CN107365787B - 具有免疫抑制作用禽白血病病毒衣壳蛋白真核表达载体的构建方法及应用 - Google Patents
具有免疫抑制作用禽白血病病毒衣壳蛋白真核表达载体的构建方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107365787B CN107365787B CN201710763557.4A CN201710763557A CN107365787B CN 107365787 B CN107365787 B CN 107365787B CN 201710763557 A CN201710763557 A CN 201710763557A CN 107365787 B CN107365787 B CN 107365787B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- expression vector
- cells
- eukaryotic expression
- lps
- poly
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000713826 Avian leukosis virus Species 0.000 title claims abstract description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 title claims abstract description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 title abstract description 10
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 title abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 title description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 22
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 15
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 14
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 4
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 abstract description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 abstract description 2
- 208000004668 avian leukosis Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 241000714230 Avian leukemia virus Species 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 230000006870 function Effects 0.000 description 11
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 6
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101800001218 Capsid protein p27 Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 3
- 244000144992 flock Species 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 108010062490 p27 antigen Proteins 0.000 description 2
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 102200139497 rs2274268 Human genes 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 6,7-dimethyl-3-[[methyl-[2-[methyl-[[1-[3-(trifluoromethyl)phenyl]indol-3-yl]methyl]amino]ethyl]amino]methyl]chromen-4-one;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=1OC2=CC(C)=C(C)C=C2C(=O)C=1CN(C)CCN(C)CC(C1=CC=CC=C11)=CN1C1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 GOZMBJCYMQQACI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004035 construction material Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098622 gag gene Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 101150115162 p27 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
具有免疫抑制作用禽白血病病毒衣壳蛋白真核表达载体的构建方法及应用，涉及病毒编码蛋白表达及功能研究生物技术领域。本发明以pGEX‑6p‑1‑p27/BL21质粒作为模板，采用特异性引物进行PCR扩增，回收PCR片段后与pcDNA3.1载体链接，得到阳性的重组质粒，即具有抑制细胞对LPS和Poly(I:C)刺激免疫反应功能的真核表达载体。本发明构建方法简单、合理，真核表达载体转染细胞表达后，可应用于抑制LPS或Poly(I:C)刺激细胞免疫反应中，为抗禽白血病免疫抑制药物的研究与开发提供靶点。
Description
技术领域
本发明涉及病毒编码蛋白表达及功能研究生物技术领域。
背景技术
禽白血病（Avianleukosis，AL）是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的家禽重要肿瘤性疾病之一。病毒感染除了引起鸡群的直接损害外，还造成严重的免疫抑制，生产力下降，混合感染，继发感染等，造成巨大的经济损失，严重危害养禽业的发展。
禽白血病病毒（ALV）结构基因的序列，即从RNA分子5子端到3到端为gag/pro-pol-env，这些基因分别编码病毒群特异性抗原蛋白、蛋白酶、RNA依赖性DNA聚合酶(反转录酶或RT)和囊膜糖蛋白。结构基因的两侧的末端基因序列具有启动子和增强子活性，在DNA前病毒中形成长末端重复（LTR）区。
gag基因编码病毒内部非糖基化结构蛋白，包括基质蛋白、蛋白酶、衣壳和核衣壳，主要有27kDa、19kDa、15kDa和12kDa四种蛋白质，它们分别称作为P27、P19、P15和P12，其中P19是一种磷蛋白。这些蛋白是群特异性抗原，病毒核衣壳前体蛋白分子量为76kDa。P12是一种强RNA结合蛋白，因此可以紧密包围RNA基因组。在ALV亚群间，这些病毒蛋白十分保守，具有高度的同源性，不同亚群间的同源性达96%以上，即所谓的群特异性抗原（GSA）。由于GSA抗原为各亚群所共有，因此常常用ELISA检测其中的p27抗原作为鸡群是否感染ALV的重要依据。
禽白血病病毒p27基因是禽白血病病毒不同亚群之间的一段高度保守的基因。p27蛋白是病毒的核心蛋白，其含量高，占病毒总蛋白成分的30%以上，有许多易于检测的病毒抗原位点，是ALV的群特异性抗原团。常常用ELISA检测其中的p27抗原作为鸡群是否感染ALV的重要依据。根据以往报道的文献，病毒编码蛋白在病毒与宿主相互作用中发挥重要作用。2010年PANG等发现ALV p27蛋白在小鼠的巨噬细胞中抑制LPS刺激TNF-α的合成。高雁妮等发现ALV p27在鸡脾脏细胞中通过上调IL-6诱导VEGF的表达。除此之外，关于ALV p27的生物学功能研究鲜有报道。
总体而言，国内外关于禽白血病病毒p27蛋白生物学功能的研究鲜有报道，对于p27蛋白具有免疫抑制功能更是未见报道。
发明内容
针对以上研究现状，本发明提出具有抑制细胞对LPS和Poly(I:C)刺激的免疫反应功能的真核表达载体的构建方法。
本发明构建方法是：以pGEX-6p-1-p27/BL21质粒作为模板，采用以下特异性引物进行PCR扩增：
F：GCGGATCCATG ccatccgagtcctttgtt；
R：GCCTCGAGCTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCggccgcggctatgccttg；
回收PCR片段后与pcDNA3.1载体链接，得到阳性的重组质粒，即具有抑制细胞对LPS和Poly(I:C)刺激免疫反应功能的真核表达载体。
另外，本发明所述PCR扩增条件为：95℃预变性5min，然后94℃ 1min，52℃ 30 s，72℃1min，35个循环，72℃、7min，4℃循环。
通过研究，本发明首先发现了禽白血病病毒p27蛋白具有抑制细胞对LPS和Poly(I:C)刺激的免疫反应的功能。在体外细胞中证实p27蛋白的免疫抑制功能，并且通过分段表达的p27蛋白确定发挥免疫抑制作用的核苷酸区域在481-720bp之间，氨基酸在160-240aa之间。
本发明以上pGEX-6p-1-p27/BL21质粒（公布于专利申请号201310046928.9）作为模板，本发明以上构建方法简单、合理，方便操作，为抗禽白血病免疫抑制药物的研究与开发提供靶点。
构建的具有抑制细胞对LPS和Poly(I:C)刺激的免疫反应功能的真核表达载体转染细胞表达后，在抑制LPS刺激细胞免疫反应中的应用。
构建的具有抑制细胞对LPS和Poly(I:C)刺激的免疫反应功能的真核表达载体转染细胞表达后，在抑制Poly(I:C)刺激细胞免疫反应中的应用。
以上两种应用的意义主要在于确定了禽白血病病毒p27蛋白具有免疫抑制功能，并且为禽白血病病毒p27蛋白生物学功能研究以及抗禽白血病免疫抑制药物的研究提供靶点。
附图说明
图1为禽白血病病毒p27蛋白分段表达模式图。
图2为各质粒DNA抑制LPS刺激细胞IL-1β表达对比图。
图3为各质粒DNA抑制Poly(I:C)刺激细胞IFN-β表达对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
1. 真核表达载体的构建及鉴定：
将pGEX-6p-1-p27/BL21质粒用BamH I和Xho I 进行双酶切，胶回收后连接到pcDNA3.1(+)空载体。将酶切鉴定正确的阳性克隆质粒送往上海英骏生物技术有限公司进行测序，表明，经过以上双酶切，取得了长度了720bp的目标基因片段。
以上构建用材料pGEX-6p-1-p27/BL21质粒的构建方法已公布于申请号为201310046928.9的中国专利申请文献中。
设计带有flag标签的p27分段表达的引物1～480(p27A段)，241～720(p27B段)，481～720(p27C段)见图1。
PCR扩增引物序列如下（下划线分别为Ecor I和Xho I酶切位点）：
p27A：F：gcggatccatgcctgtagtgattaag；
R：gcctcgagcttatcgtcgtcatccttgtaatctccctgcgtaatgtccgc。
p27B：F：gcggatccatggttatagcggcagccact；
R：gcctcgagcttatcgtcgtcatccttgtaatcggccgcggctatgccttg。
p27C：F：gcggatccatgccatccgagtcctttgtt；
R：gcctcgagcttatcgtcgtcatccttgtaatcggccgcggctatgccttg。
利用设计的每对引物分别以pGEX-6p-1-p27/BL21质粒为模板进行PCR扩增。PCR程序是：95℃预变性5min，然后94℃ 1min，52℃ 30 s，72℃1min，35个循环，72℃ 7min，4℃循环。
PCR产物片段转酶切回收后分别与pcDNA3.1载体链接，经双酶切鉴定为阳性的重组质粒送往上海英骏生物技术有限公司进行测序鉴定。
2.鉴定结果：
经上海英骏生物技术有限公司测序鉴定，通过以上引物1～480(p27A段)，241～720(p27B段)，481～720(p27C段)分别取得三个基因片段的核苷酸DNA序列分别为：
p27A段，长度为480bp：
atgcctgtag tgattaagac agagggaccc gcctggaccc ctctggagcc aaaattgatc 60
acaagactgg ctgatacagt caggaccaag ggcttacgat ccccaattac tatggcggag 120
gtggaagcgc ttatgtcctc cccgctgctg ccgcatgacg ttacgaatct aatgagagtt 180
attttaggac ctgccccata tgctttgtgg atggacgctt ggggtgtcca actacagacg 240
gttatagcgg cagccactcg cgacccccga cacccagcga acggtcaagg gcggggggaa 300
cggactaatt tggatcgctt aaagggttta gctgatggga tggtgggcaa cccgcagggt 360
caggccgcat tattaagacc gggggaattg gttgctatta cggcgtcggc tctccaggca 420
tttagagagg tcgcccggct ggcggaacct gctggtccat gggcggacat tacgcaggga 480。
p27B段，长度为480 bp：
gttatagcgg cagccactcg cgacccccga cacccagcga acggtcaagg gcggggggaa 60
cggactaatt tggatcgctt aaagggttta gctgatggga tggtgggcaa cccgcagggt 120
caggccgcat tattaagacc gggggaattg gttgctatta cggcgtcggc tctccaggca 180
tttagagagg tcgcccggct ggcggaacct gctggtccat gggcggacat tacgcaggga 240
ccatccgagt cctttgttga ttttgccaat aggcttataa aggcggttga ggggtcagat 300
ctcccgcctt ccgcgcgagc tccggtgatc attgactgct ttaggcagaa gtcacagcca 360
gatatccagc agcttatacg ggcagcaccc tccacgttga ccaccccagg agagataatc 420
aaatatgtgc tagacaggca gaagaccgcc cctcttacgg atcaaggcat agccgcggcc 480。
p27C段，长度为240bp：
ccatccgagt cctttgttga ttttgccaat aggcttataa aggcggttga ggggtcagat 60
ctcccgcctt ccgcgcgagc tccggtgatc attgactgct ttaggcagaa gtcacagcca 120
gatatccagc agcttatacg ggcagcaccc tccacgttga ccaccccagg agagataatc 180
aaatatgtgc tagacaggca gaagaccgcc cctcttacgg atcaaggcat agccgcggcc240。
3. pcDNA3.1-p27全长及分段表达载体的暂态表达：
转染前12小时将单层293T细胞接种于35mm细胞培养皿中，细胞生长密度约为80%～90%。将pcDNA3.1-p27质粒及分段表达A、B、C阳性的重组质粒分别转染细胞。
以上pcDNA3.1-p27质粒的构建：将pGEX-6p-1-p27/BL21质粒和pcDNA3.1(+)空载体经BamHⅠ和Xho I双酶切，回收p27片段和pcDNA3.1(+)载体进行连接，构建重组表达质粒pcDNA3.1-p27，并测序鉴定。
转染细胞具体步骤如下：在2 ml离心管中加入250ul的Opti-MEM和10 ulLipofectamine-2000，然后加入4ug的pcDNA3.1-p27质粒，充分混匀，室温放置30 min。用Opti-MEM清洗细胞后，加入以上混合物，37℃孵育6h，吸出混合物，以1%生长液替换，37℃孵育45h后收集细胞。转染同时另设空载体转染对照和空白对照。
4. ALV-p27表达抑制细胞对LPS和Poly(I:C)刺激的免疫反应：
DF-1细胞转染，步骤如下：单层DF-1细胞12-16小时前接种于6孔细胞板，备用。
在2 ml离心管中加入250ul的Opti-MEM和10 ul Lipofectamine-2000，然后加入4ug质粒，充分混匀，室温放置30 min。用Opti-MEM清洗单层DF-1细胞后，加入以上混合物，37℃孵育6h，吸出混合物，以1%细胞维持液替换，37℃孵育24h后利用100ng/mL的LPS或者5μg/mL的Poly(I:C)刺激。转染同时另设空载体转染对照和空白对照。
以上加入的质粒分别指PC质粒：空载体转染对照； P27质粒：禽白血病病毒衣壳蛋白P27全长质粒； P27A质粒：禽白血病病毒衣壳蛋白P27A片段质粒； P27B质粒：禽白血病病毒衣壳蛋白P27B片段质粒； P27C质粒：禽白血病病毒衣壳蛋白P27C片段质粒。
在DF-1细胞转染24小时后，用浓度为100ng/mL的LPS或者5μg/mL的Poly(I:C)刺激，刺激24小时裂解细胞，提取RNA，反转录为cDNA模板，利用Real-time PCR检测LPS或者Poly(I:C)引起的免疫相关细胞因子的变化情况。
所有Real-time PCR 实验数据均使用Graph Pad Prism 5.0数据统计软件进行分析，多样本均数比较使用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05为有显著性差异，用星号*表示。
图2为各质粒DNA抑制LPS刺激细胞IL-1β表达对比图；图3为各质粒DNA抑制Poly(I:C)刺激细胞IFN-β表达对比图。
图2、3中，PC代表：空载体转染对照； P27代表：禽白血病病毒衣壳蛋白P27全长质粒转染； P27A代表：禽白血病病毒衣壳蛋白P27A片段质粒转染； P27B代表：禽白血病病毒衣壳蛋白P27B片段质粒转染； P27C代表：禽白血病病毒衣壳蛋白P27C片段质粒转染。
由图2、3可见：转染表达pcDNA3.1-p27全长以及B、C片段能够明显抑制LPS刺激细胞中的IL-1β的表达（图2）。同样pcDNA3.1-p27全长以及B、C片段也能够抑制Poly(I:C)刺激细胞中的IFN-β的表达（图3）。实验结果说明，禽白血病病毒衣壳蛋白p27具有免疫抑制的功能，分段表达的p27-B和C片段证实了P27蛋白的确具有免疫抑制功能，发挥这一免疫抑制能力的序列位于p27碳端C段481-720核苷酸。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 具有免疫抑制作用禽白血病病毒衣壳蛋白真核表达载体的构建方法及应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 反转录病毒(Retroviridae)
<220>
<221> gene
<222> (（2）)..(.（7）)
<223> 带有flag标签的p27分段表达的引物
<400> 1
gcggatccat gcctgtagtg attaag 26
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 反转录病毒(Retroviridae)
<220>
<221> gene
<223> 带有flag标签的p27分段表达的引物
<400> 2
gcctcgagct tatcgtcgtc atccttgtaa tctccctgcg taatgtccgc 50
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 反转录病毒(Retroviridae)
<220>
<221> gene
<223> 带有flag标签的p27分段表达的引物
<400> 3
gcggatccat ggttatagcg gcagccact 29
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 反转录病毒(Retroviridae)
<220>
<221> gene
<223> 带有flag标签的p27分段表达的引物
<400> 4
gcctcgagct tatcgtcgtc atccttgtaa tcggccgcgg ctatgccttg 50
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 反转录病毒(Retroviridae)
<220>
<221> gene
<223> 带有flag标签的p27分段表达的引物
<400> 5
gcggatccat gccatccgag tcctttgtt 29
<210> 6
<211> 50
<212> DNA
<213> 反转录病毒(Retroviridae)
<220>
<221> gene
<223> 带有flag标签的p27分段表达的引物
<400> 6
gcctcgagct tatcgtcgtc atccttgtaa tcggccgcgg ctatgccttg 50
<210> 7
<211> 480
<212> DNA
<213> pGEX-6p-1-p27/BL21
<220>
<221> gene
<223> 采用引物p27A酶切pGEX-6p-1-p27/BL21取得的基因片段
<400> 7
atgcctgtag tgattaagac agagggaccc gcctggaccc ctctggagcc aaaattgatc 60
acaagactgg ctgatacagt caggaccaag ggcttacgat ccccaattac tatggcggag 120
gtggaagcgc ttatgtcctc cccgctgctg ccgcatgacg ttacgaatct aatgagagtt 180
attttaggac ctgccccata tgctttgtgg atggacgctt ggggtgtcca actacagacg 240
gttatagcgg cagccactcg cgacccccga cacccagcga acggtcaagg gcggggggaa 300
cggactaatt tggatcgctt aaagggttta gctgatggga tggtgggcaa cccgcagggt 360
caggccgcat tattaagacc gggggaattg gttgctatta cggcgtcggc tctccaggca 420
tttagagagg tcgcccggct ggcggaacct gctggtccat gggcggacat tacgcaggga 480
<210> 8
<211> 480
<212> DNA
<213> pGEX-6p-1-p27/BL21
<220>
<221> gene
<223> 采用引物p27B酶切pGEX-6p-1-p27/BL21取得的基因片段
<400> 8
gttatagcgg cagccactcg cgacccccga cacccagcga acggtcaagg gcggggggaa 60
cggactaatt tggatcgctt aaagggttta gctgatggga tggtgggcaa cccgcagggt 120
caggccgcat tattaagacc gggggaattg gttgctatta cggcgtcggc tctccaggca 180
tttagagagg tcgcccggct ggcggaacct gctggtccat gggcggacat tacgcaggga 240
ccatccgagt cctttgttga ttttgccaat aggcttataa aggcggttga ggggtcagat 300
ctcccgcctt ccgcgcgagc tccggtgatc attgactgct ttaggcagaa gtcacagcca 360
gatatccagc agcttatacg ggcagcaccc tccacgttga ccaccccagg agagataatc 420
aaatatgtgc tagacaggca gaagaccgcc cctcttacgg atcaaggcat agccgcggcc 480
<210> 9
<211> 240
<212> DNA
<213> pGEX-6p-1-p27/BL21
<220>
<221> gene
<223> 采用引物p27C酶切pGEX-6p-1-p27/BL21取得的基因片段
<400> 9
ccatccgagt cctttgttga ttttgccaat aggcttataa aggcggttga ggggtcagat 60
ctcccgcctt ccgcgcgagc tccggtgatc attgactgct ttaggcagaa gtcacagcca 120
gatatccagc agcttatacg ggcagcaccc tccacgttga ccaccccagg agagataatc 180
aaatatgtgc tagacaggca gaagaccgcc cctcttacgg atcaaggcat agccgcggcc 240
Claims (3)
1. 具有抑制细胞对 LPS 和 Poly(I:C)刺激免疫反应功能的禽白血病病毒衣壳蛋白真核表达载 体的构建方法，其特征在于：以 pGEX-6p-1-p27/BL21 质粒作为模板，所述质粒公布于专利申请号201310046928.9，利用以下特异性引物 进行 PCR 扩增：
F：gcggatccat gccatccgag tcctttgtt ；
R：gcctcgagct tatcgtcgtc atccttgtaa tcggccgcgg ctatgccttg ；
回收双酶切 PCR 片段后与 pcDNA3.1 载体链接，得到具有抑制细胞对 LPS 和 Poly(I:C)刺激免 疫反应功能的真核表达载体；所述 PCR 条件为：95℃预变性 5min，然后 94℃ 1min，52℃ 30 s，72℃1min，35 个循环， 72℃、7min，4℃保持。
2. 如权利要求 1 所述的方法构建的具有抑制细胞对 LPS 和 Poly(I:C)刺激的免疫反应功能的 真核表达载体转染细胞表达后，在抑制 LPS 刺激细胞免疫反应中的应用。
3. 如权利要求 1 所述的方法构建的具有抑制细胞对 LPS 和 Poly(I:C)刺激的免疫反应功能的 真核表达载体转染细胞表达后，在抑制 Poly(I:C)刺激细胞免疫反应中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710763557.4A CN107365787B (zh) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | 具有免疫抑制作用禽白血病病毒衣壳蛋白真核表达载体的构建方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710763557.4A CN107365787B (zh) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | 具有免疫抑制作用禽白血病病毒衣壳蛋白真核表达载体的构建方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107365787A CN107365787A (zh) | 2017-11-21 |
| CN107365787B true CN107365787B (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=60312177
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710763557.4A Active CN107365787B (zh) | 2017-08-30 | 2017-08-30 | 具有免疫抑制作用禽白血病病毒衣壳蛋白真核表达载体的构建方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107365787B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109957575A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-07-02 | 扬州大学 | 一种山羊痘病毒p32可溶性蛋白的制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103163299A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-06-19 | 扬州大学 | 禽白血病双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 |
-
2017
- 2017-08-30 CN CN201710763557.4A patent/CN107365787B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103163299A (zh) * | 2013-02-05 | 2013-06-19 | 扬州大学 | 禽白血病双抗体夹心elisa抗原检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 胡海.禽白血病病毒衣壳蛋白p27生物学功能的初步研究.硕士电子期刊.2017,(第2期),第1.4节和第3节. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN107365787A (zh) | 2017-11-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Andersson et al. | A defined subgenomic fragment of in vitro synthesized Moloney sarcoma virus DNA can induce cell transformation upon transfection | |
| Laughrea et al. | Mutations in the kissing-loop hairpin of human immunodeficiency virus type 1 reduce viral infectivity as well as genomic RNA packaging and dimerization | |
| Accola et al. | A putative α-helical structure which overlaps the capsid-p2 boundary in the human immunodeficiency virus type 1 Gag precursor is crucial for viral particle assembly | |
| Ma et al. | Rous sarcoma virus Gag protein-oligonucleotide interaction suggests a critical role for protein dimer formation in assembly | |
| EP2126137B1 (en) | Method for designing a drug regime for hiv-infected patients | |
| JP2016539629A (ja) | レトロウイルスベクター | |
| US20210222178A1 (en) | MICROBIAL SYSTEM FOR PRODUCTION AND DELIVERY OF EUKARYOTE-TRANSLATABLE mRNA TO EUKARYA | |
| JP7105875B2 (ja) | レトロウイルスベクター | |
| Erlwein et al. | Sequences in pol are required for transfer of human foamy virus-based vectors | |
| Wang et al. | RNA incorporation is critical for retroviral particle integrity after cell membrane assembly of Gag complexes | |
| CN111744000B (zh) | 免疫抑制功能降低的口蹄疫重组病毒及其制备方法与应用 | |
| CN111218477B (zh) | 靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体及其应用 | |
| CN106755089B (zh) | 表达山羊淋巴细胞活化分子的细胞系及其构建方法与应用 | |
| Hill et al. | Proline residues within spacer peptide p1 are important for human immunodeficiency virus type 1 infectivity, protein processing, and genomic RNA dimer stability | |
| CN107365787B (zh) | 具有免疫抑制作用禽白血病病毒衣壳蛋白真核表达载体的构建方法及应用 | |
| CN110468155B (zh) | 一种用于拯救猪肠道甲型冠状病毒的系统、方法及应用 | |
| MXPA97002524A (en) | Attenuated viruses and method to prepare | |
| CN116284351A (zh) | 一种人工抗体的制备方法 | |
| CA2201487A1 (en) | Attenuated viruses and method of making the same | |
| Ohsugi et al. | Construction of a full-length human T cell leukemia virus type I genome from MT-2 cells containing multiple defective proviruses using overlapping polymerase chain reaction | |
| CN116218844B (zh) | 一种双向启动子及其过表达载体、慢病毒表达质粒和应用 | |
| CN116554349A (zh) | 嵌合病毒包膜糖蛋白及包含其的载体 | |
| CN113549634B (zh) | 编码可溶性hpv58 l1蛋白的基因及其重组质粒的构建与应用 | |
| Kang | Interference induced by defective interfering particles | |
| Olsthoorn et al. | Similarities and differences between the subgenomic and minus-strand promoters of an RNA plant virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |