CN103163299A

CN103163299A - 禽白血病双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒

Info

Publication number: CN103163299A
Application number: CN2013100469289A
Authority: CN
Inventors: 秦爱建; 钱琨; 尹丽平; 韶红霞; 金文杰
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2013-06-19

Abstract

本发明提供了一种禽白血病双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，其中包括：包被抗ALVp27蛋白单克隆抗体的酶标板、酶标记抗ALVp27蛋白单克隆抗体等。捕获抗体和检测抗体分别针对p27蛋白不同的抗原决定簇；包被在酶标板的抗ALVp27蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株ALVP27-5D3分泌获得，酶标记抗ALVp27蛋白单克隆抗体由杂交瘤细胞株ALVP27-4F12分泌获得。本发明试剂盒操作简便、快速，可以用于ALV所有亚群病毒的检测，适用于基层各级兽医部门和出入境禽白血病的快速大量筛选检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。

Description

禽白血病双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测禽白血病病毒的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。

背景技术

禽白血病（Avian leukosis，AL）是由反转录病毒科中的禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的多种肿瘤性疾病的统称，呈世界性分布。根据病毒宿主范围、囊膜特性和交叉中和反应的不同，将ALV分为A-J10个亚群，其中E亚群为内源性ALV，A、B、C、D和J亚群为外源性ALV。由于诱发肿瘤、患鸡胴体废弃、产蛋性能下降和对鸡群生产性能的影响，ALV给养禽业带来巨大经济损失。然而，迄今为止，针对该病尚无可供预防的疫苗和有效药物，检测淘汰阳性鸡，进而建立无禽白血病种鸡群是控制本病的有效途径。培育无ALV感染鸡群时，首先对母鸡血清分离病毒，检测其中的p27抗原，同时检测泄殖腔棉拭子的p27抗原，选择ALV阴性和不排泄ALV的母鸡的种蛋孵化，然后对孵出的雏鸡检测其泄殖腔拭子中的p27抗原。选用阴性的雏鸡分成小群隔离饲养，至6周和25周龄时再检测ALV，淘汰阳性鸡，连续3-4个世代，可逐步建立起无ALV感染鸡群，达到净化ALV的目的。

目前常用的检测ALV的方法主要包括：病毒分离，免疫荧光检测（IFA），琼脂扩散试验，ELISA，RT-PCR等。不同方法各有优缺点。ELISA抗原检测方法以其敏感、特异、易于操作而被广泛使用，适用于大量样品的快速检测，更适合基层对该病的检测。

ALV核衣壳蛋白p27由ALV gag基因保守序列编码，p27蛋白是核衣壳蛋白的主要成分，有许多易于检测的抗原位点，外源性ALV各亚群间同源性高达90%，在病毒粒子中含量高，占总蛋白成分的30%以上。本专利应用两株抗ALV p27蛋白的特异性单克隆抗体ALVP27-5D3和ALV P27-4F12研制出了禽白血病病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，能够快速、准确地检测ALV病毒，具有很好的特异性和敏感性。

发明内容

本发明提供的禽白血病病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，其包括：

(1)包被抗ALVp27蛋白单克隆抗体(捕获抗原的抗体)的酶标板；

(2)酶标记ALVp27蛋白单克隆抗体(检测抗体)；

其中，包被在酶标板的ALVp27蛋白单克隆抗体与酶标记ALVp27蛋白单克隆抗体分别针对ALVp27蛋白不同的抗原决定簇。

本发明以GST-p27纯化的蛋白作为抗原制备ALV病毒核衣壳蛋白p27单克隆抗体，得到多个不同抗原决定簇的单克隆抗体，进一步筛选发现其中2株针对不同表位的杂交瘤细胞株分泌抗体效价高。

在本发明实施例中，包被在酶标板的抗ALV p27蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株ALVP27-5D3（保藏号：CGMCCNo.7106）分泌获得，酶标记ALVp27蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株ALV P27-4F12（保藏号：CGMCC No.7107）分泌获得。

本发明所述酶标记抗ALV p27蛋白单克隆抗体的标记酶是辣根过氧化物酶，具体标记方法包括如下步骤：将5mg HRP溶于0.5mL0.1mol/L NaHCO₃溶液中；加0.5ml10mmol/L NaIO₄溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2小时。（2）加0.75mL0.1mol/L Na₂CO₃混匀。（3）加入0.75mL小鼠已处理的腹水，或纯化单克隆抗体等（15mg/mL），混匀。（4）称取SephadexG-25干粉0.3g，加入一支下口垫玻璃棉的5ml注射器外筒内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用（避光）3小时或4℃过夜。（5）用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20体积新鲜配制的5mg/mL NaBH₄溶液，混匀，室温作用30分钟；再加入3/20体积的NaBH₄溶液，混匀，室温作用1小时（或4℃过夜）。（6）用等体积的饱和硫酸铵沉淀交联物，收集沉淀并用PBS溶解。(7)用Protein G柱纯化，4℃过夜透析24-36h，即得纯化酶标记抗体。

单克隆抗体可按照如下方法包被到酶标板：将3.5μg/mL的单克隆抗体按100μL/孔加入到酶标板中，4℃放置12-16h，用PBST洗涤后，用5%脱脂乳封闭，350μL/孔，于37℃放置2h，再用PBST洗涤。

此外，本发明试剂盒还包括以下试剂中的一种或多种：稀释液、酶标抗体、10×洗涤液、阳性对照、阴性对照、底物缓冲液、TMB粉剂、TMB溶解液、H₂O₂溶液、终止液。

运用本发明检测试剂盒可检测天然的ALV病毒p27蛋白，以及重组的ALVp27蛋白。

本发明运用杂交瘤细胞技术制备了多株针对ALVp27蛋白的单克隆抗体，筛选出其中可分别识别p27蛋白上2个不同线性表位的2株单克隆抗体(即ALV P27-5D3、ALV P27-4F12)进行了相应的特性鉴定。经间接免疫荧光和ELISA方法鉴定，2株单克隆抗体与ALV分离株ALV(GY3)具有良好的反应性。其腹水效价均可达1:1.5x10⁵或以上，且分泌抗体的杂交瘤细胞株活性稳定。

本发明用分别针对p27蛋白不同线性表位的2株单克隆抗体对抗原进行捕获和检测，相对于仅用一株单克隆抗体建立的抗体夹心ELISA方法来说，敏感性大大提高，更适用于临床样本中微量抗原的检测。

本发明还有一个重要的环节就是需要高纯度的酶标记抗体，优质的酶标记抗体既能保留抗体的免疫学活性，又能保留酶的活性。抗体的标记率越高，则方法的敏感性越高，所以这就需要摸索出比较成熟的HRP标记抗体的方法;本发明利用免疫学上的过碘酸钠法进行标记，并进行了一些细节上的改进。这有效地保证了本方法的高敏感性。

与目前常用于ALV检测的RT-PCR等方法相比，本发明建立的双抗体夹心ELISA抗原检测法成本低、操作简便、重复性好，适用于基层临床推广应用，具有巨大的经济效益和广阔的应用前景。本试剂盒的建立为ALV流行病学研究及疫病防控、净化提供了实用、快速、有效的检测工具。

附图说明

图1显示的是本发明ELISA抗原检测建立的技术路线。·

图2显示的是两株单克隆抗体分别与ALVp27蛋白反应性的Westernblotting鉴定，M.蛋白marker，1.DF-1细胞裂解产物，2,3.感染ALV-J的DF-1细胞裂解产物，4.感染ALV-A的DF-1细胞裂解产物。

图3显示的是单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定ALV-J，A.ALV P27-4F12；B.ALV P27-5D3；C.ALV P27-3C6；D.ALV P27-5B10；E.ALV P27-1C5。

图4显示的是两株腹水纯化后的SDS-PAGE，M.Marker；1.纯化后的ALV P27-5D3IgG；2.纯化后的ALV P27-4F12IgG。

本发明中杂交瘤细胞株ALV P27-5D3于2013年1月21日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.7106。

杂交瘤细胞株ALV P27-4F12于2013年1月21日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No.7107。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1双抗夹心ELISA抗原检测方法的建立

一、单克隆杭体的制备

1.单克隆抗体的制备（技术路线见图1）

根据已发表的ALV JS-nt株的基因序列（登录号：HM235667），设计合成了一对针对 p27的特异性引物，在上下游分别添加了BamHI和XhoI酶切位点，由上海英骏公司合成。引物序列如下：

上游引物5′-GCGGATCCATGCCTGTAGTGATTAAGACAG-3′（SEQ ID NO.1）；

下游引物5′-GCCTCGAGTTAGGCCGCGGCTATGCCT-3′(SEQ ID NO.2)。

用PCR的方法从ALV基因组中扩增出了p27基因，并将扩增片段克隆至pGEX-6P-1表达载体（GE公司产品）中，筛选重组菌pGEX-6p-1-P27/BL21，用IPTG诱导蛋白表达GST-p27，并利用GE公司蛋白预装柱纯化蛋白，得到纯化的GST-p27融合蛋白。

用上述纯化的GST-p27融合蛋白腹腔注射6周龄雌性BALB/C小鼠，共三次，每次间隔14天，剂量分别为50、100、150μg/只。融合前加强免疫，200μg/只，加强免疫后72-96h按常规方法进行细胞融合，融合后第10天用预冷丙酮乙醇（3：2，v/v）固定感染ALV-J的DF-1细胞，经间接免疫荧光（IFA）检测融合细胞上清中的抗体，筛选阳性杂交瘤细胞；同时用包被GST-p27蛋白，间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清中的抗体，用非重组菌裂解上清GST作对照，筛选阳性杂交瘤细胞。所有检测强阳性孔的融合细胞转到24孔板，进行扩大培养，同时选择5个荧光亮度强并且ELISA值高的孔进行亚克隆。最终获得了5株能稳定分泌单克隆抗体的细胞株，分别命名为ALV P27-5D3、ALV P27-4F12、ALV P27-5B10、ALV P27-1C5和ALV P27-3C6。

参照Barton F等(1983)的方法制备单克隆抗体的腹水：主要步骤是挑选雌性或者个体大的雄性BALB/c小鼠，每只腹腔注射灭菌石蜡油0.5mL，10-14天后，将状态良好的杂交瘤细胞从细胞培养瓶内轻轻吹下，1000rpm/min离心10min，弃上清，用无菌PBS悬浮，计数；每只小鼠腹腔注射杂交瘤细胞5x10⁵-1x10⁶个，注射后轻柔小鼠腹部，使细胞均匀分散于小鼠的腹腔中；7-10天后，可见小鼠腹部明显增大，采集腹水；将腹水5000rpm/min离心10min，收集上清，即为单克隆抗体腹水，-20℃保存备用。

2.单克隆抗体的鉴定

2.1单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定

将单克隆抗体ALV P27-5D3、ALV P27-4F12、ALV P27-5B10、ALV P27-1C5和ALVP27-3C6分别用ALV-J GY3（Wu X，2010Vet Res Commun,2010.34(7):p.619-32）感染DF1细胞进行间接免疫荧光检测，同时设SP2/0细胞培养上清液对照。结果显示获得的5株单克隆抗体对ALV-J的感染的细胞都具有特异性荧光，SP2/0细胞上清液没有荧光，为阴性(如图3)。

2.1单克隆抗体识别表位的分析

采用相加指数法测定单克隆抗体的抗原识别表位。即用p27蛋白以3.5μg/mL浓度100μL包被酶标板，封闭、洗涤后分别加入饱和稀释度的单克隆抗体，37℃作用60min，再洗涤后每孔分别两两组合加入另一株单克隆抗体，37℃作用60min，同样洗涤后加入工作浓度的HRP标记山羊抗小鼠二抗（Sigma公司产品），37℃作用60min，最后再洗涤，底物显色测定OD450nm值。按如下公式计算两种单克隆抗体叠加后的AI值:

AI=(A1.2-A1)/A2x100%(A1.2：表示2株单克隆抗体叠加后的OD值；A1：表示第1株单克隆抗体自身叠加的OD值；A2：表示第2株单克隆抗体自身叠加的OD值)。当两两抗体叠加之后的AI值大于30%，判为两株单克隆抗体识别不同位点。

经过相加指数计算，并结合单克隆抗体腹水效价和间接免疫荧光结果，确定识别2个不同表位的单克隆抗体代表株分别为ALV P27-5D3和ALV P27-4F12。

2.2杂交瘤细胞上清及腹水中单克隆抗体效价的测定

杂交瘤细胞培养上清从1:100开始作2倍比稀释，纯化的腹水从1:1000开始作2倍比稀释，按间接ELISA方法测定其效价。细胞培养上清和纯化的腹水的效价测定结果分别见表1、表2。

表1两株单克隆杂交瘤细胞培养上清抗体ELISA效价

表2两株单克隆抗体腹水的效价

2.3免疫印迹(Western blot)试验

SDS-PAGE：诱导表达GST-p27蛋白按照常规方法进行SDS-PAGE和Western blot；单克隆抗体ALVP27-5D3和ALVP27-4F12分别作为一抗，1:10000稀释的羊抗鼠AP-IgG（Sigma公司产品）作为二抗，BCIP/NBT显色。结果显示，2株单克隆抗体均能特异性识别ALVp27 蛋白(在27kDa处出现特异性的目的条带)(图2)，包括ALV-J，ALV-A。

2.4单克隆抗体的间接免疫荧光（IFA）鉴定反应程序

ALV-J感染DF-1细胞，并用丙酮乙醇固定，以单克隆抗体为一抗，以羊抗鼠FITC-IgG（Sigma公司产品）作为二抗，同时以抗ALV-J囊膜蛋白特异性单克隆抗体JE9（Qin，et al，Avian Dis.2001;45(4):938-45）和ICR小鼠血清作阳性、阴性对照，进行IFA。用DAPI进行细胞核染色，于共聚焦荧光显微镜下观察。结果证明筛选出的单克隆抗体均能与ALV感染的DF1细胞发生特异性反应（图3）。

2.5单克隆抗体的亚类鉴定

按PIERCE公司的免疫球蛋白标准亚类快速鉴定试剂盒操作说明书进行。亚类鉴定结果是，上述5株单克隆抗体，仅ALV P27-3C6为IgG_2b亚类/kappa链，其他均为IgG₁亚类/Kappa链。

2.6杂交瘤细胞系分泌单克隆抗体的稳定性检测

在杂交瘤细胞冻存24个月后，从液氮中取出冻存的杂交瘤细胞株复苏，然后进行间接ELISA检测杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的情况。结果表明ALV P27-5D3，ALV P27-4F12等分泌的单克隆抗体上清效价都达到了1:1600，上清的效价与冻存时相同，抗体分泌稳定。对传代50代次后的杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体检测结果也证明了这些细胞株分泌单克隆抗体的性能稳定。

二、双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立

1．ALVp27蛋白单克隆抗体

抗ALVp27蛋白单克隆抗体ALVP27-5D3、ALVP27-4F12由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，包被在酶标板的抗ALVp27蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株（细胞保藏号：CGMCC No.7106）ALV P27-5D3分泌获得，酶标记ALV p27蛋白单克隆抗体为杂交瘤细胞株（细胞保藏号：CGMCC No.7107）ALV P27-4F12分泌获得。

2.双抗体夹心ELISA抗原检测方法建立过程

2.1单克隆抗体腹水的制备与纯化

按上述方法制备ALV P27-5D3和ALV P27-4F12的单克隆抗体腹水。利用GE公司的Protein G预装柱进行单克隆抗体IgG纯化。纯化后利用SDS-PAGE鉴定，结果获得了纯度很好的单克隆抗体，如图4所示。

2.2酶标单克隆抗体的制备

利用加强型活化过氧化物酶及标记试剂盒对单克隆抗体ALV P27-5D3和ALV P27-4F12进行HRP酶标记。ALV P27-5D3、ALV P27-4F12两株单克隆抗体经过酶标记后，记为5D3^E、4F12^E，利用双抗体夹心ELISA方法进行活性的鉴定。结果，它们的效价分别达到1：10⁴和1：1.5×10⁴。

2.3双抗体夹心配对抗体的选择

将ALV P27-5D3和ALV P27-4F12单克隆抗体提纯的IgG作为捕获抗体，5D3^E和4F12^E作为检测抗体，进行夹心配对性实验，以OD450nm值最高的配对为最佳的抗体组合，比较结果如表3，结果发现，ALVP27-5D3作为捕获抗体，4F12^E作为检测抗体效果最好。

表3夹心配对抗体的选择

2.4单克隆抗体包被浓度及酶标单克隆抗体(4F12^E)工作浓度的确定

采用方阵滴定法来测定：用包被液将ALV P27-5D3株单克隆抗体IgG梯度稀释，5.5μg/mL到1.5μg/mL中取五个浓度；用PBST将酶标单克隆抗体4F12E进行稀释，1μg/mL到0.0625μg/mL中取五个浓度。选定P/N最大且阳性OD450nm值2.0左右的孔，其所对应的捕获抗体包被浓度和酶标检测抗体的浓度为最佳条件，最终确定单克隆抗体包被浓度为3.5μg/mL，酶标抗体的作用浓度为0.5μg/mL。

2.5抗原作用时间的确定

用已知的阴阳性对照进行ELISA抗原检测，按已经确定的程序反应，抗原在37℃分别反应30min、60min、90min、120min，在其它条件和反应程序相同的情况下，进行ELISA抗原检测，取P/N最大的一组且阳性值在2.0左右的作用时间确定为最佳反应时间。结果确定抗原最佳作用时间为37℃90min。

2.6酶标单克隆抗体4F12E作用时间的确定

按已确定好的反应条件，用已知的阴阳性对照进行ELISA抗原检测，酶标单克隆抗体的反应时间分别为30min，45min，60min，90min。确定P/N最大时，结果确定酶标单克隆抗体的最佳工作时间为60min。

2.7阴阳性临界值的确定

选择30份ALV阴性鸡棉拭，按照已确定的最佳的反应条件进行ELISA抗原检测，测定各孔OD450nm值，根据公式：阴阳性临界值=阴性样本OD450nm平均值+3x标准差(SD)。结果，OD₄₅₀的平均值为0.056，方差为0.0525，当OD₄₅₀≥0.2135时判为阳性，OD₄₅₀≤0.2135判为阴性，0.2135＞OD₄₅₀＞0.105判为可疑。

2.8特异性反应

分别在相同条件下，用马立克氏病毒(MDV)，新城疫病毒(NDV)，小鹅瘟病毒(GPV)，鸡传染性贫血病病毒（CAV），H9型禽流感病毒(AIV H9)样本（江苏省动物预防医学重点实验室保存）进行交叉反应试验。结果表明，该方法具有很好的特异性，与其它引起禽类疾病的病毒间不存在交叉反应(见表4)。

表4：双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒的特异性

2.9双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒的敏感性

将ALV-J（GY3）株抗原阳性样本(1000TCID₅₀/mL)进行2倍比稀释，分别用本发明ELISA抗原检测试剂盒和进口ALV ELISA抗原检测试剂盒检测。结果证明，该试剂盒可检测的最低量达到约1个TCID₅₀（表5）。

表5双抗体夹心ELISA检测试剂盒的敏感性

3.10双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒临床样品检测结果

用本发明的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，对江苏、安徽送检的663份临床样本进行检测，同时与进口ELISA抗原检测试剂盒进行比较。结果表明，本双抗体夹心ELISA抗原试剂盒与进口试剂盒的特异性为100%，符合率达到95%以上。

3.11双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒的构建和检测过程

包被酶标板：将ALV P27-5D3株单克隆抗体的IgG用包被液稀释为3.5μg/mL,100μL/孔，4℃放置12-16h；

封闭：取出包被酶标板，用PBST洗涤4次，3min/次；用5%脱脂乳封闭，350μL/孔，37℃放置2h，封闭后洗涤同上；

加样：取样品加入上述封闭好的酶标板，100μL/孔：阴阳性对照不稀释，37℃反应90min，洗涤同上；

不同检测样品的前处理：

泄殖腔拭子：将泄殖腔拭子加到1ml稀释液中，反复冻融两次，检测前，将样品恢复至室温（18-25℃），让杂质沉淀下来。

蛋清：收集蛋清，用PBST等体积稀释，涡旋混匀；

分离病毒的DF-1细胞上清：不用处理，直接取样；

加酶标单杭：将4F12^E稀释到0.5μg/ml，100μL/孔，37℃反应60min，洗涤同上；

显色：加入新鲜配制的TMB底物溶液，100μL/孔，37℃反应15-20min；

终止：显色后，每孔加入50μL2mo1/mL H₂S0₄终止；

读板：酶标仪上测定各孔OD450nm，进行结果判定。

实施例2试剂盒的构成

本例中的试剂盒的组成如下：

酶标板：包被ALV P27-5D3株分泌产生的单克隆抗体

酶标抗体：辣根过氧化物酶标记ALV P27-4F12分泌产生的单克隆抗体4F12^E

底物液配制：100mmol/L的柠檬酸溶液(21g柠檬酸（C₆H₈O₇·H2O）溶于去离子水，定容至1L)24.3mL，200mmol/LNa₂HP0₄.12H₂0(71.6g Na₂HP0₄.12H₂0溶于去离子水，定容至1L)25.7mL混匀，加入50mg的四甲基联苯胺(TMB)，临用前加入50μL的30%H₂0₂;

终止液(2mol/LH₂S0₄)：分别取蒸馏水177.8mL和浓硫酸22.2mL混和即可。

洗涤液：1000mL10mmo1/L pH7.4的PBS中加入0.5mL Tween-20；

阴性对照和阳性对照。

Claims

1.禽白血病双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，其包括:

(1) 包被抗ALV p27蛋白单克隆抗体的酶标板;

(2) 酶标记抗ALV p27蛋白单克隆抗体;

其中，包被在酶标板的抗ALV p27蛋白单克隆抗体与酶标记抗ALV p27蛋白单克隆抗体分别针对ALV p27蛋白不同的抗原决定簇；包被在酶标板的抗ALV p27蛋白单克隆抗体为保藏号CGMCC No.7106的杂交瘤细胞株ALV P27-5D3分泌获得，酶标记抗ALV p27蛋白单克隆抗体为保藏号CGMCC No.7107的杂交瘤细胞株ALV P27-4F12分泌获得。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记ALV p27蛋白单克隆抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。