KR20220078650A - 이중 바이러스 및 이중 종양용해 바이러스 및 치료 방법 - Google Patents

이중 바이러스 및 이중 종양용해 바이러스 및 치료 방법 Download PDF

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KR20220078650A
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에드워드 엠. 케네디
로레나 레르너
크리스토프 쿠에바
크레이그 에이. 스트래스디
제니퍼 에스. 리
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온코루스, 인크.
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Abstract

본 개시는 일차 바이러스 및 이차 바이러스를 생산할 수 있는 이중 바이러스, 및 일차 종양용해 바이러스 및 이차 종양용해 바이러스를 생산할 수 있는 이중 종양용해 바이러스를 제공한다.

Description

이중 바이러스 및 이중 종양용해 바이러스 및 치료 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 10월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 62/913,514에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되며, 본 명세서에 참조로서 통합된다. 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 포맷 사본: 파일명: ONCR-013_01WO_SeqList_ST25.txt, 기록된 날짜: 2020년 10월 9일, 파일 크기 271 kb.
종양용해 바이러스(oncolytic virus)는 암 세포를 우선적으로 감염시키고 파괴하도록 설계되었으며(MacLean 등, J. Gen. Virol. 72:630-639 (1991); Robertson 등, J. Gen. Virol. 73:967-970 (1992); Brown 등, J. Gen. Virol. 75:3767-3686 (1994); Chou 등, Science 250:1262-1265 (1990)) 암 치료에 대한 다수의 전임상 및 임상 연구에서 사용되었다. 직접 종양 세포 용해는 세포 사멸을 초래할 뿐만 아니라, 국소 항원 제시 세포에 의해 흡수되고 제시되는 종양 항원에 대한 적응 면역 반응의 생성도 초래한다. 그러나, 강력한 항-종양 면역 반응은 바이러스 균주의 낮은 효능뿐만 아니라 바이러스 자체를 표적으로 하는 면역 반응의 잠재적 재유도(redirection)에 의해 제한된다.
본 개시는 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 일차 종양용해 바이러스를 제공한다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 및 이차 종양용해 바이러스는 복제 능력이 있다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 및/또는 이차 종양용해 바이러스는 복제 불능이다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스는 이차 종양용해 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성한다.
본 개시는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 일차 바이러스를 제공한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 및 이차 바이러스는 복제 능력이 있다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 및/또는 이차 바이러스는 복제 불능이다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 이차 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성한다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스이다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스이다. 일부 실시예에서, dsDNA 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV) 또는 아데노바이러스이다. 일부 실시예에서, dsDNA 바이러스는 폭스바이러스과(Poxviridae) 계열의 바이러스이다. 일부 실시예에서, dsDNA 바이러스는 전염성 연속종 바이러스(molluscum contagiosum virus), 점액종 바이러스(myxoma virus), 우두 바이러스(vaccina virus), 원숭이폭스 바이러스(monkeypox virus), 또는 야타폭스 바이러스(yatapoxvirus)이다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 RNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, RNA 바이러스는 파라믹소바이러스(paramyxovirus) 또는 랍도바이러스(rhabdovirus)이다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스(ambi-sense) ssRNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스 ssRNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 음성-센스 ssRNA 바이러스는 랍도바이러스과(Rhabdoviridae) 계열, 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열, 또는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 계열의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 랍도바이러스과 계열의 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV) 또는 마라바 바이러스(maraba virus)이다. 일부 실시예에서, 파라믹소바이러스과 계열의 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스, 센다이 바이러스, 또는 홍역 바이러스이다. 일부 실시예에서, 오르토믹소바이러스과 계열의 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 일부 실시예에서, 양성-센스 ssRNA 바이러스는 엔테로바이러스이다. 일부 실시예에서, 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus, SVV), 콕사키바이러스(coxsackievirus), 또는 에코바이러스이다. 일부 실시예에서, 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 A(CVA) 또는 콕사키바이러스 B(CVB)이고, 일부 실시예에서, 콕사키바이러스는 CVA9, CVA21 또는 CVB3이다. 일부 실시예에서, 양성-센스 ssRNA 바이러스는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV)이다. 일부 실시예에서, 양성-센스 ssRNA 바이러스는 멘고바이러스(Mengovirus)이다. 일부 실시예에서, 양성-센스 ssRNA 바이러스는 토가바이러스과(Togaviridae) 계열의 바이러스이다. 일부 실시예에서, 토가바이러스과 계열의 바이러스는 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스이다. 일부 실시예에서, 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스는 VEEV, WEEV, EEV, 신비스(Sindbis) 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 또는 마야로 바이러스(Mayaro virus)이다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 및/또는 이차 종양용해 바이러스는 키메라 바이러스이다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 및/또는 이차 종양용해 바이러스는 위형화된 바이러스(pseudotyped virus)이다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스는 위형화된 바이러스이며, 일차 종양용해 바이러스는 이차 종양용해 바이러스를 위한 코딩 영역 외부에 이차 종양용해 바이러스의 캡시드 단백질 또는 외피 단백질을 위한 코딩 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스는 알파바이러스이다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스는 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스이다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스 및/또는 이차 바이러스는 키메라 바이러스이다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 및/또는 이차 바이러스는 위형화된 바이러스이다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스는 위형화된 바이러스이며, 일차 바이러스는 이차 바이러스를 위한 코딩 영역 외부에 이차 바이러스의 캡시드 단백질 또는 외피 단백질을 위한 코딩 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스는 알파바이러스이다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스는 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스이다.
일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 스테로이드-유도성 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, MX-1 프로모터, GENESWITCHTM 하이브리드 프로모터, 큐메이트-반응성(cumate-responsive) 프로모터, 및 테트라사이클린-유도성 프로모터로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 재조합효소 인식 부위가 측부에 위치한 구성적 프로모터를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 개시의 일차 종양용해 바이러스는 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 본 개시의 일차 바이러스는 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 구성적 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, Moloney 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 루스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 조기 성장 반응 1(EGR1) 프로모터, 페리틴 H(FerH) 프로모터, 페리틴 L(FerL) 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, 진핵 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1) 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터(UBC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 및 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-의존성 프로모터이고, 펩티드는 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(rtTA) 펩티드이다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-의존성 프로모터이고, 펩티드는 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA) 펩티드이다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스는 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제2 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 RNAi 분자는 이차 종양용해 바이러스의 게놈 내 표적 서열에 결합하고 이차 종양용해 바이러스의 복제를 억제한다. 일부 실시예에서, RNAi 분자는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 AmiRNA이다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스는 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제2 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 RNAi 분자는 이차 바이러스의 게놈 내 표적 서열에 결합하고 이차 바이러스의 복제를 억제한다. 일부 실시예에서, RNAi 분자는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 AmiRNA이다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소 반응성 카세트를 포함하고, 재조합효소 반응성 카세트는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함한다.
일부 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소 반응성 카세트를 포함하고, 재조합효소 반응성 카세트는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함한다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 재조합효소 반응성 카세트는 재조합효소 반응성 절제 카세트(RREC)를 포함한다. 일부 실시예에서, RREC는 전사/번역 종결(STOP) 요소를 포함한다. 일부 실시예에서, 전사/번역 종결(STOP) 요소는 서열번호 854-856 중 어느 하나와 80% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 재조합효소 반응성 카세트는 재조합효소 반응성 역위 카세트(RRIC)를 포함한다. 일부 실시예에서, RRIC는 중앙 요소의 각 측면 상에 2개 이상의 직교 재조합효소 인식 부위를 포함한다. 일부 실시예에서, RRIC는 프로모터 또는 프로모터의 일부를 포함한다. 일부 실시예에서, RRIC는 코딩 영역 또는 코딩 영역의 일부를 포함하고, 코딩 영역은 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 바이러스 게놈을 암호화한다. 일부 실시예에서, RRIC는 하나 이상의 제어 요소(들)를 포함한다. 일부 실시예에서, 제어 요소(들)는 전사/번역 종결(STOP) 요소이다. 일부 실시예에서, 제어 요소(들)는 서열번호 854-856 중 어느 하나와 80% 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 실시예에서, 재조합효소 반응성 역위 카세트(RRIC)는 인트론의 일부를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 mRNA 스플라이싱을 통해 인트론을 제거한 후, 재조합효소 인식 부위 없이 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 성숙한 바이러스 게놈 전사물을 수득한다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 플립파아제(Flp) 또는 Cre 재조합효소(Cre)이다. 일부 실시예에서, 재조합효소의 코딩 영역은 인트론을 포함한다. 일부 실시예에서, 재조합효소 재조합효소의 발현 카세트는 하나 이상의 mRNA 탈안정화 요소를 포함한다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 추가 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 일부이고, 추가 폴리펩티드는 재조합효소의 활성 및/또는 세포 국소화를 조절한다. 일부 실시예에서, 재조합효소의 활성 및/또는 세포 국소화는 리간드 및/또는 소분자의 존재에 의해 조절된다. 일부 실시예에서, 추가 폴리펩티드는 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인을 포함한다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 재조합효소 인식 부위는 플립파아제 인식 표적(FRT) 부위이다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스는 조절성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 조절성 폴리펩티드는 하나 이상의 프로모터의 활성을 조절한다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스는 조절성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하고, 조절성 폴리펩티드는 하나 이상의 프로모터의 활성을 조절한다.
본 개시는 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 일차 종양용해 바이러스를 제공한다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 및 이차 종양용해 바이러스는 복제 능력이 있다. 일부 실시예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 제2 폴리뉴클레오티드는 제2 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스는 이차 종양용해 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성한다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스이다. 일부 실시예에서, dsDNA 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV), 아데노바이러스 또는 폭스바이러스과의 바이러스이고, 임의로 폭스바이러스과의 바이러스는 전염성 연속종 바이러스(molluscum contagiosum virus), 점액종 바이러스(myxoma virus), 우두 바이러스(vaccina virus), 원숭이폭스 바이러스(monkeypox virus), 또는 야타폭스 바이러스(yatapoxvirus)이다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스는 RNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, RNA 바이러스는 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스이다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스(ambi-sense) ssRNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 음성-센스 ssRNA 바이러스는 랍도바이러스과(Rhabdoviridae) 계열, 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열, 또는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 계열의 바이러스이고, 랍도바이러스과 계열의 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)이고; 선택적으로 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열의 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스, 센다이 바이러스, 또는 홍역 바이러스이고; 선택적으로 오르토믹소바이러스과 계열의 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 일부 실시예에서, 양성-센스 ssRNA 바이러스는 엔테로바이러스이고, 선택적으로 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus, SVV), 콕사키바이러스(coxsackievirus), 또는 에코바이러스이고, 선택적으로 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 A(CVA) 또는 콕사키바이러스 B(CVB3)이고, 선택적으로 콕사키바이러스는 CVA9, CVA21이다. 일부 실시예에서, 양성-센스 ssRNA 바이러스는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV) 또는 멘고바이러스이다. 일부 실시예에서, 양성-센스 ssRNA 바이러스는 토가바이러스과(Togaviridae) 계열의 바이러스이고, 선택적으로 토가바이러스과 계열의 바이러스는 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스이고, 선택적으로 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스는 VEEV, WEEV, EEV, 신비스(Sindbis) 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 또는 마야로 바이러스(Mayaro virus)이다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 및/또는 이차 종양용해 바이러스는 키메라 바이러스이다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 및/또는 이차 종양용해 바이러스는 위형화된 바이러스이다.
본 개시는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 일차 바이러스를 제공한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 및 이차 바이러스는 복제 능력이 있다. 일부 실시예에서, 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 제2 폴리뉴클레오티드는 제2 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 이차 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성한다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스이다. 일부 실시예에서, dsDNA 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV), 아데노바이러스 또는 폭스바이러스과의 바이러스이고, 임의로 폭스바이러스과의 바이러스는 전염성 연속종 바이러스(molluscum contagiosum virus), 점액종 바이러스(myxoma virus), 우두 바이러스(vaccina virus), 원숭이폭스 바이러스(monkeypox virus), 또는 야타폭스 바이러스(yatapoxvirus)이다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 RNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, RNA 바이러스는 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스이다.
일부 실시예에서, 이차 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스(ambi-sense) ssRNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 음성-센스 ssRNA 바이러스는 랍도바이러스과(Rhabdoviridae) 계열, 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열, 또는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 계열의 바이러스이고, 랍도바이러스과 계열의 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus, VSV)이고; 선택적으로 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열의 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스, 센다이 바이러스, 또는 홍역 바이러스이고; 선택적으로 오르토믹소바이러스과 계열의 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 일부 실시예에서, 양성-센스 ssRNA 바이러스는 엔테로바이러스이고, 선택적으로 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus, SVV), 콕사키바이러스(coxsackievirus), 또는 에코바이러스이고, 선택적으로 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 A(CVA) 또는 콕사키바이러스 B(CVB3)이고, 선택적으로 콕사키바이러스는 CVA9, CVA21이다. 일부 실시예에서, 양성-센스 ssRNA 바이러스는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV) 또는 멘고바이러스이다. 일부 실시예에서, 양성-센스 ssRNA 바이러스는 토가바이러스과(Togaviridae) 계열의 바이러스이고, 선택적으로 토가바이러스과 계열의 바이러스는 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스이고, 선택적으로 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스는 VEEV, WEEV, EEV, 신비스(Sindbis) 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 또는 마야로 바이러스(Mayaro virus)이다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스 및/또는 이차 바이러스는 키메라 바이러스이다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 및/또는 이차 바이러스는 위형화된 바이러스이다.
일부 실시예에서, 제1 및 제2 조절가능 프로모터는 스테로이드-유도성 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, MX-1 프로모터, GENESWITCHTM 하이브리드 프로모터, 큐메이트-반응성(cumate-responsive) 프로모터, 및 테트라사이클린-유도성 프로모터로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 본 개시의 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 제1 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 제1 펩티드 및 제2 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 제2 펩티드를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 구성적 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, Moloney 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 루스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 조기 성장 반응 1(EGR1) 프로모터, 페리틴 H(FerH) 프로모터, 페리틴 L(FerL) 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, 진핵 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1) 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터(UBC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 및 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 제1 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-유도성 프로모터이고, 제1 펩티드는 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(rtTA) 펩티드이다. 일부 실시예에서, 제2 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-억제성 프로모터이고, 제2 펩티드는 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA) 펩티드이다. 일부 실시예에서, 제1 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-억제성 프로모터이고, 제1 펩티드는 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA) 펩티드이다. 일부 실시예에서, 제2 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-유도성 프로모터이고, 여기서 제2 펩티드는 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA) 펩티드이다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 RNAi 분자는 이차 종양용해 바이러스의 게놈 내 표적 서열에 결합하고 이차 종양용해 바이러스의 복제를 억제한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 RNAi 분자는 이차 바이러스의 게놈 내 표적 서열에 결합하고 이차 바이러스의 복제를 억제한다. 일부 실시예에서, RNAi 분자는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 AmiRNA이다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제1 3' 리보자임-암호화 서열 및 제2 5' 리보자임 암호화 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 리보자임-암호화 서열은 해머헤드 리보자임 또는 간염 델타 바이러스 리보자임을 암호화한다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스의 게놈은 바이러스 게놈의 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스의 게놈은 바이러스 게놈의 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 및 이차 종양용해 바이러스는 각각 바이러스 게놈의 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포에서 하나 이상의 miRNA의 발현은 일차 및/또는 이차 종양용해 바이러스의 복제를 억제한다.
일부 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제1 3' 리보자임-암호화 서열 및 제2 5' 리보자임 암호화 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 리보자임-암호화 서열은 해머헤드 리보자임 또는 간염 델타 바이러스 리보자임을 암호화한다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스의 게놈은 바이러스 게놈의 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스의 게놈은 바이러스 게놈의 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 및 이차 바이러스는 각각 바이러스 게놈의 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 세포에서 하나 이상의 miRNA의 발현은 일차 및/또는 이차 바이러스의 복제를 억제한다.
일부 실시예에서, 본 개시의 일차 종양용해 바이러스는 적어도 하나의 외인성 페이로드 단백질(payload protein)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소, 사이토카인, 케모카인, 또는 항원-결합 분자이다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스의 발현은 외인성 제제에 의해 조절된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 펩티드, 호르몬, 또는 소분자이다.
일부 실시예에서, 본 개시의 일차 바이러스는 적어도 하나의 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소, 사이토카인, 케모카인, 또는 항원-결합 분자이다.
일부 실시예에서, 이차 바이러스의 발현은 외인성 제제에 의해 조절된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 펩티드, 호르몬, 또는 소분자이다.
본 개시는 본 개시의 일차 종양용해 바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 본 개시의 일차 바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시는 종양 세포의 집단을 사멸시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 일차 종양용해 바이러스 또는 이의 조성물을 종양 세포의 집단에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 종양 세포의 제1 하위 집단은 일차 종양용해 바이러스에 의해 감염되고 사멸된다. 일부 실시예에서, 종양 세포의 제2 하위 집단은 이차 종양용해 바이러스에 의해 감염되고 사멸된다. 일부 실시예에서, 종양 세포의 하위 집단은 일차 종양용해 바이러스 및 이차 종양용해 바이러스 모두에 의해 감염되고 사멸된다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 또는 이차 종양용해 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 일차 및 이차 종양용해 바이러스에 의해 사멸된다.
일부 실시예에서, 본 개시의 방법은 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 하나 이상의 외인성 제제는 이차 종양용해 바이러스의 생산을 조절한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 제제는 일차 종양용해 바이러스와 동시에 투여되고, 외인성 제제(들)의 존재는 이차 종양용해 바이러스의 생산을 억제한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 제제는 일차 종양용해 바이러스 후에 투여되고, 외인성 제제(들)의 존재는 이차 종양용해 바이러스의 생산을 유도한다. 일부 실시예에서, 외인성 제제(들)는 일차 종양용해 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 종양용해 바이러스는 검출가능하지 않다.
본 개시는 종양을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 일차 종양용해 바이러스 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 또는 이차 종양용해 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 일차 및 이차 종양용해 바이러스에 의해 사멸된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 또는 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 더 많은 종양 크기 감소를 초래한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 하나 이상의 종양 항원에 대한 보다 강한 면역 반응을 유도한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 일차 종양용해 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 종양용해 바이러스 단독 투여에 비해 대상체에서 이차 종양용해 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 종양 세포를 우선적으로/더 특이적으로 사멸시킨다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 일차 종양용해 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 종양용해 바이러스 단독 투여에 비해 대상체에서 이차 종양용해 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 연장된 종양 억제 기간을 초래한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 더 많은 세포 유형의 바이러스 감염을 가능하게 한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 이차 종양용해 바이러스의 생산을 조절한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 제제는 일차 종양용해 바이러스와 동시에 투여되고, 외인성 제제(들)의 존재는 이차 종양용해 바이러스의 생산을 억제한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 제제는 일차 종양용해 바이러스 후에 투여되고, 외인성 제제(들)의 존재는 이차 종양용해 바이러스의 생산을 유도한다. 일부 실시예에서, 외인성 제제(들)는 일차 종양용해 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 종양용해 바이러스는 검출가능하지 않다.
본 개시는 종양 세포의 집단을 사멸시키는 방법을 제공하고, 상기 방법은 본 개시의 일차 바이러스 또는 이의 조성물을 종양 세포의 집단에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 종양 세포의 제1 하위 집단은 일차 바이러스에 의해 감염되고 사멸된다. 일부 실시예에서, 상기 종양 세포의 제2 하위 집단은 일차 바이러스에 의해 감염되고 사멸된다. 일부 실시예에서, 상기 종양 세포의 하위 집단은 일차 바이러스 및 이차 바이러스 모두에 의해 감염되고 사멸된다 일부 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 이차 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 일차 및 이차 바이러스에 의해 사멸된다.
일부 실시예에서, 본 개시의 방법은 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 하나 이상의 외인성 제제는 이차 바이러스의 생산을 조절한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 제제는 일차 바이러스와 동시에 투여되고/되며, 외인성 제제(들)의 존재는 이차 바이러스의 생산을 억제한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 제제는 일차 바이러스 후에 투여되고, 외인성 제제(들)의 존재는 이차 바이러스의 생산을 유도한다. 일부 실시예에서, 외인성 제제(들)는 일차 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 바이러스는 검출 가능하지 않다.
본 개시는 종양을 치료하는 것을 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 개시의 일차 바이러스 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 이차 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 일차 및 이차 바이러스에 의해 사멸된다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 더 많은 종양 크기 감소를 초래한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여 또는 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 하나 이상의 종양 항원에 대한 보다 강한 면역 반응을 유도한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 일차 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 이차 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여 또는 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 종양 세포를 우선적으로/더 특이적으로 사멸시킨다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 일차 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 이차 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 비해 대상체에서 연장된 종양 억제 기간을 초래한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 더 많은 세포 유형의 바이러스 감염을 가능하게 한다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 이차 바이러스의 생산을 조절한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 제제는 일차 바이러스와 동시에 투여되고, 외인성 제제(들)의 존재는 이차 바이러스의 생산을 억제한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 외인성 제제는 일차 바이러스 후에 투여되고, 외인성 제제(들)의 존재는 이차 바이러스의 생산을 유도한다. 일부 실시예에서, 외인성 제제(들)는 일차 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 바이러스는 검출가능하지 않다.
본 개시는 본 개시의 일차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 개시는 본 개시의 일차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 개시는 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 본 개시는 본 개시의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
도 1a 내지 도 1b는 내재된 종양용해 바이러스 및 시간 경과에 따른 면역 반응의 개략도를 도시한다. 도 1a는 내재된 종양용해 바이러스를 도시하고, 여기서 일차 종양용해 바이러스의 게놈(oV1 게놈, 회색 막대)은 이차 종양용해 바이러스의 게놈(oV2 폴리뉴클레오티드, 흰색 막대)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 2개의 상이한 바이러스(oV1 및 oV2)가 동일한 작제물로부터 생산된다. 도 1b는 시간 경과에 따른 oV1 및 oV2의 상대적 수준을 도시하며, oV2의 생산은 유도 자극에 의해 촉발된다. 시간 경과에 따른 종양-특이적 CD8+ T 세포의 상응하는 확장은 회색 파선으로 표시되어 있다. 이러한 절차는 종양용해 바이러스가 아닌 바이러스로 수행될 수도 있다.
도 2는 내재된 종양용해 바이러스 작제물을 도시하고, 여기서 일차 바이러스는 재조합 HSV이고 이차 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA 바이러스(좌측 하단) 또는 음성-센스 단일-가닥 RNA 바이러스(우측 하단)이다. 이차 바이러스 게놈의 발현은 테트라사이클린-반응성 Pol II 프로모터(검정색 화살표) 및 RNA 중합효소 I 프로모터(회색 화살표)에 의해 조절된다. 재조합 HSV는 당단백질 B(gB: N/T)에서의 D285N 및 A549T 돌연변이, ICP27에서의 T128, T219a 및 T122 miR-표적 서열, 연접 영역의 결실, US12 돌연변이, ICP4에서의 T124, T1 및 T143 miR-표적 서열, 및 ICP34.5에서의 T128, T204 및 T219 miR-표적 서열을 포함한다.
도 3은 T7 RNA 중합효소 또는 재조합효소를 활성화하는 바이러스의 발현 및/또는 기능을 조절하기 위한 제어 요소를 도시하는 개략도이다. 전사 제어는 종양-특이적 프로모터 또는 리간드-유도성 프로모터로 달성될 수 있다. 전사후 제어 요소는 mRNA를 조절하는 것을 포함하거나 또는 mRNA 암호화된 단백질 반감기, miRNA 표적 부위, Tet-ON miR-T 요소, Tet-OFF 리보자임/앱타자임, 및 리간드 의존성 또는 구성적 방식으로 전사체 풍부도를 제어하는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 추가 제어 요소는 그의 반감기, 서브세포 편재화 및/또는 활성을 제어하기 위해 암호화된 폴리펩티드(예를 들어, 재조합효소)로 조작될 수 있다.
도 4a 내지 도 4b는 이차 종양용해 바이러스의 발현을 제어하기 위한 부위-유도 재조합 시스템의 용도를 보여준다. 도 4a는 FLP 또는 다른 재조합효소에 의해 절제될 수 있는 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 프레임시프트/정지 코돈을 삽입하기 위한 계획을 보여준다. 도 4b는 정확한 배향으로 역위된 활성으로 부여될 수 있는 비활성 역위 프로모터를 도시한다. 이러한 절차는 종양용해 바이러스가 아닌 바이러스로 수행될 수도 있다.
도 5는 예시적인 내재된 종양용해 바이러스 작제물을 생산하기 위해 일차 종양용해 바이러스 게놈에 삽입될 수 있는 성분의 예시적인 개략도를 도시한다. rtTA 펩티드의 발현은 구성적으로 활성인 프로모터의 제어 하에 있고, 이차 바이러스 게놈의 발현은 테트라사이클린-반응성(TetOn) Pol II 프로모터의 제어 하에 있어서, 바이러스 게놈의 전사가 Tet 및 rtTA 펩티드의 존재 시에 발생하도록 한다. 이차 종양용해 바이러스 전사체의 발현은 내부 TetOff-리보자임(TetOff-R)에 의해 추가로 조절되어, 전사체가 Tet의 부재 시에 분해되도록 한다. 또한, 이차 바이러스 전사체는 5' 및 3' TetOn-리보자임(TetOn-R)에 의해 활성화되어, mRNA 전사체가 Tet의 존재 시에 5' 및 3' 말단 상에서 가공되도록 한다. 이러한 절차는 종양용해 바이러스가 아닌 바이러스로 수행될 수도 있다.
도 6은 예시적인 내재된 종양용해 바이러스 작제물을 생산하기 위해 일차 종양용해 바이러스 게놈에 삽입될 수 있는 성분의 예시적인 개략도를 도시한다. rtTA 및 테트라사이클린 전사활성화제(tTA) 펩티드의 발현은 구성적으로 활성인 프로모터의 제어 하에 있다. 이차 바이러스 게놈의 발현은 TetOn Pol II 프로모터의 제어 하에 있어서, 바이러스 게놈의 전사가 Tet 및 rtTA 펩티드의 존재 시에 발생하도록 한다. 이차 종양용해 바이러스 전사체의 발현은 이차 바이러스의 mRNA 전사체에서 표적 서열에 특이적인 shRNA에 의해 추가로 조절된다. shRNA의 발현은 TetOff 프로모터의 제어 하에 있어서, shRNA의 전사가 Tet의 부재 및 tTA 펩티드의 존재 시에 발생하도록 한다. 또한, 이차 바이러스 전사체는 5' 및 3' TetOn-R에 의해 활성화되어, mRNA 전사체가 Tet의 존재 시에 5' 및 3' 말단 상에서 가공되도록 한다. 이러한 절차는 종양용해 바이러스가 아닌 바이러스로 수행될 수도 있다.
도 7은 예시적인 내재된 바이러스 작제물을 생산하기 위해 일차 종양용해 바이러스 게놈에 삽입된 성분의 개략도를 도시한다. rtTA 및 tTA 펩티드의 발현은 구성적으로 활성인 프로모터에 의해 제어 하에 있다. 이차 바이러스 게놈의 발현은 TetOn Pol II 프로모터의 제어 하에 있어서, 바이러스 게놈의 전사가 Tet 및 rtTA 펩티드의 존재 시에 발생하도록 한다. 이차 종양용해 바이러스 전사체의 발현은 이차 바이러스의 mRNA 전사체에서 표적 서열에 특이적인 shRNA에 의해 추가로 조절된다. shRNA의 발현은 TetOff 프로모터의 제어 하에 있어서, shRNA의 전사가 Tet의 부재 및 tTA 펩티드의 존재 시에 발생하도록 한다. 또한, 이차 바이러스 전사체는 AmiRNA 표적 부위와 3' TetOn-R에 의한 5' 말단의 절단에 의해 활성화되어, mRNA 전사체가 Tet의 존재 시에 5' 말단 상에서 가공되도록 한다. 이러한 절차는 종양용해 바이러스가 아닌 바이러스로 수행될 수도 있다.
도 8은 재조합효소 시스템의 다수의 수준의 제어를 도시하는 표이다. Flp는 여기에서 비제한적인 예시적 재조합효소로서 사용된다.
도 9는 STOP 요소를 포함하는 예시적인 재조합효소-반응성 절제 카세트(RREC)를 도시하는 개략도이다.
도 10a-10b는 STOP 요소를 포함하는 예시적인 재조합효소-반응성 역위 카세트(RRIC)를 도시하는 개략도이다. 도 10a는 뒤집힌 텍스트에 의해 도시된 바와 같이 프로모터 영역 및 STOP 요소가 초기 작제물에서 반전된 배향에 있는, 프로모터 역위 설계를 도시한다. 도 10b는 뒤집힌 텍스트에 의해 도시된 바와 같이 페이로드 분자를 암호화하는 cDNA가 초기 작제물에서 반전된 배향에 있는, 페이로드 역위 설계를 도시한다.
도 11은 분할 인트론 역위 설계로 지칭되는, 인트론을 갖는 재조합효소-반응성 역위 카세트(RRIC)의 예시적인 설계를 도시하는 개략도이다. 역위 요소는 뒤집힌 텍스트로 도시된다.
도 12는 MND-TetR 작제물 및 Tet-의존성 프로모터에 작동가능하게 연결된 mCherry-NLuc 리포터 유전자의 작제물로 형질감염된 HEK293T 세포에서의 리포터 유전자 수준을 보여주는 막대 차트이다.
도 13은 다양한 작제물로 형질감염된 HEK293T 세포에서의 리포터 유전자 수준을 보여주는 막대 차트이다.
도 14는 표시된 바와 같이 3개의 상이한 작제물의 조합으로 형질감염된 HEK293T 세포에서의 리포터 유전자 수준을 보여주는 막대 차트이다.
도 15a는 선택적인 인트론 영역을 갖는 Flp-ERT2 융합 단백질 작제물 및 선택적인 STOP 카세트를 갖는 mCherry-NLuc 리포터 작제물로 형질감염된 HEK293T 세포에서의 리포터 유전자 수준을 보여주는 막대 차트이다. 도 15b는 표시된 바와 같이 인트론 영역 및 선택적인 mRNA 탈안정화 요소를 갖는 Flp-ERT2 융합 단백질 작제물 및 다른 작제물로 형질감염된 HEK293T 세포에서의 리포터 유전자 수준을 보여주는 막대 차트이다.
도 16은 표시된 발현 작제물로 형질감염된 HEK293T 세포에서의 베이스라인 리포터 유전자 수준을 보여주는 막대 차트이다. 역위 요소는 뒤집힌 텍스트로 도시된다.
도 17은 독시사이클린 및/또는 4OHT에 반응하여, 표시된 발현 작제물로 형질감염된 HEK293T 세포에서의 리포터 유전자 수준을 보여주는 막대 차트이다.
도 18은 다수의 제어 요소를 사용하여 리포터 유전자 발현을 조절하기 위한 pDEST14 기반 발현 작제물의 설계를 도시하는 개략도이다. 삽입은 좌측에서 우측으로: attB1, SV40 pA, MND-TetR (역 배향으로), HBP1-TO-FEXPi2, ACTB polyA, attB5, GAPDH polyA, CMV-NLucP(역 배향으로), HBP2-TO-STOP3-mCherry-Fluc, bGH polyA, attB2를 포함한다.
도 19는 이중 종양용해 바이러스 벡터에 기초한 ONCR222b 벡터의 설계를 도시하는 개략도이다. 14.1 kb 삽입은 좌측에서 우측으로: attB1, SV40 pA, MND-TetR(역 배향으로), HBP1-TO-FEXPi2, ACTB polyA, attB5, GAPDH polyA, CMV(역 배향으로), HBP2-TO-STOP3-SVV-mCherry, bGH polyA, attB2를 포함한다. 재조합 HSV는 당단백질 B(gB: N/T)에서의 D285N 및 A549T 돌연변이, ICP27에서의 T128, T219a 및 T122 miR-표적 서열, 연접 영역의 결실, US12 돌연변이, ICP4에서의 T124, T1 및 T143 miR-표적 서열, 및 ICP34.5에서의 T128, T204 및 T219 miR-표적 서열을 포함한다.
도 20a는 표시된 이중 종양용해 바이러스 벡터로 NCI-H1299 세포를 감염시킨 후 시간 경과에 따른 HSV의 바이러스 역가를 보여주는 그래프이다. 도 20b는 표시된 이중 종양용해 바이러스 벡터로 NCI-H1299 세포를 감염시킨 후 시간 경과에 따른 SVV의 바이러스 역가를 보여주는 그래프이다.
도 21은 HSV-1 바이러스 게놈에 삽입된 SVV 바이러스 게놈을 갖는 이중 종양용해 바이러스 벡터의 설계를 도시하는 개략도이다. 재조합 HSV는 당단백질 B(gB: N/T)에서의 D285N 및 A549T 돌연변이, US37 돌연변이, 연접 영역의 결실, US12 돌연변이, 및 ICP4에서의 T124, T1 및 T143 miR-표적 서열을 포함한다.
도 22는 Vero 또는 H1299 세포에서 ONCR-189 또는 ONCR-190 바이러스에 의한 바이러스 감염의 10배 연속 희석을 보여주는 일련의 이미징 도면이다.
도 23은 H1299 세포에서 ONCR-189 및 ONCR-190 바이러스에 의한 바이러스 감염의 10배 연속 희석을 보여주는 일련의 이미징 도면이다.
도 24a는 H446 세포의 ONCR-189 및 ONCR-190 바이러스 감염의 IC50 역가 검정을 보여주는 일련의 그래프이다. 도 24b는 도 24a에 도시된 실험에 따라 계산된 IC50 값을 보여주는 표이다.
도 25는 형질감염 또는 감염된 H1299 세포에서 SVV RNA 사본 수를 측정하는 qPCR 검정을 보여주는 막대 그래프이다.
도 26a는 종양용해 바이러스로 치료한 NCI-H1299 이종이식 마우스에 대한 시간 경과에 따른 종양 부피의 변화를 보여주는 그래프이다. 도 26b는 동일한 실험에 대한 체중 변화를 보여주는 그래프이다.
도 27은 HEK293 세포에서 TetOff 앱타자임 제어 하에 mCherry의 발현 수준을 평가하는 어레이 스캐닝 세포측정 검정을 보여주는 막대 그래프이다.
도 28은 이중 바이러스(dual virus)의 다양한 성분의 설계를 도시하는 개략도이다. 일부 실시예에서, 이중 바이러스는 이중 종양용해 바이러스이다. 모든 이탤릭체 문자 및/또는 파선은 선택적 성분을 나타낸다. 예를 들어, 선택적 RNAi 표적 서열은 도면에 표시된 바와 같이 폴리뉴클레오티드의 코딩 및/또는 논코딩 영역에 삽입되어 상응하는 RNA 전사체의 발현 수준 및/또는 안정성을 제어할 수 있고, 선택적 재조합효소 반응성 카세트는 도면에 표시된 바와 같이 폴리뉴클레오티드에 삽입되어 재조합효소의 존재에 대한 반응으로 표적 RNA 발현의 제어를 가능하게 할 수 있다.
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정의
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 균등물로서 사용된다. 본 출원에 사용된 임의의 숫자는 약/대략의 유무에 관계없이 당 기술분야의 숙련자에 의해 이해되는 임의의 정상적인 변동을 포함하는 것을 의미한다. 소정의 실시예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 맥락에서 달리 언급되거나 달리 명백하지 않는 한, 언급된 참조 값의 어느 한 방향에서(초과하거나 미만) 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하에 속하는 값의 범위를 지칭한다 (그러한 수가 가능한 값의 100%을 초과하는 경우는 제외함).
"투여"는 본원에서 제제 또는 조성물을 대상체 내로 도입하는 것을 지칭한다.
"상보적"은 염기 스태킹 및 특이적 수소 결합을 통해서, 자연적으로 또는 자연적으로 발생하지 않는 염기 또는 이의 유사체를 포함하는 2개의 서열 사이에서, 페어링하는 능력을 지칭한다. 예를 들어, 핵산의 한 위치에서의 염기가 표적의 상응하는 위치에서의 염기와 수소 결합할 수 있는 경우, 그 염기들은 그 위치에서 서로 상보적인 것으로 간주된다. 핵산은 수소 결합에 양 또는 음으로 기여하지 않는 범용 염기, 또는 불활성 비염기 스페이서를 포함할 수 있다. 염기 페어링은 정규 Watson-Crick 염기 페어링 및 비-Watson-Crick 염기 페어링(예, Wobble 염기 페어링 및 Hoogsteen 염기 페어링) 모두 포함할 수 있다. 상보적 염기 페어링의 경우, 아데노신형 염기(A)는 티미딘형 염기(T) 또는 우라실형 염기(U)에 상보적이고; 시토신형 염기(C)는 구아노신형 염기(G)에 상보적이고, 범용 염기, 예컨대 3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌은 임의의 A, C, U, 또는 T에 상보적인 것으로 간주될 수 있다. Nichols 등, Nature, 1994;369:492-493 및 Loakes 등, Nucleic Acids Res., 1994;22:4039-4043. 이노신(I)은 또한 당해 기술분야에서 범용 염기인 것으로 간주되었고, 임의의 A, C, U, 또는 T에 상보적인 것으로 간주된다. 참조 Watkins and SantaLucia, Nucl. Acids Research, 2005; 33 (19): 6258-6267.
용어 "유효량"은 특정 생리학적 효과를 초래하는 제제 또는 조성물의 양(예를 들어, 특정 생리학적 효과를 증가, 활성화 및/또는 향상시킬 수 있는 양)을 지칭한다. 특정 제제의 유효량은 제제의 성질, 예컨대 질량/부피, 세포 수/부피, 입자/부피, (제제의 질량)/(대상체의 질량), 세포 수/(대상체의 질량), 또는 입자/(대상체의 질량)에 기초하여 다양한 방식으로 표현될 수 있다. 특정 제제의 유효량은 반수 최대 유효 농도(half-maximal effective concentration, EC50)로서 표현될 수도 있는데, 이는 참조 수준과 최대 반응 수준 사이의 절반인 특정 생리학적 반응의 크기를 초래하는 제제의 농도를 지칭한다.
용어 "종양용해 바이러스"는 변형되었거나 자연적으로 암세포를 우선적으로 감염시키는 바이러스를 지칭한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 대상체에게 투여될 때 알레르기 반응 또는 유사한 바람직하지 않은 반응을 생성하지 않는 분자 엔티티 및 조성물을 지칭한다.
용어 "복제 능력이 있는 바이러스"는 숙주 세포에서 복제하고 감염성 바이러스 입자를 생산할 수 있는 바이러스를 지칭한다.
용어 "서열 동일성"은 동일하고 동일한 상대 위치에 있는 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 염기 또는 아미노산의 백분율을 지칭한다. 이와 같이, 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은 다른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 소정의 백분율의 서열 동일성을 갖는다. 서열 비교를 위해, 통상적으로 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 용어 "참조 서열"은 시험 서열이 비교되는 분자를 지칭한다.
용어 "대상체"는 예를 들어 영장류 및 인간을 포함하는 포유류와 같은 동물을 포함한다. 상기 용어는 소, 양, 염소, 암소, 돼지 등과 같은 가축; 개 및 고양이와 같은 가축류 동물; 설치류(예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터), 토끼, 영장류, 또는 돼지, 예컨대 교배 돼지 등을 포함하는 연구 동물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료하는"이란 생리학적 결과에 영향을 미치기 위해 대상체에게 제제 또는 조성물을 전달하는 것을 지칭한다.
용어 "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 전달하거나 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.
분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법은 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제3판 (Sambrook 등, HaRBor Laboratory Press 2001 ); Short Protocols in Molecular Biology, 제4판 (Ausubel 등 eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag 등, John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner 등, eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)과 같은 표준 교재들에서 찾을 수 있으며, 이들의 개시 내용은 본원에 참조로서 통합된다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 제1 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 프로모터를 지칭하며, 제2 전사가능 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 관심 유전자 또는 바이러스 게놈의 코딩 서열과 연결되며, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 분자는 제1 폴리뉴클레오티드 분자가 제2 폴리뉴클레오티드 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 2개의 폴리뉴클레오티드 분자는 단일 인접 폴리뉴클레오티드 분자의 일부일 수 있고 인접할 수 있다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 분자는 작동 가능하게 연결되기 위해 인접할 필요는 없다. 일부 실시예에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 (예를 들어, 재조합효소에 의해 매개되는) 재조합 후에 작동가능하게 연결되지만, 초기 배열에는 그렇지 않은, 2개의 폴리뉴클레오티드 분자를 또한 지칭한다.
이중 바이러스
모든 부제목 및 모든 섹션을 포함하여, 본 개시의 전반에 걸쳐, 종양용해 바이러스(예를 들어, 이중 종양용해 바이러스)에 대해 제공된 개시 및 실시예는 종양용해 바이러스 이외의 바이러스에 적용될 수도 있다. 일부 실시예에서, 종양용해 바이러스가 아닌 바이러스는 비-종양용해 바이러스일 수 있다.
본 개시의 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 실시예는 본원에서 "이중 바이러스" 또는 "이중 바이러스 작제물"로서 지칭되는데, 바이러스 작제물이 숙주 세포 내로 도입될 때 동일한 작제물로부터 2개의 상이한 종양용해 바이러스를 생산할 수 있기 때문이다.
악성 종양의 바이러스 치료의 맥락에서, 전반적인 목적은 종양 세포 용해에 의한 종양 특이적 면역 반응을 촉진하는 것이다. 효과적인 바이러스 요법은 숙주에서 항-종양 면역 반응을 자극하기에 충분한 면역원성이 있고 종양 세포 용해를 매개하기에 충분한 독성이 있는 바이러스를 필요로 한다. 동시에, 바이러스의 면역원성 및 독성은 바이러스 자체에 대한 숙주 면역 반응을 재유도함으로써, 항-종양 면역 반응 및 종양 세포 용해의 발생을 제한하고, 대신에 바이러스 소거를 유도할 수 있다. 이와 같이, 항-종양 면역을 촉진하고 항-바이러스 면역을 억제할 수 있는 바이러스에 대한 필요성이 당 기술분야에 인식되고 있다. 일부 실시예에서, 본 개시는 악성 암의 치료를 위한 이중 바이러스를 제공한다.
백신 또는 유전자 요법과 같은 다른 응용예에서 바이러스에 대해 유사한 면역원성 및/또는 독성 문제가 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 개시는 본 개시의 이중 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 일부 실시예에서, 본 개시는 유전자 요법 벡터로서 본 개시의 이중 바이러스를 제공한다.
본 개시의 일부 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 바이러스 (즉, 이중 바이러스). 본원에 설명된 이중 바이러스는 하나의 바이러스 벡터로부터 2개의 상이한 바이러스: 일차 바이러스 및 이차 바이러스를 생산할 수 있게 한다. 일부 실시예에서, 일차 및/또는 이차 바이러스의 발현은 유도성이며, 일차 및/또는 이차 바이러스의 발현에 대한 일시적인 제어를 가능하게 한다. 일부 실시예에서, 본원에 설명된 이중 바이러스는 숙주에서 바이러스 지속성을 촉진하며, 종양 세포의 바이러스 용해를 증가시키고 종양 항원-특이적 T 세포 집단의 발생을 향상시키게 한다.
이중 종양용해 바이러스
일부 실시예에서, 본 개시는 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 종양용해 바이러스를 제공한다. 이러한 실시예는 본원에서 "이중 종양용해 바이러스" 또는 "이중 종양용해 바이러스 작제물"로서 지칭되는데 바이러스 작제물이 숙주 세포 내로 도입될 때 동일한 작제물로부터 2개의 상이한 종양용해 바이러스를 생산할 수 있기 때문이다.
악성 종양의 바이러스 치료의 맥락에서, 전반적인 목적은 종양 세포 용해에 의한 종양 특이적 면역 반응을 촉진하는 것이다. 효과적인 종양용해 바이러스 요법은 숙주에서 항-종양 면역 반응을 자극하기에 충분한 면역원성과 종양 세포 용해를 매개하기에 충분한 독성이 있는 바이러스를 필요로 한다. 동시에, 바이러스의 면역원성 및 독성은 바이러스 자체에 대한 숙주 면역 반응을 재유도함으로써, 항-종양 면역 반응 및 종양 세포 용해의 발생을 제한하고, 대신에 바이러스 제거를 유도할 수 있다 (Ikeda 등, Nature Medicine (1999) 5:8; 881-887). 이와 같이, 항-종양 면역을 촉진하고 항바이러스 면역을 억제할 수 있는 종양용해 바이러스에 대한 필요성이 당 기술분야에 인식되고 있다(예, Aurelian, Onco Targets Ther (2016) 9; 2627-2637 참조).
일부 실시예에서, 본 개시는 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 종양용해 바이러스를 제공한다(즉, 이중 종양용해 바이러스). 본원에 설명된 이중 종양용해 바이러스는 하나의 바이러스 벡터로부터 2개의 상이한 종양용해 바이러스, 즉 일차 종양용해 바이러스 및 이차 종양용해 바이러스의 생산을 가능하게 한다. 일부 실시예에서, 일차 및/또는 이차 바이러스의 발현은 유도성이며, 일차 및/또는 이차 바이러스의 발현에 대한 일시적인 제어를 가능하게 한다. 이러한 프로세스의 예시적인 예시가 도 1에 도시되어 있다. 간략하게, 도 1a에 도시된 이중 종양용해 바이러스의 투여는 일차 종양용해 바이러스(oV1)의 초기 발현 및 종양 세포의 바이러스 용해를 초래한다(도 1b, 검정색 선). oV1에 의해 매개된 종양 세포 용해는 종양 신생항원의 방출 및 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포의 발생을 초래하여, 종양 세포의 추가 면역 세포-매개 용해를 초래한다(도 1b, 회색 파선). oV1의 게놈 내로 삽입된 폴리뉴클레오티드로부터 이차 종양용해 바이러스(oV2)의 전사는 (도 1a) oV2의 발현을 초래하고, oV2에 의해 매개된 종양 세포 용해는 종양 항원의 제2 방출을 초래하여, 항-종양 CD8+ T 세포의 기존 집단에 항원 부스트를 제공한다. oV2의 전사 및 발현은 유도제의 투여 또는 억제성 제제의 제거에 의해 임의로 유도될 수 있다. oV1 및 oV2가 상이한 바이러스이기 때문에, 하나에 대해 생성된 항-바이러스 면역 반응은 다른 것에 대해 효과적이지 않을 것이고, 이에 의해 바이러스 항원에 대한 면역 반응의 재유도를 완화시킬 것이다. 따라서, 본원에 설명된 이중 종양용해 바이러스는 숙주에서 바이러스 지속성을 촉진하여, 종양 세포의 바이러스 용해를 증가시키고 종양 항원-특이적 T 세포 집단의 발생을 향상시키게 한다.
투여
일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 종양 세포 또는 종양 항원에 대한 특이적 면역 반응을 촉진한다. 일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독 투여 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여 대상체에서 종양 세포의 보다 특이적인 사멸을 초래한다. 일부 실시예에서, 종양에 대한 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 및 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 감염은 감염의 결과로서 방출되는 흔한 종양 항원에 대한 면역 반응의 집중으로 이어진다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 및 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 감염은 종양 세포 또는 종양 항원에 대한 우선적 또는 특이적 숙주 면역을 유도한다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독을 투여함으로써 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여에 의해 더 많은 수의 종양 세포가 사멸된다. 일부 실시예에서, 동일한 양/용량의 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독을 투여함으로써 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여에 의해 적어도 10% 더 많거나, 적어도 20% 더 많거나, 적어도 30% 더 많거나, 적어도 50% 더 많거나, 적어도 100% 더 많거나, 적어도 200% 더 많거나, 또는 적어도 500% 더 많은, 종양 세포가 사멸된다. 일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 어느 한 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 더 많은 종양 크기 감소를 초래한다(또는 어느 바이러스 단독으로도 종양 크기를 감소시킬 수 없는 상황에서 종양 크기를 감소시킨다). 일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 어느 한 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90%의 종양 크기의 추가 감소를 초래한다.
일부 실시예에서, 대상체에서 본 개시의 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독의 투여 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 대상체에서 하나 이상의 종양 항원에 대한 보다 강한 면역 반응을 초래한다. 일부 실시예에서, 면역 반응은 하나 이상의 종양 연관 항원에 특이적인 면역 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)의 수에 의해 측정된다. 일부 실시예에서, 대상체에서 본 개시의 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독의 투여 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 또는 적어도 500% 많은, 하나 이상의 종양 연관 항원에 특이적인 면역 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)를 초래한다. 일부 실시예에서, 면역 세포는 CD4+ T 세포이다. 일부 실시예에서, 면역 세포는 CD8+ T 세포이다.
일부 실시예에서, 대상체에서 본 개시의 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 대상체에서 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 면역 반응은 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스의 하나 이상의 항원에 특이적인 면역 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)의 수에 의해 측정된다. 일부 실시예에서, 면역 반응은 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스의 하나 이상의 항원에 특이적인 항체의 수준에 의해 측정된다. 일부 실시예에서, 면역 반응은 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%만큼 감소된다.
일부 실시예에서, 대상체에서 본 개시의 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 대상체에서 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스에 대한 면역 면역 반응을 감소시킨다. 일부 실시예에서, 면역 반응은 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 하나 이상의 항원에 특이적인 면역 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)의 수에 의해 측정된다. 일부 실시예에서, 면역 반응은 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 하나 이상의 항원에 특이적인 항체의 수준에 의해 측정된다. 일부 실시예에서, 면역 반응은 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%만큼 감소된다. 일부 실시예에서, 대상체에서 본 개시의 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 대상체에서 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하지 않는다.
일부 실시예에서, 대상체에서 본 개시의 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 대상체에서 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래한다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스의 지속적인 생산은 혈액 순환 또는 종양 부위에서의 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스의 수준에 의해 측정된다. 일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 혈액 순환 또는 종양 부위에서 더 긴 시간 동안, 예를 들어, 적어도 10% 더 길거나, 적어도 20% 더 길거나, 적어도 30% 더 길거나, 적어도 50% 더 길거나, 적어도 100% 더 길거나, 적어도 200% 더 길거나, 적어도 500% 더 긴 시간 동안 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스의 검출 가능한 수준을 초래한다.
일부 실시예에서, 대상체에서 본 개시의 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 대상체에서 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 지속적인 생산은 혈액 순환 또는 종양 부위에서 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 수준에 의해 측정된다. 일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 혈액 순환 중 또는 종양 부위에서 더 긴 시간 동안, 예를 들어, 적어도 10% 더 길거나, 적어도 20% 더 길거나, 적어도 30% 더 길거나, 적어도 50% 더 길거나, 적어도 100% 더 길거나, 적어도 200% 더 길거나, 적어도 500% 더 긴 시간 동안 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 검출 가능한 수준을 초래한다.
일부 실시예에서, 대상체에서 본 개시의 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 대상체에서 연장된 종양 억제 기간을 초래한다. 일부 실시예에서, 종양 억제 기간은 무-진행 기간이다. 일부 실시예에서, 종양 억제 기간은 무-종양 기간이다. 일부 실시예에서, 종양 억제 기간은 바이러스 투여 개시와 암 관해 사이의 시간이다. 일부 실시예에서, 종양 억제 기간은 무-전이 기간이다. 일부 실시예에서, 종양 억제 기간은 종양용해 바이러스 또는 바이러스의 투여 직전(종양용해 바이러스 치료 또는 바이러스 치료로 인한 종양 감소 기간 후)에 종양이 초기 크기로 성장하기 전의 시간이다. 일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 적어도 10% 더 길거나, 적어도 20% 더 길거나, 적어도 30% 더 길거나, 적어도 50% 더 길거나, 적어도 100% 더 길거나, 적어도 200% 더 길거나, 적어도 500% 더 길거나, 적어도 1000% 더 긴 종양 억제 기간을 초래한다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 생산은 외인성 제제에 의해 조절된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제에 의한 조절은 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 생산에 대한 공간적 및/또는 시간적 제어를 제공한다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 펩티드, 호르몬, 또는 소분자이다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 리간드이다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 프로모터, 리보자임 또는 RNAi의 활성을 조절함으로써 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 생산을 조절한다. 예를 들어, 테트라사이클린/독시사이클린은 Tet-On 또는 Tet-OFF 프로모터 및/또는 리보자임에 대한 예시적인 외인성 제제이다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 재조합효소의 활성을 조절하는 것을 통해 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 생산을 조절한다. 예를 들어, 4-하이드록시타목시펜은 재조합효소에 융합된 에스트로겐 수용체(ER)의 변형된 리간드 결합 도메인을 통해 재조합효소의 활성/서브세포성 국소화를 조절할 수 있는 예시적인 외인성이다.
일부 실시예에서, 외인성 제제는 전신 투여된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 예를 들어, 종양내로 국소 투여된다. 일부 실시예에서, 본 개시는 외인성 제제를 투여해서 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 생산을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시예에서, 외인성 제제의 존재는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 생산을 억제한다. 일부 실시예에서, 외인성 제제의 존재는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 생산을 유도한다. 일부 실시예에서, 외인성 제제의 투여 전에 대상체에서 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스가 검출가능하지 않다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여와 대략 동일한 시간에 또는 투여 전에 투여된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여 후에 투여된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여 후 적어도 1시간, 적어도 3시간, 적어도 6시간, 적어도 12시간, 또는 적어도 24시간 후에 투여된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제는 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여 후 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 또는 적어도 6개월에 투여된다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 및 이차 바이러스의 감염은 일시적으로 분리된다. 일부 실시예에서, 일차 및 이차 종양용해 바이러스, 또는 일차 및 이차 바이러스의 일시적으로 분리된 감염은 종양 세포 및/또는 종양 항원에 대한 면역 반응의 집중을 초래한다.
일부 실시예에서, 본 개시의 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 투여는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여, 더 많은 세포 유형의 바이러스 감염을 가능하게 한다. 일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스에 의해 감염된 적어도 하나의 세포 유형은 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독에 내성을 갖는다. 일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스에 의해 감염된 적어도 하나의 세포 유형은 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독에 내성을 갖는다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독에 내성을 갖는 세포 유형은 골수 세포, 대식세포 또는 섬유아세포 세포이다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독에 내성을 갖는 세포 유형은 면역 억제에 기여한다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스 단독 또는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 단독에 내성을 갖는 세포 유형은 종양 억제에 기여한다.
일부 실시예에서, 본 개시의 "일차 종양용해 바이러스 단독"은 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 참조 일차 종양용해 바이러스를 지칭한다(즉, 이중 종양용해 바이러스가 아님). 일부 실시예에서, 본 개시의 "일차 바이러스 단독"은 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 참조 일차 바이러스를 지칭한다(즉, 이중 바이러스가 아님).
변형된 이중 바이러스 및 변형된 이중 종양용해 바이러스
일부 실시예에서, 본 개시는 위형화되거나 달리 조작된 바이러스(예를 들어, 일차 바이러스 및/또는 이차 바이러스)를 제공한다. 일부 실시예에서, 바이러스는 위형화되거나 달리 조작된 일차 종양용해 바이러스 및/또는 이차 종양용해 바이러스이다.
본 개시의 일부 실시예에서, "위형화된 바이러스(Pseudotyped viruses)"는 바이러스 코트 단백질(예를 들어, 외피 단백질) 중 하나 이상이 대체되거나 변형된 바이러스를 지칭한다. 일부 실시예에서, 위형화된 바이러스는 상응하는 비-위형화된 바이러스가 감염시킬 수 없는 세포 또는 조직 유형을 감염시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 위형화된 바이러스는 비-위형화된 바이러스와 비교하여 세포 또는 조직 유형을 우선적으로 감염시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 위형화된 바이러스의 바이러스 입자의 부분(예를 들어, 외피 또는 캡시드)는 이종 바이러스로부터 유래된 바이러스 단백질 또는 비-바이러스 단백질과 같은, 이종 단백질을 포함한다. 비-바이러스 단백질은 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 위형화된 바이러스는 i) 비-위형화된 바이러스에 비해 변경된 향성, 및/또는 ii) 비-유익 효과의 감소 또는 제거가 가능하다. 일부 실시예에서, 위형화된 바이러스는 비-위형화된 바이러스와 비교하여 비-종양 세포 또는 비-종양 조직의 감소된 독성 또는 감소된 감염을 나타낸다.
일반적으로, 바이러스는 이들이 가장 효율적으로 감염시키는 자연 숙주 세포 집단을 갖는다. 예를 들어, 레트로바이러스는 제한된 자연 숙주 세포 범위를 갖는 반면, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스는, 일부 세포 유형은 이들 바이러스에 의한 감염에 불응성이긴 하지만, 상대적으로 더 넓은 범위의 숙주 세포를 효율적으로 감염시킬 수 있다. 바이러스의 표면 상의 단백질(예를 들어, 외피 단백질 또는 캡시드 단백질)은 감수성 숙주 세포에 대한 부착 및 이에 대한 진입을 매개하여 바이러스의 향성, 즉 특정 세포 또는 조직 유형을 감염시키는 특정 바이러스의 능력을 결정한다. 일부 실시예에서, 본 개시의 바이러스는 바이러스의 표면 상에 단일 유형의 단백질을 포함한다. 예를 들어, 레트로바이러스 및 아데노-연관 바이러스는 그들의 막을 코팅하는 단일 단백질을 갖는다. 일부 실시예에서, 본 개시의 바이러스는 바이러스의 표면 상에 하나 이상의 유형의 단백질을 포함한다. 예를 들어, 아데노바이러스는 바이러스의 표면으로부터 멀리 연장되는 섬유와 외피 단백질 모두로 코팅된다.
일부 실시예에서, 바이러스의 표면 상의 단백질은 헤파린 설페이트 같은 세포 표면 분자에 결합하여, 잠재적 숙주 세포의 표면에 바이러스를 편재화할 수 있다. 바이러스 표면 상의 단백질은 바이러스 진입을 매개하기 위해 바이러스 단백질에서 구조적 변화를 유도하는 숙주 세포에서 발현된 특이적 단백질 수용체와 바이러스 간의 상호작용을 매개할 수도 있다. 일부 실시예에서, 바이러스의 표면 상의 단백질과 세포 수용체 사이의 상호작용은 엔도솜으로의 바이러스 내재화를 용이하게 할 수 있으며, 여기서 엔도솜 내강의 산성화가 바이러스 코트의 재접힘을 유도한다. 일부 실시예에서, 잠재적 숙주 세포 내로의 바이러스 진입은 바이러스의 표면 상의 적어도 하나의 분자와 세포의 표면 상의 적어도 하나의 분자 사이의 유리한 상호작용을 필요로 한다.
일부 실시예에서, 본 개시의 바이러스는 바이러스 코트(예를 들어, 바이러스 외피 또는 바이러스 캡시드)를 포함하되, 바이러스 코트의 표면에 존재하는 단백질(예를 들어, 바이러스 외피 단백질 또는 바이러스 캡시드 단백질)은 바이러스 진입을 위한 잠재적 표적 세포의 인식을 조절한다. 일부 실시예에서, 바이러스에 의해 진입하기 위한 잠재적 표적 세포를 결정하는 이러한 과정은 숙주 향성(host tropism)으로 지칭된다. 일부 실시예에서, 숙주 향성은 세포 향성으로, 여기서 수용체의 바이러스 인식은 세포 수준에서 일어나거나, 조직 향성으로, 여기서 세포 수용체의 바이러스 인식은 조직 수준에서 일어난다. 일부 실시예에서, 바이러스의 바이러스 코트는 단일 유형의 세포에 존재하는 수용체를 인식한다. 일부 실시예에서, 바이러스의 바이러스 코트는 다수의 세포 유형(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 상이한 세포 유형)에 존재하는 수용체를 인식한다. 일부 실시예에서, 바이러스의 바이러스 코트는 단일 유형의 조직에 존재하는 세포 수용체를 인식한다. 일부 실시예에서, 바이러스의 바이러스 코트는 다수의 조직 유형(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6 이상의 상이한 조직 유형)에 존재하는 세포 수용체를 인식한다.
일부 실시예에서, 본 개시의 위형화된 바이러스는 특정 세포 또는 조직 유형으로의 바이러스 진입을 용이하게 하기 위해 상이한 바이러스로부터의 표면 단백질을 포함하도록 변형된 바이러스 코트를 포함한다. 일부 실시예에서, 위형화된 바이러스는 바이러스 코트를 포함하고, 여기서 제1 바이러스의 바이러스 코트가 제2 바이러스 코트와 교환되고, 여기서 이차 바이러스의 바이러스 코트는 위형화된 바이러스가 특정 세포 또는 조직 유형을 감염시킬 수 있게 한다. 일부 실시예에서, 바이러스 코트는 바이러스 외피를 포함한다. 일부 실시예에서, 바이러스 외피는 인지질 이중층 및 단백질, 예컨대 숙주 막으로부터 수득된 단백질을 포함한다. 일부 실시예에서, 바이러스 외피는 숙주 세포에 의해 발현된 수용체에 대한 인식 및 부착을 위한 당단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 바이러스 코트는 캡시드를 포함한다. 일부 경우에, 캡시드는 프로토머(protomer)라고 불리는 올리고머 단백질 서브유닛으로부터 조립된다. 일부 실시예에서, 캡시드는 하나의 유형의 프로토머 또는 단백질로부터 조립되거나, 2, 3, 4 또는 그 이상의 유형의 프로토머 또는 단백질로부터 조립된다.
일부 실시예에서, 요법(예, 암 요법)를 목적으로 본 개시의 바이러스에 의한 형질도입에 민감한 세포의 범위를 제한하거나 확장하는 것이 유리하다. 이를 위해, 내인성 바이러스 코트 단백질(예를 들어, 바이러스 외피 또는 캡시드 단백질)이 다른 바이러스 유래의 바이러스 코트 단백질 또는 키메라 단백질로 대체된 많은 바이러스가 개발되었다. 일부 실시예에서, 키메라 단백질은 비리온 내로의 혼입에 필요한 바이러스 단백질의 일부뿐만 아니라, 표적화 모이어티와 같은 특이적 숙주 세포 단백질과 상호작용하도록 설계된 단백질 또는 핵산으로 구성된다.
일부 실시예에서, 본 개시의 위형화된 바이러스는 바이러스 향성을 제한하거나 제어하기 위해(즉, 위형화된 바이러스가 감염시킬 수 있는 세포 또는 조직 유형의 수를 감소시키기 위해) 위형화된다. 향성을 제한하기 위해 채택된 대부분의 전략은 키메라 바이러스 코트 단백질(예, 외피 단백질) 결합 항체 단편을 사용하였다. 이러한 바이러스는 요법(예, 암 요법)의 개발에 대한 큰 가능성을 보여준다. 일부 실시예에서, 본 개시의 위형화된 바이러스는 바이러스 향성을 확장시키기 위해(즉, 위형화된 바이러스가 감염시킬 수 있는 세포 또는 조직 유형의 수를 증가시키기 위해) 위형화된다. 바이러스(예를 들어, 외피형 바이러스)의 세포 향성을 확장하기 위한 하나의 메커니즘은, 2개 이상의 바이러스에 감염된 세포에서 바이러스 조립 중에 흔히 발생하는 과정인, 표현형적으로 혼합된 입자 또는 위형을 형성하는 것을 통해서다. 예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1). HIV1은 적절한 보조수용체를 가진 CCR4를 발현하는 세포를 감염시킨다. 그러나, HIV1은 표현형 혼합을 통해 이종 당단백질(GP)의 혼입에 의해 위형을 형성하여, 바이러스가 CD4 수용체 및/또는 적절한 보조수용체를 발현하지 않는 세포를 감염시키고, 이에 의해 바이러스의 향성을 확장시킬 수 있도록 한다. 여러 연구에서 이종성 쥣과 백혈병 바이러스(MLV), 암포성 MLV, 또는 단순 포진 바이러스에 감염된 세포에서 생산된 야생형 HIV-1은 숙주 범위가 확장된 표현형 혼합 비리온을 유발하며, 이는 위형화된 비리온이 생산되었음을 나타낸다. 바이러스 GP의 표현형 혼합은 또한 동시감염된 세포 배양물에서 HIV-1과 VSV 사이에서 발생하는 것으로 나타났다. 이러한 초기 관찰은 이종 GP를 갖는 HIV-1-기반 렌티바이러스 벡터의 후속 설계에 핵심이었다.
렌티바이러스를 위형화하기 위한 대체 GP 목록이 지속적으로 증가하고 있으며, 각각은 특정한 장점과 단점을 가지고 있다. 렌티바이러스를 위형화하기 위한 VSV G-단백질(VSV-G)의 광범위한 사용은 이 GP를 위형을 형성하는 다른 바이러스 GP의 유용성을 비교하는 표준으로 만들었다. 렌티바이러스 위형의 부가적인 비제한적인 예는 리사바이러스 유래 GP를 가진 위형, 림프구성 맥락수막염 바이러스 GP를 가진 위형 렌티바이러스, 알파바이러스 GP를 가진 렌티바이러스 위형 (예, RRV 및 SFV GP로 위형화된 렌티바이러스 벡터, sidbis 바이러스 GP로 위형화된 렌티바이러스 벡터), 필로바이러스(filovirus) GP를 가진 위형, 및 배큘로바이러스 GPGP64를 함유한 렌티바이러스 벡터 위형을 포함한다.
일부 실시예에서, 조작된(예를 들어, 위형화된) 바이러스는 일반적으로 종양 세포 상에서 발현된 단백질, 지질, 또는 탄수화물에 결합함으로써, 종양 및/또는 종양 세포에 결합할 수 있다. 이러한 실시예에서, 본원에 설명된 조작된 바이러스는 바이러스를 특정 숙주 세포로 유도하는 표적화 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 특정 세포 또는 조직 유형(예, 종양 또는 종양 세포, 또는 종양 연관 기질 또는 기질 세포) 상에 차등적으로 발현되거나 달리 존재하는 당 기술분야에 알려져 있거나 아직 식별되지 않은 임의의 세포 표면 생물학적 물질이 본 개시의 바이러스에 대한 잠재적 표적으로서 사용될 수 있다. 소임 실시예에서, 세포 표면 물질은 단백질이다. 일부 실시예에서, 표적화 모이어티는 질환, 예컨대 암(예, 유방, 폐, 난소, 전립선, 결장, 림프종, 백혈병, 흑색종, 및 기타); 자가면역 질환(예, 중증근무력증, 다발성 경화증, 전신 홍반성 루푸스증, 류마티스 관절염, 당뇨병, 및 기타); 감염성 질환, 예로서 HIV, HCV, HBV, CMV, 및 HPV 감염; 및 유전 질환, 예로서 겸상 적혈구 빈혈증, 낭성 섬유증, 테이-삭스, J3-지중해빈혈(thalassemia), 신경섬유종증, 다낭성 신장 질환, 혈우병, 기타를 나타내는 세포 표면 항원에 결합한다. 소정의 실시예에서, 표적화 모이어티는 특정 세포 또는 조직 유형에 특이적인 세포 표면 항원, 예를 들어, 신경, 폐, 신장, 근육, 혈관, 갑상선, 안구, 유방, 난소, 고환 또는 전립선 조직에 존재하는 세포 표면 항원을 표적화한다.
일부 실시예에서, 본 개시의 바이러스(일차 바이러스 및/또는 이차 바이러스)는 키메라 바이러스(예를 들어, 제1 바이러스로부터 유래된 캡시드 단백질 또는 IRES와 같은 한 부분 및 제2 바이러스로부터 유래된 프로테아제 또는 중합효소와 같은 비-구조적 유전자와 같은 또 다른 부분을 포함하는 바이러스를 암호화함)이다. 일부 실시예에서, 바이러스는 일차 종양용해 바이러스 및/또는 이차 종양용해 바이러스이다.
이중 종양용해 바이러스, 이중 바이러스 및 제어 요소의 설계
본 개시는 도 28에 도시된 바와 같이, 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 선택적으로 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 조절성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 종양용해 바이러스를 제공한다. 일부 실시예에서, 조절성 폴리펩티드는 조절가능 프로모터에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 조절성 폴리펩티드는 도 28에 도시된 하나 이상의 조절가능 프로모터의 기능을 조절한다. 일부 실시예에서, 조절성 폴리펩티드는 rtTA 단백질이다. 일부 실시예에서, 조절성 폴리펩티드는 tTA 단백질이다.
본 개시는 도 28에 도시된 바와 같이, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 선택적으로 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 조절성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 바이러스를 제공한다. 일부 실시예에서, 조절성 폴리펩티드는 조절가능 프로모터에 결합할 수 있다. 일부 실시예에서, 조절성 폴리펩티드는 도 28에 도시된 하나 이상의 조절가능 프로모터의 기능을 조절한다. 일부 실시예에서, 조절성 폴리펩티드는 rtTA 단백질이다. 일부 실시예에서, 조절성 폴리펩티드는 tTA 단백질이다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 종양용해 바이러스를 제공하고, 이차 종양용해 바이러스의 발현은 조절가능 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 스테로이드-유도성 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, MX-1 프로모터, GENESWITCHTM 하이브리드 프로모터, 큐메이트-반응성(cumate-responsive) 프로모터, 호르몬-반응성 프로모터(예, 포나스테론 A-유도성 프로모터), 및 테트라사이클린-유도성 프로모터로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 재조합효소 인식 부위(RRS)가 측부에 위치한 프로모터이다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 바이러스를 제공하고, 이차 바이러스의 발현은 재생 가능한 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 스테로이드-유도성 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, MX-1 프로모터, GENESWITCHTM 하이브리드 프로모터, 큐메이트-반응성(cumate-responsive) 프로모터, 호르몬-반응성 프로모터(예, 포나스테론 A-유도성 프로모터), 및 테트라사이클린-유도성 프로모터로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 재조합효소 인식 부위(RRS)가 측부에 위치한 프로모터이다.
일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 Tet-조절된 프로모터이다. Tet-조절된 프로모터는 최소 프로모터의 상류에 Tet 반응 요소(TRE)를 배치함으로써 개발된다. TRE는 19 뉴클레오티드 테트라사이클린 작동자(tetO) 서열의 7회 반복이며, 테트라사이클린 억제자(tetR)에 의해 인식된다. 내인성 박테리아계에서, 테트라사이클린, 또는 독시사이클린 같은 유사체가 존재하는 경우, tetR이 테트라사이클린에 결합하고 TRE에는 결합하지 않을 것이며, 이에 의해 전사를 허용한다. Tet를 유전자 발현의 조절자로서 사용하기 위해, tetR을 비리온 단백질 16(VP16)의 전사 활성화 도메인과 융합시킴으로써 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA)를 생성하였다(Gossen and Bujard, PNAS (1992) 15:89(12): 5547-5551). 테트라사이클린 부재 시, tTA의 tetR 부분은 TRE에서 tetO 서열에 결합할 것이고, VP16 활성화 도메인은 하류 유전자의 전사를 촉진할 것이다. 테트라사이클린 존재 시, 테트라사이클린은 tTA의 tetR 도메인에 결합하여, ttO 서열에 대한 tTA 결합 및 하류 유전자 발현의 VP16-매개 활성화를 배제한다. 따라서, 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 Tet-조절된 프로모터이며, 여기서 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사는 tTA 단백질의 존재 및 Tet(또는 이의 독시사이클린 유도체)의 부재 시 활성이다. 이러한 프로모터는 테트라사이클린의 부재 시에 활성이기 때문에, 본원에서 Tet-OFF 프로모터로 지칭된다. 일부 실시예에서, tTA 폴리펩티드는 서열번호 853에 의해 암호화된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 Tet-조절된 프로모터이며, 여기서 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사는 Tet(또는 이의 독시사이클린 유도체) 및 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(rtTA)의 존재 시에 활성이다. rtTA는 tetR 도메인이 프로모터에서 tetO 서열에 결합하기 위해 Tet의 존재에 의존하도록 VP16 전사 활성화 도메인 및 돌연변이된 tetR 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 따라서, 하류 유전자의 전사는 테트라사이클린의 부재시 활성이 아니다. 그러나, 테트라사이클린 존재 시, rtTA 단백질의 돌연변이체 tetR 부분은 tetO 서열에 결합하여 VP16-매개 전사 활성화 및 하류 유전자의 발현을 가능하게 할 것이다. 이러한 프로모터는 테트라사이클린의 존재 시에 활성이기 때문에, 본원에서 Tet-ON 프로모터로 지칭된다. 일부 실시예에서, rtTa 단백질은 서열번호 852에 의해 암호화된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결된 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 Tet-ON 프로모터이고, 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 단백질은 rtTA 단백질이다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 Tet-OFF 프로모터이고, 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 단백질은 tTA 단백질이다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 구성적 프로모터는 당 기술분야에 공지되어 있고, 이들에만 한정되지는 않지만, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, Moloney 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 루스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 조기 성장 반응 1(EGR1) 프로모터, 페리틴 H(FerH) 프로모터, 페리틴 L(FerL) 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, 진핵 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1) 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터(UBC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 및 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터를 포함한다.
일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 재조합효소 인식 부위(RRS)가 측부에 위치한 프로모터이다. RRS-측부에 위치한 프로모터는 재조합효소 인식 부위로 구성적 프로모터의 측부에 위치시킴으로써 생성된다. 이러한 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 RRS-측부에 위치한 프로모터에 작동가능하게 연결된 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드, 및 재조합효소 인식 부위 간의 재조합을 매개할 수 있는 재조합효소 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 재조합효소 단백질의 발현은 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 허용한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, RRS-측부에 위치한 프로모터는 역위 프로모터 서열을 포함한다(예를 들어, 도 4b 참조). 재조합효소 발현이 없는 경우, 프로모터 서열은 역위된 상태로 유지되고, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사는 발생하지 않는다. 재조합효소가 발현될 때, 역위된 프로모터 서열이 뒤집혀, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 허용한다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 동일한 폴리뉴클레오티드에 포함된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 양방향 프로모터에 의해 제어된다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 및 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 일차 바이러스의 게놈 내의 상이한 위치에 삽입된 상이한 폴리뉴클레오티드에 포함된다.
일부 실시예에서, 본 개시는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스를 제공하며, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현은 하나 이상의 전사후 제어 요소에 의해 조절된다. 본원에서, "전사후 제어 요소"는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 mRNA 전사체의 풍부도를 조절할 수 있는 프로모터 이외의 임의의 요소를 지칭한다. 전사후 제어 요소는 다양한 전사후 메커니즘을 통해 mRNA 전사물 풍부도를 제어하며, 구성적 또는 유도성 요소일 수 있다. 전사후 제어 요소의 예는 리보자임, 앱타자임, RNAi 분자에 대한 표적 부위(예를 들어, shRNA 표적 부위, microRNA 표적 부위, 인공 microRNA (AmiRNA) 표적 부위), 및 RSS-측부에 위치한 프레임-시프트 또는 정지 코돈 삽입을 포함한다.
일부 실시예에서, 전사후 제어 요소는 mRNA 전사체의 자기-절단을 매개하는 리보자임-암호화 서열이다. 예시적인 리보자임은 Hammerhead 리보자임, Varkud 위성(VS) 리보자임, 헤어핀 리보자임, GIR1 분지 리보자임, glmS 리보자임, 트위스터 리보자임, 트위스터 자매 리보자임, 피스톨 리보자임, 해칫 리보자임, 및 간염 델타 바이러스 리보자임을 포함한다. 이러한 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 게놈은 하나 이상의 내부 리보자임 서열을 포함하여, 바이러스 전사체가 내부적으로 절단되어 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현을 방지하도록 한다.
일부 실시예에서, 전사후 제어 요소는 앱타자임 암호화 서열이다. "앱타자임"은 리간드에 특이적인 통합된 앱타머 도메인을 함유하여 리간드-유도성 자기-절단 리보자임을 생성하는 리보자임 서열이다. 앱타머 도메인에 대한 리간드 결합은 리보자임의 효소 활성을 활성화시켜, RNA 전사체의 절단을 초래한다. 예시적인 앱타자임은 테오필린-의존성 앱타자임(예, 테오필린-의존성 앱타머에 연결된 해머헤드 리보자임, Auslander 등, Mol BioSyst. (2010) 6, 807-814에 기재됨), 테트라사이클린-의존성 앱타자임(예, Tet-의존성 앱타머에 연결된 해머헤드 리보자임, Zhong 등,eLife 2016;5:e18858 DOI: 10.7554/eLife.18858; Win and Smolke, PNAS (2007) 104; 14283-14288; Whittmann and Suess, Mol Biosyt (2011) 7; 2419-2427; Xiao 등, Chem & Biol (2008) 15; 125-1137; 및 Beilstein 등, ACS Syn Biol (2015) 4; 526-534에 기재됨), 구아닌-의존성 앱타자임(예, 구아닌-의존성 앱타머에 연결된 해머헤드 리보자임, Nomura 등, Chem Commun., (2012) 48(57); 7215-7217에 기재됨)을 포함한다. 이러한 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 게놈은 하나 이상의 내부 앱타자임 서열을 포함하여, 바이러스 전사체가 내부적으로 절단되어 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현을 방지하도록 한다. 일부 실시예에서, 본 개시의 리보자임/앱타자임은 TetOff 리보자임/앱타자임이다. 일부 실시예에서, TetOff 앱타자임은 서열번호 913과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, TetOff 앱타자임은 서열번호 914과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, 리보자임/앱타자임은 3' UTR 영역에 위치한다.
일부 실시예에서, 전사후 제어 요소는 RNAi 표적 서열이다. 이러한 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 하나 이상의 RNAi 표적 부위를 포함한다. 본원에 사용된 "RNA 간섭 분자" 또는 "RNAi 분자"는 내인성 유전자 침묵 경로(예, Dicer 및 RNA-유도 침묵 복합체(RISC))를 통해 표적 mRNA 서열의 분해를 매개하는 RNA 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예시적인 RNA 간섭 제제는 micro RNA(miRNA), 인공 microRNA(AmiRNA), 짧은 헤어-핀 RNA(shRNA), 및 소형 간섭 RNA(siRNA)를 포함한다.
일부 실시예에서, 전사후 제어 요소는 miRNA 표적 서열이다. miRNA는 표적 mRNA 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 길이가 약 18-25 뉴클레오티드인 자연적으로 발생하는, 소형 논코딩 RNA 분자를 지칭한다. 동물에서, miRNA에 대한 유전자는, 이중 가닥이며 줄기-루프 구조를 형성하는 일차 miRNA(pri-miRNA)로 전사된다. 그런 다음, 클래스 2 RNase III, Drosha, 및 마이크로프로세서 서브유닛인 DCGR8을 포함하는 마이크로프로세서 복합체에 의해 pri-miRNA가 핵 내에서 절단되어, 70-100 뉴클레오티드 전구체 miRNA(pre-miRNA)를 형성한다. pre-miRNA는 헤어핀 구조를 형성하고, 이는 세포질로 운반되며, 여기에서 RNase III 효소, Dicer에 의해 약 18-25 뉴클레오티드의 miRNA 이중체로 가공된다. 이중 가닥 중 어느 하나가 잠재적으로 기능적 miRNA로서 작용할 수도 있지만, 통상적으로 miRNA의 한 가닥이 분해되고 단 한 가닥만이 아르고노트(AGO) 뉴클레아제 상에 로딩되어 miRNA 및 이의 mRNA 표적이 상호 작용하는 효과기 RNA-유도 침묵 복합체(RISC)를 생성한다(Wahid 등, 1803:11, 2010, 1231-1243).
일부 실시예에서, 전사후 제어 요소는 siRNA 표적 서열이다. siRNA는 일반적으로 약 21-23 뉴클레오티드의 길이인 이중 가닥 RNA 분자를 지칭한다. 이중체 siRNA 분자는, "패신저" 센스 가닥이 이중체로부터 효소적으로 절단되는, RNA-유도 침묵 복합체(RISC)로 불리는 다중 단백질 복합체와 연관함으로써 세포질에서 가공된다. 그런 다음, 활성화된 RISC에 함유된 안티센스 "가이드" 가닥이 서열 상보성에 의해 RISC를 상응하는 mRNA로 가이드하고, AGO 뉴클레아제는 표적 mRNA를 잘라서, 특이적 유전자 침묵을 초래한다. 일부 실시예에서, siRNA 분자는 shRNA 분자로부터 유래된다. shRNA는 줄기-루프 구조를 형성하는 길이의 단일 가닥 인공 RNA 분자 약 50-70 뉴클레오티드이다. 일부 실시예에서, shRNA는 pre-miRNA를 모방하고, Drosha 가공을 우회할 수 있고, Dicer에 의한 가공을 위해 직접 내보내질 수 있다. 일부 실시예에서, shRNA는 miRNA-기반 shRNA이다. 세포에서의 miRNA-기반 shRNA의 발현은 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 의해 miRNA-기반 shRNA를 암호화하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 달성된다. 그런 다음, miRNA-기반 shRNA은 pri-miRNA의 줄기-루프 구조를 모방하는 생성물로 전사되고, 마찬가지로 Drosha에 의해 핵에서 가공되어 헤어-핀 루프 구조를 갖는 단일 가닥 RNA를 형성한다. 헤어-핀 RNA를 세포질로 내보낸 후, Dicer에 의해 헤어-핀을 가공하여 이중 siRNA 분자를 형성하고, 이는 이어서 RISC에 의해 추가로 가공되어 표적-유전자 침묵을 매개한다.
일부 실시예에서, 전사후 제어 요소는 인공 microRNA(AmiRNA)이다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 하나 이상의 RNAi 표적 부위, 및 RNAi 표적 부위에 결합하는 하나 이상의 RNAi 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 실시예에서, 하나 이상의 RNAi 분자는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 게놈에서 표적 서열에 결합하여, 하나 이상의 RNAi 분자의 발현이 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 mRNA 전사체의 분해를 초래함으로써, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현을 방지하도록 한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 RNAi 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 실시예에서, 하나 이상의 RNAi 분자의 조절된 발현은 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 비정상적인 발현을 방지하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 하나 이상의 RNAi 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드는 제2 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 제1 조절가능 프로모터는 Tet-ON 프로모터(예, 서열번호 844)이고, 제2 조절가능 프로모터는 Tet-OFF 프로모터(예, 서열번호 845)이다. 이러한 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현은 Tet의 존재 시에 활성화되어, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현이 원하는 시간에 촉발될 수 있게 한다. Tet의 투여 전에(즉, Tet의 부재 시에), RNAi 분자가 발현된다. 따라서, Tet의 부재 시에 생산된 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 임의의 RNA 전사체는 RNAi 분자에 의해 표적화되어, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 비정상적인 발현을 방지할 것이다. 일부 실시예에서, 제1 조절가능 프로모터는 Tet-OFF 프로모터이고, 제2 조절가능 프로모터는 Tet-ON 프로모터이다. 이러한 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 Tet와 조합하여 투여될 수 있어서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현이 분해에 의해 Tet가 제거된 후에 촉발되도록 한다. Tet가 존재하는 동안, RNAi 분자가 발현되고, 분해를 위해 Tet의 존재 시에 생산된 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 표적 RNA 전사체에 의해, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 비정상적인 발현을 방지한다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 제1 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결된 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 제2 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 RNAi 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드; 및 제1 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 제1 단백질 및/또는 제2 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 제2 단백질을 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 조절가능 프로모터는 Tet-On 프로모터이고, 제1 단백질은 rtTA이다. 일부 실시예에서, 제2 조절가능 프로모터는 Tet-On 프로모터이고, 제2 단백질은 rtTA이다. 일부 실시예에서, 제1 조절가능 프로모터는 Tet-OFF 프로모터이고, 제1 단백질은 tTA이다. 일부 실시예에서, 제2 조절가능 프로모터는 Tet-OFF 프로모터이고, 제2 단백질은 tTA이다. 일부 실시예에서, 제1 조절가능 프로모터는 Tet-On 프로모터이고, 제1 단백질은 rtTA이고, 제2 조절가능 프로모터는 Tet-OFF 프로모터이고 제2 단백질은 tTA이다. 일부 실시예에서, 제1 조절가능 프로모터는 Tet-OFF 프로모터이고, 제1 단백질은 tTA이고, 제2 조절가능 프로모터는 Tet-ON 프로모터이고 제2 단백질은 rtTA이다.
이중 종양용해 바이러스 작제물의 비제한적인 예가 도 2에 도시되어 있다. 여기서, 일차 바이러스는 재조합 HSV이고 이차 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA 바이러스 또는 음성-센스 단일-가닥 RNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스는 SVV 및 CVA21로부터 선택된 양성-센스 단일-가닥 RNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스는 VSV(음성-센스 RNA 바이러스)이다. 이차 바이러스의 바이러스 게놈은 일차 HSV 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입된다. 일부 실시예에서, 삽입 부위는 HSV의 UL37과 UL38 사이의 유전자간 영역이다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스 게놈의 발현은 테트라사이클린-반응성 Pol II 프로모터(검은색 화살표) 및 RNA 중합효소 I 프로모터(회색 화살표)에 의해 조절된다.
도 5 내지 도 7은 전사 제어 요소(예컨대, 조절가능 프로모터) 및 전사 후 제어 요소(예컨대, 리보자임 및/또는 RNAi 메커니즘)의 조합을 사용하여, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 바이러스 게놈의 발현, 활성화 및 분해를 제어하는 비제한적인 예를 제공한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 게놈 또는 이차 바이러스 게놈을 암호화하는 mRNA의 전사는 조절가능 프로모터(예, TetOn 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 게놈 또는 이차 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 바이러스 게놈 전사체로부터 비-바이러스 RNA를 제거할 수 있는 TetOn-리보자임(TetOn-R) 및/또는 RNAi 표적 서열(예, AmiRNA)이 측부에 위치한다. 일부 실시예에서, 바이러스 게놈 전사체의 분해는 또한 조절성 제어 하에 있는 추가적인 조절성 메커니즘(예를 들어, 내부 TetOff 리보자임, RNAi 분자)에 의해, 선택적으로는 조절가능 프로모터를 제어하는 동일한 조절성 메커니즘에 의해 제어된다.
도 5는 예시적인 내재된(nested) 종양용해 바이러스 작제물 또는 내재된 바이러스 작제물을 생산하기 위해 일차 종양용해 바이러스 게놈 또는 일차 바이러스 게놈에 삽입될 수 있는 성분의 예시적인 개략도를 도시한다. 이러한 비제한적인 예에서, rtTA 펩티드의 발현은 구성적으로 활성인 프로모터의 제어 하에 있고, 이차 바이러스 게놈의 발현은 테트라사이클린 반응성(TetOn) Pol II 프로모터의 제어 하에 있어서, 바이러스 게놈의 전사가 Tet 및 rtTA 펩티드의 존재 시에 발생하도록 한다. 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 전사체의 발현은 내부 TetOff-리보자임(TetOff-R)에 의해 추가로 조절되어서, 전사체가 Tet의 부재 시에 분해된다. 또한, 이차 바이러스 전사체는 5' 및 3' TetOn-리보자임(TetOn-R)에 의해 활성화되어, mRNA 전사체가 5' 및 3' 말단에서 Tet의 존재 시에 가공되며, 이는 과잉 뉴클레오티드가 측부에 위치하지 않고 바이러스 게놈의 RNA 전사체를 생성한다. 따라서, 본 예시에서, Tet의 존재는 이차 종양용해 바이러스 게놈 또는 이차 바이러스 게놈의 전사 및 활성화를 개시하며, 동시에 이의 분해를 방지한다.
도 6은 예시적인 내재된 종양용해 바이러스 작제물 또는 내재된 바이러스 작제물을 생산하기 위해 일차 종양용해 바이러스 게놈 또는 일차 바이러스 게놈에 삽입될 수 있는 성분의 예시적인 개략도를 도시한다. rtTA 및 테트라사이클린 전사활성화제(tTA) 펩티드의 발현은 구성적으로 활성인 프로모터의 제어 하에 있다. 이차 바이러스 게놈의 발현은 TetOn Pol II 프로모터의 제어 하에 있어서, 바이러스 게놈의 전사가 Tet 및 rtTA 펩티드의 존재 시에 발생하도록 한다. 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 전사체의 발현은 이차 바이러스의 mRNA 전사체에서 표적 서열에 특이적인 shRNA에 의해 추가로 조절된다. shRNA의 발현은 TetOff 프로모터의 제어 하에 있어서, shRNA의 전사가 Tet의 부재 및 tTA 펩티드의 존재 시에 발생하도록 한다. 또한, 이차 바이러스 전사체는 5' 및 3' TetOn-R에 의해 활성화되어, mRNA 전사체는 Tet의 존재 시에 5' 및 3' 말단에서 처리되며, 이는 과잉 뉴클레오티드가 측부에 위치하지 않고 바이러스 게놈의 RNA 전사체를 생성한다. 따라서, 본 예시에서, Tet의 존재는 이차 종양용해 바이러스 게놈 또는 이차 바이러스 게놈의 전사 및 활성화를 개시하며, 동시에 이의 분해를 방지한다.
도 7은 예시적인 내재된 종양용해 바이러스 작제물을 생산하기 위해 일차 종양용해 바이러스 게놈 또는 일차 바이러스 게놈에 삽입될 수 있는 성분의 예시적인 개략도를 도시한다. rtTA 및 tTA 펩티드의 발현은 구성적으로 활성인 프로모터에 의해 제어 하에 있다. 이차 바이러스 게놈의 발현은 TetOn Pol II 프로모터의 제어 하에 있어서, 바이러스 게놈의 전사가 Tet 및 rtTA 펩티드의 존재 시에 발생하도록 한다. 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 전사체의 발현은 이차 바이러스의 mRNA 전사체에서 표적 서열에 특이적인 shRNA에 의해 추가로 조절된다. shRNA의 발현은 TetOff 프로모터의 제어 하에 있어서, shRNA의 전사가 Tet의 부재 및 tTA 펩티드의 존재 시에 발생하도록 한다. 또한, 이차 바이러스 전사체는 AmiRNA 표적 부위와 3' TetOn-R에 의한 5' 말단의 절단에 의해 활성화되어, mRNA 전사체가 Tet의 존재 시에 5' 말단 상에서 가공되도록 한다.
일부 실시예에서, 부위-유도 재조합 시스템은 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현을 제어하기 위해 사용된다. 이러한 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 재조합효소 인식 부위를 포함하는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 상응하는 재조합효소 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 재조합효소 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드는, 유도성 프로모터 또는 달리 조절가능 프로모터의 제어 하에 있어서 재조합효소 단백질의 발현이 일시적으로 조절될 수 있도록 한다. 본 개시에서 사용하기에 적합한 부위-유도 재조합 시스템은, 플립파아제(FLP) 재조합효소에 의해 인식되는 플립파아제 인식 표적(FRT) 부위를 포함하는 FRT/FLP 시스템 및 Cre 재조합효소에 의해 인식되는 loxP 부위를 포함하는 Cre/Lox 시스템을 포함하여, 당 기술분야에 공지되어 있다.
일부 실시예에서, 재조합효소는 Flp 재조합효소이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 FRT 부위(예를 들어, FRT-1 부위, FRT-14 부위)이다. 일부 실시예에서, FRT-1 부위는 서열번호 850 또는 이의 상보체와 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 FRT-14 부위이다. 일부 실시예에서, FRT-14 부위는 서열번호 851 또는 이의 상보체와 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 실시예에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 Dre 재조합효소이다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 ΦC31(phiC31) 재조합효소이다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 λ 인테그라아제(integrase)이다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 아래 표 1로부터 선택된다:
표 1. 재조합효소 및 예시적인 표적 부위/서열 목록
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일부 실시예에서, 재조합효소의 발현은 기능적 이차 종양용해 바이러스 또는 기능적 이차 바이러스의 발현을 초래한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 재조합효소 인식 부위가 측부에 위치한 하나 이상의 프레임-시프트 또는 정지 코돈 삽입을 포함한다(예를 들어, 도 4a 참조). 재조합효소 발현의 부재 시에, 전사된 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 프레임-시프트 또는 정지 코돈 삽입을 포함하며, 이는 기능적 이차 종양용해 바이러스 또는 기능적 이차 바이러스의 발현을 방지한다. 재조합효소 단백질의 발현이 활성화되거나 유도될 때, 프레임-시프트 또는 정지 코돈 삽입은 제2 폴리뉴클레오티드로부터 절제되어, 기능적 이차 종양용해 바이러스 또는 기능적 이차 바이러스의 발현을 허용한다(예를 들어, 도 4a 참조). 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스 또는 이의 일부분을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 반전되고 재조합효소 인식 부위가 측부에 위치한다. 재조합효소 발현의 부재 시에, 전사된 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 기능적 이차 종양용해 바이러스 또는 기능적 이차 바이러스의 발현을 방지하는 반전된 부분을 포함한다. 재조합효소 단백질의 발현이 활성화되거나 유도될 때, 반전된 부분은 정확한 배향으로 뒤집혀, 기능적 이차 종양용해 바이러스 또는 기능적 이차 바이러스의 발현을 허용한다(예를 들어, 도 4b 참조).
일부 실시예에서, 재조합효소의 발현은 기능적 이차 종양용해 바이러스 또는 기능적 이차 바이러스의 발현을 방지한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 재조합효소 인식 부위가 측부에 위치한다. 재조합효소 발현의 부재 시에, 폴리뉴클레오티드가 전사되어 기능성 이차 종양용해 바이러스 또는 기능성 이차 바이러스를 생산한다. 재조합효소 단백질의 발현이 활성화되거나 유도될 때, 재조합효소 인식 부위 사이의 재조합은 폴리뉴클레오티드의 역위를 초래하여, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현을 방지할 수 있다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 제어하는 프로모터는 재조합효소 인식 부위가 측부에 위치한다. 재조합효소 발현의 부재 시에, 프로모터는 기능성을 유지하고 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 전사를 허용한다. 재조합효소 단백질의 발현이 활성화되거나 유도될 때, 재조합효소 인식 부위 간의 재조합은 프로모터의 반전을 초래하여, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현을 방지할 수 있다.
도 8의 비제한적인 예에 도시된 바와 같이, 적어도 3개의 수준의 제어가 재조합효소 시스템으로 조작될 수 있으며, 이는 이차 종양용해 바이러스(OV2) 또는 이차 바이러스의 발현에 대한 엄격한 시간 조절을 제공할 수 있다.
제1 수준은 재조합효소의 전사 제어이다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 재조합효소의 코딩 영역에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 TetOn 프로모터이다. 일부 실시예에서, 조절가능 프로모터는 박테리아 TetR 억제자에 의한 전사 억제를 허용한다. 일부 실시예에서, 프로모터 활성은 독시사이클린의 첨가를 통해 탈-억제되며, 이는 재조합효소의 발현을 초래한다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 Flp 재조합효소 또는 이의 융합 단백질이다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소 또는 이의 융합 단백질이다.
도 3은 재조합효소를 암호화하는 mRNA의 전사를 조절하는 데 사용될 수 있는 예시적인 제어 요소를 도시한다. 이러한 비제한적인 예는 T7 RNA 중합효소 또는 재조합효소를 활성화하는 바이러스의 발현 및/또는 기능을 조절하기 위한 제어 요소를 도시한다. 일부 실시예에서, 전사 제어는 종양 특이적 프로모터 또는 조절가능 프로모터로 달성될 수 있다. 일부 실시예에서, 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 전사후 제어 요소를 포함한다. 전사후 제어 요소는 조절 mRNA 또는 mRNA로 암호화된 단백질 반감기, miRNA 표적 부위, Tet-ON miR-T 요소, Tet-OFF 리보자임/앱타자임, 및 리간드 의존성, 종양 세포 특이적, 또는 구성적 방식으로 전사체 풍부도를 제어하는 이들의 임의의 조합을 하는 것을 포함한다. 일부 실시예에서, 추가의 제어 요소는 그의 반감기, 세포하 편재화 및/또는 활성을 제어하기 위해 암호화된 폴리펩티드(예를 들어, 재조합효소)로 조작될 수 있다. 예시적인 Tet-On miR-T 요소는 Mou 등의 Mol Ther. 2018 May 2;26(5):1277-1286에 기술되어 있다. 예시적인 Tet-On 리보자임/앱타자임은 Zhong 등의 Elife. 2016 Nov 2;5:e18858에 기술되어 있다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 mRNA 불안정화 요소는 재조합효소 발현 카세트 내에 삽입된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 mRNA 불안정화 요소는 재조합효소를 암호화하는 mRNA 전사체를 탈안정화하고/하거나 mRNA 전환을 증가시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 mRNA 탈안정화 요소의 존재는, 시스템이 (예를 들어, 외인성 제제에 의해) 유도될 때 의도된 재조합 반응을 매개하기에 충분한 재조합효소만이 존재하도록, 유도되지 않은 상태에서 재조합효소 mRNA의 누출 발현을 감소시키거나 최소화할 수 있다. 일부 실시예에서, mRNA 탈안정화 요소는 c-fos 코딩 요소를 포함한다. 일부 실시예에서, c-fos 코딩 요소는 서열번호 894과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, mRNA 탈안정화 요소는 c-fos 유전자의 3'UTR 유래의 AU-풍부 요소를 포함한다. 일부 실시예에서, c-fos 유전자의 3'UTR 유래의 AU-풍부 요소는 서열번호 895과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, mRNA 탈안정화 요소는 선택적으로 일렬로, FCE 및 ARE의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, FCE와 ARE의 조합은 서열번호 896과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 인트론이 재조합효소 코딩 영역에 삽입된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 인트론의 존재는 원핵 발현 시스템(예를 들어, 원핵 세포가 재조합효소를 암호화하는 벡터를 생성하는 데 사용되는 경우)에서 재조합효소의 바람직하지 않은 누출 발현을 방지하거나 최소화할 수 있다.
제2 수준은 재조합효소 활성의 번역 후 제어이다. 일부 실시예에서, 재조합효소의 활성 및/또는 세포 편재화는 조절가능하다. 일부 실시예에서, 재조합효소의 활성 및/또는 세포 편재화는 외인성 제제(예:리간드 또는 소분자)에 의해 조절된다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 하나 이상의 활성 제어 도메인에 융합된다. 일부 실시예에서, 외인성 제제(예를 들어, 리간드 또는 소분자)는 하나 이상의 활성 제어 도메인을 통해 재조합효소의 세포 활성 및/또는 편재화를 조절한다. 일부 실시예에서, 활성 제어 도메인은 에스트로겐 수용체(ER)의 변형된 리간드 결합 도메인이다. 리간드 부재 시, 융합 단백질(재조합효소-ER)은 세포질 내에 보유되며, 여기서 융합 단백질은 재조합을 촉매할 수 없지만, 상응하는 소분자(예를 들어, 4-하이드록시타목시펜)의 첨가로 융합 단백질이 핵으로 전위되어 재조합을 수행할 수 있게 한다. 일부 실시예에서, 활성 제어 도메인은 프로게스테론 수용체(PR) 또는 이의 부분이다. 일부 실시예에서, 상응하는 융합 단백질(재조합효소-PR)의 활성은 프로게스테론 유사체 RU-486으로 유도된다. 일부 실시예에서, 활성 제어 도메인은 변형된 대장균 디하이드로엽산 환원효소(DHFR) 단백질이다. 일부 실시예에서, 상응하는 융합 단백질(재조합효소-DHFR)은 불안정하고, 유도제의 부재 시 프로테아좀에서 신속하게 분해된다. 일부 실시예에서, 상응하는 유도제는 항생제 트리메토프림(TMP)이고, 융합 단백질은 안정화되고, 핵으로 전위되고, TMP의 존재 시에 재조합을 수행한다.
일부 실시예에서, 재조합효소는 Flp이고, 활성 제어 도메인은 에스트로겐 수용체(ER)의 변형된 리간드 결합 도메인이다. 일부 실시예에서, Flp-ER 융합 단백질은 서열번호 846에 의해 암호화된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, Flp-ER 융합 단백질은 서열번호 847에 의해 암호화된 아미노산 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 융합 단백질은 RGS 링커를 포함한다. 일부 실시예에서, 융합 단백질은 XTEN 링커를 포함한다. 일부 실시예에서, 융합 단백질은 NLS 및/또는 PEST 서열을, 임의로는 융합 단백질의 N-말단에서 포함한다. 일부 실시예에서, NLS 서열은 서열번호 848과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, PEST 서열은 서열번호 849과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, FLP-RGS-ER 융합 폴리펩티드는 서열번호 846과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, FLP-XTEN-ERT2 폴리펩티드는 서열번호 847과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
제3 수준은 OV2 발현의 전사 제어이며, 여기서 재조합효소는 프로모터 및 OV2의 코딩 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 일부분의 절제 및/또는 역위를 매개하여, OV2 바이러스 게놈 전사체 발현의 활성화 또는 불활성화를 초래한다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 폴리뉴클레오티드의 일부분의 절제를 매개한다(예를 들어, 전사 종결 신호를 제거하기 위해). 일부 실시예에서, 재조합효소는 폴리뉴클레오티드의 일부분의 역위를 매개한다(예를 들어, 프로모터의 제어 하에 OV2의 코딩 영역을 배치함). 일부 실시예에서, 재조합효소는 절제 및 반전 모두를 매개한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 인트론 영역이 폴리뉴클레오티드 내에 도입된다. 일부 실시예에서, 인트론 영역은 성숙 OV2 바이러스 게놈 전사체로부터 재조합효소 인식 부위를 제거한다.
도 4a 내지 도 4b는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현을 제어하기 위한 부위-유도 재조합 시스템의 예시적인 용도를 도시한다. 도 4a는 FLP 또는 다른 재조합효소에 의해 절제될 수 있는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 프레임시프트/정지 코돈을 삽입하기 위한 계획을 보여준다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 바이러스 게놈은 재조합 부위(예를 들어, FRT 부위)가 측부에 위치하는, 정지 코돈(들) 또는 코딩 영역의 프레임시프트를 유발하는 폴리뉴클레오티드의 삽입에 의해 불활성이 된다. 상응하는 재조합효소(FLP 단백질)의 존재 시에, 정지 코돈(들) 또는 코딩 영역의 프레임시프트를 유발하는 폴리뉴클레오티드를 제거하여 기능적 바이러스 게놈을 생성할 수 있다. 유사하게, 도 4b는 재조합 부위가 측부에 위치한 비활성 역위 프로모터를 도시하며, 이는 상응하는 재조합효소의 존재 시에 정확한 배향으로 반전되면 활성화될 수 있다.
도 9 내지 도 11은 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 제어하는 데 사용될 수 있는 예시적인 재조합효소-반응성 카세트를 도시한다.
재조합효소-반응성 절제 카세트(RREC)는 표적 폴리뉴클레오티드(예:cDNA)의 발현을 제어하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, RREC는 제어 요소의 각각의 측면 상의 중간 및 측부에 위치하는 재조합효소 인식 부위에 제어 요소를 포함한다.
일부 실시예에서, 재조합효소-반응성 절제 카세트(RREC)는 다음 구성을 채택한다:
5' - 재조합효소 인식 부위 A1 - 제어 요소 - 재조합효소 인식 부위 A2 - 3',
여기서 상기 재조합효소 인식 부위는 상응하는 재조합효소의 존재 시에 제어 요소의 절제를 매개한다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위 A1 및 A2는 동일한 배향에 있다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위 A1 및 A2는 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 Flp 재조합효소이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 FRT 부위이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 FRT-1 부위이다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 Lox 부위이다.
일부 실시예에서, 제어 요소는 전사/번역 종결 요소(STOP)를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, 전사/번역 종결 요소(STOP)는 선택적으로 각각의 판독 프레임에서, 하나 이상의 번역 정지 코돈을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, 전사/번역 종결 요소(STOP)는 하나 이상의 전사 종결 신호를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, 전사/번역 종결 요소(STOP)는 각각의 판독 프레임에서 다수의 번역 정지 코돈을 암호화하는 DNA 서열에 이어서 전사 종결 신호(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, 제어 요소는 하류 개방 판독 프레임의 프레임시프트를 유발하는 DNA 서열로 이루어진, 프레임시프트 요소를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, 추가 뉴클레오티드가 제어 요소와 재조합효소 인식 부위 중 하나 이상 사이에 한쪽 또는 양쪽에 존재한다. 일부 실시예에서, RREC는 프로모터와 코딩 영역(예를 들어, 개방 판독 프레임) 사이에 배치된다. 일부 실시예에서, RREC는 전사체의 5'-UTR에 배치된다. 일부 실시예에서, RREC는 프로모터 영역에 배치된다. 일부 실시예에서, RREC는 코딩 영역(예를 들어, 개방 판독 프레임)에 배치된다. 일부 실시예에서, STOP 요소는 서열번호 854과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, STOP 요소는 서열번호 855과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, STOP 요소는 서열번호 856과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
RREC의 비제한적인 예인 STOP 카세트가 도 9에 도시되어 있으며, 여기서 재조합효소는 Flp이고, 양쪽 재조합효소 인식 부위가 동일한 배향의 FRT-1 부위이고, 제어 요소는 전사/번역 종결 요소(STOP)이다. 일부 실시예에서, STOP 카세트는 최소 FRT 요소의 일렬 직접 반복이 측부에 위치한 (STOP) 요소를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 실시예에서, 전사/번역 종결 요소는 각각의 판독 프레임에서 다수의 번역 정지 코돈을 암호화하는 DNA 서열에 이어서 폴리아데닐화 신호를 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, STOP 카세트는 상응하는 전사체의 5'-UTR에 위치되도록 조절되는 관심 cDNA와 프로모터 사이에 삽입된다. Flp 재조합효소의 부재 시, STOP 카세트는 안정적으로 통합된 채로 유지되고 전사를 종결시켜 관심 cDNA의 발현을 방지하는 기능을 한다. Flp 재조합효소의 존재 시, 이는 일렬 FRT 요소 간의 재조합을 매개하고 STOP 요소를 비가역적으로 절제하여, 관심 cDNA의 발현을 활성화시킬 것이다. 일부 실시예에서, STOP 요소는 (예를 들어, STOP 1, 서열번호 854에서와 같은) 단일 합성 폴리아데닐화 신호를 함유한다. 일부 실시예에서, STOP 요소는 STOP2(서열번호 855) 및 STOP3(서열번호 856)에서와 같이, 다수의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 실시예에서, 다수의 폴리아데닐화 신호를 갖는 것은 전사 종결의 효율을 증가시킨다. 일부 실시예에서, STOP 카세트는 서열번호 857과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, STOP 카세트는 서열번호 858과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시예에서, STOP 카세트는 서열번호 859과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
발현 제어의 추가 층은 재조합효소 반응성 역위 카세트(RRIC)를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시예에서, RRIC는 제어 요소의 각 측면 상의 중앙 및 측부 재조합효소 인식 부위를 포함한다.
일부 실시예에서, 재조합효소 반응성 역위 카세트(RRIC)는 다음 구성을 채택한다:
5' - 재조합효소 인식 부위 A1 - 중앙 요소 - 재조합효소 인식 부위 A2 - 3',
재조합효소 인식 부위 A1 및 A2는 상응하는 재조합효소의 존재 시 중앙 요소의 배향의 반전을 매개한다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위 A1 및 A2는 반대 배향이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위 A1 및 A2는 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 Flp 재조합효소이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 FRT 부위이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 FRT-1 부위이다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 Lox 부위이다.
일부 실시예에서, RLIC의 중앙 요소는 프로모터 또는 프로모터의 일부분을 포함하거나 이로 구성되며, 이러한 RRIC는 선택적으로 코딩 영역의 상류에 배치될 수 있다. 일부 실시예에서, RLIC의 중앙 요소는 코딩 영역(예를 들어, 개방 판독 프레임) 또는 코딩 영역의 일부분을 포함하거나 이로 구성되며, 이러한 RRIC는 선택적으로 프로모터 영역의 하류에 배치될 수 있다. 일부 실시예에서, 코딩 영역은 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 바이러스 게놈을 암호화한다. 일부 실시예에서, 추가 뉴클레오티드는 중앙 요소와 하나 이상의 재조합효소 인식 부위 사이에 한쪽 또는 양쪽에 존재한다.
일부 실시예에서, RRIC는 중앙 요소의 각 측면 상에 2개 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함한다. 일부 실시예에서, RRIC은 다음 구성을 채택한다:
5' - 재조합효소 인식 부위 A1 - 재조합효소 인식 부위 B1 - 중앙 요소 - 재조합효소 인식 부위 A2 - 재조합효소 인식 부위 B2 - 3',
여기서 재조합효소 인식 부위 쌍 A1 및 A2, 및/또는 재조합효소 인식 부위 쌍 B1 및 B2은, 상응하는 재조합효소의 존재 시 중앙 요소의 배향의 반전을 매개할 수 있다. 일부 실시예에서, 이들 두 쌍은 서로 직교한다(즉, 재조합효소 인식 부위 A의 하나 및 재조합효소 인식 부위 B의 하나에 의해 매개되는 역위 없음). 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위 A1 및 A2는 반대 배향이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위 A1 및 A2는 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위 B1 및 B2는 반대 배향이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위 B1 및 B2는 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 Flp 재조합효소이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 FRT 부위이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위의 한 쌍(쌍 A 또는 쌍 B)은 FRT-1 부위를 포함하고, 다른 한 쌍은 FRT-14 부위를 포함한다. 일부 실시예에서, 재조합효소는 Cre 재조합효소이다. 일부 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 Lox 부위이다. 추가적인 폴리뉴클레오티드가 상기 구성에서 이들 요소 사이에 존재할 수 있다.
일부 실시예에서, 한 쌍의 재조합효소 인식 부위(쌍 A 또는 쌍 B)에 의해 매개된 역위는 다른 한 쌍을 동일한 배향이 되게 하여, 다른 한 쌍의 재조합효소 인식 부위가 이제 RRIC의 일부의 절제를 매개할 수 있도록 하며, 다음과 같은 새로운 폴리뉴클레오티드 구성을 초래하게 된다:
5' - 재조합효소 인식 부위 A - 중앙 요소(역위됨) - 재조합효소 인식 부위 B - 3'.
일부 실시예에서, 일단 절제가 이루어지면, 반응은 비가역적이다. 따라서, 이러한 구성으로 두 쌍의 재조합효소 인식 부위를 갖는 것의 이점 중 하나는 중앙 요소의 역위가, 일단 재조합효소에 의해 수행되면, 비가역적일 수 있다는 것이다.
추가적인 요소가 RRIC에 통합될 수 있다. 비제한적인 예로서, 하나 이상의 제어 요소가 RRIC에 통합될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 제어 요소는 재조합효소 인식 부위 사이의 하나 이상의 영역에 통합될 수 있다. 일부 실시예에서, 제어 요소는 본 개시의 STOP 요소 또는 다른 전사/번역 종결 신호일 수 있다. 일부 실시예에서, 전사/번역 종결 신호의 도입은 코딩 영역 근처의 암호화 프로모터 영역 및/또는 전사 개시 신호로 인해 기능적 페이로드 단백질 또는 바이러스 게놈의 우발적 또는 누출 발현을 방지한다.
따라서, 일부 실시예에서, RRIC은 다음 구성을 채택한다:
5' - 재조합효소 인식 부위 A1 - 제어 요소 1 (선택적) - 재조합효소 인식 부위 B1 - 중앙 요소 - 재조합효소 인식 부위 A2 - 제어 요소 2 (선택적) - 재조합효소 인식 부위 B2 - 3',
여기서 제어 요소 중 하나 또는 둘 모두가 RRIC에 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 제어 요소는 동일하다. 일부 실시예에서, 제어 요소는 상이하다. 일부 실시예에서, 제어 요소 중 하나 이상은 STOP 요소이다.
전술한 RRIC의 비제한적인 예가 도 10a에 도시되어 있으며, 여기서 재조합효소는 Flp이고, 재조합효소 인식 부위는 FRT-1 및 FRT-14이고, 제어 요소는 STOP3 요소이고, 중앙 요소는 프로모터이다. 프로모터는 반전이 발생하기 전에 관심 cDNA에 대해 반전되도록 배향되며, 따라서 Flp 재조합효소의 부재 시에 cDNA 발현을 유도할 수 없다. Flp 재조합효소의 부재 시, STOP 카세트는 또한 안정적으로 통합된 채로 유지되고 전사를 종결시켜 역위 프로모터 요소의 배향을 보존하도록 기능한다. Flp 재조합효소의 존재 시, 역위 FRT 요소(FRT-1 또는 FRT-14 중 하나)의 한 쌍 사이의 재조합을 매개하고 이들 사이에 위치한 모든 요소를 반전시킬 것이다. 도 10a에서, 이러한 역위 이벤트는 FRT-1 요소에 대해 도시되어 있지만, FRT-14 요소에 대해 유사한 반응이 발생할 수 있다. 역위 이벤트는 cDNA 발현을 잠재적으로 유도할 수 있도록 프로모터를 배향하고, 또한 다른 FRT 쌍의 반대 FRT 요소를 반전된 반복 방향에서 직접 반복 방향으로 변환할 수 있음을 주목한다. 충분한 FLP를 여전히 이용할 수 있는 경우, 도 10a의 FRT-14에 대해 도시된 바와 같이, 제1 반응을 반전시키고 원래 구성을 재생하거나, 일련의 직접 반복 FRT 요소를 재조합함으로써, 제2 재조합 반응을 매개할 수 있다. 이러한 제2 반응은 STOP 요소를 비가역적으로 절제하고 관심 cDNA의 발현을 활성화시킬 것이다. 도 10a의 설계는 때때로 본 개시에서 "프로모터 역위 설계"로서 지칭된다. 예시적인 프로모터 역위 설계는 서열번호 860로서 본원에 제공된다. 유사하게, 도 10b는, 프로모터 역위 요소와 유사한 프로세스지만 프로모터 대신에 cDNA 페이로드의 역위를 수반하지만, FLP 재조합효소의 존재 시 역위될 중앙 요소로서 페이로드 코딩 영역을 갖는 RRIC의 비제한적인 예를 도시한다. 도 10b의 설계는 때때로 본 개시에서 "페이로드 역위 설계"로 지칭된다. 예시적인 페이로드 역위 설계는 서열번호 861로서 본원에 제공된다.
일부 실시예에서, 하나 이상의 인트론 및/또는 스플라이싱 요소가 본 개시의 카세트 내에 삽입된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 인트론은 RRIC에 삽입되고/되거나 이에 인접한다. 일부 실시예에서, 발현 카세트는 다음 구성을 채택한다:
5' - 재조합효소 인식 부위 A1 - 제어 요소 1 (선택적) - 재조합효소 인식 부위 B1 - 인트론 보유 중앙 요소 C1- 재조합효소 인식 부위 A2 - 제어 요소 2 (선택적) - 재조합효소 인식 부위 B2 - 인트론 C2 - 3' 코딩 영역 - 3',
여기서 인트론 보유 중앙 요소 C1는 다음 구성을 포함한다:
5' - 프로모터 - 5' 코딩 영역 - 인트론 C1 - 3' (카세트 내 반전된 배향),
일부 실시예에서, 카세트 내의 5' 코딩 영역의 초기 배향은 3' 코딩 영역의 배향과 반대이다. 일부 실시예에서, 추가 뉴클레오티드는 이들 요소 중 어느 하나 또는 전부 사이에 존재한다. RRIC의 경우와 같이, 재조합효소는 재조합효소 인식 부위를 통해 역위/절제 이벤트를 매개할 수 있고, 최종 비가역적 재조합 산물은 다음 구성을 채택한다:
5' - 재조합효소 인식 부위 A - 프로모터 - 5' 코딩 영역 - 인트론 C1 - 재조합효소 인식 부위 B - 인트론 C2 - 3' 코딩 영역 - 3',
여기서 mRNA 전사 후 인트론을 인트론 영역으로 제거하는 것은(인트론 C1 및 인트론 C2 요소에 의해 매개됨) 코딩 영역 내부에 여분의 뉴클레오티드가 없는 완전한 코딩 영역을 생성시킨다. 일부 실시예에서, 본원에 설명된 바와 같은 하나 이상의 인트론 영역을 도입하는 것은 코딩 영역 근처의 암호화 프로모터 영역 및/또는 전사 개시 신호의 존재로 인해 기능적 페이로드 단백질 또는 바이러스 게놈의 우발적 또는 누출 발현을 방지한다.
비제한적인 예가 도 11에 도시되어 있다(본 개시에서 때때로 "분할 인트론 역위 설계"로 지칭됨). 예시적인 분할 인트론 역위 설계는 서열번호 862로서 본원에 제공된다. 분할 인트론 역위 설계는 프로모터 역위 설계와 유사하게 기능한다. 그러나, 주요 차이는 cDNA가 코딩 영역을 파괴하는 ACTB 유전자(서열번호 863)의 인트론 3에 기초하여 한 쌍의 분할 인트론을 함유하도록 조작되었다는 것이다. 인트론을 5'-스플라이스 공여자 및 3'-스플라이스 수용자 단편으로 분할하고, BamHI 및 EcoRV 제한 부위가 분할 위치를 나타낸다. 본원의 중앙 요소는 3' cDNA 요소에 대해 반대 배향에 있는 프로모터, 5' cDNA 요소, 인트론 중 하나 및 5'-스플라이스 공여자 부위를 포함한다. 중앙 요소는 프로모터 역위 설계와 유사하게 STOP3 요소 및 FRT 사이트가 측부에 위치한다. Flp 재조합효소의 부재 시, cDNA의 2개의 부분이 분할되고 반대 배향으로 존재하므로 완전한 cDNA의 발현을 유도할 수 없고, STOP 요소는 안정적으로 통합된 채로 유지되고 전사를 종결시켜 역위된 프로모터 및 5' cDNA 요소의 배향을 보존하도록 기능한다. Flp 재조합효소가 존재하는 경우, 역위된 일렬 FRT 부위의 한 세트 간의 재조합을 매개하고 이들 사이에 위치한 모든 요소를 반전시킬 것이다. 도 11에서, 이러한 역위 이벤트는 FRT-1 부위에 대해 도시되어 있지만, FRT-14 부위에 대해 유사한 반응이 발생할 수 있다. 역위 이벤트는 프로모터 및 부분 cDNA 요소를 배향시켜서 cDNA 발현을 잠재적으로 유도할 수 있고, 또한 FRT 부위의 다른 쌍을 역위된 반복으로부터 직접 반복 배향으로 변환할 수 있음을 주목한다. 충분한 FLP가 여전히 이용 가능한 경우, 도 11의 FRT-14에 대해 도시된 바와 같이, 제1 반응을 반전시키고 원래 구성을 재생하거나, 또는 다른 방식으로 직접 반복 FRT 요소의 세트를 재조합하는 제2 재조합 반응을 매개할 수 있다. 제2 경우에, 생성된 발현 카세트는, 일단 전사되면, RNA 스플라이싱 후 인트론 또는 FRT 부위 없이 완전한 cDNA를 형성할, 내부 인트론을 갖는 완전한 cDNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 이러한 제2 반응은 관심 cDNA의 발현을 비가역적으로 활성화시킬 수 있다.
페이로드 분자
일부 실시예에서, 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 페이로드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "페이로드 분자"는 사이토카인, 케모카인, 효소, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 가용성 수용체, 세포 표면 수용체에 대한 리간드, 이분 펩티드, 삼분 펩티드, 및 세포독성 펩티드를 포함하여, 일차 및/또는 이차 종양용해 바이러스, 또는 일차 및/또는 이차 바이러스의 치료 효능을 추가로 향상시킬 수 있는 임의의 분자를 지칭한다.
일부 실시예에서, 페이로드 분자는 세포독성 펩티드이다. "세포독성 펩티드"는 숙주 세포에서 발현될 때 세포 사멸을 유도할 수 있는 단백질 및/또는 숙주 세포에 의해 분비될 때 이웃 세포의 세포 사멸을 유도할 수 있는 단백질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 세포독성 펩티드는 카스파제, p53, 디프테리아 독소(DT), 슈도모나스 엑소독소 A(PEA), I형 리보솜 불활성화 단백질(RIP)(예:사포린 및 젤로닌), II형 RIP(예:, 리신), 쉬가 유사 독소 1(Slt1), 감광 반응성 산소 종(예: killer-red)이다. 일부 실시예에서, 세포독성 펩티드는 카스파제 유전자와 같은, 세포자멸사를 통해 세포 사멸을 초래하는 자살 유전자에 의해 암호화된다.
일부 실시예에서, 페이로드 분자는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 일부 실시예에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 면역 관문 수용체(예를 들어, PD1, PDL1, 및 CTLA4) 또는 세포 성장 및 활성화에 관여하는 추가 세포 표면 수용체(예를 들어, OX40, CD200R, SIRPα, CSF1R, 4-1BB, CD40, 및 NKG2D)와 같은 세포 표면 수용체에 특이적으로 결합한다. 일부 실시예에서, 페이로드 분자는 세포 표면 수용체에 대한 리간드이다. 페이로드로서 사용하기에 적합한 예시적인 리간드는 NKG2D 리간드, 뉴로필린 리간드, Flt3 리간드, 4-1BBL, CD40L, GITRL, LIGHT, 및 CD47을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 페이로드 분자는 가용성 수용체이다. 페이로드로서 사용하기에 적합한 예시적인 가용성 수용체는 IL-13R, TGFβR1, TGFβR2, SIRPα, PD-1, IL-35R, IL-15R, IL-2R, IL-12R, 및 인터페론 수용체와 같은 가용성 수용체를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
일부 실시예에서, 페이로드 분자는 사이토카인이다. 페이로드로서 사용하기에 적합한 예시적인 사이토카인은 IL-1, IL-12, IL-15, IL-18, IL-36, TNFα, IFNα, IFNβ, 및 IFNγ를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 페이로드 분자는 케모카인이다. 페이로드로서 사용하기에 적합한 예시적인 케모카인은 CXCL10, CXCL9, CCL21, CCL4, 및 CCL5를 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
일부 실시예에서, 페이로드 분자는 효소이다. 페이로드로서 사용하기에 적합한 예시적인 효소는 아데노신 탈아미노효소, 15-하이드록시프로스타글란딘 탈수소효소, 매트릭스 메탈로프로테아제(예를 들어, MMP9), 콜라겐분해효소, 히알루로니다아제, 젤라틴분해효소, 및 엘라스타아제를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시예에서, 효소는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나아제, 시토신 탈아미노효소, 니트로환원효소, 카르복시펩티다아제 G2, 퓨린 뉴클레오시드 인산화효소, 또는 시토크롬 P450과 같은 유전자 유도 효소 전구약물 요법(GDEPT) 시스템의 일부이다. 일부 실시예에서, 효소는 표적 세포에서 세포 사멸 경로를 유도하거나 활성화시킬 수 있다 (예를 들어, 카스파제).
일부 실시예에서, 페이로드 분자는 비암성 효과기 세포에서 발현된 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제1 도메인 및 표적 세포(예를 들어, 암 세포, 종양 세포, 또는 상이한 유형의 효과기 세포)에 의해 발현된 세포 표면 항원에 결합할 수 있는 제2 도메인을 포함하는 이분 펩티드이다. 일부 실시예에서, 이분 폴리펩티드의 개별 폴리펩티드 도메인은 항체 또는 이의 결합 단편(예를 들어, 단쇄 가변 단편(scFv) 또는 F(ab)) 스코르피온 폴리펩티드, 디아바디, 플렉시바디, DOCK-AND-LOCKTM 항체, 또는 단클론 안티-특이형 항체(mAb2)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 이분 폴리펩티드의 구조는 이중-가변 도메인 항체(DVD-IGTM), TANDAB® 이중 특이적 T 세포 체결자(BITETM), DUOBODY®, 또는 이중 친화도 재표적화(DART) 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시예에서, 종양 세포 상에서 발현된 세포 표면 항원은 종양 항원이다. 일부 실시예에서, 종양 항원은 CD19, EpCAM, CEA, PSMA, CD33, EGFR, Her2, EphA2, MCSP, ADAM17, PSCA, 17-A1, NKGD2 리간드, CSF1R, FAP, GD2, DLL3, 또는 뉴로필린으로부터 선택된다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 페이로드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, RNAi 분자에 대한 표적 서열은 페이로드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내의 하나 이상의 위치에 삽입된다.
일부 실시예에서, 페이로드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포 또는 대상체에서 페이로드 분자의 발현을 방지하기 위한 하나 이상의 내부 RNAi 표적 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 내부 RNAi 표적 서열은 siRNA 분자, AmiRNA 분자, 또는 miRNA 분자에 대한 표적 서열이다. 일부 실시예에서, 내부 RNAi 서열은 바이러스 작제물을 세포에 도입하거나 대상체에게 투여한 후 페이로드 분자의 발현에 대한 추가적인 시간적 제어를 가능하게 한다. 이러한 실시예에서, 내부 RNAi 표적 서열은 세포에 의해 내인성으로 발현되는 miRNA에 대한 miRNA 표적 서열이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 페이로드 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 비암성 세포에 의해 내인성으로 발현된 miRNA에 대한 하나 이상의 내부 표적 서열을 포함하여, 페이로드 분자는 해당 세포에서 발현되지 않도록 한다.
일부 실시예에서, 내부 RNAi 서열은 이중 바이러스 벡터의 생산 중에 페이로드 분자의 발현에 대한 제어를 가능하게 한다. 일부 실시예에서, 내부 RNAi 표적 서열은 생산 세포주에 의해 또는 시료 또는 대상체의 세포에 의해 내인성으로 발현되지 않는 siRNA 분자, AmiRNA 분자, 또는 인공 miRNA 분자에 대한 표적 서열이다.
프로모터
일부 실시예에서, 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-의존성 프로모터이다. 일부 실시예에서, Tet-의존성 프로모터는 프로모터 요소의 하류에 Tet-On 요소를 포함한다. 일부 실시예에서, 프로모터는 CMV 프로모터(서열번호 897), HSV gB 프로모터(서열번호 900), HSV gC 프로모터(서열번호 901), HSV ICP8 프로모터(서열번호 899), HSV TK 프로모터(서열번호 898), HBP1 프로모터(HSV-ICP8 및 -TK 프로모터의 하이브리드) 또는 HBP2 프로모터(HSV-TK 및 -ICP8 프로모터의 하이브리드)이다. 일부 실시예에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다. 예시적인 HBP1-TetOn 프로모터는 서열번호 865로서 본원에 제공된다. 예시적인 HBP2-TetOn 프로모터는 서열번호 866로서 본원에 제공된다. 일부 실시예에서, 프로모터는 서열번호 865-866 및 897-901에 따른 서열 중 어느 하나와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
일차 바이러스
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 이중 가닥 DNA(dsDNA) 바이러스이다. 예시적인 dsDNA 바이러스는 미오바이러스과, 포도바이러스과, 시포바이러스과, 알로헤르페스바이러스과, 헤르페스바이러스과(예를 들어, HSV-1, HSV-1, 말 헤르페스 바이러스), 폭스바이러스과(예를 들어, 전염성 연속종 바이러스(molluscum contagiosum virus), 우두 바이러스(vaccina virus), 점액종 바이러스(myxoma virus)), 아데노바이러스과(예를 들어, 아데노바이러스)를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 HSV-1 또는 HSV-2이다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 RNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스이다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입 외에는 야생형 바이러스와 비교하여 변형을 포함하지 않는다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 HSV이다. HSV 바이러스 벡터 및 이들의 구성을 위한 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,078,029, 6,261,552, 5,998,174, 5,879,934, 5,849,572, 5,849,571, 5,837,532, 5,804,413, 및 5,658,724; 및 국제 특허출원 번호 WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637, 및 WO99/06583에 기술되어 있으며, 이들 문헌은 이들의 전체 참조에 의해 본원에 통합된다. HSV의 서열은 공개되고(NCBI 수탁 번호 NC_001806; 또한 McGoech 등의 J. Gen. Virol, 69 (PT 7), 1531-1574 (1988) 참조), 추가 HSV 바이러스 벡터의 설계에 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 야생형 바이러스와 비교하여 하나 이상의 추가 변형을 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 야생형 HSV의 변이체이다. 이들의 구성을 위한 변이체 HSV 벡터 및 방법은 미국 특허 번호 9,593,347; 미국 특허 출원 공개 번호: 2016-0250267, 2017-0036819, 2017-0274025, 2017-0189514, 및 2017-0107537; 및 국제 PCT 공개 번호: WO 2011/0130749 및 WO 2015/066042에 설명되어 있고, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 변이체 HSV이고, ICP47 유전자에 대한 프로모터와 함께 이배체 유전자 ICP0, ICP34.5, LAT, 및 ICP4의 각각 1개의 사본을 포함하는, 내부 반복(결합) 영역의 결실을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 번호 10,210,575; 10,172,893; 및 10,188,686 참조).
일부 실시예에서, 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 일차 바이러스의 세포 내로의 진입을 향상시키는 하나 이상의 변형을 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 비-정규 수용체를 통해 세포 내로의 바이러스 진입을 용이하게 하고/하거나 일반적으로 바이러스 측방향 확산에 내성이 있는 세포에서의 측방향 확산을 향상시키는 하나 이상의 표면 당단백질에 돌연변이를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 표적 세포 상의 표면 수용체에 결합하는, scFv 또는 다른 항원 결합 분자와 같은, 비천연 리간드를 바이러스의 표면 상에 포함한다. 일부 실시예에서, 표적 세포 상의 표면 수용체는 EGF-R이다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스는 변이체 HSV이고 세포 내로의 향상된 진입을 나타낸다. 일부 실시예에서, 일차 HSV는 HSV 감염의 전형적인 매개자 이외의 세포 단백질(예를 들어, 넥틴-1, HVEM, 또는 헤파란 황산염/콘드로이틴 황산염 프로테오글리칸 이외)과의 상호작용을 통해 세포를 직접 감염시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 변이체 HSV이고, 비-정규 수용체를 통한 바이러스 진입을 용이하게 하는 gB 또는 gH 유전자의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 변이체 HSV이고, 일반적으로 HSV 측방향 확산에 내성인 세포, 예컨대 gD 수용체가 결여된 세포에서 측방향 확산을 나타내는 돌연변이 gH 당단백질을 포함한다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스는 변이체 HSV이고, 미국 특허 번호 9,593,347에 기술된 바와 같은 돌연변이 gB 또는 gH 단백질 중 하나 이상을 포함하며, 상기 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. HSV gB 또는 gH 당단백질의 비제한적인 돌연변이는 다음 잔기 중 하나 이상에서의 돌연변이를 포함한다: gB:D285, gB:A549, gB:S668, gH:N753, 및 gH:A778. 일부 실시예에서, 일차 HSV는 gB:D285 및 gB:A549 모두에서의 돌연변이, gH:N753 및 gH:A778 모두에서의 돌연변이, 및/또는 gB:S668, gH:N753 및 gH:A778 각각에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 HSV는 gB:285, gB:549, gH:753, 및 gH:778에서의 돌연변이를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 HSV는 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다: gB:D285N, gB:A549T, gB:S668N, gH:N753K, 또는 gH:A778V. 일부 실시예에서, 일차 HSV는 gB:D285N/gB:A549T 이중 돌연변이, gH:N753K/gH:A778V 이중 돌연변이, 또는 gB:S668N/gH:N753K/gH:A778V 삼중 돌연변이를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 HSV는 gB:D285N/gB:A549T/gH:N753K/gH:A778V를 포함한다. 돌연변이는 HSV-1 균주 KOS 유도체 K26GFP의 gD, gB 및 gH 유전자의 코돈(아미노산) 번호 부여에 대해 상대적으로 본원에서 언급된다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스는 변이체 HSV이고, 국제 PCT 공개 번호 WO 2016/141320 및 Richard 등 Plos Pathogens, 2017, 13(12), e1006741에 기술된 것과 같은, 신경 세포의 HSV 감염을 감소시키는 하나 이상의 돌연변이를 UL37 유전자에 포함한다.
이차 바이러스
일부 실시예에서, 본 개시는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스를 제공한다. 일부 실시예에서, 암호화된 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 복제 능력이 있고 숙주 세포를 감염시키고 사멸시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 복제 능력이 있다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 및 이차 종양용해 바이러스 모두 복제 능력이 있다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 및 이차 바이러스 모두 복제 능력이 있다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 복제 불능이다. 일부 실시예에서, 복제 불능 일차 종양용해 바이러스는 HSV이다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 복제 불능이다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 외피 단백질 코딩 영역에서의 결실 또는 돌연변이로 인해 복제 불능 상태이다. 일부 실시예에서, 복제 불능 이차 바이러스를 암호화하는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 외피 단백질에 대한 코딩 영역을, 선택적으로 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 코딩 영역 외부에 포함한다. 일부 실시예에서, 복제 불능 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 알파바이러스이다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 RNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 단일 가닥 RNA(ssRNA) 바이러스이다. 일부 실시예에서, ssRNA 바이러스는 양성-센스 ssRNA(+ 센스 ssRNA) 바이러스 또는 음성-센스 ssRNA(-센스 ssRNA) 바이러스이다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 DNA 바이러스이다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 이중-가닥 RNA(dsRNA) 바이러스 또는 단일-가닥 DNA(ssDNA) 바이러스이다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 + 센스 ssRNA 바이러스이다. 예시적인 + 센스 ssRNA 바이러스는 피코르나바이러스과(예, 콕사키바이러스, 폴리오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(SVV), SVV-A를 포함), 코로나바이러스과(예, 알파코로나바이러스, 예컨대 HCoV-229E 및 HCoV-NL63, 베타코로나바이러스, 예컨대 HCoV-HKU1, HCoV-OC3, 및 MERS-CoV), 레트로바이러스과(예, 쥣과 백혈병 바이러스), 및 토가바이러스과(예, 신비스(Sindbis) 바이러스)를 포함한다. 양성-감지, ssRNA 바이러스의 추가적인 예시적인 속 및 종이 아래 표 A에 나타나 있다.
표 A: 예시적인 양성-센스 ssRNA 바이러스
Figure pct00002
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 세네카 밸리 바이러스(SVV)이다. 일부 실시예에서, SVV의 바이러스 게놈은 서열번호 842과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 서열번호 842에 따른 뉴클레오티드 3505 내지 7310과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 SVV의 바이러스 게놈의 부분을 포함한다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 콕사키바이러스이다. 일부 실시예에서, 콕사키바이러스는 CVB3, CVA21, 및 CVA9로부터 선택된다. 예시적인 콕사키바이러스의 핵산 서열은 GenBank 참조 번호 M33854.1(CVB3), GenBank 참조 번호 KT161266.1(CVA21), 및 GenBank 참조 번호 D00627.1(CVA9)이 제공된다. 일부 실시예에서, 콕사키바이러스의 바이러스 게놈은 서열번호 843과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 서열번호 843에 따른 뉴클레오티드 3797 내지 7435와 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 콕사키바이러스 바이러스 게놈의 부분을 포함한다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 키메라 바이러스이다(예를 들어, 제1 바이러스로부터 유래된 캡시드 단백질 또는 IRES와 같은 한 부분 및 제2 바이러스로부터 유래된 프로테아제 또는 중합효소와 같은 비구조 유전자와 같은 다른 부분을 포함하는 바이러스를 암호화함). 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 키메라 피코르나바이러스이다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 키메라 SVV이다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 키메라 콕사키바이러스이다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 바이러스 게놈은 microRNA(miRNA) 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하고, miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 세포 내에서 상응하는 miRNA 중 하나 이상의 발현은 세포 내에서 암호화된 종양용해 바이러스 또는 암호화된 바이러스의 복제를 억제한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 miRNA는 miR-124, miR-1, miR-143, miR-128, miR-219, miR-219a, miR-122, miR-204, miR-217, miR-137, 및 miR-126으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 miR-124 표적 서열의 하나 이상의 사본, miR-1 표적 서열의 하나 이상의 사본, 및 miR-143 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 사본, miR-219a 표적 서열의 하나 이상의 사본, 및 miR-122 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 miR-128 표적 서열의 하나 이상의 사본, miR-204 표적 서열의 하나 이상의 사본, 및 miR-219 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 miR-217 표적 서열의 하나 이상의 사본, miR-137 표적 서열의 하나 이상의 사본, 및 miR-126 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다.
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 바이러스 게놈은 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 미번역 영역(UTR) 또는 3' UTR에 통합된 하나 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 바이러스 게놈은 하나 이상의 비-필수 유전자의 5' 미번역 영역(UTR) 또는 3' UTR에 통합된 하나 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 바이러스 게놈은 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 5' 또는 3'로 통합된 하나 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다.
+ 센스 ssRNA 바이러스의 게놈은 5' → 3' 배향의 ssRNA 분자를 포함하는데, 이는 일차 종양용해 바이러스 게놈 또는 일차 바이러스 게놈 내로 삽입된 폴리뉴클레오티드로부터 직접 전사될 수 있고 숙주 세포에 의해 직접 번역되어 바이러스 단백질을 생산할 수 있다. 따라서, + 센스 ssRNA 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 상기 삽입된 폴리뉴클레오티드로부터 직접 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 게놈을 생산할 수 있고, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 생산하기 위해 추가적인 바이러스 복제 단백질의 존재를 필요로 하지 않는다.
일부 실시예에서, 폴리뉴클레오티드는 음성-센스, 단일-가닥 RNA(- 센스 ssRNA) 바이러스 게놈을 암호화한다. 예시적인 - 센스 ssRNA 바이러스는 파라믹소바이러스과(예를 들어, 홍역 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스), 랍도바이러스과(예를 들어, 수포성 구내염 바이러스(VSV) 및 마르바 바이러스), 아레나바이러스과(예를 들어, 라싸 바이러스) 및 오르토믹소바이러스과(예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 예컨대 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 인플루엔자 C, 및 인플루엔자 D)의 구성원을 포함한다. 양성-감지, ssRNA 바이러스의 추가적인 예시적인 속 및 종이 아래 표 B에 나타나 있다.
표 B: 예시적인 음성-센스 ssRNA 바이러스
Figure pct00003
Figure pct00004
- 센스 ssRNA 바이러스의 게놈은 3' → 5' 배향의 ssRNA 분자를 포함하며, 이는 일차 종양용해 바이러스 게놈 또는 일차 바이러스 게놈으로 삽입된 폴리뉴클레오티드로부터 직접 전사될 수 없다. 오히려, - 센스 ssRNA 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 먼저 + 센스 mRNA로 전사되고, 이어서 하나 이상의 바이러스 RNA 중합효소에 의해 복제되어 -센스 ssRNA 게놈을 생산한다. 이와 같이, 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스에 삽입된 - 센스 ssRNA 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 복제에 필요한 바이러스 단백질을 암호화하는 제1 핵산 서열 및 - 센스 ssRNA 바이러스 게놈의 항-게놈 서열을 포함하는 제2 핵산 서열을 포함한다. 이러한 실시예에서, 제1 핵산 서열은 숙주 세포에 의해 - 센스 ssRNA 게놈의 복제에 필요한 바이러스 단백질로 직접 번역될 수 있는 5' → 3' mRNA 전사체를 암호화하고, 제2 핵산 서열은 - 센스 ssRNA 게놈의 항-게놈 서열의 5' → 3' mRNA 전사체를 암호화한다. 그런 다음, 제1 핵산 서열에 의해 암호화된 바이러스 단백질에 의해 5' → 3' 항-게놈 전사체가 복제되어 - 센스 ssRNA 게놈을 생산한다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 진핵 세포에서 발현 가능한 프로모터, 예를 들어 포유동물 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시예에서, 제1 및 제2 핵산 서열은 양방향 Pol II 프로모터와 같은 양방향 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시예에서, 이차 + 센스 및/또는 - 센스 ssRNA 종양용해 바이러스의 게놈은 바이러스에 대해 천연(native)인 이산 5' 및 3' 말단을 필요로 한다. 일부 실시예에서, 이차 + 센스 및/또는 - 센스 ssRNA 바이러스의 게놈은 바이러스에 대해 천연인 이산 5' 및 3' 말단을 필요로 한다. 포유동물 RNA Pol II에 의해 생산된 mRNA 전사체는 포유동물 5' 및 3' UTR을 함유하므로, 감염성 ssRNA 바이러스의 생산에 필요한 이산, 천연 말단을 함유하지 않는다. 따라서, 일부 실시예에서, + 센스 및/또는 - 센스 ssRNA 바이러스의 생산은 바이러스 ssRNA 및 포유동물 mRNA 서열의 접합부에서 Pol II로 암호화된 바이러스 게놈 전사체의 절단을 가능하게 하는 추가 5' 및 3' 서열을 필요로 하여, 바이러스 게놈의 내인성 5' 및 3' 이산 말단을 유지하기 위해 비-바이러스 RNA가 전사체로부터 제거된다. 이러한 서열은 본원에서 접합 절단 서열로서 지칭된다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 다음 구조를 포함한다:
(a) 5' - Pol II - 접합 절단 - 바이러스 게놈 - 접합 절단 - 3';
(b) 5' - Pol II - 접합 절단 - 바이러스 항-게놈 - 접합 절단 - 3'.
접합 절단 서열은 다양한 방법에 의해 바이러스 게놈 전사체로부터 비-바이러스 RNA의 제거를 달성할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 접합 절단 서열은 RNAi 분자에 대한 표적이다. 예시적인 RNA 간섭 제제는 miRNA, AmiRNA, shRNA, 및 siRNA를 포함한다. 또한, 당 기술분야에 현재 공지되어 있거나 미래에 정의될 특이적 부위에서 RNA 전사체를 절단하기 위한 임의의 시스템을 사용하여 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스에 천연인 이산 말단을 생성할 수 있다.
일부 실시예에서, RNAi 분자는 miRNA이고, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 miRNA 표적 서열이다. 일부 실시예에서, RNAi 분자는 siRNA 분자이고, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 siRNA 표적 서열이다. 일부 실시예에서, RNAi 분자는 AmiRNA이고, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 AmiRNA 표적 서열이다.
일부 실시예에서, 접합 절단 서열은 가이드 RNA(gRNA) 표적 서열이다. 이러한 실시예에서, gRNA는 RNase 활성을 갖는 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas13)로 설계되고 도입되어 정확한 접합 부위에서 바이러스 게놈 전사체의 절단을 매개할 수 있다. 일부 실시예에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 gRNA 표적 서열이다. 일부 실시예에서, 접합 절단 서열은 pri-miRNA 암호화 서열이다. 이차 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사 시, 이들 서열은 pri-miRNA 줄기-루프 구조를 형성한 다음, Drosha에 의해 핵 내에서 절단되어 정확한 접합 부위에서 전사체를 절단한다. 일부 실시예에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 pri-mRNA 표적 서열이다.
일부 실시예에서, 접합 절단 서열은 리보자임-암호화 서열이고, 바이러스 전사체의 자가 절단을 매개하여 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 천연 이산 말단을 생산한다. 일부 실시예에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 리보자임 암호화 서열이다. 일부 실시예에서, 접합 절단 서열은 앱타자임 암호화 서열이다. 일부 실시예에서, 5' 및/또는 3' 접합 절단 서열은 앱타자임 암호화 서열이다.
일부 실시예에서, 접합 절단 서열은 siRNA 분자, miRNA 분자, AmiRNA 분자, 또는 gRNA 분자에 대한 표적 서열이다. 이러한 실시예에서, 표적 RNA 분자는 RNAi 또는 gRNA 분자의 가이드 서열에 적어도 부분적으로 상보적이다. 서열 동일성 % 및 상보성 %의 비교 및 결정을 위한 서열 정렬 방법은 당 기술분야에 주지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444의 유사도 검색 방법에 의해, 이들 알고리즘의 전산화된 구현에 의해(GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., 위스콘신주 매디슨), 수동 정렬 및 육안 검사에 의해(예를 들어, Brent 등, (2003) Current Protocols in Molecular Biology), BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 포함하는 당 기술분야에 공지된 알고리즘을 사용하여 수행 가능하며, 이들은 Altschul 등, (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul 등, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410에 각각 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해 공개적으로 이용할 수 있다.
일부 실시예에서, 5' 접합 절단 서열 및 3' 접합 절단 서열은 동일한 군으로부터 유래된다(예를 들어, 둘 다 RNAi 표적 서열, 둘 다 리보자임-암호화 서열 등임). 예를 들어, 일부 실시예에서, 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, AmiRNA, 또는 miRNA 표적 서열)이고, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에 통합된다. 이러한 실시예에서, 5' 및 3' RNAi 표적 서열은 동일하거나(즉, 동일한 siRNA, AmiRNA, 또는 miRNA에 대한 표적) 상이할 수 있다(즉, 5' 서열은 하나의 siRNA, AmiRNA, 또는 miRNA에 대한 표적이고, 3' 서열은 또 다른 siRNA, AmiRNA, 또는 miRNA에 대한 표적임). 일부 실시예에서, 접합 절단 서열은 가이드 RNA 표적 서열이며, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에 통합된다. 이러한 실시예에서, 5' 및 3' gRNA 표적 서열은 동일하거나(즉, 동일한 gRNA에 대한 표적) 상이할 수 있다(즉, 5' 서열은 하나의 gRNA에 대한 표적이고 3' 서열은 또 다른 gRNA에 대한 표적임). 일부 실시예에서, 접합 절단 서열은 pri-mRNA 암호화 서열이고, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단에 통합된다. 일부 실시예에서, 접합 절단 서열은 리보자임-암호화 서열이고, 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열의 바로 5' 및 3'에 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내에 통합된다.
일부 실시예에서, 5' 접합 절단 서열 및 3' 접합 절단 서열은 동일한 군으로부터 유래되지만 상이한 변이체 또는 유형이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 5' 및 3' 접합 절단 서열은 RNAi 분자에 대한 표적 서열일 수 있으며, 여기서 5' 접합 절단 서열은 siRNA 표적 서열이고, 3' 접합 절단 서열은 miRNA 표적 서열이다(또는 그 반대). 일부 실시예에서, 5' 및 3' 접합 절단 서열은 리보자임-암호화 서열일 수 있으며, 여기서 5' 접합 절단 서열은 해머헤드 리보자임-암호화 서열이고 3' 접합 절단 서열은 간염 델타 바이러스 리보자임-암호화 서열이다.
일부 실시예에서, 5' 접합 절단 서열 및 3' 접합 절단 서열은 상이한 유형이다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 5' 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, AmiRNA, 또는 miRNA 표적 서열)이고, 3' 접합 절단 서열은 리보자임 서열, 앱타자임 서열, pri-miRNA 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 실시예에서, 5' 접합 절단 서열은 리보자임 서열이고 3' 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, AmiRNA, 또는 miRNA 표적 서열), 앱타자임 서열, pri-miRNA 암호화 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 실시예에서, 5' 접합 절단 서열은 앱타자임 서열이고 3' 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, AmiRNA, 또는 miRNA 표적 서열), 리보자임 서열, pri-miRNA 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 실시예에서, 5' 접합 절단 서열은 pri-miRNA 서열이고 3' 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, AmiRNA, 또는 miRNA 표적 서열), 리보자임 서열, 앱타자임 서열, 또는 gRNA 표적 서열이다. 일부 실시예에서, 5' 접합 절단 서열은 gRNA 표적 서열이고 3' 접합 절단 서열은 RNAi 표적 서열(예를 들어, siRNA, AmiRNA, 또는 miRNA 표적 서열), 리보자임 서열, pri-miRNA 서열, 또는 앱타자임 서열이다.
ssRNA 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 대한 접합 절단 서열의 예시적인 배열이 아래 표 C1 및 C2에 나타나 있다.
표 C1: 대칭적 접합 절단 서열(JSC) 배열
Figure pct00005
표 C2 : 비대칭적 JCS 배열
Figure pct00006
일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 세포 또는 대상체에서 이차 바이러스 게놈의 발현을 방지하기 위해 하나 이상의 내부 RNAi 표적 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시예에서, 내부 RNAi 표적 서열은 siRNA 분자, AmiRNA 분자, 또는 miRNA 분자에 대한 표적 서열이다. 일부 실시예에서, 내부 RNAi 서열은 바이러스 작제물을 세포에 도입하거나 대상체에게 투여한 후 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현에 대한 추가적인 시간적 제어를 가능하게 한다. 이러한 실시예에서, 내부 RNAi 표적 서열은 세포에 의해 내인성으로 발현되는 miRNA에 대한 miRNA 표적 서열이다. 이러한 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스는 miRNA-약독화된다.
일부 실시예에서, 내부 RNAi 서열은 이중 바이러스 벡터의 생산 동안 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 발현에 대한 제어를 가능하게 한다. 일부 실시예에서, 내부 RNAi 표적 서열은 생산 세포주에 의해 또는 시료 또는 대상체의 세포에 의해 내인성으로 발현되지 않는 siRNA 분자, AmiRNA 분자, 또는 인공 miRNA 분자에 대한 표적 서열이다.
miRNA-약독화
일부 실시예에서, 일차 및/또는 이차 바이러스는 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 유전자좌에 삽입된 miRNA 표적 서열의 사본 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 및/또는 이차 종양용해 바이러스는 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 유전자좌에 삽입된 miRNA 표적 서열의 사본 중 하나 이상을 포함한다. miR은 다수의 암을 포함하는, 광범위한 질환 상태에서 차등적으로 발현된다. 중요하게는, miRNA는 정상 조직과 비교하여 암 조직에서 차등적으로 발현되어, 이들은 다양한 암에서 표적화 메커니즘으로서 기능하게 할 수 있다. 발암, 악성 형질전환, 또는 전이와 연관되는 (양으로 또는 음으로) miRNA는 "oncomiR"로 공지되어 있다. oncomiR의 예 및 상이한 암에 대한 이들의 관계는 당 기술분야에 공지되어 있다(예를 들어, 참조로서 본원에 통합된 국제 PCT 공개 번호 WO 2017/132552 참조).
일부 실시예에서, 일차 및/또는 이차 바이러스, 또는 일차 및/또는 이차 종양용해 바이러스는, 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 필수 바이러스 유전자의 유전자좌 내에 삽입된 miRNA 표적 서열을 포함할 수 있다. 정상(비-암성) 세포에서 발현된 miRNA는 이러한 표적 서열에 결합하여 miRNA 표적 서열을 함유하는 바이러스 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 바이러스 복제에 필요한 주요 유전자에 miRNA 표적 서열을 통합함으로써, 바이러스 복제는 miRNA를 발현하는 정상 이배체 세포에서 조건부로 억제될 수 있고, miRNA를 발현하지 않는 세포에서 정상적으로 진행할 수 있다. 이러한 실시예에서, 건강한 비-암성 세포는 재조합 바이러스 벡터에 의한 감염의 용해 효과로부터 정상 세포로부터 보호된다. 이러한 재조합 바이러스 또는 종양용해 바이러스는, miRNA를 발현하지 않거나 이의 발현이 감소된 세포와 비교하여, 통합된 miRNA 표적 서열에 결합할 수 있는 하나 이상의 miRNA를 발현하는 세포에서 이들이 감소되거나 약독화된 바이러스 복제를 입증하므로, 본원에서 "miR-약독화된" 것으로 지칭된다.
일부 측면에서, 특정 oncomiR의 발현 수준은 특정 암의 발생 또는 유지와 긍정적으로 연관된다. 이러한 miR은 본원에서 "종양원성 miR"로 지칭된다. 일부 실시예에서, 종양원성 miR의 발현은 비-암성 대조군 세포(즉, 정상 또는 건강한 대조군)에서 관찰된 발현 수준과 비교하여 암 세포 또는 조직에서 증가되거나, 상이한 암 유형으로부터 유래된 암 세포에서 관찰된 발현 수준과 비교하여 증가된다.
일부 실시예에서, 특정 oncomiR의 발현은 특정 암 및/또는 전이의 발생 또는 유지와 부정적으로 연관된다. 이러한 oncomiR은 본원에서 "종양-억제자 miR" 또는 "종양-억제성 miR"로 지칭되며, 이들의 발현이 암의 발생을 예방하거나 억제하기 때문이다. 일부 실시예에서, 종양-억제자 miRNA의 발현은 비-암성 대조군 세포(즉, 정상 또는 건강한 대조군)에서 관찰된 발현 수준과 비교하여 암 세포 또는 조직에서 감소되거나, 상이한 암 유형으로부터 유래된 암 세포에서 관찰된 종양-억제자 miRNA의 발현 수준과 비교하여 감소된다.
일부 실시예에서, 일차 및/또는 이차 바이러스, 또는 일차 및/또는 이차 종양용해 바이러스는 서열번호 1 내지 803로부터 선택된 서열의 역상보체와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 및/또는 이차 바이러스, 또는 일차 및/또는 이차 종양용해 바이러스는 서열번호 1 내지 803로부터 선택된 서열의 역상보체를 포함하거나 이로 구성되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, miRNA 표적 서열은 "miR 표적 서열 카세트" 또는 "miR-TS 카세트"의 형태로 하나 이상의 필수 바이러스 유전자의 유전자좌 내에 삽입된다. miR-TS 카세트는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하고 바이러스 유전자의 특이적 유전자좌에 삽입될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 실시예에서, 본원에 설명된 miR-TS 카세트는 적어도 하나의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 설명된 miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 본원에 설명된 miR-TS 카세트는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 그 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다.
일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 복수의 각각의 miRNA 표적 서열은 동일한 miRNA에 대한 표적 서열이다. 예를 들어, miR-TS 카세트는 동일한 miRNA 표적 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상의 사본을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 동일한 miRNA 표적 서열의 2 내지 6개 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 동일한 miRNA 표적 서열의 3개의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 동일한 miRNA 표적 서열의 4개의 사본을 포함한다.
일부 실시예에서, 본원에 설명된 miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 복수의 miRNA는 적어도 2개의 상이한 miRNA에 특이적인 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 제1 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 사본 및 제2 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 제1 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 사본, 제2 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 사본, 및 제3 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 제1 miRNA 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 사본, 제2 miRNA 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 사본, 및 제3 miRNA 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 제1 miRNA 표적 서열의 3 또는 4개 사본, 제2 miRNA 표적 서열의 3 또는 4개 사본, 및 제3 miRNA 표적 서열의 3 또는 4개 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, 복수의 miRNA 표적 서열은 적어도 4개의 상이한 miRNA 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 제1 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 사본, 제2 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 사본, 제3 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 사본, 및 제4 miRNA 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 제1 miRNA 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 사본, 제2 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 사본, 제3 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 사본, 및 제4 miR 표적 서열의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 제1 miR 표적 서열의 3 또는 4개 사본, 제2 miR 표적 서열의 3 또는 4개 사본, 제3 miR 표적 서열의 3 또는 4개 사본, 및 제4 miR 표적 서열의 3 또는 4개 사본을 포함한다.
일부 실시예에서, miR-TS 카세트 내의 복수의 miRNA 표적 서열은 서로 일렬로 배치되기 보다는 사이에 끼워진다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트 내의 복수의 miRNA 표적 서열은 짧은(예를 들어, 길이가 4 내지 15 nt) 스페이서에 의해 분리되어, 보다 콤팩트한 카세트를 생성시킨다. 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열의 활성을 억제하는 RNA 이차 구조가 없다(또는 감소됨). 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 발암, 악성 형질전환 또는 전이와 연관된 miRNA에 대한 시드 서열이 없다(또는 시드 서열이 감소됨). 일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 폴리아데닐화 부위가 없다(또는 폴리아데닐화 부위가 감소됨).
일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 카세트가 일차 및/또는 이차 바이러스 게놈 내의 유전자좌 내에 삽입될 수 있게 하는 하나 이상의 추가 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, miR-TS 카세트는 바이러스 게놈 내의 원하는 위치에서 핵산 서열에 상보적인 5' 및 3' 말단 상에 짧은 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 서열은 본원에서 "상동성 아암"으로 지칭되고, 일차 및/또는 이차 바이러스 게놈 내의 특이적 위치 내로의 miR-TS 카세트의 삽입을 용이하게 한다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 2개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 3개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 4개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스 게놈은 2개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스 게놈은 3개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스 게놈은 4개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스 게놈은 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 2개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 3개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 4개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 2개 이상의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 3개 이상의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 4개 이상의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 적어도 하나의 miR-TS 카세트를 포함한다.
일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 적어도 2개의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 적어도 2개의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 적어도 3개의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 적어도 2개의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 적어도 4개의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 적어도 2개의 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스 게놈은 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 miR-TS 카세트를 포함하고, 이차 바이러스 게놈은 적어도 2개의 miR-TS 카세트를 포함한다.
아래 표 D는 일차 및/또는 이차 바이러스, 또는 일차 및/또는 이차 종양용해 바이러스에서 miRNA 표적 서열에 결합할 수 있는 예시적인 miRNA의 서열을 제공한다. 추가 miRNA 서열은 서열번호 33 내지 803에 제공되어 있다. 일부 실시예에서, 본원에 설명된 miR-TS 카세트는 서열번호 1 내지 803로부터 선택된 서열의 역상보체와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 본원에 설명된 miR-TS 카세트는 서열번호 1 내지 803로부터 선택된 서열의 역상보체를 포함하거나 이로 구성되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다.
표 D : 예시적인 miRNA 및 표적 서열
Figure pct00007
일부 실시예에서, miR-TS 카세트는 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하고, 복수의 miRNA는 적어도 2개의 상이한 miRNA에 특이적이고, 바이러스 매개 세포 사멸로부터 다양한 세포 유형 또는 기관을 보호하도록 선택되는 표적 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시예에서, 다양한 유형의 정상 비-암성 세포에서 고도로 발현되고, 암세포에서는 발현되지 않거나 낮은 수준으로 발현되는 miRNA에 대한 표적 서열은, 정상 세포에서 바이러스 복제를 방지하면서 암세포에서 바이러스 복제를 방지하기 위해 miR-TS 카세트 내로(및 일차 및/또는 이차 바이러스 게놈 내로) 통합된다.
일부 실시예에서, 일차 및/또는 이차 바이러스는 각각 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는 제1 및 제2 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 miR-TS 카세트는 miR-124-3p, miR-1-3p, 및/또는 miR-143-3p에 대한 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 miR-TS 카세트는 miR-1-3p, miR-145-5p, miR-199-5p, 및/또는 miR-559에 대한 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 miR-TS 카세트는 miR-219a-5p, miR-122-5p, 및/또는 miR-128-3p에 대한 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 miR-TS 카세트는 miR-122-5p에 대한 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 miR-TS 카세트는 miR-137-3p, miR-208b-3pp, 및/또는 miR-126-3p에 대한 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다.
일부 실시예에서, 일차 및/또는 이차 바이러스는 각각 복수의 miRNA 표적 서열을 포함하는, 제1, 제2 및 제3 miR-TS 카세트를 포함한다. 일부 실시예에서, 제1 miR-TS 카세트는 miR-124-3p, miR-1-3p, 및/또는 miR-143-3p에 대한 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 miR-TS 카세트는 miR-122-3p에 대한 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, 제2 miR-TS 카세트는 miR-219a-5p, miR-122-5p, 및/또는 miR-128-3p에 대한 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 miR-TS 카세트는 miR-125-5p에 대한 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다. 일부 실시예에서, 제3 miR-TS 카세트는 miR-137-3p, miR-208b-3p, 및/또는 miR-126-3p에 대한 표적 서열의 하나 이상의 사본을 포함한다.
예시적인 miR-TS 카세트가 아래 표 E에 제공된다. *N 또는 N1-20은 1개의 뉴클레오티드와 20개의 뉴클레오티드 사이에서 길이가 가변될 수 있는 링커 서열을 나타내며, 여기서 "N"은 임의의 핵산일 수 있다. 일부 실시예에서, 링커 서열은 1 내지 20개의 핵산이다. 일부 실시예에서, 링커 서열은 1 내지 8개의 핵산이다. 일부 실시예에서, 링커 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 핵산이다. 일부 실시예에서, 링커 서열은 4개의 핵산이다. miR-TS 카세트는 표 E에 나타낸 하나 이상의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 miRNA TS 서열을 포함할 수 있다. miR-TS 카세트는 표 E에 나타낸 하나 이상의 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 100% 또는 그 사이의 임의의 백분율의 동일성을 갖는 miRNA TS 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 시드 영역 내의 동일성 백분율은 100%다. 일부 실시예에서, 시드 영역은 miRNA TS 서열 또는 이의 상보체 또는 역상보체의 위치 1-8에서 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
표 E : 예시적인 miRNA TS 설계
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
예시적인 miRNA 및 관련 서열이 아래 표 F에 제공되어 있다.
표 F : 예시적인 miRNA 관련 서열
Figure pct00012
Figure pct00013
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예시적인 이중 종양용해 바이러스 작제물 또는 이중 바이러스 작제물
일부 실시예에서, 본 개시는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스를 제공한다. 일부 실시예에서, 일차 및 이차 바이러스 또는 종양용해 바이러스는 복제 능력이 있다. 일부 실시예에서, 본 개시는 (i) 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결된 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 단백질을 암호화하고 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결된 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스를 제공한다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 (i) Tet-OFF 프로모터에 작동가능하게 연결되고 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되고 Tet-OFF 프로모터에 결합할 수 있고 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하는 tTA 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 테트라사이클린의 존재 또는 부재 시 세포에서 발현되는 반면, 이차 바이러스는 테트라사이클린의 부재 시에만 발현된다. 이러한 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 측부에 위치하는 5' 및 3' 접합 절단 서열은: 리보자임, 비-테트라사이클린 활성화 앱타자임, pre-miRNA 서열, miRNA 표적 서열, gRNA 표적 서열, 또는 AmiRNA 표적 서열 중 어느 하나일 수 있다. 일차 및 이차 바이러스는 전술한 바와 같이 추가로 miR-약독화될 수 있다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 (i) Tet-OFF 프로모터에 작동가능하게 연결되고 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; (ii) Tet-ON 프로모터에 작동가능하게 연결되고 이차 바이러스 게놈에서의 서열을 표적화하는 RNAi 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되고 Tet-OFF 프로모터에 결합할 수 있고 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하는 tTA 단백질 및 Tet-ON 프로모터에 결합할 수 있고 RNAi 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하는 rtTA 단백질을 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 테트라사이클린의 존재 또는 부재 시 세포에서 발현되는 반면, 이차 바이러스는 테트라사이클린의 부재 시에만 발현된다. 테트라사이클린의 존재 시에 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 비정상적인 발현은, 이차 바이러스 게놈에서 표적 서열을 인식하고 이차 바이러스 전사체의 분해를 매개하는, 테트라사이클린의 존재 시에 안전 RNAi 분자의 발현에 의해 방지된다. 이러한 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 측부에 위치하는 5' 및 3' 접합 절단 서열은: 리보자임, 비-테트라사이클린 활성화 앱타자임, pre-miRNA 서열, miRNA 표적 서열, gRNA 표적 서열, 또는 AmiRNA 표적 서열 중 어느 하나일 수 있다. 일차 및 이차 바이러스는 전술한 바와 같이 추가로 miR-약독화될 수 있다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 (i) Tet-ON 프로모터에 작동가능하게 연결되고 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드 및 (ii) 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되고 Tet-ON 프로모터에 결합할 수 있고 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하는 rtTA 단백질을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 테트라사이클린의 존재 또는 부재 시 세포에서 발현되는 반면, 이차 바이러스는 테트라사이클린의 존재 시에만 발현된다. 이러한 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 측부에 위치하는 5' 및 3' 접합 절단 서열은: 리보자임, (테트라사이클린 활성화된 앱타자임 포함) 앱타자임, pre-miRNA 서열, miRNA 표적 서열, gRNA 표적 서열, 또는 AmiRNA 표적 서열 중 어느 하나일 수 있다. 일차 및 이차 바이러스는 전술한 바와 같이 추가로 miR-약독화될 수 있다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 (i) Tet-ON 프로모터에 작동가능하게 연결되고 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; (ii) Tet-OFF 프로모터에 작동가능하게 연결되고 이차 바이러스 게놈에서의 서열을 표적화하는 RNAi 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드; 및 (ii) 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되고 Tet-ON 프로모터에 결합할 수 있고 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하는 rtTA 단백질 및 Tet-OFF 프로모터에 결합할 수 있고 RNAi 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 조절하는 tTA 단백질을 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이러한 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 테트라사이클린의 존재 또는 부재 시 세포에서 발현되는 반면, 이차 바이러스는 테트라사이클린의 존재 시에만 발현된다. 테트라사이클린의 부재 시에 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스의 비정상적인 발현은, 이차 바이러스 게놈에서 표적 서열을 인식하고 이차 바이러스 전사체의 분해를 매개하는, 테트라사이클린이 없는 상태에서 안전 RNAi 분자의 발현에 의해 방지된다. 이러한 실시예에서, 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 측부에 위치하는 5' 및 3' 접합 절단 서열은: 리보자임, (테트라사이클린 활성화된 앱타자임 포함) 앱타자임, pre-miRNA 서열, miRNA 표적 서열, gRNA 표적 서열, 또는 AmiRNA 표적 서열 중 어느 하나일 수 있다. 일차 및 이차 바이러스는 전술한 바와 같이 추가로 miR-약독화될 수 있다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스 또는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소-반응성 카세트를 포함한다. 예시적인 재조합효소-반응성 카세트는 본 개시의 RREC 및 RRIC(선택적으로 인트론의 부분을 포함함)를 포함한다. 일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스 또는 일차 바이러스는 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인트론(또는 이의 부분)을 포함한다. 일부 실시예에서, 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 프로모터에 작동 가능하게 연결된다.
일부 실시예에서, 일차 종양용해 바이러스는 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 일차 종양용해 바이러스는 HSV이고 이차 종양용해 바이러스는 피코르나바이러스다. 일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스는 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 종양용해 바이러스를 포함하고, 일차 종양용해 바이러스는 HSV이고 이차 종양용해 바이러스는 SVV이다. 일부 실시예에서, 이중 종양용해 바이러스는 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 종양용해 바이러스를 포함하고, 일차 종양용해 바이러스는 HSV이고 이차 종양용해 바이러스는 CVA이다. 일부 실시예에서, 일차 바이러스는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 일차 바이러스는 HSV이고 이차 바이러스는 피코르나바이러스다. 일부 실시예에서, 이중 바이러스는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 바이러스를 포함하고, 일차 바이러스는 HSV이고 이차 바이러스는 SVV이다. 일부 실시예에서, 이중 바이러스는 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일차 바이러스를 포함하고, 일차 바이러스는 HSV이고 이차 바이러스는 CVA이다.
이중 종양용해 바이러스 작제물 또는 이중 바이러스 작제물의 생산
일부 실시예에서, 본 개시는 본원에 설명된 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 본원에 설명된 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 바이러스 스톡을 제공한다. 일부 실시예에서, 바이러스 스톡은 균질한 스톡이다. 바이러스 스톡의 제조 및 분석은 당 기술분야에 주지되어 있다. 예를 들어, 바이러스 스톡은 바이러스 벡터로 형질도입된 세포를 함유하는 롤러 병에서 제조될 수 있다. 그런 다음, 바이러스 스톡을 연속 nycodenze 구배 상에서 정제하고, 필요할 때까지 분취하여 저장할 수 있다. 바이러스 스톡은 역가가 상당히 다양하며, 이는 대개 바이러스 유전자형 및 이를 제조하는 데 사용된 프로토콜 및 세포주에 따라 달라진다. 일부 실시예에서, 본원에서 고려되는 바이러스 스톡의 역가는 적어도 약 105 플라크 형성 단위(pfu), 예컨대 적어도 약 106 pfu 또는 적어도 약 107 pfu이다. 특정 실시예에서, 역가는 적어도 약 108 pfu, 또는 적어도 약 109 pfu, 적어도 약 1010 pfu, 또는 적어도 약 1011 pfu일 수 있다.
치료 조성물
일부 실시예에서, 본 개시는 본원에 설명된 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시예에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "조성물"은 대상체 및/또는 세포에 투여되거나 전달될 수 있는 본원에 설명된 하나 이상의 이중 종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스의 제형을 지칭한다. 통상적으로, 제형은 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 유도체 및/또는 이의 전구약물, 용매화물, 입체이성질체, 라세미체 또는 호변이성질체를 포함하는 모든 생리학적으로 허용 가능한 조성물을 포함한다. "치료 조성물"은 특정 질환 또는 장애의 치료를 위해 환자 및/또는 대상체 및/또는 세포에 투여되거나 전달될 수 있는 하나 이상의 제제의 조성물이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "담체"는, 미국 식품의약국에 의해 인간 및/또는 가축에 사용하기에 허용 가능한 것으로 승인된 약제학적으로 허용 가능한 세포 배양 배지 및/또는 유화제를 포함하여, 생리학적으로 양립 가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당 기술분야에 주지되어 있다. 임의의 종래의 매질 또는 제제가 활성 성분과 호환되지 않는 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 이의 용도가 고려된다. 보충
일 실시예에서, 담체를 포함하는 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 혈관 내(정맥 내 또는 동맥 내), 복강 내 또는 근육 내 투여에 적합하다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당 기술분야에 주지되어 있다. 임의의 종래의 매질 또는 제제가 바이러스 벡터 또는 핵산 분자와 호환되지 않는 경우를 제외하고, 본 개시의 약제학적 조성물에서 이의 사용이 고려된다.
본 개시의 조성물은, 세포 또는 동물에게 단독으로 투여하거나 하나 이상의 다른 치료 방법과 조합하여 투여하기 위해 약제학적으로 허용 가능하거나 생리학적으로 허용 가능한 용액으로 제형화된, 본원에 설명된 바와같이, 하나 이상의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터 등을 포함할 수 있다. 또한, 원하는 경우, 본 개시의 조성물은, 예를 들어, 사이토카인, 성장 인자, 호르몬, 소분자 또는 다양한 약제학적 활성제와 같은, 다른 제제와 조합하여 투여될 수 있음을 이해할 것이다. 추가 제제가 의도된 요법을 전달하는 조성물의 능력에 부정적으로 영향을 미치지 않는다면, 조성물에 또한 포함될 수 있는 다른 성분에는 사실상 제한이 없다.
본 개시의 약제학적 조성물에서, 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은 다양한 치료 요법에서 본원에 설명된 특정 조성물을 사용하기 위한 적절한 투여 및 치료 요법의 개발에서와 마찬가지로, 당 기술분야의 숙련자에게 주지되어 있다. 제형화 시, 용액은 투여 제형과 양립 가능한 방식으로 투여되고, 증상의 개선 또는 교정을 야기하기에 치료적으로 유효한 양으로 투여된다. 제형은 섭취 가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등과 같은 다양한 투여량 형태로 쉽게 투여된다. 투여량의 일부 변화는 치료 중인 대상체의 병태에 따라 발생할 수 있다. 투여를 담당하는 사람은 어떤 경우에도, 개별 대상체에 대한 적절한 투여량을 결정할 수 있다. 또한, 인간 투여의 경우, 제제는 FDA 생물제제 평가 및 연구 표준 센터가 요구하는 무균성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족시킨다. 투여 경로는 자연적으로는, 치료 대상 질환의 위치 및 성질에 따라 달라질 것이며, 예를 들어, 피내, 경피, 피하, 비경구, 비강, 정맥내, 근육내, 비강내, 피하, 경피, 기관내, 복강내, 종양내, 관류, 세척액, 직접 주사, 및 경구 투여를 포함할 수 있다.
소정의 상황에서, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,543,158; 미국 특허 번호 5,641,515 및 미국 특허 번호 5,399,363(이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 통합됨)에 기술된 바와 같이 비경구, 정맥내, 근육내 또는 심지어 복강내로 본원에 개시된 조성물, 재조합 바이러스 벡터, 및 핵산 분자를 전달하는 것이 바람직할 것이다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로서의 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액은 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물에서 및 오일에서 제조될 수도 있다. 일반적인 보관 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다.
주사 가능한 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 분말을 포함한다(미국 특허 번호 5,466,468, 그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 통합됨). 모든 경우에, 형태는 멸균 상태여야 하며, 쉽게 주사할 수 있는 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에서 안정적이어야 하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 활동을 방지하는 것은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 촉진될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 제제, 예를 들어 당류 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용하여 이루어질 수 있다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당 기술분야에서 잘 이해된다. 통상적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사형으로서 제조되며; 주사 전에 액체 중의 용액 또는 액체 중의 현탁액에 적합한 고형분 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다.
수성 용액에서의 비경구 투여의 경우, 예를 들어, 용액은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하며, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 포도당으로 등장성으로 만들어져야 한다. 이들 특정 수성 용액은 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복강 내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시의 관점에서 당 기술분야의 숙련자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들어, 1회 용량을 1 ml의 등장성 NaCl 용액에 용해시키고, 1000 ml의 대량피하주사액에 첨가하거나 제시된 주입 부위에 주사할 수 있다(예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000 참조). 용량의 일부 변화는 반드시 치료 대상인 대상체의 병태에 따라 발생할 것이다. 투여 담당자가면 어떤 경우에도, 개별 대상체에 대한 적절한 투여량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여의 경우, 제제는 멸균성, 발열성, 및 FDA 생물제제 표준 사무소에서 요구하는 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다.
멸균 주사 가능 용액은, 필요에 따라, 상기 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적정 용매에 필요한 양으로 활성 화합물을 혼입한 다음, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분을, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 가능 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분의 분말 + 이전에 멸균 여과된 용액으로부터 임의의 원하는 추가 성분을 생성하는 진공 건조 및 냉동 건조 기술이다.
소정의 실시예에서, 조성물은 비강내 분무, 흡입, 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 비강 에어로졸 분무를 통해 폴리뉴클레오티드 및 펩티드 조성물을 폐에 직접 전달하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,756,353 및 미국 특허 번호 5,804,212(각각 그 전체가 참조로서 본원에 구체적으로 통합됨)에 기술되어 있다. 마찬가지로, 비강내 극미립자 수지(Takenaga 등,1998) 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물(미국 특허 번호 5,725,871, 구체적으로 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)를 이용한 약물 전달은 또한 약제학 분야에 주지되어 있다. 마찬가지로, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지 매트릭스의 형태로의 점막 경유 약물 전달은 미국 특허 번호 5,780,045(구체적으로 그 전체가 참조로서 본원에 통합됨)에 기술되어 있다.
사용 방법
일부 실시예에서, 본 개시는 암 세포를 사멸시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 설명된 이중-종양용해 바이러스 또는 조성물에 암 세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이중-종양용해 바이러스는 암 세포 내에서 복제해서 이차 종양용해 바이러스를 생산한다. 일부 실시예에서, 이차 종양용해 바이러스는 또 다른 암 세포 내에 감염되고 복제된다. 따라서, 일부 실시예에서, 본 개시의 이중-종양용해 바이러스는 복수의 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 이러한 실시예에서, 복수의 암 세포의 제1 서브세트는 제1 종양용해 바이러스에 의해 사멸될 수 있고, 복수의 암 세포의 제2 서브세트는 이차 종양용해 바이러스에 의해 사멸될 수 있다. 일부 실시예에서, 암 세포는 생체 내에 있다. 특정 실시예에서, 암 세포는 종양 내에 있다.
일부 실시예에서, 본 개시는 암 세포를 사멸시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 설명된 이중 바이러스 또는 조성물에 암 세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이중 바이러스는 암 세포 내에서 복제해서 이차 바이러스를 생산한다. 일부 실시예에서, 이차 바이러스는 다른 암 세포 내에서 감염되고 복제된다. 따라서, 일부 실시예에서, 본 개시의 이중 바이러스는 복수의 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 이러한 실시예에서, 복수의 암 세포의 제1 서브세트는 제1 바이러스에 의해 사멸될 수 있고, 복수의 암 세포의 제2 서브세트는 이차 바이러스에 의해 사멸될 수 있다. 일부 실시예에서, 암 세포는 생체 내에 있다. 특정 실시예에서, 암 세포는 종양 내에 있다.
이중-종양용해 바이러스 벡터로부터의 일차 및 이차 종양용해 바이러스의 생산, 또는 이중 바이러스 벡터로부터의 일차 및 이차 바이러스의 생산은 바이러스 RNA 및/또는 DNA 서열에 대한 RT-PCR을 포함하는, 당 기술분야에 공지된 수단에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 도 25는 이차 종양용해 SVV 생산의 aPCR 검정을 보여준다. H1299 세포를 시험관 내 전사된 SVV-neg 또는 SVV-야생형(WT) 양성 가닥 RNA로 형질감염시키거나, 복제 가능 SVV(ONCR-189) 또는 복제 불능(ONCR-190) SVV 바이러스 게놈을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 종양용해 HSV-1 바이러스로 감염시켰다. RNA를 추출하고 양성 및 음성 센스 SVV RNA 가닥 모두에 대해 qRT-PCR을 수행하였다. 도시된 바와 같이, 양성 및 음성 센스 RNA의 유사한 수준이 ONCR-189 및 SVV 야생형 RNA(SVV WT)를 이용한 대조군 형질감염 모두에서 검출되었는데, 여기서 SVV RNA 수준이 ONCR-190 대조군에서 훨씬 더 낮으며, 이는 복제 가능 SVV를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HSV-1의 감염으로부터 SVV 바이러스 복제가 개시됨을 나타낸다. 두 가닥의 높은 수준은 종양용해 HSV에 의해 유도되거나 발현된 활성 SVV 감염을 나타내며, 이는 oHSV 감염으로부터 양성 센스 RNA 바이러스의 감염의 개시를 예시한다.
일부 실시예에서, 본 개시는 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본원에 설명된 이중-종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스 또는 이의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 "대상체"는, 본원에 개시된 재조합 바이러스 벡터, 조성물, 및 방법으로 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 병태의 증상을 나타내는 임의의 동물을 포함한다. 적절한 대상체(예를 들어, 환자)는 실험실 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 또는 기니피그), 농장 동물(예를 들어, 말 또는 소), 및 가축 또는 애완동물(예를 들어, 고양이 또는 개)을 포함한다. 비인간 영장류 및 바람직하게는 인간 환자가 포함된다.
"투여"는 본원에 설명된 이중-종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스 또는 이의 조성물을 대상체에게 도입하거나, 본원에 설명된 이중-종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스 또는 이의 조성물을 세포 및/또는 조직과 접촉시키는 것을 지칭한다. 투여는 주사, 관류, 흡입, 소비, 전기-삼투압, 혈액투석, 이온도입, 및 당 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해 발생할 수 있다. 투여 경로는 자연적으로는, 치료 대상 질환의 위치 및 성질에 따라, 다양할 것이며, 다음을 포함할 수 있다, 예를 들어, 이개, 구강, 결막, 피부, 치과, 자궁경관내, 내분열성, 기관내, 장관, 경막외, 간질, 관절내, 동맥내, 복강내, 이개내, 담도내, 기관지내, 윤활낭 내, 해면체 내, 뇌내, 수조내, 각막 내, 크론 내, 관상 내, 두개내, 피내, 추간판내, 도관내, 십이지장 내, 십이지장 내, 경막내, 심외막 내, 표피내, 식도내, 위내, 치은 내, 간내, 회장내, 병변 내, 혀 내, 관내, 림프구 내, 유방 내, 수질내, 수막 내, 근육내, 비강 내, 결절 내, 안구 내, 턱막 내, 난소 내, 복강내, 심막 내, 흉막내, 전립선 내, 폐내, 강내, 질내, 척수 내, 심내막내, 건내, 고환 내, 기관 내, 경막내, 흉곽 내, 세관내, 종양 내, 고막내, 자궁내, 복강내, 혈관 내, 심실내, 방광내, 전정내, 정맥 내, 유리체 내, 후두, 비강, 비위관, 경구, 점안, 구인두, 비경구, 경피, 관절주위, 경막 주위, 신경 주위, 치주, 호흡기, 역관형, 직장, 척수, 지주막하, 결막 하, 피하, 진피하, 치은하, 설하, 점막하, 망막하, 국소, 경피, 경심막내, 경점막, 경태반, 경기관, 고막, 요관, 요도, 및/또는 질 관류, 세척, 직접 주사, 및 경구 투여를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 및 "치료"는 대상체가 질환 또는 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상을 개선하도록 본원에 설명된 이중-종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스 또는 이의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 지칭한다. 개선은 질환 또는 병태, 또는 질환 또는 병태의 증상의 임의의 개선 또는 교정이다. 개선은 관찰 가능하거나 측정 가능한 개선이거나, 대상체의 전반적인 안녕감의 개선일 수 있다. 따라서, 당 기술분야의 숙련자는 치료제가 질환 상태를 개선할 수 있지만, 질환에 대한 완전한 치유가 아닐 수 있음을 인지한다. "예방적으로 유효한 양"은 원하는 예방적 결과를 달성하기에 효과적인 본원에 설명된 이중-종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스 또는 이의 조성물의 양을 지칭한다. 본원에서 사용되는, "예방"은 질환의 증상의 완전한 예방, 질환의 증상의 발병 지연, 또는 후속하여 발생하는 질환 증상의 중증도의 감소를 의미할 수 있다. 일반적으로, 그러나 반드시 그렇지는 않지만, 예방적 투여량이 질환의 초기 단계에서 또는 이전에 대상체에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 적다.
본원에서의 "암"은 통상적으로 미조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종(지방육종, 골형성 육종, 혈관육종, 내피육종, 평활근육종, 척삭종, 림프관육종, 림프관내피육종, 횡문근육종, 섬유육종, 점액육종, 연골육종 포함), 신경내분비 종양, 중피종, 활액종, 신경초종, 수막종, 선암종, 흑색종 및 백혈병 또는 림프성 악성종양을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예는 편평 세포 암(예를 들어, 상피 편평 세포 암), 소세포 폐암, 비소세포 폐암을 포함하는 폐암, 폐 선암종 및 폐 편평 암종, 소세포 폐암종, 복막암, 간세포암, 위장관암을 포함하는 위암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막 암종 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 고환암, 식도암, 담도 종양, 유잉 종양, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭샘암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름스 종양, 고환 종양, 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경 종양, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아종, 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 골수이형성 질환, 중쇄 질환, 신경내분비 종양, 신경초종, 및 기타 암종, 뿐만 아니라 두경부암도 있다.
소정의 실시예에서, 본원에 설명된 이중-종양용해 바이러스 또는 이중 바이러스 또는 이의 조성물은 폐암(예, 소세포 폐암 또는 비소세포 폐암), 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 대장암, 대장암, 췌장암, 간암(예, 간세포 암종(HCC), 위암, 두경부암, 갑상선암, 악성 신경교종, 교모세포종, 흑색종, B-세포 만성 림프구성 백혈병, 미만성 거대 B-세포 림프종(DLBCL), 및 변연부 림프종(MZL)으로부터 선택되는 암을 치료하는 데 사용된다.
예
예 1: 독시사이클린-반응성 프로모터의 특성 분석
다양한 테트라사이클린(Tet)-의존성 프로모터가 리포트 유전자의 발현을 유도하는 능력을 시험하였다. 프로모터의 하류에 Tet-On 요소를 포함하는 각각의 Tet-의존성 프로모터를 리포트 작제물에서 mCherry-NLuc 리포터 유전자에 작동가능하게 연결시켰다(도 12, 우측 패널). 표준 방법에 따라 LipotfectAMINE 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 MND-TetR 작제물 및 리포트 작제물 중 하나로 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. 밤새 성장 후, 독시사이클린을 한 세트의 복제 웰에 200 nM까지 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하고, 상대적 리포터 유전자 활성을 나노 루시퍼라아제 활성(NanoGlo, Promega)에 대한 균질한 검정을 사용하여 판정하였다(도 12 막대 그래프; 각 막대 위의 숫자 값은 독시사이클린 첨가 후 RLU의 배수 변화를 나타냄). 결과는 독시사이클린의 첨가로 리포터 유전자의 발현을 유의하게 증가시켰음을 보여주었다. 시험된 Tet-의존성 프로모터 중에서, CMV 프로모터가 독시사이클린의 첨가 시 가장 큰 배수 변화를 나타냈다.
예 2: Flp-반응성 STOP 카세트의 특성 분석
HEK293T 세포를 다음으로 공동 형질감염시켰다:
a) MND-TetR 작제물(NLS-TetR-NLS 폴리펩티드는 서열번호 864에 의해 암호화됨);
b) 선택적으로, CMV-TetOn(TO)-Flp 재조합효소 작제물(+Flp); 음성 대조군은 (-Flp)로 표시됨; 및
c) STOP 카세트 없는 CMV-TO-mCherry-NLuc(NLuc) 또는 Flp-반응성 STOP 카세트 있는 CMV-TO-mCherry-NLuc 작제물(FSF-NLuc),
표준 방법에 따라 LipofectAMINE 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용함. 밤새 성장 후, 독시사이클린을 한 세트의 복제 웰에 200 nM까지 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하고, 나노 루시퍼라아제 활성(NanoGlo, Promega)에 대한 균질한 검정을 사용하여 상대적 리포터 유전자 활성을 판정하였다.
결과(도 13)는 Flp-반응성 STOP 카세트(FSF-NLuc)의 혼입이 독시사이클린에 의한 리포터 유전자 발현의 더 큰 제어를 야기하였음을 보여준다. 독시사이클린의 부재 시, 리포터 유전자의 베이스라인 발현은 FSF-NLuc 군에서 감소한다(도 13 막대 그래프의 우측). Tet-On 요소에 의해 또한 제어되는, Flp 재조합효소 발현 작제물의 첨가로, Flp 재조합효소가 없는 FSF-NLuc 군과 비교하여 FSF-NLuc 작제물에 대한 리포트 유전자 발현을 전체적으로 증가시킨다. 반대로, Flp-반응성 STOP 카세트가 없는 리포터 유전자 작제물의 경우(NLuc; 도 13 막대 그래프의 좌측), 독시사이클린의 부재 시 리포터 유전자의 더 높은 베이스라인 발현이 있었고, 발현 수준은 Flp 재조합효소 발현 작제물의 존재 또는 부재에 의해 영향을 받지 않았다.
예 3: Flp 활성의 번역 후 제어를 위한 Flp-ERT2 융합 단백질의 설계
다수의 Flp-ERT2 융합 단백질을 타목시펜을 사용하여 Flp 활성을 제어하는 능력에 대해 시험하였다(도 14).
각각의 Flp-ERT2 융합 단백질은 링커 영역을 통해 돌연변이된 에스트로겐 수용체(ERT2)에 융합된 Flp를 포함한다. 활성 타목시펜 대사물 4-하이드록시타목시펜(4OHT)의 결합 시 ERT2 만이 활성화되고 나서 핵 내로 전위된다. 따라서, 핵 내 융합 단백질의 Flp 활성은 4OHT에 의해 제어될 수 있다.
다수의 Flp-ERT2 융합 단백질을 작제하였다. RGS 링커 영역을 함유하는 융합 단백질을 "FER"로 표시하는 반면, XTEN 링커 영역을 함유하는 융합 단백질을 "FEX"로 표시한다. FER 및 FEX 작제물의 N, P, 및 NP 변이체는 표시된 NLS(N) 및 PEST(P) 도메인이 각각의 재조합 단백질의 N-말단 내로 조작되는 변이체를 지칭한다. Flp-ERT2 융합 단백질의 각각의 발현 작제물은 Flp-ERT2 융합 단백질의 코딩 영역에 작동가능하게 연결된 "HBP1 프로모터-TetOn" 영역을 포함한다.
도 14에 도시된 바와 같은 예시적인 FLP-RGS-ERT2 폴리펩티드는 서열번호 846에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는다. 도 14에 도시된 바와 같은 예시적인 FLP-XTEN-ERT2 폴리펩티드는 서열번호 847에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 NLS 서열은 서열번호 848에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는다. 예시적인 PEST 서열은 서열번호 849에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는다.
각각의 융합 단백질 작제물이 유전자 발현을 제어하는 능력을 시험하였다.
HEK293T 세포를 다음으로 공동 형질감염시켰다
a) MND-TetR 작제물;
b) CMV-TO-mCherry-NLuc 또는 CMV-TO-FSF-mCherry-NLuc 작제물; 및
c) HBP1-TO-FER 또는 HBP1-TO-FEX 발현 작제물,
표준 방법에 따라 LipofectAMINE 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용함. 밤새 성장 후, 200 nM 독시사이클린 및/또는 1 uM 4-하이드록시타목시펜을 복제 웰 세트에 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하고, 나노 루시퍼라아제 활성(NanoGlo, Promega)에 대한 균질한 검정을 사용하여 상대적 리포터 유전자 활성을 판정하였다.
결과에 따르면(도 14), 여러 Flp-ERT2 융합 단백질 작제물은 FERP, FERNPA, FEXP 및 FEXNP를 포함하여, 4OHT 의존성 Flp 활성을 나타냈다.
예 4: 발현 제어에 대한 STOP 카세트, Flp 코딩 영역의 인트론, 및 mRNA 탈안정화 요소의 효과
Flp 활성을 추가로 제어하기 위해, 인트론 요소가 삽입된 Flp 발현 작제물의 추가 설계를 시험하였다(도 15a).
이전 예에서의 FEXP 작제물(서열번호 867)을 템플릿으로서 사용하고 인트론 영역(ACTB 유전자의 인트론 2, 필요한 스플라이스 공여자/수용자 요소 포함)을 Flp 코딩 영역 내에 삽입하였다. 생성된 작제물은 "FEXPi2"(서열번호 868)로 표시한다. 따라서, FEXP 및 FEXPi2 작제물은 ACTB 유전자의 인트론 2를 FLP 코딩 영역에 삽입함으로써 상이하다.
HEK293T 세포를 다음으로 형질감염시켰다
a) MND-TetR 작제물;
b) HBP2-TO-mCherry-NLuc 또는 HBP2-TO-FSF-mCherry-NLuc 작제물; 및
c) HBP1-TO-FEXP 또는 HBP1-TO-FEXPi2 (서열번호 869) 작제물
표준 방법에 따라 LipofectAMINE 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용함. HBP2-TO-FSF-mCherry-NLuc의 3가지 버전을 사용하였는데, 각각은 Flp-반응성 STOP 카세트의 STOP1(서열번호 854), STOP2(서열번호 855), 또는 STOP3(서열번호 856) 변이체를 각각 함유한다. STOP1, STOP2 및 STOP3 변이체는 카세트 내의 일렬 폴리아데닐화 신호의 수만큼 상이하다. 밤새 성장 후, 200 nM 독시사이클린 및/또는 1 uM 4-하이드록시타목시펜을 복제 웰 세트에 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하고, 나노 루시퍼라아제 활성(NanoGlo, Promega)에 대한 균질한 검정을 사용하여 상대적 리포터 유전자 활성을 판정하였다.
결과(도 15A)에 따르면, Flp 반응성 STOP 카세트 중에서, 더 긴 일렬 폴리아데닐화 신호를 갖는 STOP3 카세트는 베이스라인 발현을 억제하는 데 더 효과적인 반면, Flp 코딩 영역에 인트론이 존재하면 독시사이클린 및 4OHT 둘 다의 존재 시에 Flp의 최대 활성을 유지하는 데 도움이 되었고, STOP3 카세트를 포함하는 발현 작제물과 조합했을 때 리포터 유전자의 발현 수준을 유지하는 데 도움이 되었다.
또한, mRNA 탈안정화 요소의 삽입이 있는 Flp 발현 작제물의 추가 설계를 시험하였다(도 15b). 상이한 mRNA 탈안정화 요소를 FEXPi2 작제물에 삽입하였다. 사용된 mRNA 탈안정화 요소는 c-fos 코딩 요소(FCE, 서열번호 894), c-fos 유전자의 3'UTR로부터의 AU-풍부 요소(ARE, 서열번호 895), 및 FCE와 ARE의 조합(서열번호 896)이었다. FCE가 삽입된 FEXPi2 작제물을 FEXPi2-F로 표시하고, ARE가 삽입된 FEXPi2 작제물을 FEXPi2-A로 표시하고, FCE 및 ARE가 삽입된 FEXPi2 작제물을 FEXPi2-FA로 표시한다.
표준 방법에 따라 LipofectAMINE 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 MND-TetR 및 HBP2-TO-FSF-mCherry-NLuc 작제물 및 HBP1-TO-FEXPi2 발현 작제물의 변이체로 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. 밤새 성장 후, 200 nM 독시사이클린 및/또는 1 uM 4-하이드록시타목시펜을 복제 웰 세트에 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하고, 나노 루시퍼라아제 활성(NanoGlo, Promega)에 대한 균질한 검정을 사용하여 상대적 리포터 유전자 활성을 판정하였다. 결과(도 15b)는 mRNA 탈안정화 요소의 혼입이 Flp 재조합효소의 발현에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다.
예 5: 다양한 발현 작제물 설계를 이용한 표적 유전자 발현의 제어
유전자 발현 조절에 미치는 영향에 대해 다양한 발현 작제물 설계를 시험하였다.
도 16에 도시된 바와 같이, 설계는 다음을 포함하였다:
1) STOP 카세트: 프로모터-TetOn 영역과 리포터 유전자 코딩 영역 사이에 삽입된 STOP 카세트를 포함하는 작제물;
2) 페이로드 역위: 2개의 STOP 카세트를 포함하는 작제물; 및 리포터 유전자 코딩 영역이 역위되어 직교 Flp 인식 부위(서열번호 861)의 제어 하에 위치함;
3) 프로모터 역위: 2개의 STOP 카세트를 포함하는 작제물; 및 프로모터 영역이 역위되어 직교 Flp 인식 부위(서열번호 860)의 제어 하에 위치됨;
4) 분할 인트론 역위: 2개의 STOP 카세트를 포함하는 작제물; 프로모터 영역 및 리포터 유전자 코딩 영역의 일부가 역위되어 직교 Flp 인식 부위의 제어 하에 위치되고; 인트론 영역은 리포터 유전자 코딩 영역(서열번호 862)에 작동 가능하게 연결됨.
표준 방법에 따라 LipofectAMINE 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 표시된 발현 작제물로 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. 세포를 2일 동안 인큐베이션하고, 반딧불 루시퍼라아제 활성(ONE-Glo, Promega)에 대한 균질한 검정을 사용하여 상대적 리포터 유전자 활성을 판정하였다. 결과(도 16)는 이들 설계가 리포터 유전자의 베이스라인 발현을 감소시켰으며, 이 중 분할 인트론 역위 설계는 최저 베이스라인 (누출) 발현을 달성하였음을 보여주었다.
이들 설계 모두는 독시사이클린 및 4OHT에 대한 반응성에 대해서도 시험하였다. 표준 방법에 따라 LipofectAMINE 2000(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 표시된 발현 작제물로 HEK293T 세포를 형질감염시켰다. 밤새 성장 후, 200 nM 독시사이클린 및/또는 1 uM 4-하이드록시타목시펜을 복제 웰 세트에 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하고, 반딧불 루시퍼라아제 활성(ONE-Glo, Promega)에 대한 균질한 검정을 사용하여 상대적 리포터 유전자 활성을 판정하였다. 결과(도 17)는 이들 모든 설계가 독시사이클린 및 4OH에 대한 반응성을 나타냈고, 최대 발현을 위해서는 두 약물 모두가 필요하다는 것을 보여주었다.
예 6: 단일 작제물에서 전사 제어, 번역 제어 및 페이로드 성분의 조작
전사 제어, 번역 제어, 및 페이로드 성분을 통합하는 벡터를 구축하기 위해, Gateway attL 부위를 다양한 작제물로 조작하여, MultiSite Gateway 시스템(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 pDEST14 벡터 내로 각 성분의 LR 클로나아제 매개 조립을 용이하게 하였다. 도 18에 도시된 작제물은 이전 예에 나타낸 바와 같이 STOP3 카세트를 사용한다(HBP2-TO-STOP3-mCherry-fLuc, 서열번호 870). 이전의 예에 따른 페이로드 역위 설계, 프로모터 역위 설계, 및 분할 인트론 역위 설계를 이용하는 추가 작제물도 생성하였다.
예 7: 전사 제어, 번역 제어, 및 OV2 페이로드 성분의 HSV 벡터로의 조작
전사 제어, 번역 제어, 및 이차 종양용해 바이러스 게놈 성분을 단일 HSV 기반 종양용해 바이러스 벡터에 통합하는 다양한 이중 종양용해 바이러스 벡터를 작제한다. Gateway attL 부위를 다양한 작제물로 조작하여 MultiSite Gateway 시스템(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 ONCR222b 벡터 내로 각 성분의 LR 클로나아제 매개 조립을 용이하게 하였다. 하나의 예시적인 작제물이 도 19에 도시되어 있는데, 이는 Flp 재조합효소 발현에 대한 HBP1_프로모터-TetOn-FEXPi2 카세트(서열번호 869), 및 HBP2_프로모터-TetOn-STOP3-SVV-mCherry(서열번호 871) 카세트를 통합하여 일단 STOP3 요소가 Flp 재조합효소에 의해 절제되면 SVV 바이러스 게놈 뿐만 아니라 mCherry 리포터 유전자의 전사 및 번역을 가능하게 한다. 전체 14.1 kb 삽입 서열은 서열번호 872에 제공되어 있다. 재조합효소 반응성 STOP3 카세트를 사용하여 도 19에서 이차 종양용해 바이러스를 제어하는 동안, 우리는 또한 이차 종양용해 바이러스를 제어하기 위해 페이로드 역위 설계, 프로모터 역위 설계, 및 분할 인트론 역위 설계를 각각 사용하여 유사한 이중 종양용해 바이러스 벡터를 구축하였다. 각각의 HSV 기반 이중 종양용해 바이러스 벡터를 Fugene HD(Promega)를 사용하여 Vero-SF 세포 내로 형질감염시켜 재구성하고, 바이러스 스톡을 표준 방법에 따라 확장하고 적정하였다.
NCI-H1299 세포를 0.1 pfu/세포의 감염 다중도에서 표시된 ONCR-222 기반 이중 종양용해 바이러스 벡터로 감염시키고, 200 nM 독시사이클린 및 1 uM 4-하이드록시타목시펜을 첨가하여 웰을 복제함으로써 SVV-mCherry 복제를 유도하였다. 바이러스 복제를 자동화된 반전 형광 현미경(IncuCyte S3)을 사용하여 3일 동안 2시간마다 분석하여 HSV로부터의 GFP 발현 및 SVV로부터의 mCherry 발현을 스크리닝하였다. 데이터를 HSV(도 20a) 또는 SVV(도 20b)에 대한 바이러스 역가의 표시로서 GFP 및 mCherry 세포/현미경 필드의 총 수로서 도표화하였다. 결과는, 시험된 모든 이중 종양용해 바이러스 벡터에 대해, HSV의 바이러스 역가가 독시사이클린 및 4-하이드록시타목시펜의 존재에 의해 유의하게 영향을 받지 않았음을 보여주었다(도 20a). 한편, STOP3 절제 카세트 설계 또는 프로모터 역위 설계를 갖는 이중 종양용해 벡터의 경우, SVV의 바이러스 역가는 독시사이클린 및 4-하이드록시타목시펜의 존재 시에 유의하게 증가하였다(도 20b). 특히, SVV 이차 종양용해 바이러스(SVV) 발현 카세트에서 프로모터 역위 설계를 사용한 이중 종양용해 바이러스 벡터의 경우, 독시시사이클린 및 4-하이드록시타목시펜이 없는 상태에서 SVV의 최소의 기본 생산이 있었지만, 이 소분자들로 유도한 후 높은 SVV 생산이 있었다.
예 8: 이중 종양용해 바이러스는 생체 내에서 더 강력한 항-종양 효과를 나타낸다
SVV 바이러스 게놈을 종양용해 HSV 백본 벡터 ONCR-142에 삽입하여 이중 종양용해 바이러스 벡터를 구축하였다(도 21). SVV +ssRNA의 발현은 게이트웨이 카세트 내의 CMV 프로모터에 의해 제어된다. ONCR-189(서열번호 873)에서, SVV 바이러스 게놈을 암호화하는 RNA의 전사 후, SVV 바이러스 게놈의 측부에 위치하는 자가 절단 리보자임이 접합 절단 서열로서 기능하여 비-바이러스 RNA를 전사체로부터 제거하며, 이는 차례로 SVV RNA를 유리시켜 감염성 SVV 바이러스를 생산할 수 있게 한다. 대조군 벡터 ONCR-190(서열번호 874)에는, 이러한 리보자임이 없으므로, 감염성 SVV 바이러스 RNA는 생산되지 않는다. 따라서, ONCR-189는 SVV 복제 능력이 있는 반면, ONCR-190은 SVV 복제 불능이다.
ONCR-189 및 ONCR-190으로부터 바이러스 스톡을 생산하고 Vero 세포에서 역가를 측정하였다. Vero 또는 H1299 세포를 감염시켜 ONCR-189 또는 ONCR-190 바이러스 스톡의 용해 활성을 시험하였다(도 22). 각 바이러스 스톡의 10배 연속 희석액을 사용해 Vero 또는 H1299 세포를 감염시키고, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 용해성 세포 사멸 및 단층 클리어런스를 시각화하였다. ONCR-189 및 ONCR-190은 HSV에 민감하지만 SVV 감염에 내성이 있는 Vero 세포에서 동등한 세포 사멸을 입증하였다. 한편, H1299 세포는 HSV 및 SVV 감염 모두에 민감하며, ONCR-189는 ONCR-190보다 더 높은 희석도로 H1299 세포의 단층을 제거하였다. 또한, 인간 혈청은 HSV를 중화하지만 SVV는 중화시키지 않으며, 2% 인간 혈청의 존재 시에 바이러스 감염이 수행된 경우, ONCR-190 대조군에서는 세포 용해가 억제되지만 ONCR-189 감염에서는 억제되지 않는다. 이들 실험은 ONCR-189가 기능적 SVV 이차 종양용해 바이러스를 효과적으로 생성할 수 있음을 입증하였다.
그런 다음, 1% Triton이 H1299 세포를 감염시키는 ONCR-189 또는 ONCR-190 바이러스 스톡의 능력에 영향을 미치는지 여부를 시험하였다(도 23). 각 바이러스 스톡의 10배 연속 희석액을 사용하여 H1299 세포를 감염시키고, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 용해성 세포 사멸 및 단층 클리어런스를 시각화하였다. H1299 세포는 HSV 및 SVV로 유도된 세포 용해에 모두 민감하다. ONCR-189는 동일한 HSV-1 MOI로 감염되었을 때 ONCR-190에 비해 더 높은 희석도로 단층을 제거한다(스톡 내 HSV 및 SVV 비리온의 존재로 인함). 1% Triton은 HSV의 외피를 파괴하고 감염성 HSV 비리온을 불활성화시키지만, 비-외피형 SVV에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 세포 용해는 ONCR-190의 경우 1% Triton의 존재 시에 억제되지만, ONCR-189의 경우는 억제되지 않는다(HSV 감염만 불활성화되었지만, ONCR-189 바이러스 스톡은 HSV 및 SVV 비리온을 함유하였으므로, SVV는 1% Triton에 의해 불활성화되지 않으며, SVV 비리온은 H1299 세포를 용해함).
H446 세포의 ONCR-189 및 ONCR-190 바이러스 감염에 대해 IC50 역가 분석을 수행하였다(도 24a). HSV 및 SVV 감염 모두에 민감한 H446 세포. 결과는 ONCR-189의 IC50 역가가 ONCR-190에 비해 더 낮음을 보여주었다. 즉, ONCR-189는 H446 세포를 사멸시키는 데 더 강력하다. 1% Triton의 존재 시 감염은 HSV의 외피를 파괴하고 감염성 HSV 비리온을 불활성화시키지만 SVV에는 영향을 미치지 않으므로, 1% Triton을 첨가했을 때 ONCR-190에서는 세포 용해를 억제하였지만 ONCR-189 감염에서는 억제하지 않았다. IC50 값은 도 24b에 요약되어 있다.
또 다른 세트의 실험에서, H1299 세포를 시험관 내 전사된 SVV-neg 또는 SVV-wt 양성 가닥 RNA로 형질감염시키거나 ONCR-189 및 ONCR-190 oHSV로 감염시켰다. 각 시험 그룹으로부터 RNA 시료를 추출하고 RT qPCR 검정을 수행하였다(도 25). 결과는 SVV-WT 양성 가닥 RNA의 형질감염이 바이러스 복제를 나타내는 양성 및 음성 가닥 RNA 모두의 높은 사본을 초래하였음을 보여주었다. ONCR-189 감염 세포에서 SVV 양성 및 음성 가닥 RNA의 수준은 SVV-WT 형질감염 세포와 유사하고, ONCR-190 감염 세포에서 SVV RNA 수준보다 훨씬 더 높았으며, 이는 ONCR-189 oHSV 감염 세포에서 성공적인 SVV 바이러스 복제를 나타낸다.
예 9: 이중 종양용해 바이러스가 생체 내에서 항-종양 효과를 나타냄
이중 종양용해 바이러스의 생체 내 효능 평가를 피하 이종이식 종양(NCI-H1299)을 가진 누드 마우스에서 수행하였다. 각각의 oHSV를 1x107 PFU의 IV 투여량으로 정맥 내(IV) 투여하고, SVV를 1x104 PFU의 IV 투여량으로 투여하였다. NCI-H1299 보유 마우스는 종양이 150mm3(그룹당 n=7)에 도달했을 때 코호트화하고 1, 4 및 7일에 정맥 내 주사했다. 종양 성장(도 26a) 및 체중(도 26b)을 매주 2회 측정하였다.
도 26a에 도시된 바와 같이, oHSV 백본 벡터(ONCR-142) 및 리보자임이 없는 SVV를 암호화하는 oHSV(ONCR-190)는 이 종양 모델에서 항-종양 효과를 갖지 않았다. 반면, SVV 비리온 또는 ONCR-190을 SVV 비리온과 병용 치료한 마우스는 유의한 종양 성장 억제를 나타냈다. ONCR-189를 IV 투여한 마우스에서 유사한 종양 성장 억제가 관찰되었는데, 이는 ONCR-189가 생체 내 전달되면 종양 성장을 억제할 수 있는 기능성 SVV 비리온을 효과적으로 생산할 수 있음을 시사한다. 본 연구에서 시험된 치료 중 어느 것에 대해서도 동물 체중에 미치는 부작용은 관찰되지 않았다(도 26b). 그룹 통계 비교를 위해, 양방향 ANOVA(Bonferroni 다중 비교 검정)를 사용하였다. P 값은 PBS 대조군에 대해 상대적이며, 여기서 *는 P < 0.05를 나타낸다.
예 10: TetOFF 리보자임을 이용한 유전자 발현 제어
3' UTR에서 K4 앱타자임(서열번호 913) 또는 K7 앱타자임(서열번호 914)을 함유하는 전사체를 발현하는 mCherry 리포터 벡터 플라스미드로 HEK293 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 표시된 농도의 테트라사이클린을 첨가할 때 형질감염 후 48시간차에 Spectramax Minimax를 이용해 어레이 스캐닝 세포측정에 의해 mCherry의 발현 수준을 평가하였다. 결과(도 27)는 테트라사이클린이 전사체의 앱타자임 절단을 억제하여 유전자 발현을 유도한다는 것을 보여주었다.
예 11: 이중 종양용해 바이러스가 생체 내에서 지속적인 항-종양 효과를 나타냄
이중 종양용해 바이러스의 생체 내 효능 평가는 일차 종양용해 바이러스에 부분적으로 민감한 피하 이종이식 종양을 가진 누드 마우스에서 수행될 것이다. 바이러스는 IV로 정맥 내(IV) 투여된다. 종양을 가진 마우스는 종양이 150 mm3에 도달했을 때(그룹 당 n=7-10) 코호트화하고 3회 정맥 내 투여할 것이다. 종양 성장은 매주 2회 측정될 것이다.
복제 불능인 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 일차 종양용해 바이러스는 이 종양 모델에서 부분적인 항-종양 효과를 가지며, 여기서 종양은 일정 시간 후에 재발하게 된다. 한편, 기능성 이차 비리온을 효과적으로 생산할 수 있는 복제 능력이 있는 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 일차 종양용해 바이러스를 처리한 마우스는 종양 성장을 더 많이, 더 장기간 억제할 것이다.
추가 번호 실시예
본 개시의 추가 실시예는 아래의 번호가 매겨진 실시예에서 제공된다:
실시예 1. 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 일차 종양용해 바이러스.
실시예 2. 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 일차 바이러스.
실시예 3. 실시예 1에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및 상기 이차 종양용해 바이러스는 복제 능력이 있는, 바이러스.
실시예 4. 실시예 2에 있어서, 상기 일차 바이러스 및 상기 이차 바이러스는 복제 능력이 있는, 바이러스.
실시예 5. 실시예 1에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및/또는 상기 이차 종양용해 바이러스는 복제 불능인, 바이러스.
실시예 6. 실시예 2에 있어서, 상기 일차 바이러스 및/또는 상기 이차 바이러스는 복제 불능인, 바이러스.
실시예 7. 실시예 1, 3, 및 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 바이러스.
실시예 8. 실시예 2, 4 및 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 바이러스.
실시예 9. 실시예 1, 3, 5 및 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 상기 이차 종양용해 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성하는, 바이러스.
실시예 10. 실시예 2, 4, 6 및 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스는 상기 이차 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성하는, 바이러스.
실시예 11. 실시예 1, 3, 5, 7, 및 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스인, 바이러스.
실시예 12. 실시예 2, 4, 6, 8 및 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스인, 바이러스.
실시예 13. 실시예 11 또는 12에 있어서, 상기 dsDNA 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV) 또는 아데노바이러스인, 바이러스.
실시예 14. 실시예 11 또는 12에 있어서, 상기 dsDNA 바이러스는 폭스바이러스과 계열의 바이러스인, 바이러스.
실시예 15. 실시예 14에 있어서, 상기 dsDNA 바이러스는 전염성 연속종 바이러스(molluscum contagiosum virus), 점액종 바이러스(myxoma virus), 우두 바이러스(vaccina virus), 원숭이폭스 바이러스(monkeypox virus), 또는 야타폭스 바이러스(yatapoxvirus)인, 바이러스.
실시예 16. 실시예 1, 3, 5, 7 및 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 RNA 바이러스인, 바이러스.
실시예 17. 실시예 2, 4, 6, 8 및 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스는 RNA 바이러스인, 바이러스.
실시예 18. 실시예 16 또는 17에 있어서, 상기 RNA 바이러스는 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스인, 바이러스.
실시예 19. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 및 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스 ssRNA 바이러스인, 바이러스.
실시예 20. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 및 17-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스 ssRNA 바이러스인, 바이러스.
실시예 21. 실시예 19 또는 20에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 랍도바이러스과(Rhabdoviridae) 계열, 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열, 또는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 계열의 음성-센스 ssRNA 바이러스인, 바이러스.
실시예 22. 실시예 21에 있어서, 상기 랍도바이러스과 계열의 바이러스는 소포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 마라바 바이러스인, 바이러스.
실시예 23. 실시예 21에 있어서, 상기 파라믹소바이러스과 계열의 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스, 센다이 바이러스, 또는 홍역 바이러스인, 바이러스.
실시예 24. 실시예 21에 있어서, 상기 오르토믹소바이러스과 계열의 바이러스는 인플루엔자 바이러스인, 바이러스.
실시예 25. 실시예 19 또는 20에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-감지 ssRNA 바이러스이고, 여기서 상기 양성-감지 ssRNA 바이러스는 엔테로바이러스인, 바이러스.
실시예 26. 실시예 25에 있어서, 상기 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus, SVV), 콕사키바이러스, 또는 에코바이러스인, 바이러스.
실시예 27. 실시예 26에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 A(CVA) 또는 콕사키바이러스 B(CVB)인, 바이러스.
실시예 28. 실시예 27에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA9, CVA21 또는 CVB3인, 바이러스.
실시예 29. 실시예 19 또는 20에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-감지 ssRNA 바이러스이고, 여기서 상기 양성-센스 ssRNA 바이러스는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV)인, 바이러스.
실시예 30. 실시예 19 또는 20에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-감지 ssRNA 바이러스이고, 여기서 상기 양성-센스 ssRNA 바이러스는 멘고바이러스인, 바이러스.
실시예 31. 실시예 19 또는 20에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-감지 ssRNA 바이러스이고, 여기서 상기 양성-감지 ssRNA 바이러스는 토가바이러스과 계열의 바이러스인, 바이러스.
실시예 32. 실시예 31에 있어서, 상기 토가바이러스과 계열의 바이러스는 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스인, 바이러스.
실시예 33. 실시예 32에 있어서, 상기 신세계 알파바이러스 또는 상기 구세계 알파바이러스는 VEEV, WEEV, EEV, 신비스(Sindbis) 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 또는 마야로 바이러스(Mayaro virus)인, 바이러스.
실시예 34. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 18-19, 및 21-33 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및/또는 상기 이차 종양용해 바이러스는 키메라 바이러스인, 바이러스.
실시예 35. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 17-18, 및 20-33 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스 및/또는 상기 이차 바이러스는 키메라 바이러스인, 바이러스.
실시예 36. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 18-19, 및 21-34 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및/또는 상기 이차 종양용해 바이러스는 위형화된 바이러스인, 바이러스.
실시예 37. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 17-18, 20-33, 및 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스 및/또는 상기 이차 바이러스는 위형화된 바이러스인, 바이러스.
실시예 38. 실시예 36에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스는 위형화된 바이러스이고, 상기 일차 종양용해 바이러스는 상기 이차 종양용해 바이러스에 대한 코딩 영역 외부의 상기 이차 종양용해 바이러스의 캡시드 단백질 또는 외피 단백질에 대한 코딩 영역을 포함하는, 바이러스.
실시예 39. 실시예 38에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스는 알파바이러스, 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스인, 바이러스.
실시예 40. 실시예 37에 있어서, 상기 이차 바이러스는 위형화된 바이러스이고, 상기 일차 바이러스는 상기 이차 바이러스에 대한 코딩 영역 외부의 상기 이차 바이러스의 캡시드 단백질 또는 외피 단백질에 대한 코딩 영역을 포함하는, 바이러스.
실시예 41. 실시예 40에 있어서, 상기 이차 바이러스는 알파바이러스, 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스인, 바이러스.
실시예 42. 실시예 7-41 중 어느 하나에 있어서, 상기 조절가능 프로모터는 스테로이드-유도성 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, MX-1 프로모터, GENESWITCHTM 하이브리드 프로모터, 큐메이트-반응성 프로모터, 및 테트라사이클린-유도성 프로모터로부터 선택되는, 바이러스.
실시예 43. 실시예 7-41 중 어느 하나에 있어서, 상기 조절가능 프로모터는 재조합효소 인식 부위가 측부에 위치한 구성적 프로모터를 포함하는, 바이러스.
실시예 44. 실시예 1 - 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 바이러스.
실시예 45. 실시예 44에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 바이러스.
실시예 46. 실시예 45에 있어서, 상기 구성적 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, Moloney 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 루스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 조기 성장 반응 1(EGR1) 프로모터, 페리틴 H(FerH) 프로모터, 페리틴 L(FerL) 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, 진핵 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1) 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터(UBC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 및 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터로부터 선택되는, 바이러스.
실시예 47. 실시예 44-46 중 어느 하나에 있어서, 상기 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-의존성 프로모터이고, 상기 펩티드는 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(rtTA) 펩티드인, 바이러스.
실시예 48. 실시예 44-46 중 어느 하나에 있어서, 상기 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-의존성 프로모터이고, 상기 펩티드는 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA) 펩티드인, 바이러스.
실시예 49. 실시예 1-48 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 또는 상기 일차 바이러스는 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 바이러스.
실시예 50. 실시예 49에 있어서, 상기 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제2 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 바이러스.
실시예 51. 실시예 49 또는 50에 있어서, 상기 하나 이상의 RNAi 분자는 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스의 게놈에서 표적 서열에 결합하고 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스의 복제를 억제하는, 바이러스.
실시예 52. 실시예 49-51 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNAi 분자는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 AmiRNA인, 바이러스.
실시예 53. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 18-19, 21-34, 36, 38-39, 및 42-52 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함하는, 바이러스.
실시예 54. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 17-18, 20-33, 35, 37, 및 40-52 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함하는, 바이러스.
실시예 55. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 18-19, 21-34, 36, 38-39, 및 42-53 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소-반응성 카세트를 포함하고, 상기 재조합효소-반응성 카세트는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함하는, 바이러스.
실시예 56. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 17-18, 20-33, 35, 37, 40-52, 및 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소-반응성 카세트를 포함하고, 상기 재조합효소-반응성 카세트는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함하는, 바이러스.
실시예 57. 실시예 55 또는 56에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합효소-반응성 카세트는 재조합효소-반응성 절제 카세트(RREC)를 포함하는, 바이러스.
실시예 58. 실시예 57에 있어서, 상기 RREC는 전사/번역 종결(STOP) 요소를 포함하는, 바이러스.
실시예 59. 실시예 58에 있어서, 상기 전사/번역 종결(STOP) 요소는 서열번호 854-856 중 어느 하나와 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바이러스.
실시예 60. 실시예 55-59 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합효소-반응성 카세트는 재조합효소-반응성 역위 카세트(RRIC)를 포함하는, 바이러스.
실시예 61. 실시예 60에 있어서, 상기 RRIC는 중앙 요소의 각 측면 상에 둘 이상의 직교 재조합효소 인식 부위를 포함하는, 바이러스.
실시예 62. 실시예 60 또는 61에 있어서, 상기 RRIC는 프로모터 또는 프로모터의 부분을 포함하는, 바이러스.
실시예 63. 실시예 60 또는 61에 있어서, 상기 RRIC는 코딩 영역 또는 코딩 영역의 부분을 포함하고, 상기 코딩 영역은 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스의 바이러스 게놈을 암호화하는, 바이러스.
실시예 64. 실시예 60-63 중 어느 하나에 있어서, 상기 RRIC는 하나 이상의 제어 요소(들)를 포함하는, 바이러스.
실시예 65. 실시예 64에 있어서, 상기 제어 요소(들)는 전사/번역 종결(STOP) 요소인, 바이러스.
실시예 66. 실시예 65에 있어서, 상기 제어 요소(들)는 서열번호 854-856 중 어느 하나와 80% 동일성을 갖는 서열을 갖는, 바이러스.
실시예 67. 실시예 60-66 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합효소-반응성 역위 카세트(RRIC)는 인트론의 부분을 추가로 포함하는, 바이러스.
실시예 68. 실시예 67에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 mRNA 스플라이싱을 통해 인트론을 제거한 후 상기 재조합효소 인식 부위 없이 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스의 성숙 바이러스 게놈 전사체를 수득하는, 바이러스.
실시예 69. 실시예 1-68 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 또는 상기 일차 바이러스는 상기 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 바이러스.
실시예 70. 실시예 69에 있어서, 상기 재조합효소는 플립파아제(Flp) 또는 Cre 재조합효소(Cre)인, 바이러스.
실시예 71. 실시예 69 또는 70에 있어서, 상기 재조합효소의 코딩 영역은 인트론을 포함하는, 바이러스.
실시예 72. 실시예 69-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합효소 재조합효소의 발현 카세트는 하나 이상의 mRNA 탈안정화 요소를 포함하는, 바이러스.
실시예 73. 실시예 69-72 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합효소는 추가 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 일부이고, 상기 추가 폴리펩티드는 상기 재조합효소의 활성 및/또는 세포 편재화를 조절하는, 바이러스.
실시예 74. 실시예 73에 있어서, 상기 재조합효소의 활성 및/또는 세포 편재화는 리간드 및/또는 소분자의 존재에 의해 조절되는, 바이러스.
실시예 75. 실시예 73 또는 74에 있어서, 상기 추가 폴리펩티드는 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인을 포함하는, 바이러스.
실시예 76. 실시예 53-75 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합효소 인식 부위는 플립파아제 인식 표적(FRT) 부위인, 바이러스.
실시예 77. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 18-19, 21-34, 36, 38-39, 42-53, 55, 및 57-76 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 조절성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하고, 상기 조절성 폴리펩티드는 하나 이상의 프로모터의 활성을 조절하는, 바이러스.
실시예 78. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 17-18, 20-33, 35, 37, 40-52, 54, 및 56-76 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스는 조절성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하고, 상기 조절성 폴리펩티드는 하나 이상의 프로모터의 활성을 조절하는, 바이러스.
실시예 79. 재조합 일차 종양용해 바이러스로서,
이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 바이러스.
실시예 80. 재조합 일차 바이러스로서,
이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 바이러스.
실시예 81. 실시예 79에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및 상기 이차 종양용해 바이러스는 복제 능력이 있는, 바이러스.
실시예 82. 실시예 80에 있어서, 상기 일차 바이러스 및 상기 이차 바이러스는 복제 능력이 있는, 바이러스.
실시예 83. 실시예 79-82 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 제2 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 바이러스.
실시예 84. 실시예 79, 81, 및 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 상기 이차 종양용해 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성하는, 바이러스.
실시예 85. 실시예 80, 82 및 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스는 상기 이차 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성하는, 바이러스.
실시예 86. 실시예 79, 81, 83, 및 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스인, 바이러스.
실시예 87. 실시예 80, 82, 83 및 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스인, 바이러스.
실시예 88. 실시예 86 또는 87에 있어서, 상기 dsDNA 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV), 아데노바이러스 또는 폭스바이러스과 계열의 바이러스이고, 선택적으로 여기서 상기 폭스바이러스과 계열의 바이러스는 전염성 연속종 바이러스(molluscum contagiosum virus), 점액종 바이러스(myxoma virus), 우두 바이러스(vaccina virus), 원숭이폭스 바이러스(monkeypox virus), 또는 야타폭스 바이러스(yatapoxvirus)인, 바이러스.
실시예 89. 실시예 79, 81, 83 및 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 RNA 바이러스인, 바이러스.
실시예 90. 실시예 80, 82, 83 및 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스는 RNA 바이러스인, 바이러스.
실시예 91. 실시예 89 또는 90에 있어서, 상기 RNA 바이러스는 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스인, 바이러스.
실시예 92. 실시예 79, 81, 83, 84, 86, 88, 89, 및 91 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스 ssRNA 바이러스인, 바이러스.
실시예 93. 실시예 80, 82, 83, 85, 87, 88, 및 90-91 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스 ssRNA 바이러스인, 바이러스.
실시예 94. 실시예 92 또는 93에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 음성-센스 ssRNA 바이러스이고, 상기 음성-센스 ssRNA 바이러스는 랍도바이러스과(Rhabdoviridae) 계열, 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열, 또는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 계열의 바이러스이고, 선택적으로:
여기서 상기 랍도바이러스과 계열의 바이러스는 소포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 마라바 바이러스이고;
여기서 상기 파라믹소바이러스과 계열의 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스, 센다이 바이러스, 또는 홍역 바이러스이고; 또는
여기서 상기 오르토믹소바이러스과 계열의 바이러스는 인플루엔자 바이러스인, 바이러스.
실시예 95 실시예 92 또는 93에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-센스 ssRNA 바이러스이고, 여기서 상기 양성-센스 ssRNA 바이러스는 엔테로바이러스이고, 선택적으로 여기서 상기 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus, SVV), 콕사키바이러스, 또는 에코바이러스이고, 선택적으로 여기서 상기 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 A(CVA) 또는 콕사키바이러스 B(CVB3)이고, 선택적으로 여기서 상기 콕사키바이러스는 CVA9, CVA21 또는 CVB3인, 바이러스.
실시예 96. 실시예 92 또는 93에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-센스 ssRNA 바이러스이고, 상기 양성-센스 ssRNA 바이러스는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV) 또는 멘고바이러스인, 바이러스.
실시예 97. 실시예 92 또는 93에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-센스 ssRNA 바이러스이고, 상기 양성-센스 ssRNA 바이러스는 토가바이러스과 계열의 바이러스이고, 선택적으로, 상기 토가바이러스과 계열의 바이러스는 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스이고, 선택적으로 여기서 상기 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스는 VEEV, WEEV, EEV, 신비스(Sindbis) 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 또는 마야로 바이러스(Mayaro virus)인, 바이러스.
실시예 98. 실시예 79, 81, 83, 84, 86, 88, 89, 91-92, 및 94-97 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및/또는 상기 이차 종양용해 바이러스는 키메라 바이러스인, 바이러스.
실시예 99. 실시예 80, 82, 83, 85, 87, 88, 90-91, 및 93-97 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스 및/또는 상기 이차 바이러스는 키메라 바이러스인, 바이러스.
실시예 100. 실시예 79, 81, 83, 84, 86, 88, 89, 91-92, 및 94-98 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및/또는 상기 이차 종양용해 바이러스는 위형화된 바이러스인, 바이러스.
실시예 101. 실시예 80, 82, 83, 85, 87, 88, 90-91, 93-97, 및 99 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스 및/또는 상기 이차 바이러스는 위형화된 바이러스인, 바이러스.
실시예 102. 실시예 79-101 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 및 제2 조절가능 프로모터는 스테로이드-유도성 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, MX-1 프로모터, GENESWITCHTM 하이브리드 프로모터, 큐메이트-반응성 프로모터, 및 테트라사이클린-유도성 프로모터로부터 선택되는, 바이러스.
실시예 103. 실시예 79-102 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 제1 펩티드 및 상기 제2 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 제2 펩티드를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 바이러스.
실시예 104. 실시예 103에 있어서, 상기 제3 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 바이러스.
실시예 105. 실시예 104에 있어서, 상기 구성적 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, Moloney 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 루스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 조기 성장 반응 1(EGR1) 프로모터, 페리틴 H(FerH) 프로모터, 페리틴 L(FerL) 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, 진핵 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1) 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터(UBC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 및 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터로부터 선택되는, 바이러스.
실시예 106. 실시예 103-105 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-유도성 프로모터이고, 상기 제1 펩티드는 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(rtTA) 펩티드인, 바이러스.
실시예 107. 실시예 103-106 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-억제성 프로모터이고, 상기 제2 펩티드는 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA) 펩티드인, 바이러스.
실시예 108. 실시예 103-106 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-억제성 프로모터이고, 상기 제1 펩티드는 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA) 펩티드인, 바이러스.
실시예 109. 실시예 103-108 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-유도성 프로모터이고, 상기 제2 펩티드는 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(rtTA) 펩티드인, 바이러스.
실시예 110. 실시예 79, 81, 83, 84, 86, 88, 89, 91-92, 94-98, 100, 및 102-109 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 RNAi 분자는 상기 이차 종양용해 바이러스의 게놈에서 표적 서열에 결합하고 상기 이차 종양용해 바이러스의 복제를 억제하는, 바이러스.
실시예 111. 실시예 80, 82, 83, 85, 87, 88, 90-91, 93-97, 99, 및 101-109 중 어느 하나에 있어서, 상기 하나 이상의 RNAi 분자는 상기 이차 바이러스의 게놈에서 표적 서열에 결합하고 상기 이차 바이러스의 복제를 억제하는, 바이러스.
실시예 112. 실시예 110 또는 111에 있어서, 상기 RNAi 분자는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 AmiRNA인, 바이러스.
실시예 113. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 18-19, 21-34, 36, 38-39, 42-53, 55, 57-77, 79, 81, 83, 84, 86, 88, 89, 91-92, 94-98, 100, 102-109, 110, 및 112 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제1 3' 리보자임-암호화 서열 및 제2 5' 리보자임 암호화 서열을 포함하는, 바이러스.
실시예 114. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 17-18, 20-33, 35, 37, 40-52, 54, 56-76, 78, 80, 82, 83, 85, 87, 88, 90-91, 93-97, 99, 101-109, 및 111-112 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제1 3' 리보자임-암호화 서열 및 제2 5' 리보자임 암호화 서열을 포함하는, 바이러스.
실시예 115. 실시예 113 또는 114에 있어서, 상기 제1 및 제2 리보자임-암호화 서열은 해머헤드 리보자임 또는 간염 델타 바이러스 리보자임을 암호화하는, 바이러스.
실시예 116. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 18-19, 21-34, 36, 38-39, 42-53, 55, 57-77, 79, 81, 83, 84, 86, 88, 89, 91-92, 94-98, 100, 102-109, 110, 112-113, 및 115 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스의 게놈은 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
실시예 117. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 17-18, 20-33, 35, 37, 40-52, 54, 56-76, 78, 80, 82, 83, 85, 87, 88, 90-91, 93-97, 99, 101-109, 111-112, 114, 및 115 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스의 게놈은 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
실시예 118. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 18-19, 21-34, 36, 38-39, 42-53, 55, 57-77, 79, 81, 83, 84, 86, 88, 89, 91-92, 94-98, 100, 102-109, 110, 112-113, 및 115-116 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스의 게놈은 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
실시예 119. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 17-18, 20-33, 35, 37, 40-52, 54, 56-76, 78, 80, 82, 83, 85, 87, 88, 90-91, 93-97, 99, 101-109, 111-112, 114-115, 및 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 바이러스의 게놈은 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
실시예 120. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 18-19, 21-34, 36, 38-39, 42-53, 55, 57-77, 79, 81, 83, 84, 86, 88, 89, 91-92, 94-98, 100, 102-109, 110, 112-113, 115-116, 및 118 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및 상기 이차 종양용해 바이러스는 각각 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
실시예 121. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 17-18, 20-33, 35, 37, 40-52, 54, 56-76, 78, 80, 82, 83, 85, 87, 88, 90-91, 93-97, 99, 101-109, 111-112, 114-115, 117, 및 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 일차 바이러스 및 상기 이차 바이러스는 각각 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
실시예 122. 실시예 116, 118 및 120 중 어느 하나에 있어서, 세포에서 상기 하나 이상의 miRNA의 발현은 상기 일차 및/또는 이차 종양용해 바이러스의 복제를 억제하는, 바이러스.
실시예 123. 실시예 117, 119 및 121 중 어느 하나에 있어서, 세포에서 상기 하나 이상의 miRNA의 발현은 상기 일차 및/또는 이차 바이러스의 복제를 억제하는, 바이러스.
실시예 124. 실시예 1 - 123 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는, 바이러스.
실시예 125. 실시예 124에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소, 사이토카인, 케모카인, 또는 항원 결합 분자인, 바이러스.
실시예 126. 실시예 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13-16, 18-19, 21-34, 36, 38-39, 42-53, 55, 57-77, 79, 81, 83, 84, 86, 88, 89, 91-92, 94-98, 100, 102-109, 110, 112-113, 115-116, 118, 120, 122, 및 124-125 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스의 발현은 외인성 제제에 의해 조절되는, 바이러스.
실시예 127. 실시예 2, 4, 6, 8, 10, 12-15, 17-18, 20-33, 35, 37, 40-52, 54, 56-76, 78, 80, 82, 83, 85, 87, 88, 90-91, 93-97, 99, 101-109, 111-112, 114-115, 117, 119, 121, 및 123-125 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 바이러스의 발현은 외인성 제제에 의해 조절되는, 바이러스.
실시예 128. 실시예 126 또는 127에 있어서, 상기 외인성 제제는 펩티드, 호르몬, 또는 소분자인, 바이러스.
실시예 129. 실시예 1 - 128 중 어느 하나의 바이러스를 포함하는 조성물.
실시예 130. 실시예 1 - 128 중 어느 하나의 바이러스 또는 실시예 129의 조성물을 종양 세포의 집단에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 집단을 사멸시키는 방법.
실시예 131. 실시예 130에 있어서, 상기 종양 세포의 제1 하위 집단은 상기 일차 종양용해 바이러스에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
실시예 132. 실시예 130 또는 131에 있어서, 상기 종양 세포의 제2 하위 집단은 상기 이차 종양용해 바이러스에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
실시예 133. 실시예 130-132 중 어느 하나에 있어서, 상기 종양 세포의 하위 집단은 상기 일차 종양용해 바이러스 및 상기 이차 종양용해 바이러스 모두에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
실시예 134. 실시예 130-133 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 상기 일차 및 이차 종양용해 바이러스에 의해 사멸되는, 방법.
실시예 135. 실시예 130-134 중 어느 하나에 있어서, 상기 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 이차 종양용해 바이러스의 생산을 조절하는, 방법.
실시예 136. 실시예 135에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 종양용해 바이러스와 동시에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 종양용해 바이러스의 생산을 억제하는, 방법.
실시예 137. 실시예 135에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 종양용해 바이러스 후에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 종양용해 바이러스의 생산을 유도하는, 방법.
실시예 138. 실시예 137에 있어서, 상기 외인성 제제(들)는 상기 일차 종양용해 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여되는, 방법.
실시예 139. 실시예 135-138 중 어느 하나에 있어서, 상기 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 종양용해 바이러스는 검출가능하지 않은, 방법.
실시예 140. 실시예 130에 있어서, 상기 종양 세포의 제1 하위 집단은 상기 일차 바이러스에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
실시예 141. 실시예 130 또는 140에 있어서, 상기 종양 세포의 제2 하위 집단은 상기 이차 바이러스에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
실시예 142. 실시예 130, 140, 및 141 중 어느 하나에 있어서, 상기 종양 세포의 하위 집단은 상기 일차 바이러스 및 상기 이차 바이러스 모두에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
실시예 143. 실시예 130 및 140-142 중 어느 하나에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 상기 이차 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 상기 일차 및 이차 바이러스에 의해 사멸되는, 방법.
실시예 144. 실시예 130 및 140-143 중 어느 하나에 있어서, 상기 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 이차 바이러스의 생산을 조절하는, 방법.
실시예 145. 실시예 144에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 일차 바이러스와 동시에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 이차 바이러스의 생산을 억제하는, 방법.
실시예 146. 실시예 145에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 일차 바이러스 후에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 이차 바이러스의 생산을 유도하는, 방법.
실시예 147. 실시예 146에 있어서, 상기 외인성 제제(들)는 일차 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여되는, 방법.
실시예 148. 실시예 144-147 중 어느 하나에 있어서, 상기 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 바이러스는 검출가능하지 않은, 방법.
실시예 149. 실시예 1 - 128 중 어느 하나의 바이러스 또는 실시예 129의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
실시예 150. 실시예 149에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 상기 일차 및 이차 종양용해 바이러스에 의해 사멸되는, 방법.
실시예 151. 실시예 149 또는 150에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 더 많은 종양 크기 감소를 초래하는, 방법.
실시예 152. 실시예 149-151 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 하나 이상의 종양 항원에 대한 보다 강한 면역 반응을 유도하는, 방법.
실시예 153. 실시예 149-152 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 일차 종양용해 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시키는, 방법.
실시예 154. 실시예 149-153 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여에 비해 대상체에서 상기 이차 종양용해 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시키는, 방법.
실시예 155. 실시예 149-154 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 종양 세포를 우선적으로/더 특이적으로 사멸시키는 것을 유발하는, 방법.
실시예 156. 실시예 149-155 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 일차 종양용해 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래하는, 방법.
실시예 157. 실시예 149-156 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여에 비해 대상체에서 상기 이차 종양용해 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래하는, 방법.
실시예 158. 실시예 149-157 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 연장된 종양 억제 기간을 초래하는, 방법.
실시예 159. 실시예 149-158 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 더 많은 세포 유형의 바이러스 감염을 가능하게 하는, 방법.
실시예 160. 실시예 149-159 중 어느 하나에 있어서, 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 이차 종양용해 바이러스의 생산을 조절하는, 방법.
실시예 161. 실시예 160에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 종양용해 바이러스와 동시에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 종양용해 바이러스의 생산을 억제하는, 방법.
실시예 162. 실시예 160에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 종양용해 바이러스 후에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 종양용해 바이러스의 생산을 유도하는, 방법.
실시예 163. 실시예 162에 있어서, 상기 외인성 제제(들)는 상기 일차 종양용해 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여되는, 방법.
실시예 164. 실시예 160-163 중 어느 하나에 있어서, 상기 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 종양용해 바이러스가 검출가능하지 않은, 방법.
실시예 165. 실시예 149에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 상기 이차 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 상기 일차 및 이차 바이러스에 의해 사멸되는, 방법.
실시예 166. 실시예 149 또는 165에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 상기 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여 대상체에서 더 많은 종양 크기 감소를 초래하는, 방법.
실시예 167. 실시예 149, 165 및 166 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여 또는 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 하나 이상의 종양 항원에 대한 보다 강한 면역 반응을 유도하는, 방법.
실시예 168. 실시예 149 및 165-167 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 일차 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시키는, 방법.
실시예 169. 실시예 149 및 165-168 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 이차 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시키는, 방법.
실시예 170. 실시예 149 및 165-169 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여 또는 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 종양 세포의 우선적/더 특이적인 사멸을 초래하는, 방법.
실시예 171. 실시예 149 및 165-170 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 일차 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래하는, 방법.
실시예 172. 실시예 149 및 165-171 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 이차 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래하는, 방법.
실시예 173. 실시예 149 및 165-172 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 연장된 종양 억제 기간을 초래하는, 방법.
실시예 174. 실시예 149 및 165-173 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 더 많은 세포 유형의 바이러스 감염을 가능하게 하는, 방법.
실시예 175. 실시예 149 및 165-174 중 어느 하나에 있어서, 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 이차 바이러스의 생산을 조절하는, 방법.
실시예 176. 실시예 175에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 바이러스와 동시에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 바이러스의 생산을 억제하는, 방법.
실시예 177. 실시예 175에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 바이러스 후에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 바이러스의 생산을 유도하는, 방법.
실시예 178. 실시예 177에 있어서, 상기 외인성 제제(들)는 상기 일차 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여되는, 방법.
실시예 179. 실시예 175-178 중 어느 하나에 있어서, 상기 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 바이러스가 검출가능하지 않은, 방법.
실시예 180. 실시예 1 - 128의 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
실시예 181. 실시예 180의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
실시예 182. 실시예 181의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
참조에 의한 통합
본원에 인용된 모든 참조, 논문, 간행물, 특허, 특허 공개, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로서 통합된다. 그러나, 본원에 인용된 임의의 참조, 논문, 간행물, 특허, 특허 공개, 및 특허 출원에 대한 언급은, 이들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 세계 어느 국가에서도 일반적인 일반 지식의 일부를 구성한다는 인정 또는 임의의 형태의 제안이 아니며, 그러한 것으로 간주되어서도 안 된다.
SEQUENCE LISTING <110> Oncorus, Inc. Kennedy, Edward M. Lerner, Lorena Queva, Cristophe Strathdee, Craig A. 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uucccuuugu cauccuaugc cu 22 <210> 23 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 23 auaagacgaa caaaagguuu gu 22 <210> 24 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 24 acagcaggca cagacaggca gu 22 <210> 25 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 25 uacugcauca ggaacugauu gga 23 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 26 ugauugucca aacgcaauuc u 21 <210> 27 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 27 ugucaguuug ucaaauaccc ca 22 <210> 28 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 28 uggcaguguc uuagcugguu gu 22 <210> 29 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 29 aaaccguuac cauuacugag uu 22 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 30 uaaaguaaau augcaccaaa a 21 <210> 31 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 31 ugagguagua gguuguauag uu 22 <210> 32 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 32 ucuuugguua ucuagcugua uga 23 <210> 33 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 33 ugagguagua gguugugugg uu 22 <210> 34 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 34 ugagguagua gguuguaugg uu 22 <210> 35 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 35 agagguagua gguugcauag uu 22 <210> 36 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 36 ugagguagga gguuguauag uu 22 <210> 37 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 37 ugagguagua gauuguauag uu 22 <210> 38 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 38 ugagguagua guuuguacag uu 22 <210> 39 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 39 ugagguagua guuugugcug uu 22 <210> 40 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 40 aacccguaga uccgaacuug ug 22 <210> 41 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 41 uacaguacug ugauaacuga a 21 <210> 42 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 42 agcagcauug uacagggcua uga 23 <210> 43 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 43 ucaaaugcuc agacuccugu ggu 23 <210> 44 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 44 aaaagugcuu acagugcagg uag 23 <210> 45 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 45 uaaagugcug acagugcaga u 21 <210> 46 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 46 agcagcauug uacagggcua uca 23 <210> 47 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 47 uacccuguag auccgaauuu gug 23 <210> 48 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 48 uacccuguag aaccgaauuu gug 23 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 49 uugcucacug uucuucccua g 21 <210> 50 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 50 uuuccggcuc gcgugggugu gu 22 <210> 51 <211> 27 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 51 cacuguaggu gauggugaga gugggca 27 <210> 52 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 52 auauacaggg ggagacucuu au 22 <210> 53 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 53 auauacaggg ggagacucuc au 22 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 54 agaggauacc cuuuguaugu u 21 <210> 55 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 55 gggaugguag accggugacg ugc 23 <210> 56 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 56 uaggacacau ggucuacuuc u 21 <210> 57 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 57 cuccugagcc auucugagcc uc 22 <210> 58 <211> 21 <212> 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23 <210> 188 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 188 aacauucaac cugucgguga gu 22 <210> 189 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 189 ccaccggggg augaauguca c 21 <210> 190 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 190 ugguucuaga cuugccaacu a 21 <210> 191 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 191 uuuggcaaug guagaacuca cacu 24 <210> 192 <211> 18 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 192 ugaggcagua gauugaau 18 <210> 193 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 193 uauggcacug guagaauuca cu 22 <210> 194 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 194 uggagagaaa ggcaguuccu ga 22 <210> 195 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 195 caaagaauuc uccuuuuggg cu 22 <210> 196 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 196 ucgugucuug uguugcagcc gg 22 <210> 197 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 197 cucccacaug caggguuugc a 21 <210> 198 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 198 caucccuugc augguggagg g 21 <210> 199 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 199 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uuggacaauc agu 23 <210> 258 <211> 23 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 258 agcuacauug ucugcugggu uuc 23 <210> 259 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 259 accuggcaua caauguagau uu 22 <210> 260 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 260 agcuacaucu ggcuacuggg u 21 <210> 261 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 261 aagcugccag uugaagaacu gu 22 <210> 262 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 262 caagucacua gugguuccgu u 21 <210> 263 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 263 gagagcagug uguguugccu gg 22 <210> 264 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 264 aucacauugc cagggauuuc c 21 <210> 265 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 265 aucacauugc cagggauuac c 21 <210> 266 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 266 aucacauugc cagugauuac cc 22 <210> 267 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 267 uggcucaguu cagcaggaac ag 22 <210> 268 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 268 cauugcacuu gucucggucu ga 22 <210> 269 <211> 21 <212> RNA <213> Homo 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naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (266)..(285) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (307)..(326) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (349)..(368) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (390)..(409) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (432)..(451) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <400> 904 ggcattcacc gcgtgcctta nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggcattcacc gcgtgcctta 60 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ggcattcacc gcgtgcctta nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 120 ggcattcacc gcgtgcctta nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn atacatactt ctttacattc 180 cannnnnnnn nnnnnnnnnn nngagctaca gtgcttcatc tcannnnnnn nnnnnnnnnn 240 nnnatacata cttctttaca ttccannnnn nnnnnnnnnn nnnnngagct acagtgcttc 300 atctcannnn nnnnnnnnnn nnnnnnatac atacttcttt acattccann nnnnnnnnnn 360 nnnnnnnnga gctacagtgc ttcatctcan nnnnnnnnnn nnnnnnnnna tacatacttc 420 tttacattcc annnnnnnnn nnnnnnnnnn ngagctacag tgcttcatct ca 472 <210> 905 <211> 476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-TS <220> <221> misc_feature <222> (22)..(41) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (64)..(83) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (105)..(124) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (147)..(166) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (188)..(207) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (229)..(248) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (271)..(290) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (312)..(331) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (353)..(372) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (394)..(413) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (436)..(455) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <400> 905 agaattgcgt ttggacaatc annnnnnnnn nnnnnnnnnn ncaaacacca ttgtcacact 60 ccannnnnnn nnnnnnnnnn nnnaaagaga ccggttcact gtgrnnnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnncaaaca ccattgtcac actccannnn nnnnnnnnnn nnnnnnagaa ttgcgtttgg 180 acaatcannn nnnnnnnnnn nnnnnnnaaa gagaccggtt cactgtgrnn nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnca aacaccattg tcacactcca nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn aaagagaccg 300 gttcactgtg rnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nagaattgcg tttggacaat cannnnnnnn 360 nnnnnnnnnn nnaaagagac cggttcactg tgrnnnnnnn nnnnnnnnnn nnncaaacac 420 cattgtcaca ctccannnnn nnnnnnnnnn nnnnnagaat tgcgtttgga caatca 476 <210> 906 <211> 476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-TS <220> <221> misc_feature <222> (22)..(41) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (63)..(82) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (105)..(124) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (146)..(165) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (187)..(206) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (229)..(248) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (270)..(289) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (311)..(330) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (353)..(372) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (394)..(413) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (435)..(454) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <400> 906 aaagagaccg gttcactgtg rnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nagaattgcg tttggacaat 60 cannnnnnnn nnnnnnnnnn nnaggcatag gatgacaaag ggaannnnnn nnnnnnnnnn 120 nnnnaaagag accggttcac tgtgrnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnagaat tgcgtttgga 180 caatcannnn nnnnnnnnnn nnnnnnaggc ataggatgac aaagggaann nnnnnnnnnn 240 nnnnnnnnaa agagaccggt tcactgtgrn nnnnnnnnnn nnnnnnnnna gaattgcgtt 300 tggacaatca nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn aggcatagga tgacaaaggg aannnnnnnn 360 nnnnnnnnnn nnaaagagac cggttcactg tgrnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnagaattg 420 cgtttggaca atcannnnnn nnnnnnnnnn nnnnaggcat aggatgacaa agggaa 476 <210> 907 <211> 488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-TS <220> <221> misc_feature <222> (23)..(42) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (65)..(84) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (108)..(127) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (150)..(169) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (193)..(212) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (235)..(254) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (277)..(296) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (320)..(339) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (362)..(381) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (405)..(424) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (447)..(466) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <400> 907 acaaaccttt tgttcgtctt atnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncrcattat tactcacggt 60 acgannnnnn nnnnnnnnnn nnnnctacgc gtattcttaa gcaataannn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnaca aaccttttgt tcgtcttatn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc tacgcgtatt 180 cttaagcaat aannnnnnnn nnnnnnnnnn nncrcattat tactcacggt acgannnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnacaaac cttttgttcg tcttatnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnctac 300 gcgtattctt aagcaataan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc rcattattac tcacggtacg 360 annnnnnnnn nnnnnnnnnn nctacgcgta ttcttaagca ataannnnnn nnnnnnnnnn 420 nnnncrcatt attactcacg gtacgannnn nnnnnnnnnn nnnnnnacaa accttttgtt 480 cgtcttat 488 <210> 908 <211> 492 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-TS <220> <221> misc_feature <222> (24)..(43) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (66)..(85) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (109)..(128) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (151)..(170) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (194)..(213) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (237)..(256) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (280)..(299) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (322)..(341) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (365)..(384) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (407)..(426) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (450)..(469) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <400> 908 ctacgcgtat tcttaagcaa taannnnnnn nnnnnnnnnn nnncrcatta ttactcacgg 60 tacgannnnn nnnnnnnnnn nnnnntccaa tcagttcctg atgcagtann nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnncr cattattact cacggtacga nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tccaatcagt 180 tcctgatgca gtannnnnnn nnnnnnnnnn nnnctacgcg tattcttaag caataannnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnntcca atcagttcct gatgcagtan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc 300 rcattattac tcacggtacg annnnnnnnn nnnnnnnnnn nctacgcgta ttcttaagca 360 ataannnnnn nnnnnnnnnn nnnncrcatt attactcacg gtacgannnn nnnnnnnnnn 420 nnnnnntcca atcagttcct gatgcagtan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc tacgcgtatt 480 cttaagcaat aa 492 <210> 909 <211> 492 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-TS <220> <221> misc_feature <222> (24)..(43) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (66)..(85) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (109)..(128) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (151)..(170) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (194)..(213) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (237)..(256) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (280)..(299) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (322)..(341) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (365)..(384) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (407)..(426) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (450)..(469) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <400> 909 ctacgcgtat tcttaagcaa taannnnnnn nnnnnnnnnn nnnagccaag ctcagacgga 60 tccgannnnn nnnnnnnnnn nnnnntccaa tcagttcctg atgcagtann nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnag ccaagctcag acggatccga nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tccaatcagt 180 tcctgatgca gtannnnnnn nnnnnnnnnn nnnctacgcg tattcttaag caataannnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnntcca atcagttcct gatgcagtan nnnnnnnnnn nnnnnnnnna 300 gccaagctca gacggatccg annnnnnnnn nnnnnnnnnn nctacgcgta ttcttaagca 360 ataannnnnn nnnnnnnnnn nnnnagccaa gctcagacgg atccgannnn nnnnnnnnnn 420 nnnnnntcca atcagttcct gatgcagtan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc tacgcgtatt 480 cttaagcaat aa 492 <210> 910 <211> 488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-TS <220> <221> misc_feature <222> (24)..(43) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (65)..(84) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (108)..(127) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (149)..(168) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (192)..(211) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (235)..(254) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (278)..(297) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (319)..(338) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (362)..(381) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (403)..(422) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (446)..(465) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <400> 910 ctacgcgtat tcttaagcaa taannnnnnn nnnnnnnnnn nnnaaagaga ccggttcact 60 gtgrnnnnnn nnnnnnnnnn nnnntccaat cagttcctga tgcagtannn nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnaaa gagaccggtt cactgtgrnn nnnnnnnnnn nnnnnnnntc caatcagttc 180 ctgatgcagt annnnnnnnn nnnnnnnnnn nctacgcgta ttcttaagca ataannnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnntccaat cagttcctga tgcagtannn nnnnnnnnnn nnnnnnnaaa 300 gagaccggtt cactgtgrnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnct acgcgtattc ttaagcaata 360 annnnnnnnn nnnnnnnnnn naaagagacc ggttcactgt grnnnnnnnn nnnnnnnnnn 420 nntccaatca gttcctgatg cagtannnnn nnnnnnnnnn nnnnnctacg cgtattctta 480 agcaataa 488 <210> 911 <211> 492 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-TS <220> <221> misc_feature <222> (24)..(43) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (66)..(85) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (109)..(128) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (151)..(170) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (194)..(213) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (237)..(256) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (280)..(299) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (322)..(341) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (365)..(384) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (407)..(426) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (450)..(469) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <400> 911 ctacgcgtat tcttaagcaa taannnnnnn nnnnnnnnnn nnnatacttt ttggggtaag 60 ggcttnnnnn nnnnnnnnnn nnnnntccaa tcagttcctg atgcagtann nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnat actttttggg gtaagggctt nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tccaatcagt 180 tcctgatgca gtannnnnnn nnnnnnnnnn nnnctacgcg tattcttaag caataannnn 240 nnnnnnnnnn nnnnnntcca atcagttcct gatgcagtan nnnnnnnnnn nnnnnnnnna 300 tactttttgg ggtaagggct tnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nctacgcgta ttcttaagca 360 ataannnnnn nnnnnnnnnn nnnnatactt tttggggtaa gggcttnnnn nnnnnnnnnn 420 nnnnnntcca atcagttcct gatgcagtan nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc tacgcgtatt 480 cttaagcaat aa 492 <210> 912 <211> 491 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-TS <220> <221> misc_feature <222> (24)..(43) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (66)..(85) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (109)..(128) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (151)..(170) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (194)..(213) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (236)..(255) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (279)..(298) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (321)..(340) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (364)..(383) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (406)..(425) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <220> <221> misc_feature <222> (449)..(468) <223> n is any naturally-occurring nucleotide and up to nineteen of them may be absent <400> 912 ctacgcgtat tcttaagcaa taannnnnnn nnnnnnnnnn nnnatgccct ttcatcattg 60 cactgnnnnn nnnnnnnnnn nnnnntccaa tcagttcctg atgcagtann nnnnnnnnnn 120 nnnnnnnnat gccctttcat cattgcactg nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn tccaatcagt 180 tcctgatgca gtannnnnnn nnnnnnnnnn nnnatgccct ttcatcattg cactgnnnnn 240 nnnnnnnnnn nnnnntccaa tcagttcctg atgcagtann nnnnnnnnnn nnnnnnnnag 300 ccaagctcag acggatccga nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ctacgcgtat tcttaagcaa 360 taannnnnnn nnnnnnnnnn nnnatgccct ttcatcattg cactgnnnnn nnnnnnnnnn 420 nnnnntccaa tcagttcctg atgcagtann nnnnnnnnnn nnnnnnnnct acgcgtattc 480 ttaagcaata a 491 <210> 913 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K4 Aptazyme <400> 913 ggcgcgtcct ggattcgtac aaaacatacc agatttcgat ctggagaggt gaagaatacg 60 accacctgta catccagctg atgagtccca aataggacga aacgcgct 108 <210> 914 <211> 108 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K7 Aptazyme <400> 914 ggcgcgtcct ggattcgtgc aaaacatacc agatttcgat ctggagaggt gaagaatacg 60 accacctgta catccagctg atgagtccca aataggacga aacgcgct 108

Claims (182)

  1. 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는,
    재조합 일차 종양용해 바이러스.
  2. 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는,
    재조합 일차 바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및 상기 이차 종양용해 바이러스는 복제 능력이 있는, 바이러스.
  4. 제2항에 있어서, 상기 일차 바이러스 및 상기 이차 바이러스는 복제 능력이 있는, 바이러스.
  5. 제1항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및/또는 상기 이차 종양용해 바이러스는 복제 불능인, 바이러스.
  6. 제2항에 있어서, 상기 일차 바이러스 및/또는 상기 이차 바이러스는 복제 불능인, 바이러스.
  7. 제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 바이러스.
  8. 제2항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 조절가능 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 바이러스.
  9. 제1항, 제3항, 제5항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 상기 이차 종양용해 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성하는, 바이러스.
  10. 제2항, 제4항, 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스는 상기 이차 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성하는, 바이러스.
  11. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스인, 바이러스.
  12. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스인, 바이러스.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 dsDNA 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV) 또는 아데노바이러스인, 바이러스.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 dsDNA 바이러스는 폭스바이러스과 계열의 바이러스인, 바이러스.
  15. 제14항에 있어서, 상기 dsDNA 바이러스는 전염성 연속종 바이러스(molluscum contagiosum virus), 점액종 바이러스(myxoma virus), 우두 바이러스(vaccina virus), 원숭이폭스 바이러스(monkeypox virus), 또는 야타폭스 바이러스(yatapoxvirus)인, 바이러스.
  16. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 RNA 바이러스인, 바이러스.
  17. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스는 RNA 바이러스인, 바이러스.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 RNA 바이러스는 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스인, 바이러스.
  19. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스 ssRNA 바이러스인, 바이러스.
  20. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 및 제17항 및 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스 ssRNA 바이러스인, 바이러스.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 랍도바이러스과(Rhabdoviridae) 계열, 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열, 또는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 계열의 음성-센스 ssRNA 바이러스인, 바이러스.
  22. 제21항에 있어서, 상기 랍도바이러스과 계열의 바이러스는 소포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 마라바 바이러스인, 바이러스.
  23. 제21항에 있어서, 상기 파라믹소바이러스과 계열의 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스, 센다이 바이러스, 또는 홍역 바이러스인, 바이러스.
  24. 제21항에 있어서, 상기 오르토믹소바이러스과 계열의 바이러스는 인플루엔자 바이러스인, 바이러스.
  25. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-감지 ssRNA 바이러스이고, 여기서 상기 양성-감지 ssRNA 바이러스는 엔테로바이러스인, 바이러스.
  26. 제25항에 있어서, 상기 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus, SVV), 콕사키바이러스, 또는 에코바이러스인, 바이러스.
  27. 제26항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 A(CVA) 또는 콕사키바이러스 B(CVB)인, 바이러스.
  28. 제27항에 있어서, 상기 콕사키바이러스는 CVA9, CVA21 또는 CVB3인, 바이러스.
  29. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-감지 ssRNA 바이러스이고, 여기서 상기 양성-센스 ssRNA 바이러스는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV)인, 바이러스.
  30. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-감지 ssRNA 바이러스이고, 여기서 상기 양성-센스 ssRNA 바이러스는 멘고바이러스인, 바이러스.
  31. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-감지 ssRNA 바이러스이고, 여기서 상기 양성-감지 ssRNA 바이러스는 토가바이러스과 계열의 바이러스인, 바이러스.
  32. 제31항에 있어서, 상기 토가바이러스과 계열의 바이러스는 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스인, 바이러스.
  33. 제32항에 있어서, 상기 신세계 알파바이러스 또는 상기 구세계 알파바이러스는 VEEV, WEEV, EEV, 신비스(Sindbis) 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 또는 마야로 바이러스(Mayaro virus)인, 바이러스.
  34. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 제18항 및 제19항, 및 제21항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및/또는 상기 이차 종양용해 바이러스는 키메라 바이러스인, 바이러스.
  35. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 제17항 및 제18항, 및 제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스 및/또는 상기 이차 바이러스는 키메라 바이러스인, 바이러스.
  36. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 제18항 및 제19항, 및 제21항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및/또는 상기 이차 종양용해 바이러스는 위형화된 바이러스인, 바이러스.
  37. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 제17항 및 제18항, 제20항 내지 제33항, 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스 및/또는 상기 이차 바이러스는 위형화된 바이러스인, 바이러스.
  38. 제36항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스는 위형화된 바이러스이고, 상기 일차 종양용해 바이러스는 상기 이차 종양용해 바이러스에 대한 코딩 영역 외부의 상기 이차 종양용해 바이러스의 캡시드 단백질 또는 외피 단백질에 대한 코딩 영역을 포함하는, 바이러스.
  39. 제38항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스는 알파바이러스, 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스인, 바이러스.
  40. 제37항에 있어서, 상기 이차 바이러스는 위형화된 바이러스이고, 상기 일차 바이러스는 상기 이차 바이러스에 대한 코딩 영역 외부의 상기 이차 바이러스의 캡시드 단백질 또는 외피 단백질에 대한 코딩 영역을 포함하는, 바이러스.
  41. 제40항에 있어서, 상기 이차 바이러스는 알파바이러스, 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스인, 바이러스.
  42. 제7항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절가능 프로모터는 스테로이드-유도성 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, MX-1 프로모터, GENESWITCHTM 하이브리드 프로모터, 큐메이트-반응성 프로모터, 및 테트라사이클린-유도성 프로모터로부터 선택되는, 바이러스.
  43. 제7항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절가능 프로모터는 재조합효소 인식 부위가 측부에 위치한 구성적 프로모터를 포함하는, 바이러스.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 펩티드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 바이러스.
  45. 제44항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는, 바이러스.
  46. 제45항에 있어서, 상기 구성적 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, Moloney 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 루스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 조기 성장 반응 1(EGR1) 프로모터, 페리틴 H(FerH) 프로모터, 페리틴 L(FerL) 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, 진핵 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1) 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터(UBC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 및 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터로부터 선택되는, 바이러스.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-의존성 프로모터이고, 상기 펩티드는 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(rtTA) 펩티드인, 바이러스.
  48. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-의존성 프로모터이고, 상기 펩티드는 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA) 펩티드인, 바이러스.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 또는 상기 일차 바이러스는 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 바이러스.
  50. 제49항에 있어서, 상기 하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제2 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 바이러스.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 상기 하나 이상의 RNAi 분자는 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스의 게놈에서 표적 서열에 결합하고 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스의 복제를 억제하는, 바이러스.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNAi 분자는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 AmiRNA인, 바이러스.
  53. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 제18항 및 제19항, 제21항 내지 제34항, 제36항, 제38항 및 제39항, 및 제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함하는, 바이러스.
  54. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 제17항 및 제18항, 제20항 내지 제33항, 제35항, 제37항, 및 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함하는, 바이러스.
  55. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 제18항 및 제19항, 제21항 내지 제34항, 제36항, 제38항 및 제39항, 및 제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소-반응성 카세트를 포함하고, 상기 재조합효소-반응성 카세트는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함하는, 바이러스.
  56. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 제17항 및 제18항, 제20항 내지 제33항, 제35항, 제37항, 제40항 내지 제52항, 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 재조합효소-반응성 카세트를 포함하고, 상기 재조합효소-반응성 카세트는 하나 이상의 재조합효소 인식 부위를 포함하는, 바이러스.
  57. 제55항 또는 제56항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합효소-반응성 카세트는 재조합효소-반응성 절제 카세트(RREC)를 포함하는, 바이러스.
  58. 제57항에 있어서, 상기 RREC는 전사/번역 종결(STOP) 요소를 포함하는, 바이러스.
  59. 제58항에 있어서, 상기 전사/번역 종결(STOP) 요소는 서열번호 854-856 중 어느 하나와 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 바이러스.
  60. 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합효소-반응성 카세트는 재조합효소-반응성 역위 카세트(RRIC)를 포함하는, 바이러스.
  61. 제60항에 있어서, 상기 RRIC는 중앙 요소의 각 측면 상에 둘 이상의 직교 재조합효소 인식 부위를 포함하는, 바이러스.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 RRIC는 프로모터 또는 프로모터의 부분을 포함하는, 바이러스.
  63. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 RRIC는 코딩 영역 또는 코딩 영역의 부분을 포함하고, 상기 코딩 영역은 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스의 바이러스 게놈을 암호화하는, 바이러스.
  64. 제60항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RRIC는 하나 이상의 제어 요소(들)를 포함하는, 바이러스.
  65. 제64항에 있어서, 상기 제어 요소(들)는 전사/번역 종결(STOP) 요소인, 바이러스.
  66. 제65항에 있어서, 상기 제어 요소(들)는 서열번호 854-856 중 어느 하나와 80% 동일성을 갖는 서열을 갖는, 바이러스.
  67. 제60항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소-반응성 역위 카세트(RRIC)는 인트론의 부분을 추가로 포함하는, 바이러스.
  68. 제67항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 mRNA 스플라이싱을 통해 인트론을 제거한 후 상기 재조합효소 인식 부위 없이 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스의 성숙 바이러스 게놈 전사체를 수득하는, 바이러스.
  69. 제1항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 또는 상기 일차 바이러스는 상기 재조합효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 바이러스.
  70. 제69항에 있어서, 상기 재조합효소는 플립파아제(Flp) 또는 Cre 재조합효소(Cre)인, 바이러스.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 재조합효소의 코딩 영역은 인트론을 포함하는, 바이러스.
  72. 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소 재조합효소의 발현 카세트는 하나 이상의 mRNA 탈안정화 요소를 포함하는, 바이러스.
  73. 제69항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합효소는 추가 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질의 일부이고, 상기 추가 폴리펩티드는 상기 재조합효소의 활성 및/또는 세포 편재화를 조절하는, 바이러스.
  74. 제73항에 있어서, 상기 재조합효소의 활성 및/또는 세포 편재화는 리간드 및/또는 소분자의 존재에 의해 조절되는, 바이러스.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 추가 폴리펩티드는 에스트로겐 수용체 단백질의 리간드 결합 도메인을 포함하는, 바이러스.
  76. 제53항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합효소 인식 부위는 플립파아제 인식 표적(FRT) 부위인, 바이러스.
  77. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 제18항 및 제19항, 제21항 내지 제34항, 제36항, 제38항 및 제39항, 제42항 내지 제53항, 제55항, 및 제57항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 조절성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하고, 상기 조절성 폴리펩티드는 하나 이상의 프로모터의 활성을 조절하는, 바이러스.
  78. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 제17항 및 제18항, 제20항 내지 제33항, 제35항, 제37항, 제40항 내지 제52항, 제54항, 및 제56항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스는 조절성 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하고, 상기 조절성 폴리펩티드는 하나 이상의 프로모터의 활성을 조절하는, 바이러스.
  79. 재조합 일차 종양용해 바이러스로서,
    이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
    하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 바이러스.
  80. 재조합 일차 바이러스로서,
    이차 바이러스를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오티드; 및
    하나 이상의 RNA 간섭(RNAi) 분자를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 바이러스.
  81. 제79항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및 상기 이차 종양용해 바이러스는 복제 능력이 있는, 바이러스.
  82. 제80항에 있어서, 상기 일차 바이러스 및 상기 이차 바이러스는 복제 능력이 있는, 바이러스.
  83. 제79항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드는 제1 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결되고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는 제2 조절가능 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 바이러스.
  84. 제79항, 제81항 및 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 상기 이차 종양용해 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성하는, 바이러스.
  85. 제80항, 제82항, 및 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스는 상기 이차 바이러스에 대한 항원 특이적 면역을 매개하지 않는 항원 특이적 면역 반응을 생성하는, 바이러스.
  86. 제79항, 제81항, 제83항, 및 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스인, 바이러스.
  87. 제80항, 제82항, 제83항 및 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스는 이중-가닥 DNA(dsDNA) 바이러스인, 바이러스.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 dsDNA 바이러스는 단순 포진 바이러스(HSV), 아데노바이러스 또는 폭스바이러스과 계열의 바이러스이고, 선택적으로 여기서 상기 폭스바이러스과 계열의 바이러스는 전염성 연속종 바이러스(molluscum contagiosum virus), 점액종 바이러스(myxoma virus), 우두 바이러스(vaccina virus), 원숭이폭스 바이러스(monkeypox virus), 또는 야타폭스 바이러스(yatapoxvirus)인, 바이러스.
  89. 제79항, 제81항, 제83항, 및 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스는 RNA 바이러스인, 바이러스.
  90. 제80항, 제82항, 제83항 및 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스는 RNA 바이러스인, 바이러스.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, 상기 RNA 바이러스는 파라믹소바이러스 또는 랍도바이러스인, 바이러스.
  92. 제79항, 제81항, 제83항, 제84항, 제86항, 제88항, 제89항, 및 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스 ssRNA 바이러스인, 바이러스.
  93. 제80항, 제82항, 제83항, 제85항, 제87항, 제88항, 및 제90항 및 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 바이러스는 양성-센스 단일-가닥 RNA(ssRNA) 바이러스, 음성-센스 ssRNA 바이러스, 또는 앰비-센스 ssRNA 바이러스인, 바이러스.
  94. 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 음성-센스 ssRNA 바이러스이고, 상기 음성-센스 ssRNA 바이러스는 랍도바이러스과(Rhabdoviridae) 계열, 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 계열, 또는 오르토믹소바이러스과(Orthomyxoviridae) 계열의 바이러스이고, 선택적으로:
    여기서 상기 랍도바이러스과 계열의 바이러스는 소포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 마라바 바이러스이고;
    여기서 상기 파라믹소바이러스과 계열의 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스, 센다이 바이러스, 또는 홍역 바이러스이고; 또는
    여기서 상기 오르토믹소바이러스과 계열의 바이러스는 인플루엔자 바이러스인, 바이러스.
  95. 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-센스 ssRNA 바이러스이고, 여기서 상기 양성-센스 ssRNA 바이러스는 엔테로바이러스이고, 선택적으로 여기서 상기 엔테로바이러스는 폴리오바이러스, 세네카 밸리 바이러스(Seneca Valley virus, SVV), 콕사키바이러스, 또는 에코바이러스이고, 선택적으로 여기서 상기 콕사키바이러스는 콕사키바이러스 A(CVA) 또는 콕사키바이러스 B(CVB3)이고, 선택적으로 여기서 상기 콕사키바이러스는 CVA9, CVA21 또는 CVB3인, 바이러스.
  96. 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-센스 ssRNA 바이러스이고, 상기 양성-센스 ssRNA 바이러스는 뇌심근염 바이러스(Encephalomyocarditis virus, EMCV) 또는 멘고바이러스인, 바이러스.
  97. 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 바이러스는 양성-센스 ssRNA 바이러스이고, 상기 양성-센스 ssRNA 바이러스는 토가바이러스과 계열의 바이러스이고, 선택적으로, 상기 토가바이러스과 계열의 바이러스는 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스이고, 선택적으로 여기서 상기 신세계 알파바이러스 또는 구세계 알파바이러스는 VEEV, WEEV, EEV, 신비스(Sindbis) 바이러스, 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki Forest virus), 로스 리버 바이러스(Ross River virus), 또는 마야로 바이러스(Mayaro virus)인, 바이러스.
  98. 제79항, 제81항, 제83항, 제84항, 제86항, 제88항, 제89항, 제91항 및 제92항, 및 제94항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및/또는 상기 이차 종양용해 바이러스는 키메라 바이러스인, 바이러스.
  99. 제80항, 제82항, 제83항, 제85항, 제87항, 제88항, 제90항 및 제91항, 및 제93항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스 및/또는 상기 이차 바이러스는 키메라 바이러스인, 바이러스.
  100. 제79항, 제81항, 제83항, 제84항, 제86항, 제88항, 제89항, 제91항 및 제92항, 및 제94항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및/또는 상기 이차 종양용해 바이러스는 위형화된 바이러스인, 바이러스.
  101. 제80항, 제82항, 제83항, 제85항, 제87항, 제88항, 제90항 및 제91항, 제93항 내지 제97항, 및 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스 및/또는 상기 이차 바이러스는 위형화된 바이러스인, 바이러스.
  102. 제79항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 조절가능 프로모터는 스테로이드-유도성 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, MX-1 프로모터, GENESWITCHTM 하이브리드 프로모터, 큐메이트-반응성 프로모터, 및 테트라사이클린-유도성 프로모터로부터 선택되는, 바이러스.
  103. 제79항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 제1 펩티드 및 상기 제2 조절가능 프로모터에 결합할 수 있는 제2 펩티드를 암호화하는 제3 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 바이러스.
  104. 제103항에 있어서, 상기 제3 폴리뉴클레오티드는 구성적 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 바이러스.
  105. 제104항에 있어서, 상기 구성적 프로모터는 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 시미안 바이러스 40(SV40) 프로모터, Moloney 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터, 루스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 신장 인자 1-알파(EF1a) 프로모터, 조기 성장 반응 1(EGR1) 프로모터, 페리틴 H(FerH) 프로모터, 페리틴 L(FerL) 프로모터, 글리세르알데히드 3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 프로모터, 진핵 번역 개시 인자 4A1(EIF4A1) 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터(UBC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제-1(PGK) 프로모터, 및 거대세포바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터로부터 선택되는, 바이러스.
  106. 제103항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-유도성 프로모터이고, 상기 제1 펩티드는 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(rtTA) 펩티드인, 바이러스.
  107. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-억제성 프로모터이고, 상기 제2 펩티드는 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA) 펩티드인, 바이러스.
  108. 제103항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-억제성 프로모터이고, 상기 제1 펩티드는 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(tTA) 펩티드인, 바이러스.
  109. 제103항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 조절가능 프로모터는 테트라사이클린(Tet)-유도성 프로모터이고, 상기 제2 펩티드는 역 테트라사이클린-제어된 전사활성화제(rtTA) 펩티드인, 바이러스.
  110. 제79항, 제81항, 제83항, 제84항, 제86항, 제88항, 제89항, 제91항 및 제92항, 제94항 내지 제98항, 제100항, 및 제102항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 RNAi 분자는 상기 이차 종양용해 바이러스의 게놈에서 표적 서열에 결합하고 상기 이차 종양용해 바이러스의 복제를 억제하는, 바이러스.
  111. 제80항, 제82항, 제83항, 제85항, 제87항, 제88항, 제90항 및 제91항, 제93항 내지 제97항, 제99항, 및 제101항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 RNAi 분자는 상기 이차 바이러스의 게놈에서 표적 서열에 결합하고 상기 이차 바이러스의 복제를 억제하는, 바이러스.
  112. 제110항 또는 제111항에 있어서, 상기 RNAi 분자는 siRNA, miRNA, shRNA, 또는 AmiRNA인, 바이러스.
  113. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 제18항 및 제19항, 제21항 내지 제34항, 제36항, 제38항 및 제39호, 제42항 내지 제53항, 제55항, 제57항 내지 제77항, 제79항, 제81항, 제83항, 제84항, 제86항, 제88항, 제89항, 제91항 및 제92항, 제94항 내지 제98항, 제100항, 제102항 내지 제109항, 제110항, 및 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제1 3' 리보자임-암호화 서열 및 제2 5' 리보자임 암호화 서열을 포함하는, 바이러스.
  114. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 제17항 및 제18항, 제20항 내지 제33항, 제35항, 제37항, 제40항 내지 제52항, 제54항, 제56항 내지 제76항, 제78항, 제80항, 제82항, 제83항, 제85항, 제87항, 제88항, 제90항 및 제91항, 제93항 내지 제97항, 제99항, 제101항 내지 제109항, 및 제111항 및 제112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 제1 3' 리보자임-암호화 서열 및 제2 5' 리보자임 암호화 서열을 포함하는, 바이러스.
  115. 제113항 또는 제114항에 있어서, 상기 제1 및 제2 리보자임-암호화 서열은 해머헤드 리보자임 또는 간염 델타 바이러스 리보자임을 암호화하는, 바이러스.
  116. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 제18항 및 제19항, 제21항 내지 제34항, 제36항, 제38항 및 제39호, 제42항 내지 제53항, 제55항, 제57항 내지 제77항, 제79항, 제81항, 제83항, 제84항, 제86항, 제88항, 제89항, 제91항 및 제92항, 제94항 내지 제98항, 제100항, 제102항 내지 제109항, 제110항, 제112항 및 제113항, 및 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스의 게놈은 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
  117. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 제17항 및 제18항, 제20항 내지 제33항, 제35항, 제37항, 제40항 내지 제52항, 제54항, 제56항 내지 제76항, 제78항, 제80항, 제82항, 제83항, 제85항, 제87항, 제88항, 제90항 및 제91항, 제93항 내지 제97항, 제99항, 제101항 내지 제109항, 제111항 및 제112항, 제114항, 및 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스의 게놈은 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
  118. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 제18항 및 제19항, 제21항 내지 제34항, 제36항, 제38항 및 제39호, 제42항 내지 제53항, 제55항, 제57항 내지 제77항, 제79항, 제81항, 제83항, 제84항, 제86항, 제88항, 제89항, 제91항 및 제92항, 제94항 내지 제98항, 제100항, 제102항 내지 제109항, 제110항, 제112항 및 제113항, 및 제115항 및 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스의 게놈은 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
  119. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 제17항 및 제18항, 제20항 내지 제33항, 제35항, 제37항, 제40항 내지 제52항, 제54항, 제56항 내지 제76항, 제78항, 제80항, 제82항, 제83항, 제85항, 제87항, 제88항, 제90항 및 제91항, 제93항 내지 제97항, 제99항, 제101항 내지 제109항, 제111항 및 제112항, 제114항 및 제115항, 및 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 바이러스의 게놈은 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
  120. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 제18항 및 제19항, 제21항 내지 제34항, 제36항, 제38항 및 제39호, 제42항 내지 제53항, 제55항, 제57항 내지 제77항, 제79항, 제81항, 제83항, 제84항, 제86항, 제88항, 제89항, 제91항 및 제92항, 제94항 내지 제98항, 제100항, 제102항 내지 제109항, 제110항, 제112항 및 제113항, 제115항 및 제116항, 및 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 종양용해 바이러스 및 상기 이차 종양용해 바이러스는 각각 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
  121. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 제17항 및 제18항, 제20항 내지 제33항, 제35항, 제37항, 제40항 내지 제52항, 제54항, 제56항 내지 제76항, 제78항, 제80항, 제82항, 제83항, 제85항, 제87항, 제88항, 제90항 및 제91항, 제93항 내지 제97항, 제99항, 제101항 내지 제109항, 제111항 및 제112항, 제114항 및 제115항, 제117항, 및 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 일차 바이러스 및 상기 이차 바이러스는 각각 복제에 필요한 하나 이상의 바이러스 유전자에 삽입되거나 바이러스 게놈의 3' 또는 5' UTR에 삽입되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함하는 miRNA 표적 서열(miR-TS) 카세트를 포함하는, 바이러스.
  122. 제116항, 제118항, 및 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 상기 하나 이상의 miRNA의 발현은 상기 일차 및/또는 이차 종양용해 바이러스의 복제를 억제하는, 바이러스.
  123. 제117항, 제119항, 및 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에서 상기 하나 이상의 miRNA의 발현은 상기 일차 및/또는 이차 바이러스의 복제를 억제하는, 바이러스.
  124. 제1항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 외인성 페이로드 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 더 포함하는, 바이러스.
  125. 제124항에 있어서, 상기 외인성 페이로드 단백질은 형광 단백질, 효소, 사이토카인, 케모카인, 또는 항원 결합 분자인, 바이러스.
  126. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 제9항, 제11항, 제13항 내지 제16항, 제18항 및 제19항, 제21항 내지 제34항, 제36항, 제38항 및 제39호, 제42항 내지 제53항, 제55항, 제57항 내지 제77항, 제79항, 제81항, 제83항, 제84항, 제86항, 제88항, 제89항, 제91항 및 제92항, 제94항 내지 제98항, 제100항, 제102항 내지 제109항, 제110항, 제112항 및 제113항, 제115항 및 제116항, 제118항, 제120항, 제122항, 및 제124항 및 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스의 발현은 외인성 제제에 의해 조절되는, 바이러스.
  127. 제2항, 제4항, 제6항, 제8항, 제10항, 제12항 내지 제15항, 제17항 및 제18항, 제20항 내지 제33항, 제35항, 제37항, 제40항 내지 제52항, 제54항, 제56항 내지 제76항, 제78항, 제80항, 제82항, 제83항, 제85항, 제87항, 제88항, 제90항 및 제91항, 제93항 내지 제97항, 제99항, 제101항 내지 제109항, 제111항 및 제112항, 제114항 및 제115항, 제117항, 제119항, 제121항, 및 제123항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 바이러스의 발현은 외인성 제제에 의해 조절되는, 바이러스.
  128. 제126항 또는 제127항에 있어서, 상기 외인성 제제는 펩티드, 호르몬, 또는 소분자인, 바이러스.
  129. 제1항 내지 제128항 중 어느 한 항의 바이러스를 포함하는 조성물.
  130. 제1항 내지 제128항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 제129항의 조성물을 종양 세포의 집단에 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 집단을 사멸시키는 방법.
  131. 제130항에 있어서, 상기 종양 세포의 제1 하위 집단은 상기 일차 종양용해 바이러스에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
  132. 제130항 또는 제131항에 있어서, 상기 종양 세포의 제2 하위 집단은 상기 이차 종양용해 바이러스에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
  133. 제130항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포의 하위 집단은 상기 일차 종양용해 바이러스 및 상기 이차 종양용해 바이러스 모두에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
  134. 제130항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 상기 일차 및 이차 종양용해 바이러스에 의해 사멸되는, 방법.
  135. 제130항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 이차 종양용해 바이러스의 생산을 조절하는, 방법.
  136. 제135항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 종양용해 바이러스와 동시에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 종양용해 바이러스의 생산을 억제하는, 방법.
  137. 제135항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 종양용해 바이러스 후에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 종양용해 바이러스의 생산을 유도하는, 방법.
  138. 제137항에 있어서, 상기 외인성 제제(들)는 상기 일차 종양용해 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여되는, 방법.
  139. 제135항 내지 제138항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 종양용해 바이러스는 검출가능하지 않은, 방법.
  140. 제130항에 있어서, 상기 종양 세포의 제1 하위 집단은 상기 일차 바이러스에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
  141. 제130항 또는 제140항에 있어서, 상기 종양 세포의 제2 하위 집단은 상기 이차 바이러스에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
  142. 제130항, 제140항, 및 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포의 하위 집단은 상기 일차 바이러스 및 상기 이차 바이러스 모두에 의해 감염되고 사멸되는, 방법.
  143. 제130항 및 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 상기 이차 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 상기 일차 및 이차 바이러스에 의해 사멸되는, 방법.
  144. 제130항 및 제140항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 이차 바이러스의 생산을 조절하는, 방법.
  145. 제144항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 일차 바이러스와 동시에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 이차 바이러스의 생산을 억제하는, 방법.
  146. 제145항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 일차 바이러스 후에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 이차 바이러스의 생산을 유도하는, 방법.
  147. 제146항에 있어서, 상기 외인성 제제(들)는 일차 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여되는, 방법.
  148. 제144항 내지 제147항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 바이러스는 검출가능하지 않은, 방법.
  149. 제1항 내지 제128항 중 어느 한 항의 바이러스 또는 제129항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 종양을 치료하는 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 상기 일차 및 이차 종양용해 바이러스에 의해 사멸되는, 방법.
  151. 제149항 또는 제150항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 더 많은 종양 크기 감소를 초래하는, 방법.
  152. 제149항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 하나 이상의 종양 항원에 대한 보다 강한 면역 반응을 유도하는, 방법.
  153. 제149항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 일차 종양용해 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시키는, 방법.
  154. 제149항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여에 비해 대상체에서 상기 이차 종양용해 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시키는, 방법.
  155. 제149항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 종양 세포를 우선적으로/더 특이적으로 사멸시키는 것을 유발하는, 방법.
  156. 제149항 내지 제155항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 일차 종양용해 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래하는, 방법.
  157. 제149항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여에 비해 대상체에서 상기 이차 종양용해 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래하는, 방법.
  158. 제149항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 연장된 종양 억제 기간을 초래하는, 방법.
  159. 제149항 내지 제158항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 종양용해 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 종양용해 바이러스 투여 또는 상기 이차 종양용해 바이러스 단독 투여와 비교하여, 더 많은 세포 유형의 바이러스 감염을 가능하게 하는, 방법.
  160. 제149항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 이차 종양용해 바이러스의 생산을 조절하는, 방법.
  161. 제160항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 종양용해 바이러스와 동시에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 종양용해 바이러스의 생산을 억제하는, 방법.
  162. 제160항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 종양용해 바이러스 후에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 종양용해 바이러스의 생산을 유도하는, 방법.
  163. 제162항에 있어서, 상기 외인성 제제(들)는 상기 일차 종양용해 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여되는, 방법.
  164. 제160항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 종양용해 바이러스가 검출가능하지 않은, 방법.
  165. 제149항에 있어서, 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 상기 이차 바이러스 단독에 의해 사멸된 종양 세포의 수와 비교하여, 집단에서 더 많은 수의 종양 세포가 상기 일차 및 이차 바이러스에 의해 사멸되는, 방법.
  166. 제149항 또는 제165항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 상기 이차 바이러스 단독의 투여와 비교하여 대상체에서 더 많은 종양 크기 감소를 초래하는, 방법.
  167. 제149항, 제165항 및 제166항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여 또는 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 하나 이상의 종양 항원에 대한 보다 강한 면역 반응을 유도하는, 방법.
  168. 제149항 및 제165항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 일차 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시키는, 방법.
  169. 제149항 및 제165항 내지 제168항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 이차 바이러스에 대한 면역 반응을 감소시키는, 방법.
  170. 제149항 및 제165항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여 또는 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 종양 세포의 우선적/더 특이적인 사멸을 초래하는, 방법.
  171. 제149항 및 제165항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 일차 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래하는, 방법.
  172. 제149항 및 제165항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 상기 이차 바이러스의 보다 지속적인 생산을 초래하는, 방법.
  173. 제149항 및 제165항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 대상체에서 연장된 종양 억제 기간을 초래하는, 방법.
  174. 제149항 및 제165항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이차 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 없는 참조 일차 바이러스 또는 상기 이차 바이러스 단독 투여와 비교하여, 더 많은 세포 유형의 바이러스 감염을 가능하게 하는, 방법.
  175. 제149항 및 제165항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 세포의 집단에 하나 이상의 외인성 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 이차 바이러스의 생산을 조절하는, 방법.
  176. 제175항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 바이러스와 동시에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 바이러스의 생산을 억제하는, 방법.
  177. 제175항에 있어서, 상기 하나 이상의 외인성 제제는 상기 일차 바이러스 후에 투여되고, 상기 외인성 제제(들)의 존재는 상기 이차 바이러스의 생산을 유도하는, 방법.
  178. 제177항에 있어서, 상기 외인성 제제(들)는 상기 일차 바이러스의 투여 후 적어도 1일, 적어도 1주, 또는 적어도 1개월에 투여되는, 방법.
  179. 제175항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외인성 제제(들)의 투여 전에 이차 바이러스가 검출가능하지 않은, 방법.
  180. 제1항 내지 제128항의 바이러스를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  181. 제180항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  182. 제181항의 벡터를 포함하는 약제학적 조성물.
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