CN111218477B - 靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体及其应用，载体包括禽4型腺病毒的基因组序列、pBR322的复制起点核酸序列和卡那霉素抗性核酸序列；所述基因组序列中的fiber核酸序列经过人工改造，包括：在fiber基因Knob区中插入RGD4C短肽核酸序列，和/或，将fiber基因Knob区替换为人35型腺病毒fiber Knob的核酸序列。本发明改造后的禽4型腺病毒载体能够提高对哺乳动物细胞的感染效率，可以用于制备哺乳动物的重组疫苗或基因治疗试剂盒。

Description

靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体及其应用
技术领域
本发明属于基因治疗和重组疫苗领域，具体而言，本发明涉及靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体及其应用。
背景技术
腺病毒载体具有以下特点：外源基因载量大，表达效率高；感染细胞类型多，既可以感染分裂期细胞也可以感染非分裂期细胞；容易制备、扩增和纯化；无包膜病毒，理化性质稳定，活力高，保存周期长；感染细胞后，在染色体外以附加体的形式存在，不整合到宿主细胞染色体，安全性好。因此，腺病毒载体在基因治疗和重组疫苗领域已经得到广泛应用。
腺病毒科包括哺乳动物腺病毒属、鸟类腺病毒属等共5个属，目前常用的腺病毒载体多是基于人或猴腺病毒构建的。人或猴的腺病毒载体在人类应用时面临的主要困难是：人群的腺病毒中和抗体水平较高，使得外源目的基因的表达水平降低、表达时间缩短；在首次应用后产生的中和抗体又限制了腺病毒载体的重复使用。禽腺病毒载体可以弥补哺乳动物腺病毒载体的这类不足。
禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdV)是鸟腺病毒属的一个亚类。禽腺病毒的双链线性DNA基因组长度为43-46kb，较哺乳动物腺病毒长7-10kb。禽腺病毒的基因组中，位于基因组中部的是共有基因，表达产物主要是病毒结构蛋白、病毒基因组复制酶或者参与病毒颗粒的组装，在整个腺病毒科中保守；属特异基因位于基因组的两侧，其表达产物主要参与病毒与宿主的相互作用，为病毒复制营造适宜的细胞内环境。FAdV的属特异基因与哺乳动物腺病毒没有同源性，这使得FAdV无法在哺乳动物细胞复制。FAdV的上述特性使得FAdV载体在某些方面可以弥补哺乳动物腺病毒载体的缺陷。同时，FAdV基因组大，有装载更大外源基因的潜力；其与哺乳动物腺病毒亲缘关系远，不能在哺乳动物细胞复制，安全性更高；作为哺乳动物基因转移载体时，FAdV自身基因的表达水平会更低，这将有利于延长目的基因的表达时间。另外，FAdV物理性质更稳定，可以用鸡胚扩增，因而载体的制备成本可能更低。
FAdV载体用于哺乳动物的困难主要在于FAdV对哺乳动物细胞的基因转移效率低。腺病毒感染细胞起始于衣壳蛋白的fiber的Knob结构域与细胞表面的病毒受体结合，从而启动内吞过程。不同腺病毒的fiber不同，因而细胞结合受体不同。感染效率低的原因一般是由于靶细胞缺少fiber的对应受体。
目前缺少能够应用于哺乳动物的高效FAdV载体，鉴于FAdV载体能够互补现有哺乳动物腺病毒应用的某些缺陷，因此，本领域对靶向哺乳动物细胞的禽腺病毒载体存在需求。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体及其应用。本发明改造后的禽4型腺病毒载体能够提高对哺乳动物细胞的感染效率，可以用于制备哺乳动物的重组疫苗或基因治疗试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供一种靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体，载体包括禽4型腺病毒的基因组序列、pBR322的复制起点核酸序列和卡那霉素抗性核酸序列；所述基因组序列中的fiber核酸序列经过人工改造，包括：在fiber基因Knob区中插入RGD4C短肽核酸序列，和/或，将fiber基因Knob区替换为人35型腺病毒fiber Knob的核酸序列。
本发明中，由禽4型腺病毒(FAdV-4)的完整基因组序列出发，载体中除了插入复制起点、抗性片段、报告基因(如GFP基因)等外，还对fiber基因核酸序列进行了改造，发现可以提高载体对哺乳动物细胞，如人类细胞的感染效率。
RGD基序，也就是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序(RGD motif)存在于众多粘附分子中，通过RGD基序与细胞受体整合素(Integrin)的识别和结合是粘附分子与细胞相互作用的重要方式之一，RGD基序也被多种病毒使用作为病毒结合宿主细胞的重要工具。多种含RGD基序的短肽在生物医学中得到广泛应用，RGD4C是含有CDCRGDCFC核心的环状短肽，结构稳定，与整合素的结合力更强，可以用作药物或基因转移载体的靶向分子。本发明中，对腺病毒的靶向性改造除了使用靶向短肽外，还采用了替换改造腺病毒fiber Knob结构域的方法。改造腺病毒fiber，使得腺病毒能够识别结合新的受体分子，是改变腺病毒靶向性、提高其对靶细胞基因转移效率的有效途径。
本发明中，所述RGD4C短肽氨基酸序列为CDCRGDCFC，所述RGD4C短肽核苷酸序列可以为：tgt gac tgc agc gga gac tgt ttc tgc。
进一步的方案，所述fiber基因包括fiber1和fiber2，人工改造的方式包括但不限于以下几种:
(1)，在fiber1和/或fiber2基因Knob区中插入RGD4C短肽核酸序列；
(2)，将fiber1和/或fiber2基因Knob区替换为人35型腺病毒fiber Knob的核酸序列；
(3)，在fiber1/fiber2基因Knob区中插入RGD4C短肽核酸序列，同时将fiber2/fiber1基因Knob区替换为人35型腺病毒fiber Knob的核酸序列。
其中，fiber1基因的核苷酸序列如Seq.NO 1所示，氨基酸序列如Seq.NO 2所示；fiber2基因的核苷酸序列如Seq.NO 3所示，氨基酸序列如Seq.NO 4所示。
进一步的方案，所述fiber核酸序列经过人工改造的方式包括：在fiber1基因Knob区的CD环、或DE环、或HI环、或IJ环中插入RGD4C短肽核酸序列。
优选的，改造后fiber1基因编码的蛋白的268Aa-269Aa，或298Aa-299Aa，或376Aa-377Aa，或402Aa-403Aa部位插入了RGD4C短肽氨基酸序列。
进一步的方案，在fiber2基因Knob区的CD环中插入RGD4C短肽核酸序列；
优选的，改造后Fiber2基因编码的蛋白的341Aa-342Aa部位插入了RGD4C短肽氨基酸序列。
进一步的方案，所述fiber核酸序列经过人工改造的方式包括：
在fiber1基因的IJ环中插入RGD4C短肽的编码序列，且将fiber2基因Knob区替换为人35型腺病毒fiber knob区的核酸序列。
进一步的方案，改造后fiber1基因编码的蛋白的402Aa-403Aa部位插入了RGD4C短肽氨基酸序列，同时，fiber2基因编码蛋白的283Aa-479Aa替换为如Seq.NO 6所示的人35型腺病毒Knob区氨基酸序列。
具体的，发明人利用前期构建的pKFAV4-GFP质粒(含有Orf1，Orf1b和Orf2缺失的FAdV-4基因组，Genbank accession number：MG547384；并在Orf1，Orf1b和Orf2缺失部位添加有巨细胞病毒启动子CMVp和SV40 polyA信号序列控制的GFP表达框)通过改造fiber1基因构建了下述多种腺病毒质粒：
其中，在fiber1蛋白的268Aa-269Aa部位插入RGD4C短肽；该插入部位位于Fiber1Knob结构域的CD环，构建成的载体命名为pKFAV4F1CDR-GFP质粒；
在fiber1蛋白的298Aa-299Aa部位插入RGD4C短肽；该插入部位位于Fiber1 Knob结构域的DE环，构建成的载体命名为pKFAV4F1DER-GFP质粒；
在fiber1蛋白的376Aa-377Aa部位插入RGD4C短肽；该插入部位位于Fiber1 Knob结构域的HI环，构建成的载体命名为pKFAV4F1HIR-GFP质粒；
在fiber1蛋白402Aa-403Aa部位插入RGD4C短肽；该插入部位位于Fiber1 Knob结构域的IJ环，构建成的载体命名为pKFAV4F1IJR-GFP质粒；
在fiber2蛋白的341Aa-342Aa部位插入RGD4C短肽；该插入部位位于Fiber2 Knob结构域的CD环，构建成的载体命名为pKFAV4F2CDR-GFP质粒；
在fiber1蛋白402Aa-403Aa部位插入RGD4C短肽，同时将fiber2基因的Knob编码区删除，也就是删除283Aa-479Aa的序列，替换为HAdV-35fiber Knob编码区序列(具体替换为HAdV-35(AC_000019)Fiber Knob结构域的129Aa-323Aa)，替换的HAdV-35fiber Knob的核苷酸序列如Seq.NO 5所示，氨基酸序列如Seq.NO 6所示，构建成的载体命名为pKFAV4IJ35K-GFP。
上述质粒是携带GFP基因的腺病毒质粒，也可以采用已知的方法构建携带其他报告基因或目的基因的腺病毒质粒。本发明的重组病毒能够有效地靶向感染哺乳动物细胞，包括人类细胞，提高感染效率。
本发明的第二目的是提供一种如上任意一种方案所述靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体的制备方法，包括：
(1)以禽4型腺病毒的完整基因组为骨架，构建含有pBR322的复制起点核酸序列、卡那霉素抗性核酸序列的载体I；
(2)利用载体II，获得人工改造的fiber核酸片段；
(3)利用载体II中的人工改造的fiber核酸片段替换载体I的基因组中的fiber核酸片段，获得fiber改造的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体。
具体的，发明人构建含有FAdV-4病毒2个fiber基因的穿梭质粒pMD-FAV4Fs(载体II)。该质粒较小，可以利用通用的定点突变方法，例如重叠延伸PCR、限制性内切酶酶切-连接克隆或DNA组装，对fiber基因进行定点改造。再利用限制性内切酶对含有人工改造的fiber核酸序列的载体质粒进行酶切，例如使用KpnI/EcoRV双酶切，分离出改造后的fiber片段。然后酶切腺病毒质粒(载体I)，例如采用MauBI/SbfI双酶切pKFAV4GFP，分离出去除fiber基因的腺病毒质粒片段。将改造后的fiber片段和去除fiber基因的腺病毒质粒片段进行DNA组装，即可获得fiber改造的重组腺病毒质粒。
或者，也可以使用MauBI/SbfI酶切改造后的穿梭质粒，通过限制性酶切-连接克隆直接替换腺病毒质粒MauBI/SbfI酶切的对应片段，得到fiber改造的重组腺病毒质粒。
重组腺病毒质粒可以作为更换新的目的基因的起点，也可以进行重组病毒的拯救和扩增。
进一步的方案，本发明的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体中还携带外源目的基因，所述外源目的基因可以是期望提高表达量的目的蛋白基因，包括但不限于：免疫调节因子或病毒结构蛋白基因等。
本发明的第三目的是提供以上任意一种方案所述的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体在制备基因治疗试剂盒或疫苗中的应用。
本发明的第四目的是提供一种基因治疗试剂盒，包括如任意一种方案所述的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体；
优选的，所述禽4型腺病毒载体中携带与治疗哺乳动物疾病相关的外源基因。
取决于选择的外源目的基因，所得的基因治疗试剂盒可用于治疗哺乳动物中与所述外源目的基因相关的疾病。例如，将免疫调节因子GM-CSF插入腺病毒质粒，利用所述fiber修饰的FAdV-4腺病毒质粒制备所需要的重组病毒，可以用于治疗人类相关恶性肿瘤。
本发明的第五目的是提供一种重组疫苗，所述重组疫苗采用如上任意一种方案所述的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体，载体中携带与预防哺乳动物疾病相关的外源基因。
取决于携带的外源目的基因，所得的重组疫苗可用于预防哺乳动物中与所述外源目的基因相关的疾病，包括但不限于：在温血动物中传播的狂犬病、包虫病或埃博拉出血热等。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体，对其fiber基因进行了改造，改造后的禽4型腺病毒载体能够提高对哺乳动物细胞的感染效率。因此，本发明制备了能够高效用于哺乳动物细胞的高效FAdV载体。
2、本发明的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体可以携带外源目的基因，能够用于制备哺乳动物的重组疫苗或基因治疗试剂盒，具有广阔的应用前景。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是携带禽4型腺病毒(FAdV-4)fiber基因的穿梭质粒pMD-FAV4Fs构建示意图，其中，Amp：氨苄青霉素抗性开放阅读框(ampicillin resistance ORF)；ori：pBR322复制起点(origin of replication)；
图2是在pMD-FAV4Fs穿梭质粒fiber1基因的CD loop编码区插入RGD4C编码序列得到pMD-FAV4F1CDR的构建示意图；其中，Amp：氨苄青霉素抗性开放阅读框(ampicillinresistance ORF)；ori：pBR322复制起点(origin of replication)；
图3是腺病毒质粒pKFAV4F1CDR-GFP构建示意图；其中，Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；Ori：pBR322复制起点(origin of replication)；
图4是腺病毒质粒pKFAV4F2CDR-GFP构建示意图，其中，Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；Ori：pBR322复制起点(origin of replication)；
图5是腺病毒质粒pKFAV4FIJ35K-GFP构建示意图；其中，Kan：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；Ori：pBR322复制起点(origin of replication)；
图6是禽4型腺病毒Fiber1和Fiber2修饰部位及修饰肽段示意图。
(a)显示FAdV-4Fiber1氨基酸序列，在Fiber1的CD环(CD loop)、DE环、HI环和IJ环插入RGD4C短肽，插入部位依次以实心三角表示；产生的重组病毒分别为FAdV4F1CDR-GFP，FAdV4F1DER-GFP，FAdV4F1HIR-GFP和FAdV4F1IJR-GFP。(b)显示FAdV-4Fiber2氨基酸序列，在Fiber2的CD环插入RGD4C短肽，插入部位以实心三角表示，产生的重组病毒为FAdV4F2CDR-GFP；【】内为Fiber2的knob结构域，在FAdV4FIJ35K-GFP重组病毒中被人35型腺病毒(HAdV-35)的Fiber knob替换。
图7是重组fiber修饰腺病毒质粒鉴定示意图；其中，M1:Lambda/HindIII DNA分子量标记；M2：DL-2000分子量标记；
图8显示重组腺病毒FAdV4F1CDR-GFP的拯救结果；
图9显示重组腺病毒FAdV4F1CDR-GFP的测序鉴定结果；
图10显示重组4型禽腺病毒对人类细胞系的感染效果；
图11显示重组4型禽腺病毒以不同感染复数对人类细胞系的感染效果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例中的附图对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明实施例中所用的出发腺病毒质粒pKFAV4GFP和pAdEasy-F35的构建过程已经公开发表和由公开号为CN108660158发明申请公开。
pKFAV4GFP质粒含有FAdV-4基因组(Genbank accession number：MG547384)，其Orf1，Orf1b和Orf2由人巨细胞病毒启动子(CMVp)和SV40病毒polyA加尾信号控制的绿色荧光蛋白(GFP)编码区取代，具体构建过程参照CN108660158专利申请。pAdEasy-F35是含有人35型腺病毒(HAdV-35)fiber Shaft和Knob编码区的HAdV-5腺病毒载体的骨架质粒。
试剂：PCR耐热DNA聚合酶(Q5高保真DNA聚合酶)和DNA组装试剂(NEBuilder HiFiDNA Assembly Master Mix,Cat.E2621)购自美国NEB公司；DNA连接试剂盒(Cat.6022Q)购自Takara Bio公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Cat.D4045)和DNA片段纯化和浓缩试剂盒(Cat.D4010)购自ZYMO RESEARCH公司；各种限制性内切酶购自NEB或Takara Bio公司；大肠杆菌TOP10感受态细胞购自天根生化科技有限公司；PCR引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；人类细胞系293(Cat.CRL-1573)、A549(Cat.CCL-185)和鸡肝癌细胞系LMH(Cat.CRL-2117)购自美国模式培养物保藏库(American type culture collection，ATCC)；质粒转染用脂质体lipofectamine 3000购自ThermoFisher Scientific公司。
实施例1、构建携带禽4型腺病毒(FAdV-4)fiber基因的穿梭质粒pMD-FAV4Fs
携带禽4型腺病毒(FAdV-4)fiber基因的穿梭质粒pMD-FAV4Fs构建过程见图1。
以pKFAV4GFP质粒为模板，1805FAV4FSC1：gccagtgccg gtacctttcg gagggcgacg和1805FAV4FSC2：gaccatgatt acgatatcct cctttggacc catggtagt为引物PCR扩增2999bp；以pMD-18T质粒为模板，1805FAV4FSC3：ggtccaaagg aggatatcgt aatcatggtc atagctgtttcctgt和1805FAV4FSC4：cctccgaaag gtaccggcac tggccgtcgt tttac为引物PCR扩增2662bp；电泳回收上述2条带，进行DNA组装反应(NEBuilder HiFi DNA Assembly MasterMix)。组装产物转化大肠杆菌TOP10感受态菌株，涂布含氨苄青霉素的LB平板，筛选得到质粒pMD-FAV4Fs。
该质粒含有FAdV-4基因组MauBI/SbfI酶切位点之间全部和外侧少量序列，包括了FAdV-4fiber1编码区(CDS)大部分序列和fiber2全部CDS。该质粒分子量小(约5600bp)，可以使用多种方法在其进行fiber基因定点突变，改造后的fiber基因可以使用传统的限制性酶切-连接克隆或DNA组装恢复到腺病毒质粒。
实施例2、在pMD-FAV4Fs穿梭质粒fiber1基因Knob编码区插入RGD4C短肽的编码序列
RGD4C是含有9个氨基酸残基的短肽(CDCRGDCFC)，选取tgt gac tgc cgc gga gactgt ttc tgc作为其编码序列。在pMD-FAV4Fs穿梭质粒fiber1基因的CD loop编码区插入RGD4C编码序列得到pMD-FAV4F1CDR的构建过程如图2所示。
以pMD-FAV4Fs质粒为模板，1805FAV4F1Mf：gtccataggc tattacatct acatggtg和1805FAV4F1CDRr：agaaacagtc tccgcggcag tcacagctcg cgcctgtgag gtc为引物PCR扩增片段，长度为119bp，以1805FAV4F1CDRf：tgactgccgc ggagactgtt tctgcggaga aaacagcctgactagcg和1805FAV4F1Mr：accctgatag gaaaaaggga tagga为引物PCR扩增片段，长度为475bp。SacI/AgeI双酶切pMD-FAV4Fs，产物长483和5124bp，电泳回收5124bp的片段。上述119bp，475bp和5124bp进行DNA组装得到pMD-FAV4F1CDR质粒。
其他穿梭质粒的构建是类似的。
以1805FAV4F1DERr：agaaacagtc tccgcggcag tcacagatga gggacaaattcacctctgt、1805FAV4F1HIRr：agaaacagtc tccgcggcag tcacatccgc tggacgtgtt ctgg或1805FAV4F1IJRr：agaaacagtc tccgcggcag tcacacgcgt tctggtcaaa ccagtt代替1805FAV4F1CDRr，PCR扩增得到209、443或521bp条带；以1805FAV4F1DERf：tgactgccgcggagactgtt tctgcgtgcc gcccacggtc tc、1805FAV4F1HIRf：tgactgccgc ggagactgtttctgcaccac gccgtcggat gc或1805FAV4F1IJRf：tgactgccgc ggagactgtt tctgccccgacactgtggtg acgac代替1805FAV4F1CDRf，PCR扩增得到385、151或73bp条带；SacI/AgeI双酶切pMD-FAV4Fs，产物长483和5124bp，电泳回收5124bp。
上述209bp，385bp和5124bp进行DNA组装得到pMD-FAV4F1DER质粒；443bp，151bp和5124bp组装得到pMD-FAV4F1HIR质粒；521，73bp和5124bp组装得到pMD-FAV4F1IJR质粒。
实施例3、将发生遗传修饰的fiber1基因引入FAdV-4腺病毒质粒
将穿梭质粒pMD-FAV4F1CDR中的fiber基因引入pKFAV4GFP得到腺病毒质粒pKFAV4F1CDR-GFP构建过程如图3所示。
使用KpnI/EcoRV双酶切实施例2中获得的pMD-FAV4F1CDR，电泳后回收2997bp片段；MauBI/SbfI双酶切pKFAV4GFP(2903,43078bp)，电泳后回收43078bp片段；将43078bp与2969bp进行DNA组装，得到腺病毒质粒pKFAV4F1CDR-GFP。
以pMD-FAV4F1DER、pMD-FAV4F1HIR或pMD-FAV4F1IJR代替pMD-FAV4F1CDR，经过上述操作，可以分别得到pKFAV4F1DER-GFP、pKFAV4F1HIR-GFP或pKFAV4F1IJR-GFP腺病毒质粒。
实施例4、在腺病毒质粒pKFAV4GFP fiber2基因的Knob CD环编码区插入RGD4C短肽编码序列
在pKFAV4GFP fiber2基因的Knob CD环编码区引入RGD4C短肽编码序列的构建过程如图4所示，得到的腺病毒质粒命名为pKFAV4F2CDR-GFP。
以pMD-FAV4Fs质粒为模板，1811MD-FAV4FSf：ccggtacctt tcggagggcg acg和1811MD-F2CDRp2：cagaaacagt ctccgcggca gtcacaccca gggcgattcc ccatgg为引物，PCR扩增2245bp片段；以1811MD-F2CDRp3：gtgactgccg cggagactgt ttctgcgacc tcaactccgccaatgccaaa t和1811MD-FAV4FSr：gatatcctcc tttggaccca tggtagtcca c为引物，PCR扩增787bp片段；上述2片段合并，以1811MD-FAV4FSf/r为引物，重叠延伸PCR扩增3007bp片段。MauBI/SbfI双酶切pKFAV4GFP电泳后回收43078bp片段；将43078bp与3007bp片段进行DNA组装，得到腺病毒质粒pKFAV4F2CDR-GFP。
实施例5、在腺病毒质粒pKFAV4GFP fiber1基因的Knob IJ环编码区插入RGD4C短肽编码序列，同时将fiber2的Knob编码区替换为HAdV-35fiber基因Knob编码序列，构建过程如图5所示，得到的腺病毒质粒命名为pKFAV4IJ35K-GFP。
以pMD-FAV4F1IJR质粒为模板，1811MD-FAV4FSf和1905F2TSF35Kp2：ggtgttaatactatcgggtg tggagacgct cccc为引物，PCR扩增2084bp片段；以pMD-FAV4F1IJR质粒为模板，以1905F2TSF35Kp5：aagacgacaa ctaaagcgga accatgatcg tgg和1811MD-FAV4FSr为引物，PCR扩增418bp片段。以pAdEasy-F35质粒为模板，1905F2TSF35Kp3：gcgtctccac acccgatagtattaacacct tatggactgg和1905F2TSF35Kp4：gatcatggtt ccgctttagt tgtcgtcttctgtaatgtaa g为引物，PCR扩增617bp片段。上述3片段合并，以1811MD-FAV4FSf/r为引物，重叠延伸PCR扩增3061bp片段。MauBI/SbfI双酶切pKFAV4GFP电泳后回收43078bp片段；将43078bp与3061bp片段进行DNA组装，得到腺病毒质粒pKFAV4FIJ35K-GFP。
上述构建得到6个FAdV-4腺病毒质粒，对应的fiber基因产物修饰部位以及用于修饰的RGD4C或HAdV-35Fiber Knob的氨基酸残基序列总结在图6。
对所有腺病毒质粒进行了限制性内切酶酶切鉴定，PCR扩增鉴定和PCR产物酶切鉴定，部分鉴定结果显示在图7。其中，(a)显示pKFAV4F1CDR-GFP质粒的NdeI酶切分析，预计片段分子量为33944,5468,3993,2352,251bp；
(b)显示腺病毒质粒fiber1片段的PCR扩增后电泳的结果，引物为1805FAV4FMS1/2，pKFAV4-GFP为模板时产物F1长1436bp，其他fiber1改造的腺病毒质粒(pKFAV4F1CDR-GFP,pKFAV4F1DER-GFP,pKFAV4F1HIR-GFP,pKFAV4F1IJR-GFP)为模板时产物长1463bp，产物分别命名为F1CDR,F1DER,F1HIR和F1IJR；(c)显示上述PCR产物的SacII酶切后电泳结果，预计片段分子量(bp)分别为：F1(1007,429)，F1CDR(622,429,412)，F1DER(532,502,429)，F1HIR(736,429,298)和F1IJR(814,429,220)；
对上述腺病毒质粒中由PCR产生的片段、酶切连接部位或DNA组装部位均进行了PCR扩增，对扩增产物进行了测序鉴定。
实施例6、fiber改造的重组禽4型腺病毒的拯救、扩增和纯化
PmeI分别酶切实施例3、4和5中得到的6种质粒，乙醇沉淀回收DNA，使用脂质体分别转染LMH细胞，37℃培养3-7天，第3天或第4天即可在荧光显微镜下见到GFP阳性细胞形成荧光灶，荧光灶不断增大，最终形成噬斑或噬斑融合后形成细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)。上述结果说明重组腺病毒得到成功拯救。在LMH扩增重组病毒，并提取病毒基因组，PCR扩增fiber基因，对PCR产物进行测序，结果显示fiber基因均发生了预计的定点突变。
图8显示由pKFAV4F1CDR-GFP质粒拯救的重组病毒FAdV4F1CDR-GFP在LMH细胞形成的荧光灶，图9显示对病毒基因组fiber基因部位进行的测序鉴定结果。
拯救获得的重组病毒分别命名为FAdV4F1CDR-GFP、FAdV4F1DER-GFP、FAdV4F1HIR-GFP、FAdV4F1IJR-GFP、FAdV4F2CDR-GFP和FAdV4IJ35K-GFP。重组病毒在LMH细胞扩增后，使用常规的CsCl密度梯度离心法进行了纯化。
实施例7、fiber改造的重组禽4型腺病毒对哺乳动物细胞的基因转导
对数生长期的293或A549细胞接种24孔细胞培养板，使用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基培养1天后，直接接种DMEM稀释的重组病毒液50微升，混匀，37度细胞培养箱感染4小时，去除病毒液，每孔更换为含2％FBS DMEM 0.5毫升，继续培养44小时。胰酶消化细胞，使用含1％FBS的10mM磷酸盐缓冲液(PBS)制成细胞悬液，添加4％多聚甲醛溶液至多聚甲醛浓度达1.5％，固定于4摄氏度，一周内使用流式细胞仪测定GFP+细胞比例。
结果：当各重组病毒以1000vp/cell(viral particles per cell)的感染复数(multiplicity of infection,MOI)感染293细胞时，未改造的对照病毒FAdV4-GFP的目的基因转导效率低于1％，fiber改造的重组病毒基因转移效率明显提高，为20％-70％不等；在FAdV4F1CDR-GFP、FAdV4F1DER-GFP、FAdV4F1HIR-GFP、FAdV4F1IJR-GFP或FAdV4F2CDR-GFP中，FAdV4F1IJR-GFP最高，达67.4％，FAdV4F1HIR-GFP最低，为23.5％(图10a)。感染A549时，未改造的对照病毒FAdV4-GFP的目的基因转导效率低于0.3％，fiber改造的重组病毒基因转移效率也明显提高，FAdV4F1IJR-GFP最高，达17.5％(图10b)。
由于FAdV4F1IJR-GFP的基因转移效率高，在其基础上，对fiber2基因的Knob进行了型别替换，替换为HAdV-5fiber Knob，制备了FAdV4IJ35K-GFP重组病毒。FAdV4-GFP、FAdV4F1IJR-GFP或FAdV4IJ35KGFP以不同感染复数分别感染293或A549细胞。
结果显示，FAdV4-GFP对293细胞感染效率极低，在4000vp/cell时，GFP+细胞数仍然低于2％；fiber改造的重组病毒随着感染复数的增加，基因转移效率逐渐增强，当使用较低的感染复数时，FAdV4IJ35KGFP明显优于FAdV4F1IJR-GFP；当使用4000vp/cell感染时，两者的基因转移效率相近，高达95％(图11a)。感染A549细胞时，FAdV4F1IJR-GFP优于FAdV4IJ35KGFP，当使用4000vp/cell感染时，FAdV4F1IJR-GFP的基因转移效率达62.6％，而FAdV4IJ35K-GFP达54.5％(图11b)。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
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Claims (9)

1.一种靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体，其特征在于，载体包括禽4型腺病毒的基因组序列、pBR322的复制起点核酸序列和卡那霉素抗性核酸序列；所述基因组序列中的fiber基因经过人工改造，所述fiber基因包括fiber1和fiber2，人工改造的方式包括：
在fiber1基因Knob区的IJ环中插入RGD4C短肽核酸序列；所述RGD4C短肽氨基酸序列为CDCRGDCFC。
2.根据权利要求1所述的一种靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体，其特征在于，
在fiber1基因的IJ环中插入RGD4C短肽的编码序列，且将fiber2基因Knob区替换为人35型腺病毒fiber knob区的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体，其特征在于，在fiber1基因Knob区的IJ环中插入RGD4C短肽核酸序列的方式包括：
改造后fiber1基因编码的蛋白的402Aa-403Aa部位插入了RGD4C短肽氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的一种靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体，其特征在于，改造后fiber1基因编码的蛋白的402Aa-403Aa部位插入了RGD4C短肽氨基酸序列，同时，fiber2基因编码蛋白的283Aa-479Aa替换为如Seq.NO 6所示的人35型腺病毒Knob区氨基酸序列。
5.一种如权利要求1-4任意一项所述靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体的制备方法，其特征在于，包括：
(1)以禽4型腺病毒的完整基因组为骨架，构建含有pBR322的复制起点核酸序列、卡那霉素抗性核酸序列的载体I；
(2)利用载体II获得人工改造的fiber核酸片段；所述载体II为由pMD-18T和FAdV-4病毒2个fiber基因构建的穿梭质粒pMD-FAV4Fs；
(3)利用载体II中的人工改造的fiber核酸片段替换载体I的基因组中的fiber核酸片段，获得fiber改造的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体。
6.如权利要求1-4任意一项所述的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体在制备基因治疗试剂盒或疫苗中的应用。
7.一种基因治疗试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-4任意一项所述的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体。
8.根据权利要求7所述的基因治疗试剂盒，其特征在于，所述禽4型腺病毒载体中携带与治疗哺乳动物疾病相关的外源基因。
9.一种重组疫苗，其特征在于，所述重组疫苗采用如权利要求1-4任意一项所述的靶向感染哺乳动物细胞的禽4型腺病毒载体，载体中携带与预防哺乳动物疾病相关的外源基因。
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