KR20210133993A - Rho-연관 상염색체-우성 망막색소변성증(adrp)을 치료하기 위한 crispr/rna-가이드 뉴클레아제-관련 방법 및 조성물 - Google Patents
Rho-연관 상염색체-우성 망막색소변성증(adrp)을 치료하기 위한 crispr/rna-가이드 뉴클레아제-관련 방법 및 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
RHO-연관 망막색소변성증, 예를 들어, 상염색체-우성 망막색소변성증(adRP)의 치료를 위한 CRISPR/RNA-가이드 뉴클레아제-관련 조성물 및 방법이 본 명세서에 개시된다.
Description
우선권 청구
본 출원은 2019년 2월 25일에 출원된 미국 가특허출원 제62/810,320호의 이익을 주장하며, 상기 출원의 주제는 본 명세서에 전체가 기재된 바와 같이 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
분야
본 개시내용은 표적 핵산 서열을 편집하기 위한 CRISPR/RNA-가이드 뉴클레아제-관련 방법 및 구성성분, 및 상염색체 우성 망막색소변성증(ADRP)과 연관된 이의 용도에 관한 것이다.
광수용체 및 망막 색소 상피 세포에 영향을 미치는 유전성 망막 이영양증인 망막색소변성증(RP)은 점진적인 망막 악화 및 위축으로 인해 시력이 점차적으로 상실되고 결국 이환된 환자에서 실명으로 이어지는 것을 특징으로 한다. RP는 동형접합 돌연변이와 이종접합 돌연변이 둘 다에 의해 야기될 수 있으며, 다양한 형태, 예를 들어, 상염색체-우성 RP(adRP), 상염색체 열성 RP(arRP) 또는 X-연관 RP(X-linked RP: X-LRP)로 존재할 수 있다. RP에 대한 치료 옵션은 제한되어 있으며, 현재 이용 가능한 RP 진행을 중단시키거나 역전시킬 수 있는 승인된 치료는 없다.
본 명세서에 제공된 전략, 방법, 조성물, 및 치료 양식의 일부 양태는 상염색체-우성 망막색소변성증(adRP)을 앓고 있는 대상체의 이환된 세포 및 조직에 게놈 편집 시스템을 전달하는 신규하고 효과적인 수단을 제공함으로써 당업계에 충족되지 않은 주요 요구를 해결한다. 본 개시내용의 일부 양태는 adRP 관련 유전자 로돕신으로 표적화된 게놈 편집 시스템을 망막 세포에 도입하기 위한 전략, 방법, 및 조성물을 제공한다. 이러한 전략, 방법, 및 조성물은, 일부 구현예에서, 로돕신 유전자의 adRP 관련 변이체를 편집하는 데, 예를 들어, 이러한 로돕신 변이체의 기능 상실을 초래하는 유전자 편집 사건을 유도하는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 이러한 전략, 방법, 및 조성물은 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, 상염색체-우성 형태의 RP를 갖는 대상체에 투여하기 위한 치료 양식으로서 유용하다. 따라서, 본 명세서에 제공된 전략, 방법, 조성물, 및 치료 양식은 RP의 치료, 예를 들어, adRP의 치료를 위한 임상적 개입의 개발로 나아가는 중요한 단계를 나타낸다.
RHO 유전자는 로돕신 단백질을 암호화하고, 망막 광수용체(PR) 간상 세포에서 발현된다. 로돕신은 간상 세포의 외부 세그먼트에서 발현되는 G 단백질-결합 수용체이며, 광변조 캐스케이드의 중요한 구성요소이다. RHO 유전자의 결함은 전형적으로 야생형 로돕신의 생산 감소 및/또는 돌연변이 로돕신의 발현을 특징으로 하고, 이는 광수용체 기능의 방해 및 상응하는 시력 상실로 이어진다. RHO의 돌연변이는 전형적으로 먼저 PR 간상 세포의 변성, 이어서 질환이 진행됨에 따라 PR 추상 세포의 변성을 초래한다. RHO 돌연변이가 있는 대상체는 야간 시력의 점진적 상실뿐만 아니라, 주변 시야의 상실에 이어 중심 시야의 상실을 경험한다. 예시적인 RHO 돌연변이는 표 A에 제공되어 있다.
본 개시내용의 일부 양태는 RHO 유전자 서열의 기능 상실을 초래하는 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자) 및 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA)에 의해 매개된 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실에 의해, 예를 들어, 세포에서 또는 adRP를 갖는 환자에서 RHO 유전자 서열을 변경하기 위한, 예를 들어, 야생형 및/또는 돌연변이체 RHO 유전자의 서열을 변경하기 위한 전략, 방법, 조성물, 및 치료 양식을 제공한다. 이러한 유형의 변경은 또한 RHO 유전자의 "넉아웃(knocking out)"으로도 지칭된다. 본 개시내용의 일부 양태는, 예를 들어, 기능성 로돕신 단백질(예를 들어, 야생형 로돕신 단백질)을 암호화하는 외인성 RHO 상보적 DNA(cDNA) 서열을 전달함으로써, 예를 들어, RHO의 RNA-가이드 뉴클레아제-매개 넉아웃을 거치는 세포에서 외인성 RHO를 발현하기 위한 전략, 방법, 조성물 및 치료 양식을 제공한다.
특정 구현예에서, RHO 유전자의 5' 영역(예를 들어, 5' 비번역 영역(UTR), 엑손 1, 엑손 2, 인트론 1, 엑손 1/인트론 1 경계 또는 엑손 2/인트론 1경계)은 유전자를 변경하도록 RNA-가이드 뉴클레아제에 의해 표적화된다. 특정 구현예에서, RHO 유전자의 임의의 영역(예를 들어, 프로모터 영역, 5' 비번역 영역, 3' 비번역 영역, 엑손, 인트론, 또는 엑손/인트론 경계)은 유전자를 변경하도록 RNA-가이드 뉴클레아제에 의해 표적화된다. 특정 구현예에서, RHO 유전자의 비-암호화 영역(예를 들어, 인핸서 영역, 프로모터 영역, 인트론, 5' UTR, 3'UTR, 폴리아데닐화 신호)은 유전자를 변경하도록 표적화된다. 특정 구현예에서, RHO 유전자의 암호화 영역(예를 들어, 초기 암호화 영역, 엑손)은 유전자를 변경하도록 표적화된다. 특정 구현예에서, RHO 유전자의 엑손/인트론 경계에 걸쳐 이어지는 영역(예를 들어, 예를 들어, 엑손 1/인트론 1, 엑손 2/인트론 1)은 유전자를 변경하도록 표적화된다. 특정 구현예에서, 변경 시 정지 코돈을 초래하고 RHO 유전자를 넉아웃시키는 RHO 유전자의 영역이 표적화된다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 RHO 유전자의 변경은 돌연변이-독립적 방식으로 발생하는데, 이는 표 A에 기재된 각 RHO 돌연변이에 대한 치료 전략을 개발할 필요를 없애는 이점을 제공한다.
구현예에서, 치료 후, adRP와 관련된 하나 이상의 증상(예를 들어, 야맹증, 비정상적인 망막전도, 백내장, 시야 결함, 간상체-추상체 이영양증, 또는 adRP와 관련된 것으로 알려진 기타 증상(들))이 개선되는데, 예를 들어, adRP의 진행이 지연, 억제, 예방, 또는 중단되고/되거나, PR 세포 변성이 지연, 억제, 예방, 및/또는 중단되고/되거나, 시력 상실이 개선되고, 예를 들어, 시력 상실의 진행이 지연, 억제, 예방, 또는 중단된다. 구현예에서, 치료 후, adRP의 진행이 지연되고, 예를 들어, PR 세포 변성이 지연된다. 구현예에서, 치료 후, adRP의 진행이 역전되고, 예를 들어, 기존 PR 간상 세포 및 추상 세포의 기능 및/또는 새로운 PR 간상 세포 및 추상 세포의 생성이 증가/향상되고/되거나 시력 상실, 예를 들어, 시력 상실의 진행이 지연, 억제, 예방, 또는 중단된다.
구현예에서, 본 개시내용의 CRISPR/RNA-가이드 뉴클레아제-관련 방법 및 구성성분 및 조성물은 RHO 표적 위치에서 서열을 변경시킴으로써, 예를 들어, 이환된 RHO 유전자 또는 대립유전자의 기능 상실을 초래하는 인델, 예를 들어, 절두, 논센스 돌연변이, 또는 암호화된 RHO 유전자 산물, 예를 들어, 암호화된 RHO mRNA 또는 RHO 단백질의 다른 유형의 기능 상실을 초래하는 뉴클레오타이드 치환; 절두, 논센스 돌연변이, 또는 암호화된 RHO 유전자 산물, 예를 들어, 암호화된 RHO mRNA 또는 RHO 단백질, 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드, 이중 뉴클레오타이드의 다른 유형의 기능 상실을 초래하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 또는 다른 프레임-시프팅 결실, 또는 미성숙 정지 코돈을 초래하는 결실; 또는 절두, 논센스 돌연변이, 또는 암호화된 RHO 유전자 산물, 예를 들어, 암호화된 RHO mRNA 또는 RHO 단백질, 예를 들어, 단일 뉴클레오타이드, 이중 뉴클레오타이드의 다른 유형의 기능 상실을 초래하는 삽입, 또는 다른 프레임-시프팅 삽입, 또는 미성숙 정지 코돈을 초래하는 삽입을 생성시킴으로써 adRP와 관련된 돌연변이체 RHO 유전자의 변경(예를 들어, 넉아웃)을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 CRISPR/RNA-가이드 뉴클레아제-관련 방법 및 구성성분 및 조성물은 RHO 표적 위치에서 서열을 변경함으로써, 예를 들어, 암호화된 유전자 산물, 예를 들어, 암호화된 RHO 전사체의 논센스-매개 붕괴를 초래하는 인델을 형성함으로써, adRP와 관련된 돌연변이체 RHO 유전자의 변경(예를 들어, 넉아웃)을 제공한다.
일 양태에서, RHO 유전자로부터의 표적 도메인과 상보적인 표적화 도메인을 포함하는, gRNA 분자, 예를 들어, 단리된 또는 비천연 gRNA 분자가 본 명세서에 개시된다.
구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 RHO 유전자 활성의 파괴(예를 들어, 넉아웃), 예를 들어, RHO 유전자의 기능 상실, 예를 들어, RHO 유전자 산물(예를 들어, RHO 전사체 또는 RHO 단백질)의 감소되거나 제거된 발현, 또는 기능장애 또는 비-기능 RHO 유전자 산물(예를 들어, 절두 RHO 단백질 또는 전사체)의 발현을 특징으로 하는 RHO 유전자의 기능 상실을 초래하는 RHO 유전자의 변경이 가능하게 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치에 충분히 가까운 절단 사건, 예를 들어, 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된다. 구현예에서, 표적화 도메인은 절단 사건, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손이 RHO 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 위치하도록 구성된다. 파손, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치의 상류 또는 하류에 위치될 수 있다.
구현예에서, 제2 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA 분자는 단독으로 또는 상기 제1 gRNA 분자에 의해 위치된 파손과 조합하여 RHO 유전자에서 변경이 가능하게 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치에 충분히 가깝게 절단 사건, 예를 들어, 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된다. 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인은 절단 사건, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손이 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에서 gRNA 분자 각각에 대하여 독립적으로 위치하도록 구성된다. 구현예에서, 파손, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치의 뉴클레오타이드의 양 측면 상에 위치한다. 구현예에서, 파손, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은, 예를 들어, RHO 유전자에서 RHO 표적 위치의 뉴클레오타이드 상류 또는 하류에서 한 측면에 위치한다.
구현예에서, 단일 가닥 파손은 하기 논의된 바와 같이 제2 gRNA 분자에 의해 위치된 추가의 단일 가닥 파손을 수반한다. 예를 들어, 표적화 도메인은 절단 사건, 예를 들어, 두 개의 단일 가닥 파손이 RHO 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 위치하도록 구성된다. 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA 분자는 Cas9 틈내기효소를 가이딩할 때 단일 가닥 파손이 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치의 변경을 초래하기 위해 서로 충분히 가깝게, 제2 gRNA에 의해 위치된 추가의 단일 가닥 파손을 수반하도록 구성된다. 구현예에서, 제1 및 제2 gRNA 분자는 상기 제2 gRNA에 의해 위치된 단일 가닥 파손이, 예를 들어, Cas9가 틈내기 효소인 경우 상기 제1 gRNA 분자에 의해 위치된 파손의 10 개, 20 개, 30 개, 40 개, 또는 50 개의 뉴클레오타이드 내에 있도록 구성된다. 구현예에서, 2 개의 gRNA 분자는, 예를 들어, 본질적으로 이중 가닥 파손을 모방하는 상이한 가닥 상에서 동일한 위치에서 또는 서로의 소수의 뉴클레오타이드 내에서 절단을 위치시키도록 구성된다.
구현예에서, 이중 가닥 파손은 하기에서 논의되는 바와 같이 제2 gRNA 분자에 의해 위치된 추가의 이중 가닥 파손을 수반할 수 있다. 예를 들어, 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손이 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치의 상류에 위치하도록, 예를 들어, 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 위치하도록 구성되고; 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손이 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치의 하류에 위치하도록, 예를 들어, 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 위치하도록 구성된다.
구현예에서, 이중 가닥 파손은 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자에 의해 위치된 2 개의 추가 단일 가닥 파손을 수반할 수 있다. 예를 들어, 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인은 이중 가닥 파손이 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치의 상류에 위치하도록, 예를 들어, 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 위치하도록 구성되고; 제2 및 제3 gRNA 분자의 표적화 도메인은 2 개의 단일 가닥 파손이 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치의 하류에 위치하도록, 예를 들어, 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 위치하도록 구성된다. 구현예에서, 제1, 제2 및 제3 gRNA 분자의 표적화 도메인은 절단 사건, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손이 각각의 gRNA 분자와 관계없이 위치하도록 구성된다.
구현예에서, 제1 및 제2 단일 가닥 파손은 제3 gRNA 분자 및 제4 gRNA 분자에 의해 위치된 2 개의 추가 단일 가닥 파손을 수반할 수 있다. 예를 들어, 제1 및 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인은 2 개의 단일 가닥 파손이 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치의 상류에 위치하도록, 예를 들어, 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 위치하도록 구성되고; 제3 및 제4 gRNA 분자의 표적화 도메인은 2 개의 단일 가닥 파손이 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치의 하류에 위치하도록, 예를 들어, 표적 위치의 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 10 개, 15 개, 20 개, 25 개, 30 개, 35 개, 40 개, 45 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드 내에 위치하도록 구성된다.
본 명세서에서는 다중 gRNA가 (1) 매우 근접한 2 개의 단일 가닥 파손, (2) RHO 표적 위치에 측접하는 1 개의 이중 가닥 파손 및 2 개의 쌍을 이룬 틈(예를 들어, DNA 조각을 제거하기 위해) 또는 (3) RHO 표적 위치의 각 측면에 2 개씩 4 개의 단일 가닥 파손을 생성시키기 위해 사용되는 경우, 이들은 동일한 RHO 표적 위치를 표적화하는 것으로 상정된다. 추가로, 다중 gRNA는 동일한 유전자에서 하나보다 많은 RHO 표적 위치를 표적화하는 데 사용될 수 있을 것으로 상정된다.
일부 구현예에서, 제1 gRNA 분자의 표적화 도메인 및 제2 gRNA 분자의 표적화 도메인은 표적 핵산 분자의 반대 가닥에 상보적이다. 일부 구현예에서, gRNA 분자 및 제2 gRNA 분자는 PAM이 바깥쪽으로 배향되도록 구성된다.
구현예에서, gRNA 분자의 표적화 도메인은 표적 도메인에서 원치 않는 표적 염색체 구성요소, 예컨대, 반복 구성요소, 예를 들어, Alu 반복부를 피하도록 구성된다. gRNA 분자는 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA 분자일 수 있다.
구현예에서, RHO 표적 위치는 RHO 유전자의 엑손 1 또는 엑손 2에 위치한 표적 위치이고, gRNA 분자의 표적화 도메인은 표 1의 표적화 도메인 서열과 동일하거나, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표 1에서 선택된다. 구현예에서, RHO 표적 위치는 RHO 유전자의 5' UTR 영역에 위치한 표적 위치이고, gRNA 분자의 표적화 도메인은 표 2의 어느 하나의 표적화 도메인 서열과 동일하거나, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표 2에서 선택된다. 구현예에서, 표적 위치는 RHO 유전자의 인트론 1에 위치한 표적 위치이고, gRNA 분자의 표적화 도메인은 표 3의 어느 하나의 표적화 도메인 서열과 동일하거나, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표 3에서 선택된다. 구현예에서, 표적 위치는 RHO 유전자에 위치한 표적 위치이고, gRNA 분자의 표적화 도메인은 표 18의 어느 하나의 표적화 도메인 서열과 동일하거나, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적화 도메인은 표 18에서 선택된다. 구현예에서, RHO 유전자와 상보적인 gRNA, 예를 들어, 표적화 도메인을 포함하는 gRNA는 모듈 gRNA이다. 다른 구현예에서, gRNA는 단분자 또는 키메라 gRNA이다.
구현예에서, RHO 유전자와 상보적인 표적화 도메인은 17 개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 구현예에서, 표적화 도메인은 17 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 18 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 추가의 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 19 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 추가의 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 20 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 추가의 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 21 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 추가의 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 22 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 추가의 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 23 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 추가의 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 24 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 추가의 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 25 개의 뉴클레오타이드 길이이다. 추가의 다른 구현예에서, 표적화 도메인은 26 개의 뉴클레오타이드 길이이다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA는 5'로부터 3'으로 표적화 도메인("코어 도메인", 및 선택적으로 "2차 도메인" 포함); 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 단일 도메인으로서 기능한다.
구현예에서, gRNA는 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, gRNA는 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 30 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, gRNA는 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 30 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함한다.
또 다른 구현예에서, gRNA는 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 40 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함한다.
절단 사건, 예를 들어, 이중 가닥 또는 단일 가닥 파손은 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자)에 의해 생성된다. Cas9 분자는 효소적으로 활성인 Cas9(eaCas9) 분자, 예를 들어, 표적 핵산에서 이중 가닥 파손을 형성하는 eaCas9 분자 또는 표적 핵산에서 단일 가닥 파손을 형성하는 eaCas9 분자(예를 들어, 틈내기효소 분자)일 수 있다. 특정 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cpf1 분자일 수 있다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, eaCas9 분자 또는 Cpf1 분자)는 이중 가닥 파손을 촉매한다.
일부 구현예에서, eaCas9 분자는 HNH-유사 도메인 절단 활성을 포함하지만, N-말단의 RuvC-유사 도메인 절단 활성을 갖지 않거나, 또는 유의하게 갖지 않는다. 이러한 경우에, eaCas9 분자는 HNH-유사 도메인 틈내기 효소이고, 예를 들어 eaCas9 분자는 D10에서 돌연변이, 예를 들어, D10A를 포함한다. 다른 구현예에서, eaCas9 분자는 N-말단의 RuvC-유사 도메인 절단 활성을 포함하지만, HNH-유사 도메인 절단 활성을 갖지 않거나, 또는 유의하게 갖지 않는다. 이러한 경우에, eaCas9 분자는 N-말단의 RuvC-유사 도메인 틈내기효소이고, 예를 들어, eaCas9 분자는 H840에서 돌연변이, 예를 들어, H840A를 포함한다.
특정 구현예에서, Cas9 분자는 Cas9 단백질의 일시적 발현을 위해 설계된 자기-불활성화 Cas9 분자일 수 있다.
구현예에서, 단일 가닥 파손은 상기 gRNA의 표적화 도메인이 상보적인 표적 핵산의 가닥에서 형성된다. 또 다른 구현예에서, 단일 가닥 파손은 상기 gRNA의 표적화 도메인이 상보적인 가닥이 아닌 표적 핵산의 가닥에서 형성된다.
또 다른 양태에서, (a) 본 명세서에 개시된 바와 같은 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산, 예를 들어, 단리된 또는 비천연 핵산, 예를 들어, DNA가 본 명세서에 개시된다.
구현예에서, 핵산은 RHO 유전자에서 변경이 가능하게 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치에 충분히 가깝게 절단 사건, 예를 들어, 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 구현예에서, 핵산은 표 1 내지 표 3 및 표 18에 기재된 것들로부터 선택된 표적화 도메인 서열과 동일하거나, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 구현예에서, 핵산은 표 1 내지 표 3 및 표 18에 기재된 것들로부터 선택된 표적화 도메인 서열을 포함하는 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 모듈 gRNA를 암호화하고, 예를 들어, 하나 이상의 핵산은 모듈 gRNA를 암호화한다. 다른 구현예에서, 핵산은 키메라 gRNA를 암호화한다. 핵산은 17 개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 포함하는 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화할 수 있다. 일 구현예에서, 핵산은 17 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 다른 구현예에서, 핵산은 18 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 추가의 다른 구현예에서, 핵산은 19 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화한다. 추가의 다른 구현예에서, 핵산은 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 5'로부터 3'으로 표적화 도메인("코어 도메인", 및 선택적으로 "2차 도메인" 포함); 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는 gRNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 단일 도메인으로서 기능한다.
구현예에서, 핵산은 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 30 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 30 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 40 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 (a) 본 명세서에 개시된 바와 같은 RHO 유전자에서 RHO 표적 도메인과 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자, 예를 들어, 제1 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함하고, 추가로 (b) RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자)를 암호화하는 서열을 포함한다.
Cas9 분자는 효소적으로 활성인 Cas9(eaCas9) 분자, 예를 들어, 표적 핵산에서 이중 가닥 파손을 형성하는 eaCas9 분자 또는 표적 핵산에서 단일 가닥 파손을 형성하는 eaCas9 분자(예를 들어, 틈내기효소 분자)일 수 있다.
본 명세서에 개시된 핵산은 (a) 본 명세서에 개시된 바와 같은 RHO 유전자에서 RHO 표적 도메인과 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 암호화하는 서열; (b) RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자)를 암호화하는 서열; (c) RHO cDNA 분자를 포함할 수 있고; 추가로 (d)(i) RHO 유전자의 제2 표적 도메인에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 본 명세서에 기재된 제2 gRNA 분자를 암호화하는 서열, 및 선택적으로 (ii) RHO 유전자의 제3 표적 도메인에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 본 명세서에 기재된 제3 gRNA 분자를 암호화하는 서열; 및 선택적으로, (iii) RHO 유전자의 제4 표적 도메인에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 본 명세서에 기재된 제4 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함한다.
구현예에서, RHO cDNA 분자는 이중 가닥 핵산이다. 일부 구현예에서, RHO cDNA 분자는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 로돕신 단백질을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자는 코돈 변형되지 않는다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자는 gRNA 분자와의 혼성화에 대한 내성을 제공하도록 코돈 변형된다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자는 암호화된 RHO 단백질(예를 들어, 서열번호 13 내지 18)의 개선된 발현을 제공하도록 코돈 변형된다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자는 RHO 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 인트론(예를 들어, 서열번호 4 내지 7)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자는 RHO 유전자의 엑손 1, 인트론 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자는 RHO 유전자의 엑손 1, 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3, 인트론 3, 엑손 4, 인트론 4, 및 엑손 5로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 이루어진 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 인트론은 인트론 1의 5' 말단, 인트론 1의 3' 말단, 또는 둘 다에서 하나 이상의 절두를 포함한다.
구현예에서, 핵산은 단독으로 또는 상기 제1 gRNA 분자에 의해 위치된 파손과 조합하여 RHO 유전자에서 변경이 가능하게 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치에 충분히 가깝게 절단 사건, 예를 들어, 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 단독으로 또는 제1 및/또는 제2 gRNA 분자에 의해 위치된 파손과 조합하여 RHO 유전자에서 변경이 가능하게 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치에 충분히 가깝게 절단 사건, 예를 들어, 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 제3 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 단독으로 또는 제1 gRNA 분자, 제2 gRNA 분자 및 제3 gRNA 분자에 의해 위치된 파손과 조합하여 변경이 가능하게 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치에 충분히 가깝게 절단 사건, 예를 들어, 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손을 제공하도록 구성된 표적화 도메인을 포함하는 제4 gRNA 분자를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 제2 gRNA 분자를 암호화한다. 제2 gRNA는 제1 gRNA 분자와 동일한 RHO 표적 위치를 표적화하도록 선택된다. 선택적으로, 핵산은 제3 gRNA를 암호화할 수 있고, 추가로 선택적으로, 핵산은 제4 gRNA 분자를 암호화할 수 있다. 제3 gRNA 분자 및 제4 gRNA 분자는 제1 및 제2 gRNA 분자와 동일한 RHO 표적 위치를 표적화하도록 선택된다.
구현예에서, 핵산은 표 1 내지 표 3 및 표 18에 기재된 것들로부터 선택된 표적화 도메인 서열과 동일하거나, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA 분자를 암호화한다. 구현예에서, 핵산은 표 1 내지 표 3 및 표 18에 기재된 것들로부터 선택된 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA 분자를 암호화한다. 구현예에서, 제3 또는 제4 gRNA 분자가 존재하는 경우, 제3 및 제4 gRNA 분자는 독립적으로 표 1 내지 표 3 및 표 18에 기재된 것들로부터 선택된 표적화 도메인 서열과 동일하거나, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 포함하는 표적화 도메인을 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 제3 또는 제4 gRNA 분자가 존재하는 경우, 제3 및 제4 gRNA 분자는 독립적으로 표 1 내지 표 3 및 표 18에 기재된 것들로부터 선택된 표적화 도메인을 포함할 수 있다.
구현예에서, 핵산은 모듈 gRNA인 제2 gRNA를 암호화하고, 예를 들어, 여기서 하나 이상의 핵산 분자는 모듈 gRNA를 암호화한다. 다른 구현예에서, 제2 gRNA를 암호화하는 핵산은 키메라 gRNA이다. 다른 구현예에서, 핵산이 제3 또는 제4 gRNA를 암호화하는 경우, 제3 및 제4 gRNA는 모듈 gRNA 또는 키메라 gRNA일 수 있다. 다중 gRNA가 사용되는 경우, 모듈 또는 키메라 gRNA의 임의의 조합이 사용될 수 있다.
핵산은 17 개 이상의 뉴클레오타이드 길이를 포함하는 표적화 도메인을 포함하는 제2, 제3, 및/또는 제4 gRNA를 암호화할 수 있다. 구현예에서, 핵산은 17 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 다른 구현예에서, 핵산은 18 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 추가의 다른 구현예에서, 핵산은 19 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다. 추가의 다른 구현예에서, 핵산은 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 제2 gRNA를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 5'로부터 3'으로 표적화 도메인; 제1 상보성 도메인; 연결 도메인; 제2 상보성 도메인; 근위 도메인; 및 꼬리 도메인을 포함하는 제2, 제3, 및/또는 제4 gRNA를 암호화한다. 일부 구현예에서, 근위 도메인 및 꼬리 도메인은 함께 단일 도메인으로서 기능한다.
구현예에서, 핵산은 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 제2, 제3, 및/또는 제4 gRNA를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 30 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 제2, 제3, 및/또는 제4 gRNA를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 30 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 제2, 제3, 및/또는 제4 gRNA를 암호화한다.
구현예에서, 핵산은 25 개 이하의 뉴클레오타이드 길이인 연결 도메인; 적어도 40 개의 뉴클레오타이드 길이인 함께 취해진 근위 및 꼬리 도메인; 및 17 개, 18 개, 19 개 또는 20 개의 뉴클레오타이드 길이인 표적화 도메인을 포함하는 제2, 제3, 및/또는 제4 gRNA를 암호화한다.
상술된 바와 같이, 핵산은 (a) RHO 유전자에서 표적 도메인과 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 암호화하는 서열, (b) RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자)를 암호화하는 서열, 및 (c) RHO cDNA 분자 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, (a), (b), 및 (c)는 동일한 핵산 분자, 예를 들어, 동일한 벡터, 예를 들어, 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어, 동일한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터에 존재한다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 임의의 기재된 조성물 및 방법에 사용될 수 있는 예시적인 AAV 벡터는 AAV5 벡터, 변형된 AAV5 벡터, AAV2 벡터, 변형된 AAV2 벡터, AAV3 벡터, 변형된 AAV3 벡터, AAV6 벡터, 변형된 AAV6 벡터, AAV8 벡터 및 AAV9 벡터를 포함한다.
다른 구현예에서, (a)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에 존재하고; (b) 및 (c)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, (a) 및 (b)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에 존재하고; (c)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, (a) 및 (c)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에 존재하고; (b)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, (a)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에 존재하고; (b)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재하고; (c)는 제3 핵산 분자, 예를 들어, 제3 벡터, 예를 들어, 제3 벡터, 예를 들어, 제3 AAV 벡터에 존재한다. 제1, 제2, 및 제3 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, 핵산은 (d)(i) 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 (a), (b), (c), 및 (d)(i)를 포함한다. (a), (b), (c), 및 (d)(i) 각각은 동일한 핵산 분자, 예를 들어, 동일한 벡터, 예를 들어, 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어, 동일한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터에 존재할 수 있다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다.
다른 구현예에서, (a) 및 (d)(i)는 상이한 벡터에 존재한다. 예를 들어, (a)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에 존재할 수 있고; (d)(i)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재할 수 있다. 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터이다.
다른 구현예에서, (b) 및 (d)(i)는 상이한 벡터에 존재한다. 예를 들어, (b)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에 존재할 수 있고; (d)(i)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재할 수 있다. 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터이다.
다른 구현예에서, (c) 및 (d)(i)는 상이한 벡터에 존재한다. 예를 들어, (c)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에 존재할 수 있고; (d)(i)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재할 수 있다. 구현예에서, 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터이다.
또 다른 구현예에서, (a) 및 (d)(i)는 동일한 핵산 분자, 예를 들어, 동일한 벡터, 예를 들어, 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터에 존재한다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 대안적인 구현예에서, (a) 및 (d)(i)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에서 암호화되고; (a) 및 (d)(i) 중 2 번째 및 3 번째는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에서 암호화된다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
또 다른 구현예에서, (b) 및 (d)(i)는 동일한 핵산 분자, 예를 들어, 동일한 벡터, 예를 들어, 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터에 존재한다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 대안적인 구현예에서, (b) 및 (d)(i)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에서 암호화되고; (b) 및 (d)(i) 중 2 번째 및 3 번째는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에서 암호화된다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
또 다른 구현예에서, (c) 및 (d)(i)는 동일한 핵산 분자, 예를 들어, 동일한 벡터, 예를 들어, 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터에 존재한다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 대안적인 구현예에서, (c) 및 (d)(i)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에서 암호화되고; (c) 및 (d)(i) 중 2 번째 및 3 번째는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에서 암호화된다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
또 다른 구현예에서, (a), (b), 및 (d)(i) 각각은 동일한 핵산 분자, 예를 들어, 동일한 벡터, 예를 들어, 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터에 존재한다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 대안적인 구현예에서, (a), (b), 및 (d)(i) 중 하나는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에서 암호화되고; (a), (b), 및 (d)(i) 중 2 번째 및 3 번째는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에서 암호화된다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
또 다른 구현예에서, (b), (c), 및 (d)(i) 각각은 동일한 핵산 분자, 예를 들어, 동일한 벡터, 예를 들어, 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터에 존재한다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 대안적인 구현예에서, (b), (c), 및 (d)(i) 중 하나는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에서 암호화되고; (b), (c), 및 (d)(i) 중 2 번째 및 3 번째는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에서 암호화된다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
또 다른 구현예에서, (a), (c), 및 (d)(i) 각각은 동일한 핵산 분자, 예를 들어, 동일한 벡터, 예를 들어, 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터에 존재한다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 대안적인 구현예에서, (a), (c), 및 (d)(i) 중 하나는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에서 암호화되고; (a), (c), 및 (d)(i) 중 2 번째 및 3 번째는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에서 암호화된다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
구현예에서, (a)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 제1 AAV 벡터에 존재하고; (b), (c), 및 (d)(i)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, (b)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에 존재하고; (a), (c), 및 (d)(i)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, (c)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에 존재하고; (a), (b), 및 (d)(i)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
다른 구현예에서, (d)(i)는 제1 핵산 분자, 예를 들어, 제1 벡터, 예를 들어, 제1 바이러스 벡터, 예를 들어, 제1 AAV 벡터에 존재하고; (a), (b), 및 (c)는 제2 핵산 분자, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 벡터, 예를 들어, 제2 AAV 벡터에 존재한다. 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
또 다른 구현예에서, (a), (b), (c), 및 (d)(i) 각각은 상이한 핵산 분자, 예를 들어, 상이한 벡터, 예를 들어, 상이한 바이러스 벡터, 예를 들어, 상이한 AAV 벡터에 존재한다. 예를 들어, (a)는 제1 핵산 분자에 존재하고, (b)는 제2 핵산 분자에 존재하고, (c)는 제3 핵산 분자에 존재하고, (d)(i)는 제4 핵산 분자에 존재할 수 있다. 제1, 제2, 제3, 및 제4 핵산 분자는 AAV 벡터일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제3 및/또는 제4 gRNA 분자가 존재하는 경우, (a), (b), (c), (d)(i), (d)(ii) 및 (d)(iii) 각각은 동일한 핵산 분자, 예를 들어, 동일한 벡터, 예를 들어, 동일한 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 벡터에 존재할 수 있다. 구현예에서, 핵산 분자는 AAV 벡터이다. 대안적인 구현예에서, (a), (b), (c), (d)(i), (d)(ii) 및 (d)(iii) 각각은 상이한 핵산 분자, 예를 들어, 상이한 벡터, 예를 들어, 상이한 바이러스 벡터, 예를 들어, 상이한 AAV 벡터에 존재할 수 있다. 추가의 구현예에서, (a), (b), (c), (d)(i), (d)(ii) 및 (d)(iii) 각각은 1 개 보다 많고 6 개보다 적은 핵산 분자, 예를 들어, AAV 벡터에 존재할 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산은 (a)의 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 프로모터를 포함한다. 핵산은 (d)의 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 프로모터, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 프로모터와 제2 프로모터는 서로 상이하다. 일부 구현예에서, 프로모터와 제2 프로모터는 동일하다.
본 명세서에 기재된 핵산은 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자)를 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제를 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 간상체-특이적 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 간상체-특이적 프로모터는 인간 RHO 프로모터일 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 RHO 프로모터는 최소 RHO 프로모터(예를 들어, 서열번호 44)일 수 있다.
본 명세서에 기재된 핵산은 (c)의 RHO cDNA 분자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, (c)의 RHO cDNA 분자에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 간상체-특이적 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, 간상체-특이적 프로모터는 인간 RHO 프로모터일 수 있다. 특정 구현예에서, 인간 RHO 프로모터는 최소 RHO 프로모터(예를 들어, 서열번호 44)일 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산은 RHO cDNA 분자의 하류에 3' UTR 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자의 하류에서 3' UTR 뉴클레오타이드 서열은 RHO 유전자 3' UTR 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자의 하류에서 3' UTR 뉴클레오타이드 서열은 고도 발현된 단백질을 암호화하는 mRNA의 3' UTR 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자의 하류에서 3' UTR 뉴클레오타이드 서열은 α-글로빈 3' UTR 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자의 하류에서 3' UTR 뉴클레오타이드 서열은 β-글로빈 3' UTR 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 3' UTR 뉴클레오타이드 서열은 상기 3' UTR 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단, 상기 3' UTR 뉴클레오타이드 서열의 3' 말단, 또는 둘 다에서 하나 이상의 절두를 포함한다.
또 다른 양태에서, (a) 본 명세서에 기재된 바와 같은 RHO 유전자에서 표적 도메인과 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 포함하는 조성물이 본 명세서에 기재된다. (a)의 조성물은 (b) RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Cas9 또는 Cpf1 분자)를 추가로 포함할 수 있다. Cpf1은 종종 Cas12a로도 지칭된다. (a) 및 (b)의 조성물은 (c) RHO cDNA 분자를 추가로 포함할 수 있다. (a), (b), 및 (c)의 조성물은 (d) 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA 분자를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 세포를 변경시키는, 예를 들어, 세포의 표적 핵산의 구조를 변경시키는, 예를 들어, 서열을 변경시키는 방법으로서, 상기 세포를 (a) RHO 유전자를 표적화하는 gRNA, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA; (b) RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 Cas9 또는 Cpf1 분자); 및 (c) RHO cDNA 분자; 및 선택적으로, (d) RHO 유전자를 표적화하는 제2, 제3 및/또는 제4 gRNA, 예를 들어, gRNA와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법이 본 명세서에 개시된다.
일부 구현예에서, 방법은 상기 세포를 (a) 및 (b)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 상기 세포를 (a), (b), 및 (c)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 상기 세포를 (a), (b), (c) 및 (d)와 접촉시키는 단계를 포함한다.
(a) 및 선택적으로 (d)의 gRNA는 표 1 내지 표 3 및 표 18에 기재된 것들로부터 선택된 표적화 도메인 서열을 포함할 수 있거나, 임의의 표 1 내지 표 3 및 표 18에 기재된 표적화 도메인 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 adRP를 앓고 있거나 adRP가 발생할 가능성이 있는 대상체로부터의 세포를 접촉시키는 단계를 포함한다. 세포는 RHO 표적 위치에 돌연변이를 갖는 대상체로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 개시된 방법에서 접촉되는 세포는 대상체의 눈으로부터의 세포, 망막 세포, 예를 들어, 광수용체 세포이다. 접촉은 생체외에서 수행될 수 있고, 접촉된 세포는 접촉 단계 후 대상체의 신체로 되돌아갈 수 있다. 다른 구현예에서, 접촉 단계는 생체내에서 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 세포를 변경시키는 방법은 접촉 단계 전에 상기 세포내 RHO 유전자에서 돌연변이의 존재에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함한다. 세포내 RHO 유전자에서 돌연변이의 정보를 획득하는 것은 RHO 유전자, 또는 RHO 유전자의 일부를 시퀀싱함으로써 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법의 접촉 단계는 세포를 (a), (b), 및 (c) 중 적어도 하나를 발현하는 핵산, 예를 들어, 벡터, 예를 들어, AAV 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법의 접촉 단계는 세포를 (a), (b), 및 (c) 각각을 발현하는 핵산, 예를 들어, 벡터, 예를 들어, AAV 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법의 접촉 단계는 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자) 및 gRNA (a), RHO cDNA (c), 및 선택적으로, 제2 gRNA (d)(i), 및 추가로 선택적으로, 제3 gRNA (d)(iv) 및/또는 제4 gRNA (d)(iii)를 암호화하는 핵산을 세포로 전달하는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 방법의 접촉 단계는 세포를 (a), (b), (c) 및 (d) 중 적어도 하나를 발현하는 핵산, 예를 들어, 벡터, 예를 들어, AAV 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법의 접촉 단계는 세포를 (a), (b), 및 (c) 각각을 발현하는 핵산, 예를 들어, 벡터, 예를 들어, AAV 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 방법의 접촉 단계는 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), gRNA (a) 및 RHO cDNA 분자 (c), 및 선택적으로, 제2 gRNA (d)(i), 및 추가로 선택적으로, 제3 gRNA (d)(iv) 및/또는 제4 gRNA (d)(iii)를 암호화하는 핵산을 세포로 전달하는 것을 포함한다.
구현예에서, 접촉은 세포를 핵산, 예를 들어, 벡터, 예를 들어, AAV 벡터, 예를 들어, AAV5 벡터, 변형된 AAV5 벡터, AAV2 벡터, 변형된 AAV2 벡터, AAV3 벡터, 변형된 AAV3 벡터, AAV6 벡터, 변형된 AAV6 벡터, AAV8 벡터 또는 AAV9 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다.
구현예에서, 접촉은 단백질 또는 mRNA로서 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), 및 (a) 및 (c) 및 선택적으로 (d)를 암호화하는 핵산을 세포로 전달하는 것을 포함한다.
구현예에서, 접촉은 단백질 또는 mRNA로서 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), RNA로서 (a)의 상기 gRNA, 및 선택적으로 RNA로서 (d)의 상기 제2 gRNA, 및 DNA로서 RHO cDNA 분자 (c)를 세포로 전달하는 것을 포함한다.
구현예에서, 접촉은 RNA로서 (a)의 gRNA, 선택적으로 RNA로서 (d)의 상기 제2 gRNA, 및 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), 및 DNA로서 RHO cDNA 분자 (c)를 암호화하는 핵산을 세포로 전달하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, adRP를 앓고 있거나 adRP가 발생할 가능성이 있는 대상체를 치료하는, 예를 들어, 대상체의 표적 핵산의 구조, 예를 들어, 서열을 변경시키는 방법으로서, 대상체(또는 대상체로부터의 세포)를 하기와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법이 본 명세서에 개시된다:
(a) RHO 유전자를 표적화하는 gRNA, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 gRNA;
(b) RNA-가이드 뉴클레아제, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 또는 Cpf1 분자; 및
(c) RHO cDNA 분자; 및
선택적으로, (d)(i) RHO 유전자를 표적화하는 제2 gRNA, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 제2 gRNA, 및
추가로 선택적으로, (d)(ii) 제3 gRNA, 및 추가로 선택적으로 (d)(iii) RHO 유전자를 표적화하는 제4 gRNA, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 제3 및 제4 gRNA.
일부 구현예에서, 접촉은 (a) 및 (b)와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 접촉은 (a), (b), 및 (c)와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 접촉은 (a), (b), (c), 및 (d)(i)와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 접촉은 (a), (b), (c), (d)(i) 및 (d)(ii)와 접촉시키는 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 접촉은 (a), (b), (c), (d)(i), (d)(ii) 및 (d)(iii)와 접촉시키는 것을 포함한다.
(a) 또는 (d)(예를 들어, (d)(i), (d)(ii), 또는 (d)(iii))의 gRNA는 표 1 내지 표 3 및 표 18에 기재된 임의의 것들로부터 선택된 표적화 도메인 서열을 포함할 수 있거나, 임의의 표 1 내지 표 3 및 표 18에 기재된 표적화 도메인 서열과 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 5 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 표적화 도메인 서열을 포함할 수 있다.
구현예에서, 방법은 상기 대상체에서 RHO 유전자 내 돌연변이의 존재에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 방법은 RHO 유전자 또는 RHO 유전자의 일부를 시퀀싱함으로써 상기 대상체에서 RHO 유전자 내 돌연변이의 존재에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함한다.
구현예에서, 방법은 RHO 유전자의 넉아웃을 초래하는 RHO 유전자에서 RHO 표적 위치를 변경시키고, 외인성 RHO cDNA를 제공하는 단계를 포함한다.
방법이 RHO 표적 위치를 변경시키고, 외인성 RHO cDNA를 제공하는 단계를 포함하는 경우, (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), 적어도 하나의 가이드 RNA(예를 들어, (a)의 가이드 RNA) 및 RHO cDNA 분자 (c)가 접촉 단계에 포함된다.
구현예에서, 대상체의 세포는 생체외에서 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d)와 접촉된다. 구현예에서, 상기 세포는 대상체의 신체로 되돌아간다.
구현예에서, 대상체의 세포는 생체내에서 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d)와 접촉된다.
구현예에서, 대상체의 세포는 생체내에서 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d)의 정맥내 전달에 의해 접촉된다.
구현예에서, 접촉은 본 명세서에 기재된 핵산, 예를 들어, 벡터, 예를 들어, AAV 벡터, 예를 들어, (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d) 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산과 대상체를 접촉시키는 것을 포함한다.
구현예에서, 접촉은 단백질 또는 mRNA로서 (b)의 상기 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), 및 (a), (c)의 RHO cDNA 분자 및 선택적으로 (d)를 암호화하는 핵산을 상기 대상체로 전달하는 것을 포함한다.
구현예에서, 접촉은 단백질 또는 mRNA로서 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), RNA로서 (a)의 gRNA, (c)의 RHO cDNA 분자 및 선택적으로 RNA로서 (d)의 제2 gRNA를 대상체로 전달하는 것을 포함한다.
구현예에서, 접촉은 RNA로서 (a)의 gRNA, 선택적으로 RNA로서 (d)의 상기 제2 gRNA, (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), 및 (c)의 RHO cDNA 분자를 암호화하는 핵산을 대상체로 전달하는 것을 포함한다.
구현예에서, 대상체의 세포는 생체외에서 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d)와 접촉된다. 구현예에서, 상기 세포는 대상체의 신체로 되돌아간다.
구현예에서, 대상체의 세포는 생체내에서 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d)와 접촉된다. 구현예에서, 대상체의 세포는 생체내에서 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d)의 정맥내 전달에 의해 접촉된다.
구현예에서, 접촉은 본 명세서에 기재된 핵산, 예를 들어, 벡터, 예를 들어, AAV 벡터, 예를 들어, (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d) 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산과 대상체를 접촉시키는 것을 포함한다.
구현예에서, 접촉은 단백질 또는 mRNA로서 (b)의 상기 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), 및 (a), (c) 및 선택적으로 (d)를 암호화하는 핵산을 상기 대상체로 전달하는 것을 포함한다.
구현예에서, 접촉은 단백질 또는 mRNA로서 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), RNA로서 (a)의 gRNA, 및 선택적으로 RNA로서 (d)의 제2 gRNA, 및 추가로 선택적으로 DNA로서 (c)의 RHO cDNA 분자를 대상체로 전달하는 것을 포함한다.
구현예에서, 접촉은 RNA로서 (a)의 gRNA, 선택적으로 RNA로서 (d)의 상기 제2 gRNA, 및 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), 및 DNA로서 (c)의 RHO cDNA 분자를 암호화하는 핵산을 대상체로 전달하는 것을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA, 핵산, 조성물, 및 세포, 예를 들어, adRP를 갖거나 adRP가 발생할 가능성이 있는 대상체, 또는 RHO 유전자에서 돌연변이를 갖는 대상체로부터의 세포를 포함하는 반응 혼합물이 본 명세서에 개시된다.
또 다른 양태에서, (a) 본 명세서에 기재된 gRNA 분자, 또는 gRNA, 및 하기 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 포함하는 키트가 본 명세서에 개시된다:
(b) RNA-가이드 뉴클레아제 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 또는 Cpf1 분자, 또는 RNA-가이드 뉴클레아제를 암호화하는 핵산 또는 mRNA;
(c) RHO cDNA 분자;
(d)(i) 제2 gRNA 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 제2 gRNA 분자 또는 (d)(i)를 암호화하는 핵산;
(d)(ii) 제3 gRNA 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 제2 gRNA 분자 또는 (d)(ii)를 암호화하는 핵산;
(d)(iii) 제4 gRNA 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 제2 gRNA 분자 또는 (d)(iii)를 암호화하는 핵산.
구현예에서, 키트는 (a), (b), (c), (d)(i), (d)(ii), 및 (d)(iii) 중 하나 이상을 암호화하는 핵산, 예를 들어, AAV 벡터를 포함한다.
특정 구현예에서, 벡터 또는 핵산은 서열번호 8 내지 11 중 하나 이상에 기재된 서열을 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 개시내용의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그들의 전문이 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
수치 및 알파벳 표제 및 부표제를 포함하는 표제는 조직화 및 제시를 위한 것이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 개시내용의 다른 특징 및 이점은 상세한 설명, 도면으로부터 그리고 청구범위로부터 명확하게 될 것이다.
첨부된 도면은 본 개시내용의 특정 양태 및 구현예를 예시한다. 도면 내 도시는 본 개시내용의 특정 양태 및 구현예의 포괄적인 예가 아니라 예시적이고 개략적인 예를 제공하는 것으로 의도된다. 도면은 임의의 특정 이론 또는 모델로 제한하거나 결부시키는 것으로 의도되지 않고, 반드시 척도대로 나타나 있지도 않다. 상기 사항을 제한하지 않으면서, 핵산 및 폴리펩타이드는 선형 서열로서, 또는 개략적인 2차원 또는 3차원 구조로서 도시될 수 있으며; 이들 도시는 이들 구조에 관한 임의의 특정 모델 또는 이론으로 제한하거나 결부시키기보다는 예시적인 것으로 의도된다.
도 1은 본 개시내용의 특정 구현예에서 구현된 게놈 편집 전략을 예시한다. 단계 1은 RHO 유전자의, 예를 들어, 엑손 1의 RHO 표적 위치에서 넉아웃("KO") 또는 변경을 포함한다. RHO 유전자를 넉아웃시키는 것은 내인성 RHO 유전자(예를 들어, 돌연변이체 RHO 유전자)의 기능 상실을 초래한다. 단계 2는 최소 RHO 프로모터 및 RHO cDNA를 포함하는 외인성 RHO cDNA로 RHO 유전자를 대체하는 것을 포함한다.
도 2는 제한 없이, 본 개시내용의 특정 구현예에 따른 RHO 표적 위치의 변경을 포함하는 다양한 적용에 사용될 수 있는 예시적인 이중 AAV 전달 시스템의 도식이다. 벡터 1은 ITR, GRK1 프로모터, 및 NLS 서열에 측접하는 Cas9 분자를 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 벡터 2는 ITR, 최소 RHO 프로모터, RHO cDNA 분자, U6 프로모터, 및 gRNA를 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 망막하 주사를 통해 전달될 수 있다.
도 3은 제한 없이, 본 개시내용의 특정 구현예에 따른 RHO 표적 위치의 변경을 포함하는 다양한 적용에 사용될 수 있는 예시적인 이중 AAV 전달 시스템의 도식이다. 벡터 1은 최소 RHO 프로모터 및 Cas9 분자를 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 벡터 2는 최소 RHO 프로모터, RHO cDNA 분자, U6 프로모터, 및 gRNA를 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 망막하 주사를 통해 전달될 수 있다.
도 4는 RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA(표 17) 및 Cas9를 포함하는 리보뉴클레오단백질(RNP)을 사용한 용량-의존적 유전자 편집에 의해 형성된 HEK293 세포에서 RHO 유전자의 인델을 도시한다. 증가된 농도의 RNP가 HEK293 세포로 전달되었다. RHO 유전자의 인델은 차세대 시퀀싱(NGS)를 이용하여 평가되었다. RHO-3 gRNA, RHO-10 gRNA, 또는 RHO-7 gRNA를 포함하는 RNP로부터의 데이터는 각각 동그라미, 네모, 및 세모로 표시된다. 대조 플라스미드(인간 게놈 내 서열을 표적화하지 않는 스크램블된 gRNA로 Cas9를 발현함)로부터의 데이터는 X로 표시된다.
도 5는 RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA(표 17)에 의해 생성된 예상 gRNA RHO 대립유전자를 특징으로 하는 세부 사항을 나타낸다. 도 5의 하단에 있는 인간 RHO cDNA 및 상응하는 엑손의 도식에 나타낸 바와 같이, RHO-3, RHO-10, 및 RHO-7 gRNA는 각각 엑손 1, 엑손 2/인트론 2 경계, 및 엑손 1/인트론 1 경계에서 RHO cDNA를 절단하는 것으로 예상된다. RHO-3, RHO-10, 및 RHO-7 gRNA에 대한 표적 부위 위치는 각각 RHO 단백질의 아미노산(AA) 96, 174, 및 120을 암호화하는 염기에 위치한다. 예상 -1, -2, 및 -3 프레임 시프트에 대한 각각의 생성된 작제물의 단백질 길이가 제시된다. RHO-3의 경우, 위치 96에서 1 개의 염기 결실은 95 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 96에서 2 개의 염기 결실은 120 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 96에서 3 개의 염기 결실은 347 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래한다. RHO-10의 경우, 위치 174에서 1 개의 염기 결실은 215 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 174에서 2 개의 염기 결실은 328 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 174에서 3 개의 염기 결실은 347 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래한다. RHO-7의 경우, 위치 120에서 1 개의 염기 결실은 142 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 120에서 2 개의 염기 결실은 142 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 120에서 3 개의 염기 결실은 347 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래한다. 도 6은 예상 절두 단백질의 도식을 제공한다.
도 6은 RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA(표 17)에 의해 생성된 예상 RHO 대립유전자의 도식을 나타낸다. RHO 대립유전자는 RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 절단 부위에서 1 개, 2 개, 또는 3 개의 염기쌍의 결실을 기초로 예상되었다. RHO 엑손은 짙은 회색으로 표현되고, 정지 코돈은 검은색으로 표시되고, 미스센스 단백질은 줄무늬로 표시되고, 결실은 옅은 회색으로 표시된다.
도 7a 및 도 7b는 야생형 또는 모의-편집된 RHO 대립유전자를 발현하는 HEK293 세포의 생존력을 나타낸다. 1 개의 염기 쌍(bp), 2 bp 또는 3 bp 결실을 갖는 RHO-3, RHO-7, 및 RHO-10 gRNA(표 17)에 의해 생성되는 것으로 예상되는 RHO 대립유전자의 도식은 도 6에서 예시된다. RHO-3, RHO-7, 및 RHO-10 gRNA로부터 생성되는 것으로 예상되는 RHO 돌연변이(즉, 모의-편집된 RHO 대립유전자)는 WT-RHO cDNA 또는 P23H RHO 변이체를 발현하는 RHO cDNA를 사용하여 생성되었다. 야생형 RHO, 모의-편집된 RHO, 또는 P23H RHO 변이체를 발현하는 RHO 대립유전자는 포유류 발현 플라스미드로 클로닝되고, HEK293 세포로 리포펙션되고, Perkin Elmer에 의한 ATPLite 발광 검정을 이용하여 48 시간 후 세포 생존력에 대해 평가되었다. 도 7a는 변형된 WT RHO 대립유전자를 갖는 세포의 발광에 의해 도시된 생존력을 나타낸다. 도 7b는 변형된 P23H RHO 대립유전자를 갖는 세포의 발광에 의해 도시된 생존력을 나타낸다. 상부 점선은 WT RHO 대립유전자로부터의 발광 수준을 나타내고, 하부 점선은 P23H RHO 대립유전자로부터의 발광 수준을 나타낸다.
도 8은 RHO-9 gRNA를 사용하여 비인간 영장류(NHP) 외식편에서 간상체 광수용체의 편집을 나타낸다(표 1). 간상체-특이적 mRNA(신경 망막 류신 지퍼(NRL))로부터의 RNA는 외식편으로부터 추출되고, 외식편에 존재하는 간상체의 백분율을 결정하기 위해 측정되었다. 베타 액틴(ACTB)으로부터의 RNA가 또한 총 세포 수를 결정하기 위해 측정되었다. x-축은 RT-PCR에 의해 측정한 바와 같은 ACTB 및 NRL RNA 수준 사이의 델타를 나타내며, 이는 외식편을 용해한 시점에 외식편 중 간상체의 백분율에 대한 척도이다. RHO 유전자의 인델은 차세대 시퀀싱(NGS)를 이용하여 평가되었다. 각 동그라미는 상이한 외식편으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 9는 RHO 대체 벡터를 최적화하기 위해 사용된 이중 루시페라제 시스템에 대한 플라스미드의 도식을 나타낸다.
도 10은 RHO 발현에 대한 상이한 길이의 RHO 프로모터의 효과를 시험하기 위해 이중 루시페라제 시스템을 사용한 반딧불이/레닐라 루시페라제 발광의 비율을 도시한다. 시험된 RHO 프로모터의 길이는 3.0 Kb 내지 250 bp의 범위였다.
도 11a 및 도 11b는 RHO 대체 벡터에 다양한 3' UTR을 첨가한 RHO mRNA 및 RHO 단백질 발현에 대한 효과를 도시한다. HBA1 3' UTR(서열번호 38), 짧은 HBA1 3' UTR(서열번호 39), TH 3' UTR(서열번호 40), COL1A1 3'UTR(서열번호 41), ALOX15 3'UTR(서열번호 42), 및 minUTR(서열번호 56)이 시험되었다. 도 11a는 RHO mRNA 발현을 측정하기 위해 RT-qPCR을 사용한 결과를 나타낸다. 도 11b는 RHO 단백질 발현을 측정하기 위해 RHO ELISA 검정을 사용한 결과를 나타낸다.
도 12는 RHO 대체 벡터에서 상이한 RHO 인트론을 RHO cDNA로 삽입한 RHO 단백질 발현에 대한 효과를 도시한다. 인트론(즉, 인트론 1 내지 인트론 4)이 삽입된 다양한 RHO cDNA 서열은 각각 서열번호 4 내지 7에 기재되어 있다.
도 13은 RHO 대체 벡터에서 야생형 또는 상이한 코돈 최적화 RHO 작제물을 사용한 RHO 단백질 발현에 대한 효과를 도시한다. 다양한 코돈 최적화 RHO cDNA 서열(즉, 코돈 1 내지 코돈 6)은 각각 서열번호 13 내지 18에 기재되어 있다. RHO cDNA는 CMV 또는 EFS 프로모터의 제어 하에 있었다.
도 14a 및 도 14b는 자기-제한적 Cas9 벡터 시스템("SD")을 사용하여 RHO 유전자의 생체내 편집 및 Cas9의 넉다운을 도시한다. 도 14a는 자기-제한적 Cas9 벡터 시스템(즉, "SD Cas9+ Rho")을 사용한 Cas9 수준의 성공적인 넉다운을 나타낸다. 도 14b는 자기-제한적 Cas9 벡터 시스템(즉, "SD Cas9")을 사용한 성공적인 편집을 나타낸다.
도 15는 인간 외식편에서의 RHO 발현을 도시한다. 외식편은 다음으로 형질도입되었다. "shRNA": RHO 유전자를 표적화하는 shRNA 및 RHO cDNA를 제공하는 대체 벡터를 이용한 망막 외식편의 형질도입(문헌[Cideciyan 2018]에 공개된 바와 같음); "벡터 A": 2-벡터 시스템(최소 RHO 프로모터(250 bp)에 의해 구동되는 saCas9를 포함하는 벡터 1, 및 코돈-최적화 RHO cDNA(코돈-6)을 포함하고 최소 250 bp RHO 프로모터의 제어 하에 HBA1 3' UTR, 뿐만 아니라 U6 프로모터의 제어 하에 RHO-9 gRNA(표 1)를 포함하는 벡터 2); "벡터 B": wt RHO cDNA를 포함하는 벡터 2를 제외하고 "벡터 A"와 동일한 2-벡터 시스템; 및 "UTC": 형질도입되지 않은 대조군.
도 16은 본 개시내용의 특정 구현예에 따른 예시적인 AAV 벡터(서열번호 11)의 도식이다. 도식은 ITR(서열번호 92), 제1 U6 프로모터(서열번호 78), 제1 RHO-7 gRNA(RHO-7 gRNA 표적화 도메인(서열번호 606)(DNA) 및 서열번호 12 포함), 제2 U6 프로모터(서열번호 78), 제2 RHO-7 gRNA(RHO-7 gRNA 표적화 도메인 (서열번호 606)(DNA) 및 서열번호 12 포함), 최소 RHO 프로모터(250 bp)(서열번호 44), SV40 인트론(서열번호 94), 코돈 최적화 RHO cDNA(서열번호 18), HBA1 3' UTR(서열번호 38), 미니폴리A(서열번호 56), 및 우측 ITR(서열번호 93)를 포함하고 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 망막하 주사를 통해 전달될 수 있다.
도 17은 본 개시내용의 특정 구현예에 따른 예시적인 AAV 벡터(서열번호 10)의 도식이다. 도식은 ITR(서열번호 92), 최소 RHO 프로모터(250 bp)(서열번호 44), SV40 인트론(서열번호 94), NLS 서열, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 서열, SV40 NLS, HBA1 3' UTR(서열번호 38), 및 우측 ITR(서열번호 93)을 포함하고 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 망막하 주사를 통해 전달될 수 있다.
도 18은 본 개시내용의 특정 구현예에 따른 예시적인 AAV 벡터(서열번호 9)의 도식이다. 도식은 ITR(서열번호 92), 최소 RHO 프로모터, SV40 SA/SD, NLS, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 서열, SV40 NLS, 미니폴리A(서열번호 56), 및 우측 ITR(서열번호 93)을 포함하고 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 망막하 주사를 통해 전달될 수 있다.
도 1은 본 개시내용의 특정 구현예에서 구현된 게놈 편집 전략을 예시한다. 단계 1은 RHO 유전자의, 예를 들어, 엑손 1의 RHO 표적 위치에서 넉아웃("KO") 또는 변경을 포함한다. RHO 유전자를 넉아웃시키는 것은 내인성 RHO 유전자(예를 들어, 돌연변이체 RHO 유전자)의 기능 상실을 초래한다. 단계 2는 최소 RHO 프로모터 및 RHO cDNA를 포함하는 외인성 RHO cDNA로 RHO 유전자를 대체하는 것을 포함한다.
도 2는 제한 없이, 본 개시내용의 특정 구현예에 따른 RHO 표적 위치의 변경을 포함하는 다양한 적용에 사용될 수 있는 예시적인 이중 AAV 전달 시스템의 도식이다. 벡터 1은 ITR, GRK1 프로모터, 및 NLS 서열에 측접하는 Cas9 분자를 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 벡터 2는 ITR, 최소 RHO 프로모터, RHO cDNA 분자, U6 프로모터, 및 gRNA를 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 망막하 주사를 통해 전달될 수 있다.
도 3은 제한 없이, 본 개시내용의 특정 구현예에 따른 RHO 표적 위치의 변경을 포함하는 다양한 적용에 사용될 수 있는 예시적인 이중 AAV 전달 시스템의 도식이다. 벡터 1은 최소 RHO 프로모터 및 Cas9 분자를 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 벡터 2는 최소 RHO 프로모터, RHO cDNA 분자, U6 프로모터, 및 gRNA를 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 망막하 주사를 통해 전달될 수 있다.
도 4는 RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA(표 17) 및 Cas9를 포함하는 리보뉴클레오단백질(RNP)을 사용한 용량-의존적 유전자 편집에 의해 형성된 HEK293 세포에서 RHO 유전자의 인델을 도시한다. 증가된 농도의 RNP가 HEK293 세포로 전달되었다. RHO 유전자의 인델은 차세대 시퀀싱(NGS)를 이용하여 평가되었다. RHO-3 gRNA, RHO-10 gRNA, 또는 RHO-7 gRNA를 포함하는 RNP로부터의 데이터는 각각 동그라미, 네모, 및 세모로 표시된다. 대조 플라스미드(인간 게놈 내 서열을 표적화하지 않는 스크램블된 gRNA로 Cas9를 발현함)로부터의 데이터는 X로 표시된다.
도 5는 RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA(표 17)에 의해 생성된 예상 gRNA RHO 대립유전자를 특징으로 하는 세부 사항을 나타낸다. 도 5의 하단에 있는 인간 RHO cDNA 및 상응하는 엑손의 도식에 나타낸 바와 같이, RHO-3, RHO-10, 및 RHO-7 gRNA는 각각 엑손 1, 엑손 2/인트론 2 경계, 및 엑손 1/인트론 1 경계에서 RHO cDNA를 절단하는 것으로 예상된다. RHO-3, RHO-10, 및 RHO-7 gRNA에 대한 표적 부위 위치는 각각 RHO 단백질의 아미노산(AA) 96, 174, 및 120을 암호화하는 염기에 위치한다. 예상 -1, -2, 및 -3 프레임 시프트에 대한 각각의 생성된 작제물의 단백질 길이가 제시된다. RHO-3의 경우, 위치 96에서 1 개의 염기 결실은 95 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 96에서 2 개의 염기 결실은 120 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 96에서 3 개의 염기 결실은 347 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래한다. RHO-10의 경우, 위치 174에서 1 개의 염기 결실은 215 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 174에서 2 개의 염기 결실은 328 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 174에서 3 개의 염기 결실은 347 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래한다. RHO-7의 경우, 위치 120에서 1 개의 염기 결실은 142 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 120에서 2 개의 염기 결실은 142 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래하고, 위치 120에서 3 개의 염기 결실은 347 개의 아미노산 길이인 절두 단백질을 초래한다. 도 6은 예상 절두 단백질의 도식을 제공한다.
도 6은 RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA(표 17)에 의해 생성된 예상 RHO 대립유전자의 도식을 나타낸다. RHO 대립유전자는 RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 절단 부위에서 1 개, 2 개, 또는 3 개의 염기쌍의 결실을 기초로 예상되었다. RHO 엑손은 짙은 회색으로 표현되고, 정지 코돈은 검은색으로 표시되고, 미스센스 단백질은 줄무늬로 표시되고, 결실은 옅은 회색으로 표시된다.
도 7a 및 도 7b는 야생형 또는 모의-편집된 RHO 대립유전자를 발현하는 HEK293 세포의 생존력을 나타낸다. 1 개의 염기 쌍(bp), 2 bp 또는 3 bp 결실을 갖는 RHO-3, RHO-7, 및 RHO-10 gRNA(표 17)에 의해 생성되는 것으로 예상되는 RHO 대립유전자의 도식은 도 6에서 예시된다. RHO-3, RHO-7, 및 RHO-10 gRNA로부터 생성되는 것으로 예상되는 RHO 돌연변이(즉, 모의-편집된 RHO 대립유전자)는 WT-RHO cDNA 또는 P23H RHO 변이체를 발현하는 RHO cDNA를 사용하여 생성되었다. 야생형 RHO, 모의-편집된 RHO, 또는 P23H RHO 변이체를 발현하는 RHO 대립유전자는 포유류 발현 플라스미드로 클로닝되고, HEK293 세포로 리포펙션되고, Perkin Elmer에 의한 ATPLite 발광 검정을 이용하여 48 시간 후 세포 생존력에 대해 평가되었다. 도 7a는 변형된 WT RHO 대립유전자를 갖는 세포의 발광에 의해 도시된 생존력을 나타낸다. 도 7b는 변형된 P23H RHO 대립유전자를 갖는 세포의 발광에 의해 도시된 생존력을 나타낸다. 상부 점선은 WT RHO 대립유전자로부터의 발광 수준을 나타내고, 하부 점선은 P23H RHO 대립유전자로부터의 발광 수준을 나타낸다.
도 8은 RHO-9 gRNA를 사용하여 비인간 영장류(NHP) 외식편에서 간상체 광수용체의 편집을 나타낸다(표 1). 간상체-특이적 mRNA(신경 망막 류신 지퍼(NRL))로부터의 RNA는 외식편으로부터 추출되고, 외식편에 존재하는 간상체의 백분율을 결정하기 위해 측정되었다. 베타 액틴(ACTB)으로부터의 RNA가 또한 총 세포 수를 결정하기 위해 측정되었다. x-축은 RT-PCR에 의해 측정한 바와 같은 ACTB 및 NRL RNA 수준 사이의 델타를 나타내며, 이는 외식편을 용해한 시점에 외식편 중 간상체의 백분율에 대한 척도이다. RHO 유전자의 인델은 차세대 시퀀싱(NGS)를 이용하여 평가되었다. 각 동그라미는 상이한 외식편으로부터의 데이터를 나타낸다.
도 9는 RHO 대체 벡터를 최적화하기 위해 사용된 이중 루시페라제 시스템에 대한 플라스미드의 도식을 나타낸다.
도 10은 RHO 발현에 대한 상이한 길이의 RHO 프로모터의 효과를 시험하기 위해 이중 루시페라제 시스템을 사용한 반딧불이/레닐라 루시페라제 발광의 비율을 도시한다. 시험된 RHO 프로모터의 길이는 3.0 Kb 내지 250 bp의 범위였다.
도 11a 및 도 11b는 RHO 대체 벡터에 다양한 3' UTR을 첨가한 RHO mRNA 및 RHO 단백질 발현에 대한 효과를 도시한다. HBA1 3' UTR(서열번호 38), 짧은 HBA1 3' UTR(서열번호 39), TH 3' UTR(서열번호 40), COL1A1 3'UTR(서열번호 41), ALOX15 3'UTR(서열번호 42), 및 minUTR(서열번호 56)이 시험되었다. 도 11a는 RHO mRNA 발현을 측정하기 위해 RT-qPCR을 사용한 결과를 나타낸다. 도 11b는 RHO 단백질 발현을 측정하기 위해 RHO ELISA 검정을 사용한 결과를 나타낸다.
도 12는 RHO 대체 벡터에서 상이한 RHO 인트론을 RHO cDNA로 삽입한 RHO 단백질 발현에 대한 효과를 도시한다. 인트론(즉, 인트론 1 내지 인트론 4)이 삽입된 다양한 RHO cDNA 서열은 각각 서열번호 4 내지 7에 기재되어 있다.
도 13은 RHO 대체 벡터에서 야생형 또는 상이한 코돈 최적화 RHO 작제물을 사용한 RHO 단백질 발현에 대한 효과를 도시한다. 다양한 코돈 최적화 RHO cDNA 서열(즉, 코돈 1 내지 코돈 6)은 각각 서열번호 13 내지 18에 기재되어 있다. RHO cDNA는 CMV 또는 EFS 프로모터의 제어 하에 있었다.
도 14a 및 도 14b는 자기-제한적 Cas9 벡터 시스템("SD")을 사용하여 RHO 유전자의 생체내 편집 및 Cas9의 넉다운을 도시한다. 도 14a는 자기-제한적 Cas9 벡터 시스템(즉, "SD Cas9+ Rho")을 사용한 Cas9 수준의 성공적인 넉다운을 나타낸다. 도 14b는 자기-제한적 Cas9 벡터 시스템(즉, "SD Cas9")을 사용한 성공적인 편집을 나타낸다.
도 15는 인간 외식편에서의 RHO 발현을 도시한다. 외식편은 다음으로 형질도입되었다. "shRNA": RHO 유전자를 표적화하는 shRNA 및 RHO cDNA를 제공하는 대체 벡터를 이용한 망막 외식편의 형질도입(문헌[Cideciyan 2018]에 공개된 바와 같음); "벡터 A": 2-벡터 시스템(최소 RHO 프로모터(250 bp)에 의해 구동되는 saCas9를 포함하는 벡터 1, 및 코돈-최적화 RHO cDNA(코돈-6)을 포함하고 최소 250 bp RHO 프로모터의 제어 하에 HBA1 3' UTR, 뿐만 아니라 U6 프로모터의 제어 하에 RHO-9 gRNA(표 1)를 포함하는 벡터 2); "벡터 B": wt RHO cDNA를 포함하는 벡터 2를 제외하고 "벡터 A"와 동일한 2-벡터 시스템; 및 "UTC": 형질도입되지 않은 대조군.
도 16은 본 개시내용의 특정 구현예에 따른 예시적인 AAV 벡터(서열번호 11)의 도식이다. 도식은 ITR(서열번호 92), 제1 U6 프로모터(서열번호 78), 제1 RHO-7 gRNA(RHO-7 gRNA 표적화 도메인(서열번호 606)(DNA) 및 서열번호 12 포함), 제2 U6 프로모터(서열번호 78), 제2 RHO-7 gRNA(RHO-7 gRNA 표적화 도메인 (서열번호 606)(DNA) 및 서열번호 12 포함), 최소 RHO 프로모터(250 bp)(서열번호 44), SV40 인트론(서열번호 94), 코돈 최적화 RHO cDNA(서열번호 18), HBA1 3' UTR(서열번호 38), 미니폴리A(서열번호 56), 및 우측 ITR(서열번호 93)를 포함하고 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 망막하 주사를 통해 전달될 수 있다.
도 17은 본 개시내용의 특정 구현예에 따른 예시적인 AAV 벡터(서열번호 10)의 도식이다. 도식은 ITR(서열번호 92), 최소 RHO 프로모터(250 bp)(서열번호 44), SV40 인트론(서열번호 94), NLS 서열, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 서열, SV40 NLS, HBA1 3' UTR(서열번호 38), 및 우측 ITR(서열번호 93)을 포함하고 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 망막하 주사를 통해 전달될 수 있다.
도 18은 본 개시내용의 특정 구현예에 따른 예시적인 AAV 벡터(서열번호 9)의 도식이다. 도식은 ITR(서열번호 92), 최소 RHO 프로모터, SV40 SA/SD, NLS, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 서열, SV40 NLS, 미니폴리A(서열번호 56), 및 우측 ITR(서열번호 93)을 포함하고 암호화하는 AAV5 게놈을 나타낸다. 특정 구현예에서, AAV 벡터는 망막하 주사를 통해 전달될 수 있다.
정의
본 명세서에서 사용되는 "도메인"은 단백질 또는 핵산의 세그먼트를 기재하기 위해 사용된다. 달리 표시되지 않는 한, 도메인은 임의의 특이적 기능적 특성을 가질 필요는 없다.
두 서열 사이의 상동성 또는 서열 동일성(상기 용어는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용됨)의 계산은 다음과 같이 수행된다. 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다(예를 들어, 갭은 최적 정렬을 위해 제1 아미노산 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있고, 비교 목적을 위해 비상동성 서열은 무시될 수 있다). 최적 정렬은 갭 페널티 12, 갭 확장 페널티 4, 및 프레임 이동 갭 페널티 5로 Blossum 62 스코어링 매트릭스를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하는 최상 스코어로서 결정된다. 이어서, 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드가 비교된다. 제1 서열 내 위치가 제2 서열 내 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되면, 상기 분자는 해당 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 동일성 백분율은 서열에 의해 공유되는 동일한 위치 수의 함수이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "조절자(modulator)"는 독립체, 예를 들어, 대상 분자 또는 유전자 서열의 활성(예를 들어, 효소 활성, 전사 활성 또는 번역 활성), 양, 분포 또는 구조를 변경시킬 수 있는 약물을 지칭한다. 구현예에서, 조절은 절단, 예를 들어, 공유 또는 비공유 결합의 파손, 또는 공유 또는 비공유 결합의 형성, 예를 들어, 대상 분자에 대한 모이어티의 부착을 포함한다. 구현예에서, 조절자는 대상 분자의 3차원, 2차, 3차 또는 4차 구조를 변경시킨다. 조절자는 대상 활성을 증가, 감소, 개시 또는 제거할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "폴리펩타이드"는 100 개 미만의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산의 중합체를 지칭한다. 구현예에서, 이는 50 개, 20 개, 또는 10 개 미만의 아미노산 잔기를 가진다.
분자의 변형과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "대체", 또는 "대체되는"은 처리 제한을 필요로 하지 않지만, 단지 대체 독립체가 존재한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "RHO 표적 위치"는 본 명세서에 기재된 방법을 이용하여 변경을 위해 표적화된 RHO 유전자 또는 근처의 표적 위치, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 지칭한다. 특정 구현예에서, 예를 들어, 치환, 결실, 또는 삽입에 의한 RHO 표적 위치의 변경은 RHO 유전자의 파괴(예를 들어, "넉아웃")를 초래할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO 표적 위치는 RHO 유전자의 5' 영역(예를 들어, 5' UTR, 엑손 1, 엑손 2, 인트론 1, 엑손 1/인트론 1 경계, 또는 엑손 2/인트론 1 경계), RHO 유전자의 비-암호화 영역(예를 들어, 인핸서 영역, 프로모터 영역, 인트론, 5' UTR, 3'UTR, 폴리아데닐화 신호), 또는 RHO 유전자의 암호화 영역(예를 들어, 초기 암호화 영역, 엑손(예를 들어, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5), 또는 RHO 유전자의 엑손/인트론 경계(예를 들어, 엑손 1/인트론1, 엑손 2/인트론 1)에 위치할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "소분자"는 분자량이 약 2 kD 미만, 예를 들어, 약 2 kD 미만, 약 1.5 kD 미만, 약 1 kD, 또는 약 0.75 kD 미만인 화합물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "대상체"는 인간 또는 비-인간 동물 중 하나를 의미할 수 있다. 상기 용어는 포유류(예를 들어, 인간, 다른 영장류, 돼지, 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트 또는 햄스터), 토끼, 기니피그, 소, 말, 고양이, 개, 양 및 염소)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 구현예에서, 대상체는 인간이다. 다른 구현예에서, 대상체는 가금류이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "치료하다", "치료하는" 및 "치료"는 (a) 질환을 저해하는 것, 즉 질환의 발생을 저지 또는 예방하는 것; (b) 질환을 완화시키는 것, 즉, 질환 상태의 퇴행을 야기하는 것; 및 (c) 질환을 치유하는 것을 포함하는, 포유류에서의, 예를 들어, 인간에서의 질환의 치료를 의미한다.
아미노산 서열과 관련하여 본 명세서에서 사용되는 "X"는 달리 구체화되지 않는 한, 임의의 아미노산(예를 들어, 임의의 20 종의 천연 아미노산)을 지칭한다.
상염색체-우성 망막색소변성증(adRP)
망막색소변성증(RP)은 미국에서 50,000 명 내지 100,000 명의 사람들에게 발생한다. RP는 광수용체 및 망막 색소 상피 세포에 영향을 미치는 유전성 망막 이영양증의 그룹이다. 이 질환은 망막 악화 및 위축을 야기하며, 점진적인 시력 저하로 인해 궁극적으로 실명을 초래하는 것을 특징으로 한다.
전형적인 질환은 10 대 중에 발병하지만, 일부 대상체는 성인기 초기에 나타날 수 있다. 대상체는 초기에 야간 시력 저하 및 주변 시력 감소를 나타낸다. 일반적으로, 시력 상실은 주변 시야에서 안쪽으로 진행된다. 대부분의 대상체는 40 세까지 법적 실명 상태가 된다. 중심 시야는 질환의 말기에 걸쳐 약해질 수 있어서, 일부 대상체는 70 대까지 좁은 시야 내에서 정상적인 시력을 가질 수 있다. 그러나, 대부분의 대상체들은 50 세 내지 80 세에 마찬가지로 이들의 중심 시력을 상실한다(Berson 1990). 검사 시, 대상체는 골 침상 색소침착, 시야 축소 및 망막 위축 중 하나 이상을 가질 수 있다.
RP를 야기하는 60 개 초과의 유전자 및 수백 개의 돌연변이가 존재한다. 상염색체 우성 RP(adRP)는 RP의 15% 내지 25%를 차지한다. 상염색체 열성 RP(arRP)은 RP의 5% 내지 20%를 차지한다. X-연관 RP(X-LRP)는 RP의 5% 내지 15%를 차지한다(Daiger 2007). 일반적으로, adRP는 흔히 후기 증상을 갖고, arRP는 중간 증상을 갖고, X-LRP는 초기 증상을 갖는다.
상염색체-우성 망막색소변성증(adRP)은 로돕신(RHO) 유전자에서 이형접합 돌연변이에 의해 초래된다. RHO 유전자에서의 돌연변이는 adRP 사례의 25% 내지 30%를 차지한다.
RHO 유전자는 로돕신 단백질을 암호화한다. 로돕신은 망막 광수용체(PR) 간상 세포의 외부 세그먼트에서 발현되는 G 단백질-결합 수용체이고, 광변조 캐스케이드의 중요한 구성요소이다. 로돕신에 의해 흡수된 광은 11-시스 망막이 모든 트랜스 망막으로 이성질화되게 한다. 이러한 입체형태적 변화는 로돕신이 트랜스듀신과 결합되도록 하는데, 이는 시각적 신호전달 캐스케이드의 첫 단계이다. RHO 유전자의 이종접합 돌연변이는 야생형 로돕신의 생산 감소 및/또는 돌연변이 로돕신의 발현을 초래한다. 이는 광변조 캐스케이드의 기능 장애 및 간상체 PR 세포에서의 기능 저하로 이어진다. 시간이 지남에 따라, 간상체 PR 세포가 위축되고, 결국 또한 추상체 PR 세포가 위축된다. 이는 RP 대상체가 경험하는 누적 시력 상실의 전형적인 표현형 진행을 초래한다. RHO 돌연변이가 있는 대상체는 주변 시야의 점진적 상실, 이어서 중심 시야의 상실을 경험한다(후자는 시력의 감소로 측정됨).
예시적인 RHO 돌연변이는 표 A에 제공되어 있다.
[표 A]
RHO 돌연변이(그룹 A 돌연변이)
RP에 대한 치료는 제한적이며, 현재 adRP에서 질환의 진행을 실질적으로 역전시키거나 중단시키는 승인된 치료는 없다. 구현예에서, 비타민 A 보충은 질환의 발병을 지연시키고 진행을 늦출 수 있다. Argus II 망막 임플란트는 2013년에 미국에서 사용이 승인되었다. Argus II 망막 임플란트는 RP가 있는 대상체의 최소 시력 개선을 제공하는 전기 임플란트이다. 예를 들어, 디바이스의 시험에서 달성된 최고 시력은 20/1260이었다. 그러나, 법적 실명은 20/200 시력으로 규정된다.
개요
본 명세서에 제공된 바와 같이, 본 발명자들은 후술되는 바와 같은 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)에 의해 매개되는 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이체 RHO 유전자를 파괴하고, 기능적 RHO cDNA를 제공하는 것을 포함하는 변경을 제공하는 치료 전략을 고안하였다. 이러한 유형의 변경은 돌연변이체 RHO 유전자의 "넉아웃"으로도 지칭되고, 돌연변이체 RHO 유전자의 기능 상실을 초래한다. 이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 돌연변이체 RHO 유전자를 넉아웃시키고, 기능적 외인성 RHO cDNA를 제공하는 것은 PR 간상 세포에서 적절한 수준의 로돕신 단백질을 유지한다. 이러한 치료 전략은 adRP와 관련된 모든 공지된 돌연변이체 대립유전자, 예를 들어, 표 A에서의 RHO 돌연변이를 파괴하는 이점을 갖는다.
특정 구현예에서, 돌연변이체 RHO 유전자의 5' UTR 영역(예를 들어, 5' UTR, 엑손 1, 엑손 2, 인트론 1, 엑손 1/인트론 1, 또는 엑손 2/인트론 1 경계)은 돌연변이체 RHO 유전자를 변경하도록(즉, 넉아웃시키도록(예를 들어, 이의 발현을 없애도록)) 표적화된다.
특정 구현예에서, 돌연변이체 RHO 유전자의 암호화 영역(예를 들어, 엑손, 예를 들어, 초기 암호화 영역)은 돌연변이체 RHO 유전자를 변경하도록(즉, 넉아웃시키도록(예를 들어, 이의 발현을 없애도록)) 표적화된다. 예를 들어, 돌연변이체 RHO 유전자의 초기 암호화 영역은 암호화 서열의 첫 번째 엑손 내에서, 또는 시작 코돈의 500 bp 내에서(예를 들어, 500 bp, 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp 또는 50 bp 미만) 시작 코돈 바로 다음에 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 돌연변이체 RHO 유전자의 비-암호화 영역(예를 들어,인핸서 영역, 프로모터 영역, 인트론, 5' UTR, 3'UTR, 폴리아데닐화 신호)은 돌연변이체 RHO 유전자를 변경하도록(즉, 넉아웃시키도록(예를 들어, 이의 발현을 없애도록)) 표적화된다.
특정 구현예에서, 돌연변이체 RHO 유전자의 엑손/인트론 경계(예를 들어, 엑손 1/인트론 1, 엑손 2/인트론 1)는 돌연변이체 RHO 유전자를 변경하도록(즉, 넉아웃시키도록(예를 들어, 이의 발현을 없애도록)) 표적화된다. 특정 구현예에서, 엑손/인트론 경계를 표적화하는 것은 gRNA에 의한 절단에 내성이 있도록 코돈-변형되지 않은 외인성 RHO cDNA 분자를 사용할 수 있다는 이점을 제공한다.
도 1은 내인성 RHO 유전자를 넉아웃시키고 외인성 RHO cDNA를 제공하는 치료 전략의 일 구현예의 도식을 나타낸다. 일 구현예에서, CRISPR/RNA-가이드 뉴클레아제 게놈 편집 시스템은 RHO 유전자의 엑손 1 또는 엑손 2를 변경(즉, 넉아웃(예를 들어, 발현 제거))하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, RHO 유전자는 돌연변이된 RHO 유전자일 수 있다. 특정 구현예에서, 돌연변이된 RHO 유전자는 표 A에서 하나 이상의 RHO 돌연변이를 포함할 수 있다. RHO 유전자의 엑손 1 또는 엑손 2의 변경은 내인성 돌연변이된 RHO 유전자의 파괴를 초래한다.
특정 구현예에서, 치료 전략은 이중-벡터 시스템을 사용하여 달성될 수 있다. 특정 양태에서, 본 개시내용은 CRISPR/RNA-가이드 뉴클레아제 게놈 편집 시스템 및 대체 RHO cDNA를 암호화하는 AAV 벡터, 및 adRP 질환을 치료하기 위한 이러한 벡터의 용도에 초점을 맞추고 있다. 예시적인 벡터 게놈은 이들 벡터의 특정의 고정된 및 가변적인 구성요소를 예시하는 도 2에 도식화되어 있다: 반전 말단 반복부(ITR), 적어도 하나의 gRNA 서열 및 이의 발현을 구동하는 프로모터 서열, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 암호화 서열 및 이의 발현을 구동하는 또 다른 프로모터, 핵 국소화 신호(NLS) 서열, 및 RHO cDNA 서열 및 이의 발현을 구동하는 또 다른 프로모터. 이들 구성요소 각각은 본 명세서에서 상세히 논의된다. 추가의 예시적인 벡터 게놈은 이들 벡터의 특정의 고정된 및 가변적인 구성요소를 예시하는 도 3에 도식화되어 있다: 적어도 하나의 gRNA 서열 및 이의 발현을 구동하는 프로모터 서열(예를 들어, U6 프로모터), RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스 Cas9) 암호화 서열 및 이의 발현을 구동하는 또 다른 프로모터(예를 들어, 최소 RHO 프로모터), 및 RHO cDNA 서열 및 이의 발현을 구동하는 또 다른 프로모터(예를 들어, 최소 RHO 프로모터). 본 명세서에 기재된 전략에 사용하기 위한 추가의 예시적인 벡터 및 서열은 도 16 내지 도 18 및 서열번호 8 내지 11에 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 사용되는 AAV 벡터는 2018년 6월 14일에 공개된 명칭이 "Systems and Methods for One-Shot guide RNA (ogRNA) Targeting of Endogenous and Source DNA"인 제WO2018/106693호에 기재된 바와 같은 자기-제한적 벡터 시스템일 수 있고, 상기 출원의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 특정 구현예에서, 이중 벡터 시스템은 야생형 로돕신 단백질의 발현을 회복시키기 위해 돌연변이체 RHO 유전자의 발현을 넉아웃시키고, 외인성 RHO cDNA를 전달하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나의 AAV 벡터 게놈은 ITR 및 RNA-가이드 뉴클레아제 암호화 서열 및 이의 발현을 구동하는 프로모터 서열 및 하나 이상의 NLS 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 제2 AAV 벡터 게놈은 ITR, RHO cDNA 서열 및 이의 발현을 구동하는 프로모터, 하나의 gRNA 서열 및 이의 발현을 구동하는 프로모터 서열을 포함할 수 있다.
이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, RHO 유전자를 넉아웃시키고, 이를 기능적 외인성 RHO cDNA로 대체하는 것은 PR 간상 세포에서 적절한 수준의 로돕신 단백질을 유지한다. 간상체 PR 세포에서 적절한 수준의 기능적 로돕신 단백질을 회복시키는 것은 광변조 캐스케이드를 유지하고, adRP가 있는 대상체에서 PR 세포 사멸을 지연시키거나 막을 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 개시된 방법은 adRP와 관련된 RHO 유전자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 RHO 돌연변이체 유전자 또는 대립유전자의 변형체를 넉아웃시키고, 이를 필요로 하는 대상체에서, 예를 들어, adRP를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에서 야생형 RHO 단백질 발현을 회복시키는 것을 특징으로 한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 명세서에 제공된 방법은 돌연변이체 및 야생형 RHO 대립유전자를 갖는 대상체에서 돌연변이체 RHO 대립유전자를 넉아웃시키고, 간상체 PR 세포에서 야생형 로돕신 단백질의 발현을 회복시키는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 야생형 대립유전자를 그대로 두면서 돌연변이체 대립유전자를 넉아웃시키는 것이 특징이다. 다른 구현예에서, 이러한 방법은 돌연변이체 대립유전자와 야생형 대립유전자 둘 다를 넉아웃시키는 것이 특징이다. 일부 구현예에서, 방법은 RHO 유전자의 돌연변이체 대립유전자를 넉아웃시키고, 예를 들어, 야생형 RHO 단백질을 암호화하는 cDNA의 발현을 통해 외인성 야생형 단백질을 제공하는 것을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, adRP를 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에서 돌연변이체 대립유전자(및, 선택적으로, 야생형 대립유전자)의 발현을 넉아웃시키고, 예를 들어, 외인성 RHO cDNA의 발현을 통해 야생형 RHO 단백질 발현을 회복시키는 것은 adRP와 관련된 적어도 하나의 증상을 개선한다. 일부 구현예에서, 이러한 개선은, 예를 들어, 대상체의 시력을 개선하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 개선은, 예를 들어, 임상적 개입 없이 예상되는 진행과 비교하여, 예를 들어, adRP 질환 진행을 지연시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 개선은, 예를 들어, adRP 질환 진행을 저지시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 개선은, 예를 들어, 대상체에서 adRP 질환의 발병을 예방하거나 지연시키는 것을 포함한다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 생체외에서 동종 또는 자기 망막 세포를 치료하는 것을 포함한다. 구현예에서, 생체외에서 치료되는 동종 또는 자기 망막 세포가 대상체에 도입된다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 생체외에서 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포 또는 iPS 세포로부터 유래된 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포를 치료하는 것을 포함한다. 구현예에서, 생체외에서 치료된 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포가 대상체에 도입된다. 구현예에서, 상기 세포는 하나 이상의 돌연변이된 RHO 유전자를 넉아웃시키고 기능성 외인성 RHO DNA를 발현시키도록 변형되고, 망막 전구 세포 또는 망막 세포, 예를 들어, 망막 광수용체 세포로 분화되고, 대상체의 눈에, 예를 들어, 망막하로, 예를 들어, 망막의 황반하 영역에 주사되는, 유도된 다능성 줄기 세포(iPS) 세포 또는 iPS 세포로부터 유래된 세포, 예를 들어, 대상체로부터 생성된 iPS 세포이다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 생체외에서 자기 줄기 세포를 치료하는 것을 포함한다. 구현예에서, 생체외에서 치료되는 자기 줄기 세포는 대상체로 되돌아간다.
구현예에서, 대상체는 생체내에서, 예를 들어, 눈으로부터 세포(예를 들어, 망막 세포, 예를 들어, 광수용체 세포, 예를 들어, 추상체 광수용체 세포, 예를 들어, 간상체 광수용체 세포, 예를 들어, 황반 추상체 광수용체 세포)를 표적화 하는 바이러스(또는 다른 메커니즘)에 의해 치료된다.
구현예에서, 대상체는 생체내에서, 예를 들어, 줄기 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 또는 iPS 세포로부터 유래된 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포)를 표적화하는 바이러스(또는 다른 메커니즘)에 의해 치료된다.
구현예에서, 치료는 대상체에서 질환 발병 전에 개시된다. 특정 구현예에서, 치료는 RHO 유전자에서 하나 이상의 돌연변이에 대해 양성으로 검사된 대상체에서 개시된다.
구현예에서, 치료는 대상체에서 질환 발병 후에 개시된다.
구현예에서, 치료는 adRP 질환의 초기 단계에 개시된다. 구현예에서, 치료는 대상체에게 점차적으로 감소되는 시력을 나타난 후에 개시된다. 구현예에서, adRP 발병 후이지만 질환 경과의 초기에 RHO 유전자의 수선이 질환의 진행을 막을 것이다.
구현예에서, 치료는 질환의 진행 단계에 있는 대상체에서 개시된다. 이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 진행 단계의 치료는 일상 생활의 주된 기능 및 활동 수행에 있어서 중요한 대상체의 시력를 보존할 가능성이 높을 것으로(중심 시야에서) 여겨진다.
구현예에서, 대상체의 치료는 질환 진행을 예방한다. 이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 질환의 모든 단계(예를 들어, 예방적 치료, 초기 단계 adRP, 및 진행 단계 adRP)에서 대상체를 위한 치료의 개시가 RP 질환 진행을 예방하고, 대상체에게 유익할 것으로 여겨진다.
구현예에서, 치료는 대상체, 예를 들어, 유아 또는 신생아, 10대, 또는 성인이 RHO 유전자에서의 돌연변이, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 돌연변이에 양성이라는 결정 후에 개시된다.
구현예에서, 치료는 대상체가 RHO 유전자에서의 돌연변이, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 돌연변이에 대해 양성이지만, 질환의 증상이 발현되기 전이라는 결정 후에 개시된다.
구현예에서, 치료는 대상체가 RHO 유전자에서의 돌연변이, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 돌연변이에 대해 양성이지만, 질환의 증상이 발현된 후라는 결정 후에 개시된다.
구현예에서, 치료는 대상체에서 시야의 감소가 나타날 때 개시된다.
구현예에서, 치료는 대상체에서 주변 시력의 감소가 나타날 때 개시된다.
구현예에서, 치료는 대상체에서 야간 시력 저하 및/또는 야맹증이 나타날 때 개시된다.
구현예에서, 치료는 대상체에서 진행성 시력 상실이 나타날 때 개시된다.
구현예에서, 치료는 대상체에서 진행성 시야 수축이 나타날 때 개시된다.
구현예에서, 치료는 대상체의 검사 시 대상체에서 adRP와 일관된 하나 이상의 적응증이 나타날 때 개시된다. 예시적인 적응증은 골 침상 색소침착, 시야 축소, 망막 위축, 망막 혈관계 약화, 망막 색소 상피 상실, 시신경 창백, 및/또는 이들의 조합을 포함하지만, 이로 제한되는 것은 아니다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에 기재된 gRNA 또는 다른 구성성분, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자) 및 RHO cDNA 분자의 망막하 주사, 황반하 주사, 맥락막상 주사, 또는 유리체내 주사를 포함한다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 gRNA 또는 다른 구성성분, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자) 및 RHO cDNA 분자는, 예를 들어, 대상체에게 AAV, 렌티바이러스, 나노입자, 또는 파보바이러스, 예를 들어, 눈으로부터의 세포(예를 들어, 망막 세포, 예를 들어, 광수용체 세포, 예를 들어, 추상체 광수용체 세포, 예를 들어, 간상체 광수용체 세포, 예를 들어, 황반 추상체 광수용체 세포)를 표적화하도록 구성된 변형된 파보바이러스에 의해 전달된다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 gRNA 또는 다른 구성성분, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자) 및 RHO cDNA 분자는, 예를 들어, 대상체에게 AAV, 렌티바이러스, 나노입자, 또는 파보바이러스, 예를 들어, 줄기 세포(예를 들어, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포 또는 iPS 세포로부터 유래된 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포)를 표적화하도록 구성된 변형된 파보바이러스에 의해 전달된다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 gRNA 또는 다른 구성성분, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자) 및 RHO cDNA 분자는 생체외에서 전기천공에 의해 전달된다.
구현예에서, CRISPR/RNA-가이드 뉴클레아제 구성성분은 질환을 일으키는 돌연변이체 RHO 유전자를 넉아웃시키는 데 사용된다.
I. gRNA 분자
용어 가이드 RNA 및 gRNA는 세포내 게놈 또는 에피솜 서열과 같은 표적 서열에 RNA-가이드 뉴클레아제, 예컨대, Cas9 또는 Cpf1의 특이적 회합(또는 "표적화")을 촉진하는 임의의 핵산을 지칭한다. gRNA는 단분자(단일 RNA 분자를 포함하고, 다르게는 키메라로 지칭됨) 또는 모듈(하나보다 많은, 전형적으로, 2 개의 별개의 RNA 분자, 예컨대, crRNA 및 tracrRNA를 포함하고, 일반적으로 서로 예를 들어, 듀플렉스화에 의해 회합됨)일 수 있다. gRNA 및 이들의 구성성분 부분은 문헌(예를 들어, 참고로 포함되는 문헌[Briner 2014] 참조; 또한 문헌[Cotta-Ramusino] 참조) 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
박테리아 및 고세균에서, 유형 II CRISPR 시스템은 일반적으로, Cas9와 같은 RNA-가이드 뉴클레아제 단백질, 외래 서열에 상보성인 5' 영역을 포함하는 CRISPR RNA(crRNA), 및 crRNA의 3' 영역에 상보적이고 이와 듀플렉스(duplex)를 형성하는 5' 영역을 포함하는 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)를 포함한다. 이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 이러한 듀플렉스는 RNA-가이드 뉴클레아제/gRNA 복합체의 형성을 용이하게 하고, 이의 활성에 필요한 것으로 사료된다. 유형 II CRISPR 시스템은 유전자 편집에 사용하도록 조정되었기 때문에, 예를 들어, crRNA 및 tracrRNA는 crRNA(이의 3' 말단에서) 및 tracrRNA(이의 5' 말단에서)의 상보성인 영역을 가교하는 4 개 뉴클레오티드(예를 들어, GAAA) "테트라루프" 또는 "링커" 서열에 의해 단일 단분자 또는 키메라 gRNA 내로 접합될 수 있을 것으로 발견되었다(Mali 2013; Jiang 2013; Jinek 2012; 이들 모두는 본원에 참고로 포함됨).
단분자 또는 모듈식이든지 간에 가이드 RNA는 표적 서열(예를 들어, 편집이 요망되는 세포의 게놈 내 이중-가닥 DNA 서열) 내의 표적 도메인에 전체적으로 또는 부분적으로 상보성인 표적화 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, RHO 표적 서열은 RHO 표적 위치를 포괄하거나, 이를 포함하거나, 이에 근접한다. 표적화 도메인은 제한 없이 "가이드 서열"(Hsu 2013(본원에 참고로 포함)), "상보성 영역"(Cotta-Ramusino), "스페이서"(Briner 2014) 및 일반적으로 "crRNA"(Jiang 2013)를 포함하여 문헌에서 다양한 명칭으로 지칭된다. 표적화 도메인에 주어지는 명칭과는 상관없이, 표적화 도메인은 전형적으로 10 개 내지 30 개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 16 개 내지 24 개의 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 16 개, 17 개, 18 개, 19 개, 20 개, 21 개, 22 개, 23 개 또는 24 개의 뉴클레오타이드 길이)이고, Cas9 gRNA의 경우 5' 말단에 또는 근처에, 그리고 Cpf1 gRNA의 경우 3' 말단에 또는 근처에 위치한다. 표적 도메인에 상보적인 핵산 서열, 즉, 표적 도메인을 포함하는 이중 가닥 DNA의 상보성 DNA 가닥 상의 핵산 서열은 본 명세서에서 "프로토스페이서"로 지칭된다.
"프로토스페이서-인접 모티프"(PAM) 서열은 "프로토스페이서" 서열에 이의 순차적인 관계로부터 이의 명칭이 취해진다. 프로토스페이서 서열과 함께, PAM 서열은 특이적 RNA-가이드 뉴클레아제/gRNA 조합에 대한 표적 서열 및/또는 표적 위치를 지정한다. 다양한 RNA-가이드 뉴클레아제는 PAM와 프로토스페이서 사이의 상이한 순차적 관계를 필요로 할 수 잇다.
예를 들어, 일반적으로, Cas9 뉴클레아제는 프로토스페이서의 3'인 PAM 서열을 인식한다:
또 다른 예에서, 일반적으로, Cpf1은 프로토스페이서의 5'인 PAM 서열을 인식한다:
본 명세서에 기재된 일부 구현예에서, RHO 프로토스페이서 및 예시적인 적합한 표적화 도메인이 기재된다. 당업자는 RNA-가이드 뉴클레아제를 주어진 프로토스페이서, 예를 들어, 추가적인 또는 더 적은 뉴클레오타이드를 포함하거나 표적 도메인에 혼성화될 때 하나 이상의 뉴클레오타이드 미스매치를 포함하는 표적화 도메인에 표적화하는 데 사용될 수 있는 추가의 적합한 가이드 RN표적화 도메인을 알 것이다.
표적화 도메인 외에도, gRNA는 전형적으로(그러나 하기 논의된 바와 같이 반드시는 아님), gRNA/Cas9 복합체의 형성 또는 활성에 영향을 미치는 복수의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 상기 언급된 바와 같이, gRNA의 제1 및 제2 상보성 도메인에 의해 형성된 듀플렉스화된 구조(반복부:안티-반복부 듀플렉스로도 지칭됨)는 Cas9의 인식(REC) 로브(lobe)와 상호 작용하고, Cas9/gRNA 복합체의 형성을 매개할 수 있다(Nishimasu 2014; Nishimasu 2015; 둘 다는 본원에 참고로 포함됨). 제1 및/또는 제2 상보성 도메인은 하나 이상의 폴리-A 트랙을 함유할 수 있으며, 이러한 트랙은 종결 신호로서 RNA 폴리머라제에 의해 인식될 수 있음을 주지해야 한다. 따라서, 제1 및 제2 상보성 도메인의 서열은 선택적으로, 예를 들어, 문헌[Briner 2014]에 기재된 바와 같은 A-G 스왑(swap), 또는 A-U 스왑의 사용을 통해 이들 트랙을 없애고 gRNA의 완전한 시험관내 전사를 촉진하도록 변형된다. 제1 및 제2 상보성 도메인에 대한 이들 및 다른 유사한 변형은 본 개시내용의 범위 내에 있다.
제1 및 제2 상보성 도메인과 함께, Cas9 gRNA는 전형적으로 생체내에서, 반드시는 아니지만 시험관내에서 뉴클레아제 활성에 필수적인 2 개 이상의 추가의 듀플렉스화된 영역을 포함한다(Nishimasu 2015). 제2 상보성 도메인의 3' 부분 부근의 제1 스템-루프는 "근위(proximal) 도메인"(Cotta-Ramusino), "스템 루프 1"(Nishimasu 2014 및 2015) 및 "넥서스(nexus)"(Briner 2014)로서 다양하게 지칭된다. 하나 이상의 추가의 스템 루프 구조는 일반적으로, gRNA의 3' 말단 근처에 존재하고, 이때 그 수는 종에 따라 다양하다: 스트렙토코커스 피오게네스 gRNA는 전형적으로 2 개의 3' 스템 루프(반복부:안티-반복부 듀플렉스를 포함하여 총 4 개의 스템 루프 구조에 대해)를 포함하는 한편, 스타필로코커스 아우레우스 및 다른 종들은 단지 1 개만 갖는다(총 3 개의 스템 루프 구조에 대해). 종에 의해 구조화된 보존된 스템 루프 구조(및 보다 일반적으로 gRNA 구조)의 설명은 문헌[Briner 2014]에 제공된다.
당업자는 gRNA가 다수의 방식으로 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이고, 이들 중 일부가 후술되며, 이들 변형은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 본 개시내용에서 제시의 효율을 위해, gRNA는 이들의 표적화 도메인 서열에 대해서만 참조로 제시될 수 있다.
gRNA 변형
gRNA의 활성, 안정성 또는 다른 특징은 화학적 및/또는 순차적 변형의 혼입을 통해 변경될 수 있다. 일례로서, 일시적으로 발현되거나 전달되는 핵산은, 예를 들어, 세포성 뉴클레아제에 의한 분해에 취약할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 gRNA는 뉴클레아제에게 안정성을 도입하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 본 명세서에 기재된 소정의 변형된 gRNA는 세포의 집단 내, 특히, 본 발명의 세포 내에 도입시, 감소된 선천적 면역 반응을 나타낼 수 있는 것으로 여겨지기도 한다. 상기 언급된 바와 같이, 용어 "선천성 면역 반응"은 사이토카인 발현 및 방출, 특히, 인터페론, 및 세포 사멸의 유도를 수반하는, 일반적으로 바이러스 또는 박테리아 기원의 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함한다.
하나의 일반적인 3' 말단 변형은 하나 이상(및 전형적으로 5 개 내지 200 개)의 아데닌(A) 잔기를 포함하는 폴리 A 트랙의 첨가이다. 폴리 A 트랙은 gRNA를 암호화하는 핵산 서열에 함유될 수 있거나, 화학적 합성 동안, 또는 시험관내에서 전사 후에 폴리아데노신 폴리머라제(예를 들어, 에스케리치아 콜라이 폴리(A)폴리머라제)를 사용하여, gRNA에 첨가될 수 있다. 생체내에서, 폴리-A 트랙은 폴리아데닐화 신호의 사용을 통해 DNA 벡터로부터 전사된 서열에 첨가될 수 있다. 이러한 신호의 예는 Maeder에 제공되어 있다.
본 발명의 RNA-가이드 뉴클레아제 기술의 맥락에서 유용한 일부 예시적인 gRNA 변형이 본 명세서에 제공되고, 당업자는 본 개시내용에 기초하여 본 명세서에 개시된 gRNA 및 치료 양식과 함께 사용될 수 있는 추가의 적합한 변형을 확인할 수 있을 것이다. 적합한 gRNA 변형은, 제한 없이, 미국 특허 출원 제US 2017/0073674 A1호 및 국제 공개 제WO 2017/165862 A1호에 기재된 것들을 포함하며, 이들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
II. gRNA의 설계 방법
표적 도메인을 선택, 설계 및 확인하기 위한 gRNA의 설계방법이 본 명세서에 기재된다. 예시적인 표적화 도메인이 또한 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에서 논의되는 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 gRNA 내로 혼입될 수 있다.
표적 부위의 선택 및 확인 방법뿐만 아니라 표적을 벗어난 분석은, 예를 들어, 문헌[Mali 2013; Hsu 2013; Fu 2014; Heigwer 2014; Bae 2014; Xiao 2014]에 기재된다.
예를 들어, 사용자의 표적 부위 내에서 gRNA의 선택을 최적화하기 위해, 예를 들어, 게놈에 걸쳐 총 표적을 벗어난 활성을 최소화하기 위해 소프트웨어 툴이 사용될 수 있다. 표적을 벗어난 활성은 절단이 아닐 수 있다. 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9를 이용하는 각각의 가능한 gRNA 선택에 대해, 툴은 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10)까지의 미스매칭된 염기쌍을 함유하는 게놈에 걸쳐 모든 표적을 벗어난 부위(상술한 NAG 또는 NGG PAM 중 하나)을 동정할 수 있다. 각각의 표적을 벗어난 부위에서 절단 효능은, 예를 들어, 실험적으로 유도된 가중치 계획을 이용하여 예측될 수 있다. 이어서, 각각의 가능한 gRNA는 그것의 전체 예측된 표적을 벗어난 절단에 따라 랭킹되고; 전체 랭킹된 gRNA는 가장 큰 표적 상의 절단 및 가장 적은 표적을 벗어난 절단을 가질 가능성이 있는 것을 나타낸다. 다른 기능, 예를 들어, CRISPR 구성을 위한 자동화된 시약 설계, 표적 상의 서베이어(Surveyor) 분석을 위한 프라이머 설계 및 고속대량 검출을 위한 프라이머 설계 및 차세대 시퀀싱(next-gen sequencing)을 통한 표적을 벗어난 절단의 정량화가 또한 툴에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 논의되는 표적화 도메인은 본 명세서에 기재된 gRNA 내로 혼입될 수 있다.
예시적인 프로토스페이서 및 표적화 도메인
스타필로코커스 아우레우스 Cas9와 사용하기 위한 RHO 유전자 내의 다양한 위치를 표적화하는 가이드 RNA가 확인되었다. 확인 후, gRNA는 3 개의 티어로 순위가 매겨졌다. 티어 1에서 gRNA는 RHO 유전자의 엑손 1 및 엑손 2에서의 절단을 기초로 선택되었다. 티어 1 가이드는 T-세포에서 >9% 편집을 나타냈다. 티어 2 gRNA의 선택을 위해, 선택은 RHO 유전자의 5' UTR에서의 절단을 기초로 했다. 티어 2 gRNA는 T-세포에서 >10% 편집을 나타냈다. 티어 3 gRNA는 RHO 유전자의 인트론 1에서의 절단을 기초로 선택되었다. 티어 3 gRNA는 T-세포에서 >10% 편집을 나타냈다.
표 1은 제1-티어 매개변수에 따라 선택된 RHO 유전자에서 엑손 1 또는 엑손 2 RHO 표적 위치에 대한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 RHO 유전자의 엑손 1 또는 엑손 2에서의 절단 및 T-세포에서 >9% 편집을 나타내는 것을 기초로 선택되었다. 본 명세서에서 표적화 도메인은 상보적 염기쌍 형성을 통해 제공된 표적 도메인 서열에 상보적인 가닥에 혼성화된다는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 절단을 제공하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 사용될 수 있다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단일 가닥 파손 뉴클레아제(틈내기효소)와 사용될 수 있다.
[표 1]
표 2는 제2-티어 매개변수에 따라 선택된 RHO 유전자에서 5'UTR RHO 표적 위치에 대한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 RHO 유전자의 5' UTR 영역에서의 절단 및 T-세포에서 >10% 편집을 나타내는 것을 기초로 선택되었다. 본 명세서에서 표적화 도메인은 상보적 염기쌍 형성을 통해 표적 도메인에 혼성화된다는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 절단을 제공하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 사용될 수 있다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단일 가닥 파손 뉴클레아제(틈내기효소)와 사용될 수 있다.
[표 2]
표 3은 제3-티어 매개변수에 따라 선택된 RHO 유전자에서 인트론 1 RHO 표적 위치에 대한 표적화 도메인을 제공한다. 표적화 도메인은 RHO 유전자의 인트론 1에서의 절단 및 T-세포에서 >10% 편집을 나타내는 것을 기초로 선택되었다. 본 명세서에서 표적화 도메인은 상보적 염기쌍 형성을 통해 표적 도메인에 혼성화된다는 것이 상정된다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 절단을 제공하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 분자와 사용될 수 있다. 표에서 임의의 표적화 도메인은 이중 가닥 절단을 제공하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단일 가닥 파손 뉴클레아제(틈내기효소)와 사용될 수 있다.
[표 3]
III. RNA-가이드 뉴클레아제
본 개시내용에 따른 RNA-가이드 뉴클레아제는 천연 클래스 2 CRISPR 뉴클레아제, 예컨대, Cas9, 및 Cpf1뿐만 아니라 그로부터 유래되거나 얻어진 다른 뉴클레아제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 기능적 의미에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 (a) gRNA와 상호작용(예를 들어, 복합체화)하고; (b) gRNA와 함께, (i) gRNA의 표적화 도메인에 상보성인 서열 및 선택적으로 (ii) 하기에서 더욱 상세하게 기재되는 "프로토스페이서 인접 모티프" 또는 "PAM"으로 지칭되는 추가적 서열을 포함하는 DNA의 표적 영역과 결합하고, 선택적으로 절단하거나 변형하는 뉴클레아제로서 정의된다. 다음의 예에 예시되는 바와 같이, RNA-가이드 뉴클레아제는 광범위한 의미에서, 동일한 PAM 특이성 또는 절단 활성을 공유하는 개개의 RNA-가이드 뉴클레아제 간에 변화가 존재할 수는 있지만, 그의 PAM 특이성 및 절단 활성에 의해 정의될 수 있다. 당업자는 본 개시내용의 일부 양태가 특정 PAM 특이성 및/또는 절단 활성을 갖는 임의의 적절한 RNA-가이드 뉴클레아제를 사용하여 구현될 수 있는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것임을 이해할 것이다. 이러한 이유로, 달리 명시되지 않는 한, 용어 RNA-가이드 뉴클레아제는 일반적인 용어로서 이해되어야 하며, 임의의 특정 유형(예를 들어, Cas9 대 Cpf1), 종(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 대 스타필로코커스 아우레우스) 또는 변화(예를 들어, 전장의 것 대 절두된 것 또는 분할된 것; 천연 PAM 특이성 대 조작된 PAM 특이성)에 제한되지 않아야 한다.
PAM 서열로 돌아가서, 이러한 구조는 gRNa 표적화 도메인(또는 "스페이서")에 상보적인 "프로토스페이서" 서열에 대한 그의 순차적 관계로부터 이의 명칭을 갖는다. 프로토스페이서 서열과 함께, PAM 서열은 특이적 RNA-가이드 뉴클레아제/gRNA 조합에 대한 표적 영역 또는 서열을 정의한다.
다양한 RNA-가이드 뉴클레아제는 PAM와 프로토스페이서 사이의 상이한 순차적 관계를 필요로 할 수 잇다. 일반적으로, Cas9는 상부 또는 상보성 가닥에 비해 보이는 바와 같이 프로토스페이서의 5'인 PAM 서열을 인식한다.
PAM 및 프로토스페이서의 특이적인 순차적 배향을 인식하는 것 이외에, RNA-가이드 뉴클레아제는 일반적으로 특이적 PAM 서열을 인식할 수 있다. 스타필로코커스 아우레우스 Cas9는, 예를 들어, NNGRRT의 PAM 서열을 인식하며, N 서열은 gRNA 표적화 도메인에 의해 의해 인식되는 영역의 3'의 바로 옆에 존재한다. 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9는 NGG PAM 서열을 인식한다. 또한, 조작된 RNA-가이드 뉴클레아제는 유사한 뉴클레아제(예컨대, RNA-가이드 뉴클레아제가 유래한 천연 변이체, 또는 조작된 RNA-가이드 뉴클레아제에 대해 최대 아미노산 서열 상동성을 갖는 천연 변이체)의 PAM 특이성과 상이한 PAM 특이성을 가질 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 대체 PAM 서열을 인식하는 변형된 Cas9는 후술된다.
RNA-가이드 뉴클레아제는 또한 그의 DNA 절단 활성을 특징으로 한다: 천연 RNA-가이드 뉴클레아제는 통상적으로 표적 핵산 내에 DSB를 형성하지만, SSB(상기에서 논의됨; 또한 본 명세서에 참고로 포함되는 문헌[Ran 2013] 참조)만을 발생시키거나, 전혀 절단하지 않는 조작된 변이체를 생성하였다.
용어 "RNA-가이드 뉴클레아제" 및 "RNA-가이드 뉴클레아제 분자"는 본 명세서에서 상호호환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 RNA-가이드 DNA 엔도뉴클레아제 효소이다. 일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 CRISPR 뉴클레아제이다. 본 명세서에 제공된 방법, 전략 및 치료 양식의 맥락에서 사용하기에 적합한 RNA-가이드 뉴클레아제의 예는 하기 표 4에 열거되어 있으며, 본 명세서에 개시된 방법, 조성물 및 치료 양식은, 일부 구현예에서, 본 명세서에 개시되거나 당업자에게 공지된 RNA-가이드 뉴클레아제의 임의의 조합을 이용할 수 있다.
[표 4]
RNA-가이드 뉴클레아제
일 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 아시다미노코쿠스 종 Cpf1 RR 변이체(AsCpf1-RR)이다. 또 다른 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 Cpf1 RVR 변이체이다.
표적화 도메인 및 가이드 RNA를 설계하기 위한, 뿐만 아니라 게놈 편집 접근의 맥락에서 다양한 Cas 뉴클레아제의 사용을 위한 예시적인 적합한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일부 예시적인 방법이 본 명세서에 개시되며, 추가의 적합한 방법이 본 개시내용을 기초로 당업자에게 자명할 것이다. 개시내용은 이와 관련하여 제한되지 않는다.
IV.
RHO
게놈 서열 및 상보성 DNA 서열
RHO 게놈 서열은 당업자에게 공지되어 있다. 예시적인 RHO 게놈 서열은 참조의 용이함을 위해 하기에서 제공된다:
(서열번호 1)
RHO 게놈 서열은 하기와 같이 주석을 달 수 있다.
본 명세서의 다른 곳에서 보다 상세하게 기재되는 예시적인 표적 도메인은 예시의 목적으로 하기에서 표 5에 제공된다.
[표 5]
다양한 RHO cDNA 서열이 본 명세서에서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 외인성 기능적 RHO cDNA를 제공하기 위해 전달될 수 있다.
야생형 RHO cDNA의 예시적인 핵산 서열이 하기에 제공된다:
(서열번호 2)
특정 구현예에서, RHO cDNA는 발현을 증가시키도록 코돈-최적화될 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 gRNA 표적화 도메인과의 혼성화에 내성이 되도록 코돈-변형될 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 gRNA 표적화 도메인과의 혼성화에 내성이 되도록 코돈-변형되지 않는다.
코돈 최적화 RHO cDNA의 예시적인 핵산 서열이 하기에 제공된다:
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 1 (코돈 1):
(서열번호 13)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 2 (코돈 2):
(서열번호 14)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 3 (코돈 3):
(서열번호 15)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 4 (코돈 4):
(서열번호 16)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 5 (코돈 5):
(서열번호 17)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 6 (코돈 6):
(서열번호 18)
특정 구현예에서, RHO cDNA는 변형된 5' UTR, 변형된 3'UTR, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, RHO cDNA는 절두 5' UTR, 절두 3'UTR, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 공지된 안정한 메신저 RNA(mRNA)로부터 3'UTR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, RHO cDNA는 RHO 암호화 서열의 하류에 이종성 3'-UTR을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, RHO cDNA는 α-글로빈 3' UTR을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 β-글로빈 3' UTR을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 하나 이상의 인트론의 절두를 포함할 수 있다.
RHO cDNA의 전사체를 안정화시키는 데 사용될 수 있는 예시적인 적합한 이종성 3'-UTR은 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
(서열번호 38)
(서열번호 39)
(서열번호 40)
(서열번호 41)
(서열번호 42)
특정 구현예에서, RHO cDNA는 하나 이상의 인트론을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 하나 이상의 인트론의 절두를 포함할 수 있다.
하기 표 6은 인트론을 함유하는 RHO cDNA의 예시적인 서열을 제공한다.
[표 6]
V. 게놈 편집 접근
일부 구현예에서, RHO 유전자는 본 명세서에서 논의되는 접근들 중 하나를 이용하여 변경된다.
RHO
의 NHEJ-매개 넉아웃
본 개시내용의 일부 양태는 RNA-가이드 뉴클레아제, 예를 들어, RHO 표적 서열, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 표적 서열에 대한 Cas9 또는 Cpf1 뉴클레아제를 표적화하고/하거나 본 명세서에 기재된 가이드 RNA를 사용하는 것을 특징으로 하는 전략, 방법, 조성물 및 치료 양식을 제공하고, 여기서 RNA-가이드 뉴클레아제는 RHO 표적 서열에서 또는 근처에서 RHO 게놈 DNA를 절단하여 절단된 게놈 DNA의 NHEJ-매개 수선을 초래한다. 이러한 NHEJ-매개 수선의 결과는 전형적으로 절단 부위에서의 인델의 형성이며, 이는 이어서 절단된 RHO 유전자의 기능 상실을 초래한다. 기능 상실은 유전자 산물, 예를 들어, RHO 유전자의 경우에, RHO 유전자 산물, 예를 들어, RHO 전사체 또는 RHO 단백질의 발현의 감소 또는 완전한 소멸, 또는 야생형 유전자 산물의 기능을 나타내지 않는 유전자 산물의 발현을 특징으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, RHO 유전자의 기능 상실은 더 낮은 수준의 기능적 RHO 단백질 발현을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, RHO 유전자의 기능 상실은 RHO 유전자로부터 RHO 단백질을 발현의 소멸을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 돌연변이체 RHO 유전자 또는 대립유전자의 기능 상실은 암호화된 돌연변이체 RHO 단백질의 감소된 발현, 또는 발현의 중지를 특징으로 한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 뉴클레아제-유도 비-상동성 말단-결합(NHEJ)은 표적 위치에서 인델을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 뉴클레아제-유도 NHEJ는 또한 관심 대상의 유전자의 표적 위치에 돌연변이를 포함하는 게놈 서열을 제거(예를 들어, 결실)하기 위해 사용될 수 있다.
이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법과 관련된 게놈 변경은 뉴클레아제-유도 NHEJ 및 NHEJ 수선 경로의 오류 유발 특성에 의존한다고 여겨진다. NHEJ는 2 개의 말단과 함께 결합함으로써 DNA 내 이중가닥 파손을 수선하고; 그러나, 일반적으로, 본래의 서열은 두 적합성 말단이 그들이 이중 가닥 파손에 의해 형성됨에 따라 완전히 결찰되어야만 복구된다. 이중-가닥 파손의 DNA 말단은 빈번하게는 효소적 가공 대상이며 말단의 재결합 전에 하나 또는 둘 다의 가닥에서 뉴클레오타이드의 첨가 또는 제거를 초래한다. 이는 NHEJ 수선 부위에서 DNA 서열에서 삽입 및/또는 결실(인델) 돌연변이의 존재를 초래한다.
NHEJ에 의해 생성된 인델 돌연변이는 천연에서 예측 불가능하지만; 그러나, 주어진 파손 부위에서 특정 인델 서열이 선호되며 집단에서 지나치게 표시되는데, 이는 마이크로상동성의 소 영역에 기인할 가능성이 있다. 결실의 길이는 가장 통상적으로는 1 bp 내지 50 bp 범위에서 크게 다를 수 있지만, 그들은 100 bp 내지 200 bp 초과로 용이하게 도달할 수 있다. 삽입은 더 짧게 되는 경향이 있으며, 종종 파손 부위를 바로 둘러싸는 서열의 짧은 중복을 포함한다. 그러나, 이는 큰 삽입을 얻을 수 있고, 이 경우에 삽입된 서열은 종종 게놈의 다른 영역에 대해 또는 세포 내에 존재하는 플라스미드 DNA에 대해 추적되었다.
NHEJ는 돌연변이유발 과정이기 때문에, 이는 또한 특이적 최종 서열의 생성이 필요하지 않다면, 작은 서열 모티프를 결실시키는 데 사용될 수 있다. 이중-가닥 파손이 특이적 서열 모티프 근처에서 표적화된다면, NHEJ 수선에 의해 야기되는 결실 돌연변이는 종종 걸쳐서 이어지고, 따라서 원치 않는 뉴클레오타이드를 제거한다. 더 큰 DNA 세그먼트의 결실을 위해, 두 이중-가닥 파손을 도입시키는 것은(서열의 각 측면 상에서 하나씩) 전체 개재 서열의 제거에 의해 말단들 사이에 NHEJ를 초래할 수 있다. 이들 접근은 둘 다 특이적 DNA 서열을 결실시키기 위해 사용될 수 있고; 그러나, NHEJ의 오류-유발 특성은 여전히 수선 부위에서 인델 돌연변이를 생성할 수 있다.
RNA-가이드 뉴클레아제를 절단하는 이중 가닥과 단일 가닥 둘 다, 또는 틈내기효소, RNA-가이드 뉴클레아제는 파손-유도 인델을 생성하기 위해 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있다.
일부 예시적인 적합한 가이드 RNA, RNA-가이드 뉴클레아제, 전달 방법, 및 이러한 방법과 관련된 다른 양태와 같이 RHO 유전자의 NHEJ-매개 넉아웃이 특징인 일부 예시적인 방법이 본 명세서에 제공된다. 추가의 적합한 방법, 가이드 RNA, RNA-가이드 뉴클레아제, 전달 방법 등은 본 개시내용을 기초로 당업자에게 명백할 것이다.
HDR 수선 및 주형 핵산
본 명세서에 기재된 바와 같이, 특정 구현예에서, 뉴클레아제-유도 상동성 지향 수선(HDR)은 돌연변이체 RHO 유전자의 표적 위치를 변경(예를 들어, 넉아웃)시키고, 야생형 RHO 서열로 돌연변이 RHO 유전자를 대체하기 위해 사용될 수 있다. 이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 표적 위치의 변경은 도너 주형 또는 주형 핵산에 의한 상동성 지향 수선(HDR)에 의해 일어난다고 여겨진다. 예를 들어, 도너 주형 또는 주형 핵산은 표적 위치의 변경을 제공한다. 플라스미드 도너는 상동성 재조합을 위한 주형으로서 사용될 수 있다는 것이 상정된다. 추가로, 단일 가닥 도너 주형은 절단 서열과 도너 주형 사이의 상동성 지향 수선(예를 들어, 단일 가닥 어닐링)의 대안의 방법에 의해 표적 서열의 변경을 위한 주형으로서 사용될 수 있다는 것이 추가로 상정된다. 표적 서열의 도너 주형-달성 변경은 RNA-가이드 뉴클레아제 분자에 의한 절단에 의존한다. RNA-가이드 뉴클레아제 분자에 의한 절단은 이중 가닥 파손 또는 2 개의 단일 가닥 파손을 포함할 수 있다.
주형 핵산을 사용하여 HDR에 의해 야생형 RHO로 대체될 수 있는 돌연변이체 RHO 유전자는 점 돌연변이, 돌연변이 핫스팟 또는 서열 삽입을 포함하는 돌연변이체 RHO 유전자를 포함한다. 구현예에서, 점 돌연변이 또는 돌연변이 핫스팟(예를 들어, 약 30 bp 미만, 예를 들어, 25 bp, 20 bp, 15 bp, 10 bp 또는 5 bp 미만의 돌연변이 핫스팟)을 갖는 돌연변이체 RHO 유전자는 단일 이중-가닥 파손 또는 2 개의 이중 가닥 파손 중 어느 하나에 의해 변경(예를 들어, 넉아웃)될 수 있다. 구현예에서, 점 돌연변이 또는 돌연변이 핫스팟(예를 들어, 약 30 bp 초과, 예를 들어, 35 bp, 40 bp, 45 bp, 50 bp, 75 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 300 bp, 400 bp 또는 500 bp 초과의 돌연변이 핫스팟) 또는 삽입을 갖는 돌연변이체 RHO 유전자는 (1) 단일 이중-가닥 파손, (2) 2 개의 단일 가닥 파손, (3) 표적 위치의 각 측면 상에서 일어나는 파손을 지니는 2 개의 이중 가닥 파손, 또는 (4) 표적 위치의 각 측면에서 일어나는 단일 가닥 파손 쌍에 의한 4 개의 단일 가닥 파손에 의해 변경(예를 들어, 넉아웃)될 수 있다.
HDR에 의해 변경(예를 들어, 넉아웃)되고, 주형 핵산으로 대체될 수 있는, 돌연변이체 RHO 유전자는 표 A의 것들, 예컨대, P23, 예를 들어, P23H 또는 P23L, T58, 예를 들어, T58R 및 P347, 예를 들어, P347T, P347A, P347S, P347G, P347L 또는 P347R을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
이중 가닥 파손 매개 변경
구현예에서, 이중 가닥 절단은 RNA-가이드 뉴클레아제에 의해 영향을 받는다. 특정 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제는 HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성 및 RuvC-유사 도메인, 예를 들어, N-말단의 RuvC-유사 도메인, 예를 들어, 야생형 Cas9와 관련된 절단 활성을 갖는 Cas9 분자일 수 있다. 그러한 구현예는 단지 하나의 단일 gRNA를 필요로 한다.
단일 가닥 파손 매개 변경
다른 구현예에서, 2 개의 단일 가닥 파손, 또는 틈내기는 틈내기효소 활성, 예를 들어, HNH-유사 도메인과 관련된 절단 활성 또는 N-말단의 RuvC-유사 도메인과 관련된 절단 활성을 갖는 Cas9 분자에 의해 영향을 받는다. 이러한 구현예는 2 개의 gRNA, 즉, 각각의 단일 가닥 파손의 배치를 위한 것을 필요로 한다. 구현예에서, 틈내기효소 활성을 갖는 Cas9 분자는 gRNA에 혼성화하지만 gRNA에 혼성화하는 가닥에 상보성인 가닥은 아닌 가닥을 절단한다. 구현예에서, 틈내기효소 활성을 갖는 Cas9 분자는 gRNA에 혼성화하는 가닥은 절단하지 않고, 오히려 gRNA에 혼성화하는 가닥에 상보성인 가닥을 절단한다.
구현예에서, 틈내기효소는 HNH 활성, 예를 들어, 불활성화된 RuvC 활성을 갖는 Cas9 분자, 예를 들어, D10에서 돌연변이, 예를 들어, D10A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자를 가진다. D10A는 RuvC를 불활성화시키며; 따라서, Cas9 틈내기효소는 (단지) HNH 활성을 가지고, gRNA에 혼성화하는 가닥(가닥 상 NGG PAM을 갖지 않는 상보적 가닥) 상에서 절단될 것이다. 다른 구현예에서, H840, 예를 들어, H840A 돌연변이를 갖는 Cas9 분자는 틈내기 효소로서 사용될 수 있다. H840A는 HNH를 불활성화시키며; 따라서, Cas9 틈내기효소는 (단지) RuvC 활성을 가지고, 비-상보적 가닥(NGG PAM을 갖고, 이의 서열이 gRNA와 동일한 가닥) 상에서 절단된다.
구현예에서, 틈내기효소 및 2 개의 gRNA는 2 개의 단일 가닥 틈에 위치되도록 사용되며, 하나의 틈은 표적 핵산의 + 가닥 상에 있고, 하나의 틈은 표적 핵산의 - 가닥 상에 있다. PAM은 표면상으로 접해있다. gRNA는 약 0 개 내지 50 개, 0 개 내지 100 개, 또는 0 개 내지 200 개의 뉴클레오타이드에 의해, 이로부터 분리되도록 gRNA가 선택될 수 있다. 구현예에서, 두 gRNA의 표적화 도메인에 상보성인 표적 도메인들 간에는 중복이 없다. 구현예에서, gRNA는 중복되지 않으며, 50 개, 100 개 또는 200 개의 뉴클레오타이드만큼 분리된다. 구현예에서, 두 gRNA의 사용은, 예를 들어, 표적을 벗어난 결합을 감소시킴으로써 특이성을 증가시킬 수 있다(Ran 2013).
구현예에서, HDR을 유도하기 위해 단일 틈이 사용될 수 있다. 본 명세서에서 주어진 절단 부위에서 HR 대 NHEJ의 비를 증가시키기 위해 단일 틈이 사용될 수 있다는 것이 상정된다.
표적 위치에 대한 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손의 배치
가닥 중 하나에서 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손은 변경이 일어나도록 표적 위치에 충분히 가까워야 한다. 구현예에서, 거리는 50 개, 100 개, 200 개, 300 개, 350 개 또는 400 개 이하의 뉴클레오타이드이다. 이론에 의해 구속되지 않지만, 파손이 말단 절제 동안 엑소뉴클레아제-매개 제거를 거치는 영역 내에 있도록 파손은 표적 위치에 충분히 가까워야 한다고 여겨진다.
구현예에서, gRNA(단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA) 및 RNA-가이드 뉴클레아제가 HDR-매개 대체를 유도할 목적을 위해 이중 가닥 파손을 유도하는 경우, 절단 부위는 표적 위치에서 0 bp 내지 200 bp(예를 들어, 0 bp 내지 175 bp, 0 bp 내지 150 bp, 0 bp 내지 125 bp, 0 bp 내지 100 bp, 0 bp 내지 75 bp, 0 bp 내지 50 bp, 0 bp 내지 25 bp, 25 bp 내지 200 bp, 25 bp 내지 175 bp, 25 bp 내지 150 bp, 25 bp 내지 125 bp, 25 bp 내지 100 bp, 25 bp 내지 75 bp, 25 bp 내지 50 bp, 50 bp 내지 200 bp, 50 bp 내지 175 bp, 50 bp 내지 150 bp, 50 bp 내지 125 bp, 50 bp 내지 100 bp, 50 bp 내지 75 bp, 75 bp 내지 200 bp, 75 bp 내지 175 bp, 75 bp 내지 150 bp, 75 bp 내지 125 bp, 75 bp 내지 100 bp)만큼 떨어져 있다. 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치에서 0 bp 내지 100 bp(예를 들어, 0 bp 내지 75 bp, 0 bp 내지 50 bp, 0 bp 내지 25 bp, 25 bp 내지 100 bp, 25 bp 내지 75 bp, 25 bp 내지 50 bp, 50 bp 내지 100 bp, 50 bp 내지 75 bp 또는 75 bp 내지 100 bp)만큼 떨어져 있다.
구현예에서, Cas9 틈내기효소와 복합체화를 이루는 2 개의 gRNA(독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA)가 HDR-매개 대체를 유도할 목적을 위해 2 개의 단일 가닥 파손을 유도하는 경우, 더 가까운 틈은 표적 위치로부터 0 bp 내지 200 bp(예를 들어, 0 bp 내지 175 bp, 0 bp 내지 150 bp, 0 bp 내지 125 bp, 0 bp 내지 100 bp, 0 bp 내지 75 bp, 0 bp 내지 50 bp, 0 bp 내지 25 bp, 25 bp 내지 200 bp, 25 bp 내지 175 bp, 25 bp 내지 150 bp, 25 bp 내지 125 bp, 25 bp 내지 100 bp, 25 bp 내지 75 bp, 25 bp 내지 50 bp, 50 bp 내지 200 bp, 50 bp 내지 175 bp, 50 bp 내지 150 bp, 50 bp 내지 125 bp, 50 bp 내지 100 bp, 50 bp 내지 75 bp, 75 bp 내지 200 bp, 75 bp 내지 175 bp, 75 bp 내지 150 bp, 75 bp 내지 125 bp, 75 bp 내지 100 bp)만큼 떨어져 있고, 2 개의 틈은 이상적으로는 서로 25 bp 내지 55 bp 내에(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 30 bp 내지 45 bp, 30 bp 내지 40 bp, 30 bp 내지 35 bp, 35 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 35 bp 내지 40 bp, 40 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 45 bp) 있고 서로로부터 100 bp 이하만큼 떨어질 것이다(예를 들어, 서로로부터 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp, 10 bp 또는 5 bp 이하만큼 떨어짐). 구현예에서, 절단 부위는 표적 위치로부터 0 bp 내지 100 bp(예를 들어, 0 bp 내지 75 bp, 0 bp 내지 50 bp, 0 bp 내지 25 bp, 25 bp 내지 100 bp, 25 bp 내지 75 bp, 25 bp 내지 50 bp, 50 bp 내지 100 bp, 50 bp 내지 75 bp 또는 75 bp 내지 100 bp)만큼 떨어져 있다.
일 구현예에서, 2 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 양측 상에 이중 가닥 파손을 위치시키도록 구성된다. 대안의 구현예에서, 3 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에 이중 가닥 파손(즉, Cas9 뉴클레아제와 하나의 gRNA 복합체) 및 2 개의 단일 가닥 파손 또는 짝지어진 단일 가닥 파손(즉, Cas9 틈내기효소와 2 개의 gRNA 복합체)을 위치시키도록 구성된다. 다른 구현예에서, 4 개의 gRNA, 예를 들어, 독립적으로, 단분자(또는 키메라) 또는 모듈 gRNA는 표적 위치의 측면 중 하나 상에서 단일 가닥 파손의 두 쌍(즉, Cas9 틈내기효소와의 2 개의 gRNA 복합체의 두 쌍)을 생성하도록 구성된다. 이중 가닥 파손(들) 또는 쌍에서 두 단일 가닥 틈 중 더 가까운 것은 이상적으로는 표적 위치의 0 bp 내지 500 bp(예를 들어, 표적 위치로부터 450 bp, 400 bp, 350 bp, 300 bp, 250 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 50 bp 또는 25 bp 이하) 내에 있다. 틈내기효소가 사용될 때, 쌍에서 두 틈은 서로 25 bp 내지 55 bp(예를 들어, 25 bp 내지 50 bp, 25 bp 내지 45 bp, 25 bp 내지 40 bp, 25 bp 내지 35 bp, 25 bp 내지 30 bp, 50 bp 내지 55 bp, 45 bp 내지 55 bp, 40 bp 내지 55 bp, 35 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 55 bp, 30 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 50 bp, 40 bp 내지 50 bp, 45 bp 내지 50 bp, 35 bp 내지 45 bp, 또는 40 bp 내지 45 bp) 내에 있고, 서로로부터 100 bp 이하(예를 들어, 90 bp, 80 bp, 70 bp, 60 bp, 50 bp, 40 bp, 30 bp, 20 bp 또는 10 bp 이하)로 떨어져 있다.
상동성 암(arm)의 길이
상동성 암은 말단 절제가 적어도, 예를 들어, 도너 주형 내에서 절제된 단일 가닥 돌출부가 상동성 영역을 발견하게 하도록 일어날 수 있는 영역만큼 멀게 연장되어야 한다. 전체 길이는 플라스미드 크기 또는 바이러스 패키징 제한과 같은 매개변수에 의해 제한될 수 있었다. 구현예에서, 상동성 암은 반복된 구성요소, 예를 들어, ALU 반복부, LINE 반복부 내로 연장되지 않는다.
예시적인 상동성 암 길이는 적어도 50 개, 100 개, 250 개, 500 개, 750 개 또는 1000 개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적 위치는 Cas9 분자-의존적 과정에 의해 변형되는 표적 핵산(예를 들어, RHO 유전자) 상의 부위를 지칭한다. 예를 들어, 표적 위치는 표적 핵산의 변형된 Cas9 분자 절단 및 주형 핵산 지향 변형, 예를 들어, 표적 위치의 변경일 수 있다. 구현예에서, 표적 위치는, 예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오타이드가 첨가되는 표적 핵산 상의 두 뉴클레오타이드, 예를 들어, 인접한 뉴클레오타이드 사이의 부위일 수 있다. 표적 위치는 변경된, 예를 들어, 주형 핵산에 의해 넉아웃되는 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 구현예에서, 표적 위치는 표적 도메인(예를 들어, gRNA가 결합하는 서열) 내이다. 구현예에서, 표적 위치는 표적 도메인(예를 들어, gRNA가 결합하는 서열)의 상류 또는 하류이다.
본 명세서에서 사용되는 용어로서 주형 핵산은 표적 위치 구조를 변경시키는 RNA-가이드 뉴클레아제 분자 및 gRNA 분자와 함께 사용될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 구현예에서, 표적 핵산은 통상적으로 절단 부위(들)에서 또는 근처에서 주형 핵산 서열의 일부 또는 모두를 갖도록 변형된다. 구현예에서, 주형 핵산은 단일 가닥이다. 대안의 구현예에서, 주형 핵산은 이중 가닥이다. 구현예에서, 주형 핵산은 DNA, 예를 들어, 이중 가닥 DNA이다. 대안의 구현예에서, 주형 핵산은 단일 가닥 DNA이다. 구현예에서, 주형 핵산은 Cas9 및 gRNA와 동일한 벡터 백본, 예를 들어, AAV 게놈, 플라스미드 DNA 상에서 암호화된다. 구현예에서, 주형 핵산은 생체내에서 벡터 백본으로부터 절제되고, 예를 들어, 이는 gRNA 인식 서열에 측접한다.
구현예에서, 주형 핵산은 상동성 지향 수선 사건에 참여함으로써 표적 위치 구조를 변경시킨다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 위치 서열을 변경시킨다. 구현예에서, 주형 핵산은 표적 핵산 내로 변형된 또는 비천연 유래 염기의 혼입을 초래한다.
통상적으로, 주형 서열은 표적 서열에 의한 파손 매개 또는 촉매된 재조합을 겪는다. 구현예에서, 주형 핵산은 eaCas9 매개 절단 사건에 의해 절단된 표적 서열 상의 부위에 대응하는 서열을 포함한다. 구현예에서, 주형 핵산은 제1 Cas9 매개 사건에서 절단된 표적 서열 상의 제1 부위와 제2 Cas9 매개 사건에서 절단된 표적 서열 상의 제2 부위 둘 다에 대응하는 서열을 포함한다.
구현예에서, 주형 핵산은 번역된 서열의 암호화 서열에서 변경을 초래하는 서열, 예를 들어, 단백질 산물에서 하나의 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환, 예를 들어, 돌연변이체 대립유전자를 야생형 대립유전자로 형질전환하는 것 및/또는 야생형 대립유전자를 돌연변이체 대립유전자로 형질전환하는 것 및/또는 정지 코돈을 도입하는 것, 아미노산 잔기의 삽입, 아미노산 잔기의 결실 또는 넌센스 돌연변이를 초래하는 서열을 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 주형 핵산은 비암호화 서열의 변경, 예를 들어, 엑손에서 또는 5' 또는 3' 비번역 또는 비-전사된 영역에서의 변경을 초래하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 제어 구성요소에서의 변경, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 및 시스-작용성 또는 트랜스-작용성 제어 구성요소에서의 변경을 포함한다.
RHO 유전자에서 표적 위치와 상동성을 갖는 주형 핵산은 표적 서열의 구조를 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 주형 서열은 원치 않는 구조, 예를 들어, 원치 않는 또는 돌연변이체 뉴클레오타이드를 변경시키기 위해 사용될 수 있다.
주형 핵산은 다음의 구성성분을 포함한다:
[5' 상동성 암]-[대체 서열]-[3' 상동성 암].
상동성 암은 염색체 내로의 재조합을 제공하며, 따라서 목적으로 하지 않는 구성요소를 대체 서열로 대체하는 것, 예를 들어, 돌연변이 또는 서명을 제공한다. 구현예에서, 상동성 암은 가장 원위의 절단 부위에 측접한다.
구현예에서, 5' 상동성 암의 3' 말단은 대체 서열의 5' 말단 옆의 위치이다. 구현예에서, 5' 상동성 암은 대체 서열의 5' 말단으로부터 적어도 10 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 100 개, 200 개, 300 개, 400 개, 500 개, 600 개, 700 개, 800 개, 900 개, 1000 개, 1500 개 또는 2000 개의 뉴클레오타이드 5'로 연장될 수 있다.
구현예에서, 3' 상동성 암의 5' 말단은 대체 서열의 3' 말단 옆의 위치이다. 구현예에서, 3' 상동성 암은 대체 서열의 3' 말단으로부터 적어도 10 개, 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 100 개, 200 개, 300 개, 400 개, 500 개, 600 개, 700 개, 800 개, 900 개, 1000 개, 1500 개 또는 2000 개의 뉴클레오타이드 3'으로 연장될 수 있다.
예시적인 주형 핵산
예시적인 주형 핵산(본원에서 도너 작제물로도 지칭됨)은 RHO 유전자의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 특정 구현예에서, 주형 핵산은 RHO cDNA 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 주형 핵산 서열은 gRNA 분자와의 혼성화에 내성이 되도록 코돈 변형될 수 있다.
하기 표 7은 예시적인 주형 핵산을 제공한다. 구현예에서, 주형 핵산은 표 7의 행에 있는 5' 상동성 암 및 3' 상동성 암을 포함한다. 다른 구현예에서, 1 열로부터의 5' 상동성 암은 표 7로부터의 3' 상동성 암과 조합될 수 있다. 각 구현예에서, 5' 상동성 암과 3' 상동성 암의 조합은 대체 서열, 예를 들어, 사이토신(C) 잔기를 포함한다.
[표 7]
게놈 편집 방법에서 gRNA의 예
본 명세서에 기재된 바와 같은 gRNA 분자는 표적 핵산의 서열을 변경시키는 이중 가닥 파손 또는 단일 가닥 파손, 예를 들어, 표적 위치 또는 표적 유전자 서명을 생성하는 RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자)에 의해 사용될 수 있다. 당업자는 본 개시내용에 기초하여 본 명세서에 개시된 방법 및 치료 양식과 함께 사용될 수 있는 추가의 적합한 gRNA 분자를 확인할 수 있을 것이다. 적합한 gRNA 분자는, 제한 없이, 미국 특허 출원 제US 2017/0073674 A1호 및 국제 공개 WO 2017/165862 A1호에 기재된 것들을 포함하며, 이들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
VI. 표적 세포
RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자) 및 gRNA 분자, 예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자/gRNA 분자 복합체는 세포를 조작하기 위해, 예를 들어, 매우 다양한 세포에서 표적 핵산을 편집하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 하나 이상의 표적 유전자를 편집(예를 들어, 변경)함으로써 조작된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 유전자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 표적 유전자)의 발현은, 예를 들어, 생체내에서 조절된다. 다른 구현예에서, 하나 이상의 표적 유전자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 표적 유전자)의 발현은, 예를 들어, 생체외에서 조절된다.
본 명세서에 기재된 RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), gRNA 분자, 및 RHO cDNA 분자는 표적 세포에 전달될 수 있다. 구현예에서, 표적 세포는, 눈으로부터의 세포, 예를 들어, 망막 세포, 예를 들어, 광수용체 세포이다. 구현예에서, 표적 세포는 추상체 광수용체 세포 또는 추상 세포이다. 구현예에서, 표적 세포는 간상체 광수용체 세포 또는 간상 세포이다. 구현예에서, 표적 세포는 황반 추상체 광수용체 세포이다. 예시적인 구현예에서, 황반의 추상체 광수용체가 표적화되는데, 즉, 황반의 추상체 광수용체가 표적 세포이다.
적합한 세포는 또한 줄기 세포, 예컨대, 예로서 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 및 간엽 줄기 세포를 포함할 수 있다. 구현예에서, 상기 세포는 돌연변이체 RHO 유전자를 변경(예를 들어, 넉아웃)시키고 외인성 RHO cDNA를 세포로 전달하도록 변형되고, 망막 전구 세포 또는 망막 세포, 예를 들어, 망막 광수용체 세포로 분화되고, 대상체의 눈에, 예를 들어, 망막하로, 예를 들어, 망막의 황반하 영역에 주사되는, 유도된 다능성 줄기 세포(iPS) 세포 또는 iPS 세포로부터 유래된 세포, 예를 들어, 대상체로부터 생성된 iPS 세포이다.
VII. 전달, 제형화 및 투여 경로
구성성분, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), gRNA 분자, 및 RHO cDNA 분자는 다양한 형태로 전달되거나 제형화될 수 있고, 예를 들어, 표 8 및 표 9를 참조하라. 구현예에서, 하나의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), 하나 이상(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 그 초과)의 gRNA 분자, 및 RHO cDNA의 서열은, 예를 들어, AAV 벡터에 의해 전달된다. 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자)를 암호화하는 서열, 하나 이상(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 그 초과)의 gRNA 분자를 암호화하는 서열(들), 및 RHO cDNA 분자의 서열은 동일한 핵산 분자, 예를 들어, AAV 벡터에 존재한다. 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자)를 암호화하는 서열은 제1 핵산 분자, 예를 들어, AAV 벡터에 존재하고, 하나 이상(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 그 초과)의 gRNA 분자를 암호화하는 서열(들), 및 RHO cDNA 분자의 서열은 제2 핵산 분자, 예를 들어, AAV 벡터에 존재한다. 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자)를 암호화하는 서열은 제1 핵산 분자, 예를 들어, AAV 벡터에 존재하고, 하나 이상(예를 들어, 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 또는 그 초과)의 gRNA 분자를 암호화하는 서열(들)은 제2 핵산 분자, 예를 들어, AAV 벡터에 존재하고, RHO cDNA 분자의 서열은 제3 핵산 분자, 예를 들어, AAV 벡터에 존재에 존재한다.
RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), gRNA, 또는 RHO cDNA 구성성분이 DNA에서 암호화되어 전달되는 경우, DNA는 통상적으로 발현을 달성하기 위해, 예를 들어, 프로모터를 포함하는 제어 영역을 포함할 것이다. RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자) 서열에 유용한 프로모터는 CMV, EFS, EF-1a, MSCV, PGK, CAG, hGRK1, hCRX, hNRL, 및 hRCVRN 제어 프로모터를 포함한다. gRNA에 유용한 프로모터는 H1, EF-1a 및 U6 프로모터를 포함한다. RHO cDNA 서열에 유용한 프로모터는 CMV, EFS, EF-1a, MSCV, PGK, CAG, hGRK1, hCRX, hNRL, 및 hRCVRN 제어 프로모터를 포함한다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제 분자 서열에 유용한 프로모터는 RHO 프로모터 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, RHO 프로모터 서열은 최소 RHO 프로모터 서열일 수 있다. 특정 구현예에서, 최소 RHO 프로모터 서열은 서열번호 44에 기재된 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 최소 RHO 프로모터는 100 bp 이하, 200 bp 이하, 250 bp 이하, 300 bp 이하, 400 bp 이하, 500 bp 이하, 600 bp 이하, 700 bp 이하, 800 bp 이하, 900 bp 이하, 또는 1000 bp 이하의 내인성 RHO 프로모터 영역, 예를 들어, RHO 전사 시작 부위로부터 3000 bp 이하 상류의 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 최소 RHO 프로모터는 100 bp 이하, 200 bp 이하, 250 bp 이하, 300 bp 이하, 400 bp 이하, 500 bp 이하, 또는 600 bp 이하의 내인성 RHO 유전자의 전사 시작 부위에 근위의 서열, 및 RHO 프로모터의 원위의 인핸서 영역, 또는 이들의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 최소 RHO cDNA 프로모터는 간상체-특이적 프로모터일 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 프로모터는 인간 옵신 프로모터일 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법, 조성물 및 치료 양식의 맥락에서 사용하기에 적합한 RHO 프로모터, 및 조작된 프로모터 변형체는, 예를 들어, 문헌[Pellissier 2014]에 기재된 것들; 및 국제 특허 출원 제PCT/NL2014/050549호, 제PCT/US2016/050809호, 및 제PCT/US2016/019725호에 기재된 것들을 포함하고, 이들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 또 다른 구현예에서, 프로모터는 조직-특이적 프로모터이다. 유사한 또는 다른 강도를 지니는 프로모터는 구성성분의 발현을 조정하도록 선택될 수 있다. RNA-가이드 뉴클레아제 분자를 암호화하는 서열은 핵 국소화 신호(nuclear localization signal: NLS), 예를 들어, SV40 NLS를 포함할 수 있다. 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 분자를 암호화하는 서열은 적어도 2 개의 핵 국소화 신호를 포함한다. 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 분자, gRNA 분자, 또는 RHO cDNA 분자에 대한 프로모터는 독립적으로, 유도성, 조직 특이적 또는 세포 특이적일 수 있다. RNA-가이드 뉴클레아제의 발현을 검출하기 위해, 친화성 태그가 사용될 수 있다. 유용한 친화성 태그 서열은 3xFlag 태그, 단일 Flag 태그, HA 태그, Myc 태그 또는 HIS 태그를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 친화성 태그 서열은 표 12에 개시되어 있다. 예를 들어, 포유류 세포에서 RNA-가이드 뉴클레아제 발현을 조절하기 위해, 폴리아데닐화 신호(폴리(A) 신호)가 사용될 수 있다. 예시적인 폴리아데닐화 신호는 표 13에 개시되어 있다.
표 8은 구성성분이 표적 세포로 전달될 수 있는 형태의 예를 제공한다.
[표 8]
표 9는 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNA-가이드 뉴클레아제 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자 구성성분, gRNA 분자 구성성분, 및 RHO cDNA 분자 구성성분을 위한 다양한 전달 방법을 요약한 것이다.
[표 9]
표 10은 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1) 발현을 위한 AAV 벡터에 사용될 수 있는 예시적인 프로모터 서열을 기재한 것이다.
[표 10]
RNA-가이드 뉴클레아제 프로모터 서열
표 11은 RHO cDNA에 대한 AAV 벡터에 사용될 수 있는 예시적인 프로모터 서열을 기재한 것이다.
[표 11]
RHO
cDNA 프로모터 서열
표 12는, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1) 발현을 위한 AAV 벡터에 사용될 수 있는 예시적인 친화성 태그 서열을 기재한 것이다.
[표 12]
예시적인 친화성 태그 서열
표 13은, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1) 발현을 위한 AAV 벡터에 사용될 수 있는 예시적인 폴리아데닐화(폴리A) 서열을 기재한 것이다.
[표 13]
예시적인 폴리A 서열
표 14는 AAV 벡터에 사용될 수 있는 예시적인 반전 말단 반복부(ITR) 서열을 기재한 것이다.
[표 14]
예시적인 AAV 혈청형으로부터의 ITR 서열
본 명세서에 기재된 재조합 AAV 게놈 구성성분에 대한 추가의 예시적인 서열이 하기에 제공된다.
예시적인 U6 프로모터 서열:
(서열번호 78)
예시적인 gRNA 표적화 도메인 서열은 본 명세서에서, 예를 들어, 표 1 내지 표 3, 및 표 18에서 기재된다.
당업자는, 일부 구현예에서, 예를 들어, gRNA가 U6 프로모터에 의해 구동되는 경우, 5' G를 gRNA 표적화 도메인 서열에 첨가하는 것이 유리할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
예시적인 gRNA 스캐폴드 도메인 서열:
(서열번호 79)
(서열번호 12)
예시적인 N-말단 NLS 뉴클레오타이드 서열:
(서열번호 81)
예시적인 N-말단 NLS 아미노산 서열: 
(서열번호 82).
본 명세서에 기재된 바와 같은 예시적인 Cas9 뉴클레오타이드 서열.
본 명세서에 기재된 바와 같은 예시적인 Cas9 아미노산 서열.
본 명세서에 기재된 바와 같은 예시적인 Cpf1 뉴클레오타이드 서열.
본 명세서에 기재된 바와 같은 예시적인 Cpf1 아미노산 서열.
예시적인 C-말단 NLS 서열: 
(서열번호 83).
예시적인 C-말단 NLS 아미노산 서열: 
(서열번호 84).
예시적인 폴리(A) 신호 서열:
(서열번호 56)
예시적인 3xFLAG 뉴클레오타이드 서열:
(서열번호 86)
예시적인 3xFLAG 아미노산 서열:
(서열번호 51)
예시적인 스페이서 서열:
(서열번호 77)
(서열번호 80)
(서열번호 85)
(서열번호 87)
예시적인 SV40 인트론 서열:
(서열번호 94).
특정 양태에서, 본 개시내용은 CRISPR/RNA-가이드 뉴클레아제 게놈 편집 시스템 및 RHO cDNA 분자를 암호화하는 AAV 벡터, 및 adRP를 치료하기 위한 이러한 벡터의 용도에 초점을 맞추고 있다. 예시적인 AAV 벡터 게놈은 이들 벡터의 특정의 고정된 및 가변적인 구성요소를 예시하는 도 2에 도식화되어 있다: NLS 서열에 측접하는 RNA-가이드 뉴클레아제 암호화 서열과 함께, ITR, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 암호화 서열 및 이의 발현을 구동하는 프로모터를 포함하는 제1 AAV 벡터; 및 ITR, 하나의 RHO cDNA 서열 및 이의 발현을 구동하는 최소 RHO 프로모터 및 하나의 gRNA 서열 및 이의 발현을 구동하는 프로모터 서열을 포함하는 제2 AAV 벡터. 추가의 예시적인 AAV 벡터 게놈은 또한 도 3 및 도 16 내지 도 18에 기재되어 있다. 예시적인 AAV 벡터 게놈 서열은 서열번호 8 내지 11에 기재되어 있다.
먼저 본 개시내용의 핵산 또는 AAV 벡터에 사용되는 gRNA로 돌아가서, 하나 이상의 gRNA는 돌연변이체 RHO 유전자의 5' 영역(예를 들어, 5' UTR, 엑손 1, 엑손 2, 인트론 1, 엑손 1/인트론 경계)을 절단하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 RHO 유전자의 5' 영역에서의 절단은 돌연변이체 RHO 유전자의 넉아웃 또는 기능 상실을 초래한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 gRNA는 돌연변이체 RHO 유전자의 암호화 영역(예를 들어, 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5) 또는 돌연변이체 RHO 유전자의 비-암호화 영역(예를 들어, 5' UTR, 인트론, 3' UTR)을 절단하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 돌연변이체 RHO 유전자의 암호화 영역 또는 비-암호화 영역에서의 절단은 돌연변이체 RHO 유전자의 넉아웃 또는 기능 상실을 초래할 수 있다.
예시적인 가이드의 표적화 도메인 서열(DNA 서열과 RNA 서열 둘 다)은 표 1 내지 표 3 및 표 18에 제시되어 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 사용된 gRNA는, 후술되는 바와 같이, 스타필로코커스 아우레우스 gRNA로부터 유래될 수 있고, 단분자 또는 모듈일 수 있다. 단분자 스타필로코커스 아우레우스 gRNA에 상응하는 예시적인 DNA 및 RNA 서열은 하기에 나타나 있다:
(서열번호 88) 및
(서열번호 89).
(서열번호 90) 및
(서열번호 91).
표적화 도메인이 임의의 적합한 길이를 가질 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 본 개시내용의 다양한 구현예에 사용된 gRNA는 바람직하게는 이들의 5' 말단에서 16 개 내지 24 개(포함) 염기 길이인 표적화 도메인을 포함하고, 선택적으로 예시된 바와 같이 3' U6 종결 서열을 포함한다.
일부 예에서, 모듈 가이드가 사용될 수 있다. 상기 예시적인 단분자 gRNA 서열에서, crRNA(밑줄)에 상응하는 5' 부분은 GAAA 링커에 의해 tracrRNA(이중 밑줄)에 상응하는 3' 부분에 연결된다. 당업자는 밑줄 및 이중 밑줄 섹션에 상응하는 2-부분 모듈 gRNA가 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
당업자는 본 명세서에 기재된 예시적인 gRNA 설계가 후술되거나 당업계에 공지된 다양한 방식으로 변형될 수 있고; 이러한 변형의 도입은 본 개시내용의 범위 내에 있다는 것을 인지할 것이다.
AAV 벡터에서 하나 이상의 gRNA의 발현은 U6 프로모터, 예컨대, 인간 U6 프로모터의 쌍에 의해 구동될 수 있다. Maeder에 기재된 바와 같은 예시적인 U6 프로모터 서열은 서열번호 78이다.
다음으로 RNA-가이드 뉴클레아제로 돌아가서, 일부 구현예에서 RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 또는 Cpf1 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9이다. 특정 구현예에서, Cas9 단백질은 스타필로코커스 아우레우스 Cas9이다. 본 개시내용의 추가의 구현예에서, Cas9 서열은 Cas9 단백질의 C-말단 및 N-말단에서 2 개의 핵 국소화 서열(NLS), 및 미니-폴리아데닐화 신호(또는 폴리-A 서열)를 포함하도록 변형된다. 예시적인 Cas9 서열 및 Cpf1 서열이 본 명세서에서 제공된다. 이들 서열의 성질은 예시적이며, 제한하고자 의도된 것이 아니다. 당업자는 이들 서열의 변형이 특정 적용에서 가능하거나 바람직할 수 있다는 것을 인지할 것이며; 이러한 변형은 후술되거나, 당업계에 공지되어 있으며, 본 개시내용의 범위 내에 있다.
당업자는 또한 폴리아데닐화 신호가 광범위하게 사용되며 당업계에 공지되어 있고, 임의의 적합한 폴리아데닐화 신호가 본 개시내용의 구현예에 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예시적인 폴리아데닐화 신호는 서열번호 56 내지 58에 기재되어 있다.
Cas9 발현은 본 개시내용의 특정 벡터에서 다음 세 가지 프로모터 중 하나에 의해 구동될 수 있다: 사이토메갈로바이러스(CMV)(즉, 서열번호 45), 신장 인자-1(EFS)(즉, 서열번호 46), 또는 인간 g-단백질 수용체 결합 키나제-1(hGRK1)(즉, 서열번호 47)(망막 광수용체 세포에서 특이적으로 발현됨). 프로모터의 서열의 변형은 특정 적용에서 가능하거나 바람직할 수 있으며, 이러한 변형은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 특정 구현예에서, Cas9 발현은 본 명세서에 기재된 RHO 프로모터(예를 들어, 최소 RHO 프로모터(250 bp) 서열번호 44)에 의해 구동될 수 있다.
다음으로 RHO cDNA로 돌아가서, 일부 구현예에서 RHO cDNA 분자는 야생형 RHO cDNA(예를 들어, 서열번호 2)일 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자는 gRNA와의 혼성화에 내성이 있도록 코돈-변형된 cDNA일 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자는 gRNA와의 혼성화에 내성이 있도록 코돈-변형되지 않는다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 분자는 로돕신 단백질 발현의 증가를 제공하도록 코돈-최적화된 cDNA일 수 있다(예를 들어, 서열번호 13 내지 18). 특정 구현예에서, RHO cDNA는 변형된 3' UTR, 예를 들어, 고도 발현된 안정한 전사체, 예컨대, 알파-글로빈 또는 베타-글로빈으로부터의 3' UTR을 포함할 수 있다. 예시적인 3' UTR은 서열번호 38 내지 42에 기재되어 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 하나 이상의 인트론(예를 들어, 서열번호 4 내지 7)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA는 하나 이상의 인트론의 절두를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, RHO cDNA 발현은 간상체-특이적 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 특정 구현예에서, RHO cDNA 발현은 본 명세서에 기재된 RHO 프로모터(예를 들어, 최소 RHO 프로모터(250 bp) 서열번호 44)에 의해 구동될 수 있다.
본 개시내용에 따른 AAV 게놈은 일반적으로 AAV5 혈청형으로부터 유래된 반전 말단 반복부(ITR)를 혼입한다. 예시적인 좌측 및 우측 ITR은 각각 서열번호 63(AAV5 좌측 ITR) 및 서열번호 72(AAV5 우측 ITR)이다. 특정 구현예에서, 예시적인 좌측 및 우측 ITR은 각각 서열번호 92(AAV 좌측 ITR) 및 서열번호 93(AAV 우측 ITR)이다. 그러나, 다수의 변형 버전의 AAV5 ITR이 당업계에서 사용되며, 본원에 나타나 있는 ITR 서열은 예시적이고, 제한하고자 의도된 것이 아님이 주지되어야 한다. 이들 서열의 변형은 당업계에 공지되어 있거나, 당업자에게 명백할 것이며, 따라서 본 개시내용의 범위에 포함된다.
gRNA, RNA-가이드 뉴클레아제, 및 RHO cDNA 프로모터는 가변적이며, 본 명세서에서 제시된 목록으로부터 선택될 수 있다. 명확성을 위해, 본 개시내용은 이들 구성요소의 임의의 조합을 포함하는 핵산 및/또는 AAV 벡터를 포함하지만, 특정 조합이 특정 적용에 바람직할 수 있다.
다양한 구현예에서, 제1 핵산 또는 AAV 벡터는 좌측 및 우측 AAV ITR 서열(예를 들어, AAV5 ITR), RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 핵산 분자에 의해 암호화된 Cas9 또는 Cpf1 핵산에 의해 암호화된 Cpf1)의 발현을 구동하는 프로모터(예를 들어, CMV, hGRK1, EFS, RHO 프로모터), RNA-가이드 뉴클레아제 핵산 분자에 측접하는 NLS 서열을 암호화할 수 있거나, 제2 핵산 또는 AAV 벡터는 좌측 및 우측 AAV ITR 서열(예를 들어, AAV5 ITR), 표적화 도메인 서열(예를 들어, 표 1 내지 표 3 또는 표 18에 따른 서열)을 포함하는 가이드 RNA의 발현을 구동하는 U6 프로모터, 및 RHO cDNA 분자의 발현을 구동하는 RHO 프로모터(예를 들어, 최소 RHO 프로모터)를 암호화할 수 있다.
핵산 또는 AAV 벡터는 또한 시미안 바이러스 40(SV40) 스플라이스 도너/스플라이스 억셉터(SD/SA) 서열 구성요소를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, SV40 SD/SA 구성요소는 프로모터와 RNA-가이드 뉴클레아제 유전자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 유전자) 사이에 위치할 수 있다. 특정 구현예에서, 코작 공통 서열은 강한 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1) 발현을 보장하기 위해 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)의 시작 코돈에 선행할 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 벡터는 상기 언급된 핵산 또는 AAV 벡터 중 하나와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 공유한다.
상술된 이들 서열은 예시적이며, 이들이 암호화하는 구성요소의 작동 원리를 방해하지 않는 방식으로 변형될 수 있다는 것이 주지되어야 한다. 일부가 하기에서 논의되는 이러한 변형들은 본 개시내용의 범위 내에 있다. 전술한 내용을 제한하지 않으면서, 당업자는 본 개시내용의 구성요소의 DNA, RNA 또는 단백질 서열이 이들의 기능을 방해하지 않는 방식으로 변할 수 있고, 실질적으로 유사한(예를 들어, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 서열 유사성, 또는 짧은 서열, 예컨대, gRNA 표적화 도메인의 서열에서 1 개, 2 개 또는 3 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열) 다양한 유사한 서열이 본 명세서에 기재된 다양한 시스템, 방법 및 AAV 벡터에서 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이러한 변형된 서열은 본 개시내용의 범위 내에 있다.
상술된 AAV 게놈은 AAV 캡시드(예를 들어, AAV5 캡시드)로 패키징될 수 있으며, 이러한 캡시드는 조성물(예컨대, 약제학적 조성물)에 포함되고/되거나 대상체에게 투여될 수 있다. 본 개시내용에 따른 AAV 캡시드를 포함하는 예시적인 약제학적 조성물은 평행염액(BSS) 및 하나 이상의 계면활성제(예를 들어, Tween20) 및/또는 감열성 또는 역감열성 중합체(예를 들어, 플루로닉)와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 다른 약제학적 제형 구성요소가 또한 본 명세서에 기재된 조성물에 사용하기에 적합할 수 있다.
본 개시내용에 따른 AAV 벡터를 포함하는 조성물은, 제한 없이, 주사, 예를 들어, 망막하 주사를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 조성물 중 AAV 벡터의 농도는, 특히, 주사 장치 내의 무용 부피 및 망막에 안전하게 투여될 수 있는 상대적으로 제한된 부피를 고려하여, 충분한 AAV 용량이 대상체의 망막에 투여되는 것을 보장하도록 선택된다. 적합한 용량은, 예를 들어, 1x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 2x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 3x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 4x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 5x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 6x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 7x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 8x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 9x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 1x1012 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 2x1012 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 3x1012 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 4x1012 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 5x1012 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 6x1012 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 7x1012 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 8x1012 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 9x1012 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 1x1013 개 vg/mL, 2x1013 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 3x1013 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 4x1013 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 5x1013 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 6x1013 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 7x1013 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 8x1013 개 바이러스 게놈(vg)/mL, 또는 9x1013 개 바이러스 게놈(vg)/mL를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 부피의 조성물이 망막하 공간으로 전달될 수 있다. 일부 예에서, 부피는, 예를 들어, 1 마이크로리터, 10 마이크로리터, 50 마이크로리터, 100 마이크로리터, 150 마이크로리터, 200 마이크로리터, 250 마이크로리터, 300 마이크로리터 등과 같이 망막하 공간에서 소포를 형성하도록 선택된다.
망막의 임의의 영역이 표적화될 수 있지만, 중심 시력에서의 이의 역할 및 망막의 주변 영역에 비해 비교적 높은 농도의 추상체 광수용체로 인해 특정 예에서 중심와(눈의 중앙으로부터 약 1 도 연장됨)가 바람직할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 주사는 간상체 및 추상체 광수용체 세포 둘 다의 존재를 특징으로 하는 중심와주변 영역(중앙에서 약 2 도 내지 10 도 연장됨)에 표적화될 수 있다. 또한, 망막의 중간선을 가로 지르는 니들 경로를 이용하여 중심와주변 영역으로의 주사가 비교적 예각으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 주사 경로는 윤부 근처의 공막의 비 면으로부터 유리체실을 통해 측두 쪽의 중심와주변 망막으로, 공막의 측두 면으로부터 비 쪽의 중심와주변 망막으로, 각막보다 상부에 위치한 공막의 일부에서 내부 중심와주변 위치로, 및/또는 공막의 내부 부분으로부터 상부 중심와주변 위치로 연장될 수 있다. 망막 표면에 비해 상대적으로 작은 주사 각도를 이용하면 유리하게 소포로부터 유리체로 벡터의 유출 가능성을 감소시키거나 제한할 수 있고, 결과적으로 전달 동안 벡터의 손실을 감소시킬 수 있다. 다른 경우에, 황반(중심와 포함)이 표적화될 수 있고, 다른 경우에 추가의 망막 영역이 표적화될 수 있거나, 넘치는 용량을 수용할 수 있다.
안구 염증 및 관련된 불편함을 완화시키기 위해, 하나 이상의 코르티코스테로이드가 AAV 벡터를 포함하는 조성물의 투여 전, 그 동안 및/또는 그 후에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 코르티코스테로이드는 경구 코르티코스테로이드일 수 있다. 특정 구현예에서, 경구 코르티코스테로이드는 프레드니손일 수 있다. 특정 구현예에서, 코르티코스테로이드는 AAV 벡터를 포함하는 조성물의 투여 전에 예방용으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 코르티코스테로이드는 AAV 벡터를 포함하는 조성물의 투여 전날에, 또는 이의 투여 전 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 또는 14 일에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 코르티코스테로이드는 AAV 벡터를 포함하는 조성물의 투여 후 1 주 내지 10 주 동안 투여될 수 있다(예를 들어, AAV 벡터를 포함하는 조성물의 투여 후 1 주, 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 또는 10 주). 특정 구현예에서, 코르티코스테로이드 치료는 AAV 벡터를 포함하는 조성물의 투여 전(예를 들어, 투여 전날에, 또는 투여 전 2 일, 3 일, 4 일, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일, 10 일, 11 일, 12 일, 13 일, 또는 14 일에), 및 이의 투여 후(예를 들어, 투여 후 1 주 2 주, 3 주, 4 주, 5 주, 6 주, 7 주, 8 주, 9 주, 또는 10 주에) 투여될 수 있다. 예를 들어, 코르티코스테로이드 치료는 AAV 벡터의 투여 전 3 일부터 시작하여 투여 후 6 주까지 투여될 수 있다.
코르티코스테로이드의 적합한 용량은, 예를 들어, 0.1 mg/kg/일 내지 10 mg/kd/일(예를 들어, 0.1 mg/kg/일, 0.2 mg/kg/일, 0.3 mg/kg/일, 0.4 mg/kg/일, 0.5 mg/kg/일, 0.6 mg/kg/일, 0.7 mg/kg/일, 0.8 mg/kg/일, 0.9 mg/kg/일, 또는 1.0 mg/kg/일)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 코르티코스테로이드는 코르티코스테로이드 치료 동안 증가 용량으로, 이어서 감소 용량의 코르티코스테로이드로 투여될 수 있다. 예를 들어, 0.5 mg/kg/일의 코르티코스테로이드는 4 주 동안 투여될 수 있고, 이어서 15-일 감소(5 일 동안 0.4 mg/kg/일, 및 이후 5 일 동안 0.2 mg/kg/일, 및 이후 5 일 동안 0.1 mg/kg/일)로 투여될 수 있다. 코르티코스테로이드 용량은 유리체 염증이 수술 후(예를 들어, 수술 후 4 주 이내) 등급 척도에서 1+ 증가한 경우 증가될 수 있다. 예를 들어, 환자가 0.5 mg/kg/일 용량을 받는 동안(예를 들어, 수술 후 4 주 이내) 유리체 염증이 등급 척도에서 1+ 증가한 경우, 코르티코스테로이드 용량은 1 mg/kg/일 증가될 수 있다. 수술 후 4 주 이내에 임의의 염증이 존재하는 경우, 감소가 지연될 수 있다.
전임상 개발 목적을 위해, 본 개시내용에 따른 시스템, 조성물, 뉴클레오타이드 및 벡터는 망막 외식편 시스템을 사용하여 생체외에서, 또는 마우스, 토끼, 돼지, 비인간 영장류 등과 같은 동물 모델을 사용하여 생체내에서 평가될 수 있다. 망막 외식편은 선택적으로 지지체 매트릭스 상에 유지되고, AAV 벡터는 망막하 주사를 모방하기 위해 광수용체 층과 지지체 매트릭스 사이의 공간으로 주사함으로써 전달될 수 있다. 망막 외식을 위한 조직은 인간 또는 동물 대상체, 예를 들어, 마우스로부터 입수될 수 있다.
외식편은 바이러스 형질도입 후 gRNA, RNA-가이드 뉴클레아제 및 로돕신 단백질의 발현을 연구하고 비교적 짧은 간격에 걸쳐 게놈 편집을 연구하는 데 특히 유용하다. 이들 모델은 또한 동물 모델에서 가능할 수 있는 것보다 더 높은 처리량을 허용하고 동물 모델 및 대상체에서 발현 및 게놈 편집을 예측할 수 있다. 약리학적 및/또는 독성학적 연구를 위해 그리고 클리닉에서 사용될 부피에 근접한 부피 및 조건에서 본 개시내용의 시스템, 뉴클레오타이드, 벡터 및 조성물을 시험하기 위해 작은(마우스, 래트) 및 큰 동물 모델(예를 들어, 토끼, 돼지, 비인간 영장류)이 사용될 수 있다. 모델 시스템은 인간 해부학 및/또는 생리학의 관련 측면을 요약하기 위해 선택되기 때문에, 이들 시스템에서 얻어진 데이터는 일반적으로(반드시는 아니지만) 인간 및/또는 동물 대상체에서 본 개시내용에 따른 AAV 벡터 및 조성물의 거동을 예측할 수 있다.
RNA-가이드 뉴클레아제 분자, gRNA 분자, 및/또는
RHO
발현 카세트의 DNA-기반 전달
RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자), gRNA 분자, 및/또는 RHO cDNA 분자를 암호화하는 DNA는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 대상체에 투여되거나 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, DNA를 암호화하는 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1), gRNA-암호화 DNA, 및/또는 RHO cDNA는, 예를 들어, 벡터(예를 들어, 바이러스 또는 비바이러스 벡터), 비벡터 기반 방법(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 이용), 또는 이들의 조합에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1)-암호화 DNA, gRNA-암호화 DNA, 및/또는 RHO cDNA는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터/바이러스 또는 플라스미드)에 의해 전달된다.
벡터는 RNA-가이드 뉴클레아제-암호화 DNA, gRNA-암호화 DNA, 및/또는 RHO cDNA 분자를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제 서열에 융합된(예를 들어, 핵 국소화, 핵소체 국소화, 미토콘드리아 국소화를 위해) 단일 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 RNA-가이드 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1) 분자를 암호화하는 서열에 융합된 핵 국소화 서열(예를 들어, SV40으로부터의)을 포함할 수 있다.
하나 이상의 조절/제어 구성요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus) 서열, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site: IRES), 2A 서열, 및 스플라이스 억셉터(acceptor) 또는 도너가 벡터 내에 포함될 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 II(예를 들어, CMV 프로모터)에 의해 인식된다. 다른 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III(예를 들어, U6 프로모터)에 의해 인식된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조절된 프로모터(예를 들어, 유도성 프로모터)이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 다른 구현예에서, 프로모터는 비바이러스 프로모터이다.
일부 구현예에서, 벡터는 또는 전달 비히클은 (예를 들어, 재조합 바이러스의 생성에 대해) 바이러스 벡터이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 DNA 바이러스(예를 들어, dsDNA 또는 ssDNA 바이러스)이다. 다른 구현예에서, 바이러스는 RNA 바이러스(예를 들어, ssRNA 바이러스)이다. 예시적인 바이러스 벡터/바이러스는, 예를 들어, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV), 백시니아 바이러스, 폭스바이러스 및 단순포진 바이러스이다.
일부 구현예에서, 바이러스는 분열 세포를 감염시킨다. 다른 구현예에서, 바이러스는 비분열 세포를 감염시킨다. 일부 구현예에서, 바이러스는 분열 세포와 비분열 세포를 둘 다 감염시킨다. 일부 구현예에서, 바이러스는 숙주 게놈 내로 통합될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는, 예를 들어, 인간에서 감소된 면역을 갖도록 공학처리된다. 일부 구현예에서, 바이러스는 복제-적격이다. 다른 구현예에서, 바이러스는, 예를 들어, 비리온 복제 및/또는 패키징의 추가적인 라운드에 필요한 유전자에 대해 하나 이상의 암호화 영역이 다른 유전자로 대체되거나 결실된, 복제-결함이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 RNA-가이드 뉴클레아제 분자, gRNA 분자, 및/또는 RHO cDNA 분자의 일시적 발현을 야기한다. 다른 구현예에서, 바이러스는 RNA-가이드 뉴클레아제 분자, gRNA 분자, 및/또는 RHO cDNA 분자의 장기간 지속, 예를 들어, 적어도 1 주, 2 주, 1 개월, 2 개월, 3 개월, 6 개월, 9 개월, 1 년, 2 년 또는 영구적 발현을 야기한다. 바이러스의 패키징 능력은, 예를 들어, 적어도 약 4 kb 내지 적어도 약 30 kb, 예를 들어, 적어도 약 5 kb, 10 kb, 15 kb, 20 kb, 25 kb, 30 kb, 35 kb, 40 kb, 45 kb 또는 50 kb로 다를 수 있다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제-암호화 DNA, gRNA-암호화 DNA, 및/또는 RHO cDNA는 재조합 레트로바이러스에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스)는, 예를 들어, 숙주 게놈 내로 통합되게 하는 역전사효소를 포함한다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 복제-적격이다. 다른 구현예에서, 레트로바이러스는, 예를 들어, 비리온 복제 및 패키징의 추가적인 라운드에 필수적인 유전자에 대해 하나 이상의 암호화 영역이 다른 유전자로 대체되거나 또는 결실된, 복제-결함이다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제-암호화 DNA, gRNA-암호화 DNA, 및/또는 RHO cDNA는 재조합 렌티바이러스에 의해 전달된다. 예를 들어, 렌티바이러스는 복제-결함이며, 예를 들어, 바이러스 복제에 필요한 하나 이상의 유전자를 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제-암호화 DNA, gRNA-암호화 DNA, 및/또는 RHO cDNA는 재조합 아데노바이러스에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스는 인간에서 감소된 면역을 갖도록 공학처리된다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제-암호화 DNA, gRNA-암호화 DNA, 및/또는 RHO cDNA는 재조합 AAV에 의해 전달된다. 일부 구현예에서, AAV는 숙주 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 세포 내로 그의 게놈을 혼입시킬 수 있다. 일부 구현예에서, AAV는 자기 상보적 아데노 연관 바이러스(scAAV), 예를 들어, 이중 가닥 DNA를 형성하기 위해 함께 어닐링하는 가닥 둘 다를 패키징하는 scAAV이다. 개시된 방법에서 사용될 수 있는 AAV 혈청형은, 예를 들어, AAV1, AAV2, 변형 AAV2(예를 들어, Y444F, Y500F, Y730F 및/또는 S662V에서의 변형), AAV3, 변형된 AAV3(예를 들어, Y705F, Y731F 및/또는 T492V에서의 변형), AAV4, AAV5, AAV6, 변형된 AAV6(예를 들어, S663V 및/또는 T492V에서의 변형), AAV8, AAV 8.2, AAV9, AAV rh 10, 및 위형 AAV를 포함하고, 예컨대 AAV2/8, AAV2/5 및 AAV2/6은 또한 개시된 방법에서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제-암호화 DNA, gRNA-암호화 DNA, 및/또는 RHO cDNA는 혼성 바이러스, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바이러스 중 하나 이상의 혼성체에 의해 전달된다.
패키징 세포를 사용하여 숙주 또는 표적 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성한다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키징할 수 있는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징할 수 있는 ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에서 사용되는 바이러스 벡터는 보통 바이러스 입자 내로 핵산 벡터를 패키징하는 생성자 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 통상적으로 패키징 및 (적용 가능하다면) 숙주 또는 표적 세포 내로의 후속적 통합에 필요한 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 예를 들어, 유전자 요법에서 사용되는 AAV 벡터는 통상적으로 숙주 또는 표적 세포에서 패키징 및 유전자 발현에 필요한 AAV 게놈으로부터의 반전 말단 반복부(ITR) 서열만을 가진다. 상실된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 도중에 공급된다. 이후로, 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉, rep 및 cap을 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하지만 ITR 서열은 없는 세포주에서 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터의 AAV 유전자의 발현을 촉진시킨다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결실에 기인하여 상단한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은, 예를 들어, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 및/또는 조직 유형 인식 능력을 가진다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 상이한/대안의 바이러스 외피 당단백질로 위형을 만들 수 있고; 세포 유형-특이적 수용체에 의해 공학 처리되며(예를 들어, 표적화 리간드, 예컨대 펩타이드 리간드, 단쇄 항체, 성장인자를 혼입시키기 위한 바이러스 외피 당단백질의 유전자 변형); 그리고/또는 바이러스 당단백질을 인식하는 하나의 말단 및 표적 세포 표면의 모이어티를 인식하는 다른 말단(예를 들어, 리간드-수용체, 단클론성 항체, 아비딘-바이오틴 및 화학적 컨쥬게이션)을 지니는 이중 특이성이 있는 분자 브릿지를 갖도록 공학처리 된다.
구현예에서, 바이러스 벡터는 세포 유형 특이적 발현을 달성한다. 예를 들어, 조직-특이적 프로모터는 표적 세포에서만 이식유전자(Cas9 및 gRNA)의 발현을 제한하도록 구성될 수 있다. 벡터의 특이성은 또한 이식유전자 발현의 마이크로RNA-의존적 제어에 의해 매개될 수 있다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 바이러스 벡터 및 표적 세포막의 융합 효율이 증가되었다. 예를 들어, 융합 단백질, 예컨대 융합-적격 혈구응집소(HA)는 바이러스 흡수를 증가시키기 위해 세포 내로 혼입될 수 있다. 구현예에서, 바이러스 벡터는 핵 국소화 능력을 가진다. 예를 들어, (세포 분할 동안) 세포벽의 파괴를 필요로 하고 따라서 비분열 세포를 감염시키지 않을 비바이러스는 바이러스의 매트릭스 단백질 내 핵 국소화 펩타이드를 혼입시키도록 변경될 수 있고, 이에 의해 비증식 세포의 형질도입을 가능하게 한다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제-암호화 DNA, gRNA-암호화 DNA, 및/또는 RHO cDNA는 비벡터 기반 방법에 의해(예를 들어, 네이키드 DNA 또는 DNA 복합체를 이용하여) 전달된다. 예를 들어, DNA는, 예를 들어, 유기적으로 변형된 실리카 또는 실리케이트(오르모실(Ormosil)), 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법(magnetofection), 지질-매개 형질감염, 덴드리머, 무기 나노입자, 인산칼슘, 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제-암호화 DNA, gRNA-암호화 DNA, 및/또는 RHO cDNA는 벡터 및 비벡터 기반 방법의 조합에 의해 전달된다. 예를 들어, 바이로좀은, 예를 들어, 바이러스 또는 리포좀 방법 중 하나의 단독보다는 호흡기 상피세포에서 더 효율적인 유전자 전달을 초래할 수 있는 불활성화 바이러스(예를 들어, HIV 또는 인플루엔자 바이러스)와 조합된 리포좀을 포함한다.
구현예에서, 전달 비히클은 비바이러스 벡터이다. 구현예에서, 비바이러스 벡터는 (예를 들어, 나노입자의 표면에 대한 페이로드에 부착된) 무기 나노입자이다. 예시적인 무기 나노입자는, 예를 들어, 자기 나노입자(예를 들어, Fe3MnO2) 또는 실리카를 포함한다. 나노입자의 외면은 페이로드를 부착(예를 들어, 컨쥬게이션 또는 포착)시키는 양으로 하전된 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리세린)와 컨쥬게이션될 수 있다. 구현예에서, 비바이러스 벡터는 유기 나노입자(예를 들어, 나노입자 내부의 페이로드의 포착)이다. 예시적인 유기 나노입자는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 프로타민으로 코팅된 중성 헬퍼 지질 및 지질 코팅으로 코팅된 핵산 복합체와 함께 양이온성 지질을 함유하는 SNALP 리포좀을 포함한다.
유전자 전달을 위한 예시적인 지질을 하기 표 15에 나타낸다.
[표 15]
유전자 전달을 위해 사용한 지질
유전자 전달을 위한 예시적인 중합체는 하기에서 표 16에 나타나 있다.
[표 16]
유전자 전달을 위해 사용한 중합체
구현예에서, 비히클은 나노입자 및 리포좀의 표적 세포 업데이트를 증가시키기 위한 표적화 변형, 예를 들어, 세포 특이적 항원, 단클론성 항체, 단쇄 항체, 앱타머, 중합체, 당 및 세포 침투 펩타이드를 가진다. 구현예에서, 비히클은 융합생성 및 엔도좀-탈안정화 펩타이드/중합체를 이용한다. 구현예에서, 비히클은 (예를 들어, 화물의 엔도좀 탈출을 가속화시키기 위해) 산-촉발 입체구조적 변화를 겪는다. 구현예에서, 자극-절단성 중합체는, 예를 들어, 세포의 격막에서의 방출을 위해 사용된다. 예를 들어, 환원성 세포 환경에서 절단된 이황화-기반 양이온성 중합체가 사용될 수 있다.
구현예에서, 전달 비히클은 생물학적 비바이러스 전달 비히클이다. 구현예에서, 비히클은 약독화된 박테리아(예를 들어, 천연으로 또는 침습성이 되도록 인공적으로 공학 처리되었지만 발병을 예방하고 이식유전자(예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스, 특정 살모넬라 균주(Salmonella strains), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 변형된 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli))를 발현시키도록 약독화됨, 표적 특이적 조직에 대해 영양적 및 조직 특이적 향성을 갖는 박테리아, 표적 조직 특이성을 변경시키도록 변형된 표면 단백질을 갖는 박테리아)이다. 구현예에서, 비히클은 유전자 변형된 박테리오파지이다(예를 들어, 거대 패키징 능력을 갖는 공학처리된 파지, 덜 면역원성, 포유류 플라스미드 유지 서열을 함유하고 혼입된 표적화 리간드를 가짐). 구현예에서, 비히클은 포유류 바이러스 유사 입자이다. 예를 들어, 변형된 바이러스 입자가 (예를 들어, "빈" 입자의 정제 후에 목적으로 하는 화물을 지니는 바이러스의 생체외 조립체에 의해) 생성될 수 있다. 비히클은 또한 표적 조직 특이성을 변경시키기 위해 표적화 리간드를 혼입하도록 공학 처리될 수 있다. 구현예에서, 비히클은 생물학적 리포좀이다. 예를 들어, 생물학적 리포좀은 인간 세포로부터 유래된 인지질 기반 입자이다(예를 들어, 대상체로부터 유래된 구체 구조로 분해된 적혈구인 적혈구 고스트(예를 들어, 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포-특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있음), 또는 식균 작용 유래의(예를 들어, 다양한 세포 유형으로부터 생성될 수 있고, 따라서 표적화 리간드에 대한 필요없이 세포에 의해 취해질 수 있음) 분비 엑소솜-대상체(즉, 환자) 유래 막-결합 나노소수포(30 nm 내지 100 nm)).
구현예에서, 본 명세서에 기재된 RNA-가이드 뉴클레아제 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자 구성성분, gRNA 분자 구성성분, 및/또는 RHO cDNA 분자 구성성분이 아닌 하나 이상의 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자)가 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 RNA-가이드 뉴클레아제 시스템의 구성성분 중 하나 이상이 전달됨과 동시에 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 RNA-가이드 뉴클레아제 시스템의 구성성분 중 하나 이상이 전달되기 (예를 들어, 약 30 분 미만, 1 시간, 2 시간, 3 시간, 6 시간, 9 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 3 일, 1 주, 2 주 또는 4 주) 전에 또는 후에 전달된다. 구현예에서, 핵산 분자는 RNA-가이드 뉴클레아제 시스템의 구성성분, 예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자 구성성분, gRNA 분자 구성성분, 및/또는 RHO cDNA 분자 구성성분 중 하나 이상과 상이한 수단에 의해 전달된다. 핵산 분자는 본 명세서에 기재된 임의의 전달 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 바이러스 벡터, 예를 들어, 통합-결손 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있고, RNA-가이드 뉴클레아제 분자 및/또는 gRNA 분자 구성성분, 및/또는 RHO cDNA 분자 구성성분은, 예를 들어, 핵산(예를 들어, DNA)에 의해 야기되는 독성이 감소될 수 있도록 전기천공법에 의해 전달될 수 있다. 구현예에서, 핵산 분자는 치료적 단백질, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 단백질을 암호화한다. 구현예에서, 핵산 분자는 RNA 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 RNA 분자를 암호화한다.
RNA-가이드 뉴클레아제 분자를 암호화하는 RNA의 전달
RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 또는 Cpf1 분자), gRNA 분자, 및/또는 RHO cDNA 분자를 암호화하는 RNA는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 표적 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 또는 Cpf1 분자), gRNA 분자, 및/또는 RHO cDNA 분자는, 예를 들어, 미량주사법, 전기천공법, 지질-매개 형질감염, 펩타이드-매개 전달 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다.
RNA-가이드 뉴클레아제 분자 단백질의 전달
RNA-가이드 뉴클레아제 분자(예를 들어, 본 명세서에 기재된 Cas9 또는 Cpf1 분자)는 당업계에 공지된 방법에 의해 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 세포 내로 전달될 수 있다. 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제 단백질 분자는, 예를 들어, 미량주사법, 전기천공법, 지질-매개 형질감염, 펩타이드-매개 전달 또는 이의 조합에 의해 전달될 수 있다. 전달은 gRNA 및/또는 RHO cDNA를 암호화하는 DNA에 의해 또는 gRNA 및/또는 RHO cDNA를 수반할 수 있다.
투여 경로
전신 투여 방식은 경구 및 비경구 경로를 포함한다. 비경구 경로는, 예로서 정맥내, 동맥내, 골내, 근육내, 진피내, 피하, 비강내 및 복막내 경로를 포함한다. 전신으로 투여되는 구성성분은 전신으로 눈에 구성성분을 표적화하도록 변형 또는 제형화될 수 있다.
국소 투여 방식은, 예를 들어, 안구내, 안와내, 결막하, 유리체강, 망막하 또는 경공막 경로를 포함한다. 구현예에서, (전신 접근에 비해) 상당히 더 적은 양의 구성성분은 전신으로(예를 들어, 정맥내로) 투여될 때에 비해 국소로(예를 들어, 유리체강) 투여될 때에 효과를 달성할 수 있다. 국소 투여 방식은 치료적 유효량의 구성성분이 전신으로 투여될 때 생길 수 있는 잠재적 독성 부작용의 발생을 감소 또는 제거할 수 있다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 구성성분은 망막하로, 예를 들어, 망막하 주사에 의해 전달된다. 망막하 주사는 황반내로, 예를 들어, 황반하에 직접 이루어질 수 있다.
구현예에서, 본 명세서에 기재된 구성성분은 유리체강 주사에 의해 전달된다. 유리체강 주사는 상대적으로 낮은 위험의 망막 박리 위험을 가진다. 구현예에서, 나노입자 또는 바이러스, 예를 들어, AAV 벡터, 예를 들어, AAV5 벡터, 예를 들어, 변형된 AAV5 벡터, AAV2 벡터, 예를 들어, 변형된 AAV2 벡터는 유리체강에 전달된다.
눈에 대한 제제의 투여방법은 의학분야에 공지되어 있으며 본 명세서에 기재된 구성성분을 투여하는데 사용될 수 있다. 예시적인 방법은 안구내 주사(예를 들어, 안구뒤, 망막하, 황반하, 유리체강 및 맥락막내), 이온도입법, 안 점적 및 안구내 이식(예를 들어, 유리체강, 테논낭하 및 결막하)을 포함한다.
투여는 주기적 볼루스(bolus)로서(예를 들어, 망막하, 정맥내 또는 유리체강) 또는 내부 저장소(예를 들어, 안구내 또는 안구외에 위치된 임플란트(미국 특허 제5,443,505호 및 제5,766,242호 참조))로부터의 또는 외부 저장소(예를 들어, 정맥내 백)로부터의 연속적 주입으로서 제공될 수 있다. 구성성분은 국소로, 예를 들어, 눈의 내벽에 고정된 지속 방출 약물 전달 장치로부터의 연속적 방출에 의해 또는 맥락막 내로 표적화된 경공막 제어 방출을 통해 투여될 수 있다(예를 들어, PCT/US00/00207, PCT/US02/14279, 문헌[Ambati 2000a], 및 문헌[Ambati 2000b] 참조). 구성성분을 눈의 내부에 국소로 투여하기에 적합한 다양한 장치는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,251,090호, 제6,299,895호, 제6,416,777호, 제6,413,540호 및 PCT/US00/28187호 참조.
또한, 구성성분은 장기간의 시간에 걸쳐 방출되도록 제형화될 수 있다. 방출 시스템은 생분해성 물질 또는 혼입 구성성분을 확산에 의해 방출시키는 물질의 매트릭스를 포함할 수 있다. 구성성분은 방출 시스템 내에서 균질하게 또는 이질적으로 분포될 수 있다. 다양한 방출 시스템이 유용할 수 있지만, 그러나, 적절한 시스템의 선택은 특정 적용분야에 의해 필요로 되는 방출 속도에 의존할 것이다. 비분해성 방출 시스템과 분해성 방출 시스템이 둘 다 사용될 수 있다. 적합한 방출 시스템은 중합체 및 중합체 매트릭스, 비중합체 매트릭스 또는 무기 및 유기 부형제 및 희석제, 예컨대 탄산칼슘 및 당(예를 들어, 트레할로스)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 방출 시스템은 천연 또는 합성일 수 있다. 그러나, 합성 방출 시스템이 바람직한데, 일반적으로 이것들은 더 믿을 수 있고, 더 재생성이며, 더 한정된 방출 프로파일을 생성하기 때문이다. 방출 시스템 물질은 상이한 분자량을 갖는 구성성분이 물질의 확산에 의해 또는 물질의 분해를 통해 방출되도록 선택될 수 있다.
대표적인 합성, 생분해성 중합체는, 예를 들어, 다음을 포함한다: 폴리아미드, 예컨대 폴리(아미노산) 및 폴리(펩타이드); 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락트산), 폴리(글리콜), 폴리(락틱-코-글리콜산), 및 폴리(카프롤락톤); 폴리(무수물); 폴리오르쏘에스테르; 폴리카보네이트; 및 이들의 화학적 유도체(치환, 화학기, 예를 들어, 알킬, 알킬렌의 첨가, 하이드록실화, 산화 및 다른 변형은 당업자에 의해 일상적으로 이루어짐), 공중합체 및 이들의 혼합물. 대표적인 합성, 비분해성 중합체는, 예를 들어, 다음을 포함한다: 폴리에테르, 예컨대 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 글리콜) 및 폴리(테트라메틸렌 옥사이드); 비닐 중합체-폴리아크릴레이트 및 폴리메트아크릴레이트, 예컨대 메틸, 에틸, 다른 알킬, 하이드록시에틸 메트아크릴레이트, 아크릴 및 메트아크릴산 및 기타, 예컨대 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐 피롤리돈), 및 폴리(비닐 아세테이트); 폴리(우레탄); 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 알킬, 하이드록시알킬, 에테르, 에스테르, 나이트로셀룰로스, 및 다양한 셀룰로스 아세테이트; 폴리실록산; 및 이들의 임의의 화학적 유도체(치환, 화학기, 예를 들어, 알킬, 알킬렌의 첨가, 하이드록실화, 산화 및 다른 변형은 당업자에 의해 일상적으로 이루어짐), 공중합체 및 이들의 혼합물.
폴리(락타이드-코-글리콜라이드) 마이크로스피어가 또한 안구내 주사를 위해 사용될 수 있다. 통상적으로 마이크로스피어는 중공 구체를 형성하도록 구조화된 락트산 및 글리콜산의 중합체로 구성된다. 구체는 직경이 대략 15 마이크론 내지 30 마이크론일 수 있고, 본 명세서에 기재된 구성성분과 함께 장입될 수 있다.
구성성분의 바이모달 또는 차별적 전달
RNA-가이드 뉴클레아제 시스템의 구성성분, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제 분자 구성성분(예를 들어, Cas9 또는 Cpf1 분자 구성성분), gRNA 분자 구성성분, 및 RHO cDNA 분자 구성성분의 별도의 전달, 및 더 구체적으로, 상이한 방식에 의한 구성성분의 전달은, 예를 들어, 조직 특이성 및 안전성을 개선시킴으로써 성능을 향상시킬 수 있다.
구현예에서, RNA-가이드 뉴클레아제 분자 구성성분, gRNA 분자 구성성분, 및 RHO cDNA 분자 구성성분은 상이한 방식에 의해, 또는 차별적 방식으로서 본 명세서에서 때때로 지칭된 바와 같이 전달된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 상이한 또는 차별적 방식은 대상 구성성분 분자, 예를 들어, n RNA-가이드 뉴클레아제 분자, gRNA 분자, 또는 RHO cDNA 분자에 대해 상이한 약역학적 또는 약동학적 특성을 부여하는 전달 방식을 지칭한다. 예를 들어, 전달 방식은, 예를 들어, 선택된 격막, 조직 또는 기관에서 상이한 조직 분포, 상이한 반감기 또는 상이한 시간적 분포를 초래할 수 있다.
일부 전달 방식, 예를 들어, 자동 복제 또는 세포 핵산 내로의 삽입에 의한, 예를 들어, 세포에서 또는 세포의 자손에서 지속되는 핵산 벡터에 의한 전달은 구성성분의 더 지속적인 발현 및 구성성분의 존재를 초래한다. 예는, 바이러스, 예를 들어, 아데노 연관 바이러스 또는 렌티바이러스 전달을 포함한다.
예로서, 구성성분, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제 분자, gRNA 분자, 및 RHO cDNA 분자는 신체에서 또는 특정 격막, 조직 또는 기관에서 전달된 구성성분의 얻어진 반감기 또는 잔류의 측면에서 상이한 방식에 의해 전달될 수 있다. 구현예에서, gRNA 분자는 이러한 방식에 의해 전달될 수 있다. RNA-가이드 뉴클레아제 분자 구성성분은 신체 또는 특정 격막 또는 조직 또는 기관에 대한 더 적은 잔류 또는 더 적은 노출을 야기하는 방식으로 전달될 수 있다. RHO cDNA 분자는 gRNA 분자 구성성분 및 RNA-가이드 뉴클레아제 분자 구성성분의 방식과 상이한 방식에 의해 전달될 수 있다.
더 일반적으로, 구현예에서, 제1 전달 방식은 제1 구성성분을 전달하기 위해 사용되고, 제2 전달 방식은 제2 구성성분을 전달하기 위해 사용된다. 제1 전달 방식은 제1 약역학적 또는 약동학적 특성을 부여한다. 제1 약역학적 특성은 신체, 격막, 조직 또는 기관 내에서 구성성분의 또는 구성성분을 암호화하는 핵산의, 예를 들어, 분포, 잔류성 또는 노출일 수 있다. 제2 전달 방식은 제2 약역학적 또는 약동학적 특성을 부여한다. 제2 약역학적 특성은 신체, 격막, 조직 또는 기관 내에서 구성성분의 또는 구성성분을 암호화하는 핵산의, 예를 들어, 분포, 잔류, 또는 노출일 수 있다.
구현예에서, 제1 약역학적 또는 약동학적 특성, 예를 들어, 분포, 잔류, 또는 노출은 제2 약역학적 또는 약동학적 특성보다 더 제한된다.
구현예에서, 제1 전달 방식은 약역학적 또는 약동학적 특성, 예를 들어, 분포, 잔류 또는 노출을 최적화, 예를 들어, 최소화하도록 선택된다.
구현예에서, 제2 전달 방식은 약역학적 또는 약동학적 특성, 예를 들어, 분포, 잔류 또는 노출을 최적화, 예를 들어, 최대화하도록 선택된다.
구현예에서, 제1 전달 방식은 상대적 잔류 구성요소, 예를 들어, 핵산, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 또는 렌티바이러스의 사용을 포함한다. 이러한 벡터는 상대적으로 잔류성이고, 그들로부터 전사된 산물도 상대적으로 잔류성일 것이다.
구현예에서, 제2 전달 방식은 상대적으로 일시적 구성요소, 예를 들어, RNA 또는 단백질을 포함한다.
구현예에서, 제1 구성성분은 gRNA를 포함하고, 전달 방식은 상대적으로 잔류성이며, 예를 들어, gRNA는 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, AAV 또는 렌티바이러스로부터 전사된다. 이들 유전자의 전사는 유전자가 단백질 산물을 암호화하지 않고, gRNA는 단리에서 작용할 수 없기 때문에 생리적 결과를 거의 나타내지 아니할 것이다. 제2 구성성분인 RNA-가이드 뉴클레아제 분자는 일시적 방식으로, 예를 들어, mRNA로서 또는 단백질로서 전달되어 전체 RNA-가이드 뉴클레아제 분자/gRNA 분자 복합체가 단지 존재하고 단시간 동안 활성이라는 것을 보장한다.
더 나아가, 구성성분은 안전성 및 조직 특이성을 증강시키기 위해 서로를 보완하는 상이한 분자 형태로 또는 상이한 전달 벡터로 전달될 수 있다.
차별적 전달 방식의 사용은 성능, 안전성 및 효능을 증강시킬 수 있다. 예를 들어, 궁국적인 표적을 벗어난 변형의 가능성은 감소될 수 있다. 더 적게 잔류성인 방식에 의한 면역원성 구성성분, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제 분자의 전달은 면역원성을 감소시킬 수 있는데, 박테리아 유래 Cas 효소로부터의 펩타이드가 MHC 분자에 의해 세포 표면 상에 나타나기 때문이다. 2 부분 전달 시스템은 이들 결점을 완화할 수 있다.
차별적 전달 방식은 구성성분을 상이하지만, 중복된 표적 영역에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 형성 활성 복합체(formation active complex)는 표적 영역의 중복 밖으로 최소화된다. 따라서, 구현예에서, 제1 구성성분, 예를 들어, gRNA 분자는 제1 공간적, 예를 들어, 조직 분포를 초래하는 제1 전달 방식에 의해 전달된다. 제2 구성성분, 예를 들어, RNA-가이드 뉴클레아제 분자는 제2 공간적, 예를 들어, 조직 분포를 초래하는 제2 전달 방식에 의해 전달된다. 구현예에서, 제1 방식은 리포좀, 나노입자, 예를 들어, 중합체 나노입자, 및 핵산, 예를 들어, 바이러스 벡터로부터 선택된 제1 구성요소를 포함한다. 제2 방식은 상기 군으로부터 선택된 제2 구성요소를 포함한다. 구현예에서, 제1 전달 방식은 제1 표적화 구성요소, 예를 들어, 세포 특이적 수용체 또는 항체를 포함하고, 제2 전달 방식은 해당 구성요소를 포함하지 않는다. 구현예에서, 제2 전달 방식은 제2 표적화 구성요소, 예를 들어, 제2 세포 특이적 수용체 또는 제2 항체를 포함한다.
RNA-가이드 뉴클레아제 분자가 바이러스 전달 벡터, 리포좀 또는 중합체 나노입자에서 전달될 때, 단일 조직만을 표적화하는 것이 바람직할 수 있을 때에 다수 조직에 대한 전달에 대한 그리고 다수 조직에서의 치료적 활성에 대한 가능성이 있다. 2-부분 전달 시스템은 이러한 도전을 해결할 수 있으며 조직 특이성을 향상시킬 수 있다. gRNA 분자 및 RNA-가이드 뉴클레아제 분자가 별도이지만 중복된 조직 향성을 지니는 분리된 전달 비히클에서 패키징된다면, 완전히 기능성인 복합체는 벡터 둘 다에 의해 표적화된 조직에서 단지 형성된다.
생체외 전달
일부 구현예에서, 표 8에 기재된 구성성분은 세포에 도입된 후, 대상체에 도입된다. 구성성분을 도입하는 방법은, 예를 들어, 표 9에 기재된 임의의 전달 방법을 포함할 수 있다.
VIII. 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 및 핵산
본 개시내용의 일부 구현예에서, 변형된 뉴클레오사이드 및/또는 변형된 뉴클레오타이드는 핵산, 예를 들어, 본원에 제공된 gRNA 분자에 존재할 수 있다. 본 발명의 RNA-가이드 뉴클레아제 기술의 맥락에서 유용한 일부 예시적인 예시적인 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 및 핵산 변형이 본 명세서에 제공되고, 당업자는 본 개시내용에 기초하여 본 명세서에 개시된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 및 핵산 및 치료 양식과 함께 사용될 수 있는 추가의 적합한 변형을 확인할 수 있을 것이다. 적합한 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드, 및 핵산 변형은, 제한 없이, 미국 특허 출원 제US 2017/0073674 A1호 및 국제 공개 WO 2017/165862 A1호에 기재된 것들을 포함하며, 이들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
실시예
하기 실시예는 단지 예시적인 것이며, 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: T 세포에서
RHO
대립유전자를 편집하기 위한 gRNA의 스크리닝
Cas9와 사용하기 위한 RHO 유전자 내의 다양한 위치를 표적화하는 대략 430 개의 gRNA를 설계하고, T 세포에서 편집 활성에 대해 스크리닝하였다. 간략히, SA Cas9 및 가이드 RNA를 1:2 비율로 복합체화하고(RNP 복합체), 전기천공을 통해 T 세포로 전달하였다. 전기천공 3 일 후, T 세포로부터 gDNA를 추출하고, 표적 부위를 gDNA로부터 PCR 증폭시켰다. RHO PCR 유전자 산물의 시퀀싱 분석을 차세대 유전자 시퀀싱(NGS)에 의해 평가하였다. 하기 표 18은 T 세포에서 >0.1% 편집을 나타낸 gRNA의 표적화 도메인의 RNA 및 DNA 서열을 제공한다. 이들 데이터는 표 18 및 Cas9에 제시된 표적화 도메인을 포함하는 gRNA가 RHO 유전자의 편집을 지원한다는 것을 시사한다.
실시예 2: HEK293 세포에서
RHO
대립유전자의 용량-의존적 편집
표적 부위가 RHO 유전자, RHO-3, RHO-7 및 RHO-10(표 17)의 엑손 1 또는 엑손 2 내에 있을 것으로 예측되는 3 개의 gRNA를 추가 최적화를 위해 선택하고, Cas9로 용량-의존적 편집에 대해 시험하였다. 간략히, 증가된 농도의 제어 플라스미드(인간 게놈 내 서열을 표적화하지 않는 스크램블된 gRNA로 Cas9를 발현함) 또는 Cas9 및 gRNA를 발현하는 플라스미드를 전기천공에 의해 HEK293 세포로 전달하였다. 전기천공 3 일 후, HEK293 세포로부터 gRNA를 추출하고, gRNA 표적 부위를 gDNA로부터 PCR 증폭시켰다. RHO PCR 유전자 산물의 시퀀싱 분석을 NGS에 의해 평가하였다. 증가된 농도의 Cas9/gRNA 플라스미드는 RHO 유전자에서 인델의 증가를 80% 지원하였다(도 4). 시퀀싱 분석은 플라스미드 농도의 증가가 인델의 증가를 초래했다는 것을 시사하였다.
[표 17]
RHO
유전자를 표적화하는 gRNA
gRNA(즉, RHO-3, RHO-7, RHO-10) 및 Cas9 리보뉴클레오단백질 복합체의 특이성을 CRISPR-Cas9 특이성을 프로파일링하기 위해 당업자에게 널리 공지되어 있는 두 가지 상이한 검정인 Digenome-seq(디지털 게놈 시퀀싱) 및 GUIDE-seq 검정을 이용하여 평가하였다. Cas9와 복합체화된 RHO-3, RHO-7 또는 RHO-10 gRNA를 포함하는 RNP에 대한 생리학적 조건 하에서 분명한 표적외 편집이 검출되지 않았다(데이터 미도시).
실시예 3: RHO-3, RHO-7, 및 RHO-10 gRNA에 의한 표적상 편집의 시뮬레이션에 의해 생성된 신규한
RHO
대립유전자의 특징화
RHO 대립유전자의 RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA(표 17에서의 표적화 도메인 참조)의 표적상 편집에 의해 생성된 절단 부위를 예측하였다. 도 5는 RHO 인간 cDNA에서 RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA의 예측 절단 위치 및 생성된 RHO 단백질의 길이를 예시한 것이다. RHO-3은 엑손 1을 표적화하는 것으로 예측되고, RHO-10은 엑손 2와 인트론 2의 경계를 표적화하는 것으로 예측되고, RHO-7은 RHO cDNA의 엑손 1과 인트론 1의 경계를 표적화하는 것으로 예측되었다. RHO-3, RHO-10, 또는 RHO-7 표적 부위에서 1 개 또는 2 개의 염기쌍의 결실은 비정상적인 RHO 단백질을 초래하는 RHO cDNA에서 프레임시프트를 야기할 것으로 예측된다. 도 6은 RHO-3, RHO-10, 또는 RHO-7 gRNA에 의한 편집으로부터 생성된 예상 RHO 대립유전자의 도식을 나타낸다.
RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA에 의한 표적상 편집에 의해 생성된 대립유전자의 효과를 이들 gRNA를 사용한 편집이 잠재적으로 유해한 RHO 대립유전자를 초래할 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 특징화하였다. 간략히, 야생형(WT) 또는 모의-편집된 RHO 대립유전자를 CMV 프로모터의 제어 하에 포유류 발현 플라스미드로 클로닝하고, HEK293 세포로 리포펙션하였다. 모의-편집된 RHO 대립유전자는 도 6에 도시된 돌연변이된 대립유전자(즉, RHO-3(-1 bp, -2 bp, 또는 -3 bp), RHO-10(-1 bp, -2 bp, 또는 -3 bp), 또는 RHO-7(-1 bp, -2 bp, -3 bp)) 각각을 포함하였다. 우성 형태의 망막색소변성증을 유발하는 잘 알려진 P23H RHO 변이체도 클로닝하고 시험하였다. 48 시간의 과발현 후, WT 및 각각의 모의-편집된 대립유전자에 대한 세포 생존력을 ATPLite 발광 분석(Perkin Elmer)을 사용하여 평가하였다.
WT RHO 과발현은 벡터 대조군(pUC19 플라스미드, 상부 점선)과 관련하여 상대적으로 세포 독성을 유도하지 않았지만, P23H RHO는 예상대로 50% 세포 사멸(하단 점선)을 초래하였다(도 7a). 또한, RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA 표적 부위에서 1- 또는 2-염기쌍 결실의 프레임시프팅의 발현은 WT RHO와 관련하여 세포 생존력의 유의한 손실을 유도하지 않았다(도 7a, RHO-3 1 및 2 bp del; RHO-10 1 및 2 bp del; 및 RHO-7 1 및 2 bp del 참조). 그러나, RHO-3 및 RHO-10 표적 부위에서의 인-프레임 3-염기쌍 결실의 경우, 세포 생존력의 유의한 손실이 있었고, P23H RHO와 비슷한 수준의 세포 사멸을 초래하였다(도 7a, RHO-3 3 bp del 및 RHO-10 3 bp del 참조). 이는 RHO-7 서열에서의 3-염기쌍 결실이 비-세포독성 RHO 대립유전자를 초래했기 때문에 모든 gRNA에 해당하는 것은 아니었다(도 7a, RHO-7 3 bp del 참조).
다음으로, RHO-3, RHO-7 및 RHO-10 모의-편집된 RHO 대립유전자가 RHO의 P23H 변이체의 독성을 감소시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 도 6에 도시되고 P23H 돌연변이를 함유하는 모의-편집된 RHO-3, RHO-7 및 RHO-10 RHO 대립유전자를 CMV 프로모터의 제어 하에 포유류 발현 플라스미드로 클로닝하고, HEK293 세포로 리포펙션하였다. 48 시간의 과발현 후, WT 및 각각의 모의-편집된 대립유전자에 대한 세포 생존력을 ATPLite 발광 검정(Perkin Elmer)을 사용하여 평가하였다.
RHO-3, RHO-7, 또는 RHO-10 gRNA 표적 부위에서 1- 또는 2-염기쌍 결실의 프레임시프팅의 발현은 RHO의 P23H 변이체의 독성을 감소시키고, WT RHO와 관련하여 세포 생존력의 유의한 손실을 유도하지 않았다(도 7b, RHO-3 1 및 2 bp del; RHO-10 1 및 2 bp del; 및 RHO-7 1 및 2 bp del 참조). RHO-3 및 RHO-10 표적 부위에서의 인-프레임 3-염기쌍 결실은, 세포 생존력의 유의한 손실이 있었고 P23H RHO와 비슷한 수준의 세포 사멸을 초래하였기 때문에 RHO의 P23H 변이체의 독성을 감소시키지 않았다(도 7b, RHO-3 3 bp del 및 RHO-10 3 bp del 참조). 그러나, RHO-7 표적 서열에서의 3-염기쌍 결실은 RHO의 P23H 변이체의 독성을 감소시키고, 비-세포독성 RHO 대립유전자를 초래했다(도 7b, RHO-7 3 bp del 참조).
이들 데이터는 RHO-3, RHO-7 또는 RHO-10 gRNA에 의해 생성된 프레임외 RHO 편집이 생산적이고 비독성인 반면, 프레임내 편집의 효과는 gRNA/유전자좌 의존적이었다는 것을 시사하였다.
실시예 4:
RHO
유전자를 표적화하는 Cas9 및 gRNA를 포함하는 리보뉴클레오단백질에 의한 비-인간 영장류 외식편의 편집
비-인간 영장류(NHP)로부터의 외식편을 편집하도록 RHO 유전자 및 Cas9를 표적화하는 RHO-9 gRNA를 포함하는 리보뉴클레오단백질의 능력을 평가하였다. RHO-9 gRNA(서열번호 108(RNA)(서열번호 608(DNA)에 기재된 표적화 도메인 서열 포함, 표 1)는 교차 반응성이며, 인간과 NHP RHO 서열 둘 다를 편집할 수 있다.
간략히, NHP 도너로부터의 망막 외식편을 수확하고, 24 웰 플레이트에서 트랜스-웰 챔버 상에서 막으로 옮겼다. 300 μl의 망막 배지를 24 웰 플레이트(즉, B27(VitA 포함) 50X(20 mL), 항생제-항진균제(5 mL) 및 GlutaMAX 1%(5 mL)를 함유하는 Neurobasal-A 배지(페놀 레드 없음)(470 mL))에 첨가하였다. RHO-9 gRNA, SA Cas9 및 대체 RHO를 포함하는 이중 AAV를 사용한 형질도입은 24 시간 내지 48 시간 후에 발생하였다. AAV를 총 100 μl의 최종 농도를 얻도록 망막 배지를 이용하여 원하는 역가(1012 vg/ml)로 희석하였다. 희석된/역가된 AAV를 24 웰 플레이트에서 외식편의 상부에 적가하였다. 72 시간마다 300 μl의 망막 배지를 보충하였다. 2 주 내지 4 주 후, 외식편을 용해시켜 분자 생물학 분석을 위한 DNA, RNA 및 단백질을 얻었다. 외식편에서 간상체의 백분율을 측정하기 위해, 간상체-특이적 mRNA(신경 망막 류신 지퍼(NRL))를 외식편으로부터 추출하고 측정하였다. 하우스키핑 RNA(베타 액틴(ACTB))을 또한 측정하여 총 세포 수를 결정하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 각 데이터 점은 상이한 수의 간상체 광수용체를 함유할 수 있는 단일 외식편을 나타낸다. x-축은 RT-qPCR에 의해 측정한 바와 같은 ACTB와 NRL RNA 수준 사이의 델타를 나타내며, 이는 외식편을 용해한 시점에 외식편 중 간상체의 백분율에 대한 척도이다. 상당수의 간상체를 갖는 외식편에서 강한 편집 수준이 달성될 수 있다는 것을 입증하는, 간상체의 높은 백분율과 유의한 편집 사이의 상관관계가 나타났다(도 8). 이들 데이터는 RHO를 표적화하는 gRNA가 비-인간 영장류 외식편을 효율적으로 편집할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 5: RHO 대체 벡터의 최적화
RHO 대체 벡터(예를 들어, 프로모터, UTR, RHO 서열)의 다양한 구성성분을 RHO mRNA 및 RHO 단백질의 최대 발현을 위한 최적의 RHO 대체 벡터를 확인하도록 최적화하였다. 먼저, 이중 루시페라제 시스템을 상이한 길이의 RHO 프로모터가 RHO 발현에 대하여 갖는 영향을 시험하도록 설계하였다. 루시페라제 시스템의 구성성분은 플라스미드 농도 및 형질감염 효율에 대해 정규화하기 위해 백본에서 CMV에 의해 구동되는 레닐라 루시페라제를 포함하였다(도 9).
간략히, 자기-절단 T2A 펩타이드(100 ng/10,000 개 세포)에 의해 분리된 반딧불이 루시페라제로 태깅된 상이한 길이의 RHO 프로모터 및 RHO 유전자를 함유하는 플라스미드를 NRL, CRX 및 NONo(100 ng/10,000)를 발현하는 플라스미드와 함께 HEK293 세포로 형질감염시켜 RHO 프로모터로부터의 발현을 개시하였다(전체 내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌[Yadav 2014] 참조). 72 시간 후 세포를 용해시키고, 형질감염 효율(반딧불이)과 실험 변수(NanoLuc) 둘 다를 분석하였다. Nano-Glo® Dual-Luciferase® 리포터 검정 시스템(Promega Corporation, Cat# N1521)을 사용하여 발광을 측정하였다. 반딧불이와 NanoLuc 둘 다로부터의 발광을 측정하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, 최소 250 bp RHO 프로모터(서열번호 44)를 포함하여 상이한 길이의 프로모터는 기능적인 것으로 밝혀졌다.
다음으로, 3' UTR이 RHO mRNA 및 RHO 단백질의 발현을 개선시킬 수 있는지의 여부를 결정하기 위해 다양한 3' UTR을 시험하였다. 간략히, 매우 안정한 전사체 및 유전자로부터의 3' UTR을 CMV RHO(즉, HBA1 3' UTR(서열번호 38), 짧은 HBA1 3' UTR(서열번호 39), TH 3' UTR(서열번호 40), COL1A1 3'UTR(서열번호 41), ALOX15 3'UTR(서열번호 42), 및 minUTR(서열번호 56))의 하류에서 클로닝하였다. 벡터(500 ng)를 HEK293 세포(80,000 개 세포/웰)로 형질감염시켰다. 72 시간 후에 세포를 용해시키고, RHO mRNA 및 단백질 발현 수준을 각각 RHO RT-qPCR 및 RHO ELISA 검정을 이용하여 결정하였다. 도 11a는 안정한 전사체로부터의 3' UTR의 RHO 대체 벡터로의 혼입이 RHO mRNA 발현 수준을 개선시켰다는 것을 나타낸다. 도 11b는 안정한 전사체로부터의 3' UTR의 RHO 대체 벡터로의 혼입도 RHO 단백질 발현 수준을 개선시켰다는 것을 나타낸다.
다음으로, RHO 단백질 발현에 대한 영향을 결정하기 위해 RHO 인트론 1, 2, 3 또는 4 서열의 혼입을 RHO 대체 벡터에서 RHO cDNA(즉, 각각 서열번호 4 내지 7)에 첨가하였다. 벡터(500 ng 및 250 ng)를 HEK293 세포(80,000 개/웰)로 형질감염시켰다. 72 시간 후에 세포를 용해시키고, RHO 단백질 발현을 RHO ELISA를 이용하여 결정하였다. 도 12는 인트론의 첨가가 RHO 단백질 발현에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
마지막으로, RHO 발현에 대한 코돈 최적화의 영향을 결정하기 위해 상이한 코돈 최적화 RHO cDNA 작제물(즉, 서열번호 13 내지 18)을 시험하였다. 벡터(500 ng 및 250 ng)를 HEK293 세포(80,000 개/웰)로 형질감염시켰다. 72 시간 후에 세포를 용해시키고, RHO 단백질 발현을 RHO ELISA를 이용하여 결정하였다. 도 13은 RHO cDNA의 코돈 최적화가 RHO 단백질 발현에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
실시예 6: 성공적인 편집 후 Cas9 수준을 감소시키는 자기-제한적 Cas9 벡터 시스템을 이용한 생체내 편집
RHO 게놈을 편집하고 Cas9 벡터 발현을 비-기능적으로 만드는 Cas9 및 gRNA를 발현하는 이중 벡터 시스템의 능력을 생체내에서 시험하였다. 자기-제한적 벡터 시스템은 이전에 공개되었다(전체 내용이 본원에 참고로 포함되는, 명칭이 Systems and Methods for One-Shot guide RNA (ogRNA) Targeting of Endogenous and Source DNA인 2018년 6월 14일에 공개된 제WO2018/106693호 참조). 간략히, Cas9 벡터가 Cas9 cDNA(SD Cas9) 내의 RHO gRNA에 대한 표적 부위를 포함한 Cas9 벡터 시스템이 생성되었다. SD Cas9 및 RHO 벡터의 투여 6 주 후, Cas9 단백질 수준, Cas9 AAV 및 RHO의 편집을 평가하였다.
도 14a는 SD Cas9 벡터 시스템이 Cas9 수준의 성공적인 침묵화를 입증했다는 것을 시사한다. 도 14b는 SD Cas9 시스템을 운반하는 벡터 시스템이 야생형 Cas9 서열을 암호화하는 벡터 시스템에 비해 약간 더 낮은 수준이기는 하지만 RHO 유전자좌에서 강한 편집을 초래했다는 것을 시사한다.
실시예 7:
RHO
유전자 및 Cas9를 표적화하는 gRNA를 포함하는 리보뉴클레오단백질에 의한 인간 외식편의 편집
인간 외식편을 편집하도록 RHO 유전자 및 Cas9를 표적화하는 RHO-9 gRNA(표 1)를 포함하는 리보뉴클레오단백질의 능력을 평가하였다. 간략히, 한 명의 인간 도너로부터의 망막 외식편을 수확하고, 24 웰 플레이트에서 트랜스-웰 챔버 상에서 막으로 옮겼다. 300 μl의 망막 배지를 24 웰 플레이트(즉, B27(VitA 포함) 50X(20 mL), 항생제-항진균제(5 mL) 및 GlutaMAX 1%(5 mL)를 함유하는 Neurobasal-A 배지(페놀 레드 없음)(470 mL))에 첨가하였다. 상이한 "넉다운 및 대체" 전략을 비교하였다: "shRNA": RHO 유전자를 표적화하는 shRNA 및 RHO cDNA를 제공하는 대체 벡터를 이용한 망막 외식편의 형질도입(문헌[Cideciyan 2018]에 공개된 바와 같음); "벡터 A": 2-벡터 시스템(최소 RHO 프로모터(250 bp)에 의해 구동되는 saCas9를 포함하는 벡터 1, 및 코돈-최적화 RHO cDNA(코돈 6(서열번호 18))를 포함하고 최소 250 bp RHO 프로모터의 제어 하에 HBA1 3' UTR, 뿐만 아니라 U6 프로모터의 제어 하에 RHO-9 gRNA를 포함하는 벡터 2); "벡터 B": wt RHO cDNA를 포함하는 벡터 2를 제외하고 "벡터 A"와 동일한 2-벡터 시스템; 및 "UTC": 형질도입되지 않은 대조군. 각각의 AAV를 총 100 μl의 최종 농도를 얻도록 망막 배지를 이용하여 원하는 역가(1 x 1012 vg/ml)까지 희석하였다. 희석된/역가된 AAV를 24 웰 플레이트에서 외식편의 상부에 적가하였다. 72 시간마다 300 μl의 망막 배지를 보충하였다. 4 주 후, 외식편을 용해시켜 분자 생물학 분석을 위한 단백질을 얻었다. RHO 단백질:총 단백질의 비율을 측정하였다. 데이터는 벡터 A(최소 250 bp 프로모터, RHO cDNA, HBA1 3' UTR, 및 RHO-9 gRNA 포함)가 RHO 단백질의 강한 발현을 초래했다는 것을 시사한다(도 15).
실시예 8: 유전자 편집 시스템을 이를 필요로 하는 환자에게 투여
adRP를 나타내는 인간 환자에게 2 개의 AAV5-기반 발현 벡터를 포함하는 유전자 편집 시스템을 투여하였다.
벡터 1은 GRK1 프로모터의 제어 하에 또는 RHO 최소 프로모터(예를 들어, 250 bp RHO 프로모터)의 제어 하에 핵 국소화 서열에 의해 각 부위에서 측접하는 스타필로코커스 아우레우스 Cas9 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
벡터 2는 각각 U6 프로모터의 제어 하에 하나 이상의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 하나 이상의 가이드 RNA의 표적화 도메인은 독립적으로 하기 서열로부터 선택된다:
RHO-1: GUCAGCCACAAGGGCCACAGCC (서열번호 100)
RHO-2: CCGAAGACGAAGUAUCCAUGCA (서열번호 101)
RHO-3: AGUAUCCAUGCAGAGAGGUGUA (서열번호 102)
RHO-4: CUAGGUUGAGCAGGAUGUAGUU (서열번호 103)
RHO-5: CAUGGCUCAGCCAGGUAGUACU (서열번호 104)
RHO-6: ACGGGUGUGGUACGCAGCCCCU (서열번호 105)
RHO-7: CCCACACCCGGCUCAUACCGCC (서열번호 106)
RHO-8: CCCUGGGCGGUAUGAGCCGGGU (서열번호 107)
RHO-9: CCAUCAUGGGCGUUGCCUUCAC (서열번호 108)
RHO-10: GUGCCAUUACCUGGACCAGCCG (서열번호 109)
RHO-11: UUACCUGGACCAGCCGGCGAGU (서열번호 110)
가이드 RNA를 암호화하는 핵산 서열은 U6 프로모터의 제어 하에 있다. 벡터 2는 추가로 RHO 원위 인핸서의 일부 및 RHO 근위 프로모터 영역의 일부를 포함하는 최소 RHO 프로모터 서열의 제어 하에 RHO 5'-UTR, RHO cDNA를 암호화하는 상류 서열, 및 HBA1 3'-UTR을 암호화하는 하류 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 벡터 2의 [프로모터]-[5'UTR]-[cDNA]-[3'UTR] 서열은 하기와 같다:
(서열번호 8)
RHO cDNA에 존재하는 야생형 RHO 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하는 가이드 RNA가 사용되는 경우, RHO cDNA의 코돈-변형 버전은 상기 핵산 작제물에 포함된 RHO cDNA를 대체할 수 있다.
벡터 1 및 벡터 2를 당업계에 공지된 방법에 따라 바이러스 입자로 패키징하고, 1x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL 내지 3x1011 개 바이러스 게놈(vg)/mL의 약 300 마이크로리터의 용량으로 망막하 주사를 통해 환자에게 전달하였다. 환자는 투여 후에 모니터링되고, 주기적으로 adRP와 관련된 하나 이상의 증상에 대하여 평가를 거친다. 예를 들어, 환자는, 예를 들어, 암소시 미세시야계(scotopic microperimetry)에 의해 간상체 광수용체 기능의 평가를 주기적으로 거친다. 벡터 1 및 벡터 2를 투여한 지 약 1 년 후에, 환자는 적어도 하나의 adRP 관련 증상의 개선, 예를 들어, 환자에서 예상 수준의 간상체 기능에 비해, 또는 적절한 대조군에서, 임상 개입의 부재 하에 개선된 간상체 기능을 특징으로 하는 간상체 기능의 안정화를 나타냈다.
[표 18]
HEK293T 세포에서
RHO
대립유전자의 >0.1% 편집을 제공하는 gRNA
참고문헌의 포함
본 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은, 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함되어 있는 것으로 지시된 것처럼 전체가 참고로 본 명세서에 포함되어 있다. 충돌하는 경우, 본 명세서의 임의의 정의를 포함하여, 본 출원이 우선할 것이다.
균등물
당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 개시내용의 구체적인 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구항에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
추가 서열
특정 구현예에서 사용될 수 있는 예시적인 서열이 하기 기재된다:
AAV ITR:
(서열번호 92)
U6 프로모터:
(서열번호 78)
예시적인 saCas9 gRNA 프로토스페이서:
(서열번호 606)
가이드 RNA 스캐폴드 서열:
(서열번호 12)
최소 RHO 프로모터(250 bp):
(서열번호 44)
SV40 인트론:
(서열번호 94)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 1 (코돈 1):
(서열번호 13)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 2 (코돈 2):
(서열번호 14)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 3 (코돈 3):
(서열번호 15)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 4 (코돈 4):
(서열번호 16)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 5 (코돈 5):
(서열번호 17)
코돈 최적화 RHO-암호화 서열 6 (코돈 6):
(서열번호 18)
헤모글로빈 A1 (HBA1) 3' UTR:
(서열번호 38)
최소 UTR(minPolyA):
(서열번호 56)
반전 ITR 서열:
(서열번호 93)
예시적인 대체 벡터(코돈-최적화 RHO cDNA를 구동하는 250 bp 최소 RHO 프로모터; RHO를 표적화하는 gRNA를 구동하는 U6 프로모터) (이후 주석에 대해 도 16 참조):
(서열번호 11)
Cas9 벡터 2 (Cas9 w/알파 글로빈 UTR을 구동하는 250 bp 최소 RHO 프로모터) (이후 주석에 대해 도 17 참조):
(서열번호 10)
Cas9 벡터 1 (SV40 폴리A 신호를 갖는 wt Cas9를 구동하는 550 bp 최소 RHO 프로모터) (이후 주석에 대해 도 18 참조):
(서열번호 9)
참고 문헌
다른 구현예들은 하기 청구항 내에 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Editas Medicine, Inc.
<120> CRISPR/RNA-Guided Nuclease-Related Methods and Compositions for
Treating RHO-Associated Autosomal-Dominant Retinitis Pigmentosa
(ADRP)
<130> 118945-8018.WO00 (EM127PCT)
<140> PCT/US2020/019766
<141> 2020-02-25
<150> US 62/810,320
<151> 2019-02-25
<160> 1002
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6706
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO genomic
<400> 1
agagtcatcc agctggagcc ctgagtggct gagctcaggc cttcgcagca ttcttgggtg 60
ggagcagcca cgggtcagcc acaagggcca cagccatgaa tggcacagaa ggccctaact 120
tctacgtgcc cttctccaat gcgacgggtg tggtacgcag ccccttcgag tacccacagt 180
actacctggc tgagccatgg cagttctcca tgctggccgc ctacatgttt ctgctgatcg 240
tgctgggctt ccccatcaac ttcctcacgc tctacgtcac cgtccagcac aagaagctgc 300
gcacgcctct caactacatc ctgctcaacc tagccgtggc tgacctcttc atggtcctag 360
gtggcttcac cagcaccctc tacacctctc tgcatggata cttcgtcttc gggcccacag 420
gatgcaattt ggagggcttc tttgccaccc tgggcggtat gagccgggtg tgggtggggt 480
gtgcaggagc ccgggagcat ggaggggtct gggagagtcc cgggcttggc ggtggtggct 540
gagaggcctt ctcccttctc ctgtcctgtc aatgttatcc aaagccctca tatattcagt 600
caacaaacac cattcatggt gatagccggg ctgctgtttg tgcagggctg gcactgaaca 660
ctgccttgat cttatttgga gcaatatgcg cttgtctaat ttcacagcaa gaaaactgag 720
ctgaggctca aagaagtcaa gcgccctgct ggggcgtcac acagggacgg gtgcagagtt 780
gagttggaag cccgcatcta tctcgggcca tgtttgcagc accaagcctc tgtttccctt 840
ggagcagctg tgctgagtca gacccaggct gggcactgag ggagagctgg gcaagccaga 900
cccctcctct ctgggggccc aagctcaggg tgggaagtgg attttccatt ctccagtcat 960
tgggtcttcc ctgtgctggg caatgggctc ggtcccctct ggcatcctct gcctcccctc 1020
tcagcccctg tcctcaggtg cccctccagc ctccctgccg cgttccaagt ctcctggtgt 1080
tgagaaccgc aagcagccgc tctgaagcag ttcctttttg ctttagaata atgtcttgca 1140
tttaacagga aaacagatgg ggtgctgcag ggataacaga tcccacttaa cagagaggaa 1200
aactgaggca gggagagggg aagagactca tttagggatg tggccaggca gcaacaagag 1260
cctaggtctc ctggctgtga tccaggaata tctctgctga gatgcaggag gagacgctag 1320
aagcagccat tgcaaagctg ggtgacgggg agagcttacc gccagccaca agcgtctctc 1380
tgccagcctt gccctgtctc ccccatgtcc aggctgctgc ctcggtccca ttctcaggga 1440
atctctggcc attgttgggt gtttgttgca ttcaataatc acagatcact cagttctggc 1500
cagaaggtgg gtgtgccact tacgggtggt tgttctctgc agggtcagtc ccagtttaca 1560
aatattgtcc ctttcactgt taggaatgtc ccagtttggt tgattaacta tatggccact 1620
ctccctatgg aacttcatgg ggtggtgagc aggacagatg tctgaattcc atcatttcct 1680
tcttcttcct ctgggcaaaa cattgcacat tgcttcatgg ctcctaggag aggcccccac 1740
atgtccgggt tatttcattt cccgagaagg gagagggagg aaggactgcc aattctgggt 1800
ttccaccacc tctgcattcc ttcccaacaa ggaactctgc cccacattag gatgcattct 1860
tctgctaaac acacacacac acacacacac acacaacaca cacacacaca cacacacaca 1920
cacacacaca aaactcccta ccgggttccc agttcaatcc tgaccccctg atctgattcg 1980
tgtcccttat gggcccagag cgctaagcaa ataacttccc ccattccctg gaatttcttt 2040
gcccagctct cctcagcgtg tggtccctct gccccttccc cctcctccca gcaccaagct 2100
ctctccttcc ccaaggcctc ctcaaatccc tctcccactc ctggttgcct tcctagctac 2160
cctctccctg tctagggggg agtgcaccct ccttaggcag tggggtctgt gctgaccgcc 2220
tgctgactgc cttgcaggtg aaattgccct gtggtccttg gtggtcctgg ccatcgagcg 2280
gtacgtggtg gtgtgtaagc ccatgagcaa cttccgcttc ggggagaacc atgccatcat 2340
gggcgttgcc ttcacctggg tcatggcgct ggcctgcgcc gcacccccac tcgccggctg 2400
gtccaggtaa tggcactgag cagaagggaa gaagctccgg gggctctttg tagggtcctc 2460
cagtcaggac tcaaacccag tagtgtctgg ttccaggcac tgaccttgta tgtctcctgg 2520
cccaaatgcc cactcagggt aggggtgtag ggcagaagaa gaaacagact ctaatgttgc 2580
tacaagggct ggtcccatct cctgagcccc atgtcaaaca gaatccaaga catcccaacc 2640
cttcaccttg gctgtgcccc taatcctcaa ctaagctagg cgcaaattcc aatcctcttt 2700
ggtctagtac cccgggggca gccccctcta accttgggcc tcagcagcag gggaggccac 2760
accttcctag tgcaggtggc catattgtgg ccccttggaa ctgggtccca ctcagcctct 2820
aggcgattgt ctcctaatgg ggctgagatg agacacagtg gggacagtgg tttggacaat 2880
aggactggtg actctggtcc ccagaggcct catgtccctc tgtctccaga aaattcccac 2940
tctcacttcc ctttcctcct cagtcttgct agggtccatt tcttacccct tgctgaattt 3000
gagcccaccc cctggacttt ttccccatct tctccaatct ggcctagttc tatcctctgg 3060
aagcagagcc gctggacgct ctgggtttcc tgaggcccgt ccactgtcac caatatcagg 3120
aaccattgcc acgtcctaat gacgtgcgct ggaagcctct agtttccaga agctgcacaa 3180
agatccctta gatactctgt gtgtccatct ttggcctgga aaatactctc accctggggc 3240
taggaagacc tcggtttgta caaacttcct caaatgcaga gcctgagggc tctccccacc 3300
tcctcaccaa ccctctgcgt ggcatagccc tagcctcagc gggcagtgga tgctggggct 3360
gggcatgcag ggagaggctg ggtggtgtca tctggtaacg cagccaccaa acaatgaagc 3420
gacactgatt ccacaaggtg catctgcatc cccatctgat ccattccatc ctgtcaccca 3480
gccatgcaga cgtttatgat ccccttttcc agggagggaa tgtgaagccc cagaaagggc 3540
cagcgctcgg cagccacctt ggctgttccc aagtccctca caggcagggt ctccctacct 3600
gcctgtcctc aggtacatcc ccgagggcct gcagtgctcg tgtggaatcg actactacac 3660
gctcaagccg gaggtcaaca acgagtcttt tgtcatctac atgttcgtgg tccacttcac 3720
catccccatg attatcatct ttttctgcta tgggcagctc gtcttcaccg tcaaggaggt 3780
acgggccggg gggtgggcgg cctcacggct ctgagggtcc agcccccagc atgcatctgc 3840
ggctcctgct ccctggagga gccatggtct ggacccgggt cccgtgtcct gcaggccgct 3900
gcccagcagc aggagtcagc caccacacag aaggcagaga aggaggtcac ccgcatggtc 3960
atcatcatgg tcatcgcttt cctgatctgc tgggtgccct acgccagcgt ggcattctac 4020
atcttcaccc accagggctc caacttcggt cccatcttca tgaccatccc agcgttcttt 4080
gccaagagcg ccgccatcta caaccctgtc atctatatca tgatgaacaa gcaggtgcct 4140
actgcgggtg ggagggcccc agtgccccag gccacaggcg ctgcctgcca aggacaagct 4200
acttcccagg gcaggggagg gggctccatc agggttactg gcagcagtct tgggtcagca 4260
gtcccaatgg ggagtgtgtg agaaatgcag attcctggcc ccactcagaa ctgctgaatc 4320
tcagggtggg cccaggaacc tgcatttcca gcaagccctc cacaggtggc tcagatgctc 4380
actcaggtgg gagaagctcc agtcagctag ttctggaagc ccaatgtcaa agtcagaagg 4440
acccaagtcg ggaatgggat gggccagtct ccataaagct gaataaggag ctaaaaagtc 4500
ttattctgag gggtaaaggg gtaaagggtt cctcggagag gtacctccga ggggtaaaca 4560
gttgggtaaa cagtctctga agtcagctct gccattttct agctgtatgg ccctgggcaa 4620
gtcaatttcc ttctctgtgc tttggtttcc tcatccatag aaaggtagaa agggcaaaac 4680
accaaactct tggattacaa gagataattt acagaacacc cttggcacac agagggcacc 4740
atgaaatgtc acgggtgaca cagccccctt gtgctcagtc cctggcatct ctaggggtga 4800
ggagcgtctg cctagcaggt tccctccagg aagctggatt tgagtggatg gggcgctgga 4860
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catgctcacc accatctgct gcggcaagaa cccactgggt gacgatgagg cctctgctac 5040
cgtgtccaag acggagacga gccaggtggc cccggcctaa gacctgccta ggactctgtg 5100
gccgactata ggcgtctccc atcccctaca ccttccccca gccacagcca tcccaccagg 5160
agcagcgcct gtgcagaatg aacgaagtca cataggctcc ttaatttttt tttttttttt 5220
aagaaataat taatgaggct cctcactcac ctgggacagc ctgagaaggg acatccacca 5280
agacctactg atctggagtc ccacgttccc caaggccagc gggatgtgtg cccctcctcc 5340
tcccaactca tctttcagga acacgaggat tcttgctttc tggaaaagtg tcccagctta 5400
gggataagtg tctagcacag aatggggcac acagtaggtg cttaataaat gctggatgga 5460
tgcaggaagg aatggaggaa tgaatgggaa gggagaacat atctatcctc tcagaccctc 5520
gcagcagcag caactcatac ttggctaatg atatggagca gttgtttttc cctccctggg 5580
cctcactttc ttctcctata aaatggaaat cccagatccc tggtcctgcc gacacgcagc 5640
tactgagaag accaaaagag gtgtgtgtgt gtctatgtgt gtgtttcagc actttgtaaa 5700
tagcaagaag ctgtacagat tctagttaat gttgtgaata acatcaatta atgtaactag 5760
ttaattacta tgattatcac ctcctgatag tgaacatttt gagattgggc attcagatga 5820
tggggtttca cccaaccttg gggcaggttt ttaaaaatta gctaggcatc aaggccagac 5880
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ctctagcacc tgggtcccag catctagagc atggagcctc tagaagccat gctcacccgc 6180
ccacatttaa ttaacagctg agtccctgat gtcatcctta tctcgaagag cttagaaaca 6240
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tgctccccct tctccatata agcaaagcca gaagctctag ctttacccag ctctgcctgg 6480
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ccctgaccct gggatggctg gattgagcaa tgagcagagc caagcagcac agagtcccct 6660
ggggctagag gtggaggagg cagtcctggg aatgggaaaa acccca 6706
<210> 2
<211> 1047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Wild-type RHO cDNA
<400> 2
atgaatggca cagaaggccc taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta 60
cgcagcccct tcgagtaccc acagtactac ctggctgagc catggcagtt ctccatgctg 120
gccgcctaca tgtttctgct gatcgtgctg ggcttcccca tcaacttcct cacgctctac 180
gtcaccgtcc agcacaagaa gctgcgcacg cctctcaact acatcctgct caacctagcc 240
gtggctgacc tcttcatggt cctaggtggc ttcaccagca ccctctacac ctctctgcat 300
ggatacttcg tcttcgggcc cacaggatgc aatttggagg gcttctttgc caccctgggc 360
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gagtcttttg tcatctacat gttcgtggtc cacttcacca tccccatgat tatcatcttt 660
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atctgctgcg gcaagaaccc actgggtgac gatgaggcct ctgctaccgt gtccaagacg 1020
gagacgagcc aggtggcccc ggcctaa 1047
<210> 3
<400> 3
000
<210> 4
<211> 2828
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO cDNA with intron 1
<400> 4
atgaatggca cagaaggccc taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta 60
cgcagcccct tcgagtaccc acagtactac ctggctgagc catggcagtt ctccatgctg 120
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gtggctgacc tcttcatggt cctaggtggc ttcaccagca ccctctacac ctctctgcat 300
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ggtatgagcc gggtgtgggt ggggtgtgca ggagcccggg agcatggagg ggtctgggag 420
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ctgagggaga gctgggcaag ccagacccct cctctctggg ggcccaagct cagggtggga 840
agtggatttt ccattctcca gtcattgggt cttccctgtg ctgggcaatg ggctcggtcc 900
cctctggcat cctctgcctc ccctctcagc ccctgtcctc aggtgcccct ccagcctccc 960
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cactcctggt tgccttccta gctaccctct ccctgtctag gggggagtgc accctcctta 2100
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ccttggtggt cctggccatc gagcggtacg tggtggtgtg taagcccatg agcaacttcc 2220
gcttcgggga gaaccatgcc atcatgggcg ttgccttcac ctgggtcatg gcgctggcct 2280
gcgccgcacc cccactcgcc ggctggtcca ggtacatccc cgagggcctg cagtgctcgt 2340
gtggaatcga ctactacacg ctcaagccgg aggtcaacaa cgagtctttt gtcatctaca 2400
tgttcgtggt ccacttcacc atccccatga ttatcatctt tttctgctat gggcagctcg 2460
tcttcaccgt caaggaggcc gctgcccagc agcaggagtc agccaccaca cagaaggcag 2520
agaaggaggt cacccgcatg gtcatcatca tggtcatcgc tttcctgatc tgctgggtgc 2580
cctacgccag cgtggcattc tacatcttca cccaccaggg ctccaacttc ggtcccatct 2640
tcatgaccat cccagcgttc tttgccaaga gcgccgccat ctacaaccct gtcatctata 2700
tcatgatgaa caagcagttc cggaactgca tgctcaccac catctgctgc ggcaagaacc 2760
cactgggtga cgatgaggcc tctgctaccg tgtccaagac ggagacgagc caggtggccc 2820
cggcctaa 2828
<210> 5
<211> 2253
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO cDNA with intron 2
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atgaatggca cagaaggccc taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta 60
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gtggctgacc tcttcatggt cctaggtggc ttcaccagca ccctctacac ctctctgcat 300
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ccagtagtgt ctggttccag gcactgacct tgtatgtctc ctggcccaaa tgcccactca 660
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atctcctgag ccccatgtca aacagaatcc aagacatccc aacccttcac cttggctgtg 780
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tcctcagtct tgctagggtc catttcttac cccttgctga atttgagccc accccctgga 1140
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taatgacgtg cgctggaagc ctctagtttc cagaagctgc acaaagatcc cttagatact 1320
ctgtgtgtcc atctttggcc tggaaaatac tctcaccctg gggctaggaa gacctcggtt 1380
tgtacaaact tcctcaaatg cagagcctga gggctctccc cacctcctca ccaaccctct 1440
gcgtggcata gccctagcct cagcgggcag tggatgctgg ggctgggcat gcagggagag 1500
gctgggtggt gtcatctggt aacgcagcca ccaaacaatg aagcgacact gattccacaa 1560
ggtgcatctg catccccatc tgatccattc catcctgtca cccagccatg cagacgttta 1620
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ccttggctgt tcccaagtcc ctcacaggca gggtctccct acctgcctgt cctcaggtac 1740
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aacaacgagt cttttgtcat ctacatgttc gtggtccact tcaccatccc catgattatc 1860
atctttttct gctatgggca gctcgtcttc accgtcaagg aggccgctgc ccagcagcag 1920
gagtcagcca ccacacagaa ggcagagaag gaggtcaccc gcatggtcat catcatggtc 1980
atcgctttcc tgatctgctg ggtgccctac gccagcgtgg cattctacat cttcacccac 2040
cagggctcca acttcggtcc catcttcatg accatcccag cgttctttgc caagagcgcc 2100
gccatctaca accctgtcat ctatatcatg atgaacaagc agttccggaa ctgcatgctc 2160
accaccatct gctgcggcaa gaacccactg ggtgacgatg aggcctctgc taccgtgtcc 2220
aagacggaga cgagccaggt ggccccggcc taa 2253
<210> 6
<211> 1163
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO cDNA with intron 3
<400> 6
atgaatggca cagaaggccc taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta 60
cgcagcccct tcgagtaccc acagtactac ctggctgagc catggcagtt ctccatgctg 120
gccgcctaca tgtttctgct gatcgtgctg ggcttcccca tcaacttcct cacgctctac 180
gtcaccgtcc agcacaagaa gctgcgcacg cctctcaact acatcctgct caacctagcc 240
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acttcggtcc catcttcatg accatcccag cgttctttgc caagagcgcc gccatctaca 1020
accctgtcat ctatatcatg atgaacaagc agttccggaa ctgcatgctc accaccatct 1080
gctgcggcaa gaacccactg ggtgacgatg aggcctctgc taccgtgtcc aagacggaga 1140
cgagccaggt ggccccggcc taa 1163
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<211> 1882
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO cDNA with intron 4
<400> 7
atgaatggca cagaaggccc taacttctac gtgcccttct ccaatgcgac gggtgtggta 60
cgcagcccct tcgagtaccc acagtactac ctggctgagc catggcagtt ctccatgctg 120
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gtcaccgtcc agcacaagaa gctgcgcacg cctctcaact acatcctgct caacctagcc 240
gtggctgacc tcttcatggt cctaggtggc ttcaccagca ccctctacac ctctctgcat 300
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ggtgaaattg ccctgtggtc cttggtggtc ctggccatcg agcggtacgt ggtggtgtgt 420
aagcccatga gcaacttccg cttcggggag aaccatgcca tcatgggcgt tgccttcacc 480
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ttctgctatg ggcagctcgt cttcaccgtc aaggaggccg ctgcccagca gcaggagtca 720
gccaccacac agaaggcaga gaaggaggtc acccgcatgg tcatcatcat ggtcatcgct 780
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tccaacttcg gtcccatctt catgaccatc ccagcgttct ttgccaagag cgccgccatc 900
tacaaccctg tcatctatat catgatgaac aagcaggtgc ctactgcggg tgggagggcc 960
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ctggccctga ctcaagcctc ttgccttcca gttccggaac tgcatgctca ccaccatctg 1800
ctgcggcaag aacccactgg gtgacgatga ggcctctgct accgtgtcca agacggagac 1860
gagccaggtg gccccggcct aa 1882
<210> 8
<211> 1670
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 2
<400> 8
ccacgtcaga atcaaaccct caccttaacc tcattagcgt tgggcataat caccaggcca 60
agcgccttaa actacgagag gccccatccc acccgccctg ccttagccct gccacgtgtg 120
ccaaacgctg ttagacccaa caccacccag gccaggtagg gggctggagc ccaggtgggc 180
atttgagtca ccaaccccca ggcagtctcc cttttcctgg atcctgagta cctctcctcc 240
ctgacctcag gcttcctcct agtgtcacct tggcccctct tagaagccaa ttaggccctc 300
agtttctgca gcggggatta atatgattat gaacaccccc aatctcccag atgctgattc 360
agccaggagc ttaggagggg gaggtcactt tataagggtc tgggggggtc agaacccaga 420
gtcatccagc tggagccctg agtggctgag ctcaggcctt cgcagcattc ttgggtggga 480
gcagccacgg gtcagccaca agggccacca ccatgaatgg cacagaaggc cctaacttct 540
acgtgccctt ctccaatgcg acgggtgtgg tacgcagccc cttcgagtac ccacagtact 600
acctggctga gccatggcag ttctccatgc tggccgccta catgtttctg ctgatcgtgc 660
tgggcttccc catcaacttc ctcacgctct acgtcaccgt ccagcacaag aagctgcgca 720
cgcctctcaa ctacatcctg ctcaacctag ccgtggctga cctcttcatg gtcctaggtg 780
gcttcaccag caccctctac acctctctgc atggatactt cgtcttcggg cccacaggat 840
gcaatttgga gggcttcttt gccaccctgg gcggtgaaat tgccctgtgg tccttggtgg 900
tcctggccat cgagcggtac gtggtggtgt gtaagcccat gagcaacttc cgcttcgggg 960
agaaccatgc catcatgggc gttgccttca cctgggtcat ggcgctggcc tgcgccgcac 1020
ccccactcgc cggctggtcc aggtacatcc ccgagggcct gcagtgctcg tgtggaatcg 1080
actactacac gctcaagccg gaggtcaaca acgagtcttt tgtcatctac atgttcgtgg 1140
tccacttcac catccccatg attatcatct ttttctgcta tgggcagctc gtcttcaccg 1200
tcaaggaggc cgctgcccag cagcaggagt cagccaccac acagaaggca gagaaggagg 1260
tcacccgcat ggtcatcatc atggtcatcg ctttcctgat ctgctgggtg ccctacgcca 1320
gcgtggcatt ctacatcttc acccaccagg gctccaactt cggtcccatc ttcatgacca 1380
tcccagcgtt ctttgccaag agcgccgcca tctacaaccc tgtcatctat atcatgatga 1440
acaagcagtt ccggaactgc atgctcacca ccatctgctg cggcaagaac ccactgggtg 1500
acgatgaggc ctctgctacc gtgtccaaga cggagacgag ccaggtggcc ccggcctaag 1560
ctggagcctc ggtggccatg cttcttgccc cttgggcctc cccccagccc ctcctcccct 1620
tcctgcaccc gtacccccgt ggtctttgaa taaagtctga gtgggcggca 1670
<210> 9
<211> 4498
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector 1: 550 bp minimal RHO promoter driving wt Cas9 with SV40
polyA signal
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(141)
<223> ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (172)..(796)
<223> MinRHO promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (797)..(960)
<223> SV40 SA/SD
<220>
<221> misc_feature
<222> (964)..(976)
<223> Kozak start
<220>
<221> misc_feature
<222> (979)..(1008)
<223> NLS
<220>
<221> misc_feature
<222> (1009)..(4167)
<223> Sa Cas9
<220>
<221> misc_feature
<222> (4174)..(4194)
<223> SV40 NLS
<220>
<221> misc_feature
<222> (4201)..(4260)
<223> Minimal polyA
<220>
<221> misc_feature
<222> (4358)..(4498)
<223> ITR
<400> 9
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc taagcggccg cggttcctca gatctgaatt ctcatgttac 180
aggcagggag acgggcacaa aacacaaata aaaagcttcc atgctgtcag aagcactatg 240
caaaaagcaa gatgctgagg tcatggagct cctcctgtca gaggagtgtg gggactggat 300
gactccagag gtaacttgtg ggggaacgaa caggtaaggg gctgtgtgac gagatgagag 360
actgggagaa taaaccagaa agtctctagc tgtccagagg acatagcaca gaggcccatg 420
gtccctattt caaacccagg ccaccagact gagctgggac cttgggacag acaagtcatg 480
cagaagttag gggaccttct cctccctttt cctggatcct gagtacctct cctccctgac 540
ctcaggcttc ctcctagtgt caccttggcc cctcttagaa gccaattagg ccctcagttt 600
ctgcagcggg gattaatatg attatgaaca cccccaatct cccagatgct gattcagcca 660
ggagcttagg agggggaggt cactttataa gggtctgggg gggtcagaac ccagagtcat 720
ccagctggag ccctgagtgg ctgagctcag gccttcgcag cattcttggg tgggagcagc 780
cacgggtcag ccacaatcta gaggatccgg tactcgagga actgaaaaac cagaaagtta 840
actggtaagt ttagtctttt tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa 900
tcaaagaact gctcctcagt ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac 960
gcggccgcca ccatgggacc gaagaaaaag cgcaaggtcg aagcgtccat gaaaaggaac 1020
tacattctgg ggctggacat cgggattaca agcgtggggt atgggattat tgactatgaa 1080
acaagggacg tgatcgacgc aggcgtcaga ctgttcaagg aggccaacgt ggaaaacaat 1140
gagggacgga gaagcaagag gggagccagg cgcctgaaac gacggagaag gcacagaatc 1200
cagagggtga agaaactgct gttcgattac aacctgctga ccgaccattc tgagctgagt 1260
ggaattaatc cttatgaagc cagggtgaaa ggcctgagtc agaagctgtc agaggaagag 1320
ttttccgcag ctctgctgca cctggctaag cgccgaggag tgcataacgt caatgaggtg 1380
gaagaggaca ccggcaacga gctgtctaca aaggaacaga tctcacgcaa tagcaaagct 1440
ctggaagaga agtatgtcgc agagctgcag ctggaacggc tgaagaaaga tggcgaggtg 1500
agagggtcaa ttaataggtt caagacaagc gactacgtca aagaagccaa gcagctgctg 1560
aaagtgcaga aggcttacca ccagctggat cagagcttca tcgatactta tatcgacctg 1620
ctggagactc ggagaaccta ctatgaggga ccaggagaag ggagcccctt cggatggaaa 1680
gacatcaagg aatggtacga gatgctgatg ggacattgca cctattttcc agaagagctg 1740
agaagcgtca agtacgctta taacgcagat ctgtacaacg ccctgaatga cctgaacaac 1800
ctggtcatca ccagggatga aaacgagaaa ctggaatact atgagaagtt ccagatcatc 1860
gaaaacgtgt ttaagcagaa gaaaaagcct acactgaaac agattgctaa ggagatcctg 1920
gtcaacgaag aggacatcaa gggctaccgg gtgacaagca ctggaaaacc agagttcacc 1980
aatctgaaag tgtatcacga tattaaggac atcacagcac ggaaagaaat cattgagaac 2040
gccgaactgc tggatcagat tgctaagatc ctgactatct accagagctc cgaggacatc 2100
caggaagagc tgactaacct gaacagcgag ctgacccagg aagagatcga acagattagt 2160
aatctgaagg ggtacaccgg aacacacaac ctgtccctga aagctatcaa tctgattctg 2220
gatgagctgt ggcatacaaa cgacaatcag attgcaatct ttaaccggct gaagctggtc 2280
ccaaaaaagg tggacctgag tcagcagaaa gagatcccaa ccacactggt ggacgatttc 2340
attctgtcac ccgtggtcaa gcggagcttc atccagagca tcaaagtgat caacgccatc 2400
atcaagaagt acggcctgcc caatgatatc attatcgagc tggctaggga gaagaacagc 2460
aaggacgcac agaagatgat caatgagatg cagaaacgaa accggcagac caatgaacgc 2520
attgaagaga ttatccgaac taccgggaaa gagaacgcaa agtacctgat tgaaaaaatc 2580
aagctgcacg atatgcagga gggaaagtgt ctgtattctc tggaggccat ccccctggag 2640
gacctgctga acaatccatt caactacgag gtcgatcata ttatccccag aagcgtgtcc 2700
ttcgacaatt cctttaacaa caaggtgctg gtcaagcagg aagagaactc taaaaagggc 2760
aataggactc ctttccagta cctgtctagt tcagattcca agatctctta cgaaaccttt 2820
aaaaagcaca ttctgaatct ggccaaagga aagggccgca tcagcaagac caaaaaggag 2880
tacctgctgg aagagcggga catcaacaga ttctccgtcc agaaggattt tattaaccgg 2940
aatctggtgg acacaagata cgctactcgc ggcctgatga atctgctgcg atcctatttc 3000
cgggtgaaca atctggatgt gaaagtcaag tccatcaacg gcgggttcac atcttttctg 3060
aggcgcaaat ggaagtttaa aaaggagcgc aacaaagggt acaagcacca tgccgaagat 3120
gctctgatta tcgcaaatgc cgacttcatc tttaaggagt ggaaaaagct ggacaaagcc 3180
aagaaagtga tggagaacca gatgttcgaa gagaagcagg ccgaatctat gcccgaaatc 3240
gagacagaac aggagtacaa ggagattttc atcactcctc accagatcaa gcatatcaag 3300
gatttcaagg actacaagta ctctcaccgg gtggataaaa agcccaacag agagctgatc 3360
aatgacaccc tgtatagtac aagaaaagac gataagggga ataccctgat tgtgaacaat 3420
ctgaacggac tgtacgacaa agataatgac aagctgaaaa agctgatcaa caaaagtccc 3480
gagaagctgc tgatgtacca ccatgatcct cagacatatc agaaactgaa gctgattatg 3540
gagcagtacg gcgacgagaa gaacccactg tataagtact atgaagagac tgggaactac 3600
ctgaccaagt atagcaaaaa ggataatggc cccgtgatca agaagatcaa gtactatggg 3660
aacaagctga atgcccatct ggacatcaca gacgattacc ctaacagtcg caacaaggtg 3720
gtcaagctgt cactgaagcc atacagattc gatgtctatc tggacaacgg cgtgtataaa 3780
tttgtgactg tcaagaatct ggatgtcatc aaaaaggaga actactatga agtgaatagc 3840
aagtgctacg aagaggctaa aaagctgaaa aagattagca accaggcaga gttcatcgcc 3900
tccttttaca acaacgacct gattaagatc aatggcgaac tgtatagggt catcggggtg 3960
aacaatgatc tgctgaaccg cattgaagtg aatatgattg acatcactta ccgagagtat 4020
ctggaaaaca tgaatgataa gcgcccccct cgaattatca aaacaattgc ctctaagact 4080
cagagtatca aaaagtactc aaccgacatt ctgggaaacc tgtatgaggt gaagagcaaa 4140
aagcaccctc agattatcaa aaagggcgga tcccccaaga agaagaggaa agtctcgagc 4200
tagcaataaa ggatcgttta ttttcattgg aagcgtgtgt tggttttttg atcaggcgcg 4260
tccaagcttg catgctgggg agagatctgc ggccgcctag caataaagga tcgtttattt 4320
tcattggaag cgtgtgttgg ttttttgatc aggcgcgagg aacccctagt gatggagttg 4380
gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga 4440
cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagg 4498
<210> 10
<211> 4170
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cas9 Vector 2: 250 bp minimal RHO promoter driving Cas9 w/ alpha
globin UTR
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(141)
<223> ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (179)..(427)
<223> MinRHO promoter (250bp)
<220>
<221> misc_feature
<222> (428)..(590)
<223> SV40 intron
<220>
<221> misc_feature
<222> (607)..(636)
<223> NLS
<220>
<221> misc_feature
<222> (637)..(3795)
<223> Sa Cas9
<220>
<221> misc_feature
<222> (3802)..(3822)
<223> SV40 NLS
<220>
<221> misc_feature
<222> (3832)..(3942)
<223> HBA1 UTR
<220>
<221> misc_feature
<222> (4030)..(4170)
<223> ITR
<400> 10
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc taagcggccg cggttcctca gatctgaatt cggtacctgt 180
caccttggcc cctcttagaa gccaattagg ccctcagttt ctgcagcggg gattaatatg 240
attatgaaca cccccaatct cccagatgct gattcagcca ggagcttagg agggggaggt 300
cactttataa gggtctgggg gggtcagaac ccagagtcat ccagctggag ccctgagtgg 360
ctgagctcag gccttcgcag cattcttggg tgggagcagc cacgggtcag ccacaagggc 420
cacagcctct agaggatccg gtactcgagg aactgaaaaa ccagaaagtt aactggtaag 480
tttagtcttt ttgtctttta tttcaggtcc cggatccggt ggtggtgcaa atcaaagaac 540
tgctcctcag tggatgttgc ctttacttct aggcctgtac ggaagtgtta ctccgccacc 600
atgggaccga agaaaaagcg caaggtcgaa gcgtccatga aaaggaacta cattctgggg 660
ctggacatcg ggattacaag cgtggggtat gggattattg actatgaaac aagggacgtg 720
atcgacgcag gcgtcagact gttcaaggag gccaacgtgg aaaacaatga gggacggaga 780
agcaagaggg gagccaggcg cctgaaacga cggagaaggc acagaatcca gagggtgaag 840
aaactgctgt tcgattacaa cctgctgacc gaccattctg agctgagtgg aattaatcct 900
tatgaagcca gggtgaaagg cctgagtcag aagctgtcag aggaagagtt ttccgcagct 960
ctgctgcacc tggctaagcg ccgaggagtg cataacgtca atgaggtgga agaggacacc 1020
ggcaacgagc tgtctacaaa ggaacagatc tcacgcaata gcaaagctct ggaagagaag 1080
tatgtcgcag agctgcagct ggaacggctg aagaaagatg gcgaggtgag agggtcaatt 1140
aataggttca agacaagcga ctacgtcaaa gaagccaagc agctgctgaa agtgcagaag 1200
gcttaccacc agctggatca gagcttcatc gatacttata tcgacctgct ggagactcgg 1260
agaacctact atgagggacc aggagaaggg agccccttcg gatggaaaga catcaaggaa 1320
tggtacgaga tgctgatggg acattgcacc tattttccag aagagctgag aagcgtcaag 1380
tacgcttata acgcagatct gtacaacgcc ctgaatgacc tgaacaacct ggtcatcacc 1440
agggatgaaa acgagaaact ggaatactat gagaagttcc agatcatcga aaacgtgttt 1500
aagcagaaga aaaagcctac actgaaacag attgctaagg agatcctggt caacgaagag 1560
gacatcaagg gctaccgggt gacaagcact ggaaaaccag agttcaccaa tctgaaagtg 1620
tatcacgata ttaaggacat cacagcacgg aaagaaatca ttgagaacgc cgaactgctg 1680
gatcagattg ctaagatcct gactatctac cagagctccg aggacatcca ggaagagctg 1740
actaacctga acagcgagct gacccaggaa gagatcgaac agattagtaa tctgaagggg 1800
tacaccggaa cacacaacct gtccctgaaa gctatcaatc tgattctgga tgagctgtgg 1860
catacaaacg acaatcagat tgcaatcttt aaccggctga agctggtccc aaaaaaggtg 1920
gacctgagtc agcagaaaga gatcccaacc acactggtgg acgatttcat tctgtcaccc 1980
gtggtcaagc ggagcttcat ccagagcatc aaagtgatca acgccatcat caagaagtac 2040
ggcctgccca atgatatcat tatcgagctg gctagggaga agaacagcaa ggacgcacag 2100
aagatgatca atgagatgca gaaacgaaac cggcagacca atgaacgcat tgaagagatt 2160
atccgaacta ccgggaaaga gaacgcaaag tacctgattg aaaaaatcaa gctgcacgat 2220
atgcaggagg gaaagtgtct gtattctctg gaggccatcc ccctggagga cctgctgaac 2280
aatccattca actacgaggt cgatcatatt atccccagaa gcgtgtcctt cgacaattcc 2340
tttaacaaca aggtgctggt caagcaggaa gagaactcta aaaagggcaa taggactcct 2400
ttccagtacc tgtctagttc agattccaag atctcttacg aaacctttaa aaagcacatt 2460
ctgaatctgg ccaaaggaaa gggccgcatc agcaagacca aaaaggagta cctgctggaa 2520
gagcgggaca tcaacagatt ctccgtccag aaggatttta ttaaccggaa tctggtggac 2580
acaagatacg ctactcgcgg cctgatgaat ctgctgcgat cctatttccg ggtgaacaat 2640
ctggatgtga aagtcaagtc catcaacggc gggttcacat cttttctgag gcgcaaatgg 2700
aagtttaaaa aggagcgcaa caaagggtac aagcaccatg ccgaagatgc tctgattatc 2760
gcaaatgccg acttcatctt taaggagtgg aaaaagctgg acaaagccaa gaaagtgatg 2820
gagaaccaga tgttcgaaga gaagcaggcc gaatctatgc ccgaaatcga gacagaacag 2880
gagtacaagg agattttcat cactcctcac cagatcaagc atatcaagga tttcaaggac 2940
tacaagtact ctcaccgggt ggataaaaag cccaacagag agctgatcaa tgacaccctg 3000
tatagtacaa gaaaagacga taaggggaat accctgattg tgaacaatct gaacggactg 3060
tacgacaaag ataatgacaa gctgaaaaag ctgatcaaca aaagtcccga gaagctgctg 3120
atgtaccacc atgatcctca gacatatcag aaactgaagc tgattatgga gcagtacggc 3180
gacgagaaga acccactgta taagtactat gaagagactg ggaactacct gaccaagtat 3240
agcaaaaagg ataatggccc cgtgatcaag aagatcaagt actatgggaa caagctgaat 3300
gcccatctgg acatcacaga cgattaccct aacagtcgca acaaggtggt caagctgtca 3360
ctgaagccat acagattcga tgtctatctg gacaacggcg tgtataaatt tgtgactgtc 3420
aagaatctgg atgtcatcaa aaaggagaac tactatgaag tgaatagcaa gtgctacgaa 3480
gaggctaaaa agctgaaaaa gattagcaac caggcagagt tcatcgcctc cttttacaac 3540
aacgacctga ttaagatcaa tggcgaactg tatagggtca tcggggtgaa caatgatctg 3600
ctgaaccgca ttgaagtgaa tatgattgac atcacttacc gagagtatct ggaaaacatg 3660
aatgataagc gcccccctcg aattatcaaa acaattgcct ctaagactca gagtatcaaa 3720
aagtactcaa ccgacattct gggaaacctg tatgaggtga agagcaaaaa gcaccctcag 3780
attatcaaaa agggcggatc ccccaagaag aagaggaaag tctcgagcta ggctggagcc 3840
tcggtggcca tgcttcttgc cccttgggcc tccccccagc ccctcctccc cttcctgcac 3900
ccgtaccccc gtggtctttg aataaagtct gagtgggcgg cacatgctgg ggagagatct 3960
gcggccgcct agcaataaag gatcgtttat tttcattgga agcgtgtgtt ggttttttga 4020
tcaggcgcga ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc 4080
tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag 4140
tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 4170
<210> 11
<211> 2691
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Exemplary replacement vector: 250 bp minimal RHO promoter driving
codon-optimized RHO cDNA; U6 promoter driving gRNA targeting RHO
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(139)
<223> ITR
<220>
<221> misc_feature
<222> (174)..(437)
<223> U6 promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (439)..(460)
<223> RHO-7 gRNA targeting domain
<220>
<221> misc_feature
<222> (461)..(536)
<223> Sa gRNA scaffold
<220>
<221> misc_feature
<222> (563)..(826)
<223> U6 promoter
<220>
<221> misc_feature
<222> (828)..(849)
<223> RHO-7 gRNA targeting domain
<220>
<221> misc_feature
<222> (850)..(925)
<223> Sa gRNA scaffold
<220>
<221> misc_feature
<222> (947)..(1195)
<223> minRHO promoter (250bp)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1196)..(1359)
<223> SV40 intron
<220>
<221> misc_feature
<222> (1369)..(2412)
<223> Codon Optimized RHO cDNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (2416)..(2526)
<223> HBA1 UTR
<220>
<221> misc_feature
<222> (2553)..(2691)
<223> ITR
<400> 11
tgcaggcagc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg 60
gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120
tccatcacta ggggttcctg cggccgcggt tcctcagatc tgaattcggt accaaggtcg 180
ggcaggaaga gggcctattt cccatgattc cttcatattt gcatatacga tacaaggctg 240
ttagagagat aattagaatt aatttgactg taaacacaaa gatattagta caaaatacgt 300
gacgtagaaa gtaataattt cttgggtagt ttgcagtttt aaaattatgt tttaaaatgg 360
actatcatat gcttaccgta acttgaaagt atttcgattt cttggcttta tatatcttgt 420
ggaaaggacg aaacaccgcc cacacccggc tcataccgcc gttatagtac tctggaaaca 480
gaatctacta taacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt caacttgttg gcgagatttt 540
ttcgacttag ttcgatcgaa ggaaggtcgg gcaggaagag ggcctatttc ccatgattcc 600
ttcatatttg catatacgat acaaggctgt tagagagata attagaatta atttgactgt 660
aaacacaaag atattagtac aaaatacgtg acgtagaaag taataatttc ttgggtagtt 720
tgcagtttta aaattatgtt ttaaaatgga ctatcatatg cttaccgtaa cttgaaagta 780
tttcgatttc ttggctttat atatcttgtg gaaaggacga aacaccgccc acacccggct 840
cataccgccg ttatagtact ctggaaacag aatctactat aacaaggcaa aatgccgtgt 900
ttatctcgtc aacttgttgg cgagattttt tggtaccgct agcgctgtca ccttggcccc 960
tcttagaagc caattaggcc ctcagtttct gcagcgggga ttaatatgat tatgaacacc 1020
cccaatctcc cagatgctga ttcagccagg agcttaggag ggggaggtca ctttataagg 1080
gtctgggggg gtcagaaccc agagtcatcc agctggagcc ctgagtggct gagctcaggc 1140
cttcgcagca ttcttgggtg ggagcagcca cgggtcagcc acaagggcca cagcctctag 1200
aggatccggt actcgaggaa ctgaaaaacc agaaagttaa ctggtaagtt tagtcttttt 1260
gtcttttatt tcaggtcccg gatccggtgg tggtgcaaat caaagaactg ctcctcagtg 1320
gatgttgcct ttacttctag gcctgtacgg aagtgttact ccgccaccat gaatggcaca 1380
gagggcccta acttctacgt gccctttagc aatgccacag gcgtcgtgcg gagccctttt 1440
gagtaccctc agtactatct ggccgagcct tggcagttta gcatgctggc cgcctacatg 1500
ttcctgctga tcgtgctggg cttccccatc aactttctga ccctgtacgt gaccgtgcag 1560
cacaagaagc tgcggacccc tctgaactac atcctgctga atctggccgt ggccgacctg 1620
tttatggtgc tcggcggctt taccagcaca ctgtacacaa gcctgcacgg ctacttcgtg 1680
tttggcccca ccggctgcaa tctggaaggc ttttttgcca cactcggcgg cgaaattgct 1740
ctgtggtcac tggtggtgct ggccatcgag agatacgtgg tcgtgtgcaa gcccatgagc 1800
aacttcagat tcggcgagaa ccacgccatc atgggcgtcg cctttacatg ggttatggcc 1860
ctggcttgtg cagctcctcc tcttgccggc tggtccagat atattcctga gggcctgcag 1920
tgcagctgcg gcatcgatta ctacaccctg aagcctgaag tgaacaacga gagcttcgtg 1980
atctacatgt ttgtggtgca cttcacgatc cccatgatca tcatattctt ttgctacggc 2040
cagctggtgt tcaccgtgaa agaagccgct gctcagcagc aagagagcgc cacaacacag 2100
aaagccgaga aagaagtgac ccggatggtc attatcatgg ttatcgcctt tctgatctgt 2160
tgggtgccct acgccagcgt ggccttctac atctttaccc accaaggcag caacttcggc 2220
cccatcttta tgacaatccc cgccttcttt gccaagagcg ccgccatcta caaccccgtg 2280
atctatatca tgatgaacaa gcagttccgc aactgcatgc tgaccaccat ctgctgcgga 2340
aagaaccctc tgggagatga tgaggccagc gccaccgtgt ctaagaccga aacatctcag 2400
gtggcccctg catgagctgg agcctcggtg gccatgcttc ttgccccttg ggcctccccc 2460
cagcccctcc tccccttcct gcacccgtac ccccgtggtc tttgaataaa gtctgagtgg 2520
gcggcacatg ctggggagag atctgcggcc gcaggaaccc ctagtgatgg agttggccac 2580
tccctctctg cgcgctcgct cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc 2640
gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc a 2691
<210> 12
<211> 76
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA scaffold sequence
<400> 12
gttatagtac tctggaaaca gaatctacta taacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt 60
caacttgttg gcgaga 76
<210> 13
<211> 1047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon optimized RHO-encoding sequence 1 (Codon 1)
<400> 13
atgaacggca ccgagggccc caacttctac gtccccttca gcaacgccac cggcgtcgtc 60
cgcagcccct tcgagtaccc ccagtactac ctggccgagc cctggcagtt cagcatgctg 120
gccgcctaca tgttcctgct gatcgtcctg ggcttcccca tcaacttcct gaccctgtac 180
gtcaccgtcc agcacaagaa gctgcgcacc cccctgaact acatcctgct gaacctggcc 240
gtcgccgacc tgttcatggt cctgggcggc ttcaccagca ccctgtacac cagcctgcac 300
ggctacttcg tcttcggccc caccggctgc aacctggagg gcttcttcgc caccctgggc 360
ggcgagatcg ccctgtggag cctggtcgtc ctggccatcg agcgctacgt cgtcgtctgc 420
aagcccatga gcaacttccg cttcggcgag aaccacgcca tcatgggcgt cgccttcacc 480
tgggtcatgg ccctggcctg cgccgccccc cccctggccg gctggagccg ctacatcccc 540
gagggcctgc agtgcagctg cggcatcgac tactacaccc tgaagcccga ggtcaacaac 600
gagagcttcg tcatctacat gttcgtcgtc cacttcacca tccccatgat catcatcttc 660
ttctgctacg gccagctggt cttcaccgtc aaggaggccg ccgcccagca gcaggagagc 720
gccaccaccc agaaggccga gaaggaggtc acccgcatgg tcatcatcat ggtcatcgcc 780
ttcctgatct gctgggtccc ctacgccagc gtcgccttct acatcttcac ccaccagggc 840
agcaacttcg gccccatctt catgaccatc cccgccttct tcgccaagag cgccgccatc 900
tacaaccccg tcatctacat catgatgaac aagcagttcc gcaactgcat gctgaccacc 960
atctgctgcg gcaagaaccc cctgggcgac gacgaggcca gcgccaccgt cagcaagacc 1020
gagaccagcc aggtcgcccc cgcctaa 1047
<210> 14
<211> 1047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon optimized RHO-encoding sequence 2 (Codon 2)
<400> 14
atgaacggca ccgagggccc caacttctac gtgcccttct ccaacgccac cggcgtggtg 60
cgctccccct tcgagtaccc ccagtactac ctggccgagc cctggcagtt ctccatgctg 120
gccgcctaca tgttcctgct gatcgtgctg ggcttcccca tcaacttcct gaccctgtac 180
gtgaccgtgc agcacaagaa gctgcgcacc cccctgaact acatcctgct gaacctggcc 240
gtggccgacc tgttcatggt gctgggcggc ttcacctcca ccctgtacac ctccctgcac 300
ggctacttcg tgttcggccc caccggctgc aacctggagg gcttcttcgc caccctgggc 360
ggcgagatcg ccctgtggtc cctggtggtg ctggccatcg agcgctacgt ggtggtgtgc 420
aagcccatgt ccaacttccg cttcggcgag aaccacgcca tcatgggcgt ggccttcacc 480
tgggtgatgg ccctggcctg cgccgccccc cccctggccg gctggtcccg ctacatcccc 540
gagggcctgc agtgctcctg cggcatcgac tactacaccc tgaagcccga ggtgaacaac 600
gagtccttcg tgatctacat gttcgtggtg cacttcacca tccccatgat catcatcttc 660
ttctgctacg gccagctggt gttcaccgtg aaggaggccg ccgcccagca gcaggagtcc 720
gccaccaccc agaaggccga gaaggaggtg acccgcatgg tgatcatcat ggtgatcgcc 780
ttcctgatct gctgggtgcc ctacgcctcc gtggccttct acatcttcac ccaccagggc 840
tccaacttcg gccccatctt catgaccatc cccgccttct tcgccaagtc cgccgccatc 900
tacaaccccg tgatctacat catgatgaac aagcagttcc gcaactgcat gctgaccacc 960
atctgctgcg gcaagaaccc cctgggcgac gacgaggcct ccgccaccgt gtccaagacc 1020
gagacctccc aggtggcccc cgcctaa 1047
<210> 15
<211> 1047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon Optimized RHO-encoding sequence 3 (Codon 3)
<400> 15
atgaacggca ccgagggccc caacttctac gtccccttca gcaacgccac cggcgtcgtc 60
cgcagcccct tcgagtaccc ccagtactac ctggccgagc cctggcagtt ctctatgctg 120
gccgcctaca tgttcctgct gatcgtcctg ggcttcccta tcaacttcct caccctctac 180
gtcaccgtcc agcacaagaa gctccgcacc cctctcaact acatcctcct taaccttgcc 240
gtcgccgacc ttttcatggt ccttggcggc ttcacctcta ctctttacac ttctttgcac 300
gggtacttcg tgttcggtcc tactggttgc aacttggagg gtttcttcgc cactttgggt 360
ggtgagatcg ccttgtggtc gttggtggtg ttagctatcg agcgatacgt ggtggtgtgc 420
aagcctatgt cgaacttccg gttcggtgag aatcatgcta tcatgggagt ggcttttact 480
tgggtgatgg ctttagcttg cgctgctcct ccgttagctg gatggtcgcg ttatatcccg 540
gagggattac agtgctcatg cggaatcgac tattatactc taaagccgga agttaataat 600
gaatcatttg ttatttatat gtttgttgtt cattttacaa ttccgatgat tattattttt 660
ttttgttatg gacagctagt ttttacagtt aaggaagcag cagcacagca acaagaatca 720
gcaacaacac aaaaggcaga aaaagaagtt acaaggatgg ttattattat ggtaattgca 780
tttctaatat gttgggtacc gtatgcatcc gtagcatttt atatatttac acatcaaggg 840
tccaattttg ggccaatatt tatgacgata ccagcgtttt ttgcgaaatc cgcggcgata 900
tataatccag taatatatat aatgatgaat aaacaattta gaaattgtat gctaacgacg 960
atatgttgtg ggaaaaatcc actaggggat gatgaagcga gtgcgacggt aagtaaaacg 1020
gaaacgagtc aagtagcgcc agcgtaa 1047
<210> 16
<211> 1047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon Optimized RHO-encoding sequence 4 (Codon 4)
<400> 16
atgaacggca ccgagggtcc caatttctac gtcccatttt ccaacgccac gggggtggta 60
cgcagccctt tcgaatatcc gcagtactat ctggctgagc cctggcagtt ttctatgctc 120
gcagcgtaca tgttcttgct aatcgttctg ggatttccaa ttaatttcct cacattgtat 180
gtcaccgtgc agcacaagaa gctacggacg cctctgaact acatcctctt gaatctagcc 240
gtcgctgacc tgtttatggt tctcggcggt ttcacatcga ccttgtatac gtcactacat 300
gggtactttg tcttcggacc gacaggctgc aacctggaag gttttttcgc aaccctcggg 360
ggagagattg cgttgtggtc cctagtggta ctggccatcg aaaggtatgt tgtcgtgtgt 420
aagcccatga gcaattttcg cttcggcgag aaccacgcta ttatgggtgt agcatttacg 480
tgggttatgg cgctcgcctg cgctgcacca cctttggcgg ggtggtctcg gtacatcccg 540
gaaggactac agtgttcgtg cggcattgat tattacacac tgaagcccga ggtcaataac 600
gaatcattcg tgatctatat gtttgtagtt catttcacca ttccaatgat cattatcttt 660
ttctgttacg gtcagctcgt ctttacggtg aaggaggccg ctgcacagca gcaggaatcc 720
gcgacaaccc agaaggccga gaaggaagta acgaggatgg ttattatcat ggtcattgct 780
ttcttgatct gctgggtgcc ttatgcaagc gtagcgtttt acattttcac acaccagggg 840
tctaattttg gaccgatctt catgaccatt cccgcctttt tcgctaagtc ggcagcgatc 900
tataacccag ttatttacat catgatgaat aagcagtttc gcaactgtat gctaacgaca 960
atttgctgtg gcaagaatcc tctgggtgac gatgaggcct cagctaccgt ctccaagacg 1020
gaaacaagcc aggtggcacc ggcgtaa 1047
<210> 17
<211> 1047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon Optimized RHO-encoding sequence 5 (Codon 5)
<400> 17
atgaatggga ctgaaggacc taatttctat gtgccattta gcaatgctac tggcgttgtc 60
agaagcccct tcgaatatcc acaatactat ctggccgaac cttggcagtt cagcatgctc 120
gctgcctata tgtttctgct gattgtgctg ggctttccca taaatttcct caccctgtat 180
gttactgttc aacacaaaaa gctgcggacg cctctgaact acatactgct gaacctggcc 240
gtcgccgacc tgtttatggt cctgggaggc tttacaagca ctctgtatac aagcctgcac 300
ggctacttcg tgttcggccc cacaggctgc aacctcgaag gcttctttgc caccctcgga 360
ggagagattg ccctgtggag cctggtggtg ctggccatcg aaaggtatgt ggtggtgtgt 420
aaacccatgt ccaattttcg gttcggcgag aaccacgcta ttatgggagt ggctttcact 480
tgggtgatgg ccctggcctg cgccgcccca ccactggccg ggtggagccg gtacatccca 540
gaggggctgc aatgtagctg cggaatcgac tattataccc tgaaaccaga ggtgaacaac 600
gagagctttg tgatttatat gtttgtggtg cattttacaa ttcctatgat tatcattttc 660
ttctgttacg ggcaactggt gtttaccgtg aaggaagccg ccgctcaaca gcaggagagc 720
gccacaaccc aaaaggccga gaaggaggtg accagaatgg tgattattat ggtgatcgct 780
tttctgattt gctgggtgcc atacgctagc gtcgctttct atattttcac tcaccagggg 840
agcaacttcg gccccatttt catgacaatc cctgcctttt ttgctaaaag cgccgccatc 900
tataacccag tgatctacat catgatgaac aaacagttta ggaactgtat gctcacaaca 960
atctgctgtg gaaagaaccc cctcggcgat gacgaagcca gcgccaccgt cagcaagaca 1020
gaaacaagcc aggtggcccc tgcctaa 1047
<210> 18
<211> 1047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Codon Optimized RHO-encoding sequence 6 (Codon 6)
<400> 18
atgaatggca cagagggccc taacttctac gtgcccttta gcaatgccac aggcgtcgtg 60
cggagccctt ttgagtaccc tcagtactat ctggccgagc cttggcagtt tagcatgctg 120
gccgcctaca tgttcctgct gatcgtgctg ggcttcccca tcaactttct gaccctgtac 180
gtgaccgtgc agcacaagaa gctgcggacc cctctgaact acatcctgct gaatctggcc 240
gtggccgacc tgtttatggt gctcggcggc tttaccagca cactgtacac aagcctgcac 300
ggctacttcg tgtttggccc caccggctgc aatctggaag gcttttttgc cacactcggc 360
ggcgaaattg ctctgtggtc actggtggtg ctggccatcg agagatacgt ggtcgtgtgc 420
aagcccatga gcaacttcag attcggcgag aaccacgcca tcatgggcgt cgcctttaca 480
tgggttatgg ccctggcttg tgcagctcct cctcttgccg gctggtccag atatattcct 540
gagggcctgc agtgcagctg cggcatcgat tactacaccc tgaagcctga agtgaacaac 600
gagagcttcg tgatctacat gtttgtggtg cacttcacga tccccatgat catcatattc 660
ttttgctacg gccagctggt gttcaccgtg aaagaagccg ctgctcagca gcaagagagc 720
gccacaacac agaaagccga gaaagaagtg acccggatgg tcattatcat ggttatcgcc 780
tttctgatct gttgggtgcc ctacgccagc gtggccttct acatctttac ccaccaaggc 840
agcaacttcg gccccatctt tatgacaatc cccgccttct ttgccaagag cgccgccatc 900
tacaaccccg tgatctatat catgatgaac aagcagttcc gcaactgcat gctgaccacc 960
atctgctgcg gaaagaaccc tctgggagat gatgaggcca gcgccaccgt gtctaagacc 1020
gaaacatctc aggtggcccc tgcatga 1047
<210> 19
<400> 19
000
<210> 20
<400> 20
000
<210> 21
<400> 21
000
<210> 22
<400> 22
000
<210> 23
<400> 23
000
<210> 24
<400> 24
000
<210> 25
<400> 25
000
<210> 26
<400> 26
000
<210> 27
<400> 27
000
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<400> 29
000
<210> 30
<400> 30
000
<210> 31
<400> 31
000
<210> 32
<400> 32
000
<210> 33
<400> 33
000
<210> 34
<400> 34
000
<210> 35
<400> 35
000
<210> 36
<400> 36
000
<210> 37
<400> 37
000
<210> 38
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HBA1 3'UTR
<400> 38
gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc 60
ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg agtgggcggc a 111
<210> 39
<211> 101
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> short HBA1 3'UTR
<400> 39
gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc 60
ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg a 101
<210> 40
<211> 304
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TH 3'UTR
<400> 40
gtgcacggcg tccctgaggg cccttcccaa cctcccctgg tcctgcactg tcccggagct 60
caggccctgg tgaggggctg ggtcccgggt gccccccatg ccctccctgc tgccaggctc 120
ccactgcccc tgcacctgct tctcagcgca acagctgtgt gtgcccgtgg tgaggttgtg 180
ctgcctgtgg tgaggtcctg tcctggctcc cagggtcctg ggggctgctg cactgccctc 240
cgcccttccc tgacactgtc tgctgcccca atcaccgtca caataaaaga aactgtggtc 300
tcta 304
<210> 41
<211> 1406
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> COL1A1 3'UTR
<400> 41
actccctcca tcccaacctg gctccctccc acccaaccaa ctttcccccc aacccggaaa 60
cagacaagca acccaaactg aaccccctca aaagccaaaa aatgggagac aatttcacat 120
ggactttgga aaatattttt ttcctttgca ttcatctctc aaacttagtt tttatctttg 180
accaaccgaa catgaccaaa aaccaaaagt gcattcaacc ttaccaaaaa aaaaaaaaaa 240
aaaagaataa ataaataact ttttaaaaaa ggaagcttgg tccacttgct tgaagaccca 300
tgcgggggta agtccctttc tgcccgttgg gcttatgaaa ccccaatgct gccctttctg 360
ctcctttctc cacacccccc ttggggcctc ccctccactc cttcccaaat ctgtctcccc 420
agaagacaca ggaaacaatg tattgtctgc ccagcaatca aaggcaatgc tcaaacaccc 480
aagtggcccc caccctcagc ccgctcctgc ccgcccagca cccccaggcc ctgggggacc 540
tggggttctc agactgccaa agaagccttg ccatctggcg ctcccatggc tcttgcaaca 600
tctccccttc gtttttgagg gggtcatgcc gggggagcca ccagcccctc actgggttcg 660
gaggagagtc aggaagggcc acgacaaagc agaaacatcg gatttgggga acgcgtgtca 720
atcccttgtg ccgcagggct gggcgggaga gactgttctg ttccttgtgt aactgtgttg 780
ctgaaagact acctcgttct tgtcttgatg tgtcaccggg gcaactgcct gggggcgggg 840
atgggggcag ggtggaagcg gctccccatt ttataccaaa ggtgctacat ctatgtgatg 900
ggtggggtgg ggagggaatc actggtgcta tagaaattga gatgcccccc caggccagca 960
aatgttcctt tttgttcaaa gtctattttt attccttgat atttttcttt tttttttttt 1020
ttttttgtgg atggggactt gtgaattttt ctaaaggtgc tatttaacat gggaggagag 1080
cgtgtgcggc tccagcccag cccgctgctc actttccacc ctctctccac ctgcctctgg 1140
cttctcaggc ctctgctctc cgacctctct cctctgaaac cctcctccac agctgcagcc 1200
catcctcccg gctccctcct agtctgtcct gcgtcctctg tccccgggtt tcagagacaa 1260
cttcccaaag cacaaagcag tttttccccc taggggtggg aggaagcaaa agactctgta 1320
cctattttgt atgtgtataa taatttgaga tgtttttaat tattttgatt gctggaataa 1380
agcatgtgga aatgacccaa acataa 1406
<210> 42
<211> 681
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ALOX15 3'UTR
<400> 42
gcgtcgccac cctttggtta tttcagcccc catcacccaa gccacaagct gaccccttcg 60
tggttatagc cctgccctcc caagtcccac cctcttccca tgtcccaccc tccctagagg 120
ggcacctttt catggtctct gcacccagtg aacacatttt actctagagg catcacctgg 180
gaccttactc ctctttcctt ccttcctcct ttcctatctt ccttcctctc tctcttcctc 240
tttcttcatt cagatctata tggcaaatag ccacaattat ataaatcatt tcaagactag 300
aataggggga tataatacat attactccac accttttatg aatcaaatat gatttttttg 360
ttgttgttaa gacagagtct cactttgaca cccaggctgg agtgcagtgg tgccatcacc 420
acggctcact gcagcctcag cgtcctgggc tcaaatgatc ctcccacctc agcctcctga 480
gtagctggga ctacaggctc atgccatcat gcccagctaa tattttttta ttttcgtgga 540
gacggggcct cactatgttg cctaggctgg aaataggatt ttgaacccaa attgagttta 600
acaataataa aaagttgttt tacgctaaag atggaaaaga actaggactg aactatttta 660
aataaaatat tggcaaaaga a 681
<210> 43
<211> 516
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human rhodopsin promoter
<400> 43
ccacgtcaga atcaaaccct caccttaacc tcattagcgt tgggcataat caccaggcca 60
agcgccttaa actacgagag gccccatccc acccgccctg ccttagccct gccacgtgtg 120
ccaaacgctg ttagacccaa caccacccag gccaggtagg gggctggagc ccaggtgggc 180
atttgagtca ccaaccccca ggcagtctcc cttttcctgg atcctgagta cctctcctcc 240
ctgacctcag gcttcctcct agtgtcacct tggcccctct tagaagccaa ttaggccctc 300
agtttctgca gcggggatta atatgattat gaacaccccc aatctcccag atgctgattc 360
agccaggagc ttaggagggg gaggtcactt tataagggtc tgggggggtc agaacccaga 420
gtcatccagc tggagccctg agtggctgag ctcaggcctt cgcagcattc ttgggtggga 480
gcagccacgg gtcagccaca agggccacca ccatgg 516
<210> 44
<211> 249
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Minimal Human rhodopsin promoter
<400> 44
gtcaccttgg cccctcttag aagccaatta ggccctcagt ttctgcagcg gggattaata 60
tgattatgaa cacccccaat ctcccagatg ctgattcagc caggagctta ggagggggag 120
gtcactttat aagggtctgg gggggtcaga acccagagtc atccagctgg agccctgagt 180
ggctgagctc aggccttcgc agcattcttg ggtgggagca gccacgggtc agccacaagg 240
gccacagcc 249
<210> 45
<211> 617
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CMV promoter
<400> 45
cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca 60
tatatggagt tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac 120
gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact 180
ttccattgac gtcaatgggt ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa 240
gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg 300
cattatgccc agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta 360
gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg 420
tttgactcac ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg 480
caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 540
ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctggtttagt gaaccgtcag 600
atccgctaga gatccgc 617
<210> 46
<211> 252
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EFS promoter
<400> 46
tcgagtggct ccggtgcccg tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag 60
ttggggggag gggtcggcaa ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg 120
gaaagtgatg tcgtgtactg gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata 180
agtgcagtag tcgccgtgaa cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggtg 240
tcgtgaccgc gg 252
<210> 47
<211> 292
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human GRK1 (rhodopsin kinase) promoter
<400> 47
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttcgcctg 180
gtgctgtgtc agccccggtc tcccaggggc ttcccagtgg tccccaggaa ccctcgacag 240
ggcccggtct ctctcgtcca gcaagggcag ggacgggcca caggccaagg gc 292
<210> 48
<211> 113
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human CRX (cone rod homeobox transcription factor) promoter
<400> 48
gcctgtagcc ttaatctctc ctagcagggg gtttggggga gggaggagga gaaagaaagg 60
gccccttatg gctgagacac aatgacccag ccacaaggag ggattaccgg gcg 113
<210> 49
<211> 281
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human NRL (neural retina leucine zipper transcription factor
enhance upstream of the human TK terminal promoter)
<400> 49
aggtaggaag tggcctttaa ctccatagac cctatttaaa cagcttcgga caggtttaaa 60
catctccttg gataattcct agtatccctg ttcccactcc tactcaggga tgatagctct 120
aagaggtgtt aggggattag gctgaaaatg taggtcaccc ctcagccatc tgggaactag 180
aatgagtgag agaggagaga ggggcagaga cacacacatt cgcatattaa ggtgacgcgt 240
gtggcctcga acaccgagcg accctgcagc gacccgctta a 281
<210> 50
<211> 235
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human RCVRN (recoverin) promoter
<400> 50
attttaatct cactagggtt ctgggagcac ccccccccac cgctcccgcc ctccacaaag 60
ctcctgggcc cctcctccct tcaaggattg cgaagagctg gtcgcaaatc ctcctaagcc 120
accagcatct cggtcttcag ctcacaccag ccttgagccc agcctgcggc caggggacca 180
cgcacgtccc acccacccag cgactcccca gccgctgccc actcttcctc actca 235
<210> 51
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3X Flag tag
<400> 51
Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr
1 5 10 15
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
20
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Flag tag (single)
<400> 52
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HA tag
<400> 53
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Myc tag
<400> 54
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HIS tag
<400> 55
His His His His His His
1 5
<210> 56
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mini polyA
<400> 56
tagcaataaa ggatcgttta ttttcattgg aagcgtgtgt tggttttttg atcaggcgcg 60
<210> 57
<211> 228
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bGH polyA
<400> 57
gctgcaggat gaccggtcat catcaccatc accattgagt ttaaacccgc tgatcagcct 60
cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga 120
ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt 180
gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggaca 228
<210> 58
<211> 134
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 polyA
<400> 58
atgctttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa 60
taaacaagtt aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg 120
ggaggttttt taaa 134
<210> 59
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV1 Left ITR
<400> 59
ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60
agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
ggcaactcca tcactagggg taa 143
<210> 60
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV2 Left ITR
<400> 60
ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc 60
cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg ttcct 145
<210> 61
<211> 142
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV3B Left ITR
<400> 61
tggccactcc ctctatgcgc actcgctcgc tcggtggggc ctggcgacca aaggtcgcca 60
gacggacgtg ctttgcacgt ccggccccac cgagcgagcg agtgcgcata gagggagtgg 120
ccaactccat cactagaggt at 142
<210> 62
<211> 146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV4 Left ITR
<400> 62
ttggccactc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc 60
agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg 120
gccaactcca tcatctaggt ttgccc 146
<210> 63
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV5 Left ITR
<400> 63
ctctcccccc tgtcgcgttc gctcgctcgc tggctcgttt gggggggtgg cagctcaaag 60
agctgccaga cgacggccct ctggccgtcg cccccccaaa cgagccagcg agcgagcgaa 120
cgcgacaggg gggagagtgc cacactctca agcaa 155
<210> 64
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV6 Left ITR
<400> 64
atacccctag tgatggagtt gcccactccc tctatgcgcg ctcgctcgct cggtggggcc 60
ggcagagcag agctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga 120
gcgcgcatag agggagtggg caa 143
<210> 65
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV7 Left ITR
<400> 65
ttggccactc cctctatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60
agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat agagggagtg 120
gccaactcca tcactagggg taccg 145
<210> 66
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV8 Left ITR
<400> 66
cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggtagcgcg aagcgcctcc cacgctgccg 60
cgtcagcgct gacgtaaatt acgtcatagg ggagtggtcc tgtattagct gtcacgtgag 120
tgcttttgcg gcattttgcg acacc 145
<210> 67
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV9 Left ITR
<400> 67
cagagaggga gtggccaact ccatcactag gggtaatcgc gaagcgcctc ccacgctgcc 60
gcgtcagcgc tgacgtagat tacgtcatag gggagtggtc ctgtattagc tgtcacgtga 120
gtgcttttgc gacattttgc gacac 145
<210> 68
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV1 Right ITR
<400> 68
ttacccctag tgatggagtt gcccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cggtggggcc 60
ggcagagcag agctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga 120
gcgcgcagag agggagtggg caa 143
<210> 69
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV2 Right ITR
<400> 69
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag agagggagtg gccaa 145
<210> 70
<211> 142
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV3B Right ITR
<400> 70
atacctctag tgatggagtt ggccactccc tctatgcgca ctcgctcgct cggtggggcc 60
ggacgtgcaa agcacgtccg tctggcgacc tttggtcgcc aggccccacc gagcgagcga 120
gtgcgcatag agggagtggc ca 142
<210> 71
<211> 146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV4 Right ITR
<400> 71
gggcaaacct agatgatgga gttggccact ccctctatgc gcgctcgctc actcactcgg 60
ccctgccggc cagaggccgg cagtctggag acctttggtc tccagggccg agtgagtgag 120
cgagcgcgca tagagggagt ggccaa 146
<210> 72
<211> 155
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV5 Right ITR
<400> 72
ttgcttgaga gtgtggcact ctcccccctg tcgcgttcgc tcgctcgctg gctcgtttgg 60
gggggcgacg gccagagggc cgtcgtctgg cagctctttg agctgccacc cccccaaacg 120
agccagcgag cgagcgaacg cgacaggggg gagag 155
<210> 73
<211> 143
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV6 Right ITR
<400> 73
ttgcccactc cctctatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc 60
agacggcaga gctctgctct gccggcccca ccgagcgagc gagcgcgcat agagggagtg 120
ggcaactcca tcactagggg tat 143
<210> 74
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV7 Right ITR
<400> 74
cggtacccct agtgatggag ttggccactc cctctatgcg cgctcgctcg ctcggtgggg 60
ccggcagagc agagctctgc cgtctgcgga cctttggtcc gcaggcccca ccgagcgagc 120
gagcgcgcat agagggagtg gccaa 145
<210> 75
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV8 Right ITR
<400> 75
ggtgtcgcaa aatgccgcaa aagcactcac gtgacagcta atacaggacc actcccctat 60
gacgtaattt acgtcagcgc tgacgcggca gcgtgggagg cgcttcgcgc tacccctagt 120
gatggagttg gccactccct ctctg 145
<210> 76
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV9 Right ITR
<400> 76
gtgtcgcaaa atgtcgcaaa agcactcacg tgacagctaa tacaggacca ctcccctatg 60
acgtaatcta cgtcagcgct gacgcggcag cgtgggaggc gcttcgcgat tacccctagt 120
gatggagttg gccactccct ctctg 145
<210> 77
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer
<400> 77
cagatctgaa ttcggtacc 19
<210> 78
<211> 264
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> U6 Promoter
<400> 78
aaggtcgggc aggaagaggg cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac 60
aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa 120
aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt 180
aaaatggact atcatatgct taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat 240
atcttgtgga aaggacgaaa cacc 264
<210> 79
<211> 82
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gRNA scaffold domain
<400> 79
gttttagtac tctggaaaca gaatctacta aaacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt 60
caacttgttg gcgagatttt tt 82
<210> 80
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer
<400> 80
ggtaccgcta gcgcttaagt cgcgatgtac gggccagata tacgcgttga 50
<210> 81
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-ter NLS nucleotide sequence
<400> 81
ccgaagaaaa agcgcaaggt cgaagcgtcc 30
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N-ter NLS amino acid sequence
<400> 82
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 83
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-ter NLS sequence
<400> 83
cccaagaaga agaggaaagt c 21
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-ter NLS amino acid sequence
<400> 84
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 85
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer
<400> 85
tccaagcttc gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcgt taactctaga 60
tttaaatgca tgctggggag agatct 86
<210> 86
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3X FLAG nucleotide sequence
<400> 86
gactacaaag accatgacgg tgattataaa gatcatgaca tcgattacaa ggatgacgat 60
gacaag 66
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Spacer
<400> 87
cgacttagtt cgatcgaagg 20
<210> 88
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unimolecular S. aureus gRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> targeting domain (between 16 and 24 bases in length)
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(24)
<223> a, c, t, g, unknown, absent or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(38)
<223> crRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(42)
<223> GAAA linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(106)
<223> tracrRNA
<400> 88
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngtttta gtactctgga aacagaatct actaaaacaa 60
ggcaaaatgc cgtgtttatc tcgtcaactt gttggcgaga tttttt 106
<210> 89
<211> 106
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unimolecular S. aureus gRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> a, c, g, u, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> targeting domain (between 16 and 24 bases in length)
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(24)
<223> a, c, g, u, unknown, absent or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(38)
<223> crRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(42)
<223> GAAA linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(106)
<223> tracrRNA
<400> 89
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnguuuua guacucugga aacagaaucu acuaaaacaa 60
ggcaaaaugc cguguuuauc ucgucaacuu guuggcgaga uuuuuu 106
<210> 90
<211> 106
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unimolecular S. aureus gRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> a, c, t, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> targeting domain (between 16 and 24 bases in length)
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(24)
<223> a, c, t, g, unknown, absent or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(38)
<223> crRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(42)
<223> GAAA linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(106)
<223> tracrRNA
<400> 90
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnngttata gtactctgga aacagaatct actataacaa 60
ggcaaaatgc cgtgtttatc tcgtcaactt gttggcgaga tttttt 106
<210> 91
<211> 106
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Unimolecular S. aureus gRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(16)
<223> a, c, u, g, unknown or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> targeting domain (between 16 and 24 bases in length)
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(24)
<223> a, c, u, g, unknown, absent or other
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(38)
<223> crRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (39)..(42)
<223> GAAA linker
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(106)
<223> tracrRNA
<400> 91
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnguuaua guacucugga aacagaaucu acuauaacaa 60
ggcaaaaugc cguguuuauc ucgucaacuu guuggcgaga uuuuuu 106
<210> 92
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV Left ITR
<400> 92
tgcaggcagc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg 60
gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac 120
tccatcacta ggggttcct 139
<210> 93
<211> 139
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> AAV Right ITR
<400> 93
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgca 139
<210> 94
<211> 164
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SV40 intron
<400> 94
tctagaggat ccggtactcg aggaactgaa aaaccagaaa gttaactggt aagtttagtc 60
tttttgtctt ttatttcagg tcccggatcc ggtggtggtg caaatcaaag aactgctcct 120
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<220>
<223> RHO-94 targeting domain
<400> 193
ggcagaggga ccacacgcug ag 22
<210> 194
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-95 targeting domain
<400> 194
ucugacucag cacagcugcu cc 22
<210> 195
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-96 targeting domain
<400> 195
cucucagcca ccaccgccaa gc 22
<210> 196
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-97 targeting domain
<400> 196
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<210> 197
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-98 targeting domain
<400> 197
caccugagga caggggcuga ga 22
<210> 198
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-99 targeting domain
<400> 198
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-100 targeting domain
<400> 199
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<210> 200
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-101 targeting domain
<400> 200
agcacccucu acaccucucu gc 22
<210> 201
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-102 targeting domain
<400> 201
cuuuggauaa cauugacagg ac 22
<210> 202
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-103 targeting domain
<400> 202
ggugaagcca ccuaggacca ug 22
<210> 203
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-104 targeting domain
<400> 203
uaacauugac aggacaggag aa 22
<210> 204
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-105 targeting domain
<400> 204
gggagagggg aagagacuca uu 22
<210> 205
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-106 targeting domain
<400> 205
gcugugcuga gucagaccca gg 22
<210> 206
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-107 targeting domain
<400> 206
uugaggaggc cuuggggaag ga 22
<210> 207
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-108 targeting domain
<400> 207
gcccgggagc auggaggggu cu 22
<210> 208
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-109 targeting domain
<400> 208
guaaacuggg acugacccug ca 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-110 targeting domain
<400> 209
auaacauuga caggacagga ga 22
<210> 210
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 210
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<210> 211
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-112 targeting domain
<400> 211
gcaaacaugg cccgagauag au 22
<210> 212
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-113 targeting domain
<400> 212
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<210> 213
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-114 targeting domain
<400> 213
gcucuacguc accguccagc ac 22
<210> 214
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-115 targeting domain
<400> 214
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<210> 215
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-116 targeting domain
<400> 215
cuaaagcaaa aaggaacugc uu 22
<210> 216
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-117 targeting domain
<400> 216
gagaggaaaa cugaggcagg ga 22
<210> 217
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-118 targeting domain
<400> 217
cauugcaaag cugggugacg gg 22
<210> 218
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-119 targeting domain
<400> 218
uugccacccu gggcgguaug ag 22
<210> 219
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-120 targeting domain
<400> 219
agcuaggaag gcaaccagga gu 22
<210> 220
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-121 targeting domain
<400> 220
ucucuggggg cccaagcuca gg 22
<210> 221
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-122 targeting domain
<400> 221
agcacaggga agacccaaug ac 22
<210> 222
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-123 targeting domain
<400> 222
guugacugaa uauaugaggg cu 22
<210> 223
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-124 targeting domain
<400> 223
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<210> 224
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-125 targeting domain
<400> 224
cacacccacc uucuggccag aa 22
<210> 225
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-126 targeting domain
<400> 225
ccagaggaag aagaaggaaa ug 22
<210> 226
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-127 targeting domain
<400> 226
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<210> 227
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-128 targeting domain
<400> 227
aggggcagag ggaccacacg cu 22
<210> 228
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-129 targeting domain
<400> 228
aacuauaugg ccacucuccc ua 22
<210> 229
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-130 targeting domain
<400> 229
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<210> 230
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-131 targeting domain
<400> 230
caccaugaau gguguuuguu ga 22
<210> 231
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-132 targeting domain
<400> 231
gcagccauug caaagcuggg ug 22
<210> 232
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-133 targeting domain
<400> 232
ugacucagca cagcugcucc aa 22
<210> 233
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-134 targeting domain
<400> 233
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<210> 234
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-135 targeting domain
<400> 234
gauaacauug acaggacagg ag 22
<210> 235
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-136 targeting domain
<400> 235
ccaaacuggg acauuccuaa ca 22
<210> 236
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-137 targeting domain
<400> 236
aggaaaacag auggggugcu gc 22
<210> 237
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-138 targeting domain
<400> 237
cggacaugug ggggccucuc cu 22
<210> 238
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-139 targeting domain
<400> 238
gcaaagaaau uccagggaau gg 22
<210> 239
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-140 targeting domain
<400> 239
ccaggagacu uggaacgcgg ca 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-141 targeting domain
<400> 240
ugguccuugg ugguccuggc ca 22
<210> 241
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-142 targeting domain
<400> 241
aauggaaaau ccacuuccca cc 22
<210> 242
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-143 targeting domain
<400> 242
gcccgaagac gaaguaucca ug 22
<210> 243
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-144 targeting domain
<400> 243
gugcuggacg gugacguaga gc 22
<210> 244
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-145 targeting domain
<400> 244
agaaacaugu aggcggccag ca 22
<210> 245
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-146 targeting domain
<400> 245
ccgcucgaug gccaggacca cc 22
<210> 246
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-147 targeting domain
<400> 246
ucagcacaga ccccacugcc ua 22
<210> 247
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-148 targeting domain
<400> 247
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<210> 248
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-149 targeting domain
<400> 248
gaguacccac aguacuaccu gg 22
<210> 249
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-150 targeting domain
<400> 249
caaccaggag ugggagaggg au 22
<210> 250
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-151 targeting domain
<400> 250
uugagaaccg caagcagccg cu 22
<210> 251
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-152 targeting domain
<400> 251
gcaagccaga ccccuccucu cu 22
<210> 252
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-153 targeting domain
<400> 252
gagagcuggg caaagaaauu cc 22
<210> 253
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-154 targeting domain
<400> 253
cgaggcagca gccuggacau gg 22
<210> 254
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-155 targeting domain
<400> 254
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<210> 255
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-156 targeting domain
<400> 255
uucccgagaa gggagaggga gg 22
<210> 256
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-157 targeting domain
<400> 256
uccuuccucc cucucccuuc uc 22
<210> 257
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-158 targeting domain
<400> 257
uguuuugccc agaggaagaa ga 22
<210> 258
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-159 targeting domain
<400> 258
ccggcugguc cagguaaugg ca 22
<210> 259
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-160 targeting domain
<400> 259
cagcacaggg aagacccaau ga 22
<210> 260
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-161 targeting domain
<400> 260
accaggagug ggagagggau uu 22
<210> 261
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-162 targeting domain
<400> 261
gcuggugaag ccaccuagga cc 22
<210> 262
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-163 targeting domain
<400> 262
ggcgguauga gccgggugug gg 22
<210> 263
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-164 targeting domain
<400> 263
cagccauugc aaagcugggu ga 22
<210> 264
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-165 targeting domain
<400> 264
acauugacag gacaggagaa gg 22
<210> 265
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-166 targeting domain
<400> 265
ugggucuucc cugugcuggg ca 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 266
guacguggug guguguaagc cc 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-168 targeting domain
<400> 267
agcaaauaac uucccccauu cc 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 268
ggauuugagg aggccuuggg ga 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 269
cccugagcuu gggcccccag ag 22
<210> 270
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-171 targeting domain
<400> 270
cagagauucc cugagaaugg ga 22
<210> 271
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-172 targeting domain
<400> 271
gaguuggaag cccgcaucua uc 22
<210> 272
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-173 targeting domain
<400> 272
aguccuuccu cccucucccu uc 22
<210> 273
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-174 targeting domain
<400> 273
guuauuucau uucccgagaa gg 22
<210> 274
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-175 targeting domain
<400> 274
auuucauuuc ccgagaaggg ag 22
<210> 275
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-176 targeting domain
<400> 275
gacguagagc gugaggaagu ug 22
<210> 276
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-177 targeting domain
<400> 276
cauuucccga gaagggagag gg 22
<210> 277
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-178 targeting domain
<400> 277
guagagcgug aggaaguuga ug 22
<210> 278
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 278
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<210> 279
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 279
agguaguacu guggguacuc ga 22
<210> 280
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 280
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<210> 281
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-182 targeting domain
<400> 281
uuucauuucc cgagaaggga ga 22
<210> 282
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-183 targeting domain
<400> 282
gggaagaccc aaugacugga ga 22
<210> 283
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-184 targeting domain
<400> 283
aaaacugagg cagggagagg gg 22
<210> 284
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-185 targeting domain
<400> 284
ugagucagac ccaggcuggg ca 22
<210> 285
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-186 targeting domain
<400> 285
gggauuugag gaggccuugg gg 22
<210> 286
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-187 targeting domain
<400> 286
ucugggggcc caagcucagg gu 22
<210> 287
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-188 targeting domain
<400> 287
cgggcccaca ggaugcaauu ug 22
<210> 288
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<212> RNA
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<223> RHO-189 targeting domain
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<210> 289
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-190 targeting domain
<400> 289
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-191 targeting domain
<400> 290
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gcgguucuca acaccaggag ac 22
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<213> Artificial Sequence
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cucugggggc ccaagcucag gg 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gggagugcac ccuccuuagg ca 22
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-214 targeting domain
<400> 313
agaaugggac cgaggcagca gc 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-215 targeting domain
<400> 314
ggcaagccag accccuccuc uc 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 315
cccgggcuug gcgguggugg cu 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 322
auugcauccu gugggcccga ag 22
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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cggguuauuu cauuucccga ga 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 325
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<400> 334
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 339
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-241 targeting domain
<400> 340
agaauaaugu cuugcauuua ac 22
<210> 341
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-242 targeting domain
<400> 341
cuaggaaggc aaccaggagu gg 22
<210> 342
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-243 targeting domain
<400> 342
ucucccagac cccuccaugc uc 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-244 targeting domain
<400> 343
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<210> 344
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 344
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<210> 345
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 345
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<210> 346
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-247 targeting domain
<400> 346
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<210> 347
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-248 targeting domain
<400> 347
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<210> 348
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 348
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 349
cuagcuaccc ucucccuguc ua 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-251 targeting domain
<400> 350
gcuuuggaua acauugacag ga 22
<210> 351
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 351
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-253 targeting domain
<400> 352
ccuaggucuc cuggcuguga uc 22
<210> 353
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-254 targeting domain
<400> 353
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<210> 354
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-255 targeting domain
<400> 354
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<210> 355
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-256 targeting domain
<400> 355
gaggggcacc ugaggacagg gg 22
<210> 356
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-257 targeting domain
<400> 356
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<210> 357
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-258 targeting domain
<400> 357
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<210> 358
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-259 targeting domain
<400> 358
ccaggagugg gagagggauu ug 22
<210> 359
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-260 targeting domain
<400> 359
agaggggagg cagaggaugc ca 22
<210> 360
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-261 targeting domain
<400> 360
ccgccugcug acugccuugc ag 22
<210> 361
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-262 targeting domain
<400> 361
ggcuuggugc ugcaaacaug gc 22
<210> 362
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-263 targeting domain
<400> 362
cagguaaugg cacugagcag aa 22
<210> 363
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-264 targeting domain
<400> 363
uuggaacgcg gcagggaggc ug 22
<210> 364
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-265 targeting domain
<400> 364
uguccggguu auuucauuuc cc 22
<210> 365
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-266 targeting domain
<400> 365
cagguaguac uguggguacu cg 22
<210> 366
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-267 targeting domain
<400> 366
auaacagauc ccacuuaaca ga 22
<210> 367
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-268 targeting domain
<400> 367
agggacgggu gcagaguuga gu 22
<210> 368
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-269 targeting domain
<400> 368
gaaggagaga gcuuggugcu gg 22
<210> 369
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-270 targeting domain
<400> 369
ggucagccac ggcuagguug ag 22
<210> 370
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-271 targeting domain
<400> 370
auuucacagc aagaaaacug ag 22
<210> 371
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-272 targeting domain
<400> 371
ucaaagaagu caagcgcccu gc 22
<210> 372
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-273 targeting domain
<400> 372
gcugcuccca cccaagaaug cu 22
<210> 373
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-274 targeting domain
<400> 373
gcaacaaaca cccaacaaug gc 22
<210> 374
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-275 targeting domain
<400> 374
aaauccacuu cccacccuga gc 22
<210> 375
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-276 targeting domain
<400> 375
cagggaggcu ggaggggcac cu 22
<210> 376
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-277 targeting domain
<400> 376
gggcaagcca gaccccuccu cu 22
<210> 377
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-278 targeting domain
<400> 377
caggaaaaca gauggggugc ug 22
<210> 378
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-279 targeting domain
<400> 378
uuggagaagg gcacguagaa gu 22
<210> 379
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-280 targeting domain
<400> 379
agagcuuggu gcugggagga gg 22
<210> 380
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-281 targeting domain
<400> 380
uagcuaggaa ggcaaccagg ag 22
<210> 381
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-282 targeting domain
<400> 381
ggcuagguug agcaggaugu ag 22
<210> 382
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-283 targeting domain
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cucaccaccc caugaaguuc ca 22
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-284 targeting domain
<400> 383
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<210> 384
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-285 targeting domain
<400> 384
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<210> 385
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-286 targeting domain
<400> 385
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<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gugggugggg ugugcaggag cc 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 414
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-321 targeting domain
<400> 420
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 421
cagcaccaag ccucuguuuc cc 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-323 targeting domain
<400> 422
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 423
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 434
uggggaagga gagagcuugg ug 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 435
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 440
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 441
uccuagcuac ccucucccug uc 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 442
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 444
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 445
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 447
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 450
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 453
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-355 targeting domain
<400> 454
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-357 targeting domain
<400> 456
gggggagaca gggcaaggcu gg 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 457
gccgggugug gguggggugu gc 22
<210> 458
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 458
cugcguacca cacccgucgc au 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-360 targeting domain
<400> 459
cacccaagaa ugcugcgaag gc 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-361 targeting domain
<400> 460
ccuagcuacc cucucccugu cu 22
<210> 461
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-362 targeting domain
<400> 461
caccaggaga cuuggaacgc gg 22
<210> 462
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-363 targeting domain
<400> 462
uuggauaaca uugacaggac ag 22
<210> 463
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-364 targeting domain
<400> 463
uucgggccca caggaugcaa uu 22
<210> 464
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-365 targeting domain
<400> 464
gaaguaucca ugcagagagg ug 22
<210> 465
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-366 targeting domain
<400> 465
ggugugcagg agcccgggag ca 22
<210> 466
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-367 targeting domain
<400> 466
ggagcagcca cgggucagcc ac 22
<210> 467
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-368 targeting domain
<400> 467
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 468
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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agggccacag ccaugaaugg ca 22
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 471
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<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-373 targeting domain
<400> 472
ggccuucgca gcauucuugg gu 22
<210> 473
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-374 targeting domain
<400> 473
uuaacagaga ggaaaacuga gg 22
<210> 474
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-375 targeting domain
<400> 474
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<210> 475
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-376 targeting domain
<400> 475
accgaggcag cagccuggac au 22
<210> 476
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-377 targeting domain
<400> 476
agggaccaca cgcugaggag ag 22
<210> 477
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-31 targeting domain
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<220>
<223> RHO-33 targeting domain
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<223> RHO-35 targeting domain
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ctcctctctg ggggcccaag ct 22
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<220>
<223> RHO-39 targeting domain
<400> 638
aggattgaac tgggaacccg gt 22
<210> 639
<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-40 targeting domain
<400> 639
cctaggagag gcccccacat gt 22
<210> 640
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-41 targeting domain
<400> 640
atcactcagt tctggccaga ag 22
<210> 641
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-42 targeting domain
<400> 641
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-43 targeting domain
<400> 642
ccaccccatg aagttccata gg 22
<210> 643
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-44 targeting domain
<400> 643
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<210> 644
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-45 targeting domain
<400> 644
cagaggaaga agaaggaaat ga 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-46 targeting domain
<400> 645
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-47 targeting domain
<400> 646
ggattgaact gggaacccgg ta 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-48 targeting domain
<400> 647
tgtgtgtgtg tgtgtttagc ag 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-49 targeting domain
<400> 648
tcacacaggg acgggtgcag ag 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-51 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-53 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-54 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-55 targeting domain
<400> 654
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-56 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-57 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-58 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-59 targeting domain
<400> 658
gggtggtgag caggacagat gt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-60 targeting domain
<400> 659
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-61 targeting domain
<400> 660
cctgctgggg cgtcacacag gg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-62 targeting domain
<400> 661
cacacacaca caaaactccc ta 22
<210> 662
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-63 targeting domain
<400> 662
acttacgggt ggttgttctc tg 22
<210> 663
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-64 targeting domain
<400> 663
cacagggaag acccaatgac tg 22
<210> 664
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-65 targeting domain
<400> 664
agcacagacc ccactgccta ag 22
<210> 665
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-66 targeting domain
<400> 665
acctgaggac aggggctgag ag 22
<210> 666
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-67 targeting domain
<400> 666
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-68 targeting domain
<400> 667
tgctgcctcg gtcccattct ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-69 targeting domain
<400> 668
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-70 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-71 targeting domain
<400> 670
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-72 targeting domain
<400> 671
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<210> 672
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-73 targeting domain
<400> 672
ggaaggcaac caggagtggg ag 22
<210> 673
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-74 targeting domain
<400> 673
gctgagatgc aggaggagac gc 22
<210> 674
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-75 targeting domain
<400> 674
aggctggagg ggcacctgag ga 22
<210> 675
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-76 targeting domain
<400> 675
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<210> 676
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-77 targeting domain
<400> 676
ccgggagcat ggaggggtct gg 22
<210> 677
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-78 targeting domain
<400> 677
ggataacaga tcccacttaa ca 22
<210> 678
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-79 targeting domain
<400> 678
aggcagagga tgccagaggg ga 22
<210> 679
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-80 targeting domain
<400> 679
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<210> 680
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-81 targeting domain
<400> 680
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<210> 681
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-82 targeting domain
<400> 681
tcccacttaa cagagaggaa aa 22
<210> 682
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-83 targeting domain
<400> 682
gaatgcagag gtggtggaaa cc 22
<210> 683
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-84 targeting domain
<400> 683
gggagacagg gcaaggctgg ca 22
<210> 684
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-85 targeting domain
<400> 684
caccacccca tgaagttcca ta 22
<210> 685
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-86 targeting domain
<400> 685
gccatatagt taatcaacca aa 22
<210> 686
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-87 targeting domain
<400> 686
gtagctagga aggcaaccag ga 22
<210> 687
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-88 targeting domain
<400> 687
cacattgctt catggctcct ag 22
<210> 688
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-89 targeting domain
<400> 688
ctgagcttgg gcccccagag ag 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-90 targeting domain
<400> 689
accgagccca ttgcccagca ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-91 targeting domain
<400> 690
ctcaaagaag tcaagcgccc tg 22
<210> 691
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-92 targeting domain
<400> 691
gctaccctct ccctgtctag gg 22
<210> 692
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-93 targeting domain
<400> 692
accctgagct tgggccccca ga 22
<210> 693
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-94 targeting domain
<400> 693
ggcagaggga ccacacgctg ag 22
<210> 694
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-95 targeting domain
<400> 694
tctgactcag cacagctgct cc 22
<210> 695
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-96 targeting domain
<400> 695
ctctcagcca ccaccgccaa gc 22
<210> 696
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-97 targeting domain
<400> 696
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<210> 697
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-98 targeting domain
<400> 697
cacctgagga caggggctga ga 22
<210> 698
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-99 targeting domain
<400> 698
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-100 targeting domain
<400> 699
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-101 targeting domain
<400> 700
agcaccctct acacctctct gc 22
<210> 701
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-102 targeting domain
<400> 701
ctttggataa cattgacagg ac 22
<210> 702
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-103 targeting domain
<400> 702
ggtgaagcca cctaggacca tg 22
<210> 703
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-104 targeting domain
<400> 703
taacattgac aggacaggag aa 22
<210> 704
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-105 targeting domain
<400> 704
gggagagggg aagagactca tt 22
<210> 705
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-106 targeting domain
<400> 705
gctgtgctga gtcagaccca gg 22
<210> 706
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-107 targeting domain
<400> 706
ttgaggaggc cttggggaag ga 22
<210> 707
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-108 targeting domain
<400> 707
gcccgggagc atggaggggt ct 22
<210> 708
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-109 targeting domain
<400> 708
gtaaactggg actgaccctg ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-110 targeting domain
<400> 709
ataacattga caggacagga ga 22
<210> 710
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-111 targeting domain
<400> 710
ggcagggagg ctggaggggc ac 22
<210> 711
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-112 targeting domain
<400> 711
gcaaacatgg cccgagatag at 22
<210> 712
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-113 targeting domain
<400> 712
ggaccgagcc cattgcccag ca 22
<210> 713
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-114 targeting domain
<400> 713
gctctacgtc accgtccagc ac 22
<210> 714
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-115 targeting domain
<400> 714
agcacagctg ctccaaggga aa 22
<210> 715
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-116 targeting domain
<400> 715
ctaaagcaaa aaggaactgc tt 22
<210> 716
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-117 targeting domain
<400> 716
gagaggaaaa ctgaggcagg ga 22
<210> 717
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-118 targeting domain
<400> 717
cattgcaaag ctgggtgacg gg 22
<210> 718
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-119 targeting domain
<400> 718
ttgccaccct gggcggtatg ag 22
<210> 719
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-120 targeting domain
<400> 719
agctaggaag gcaaccagga gt 22
<210> 720
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-121 targeting domain
<400> 720
tctctggggg cccaagctca gg 22
<210> 721
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-122 targeting domain
<400> 721
agcacaggga agacccaatg ac 22
<210> 722
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-123 targeting domain
<400> 722
gttgactgaa tatatgaggg ct 22
<210> 723
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-124 targeting domain
<400> 723
ttgtaaactg ggactgaccc tg 22
<210> 724
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-125 targeting domain
<400> 724
cacacccacc ttctggccag aa 22
<210> 725
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-126 targeting domain
<400> 725
ccagaggaag aagaaggaaa tg 22
<210> 726
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-127 targeting domain
<400> 726
gagatattcc tggatcacag cc 22
<210> 727
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-128 targeting domain
<400> 727
aggggcagag ggaccacacg ct 22
<210> 728
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-129 targeting domain
<400> 728
aactatatgg ccactctccc ta 22
<210> 729
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-130 targeting domain
<400> 729
gctgcttgcg gttctcaaca cc 22
<210> 730
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-131 targeting domain
<400> 730
caccatgaat ggtgtttgtt ga 22
<210> 731
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-132 targeting domain
<400> 731
gcagccattg caaagctggg tg 22
<210> 732
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-133 targeting domain
<400> 732
tgactcagca cagctgctcc aa 22
<210> 733
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-134 targeting domain
<400> 733
ctgggaggag ggggaagggg ca 22
<210> 734
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<212> DNA
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<223> RHO-135 targeting domain
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-136 targeting domain
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<210> 736
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-137 targeting domain
<400> 736
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-155 targeting domain
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-156 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-157 targeting domain
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<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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tttcatttcc cgagaaggga ga 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-185 targeting domain
<400> 784
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-186 targeting domain
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-187 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 790
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 792
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gtccttcctc cctctccctt ct 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-201 targeting domain
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-202 targeting domain
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ccttctcggg aaatgaaata ac 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gcggttctca acaccaggag ac 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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ctctgggggc ccaagctcag gg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-205 targeting domain
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<210> 805
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-206 targeting domain
<400> 805
cagagaggtg tagagggtgc tg 22
<210> 806
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-207 targeting domain
<400> 806
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-208 targeting domain
<400> 807
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<210> 808
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-209 targeting domain
<400> 808
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-211 targeting domain
<400> 810
tcaccacccc atgaagttcc at 22
<210> 811
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-212 targeting domain
<400> 811
gggagtgcac cctccttagg ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-213 targeting domain
<400> 812
aatggccaga gattccctga ga 22
<210> 813
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-214 targeting domain
<400> 813
agaatgggac cgaggcagca gc 22
<210> 814
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-215 targeting domain
<400> 814
ggcaagccag acccctcctc tc 22
<210> 815
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-216 targeting domain
<400> 815
cccgggcttg gcggtggtgg ct 22
<210> 816
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-217 targeting domain
<400> 816
agcccgggag catggagggg tc 22
<210> 817
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-218 targeting domain
<400> 817
ccgggttatt tcatttcccg ag 22
<210> 818
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-219 targeting domain
<400> 818
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<210> 819
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-220 targeting domain
<400> 819
ccgtccctgt gtgacgcccc ag 22
<210> 820
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-221 targeting domain
<400> 820
ggacaggggc tgagagggga gg 22
<210> 821
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-222 targeting domain
<400> 821
agagggtgct ggtgaagcca cc 22
<210> 822
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-223 targeting domain
<400> 822
attgcatcct gtgggcccga ag 22
<210> 823
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-224 targeting domain
<400> 823
cgggttattt catttcccga ga 22
<210> 824
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-225 targeting domain
<400> 824
ggaaatgaaa taacccggac at 22
<210> 825
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-226 targeting domain
<400> 825
ctgactcagc acagctgctc ca 22
<210> 826
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-227 targeting domain
<400> 826
ggcacctgag gacaggggct ga 22
<210> 827
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-228 targeting domain
<400> 827
ggagagctgg gcaaagaaat tc 22
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-230 targeting domain
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cctccctctc ccttctcggg aa 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-231 targeting domain
<400> 830
tccaggtaat ggcactgagc ag 22
<210> 831
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-232 targeting domain
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gtgggggcct ctcctaggag cc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-233 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-235 targeting domain
<400> 834
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-237 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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ccggacatgt gggggcctct cc 22
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-251 targeting domain
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gctttggata acattgacag ga 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-252 targeting domain
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gccattgcaa agctgggtga cg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-253 targeting domain
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cctaggtctc ctggctgtga tc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-254 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-255 targeting domain
<400> 854
attacctgga ccagccggcg ag 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-256 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-257 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-259 targeting domain
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ccaggagtgg gagagggatt tg 22
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<212> DNA
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<223> RHO-260 targeting domain
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-263 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-264 targeting domain
<400> 863
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<210> 864
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-265 targeting domain
<400> 864
tgtccgggtt atttcatttc cc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-266 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-267 targeting domain
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-268 targeting domain
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-272 targeting domain
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-273 targeting domain
<400> 872
gctgctccca cccaagaatg ct 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-274 targeting domain
<400> 873
gcaacaaaca cccaacaatg gc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-275 targeting domain
<400> 874
aaatccactt cccaccctga gc 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-282 targeting domain
<400> 881
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-283 targeting domain
<400> 882
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-284 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-285 targeting domain
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-286 targeting domain
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tggccaggac caccaaggac ca 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-293 targeting domain
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ccaggtaatg gcactgagca ga 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-295 targeting domain
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-302 targeting domain
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ttgcacattg cttcatggct cc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-303 targeting domain
<400> 902
gaccgagccc attgcccagc ac 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-304 targeting domain
<400> 903
tgaacactgc cttgatctta tt 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-305 targeting domain
<400> 904
ggtgcactcc cccctagaca gg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-306 targeting domain
<400> 905
gcttggtgct gggaggaggg gg 22
<210> 906
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-307 targeting domain
<400> 906
ggatacttcg tcttcgggcc ca 22
<210> 907
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-308 targeting domain
<400> 907
agtcagaccc aggctgggca ct 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-309 targeting domain
<400> 908
agcaccaagc ctctgtttcc ct 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-310 targeting domain
<400> 909
tgggcaaaga aattccaggg aa 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-311 targeting domain
<400> 910
agagggattt gaggaggcct tg 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-312 targeting domain
<400> 911
gcaatgtttt gcccagagga ag 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-313 targeting domain
<400> 912
catgtccggg ttatttcatt tc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-314 targeting domain
<400> 913
aagcccatga gcaacttccg ct 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-315 targeting domain
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tcccaccctg agcttgggcc cc 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-316 targeting domain
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gagagagctt ggtgctggga gg 22
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
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cgaaggcctg agctcagcca ct 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-321 targeting domain
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ggagggtgca ctccccccta ga 22
<210> 921
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-322 targeting domain
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cagcaccaag cctctgtttc cc 22
<210> 922
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-323 targeting domain
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gggcaaagaa attccaggga at 22
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> RHO-324 targeting domain
<400> 923
cttcggggag aaccatgcca tc 22
<210> 924
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-325 targeting domain
<400> 924
tgggaggagg gggaaggggc ag 22
<210> 925
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-326 targeting domain
<400> 925
cctagacagg gagagggtag ct 22
<210> 926
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-327 targeting domain
<400> 926
taacagagag gaaaactgag gc 22
<210> 927
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-328 targeting domain
<400> 927
tctcagccac caccgccaag cc 22
<210> 928
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-329 targeting domain
<400> 928
gtcagcacag accccactgc ct 22
<210> 929
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-330 targeting domain
<400> 929
aggaaaactg aggcagggag ag 22
<210> 930
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-331 targeting domain
<400> 930
agccattgca aagctgggtg ac 22
<210> 931
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-332 targeting domain
<400> 931
aaatgaaata acccggacat gt 22
<210> 932
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-333 targeting domain
<400> 932
tagctaccct ctccctgtct ag 22
<210> 933
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-334 targeting domain
<400> 933
tgtgggtggg gtgtgcagga gc 22
<210> 934
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-335 targeting domain
<400> 934
tggggaagga gagagcttgg tg 22
<210> 935
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-336 targeting domain
<400> 935
gacttggaac gcggcaggga gg 22
<210> 936
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-337 targeting domain
<400> 936
aaggagagag cttggtgctg gg 22
<210> 937
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-338 targeting domain
<400> 937
gggaaggaga gagcttggtg ct 22
<210> 938
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-339 targeting domain
<400> 938
atttgaggag gccttgggga ag 22
<210> 939
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-340 targeting domain
<400> 939
atccagctgg agccctgagt gg 22
<210> 940
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-341 targeting domain
<400> 940
gagagcttgg tgctgggagg ag 22
<210> 941
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-342 targeting domain
<400> 941
tcctagctac cctctccctg tc 22
<210> 942
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-343 targeting domain
<400> 942
ccgaggcagc agcctggaca tg 22
<210> 943
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-344 targeting domain
<400> 943
ggggaaggag agagcttggt gc 22
<210> 944
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-345 targeting domain
<400> 944
tgctgggagg agggggaagg gg 22
<210> 945
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-346 targeting domain
<400> 945
cttcttgtgc tggacggtga cg 22
<210> 946
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-347 targeting domain
<400> 946
taccacaccc gtcgcattgg ag 22
<210> 947
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-348 targeting domain
<400> 947
agcagcctgg acatggggga ga 22
<210> 948
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-349 targeting domain
<400> 948
agccaggtag tactgtgggt ac 22
<210> 949
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-350 targeting domain
<400> 949
ggctgcttgc ggttctcaac ac 22
<210> 950
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-351 targeting domain
<400> 950
ggaccgaggc agcagcctgg ac 22
<210> 951
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-352 targeting domain
<400> 951
ctgggcaaag aaattccagg ga 22
<210> 952
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-353 targeting domain
<400> 952
tgagagggga ggcagaggat gc 22
<210> 953
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-354 targeting domain
<400> 953
gagggtgcac tcccccctag ac 22
<210> 954
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-355 targeting domain
<400> 954
cggttctcaa caccaggaga ct 22
<210> 955
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-356 targeting domain
<400> 955
tgtgcaatgt tttgcccaga gg 22
<210> 956
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-357 targeting domain
<400> 956
gggggagaca gggcaaggct gg 22
<210> 957
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-358 targeting domain
<400> 957
gccgggtgtg ggtggggtgt gc 22
<210> 958
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-359 targeting domain
<400> 958
ctgcgtacca cacccgtcgc at 22
<210> 959
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-360 targeting domain
<400> 959
cacccaagaa tgctgcgaag gc 22
<210> 960
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-361 targeting domain
<400> 960
cctagctacc ctctccctgt ct 22
<210> 961
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-362 targeting domain
<400> 961
caccaggaga cttggaacgc gg 22
<210> 962
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-363 targeting domain
<400> 962
ttggataaca ttgacaggac ag 22
<210> 963
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-364 targeting domain
<400> 963
ttcgggccca caggatgcaa tt 22
<210> 964
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-365 targeting domain
<400> 964
gaagtatcca tgcagagagg tg 22
<210> 965
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-366 targeting domain
<400> 965
ggtgtgcagg agcccgggag ca 22
<210> 966
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-367 targeting domain
<400> 966
ggagcagcca cgggtcagcc ac 22
<210> 967
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-368 targeting domain
<400> 967
agcgccctgc tggggcgtca ca 22
<210> 968
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-369 targeting domain
<400> 968
gagcccggga gcatggaggg gt 22
<210> 969
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-370 targeting domain
<400> 969
agggccacag ccatgaatgg ca 22
<210> 970
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-371 targeting domain
<400> 970
gcaatgtgca atgttttgcc ca 22
<210> 971
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-372 targeting domain
<400> 971
gaagaggtca gccacggcta gg 22
<210> 972
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-373 targeting domain
<400> 972
ggccttcgca gcattcttgg gt 22
<210> 973
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-374 targeting domain
<400> 973
ttaacagaga ggaaaactga gg 22
<210> 974
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-375 targeting domain
<400> 974
tgatggcatg gttctccccg aa 22
<210> 975
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-376 targeting domain
<400> 975
accgaggcag cagcctggac at 22
<210> 976
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-377 targeting domain
<400> 976
agggaccaca cgctgaggag ag 22
<210> 977
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-378 targeting domain
<400> 977
tggaacgcgg cagggaggct gg 22
<210> 978
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-379 targeting domain
<400> 978
tgcacattgc ttcatggctc ct 22
<210> 979
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-380 targeting domain
<400> 979
gcgttccaag tctcctggtg tt 22
<210> 980
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-381 targeting domain
<400> 980
gggtgtgcag gagcccggga gc 22
<210> 981
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-382 targeting domain
<400> 981
ggcaaagaaa ttccagggaa tg 22
<210> 982
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-383 targeting domain
<400> 982
ggctggaggg gcacctgagg ac 22
<210> 983
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-384 targeting domain
<400> 983
gcgccctgct ggggcgtcac ac 22
<210> 984
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-385 targeting domain
<400> 984
gcgtaccaca cccgtcgcat tg 22
<210> 985
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-386 targeting domain
<400> 985
accaggagac ttggaacgcg gc 22
<210> 986
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-387 targeting domain
<400> 986
gctgctgcct cggtcccatt ct 22
<210> 987
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-388 targeting domain
<400> 987
gaagccctcc aaattgcatc ct 22
<210> 988
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-389 targeting domain
<400> 988
cgtagagcgt gaggaagttg at 22
<210> 989
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-390 targeting domain
<400> 989
ctgaagcagt tcctttttgc tt 22
<210> 990
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-391 targeting domain
<400> 990
gctggacggt gacgtagagc gt 22
<210> 991
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-392 targeting domain
<400> 991
tgagggcttt ggataacatt ga 22
<210> 992
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-393 targeting domain
<400> 992
agccgggtgt gggtggggtg tg 22
<210> 993
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-394 targeting domain
<400> 993
ctcagttttc ctctctgtta ag 22
<210> 994
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-395 targeting domain
<400> 994
caagacatta ttctaaagca aa 22
<210> 995
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-396 targeting domain
<400> 995
tggaacttca tggggtggtg ag 22
<210> 996
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-397 targeting domain
<400> 996
gagagggatt tgaggaggcc tt 22
<210> 997
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-398 targeting domain
<400> 997
cttcgggccc acaggatgca at 22
<210> 998
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-399 targeting domain
<400> 998
acttggaacg cggcagggag gc 22
<210> 999
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-400 targeting domain
<400> 999
atggccagag attccctgag aa 22
<210> 1000
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-401 targeting domain
<400> 1000
cctcagtttt cctctctgtt aa 22
<210> 1001
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-402 targeting domain
<400> 1001
taacagatcc cacttaacag ag 22
<210> 1002
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RHO-403 targeting domain
<400> 1002
gggagaggga tttgaggagg cc 22
Claims (118)
- RHO 유전자의 표적 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하는, 가이드 RNA("gRNA") 분자.
- 제1항에 있어서, 표적화 도메인은 RHO 유전자의 표적 도메인에 상보적인, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 RHO 표적 위치의 10 개 뉴클레오타이드 내에서 이중 가닥 파손 및 단일 가닥 파손으로부터 선택된 절단 사건을 제공하도록 구성되는, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, RHO 표적 위치는 RHO 유전자의 5' 영역에 있는, gRNA 분자.
- 제4항에 있어서, RHO 유전자의 5' 영역은 RHO 유전자의 5' 비번역("UTR") 영역, 엑손 1, 엑손 1/인트론 1 경계, 엑손 2, 및 엑손 2/인트론 1 경계로 이루어진 군으로부터 선택되는, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 임의의 표 1 내지 표 3 및 표 18의 표적화 도메인 서열과 동일하거나, 3 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 포함하는, gRNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 1 내지 표 3 및 표 18에서 선택되는, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 모듈 gRNA 분자 또는 키메라 gRNA 분자인, gRNA 분자.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 5'로부터 3'으로
표적화 도메인;
제1 상보성 도메인;
연결 도메인;
제2 상보성 도메인;
근위 도메인; 및
꼬리 도메인을 포함하는, gRNA 분자. - (a) RHO 유전자에서 표적 도메인에 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 포함하는, 핵산.
- 제10항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 gRNA 분자인, 핵산.
- 제11항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 RHO 표적 위치의 10 개 뉴클레오타이드 내에서 이중 가닥 파손 및 단일 가닥 파손으로부터 선택된 절단 사건을 제공하도록 구성되는, 핵산.
- 제11항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 임의의 표 1 내지 표 3 및 표 18의 표적화 도메인 서열과 동일하거나, 3 개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 서열을 포함하는, 핵산.
- 제11항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 표 1 내지 표 3 및 표 18에서 선택되는, 핵산.
- 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 모듈 gRNA 분자 또는 키메라 분자인, 핵산.
- 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 (a)의 상기 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 핵산.
- 제16항에 있어서, (a)의 상기 gRNA 분자를 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터는 U6 프로모터인, 핵산.
- 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (b) RNA-가이드 뉴클레아제 분자를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
- 제18항에 있어서, 상기 RNA-가이드 뉴클레아제 분자는 표적 핵산에서 이중 가닥 파손을 형성하는, 핵산.
- 제18항에 있어서, 상기 RNA-가이드 뉴클레아제 분자는 표적 핵산에서 단일 가닥 파손을 형성하는, 핵산.
- 제20항에 있어서, 상기 단일 가닥 파손은 상기 gRNA 분자의 표적화 도메인이 상보적인 표적 핵산의 가닥에서 형성되는, 핵산.
- 제21항에 있어서, 상기 단일 가닥 파손은 상기 gRNA의 표적화 도메인이 상보적인 가닥이 아닌 표적 핵산의 가닥에서 형성되는, 핵산.
- 제18항에 있어서, 상기 RNA-가이드 뉴클레아제 분자는 Cas9 분자인, 핵산.
- 제23항에 있어서, 상기 Cas9 분자는 틈내기효소 분자를 포함하는, 핵산.
- 제18항에 있어서, 상기 RNA-가이드 뉴클레아제 분자는 Cpf1 분자인, 핵산.
- 제18항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자를 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 핵산.
- 제26항에 있어서, (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자를 암호화하는 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 프로모터는 RHO, CMV, EFS, GRK1, CRX, NRL, 및 RCVRN 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는, 핵산.
- 제10항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, (c) RHO cDNA 분자를 추가로 포함하는, 핵산.
- 제24항에 있어서, 상기 RHO cDNA 분자는 gRNA 분자와의 혼성화에 내성이 있도록 코돈 변형되지 않는, 핵산.
- 제28항에 있어서, 상기 RHO cDNA 분자는 RHO 유전자의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
- 제28항에 있어서, 상기 RHO cDNA 분자는 RHO 유전자의 엑손 1, 인트론 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 및 엑손 5를 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
- 제28항에 있어서, 인트론 1은 인트론 1의 5' 말단, 인트론 1의 3' 말단, 또는 둘 다에서 하나 이상의 절두를 포함하는, 핵산.
- 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 RHO cDNA 분자의 하류에 3' UTR 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
- 제33항에 있어서, 상기 3' UTR 뉴클레오타이드 서열은 RHO 유전자 3' UTR 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
- 제33항에 있어서, 상기 3' UTR 뉴클레오타이드 서열은 α-글로빈 3' UTR 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
- 제33항에 있어서, 상기 3' UTR 뉴클레오타이드 서열은 β-글로빈 3' UTR 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
- 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' UTR 뉴클레오타이드 서열은 상기 3' UTR 뉴클레오타이드 서열의 5' 말단, 상기 3' UTR 뉴클레오타이드 서열의 3' 말단, 또는 둘 다에서 하나 이상의 절두를 포함하는, 핵산.
- 제28항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 RHO cDNA 분자 (c)에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 핵산.
- 제38항에 있어서, RHO cDNA 분자 (c)에 작동 가능하게 연결된 상기 프로모터는 간상체-특이적 프로모터인, 핵산.
- 제39항에 있어서, 상기 간상체-특이적 프로모터는 인간 RHO 프로모터인, 핵산.
- 제40항에 있어서, 상기 인간 RHO 프로모터는 내인성 RHO 프로모터를 포함하는, 핵산.
- 제41항에 있어서, (d) RHO 유전자의 제2 표적 도메인에 상보적인 표적화 도메인을 갖는 제2 gRNA 분자를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
- 제42항에 있어서, 상기 제2 gRNA의 상기 표적화 도메인은 RHO 표적 위치의 10 개 뉴클레오타이드 내에서 이중 가닥 파손 및 단일 가닥 파손으로부터 선택된 절단 사건을 제공하도록 구성되는, 핵산.
- 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는 모듈 gRNA 분자 또는 키메라 gRNA 분자인, 핵산.
- 제42항 또는 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는 키메라 gRNA 분자인, 핵산.
- 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 gRNA 분자는 5'로부터 3'으로
표적화 도메인;
제1 상보성 도메인;
연결 도메인;
제2 상보성 도메인;
근위 도메인; 및
꼬리 도메인을 포함하는, 핵산. - 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 핵산.
- 제47항에 있어서, 제4 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 핵산.
- 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 및 (b) 각각은 동일한 핵산 분자에 존재하는, 핵산.
- 제49항에 있어서, 상기 핵산 분자는 AAV 벡터인, 핵산.
- 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, (a)는 제1 핵산 분자에 존재하고; (b)는 제2 핵산 분자에 존재하는, 핵산.
- 제51항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인, 핵산.
- 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항의 RHO cDNA 분자를 추가로 포함하는, 핵산.
- 제53항에 있어서, (a) 및 (c) 각각은 동일한 핵산 분자에 존재하는, 핵산.
- 제54항에 있어서, 상기 핵산 분자는 AAV 벡터인, 핵산.
- 제53항에 있어서, (a)는 제1 핵산 분자에 존재하고; (c)는 제2 핵산 분자에 존재하는, 핵산.
- 제56항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인, 핵산.
- 제10항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자를 암호화하는 서열; 및
(c) 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항의 RHO cDNA 분자를 추가로 포함하는, 핵산. - 제58항에 있어서, (a), (b), 및 (c) 각각은 동일한 핵산 분자에 존재하는, 핵산.
- 제59항에 있어서, 상기 핵산 분자는 AAV 벡터인, 핵산.
- 제58항에 있어서,
(a), (b), 및 (c) 중 하나는 제1 핵산 분자에 존재하고;
(a), (b), 및 (c) 중 2 번째 및 3 번째는 제2 핵산 분자에 존재하는, 핵산. - 제61항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인, 핵산.
- 제58항에 있어서, (a)는 제1 핵산 분자에 존재하고; (b) 및 (c)는 제2 핵산 분자에 존재하는, 핵산.
- 제63항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인, 핵산.
- 제58항에 있어서, (b)는 제1 핵산 분자에 존재하고; (a) 및 (c)는 제2 핵산 분자에 존재하는, 핵산.
- 제65항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인, 핵산.
- 제58항에 있어서, (c)는 제1 핵산 분자에 존재하고; (b) 및 (a)는 제2 핵산 분자에 존재하는, 핵산.
- 제67항에 있어서, 상기 제1 및 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인, 핵산.
- 제51항, 제56항, 제61항, 제63항, 제65항 및 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 핵산 분자는 AAV 벡터가 아니고, 상기 제2 핵산 분자는 AAV 벡터인, 핵산.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 gRNA 분자를 포함하는, 조성물.
- 제70항에 있어서, (b) 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항의 Cas9 분자를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제71항에 있어서, (c) 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항의 RHO cDNA 분자를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제72항에 있어서, 제2 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제73항에 있어서, 제3 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제75항에 있어서, 제4 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 조성물.
- 세포를 변경시키는 방법으로서, 상기 세포를
(a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 gRNA;
(b) 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자;
(c) 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항의 RHO cDNA 분자; 및
선택적으로, (d) 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항의 제2 gRNA 분자
와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법. - 제76항에 있어서, 제3 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 방법.
- 제77항에 있어서, 제4 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 방법.
- 제76항에 있어서, 상기 세포를 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 adRP를 앓고 있는 대상체로부터 유래된, 방법.
- 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 RHO 유전자에서 돌연변이를 갖는 대상체로부터 유래된, 방법.
- 제76항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 망막 세포인, 방법.
- 제82항에 있어서, 망막 세포는 간상체 광수용체인, 방법.
- 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포 또는 간엽 줄기 세포인, 방법.
- 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 생체외에서 수행되는, 방법.
- 제84항에 있어서, 상기 접촉된 세포는 상기 대상체의 신체로 되돌아가는, 방법.
- 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 생체내에서 수행되는, 방법.
- 제80항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에서 RHO 유전자 내 돌연변이의 존재에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제88항에 있어서, RHO 유전자의 일부를 시퀀싱함으로써 상기 세포에서 RHO 유전자 내 돌연변이의 존재에 대한 존재에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제76항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, RHO 유전자의 기능을 넉아웃(knock-out)시키도록 RHO 표적 위치를 변경시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제76항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 상기 세포를 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d) 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제76항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 상기 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자, 및 (a) 및 (c) 및 선택적으로 (d)를 암호화하는 핵산을 상기 세포로 전달하는 것을 포함하는, 방법.
- 제76항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 상기 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자, 상기 (a)의 gRNA 분자, 및 상기 (c)의 RHO cDNA 분자를 상기 세포로 전달하는 것을 포함하는, 방법.
- 제76항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 상기 (a)의 gRNA 분자, 상기 (c)의 RHO cDNA 분자 및 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자를 암호화하는 핵산을 상기 세포로 전달하는 것을 포함하는, 방법.
- 대상체(또는 상기 대상체로부터의 세포)를
(a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 gRNA;
(b) 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자;
(c) 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항의 RHO cDNA 분자; 및
선택적으로, (d) 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항의 제2 gRNA
와 접촉시키는 방법. - 제95항에 있어서, 제3 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 방법.
- 제96항에 있어서, 제4 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 방법.
- 제97항에 있어서, 상기 대상체를 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d)와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 adRP를 앓고 있는, 방법.
- 제95항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 RHO 유전자에서 돌연변이를 갖는, 방법.
- 제95항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 RHO 유전자 내 돌연변이의 존재에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제101항에 있어서, RHO 유전자의 일부를 시퀀싱함으로써 상기 대상체에서 RHO 유전자 내 돌연변이의 존재에 대한 정보를 획득하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제102항에 있어서, RHO 유전자의 기능을 넉아웃시키도록 RHO 표적 위치를 변경시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 세포는 생체외에서 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d)와 접촉되는, 방법.
- 제104항에 있어서, 상기 세포는 대상체의 신체로 되돌아가는, 방법.
- 제95항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 상기 대상체의 신체에 세포를 도입하는 것을 포함하고, 상기 세포 대상체는 생체외에서 (a), (b), (c), 및 선택적으로 (d)와 접촉되는, 방법.
- 제95항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉은 생체내에서 수행되는, 방법.
- 제107항에 있어서, 상기 접촉은 정맥내 전달을 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 상기 대상체를 (a), (b), (c) 및 선택적으로 (d) 중 적어도 하나를 암호화하는 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 상기 대상체를 제10항 내지 제69항 중 어느 한 항의 핵산과 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 상기 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자, 및 (a) 및 (c) 및 선택적으로 (d)를 암호화하는 핵산을 상기 대상체로 전달하는 것을 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 상기 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자, 상기 (a)의 gRNA 분자, 및 상기 (c)의 RHO cDNA 분자, 및 선택적으로 상기 (d)의 제2 gRNA를 상기 대상체로 전달하는 것을 포함하는, 방법.
- 제95항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 상기 (a)의 gRNA, 상기 (c)의 RHO cDNA 분자 및 (b)의 RNA-가이드 뉴클레아제 분자를 암호화하는 핵산을 상기 대상체로 전달하는 것을 포함하는, 방법.
- gRNA, 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 조성물, 및 adRP를 갖는 대상체, 또는 RHO 유전자에서 돌연변이를 갖는 대상체로부터의 세포를 포함하는, 반응 혼합물.
- (a) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 gRNA 분자, 또는 상기 gRNA를 암호화하는 핵산, 및 다음 중 하나 이상을 포함하는 키트:
(b) 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항의 Cas9 분자;
(c) 제28항 내지 제41항 중 어느 한 항의 RHO cDNA 분자;
선택적으로, (d) 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항의 제2 gRNA 분자; 및
(e) (b) 및 (c) 중 하나 이상의 암호화하는 핵산. - 제115항에 있어서, (a), (b) (c) 및 (d) 중 하나 이상을 암호화하는 핵산을 포함하는, 키트.
- 제116항에 있어서, RHO 유전자의 RHO 표적 위치를 표적화하는 제3 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 키트.
- 제117항에 있어서, RHO 유전자의 RHO 표적 위치를 표적화하는 제4 gRNA 분자를 추가로 포함하는, 키트.
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