CN113999304B - 抗肠菌素单克隆抗体mAb4及其在肠菌素检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肠杆菌科细菌分泌产物的检测，具体涉及抗肠菌素单克隆抗体mAb4及其在肠菌素检测中的应用。所述抗肠菌素单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.21016的杂交瘤细胞所分泌。基于所述抗肠菌素单克隆抗体，本发明建立了一种快速检测基质中肠菌素含量的方法，该方法具有快速便捷、特异性强、准确性高、重现性好的优点。本发明实现了对肠菌素的快速定量检测，为畜禽肠道病原细菌感染的防控提供了技术支持。

Description

抗肠菌素单克隆抗体mAb4及其在肠菌素检测中的应用
技术领域
本发明涉及肠杆菌科细菌分泌产物的检测，具体涉及抗肠菌素单克隆抗体mAb4及其在肠菌素检测中的应用。
背景技术
细菌侵入宿主肠道定植的过程中，离不开一些关键因子来克服苛刻的生长环境，比如细菌生长必需的营养因子--铁离子，在健康宿主肠道中的浓度约为10-24M，而细菌生长所需的浓度为10-5～10-7M。铁载体是细菌分泌的一种小分子化合物(<1.0kDa)，对三价铁离子表现出高度的亲和力，因此，为在缺铁环境下捕获生长所需的铁离子，细菌利用铁载体对铁进行转运。
肠菌素(Enterobactin，Ent)是一种主要由肠杆菌科细菌分泌的分子量为670Da的小分子化合物，是目前已知对铁亲和力最高的铁载体(Kd＝10-49M)。肠菌素介导的铁摄取系统在肠道病原细菌定植宿主肠道过程中发挥关键作用，如鼠伤寒沙门氏菌可滞留在小鼠单核细胞中，并引发系统性持续感染，而这种感染依赖于铁转运蛋白FepBDGC和肠菌素对铁的转运，同时协助沙门氏菌逃避巨噬细胞的免疫作用；空肠弯曲菌自身不能分泌肠菌素，但同样可利用肠菌素介导的铁摄取系统来促进其在宿主肠道中定植和致病。因此，肠菌素含量对病原菌在宿主肠道内的生长和定植具有重要影响。目前还缺少一种快速准确检测肠菌素含量的方法。
发明内容
本发明旨在制备抗肠菌素单克隆抗体，并基于此建立可以定量检测基质中肠菌素含量的快速检测方法。通过对肠菌素的定量检测，同时分析肠道病原菌定植情况，以实现将肠菌素含量作为指示肠道内病原细菌定植水平的标识物，为畜禽肠道病原细菌感染的防控提供技术支持。
本发明提供一种抗肠菌素单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.21016的杂交瘤细胞所分泌。
分泌所述的抗肠菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株也属于本发明的保护范围，其保藏编号为CGMCC No.21016。
本发明还提供用于定量检测肠菌素的ELISA试剂盒，其包含权利要求1所述的抗肠菌素单克隆抗体。
优选地，所述试剂盒还包含肠菌素-BSA偶联物；所述肠菌素-BSA偶联物被预先包被在酶标板上或用于临用前包被在酶标板上，包被浓度为1ng/μL；所述抗肠菌素单克隆抗体的工作浓度为11.72ng/mL。
优选地，所述肠菌素-BSA偶联物的包被缓冲液为0.05mol/L，pH 9.6的碳酸盐缓冲液。
优选地，所述试剂盒还包含肠菌素标准品、酶标的抗小鼠二抗、封闭液、洗涤液、显色液和/或终止液。
优选地，所述试剂盒还包含用于稀释肠菌素标准品和抗肠菌素单克隆抗体的竞争反应液；所述竞争反应液为0.05mol/L，pH 9.6的碳酸盐缓冲液，含5％(v/v)小牛血清，离子浓度为0，并且不添加有机溶剂。
优选地，所述封闭液含有Na2HPO4 5.80g/L，NaH2PO4 0.593g/L，蔗糖50.00g/L，5％(v/v)小牛血清，和0.02％(v/v)Proclin 300。
本发明还提供一种快速检测基质中肠菌素含量的方法，其特征在于：使用任一所述的试剂盒，通过间接竞争ELISA方法检测基质中肠菌素的含量。所述基质可以是液体培养基，包括但不限于BHI、LB、MHB、PPLO、T-medium和TSB培养基；所述基质也可以是除培养基以外的其他液体基质。
优选地，所述方法包括如下步骤：
(1)将1ng/μL的肠菌素-BSA偶联物溶液加入酶标板中，100μL/孔，孵育；洗酶标板，拍干；
(2)加入封闭液，孵育；洗酶标板，拍干；
(3)使用竞争反应液配制梯度浓度的肠菌素标准品溶液以及浓度为11.72ng/mL的抗肠菌素单克隆抗体溶液；在酶标板上设置对照孔、标准品孔和样品孔，对照孔中不加样，向各个标准品孔中分别加入等体积的梯度浓度的肠菌素标准品溶液，向样品孔中加入等体积的待测基质，最后向所有微孔中加入等体积的抗肠菌素单克隆抗体溶液；用盖板膜封板，25℃反应90min；洗酶标板，拍干；
(4)加入酶标记的抗小鼠二抗，孵育；洗酶标板，拍干；
(5)加入显色液，孵育；
(6)加入终止液，混匀后在450nm/630nm波长下检测每孔吸光度值；
(7)以肠菌素标准品溶液的浓度为横坐标，以抑制率(B/B0)为纵坐标，绘制标准曲线；其中B0为对照孔的OD450nm-OD630nm值，B为各个标准品孔的OD450nm-OD630nm值；将样品孔的OD450nm-OD630nm值代入标准曲线中，计算得到待测基质中肠菌素的含量。
本发明提供的抗肠菌素单克隆抗体，其制备过程主要包括：(1)肠菌素的制备和纯化；(2)将纯化的肠菌素与载体蛋白如钥孔傶血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)等进行偶联，鉴定偶联效果并对偶联产物进行纯化；(3)将纯化的偶联产物与佐剂乳化后制备免疫原，对小鼠进行免疫；(4)利用间接酶联免疫吸附(Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)方法对小鼠血清进行免疫效价检测；(5)选取免疫效价高的小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞融合，制备可产生肠菌素特异性抗体的杂交瘤细胞；(6)利用间接ELISA方法筛选可产生肠菌素特异性抗体的杂交瘤细胞；(7)对筛选出的杂交瘤细胞株分泌的肠菌素特异性抗体进行亚类鉴定；(8)对制备纯化的肠菌素单克隆抗体的特异性进行检测。
基于制备的特异性抗肠菌素单克隆抗体，本发明建立了可用于检测不同细菌在不同培养基中肠菌素含量的间接竞争ELISA检测方法，优化了最佳抗原包被浓度与单克隆抗体稀释倍数、间接竞争反应的条件(反应温度、反应时间、pH、离子浓度、有机溶剂含量)。经实验证明，本发明建立的间接竞争ELISA方法对培养基BHI、LB、MHB、PPLO、T-medium和TSB中肠菌素检测的灵敏度IC50分别为38.35、28.77、34.40、31.27、26.80和22.44μg/mL，检测限(LOD)分别为0.96、1.03、0.53、0.39、0.39和0.56μg/mL；特异性强，对肠菌素衍生物如Linear Ent、Salmochelins(MGE、DGE和TGE)均无交叉反应，且基质添加标准曲线R2均大于0.99(图4)，具有良好的准确性和重现性。
本发明提供的杂交瘤细胞已进行了专利保藏，保藏信息如下：
参椐的生物材料(株)：Ent_mAb4
分类命名：杂交瘤细胞
保藏日期：2020年11月30日
保藏编号：CGMCC No.21016
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为肠菌素(Enterobactin)的分子结构式。
图2为肠菌素与载体蛋白KLH/BSA偶联效果的非变性PAGE检测结果；图中Ladder为蛋白Marker，KLH表示仅KLH蛋白，BSA表示仅BSA蛋白，Ent-KLH表示肠菌素与KLH的偶联产物，Ent-BSA表示肠菌素与BSA的偶联产物。
图3为抗肠菌素单克隆抗体mAb4结合效果的Western Blot鉴定；图中Ladder为蛋白Marker，KLH表示仅KLH蛋白，BSA表示仅BSA蛋白，Ent-KLH表示肠菌素与KLH的偶联产物，Ent-BSA表示肠菌素与BSA的偶联产物。
图4为检测不同培养基中肠菌素含量的间接竞争ELISA标准曲线。横坐标为肠菌素浓度(μg/mL)，纵坐标为抑制率(B/B0)。其中B0为不添加肠菌素无抑制时对照孔的OD值，B为添加了相应浓度肠菌素抑制时孔的OD值；OD值＝OD450nm-OD630nm。在抑制率为50％时所对应的肠菌素浓度称为IC50。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细阐述，需要理解的是，下述实施例仅作为对本发明的解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中使用的大肠杆菌AN102菌株由美国田纳西大学林军教授馈赠，该菌株已在非专利文献Cox,G.B.,F.Gibson,R.K.Luke,N.A.Newton,I.G.O’Brien,andH.Rosenberg.1970.Mutations affecting iron transport in Escherichiacoli.Journal of Bacteriology,104:219–226中公开。
以下实施例中使用的SPF级BALB/c小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。
以下实施例中使用的SP2/0骨髓瘤细胞由北京市农林科学院畜禽疫病研究中心提供。
培养基
BHI(Brain heart infusion broth)培养基：购自OXOID(CM1135)，若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。
LB(Luria bertani broth)培养基：购自OXOID(CM0996)，若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。
MHB(Mueller-hinton broth)培养基：购自OXOID(CM0405)，若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。
PPLO(Mycoplasma broth)培养基：购自BD Difco(255420)，若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。
TSB(Tryptone soya broth)培养基：购自OXOID(CM0129)，若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。
T-培养基(T-medium，10L)：NaCl 58g，KCl 37g，CaCl2 1.33g，MgCl2·6H2O 1.0g，NH4Cl 11g，KH2PO4 2.72g，Tris 121.0g，Na2SO4 1.42g，100mmol/L MnCl2 100μL，酪蛋白水解物5g。121℃高压蒸汽灭菌20min。
试剂
乙酸乙酯：分子式C4H8O2，CAS号141-78-6，MREDA公司产品，货号：UN1173。
柠檬酸钠：分子式C6H5Na3O7，CAS号68-04-2，国药集团化学试剂有限公司产品，货号：10019418。
正己烷：分子式C6H14，CAS号110-54-3，MREDA公司产品，货号：UN1682。
BSA：牛血清白蛋白，ThermoFisher Scientific公司产品，货号：77110。
KLH：钥孔傶血蓝蛋白，ThermoFisher Scientific公司产品，货号：77600。
二甲基甲酰胺(DMF)：CAS号68-12-2，Sigma公司产品，货号：270547-1L。
Linear Ent、Salmochelin1、Salmochelin2、Salmochelin3的制备参照文献(WangHhuiwen,Zeng Ximin,Mo Yiming,He Bin,Lin Hening,Lin Jun.Enterobactin-SpecificAntibodies Induced by a Novel Enterobactin Conjugate Vaccine.Appl EnvironMicrob 2019,85,e00358-19)进行，具体方法简述为：
Linear Ent：线性Ent由Ent经重组酶IroE水解，并通过HPLC纯化制备。
Salmochelin1(MGE)：MGE由Ent经单糖基化修饰，并通过HPLC纯化制备。
Salmochelin2(DGE)：DGE由Ent经二糖基化修饰，并通过HPLC纯化制备。
Salmochelin3(TGE)：TGE由Ent经三糖基化修饰，并通过HPLC纯化制备。
若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和条件均为本领域常规实验方法和条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。
实施例1、抗肠菌素单克隆抗体的制备与筛选
1、肠菌素的制备和纯化
取大肠杆菌AN102菌株，用接种环在LB平板上进行划线，然后置于37℃恒温培养箱中培养。挑取AN102单菌落接种于5mL LB液体培养基中进行摇床培养，扩大培养至10L T-培养基，37℃摇床培养13-15h。收集AN102培养上清，用乙酸乙酯分3次萃取，第一次每升培养上清添加150mL的乙酸乙酯，充分混匀后，收集上层有机相。第二次每升培养上清添加50mL的乙酸乙酯，充分混匀后，收集上层有机相。第三次每升培养上清添加50mL的乙酸乙酯，充分混匀后，收集上层有机相。每升有机相添加10-30mL的柠檬酸钠。充分混匀后，4℃过夜。收集上层有机相，70℃蒸馏至50mL。逐滴加入正己烷至浓缩蒸馏的有机相中，弃去开始出现的棕色沉淀，继续加入正己烷至出现大量白色沉淀，离心收集沉淀物，干燥后即为提纯的肠菌素，对肠菌素进行称量后保存于-20℃冰箱。肠菌素(Ent)的分子结构如图1所示，其CAS号为RN 28384-96-5。
2、肠菌素与载体的偶联、鉴定及纯化
利用提纯的肠菌素(Ent)分别与载体蛋白钥孔傶血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)进行偶联反应。步骤如下：取669.55mg(1mmol)提纯的Ent干粉溶于20mL二甲基甲酰胺(DMF)，完全溶解后Ent浓度为33.48mg/mL(50mmol/L)；将载体蛋白KLH/BSA干粉分别溶于0.1mol/L PBS(pH 8.0)中，使载体蛋白浓度为1mg/mL；偶联体系为：20mL溶解的Ent+20mL溶解的KLH/BSA+160mL偶联缓冲液(0.1mol/L PBS,pH 8.0)，体系中Ent的浓度为3.348mg/mL(5mmol/L)，KLH/BSA浓度为0.1mg/mL；将体系混匀后，置于37℃反应4h，得到偶联产物。将偶联产物用超滤管Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units(10kDa，货号UFC801024)进行超滤，然后使用超纯水将偶联产物稀释至浓度为1mg/mL，-80℃冰箱保存备用。
偶联缓冲液(0.1mol/L PBS，pH 8.0)的配方为：溶解3.1g NaH2PO4·H2O和10.9gNa2HPO4于蒸馏水中，调节pH至8.0，定容至1L，经0.22μm微孔滤膜过滤后置室温备用。
采取非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)鉴定偶联效果，具体参照《分子克隆实验指南》(第二版，作者：[美]萨姆布鲁克，著.金冬雁,译.ISBN：9787030028082，科学出版社，1999-10.)中记载的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。凝胶电泳缓冲液(0.025mol/LTris，0.2mol/L甘氨酸，pH 8.3)配方：15.14g Tris加上72.07g甘氨酸，用双蒸水稀释到5L。结果如图2所示，偶联产物(Ent-KLH/Ent-BSA)与载体蛋白(KLH/BSA)相比，电泳带形出现显著变化，提示偶联成功。
3、免疫原的制备及免疫
将Ent-KLH偶联物与油佐剂(SEPPIC，MONTANIDE IMS 251C VG)按体积比3：7混合乳化，制备成油佐剂疫苗作为免疫原，按60μg蛋白/只小鼠的量，经皮下注射初次免疫4只8周龄雌性SPF级BALB/c小鼠，免疫小鼠的编号为Ent-KLH-1、Ent-KLH-2、Ent-KLH-3、Ent-KLH-4；免疫时间间隔为15天，按30μg蛋白/只小鼠的量经皮下加强免疫4次。
4、抗体效价的检测
完成免疫后，小鼠通过眼眶取血分离血清，通过间接ELISA方法检测抗体效价。间接ELISA方法的主要步骤为：
(1)包被：在96孔酶标板中加入稀释的Ent-BSA溶液(1ng/μL)，100μL/孔，4℃包被过夜，用洗涤液(0.01mol/L pH 7.4PBST)洗涤1次，拍干；
(2)封闭：加入封闭液(5.8g NaH2PO4·12H2O，0.593g NaH2PO4·2H2O，50g蔗糖，50mL小牛血清，200μL Proclin 300，超纯水定容至1L)，150μL/孔，在37℃孵育2h，弃去封闭液，用洗涤液洗涤1次，拍干，置于4℃冰箱保存备用；
(3)一抗：加入倍比稀释的免疫小鼠血清，100μL/孔，用盖板膜封板，37℃孵育1h；
(4)洗涤：倒出孔中液体，每孔加入150μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板3次，用吸水纸拍干；
(5)二抗：加入稀释好的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠二抗(Invitrogen，31430，1:10000稀释)，100μL/孔，37℃反应30min；
(6)洗涤：倒出孔中液体，每孔加入150μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板3次，用吸水纸拍干；
(7)显色：每孔加入100μL TMB显色液，室温(25℃)避光显色15min，每孔加入终止液(2mol/L硫酸)50μL，在450nm/630nm波长下检测每孔吸光度值。
血清抗体效价的判定方法：应用上述间接ELISA方法测定免疫小鼠血清中肠菌素特异性抗体效价，以最小稀释倍数与阴性对照(未免疫小鼠血清作为一抗)OD值差值约一半时对应的稀释倍数为免疫小鼠的血清抗体效价。若稀释倍数相同，则选取OD值高的小鼠。结果如表1所示，编号为Ent-KLH-4的免疫小鼠的血清抗体效价最高。
表1 Ent-KLH免疫小鼠血清抗体效价检测结果
注：表中的检测结果为OD450nm-OD630nm。“空白”表示空白对照孔(不加一抗)，“阴性”表示阴性对照孔(用未免疫小鼠的血清作为一抗)。
5、杂交瘤细胞的制备
无菌环境下取抗体效价高的小鼠脾细胞，采用PEG法将小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按5:1的细胞数量比进行融合，融合完细胞使用HAT培养基(Sigma，H0262-10VL)进行筛选培养。具体操作步骤如下：
(1)将状态良好的SP2/0骨髓瘤细胞轻柔地从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50mL离心管中。
(2)小鼠摘取眼球取血，通过颈椎脱臼处死后放入75％的酒精中浸泡5min。
(3)在平皿中倒入少量无血清IMDM培养基(Gibco，12440053)，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠脾脏，放置于细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的脾细胞吸入到装着SP2/0骨髓瘤细胞的离心管中，1500rad/min离心5min。
(4)用剪刀和镊子取下小鼠胸腺碾碎，将碾好的胸腺细胞装到15mL离心管中，再加入1mL HAT，放在孵育箱中备用。
(5)将离心好的细胞，弃掉上清，用无血清的IMDM培养基将细胞小心轻柔地吹匀，1500rad/min离心5min。
(6)将离心好的细胞上清尽量弃掉，拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1min内缓慢加入1mL的PEG，加完后在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2mL无血清的IMDM培养基，接着2min内缓慢加入8mL无血清的IMDM培养基，1500rad/min离心5min。
(7)弃掉上清，加入10mL血清(Gibco，10099141)，小心将细胞吹匀，倒入前面准备好的小鼠胸腺细胞，再加入25mL HAT培养基(Sigma，H0262-10VL)，充分混匀，然后均匀倒入细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵育箱中培养。
6、杂交瘤细胞株的筛选
参照前述的间接ELISA方法测定细胞培养上清液的抗体效价，筛选可产生肠菌素特异性抗体的杂交瘤细胞。设置阴性对照孔(用未免疫小鼠的血清作为一抗)、空白对照孔(不加一抗)和阳性对照孔(用免疫小鼠的血清作为一抗)。ELISA结果判定方法：若样品孔OD450nm值/阴性对照孔OD450nm值(S/N)>2.1，则判定为阳性细胞；若1<S/N<2.1，则加大包被浓度后再次检测，S/N>2.1的仍判定为阳性。利用有限稀释法对阳性孔进行单克隆纯化，得到稳定分泌抗肠菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.4mL/只，7天后腹腔注射该单克隆杂交瘤细胞株5×105个/只，7天后釆集腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法对其进行纯化，纯化后放入-20℃保存。如表2所示，经过两次筛选，得到编号为2-5、9-10、12-16的11株阳性杂交瘤细胞株。编号为1和11的杂交瘤细胞株，重复测定后S/N值都比较低，属于弱阳性结果，因此不再进行后续实验。
表2阳性杂交瘤细胞株筛选结果
注：“阴”表示阴性对照孔，“空”表示空白对照孔，“阳”表示阳性对照孔。
7、抗肠菌素单克隆抗体亚类的鉴定
按照前述的间接ELISA方法测定上述11株阳性杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体的亚类，使用不同亚类的免疫球蛋白作为包被原(Thermo ScientificTM，26178)，二抗为针对不同免疫球蛋白亚类的抗小鼠HRP酶标二抗(Thermo ScientificTM，26178)。ELISA结果判定方法为：阳性细胞株针对不同包被免疫球蛋白亚类OD450nm值最高的判定为该亚类。结果如表3所示，得到1株IgM类型的阳性杂交瘤细胞株，4株IgG2b类型的杂交瘤细胞株，6株IgG1类型的杂交瘤细胞株。
表3单克隆抗体亚类检测结果
注：表中的检测结果为OD450nm值。“阴性”表示阴性对照孔(用未免疫小鼠的血清作为一抗)。
将编号为4的杂交瘤细胞株送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏名称为Ent_mAb4，保藏编号为CGMCC No.21016。该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体以mAb4表示。
8、单克隆抗体mAb4的纯化
采用二氧化硅吸附法处理腹水，之后用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水，具体操作步骤如下：
(1)取一定量的腹水，用PBS稀释，再加入适量二氧化硅粉末吸附脂肪等杂质，作用30min后2500rpm离心20min，上清即澄清腹水。
(2)取4mL腹水，加入适量醋酸盐缓冲液，混合后加入正辛酸，室温搅拌使辛酸与杂蛋白充分结合，作用30min后4℃静置2h。
(3)收集腹水溶液，11000rpm 4℃离心30min，收集上清，调节pH至7.4。
(4)向上清液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，此时即为50％饱和的硫酸铵，继续搅拌30min，4℃静置2h。
(5)收集悬液，11000rpm 4℃离心30min，弃上清，溶于适量0.01mol/L pH 7.4的PBS中。
(6)边搅拌边向悬液中加入适量饱和硫酸铵溶液，使其饱和度为30-40％，缓慢搅拌30min，4℃静置2h。
(7)收集悬液，12000rpm 4℃离心30min，取沉淀溶于pH 7.4的PBS中。
(8)沉淀悬液装入透析袋，4℃透析48h，每8h换一次液。
(9)利用Folin-酚法测定抗体浓度，纯化后的抗体用PBS适当稀释并加入一定浓度的BSA作为抗体稳定剂，与等体积中性甘油混匀，于-20℃长期保存，避免反复冻融。
9、单克隆抗体mAb4结合效果鉴定
通过Western Blot(免疫印迹法)对抗肠菌素单克隆抗体mAb4的结合效果进行鉴定，具体步骤如下：
(1)按说明书配制分离胶与浓缩胶(Bio-Rad，TGX FastCast AcrylamideSolutions 1658006)。
(2)电泳前拔掉梳子，仔细清除残存碎胶，加入2μg样品(KLH、BSA、Ent-KLH、Ent-BSA)进行电泳。电泳条件：180v，15min；120v，2h。
(3)停止电泳后，小心取出胶块，自下而上依次放置：滤纸、胶块、PVDF膜、滤纸。PVDF膜使用前用无水甲醇浸泡活化1-2min。
(4)100v转膜2h。
(5)转膜后将膜转移至含有封闭液(5％脱脂乳)的平皿中，37℃封闭2h。
(6)封闭后PBST洗膜3次，每次10min。
(7)用封闭液(5％脱脂乳)稀释抗肠菌素单克隆抗体mAb4，4℃孵育过夜。
(8)使用PBST洗膜3次，每次10min。
(9)加入抗小鼠IgG-HRP二抗稀释液(Invitrogen，货号31430，1:5000稀释)，37℃孵育1h。
(10)将PVDF膜置于干净的台面，将化学发光两种试剂(Thermo Scientific，SuperSignalTM West Pico PLUS 34580)等体积混合，均匀地滴在PVDF膜的蛋白面，避光反应1-2min后，将PVDF膜上多余的工作液吸干，进行曝膜显影。
鉴定结果如图3所示，仅偶联产物(Ent-KLH/Ent-BSA)出现阳性条带，而载体蛋白(KLH/BSA)为阴性，证实抗肠菌素单克隆抗体mAb4与Ent可以结合，并且特异性良好。
10、单克隆抗体mAb4特异性检测
按照前述的间接ELISA方法测定肠菌素单克隆抗体mAb4特异性，分别在酶标板上包被不同的检测抗原，即肠菌素和不同的肠菌素衍生物(Linear Ent、MGE、DGE和TGE)，包被浓度为1ng/μL，进行间接ELISA检测。结果如表4所示，本发明制备的抗肠菌素单克隆抗体mAb4对肠菌素衍生物如Linear Ent、Salmochelins(MGE、DGE和TGE)均无交叉反应，特异性良好。
表4抗肠菌素单克隆抗体mAb4对肠菌素衍生物的结合力检测结果
注：表中的“阴”表示阴性对照(用未免疫小鼠的血清作为一抗)。
实施例2、肠菌素含量的间接竞争ELISA检测方法的建立
利用制备的抗肠菌素单克隆抗体(mAb4)，建立可用于检测不同细菌在不同培养基中肠菌素含量的间接竞争ELISA方法。
1、包被原最佳包被浓度与单克隆抗体最佳稀释倍数的确定
使用棋盘法确定包被原(Ent-BSA)的最佳包被浓度和抗肠菌素单克隆抗体(mAb4)的最佳稀释倍数，具体操作步骤参照前述的间接ELISA方法。纵列使用不同稀释倍数的mAb4，行使用不同包被浓度的Ent-BSA(ng/μL)，选取OD450nm-OD630nm值最接近1.0的孔所对应的包被原浓度和单抗稀释倍数为最佳抗原包被浓度和最佳单抗稀释倍数。结果如表5所示，包被原最佳包被浓度为1ng/μL，对应的单抗稀释倍数为256000倍(稀释后的单抗浓度为11.72ng/mL)。
表5 Ent-BSA不同包被浓度与单抗稀释倍数配对参数
2、间接竞争ELISA方法的优化
分别对间接竞争ELISA的反应温度、反应时间、反应液的pH、离子浓度和有机溶剂含量等条件进行摸索。首先配制如下溶液：
肠菌素标准品溶液：将实施例1纯化的Ent溶解于DMF中，终浓度为1mg/mL，-20℃保存。
0.01mol/L pH 7.4PBST洗涤液：Na2HPO4 1.15g，KH2PO4 0.20g，NaCl 8.00g，KCl0.20g，Tween 20 0.50mL，加超纯水定容至1L。
0.05mol/L pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加超纯水定容至1L。
封闭液：Na2HPO4 5.80g，NaH2PO4 0.593g，蔗糖50.00g，小牛血清50.00mL，Proclin300 0.20mL，加超纯水定容至1L。
竞争反应液：包被缓冲液加入5％(v/v)小牛血清(四季青，货号：22011-8612)。
不同pH的竞争反应液的配制：使用1mol/L NaOH进行pH调节，得到pH分别为6.2、6.8、7.4、8、8.5、9、9.6的竞争反应液。
不同离子浓度的竞争反应液的配制：向竞争反应液中加入NaCl，配制含0.4％、0.8％、1.6％、3.2％(g/ml)NaCl的竞争反应液。
不同DMF含量的竞争反应液的配制：向竞争反应液中加入DMF，配制含1％、5％、10％、20％(v/v)DMF的竞争反应液。
间接竞争ELISA操作步骤为：
(1)包被：在96孔酶标板中加入Ent-BSA溶液(1ng/μL)，100μL/孔，4℃包被过夜，用洗涤液洗涤1次，拍干；
(2)封闭：加入封闭液，150μL/孔，37℃孵育2h，弃去封闭液，用洗涤液洗涤1次，拍干，置于4℃冰箱保存备用；
(3)竞争：使用竞争反应液稀释肠菌素标准品溶液与抗肠菌素单克隆抗体(mAb4)溶液。向包被的酶标板微孔中加入系列稀释的肠菌素标准品溶液50μL，再加入256000倍稀释的抗肠菌素单克隆抗体mAb4溶液(11.72ng/mL)50μL，用盖板膜封板，在设定的竞争反应条件下(37℃,30min/25℃,60min/25℃,90min)反应；
(4)洗涤：倒出孔中液体，每孔加入150μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板3次，用吸水纸拍干；
(5)二抗：加入稀释好的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠二抗(Invitrogen，31430，1:10000稀释)，100μL/孔，37℃反应30min；
(6)洗涤：倒出孔中液体，每孔加入150μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板3次，用吸水纸拍干；
(7)显色：每孔加入100μL TMB显色液，室温(25℃)避光显色15min，每孔加入终止液(2mol/L硫酸)50μL，在450nm/630nm波长下检测每孔吸光度值。
方法的灵敏度结果如表6所示，其中最适的竞争反应条件为25℃竞争反应90min，最佳的竞争反应液：pH为9.6，离子浓度为0，并且不添加有机溶剂(DMF含量为0)。
表6间接竞争ELISA方法参数的优化
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3、间接竞争ELISA方法的验证
(1)灵敏度确定
采用优化的间接竞争ELISA方法，通过构建添加浓度范围为0.10～669.55μg/mL的肠菌素标准曲线来确定不同培养基中肠菌素竞争ELISA检测方法的灵敏度。
构建间接竞争ELISA检测标准曲线的具体步骤如下：
使用DMF将Ent标准品配制为0.10至669.55μg/mL系列梯度稀释的溶液，按间接竞争ELISA方法测定方法灵敏度。以零浓度的标准品溶液，即无标准品抑制时的OD450nm-OD630nm值为B0值，相应添加浓度标准品抑制时的OD450nm-OD630nm值为B值，以B/B0为纵坐标，标准品的浓度为横坐标，绘制标准曲线。当B/B0＝50％时的标准品的浓度(IC50)为评价间接竞争ELISA方法的灵敏度。利用OriginPro 9.1.0软件依据下述公式拟合标准曲线，并计算IC50值。
其中，A1是吸光度的最大值(即零浓度标准品时的吸光度)；A2为标准品浓度无穷大时最小OD450nm吸收值；P为在拐点的曲线斜率；x0为对应出现50％抑制时标准品的浓度。
结果如图4所示，培养基BHI、LB、MHB、PPLO、T-medium和TSB中肠菌素检测的IC50分别为38.35μg/mL、28.77μg/mL、34.40μg/mL、31.27μg/mL、26.80μg/mL和22.44μg/mL。
(2)特异性验证
采用优化的间接竞争ELISA方法，在竞争步骤加入不同肠菌素衍生物(LinearEnt、MGE、DGE和TGE)，添加浓度为67.0μg/mL，进行间接竞争ELISA检测。结果如表7所示，本发明的间接竞争ELISA方法对肠菌素衍生物如Linear Ent、Salmochelins(MGE、DGE和TGE)均无交叉反应，特异性良好。
表7间接竞争ELISA方法对肠菌素衍生物的检测结果
注：表中的“阴”表示阴性对照(在竞争步骤不加入竞争物)。
(3)检测限、重复性和再现性测定
将BHI、LB、MHB、PPLO、T-medium和TSB液体培养基作为空白样品。测定20份未加标空白样品在450nm/630nm波长下吸光度值的平均值及3倍标准差，确定不同培养基中肠菌素的检测限(Limit of detection，LOD)。
检测限LOD＝空白样本平均值+3×空白样本的标准差
添加1、2、4倍检测限浓度的肠菌素于空白样品中，采用优化的间接竞争ELISA方法，连续3天每天重复测定3次，计算批间、批内方法的回收率与变异系数。
结果如表8所示，本发明建立的间接竞争ELISA方法对BHI、LB、MHB、PPLO、T-medium和TSB培养基中肠菌素含量的检测限(LOD)分别为0.96μg/mL、1.03μg/mL、0.53μg/mL、0.39μg/mL、0.39μg/mL和0.56μg/mL。基质添加标准曲线R2均大于0.99(图4)，表明方法的准确性和重现性良好。
表8间接竞争ELISA方法的验证
实施例3、用于定量检测肠菌素的ELISA试剂盒的制备
试剂盒的组装：将酶标板、肠菌素-BSA偶联物、抗肠菌素单克隆抗体(mAb4)、肠菌素标准品、辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠二抗、包被缓冲液(Na2CO3 1.59g/L，NaHCO32.93g/L，pH9.6)、竞争反应液(包被缓冲液+5％(v/v)小牛血清)、封闭液(Na2HPO4 5.80g/L，NaH2PO4 0.593g/L，蔗糖50.00g/L，5％(v/v)小牛血清，0.02％(v/v)Proclin 300)、洗涤液(0.01mol/L，pH 7.4的PBST)、终止液(2mol/L硫酸)分别无菌包装后装入试剂盒中，再放入试剂盒使用说明书，最后在试剂盒外壳上贴上试剂盒标签。肠菌素-BSA偶联物也可以提前包被在酶标板上，制成预包被酶标板。
本试剂盒可用于检测待测基质中肠菌素的含量，操作步骤如下：
(1)包被：用包被缓冲液配制1ng/μL肠菌素-BSA偶联物溶液；在酶标板中加入肠菌素-BSA偶联物溶液，100μL/孔，4℃包被过夜，用洗涤液洗涤1次，拍干；
(2)封闭：加入封闭液，150μL/孔，37℃孵育2h，弃去封闭液，用洗涤液洗涤1次，拍干，置于4℃冰箱保存备用；
(3)竞争：使用竞争反应液配制梯度浓度的肠菌素标准品溶液以及浓度为11.72ng/mL的抗肠菌素单克隆抗体溶液；在酶标板上设置对照孔、标准品孔和样品孔，对照孔中不加样，向各个标准品孔中分别加入梯度浓度的肠菌素标准品溶液，50μL/孔；向样品孔中加入待测基质，50μL/孔；最后向所有微孔中加入抗肠菌素单克隆抗体溶液，50μL/孔；用盖板膜封板，25℃反应90min；
(4)洗涤：倒出孔中液体，每孔加入150μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板3次，用吸水纸拍干；
(5)二抗：加入稀释好的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠二抗，100μL/孔，37℃反应30min；
(6)洗涤：倒出孔中液体，每孔加入150μL洗涤液，30s后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板3次，用吸水纸拍干；
(7)显色：每孔加入100μL TMB显色液，室温(25℃)避光显色15min；
(8)终止：每孔加入终止液(2mol/L硫酸)50μL，在450nm/630nm波长下检测每孔吸光度值；
(9)计算：以肠菌素标准品溶液的浓度为横坐标，以抑制率(B/B0)为纵坐标，绘制标准曲线；其中B0为对照孔的OD450nm-OD630nm值，B为各个标准品孔的OD450nm-OD630nm值；将样品孔的OD450nm-OD630nm值代入标准曲线中，计算得到待测基质中肠菌素的含量。
所述待测基质可以是培养基，例如BHI、LB、MHB、PPLO、T-medium和TSB培养基；也可以是其他液体基质。

Claims (10)

1.抗肠菌素单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.21016的杂交瘤细胞所分泌；所述肠菌素的分子结构式如下：
2.分泌权利要求1所述的抗肠菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.21016。
3.用于定量检测肠菌素的ELISA试剂盒，其包含权利要求1所述的抗肠菌素单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含肠菌素-BSA偶联物；所述肠菌素-BSA偶联物被预先包被在酶标板上或用于临用前包被在酶标板上，包被浓度为1ng/μL；所述抗肠菌素单克隆抗体的工作浓度为11.72ng/mL。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述肠菌素-BSA偶联物的包被缓冲液为0.05mol/L，pH 9.6的碳酸盐缓冲液。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含肠菌素标准品、酶标的抗小鼠二抗、封闭液、洗涤液、显色液和/或终止液。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含用于稀释肠菌素标准品和抗肠菌素单克隆抗体的竞争反应液；所述竞争反应液为0.05mol/L，pH 9.6的碳酸盐缓冲液，含5％小牛血清，离子浓度为0，并且不添加有机溶剂。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述封闭液含有Na2HPO4 5.80g/L，NaH2PO4 0.593g/L，蔗糖50.00g/L，5％小牛血清，和0.02％Proclin 300。
9.一种快速检测基质中肠菌素含量的方法，其特征在于：使用权利要求3-8任一所述的试剂盒，通过间接竞争ELISA方法检测基质中肠菌素的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将1ng/μL的肠菌素-BSA偶联物溶液加入酶标板中，100μL/孔，孵育；洗酶标板，拍干；
(2)加入封闭液，孵育；洗酶标板，拍干；
(3)使用竞争反应液配制梯度浓度的肠菌素标准品溶液以及浓度为11.72ng/mL的抗肠菌素单克隆抗体溶液；在酶标板上设置对照孔、标准品孔和样品孔，对照孔中不加样，向各个标准品孔中分别加入等体积的梯度浓度的肠菌素标准品溶液，向样品孔中加入等体积的待测基质，最后向所有微孔中加入等体积的抗肠菌素单克隆抗体溶液；用盖板膜封板，25℃反应90min；洗酶标板，拍干；
(4)加入酶标记的抗小鼠二抗，孵育；洗酶标板，拍干；
(5)加入显色液，孵育；
(6)加入终止液，混匀后在450nm/630nm波长下检测每孔吸光度值；
(7)以肠菌素标准品溶液的浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，绘制标准曲线；其中B0为对照孔的OD450nm-OD630nm值，B为各个标准品孔的OD450nm-OD630nm值；将样品孔的OD450nm-OD630nm值代入标准曲线中，计算得到待测基质中肠菌素的含量。
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