CN103642757A

CN103642757A - 蓝舌病病毒ns2蛋白单克隆抗体btv-4d4及其识别的b细胞表位和应用

Info

Publication number: CN103642757A
Application number: CN201310478429.7A
Authority: CN
Inventors: 吴东来; 徐青元; 刘霓红; 杨涛
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2013-10-14
Publication date: 2014-03-19

Abstract

本发明公开了一种抗蓝舌病病毒（BTV）NS2蛋白单克隆抗体BTV-4D4及其识别的B细胞表位和应用。本发明以蓝舌病病毒血清型8型（BTV8）全病毒免疫BALB/c小鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合，用BTV8为包被抗原经间接ELISA方法筛选得到一株稳定分泌抗BTV-NS2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株BTV-4D4，该杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体与BTV-NS2蛋白发生特异性反应。利用噬菌体展示技术鉴定BTV-4D4所识别的B细胞表位是¹⁴⁹RSNYDV¹⁵⁴。本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的BTV-NS2蛋白B细胞表位可用于蓝舌病病毒感染的诊断或预防。

Description

蓝舌病病毒NS2蛋白单克隆抗体BTV-4D4及其识别的B细胞表位和应用

技术领域

本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗BTV-NS2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体；本发明还涉及一个B细胞表位，尤其涉及由上述单克隆抗体所识别的BTV-NS2蛋白B细胞表位多肽；本发明还涉及上述杂交瘤细胞株、单克隆抗体以及B细胞表位多肽在制备诊断或预防BTV感染中的应用，本发明属于蓝舌病的防制领域。

背景技术

蓝舌病（Bluetongue，BT）是由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒（Bluetongue virus，BTV）引起的反刍动物虫媒传染病。BTV能感染大多数家养的和野生的反刍动物，因动物的易感性不同表现出不同的临床症状。不同流行地区易感动物的死亡率差别很大，一般都可达到30%，在某些地区甚至更高。由于BT对世界经济的影响，世界动物卫生组织（OIE）将BT列为法定通报性疾病，我国将其划定为一类动物疫病。BT所造成的相关经济损失一方面通过直接降低动物的生产能力和增加动物的死亡率，更重要的是由于控制动物的流动、控制牛精液出口以及实施这些控制措施所需的费用而间接造成的动物贸易损失。

BT最早于1876年发现于南非的绵羊，1902年被命名为“抗疟疾绵羊卡他热”，1905年被正式命名为“蓝舌病”。20世纪初，由于高度易感的非本土绵羊品种的引进致使BT开始在非洲蔓延。BT被认为是一种地方流行性疾病，位于纬度40°S和53°N的美洲、非洲、亚洲、澳洲是高发地区，仅1996年造成全球范围内的经济损失高达30亿美。1979年我国首次在云南绵羊发现蓝舌病，随后在29个省均检出BT阳性家畜，如山西（1991）、甘肃（1990）、四川（1988）、安徽（1985）、湖北（1983）等。2006年以来，随着气候变暖，BT尤其是BTV8在欧洲许多国家如比利时、荷兰、法国、德国等爆发，造成了严重的经济损失，同时也扩大了BTV的传统分布范围。覃绍敏等(2011)对广西11个地区的山羊BT进行了血清学调查，结果表明阳性率为6.3%-45.1%，平均阳性率为20.5%。

BTV血清型众多，目前已发现24个血清型，而随着气候变化新的血清型不断出现，如最近又相继分离到的BTV25（瑞士，2008年）和BTV26（科威特，2011年）。然而由于各个血清型之间交叉免疫保护性差，使得疫苗免疫错综复杂不能起到很好的保护作用，到目前为止尚未有有效的疫苗。早期准确诊断，早期预防，是防止本病爆发的最有效方法。所以，必须加强我国BT的相关工作的研究，做好必要的技术储备。

BTV属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus），其基因组为分节段的线性双链RNA，包含10个节段，大小约为19kb，共编码11种蛋白。由S8基因编码的NS2，长357个氨基酸，是唯一的一种磷酸化蛋白。NS2在病毒的复制和装配过程中起到重要作用，NS2能够结合病毒的单链RNA，能够水解核苷三磷酸为核苷一磷酸。NS2是BTV感染细胞病毒包涵体（VIB）的主要成分，在细胞内大量表达。因此，通过在病毒复制过程中阻断NS2的一项或多项功能使病毒不能有效复制，从而对机体提供保护作用。此外，对NS2抗原的检测可区分自然感染和疫苗接种动物。所以，筛选出一株可以分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，并鉴定出其所分泌的单克隆抗体所识别的BTV-NS2蛋白特异性B细胞表位对BTV诊断或预防具有重要作用，并为BTV表位标记疫苗的研制奠定了基础。

发明内容

本发明目的之一是提供一株分泌BTV-NS2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明目的之二是提供一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，该单克隆抗体可与24个血清型BTV发生特异性反应；

本发明目的之三是鉴定一个BTV-NS2蛋白的特异性B细胞表位。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明利用BTV8全病毒作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。此外，本发明还利用BTV8全病毒作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选，最终获得一株稳定分泌抗BTV-NS2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其菌种保藏号是：CGMCC No.7001，命名为BTV-4D4，分类命名是：分泌抗BTV-4D4单克隆抗体的杂交瘤细胞株；保藏时间：2012年12月11日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所。

本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体，其命名为 BTV-4D4，Western blot检测结果表明BTV-4D4可与BTV-NS2蛋白发生特异性反应，而与对照BHK-21细胞不发生反应。

本发明利用噬菌体展示技术和肽扫描技术对BTV-4D4所识别的BTV-NS2蛋白的B细胞表位进行了鉴定，最终将该表位精确定位为：¹⁴⁹RSNYDV¹⁵⁴（SEQ ID NO.1所示）。同时，序列比对结果显示¹⁴⁹RSNYDV¹⁵⁴在不同血清型BTV中是高度保守的。

因此，本发明提出了所述杂交瘤细胞株在制备诊断或预防BTV病毒感染药物中的应用。及

所述的单克隆抗体在制诊断或预防BTV1病毒感染药物中的应用。以及

所述的BTV-4D4蛋白线性B细胞表位多肽¹⁴⁹RSNYDV¹⁵⁴（SEQ ID NO.1所示）在制备诊断BTV感染药物中的应用。

综上所述，本发明制备并鉴定出了一种特异性针对BTV-NS2蛋白的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的BTV-NS2蛋白病毒特异性保守B细胞表位，本发明的单克隆抗体以及该单克隆抗体所识别的BTV-NS2蛋白病毒特异性保守B细胞表位为建立BTV免疫学检测方法和BTV-NS2蛋白的功能研究奠定了基础。

附图说明

图1为应用Western blot试验检测单克隆抗体BTV-4D4与BTV-NS2蛋白和BHK-21细胞的反应性结果；

1:BTV-4D4与BTV8感染的BHK-21细胞裂解沉淀的反应;2:BTV-4D4与BHK-21细胞裂解沉淀的反应;M:标准蛋白Marker

图2为噬菌体克隆测序结果及与BTV-NS2蛋白相似性比较；

图3为表1中所合成短肽与BTV-4D4反应性的间接ELISA分析；

图4为所鉴定B细胞表位的保守性及特异性分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

主要实验材料和来源

1.细胞与病毒

BHK-21细胞、SP2/0骨髓瘤细胞以及BTV1-24型毒株由本研究室保存。

2.主要试剂

胎牛血清、DMEM培养基购自GIBCO公司；50%PEG、50×HAT、50×HT、FITC标记羊抗鼠IgG抗体购自Sigma公司；二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司；邻苯二胺(OPD)购自哈尔滨博瑞生物技术有限公司；预染蛋白Marker购自Fermentas公司；SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒购于Southern Biotechnology公司;库容量为2.7×10⁹的M13噬菌体随机肽库Ph.D.-12TM、四环素（Tet）抗性的宿主菌ER2738均购自NEB公司。

3.实验动物

6-8周龄BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

实施例1单克隆抗体的制备

1.小鼠免疫

以BTV8（TCID₅₀10^8.25/0.1mL）全病毒免疫5只6周龄雌性BALB/c小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔两周，免疫剂量为0.5mL/只，免疫途径为腹腔免疫。

分别在二免和三免后一周对小鼠进行断尾采血，分离血清（4℃，10000rpm，20min），用间接ELISA检测抗体水平。在细胞融合前3天，对免疫效果好的BALB/c小鼠再进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射0.5mL免疫抗原。

2.细胞融合

融合前1天准备饲养细胞，按照常规方法取BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞铺于96孔细胞培养板中待用。断颈处死待取脾的小鼠，无菌取脾并分离脾细胞，按脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞4∶1的比例用PEG进行细胞融合，融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。

3.阳性杂交瘤细胞株的筛选及克隆

利用BTV8建立间接ELISA检测方法筛选阳性杂交瘤细胞株，对反应阳性的杂交瘤细胞扩大培养，同时用有限稀释法进行阳性杂交瘤细胞的亚克隆，至少亚克隆3次，将亚克隆好的阳性杂交瘤细胞及时冻存。最终获得一株可以稳定分泌抗BTV-NS2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其菌种保藏号是：CGMCC No.7001；并将其分泌的单克隆抗体命名为BTV-4D4。

4.单克隆抗体的大量制备

给10周龄左右的健康BALB/c小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.5mL/只，1周后腹腔注射1×10⁶个杂交瘤细胞，7～10d后当小鼠腹部极度膨胀时抽取腹水，隔2d抽一次，将抽取的腹水10000r/min离心10min，去除上层油脂和沉淀，上清分装保存于-20℃。

实施例2单克隆抗体的鉴定

1.单克隆抗体的亚类鉴定

按照SBA ClonotypingTM System/HRP抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书对实施例1所得到的单克隆抗体进行亚类鉴定。

结果显示本发明单克隆抗体BTV-4D4的重链为IgG1，轻链为κ链。IFA试验结果表明单克隆抗体BTV-4D4可与24个血清型BTV发生反应。

2.Western blot试验

将离心收获BTV8病毒上清后的细胞沉淀和BHK-21细胞沉淀处理后进行SDS-PAGE电泳，然后经电转印将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电转条件为18V电压30min;用5%脱脂奶粉封闭液将转印后的硝酸纤维素膜4℃封闭过夜;加入单克隆抗体上清室温孵育1h，用PBST（含0.5mL/L吐温-20的pH7.4的PBS缓冲液）洗涤三次，再与4000倍稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗鼠IgG抗体室温孵育1h，PBST洗涤3次后，用DAB显色试剂盒显色，扫描记录。

试验结果证实，本发明所制备的单克隆抗体BTV-4D4能够与BTV-NS2蛋白发生特异性反应，而与对照BHK-21细胞不发生反应（图1），同时根据本实验结果推测BTV-4D4所识别的BTV-NS2蛋白B细胞表位应该是一个线性表位。

实施例3B细胞表位的鉴定

1.噬菌体展示随机肽库的生物淘选与噬菌体基因组序列测定

参照NEB公司噬菌体展示随机12肽库操作手册，用所制备纯化出的单克隆抗体BTV-4D4对随机肽库进行3轮淘选，从而淘选出所展示肽段可与单克隆抗体特异性结合的噬菌体。3轮淘选单克隆抗体包被量均为100μg/mL，150μL/孔，而3轮淘选所用的PBST缓冲液中吐温-20浓度分别为0.1%、0.3%和0.5%。

从第3轮洗脱下来的噬菌体中取2μL做10倍系列稀释，每一稀释度取10μL接种200μL对数生长期ER2738宿主菌，作用5min后将全部菌液与3mL顶层琼脂培养基混合倾注于含有IPTG和X-gal的固体培养基之上，37℃培养过夜。

从总量不到100个噬菌斑的平板上，随机挑取10个噬菌斑，分别接种8管1mL对数生长期ER2738宿主菌，37℃摇床培养4.5h。之后将培养物10000rpm，离心30s，上清移入新管中再次10000rpm，离心30s，取600μL上清即为扩增噬菌体贮液。之后根据操作手册中介绍的方法即可从上述噬菌体贮液中提取出噬菌体基因组DNA，并交由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。

噬菌体测序结果显示BTV-4D4所淘选出的10个噬菌体克隆中有4个拥有一些共同序列（图2），通过比较整合最终确定出一条一致序列SNYD，而且BTV-NS2蛋白上存在该序列，故认为SNYD应该是BTV-4D4所识别的线性表位的核心序列。

2.B细胞表位的初步鉴定

以上述NS2蛋白上的相似区段为核心，分别向蛋白N端和C端各延伸4～5个氨基酸，最终选取长度为13个氨基酸的短肽（GVMRSNYDVRELR）为研究对象，进行BTV-NS2蛋白B细胞表位的初步鉴定。具体方法如下：

由哈尔滨塞拓生物有限公司代理合成上述短肽，并将短肽100ng/孔包被ELISA反应板对BTV-4D4进行间接ELISA检测。

结果显示所合成的13氨基酸短肽可以与BTV-4D4发生特异性反应（图3）。进而将BTV-4D4所识别的BTV-NS2蛋白B细胞表位初步定位于 ¹⁴⁶GVMRSNYDVRELR¹⁵⁸。

3.B细胞表位的精确定位

利用肽扫描技术合成如下短肽（表1），并对其进行间接ELISA检测，包被量为100ng/孔，进而精确定位B细胞表位。

表1针对BTV-4D4所合成的短肽

结果显示P2、P3、P4、P6、P7、P8和P9均可以与BTV-4D4呈阳性反应，而P5与P10与BTV-4D4反应的OD492值较低约为0.2，说明两者的结合效率较低（图3）。上述结果说明149位的R与154位的V对BTV-4D4所识别的表位来说是两个关键氨基酸，它们的缺失会显著降低BTV-4D4与相应表位的结合效率，而缺失的其他氨基酸对BTV-4D4所识别的表位来说则是一些非必须氨基酸，它们的缺失不会影响BTV-4D4与相应表位的结合效率。

综上所述，本发明将BTV-4D4所识别的BTV-NS2蛋白B细胞表位精确定位为 ¹⁴⁹RSNYDV¹⁵⁴（SEQ ID NO.1所示）。

4.B细胞表位的保守性和病毒特异性分析

利用European Bioinformatics Institute（EBI）数据库提供的氨基酸序列Blast程序，对所鉴定出的BTV-NS2蛋白B细胞表位进行保守性分析，同时将该表位序列与其它环状病毒属病毒NS2蛋白相应区段进行比对，分析该表位是否是BTV特异性表位。

Blast结果显示所鉴定出的BTV-NS2蛋白B细胞表位在BTV各血清型毒株中是相对保守的（图4），而且与环状病毒属的鹿流行性出血热病毒的NS2蛋白相应区段同源性较高，而和其它环状病毒属病毒如AHSV、Chuzan virus NS2蛋白相应区段几乎无同源性（图4）。

Claims

1.一株分泌抗蓝舌病病毒NS2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV-4D4，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏号为：CGMCC No.7001。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

3.蓝舌病病毒NS2蛋白线性B细胞表位多肽，其特征在于：所述表位多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述表位多肽被权利要求2所述的单克隆抗体所识别。

4.权利要求1所述杂交瘤细胞株在制备诊断或预防蓝舌病病毒感染药物中的应用。

5.权利要求2所述单克隆抗体在制备诊断或预防蓝舌病病毒感染药物中的应用。

6.权利要求3所述蓝舌病病毒NS2蛋白线性B细胞表位多肽在制备诊断蓝舌病病毒感染试剂中的应用。