CN102766207B - 抗猪圆环病毒2型的双峰驼重链单域抗体及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体及其制备方法和用途，属于生物技术领域。本发明首次利用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼，利用噬菌体展示技术建立PCV 2免疫VHH抗体库，筛选与PCV特别是PCV 2型病毒抗原具有良好亲和力的高特异性单域重链抗体（VHH），本发明所述的抗体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO.1所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。本发明的PCV 2单域重链抗体对于研究猪圆环病毒，特别是对于研究猪圆环病毒2型的感染机理和建立高度敏感和特异的抗原快速检测或诊断试剂具有重要意义。

Description

抗猪圆环病毒2型的双峰驼重链单域抗体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种抗体及其制备方法和用途，特别涉及以一种抗PCV2型的双峰驼单域重链抗体。此外，还涉及到该抗体的制备方法、功能鉴定和用途。本发明属于生物技术领域。

背景技术

猪圆环病毒病是近些年来流行的一种猪的病毒性传染病，病原为猪圆环病毒2型（PCV2）。PCV2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症的主要病原，并且还与猪繁殖障碍、猪呼吸道病综合症、猪皮炎与肾炎综合症、猪增生性坏死性肺炎、先天性振颤等疾病发生有关。

猪圆环病毒属于圆环病毒科、圆环病毒属，该病毒无囊膜，是单股负链环状DNA病毒。根据其致病性、抗原性及核苷酸序列将PCV分为PCV1和PCV2两个血清型。PCV2为致病病原，目前没有PCV1致病的报道。PCV2编码有11个开放阅读框ORF,由开放阅读框ORF2编码的CAP蛋白为病毒的主要结构蛋白，构成病毒的核衣壳，能诱导机体产生中和抗体，还具有型特异性的表位。

血清学调查表明，猪圆环病毒在世界上流行的范围很广，主要以混合感染和隐性感染为流行特点，猪群中存在大量病毒携带者，表现为血清抗体阳性的亚临床症状。我国自有圆环病毒感染的报道以来，很多地区都有发病的报道，流行不断加剧。PCV2感染会引起机体的免疫抑制，这就为其它病原的感染提供了便利。猪圆环病毒病已经成为威胁养猪业的又一大传染病。面对如此严峻的疫病形式，建立快速、敏感、特异的诊断方法进行及时的诊断显得尤为重要。

重链抗体（HCAbs）是发现于骆驼和软骨鱼等体内的一种天然缺失轻链，仅有重链的抗体（Hamers-Casterman C,Atarhouch T,Muyldermans S,.et al.Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains[J].Nature,1993,363:446-448.）。这类抗体的抗原结合位点仅由重链可变区单域结构域组成，称为单域重链抗体（variable domainofthe heavy chain of HCAbs，VHH）。由于天然缺失轻链，单域重链抗体靠仅有的3个互补决定区(CDRs)就具备了特异的抗原结合能力及高亲和力，而普通抗体则需要6个CDRs才具备与抗原结合的能力。VHH是目前可以得到的具有完整功能的最小抗体分子片段，分子量仅15kD，是常规抗体的1/10，单克隆抗体的1/3，其晶体结构为直径2.5nm，长4nm的圆柱体，有人也称其为纳米抗体（Nanobody）。VHH的抗原结合环的结构组成比普通抗体VH更大，CDR3区也更长，能够形成更多的新结构，因而能补偿抗原结合位点VL的缺乏。并且，VHH具有易表达、水溶性好、耐高温、耐极度pH值等独特性质。

作为一种小分子抗体，VHH抗体有其独特的应用潜力。可应用在制备肤类药物、制备体内显影剂、构建免疫融合物、构建多价及多功能抗体、制备亲和纯化材料、作为细胞内抗体药物以及用于基础研究当中。

抗体做为检测试剂的核心部分，其特异性及亲和力决定了测定结果的准确性和灵敏度。目前，已有大量关于利用高特异性、高亲和力的单域重链抗体建立检测方法的文献报道。Deckers等（Deckers，N.，D.Saerens，et al.Nanobodies a promising toolfor species-specific diagnosis of Taenia solium cysticercosis.[J]int Jparasitol,2009,39(5):625-633.）采用单域重链抗体建立了检测猪带绦虫囊尾蝴的ELISA检测方法，具有良好的特异性。Perruchini等（Perruchini,C.,F.Pecorari,etal.Llama V(H)H antibody fragments against GFAP:better diffusion in fixed tissues thanclassical monoclonal antibody[J].Acta Neuropathol,2009,118(5):685-695.）将单域重链抗体用于免疫组化实验，结果证实单域重链抗体用于免疫组化实验中，具有扩散的距离长、有利于较厚切片的免疫标记和测定等优点。

利用双峰驼制备PCV2VHH免疫抗体库，筛选PCV2特异性的VHH抗体，研制病原快速诊断方法在国内外尚无报道。

本发明首次利用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼，利用噬菌体展示技术建立PCV2VHH免疫抗体库，筛选具有良好型特异性和抗原亲和性的单域抗体，对于建立敏感和特异的PCV2抗体检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体；

本发明的目的之二是提供编码所述双峰驼单域重链抗体的核苷酸序列；

本发明的目的之三提供所述的双峰驼单域重链抗体或其编码序列在制备检测或诊断PCV2病毒感染试剂中的应用。

为了达到所述的目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明使用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼并利用噬菌体展示技术建立了PCV2VHH免疫抗体库，经过三次大量连接和转化，随机选择15个克隆进行测序，结果表明，15个克隆的片段均为编码重链抗体的可变区的基因，计算得到库容为1.12×10⁸的骆驼免疫单域抗体库，将该抗体库命名为NAL-PCV2，从中筛选出具有高特异性和抗原结合能力的单域重链抗体（VHH）。

本发明的一种抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体，其特征在于所述的抗体具有以下（a）或（b）所示的氨基酸序列：

（a）SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；或

（b）与SEQ ID NO.1所示的序列同源性在95%以上的氨基酸序列。

在本发明中，优选的，所述的与SEQ ID NO.1所示的序列同源性在95%以上的序列包括SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的序列。

进一步的，本发明还提供了编码以上所述的双峰驼单域重链抗体的核苷酸序列。

在本发明中，优选的，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的序列。

再进一步的，本发明还提供了一种重组表达载体，其特征在于含有以上所述的核苷酸序列。

更进一步的，本发明还提供了一种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有以上所述的核苷酸序列的真核或原核细胞。

在本发明中，优选的，所述的宿主细胞为含有以上所述的表达载体的真核或原核细胞。

本发明对得到的编码所述双峰驼单域重链抗体的基因进行了原核表达和纯化，通过结合力、特异性鉴定以及识别表位鉴定试验，证实获得的3株抗体具有很好的PCV2结合活性，其中2株（clone1和clone4）具有PCV2型特异性，通过抗体叠加实验证实3株抗体识别CAP蛋白上的不同表位。获得的VHH抗体能够在pH值2.0的情况下耐受胃蛋白酶消化30min。

利用有型特异性的2株抗体（clone1和clone4），通过双抗体夹心ELISA方法，对已知的PCV2阴性和阳性血清进行检测，结果表明该方法能够区分出血清抗体的阴阳性，并且能够反映出血清中PCV2抗体的含量，具有高敏感性和特异性。结果表明这2株抗体能够有效结合PCV2CAP蛋白，可以应用于PCV2血清抗体ELISA检测方法的建立。

因此，最后，本发明提供了所述的双峰驼单域重链抗体在制备检测或诊断猪圆环病毒感染试剂中的应用。及

所述的双峰驼单域重链抗体在制备检测或诊断猪圆环病毒2型感染试剂中的应用，其中所述的双峰驼单域重链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。及

所述的核苷酸序列在制备检测或诊断猪圆环病毒感染试剂中的应用。及

所述的核苷酸序列在制备检测或诊断猪圆环病毒2型感染试剂中的应用，其中所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。

本发明首次利用PCV2灭活疫苗免疫双峰驼，利用噬菌体展示技术建立PCV2VHH免疫抗体库，筛选出具有良好型特异性和抗原亲和性的单域抗体，对于建立敏感和特异的PCV2抗体检测方法具有重要意义。

附图说明

图1为双峰驼外周血淋巴细胞RNA提取结果；

1：总RNA；M：λ-EcoT14 I digest标准分子量

图2为VHH基因第一轮PCR扩增结果；

M：DL2000标准分子量；1.PCR扩增产物；

图3为VHH基因第二轮PCR扩增结果；

1：PCR扩增产物；M：DL2000标准分子量

图4为VHH基因第三轮PCR扩增结果；

1：PCR扩增产物；M：DL2000标准分子量

图5为双峰驼PCV2 VHH基因1、3和4号克隆的PCR电泳结果；

M：DL2000Marker；1：clone1基因；2：clone3基因；3：clone4基因

图6为PCV2VHH抗体的原核表达；

M：蛋白分子量标准（SM0431）；1,4,6分别为未诱导的对照；2,3,5分别为clone3、clone1、clone4表达组；

图7为western bloting鉴定结果；

1,3,5为未诱导的空白对照；2,4,6分别为clone1、clone3、clone4诱导后的总蛋白；M为蛋白分子量标准（SM0431）

图8为可溶性分析和目的蛋白纯化；

1,3,5：分别是clone1 clone3和clone4纯化结果；2,4,6：分别是表达clone1 clone3和clone4菌进过超声波破碎后，收集的上清；M：蛋白分子量标准（SM0431）

图9为PCV2 VHH抗体抗原结合能力鉴定；

A：clone1；B：clone3；C：clone4

注：clone+CAP+serum表示包被抗体与衣壳蛋白和阳性血清依次作用；CAP+serum表示包被的CAP蛋白与血清直接作用作为实验对照；Sumo+CAP+serum表示包被sumo蛋白与衣壳蛋白和阳性血清依次做用作为对照；clone+serum表示包被抗体与阳性血清直接作用作为对照；Clone+CAP+Negserum表示抗体与衣壳蛋白和PCV2阴性血清作用作为对照；

图10为PCV2 VHH抗体型特异性分析；

A：clone1；B：clone3；C：clone4

注：Clone PCV2表示抗体与PCV2抗原和阳性血清依次作用；Clone PCV1表示抗体与PCV1抗原和阳性血清依次作用；Clone control表示与PCV1和PCV2双阴性血清作用；

图11为胃蛋白酶消化实验。

1：作用40min，2：作用30min，3：作用20min，4：作用10min，5：胃蛋白酶对照，6：蛋白对照，M：蛋白marker（SM0431）

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

实施例1抗猪圆环病毒2型的双峰驼VHH重链抗体的制备

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1试验动物、抗原、佐剂

1峰雄性双峰驼（1周岁），1峰雌性双峰驼（6月龄）；PCV2灭活疫苗（IngelvaccircoFLEX，Serial NO.309-211），重组PCV2VLPs抗原（Shuanghui Yin,Shiqi Sun,Shunli Yang,et al.Self-assembly of virus-like particles of porcine circovirus type 2capsid protein expressed from Escherichia coli[J.]Virology Journal 2010,7:166）。

1.1.2菌株、辅助噬菌体和试剂

大肠杆菌TG1和HB2151、辅助噬菌体M13K07、载体pHEN2购自Novagen公司；表达载体pSMK本所孙世琪博士惠赠；限制性内切酶购自NEB；淋巴细胞分离液（1.077）购自上海生工；Trizol、DNA片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒为OMEGA产品；镍亲和层析树脂购自Qiagen；PCR相关试剂购自宝生物公司；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2方法

1.2.1免疫方法、抗原接种剂量、免疫程序和血清抗体的测定

在双峰驼的颈部皮下、背部皮下、腹部皮下和后腿皮下进行分点接种PCV2灭活疫苗（Ingelvac circoFLEX）。首次免疫前和每次免疫后采集静脉血，用CAP蛋白ELISA方法检测抗体产生情况（Shuang-hui YIN,Shun-li YANG，Hong TIAN,et al.AnELISA Based on a Truncated Soluble ORF2 Protein for the Detection of PCV2Antibodies in Domestic Pigs[J]VIROLOGICA SINICA,2010,25(3):191-198.），第五次免疫后5天，静脉采血500ml，进行下一步实验。具体动物免疫程序和抗原接种剂量见表1。

表1双峰驼免疫程序和抗原剂量

1.2.2淋巴细胞分离

最后一次免疫后5天，静脉采集抗凝血，用比重为1.077的淋巴细胞分离液，分离外周血淋巴细胞，用1640液洗涤分离的淋巴细胞，细胞计数，液氮冻存备用。

1.2.3细胞总RNA的提取

利用Trizol法抽提分离的淋巴细胞总RNA。

1.2.4VHH基因扩增，噬菌体展示载体的构建和免疫库的构建

根据参考文献（Ana Monegal,Diletta Ami,Chiara Martinelli.et al.Immunologicalapplications of single-domain llama recombinant antibodies isolated from a

library[J].Protein Engineering design and selection,2009,22(4),273-280.）做适当修改设计三对引物扩增VHH基因片段，引物CH2D位于高度保守的CH2区序列，H1R位于抗体编码区前导序列，H2S和H2SfiI位于可变区框架1（framework region1，FR1），H3D和H3NotI位于可变骨架4（framework region4，FR4）。引物见表2。

表2VHH基因片段扩增用引物

注：划线部分为引用酶切位点

以Oligo dT为反转录引物，将提取的RNA转录为cDNA，然后以cDNA为模板，H1R、CH2D为上下游引物扩增得到大小分别为600bp和900bp的2条带，回收600bp条带作为模板，进行第二轮PCR扩增。以第二轮PCR产物为模板，H2S、H3D为上下游引物得到约大小450bp条带。以第二轮PCR产物为模板，以H2SfiI，H3NotI为上下游引物进行第三轮扩增，得到约450bp条带。将第三轮PCR产物经过SfiI/NotI双酶切后，克隆入pHEN2载体，通过电转化方法将连接产物转化到大肠杆菌TG1中，电转结束后，细胞立即倒入1mL SOC培养液中，37℃、150r/min培养1h，然后菌液以1:100比例后涂布于2YTG平板（2%葡萄糖、Amp^r50mg/L、2×YT，2YTG）平板，另取10ul菌液做1000倍稀释后涂板，37℃过夜培养，用于计算库容。

平板过夜培养后，用10mL的2×YT培养基将培养板上长出的菌苔刮洗干净，加入终浓度25%的甘油，分装保存在-70℃备用，此为获得的抗PCV2单域重链抗体（VHH）免疫库。

电转化后的随机挑选电转后的克隆，抽提质粒进行测序，鉴定抗体库的多样性，根据克隆的正确率来计算实际库容。

1.2.5制备噬菌体抗体库

(1)取用甘油保存的VHH文库，接种到500ml2YT-G(2×YT，Glucose：0.5%)培养基中，37°C 250rpm震摇培养直到菌浓度达到OD₆₀₀值为0.8-0.9。

(2)加入M13K07辅助噬菌体至终浓度5×10⁹pfu/mL，首先，在37°C静置培养30min，然后在进行200rpm震摇培养30min，使噬菌体充分感染。

(3)2200g离心15min重新收获菌体，然后重悬到相同体积的2YT-AK（2×YT，2%葡萄糖，50ug/ml Kanamycin，100ug/ml Ampicillin）中，30°C 300rpm过夜震摇培养。

(4)7000g，4°C离心15min收集含有噬菌体的上清，加入到容量为1L的提前预冷的三角瓶内。加入0.3体积的噬菌体沉淀剂PEG/NaCl(20%PEG80002.5mol/LNaCl)。混匀冰上静置1h，使噬菌体沉淀。

(5)7000g15min离心两次，尽可能多的收集噬菌体沉淀，重悬到8ml的PBS中。

(6)分装到小离心管12000g离心10min确保细菌充分分离，收集上清。最后滴定噬菌体，将得到的噬菌体稀释后感染TG1在涂到含有TG1的2TY-AG(2×YT，Amp^r：100μg/mL；Glucose：0.5%)平板，培养，确定抗Amp^r克隆的数量。然后4°C保存噬菌体，准备进行筛选。

1.2.6抗体库的淘选

（1）抗原包被：在96孔酶标板中用碳酸盐缓冲液（pH9.6）包被PCV2VLPs，三轮筛选包被浓度分别为30μg/ml、15μg/ml、10μg/ml，100μL/孔，4℃包被过夜，制成抗体淘洗板。

（2）封闭：弃去孔内液体，加入100μL/孔封闭液（TBST+5mg/ml BSA,0.02%NaN3），37℃封闭2h。

（3）去封阻液，在用TBST(TBS+0.1%Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液。

（4）用100μl的TBST缓冲液稀释噬菌体原始文库，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动60min。（第一轮淘洗噬菌体颗粒的数量比文库大小高100倍）。

（5）倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。用TBST缓冲液洗板10次，每次换一干净纸巾以避免交叉污染。

（6）洗脱：用100μl的非特异性缓冲液（0.1M HCl-Glycin pH2.2）洗脱，室温摇动30min，吸出洗脱液，用80μL左右1M Tris-HCl（pH9.1）中和至pH等于7.4。

（7）取少量洗脱液（10μl）进行噬菌体滴度测定和产出量计算，同时将剩余洗脱的噬菌体感染20ml指数生长的TG1，37℃ 300rpm扩增培养5h。

（8）将培养物转入一离心管中，然后，4℃ 10 000rpm离心10min。上清液转入另一离心管中，再离心。将上清的上部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀过夜。4℃ 10 000rpm离心15min。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。

（9）沉淀物重悬于1ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5min使残余细胞沉淀。上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育60min。4℃离心10min，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。沉淀物重悬于200μl TBS中。离心1min，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。分装冻存-70℃备用。

（10）根据常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4℃贮存。

按以上步骤进行“结合-洗涤-洗脱（感染）”，反复进行三轮。

1.2.7噬菌体ELISA鉴定阳性克隆

（1）挑取经过三轮经筛选后的克隆于96孔深孔板中，每孔250μL2×YTATG(2×YT培养基中添加Amp^r：100μg/mL；Tet^r：10μg/mL；Glucose：0.5%)培养基，37℃摇床培养至OD₆₀₀约为0.5，按照MOI=20∶1加入辅助噬菌体，室温静置30min，37℃，150rpm/min培养30min，5000g离心10min收集沉淀，重悬于等体积2×YTATG，30℃，摇床200rpm培养过夜。

（2）10000rpm/min离心10min收集上清，加入沉淀剂收集噬菌体。重悬于1ml无钙镁离子的磷酸盐缓冲液（DPBS）中，反复离心确保没有任何杂质颗粒存在。

（3）包被PCV2 VLPs 10μg/ml，加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃包被过夜。

（4）弃包被液，用DPBS溶液220μL/孔洗5次，用封闭液（5%BSA+0.1%Tween-20）封闭，100μL/孔，37℃封闭2h。

（5）弃去封闭液，加入溶于洗液的单克隆噬菌体抗体，100μL/孔，37℃静置2h。

（6）弃去液体，用DPBS洗6次，220μl/孔。

（7）将鼠抗M13-HRP抗体用封闭缓冲液按1:5000稀释，100μL/孔，37℃作用1h。

（8）弃去液体，酶标板用DPBS洗6次。

（9）弃去洗涤液，加入底物OPD显色液，50μL/孔，室温静置显色。用50μL/孔2M H₂SO₄终止显色。酶标仪测定OD490值。

1.2.8阳性克隆的测序

（1）进行噬菌斑扩增，然后，取500μl含噬菌体上清转入一新鲜离心管。加200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min。

（2）离心10min，弃上清液，再短暂离心，小心吸去残余上清。

（3）沉淀物彻底重悬于100μl碘化物缓冲液［10mM Tris-HCl(pH8.0),1mMEDTA,4M NaI］中，加入250μl乙醇，室温温育10min。短时间的室温温育使单链噬菌体DNA沉淀而大多数噬菌体蛋白保持在溶液中。

（4）离心10min，弃上清。用70%的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥。沉淀重悬于30μl TE[10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA]中。

（5）10μl的上述模板溶液送出测序，使用用通用测序引物测序。

1.2.9筛选的PCV2VHH重链抗体在E.coli中表达、鉴定和纯化

上述实验共获得阳性克隆，通过测序得到基因组序列，通过序列分析比较，该筛选序列为VHH重链抗体序列。利用含有BSAI和BamHI位点的引物进行PCR将这些序列扩增，胶回收PCR扩增后片段，然后双酶切酶切，酶切后的目的片段与E.coli表达载体pSMK连接，构建VHH重链抗体重组表达载体，并转化到E.coli［BL21-codon-Plus(DE3)-RIL strain(Stratagene)］中进行表达。利用SDS-PAGE鉴定表达的VHH抗体蛋白表达情况，利用抗His单抗进行Western blot实验，对蛋白表达进一步验证，并使用镍柱进行目的蛋白的纯化。

1.2.10重组PCV2重链单域抗体（VHH）结合抗原能力和型特异性鉴定

1.2.10.1双抗体夹心ELISA鉴定PCV2 VHH抗体结合力

（1）抗体包被：纯化VHH抗体包被酶标板（10μg/ml 100μl/孔），设定SUMO蛋白（10μg/ml 100μl/孔）、PCV2 VPLs（10μg/ml 100μl/孔）做对照，4℃过夜包被。

（2）加入抗原：1×PBST洗涤4次，220μL/孔，最后一次弃净孔内液体，拍干，按照50ug/ml的浓度加入PCV2 VPLs 100μl/孔，37℃作用60min，洗板。

（3）加入PCV2阳性多抗血清：用血清稀释液（1%BSA，10%马血清，1x PBST），按照倍比稀释加入100μl/孔，37℃作用60min，洗板。

（4）加酶标二抗：1∶10000稀释抗猪HRP标记二抗，100μl/孔，37℃作用60min，洗板。

（5）显色：加入OPD底物，50μl/孔，37℃避光显色15min。

（6）终止并读数：加入2M H₂SO₄终止反应，50μl/孔，OD₄₉₀读取吸光度值。

1.2.10.2双抗体夹心ELISA鉴定PCV2VHH抗体型特异性

（1）抗体包被：对纯化VHH抗体用碳酸盐缓冲液（pH值9.6）包被酶标板（10μg/ml 100μl/孔），4℃过夜包被。

（2）加入抗原：1×PBST洗涤4次，220μL/孔，最后一次弃净孔内液体，拍干，分别加入纯化的PCV1 CAP和PCV2 VPLS（50ug/ml，100μl/孔），37℃作用60min，洗板。

（3）分别加入PCV2和PCV1阳性多抗血清（产生于免疫鼠的多抗血清）和阴性对照血清（未免疫鼠血清），用血清稀释液（1%BSA，10%马血清，1x PBST），按照倍比稀释加入100μl/孔，37℃作用60min，洗板。

（4）加酶标二抗：1∶10000稀释抗鼠HRP标记二抗，100μl/孔，37℃作用60min，洗板。

（5）显色：加入OPD底物，50μl/孔，37℃避光显色15min。

（6）终止并读数：加入2M H₂SO₄终止反应，50μl/孔，OD₄₉₀读取吸光度值。

1.2.11抗体叠加实验

对获得的几株抗体进行叠加实验鉴定其是否结合同一个抗原表位

（1）抗体包被：用碳酸盐缓冲液（pH值9.6）按10μg/ml加入PCV2 VPLs抗原100μl/孔，4℃过夜包被。

（2）加入纯化抗体：1×PBST洗涤4次，220μL/孔，最后一次弃净孔内液体，拍干，超量加入纯化抗体（50μg/ml），每个抗体为选择两个实验重复孔，37℃作用60min，洗板。此时取其中一个实验重复孔，加入不同的抗体，100μl/孔，37℃作用60min。

（3）非重叠孔先加入抗HIS的鼠源单抗（1：1000），然后做重叠的孔也按照相同的比列加入，100μl/孔，37℃作用60min，洗板。

（4）加入HRP标记的抗鼠二抗，按照1∶10000稀释，100μl/孔，37℃作用60min，洗板。

（5）显色：加入OPD底物，50μl/孔，37℃避光显色15min。

（6）终止并读数：加入2M H₂SO₄终止反应，50μl/孔，OD₄₉₀读取吸光度值。

1.2.12抗体胃蛋白酶消化实验

据报道VHH抗体具有很好的稳定性，在极端的条件下也很稳定，本实验采用猪的胃蛋白酶对获得抗体进行消化。

（1）取纯化的抗体80μg（100μl），取等量的5份。

（2）胃蛋白酶终浓度为0.8mg/ml溶解于含有0.8%体积浓盐酸的液体中（pH约为1.6）。

（3）加入等量的胃蛋白酶（100μl）到抗体管中，此时pH值约为2.2，按照10min20min 30min 40min 60min分别进行消化。

（4）终止加入2M的NaoH 10μl，此时pH值约为6.0。

（5）加入5×SDS loadingbuffer进行SDS-PAGE。

1.2.13PCV2 VHH在双抗体夹心ELISA血清抗体检测方法建立中的应用

利用PCV2VHH抗体clone1和clone4，通过双抗体夹心ELISA方法对15份PCV2阳性和5份阴性血清进行抗体测定，从而对获得PCV2VHH抗体是否可以用于临床样品抗体检测进行验证。

（1）抗体包被：用碳酸盐缓冲液（pH值9.6），稀释clone1和clone4浓度均为10μg/ml，加到载体反应板，50μl/孔，4℃包被过夜。

（2）1×PBST5次洗版后，加入用稀释液稀释的PCV2VPLs（50ug/ml），50μl/孔，37℃1h。

（3）加入倍比稀释的样品血清，50μl/孔，37℃1h。

（4）加入HRP标记二抗（1:10000），50μl/孔，37℃1h。

（5）加入TMB底物，显色15min，加入2M H₂SO₄终止反应，50μl/孔，OD₄₅₀读取吸光度值。

2.结果

2.1完整淋巴细胞总RNA的提取

提取外送免疫后双峰驼外周血淋巴细胞的总RNA，凝结电泳分析提取的总RNA无基因组污染，大小与预期相符，见图1所示。

2.2VHH重链抗体基因PCR扩增

以Oligo dT为反转录引物，将提取的RNA转录为cDNA，以cDNA为模板，H1R、CH2D为上下游引物，进行第一轮PCR扩增，得到大小600bp和900bp左右2条带，见图2。回收600bp条带。以第一轮扩增的PCR产物为模板，H2S、H3D为上下游引物进行第二轮PCR扩增得到约450bp条带，见图3。以第二轮PCR产物为模板，以H2SfiI、H3NotI为上下游引物进行第三轮PCR扩增得到约450bp条带，见图4，此时VHH基因两端分别引入了SfiI/NotI限制性酶切位点。

2.3噬菌体展示抗体库多多样性的确定和库容量

经过三次大量连接和转化，随机选择15个克隆测序结果表明，15个克隆的片段均为编码重链抗体的可变区的基因，计算得到库容为1.12×10⁸的骆驼免疫单域抗体库，将该抗体库命名为NA L-PCV2。

2.4抗体库的淘选

采用噬菌体文库NAL-PCV2淘洗能与PCV2抗原特异性结合的噬菌体颗粒，测定每轮筛选的噬菌体的回收率，经过3轮淘选，表明选择性吸附的噬菌体量明显增加（表3），能与PCV2抗原特异性结合的噬菌体的得到了富集。对每一轮洗脱无扩增得到的噬菌体文库进行phage-ELISA监测，在抗原包被浓度相同，噬菌体投入量相同的条件下，测定的吸光度值随着淘洗次数的增加而升高，说明能够与目标抗原结合的噬菌体克隆得到了富集，结果见表4。

表3三轮淘选噬菌体富集结果

表4phage-ELISA检测每轮淘选的噬菌体

2.5单克隆噬菌体-ELISA

选择第三轮淘洗后的24个克隆，进行扩增和纯化，经过鉴定有6个克隆为完整的VHH抗体，对这些纯化后的噬菌体颗粒采用PCV2抗原间接ELISA鉴定（表5），通过与阴性对照比较，并且DNA测序后鉴定出3个能够与PCV2抗原特异性结合的克隆。

表5单克隆Phage-ELISA

2.6筛选获得的PCV2VHH重链抗体阳性克隆测序结果

对3个能够与PCV2抗原特异性结合的克隆测序，测定的序列命名为Clone1、3和4。

Clone1的测序结果如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示；Clone3的测序结果如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示；Clone4的测序结果如SEQ ID NO.3所示，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示。

2.7基因扩增结果

根据测序结果设计特异性引物（表6）

表6引物设计

注：划线部分为引用酶切位点

利用表达引物扩增结果，出现400bp左右的条带（图5），经过双酶切后回收连接到SUMO载体。

2.8PCV2 VHH抗体表达，鉴定及纯化

将连接后的阳性质粒转化到表达菌Ecoli DE3，挑取单克隆致10mlLB培养基，220rpm 37℃培养12h，转接到500ml LB培养基，继续培养3h，当OD₆₀₀使约为0.6时，用IPTG诱导（终浓度为0.5mM），8h后离心收菌，经过SDS-PAGE分析，得到大小为32Kd的目的条带，与预期大小相符（图6）。利用抗His单克隆抗体，进行western blot实验，进一步证实蛋白得到了表达（图7）；收获的菌通过超声波裂解，进行可溶性分析，结果表明这些目的蛋白为可溶性表达；对超声后的上清过镍柱进行纯化，能够得到预期大小的目的蛋白（图8）

2.9PCV2 VHH抗体的抗原结合能力和型特异性实验结果

用双抗体夹心ELISA方法检测获得抗体的抗原结合能力和型特异性，实验结果：获得的抗体与血清直接作用对照、SUMO标签对照的OD₄₉₀值很低，表明实验值不是由于抗体与血清直接作用或标签与血清直接作用而产生。CAP蛋白直接与阳性血清作用的OD₄₉₀值很高，表明CAP蛋白可以与血清抗体结合，实验设计成立。三株抗体夹心ELISA实验阳性对照OD₄₉₀较高，并且与阴性血清对照的OD₄₉₀值差异明显（图9），表明这些获得抗体具有很好的CAP结合活性。

在型特异性试验中，对所获得的三株抗体与PCV2 CAP的结合力和与PCV1CAP的结合力进行比较，clone1和clone4有差异明显，表明获得抗体中其中clone1和clone4具有具有较好的型特异性，而clone3对PCV1和PCV2的CAP蛋白结合力差别不明显，不具有型特异性（图10）。

2.10获得的三株PCV2 VHH抗体叠加实验结果

用ELISA叠加试验对三株PCV2 VHH抗体进行抗原位点分析，试验取所有重复孔OD₄₉₀nm的平均值，结果按照此公式AI＝[2×A(1+2)÷(A1+A2)-1]×100%，计算抗体之间的叠加率。式中：A1和A2代表单个抗体的OD₄₉₀nm值；A(1+2)代表两株抗体的OD₄₉₀nm叠加值。判定：当AI＞50％则表明被检测的两株单抗所识别的抗原位点不同，AI＜50%则表明被检测的两株单抗所识别的抗原位点相同（Friguet,B.,Djavadi-Ohaniance,L.,Pages,J.,Bussard,A.,Goldberg,M..A convenient enzyme-linked immunosorbent assay for testing whether monoclonal antibodies recognize thesame antigenic site.Application to hybridomas specific for the beta 2-subunit ofEscherichia coli tryptophan synthase[J].1983.J Immunol Methods,60,351.）。如果AI值越大，则所识别的抗原位点重叠的可能性越小。结果如表7所示。

表7抗体叠加实验

实验结果表明：clone1、clone3和clone4之间的AI值均大于50%，说明这3株抗体所针对的抗原决定表位不同。

2.11 PCV2 VHH抗体抵抗胃蛋白酶消化实验结果

在pH2.0的条件下用相同含量的胃蛋白酶与获得的VHH抗体（clone1，clone3和clone4）作用，经过SDS-Page电泳分析表明，clone1,clone3和clone4在作用30min时均有完整VHH抗体，表明这些抗体能在极端pH值条件耐受胃蛋白酶消化30min，其中clone1抗体抵抗胃蛋白酶消化实验结果如图11所示，其余两个克隆的结果与clone1结果一致。

2.12双抗体夹心ELISA方法血清抗体的检测结果

利用PCV2VHH抗体（clone1和clone4），通过双抗体夹心ELISA方法对15份PCV2阳性和5份阴性血清进行了抗体测定，结果该方法够区分出血清抗体的阴阳性，并且能够反映出血清中抗体的含量高低，具有高敏感性和特异性（表8、表9）。结果表明这2株抗体可以应用于PCV2血清抗体ELISA检测方法的建立。

表8采用Clone1进行的双抗体夹心ELISA方法检测结果

注：N1-5表示阴性血清样品

表9采用Clone4进行的双抗体夹心ELISA方法检测结果

注：N1-5表示阴性血清样品

Claims (10)

1.抗猪圆环病毒2型的双峰驼单域重链抗体，其特征在于所述的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。

2.编码权利要求1所述的双峰驼单域重链抗体的核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。

4.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求2或3所述的核苷酸序列。

5.一种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求2或3所述的核苷酸序列的真核或原核细胞。

6.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求4所述的表达载体的真核或原核细胞。

7.权利要求1所述的双峰驼单域重链抗体在制备检测或诊断猪圆环病毒2型感染试剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的双峰驼单域重链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示。

9.权利要求2或3所述的核苷酸序列在制备检测或诊断猪圆环病毒2型感染试剂中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.6所示。

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