CN108660158A - 禽4型腺病毒（FAdV-4）载体系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种重组禽腺病毒FAdV‑4载体系统，包括骨架质粒pKFAV4、中间质粒pKFAV4AP和穿梭质粒pKFAV4APNM。将目的基因编码区克隆到穿梭质粒的多克隆位点，NheI酶切携带目的基因表达框的穿梭质粒，用所得片段替换中间质粒的对应部位；再用AvrII或PacI酶切携带目的基因的中间质粒，借助连接反应或DNA组装反应将所得片段替换骨架质粒的对应部位，可获得重组腺病毒质粒；PmeI线性化腺病毒质粒转染LMH细胞，能够制备由人巨细胞启动子(CMVp)控制目的基因表达的重组FAdV‑4腺病毒。在制备的重组腺病毒中，FAdV‑4基因组Orf1‑Orf2区域由目的基因表达框替代，腺病毒的其他区域保留。预计其在鸟类口服疫苗研发中具有广阔的应用前景。

Description

禽4型腺病毒(FAdV-4)载体系统及其应用
技术领域
本发明属于重组疫苗领域，具体而言，涉及一种重组禽腺病毒FAdV-4载体系统及其应用。
背景技术
腺病毒科(Adenoviridae)分为5个属(genus)，其中哺乳动物腺病毒属感染哺乳动物，而鸟类腺病毒属(Aviadenovirus)感染鸟类[1]。鸟类腺病毒基因组长43.7-45.7kb，是除白鲟腺病毒(white sturgeon adenovirus)外最长的腺病毒基因组；其五邻体含有2根纤毛(fiber)，由单个基因或2个基因编码(1个基因编码1根)。鸟类腺病毒包括禽腺病毒，禽腺病毒分类为A、B、C、D、E共5个种。禽腺病毒4型(fowl adenovirus 4，FAdV-4)属于FAdV-C，是鸡包涵体肝炎-心包积水症(hepatitis-hydropericardium syndrome,HHS)的病原。该病的致死率30％-70％，对肉鸡养殖危害严重。对其疫苗的研发是目前的研究热点[2,3]。
FAdV-1,9和10致病性弱，研究得较多，已被改造为基因转移载体[4,5]。目前未见基于FAdV-4基因转移载体的研究报道。对FAdV-1,9和10的前期研究表明，病毒基因组左端的Orf0，Orf1a，Orf1b和Orf2对于病毒在体外培养的细胞中增殖是非必需的，我们尝试删除Orf1a，Orf1b和Orf2序列，建立重组病毒载体系统。将目的基因插入穿梭质粒的多克隆位点，经过一系列的构建操作，最终获得由人巨细胞病毒启动子(CMVp)控制目的基因表达的重组FAdV-4。常见的腺病毒载体系统基于大肠杆菌E.coli BJ5183菌株同源重组活性进行构建[6-8]。由于禽腺病毒基因组内部有多处重复序列，大肠杆菌细胞内的同源重组有可能造成病毒基因组不稳定。为了减小同源重组发生在非目标区域的可能，本系统选用了酶切连接或DNA组装技术用于载体构建，这类技术在控制病毒基因组稳定性上有优势，构建过程的质量控制相对容易，构建过程所需的工作量与同源重组方法相近[9-12]。
禽腺病毒的关键基因位于病毒基因组中部，基因组左右两端含有较多的非必需基因[13,14]，本载体系统的穿梭质粒同时包含了病毒基因组两端的基因，非常有利于对重组病毒的进一步改造，可以作为FAdV-4减毒疫苗研究的起始载体。建立FAdV-4基因转移载体系统，一方面有利于制备FAdV-4减毒疫苗，另一方面可以用于其他病毒传染病(例如禽流感)的载体疫苗研发。
发明内容
为了满足本领域的需求，本发明的目的是提供一种重组禽腺病毒FAdV-4载体系统。
本发明人由野生型禽4型腺病毒(FAdV-4)的基因组DNA出发，构建了可在Orf1-Orf2区域插入目的基因的FAdV-4载体系统。
在第一方面，本发明提供一种重组腺病毒FAdV-4载体系统，所述载体系统包括骨架质粒、中间质粒和穿梭质粒。本发明人将所述骨架质粒命名为pKFAV4，所述中间质粒命名为pKFAV4AP，并且所述穿梭质粒命名为pKFAV4APNM。换言之，本发明所述的禽腺病毒FAdV-4载体系统包括骨架质粒pKFAV4、中间质粒pKFAV4AP和穿梭质粒pKFAV4APNM。在一个优选的实施方案中，所述禽4型腺病毒(FAdV-4)载体系统由骨架质粒pKFAV4、中间质粒pKFAV4AP和穿梭质粒pKFAV4APNM组成。
其中，骨架质粒pKFAV4由本发明人设计并构建得到(见实施例1和图1)，其含有pBR322质粒的复制起点(ORI)、卡那霉素的抗性基因(KAN)和FAdV-4基因组(Genbankaccession number:AY339865)。本发明人通过将经PCR获得的KAN-ORI片段(SEQ ID NO：1)与野生型FAdV-4基因组序列(Genbank accession number:MG547384)进行DNA组装(DNAassembly)得到骨架质粒pKFAV4。
中间质粒pKFAV4AP由本发明人设计并构建得到(见实施例2和图2)，其含有pBR322质粒的复制起点(ORI)、卡那霉素的抗性基因(KAN)、FAdV-4基因组2个AvrII位点外侧的序列、FAdV-4基因组2个AvrII位点及其内侧约24bp的序列；其中FAdV-4基因组2个AvrII位点内侧各约24bp的序列由PacI酶切位点相连。本发明人将AvrII酶切骨架质粒pKFAV4得到的16728bp片段与AvrII-PacI片段(SEQ ID NO：2)进行DNA组装，得到中间质粒pKFAV4AP。
穿梭质粒pKFAV4APNM由本发明人设计并构建得到(见实施例3和图3)，其含有pKFAV4AP质粒2个NheI位点之间删除Orf1a、Orf1b和Orf2CDS后的序列。pKFAV4APNM含有多克隆位点，以便插入目的基因CDS。换言之，可以将外源的目的基因插入到穿梭质粒pKFAV4APNM的多克隆位点，从而得到携带外源目的基因的重组穿梭质粒。实施例3和图3具体描述了穿梭质粒pKFAV4APNM的构建，将pKFAV4AP用NheI酶切后自身环化得到pKFAV4APN质粒；将NheI/AgeI双酶切pKFAV4APN所得片段、PCR所得AgeI-Orf1片段(SEQ ID NO：3)与PCR所得CMVp-MCS-pA片段(SEQ ID NO：4)进行DNA组装可以构建得到所述穿梭质粒pKFAV4APNM。其中，穿梭质粒pKFAV4APNM中多克隆位点含有的限制性内切酶位点包括SalI、NotI、XhoI和HindIII酶切位点。本领域技术人员应该理解，可以根据实际需要选择适当的限制性内切酶位点组合作为多克隆位点，在构建重组FAdV-4腺病毒时，也可以根据实际需要选择可用的限制性内切酶位点。
在第二方面，本发明提供利用第一方面的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统制备由人巨细胞病毒启动子(CMVp)控制目的基因表达的重组FAdV-4腺病毒的方法。
在一个实施方案中，本发明人利用GFP作为外源目的蛋白，验证了由本发明第一方面的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统拯救的重组FAdV-4腺病毒的感染活性。具体而言，通过PCR扩增GFP的编码序列(GFP CDS，SEQ ID NO：5)，用适当的限制酶酶切，将回收的酶切片段插入穿梭质粒pKFAV4APNM的多克隆位点；NheI酶切携带GFP基因的穿梭质粒，用获得的片段替换中间质粒pKFAV4AP的对应部位；再用AvrII酶切新的中间质粒，用获得的片段替换骨架质粒pKFAV4的对应部位，获得腺病毒质粒pKFAV4GFP；将得到的腺病毒质粒pKFAV4GFP用PmeI酶切线性化，转染LMH鸡细胞，拯救获得重组病毒FAdV-4GFP。通过观察GFP的绿色荧光，观察到该重组腺病毒能够感染LMH细胞和人293细胞。这意味着，利用本发明第一方面的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统能够制备得到具有感染活性的重组腺病毒。
换言之，可以将适当的外源目的基因插入到穿梭质粒pKFAV4APNM的多克隆位点，NheI消化该携带外源目的基因的重组穿梭质粒，用线性化的重组穿梭质粒替换中间质粒pKFAV4AP的相应部位(通过酶切连接操作)，再用AvrII酶切新的中间质粒，并用该线性化的中间质粒替换骨架质粒pKFAV4的对应部位(通过酶切连接操作)，即可得到将完整的FAdV-4基因组中的Orf1-Orf2区域用含外源目的基因的表达框替代的重组腺病毒质粒，最后将得到的重组腺病毒质粒用PmeI酶切，将线性化的重组腺病毒基因组片段转染到适当的细胞中，拯救可以得到表达外源目的基因的重组腺病毒。上述为利用本发明第一方面的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统拯救表达外源目的基因的重组FAdV-4腺病毒的通用方法步骤。
在制备的重组腺病毒中，FAdV-4基因组Orf1-Orf2区域由含外源目的基因的表达框替代，腺病毒基因组其他部分保留。由于腺病毒在体外培养细胞中扩增时，Orf1-Orf2区域是非必需的，故该重组病毒在体外培养的鸡细胞中能够复制增殖，是复制型腺病毒。该重组病毒颗粒中，除基因组含有部分外源序列(目的基因表达框)外，基因组其他部分以及病毒所有结构蛋白均源于野生型FAdV-4。
在第三方面，本发明提供利用第一方面的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统制备的携带外源目的基因的重组腺病毒。其中所述外源目的基因可以是欲提高表达量的目的蛋白基因，例如，但不限于，免疫调节因子或病毒结构蛋白基因等。
在第四方面，本发明提供利用第一方面的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统或由该载体系统制备的携带外源目的基因的重组腺病毒在制备基因治疗试剂盒或重组疫苗中的应用。基于本发明第一方面的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，结合本领域中相关的技术手段，本领域技术人员能够预计到本发明产生的能够复制的携带外源目的基因的重组FAdV-4病毒在重组疫苗研究或基因治疗试剂盒中具有广阔的应用前景。优选地，所述重组疫苗可以为鸟类口服重组疫苗。
相应地，本发明提供一种重组疫苗，其包含有效量的携带外源目的基因的重组禽腺病毒FAdV-4，其中所述携带外源目的基因的重组禽腺病毒FAdV-4利用本发明第一方面的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统制备得到。具体制备方法可以为：利用PCR或其他方法获得中和抗原基因CDS，将所述中和抗原基因CDS序列克隆到穿梭质粒，利用本发明的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统构建所需要的重组病毒。
优选地，所述重组疫苗可以为口服重组疫苗。
取决于在穿梭质粒中插入的外源目的基因，所得的重组疫苗可用于鸟类动物中与所述外源目的基因相关的疾病。例如，但不限于，在鸟类动物中传播的禽流感等。
本发明还可以提供一种基因治疗试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统。取决于在穿梭质粒中插入的外源目的基因，所得的基因治疗试剂盒可用于治疗哺乳动物中与所述外源目的基因相关的疾病。例如，将免疫调节因子GM-CSF插入穿梭质粒多克隆位点，利用所述重组禽腺病毒FAdV-4载体系统制备所需要的重组病毒，可以用于治疗人类相关恶性肿瘤。
在第五方面，本发明提供一种预防或治疗疾病的方法，所述方法应用本发明的疫苗或基因治疗试剂盒进行。换言之，所述方法可以利用本发明的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统进行。所述疾病可以是与利用本发明的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统引入的外源目的基因相关的疾病，例如禽流感等，还可以是恶性肿瘤。适用的受试者是鸟类或哺乳动物。
由此可见，本发明提供的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统能够拯救具有感染活性的重组腺病毒。该重组禽腺病毒FAdV-4载体系统可以作为良好的构建口服重组疫苗的工具，在穿梭质粒中插入外源目的基因，进而拯救得到携带外源目的基因的重组禽腺病毒，并且所得到的携带外源目的基因的重组腺病毒可以用于制备具有相应的预防功能的口服重组疫苗。显然，本发明的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统具有现有技术中其他腺病毒载体系统所不具备的优点。
综上所述，本发明提供下述技术方案：
1.一种重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其包括骨架质粒、中间质粒和穿梭质粒，其中所述骨架质粒命名为pKFAV4，所述中间质粒命名为pKFAV4AP，并且所述穿梭质粒命名为pKFAV4APNM。
2.根据第1项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：所述骨架质粒pKFAV4含有FAdV-4完整基因组；同时还含有在原核细胞中进行质粒复制所需的pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因。
3.根据第2项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其中所述骨架质粒通过将含有KAN-ORI的PCR片段(SEQ ID NO：1)与野生型FAdV-4基因组序列(Genbank accessionnumber:MG547384)进行DNA组装得到。
4.根据第1项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：所述中间质粒pKFAV4AP包含FAdV-4基因组2个AvrII位点外侧的序列；FAdV-4基因组2个AvrII位点内侧各约25bp的序列；以及在原核细胞中进行质粒复制所需的pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因。
5.根据第4项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其中所述中间质粒通过将AvrII酶切骨架质粒pKFAV4得到的16728bp片段与AvrII-PacI片段(SEQ ID NO：2)进行DNA组装而得到。
6.根据第1项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：所述穿梭质粒pKFAV4APNM包含pKFAV4AP质粒2个NheI位点之间的片段，该片段含有的Orf1-Orf2编码区由人巨细胞病毒启动子(CMVp)、多克隆位点和SV40polyA加尾信号(pA)替代。
7.根据第6项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其中所述穿梭质粒通过将PCR扩增所得AgeI-Orf1片段(SEQ ID NO：3)、PCR扩增所得CMVp-MCS-pA片段(SEQ ID NO：4)与中间质粒pKFAV4AP NheI-AgeI酶切片段进行DNA组装而得到。
8.根据第1或2项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：在所述骨架质粒pKFAV4中，在FAdV-4基因组末端各添加有一个限制性内切酶PmeI酶切位点。
9.根据第1或4项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：在中间质粒pKFAV4AP中，在左侧和右侧FAdV-4基因组片段这间含有一个限制性内切酶PacI酶切位点。
10.根据第1或6项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：在穿梭质粒pKFAV4APNM中，自pKFAV4AP分离的片段的末端含有有一个限制性内切酶NheI酶切位点；多克隆位点含有的限制性内切酶位点包括SalI、NotI、XhoI和HindIII酶切位点。
11.第1-10项中任一项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统在制备基因治疗试剂盒或重组疫苗中的应用。
12.一种基因治疗试剂盒，其包含第1-10项中任一项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统。
13.一种重组疫苗，其包含有效量的携带外源目的基因的重组禽腺病毒FAdV-4载体，其中所述携带外源目的基因的重组禽腺病毒FAdV-4利用第1-10项中任一项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统制备得到。
附图说明
图1是将FAdV-4基因组克隆到质粒示意图。设计引物，以pShuttle-CMV质粒为模板，扩增KAN-ORI片段(2537bp)，该片段两端与FAdV-4基因组两端ITR区域有30bp的重叠区；将FAdV-4基因组DNA(43719bp)与KAN-ORI混合，体外进行DNA组装(DNA assembly)反应；反应产物转化E.coli XL-Blue感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB琼脂平板，提取质粒，获得含有FAdV-4基因组的质粒pKFAV4。图中ITR：反向末端重复(the inverted terminalrepeat)；KAN：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；ORI：pBR322复制起点(pBR322origin of replication)。PCR引物序列以斜体表示，引物中添加的PmeI位点以下划线表示。
图2是中间质粒pKFAV4AP构建示意图。先用AvrII酶切骨架质粒pKFAV4，小牛碱性磷酸酶(CIP)处理后，电泳回收含有KAN-ORI的16728bp片段；再将合成的两条单链寡核苷酸退火，DNA聚合酶延伸获得双链DNA，电泳回收；上述2片段通过DNA组装、转化大肠杆菌感受态细胞得到pKFAV4AP质粒。图中ITR：反向末端重复(the inverted terminal repeat)；KAN：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；ORI：pBR322复制起点(pBR322origin of replication)；Orf1、Orf2、Orf4和Orf19A为FAdV-4的基因。
图3是穿梭质粒pKFAV4APNM构建示意图。先用NheI酶切中间质粒pKFAV4AP，电泳回收含有KAN-ORI的6950bp片段，自连得到质粒pKFAV4APN。NheI/AgeI双酶切质粒pKFAV4APN，电泳回收含有KAN-ORI的4942bp片段(NheI-AgeI)；PCR扩增获得FAdV-4Orf1上游至AgeI酶切位点的部分序列(Age-Orf1)；PCR扩增获得人巨细胞病毒启动子-多克隆位点-SV40polyA信号序列(CMVp-MCS-pA)；上述3个序列通过DNA组装整合为pKFAV4APNM质粒。图中ITR：反向末端重复(the inverted terminal repeat)；KAN：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycinresistance ORF)；ORI：pBR322复制起点(pBR322origin of replication)；CMVp：人巨细胞病毒启动子；MCS：多克隆位点；pA：SV40polyA信号序列；Orf0、Orf4和Orf19A为FAdV-4的基因。
图4是携带报告基因GFP的穿梭质粒pKFAV4APNG构建示意图。PCR扩增获得两端携带SalI/NotI酶切位点的绿色荧光蛋白GFP的编码区(CDS)；使用SalI/NotI双酶切PCR扩增得到的GFP的CDS，克隆到穿梭质粒pKFAV4APNM的SalI/NotI位点，得到pKFAV4APNG质粒。图中ITR：反向末端重复(the inverted terminal repeat)；KAN：卡那霉素抗性开放阅读框(kanamycin resistance ORF)；ORI：pBR322复制起点(pBR322origin of replication)；CMVp：人巨细胞病毒启动子；GFP：绿色荧光蛋白编码区；pA：SV40polyA信号序列。
图5是腺病毒质粒pKFAV4GFP构建示意图。NheI酶切携带GFP基因的穿梭质粒pKFAV4APNG，CIP处理后电泳回收，替换中间质粒pKFAV4AP的对应部分，得到新的中间质粒pKFAV4APG。AvrII酶切pKFAV4APG，CIP处理，电泳回收，替换骨架质粒pKFAV4的对应部位，得到腺病毒质粒pKFAV4GFP；或者PacI酶切pKFAV4APG，CIP处理，电泳回收，与AvrII酶切骨架质粒pKFAV4电泳回收的29468bp片段用DNA组装进行连接得到腺病毒质粒pKFAV4GFP。
图6显示FAdV-4GFP重组病毒在LMH鸡肝癌细胞中的拯救。使用PmeI线性化pKFAV4GFP腺病毒质粒后转染LMH细胞，培养2天后荧光显微镜下可见荧光灶形成，转染后3天和5天时可见病毒扩散到起始时未转染的其他细胞，培养体系发生细胞病变效应(CPE)，这说明成功拯救了重组病毒。
图7显示拯救的FAdV-4GFP重组病毒负染后在透射电镜下可见典型的腺病毒形态，提示拯救的确为腺病毒。
图8显示拯救的FAdV-4GFP感染鸡LMH细胞和人293细胞。拯救的重组病毒感染LMH细胞，1天后显微镜下即可见较强的绿色荧光；拯救的病毒感染人293细胞后，3天后荧光显微镜观察，部分细胞表达GFP。上述结果说明拯救的病毒具有感染活性。
图9是对FAdV-4GFP病毒基因组DNA进行限制性内切酶分析鉴定的结果。以腺病毒质粒pKFAV4GFP为对照。M:Lambda/HindIII DNA分子量标记。对于FAdV-4GFP基因组，酶切预计片段分子量分别为：EcoRI/463,516,699,1248,1384,3584,7836,27774bp；HindIII/2151,5216,5900,7413,10468,12356bp；NdeI/251,1016,1975,2352,3993,33917bp；PmeI/43504(不切割)。对于pKFAV4GFP质粒，酶切预计片段分子量分别为：EcoRI/463,699,1248,1384,6577,7836,27774bp；HindIII/5216,5900,7413,12356,15096bp；NdeI/251,2352,3993,5468,33917bp；PmeI/2471,43510bp。图9的电泳图显示酶切片段的实际分子量大小与预计的一致，说明拯救的病毒确为FAdV-4GFP。
序列表说明
序列编号 说明
SEQ ID NO:1 用于构建骨架质粒pKFAV4的KAN-ORI片段
SEQ ID NO:2 用于构建中间质粒的AvrII-PacI片段
SEQ ID NO:3 用于构建穿梭质粒的AgeI-Orf1片段
SEQ ID NO:4 用于构建穿梭质粒的CMVp-MCS-pA片段
SEQ ID NO:5 目的基因GFP的编码序列
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
除非另外指明，下述实施例中所用的出发质粒、酶、相关试剂均可从市售公司购买得到，所用的引物通过合成公司合成。
实施例1、将FAdV-4基因组克隆到质粒
骨架质粒pKFAV4的构建示意图见图1。野生型FAdV-4分离自山东省某肉鸡养殖厂，可在LMH鸡肝癌细胞传代和扩增。在标准的聚合酶链反应(PCR)条件下，以pShuttle-CMV质粒(stratagene公司)为模板，以1707KFAdV-F：tgtcaaaaga cgcggttata taagatgatg tttaaacgat cccgagcggt atcag(下划线表示PmeI酶切位点)，1708KFAdV-R：tgtcaaaagacgcggttata taagatgatgtttaaactgg aacaacactc aaccctat(下划线表示PmeI酶切位点)(华大基因合成)为引物扩增得到2537bp片段KAN-ORI(SEQ ID NO：1)。该片段两端30bp与FAdV-4基因组的ITR序列相同。将电泳回收的KAN-ORI片段与野生型FAdV-4基因组DNA混合，再加入等体积DNA assembly试剂母液(the NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix,Cat.E2623S,New England Biolabs)，50度反应1h。取反应产物直接转化E.coli XL-Blue感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB琼脂糖平板，阳性菌落使用LB液体培养基扩大培养，提取质粒pKFAV4，保存并测序。
骨架质粒pKFAV4含有的野生型FAdV-4序列参见Genbank accession number：MG547384；该质粒已保藏，保藏号为：CGMCC No.15357。
实施例2、中间质粒pKFAV4AP的构建
pKFAV4质粒较大，难以直接在该质粒上对其左侧基因组进行改造，故采取自pKFAV4质粒逐步分离出一个小质粒，以供外源基因替换。
图2显示了中间质粒pKFAV4AP的构建示意图。先用AvrII酶切pKFAV4质粒，小牛碱性磷酸酶(CIP)处理，去除5’p，防止片段自连，电泳回收16728bp片段；再设计2条引物，1707Avr-PacF：cgaatacgag ttggcctagg ctctcgcaga acagggaatg gggcattaat taaccgct(下划线表示AvrII和PacI酶切位点)，1707Avr-PacR tgtcgtactt cagccctagg ccattggcggagaccgtaag cggttaatta atgcccca(下划线表示AvrII和PacI酶切位点)自身退火，DNA聚合酶延伸得到96bp DNA片段(SEQ ID NO：2)；上述2片段混合，再加入等体积DNA assembly试剂母液，50度反应1h。取反应产物直接转化E.coli XL-Blue感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB琼脂糖平板，阳性菌落使用LB液体培养基扩大培养，提取质粒pKFAV4AP，保存并对添加的96bp区域测序。
实施例3、穿梭质粒pKFAV4APNM的构建
图3显示了穿梭质粒pKFAV4APNM的构建示意图。中间质粒pKFAV4AP分子量仍然偏大，难以直接用于目的基因插入操作，故从pKFAV4AP中分离出一个更小的质粒，将其中的Orf1-Orf2替换为人巨细胞病毒启动子-多克隆位点-SV40polyA加尾信号，得到穿梭质粒pKFAV4APNM。具体构建过程如下：先使用NheI酶切中间质粒pKFAV4AP，电泳回收6950bp片段，自连后得到pKFAV4APN质粒。再使用NheI/AgeI双酶切pKFAV4APN质粒，电泳回收4942bp片段；以pKFAV4APN质粒为模板，以1707KFAV4AgeIF attcctccac tgctttgaac cca1707KFAV4AgeIR cccgtaattg attactatta ccttgtagaa aaagagagaa aattg为引物，扩增得到204bp片段AgeI-Orf1(SEQ ID NO：3)；以pShuttle-CMV为模板，以1707F02MCSFttctacaagg taatagtaat caattacggg gtcattagtt 1707F02MCSR tcgatttact gtgaagctacaagtgctagc taagatacat tgatgagttt ggacaaac为引物扩增得到933bp片段CMVp-MCS-pA(SEQ ID NO：4)；上述3片段混合，再加入等体积DNA组装试剂母液，50℃反应1h，组装得到穿梭质粒pKFAV4APNM。
实施例4、携带绿色荧光蛋白GFP基因穿梭质粒pKFAV4APNG的构建
图4显示了携带绿色荧光蛋白GFP基因穿梭质粒pKFAV4APNG的构建示意图。克隆GFP编码区，插入穿梭质粒的多克隆位点得到携带目的基因的穿梭质粒。以pLEGFP-C1(购自Clontech公司)为模板，以1707MCSGFPF ggccgtcgac ggtcgccacc atggtgagca ag和1707MCSGFPR ggccgcggcc gcttagagtc cggacttgta cagctcgt为引物，扩增761bp目的基因GFP的编码序列(SEQ ID NO：5)。SalI/NotI双酶切PCR产物，电泳回收；SalI/NotI双酶切pKFAV4APNM穿梭质粒，电泳回收；两片段连接，转化E.coli Top10感受态细胞，得到携带GFP基因的穿梭质粒pKFAV4APNG。
实施例5、腺病毒质粒pKFAV4GFP的构建
NheI酶切携带GFP基因的穿梭质粒pKFAV4APNG，CIP处理，电泳回收6735bp片段；NheI酶切中间质粒pKFAV4AP，电泳回收9840bp片段；上述2片段连接得到新的中间质粒pKFAV4APG。由pKFAV4APG和骨架质粒pKFAV4得到腺病毒质粒pKFAV4GFP可以通过2种方案(图5)。第1种方案为：AvrII酶切pKFAV4APG，CIP处理，电泳回收16513bp片段；AvrII酶切pKFAV4，电泳回收29468bp片段；2片段连接，转化大肠杆菌，提取质粒，鉴定正反向，得到正向连接质粒pKFAV4GFP。第2种方案：PacI酶切pKFAV4APG，CIP处理，电泳回收16575bp片段；AvrII酶切pKFAV4，电泳回收29468bp片段；2片段通过DNA组装得到质粒pKFAV4GFP。DNA组装操作的优势在于无需鉴定所获质粒的正反向。
实施例6、重组病毒FAdV4-GFP在LMH细胞的拯救和增殖
使用PmeI酶切pKFAV4GFP质粒，乙醇沉淀回收DNA，使用脂质体lipofectamine3000(ThermoFisher Scientific公司)转染LMH鸡肝癌细胞(ATCC，CRL-2117)，培养5天。转染后2天可见GFP阳性细胞形成荧光灶，第3天至第5天病毒逐渐扩散到整个培养体系，引起细胞病变效应(CPE)。荧光显微镜下可见GFP的高效表达(图6)。上述结果说明FAdV4-GFP重组病毒得到成功拯救，并能够在LMH细胞迅速扩散和增殖。
实施例7、透射电镜观察拯救的FAdV4-GFP重组病毒
线性化pKFAV4GFP转染LMH细胞引起CPE后，将培养体系冻融裂解3次，2000g离心5min，分装保留病毒上清。取20μl病毒液用于电镜负染观察，电镜下可见大小约80nm，无包膜，成正二十面体对称的病毒颗粒(图7)。这是腺病毒的典型形态特征，说明拯救得到的是重组腺病毒。
实施例8、拯救的FAdV4-GFP重组病毒对鸡LMH细胞和人293细胞的感染
线性化pKFAV4GFP转染LMH细胞引起CPE后，将培养体系冻融裂解3次，2000g离心5min，分装保留病毒上清，冻存于-80度冰箱，作为种子病毒。取50μl FAdV4-GFP种子病毒接种培养在T25培养瓶中的LMH细胞或人293细胞，感染4小时后，去除病毒液，更换含2％胎牛血清(FBS)的新鲜培养基，继续培养1-3天后，荧光显微镜下可见GFP的高效表达(图8)。说明拯救的FAdV4-GFP重组病毒具有感染活性。
实施例9、FAdV4-GFP病毒基因组的酶切鉴定
FAdV4-GFP种子病毒接种培养在15cm细胞培养皿中的LMH细胞，共接种5皿。待细胞发生CPE后，收集细胞，冻融裂解3次，2000g离心15分钟，得到的病毒上清利用传统的CsCl密度梯度方法进行纯化。纯化的病毒与2×裂解液(20mM EDTA,1％SDS,0.4mg/ml proteinaseK,pH 7.4)等体积混合，50度裂解2小时[15]。病毒基因组DNA利用Genomic DNA Clean&Concentrator 10(购自ZYMO RESEARCH公司，Cat.No.D4010)进行纯化回收。使用限制性内切酶酶切病毒基因组DNA(以腺病毒质粒pKFAV4GFP为对照)，琼脂糖凝胶电泳分析。图9的电泳图可见酶切片段的实际分子量大小与预计的一致，说明拯救的病毒确为FAdV4-GFP。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
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序列表
<110> 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
江苏省农业科学院
<120> 禽4型腺病毒（FAdV-4）载体系统及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2537
<212> DNA
<213> 骨架质粒(pKFAV4)
<400> 1
tgtcaaaaga cgcggttata taagatgatg tttaaacgat cccgagcggt atcagctcac 60
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 120
gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 180
aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 240
ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 300
gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 360
ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 420
ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 480
cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 540
attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 600
ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 660
aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 720
gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 780
tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 840
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc 900
taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct 960
atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata 1020
actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca 1080
cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga 1140
agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga 1200
gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctgc agccatgaga 1260
ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttcacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg 1320
tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca 1380
aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta 1440
tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc 1500
tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaagc 1560
tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca 1620
ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc 1680
ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc 1740
aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg 1800
ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg 1860
gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct 1920
gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct 1980
acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac tcggatggaa 2040
gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa 2100
ctgttcgcca ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc 2160
gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt 2220
ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct 2280
gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc 2340
gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaat tttgttaaaa 2400
tttttgttaa atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaca tcccttataa 2460
atcaaaagaa tagaccgcga tagggttgag tgttgttcca gtttaaacat catcttatat 2520
aaccgcgtct tttgaca 2537
<210> 2
<211> 96
<212> DNA
<213> 中间质粒(pKFAV4AP)
<400> 2
cgaatacgag ttggcctagg ctctcgcaga acagggaatg gggcattaat taaccgctta 60
cggtctccgc caatggccta gggctgaagt acgaca 96
<210> 3
<211> 204
<212> DNA
<213> 穿梭质粒(pKFAV4APNM)
<400> 3
attcctccac tgctttgaac ccaaccggtt ttggaccgaa atcctctgga acggcaccgt 60
gaagcagagt gaactgaacg cggcgttgga gaagatcgtt gaactgttat aggtgaggat 120
tgttttctgt acgtttttcg cggtggtgtc atcccttgac aattttctct ctttttctac 180
aaggtaatag taatcaatta cggg 204
<210> 4
<211> 933
<212> DNA
<213> 穿梭质粒(pKFAV4APNM)
<400> 4
ttctacaagg taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt 60
ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 120
attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 180
tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 240
gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 300
gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 360
taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg 420
gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca 480
acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg 540
tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc tggtttagtg aaccgtcaga tccgctagag 600
atctggtacc gtcgacgcgg ccgctcgagc ctaagcttct agataagata tccgatccac 660
cggatctaga taactgatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt 720
aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt 780
taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac 840
aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc 900
ttagctagca cttgtagctt cacagtaaat cga 933
<210> 5
<211> 761
<212> DNA
<213> 腺病毒质粒(pKFAV4GFP)
<400> 5
ggccgtcgac ggtcgccacc atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc 60
ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 120
gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc 180
tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc 240
gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 300
tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga 360
agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg 420
acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca 480
tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg 540
acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg 600
tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg 660
agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca 720
tggacgagct gtacaagtcc ggactctaag cggccgcggc c 761

Claims (10)

1.一种重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其包括骨架质粒、中间质粒和穿梭质粒，其中所述骨架质粒命名为pKFAV4，所述中间质粒命名为pKFAV4AP，并且所述穿梭质粒命名为pKFAV4APNM。
2.根据权利要求1所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：所述骨架质粒pKFAV4含有FAdV-4完整基因组；同时还含有在原核细胞中进行质粒复制所需的pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因。
3.根据权利要求1所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：所述中间质粒pKFAV4AP包含FAdV-4基因组2个AvrII位点外侧的序列；FAdV-4基因组2个AvrII位点内侧各约25bp的序列；以及在原核细胞中进行质粒复制所需的pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因。
4.根据权利要求1所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：所述穿梭质粒pKFAV4APNM包含中间质粒pKFAV4AP两个NheI位点之间的片段，该片段含有的Orf1-Orf2编码区由人巨细胞病毒启动子、多克隆位点和SV40polyA加尾信号替代。
5.根据权利要求1或2所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：在所述骨架质粒pKFAV4中，在FAdV-4基因组末端各添加有一个限制性内切酶PmeI酶切位点。
6.根据权利要求1或3所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：在中间质粒pKFAV4AP中，在FAdV-4基因组左侧部分与右侧部分通过一个限制性内切酶PacI酶切位点相连。
7.根据权利要求1或4所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统，其特征在于：在穿梭质粒pKFAV4APNM中，所述多克隆位点含有的限制性内切酶位点包括HindIII、XhoI、NotI和SalI酶切位点。
8.权利要求1-7中任一项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统在制备基因治疗试剂盒或重组疫苗中的应用。
9.一种基因治疗试剂盒，其包含权利要求1-7中任一项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统。
10.一种重组疫苗，其包含有效量的携带外源目的基因的重组禽腺病毒FAdV-4，其中所述携带外源目的基因的重组禽腺病毒FAdV-4利用权利要求1-7中任一项所述的重组禽腺病毒FAdV-4载体系统制备得到。
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