CN112940085B - Btv1保护性表位多肽、其特异性识别单克隆抗体、抗体分泌细胞及其应用 - Google Patents
Btv1保护性表位多肽、其特异性识别单克隆抗体、抗体分泌细胞及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种BTV1保护性表位多肽、其特异性识别单克隆抗体、抗体分泌细胞及其应用，旨在解决BTV血清型的检测诊断及BTV预防和治疗试剂或药物不完善、不全面的技术问题。本发明鉴定得到一种全新的BTV1 VP2蛋白的线性B细胞表位：296‑KEPAD‑300，并诱导制得能特异性识别该表位的单克隆抗体。该线性B细胞表位丰富了BTV1 VP2蛋白的免疫学功能，为后续研究VP2蛋白的结构特性以及抗原特性提供参考，可应用于抗病毒药物、防疫疫苗等的研发。
Description
技术领域
本发明主要涉及分子生物学、病毒学及免疫学领域，具体涉及BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位肽、其特异性识别单克隆抗体、抗体分泌细胞，及其在制备相关BTV1诊断或预防试剂中的应用。
背景技术
蓝舌病（Bluetongue, BT）是由蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)引起的一种可经由媒介昆虫如库蠓、伊蚊等传播的非接触性传染病。BTV主要感染包括牛、羊在内的多种反刍哺乳动物，感染后能够造成较高的发病率、死亡率和严重的临床症状，严重危害畜牧业的经济发展，对全球经济产生重大影响。因此，该病是世界动物卫生组织（OIE）规定的需要上报的一种多种动物共患疫病，被我国列为一类动物传染病。
BTV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)，其基因组包含了10段双链RNA片段，可编码7种结构蛋白和4种非结构蛋白。目前，共有27种血清型的BTV被发现，然而研究表明，不同血清型之间的中和抗体并没有交叉保护性。我国于1979 年在云南首次出现 BT，其中BTV1和BTV16在我国流行最广。由BTV L2基因编码VP2蛋白是BTV中可变程度最高的蛋白，因此也是决定血清型的主要因素。此外，VP2蛋白位于病毒粒子的最外层，主要与环境介质相互作用；同时，介导病毒的吸附和进入，包含可被中和的血凝抑制（HI）抗体识别的血清型特异性表位，可以诱导产生中和抗体。因此，针对VP2蛋白单克隆抗体的制备及其B细胞表位的研究将会为BTV相关诊断、预防和治疗试剂或药物的研究及应用提供重要技术支持，并为蛋白结构解析及表位疫苗制备奠定基础。
发明内容
基于现有研究的不足和现实需要，本发明旨在提供一种BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位，并诱导产生特异性中和抗体，以建立、完善BTV血清型的鉴定方法，并为相关诊断、预防和治疗BTV试剂或药物的制备研究提供技术支撑。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
经大量的试验研究，鉴定得到一种BTV1 VP2线性B细胞表位：296-KEPAD-300。
本发明基于Bac to Bac双启动子杆状病毒表达系统，成功构建pFastBacTMDual-VP2重组表达载体，在Sf21昆虫细胞中进行重组BTV1 VP2蛋白的表达，经镍离子亲和层析法对表达后的VP2蛋白进行纯化并获得了高纯度、具有良好生物活性和免疫原性的目的蛋白。
并进一步利用纯化所得BTV1 VP2重组蛋白免疫Balb/c小鼠，间接ELISA方法检测免疫后小鼠血清效价水平，取血清效价水平较高的小鼠进行细胞融合。利用大肠杆菌表达系统所得的原核VP2重组蛋白作为检测抗原，经间接ELISA方法对融合后产生的杂交瘤细胞株进行筛选检测，最终筛选得到三株能稳定分泌抗BTV1 VP2蛋白mAbs的杂交瘤细胞株，并将其分泌的单克隆抗体命名为17E9C6、17E9C8和17E9H12。
经间接免疫荧光试验（IFA）鉴定，三株单克隆抗体可与BTV1 VP2蛋白发生特异性反应；而Dot-ELISA试验结果表明此三株单克隆抗体也可与BTV1灭活病毒发生特异性反应。
对BTV1 VP2蛋白全长的氨基酸序列进行截短合成，经间接ELISA和Dot-ELISA试验对其进行鉴定，结果显示所述三株单克隆抗体能特异性识别所述BTV1 VP2线性B细胞表位：296-KEPAD-300。
与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：
1. 本发明综合利用分子生物学、病毒学和免疫学等相关技术，筛选、鉴定出了一种BTV1 VP2蛋白的全新的线性B细胞表位；并进一步利用诱导制备的三株单克隆抗体对含有BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位的多肽、VP2蛋白、BTV1灭活病毒进行识别，表明该BTV1 VP2线性B细胞表位可被特异性识别。
2. 本发明鉴定得到的BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位丰富了BTV1 VP2蛋白的免疫学功能，为后续研究VP2蛋白的结构特性以及抗原特性提供参考，可应用于抗病毒药物研发。
3. 本发明所诱导制备的单克隆抗体可特异识别BTV1灭活病毒，可为BTV1的鉴别诊断提供新的技术手段。
附图说明
图1为本发明实施例中重组pFastBacTMDual-VP2载体构建鉴定图；其中，A为VP2基因PCR扩增（M:DL 5000 DNA marker; 1:VP2目的基因）；B为DH5α单克隆菌液PCR鉴定（M:DL 5000 DNA marker; 1-8:VP2菌液PCR产物 9:空白对照）；C为重组Bac-VP2质粒（M:DL 8000 DNA marker; 1:重组Bac-VP2质粒; 2:pFastBacDual质粒）；D为DH10Bac单克隆菌液PCR鉴定（M:DL 5000 DNA marker; 1-5:VP2引物菌液PCR产物 6:空白对照）。
图2 为本发明实施例中BTV1 VP2重组蛋白表达及纯化鉴定图；其中，A 为VP2蛋白表达SDS-PAGE鉴定（M:蛋白分子质量标准; 1:空白细胞; 2:破碎后细胞沉淀; 3:破碎后细 胞上清）；B为VP2蛋白表达Western Blot鉴定（M:蛋白分子质量标准; 1:空白细胞; 2:破碎 后细胞沉淀; 3:破碎后细胞上清）；C为VP2蛋白纯化条件SDS-PAGE鉴定（M:蛋白分子质量标 准; 1:细胞破碎后上清; 2:穿出; 3:平衡液; 4-11:20mM咪唑洗脱液; 12: 50mM咪唑洗脱 液）；D为透析后VP2蛋白SDS-PAGE鉴定（M:蛋白分子质量标准; 1:VP2蛋白透析后; 2:VP2蛋 白透析前）；E为透析后VP2蛋白Western Blot鉴定（M:蛋白分子质量标准; 1:VP2蛋白透析 后; 2:VP2蛋白透析前）。
图3为本发明实施例中VP2重组蛋白小鼠免疫血清效价及与BTV1灭活病毒反应性检测图；其中，A为VP2重组蛋白小鼠免疫血清与BTV1灭活病毒反应性的Dot-ELISA检测（a- c:一抗为10ug VP2蛋白首次免疫42d小鼠血清; d-f:一抗为20ug VP2蛋白首次免疫42d小 鼠血清; 1:包被原为VP2蛋白; 2:包被原为BTV1灭活病毒; 3:PBS阴性对照）；B为VP2首次免疫42d小鼠血清效价。
图4为本发明实施例中单克隆抗体纯化及抗体效价测定图；其中，A为单克隆抗体纯化SDS-PAGE鉴定（M:蛋白分子质量标准; 1:单抗17E9C6纯化前; 2:单抗17E9C6纯化后; 3:单抗17E9C8纯化前; 4:单抗17E9C8纯化后; 5:单抗17E9H12纯化前; 6:单抗17E9H12纯 化后）；B为单克隆抗体效价测定。
图5为本发明实施例中 IFA检测图。
图6为本发明实施例中单克隆抗体交叉反应性检测图；其中，A为单克隆抗体交叉反应性检测；B为单克隆抗体与BTV1灭活病毒反应Dot-ELISA鉴定（1:抗原为BTV1灭活病毒; 2:抗原为VP2蛋白; NC:阴性对照）。
图7为本发明实施例中VP2 L1-L38多肽的间接ELISA鉴定图。
图8为本发明实施例中VP2 L1-L38多肽的Dot-ELISA鉴定图。
图9为本发明实施例中VP2 L12-1至L12-6多肽的间接ELISA及Dot-ELISA鉴定图；其中，A为间接ELISA筛选L12-1至L12-6多肽；B为Dot-ELISA筛选L12-1至L12-6多肽。
图10为本发明实施例中表位序列定位的间接ELISA及Dot-ELISA鉴定图；其中，A为间接ELISA确定表位序列；B为Dot-ELISA确定表位序列。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的主要试验材料包括：
DH5α、DH10Bac感受态细胞均购自TAKARA公司；pFastBacTMDual昆虫细胞表达载体由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室提供；Sf21细胞由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室提供；BTV1灭活病毒由云南省畜牧兽医科学研究院捐赠；BTV1阳性血清由郑州大学分子免疫学实验室保存。
IPTG、氨苄青霉素、卡那霉素、X-Gal、Tris、咪唑均购自Solarbio公司；His单抗、HRP标记的羊抗鼠酶标二抗均购自Proteintech公司；质粒小提试剂盒、DNA纯化回收试剂盒为天根公司产品；BamH I、EcoR I由TAKARA公司提供。
实施例1.BTV1 VP2重组蛋白表达载体构建、蛋白表达、纯化与鉴定
1.1 BTV1 VP2真核表达载体构建
根据NCBI上发表的BTV1 VP2核酸序列（GenBank Accession No. KF664124），将BTV1 VP2的基因序列交由生工生物工程（上海）股份有限公司进行密码子优化并合成。根据VP2的基因序列，按照In-Fusion® HD Cloning Kit设计VP2基因克隆至pFastBacTMDual载体的引物：
VP2-F：tcccaccatcgggcgcGGATCCATGGACGAGCTGGGTATCCCAAT，
VP2-R：tcgacgtaggcctttGAATTCTTAAACGTTGAGGAGCTTAGTCAGC；
选择BamH I和EcoR I两个酶切位点（划线部分），该引物由生工生物（上海）合成。以合成的VP2基因序列为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为50 µL：Primer STAR DNA（2×）聚合酶25 μL，VP2-F 、VP2-R各1 μL，模板1 μL，无菌ddH2O 25 μL。
PCR反应程序为：预变性98℃ 10 s，变性98℃ 10 s，退火55℃ 30 s，延伸68℃ 2min，30个循环；再延伸68℃ 5 min，16℃ 10 min后结束反应。
反应结束后，用1%的核酸凝胶对PCR扩增产物进行电泳鉴定，如图1A。结果显示，目的基因PCR结果显示有一条2800bp左右的条带，表明扩增出了与预期大小相同的特异性核酸条带。
使用DNA纯化回收试剂盒（天根）回收目的基因PCR产物，pFastBacTMDual载体质粒用BamHI 和EcoR I进行双酶切。双酶切体系：10×CutSmart Buffer 2μL，BamH I 、EcoR I各1μL，pFastBacTMDual质粒11μL（2μg），无菌ddH2O 5μL，将上述体系混匀后37℃酶切9h，酶切结束后使用通用型DNA纯化回收试剂盒（天根）回收酶切产物。
将纯化回收后的VP2基因和pFastBacTMDual质粒按照In-Fusion® HD CloningKit说明步骤进行连接，连接体系为：5×in-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，胶回收VP2基因0.5μL（100ng），酶切回收pFastBacTMDual 3μL（50ng），无菌ddH2O 4.5μL，混匀后50℃水浴15min，然后冰浴静置5min。
取5μL连接后的产物转化至50μL DH5α感受态细胞（TAKARA）中，冰浴30min后42℃热激90s，冰上静置2min，加入1mL SOC，置于37℃摇床，220rpm震荡培养50min。取出13000rpm离心1min，弃去900μL上清，重悬菌液后取50μL均匀涂布在含有Amp+的固体LB培养基平板上，倒置平板于37℃恒温培养箱中，过夜培养。
从平板上随机挑选单克隆菌落接种于1mL含有Amp+的液体LB培养基中，置于37℃摇床，220rpm震荡培养。观察到液体浑浊后进行菌液PCR鉴定，菌液PCR体系为：ExTaq DNA聚合酶5μL，VP2-F 、VP2-R各1μL，菌液1μL，无菌ddH2O 2μL；PCR程序为：预变性95℃ 5 min，变性95℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 3 min，30个循环；再延伸72℃ 10 min，16℃ 10min后结束反应。菌液PCR结束后将产物用1%的核酸凝胶进行鉴定并筛选出有目的条带的阳性菌液，如图1B所示。
将阳性菌液送尚亚生物公司测序。测序结果无误的阳性菌液按照天根质粒小提试剂盒说明书进行质粒提取并将质粒命名为Bac-VP2。提取质粒后用1%的核酸凝胶进行鉴定，如图1C所示，条带大小确认无误，BTV1 VP2基因被成功构建于pFastBacTMDual载体上。
取3μL Bac-VP2重组质粒（300ng）转化至50μL DH10Bac感受态细胞（全式金）中，冰浴30min后42℃热激90s，冰上静置2min，加入1mL LB液体培养基，置于37℃摇床，220rpm震荡培养5h。取出13000rpm离心1min，弃去900μL上清，重悬菌液后取50μL均匀涂布在含有Kan+、Gen+、Tel+三种抗生素及IPTG、X-gal的固体LB培养基平板上，倒置平板于37℃恒温培养箱中，培养48h。
从平板上随机挑选菌落接种于1mL含有Kan+、Gen+、Tel+三种抗生素的液体LB培养基中，置于37℃摇床，220rpm震荡培养。测菌液OD值0.6-0.8时进行菌液PCR鉴定，菌液PCR体系及程序如前所述。菌液PCR结束后将产物用1%的核酸凝胶进行鉴定，筛选出有目的条带的阳性菌液，如图1D所示。将阳性菌液送尚亚生物公司测序。测序结果无误的阳性菌液按照Endo-Free Plasmid Mini Kit I（OMEGA）说明书步骤提取重组Bac-VP2粘粒。
重组蛋白表达及纯化
1.2.1重组Bac-VP2粘粒转染Sf21昆虫细胞
采用Cellfection Ⅱ Reagent（Gibco）阳离子脂质体转染试剂，取Bac-VP2粘粒10μL按照操作说明书将其转染至Sf21昆虫细胞中，使用无血清昆虫细胞培养基（serum-freemedium，SFM）Sf-900 II（Gibco）28℃细胞培养箱中培养5h后换液。继续培养72h后细胞病变约70%，1000rpm离心10min收集细胞上清液即为第一代（P1）重组杆状病毒。将P1代产物继续接种Sf21昆虫细胞，培养72h后收集上清为第二代（P2），以此类推接种培养至第三代（P3），收集后4℃保存。
1.2.2 BTV1 VP2重组蛋白表达、纯化及鉴定
将收集到的P3代细胞上清液接种100mL Sf21昆虫细胞，28℃、220rpm培养箱中培养72h后8000rpm离心10min收集细胞沉淀。用10mL 1×PBS（pH7.4）重悬沉淀，按照1:100的比例加入PMSF（100mM）后进行超声破碎，破碎后10000rpm离心10min收集上清液。取60μL破碎后上清液加入5×SDS上样缓冲液 15μL，煮沸10min后进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定，如图2A、2B所示。Western Blot鉴定中使用HRP标记的Goat-Mouse 6×His单抗以1：5000的比例进行稀释，室温孵育1 h。孵育结束后，用PBST洗涤PVDF膜5遍，使用ECL化学发光液（新赛美）对PVDF膜进行曝光。
SDS-PAGE结果显示在110kDa左右位置有一明显条带，与VP2蛋白大小相符；Western Blot结果显示在同一位置有显色，进一步证明BTV1 VP2重组蛋白成功表达。
破碎后上清液经0.45μm滤膜过滤后采用镍离子亲和层析法进行纯化。纯化条件为：以50mM Tris+200mM Nacl+0.05%吐温+5%甘油+1mM DTT+0.1mM EDTA，pH8.0为平衡液，50mM Tris+200mM Nacl+0.05%吐温+5%甘油+1mM DTT+0.1mM EDTA+5mM咪唑，pH8.0为洗涤液，50mM Tris+200mM Nacl+0.05%吐温+5%甘油+1mM DTT+0.1mM EDTA+20mM咪唑，pH8.0为目的蛋白洗脱液。依次收集破碎后上清原液、柱穿出液、平衡液、洗涤液以及目的蛋白洗脱液，各取60μL，加入5×SDS上样缓冲液 15μL，煮沸10min后进行SDS-PAGE，如图2C所示。SDS-PAGE 结果显示洗脱液中纯化的BTV1 VP2目的蛋白纯度约达到90%。收集系列洗脱液，使用透析袋，以50mM Tris为透析液对其进行过夜透析处理，透析后10000rpm离心1min收集上清液并取其60μL，加入5×SDS上样缓冲液 15μL，煮沸10min后进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定，如图2D、2E所示。Western Blot鉴定中使用鼠源BTV1灭活病毒免疫血清以1：1000的比例进行稀释作为一抗，HRP标记的羊抗鼠以1：1000的比例进行稀释作为二抗，分别室温孵育1h。孵育结束后，用PBST洗涤PVDF膜5遍，使用ECL化学发光液（新赛美）对PVDF膜进行曝光。
SDS-PAGE及Western Blot结果显示，透析后的BTV1 VP2重组蛋白纯度可达98%，且该重组蛋白可与BTV1 灭活病毒鼠源免疫血清产生特异性反应。
实施例2. BTV1 VP2重组蛋白小鼠免疫及免疫效果分析
2.1小鼠免疫及免疫效果初步评价
将6只6-8周龄的Balb/c小鼠随机分成两组，每组三只。低剂量组每只免疫10μg的VP2蛋白，高剂量组每只免疫20μg的VP2蛋白，PBS免疫小鼠作为阴性对照。共免疫三次，每隔两周免疫一次，首免用弗氏完全佐剂和蛋白/PBS混合乳化，二免和三免均用弗氏不完全佐剂和蛋白/PBS混合乳化。在首次免疫后14d、21d、28d、35d、42d尾静脉采血，以间接ELISA、Dot-ELISA评价免疫效果。
2.1.1 Dot-ELISA测定VP2免疫小鼠血清与灭活病毒BTV1的反应性
将条状NC膜在1×PBS缓冲液（pH7.4）中完全浸湿，室温晾干。取1μL灭活BTV1病毒点在点样孔中心，再取同等质量的VP2蛋白和等体积的1× PBS分别作为阳性对照和阴性对照点在点样孔中心，1：1000稀释的首次免疫42d的小鼠血清作为一抗，1:1000稀释HRP标记的羊抗鼠作为二抗，ECL显色，如图3A所示。
结果表明，高、低剂量组中的小鼠首次免疫后42d的血清均能与BTV1灭活病毒发生特异性反应（图3A），高、低剂量组之间相比反应差别不大。而低剂量组中的c和高剂量组中的f和BTV1灭活病毒反应较弱，高剂量组中e反应较强（图3A）。PBS阴性对照组均不与首次免疫42d的小鼠血清反应，说明杆状病毒系统表达的VP2蛋白免疫的血清可以与BTV1灭活病毒发生良好的特异性反应。
2.1.2间接ELISA测定VP2免疫小鼠血清效价
以2μg/mL的VP2重组蛋白CBS稀释后包被96孔反应板，每孔100μL，4℃包被过夜；弃去包被液，PBST洗涤三次，5%脱脂奶封闭，37℃孵育1h；弃去封闭液，PBST洗涤三次；首孔分别加入起始浓度为1:1000稀释的首次免疫42d的小鼠血清，同时以PBS免疫小鼠血清作为阴性对照，从左到右依次倍比稀释，37℃孵育1 h；PBST洗涤三次，加入1:1000稀释的HRP标记的羊抗鼠为二抗，37℃孵育1h；PBST洗涤三次，加入TMB显色液，避光显色5min后加入2 mol/L H2SO4终止显色；测定OD450nm值，评价免疫效果。如图3B所示，高、低剂量组均能针对VP2蛋白产生较高效价的特异性抗体，抗体效价最高可达1:2.56×105。
实施例3. BTV1 VP2重组蛋白单克隆抗体制备与鉴定
3.1细胞融合
超级免疫在细胞融合前3-4 d进行，超级免疫时直接进行腹腔注射：根据间接ELISA测定VP2免疫小鼠血清效价结果，选择效价最好的20μg ②小鼠，取40 μg BTV1 VP2重组蛋白（222 μL），不添加佐剂，进行腹腔注射超免。超免完成三天后进行细胞融合。
取1.5 mL EP管收集小鼠眼球血液，将血液放置37℃静置2 h后，4000 rpm，离心10min，吸取上清作为阳性血清，分装后﹣20℃储存备用。
收集生长良好的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞2~5×107个于50mL离心管中备用。超免后小鼠脱颈处死后用75%酒精浸泡消毒。在超净台内用无菌剪刀和镊子剪开表皮，更换第二套刀剪开腹膜，取出脾脏放在200目无菌尼龙网上，用剪刀研磨，加GNK洗液冲洗，使脾细胞单个滤入无菌烧杯中。将脾细胞悬液移入离心管中，补加GNK到40mL，与瘤细胞一起离心，1000rpm离心10min。弃上清，弹虚细胞团，各加GNK 10mL，将脾细胞悬液转入瘤细胞瓶中，加GNK至40mL，1000rpm离心10min，弃尽上清。将细胞团微微打散，滴加1mL 50% PEG1500，1min内加完，静置90s，然后慢慢滴加15mL GNK终止融合，37℃水浴稳定5min，补加GNK至40mL，1000rpm离心10min，弃上清，将细胞团微微打散，加500mL含HAT和10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，轻轻混悬细胞，平均铺在96孔细胞培养板中，每孔加250μL细胞悬液，在培养箱中培养10天。
杂交瘤细胞筛选
细胞融合后10天，观察到细胞团长至比较大时，用间接ELISA测其细胞上清。细胞融合前小鼠眼球采血血清为阳性对照，PBS免疫的小鼠血清为阴性对照。以CBS为稀释液分别将杆状病毒表达系统和大肠杆菌表达系统纯化得到的VP2蛋白作为检测抗原，按照200ng/孔的包被量包被于96孔反应板中，4℃过夜。5%脱脂奶每孔加入200μL，37℃封闭2h；吸取细胞上清50μL作为一抗，37℃孵育30min；HRP标记羊抗鼠作为二抗1:1000稀释后每孔50μL，37℃孵育30min；PBST洗板3次后加入TMB显色液，100 μL/孔，遮光反应5 min；加入100μL 2 mol/L H2SO4终止反应，选取显色反应最强、同时与真核表达和原核表达的VP2蛋白均能反应的孔转至48孔板和24孔板中扩大培养，再以同样的方法对其测定，反复测定三次之后将能稳定反应的阳性杂交瘤细胞孔进行亚克隆。通过有限稀释法进行单克隆化，确保获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
单克隆抗体的大量制备及纯化
亚克隆后用间接ELISA以上述同样的方法再次进行筛选，将筛选出的三个阳性孔杂交瘤细胞孔17E9C6、17E9C8和17E9H12扩大培养。对经产Balb/c小鼠腹腔中注射灭菌的液体石蜡，注射石蜡一周后，将阳性孔杂交瘤细胞用 RPMI-1640 基础培养基稀释后计数，每只小鼠注射细胞量约为1.0×106 个。注射7天小鼠腹部明显的增大，说明有腹水产生，将小鼠拖颈处死，收集腹水；将收取的腹水 6000 rpm，离心10 min，除去杂质，将上清分装成小管，储存在﹣80℃。
采用辛酸-硫酸铵法纯化所收集的腹水，SDS-PAGE鉴定纯化结果，如图4A所示。结果显示在55kDa和25kDa处有明显目的条带，即为单克隆抗体的重链和轻链大小。
单克隆抗体的亚类鉴定
使用Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒（Proteintech），按照说明书步骤对17E9C6、17E9C8和17E9H12三株单抗进行亚型鉴定。如表1所示，结果表明本例所得的17E9C6和17E9C8重链为IgG1型，17E9H12重链为IgG2b型，三株单克隆抗体轻链均为Kappa。
表1. 单克隆抗体的亚类鉴定
单抗效价测定
间接 ELISA 实验测定三株单克隆抗体的效价，用3μg/mL VP2蛋白包板，CBS稀释后每孔包被100μL，4℃过夜。5%脱脂奶每孔加入200μL封闭，37℃，2h；以纯化后单克隆抗体1:1000稀释后加入首孔，然后从左至右依次倍比稀释，同时以PBS免疫小鼠血清作为阴性对照，37℃，1h；HRP标记羊抗鼠作为二抗1:1000稀释后每孔100μL，37℃，1h；PBST洗板3次后加入TMB显色液，100μL/孔，遮光反应5min；加入100μL 2 mol/L H2SO4终止反应，最后读取OD450nm值。结果显示，17E9C6单克隆抗体株效价最高，可达1：1.024×106，17E9C8和17E9H12单克隆抗体株效价均为1：5.12×105，如图4B所示。
间接免疫荧光（IFA）试验
将Sf21昆虫细胞铺于6孔板中，细胞密度在85%，共2mL。取1.2.1中所述P3代细胞上清100μL接种于上述6孔板中，以未接种的细胞孔作为阴性对照，28℃细胞培养箱中培养72h。弃去上清，每孔加入1mL预冷甲醇，固定20min后小心吸出甲醇并晾干6孔板。吸取1mLPBS清洗6孔板后每孔加入2mL 5%脱脂奶37℃封闭1h；三株单克隆抗体17E9C6、17E9C8和17E9H12按照1:1000稀释后分别加入细胞孔，以融合小鼠眼眶血清1:1000稀释作为阳性对照，37℃，1h；AF488荧光二抗1:1000稀释，37℃，1h；PBS洗3次后每孔加入800μL DAPI孵育15min，弃去，PBS再洗3次，每孔加入1mL ddH2O，荧光显微镜下观察结果。
结果表明（图5），本次试验筛选得到的三株单克隆抗体17E9C6、17E9C8和17E9H12均可与BTV1 VP2重组蛋白发生特异性反应。
单克隆抗体的特异性反应分析
通过间接ELISA法测定单克隆抗体17E9C6、17E9C8和17E9H12分别与BTV1 重组VP2蛋白、BTV1 VP5蛋白、BTV1 VP7蛋白、BTV1 灭活病毒以及BTV16灭活病毒的交叉反应性。
取3μg/mL的 VP2蛋白、BTV1 VP5蛋白、BTV1 VP7蛋白、BTV1 灭活病毒以及BTV16灭活病毒包板，同时以BSA作为对照，以CBS为包被液每孔包被100μL，4℃过夜。5%脱脂奶每孔加入200μL封闭，37℃，2h；单克隆抗体17E9C6、17E9C8和17E9H12按照1:1000稀释后分别加入反应板中，100μL/孔，1×PBS作为空白对照；HRP标记羊抗鼠作为二抗1:1000稀释后每孔100μL，37℃，1h；PBST洗板3次后加入TMB显色液，100 μL/孔，遮光反应5 min；加入100 μL2mol/L H2SO4终止反应，最后读取OD450nm值。
如图6A所示，本例所得三株单克隆抗体均可与BTV1 重组VP2蛋白及BTV1 灭活病毒可发生特异性反应，而与BTV1 VP5蛋白、BTV1 VP7蛋白以及BTV16灭活病毒不发生反应，同时BSA组无反应。这表明所得三株单克隆抗体特异性反应良好，与BTV16血清型不具有交叉反应性。
Dot-ELISA法检测单克隆抗体17E9C6、17E9C8和17E9H12与BTV1灭活病毒的反应性。将条状NC膜在1×PBS缓冲液（pH7.4）中完全浸湿，室温晾干。取1μL灭活BTV1病毒点在点样孔中心，再取同等质量的VP2蛋白和等体积的1× PBS分别作为阳性对照和阴性对照点在点样孔中心。1：1000稀释的单克隆抗体作为一抗，1:1000稀释HRP标记的羊抗鼠作为二抗，分别37℃孵育1h，PBST洗膜3次后ECL显色。
结果表明（图6B），本例中的三株单克隆抗体可与BTV1 灭活病毒发生反应，说明三株单克隆抗体具有一定中和作用。
实施例4. BTV1 VP2重组蛋白线性B细胞表位多肽的鉴定
4.1 BTV1 VP2蛋白全长氨基酸序列截短合成及鉴定
表2. VP2蛋白全长氨基酸序列截短合成方案
对BTV1 VP2蛋白全长的氨基酸序列按照上述表2进行截短合成（吉尔生化）一系列连续重叠肽段，合成后的BTV1VP2-L1~BTV1 VP2-L38共38条多肽稀释成 4mg/mL ，每条多肽按照每孔包被4μg分别包被9个孔（针对每个mAb，分别做3次重复实验），真核VP2重组蛋白作为阳性对照包被原，PBS作为阴性对照。间接ELISA结果显示（图7），BTV1 VP2-L12与VP2重组蛋白阳性对照组有相似的特异性反应。
稀释后的BTV1VP2-L1~BTV1 VP2-L38共38条多肽作为待测抗原，每条多肽取2.5μL点在NC膜点样孔中心，取等质量的真核VP2重组蛋白和等体积的PBS分别作为阳性、阴性对照。三株单克隆抗体17E9C6、17E9C8和17E9H12按照1:1000稀释后作为一抗对以上多肽进行检测。Dot-ELISA试验结果显示（图8），BTV1 VP2-L12与阳性对照组有相似的特异性反应。
间接ELISA和Dot-ELISA结果一致，即本例中的三株单克隆抗体17E9C6、17E9C8和17E9H12均可特异性识别BTV1 VP2-L12肽段，表明BTV1 VP2-L12肽段包含此单克隆抗体特异性识别的BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位序列。
肽段序列截短合成及鉴定
将4.1中筛选出的阳性多肽BTV1 VP2-L12肽段序列按照表3再次截短合成连续重叠肽段BTV1 VP2-L12-1～BTV1 VP2-L12-6。按照如4.1中所述方法，经间接ELISA和Dot-ELISA对前述中的6段多肽进行筛选鉴定，结果如图9所示。
间接ELISA和Dot-ELISA结果一致，即所述三株单克隆抗体17E9C6、17E9C8和17E9H12均可特异性识别BTV1 VP2-L12-4肽段，表明BTV1 VP2-L12-4肽段包含此单克隆抗体能够特异性识别的BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位序列。
表3. BTV1 VP2-L12肽段序列截短合成方案
重组蛋白线性B细胞表位的精确定位及鉴定
将4.2中筛选出的阳性多肽BTV1 VP2-L12-4肽段序列按照表4再次截短合成。BTV1VP2-L12-4肽段序列分别从N-term和C-term逐个氨基酸截断，以精确定位出线性B细胞表位序列。按照如4.1中所述方法，经间接ELISA和Dot-ELISA对前述中分别从N-term和C-term逐个氨基酸截断合成的多肽进行筛选鉴定，结果如图10所示。
间接ELISA和Dot-ELISA结果一致，即本例中的三株单克隆抗体17E9C6、17E9C8和17E9H12均可特异性识别296-KEPAD-300序列，表明BTV1 VP2-L12-4肽段包含此单克隆抗体特异性识别的BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位序列为296-KEPAD-300。
表4. BTV1 VP2-L12-4肽段序列截短合成方案
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明构思的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 郑州大学;河南中泽生物工程有限公司
<120> BTV1保护性表位多肽、其特异性识别单克隆抗体、抗体分泌细胞及其应用
<130> /
<160> 3
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> BTV1
<400> 1
Lys Glu Pro Ala Asp
1 5
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<211> 45
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 2
tcccaccatc gggcgcggat ccatggacga gctgggtatc ccaat 45
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工设计
<400> 3
tcgacgtagg cctttgaatt cttaaacgtt gaggagctta gtcagc 46
Claims (3)
1.一种BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位肽，其氨基酸序列为KEPAD，如SEQ ID NO.1所示。
2.一种BTV1 VP2蛋白线性多肽，用以激活B细胞产生特异性细胞免疫，为下述肽段中的一种：
。
3.权利要求1所述BTV1 VP2蛋白线性B细胞表位肽或权利要求2所述BTV1 VP2蛋白线性多肽在制备诊断或预防BTV1试剂中的应用。
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