CN105219733A - 抗蓝舌病病毒12型ns1蛋白的单克隆抗体btv12-ns1-1f8及其识别的b细胞表位和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗蓝舌病病毒(Bluetongue？Virus，BTV)12型NS1蛋白的单克隆抗体BTV12-NS1-IF8及其识别的B细胞表位和应用。所述的单克隆抗体是由本发明筛选得到的微生物保藏号为CGMCC？No.10207的杂交瘤细胞株分泌产生，实验证明该杂交瘤细胞株分泌的抗BTV12？NS1蛋白单克隆抗体能够与BTV12型NS1蛋白发生特异性反应。此外，本发明还公开了该单克隆抗体所识别的BTV12？NS1蛋白特异性B细胞表位。本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的BTV12？NS1蛋白特异性B细胞表位可用于制备鉴别、诊断、预防或治疗BTV12型感染的试剂，同时为以表位为基础的诊断方法建立和表位标记疫苗的设计奠定基础，为进一步研究和治疗BTV12型提供物质储备。

Description

抗蓝舌病病毒12型NS1蛋白的单克隆抗体BTV12-NS1-1F8及其识别的B细胞表位和应用

技术领域

本发明一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，特别涉及一株分泌抗蓝舌病病毒12型NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及由上述单克隆抗体所识别的BTV12型NS1蛋白的线性B细胞表位以及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及线性B细胞表位在制备鉴别、诊断、预防或治疗蓝舌病病毒12型感染的相关试剂与药物中的应用，本发明属于蓝舌病的防治领域。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue，BT)是由呼肠孤病毒科环状病毒属蓝舌病病毒(BluetongueVirus，BTV)引起的反刍动物虫媒(如库蠓、伊蚊等)传染病。其临诊特征为发热、黏膜水肿和糜烂等炎症变化。世界动物卫生组织(OIE)将BT列为法定通报性疾病，我国将其划定为一类动物疫病。本病于19世纪在南非的绵羊中首次发现，1905年被命名为“蓝舌病”，由于BTV中存在大量的基因变异和抗原变异，到目前为止世界上已经发现26种BTV血清型，且各个血清型之间缺乏有效的交叉免疫保护作用，这给BT的检测和防控带来了极大的困难。因此，尽早鉴别诊断爆发的BT血清型并在该病流行区域接种相应的疫苗是防治本病的关键。我国于1979年在云南首次发现BT流行，之后在湖北(1983年)、安徽(1985年)、四川(1989年)、山西(1991年)相继爆发本病；同时内蒙古、河北、广东、广西等10个省有BTV血清学阳性畜检出。在我国已经检测出BTV-1，2，3，4，12，15，16七个血清型，其中1型和16型是主要的致病血清型。因此，制备出特异性针对BTV12的Mab，针对BTV12建立一套行之有效的检测方法就显得十分必要。

蓝舌病病毒(BTV)与茨城病毒、鹿流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒同属环状病毒属。蓝舌病病毒为双股RNA病毒，呈20面体对称，直径为70-80nm，具有双层衣壳。基因组由10个大小不同的双股RNA组成，分别编码7种结构蛋白(VP1～VP7)和4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3A、NS4)。外壳蛋白包含VP2和VP5，诱导产生型特异性中和抗体。非结构蛋白(NS)负责控制BTV复制，成熟和出芽，其中NS1蛋白由S5基因编码,核苷酸长1689bp,编码552个氨基酸,蛋白大小为64kDa。S5基因在BTV感染宿主过程中具有遗传和和抗原稳定性。NS1蛋白是在BTV复制周期中表达量最高的细胞质蛋白，其多聚体能够在感染细胞内中形成大量的病毒特异性微管(直径52.3nm，1000nm)，上调包括NS1蛋白的所有病毒蛋白的合成，形成NS1表达的正反馈，进而迅速增加所有病毒蛋白的合成，使BTV感染哺乳动物后，病毒蛋白的合成能够迅速取代细胞蛋白的合成，在BTV引起细胞病变的过程中起重要作用。所以可以通过制备BTV12-NS1蛋白特异性的单克隆抗体并鉴定NS1蛋白的B细胞表位以建立BTV12的快速准确的鉴别诊断方法并进一步研究预防与治疗措施。

发明内容

本发明目的之一是提供一株分泌抗蓝舌病病毒12型(BTV12)NS1蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明目的之二是提供一种由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与BTV12NS1蛋白发生特异性反应；

本发明目的之三是提供一种BTV12NS1蛋白的线性B细胞表位。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV12NS1蛋白作为免疫原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以pET-30a原核系统表达纯化的重组NS1蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，最终获得一株能够稳定分泌抗BTV12NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV12-NS1-IF8，分类命名为分泌抗BTV12-NS1-IF8单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其微生物保藏号是：CGMCCNo.10207；保藏时间为2014年12月23日；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

此外，本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体，命名为BTV12-NS1-1F8，IFA检测结果表明该单克隆抗体与重组BTV12NS1蛋白及感染BTV12的BHK-21细胞发生特异性反应，而与感染BTV1-11，BTV13-24的BHK-21细胞及相应阴性对照均不发生反应。

进一步的，本发明利用肽扫描技术对BTV12-NS1-1F8所识别的BTV12NS1蛋白的线性B细胞表位进行了鉴定，结果表明：BTV12-NS1-1F8所识别的BTV12NS1蛋白的线性B细胞表位的氨基酸序列为⁶¹PRKAFQLVELAKEAMY⁷⁶(SEQIDNO.1所示)。

综上所述，本发明制备并鉴定出了一株能够稳定分泌特异性针对BTV12-NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，实验证明由该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的针对12型BTV的线性B细胞表位可用于制备鉴别或诊断BTV12感染的的试剂以及预防或治疗BTV12型感染的相关药物，本发明的提出为建立BTV12型的鉴别诊断方法以及进一步研究BTV12型的防治措施奠定了基础。

附图说明

图1为pET-30a原核系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白的SDS-PAGE与Westernblot鉴定；

1：pET-30a空载体；2：重组BTV12-NS1蛋白超声后沉淀；3：重组BT:12-NS1蛋白超声后上清；4：重组BTV12-NS1蛋白诱导后；5：重组BTV12-NS1蛋白诱导前；6：纯化后的重组BTV12-NS1蛋白(SDS-PAGE)；7：纯化的重组BTV12-NS1蛋白(WB)；8：未纯化的重组BTV12-NS1蛋白(WB)；M：标准蛋白Marker。

图2为Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白的SDS-PAGE与Westernblot鉴定；

1：重组杆状病毒感染Sf9细胞的裂解产物；2：重组杆状病毒感染Sf9细胞的裂解产物上清；3：重组杆状病毒感染Sf9细胞的裂解产物沉淀；4：纯化的BTV12NS1蛋白(SDS-PAGE)；5：野生型杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞；6：纯化的BTV12NS1蛋白(WB)；M：标准蛋白Marker。

图3为应用IFA检测单克隆抗体BTV12-NS1-1F8与BTV1-24型病毒感染的BHK-21细胞、未接毒的BHK-21细胞的反应性结果；

1-24：感染BTV1-24；25：鼠的阳性血清；26：阴性血清。

图4为应用Westernblot检测单克隆抗体BTV12-NS1-1F8与真核重组重组NS1蛋白的反应性结果；

1：感染12型BTV的BHK-21细胞沉淀；2:未感染BTV的BHK-21细胞沉淀；3:真核重组NS1蛋白；M：蛋白marker

图5为原核表达的55条16氨基酸短肽SDS-PAGE分析；

M：蛋白质分子量标准；1-55：表达的55条短肽pNS1-1～pNS1-55。

图6为利用间接ELISA法鉴定BTVNS1蛋白的线性B细胞表位分析；

图7为原核表达的pNS1-7与BTV12-NS1-1F8反应性的Westernblot鉴定。

M：标准蛋白Marker；1：BTV12-NS1-1F8与真核表达的重组NS1蛋白的反应；2：BTV12-NS1-1F8与空载体pMAL-c4x的反应；3：BTV12-NS1-1F8与pNS1-7的反应。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

主要实验材料和来源

1、蛋白、细胞、毒种

pET-30a原核系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白、Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白，SP2/0细胞、Sf21细胞，NS1蛋白截短表达的55条短肽均由本实验室保存。

2、主要试剂和药品

胎牛血清(FBS)购自HYCLONE公司、DMEM购自GIBCOL公司；弗氏佐剂、50％PEG、50×HAT、50×HT和8-氮鸟嘌呤(8-AG)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记山羊抗小鼠IgG均购自Sigma公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG为金桥生物技术有限公司进口分装产品；SBAClonotyping^TMSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于SouthernBiotechnology公司；快速连接试剂盒、pMAL^TMProteinFusionandPurificationSystem融合蛋白表达与纯化试剂盒购自NewENGLANDBiolabs(NEB)公司；CellfectinIIReagent购自Invitrogen公司；PremixExTaqHS、T4DNA连接酶、DNAMarker、限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ购置于TaKaRa公司；抗6×His标签的单克隆抗体购自Roche公司；Ni²⁺NTA树脂购自Novagen公司。

3、实验动物

8周龄BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

实施例1BTV12-NS1蛋白的原核与真核表达及纯化

1.引物设计

原核表达采用pET-30a原核表达系统，根据NCBI的BTV12-NS1基因序列(GenBank登录号：X63135.1)设计PCR扩增引物：pET-BTV12-NS1-1-22F：

5＇-GCGGATCCATGGAGCGCTTTTTGAGAAAAT-3＇(BamHⅠ)；pET-BTV12-NS1-1659-1640R：

5＇-ACGAAGCTTGATACTCCATCCACATCTGCGAC-3＇(HindⅢ)。

真核表达采用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统，按照上述序列分别设计PCR扩增引物：

pF-BTV12-NS1-1-22F：

5'-GCGGATCCGATGGAGCGCTTTTTGAGAAAAT-3'(BamHⅠ)；pF-BTV12-NS1-1659-1635R：

5'-ACGAAGCTTCTAATACTCCATCCACATCTGCGAC-3'(HindⅢ)。

2.BTV12-NS1蛋白的原核表达载体构建及NS1蛋白的原核表达与纯化

首先PCR扩增BTV12NS1基因，将获得的目的片段进行胶回收，分别将回收产物和原核表达载体pET-30a进行BamHⅠ、HindⅢ双酶切。纯化后的酶切NS1基因和原核表达载体pET-30a进行连接，在DNA连接仪中25℃作用5min后将上述连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞中，37℃恒温倒置过夜培养。随机挑取单个菌落，接种于5mLLB液体抗性培养基(Kan⁺100μg/mL)中，37℃过夜培养。提取重组质粒进行初步筛选，空载体pET-30a作为阴性对照。对疑似重组质粒分别进行双酶切与PCR鉴定。将上述鉴定全部正确的含有阳性重组质粒的菌液进行测序，测序正确的重组质粒命名为pET-BTV12-NS1。

将鉴定正确的重组质粒pET-BTV12-NS1转化至E.coliBL21感受态细胞中，37℃过夜培养后，随机挑取单个菌落，接种于5mLLB液体培养基(100μg/mLKan⁺)中37℃过夜培养后进行重组NS1蛋白的诱导表达。首先取1mL过夜培养的新鲜菌液加入到100mL(100μg/mLKan⁺)LB培养基中37℃培养至OD_600nm约为0.5时加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，37℃诱导6h。菌体4度离心后进行超声裂解，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，发现重组蛋白出现在沉淀中，以包涵体形式存在。原核表达载体pET-30a携带6×His标签，使用Ni²⁺NTA树脂对其进行变性纯化，结果只有一条特异性的条带出现在70kDa左右(图1)，与NS1蛋白的分子质量相符，蛋白浓度可达2mg/mL。利用HRP标记的抗6×His标签单克隆抗体进行Westernblot鉴定，表明NS1蛋白纯化成功。

3.BTV12-NS1蛋白的真核核表达载体构建及NS1蛋白的真核表达与纯化

首先PCR扩增BTV12NS1基因，将目的产物进行胶回收，回收获得的片段与杆状病毒的穿梭载体pFastBac^TMHTA分别进行双酶切。将纯化后的酶切产物利用快速连接试剂盒25℃连接5min后连接产物转化至E.coliDH5α，37℃恒温倒置过夜培养。随机挑取单个菌落，分别接种到5mLLB液体抗性培养基(Amp⁺100μg/mL)中，37℃过夜培养。提取重组质粒进行初步筛选，空载体pFastBac^TMHTA作为阴性对照。对疑似重组质粒分别进行双酶切与PCR鉴定。将上述鉴定全部正确的含有阳性重组质粒的菌液进行测序，测序正确的重组质粒命名为pFast-BTV12-NS1。

将鉴定正确的重组质粒pFast-BTV12-NS1按照说明书转化感受态细胞E.coliDH10Bac^TM。首先将-80℃保存的感受态细胞DH10Bac^TM(100μL)置于冰上，融化后立即加入1μL重组质粒pFast-BTV12-NS1，混匀后冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，在超净工作台内向混合物中加入室温的无抗生素的SOC液体培养基900μL，37℃震荡培养4h。将上述菌液分别做10倍、100倍、1000倍稀释后各取100μLLA-Bac平板(LA-Bac平板即含Kan⁺50μg/mL、庆大霉素7μg/mL、四环素10μg/mL、X-gal100μg/mL和IPTG40μg/mL的LB固体培养基)上，37℃恒温倒置培养48h，然后进行蓝白斑筛选。随机挑选单个白色菌落划线培养接种到新的LA-Bac平板上做3次纯化鉴定，方法同上。当LA-Bac平板上菌落均为大小均匀的白色菌落时，随机挑取一个菌落分别接种至5mL含50μg/mLKan⁺、7μg/mL庆大霉素、10μg/mL四环素的LB液体培养基中，同时挑取蓝色菌落作为阴性对照，37℃过夜培养后分别提取重组杆粒与空杆粒。PCR鉴定正确的重组杆粒，命名为BAC-BTV12-NS1，用于转染获得重组杆状病毒。

利用杆状病毒转染试剂CellfectinIIReagent，将重组杆粒BAC-BTV12-NS1转染Sf21昆虫细胞，获得带有NS1基因的重组杆状病毒BACV-NS1，同时设立野生型杆粒转染与单独的转染试剂作为阴性对照。具体操作如下：

首先铺Sf21细胞六孔板，以每孔Sf21细胞(细胞活力在97％以上)4.5×10⁵个/mL密度铺于2mL完全培养基(0.1％1000×双抗，10％胎牛血清(FBS)，89％基础培养基)中，于27℃恒温培养箱中至少培养1h，待细胞完全贴壁后准备转染，将1μg重组杆粒BAC-BTV12-NS1稀释至100μL基础培养液(Grace粉(1×1L)1瓶、酵母提取物3.3g、水解乳蛋白3.3g、碳酸氢钠(NaHCO₃)0.35g)中，同时取混匀的CellfectinReagent转染试剂6μL稀释至新100μL基础培养液中，两者混匀后室温孵育30min。对照组1将1μg野生型杆粒加入到100μL基础培养液中与B液混匀，室温孵育30min，对照组2只加入B液，室温孵育30min。期间弃掉细胞培养板中的原来的完全培养液，再用基础培养液清洗细胞，2mL/次，共清洗2次。30min后将800μL基础培养液加入到已孵育好的A液和B液的混合物中，混匀后加入到Sf21昆虫细胞六孔板中，27℃恒温孵育5h后弃掉转染液，加入新的完全培养基，3.0mL/孔，27℃下孵育至细胞发生明显病变(75％的细胞病变)时，收集培养液，1000rpm离心10min后收集上清，即为重组杆状病毒母液，命名为BACV-NS1/P1，4℃避光保存备用。取一定量的BACV-NS1/P1感染Sf21昆虫细胞，不断摸索最佳感染条件(用于病毒接种的最适Sf21昆虫细胞生长密度、最适病毒接种量、最适的病毒感染时间、最适的病毒收获时间以及蛋白表达量最高的病毒代数等)，从而确定重组杆状病毒BACV-NS1滴度最高与重组NS1蛋白表达量最大时的病毒代次。BACV-W定义为空杆粒转染Sf21昆虫细胞获得的野生型杆状病毒。收集感染重组杆状病毒BACV-NS1/P1-P4的Sf21昆虫细胞，1000rpm离心10min后将细胞沉淀用PBS洗一次，离心后按照1:10的体积比例PBS悬浮，超声裂解悬浮细胞，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析。结果确定蛋白表达量最大的重组杆状病毒的感染代次为BACV-NS1/P3，重组蛋白以包涵体形式存在，在70kDa左右出现1条明显的条带，与NS1蛋白的分子质量大小相符(图2)。野生型杆状病毒BACV-W表达蛋白按上述方法处理后作为阴性对照。大量接种BACV-NS1/P2，以获得足够的重组NS1蛋白用于纯化。由于真核表达蛋白携带6×His标签，使用Ni²⁺NTA树脂进行变性纯化，蛋白浓度可达2mg/mL。利用HRP标记的抗6×His标签单克隆抗体进行Westernblot鉴定，表明BTV12-NS1蛋白表达纯化成功。

实施例2单克隆抗体的制备

1.免疫小鼠

以Bac-to-Bac真核表达系统表达纯化的重组BTV12-NS1蛋白作为免疫原腹腔多点免疫8周龄雌性BALB/c小鼠3只，100μg/只，共免疫3次，1只未免疫的BALB/c小鼠在相同条件下饲养作为阴性对照。一免将弗氏完全佐剂与纯化的真核重组NS1蛋白等体积比例混合；二免和三免均将弗氏不完全佐与纯化的真核重组NS1蛋白等体积比例混合。分别在二免与三免一周后尾静脉采血，将血清和纯化的原核重组NS1蛋白分别倍比稀释后进行间接ELISA检测血清抗体效价和最佳抗原包被浓度。在融合前3天，对抗体水平较高的BALB/c小鼠直接腹腔注射50μg不加佐的剂纯化重组NS1蛋白。

2.细胞融合

融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞。融合前1天准备饲养层细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中。融合当天饲养层细胞状态良好没有污染且SP2/0骨髓瘤细胞处于对数生长期时进行细胞融合：摘除免疫的BALB/c小鼠眼球并采血后脱颈致死，消毒灭菌后在生物安全柜中无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞4∶1的比例用50％PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养层细胞之上。

3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

利用纯化后的原核表达的BTV12NS1蛋白建立的间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对阳性杂交瘤细胞进行扩大培养，同时用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行3次克隆纯化，将克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得1株稳定分泌抗BTV12NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV12-NS1-IF8，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其微生物保藏号是：CGMCCNo.10207。

4.单克隆抗体腹水的制备

在注射杂交瘤细胞前一周，先取雌性BALB/c小鼠(8-12周龄)腹腔注射石蜡油500μL/只，一周后腹腔注射DMEM基础培养液稀释的阳性杂交瘤细胞(细胞密度为1-2×10⁶个/mL)，500μL/只。此后观察小鼠状态，小鼠腹部逐渐变大，待其行动不便时收集腹水。收集的腹水离心上清分装后-20℃保存，将获得单抗命名为BTV12-NS1-1F8。

实施例3单克隆抗体的鉴定

1.单克隆抗体的亚类鉴定

按照SBAClonotyping^TMSystem/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例1所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定，具体流程如下：以原核表达的重组BTV12-NS1蛋白作为包被抗原，以实施例2所得的单抗BTV12-NS1-1F8作为一抗，分别以HRP标记的IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、κ链、λ链、羊抗鼠抗体为二抗，进行间接ELISA鉴定。

结果显示本发明单克隆抗体BTV12-NS1-1F8的重链为IgG₁，轻链为λ链。

2.IFA试验(重组杆状病毒感染BHK-21细胞的IFA鉴定)

(1)使用BHK-21细胞铺板(96细胞培养板)，细胞生长至板底面积的80-90％时，分别接种BTV1-24，不接毒的BHK-21细胞作为阴性对照。

(2)接毒24-36小时细胞尚未发生明显病变时，弃去培养液，加入预冷的90％乙醇4度固定30min。

(3)弃去固定液，PBST清洗3次，5min/次。

(4)将筛选出的阳性杂交瘤细胞培养液上清加入上述细胞培养孔中，100μL/孔。同时以200×稀释的小鼠阴、阳性血清作为阴阳性对照。

(5)37℃孵育1h后，弃去一抗，用PBST清洗3次，5min/次。

(6)将FITC标记山羊抗小鼠的二抗50×稀释，50μL/孔，加入到上述细胞培养孔中。

(7)37℃孵育1h后，弃二抗，PBST清洗3次，5min/次；然后荧光显微镜拍照记录。

IFA结果显示该单克隆抗体BTV12-NS1-1F8培养上清与感染BTV12的BHK-21细胞呈阳性反应，而与感染BTV1-11，BTV13-24及未感染BTV的BHK-21细胞呈阴性反应(图3)。

3.Westernblot实验

BTV12型感染BHK-21细胞，当细胞出现明显病变时8000rpm离心取沉淀进行SDS-PAGE电泳，未接毒的BHK-21细胞沉淀作为阴性对照，进行Westernblot鉴定。半干转印仪将SDS-PAGE胶转印至NC膜，5％脱脂乳4℃封闭过夜后，阳性杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体作为一抗，HPR标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，DAB显色，扫描实验结果(图4)。

实施例4NS1蛋白B细胞表位的鉴定

1.NS1蛋白55条短肽的截短表达

(1)将NS1蛋白截短表达为55条相互重叠6个aa的16肽，据此以pET-BTV12-NS1质粒为模版设计55对互补的寡核酸链序列，在编码区的5’引入BamHI，3’端引物HindIII酶切位点；

(2)寡核苷酸链合成回来后，取出一管，直接稀释100倍成10pmol，稀释前将管离心，稀释后震荡混匀。分别将55对互补的寡核苷酸链55℃退火15min，形成带有粘性末端的双链DNA；

(3)使用限制性内切酶BamHI和HindIII对原核表达载体pMALTM-c4X进行双酶切；

(4)将双酶切胶回收之后的pMAL^TM-c4X与退火后形成的双链DNA连接，25℃作用5min；

(5)将连接产物转化E.coliDH5。双酶切及PCR鉴定正确后进行测序，将测序正确的55个重组质粒分别命名为pNS1-1～pNS-55。此后，将构建好的重组质粒pNS1-1～pNS-55转化E.coliBL21感受态细胞，随机挑取单个菌落接种到5mLLB液体培养基(Amp⁺100μg/mL)中，37℃过夜培养；

(6)取新鲜菌液以1:100接种于10mLLB液体培养基(Amp⁺100μg/mL)中，37℃培养至菌液OD_600nm约为0.5，加入诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达4h，离心收集菌体。菌体按10:1例PBS悬浮，超声裂解后分离上清和沉淀，SDS-PAGE电泳发现，蛋白以上清形式存在，大小与预期相符(图5)。

2.B细胞表位的初步鉴定

将上述确定成功表达的55条短肽，分别以浓度100ng/孔包被ELISA反应板，以实施例2所得的单克隆抗体BTV12-NS1-1F8作为一抗利用间接ELISA进行筛选确定此单克隆抗体所对应的抗原表位(图6)。

将筛选的抗原表位利用WesternBlot进行进一步确定，将鉴定反应的短肽、空载体pMAL^TM-c4X表达蛋白以及真核表达重组NS1蛋白进行SDS-PAGE电泳后，转印至NC膜上，用上述已鉴定表位的杂交瘤细胞培养上清作为一抗，山羊抗小鼠HRP-IgG作为二抗，DAB显色(图7)。

间接ELISA与WesternBlot结果均证实BTV12-NS1-1F8与pNS1-7反应，对应NS1蛋白氨基酸⁶¹PRKAFQLVELAKEAMY⁷⁶(SEQIDNO.1所示)。

Claims (6)

1.一株分泌抗蓝舌病病毒(Bluetonguevirus,BTV)12型NS1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其微生物保藏号为：CGMCCNo.10207。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗蓝舌病病毒12型NS1蛋白的单克隆抗体。

3.蓝舌病病毒12型NS1蛋白的线性B细胞表位，其特征在于，所述表位多肽由权利要求2所述的单克隆抗体所识别，所述表位的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备鉴别、诊断、预防或治疗蓝舌病病毒12型感染的试剂与药物中的应用。

5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备鉴别、诊断、预防或治疗蓝舌病病毒12型感染的试剂与药物中的应用。

6.权利要求3所述的线性B细胞表位在制备鉴别、诊断、预防或治疗蓝舌病病毒12型感染的试剂与药物中的应用。