640不完全培养基，并在90s内完成，此稀释过程应先慢后快，前5s加1ml，前10s加2ml；室温静置10min后，1000rpm/min条件下离心10min；弃上清，加入适量含10％胎牛血清的HAT培养基，重悬细胞；将杂交瘤细胞悬浮液分配到加入了饲养层细胞的96孔细胞培养板中，做好相应标记，置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

5、挑克隆

融合后7d克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取大小较均一、光亮、浑圆的克隆团分到事先准备好的96孔培养板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

三、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

将上述免疫雌性Balb/c小鼠摘除眼球采血作为阳性对照血清作为筛选时的阳性对照；以非免疫小鼠眼球采血制备的血清作为阴性对照；同时以PBST作为空白对照，采用间接ELISA法筛选融合细胞。具体步骤如下：

(1)包被：用包被缓冲液将HP抗原蛋白溶液稀释至5μg/mL，然后包被聚苯乙烯板的反应孔，100μL/孔，4℃过夜。

(2)洗涤：弃去孔内的包被液，用PBST洗涤3次,每次3min(以下简称洗涤)。(3)封闭：每孔加入200μL的封闭液，37℃封闭2h；尽量弃尽封闭液。

(4)加一抗：每孔加入100μL用稀释液稀释至一定浓度的免疫血清，同时设置阳性、阴性和空白对照，37℃下孵育1h；孵育完毕后弃尽一抗，充分洗涤后甩干。

(5)加二抗：每孔加入100μL用稀释液稀释至一定浓度的HRP-羊抗小鼠IgG二抗，37℃下孵育30min；孵育完毕后弃尽弃尽酶标二抗，洗涤，甩干。

(6)显色：每孔加入100μL底物TMB，37℃避光反应10-15min；每孔加入50μL的终止液以终止显色反应。测定各孔OD₄₅₀。

(7)结果判定：

测定结果若显示(待检孔的OD₄₅₀-空白对照)≥2.1×(阴性孔的OD₄₅₀-空白对照)，且阴性孔的OD₄₅₀>0.1，则将此时待检孔内的细胞株判为阳性株。

四、杂交瘤细胞细胞的克隆化培养：

经过克隆化筛选和培养的杂交瘤细胞株，能够稳定分泌抗体。杂交瘤细胞株一般经过2-3次的克隆化才能稳定。本实验采用有限稀释法进行克隆化培养，具体步骤如下：

(1)将检测结果为阳性的细胞吹起制成细胞悬液。

(2)用排枪吸取HT培养基加入96孔板的第一列，每孔100μL，共8孔。

(3)吸取100μL细胞加入96孔板的第一列第一孔，混合均匀后，依次在第一列的其余孔进行梯度稀释。

(4)显微镜下观察每孔细胞数量，并计数每个视野的细胞数量。

(5)选取视野中含有10-15个细胞的一孔，吸取细胞液至含有20mLHT

培养基的离心管，混匀。

(6)将混合细胞悬液加入96孔板中，每孔200μL，做好具体标记后放置于37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

(7)约7-10天左右在倒置显微镜下观察细胞，标出肉眼可见的只有单个克隆生长的孔，进行抗体检测。

(8)将检测结果阳性细胞扩大培养，并做好保种冻存工作。

(9)重复克隆化过程，直至100％孔分泌抗体，可建系保存该细胞株。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

将克隆化培养、筛选得到的杂交瘤细胞接种于8-10周龄体重20g以上的Balb/c雌性小鼠腹腔内，即可得到抗体浓度很高的腹水单抗。具体方法如下：

1、每只小鼠腹腔注射液体石蜡0.5mL。

2、一周后每只小鼠注射杂交瘤细胞(2×10⁶-5×10⁶细胞/0.2mL)。

3、小鼠腹部明显膨大，则可采集其腹水。

4、3000r/min离心10min，收集上清，分装后于-20℃冻存备用。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按照说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。SDS结果见图1，测定结果为：抗体纯度约90％，抗体浓度6.6mg/ml。纯化的抗体保存于-20℃备用。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚型鉴定

利用亚型鉴定试剂盒采用ELISA法进行鉴定，具体步骤如下：

(1)用PBS缓冲液将亚型鉴定抗体稀释1000倍。

(2)每种抗体鉴定设置2孔，每孔添加100μL已稀释的亚型抗体，37℃孵育1h。

(3)移除包被液，用洗涤液冲洗3×3min。

(4)每孔添加100μL待测样品(培养基上清可直接添加，浓缩液或纯化液应用PBS缓冲液稀释至2-5μg/mL)室温下孵育1h。

(5)移除包被液，用洗涤液冲洗3×3min。

(6)将酶标二抗IgG(Fab特异性)，用洗涤液按1:500稀释。

(7)每孔添加100μL已稀释的酶标二抗IgG，室温孵育30min。

(8)移除包被液，用洗涤液冲洗3×3min。

(9)每孔添加100μL TMB显色剂显色5-30min。

(10)每孔添加50μL终止液，450nm下测定吸光值。

结果显示，本发明单克隆抗体为IgG_2b型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被Hp全菌体蛋白，包被浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，PBS-T洗3次。实施例3纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/mL)：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl TMB(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl 1.0N盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台OD值”对应的抗体浓度A。利用下列公式计算出亲和常数为7.23×10⁹L×mol^-1。

三、单抗反应特异性和应用效果

1、间接ELISA法

将培养的酵母菌、埃希克氏大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、腾黄八叠球菌以及幽门螺杆菌标准株经超声破碎后，收集上清并作为包被抗原，进行间接ELISA检测。检测结果显示该单抗只与幽门杆菌标准株呈现阳性反应，而与其它几种菌无反应。

实施例5组织芯片染色和鉴定

一.组织蜡块制备过程

对样本进行HE切片染色，以确定病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.IHC染色及分析

(1)脱蜡和水化：脱蜡前将组织切片放在60℃恒温箱烘烤20min，再分别置于二甲苯I、二甲苯II中浸泡10min；再按先后顺序分别浸泡于无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95％乙醇、85％乙醇中，各浸3min。最后水中浸泡5min。

(2)抗原修复：采用EDTA常压加热修复。

(3)甩去PBS，用PAP笔在组织片周围画圈，油圈距离组织片边缘2-3mm。

(4)封闭内源性过氧化物酶：在切片上滴加过氧化物酶阻断试剂，室温下孵育10min。PBS冲洗3×3min。

(5)封闭非特异性抗原：甩去PBS液，滴加5％山羊血清，37℃下孵育10min

(6)加一抗：甩去山羊血清，每张切片滴加50-100μL适当比例稀释的第一抗体(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)，37℃下孵育60min或4℃孵育过夜。PBS冲洗3×3min。

(7)加二抗：甩去PBS液，每张切片滴加50-100μL的二抗，37℃下孵育20-30min。PBS冲洗3×3min。

(8)DAB显色：甩去PBS液，用新鲜配制的DAB溶液显色3-10min。

(9)复染：用自来水冲洗去DAB溶液，苏木素复染20s，PBS返蓝20s。

(10)封片：经梯度酒精脱水干燥或电吹风吹干组织切片后，滴加中性树胶进行进行封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。染色结果根据染色强度的差异进行划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三、样本检测结果统计：

将本抗体和市售抗体(Thermo兔多抗)在组织芯片(包括60例胃炎、109例胃癌)上进行幽门螺旋杆菌的同步检测并比较检测结果。HP的免疫组化试验过程采取双盲设计，试验结果如下表所示。

本抗体和市售临床抗体(Thermo兔多抗)符合率达到100％。同时，本抗体在1例胃炎组织内的染色强度大于市售抗体，说明本抗体在胃炎、胃癌组织的特异性同市售抗体相当，敏感性和亲和力高于市售抗体。本抗体能够呈现胃幽门螺杆菌形态，呈弧形弯曲状、S形或点状，菌体纤细，便于观察。而对照兔多抗呈现的菌体形态偏粗，未能呈现菌体真正形态，镜下观察的形态不够清晰。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗幽门螺杆菌单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

<130> 2018

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly

1 5 10 15

Val Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Ser Asn Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Thr

65 70 75 80

Gln Lys Phe Arg Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Val Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Phe Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Glu Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

130 135

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Met Asp Ser Gln Ala Gln Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser

1 5 10 15

Gly Thr Cys Gly Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Val Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn

35 40 45

Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

50 55 60

Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Ser Arg

65 70 75 80

Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr

100 105 110

Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr

115 120 125

Lys Leu Glu Ile Lys

130

<210> 3

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

atggaatgta actggatact tccttttatt ctgtcagtaa cttcaggtgt ctactcacag 60

gttcagctcc agcagtctgg ggctgaactg gcaagacctg gggcctcagt gaagttgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac ctttagtaac tactggatgc agtgggtaaa acagaggcct 180

ggacagggtc tggaatggat tggggctatt tatcctggag atggtgatac tagatacact 240

cagaagttca gggccaaggc cacattgact gcagataaat cctccagcac agtctacatg 300

caactcagca gtttggcatc tgaggactct gcggtctttt actgtgcccg aggaagcgaa 360

ctgggatttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 408

<210> 4

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

atggattcac aggcccaggt tcttatgtta ctgctgctat gggtatctgg tacctgtggg 60

gacattgtga tgtcacagtc tccagcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 120

atgagctgca agtccagtca gaacctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 180

tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccagtagg 240

gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300

atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatacctat 360

ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaa 399

Claims

1.一种抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列所编码。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.16206的小鼠杂交瘤细胞系分泌。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别幽门螺旋杆菌。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG_2b亚型单克隆抗体。

6.一种抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，用于免疫小鼠的抗原蛋白为用EDTA缓冲液进行水浴处理的幽门螺旋杆菌全菌体蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述EDTA缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为8.0-9.0，水浴温度为85℃-100℃。

8.一株分泌抗幽门螺旋杆菌的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系13F1F6，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.16206。

9.权利要求1-5任一所述的抗幽门螺旋杆菌单克隆抗体，在免疫检测中的用途。

10.根据权利要求9所述的免疫检测，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。