CN111057716B - 用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统，所述载体系统含有E3区缺失的人4型腺病毒(Human Adenovirus type 4,HAdV‑4或Ad4)基因组、用于质粒在细菌内扩增的载体序列、pBR322复制原点、卡那霉素抗性基因以及复制控制序列，外源基因嵌入位点位于人4型腺病毒的包装信号之后、E1区之前。本发明还公开了所述单质粒载体系统包装重组人4型腺病毒的方法以及在疫苗和药物制备中的应用。所述载体系统可以快捷、高效地制备稳定表达外源基因的人4型腺病毒载体重组病毒，在诊断试剂盒、疫苗、基因治疗试剂盒和/或肿瘤治疗药物制备的应用等领域具有良好的应用前景。

Description

用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体而言，涉及一种重组人4型腺病毒载体系统(Ad4Fast)及其应用。

背景技术

腺病毒为无包膜，正二十面体对称结构，直径70-90nm，其基因组为单股双链DNA，长度约36kb，基因组两端各含有一个反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeats,ITR)，上游末端重复序列内侧含有包装信号用于控制重组病毒的包装。基因组入核后，腺病毒将启动有序而复杂的逐级放大转录和剪切过程，根据转录时间先后可将基因组编码区分为早期转录区(E1-E4)和晚期转录区(L1-L5)。其中，E1区是调节细胞代谢、激活早期基因表达的重要蛋白，E1缺失将导致病毒失去复制能力。E3区的功能主要与病毒逃逸宿主细胞的免疫监视等功能有关，E3缺失不会阻断病毒的复制和装配。

现阶段，复制缺陷型5型腺病毒载体系统广泛应用于疫苗研发、基因治疗、肿瘤治疗等领域。但是，5型腺病毒预存免疫在世界范围内均维持在较高水平，在中国的中和抗体血清阳性率在70％以上。所谓预存免疫是指在疫苗免疫前，机体已经存在的针对载体病毒的免疫反应。往往由野生型载体病毒感染导致，以针对载体病毒的血清中和抗体水平衡量预存免疫水平的高低。在人用腺病毒载体疫苗研究中，5型腺病毒高预存免疫显著影响5型腺病毒载体疫苗诱导的抗原特异性体液和细胞免疫反应。4型腺病毒预存免疫水平显著低于5型腺病毒，且长期作为口服疫苗用于预防腺病毒感染导致的急性呼吸道疾病，具有较高的安全性。因此4型腺病毒载体具有较高的应用价值。本发明的目的就是提供一种能够克服现有技术缺陷、稳定、高效、快速地用于包装重组人4型腺病毒的载体系统

发明内容

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种复制型人4型腺病毒载体单质粒系统。所述载体系统含有E3区缺失的人4型腺病毒基因组，外源基因嵌入位点位于人4型腺病毒的包装信号之后、E1区之前。

此处的单质粒系统还可以含有用于质粒在细菌内扩增的载体序列、pBR322复制原点、卡那霉素抗性基因以及复制控制序列，这些功能组件是本领域常规技术，不构成本发明的核心内容。

在一个优选的实施方案中，所述载体系统中人4型腺病毒基因组与载体序列之间通过两个PacI限制性酶切位点连接，外源基因的嵌入依赖PmeI限制性酶切位点。

更为优选地，所述载体系统中人4型腺病毒E1区之前的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的4型腺病毒载体骨架质粒，将外源基因表达框或外源基因体外嵌入腺病毒骨架质粒克隆位点，可以直接包装重组病毒。该骨架质粒包含三种形式，分别为：用于嵌入外源基因表达框的载体质粒PAd4-dE3-E1，用于正向嵌入外源基因的载体质粒PAd4-dE3-E1RC、用于反向嵌入外源基因的载体质粒PAd4-dE3-E1LC。

在一个更为优选的实施方案中，所述载体系统在外源基因嵌入位点不含有控制表达元件，携带外源基因表达框的DNA片段直接克隆至所述载体系统的PmeI限制性酶切位点。本载体系统被定义为PAd4-dE3-E1。

其中，载体质粒PAd4-dE3-E1由本发明人设计并构建得到(见实施例1和图1-6)，用于完整的外源基因表达框的嵌入，可自由选择启动子与终止序列。其包含E3完全缺失的人4型腺病毒基因组，pBR322复制原点、卡那霉素抗性基因以及复制控制序列(repression ofprimer，ROP)等。本发明人以病毒上、下游末端序列为同源臂，制备同源重组质粒，与野生型人4型腺病毒基因组在BJ5183细菌中同源重组得到包含腺病毒基因组全长的质粒PAd4-V0。以病毒基因组E3区上、下游序列为同源臂，制备同源重组质粒，与质粒PAd4-V0在BJ5183细菌中同源重组得到E3缺失的腺病毒骨架质粒PAd4-dE3。质粒PAd4-dE3中腺病毒基因组包装序列后、E1区之前(对应腺病毒基因组397-471碱基之间)引入PmeI单酶切位点，得到可以用于外源基因表达框嵌入的载体质粒PAd4-dE3-E1。

在另一个优选的实施方案中，在所述载体系统的外源基因嵌入位点正向嵌入控制外源基因表达的控制元件，所述控制元件为包含mCMV启动子和SV40多聚腺苷酸尾终止序列的DNA片段。本载体系统被定义为PAd4-dE3-E1RC。

更为优选地，所述控制元件两端为PmeI位点，控制元件中的外源基因克隆位点为SwaI，外源基因DNA片段直接克隆至所述载体系统的SwaI限制性酶切位点。所述载体系统被命名为PAd4-dE3-E1RC

载体质粒PAd4-dE3-E1RC由本发明人设计并构建得到(见实施例2和图7)，用于外源基因的正向嵌入。在载体质粒PAd4-dE3-E1的基础上，该载体在PmeI位点处引入用于起始外源基因表达的mCMV启动子和控制表达终止的SV40 polyA序列，mCMV启动子和SV40 polyA序列正向嵌入(mCMV启动子在腺病毒基因组上游方向，SV40 polyA序列在腺病毒基因组下游方向)，二者之间包含用于外源基因嵌入的SwaI酶切位点。

在又一个优选的实施方案中，在所述载体系统的外源基因嵌入位点反向嵌入控制外源基因表达的控制元件，所述控制元件为包含mCMV启动子和SV40多聚腺苷酸尾终止序列的DNA片段。

更为优选地，所述控制元件两端为PmeI位点，所述控制元件中的外源基因克隆位点为SwaI，外源基因DNA片段直接克隆至PAd4-dE3-E1RC所述载体系统的SwaI限制性酶切位点。本载体系统被定义为粒PAd4-dE3-E1LC。

载体质粒PAd4-dE3-E1LC由本发明人设计并构建得到(见实施例2和图8)，用于外源基因的反向嵌入。在载体质粒PAd4-dE3-E1的基础上，在PmeI位点处引入用于控制外源基因表达起始的mCMV启动子和控制表达终止的SV40 polyA序列，mCMV启动子和SV40 polyA序列反向嵌入(mCMV启动子在腺病毒基因组下游方向，SV40 polyA序列在腺病毒基因组上游方向)，二者之间包含用于外源基因嵌入的SwaI酶切位点。

其次，本发明还提供了上述单质粒载体系统包装重组人4型腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)使用PacI限制性内切酶线性化人4型腺病毒载体重组质粒；

(2)将线性化片段转染HEK293细胞中，培养至细胞病变；

(3)冻融病变后的细胞培养液，连续传代至细胞持续病变；

(4)获得稳定传代的重组人4型腺病毒。

发明人利用PCR扩增萤火虫荧光素酶作为外源目的基因，将扩增得到的序列与人4型腺病毒载体组装得到携带外源目的基因的重组质粒，将重组质粒使用PacI酶切后，转染至HEK293细胞，维持培养3-5天即可观察到显著的细胞病变。通过连续传代获得毒力稳定的重组病毒(见实施例3和图9)。不同形式的载体质粒包装的重组病毒存在一定的差别，其中载体质粒PAd4-dE3-E1提供了使用者任意更换启动子的机会，因为在不同类型细胞中，启动子显著影响外源基因的表达水平；载体质粒PAd4-dE3-E1RC或载体质粒PAd4-dE3-E1LC均含有控制外源基因表达的启动子，但控制序列方向不同，表达外源基因能力略有差异(见实施例4-5和图10-11)。

最后，本发明提供了上述的单质粒载体系统在疫苗和药物制备的应用。

本发明公开了复制型人4型腺病毒载体单质粒系统制备的携带萤火虫荧光素酶报告基因的重组病毒在人4型腺病毒流行病学研究中的应用。含报告基因的重组人4型腺病毒的加入量在一定范围内与报告基因的表达水平呈正相关关系。若人血清中含有人4型腺病毒中和抗体，与含报告基因的重组人4型腺病毒孵育后，重组病毒被抗体中和，外源基因的表达水平与中和抗体的浓度的对数值呈“S”型分布，利用曲线拟合可以计算样品中的中和抗体水平。

因此，本发明提供的人4型腺病毒载体单质粒系统及包装重组4型腺病毒的方法可以用于人4型腺病毒中和抗体检测试剂盒的制备，该方法或试剂盒可能用于人4型腺病毒血清流行病学监测、人4型腺病毒疫苗的体液免疫反应评价、人4型腺病毒载体重组疫苗的预存免疫水平研究等。

其次，本发明提供的的复制型人4型腺病毒载体单质粒系统或由该载体系统制备的携带外源目的基因的重组腺病毒还可以应用于制备重组疫苗、基因治疗试剂盒或溶瘤病毒药物。基于本发明的重组腺病毒系统，结合本领域中相关的技术手段，可以制备相应的重组人4型腺病毒，用于基因治疗或重组疫苗研究。

利用本发明提供的的复制型人4型腺病毒载体单质粒系统制备的重组人4型腺病毒载体疫苗，为复制型腺病毒载体疫苗，其基因组中携带目的病原体的相应抗原。使用此类型疫苗免疫人或者其它哺乳动物后，腺病毒感染受体动物并在动物细胞中表达相应抗原，刺激机体产生针对该抗原的特异性抗体，获得免疫效果。所述重组疫苗优选为口服疫苗。

在基因治疗试剂盒的应用中，可以将具有治疗效果的外源基因嵌入本发明提供的人4型腺病毒载体系统，将重组病毒作为递送外源基因的工具，可以高效地将外源基因递送至机体，在相应部位高表达治疗性蛋白。

在肿瘤治疗药物制备的应用中，本发明可以提供一种基于人复制型人4型腺病毒载体的溶溜病毒。由于病毒可以复制和增殖，将修饰后的重组病毒注射肿瘤内部，借助病毒的增殖和裂解细胞的能力，或者病毒分泌抗肿瘤蛋白，杀伤恶性肿瘤。如，将抑癌基因p53嵌入重组病毒可以用于肿瘤治疗。

在本研究中，我们以一种长期作为活病毒疫苗使用的人4型腺病毒为模板，构建了一种可用于包装重组人4型腺病毒的载体系统。

本研究构建的人4型腺病毒载体系统为复制型腺病毒载体系统。常规的5型腺病毒载体系统中，腺病毒E1区和E3区缺失。其中E1区缺失使得病毒失去复制能力，在生产中一般使用回补了5型腺病毒E1区基因的293细胞扩大培养。本研究中我们采用了不同的构建策略，制备了复制型重组人4型腺病毒载体系统。由于腺病毒包装容量上限约为全基因组的5％-10％，即腺病毒全基因组最高仅能容许2000bp左右外源片段的嵌入，因此我们敲除腺病毒E3区使得病毒载体包装容量上限扩大至6000bp以上。考虑到人4型腺病毒活病毒疫苗从上世纪70年代开始即在美国长期使用，疫苗表现出较好的安全性和耐受性，因此我们选择保留腺病毒E1区，使其仍具有复制能力，以增强重组病毒外源基因表达水平。

本研究构建的人4型腺病毒载体系统与其它人4型腺病毒载体的骨架设计存在显著差异。国际上已有复制型人4型腺病毒载体的相关研究，仍处于初期研究阶段。与本研究构建的人4型腺病毒载体系统不同的是，已有的复制型人4型腺病毒载体仅部分缺失了腺病毒E3区，并在E3缺失位点嵌入抗原表达框。而在本研究中，腺病毒E3区完全缺失，外源基因嵌入在腺病毒基因组包装信号和E1区之间(E1上游序列)。经细胞水平和动物水平验证，在E1上游序列嵌入抗原表达框会显著提高病毒载体的外源基因表达水平。

另外，本研究构建的人4型腺病毒载体系统为单质粒载体系统。一般腺病毒载体多借鉴5型腺病毒载体系统的构建方式，主要包括Adeasy和Admax系统，二者均为双质粒重组病毒包装系统。在Adeasy系统中，抗原首先嵌入穿梭质粒中，穿梭质粒的抗原嵌入位点两侧含有与骨架质粒重组的同源臂，利用穿梭质粒和骨架质粒在BJ5183细菌中的同源重组，可以筛选得到用于包装病毒的重组质粒，随后将重组质粒线性化后导入293细胞以包装重组病毒。该系统中，病毒包装效率较高，但重组质粒的获取需要依赖细菌内同源重组筛选，可能出现非特异重组。而在Admax系统中，抗原首先嵌入较小的中间质粒中，中间质粒的抗原嵌入位点两侧分别为5型腺病毒E1区的上游末端和E1区下游基因，并在外侧含有Loxp重组位点。将中间质粒与病毒骨架质粒导入293细胞后，利用位点特异性重组完成含有抗原基因的末端片段和基因组骨架的拼接，同时包装重组病毒。该系统中，不需要额外获得含有目的基因的全长重组质粒，骨架和片段的重组以及病毒的包装一步完成，但是病毒包装的效率较低。本研究所构建的人4型腺病毒载体系统，仅包含一个骨架质粒，外源基因直接通过体外一步重组嵌入骨架质粒E1区上游的外源基因嵌入位点，得到用于包装的全长重组质粒。该过程，不需要细菌内或细胞内的同源重组，避免了非特异重组的出现，速度快、效率高，成本低，可以批量制备，具有显著的应用优势。

综上所述，本载体系统为一种用于包装复制型人4型腺病毒载体重组病毒的单质粒载体系统，该系统完全缺失腺病毒E3区且将外源基因嵌入在E1区上游和包装信号之间。使用该载体系统可以快速高效、低成本、批量制备复制型人4型腺病毒载体重组病毒。使用该系统包装的重组病毒可以应用于人4型腺病毒流行病监测、人4型腺病毒疫苗评价、人4型腺病毒载体重组疫苗或重组药物开发等领域。

附图说明

图1为人4型腺病毒骨架质粒构建流程图。使用NdeI线性化人4型腺病毒末端重组质粒(Ad4-re)，与人4型腺病毒基因组共同电转化至BJ5183电转感受态细胞。线性化末端重组质粒的左侧同源臂(LH)与腺病毒基因组左侧末端序列同源重组，同理右侧同源臂(RH)与腺病毒基因组右侧末端序列同源重组，重组后两个线性片段组合为闭合环状质粒，利用卡那霉素筛选成功实现同源重组的闭合环状腺病毒骨架质粒PAd4-V0。

图2为人4型腺病毒末端重组质粒示意图。以pET28a质粒为模板，扩增含有卡那霉素抗性基因(Kana R)和pBR322复制原点(pBR322Ori)的载体区。以Ad4基因组为模板，扩增基因组两侧末端约3000bp的DNA序列分别作为左侧同源臂(Left homology)和右侧同源臂(Right homology)。将上述三个片段依次拼接，载体区与两同源臂末端序列通过PacI酶切位点连接，两同源臂之间通过NdeI酶切位点连接。

图3为人4型腺病毒E3同源重组质粒示意图。以人4型腺病毒基因组为模板分别扩增E3区上游和下游各3000bp左右序列作为上游同源臂(Ad4-E3-up)和下游同源臂(Ad4-E3-down)；以pET28a为模板扩增含有卡纳抗性基因(Kana)和复制子的载体区序列；以pMD-18T质粒为模板扩增氨苄抗性基因(AMP)。将上述片段按照“E3上游同源臂-氨苄抗性基因-E3右侧同源臂”的顺序拼接，并将拼接的片段导入含卡那霉素抗性基因的克隆载体。同源臂与氨苄抗性基因相交的位置引入SpeI酶切位点，同源臂与载体区相交的位置引入PacI酶切位点，制备E3区同源重组质粒，用于完全敲除人4型腺病毒载体的E3区。

图4为E3缺失的人4型腺病毒骨架质粒构建示意图。将腺病毒骨架质粒PAd4-V0转化至BJ5183细菌，并将该细菌制备成感受态细菌。使用PacI线性化E3区同源重组质粒PAd4-dE3-Re，将该片段转化至含有腺病毒骨架质粒PAd4-V0的感受态细菌中。线性化E3同源重组质粒中，氨苄抗性基因上下游分别为腺病毒基因组E3区上、下游片段，该片段与骨架质粒PAd4-V0的E3区上、下游序列同源重组后，腺病毒骨架质粒E3区被氨苄抗性基因替换，重组后的转化子获得氨苄抗性，利用氨苄青霉素抗生素筛选符合要求的目的转化子PAd4-dE3-AMP。随后使用SpeI限制性内切酶删除氨苄青霉素抗性基因。将酶切后的片段回收后，加入T4DNA连接酶使片段进行自连，并转化至TOP 10感受态细菌中，利用卡那霉素筛选E3缺失的人4型腺病毒骨架质粒PAd4-dE3。

图5为人4型腺病毒骨架质粒PAd4-dE3-E1构建示意图。将腺病毒骨架质粒PAd4-dE3使用PmeI(2692bp，单酶切位点)和NdeI(5454bp，单酶切位点)酶切后，使用重叠PCR扩增回补片段。将2692bp处A碱基突变为G碱基删除原PmeI位点，在包装信号和E1区之间空余序列2939bp处加入碱基AAAC，以引入PmeI酶切位点，新引入的PmeI酶切位点即为用于外源基因表达框嵌入的克隆位点。使用Gibson体外一步重组法(NEB公司)将PCR扩增的回补片段与双酶切后的骨架质粒PAd4-dE3拼接，转化TOP10感受态细胞，挑取阳性转化子，即可得到用于在E1区嵌入抗原表达框的骨架质粒PAd4-dE3-E1。

图6为人4型腺病毒骨架质粒PAd4-dE3-E1示意图。使用PmeI线性化骨架质粒，即可使用Gibson体外重组法将外源基因表达框与骨架质粒拼接为重组质粒，用于人4型腺病毒载体重组病毒的包装。

图7为人4型腺病毒骨架质粒PAd4-dE3-E1RC示意图。使用SwaI线性化骨架质粒，即可使用Gibson体外重组法将外源基因与骨架质粒拼接为重组质粒，用于人4型腺病毒载体重组病毒的包装。重组病毒中由mCMV启动子起始外源基因的表达。

图8为人4型腺病毒骨架质粒PAd4-dE3-E1LC示意图。使用SwaI线性化骨架质粒，即可使用Gibson体外重组法将外源基因与骨架质粒拼接为重组质粒，用于人4型腺病毒载体重组病毒的包装。重组病毒中由mCMV启动子起始外源基因的表达。

图9为人4型腺病毒重组病毒的包装与验证。将上述人4型腺病毒载体系统构建的重组质粒，使用PacI线性化后，转染HEK293细胞，维持培养3-5天即可看到显著的细胞病变。经验证，外源基因(本例中为萤火虫荧光素酶基因)可稳定表达，重组病毒经透射电镜观察结构正常。

图10为使用不同嵌入方式的人4型腺病毒重组荧光素酶病毒感染HEK293和A549细胞后的外源基因表达情况。使用4种重组病毒以感染复数为1的比例分别感染HEK293和A549细胞，感染24小时后，移除上清，裂解细胞并检测裂解液中荧光素酶表达水平。结果显示，荧光素酶表达框在E1区正向嵌入(L3)和在E1区反向嵌入(L4)的重组病毒分别在HEK293和A549细胞中表达水平显著高于在E3区正向和反向嵌入(L1和L2)的重组病毒。

图11为使用不同嵌入方式的人4型腺病毒重组荧光素酶病毒感染BALB/c小鼠后外源基因表达情况。使用4种不同嵌入方式的人4型腺病毒载体重组荧光素酶病毒，分别以每只10⁷IFU剂量感染BALB/c小鼠，利用活体成像观察给药1、3、7、14、28天后荧光素酶表达水平(A)，同时比较各时间点各组平均荧光密度强弱差异(B)。结果显示，荧光素酶表达框在E1区正向嵌入(L3)和在E1区反向嵌入(L4)的重组病毒感染后，荧光检测强度显著高于在E3区正向和反向嵌入(L1和L2)的重组病毒。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

除非另外指明，下述实施例中所用的出发质粒、酶、相关试剂均可从市售公司购买得到，所用的引物通过合成公司合成。

实施例1：可在E1区嵌入抗原表达框的骨架质粒(PAd4-dE3-E1)的构建

1.人4型腺病毒末端末端重组质粒(Ad4-re)的构建

该质粒用于同腺病毒基因组同源重组制备腺病毒骨架质粒，构建方法如下：从Ad4-RI67病毒株基因组两侧末端扩增同源臂。其中，左侧末端同源臂扩增引物对为Ad4-left-F：GGAACATAATGGTGCTTAATTAACTATCTATATAATATACC和Ad4-Left(3500)-R：CATATGGTCAGATAAGGGCTGAAT，扩增后序列长度约为3500bp；右侧末端同源臂扩增引物对为Ad4-Right(3300)-F：TTATCTGACCATATGACTCCATACACCAATGCTG和Ad4-right-R：GCGCACATTAATTAACTATCTATATAATATACC，扩增后序列长度约为3300bp。从pET28a载体质粒中扩增含PBR322复制原点和卡那霉素抗性基因的载体区，扩增引物对为pET28a-F：TTAATTAAGCACCATTATGTTCCGGATCTG和pET28a-R：TTAATTAATGTGCGCGGAACCCCTATT，扩增后序列长度约为2500bp。上述扩增后的片段回收后，使用Gibson重组体系(NEB公司)拼接，具体方法为：纯化后的载体片段50ng，纯化后的多个用于整合的片段约100ng(与载体的摩尔比控制为2:1)，Gibson Mix组装液10μl，以无菌水补齐20μl。50℃孵育15min，冰浴3min左右。取2μl重组体系转化至50μl TOP10感受态细胞，孵育40～60min，涂布平板，过夜培养。拼接完成后，同源臂之间相交的位置将引入NdeI酶切位点，同源臂与载体区相交的位置将引入PacI酶切位点，得到人4型腺病毒末端重组质粒PAd4-recomber(Ad4-re)，质粒图谱见图2。

2.同源重组制备腺病毒骨架质粒(PAd4-V0)

该质粒为包含人4型腺病毒(HAdV-4)全基因组的腺病毒骨架质粒，构建方法如下：使用NdeI线性化HAdV-4末端重组质粒，与HAdV-4病毒基因组共同电转化至BJ5183电转感受态细胞中，电击条件为2.5KV、25μF、200Ω、2mm。线性化HAdV-4末端重组质粒中含有卡那霉素抗性基因，该片段末端与病毒基因组末端重组后，形成闭合环状腺病毒骨架质粒，利用卡那霉素抗生素筛选符合要求的目的转化子PAd4-V0，质粒结构示意图及构建流程图见图1。

3.E3同源重组质粒(PAd4-dE3-Re)的制备

该质粒用于同腺病毒骨架质粒同源重组完全缺失腺病毒基因组的E3区，构建方法如下：分别从Ad4-RI67基因组E3区两侧上、下游毗邻区扩增同源臂，从pMD-18T载体质粒中扩增氨苄抗性基因，从pET28a质粒中扩增载体片段。E3区上游同源臂的扩增引物对为Ad4-de E3-up-F：GCGCACATTAATTAATGCACTACATCTTCAGGCACGG和Ad4-de E3-up-R：ACTAGTTGTCGAAGCCGAGCTAGGTCAG；E3区下游同源臂的扩增引物对为Ad4-de E3-down-F：ACTAGTTCAAGACCCTATGCGGCCT和Ad4-de E3-down-R：CGTGACTTTAATTAACGGAAACAGCTCCATCATG；氨苄抗性基因的扩增引物对为Ad4-de E3-AMP-F：GCTTCGACAACTAGTGGATCTTCACCTAGATCC和Ad4-de E3-AMP-R：GGGTCTTGAACTAGTGGAAATGTGCGCGGAAC；载体片段的扩增引物对为Ad4-deE3-V-F：TTAATTAAAGTCACGTAGCGATAGCGGA和Ad4-de E3-V-R：TTAATTAATGTGCGCGGAACCCCTATT。利用Gibson体外一步重组法将上述4个片段依次拼接(具体方法见实施例1-1)，同源臂与氨苄抗性基因相交的位置将引入SpeI酶切位点，同源臂与载体区相交的位置将引入PacI酶切位点，重组质粒结构示意图见图3。

4.E3完全缺失的人4型腺病毒骨架质粒(PAd4-dE3)的制备

构建方法如下：将腺病毒骨架质粒PAd4-V0转化至BJ5183细菌，并将该细菌制备成感受态细菌。使用PacI线性化E3同源重组质粒PAd4-dE3-Re，将该片段转化至含有腺病毒骨架质粒PAd4-V0的感受态细菌中。线性化E3同源重组质粒中含有氨苄抗性基因，该片段末端与病毒基因组E3区两侧同源重组后，腺病毒骨架质粒E3区被氨苄抗性基因替换，重组后的转化子获得氨苄抗性，利用氨苄青霉素抗生素筛选符合要求的目的转化子PAd4-dE3-AMP。使用SpeI限制性内切酶删除PAd4-dE3-AMP中氨苄青霉素抗性基因。将酶切后的片段回收后，加入T4DNA连接酶使片段进行自连，并转化至TOP 10感受态细菌中，利用卡那霉素筛选阳性克隆PAd4-dE3，重组质粒结构示意图及构建流程图见图4。

5.可在E1区嵌入抗原表达框的骨架质粒(PAd4-dE3-E1)的构建。

在E3缺失的人4型腺病毒骨架质粒的E1区上游引入PmeI单克隆位点，构建方法为：将腺病毒骨架质粒PAd4-dE3使用PmeI和NdeI酶切后，使用重叠PCR扩增回补片段。在回补片段制备过程中，将PAd4-dE3质粒2692bp处(对应Ad4-RI67基因组204bp处，参考序列GenBankNo.AY594253)A碱基突变为G碱基以删除原PmeI位点，在包装信号和E1区之间空余序列2939bp-2940bp(对应Ad4-RI67基因组397bp-471bp，参考序列GenBank No.AY594253)之间加入碱基AAAC以引入PmeI酶切位点，突变后的E1前序列如SEQ ID NO.1所示，其中第447-454bp为引入的PmeI酶切位点序列gtttaaac。重叠PCR需使用如下两引物对，用于扩增上游片段的引物对为：Ad4-E1-dPme1-1F：AACGAGGTGTGGTTTG，和Ad4-E1-dPme1-1R：CAGCTGACACCTACGTAAGTTTAAACACCGGACTTTGACACCG，下游片段引物对为Ad4-E1-dPme1-2F：CGGTGTCAAAGTCCGGTGTTTAAACTTACGTAGGTGTCAGCTG和Ad4-GP-E1-dPme1-2R:ACGGCGGCCAGCATATGACTG。使用Gibson体外一步重组法将PCR扩增的回补片段与双酶切后的骨架质粒PAd4-dE3拼接，转化TOP10感受态细胞，利用卡那霉素筛选阳性克隆PAd4-dE3-E1，重组质粒在E1处的突变情况见图5，重组质粒结构示意图见图6。PCR扩增合适的目的基因表达框片段，正向和反向引物末端分别添加15bp的同源区(正向引物末端同源区序列(5’→3’)CAAAGTCCGGTGTTT，反向引物末端同源区序列(5’→3’)CACCTACGTAAGTTT)，利用Gibson体外重组(具体方法参考实施例1-1，与之区别的是载体片段的加入量从50ng调整为400ng左右)，可与PmeI线性化后的PAd4-dE3-E1质粒直接拼接，制备用于包装重组病毒的人4型腺病毒载体重组质粒。

实施例2：用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统PAd4-dE3-E1RC和PAd4-dE3-E1LC的制备

根据实施例1的步骤1-4获得E3完全缺失的人4型腺病毒骨架质粒(PAd4-dE3)，然后从PDC316载体质粒中扩增mCMV启动子和SV40 PolyA序列作为腺病毒载体中表达外源基因的控制序列，在启动子和多聚腺苷酸尾之间引入SwaI作为腺病毒载体的单克隆位点。利用Gibson体外一步重组法，将控制序列分别按照正向(启动子在上游)和反向(启动子在下游)嵌入PAd4-dE3-E1质粒的PmeI位点，分别得到重组质粒PAd4-dE3-E1RC(图7)和PAd4-dE3-E1LC(图8)。用于正向嵌入控制序列的引物对为Ad4-E1R-F：CAAAGTCCGGTGTTTAAACGTTCCGGGTCAAAGTTGG和Ad4-E1R-R：CACCTACGTAAGTTTAAACTGGATCTTCGATGCTAGACG；用于反向嵌入控制序列的引物对为Ad4-E1L-F：CAAAGTCCGGTGTTTAAACTGGATCTTCGATGCTAGACG和Ad4-E1L-R：CACCTACGTAAGTTTAAACGTTCCGGGTCAAAGTTGG。PCR扩增合适的目的基因片段，正向和反向引物末端分别添加15bp的同源区(上游引物末端同源区序列(5’→3’)：TGAGCTCGTCGATTT，下游引物末端同源区序列(5’→3’)：GCTCGAAGTCGATTT)，利用Gibson体外重组(具体方法参考实施例1-1，与之区别的是载体片段的加入量从50ng调整为400ng左右)，可与SwaI线性化后的PAd4-dE3-E1RC或者PAd4-dE3-E1LC质粒拼接，制备用于包装重组病毒的人4型腺病毒载体重组质粒。PAd4-dE3-E1RC质粒中PmeI酶切位点之间的序列如SEQID NO.2所示，其中第1-8和759-766bp引入的PmeI酶切位点序列gtttaaac，第586-593为引入的SwaI酶切位点序列atttaaat，PAd4-dE3-E1LC质粒中PmeI酶切位点之间的序列如SEQID NO.3所示，其中第1-8和759-766bp引入的PmeI酶切位点序列gtttaaac，第174-181为引入的SwaI酶切位点序列atttaaat。

实施例3：人4型腺病毒载体重组萤火虫荧光素酶病毒的包装

根据实施例1或实施例2所示方式，构建人4型腺病毒载体重组萤火虫荧光素酶质粒后，使用PacI限制性内切酶线性化人4型腺病毒载体重组质粒，选择HEK293细胞为包装细胞系，使用Turbofect转染试剂将线性化片段转染HEK293细胞中，维持培养3～5天至细胞病变。病变主要表现为细胞变圆，通透性增加，病变严重时出现大范围细胞漂浮(图9A)。冻融病变后的细胞培养液，连续传代至细胞持续病变，即可获得稳定传代的重组病毒。我们完成了人4型腺病毒载体重组萤火虫荧光素酶病毒的包装，使用该重组病毒感染HEK293细胞，发现荧光素酶可持续表达(图9B)。利用电子显微镜检测重组病毒颗粒结构，病毒颗粒大小在80-90nm，为典型的球状结构，与预期结果一致(图9C)。说明该系统能够获得结构正常且稳定表达外源基因的人4型腺病毒载体重组病毒。

实施例4：E1区嵌入抗原表达框的重组病毒在细胞中的外源基因表达水平显著高于在E3区嵌入抗原表达框的重组病毒。

在E3缺失位点和E1上游位点按照正向和反向分别嵌入萤火虫荧光素酶抗原表达框，制备4种不同嵌入方式的人4型腺病毒载体重组萤火虫荧光素酶病毒。使用4种病毒以感染复数为1分别感染HEK293和A549细胞。感染24小时后，移除上清，检测细胞裂解物中的荧光素酶活性水平，结果见图10。其中，在E3区正向和反向嵌入的重组病毒分别标记为L1和L2，在E1区上游正向和反向嵌入的重组病毒分别标记为L3和L4。不同方式嵌入外源基因表达框会影响重组病毒的荧光素酶表达水平。在HEK293细胞中，重组病毒L3(E1上游正向嵌入基因表达框)荧光素酶表达水平最高(t检验，P<0.01)；在A549细胞中，重组病毒L4(E1上游反向嵌入基因表达框)荧光素酶表达水平最高(t检验，P<0.001)。

实施例5：E1区嵌入抗原表达框的重组病毒感染小鼠后外源基因表达水平显著高于在E3区嵌入抗原表达框的重组病毒。

在细胞内表达水平的检测中，我们发现E1上游嵌入的重组病毒表达水平较高，但在不同细胞系中表现不一致。为了进一步了解不同嵌入方式重组病毒感染正常机体的外源基因表达水平差异，我们使用4种不同嵌入方式的重组荧光素酶病毒，以10⁷IFU/只剂量，经单侧后肢肌肉注射感染BALB/c小鼠。于感染后1，3，7，14，28天分别进行活体成像(重组病毒感染后，病毒基因组中的荧光素酶在宿主细胞中表达。向小鼠腹腔注射萤火虫荧光素酶底物，该底物在荧光素酶作用下产生发光物质，大量表达荧光素酶的组织或者器官可被活体成像仪镜头捕捉到荧光信号)，考察重组病毒免疫后的体内分布和感染水平，结果见图11。给药1天后，重组病毒表达水平最强，且不同嵌入方式重组病毒的表达水平存在显著差异。重组病毒L3(E1上游正向嵌入基因表达框)和L4(E1上游反向嵌入基因表达框)感染后，小鼠体内荧光素酶活性显著高于L1(E3区正向嵌入基因表达框)和L2(E3区反向嵌入基因表达框)。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 475

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctatctatat aatatacctt attttttttg tgtgagttaa tatgcaaata aggcgtgaaa 60

atttggggat ggggcgcgct gattggctgt gacagcggcg ttcgttaggg gcggggcagg 120

tgacgttttg atgacgcgac tatgaggagg agttagtttg caagttctgg tggggaaaag 180

tgacgtcaaa cgaggtgtgg tttgaacacg gaaatactca attttcccac gctgtctaac 240

aggaaatgag gtgtttttgg gcggatgcaa gtgaaaacgg accattttcg cgcgaaaact 300

gaatgaggaa gtgaaatctg agtaatttag tgtttatgac agggaggagt atttgccgag 360

ggccgagtag actttgaccg tttacgtggg ggtttcgatt accgtgtttt tcacctaaag 420

ttccgcgtac ggtgtcaaag tccggtgttt aaacttacgt aggtgtcagc tgatc 475

<210> 2

<211> 766

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtttaaacgt tccgggtcaa agttggcgtt ttattattat agtcagctct agagatatac 60

tgagtcatta gggactttcc aatgggtttt gcccagtaca taaggtcaat aggggtgaat 120

caacaggaaa gtcccattgg agccaagtac actgagtcaa tagggacttt ccattgggtt 180

ttgcccagta caaaaggtca atagggggtg agtcaatggg tttttcccat tattggcacg 240

tacataaggt caataggggt gagtcattgg gtttttccag ccatttagtt aaaacgccat 300

gtactttccc accattgacg tcaatgggct attgaaacta atgcaacgtg acctttaaac 360

ggtactttcc catagctgat taatgggaaa gtaccgttct cgagccaata cacgtcaatg 420

ggaagtgaaa gggcagccaa aacgtaacac cgccccggtt ttcccctgga aattccatat 480

tggcacgcat tctattggct gagctgcgtt ctacgtgggt ataagaggcg cgaccagcgt 540

cggtaccgtc gcagtcttcg gtctgaccac cgtagaacgc agatcattta aatcgacttc 600

gagcaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt 660

cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt 720

atcttatcat gtctggatcg tctagcatcg aagatccagt ttaaac 766

<210> 3

<211> 766

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtttaaactg gatcttcgat gctagacgat ccagacatga taagatacat tgatgagttt 60

ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct 120

attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttgctcgaag tcgatttaaa 180

tgatctgcgt tctacggtgg tcagaccgaa gactgcgacg gtaccgacgc tggtcgcgcc 240

tcttataccc acgtagaacg cagctcagcc aatagaatgc gtgccaatat ggaatttcca 300

ggggaaaacc ggggcggtgt tacgttttgg ctgccctttc acttcccatt gacgtgtatt 360

ggctcgagaa cggtactttc ccattaatca gctatgggaa agtaccgttt aaaggtcacg 420

ttgcattagt ttcaatagcc cattgacgtc aatggtggga aagtacatgg cgttttaact 480

aaatggctgg aaaaacccaa tgactcaccc ctattgacct tatgtacgtg ccaataatgg 540

gaaaaaccca ttgactcacc ccctattgac cttttgtact gggcaaaacc caatggaaag 600

tccctattga ctcagtgtac ttggctccaa tgggactttc ctgttgattc acccctattg 660

accttatgta ctgggcaaaa cccattggaa agtccctaat gactcagtat atctctagag 720

ctgactataa taataaaacg ccaactttga cccggaacgt ttaaac 766

Claims (3)

1.一种用于包装重组人4型腺病毒的单质粒载体系统，其特征在于，所述载体系统含有E3区缺失的人4型腺病毒基因组，外源基因嵌入位点位于人4型腺病毒的包装信号之后、E1区之前，所述载体系统中人4型腺病毒E1区之前的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述载体系统在外源基因嵌入位点不含有控制表达元件，携带外源基因表达框的DNA片段直接克隆至所述载体系统的Pme I限制性酶切位点；或者，

在所述载体系统的外源基因嵌入位点正向嵌入控制外源基因表达的控制元件，所述控制元件为包含mCMV启动子和SV40多聚腺苷酸尾终止序列的DNA片段，所述控制元件两端为Pme I位点，控制元件中的外源基因克隆位点为Swa I，外源基因DNA片段直接克隆至所述载体系统的Swa I限制性酶切位点；或者，

在所述载体系统的外源基因嵌入位点反向嵌入控制外源基因表达的控制元件，所述控制元件为包含mCMV启动子和SV40多聚腺苷酸尾终止序列的DNA片段，所述控制元件两端为Pme I位点，所述控制元件中的外源基因克隆位点为Swa I，外源基因DNA片段直接克隆至所述载体系统的Swa

限制性酶切位点。

2.一种应用权利要求1所述的单质粒载体系统包装重组人4型腺病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

（1）使用PacI限制性内切酶线性化人4型腺病毒载体重组质粒；

（2）将线性化片段转染HEK293细胞中，培养至细胞病变；

（3）冻融病变后的细胞培养液，连续传代至细胞持续病变；

（4）获得稳定传代的重组人4型腺病毒。

3.权利要求1所述的单质粒载体系统在诊断试剂盒、疫苗、基因治疗试剂盒和/或肿瘤治疗药物制备的应用。

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