RU2811724C2 - РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК) - Google Patents

РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК) Download PDF

Info

Publication number
RU2811724C2
RU2811724C2 RU2020121128A RU2020121128A RU2811724C2 RU 2811724 C2 RU2811724 C2 RU 2811724C2 RU 2020121128 A RU2020121128 A RU 2020121128A RU 2020121128 A RU2020121128 A RU 2020121128A RU 2811724 C2 RU2811724 C2 RU 2811724C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
human
itr
hla
sequence
itrs
Prior art date
Application number
RU2020121128A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2020121128A (ru
Inventor
Роберт Майкл КОТИН
Дуглас КЕРР
Филлип САМАЙОА
Озан Алкан
Мэттью Дж. СИММОНС
Original Assignee
Дженерейшен Био Ко.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дженерейшен Био Ко. filed Critical Дженерейшен Био Ко.
Priority claimed from PCT/US2018/064242 external-priority patent/WO2019113310A1/en
Publication of RU2020121128A publication Critical patent/RU2020121128A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2811724C2 publication Critical patent/RU2811724C2/ru

Links

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Изобретение представляет собой способ вставки донорной последовательности в предварительно определенный сайт вставки на хромосоме в клетке-хозяине, включающий: введение в клетку-хозяина направляющей РНК (нРНК) и мРНК, кодирующей фермент Cas; и композиции, содержащей липидную наночастицу (LNP), содержащую бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК); при этом зкДНК-вектор содержит нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность редактирующей ген нуклеиновой кислоты, содержащую 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность матрицы репарации и 3'-гомологичное плечо, и причем донорная последовательность вставлена в хромосому в указанном сайте вставки или рядом с ним посредством гомологичной рекомбинации. Изобретение касается также способа редактирования генов хромосомы в клетке-хозяине, включающего введение в клетку-хозяина направляющей РНК (нРНК) и мРНК, кодирующей фермент Cas; и композиции, содержащей липидную наночастицу (LNP), содержащую бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК); при этом зкДНК-вектор содержит нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность редактирующей ген нуклеиновой кислоты, причем последовательность редактирующей ген нуклеиновой кислоты содержит донорную последовательность, причем указанную хромосому восстанавливают с использованием негомологичного присоединения концов (NHEJ). Изобретение позволяет эффективно вставлять донорную последовательность в определенную часть хромосомы клетки-хозяина. 2 н. и 60 з.п. ф-лы, 19 ил., 10 табл., 18 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет согласно §119(e) Раздела 35 Свода законов США на основании предварительной заявки на патент США № 62/595328, поданной 6 декабря 2017 г., и предварительной заявки № 62/607069, поданной 18 декабря 2017 г., содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Данная заявка включает перечень последовательностей, поданный в электронном виде в формате ASCII и включенный в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 6 декабря 2018 года, имеет название 080170-090470WOPT_SL.txt и размер 198924 байтов.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0003] Данное изобретение относится к области генной терапии, в том числе к изолированным полинуклеотидам, имеющим функцию редактирования генов. Данное изобретение также относится к конструктам нуклеиновых кислот, промоторам, векторам и клеткам-хозяевам, содержащим полинуклеотиды, а также к способам доставки экзогенных последовательностей ДНК в клетки-мишени, ткань, орган или организм. Например, данное изобретение обеспечивает невирусные ДНК-векторы для редактирования генов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Целью генной терапии является улучшение клинических исходов для пациентов, страдающих генетическими мутациями или приобретенными заболеваниями, вызываемыми аберрациями в профиле генной экспрессии. Генная терапия включает лечение или предотвращение медицинских состояний, обусловленных дефектными генами или аномальной регуляцией или экспрессией, например, недостаточной экспрессией или избыточной экспрессией, которые могут приводить к нарушению, заболеванию, злокачественному новообразованию и т.п. Например, лечение, предотвращение или облегчение заболевания или нарушения, вызываемого дефектным геном, может быть осуществлено путем доставки пациенту корректирующего генетического материала, приводящей к терапевтической экспрессии указанного генетического материала у указанного пациента. Лечение, предотвращение или облегчение заболевания или нарушения, вызываемого дефектным геном, можно осуществлять, изменяя или заглушая дефектный ген, например, удаляя пациенту весь дефектный ген или его часть и/или редактируя определенную часть дефектного гена с помощью корректирующего генетического материала, что приводит к терапевтической экспрессии указанного генетического материала у указанного пациента.
[0005] Генная терапия основана на обеспечении транскрипционной кассеты с активным генным продуктом (иногда называемым трансгеном), например, который может приводить к положительному эффекту приобретения функции, отрицательному эффекту утраты функции, или другому исходу, такому как, например, онколитический эффект. Генная терапия может также применяться для лечения заболевания или злокачественного новообразования, вызываемого другими факторами. Лечение моногенных нарушений человека может осуществляться путем доставки и экспрессии нормального гена в клетках-мишенях. Доставка и экспрессия корректирующего гена в целевые клетки (клетки-мишени) пациента может быть осуществлена с применением многочисленных способов, в том числе с применением сконструированных вирусов и вирусных векторов для доставки генов. Среди многочисленных доступных происходящих из вирусов векторов (например, из рекомбинантного ретровируса, рекомбинантного лентивируса, рекомбинантного аденовируса и т.п.) набирает популярность в качестве многоцелевого вектора для генной терапии рекомбинантный аденоассоциированный вирус (rAAV).
[0006] Аденоассоциированные вирусы (AAV) принадлежат к семейству Parvoviridae; более конкретно, они составляют род Dependoparvovirus. Геном AAV состоит из линейной одноцепочечной молекулы ДНК, которая содержит приблизительно 4,7 т.п.о. (кб) и состоит из двух основных открытых рамок считывания (ORF), кодирующих неструктурный белок Rep (репликация) и структурный белок Cap (капсид). В гене cap была идентифицирована вторая ORF, которая кодирует активирующий сборку белок (AAP). ДНК, фланкирующие кодирующие области AAV, представляют собой две последовательности действующих в цис-положении инвертированных концевых повторов (ITR) длиной приблизительно 145 нуклеотидов, с прерывистыми палиндромными последовательностями, которые могут укладываться в энергетически стабильные шпилечные структуры, функционирующие в качестве праймеров при репликации ДНК. Наряду с ролью в репликации ДНК, указанные последовательности ITR, как было показано, вовлечены в интеграцию вирусной ДНК в клеточный геном, выход из генома хозяина или плазмиды, и заключение в капсид вирусной нуклеиновой кислоты в зрелых вирионах (Muzyczka, (1992) Curr. Top. Micro. Immunol. 158:97-129).
[0007] Векторы, происходящие из AAV (т.е. рекомбинантные AAV- (rAVV) или AAV-векторы), являются привлекательным способом доставки генетического материала, поскольку (i) они способны инфицировать (трансдуцировать) широкий спектр типов неделящихся и делящихся клеток, в том числе миоциты и нейроны; (ii) они лишены вирусных структурных генов, что обеспечивает уменьшение ответов клетки-хозяина на вирусную инфекцию, например, интерферон-опосредованных ответов; (iii) вирусы дикого типа считаются непатогенными для человека; (iv) в отличие от AAV дикого типа, который способен к интеграции в геном клетки-хозяина, у дефектных по репликации векторов AAV отсутствует ген rep, и обычно они персистируют в виде эписом, что ограничивает риск инсерционного мутагенеза или генотоксичности; и (v) по сравнению с другими векторными системами, AAV-векторы в целом считаются относительно слабыми иммуногенами и, соответственно, не вызывают значимого иммунного ответа (см. ii), обеспечивая таким образом персистенцию векторной ДНК и, потенциально, долгосрочную экспрессию терапевтических трансгенов. AAV-векторы могут также быть продуцированы и введены в составы с высокими титрами и доставлены путем внутриартериальных, внутривенных, или внутрибрюшинных инъекций, обеспечивая распределение вектора и перенос генов в значимые мышечные области посредством однократной инъекции у грызунов (Goyenvalle et al., 2004; Fougerousse et al., 2007; Koppanati et al., 2010; Wang et al., 2009) и собак. В клиническом исследовании лечения спинальной мышечной дистрофии типа 1 AAV-векторы доставляли системно для нацеливания на мозг, что приводило к видимым клиническим улучшениям.
[0008] Однако применение частиц AAV в качестве вектора для доставки генов имеет ряд серьезных недостатков. Один существенный недостаток, ассоциированный с rAAV, заключается в ограниченной емкости вирусной упаковки, составляющей приблизительно 4,5 кб гетерологичной ДНК (Dong et al., 1996; Athanasopoulos et al., 2004; Lai et al., 2010). В результате применение AAV-векторов было ограничено кодированием белка менее чем 150000 Да. Второй недостаток заключается в том, что ввиду распространенности инфекции AAV дикого типа в популяции кандидаты для генной терапии rAAV должны проходить скрининг на присутствие нейтрализующих антител, элиминирующих вектор из организма пациента. Третий недостаток связан с иммуногенностью капсида, которая предотвращает повторное введение пациентам, не исключенным из первичного лечения. Иммунная система пациента может отвечать на вектор, который эффективно действует в качестве «бустерного» агента, стимулируя иммунную систему, генерирующую высокие титры антител против AAV, исключая лечение в будущем. В некоторых недавних отчетах описаны проблемы с иммуногенностью в ситуациях с использованием высоких доз. Другой заметный недостаток заключается в относительно медленном начале действия AAV-опосредованной генной экспрессии, учитывая, что одноцепочечная ДНК AAV должна быть преобразована в двунитевую ДНК до гетерологичной генной экспрессии. Хотя были предприняты попытки обойти указанную проблему путем конструирования двунитевых ДНК-векторов, указанная стратегия дополнительно ограничивает размер трансгенной экспрессионной кассеты, которая может быть интегрирована в AAV-вектор (McCarty, 2008; Varenika et al., 2009; Foust et al., 2009).
[0009] Кроме того, стандартные вирионы AAV с капсидами получают путем введения плазмиды или плазмид, содержащих геном AAV, гены rep и гены cap (Grimm et al., 1998). При введении указанных хелперных (вспомогательных) плазмид в транс-положении, происходит «спасение» генома AAV (т.е. высвобождение с последующей амплификацией) из генома хозяина, и дальнейшее заключение в капсид (вирусные капсиды) с получением биологически активных AAV-векторов. Однако, как было обнаружено, такие заключенные в капсиды вирусные AAV-векторы неэффективно трансдуцируют определенные типы клеток и тканей. Указанные капсиды также индуцируют иммунный ответ.
[0010] Соответственно, применение векторов на основе аденоассоциированного вируса (AAV-векторов) для генной терапии ограничено однократным введением пациентам (из-за иммунного ответа у пациентов), ограниченным диапазоном трансгенного генетического материала, подходящего для доставки в AAV-векторах ввиду минимальной емкости вирусной упаковки (приблизительно 4,5 т.п.о.) ассоциированного капсида AAV, а также медленной AAV-опосредованной генной экспрессией. Применение клинической генной терапии с использованием rAAV дополнительно затрудняет вариабельность среди пациентов, которую нельзя предсказать на основании дозовой зависимости в моделях сингенных мышей или других модельных видов.
[0011] Современные подходы к редактированию генов, такие как использующие AAV для доставки донорной матрицы, проблематичны и имеют несколько ограничений. Во-первых, размер донорной матрицы и, например, гомологичных плечей для индуцирования гомологичной репарации (HDR) ограничен требованиями к упаковке в частице AAV. Во-вторых, иммуногенность, вызванная введением AAV, исключает повторную дозировку, и, следовательно, процесс редактирования генов может быть выполнен только один раз. Наконец, исходный иммунитет против AAV не позволяет значительной части пациентов получать потенциальную терапию редактирования генов. Авторы изобретения наблюдали другие ограничения современных подходов к редактированию генов, относящиеся к различным компонентам, таким как нуклеаза (нуклеазы), промотор(ы), направляющая (направляющие) РНК (если Cas9 является нуклеазой), донорная матрица (донорные матрицы) «скорректированного гена» (например, матрица репарации гомологично-направленной рекомбинации (HDR)) и раздельная доставка областей гомологии. Доставка компонентов по данному изобретению также проблематична, поскольку компоненты не могут быть упакованы в одну доставляемую частицу, а использование нескольких частиц может вызывать проблемы, связанные с иммуногенностью. Поскольку редактирование генов требует, чтобы все компоненты присутствовали в одной клетке, которая должна быть подвергнута редактированию, эффективность редактирования генов является низкой, так как многие клетки не содержат все доставляемые компоненты.
[0012] Рекомбинантные бескапсидные AAV-векторы могут быть получены в виде выделенной линейной молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей экспрессируемые области трансгена и промотора, фланкированные двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) AAV дикого типа, включая Rep-связывающие сайты и сайт концевого разрешения. Указанные рекомбинантные AAV-векторы лишены кодирующих последовательностей капсидного белка AAV, и могут быть одноцепочечными, двуцепочечными или дуплексными, с одним или обоими концами, ковалентно связанными посредством двух палиндромных последовательностей ITR дикого типа (например, WO2012/123430, патент США 9598703). Они позволяют избежать многих проблем AAV-опосредованной генной терапии благодаря значительно большей трансгенной емкости, быстрому началу трансгенной экспрессии, и действительному распознаванию иммунной системой пациента молекул ДНК как вируса, который необходимо удалить. Однако постоянная экспрессия трансгена может быть желательной не во всех случаях, а канонические ITR AAV дикого типа могут не поддаваться оптимизации для использования в качестве зкДНК.
[0013] В данной области существует потребность в технологии, которая позволяет точно направлять нуклеазную активность (или другие белковые активности) на определенные участки целевой ДНК таким образом, чтобы не требовалось конструировать новый белок для каждой новой целевой последовательности. Кроме того, в данной области техники существует потребность в способах контроля экспрессии генов с минимальными эффектами вне целевой области, и остается важная неудовлетворенная потребность в контролируемых рекомбинантных ДНК-векторах с улучшенной способностью к продуцированию и/или экспрессии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0014] Описанное в данном документе изобретение относится к невирусному бескапсидному ДНК-вектору с ковалентно-замкнутыми концами (называемому в данном документе «вектором с ДНК с замкнутыми концами», или «зкДНК-вектором») для редактирования генов. зкДНК-векторы, описанные в данном документе, представляют собой не содержащие капсида линейные дуплексные молекулы ДНК, образованные непрерывной цепью комплементарной ДНК с ковалентно замкнутыми концами (линейная, непрерывная и бескапсидная структура), которые содержат последовательность 5'-инвертированного концевого повтора (ITR) и последовательность 3'-ITR, где 5'-ITR и 3'-ITR могут иметь одинаковую симметричную трехмерную организацию друг относительно друга (т.е. симметричную или по существу симметричную) или, альтернативно, 5'-ITR и 3'-ITR могут иметь различную трехмерную организацию по отношению друг к другу (т.е. асимметричные ITR). Кроме того, ITR могут принадлежать к одному или разным серотипам. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для редактирования генов может содержать последовательности ITR, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве, или имеют одинаковые петли A, C-C' и B-B' в трехмерном пространстве (т.е. они одинаковы или являются зеркальными отображениями по отношению друг к другу). В таком варианте реализации оба члена пары симметричных ITR или пары по существу симметричных ITR могут быть одинаковым образом модифицированными ITR (например, mod-ITR), и они не обязательно должны быть ITR дикого типа. Пара mod-ITR может иметь одну и ту же последовательность, которые имеют одну или несколько модификаций по сравнению с ITR дикого типа и взаимно дополняют друг друга (являются инвертированными). В альтернативных вариантах реализации модифицированная пара ITR, по существу, является симметричной, как определено в данном документе, т.е. пара модифицированных ITR могут иметь разные последовательности, но аналогичную или одинаковую симметричную трехмерную форму. В некоторых вариантах реализации один ITR может принадлежать к одному серотипу AAV, а другой ITR может принадлежать к другому серотипу AAV.
[0015] Соответственно, некоторые аспекты технологии, описанной в данном документе, относятся к зкДНК-вектору для редактирования генов, который содержит последовательности ITR, выбранные из любых из: (i) по меньшей мере одного ITR дикого типа (WT) и по меньшей мере одного модифицированного инвертированного концевого повтора (ITR) AAV (например, асимметричных модифицированных ITR); (ii) двух модифицированных ITR, где пара mod-ITR имеют разную трехмерную пространственную организацию друг относительно друга (например, асимметричных модифицированных ITR), или (iii) пары симметричных или по существу симметричных ITR WT-WT, где все WT-ITR имеют одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) пары симметричных или по существу симметричных модифицированных ITR, где все mod-ITR имеют одинаковую трехмерную пространственную организацию. зкДНК-векторы, раскрытые в данном документе, могут продуцироваться в эукариотических клетках и, соответственно, не содержат прокариотических модификаций ДНК и загрязнения бактериальными эндотоксинами в клетках насекомых.
[0016] Более конкретно, варианты реализации данного изобретения основаны на способах и композициях, содержащих зкДНК-вектор редактирования генов, который может экспрессировать трансген, представляющий собой молекулу редактирования генов в клетке-хозяине (например, трансген представляет собой нуклеазу, такую как ZFN, TALEN, Cas; одну или несколько направляющих РНК; CRISPR; рибонуклеопротеин (RNP) или любую их комбинацию) и приводит к эффективному редактированию генома. зкДНК-векторы, описанные в данном документе, не ограничены по размеру, что позволяет, например, экспрессировать все компоненты, необходимые для системы редактирования генов, из одного вектора (например, системы редактирования генов CRISPR/Cas (например, фермента Cas9 или модифицированного Cas9, направляющей РНК и/или матрицы гомологично направляемой репарации) или для системы TALEN или цинкового пальца). Однако, также предполагается, что один или два из таких компонентов кодируются в одном зкДНК-векторе, тогда как остальные компоненты (компонент) могут экспрессироваться отдельным зкДНК-вектором или традиционной плазмидой.
[0017] Описанная в данном документе технология относится к зкДНК-вектору, содержащему две последовательности инвертированных концевых повторов AAV (ITR), фланкирующие трансген или гетерологичную нуклеиновую кислоту, где гетерологичная нуклеиновая кислота представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, редактирующую ген. Во всех аспектах, представленных в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов кодирует молекулу для редактирования генов, выбранную из группы, состоящей из: последовательность-специфичной нуклеазы, одной или нескольких направляющих РНК, CRISPR/Cas, рибонуклеопротеина (RNP), или деактивированного CAS для систем CRISPRi или CRISPRa, или любой их комбинации.
[0018] В некоторых вариантах реализации, зкДНК-вектор содержит: (1) экспрессионную кассету, содержащую цис-регуляторный элемент, промотор и по меньшей мере один трансген (например, молекулу для редактирования гена); или (2) промотор, функционально связанный с по меньшей мере одним трансгеном (например, молекулой, редактирующей ген), и (3) две самокомплементарные последовательности, например, асимметричные или симметричные или по существу симметричные ITR, как определено в данном документе, фланкирующие указанную экспрессионную кассету, при этом зкДНК-вектор не ассоциирован с капсидным белком. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит две самокомплементарные последовательности, присутствующие в геноме AAV, при этом по меньшей мере один ITR содержит функциональный Rep-связывающий элемент (RBE) (также иногда называемый в данном документе «RBS») и сайт концевого разрешения (trs) AAV или функциональный вариант RBE, и один или нескольких цис-регуляторных элементов, функционально связанных с трансгеном. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена (например, молекулы, редактирующей гены), например, регуляторные переключатели, которые описаны в данном документе в разделе, озаглавленном «Регуляторные переключатели», для контроля и регулирования экспрессии трансгена, и может включать регуляторный переключатель, например, «аварийный выключатель», обеспечивающий контролируемую клеточную гибель клетки, содержащей зкДНК-вектор.
[0019] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для редактирования генов, описанный в данном документе, может использоваться для встраивания желаемой последовательности нуклеиновой кислоты. В частности, способы и композиции, описанные в данном документе, могут использоваться для введения новой последовательности нуклеиновой кислоты, исправления мутации в геномной последовательности или введения мутации в последовательность гена-мишени в клетке-хозяине. Такие способы могут называться «системы встраивания ДНК».
[0020] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для редактирования генов, раскрытый в данном документе, содержит гомологичные плечи, например, при увеличении специфичности нацеливания на ген-мишень. Гомологически направленная репарация (HDR) представляет собой процесс гомологичной рекомбинации, в котором матрица ДНК используется для обеспечения гомологии, необходимой для точной репарации двухцепочечного разрыва (DSB) путем вставки донорной последовательности, представляющей интерес. Например, в одном неограничительном примере зкДНК-вектор для редактирования генов может содержать 5'- и 3'-гомологичное плечо конкретного гена или целевой сайт интеграции. В некоторых вариантах реализации специфический сайт рестрикции может быть сконструирован в направлении 5' по отношению к 5'-гомологичному плечу, в направлении 3' к 3'-гомологичному плечу, или в обоих направлениях. Когда зкДНК-вектор расщепляется одной или несколькими рестрикционными эндонуклеазами, специфичными к сконструированному сайту (сайтам) рестрикции, получающаяся в результате кассета содержит 5'-гомологичное плечо-донорную последовательность-3'-гомологичное плечо и может быть легче рекомбинирована с желаемым геномным локусом. В некоторых вариантах реализации в последовательности геномной ДНК, на которую должно проводиться нацеливание, расположенной со стороны 5'-конца и рядом с тем местом, где 5'-конец 3'-гомологичного плеча является гомологичным, и/или расположенной со стороны 3'-конца, и рядом с тем местом, где 3'-конец 5'-гомологичного плеча является гомологичным, находится последовательность-мишень онРНК (например, см. Фиг. 17 и 18A). Специалисту в данной области будет понятно, что эта расщепленная кассета может дополнительно содержать другие элементы, такие как, без ограничений, один или несколько из следующих: регуляторная область, нуклеаза и дополнительная донорная последовательность. В определенных аспектах сам зкДНК-вектор может кодировать эндонуклеазу рестрикции, так чтобы при доставке зкДНК-вектора в ядро эндонуклеаза рестрикции экспрессировалась и была способна расщеплять вектор. В определенных аспектах эндонуклеаза рестрикции кодируется вторым зкДНК-вектором, который доставляется отдельно. В определенных аспектах эндонуклеазу рестрикции вводят в ядро с помощью средства доставки, не основанного на зкДНК. В некоторых вариантах реализации эндонуклеазу рестрикции вводят после доставки зкДНК-вектора в ядро. В некоторых вариантах реализации эндонуклеаза рестрикции и зкДНК-вектор переносятся в ядро одновременно. В некоторых вариантах реализации эндонуклеаза рестрикции уже присутствует при введении зкДНК-вектора.
[0021] Соответственно, в некоторых вариантах реализации технология, описанная в данном документе, позволяет доставлять субъекту более чем одну зкДНК, редактирующую гены. Как описано в данном документе, в одном варианте реализации зкДНК может иметь гомологичные плечи, фланкирующие донорную последовательность, которая нацелена на конкретный ген-мишень или локус, и может в некоторых вариантах реализации также включать одну или несколько направляющих РНК (например, онРНК) для нацеливания разрезания геномной ДНК, как описано в данном документе, и другая зкДНК может содержать нуклеазный фермент и РНК-активатор, как описано в данном документе, для стадий фактического редактирования генов.
[0022] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, последовательность-специфическая нуклеаза включает: нуклеазу TAL, нуклеазу цинкового пальца (ZFN), мегануклеазу, мегаТАЛ (megaTAL) или РНК-направляемую эндонуклеазу (например, CAS9, cpf1, dCAS9, nCAS9).
[0023] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов представляет собой матрицу гомологично направляемой репарации.
[0024] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, матрица гомологично направляемой репарации содержит 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо.
[0025] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, композиция дополнительно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндонуклеазу, причем эндонуклеаза расщепляет или разрезает ДНК гена-мишени по специфическому сайту эндонуклеазы или сайту-мишени зкДНК-вектора.
[0026] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, 5'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной перед сайтом разрезания или разрыва эндонуклеазы ДНК на хромосоме.
[0027] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, 3'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной после сайта разрезания или разрыва эндонуклеазы ДНК.
[0028] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, каждое из гомологичных плеч составляет приблизительно от 250 до 2000 п.о.
[0029] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, эндонуклеаза ДНК включает: нуклеазу TAL, нуклеазу цинкового пальца (ZFN) или РНК-направляемую эндонуклеазу (например, Cas9 или Cpf1).
[0030] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, РНК-направляемая эндонуклеаза содержит фермент Cas.
[0031] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, фермент Cas представляет собой Cas9.
[0032] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, фермент Cas представляет собой никующую Cas9 (nCas9).
[0033] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, nCas9 содержит мутацию в домене HNH или RuVc (например, D10A) Cas.
[0034] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, фермент Cas представляет собой деактивированную нуклеазу Cas (dCas), которая образует комплекс с направляющей РНК (нРНК), которая нацелена на промоторную область гена-мишени.
[0035] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, композиция дополнительно содержит эффекторный домен KRAB.
[0036] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, dCas слита с гетерологичным доменом активации транскрипции, который может быть направлен в область промотора.
[0037] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, слияние с dCas направлено в область промотора гена-мишени посредством направляющей РНК, которая рекрутирует дополнительные домены трансактивации для усиления экспрессии гена-мишени.
[0038] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, dCas представляет собой dCas9 S. pyogenes.
[0039] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, последовательность направляющей РНК нацелена на близость промотора гена-мишени, и CRISPR заставляет молчать ген-мишень (система CRISPRi). Используемое здесь выражение «близость промотора гена-мишени» относится к области, которая физически находится в, рядом с, или поблизости от промоторной последовательности гена-мишени, и каталитически неактивная ДНК-эндонуклеаза может функционировать для ингибирования экспрессии гена-мишени. В некоторых вариантах реализации «близость к промотору» относится к последовательности, находящейся внутри самой последовательности промотора, непосредственно примыкающей к последовательности промотора (с любого конца) или отстоящей на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 нуклеотидов или более от терминального конца последовательности промотора.
[0040] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, последовательность направляющей РНК направлена на сайт начала транскрипции гена-мишени и активирует или модулирует ген-мишень (система CRISPRa). Используемый в данном документе термин «сайт начала транскрипции гена-мишени» относится к области, которая физически находится в, рядом с, или поблизости от стартовой последовательностью транскрипции («ATG»; инициирующий метионин) гена-мишени, и каталитически неактивная ДНК-эндонуклеаза может функционировать путем рекрутирования транскрипционного механизма, такого как РНК-полимераза, для увеличения экспрессии гена-мишени, например, по меньшей мере на 10%. В некоторых вариантах реализации направляющая РНК может содержать последовательность, которая включает сайт начала транскрипции «ATG». В других вариантах реализации направляющая РНК может содержать последовательность, расположенную непосредственно перед сайтом начала транскрипции. В дополнительных вариантах реализации направляющая РНК может содержать последовательность, расположенную за 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 нуклеотидов или более до сайта начала транскрипции, при условии, что расстояние не настолько велико, чтобы рекрутированный трансляционный механизм не функционировал для усиления экспрессии гена-мишени.
[0041] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, последовательность направляющей РНК нацелена на близость промотора гена-мишени и активирует или модулирует ген-мишень (система CRISPRa), например, для увеличения экспрессии гена-мишени.
[0042] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, композиция дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере одну направляющую РНК (нРНК) для РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы.
[0043] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, направляющая РНК (нРНК) нацелена на акцепторный сайт сплайсинга или донорный сайт сплайсинга дефектного гена для осуществления негомологичного присоединения конца (NHEJ) и коррекции дефектного гена для экспрессии функционального белка. Используемый в данном документе термин «акцептор сплайсинга» относится к последовательности нуклеиновой кислоты на 3'-конце интрона, где он соединяется с экзоном. Консенсусные последовательности для акцептора сплайсинга включают, без ограничений: NTN(TC) (TC) (TC)TTT (TC) (TC)(TC) (TC) (TC) (TC)NCAGg (SEQ ID NO: 558). Интронные последовательности представлены заглавными буквами, а экзонные последовательности - строчными. Используемый в данном документе термин «донор сплайсинга» относится к последовательности нуклеиновой кислоты на 5'-конце интрона, где он соединяется с экзоном. Консенсусная последовательность для донорной последовательности сплайсинга включает, без ограничений: naggt(ag)aGT (SEQ ID NO: 559). Интронные последовательности представлены заглавными буквами, а экзонные последовательности - строчными. Эти последовательности представляют собой последовательности, являющиеся консервативными от вирусных геномов до генома приматов.
[0044] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, вектор кодирует множество копий одной последовательности направляющей РНК.
[0045] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, композиция дополнительно содержит регуляторную последовательность, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность редактирования гена.
[0046] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, регуляторная последовательность содержит энхансер и/или промотор. В некоторых вариантах реализации промотор является индуцибельным промотором.
[0047] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, промотор функционально связан с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей эндонуклеазу ДНК, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей эндонуклеазу ДНК, дополнительно содержит интронную последовательность, расположенную перед последовательностью эндонуклеазы, и интрон содержит сайт расщепления нуклеазой.
[0048] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, сайт поли(А) расположен перед и вблизи от 5'-гомологичного плеча.
[0049] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, донорная последовательность является чужеродной для 5'-гомологичного плеча или 3'-гомологичного плеча.
[0050] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, 5'-гомологичное плечо или 3'-гомологичное плечо являются проксимальными к по меньшей мере одному ITR, как определено в данном документе.
[0051] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеазу, представляет собой кДНК.
[0052] В другом варианте реализации редактирование направлено на РНК, а не на ДНК. Например, используют Cas13, такой как Cas13 бактерий Prevotella spp. Этот фермент комбинируют с другой молекулой, которая корректирует РНК. Например, белок ADAR2 заменяет аденозин на инозин в РНК индивидуума. См., например, Science, Cox, D.B.T. et al. 25 Oct 2017 “RNA editing with CRISPR-Cas13. Редактирование и/или отслеживание РНК с использованием вектора (векторов) зкДНК, кодирующих систему редактирования генов, как описано в данном документе, можно выполнять способами, известными в данной области, например, Abudayyeh et al. Science 353:1-9 (2016); O'Connell et al. Nature 516:263-266 (2014); Nelles et al. Cell 165:488-496 (2016); содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.
[0053] Другой аспект, представленный в данном документе, относится к способу редактирования генома, включающему: контактирование клетки с системой редактирования генов, при этом один или несколько компонентов системы редактирования генов доставляют в клетку путем контактирования клетки с композицией, содержащей зкДНК-вектор, как описано в данном документе, причем в состав зкДНК-вектора нуклеиновой кислоты входят фланкирующие последовательности инвертированного концевого повтора (ITR), при этом последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе, и по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты, редактирующей ген.
[0054] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, система редактирования генов выбирают из группы, состоящей из: системы TALEN, системы эндонуклеазы цинкового пальца (ZFN), системы CRISPR/Cas, системы CRISPRi, системы CRISPRa и системы мегануклеазы.
[0055] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, по меньшей мере одна последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов кодирует молекулу для редактирования генов, выбранную из группы, состоящей из: РНК-направляемой нуклеазы, направляющей РНК, направляющей ДНК, ZFN (нуклеаза цинковых пальцев), TALEN, Cas, молекулы CRISPR/Cas или ее ортолога, рибонуклеопротеина (RNP) или деактивированного CAS для систем CRISPRi или CRISPRa.
[0056] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, один зкДНК-вектор содержит все компоненты системы редактирования генов.
[0057] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, белок Cas является оптимизированным по кодонам для экспрессии в эукариотической клетке.
[0058] В данном документе также представлен, в другом аспекте, способ редактирования генома, включающий введение в клетку эффективного количества композиции зкДНК, как описано в данном документе, в подходящих условиях и в течение времени, достаточного для редактирования гена-мишени.
[0059] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, для нацеливания на ген-мишень используют одну или несколько последовательностей направляющих РНК и редактирование проводят путем гомологично направляемой репарации (HDR) в присутствии донорной матрицы HDR.
[0060] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, для нацеливания на ген-мишень используют одну последовательность направляющей РНК, и ген-мишень редактируют с помощью негомологичного присоединения конца (NHEJ). В одном варианте реализации направляющая РНК нацелена на донора или акцептора сплайсинга, чтобы стимулировать пропуск экзонов и экспрессию функционального белка, например, белка дистрофина.
[0061] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, способ проводится in vivo для коррекции однонуклеотидного полиморфизма (SNP), или делеции, или вставки, связанных с заболеванием.
[0062] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, заболевания, подходящие для редактирования генов с использованием зкДНК-векторов, раскрытых в данном документе, обсуждаются в разделах настоящего документа, озаглавленных «Примеры заболеваний для лечения с помощью зкДНК для редактирования генов» и «Дополнительные заболевания для редактирования генов». Примерами заболеваний, подлежащих лечению, являются, например, без ограничений, мышечная дистрофия Дюшенна (ген DMD), транстиретиновый амилоидоз (ATTR) (правильный ген mutTTR), дефицит орнитин-транскарбамилазы (дефицит ОТК), гемофилия, муковисцидоз, серповидноклеточная анемия, наследственный гемохроматоз, рак или наследственная слепота, и гены, подлежащие коррекции, включают, без ограничений; эритропоэтин, ангиостатин, эндостатин, супероксиддисмутазу (SOD1), глобин, лептин, каталазу, тирозин-гидроксилазу, цитокин, трансмембранный регулятор проводимости муковисцидоза (МВТР), или фактор роста пептидов и т.п.
[0063] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, в зкДНК-векторе присутствуют по меньшей мере 2 различных белка Cas, при этом один из белков Cas является каталитически неактивным (Cas-i), и направляющая РНК, связанная с Cas-I, нацелена на промотор клетки-мишени, и при этом ДНК, кодирующая Cas-I, находится под контролем индуцибельного промотора, так что он может в нужное время отключить экспрессию гена-мишени. Используемый в данном документе термин «каталитически неактивный» относится к молекуле (например, ферменту или киназе) с каталитическим сайтом, который был переведен из активного состояния в неактивное состояние, что препятствует его активности. Молекула может быть сделана каталитически неактивной, например, в результате денатурации, ингибирующего связывания, мутаций в каталитическом сайте или вторичной обработки (например, фосфорилирования или других посттрансляционных модификаций). Например, каталитически неактивный или деактивированный Cas9 (dCas9) не обладает эндонуклеазной активностью и может быть получен, например, путем введения точечных мутаций в два каталитических остатка (D10A и H840A) гена, кодирующего Cas9. В одном варианте реализации каталитически неактивное состояние молекулы относится к молекуле с каталитической активностью, составляющей менее 0,1% по сравнению с ее каталитически активным состоянием, и дополнительно охватывает молекулу, обладающую любой активностью, определяемой стандартными лабораторными методами.
[0064] Также в данном документе, в другом аспекте, представлен способ редактирования одной пары нуклеотидных оснований в гене-мишени клетки, причем способ включает контактирование клетки с системой редактирования гена CRISPR/Cas, в которой один или несколько компонентов системы редактирования генов CRISPR/Cas доставляется в клетку путем введения в контакт клетки с композицией вектора нуклеиновой кислоты с ДНК с замкнутыми концами (зкДНК), причем композиция нуклеиновой кислоты зкДНК-вектора представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, содержащую фланкирующие последовательности концевых повторов (TR) и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования гена для нацеливания гена-мишени или регуляторную последовательность гена-мишени, при этом белок Cas, экспрессируемый из вектора, является каталитически неактивным и слит с фрагментом редактирования оснований, причем способ осуществляют в условиях и в течение времени, достаточного для модуляции экспрессии гена-мишени.
[0065] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, фрагмент для редактирования основания содержит специфичную к одноцепочечным участкам цитидиндеаминазу, ингибитор урацилгликозилазы или тРНК-аденозиндеаминазу.
[0066] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, каталитически неактивный белок Cas, экспрессируемый из вектора, представляет собой dCas9.
[0067] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, вводимая в контакт клетка представляет собой Т-клетку или клетку CD34+.
[0068] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, ген-мишень кодирует белок программируемой смерти (PD1), цитотоксический антиген 4, ассоциированный с T-лимфоцитами (CTLA4), или фактор некроза опухоли-α (ФНО-α).
[0069] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, дополнительно включается введение клеток (например, T-клеток или клеток CD34+), полученных способом, описанным в данном документе, нуждающемуся в этом субъекту.
[0070] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, субъект, нуждающийся в этом, имеет вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, рак или аутоиммунное заболевание.
[0071] Другой аспект, представленный в данном документе, относится к способу модулирования экспрессии двух или более генов-мишеней в клетке, включающему: введение в клетку: (i) композиции, содержащей зкДНК-вектор, который содержит: фланкирующие последовательности ITR, причем последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую, по меньшей мере, две направляющие РНК, комплементарные к двум или более генам-мишеням, причем вектор представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, (ii) второй композиции, содержащей зкДНК-вектор, который содержит: фланкирующие последовательности ITR, причем последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере две каталитически неактивные эндонуклеазы ДНК, каждая из которых ассоциируется с направляющей РНК, и связывается с двумя или более генами-мишенями, причем вектор представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, и (iii) третьей композиции, содержащей зкДНК-вектор, который содержит: фланкирующие последовательности ITR, причем последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе, и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере два белка или домена регулятора транскрипции, причем вектор представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, и при этом по меньшей мере две направляющие РНК, по меньшей мере две каталитически неактивные РНК-направляемые эндонуклеазы, и по меньшей мере два белка или домена регулятора транскрипции экспрессируются в клетке, причем образуются два или более комплексов ко-локализации между направляющей РНК, каталитически неактивной РНК-направляемой эндонуклеазой, белком или доменом регулятора транскрипции и геном-мишенью, и при этом белок или домен регулятора транскрипции регулирует экспрессию по меньшей мере двух генов-мишеней.
[0072] В одном аспекте невирусные бескапсидные векторы ДНК с ковалентно-замкнутыми концами предпочтительно представляют собой линейные дуплексные молекулы и могут быть получены из векторного полинуклеотида, который кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) (например, ITR AAV), причем по меньшей мере один из ITR содержит сайт концевого разрешения и сайт связывания белка репликации (RPS) (иногда называемый сайтом связывания репликативного белка), например, Rep-связывающий сайт. 5'-ITR и 3'-ITR могут быть симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, причем 5'- и 3'-ITR имеют одинаковую трехмерную пространственную организацию (т.е. являются симметричной парой mod-ITR или симметричной или по существу симметричной парой WT-ITR), или асимметричными друг относительно друга, так что 5'-ITR и 3'-ITR имеют различную трехмерную организацию по отношению друг к другу (т.е. асимметричные ITR) друг относительно друга (например, WT-ITR и mod-ITR или пара mod-ITR, которые имеют значения, определенные в данном документе).
[0073] В некоторых вариантах реализации две самокомплементарные последовательности могут быть последовательностями ITR из любого известного парвовируса, например, депендовируса, такого как AAV (например, AAV1-AAV12). Может быть использован любой серотип AAV, включая, без ограничений, модифицированную последовательность ITR AAV2, которая сохраняет Rep-связывающий сайт (RBS), такой как 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531), и сайт концевого разрешения (trs) в дополнение к переменной палиндромной последовательности, позволяющей сформировать вторичную структуру шпильки. В некоторых вариантах реализации ITR представляет собой синтетическую последовательность ITR, которая сохраняет функциональный Rep-связывающий сайт (RBS), такой как 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531), и сайт концевого разрешения (TRS), в дополнение к вариабельной палиндромной последовательности, позволяющей формировать вторичную структуру шпильки. В некоторых примерах последовательность ITR сохраняет последовательность RBS, trs и структуру и положение Rep-связывающего элемента, образующего участок концевой петли одной из вторичной структуры шпильки ITR из соответствующей последовательности ITR AAV2 дикого типа.
[0074] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, содержащий асимметричную пару ITR, может содержать ITR с модификацией в ITR, соответствующей любой из модификаций последовательностей ITR или частичных последовательностей ITR, приведенных в любой одной или нескольких из Таблиц 4A или 4B в данном документе, или одной или нескольких из Таблиц 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10А-10В заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки. В качестве типичного примера в данном изобретении представлен ДНК-вектор с замкнутыми концами для редактирования генов, который содержит асимметричные ITR, причем указанный зкДНК-вектор содержит промотор, функционально связанный с трансгеном, при этом зкДНК лишена капсидных белков и: (а) продуцируется из зкДНК-плазмиды (например, см. Примеры 1-2 и/или Фиг. 1A-1B ), которая кодирует мутированную правую сторону ITR AAV2, имеющую то же число внутримолекулярных дуплексных пар оснований, что и SEQ ID NO: 2, или мутированную левую сторону ITR AAV2, имеющая такое же число внутримолекулярных дуплексных пар оснований, что и SEQ ID NO: 51 в конфигурации вторичной шпильки (предпочтительно, за исключением делеции любой AAA- или TTT-концевой петли в этой конфигурации по сравнению с такими референсными последовательностями), и (b) идентифицируется как зкДНК с использованием анализа для идентификации зкДНК методом электрофореза в агарозном геле, в нативном геле и денатурирующих условиях, указанных в Примере 1. Примеры таких 5'- и 3'-модифицированных последовательностей ITR для зкДНК-вектора, содержащего асимметричные ITR, представлены в Таблицах 4А или 4В, или в одной или нескольких из Таблиц 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10А-10B заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.
[0075] Альтернативно, в некоторых вариантах реализации типичные примеры модифицированных последовательностей ITR для использования в зкДНК-векторе, который содержит симметричные модифицированные ITR, т.е. зкДНК, содержащем модифицированный 5'ITR и модифицированный 3'ITR, при этом модифицированный 5'ITR и модифицированный 3'ITR симметричны или по существу симметричны друг относительно друга, как показано в Таблице 5, в которой приведены пары ITR (модифицированный 5'-ITR и симметричный модифицированный 3'-ITR). В некоторых вариантах реализации симметричная пара ITR представляет собой пару WT-WT ITR, которая представлена в Таблице 2.
[0076] Описанная в данном документе технология дополнительно относится к зкДНК-вектору для редактирования генов, причем зкДНК-вектор содержит гетерологичную экспрессионную кассету нуклеиновых кислот, которая может содержать, например, более 4000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов или 20000 нуклеотидов, или 30000 нуклеотидов, или 40000 нуклеотиды или 50000 нуклеотидов, или любой интервал в диапазоне примерно 4000-10000 нуклеотидов или 10000-50000 нуклеотидов, или более 50000 нуклеотидов. зкДНК-векторы не имеют ограничений по размеру инкапсидированных векторов AAV, что позволяет доставлять экспрессионную кассету большого размера для обеспечения эффективной экспрессии трансгенов. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор лишен для прокариот метилирования.
[0077] Кассета экспрессии также может содержать внутренний сайт входа в рибосому (IRES) и/или элемент 2А. Цис-регуляторные элементы включают, без ограничений, промотор, рибопереключатель, инсулятор, mir-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации ITR может действовать в качестве промотора для трансгена. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена. Например, дополнительный регуляторный компонент может представлять собой переключатель регулятора, как раскрыто в данном документе, включая, без ограничений, «аварийный выключатель», который может уничтожить инфицированную зкДНК клетку, при необходимости, и другие индуцибельные и/или репрессируемые элементы.
[0078] Описанная в данном документе технология дополнительно обеспечивает новые способы редактирования генов с использованием зкДНК-векторов. зкДНК-вектор способен переноситься в клетки-хозяева, а также транспортироваться в ядро в отсутствие капсида AAV. Кроме того, в описанных в данном документе зкДНК-векторах отсутствует капсид, что позволяет избежать иммунного ответа, который может возникнуть в ответ на капсидсодержащие векторы.
[0079] Аспекты изобретения относятся к способам получения зкДНК-векторов, пригодных для редактирования генов, как описано в данном документе. Другие варианты реализации относятся к зкДНК-вектору, полученному способом, представленным в данном документе. В одном варианте реализации бескапсидный невирусный ДНК-вектор (зкДНК-вектор) получают из плазмиды (называемой в данном документе «зкДНК-плазмида»), содержащей матрицу полинуклеотидного экспрессионного конструкта, содержащую, в указанном порядке: первый 5'-инвертированный концевой повтор (например, ITR AAV); гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты; и 3'-ITR (например, ITR AAV), при этом 5'-ITR и 3'-ITR могут быть асимметричными друг относительно друга или симметричными (например, представлять собой WT-ITR или модифицированные симметричные ITR), как определено в данном документе.
[0080] зкДНК-вектор, раскрытый в данном документе, может быть получен рядом способов, которые будут известны рядовому специалисту после прочтения данного раскрытия. Например, полинуклеотидная матрица экспрессионного конструкта, используемая для генерирования зкДНК-векторов по данному изобретению, может представлять собой зкДНК-плазмиду (например, см. Таблицу 8 или Фиг. 7В), зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус. В одном варианте реализации зкДНК-плазмида содержит сайт рестрикционного клонирования (например, SEQ ID NO: 7), функционально расположенный между ITR, где может быть вставлена экспрессионная кассета, содержащая, например, промотор, функционально связанный с трансгеном, например, репортерным геном и/или терапевтическим геном). В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы получают из полинуклеотидной матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, зкДНК-бакуловируса), содержащей симметричные или асимметричные ITR (модифицированные ITR или ITR дикого типа (WT)).
[0081] В пермиссивной клетке-хозяине, в присутствии, например, Rep, полинуклеотидная матрица, имеющая по меньшей мере два ITR, реплицируется для продуцирования зкДНК-векторов. Продуцирование зкДНК-вектора проходит в два этапа: во-первых, вырезание («спасение») матрицы из основной цепи матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, зкДНК-бакуловирусного генома и т.д.) посредством Rep-белков и, во-вторых, Rep-опосредованная репликация вырезанного зкДНК-вектора. Белки Rep и Rep-связывающие сайты различных серотипов AAV хорошо известны рядовым специалистам в данной области. Рядовой специалист в данной области понимает, что следует выбирать белок Rep из серотипа, который связывается с последовательностью нуклеиновой кислоты и реплицирует ее на основе, по меньшей мере, одного функционального ITR. Например, если компетентный по репликации ITR относится к серотипу AAV 2, соответствующий Rep будет принадлежать серотипу AAV, который работает с указанным серотипом, таким как ITR AAV2 с Rep AAV2 или AAV4, но не с Rep AAV5, который непригоден для этого. После репликации зкДНК-вектор с ковалентно-замкнутыми концами продолжает накапливаться в пермиссивных клетках, и зкДНК-вектор предпочтительно является достаточно стабильным во времени в присутствии белка Rep в стандартных условиях репликации, например, для накопления в количестве, составляющем по меньшей мере 1 пг/клетку. предпочтительно, по меньшей мере 2 пг/клетку, предпочтительно, по меньшей мере 3 пг/клетку, более предпочтительно, по меньшей мере 4 пг/клетку, еще более предпочтительно, по меньшей мере 5 пг/клетку.
[0082] Соответственно, один аспект изобретения относится к способу получения зкДНК-вектора для редактирования генов, включающему стадии: а) инкубации популяции клеток-хозяев (например, клеток насекомых), несущих полинуклеотидную матрицу экспрессионного конструкта (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус), лишенную последовательностей, кодирующих вирусный капсид, в присутствии белка Rep в условиях, эффективных для, и в течение времени, достаточного для индукции продуцирования зкДНК-вектора в клетках-хозяевах. и при этом клетки-хозяева не содержат последовательностей, кодирующих вирусный капсид; и б) сбора и выделения зкДНК-вектора из клеток-хозяев. Присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида с модифицированным ITR для продуцирования зкДНК-вектора в клетке-хозяине. Однако вирусные частицы (например, вирионы AAV) не экспрессируются. Таким образом, отсутствуют ограничения по размеру, вызываемые вирионами.
[0083] Присутствие пригодного для редактирования генов зкДНК-вектора, выделенного из клеток-хозяев, можно подтвердить путем расщепления ДНК, выделенной из клетки-хозяина, с помощью рестриктазы, имеющей единственный сайт узнавания на зкДНК-векторе, и анализа материала расщепленной ДНК на денатурирующем и неденатурирующем гелях для подтверждения наличия характерных полос линейной и непрерывной ДНК по сравнению с линейной и не-непрерывной ДНК.
[0084] В другом аспекте данного изобретения также представлен способ вставки последовательности нуклеиновой кислоты в геномный ген «безопасной гавани», включающий: контактирование клетки с (i) системой редактирования генов, и (ii) матрицей гомологично направляемой репарации, имеющей гомологию с геном безопасной гавани генома и содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую представляющий интерес белок, при этом один или несколько компонентов системы редактирования генов доставляют в клетку путем контактирования клетки с композицией зкДНК-вектора, как описано в данном документе, причем композиция зкДНК-вектора представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, содержащую фланкирующие последовательности ITR, при этом последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе, и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов, имеющую область, комплементарную геномному гену безопасной гавани, и при этом способ осуществляют в условиях и в течение времени, достаточных для вставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес белок ген безопасной гавани геномав ген безопасной гавани генома.
[0085] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, ген безопасной гавани генома содержит активный интрон, расположенный близко к по меньшей мере одной кодирующей последовательности, о которой известно, что она экспрессирует белки с высоким уровнем экспрессии.
[0086] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, ген безопасной гавани генома содержит сайт, расположенный в или рядом с геном альбумина.
[0087] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, ген безопасной гавани генома представляет собой локус AAVS1.
[0088] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, представляющий интерес белок является рецептором, токсином, гормоном, ферментом или белком клеточной поверхности. В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, представляющий интерес белок является рецептором. В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, представляющий интерес белок является протеазой.
[0089] В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, типичными неограничивающими примерами генов, на которые нужно проводить нацеливание, или представляющего интерес белка может быть фактор VIII (FVIII) или фактор IX (FIX). В другом варианте реализации этого аспекта и всех других аспектов, представленных в данном документе, способ осуществляют in vivo для лечения гемофилии А или гемофилии В. Использование зкДНК-векторов для редактирования генов, как раскрыто в данном документе, обсуждается в разделах, озаглавленных «Типичные примеры заболеваний для лечения с помощью зкДНК для редактирования генов» и «Дополнительные заболевания для редактирования генов» в данном документе. Примерами заболеваний, подлежащих лечению, являются, например, без ограничений, мышечная дистрофия Дюшенна (ген DMD), транстиретиновый амилоидоз (ATTR) (правильный ген mutTTR), дефицит орнитин-транскарбамилазы (дефицит ОТК), гемофилия, муковисцидоз, серповидноклеточная анемия, наследственный гемохроматоз, рак или наследственная слепота, и гены, подлежащие коррекции, включают, без ограничений; эритропоэтин, ангиостатин, эндостатин, супероксиддисмутазу (SOD1), глобин, лептин, каталазу, тирозин-гидроксилазу, цитокин, трансмембранный регулятор проводимости муковисцидоза (МВТР), или фактор роста пептидов и т.п.
[0090] В некоторых вариантах реализации данная заявка может быть определена любым из следующих параграфов:
1. Невирусный бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК), содержащий:
по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), при этом по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена.
2. зкДНК-вектор по п. 1, в котором по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена, выбирают из нуклеазы, направляющей РНК (нРНК), направляющей ДНК (нДНК) и РНК-активатора.
3. зкДНК-вектор по п. 2, в котором по меньшей мере одна молекула для редактирования гена, представляет собой нуклеазу.
4. зкДНК-вектор по п. 3, в котором нуклеаза представляет собой последовательность-специфичную нуклеазу.
5. зкДНК-вектор по п. 4, в котором специфичную к последовательности нуклеазу выбирают из нуклеазы, направляемой нуклеиновой кислотой, нуклеазы цинкового пальца (ZFN), мегануклеазы, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), или megaTAL.
6. зкДНК-вектор по п. 5, в котором специфичная к последовательности нуклеаза представляет собой направляемую нуклеиновой кислотой нуклеазу, выбранную из редактора одиночных оснований, РНК-направляемой нуклеазы и ДНК-направляемой нуклеазы.
7. зкДНК-вектор по п. 2 или п. 6, в котором по меньшей мере одна молекула для редактирования гена, представляет собой нРНК или нДНК.
8. зкДНК-вектор по пп. 2, 6 или 7, в котором по меньшей мере одна молекула для редактирования гена, представляет собой РНК-активатор.
9. зкДНК по любому из пп. 6-8, в котором направляемая нуклеиновой кислотой нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR.
10. зкДНК-вектор по п. 9, в котором нуклеаза CRISPR представляет собой нуклеазу Cas.
11. зкДНК-вектор по п. 10, в котором нуклеазу Cas выбирают из Cas9, никующей Cas9 (nCas9) и деактивированной Cas (dCas).
12. зкДНК-вектор по п. 11, в котором nCas9 содержит мутацию в домене HNH или RuVc Cas.
13. зкДНК-вектор по п. 11, в котором нуклеаза Cas представляет собой деактивированную нуклеазу Cas (dCas), образующую комплекс с нРНК, нацеленой на промоторную область гена-мишени.
14. зкДНК-вектор по п. 13, дополнительно содержащий эффекторный домен KRAB.
15. зкДНК-вектор по п. 13 или п. 14, в котором dCas слит с гетерологичным доменом активации транскрипции, который может быть направлен в область промотора.
16. зкДНК-вектор по п. 15, в котором слияние dCas направляют в промоторную область гена-мишени посредством направляющей РНК, которая рекрутирует дополнительные домены трансактивации для усиления экспрессии гена-мишени.
17. зкДНК-вектор по любому из пп. 13-16, в котором dCas представляет собой dCas9 S. pyogenes.
18. зкДНК-вектор по любому из пп. 7-17, в котором последовательность направляющей РНК нацелена на промотор гена-мишени, а CRISPR заглушает ген-мишень (система CRISPRi).
19. зкДНК-вектор по любому из пп. 7-17, в котором последовательность направляющей РНК нацелена на сайт старта транскрипции гена-мишени и активирует ген-мишень (система CRISPRa).
20. зкДНК-вектор по любому из пп. 6-19, в котором по меньшей мере одна молекула для редактирования генов содержит первую направляющую РНК и вторую направляющую РНК.
21. зкДНК-вектор по любому из пп. 7-20, в котором указанная нРНК нацелена на акцепторный сайт сплайсинга или донорный сайт сплайсинга.
22. зкДНК-вектор по п. 21, в котором нацеливание на акцепторный сайт сплайсинга или донорный сайт сплайсинга вызывает негомологичное присоединение конца (NHEJ) и коррекцию дефектного гена.
23. зкДНК-вектор по любому из пп. 7-22, в котором вектор кодирует множество копий одной последовательности направляющей РНК.
24. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-23, в котором первая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит первую регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует нуклеазу.
25. зкДНК-вектор по п. 24, в котором первая регуляторная последовательность содержит промотор.
26. зкДНК-вектор по п. 25, в котором промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
27. зкДНК-вектор по любому из пп. 24-26, в котором первая регуляторная последовательность содержит модулятор.
28. зкДНК-вектор по п. 27, в котором модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
29. зкДНК-вектор по любому из пп. 24-28, в котором первая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит интронную последовательность перед нуклеотидной последовательностью, которая кодирует нуклеазу, при этом интронная последовательность содержит сайт расщепления нуклеазой.
30. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-29, в котором вторая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит вторую регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует направляющую РНК.
31. зкДНК-вектор по п. 30, в котором вторая регуляторная последовательность содержит промотор.
32. зкДНК-вектор по п. 31, в котором промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
33. зкДНК-вектор по любому из пп. 30-32, в котором вторая регуляторная последовательность содержит модулятор.
34. зкДНК-вектор по п. 33, в котором модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
35. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-34, в котором третья гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит третью регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует РНК-активатор.
36. зкДНК-вектор по п. 35, в котором третья регуляторная последовательность содержит промотор.
37. зкДНК-вектор по п. 36, в котором промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
38. зкДНК-вектор по любому из пп. 35-37, в котором третья регуляторная последовательность содержит модулятор.
39. зкДНК-вектор по п. 38, в котором модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
40. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-39, в котором зкДНК-вектор содержит 5'-гомологичное плечо и 3'-гомологичное плечо по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
41. зкДНК-вектор по п. 40, в котором каждое из 5'-гомологичного плеча и 3'-гомологичного плеча имеет размер в диапазоне приблизительно от 250 до 2000 п.о.
42. зкДНК-вектор по п. 40 или п. 41, в котором 5'-гомологичное плечо и/или 3'-гомологичное плечо проксимальны к ITR.
43. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-42, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность расположена между 5'-гомологичным плечом и 3'-гомологичным плечом.
44. зкДНК-вектор по п. 43, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, которая расположена между 5'-гомологичным плечом и 3'-гомологичным плечом, содержит ген-мишень.
45. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-44, в котором (зкДНК-вектор) по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, которая кодирует молекулу для редактирования гена, не расположена между 5'-гомологичным плечом и 3'-гомологичным плечом.
46. зкДНК-вектор по п. 45, в котором ни одна из гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих молекулы для редактирования генов, не расположена между 5'-гомологичным плечом и 3'-гомологичным плечом.
47. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-46, содержащий первый сайт рестрикции эндонуклеазой перед 5'-гомологичным плечом и/или второй сайт рестрикции эндонуклеазой после 3'-гомологичного плеча.
48. зкДНК-вектор по п. 47, в котором первый сайт рестрикции эндонуклеазой и второй сайт рестрикции эндонуклеазой представляют собой одинаковые сайты рестрикции эндонуклеазы.
49. зкДНК-вектор по п. 47 или п. 48, в котором по меньшей мере один сайт рестрикции эндонуклеазой расщепляется эндонуклеазой, которая также кодируется в зкДНК-векторе.
50. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-49, который дополнительно содержит один или несколько сайтов поли-А.
51. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-50, содержащий по меньшей мере один из регуляторного элемента трансгена и сайт поли(А) после 3'-гомологичного плеча и близко к нему и/или перед 5'-гомологичным плечом и близко к нему.
52. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-51, содержащий 2A и сайт маркера селекции перед 3'-гомологичным плечом и близко к нему.
53. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-52, в котором 5'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной перед сайтом расщепления нуклеазой в хромосоме.
54. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-53, в котором 3'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной после сайта расщепления нуклеазой в хромосоме.
55. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-54, содержащий гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую энхансер гомологичной рекомбинации.
56. зкДНК-вектор по п. 55, в котором энхансер гомологичной рекомбинации выбирают из вышерасположенной последовательности позднего энхансера полиА-сигнала SV40, раннего энхансерного элемента цитомегаловируса, энхансера RSV и энхансера CMV.
57. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-56, в котором по меньшей мере один ITR содержит 58. функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт.
58. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-57, в котором фланкирующие ITR являются симметричными или асимметричными.
59. зкДНК-вектор по п. 58, в котором фланкирующие ITR являются асимметричными, причем по меньшей мере один из ITR изменен по сравнению с последовательностью AAV ITR дикого типа путем делеции, добавления или замены, которые влияют на общую трехмерную конформацию ITR.
60. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-59, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность представляет собой кДНК.
61. зкДНК-вектор по пп. 1-60, в котором один или несколько фланкирующих ITR получены из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
62. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-61, в котором один или несколько ITR являются синтетическими.
63. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-62, в котором один или несколько ITR не являются ITR дикого типа.
64. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-63, в котором один или оба ITR модифицированы путем делеции, вставки и/или замены по меньшей мере в одной из областей ITR, выбранных из A, A', B, B', C, C', D и D'.
65. зкДНК-вектор по п. 64, в котором делеция, вставка и/или замена приводит к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями A, A', B, B', C или C'.
66. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-58 или 56-65, в котором ITR являются симметричными.
67. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-58, 60, 61 и 66, в котором ITR относятся к дикому типу.
68. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-66, в котором оба ITR изменяют таким образом, чтобы это приводило к общей трехмерной симметрии, когда ITR инвертированы друг относительно друга.
69. зкДНК-вектор по п. 68, в котором изменение представляет собой делецию, вставку и/или замену в областях ITR, выбранных из A, A', B, B', C, C', D и D'.
70. Способ редактирования генома, включающий:
контактирование клетки с системой редактирования генов, при котором один или несколько компонентов системы редактирования генов доставляют в клетку путем контактирования клетки с невирусным бескапсидным ДНК-вектором с замкнутыми концами (зкДНК), содержащим по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена.
71. Способ по п. 70, в котором по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена, выбирают из нуклеазы, направляющей РНК (нРНК), направляющей ДНК (нДНК) и РНК-активатора.
72. Способ по п. 71, в котором по меньшей мере одна молекула для редактирования генов представляет собой нуклеазу.
73. Способ по п. 72, в котором нуклеаза представляет собой последовательность-специфическую нуклеазу.
74. Способ по п. 73, в котором специфичную к последовательности нуклеазу выбирают из нуклеазы, направляемой нуклеиновой кислотой, нуклеазы цинкового пальца (ZFN), мегануклеазы, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), или megaTAL.
75. Способ по п. 73, в котором специфичная к последовательности нуклеаза представляет собой направляемую нуклеиновой кислотой нуклеазу, выбранную из редактора одиночных оснований, РНК-направляемой нуклеазы и ДНК-направляемой нуклеазы.
76. Способ по п. 70 или 75, в котором по меньшей мере одна молекула для редактирования генов представляет собой нРНК или нДНК.
77. Способ по п. 70, 75 или 76, в котором по меньшей мере одна молекула для редактирования генов представляет собой РНК-активатор.
78. Способ по любому из пп. 74-77, в котором направляемая нуклеиновой кислотой нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR.
79. Способ по п. 78, в котором нуклеаза CRISPR представляет собой нуклеазу Cas.
80. Способ по п. 79, в котором нуклеазу Cas выбирают из Cas9, никующей Cas9 (nCas9) и деактивированной Cas (dCas).
81. Способ по п. 80, в котором nCas9 содержит мутацию в домене HNH или RuVc Cas.
82. Способ по п. 80, в котором нуклеаза Cas представляет собой деактивированную Cas-нуклеазу (dCas), образующую комплекс с нРНК, нацеленой на промоторную область гена-мишени.
83. Способ по п. 82, дополнительно включающий эффекторный домен KRAB.
84. Способ по п. 82 или 83, в котором dCas слит с гетерологичным доменом активации транскрипции, который может быть направлен в область промотора.
85. Способ по п. 84, в котором слияние dCas направлено в область промотора гена-мишени посредством направляющей РНК, которая рекрутирует дополнительные домены трансактивации для усиления экспрессии гена-мишени.
86. Способ по любому из пп. 82-85, в котором dCas представляет собой dCas9 S. pyogenes.
87. Способ по любому из пп. 78-86, в котором последовательность направляющей РНК нацелена на промотор гена-мишени, а CRISPR заглушает ген-мишень (система CRISPRi).
88. Способ по любому из пп. 78-86, в котором последовательность направляющей РНК нацелена на сайт начала транскрипции гена-мишени и активирует ген-мишень (система CRISPRa).
89. Способ по любому из пп. 76-88, в котором по меньшей мере одна молекула для редактирования генов содержит первую направляющую РНК и вторую направляющую РНК.
90. Способ по любому из пп. 76-89, в котором рРНК нацелена на акцепторный сайт сплайсинга или донорный сайт сплайсинга.
91. Способ по п. 22, в котором нацеливание на акцепторный сайт сплайсинга или донорный сайт сплайсинга вызывает негомологичное присоединение конца (NHEJ) и коррекцию дефектного гена.
92. Способ по пп. 76-91, в котором вектор кодирует множество копий одной последовательности направляющей РНК.
93. Способ по любому из пп. 70-92, в котором первая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит первую регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует нуклеазу.
94. Способ по п. 93, в котором первая регуляторная последовательность содержит промотор.
95. Способ по п. 94, в котором промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
96. Способ по любому из пп. 93-95, в котором первая регуляторная последовательность содержит модулятор.
97. Способ по п. 96, в котором модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
98. Способ по любому из пп. 93-97, в котором первая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит интронную последовательность перед нуклеотидной последовательностью, которая кодирует нуклеазу, причем интронная последовательность содержит сайт расщепления нуклеазой.
99. Способ по любому из пп. 70-98, в котором вторая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит вторую регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует направляющую РНК.
100. Способ по п. 99, в котором вторая регуляторная последовательность содержит промотор.
101. Способ по п. 100, в котором промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
102. Способ по любому из пп. 99-101, в котором вторая регуляторная последовательность содержит модулятор.
103. Способ по п. 102, в котором модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
104. Способ по любому из пп. 70-103, в котором третья гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит третью регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует РНК-активатор.
105. Способ по п. 104, в котором третья регуляторная последовательность содержит промотор.
106. Способ по п. 105, в котором промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
107. Способ по пп. 104-106, в котором третья регуляторная последовательность содержит модулятор.
108. Способ по п. 107, в котором модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
109. Способ по любому из пп. 70-108, в котором зкДНК-вектор содержит 5'-гомологичное плечо и 3'-гомологичное плечо по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
110. Способ по п. 109, в котором каждое из 5'-гомологичного плеча и 3'-гомологичного плеча имеет размер примерно от 250 до 2000 п.о.
111. Способ по п. 109 или 110, в котором 5'-гомологичное плечо и/или 3'-гомологичное плечо проксимальны к ITR.
112. Способ по любому из пп. 109-111, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность расположена между 5'-гомологичным плечом и 3'-гомологичным плечом.
113. Способ по п. 112, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, расположенная между 5'-гомологичным плечом и 3'-гомологичным плечом, содержит ген-мишень.
114. Способ по пп. 109-113, в котором (зкДНК-вектор) по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, которая кодирует молекулу для редактирования генов, не расположена между 5'-гомологичным плечом и 3'-гомологичным плечом.
115. Способ по п. 114, в котором ни одна из гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих молекулы редактирования генов, не расположена между 5'-гомологичным плечом и 3'-гомологичным плечом.
116. Способ по пп. 109-115, включающий первый сайт рестрикции эндонуклеазой перед 5'-гомологичным плечом и/или второй сайт рестрикции эндонуклеазой после 3'-гомологичного плеча.
117. Способ по п. 116, в котором первый сайт рестрикции эндонуклеазой и второй сайт рестрикции эндонуклеазой представляют собой одинаковые сайты рестрикции эндонуклеазой.
118. Способ по п. 116 или 117, в котором по меньшей мере один сайт рестрикции эндонуклеазой расщепляется эндонуклеазой, которая также кодируется в зкДНК-векторе.
119. Способ по любому из пп. 109-118, который дополнительно включает один или несколько сайтов поли-А.
120. Способ по любому из пп. 109-119, включающий по меньшей мере один из регуляторного элемента трансгена и сайт поли-A после 3'-гомологичного плеча и близко к нему и/или перед 5'-гомологичным плечом и близко к нему.
121. Способ по любому из пп. 109-120, включающий 2А и сайт селекции маркера перед 3'-гомологичным плечом и близко к нему.
122. Способ по любому из пп. 109-121, в котором 5'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной перед сайтом расщепления нуклеазой в хромосоме.
123. Способ по любому из пп. 109-122, в котором 3'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной после сайта расщепления нуклеазой в хромосоме.
124. Способ по любому из пп. 109-123, включающий гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую энхансер гомологичной рекомбинации.
125. Способ по п. 124, в котором энхансер гомологичной рекомбинации выбирают из вышерасположенной последовательности позднего энхансера полиА-сигнала SV40, раннего энхансерного элемента цитомегаловируса, энхансера RSV и энхансера CMV.
126. Способ по любому из пп. 70-125, в котором по меньшей мере один ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт.
127. Способ по любому из пп. 70-126, в котором фланкирующие ITR являются симметричными или асимметричными.
128. Способ по п. 127, в котором фланкирующие ITR являются асимметричными, при этом по меньшей мере один из ITR изменен по сравнению с последовательностью AAV ITR дикого типа посредством делеции, добавления или замены, которые влияют на общую трехмерную конформацию ITR.
129. Способ по любому из пп. 70-128, в котором по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность представляет собой кДНК.
130. Способ по любому из пп. 70-129, в котором один или несколько фланкирующих ITR получены из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
131. Способ по любому из пп. 70-130, в котором один или несколько ITR являются синтетическими.
132. Способ по любому из пп. 70-131, в котором один или несколько ITR не являются ITR дикого типа.
133. Способ по любому из пп. 70-132, в котором один или оба ITR модифицируют путем делеции, вставки и/или замены по меньшей мере в одной из областей ITR, выбранных из A, A', B, B', С, С', D и D'.
134. Способ по п. 133, в котором делеция, вставка и/или замена приводит к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями A, A', B, B', C или C'.
135. Способ по любому из пп. 70-127 или 129-134, в котором ITR являются симметричными.
136. Способ по любому из пп. 70-127 или 129-130, в котором ITR относятся к дикому типу.
137. Способ по любому из пп. 70-136, в котором оба ITR изменяют таким образом, чтобы это приводило к общей трехмерной симметрии, когда ITR инвертированы друг относительно друга.
138. Способ по п. 137, в котором изменение представляет собой делецию, вставку и/или замену в областях ITR, выбранных из A, A', B, B', C, C', D и D'.
139. Способ по любому из пп. 70-138, в котором контактирующая клетка представляет собой эукариотическую клетку.
140. Способ по любому из пп. 84-139, в котором нуклеаза CRISPR является оптимизированной по кодонам для экспрессии в эукариотической клетке.
141. Способ по любому из пп. 84-140, в котором белок Cas является оптимизированным по кодонам для экспрессии в эукариотической клетке.
142. Способ редактирования генома, включающий введение в клетку эффективного количества невирусной бескапсидной ДНК с замкнутыми концами (зкДНК-вектор) по любому из пп. 1-69 в подходящих условиях и в течение времени, достаточного для редактирования гена-мишени.
143. Способ по любому из пп. 113-142, в котором ген-мишень представляет собой ген, нацеливание на который осуществляется с использованием одной или нескольких последовательностей направляющих РНК, и редактирование проводится путем гомологично направляемой репарации (HDR) в присутствии донорной матрицы HDR.
144. Способ по любому из пп. 142-143, в котором нацеливание на ген-мишень осущестляется с использованием одной последовательности направляющей РНК, а ген-мишень редактируется путем негомологичного присоединения концов (NHEJ).
145. Способ по любому из пп. 70-144, в котором способ выполняют in vivo для коррекции однонуклеотидного полиморфизма (SNP), связанного с заболеванием.
146. Способ по п. 145, в котором заболевание включает серповидноклеточную анемию, наследственный гемохроматоз или рак, наследственную слепоту.
147. Способ по любому из пп. 70-146, в котором по меньшей мере 2 различных белка Cas присутствуют в зкДНК-векторе, и при этом один из белков Cas является каталитически неактивным (Cas-i), причем направляющая РНК, связанная с Cas-I, нацелена на промотор клетки-мишени, и ДНК, кодирующая Cas-I, находится под контролем индуцибельного промотора, так что он может отключить экспрессию гена-мишени в желаемое время.
148. Способ редактирования одной пары нуклеотидных оснований в гене-мишени клетки, включающий контактирование клетки с системой редактирования генов CRISPR/Cas, при этом один или несколько компонентов системы редактирования генов CRISPR/Cas доставляются в клетку путем контактирования клетки с невирусной бескапсидной композицией ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), и
при этом белок Cas, экспрессируемый из зкДНК-вектора, каталитически неактивен и слит с основным фрагментом редактирования основания,
при этом способ осуществляют в условиях и в течение времени, достаточного для модуляции экспрессии гена-мишени.
149. Способ по п. 148, в котором зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69.
150. Способ по п. 148, в котором фрагмент для редактирования основания включает специфичную к одноцепочечным участкам цитидиндеаминазу, ингибитор урацилгликозилазы или тРНК-аденозиндеаминазу.
151. Способ по п. 148, в котором каталитически неактивный белок Cas представляет собой dCas9.
152. Способ по любому из пп. 70-151, в котором клетка представляет собой Т-клетку или CD34+.
153. Способ по любому из пп. 70-152, в котором ген-мишень кодирует белок программируемой смерти (PD1), антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами (CTLA4) или фактор некроза опухоли-α (ФНО-α).
154. Способ по любому из пп. 70-153, дополнительно включающий введение продуцируемых клеток нуждающемуся в этом субъекту.
155. Способ по п. 154, в котором субъект, нуждающийся в этом, имеет генетическое заболевание, вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, рак или аутоиммунное заболевание.
156. Способ модулирования экспрессии двух или более генов-мишеней в клетке, включающий: введение в клетку:
первой композиции, содержащей вектор, который содержит: фланкирующие последовательности концевых повторов (TR) и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую, по меньшей мере, две направляющих РНК, комплементарные двум или более генам-мишеням, при этом вектор представляет собой невирусный бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК),
второй композиции, содержащей вектор, который содержит: фланкирующие последовательности концевых повторов (TR) и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере две каталитически неактивные ДНК-эндонуклеазы, каждая из которых связывается с направляющей РНК и связывается с двумя или более генами-мишенями, при этом вектор представляет собой невирусный бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК), и
третьей композицией, содержащей вектор, который содержит: фланкирующие последовательности концевых повторов (TR) и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере два белка или домена регулятора транскрипции, при это вектор представляет собой невирусный бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК), и
при этом по меньшей мере две направляющих РНК, по меньшей мере две каталитически неактивные РНК-направляемые эндонуклеазы и по меньшей мере два белка или домена регулятора транскрипции экспрессируются в клетке,
при этом два или более комплексов ко-локализации образуются между направляющей РНК, каталитически неактивной РНК-направляемой эндонуклеазой, белком или доменом регулятора транскрипции и геном-мишенью, и
при этом белок или домен регулятора транскрипции регулирует экспрессию по меньшей мере двух генов-мишеней.
157. Способ по п. 156, в котором зкДНК-вектор первой композиции представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69, зкДНК-вектор второй композиции представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69, и третья композиция представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69.
158. Способ вставки последовательности нуклеиновой кислоты ген безопасной гавани геномав ген безопасной гавани генома, включающий: контактирование клетки с (i) системой редактирования генов и (ii) матрицей гомологично направляемой репарации, имеющей гомологию с геном безопасной гавани генома, и содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, представляющий интерес,
при этом один или несколько компонентов системы редактирования генов доставляют в клетку путем контактирования клетки с композицией невирусного бескапсидного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), при этом композиция нуклеиновой кислоты зкДНК-вектора содержит по меньшей мере одну последовательность гетерологичного нуклеотида между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена, и
при этом способ осуществляют в условиях и в течение времени, достаточных для вставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес белок, ген безопасной гавани геномав ген безопасной гавани генома.
159. Способ по п. 158, в котором зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69.
160. Способ по п. 158, в котором ген безопасной гавани генома содержит активный интрон, близкий к по меньшей мере одной кодирующей последовательности, о которой известно, что она экспрессирует белки с высоким уровнем экспрессии.
161. Способ по п. 158, в котором ген безопасной гавани генома содержит сайт в или вблизи от любого из: гена альбумина, гена CCR5, локуса AAVS1.
162. Способ по любому из пп. 158-161, в котором представляющий интерес белок является рецептором, токсином, гормоном, ферментом или белком клеточной поверхности.
163. Способ по любому из пп. 162, в котором представляющий интерес белок является секретируемым белком.
164. Способ по п. 163, в котором представляющий интерес белок содержит фактор VIII (FVIII) или фактор IX (FIX).
165. Способ по п. 164, в котором способ выполняют in vivo для лечения гемофилии A или гемофилии B.
166. Способ вставки донорной последовательности в предварительно определенный сайт вставки на хромосоме в клетке-хозяине, включающий: введение в клетку-хозяина зкДНК-вектора по пп. 1-69, в котором донорную последовательность вставляют в хромосому в сайте вставки или рядом с ним путем гомологичной рекомбинации.
167. Способ генерирования генетически модифицированного животного, содержащего донорную последовательность, вставленную в предварительно определенный сайт вставки на хромосоме животного, включающий: a) создание клетки с донорной последовательностью, вставленной в предварительно определенный сайт вставки на хромосоме, согласно п. 167; и b) введение клетки, полученной в соответствии с (а), животному-носителю для получения генетически модифицированного животного.
168. Способ по п. 167, в котором клетка представляет собой зиготу или плюрипотентную стволовую клетку.
169. Генетически модифицированное животное, полученное способом по п. 168.
170. Генетически модифицированное животное по п. 169, при этом животное представляет собой животное, не являющееся человеком.
171. Набор для вставки донорной последовательности в сайт вставки на хромосоме в клетке, включающий: а) первый невирусный бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК), содержащий:
два инвертированных терминальных повтора (ITR) AAV; и
первую нуклеотидную последовательность, содержащую 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо, при этом донорная последовательность обладает функциональностью редактирования генов; и
(a) второй зкДНК-вектор, содержащий:
хотя бы один ITR AAV; и
нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена,
при этом в первом зкДНК-векторе 5'-гомологичное плечо гомологично последовательности перед сайтом расщепления молекулы редактирования гена на хромосоме, и 3'-гомологичное плечо гомологично последовательности после сайта расщепления молекулы редактирования гена на хромосоме; и 5'-гомологичное плечо или 3'-гомологичное плечо проксимальны к ITR.
172. Способ по п. 171, в котором молекула для редактирования генов представляет собой нуклеазу.
173. Способ по п. 172, в котором нуклеаза представляет собой последовательность-специфическую нуклеазу.
174. Способ по любому из пп. 171-173, в котором первый зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1, 40-56, 57-69.
175. Способ по любому из пп. 171-173, в котором второй зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-39 или пп. 57-69.
176. Способ вставки донорной последовательности в предварительно определенный сайт вставки в хромосому в клетке-хозяине, включающий:
введение в клетку-хозяина первого невирусного бескапсидного вектора с ДНК с замкнутыми концами (зкДНК), имеющего по меньшей мере один инвертированный концевой повтор (ITR), причем зкДНК-вектор содержит первую линейную нуклеиновую кислоту, содержащую 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо; и
введение в клетку-хозяина второго зкДНК-вектора, содержащего по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена, которая расщепляет хромосому в или рядом с сайтом вставки, при этом донорная последовательность встраивается в хромосому в или рядом с сайтом вставки посредством гомологичной рекомбинации.
177. Способ по п. 176, в котором молекула для редактирования генов представляет собой нуклеазу.
178. Способ по п. 177, в котором нуклеаза представляет собой последовательность-специфическую нуклеазу.
179. Способ по любому из пп. 176-178, в котором первый зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1, 40-56, 57-69.
180. Способ по любому из пп. 176-179, в котором второй зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-39 или пп. 57-69.
181. Способ по любому из пп. 179-180, в котором второй зкДНК-вектор дополнительно содержит третью нуклеотидную последовательность, кодирующую направляющую последовательность, распознающую сайт вставки.
182. Клетка, содержащая зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69.
183. Композиция, содержащая вектор по любому из пп. 1-69 и липид.
184. Композиция по п. 184, в которой липид представляет собой липидную наночастицу (LNP).
185. Набор, содержащий композицию по п. 183 или 184 или клетку по п. 182.
[0091] В некоторых вариантах реализации один из аспектов технологии, описанной в данном документе, относится к невирусному бескапсидному ДНК-вектору с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-вектор), при этом зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между последовательностями асимметричных инвертированных концевых повторов (асимметричные ITR), причем по меньшей мере один из асимметричных ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт, и, необязательно, гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансген, и при этом вектор не заключен в вирусный капсид.
[0092] Эти и другие аспекты изобретения описаны более подробно ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0093] Варианты реализации данного изобретения, вкратце изложенные выше и описанные более подробно ниже, будут понятными со ссылкой на иллюстративные варианты реализации данного изобретения, представленные на прилагаемых чертежах. Однако прилагаемые чертежи иллюстрируют только типичные варианты реализации данного изобретения и поэтому не должны рассматриваться как ограничивающие объем, поскольку раскрытие может допускать другие в равной степени эффективные варианты реализации.
[0094] Фиг. 1А демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора, содержащего асимметричные ITR, для редактирования генов. В этом варианте реализации типичный пример зкДНК-вектора содержит экспрессионную кассету, содержащую промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген люциферазы, вставляется в сайт клонирования (R3/R4) между промотором CAG и WPRE. Кассета экспрессии окружена двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) - ITR AAV2 дикого типа перед (на 5'-конце) и модифицированный ITR после (на 3'-конце) кассеты экспрессии, поэтому два ITR, фланкирующие экспрессионную кассету, являются асимметричными друг относительно друга.
[0095] Фиг. 1B демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора, содержащего асимметричные ITR для редактирования генов с помощью кассеты экспрессии, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген люциферазы, вставляется в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Кассета экспрессии фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) - модифицированным ITR перед (на 5'-конце) и ITR дикого типа после (на 3'-конце) кассеты экспрессии.
[0096] Фиг. 1C демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора для редактирования генов, содержащего асимметричные ITR, с экспрессионной кассетой, содержащей энхансер/промотор, открытую рамку считывания (ORF) для вставки трансгена, который представляет собой молекулу для редактирования генов, или последовательности нуклеиновой кислоты для редактирования генов, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал polyA. Открытая рамка считывания (ORF) позволяет вставлять трансген, который представляет собой молекулу для редактирования гена, последовательность нуклеиновой кислоты, редактирующей ген, в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Кассета экспрессии фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами (ITR) асимметричными друг относительно друга; модифицированным ITR перед (на 5'-конце) и модифицированным ITR после (на 3'-конце) кассеты экспрессии, причем 5'-ITR и 3'-ITR оба являются модифицированными ITR, но имеют разные модификации (т.е. они имеют неодинаковые модификации).
[0097] Фиг. 1D демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора для редактирования генов, содержащего симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, как определено в данном документе, с кассетой экспрессии, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген люциферазы, вставляется в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Кассета экспрессии фланкирована двумя модифицированными инвертированными концевыми повторами (ITR), причем 5'-модифицированный ITR и 3'-модифицированный ITR симметричны или по существу симметричны.
[0099] Фиг. 1Е демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора для редактирования генов, содержащего симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, как определено в данном документе, с кассетой экспрессии, содержащей энхансер/промотор, открытую рамку считывания (ORF) для вставки трансгена, который представляет собой молекулу для редактирования гена или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования гена, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал polyA. Открытая рамка считывания (ORF) позволяет вставлять трансген, который представляет собой молекулу для редактирования гена, последовательность нуклеиновой кислоты, редактирующей ген, в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Кассета экспрессии фланкирована двумя модифицированными инвертированными концевыми повторами (ITR), причем 5'-модифицированный ITR и 3'-модифицированный ITR симметричны или по существу симметричны.
[0099] Фиг. 1F демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора для редактирования генов, содержащего симметричные WT-ITR или по существу симметричные WT-ITR, как определено в данном документе, с кассетой экспрессии, содержащей промотор CAG, WPRE и BGHpA. Открытая рамка считывания (ORF), кодирующая трансген люциферазы, вставляется в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Кассета экспрессии фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами дикого типа (WT-ITR), причем 5'-WT-ITR и 3'-WT-ITR симметричны или по существу симметричны.
[00100] Фиг. 1G демонстрирует иллюстративную структуру зкДНК-вектора для редактирования генов, содержащего симметричные модифицированные ITR или по существу симметричные модифицированные ITR, как определено в данном документе, с кассетой экспрессии, содержащей энхансер/промотор, открытую рамку считывания (ORF) для вставки трансгена, который представляет собой молекулу для редактирования гена или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования гена, посттранскрипционный элемент (WPRE) и сигнал polyA. Открытая рамка считывания (ORF) позволяет вставлять трансген, который представляет собой молекулу для редактирования гена, последовательность нуклеиновой кислоты, редактирующей ген, в сайт клонирования между промотором CAG и WPRE. Кассета экспрессии фланкирована двумя инвертированными концевыми повторами дикого типа (WT-ITR), причем 5'-WT-ITR и 3'-WT-ITR симметричны или по существу симметричны.
[00101] На Фиг. 2А представлена Т-образная структура стебель-петля левого ITR дикого типа AAV2 (SEQ ID NO: 538) с обозначенными A-A'-плечом, B-B'-плечом, C-C'-плечом, двумя сайтами связывания Rep (RBE и RBE'), а также с указанным сайтом концевого разрешения (trs). RBE содержит серию из 4 дуплексных тетрамеров, которые, как полагают, взаимодействуют либо с Rep 78, либо с Rep 68. Кроме того, считается, что RBE' также взаимодействует с комплексом Rep, собранным на ITR дикого типа, или мутировавшим ITR в конструкте. Области D и D' содержат сайты связывания транскрипционных факторов и другие консервативные структуры. Фиг. 2B демонстрирует предполагаемую катализируемую Rep никующую и лигирующую активности левого ITR дикого типа (SEQ ID NO: 539), включая Т-образную структуру стебель-петля левого ITR дикого типа AAV2 с обозначенными A-A'-плечом, B-B'-плечом, C-C'-плечом, двумя сайтами связывания Rep (RBE и RBE'), а также с указанным сайтом концевого разрешения (trs), и область D и D', содержащую несколько сайтов связывания транскрипционных факторов и другую консервативную структуру.
[00102] На Фиг. 3А представлена первичная структура (полинуклеотидная последовательность) (слева) и вторичная структура (справа) RBE-содержащих частей A-A'-плеча, и C-C'- и B-B'-плечо ITR AAV2 дикого типа (SEQ ID NO: 540). Фиг. 3B демонстрирует типичный пример последовательности мутированного ITR (также называемого модифицированным ITR) для левого ITR. Представлена первичная структура (слева) и предсказанная вторичная структура (справа) RBE-участка A-A'-плеча, C-плечо и B-B'-плечо типичного примера мутированного левого ITR (ITR-1, левый) (SEQ ID NO: 113) Фиг. 3C демонстрирует первичную структуру (слева) и вторичную структуру (справа) RBE-содержащей части петли A-A' и B-B'- и C-C'-плеч правого ITR AAV2 дикого типа (SEQ ID NO: 541). Фиг. 3D демонстрирует типичный пример правого модифицированного ITR. Представлена первичная структура (слева) и прогнозируемая вторичная структура (справа) RBE-содержащей части A-A'-плеча, B-B'- и C-плечо типичного примера мутанта правого ITR (ITR-1, правый) (SEQ ID NO: 114). Любая комбинация левого и правого ITR (например, ITR AAV2 или другого вирусного серотипа или синтетических ITR) может быть использована, как описано в данном документе. Каждая из полинуклеотидных последовательностей Фиг. 3А-3D относятся к последовательности, используемой в геноме плазмиды или бакмиды/бакуловируса, использованном для получения зкДНК, как описано в данном документе. Также в каждую из Фиг. 3A-3D включены соответствующие вторичные структуры зкДНК, полученные из конфигураций зкДНК-вектора в геноме плазмиды или бакмиды/бакуловируса и предсказанных значений свободной энергии Гиббса.
[00103] На Фиг. 4A приведено схематическое изображение апстрим (предшествующего) -процесса получения инфицированных бакуловирусом клеток насекомых (BIIC), которые подходят для получения зкДНК способом, схематически представленным на Фиг. 4B. На Фиг. 4B схематически представлен пример способа получения зкДНК, а на Фиг. 4C продемонстрирован биохимический способ и процесс подтверждения получения зкДНК-вектора. На Фиг. 4D и Фиг. 4E приведены схематические изображения, описывающие процесс идентификации присутствия зкДНК в ДНК, собранной из клеточных осадков, полученных в ходе процессов получения зкДНК на Фиг. 4B. На Фиг. 4E показана ДНК с прерывистой структурой. зкДНК может быть разрезана рестрикционной эндонуклеазой, имеющей один сайт распознавания на зкДНК-векторе, с получением двух фрагментов ДНК разного размера (1 т.п.о. и 2 т.п.о.) как в нейтральных, так и в денатурирующих условиях. На Фиг. 4E также показана зкДНК, имеющая линейную и непрерывную структуру. Указанный зкДНК-вектор может быть разрезан рестрикционной эндонуклеазой с получением двух фрагментов ДНК, мигрирующих в виде отрезков с 1 т.п.о. и 2 т.п.о. в нейтральных условиях, однако в денатурирующих условиях цепи остаются соединенными и продуцируют одиночные цепи, мигрирующие в виде отрезков с 2 т.п.о. и 4 т.п.о. На Фиг. 4D схематически представлены ожидаемые полосы для примера зкДНК, нерасщепленной или расщепленной рестрикционной эндонуклеазой, а затем подвергнутой электрофорезу либо на нативном, либо на денатурирующем геле. На самом левом схематическом изображении продемонстрирован нативный гель с несколькими полосами, предполагающими, что в дуплексной и неразрезанной форме зкДНК существует по меньшей мере в мономерном и димерном состояниях, которые видны в виде более быстро мигрирующего мономера меньшего размера и медленнее мигрирующего димера, размер которого в 2 раза больше размера мономера. На втором слева схематическом изображении показано, что при разрезании зкДНК рестрикционной эндонуклеазой исходные полосы пропадают и появляются полосы более быстро мигрирующих фрагментов (например, меньшего размера), соответствующие ожидаемым размерам фрагментов, остающихся после расщепления. В денатурирующих условиях исходная дуплексная ДНК является одноцепочечной и мигрирует как соединение в два раза большего размера по сравнению с тем, что наблюдается на нативном геле, поскольку комплементарные цепи ковалентно связаны. Соответственно, на втором схематическом изображении справа расщепленная зкДНК демонстрирует аналогичное распределение полос по сравнению с тем, что наблюдается на нативном геле, однако полосы соответствуют миграции фрагментов, размер которых в два раза больше их эквивалентов в нативном геле. На самом правом схематическом изображении показано, что неразрезанная зкДНК в денатурирующих условиях мигрирует в виде одноцепочечного раскрытого кольца, и, соответственно, размер наблюдаемых полос в два раза больше размера наблюдаемых в нативных условиях при нераскрытом кольце. На указанном чертеже «т.п.о.» относится к относительному размеру нуклеотидных молекул, основанному, в зависимости от контекста, либо на длине нуклеотидной цепи (например, для одноцепочечных молекул, наблюдаемых в денатурирующих условиях), либо на числе пар оснований (например, для двуцепочечных молекул, наблюдаемых в нативных условиях).
[00104] На Фиг. 5 приведено иллюстративное изображение прогона через денатурирующий гель примеров зкДНК-векторов с (+) или без (-) расщепления эндонуклеазами (EcoRI для зкДНК-конструктов 1 и 2; BamH1 для зкДНК-конструктов 3 и 4; SpeI для зкДНК-конструктов 5 и 6; и XhoI для зкДНК-конструктов 7 и 8). Размеры для полос, выделенных звездочкой, определены и приведены в нижней части чертежа.
[00105] На Фиг. 6A приведен пример Rep-бакмиды в плазмиде pFBDLSR, содержащей последовательности нуклеиновых кислот для белков Rep Rep52 и Rep78. Указанный пример Rep-бакмиды содержит: фрагмент промотора IE1 (SEQ ID NO:66); нуклеотидную последовательность Rep78, в том числе последовательность Козак (SEQ ID NO:67), последовательность промотора полиэдрина для Rep52 (SEQ ID NO:68) и нуклеотидную последовательность Rep58, начиная с последовательности Козак gccgccacc) (SEQ ID NO: 69). На Фиг. 6B приведено схематическое изображение примера зкДНК-плазмиды-1, с wt-L (левым дикого типа) ITR, промотором CAG, трансгеном люциферазы, WPRE и последовательностью полиаденилирования; и mod-R (модифицированным правым) ITR.
[00106] На Фиг. 7А показаны предсказанные структуры RBE-содержащей части плеча A-A' и модифицированного плеча B-B' и/или модифицированного плеча C-C' примеров модифицированных правых ITR, приведенных в Таблице 4A. Фиг. 7B демонстрирует прогнозируемые структуры RBE-содержащей части плеча A-A' и модифицированного плеча C-C' и/или модифицированного плеча B-B' примеров модифицированных правых ITR, приведенных в Таблице 4B. Показанные структуры являются предсказанными структурами с наименьшей свободной энергией. Обозначение условными цветами: красный = вероятность >99%; оранжевый = вероятность 99% - 95%; бежевый = вероятность 95-90%; темно-зеленый 90% - 80%; ярко-зеленый = 80% - 70%; голубой = 70% - 60%; темно-синий 60% - 50%; и розовый = < 50%.
[00107] Фиг. 8 представляет собой схематическое изображение зкДНК-вектора в соответствии с данным изобретением.
[00108] Фиг. 9 представляет собой схематическое изображение зкДНК-вектора в соответствии с данным изобретением, которок отличается от Фиг. 20.
[00109] На Фиг. 10A-10F представлены схематические изображения зкДНК-векторов в соответствии с данным изобретением.
[00110] Фиг. 11 представляет собой схематическое изображение зкДНК-векторов в соответствии с данным изобретением. Enh = энхансер, Pro = промотор, интрон = синтетический или встречающийся в природе интрон с последовательностью донора и акцептора сплайсинга, NLS = сигнал ядерной локализации, нуклеаза = ORF для Cas9, ZFN, Talen или других последовательностей эндонуклеаз. Закрашенные стрелки представляют последовательность онРНК (последовательности-мишени одиночной направляющей РНК (например, 4) выбираются с использованием свободно доступного программного обеспечения/алгоритма, выбранного и подтвержденного экспериментально), незакрашенные стрелки представляют альтернативные последовательности онРНК.
[00111] Фиг. 12 представляет собой схематическое изображение зкДНК-векторов в соответствии с данным изобретением.
[00112] Фиг. 13 представляет собой схематическое изображение зкДНК-векторов в соответствии с данным изобретением.
[00113] Фиг. 14 представляет собой схематическое изображение кассет экспрессии для экспрессии онРНК.
[00114] Фиг. 15 представляет собой схематическое изображение зкДНК-вектора в соответствии с данным изобретением, который отличается от Фиг. 20 и 21.
[00115] Фиг. 16 представляет собой схематическое изображение зкДНК-вектора в соответствии с данным изобретением. Три зкДНК-вектора содержат 5'- и 3'-гомологичные плечи и беспромоторные трансгены, подходящие для встраивания в альбумин. Также изображена зкДНК с 5'- и 3'-гомологичными плечами, которая содержит направляемый промотором трансген, например, репортерный ген, который может быть вставлен в любой сайт безопасной гавани. Целевая область, вставка в которую не вызывает значительных отрицательных эффектов. Геномный сайт безопасной гавани в данном геноме (например, геноме человека) может быть определен с использованием методов, известных в данной области техники и описанных, например, в Papapetrou, ER & Schambach, A. Molecular Therapy 24(4):678-684 (2016) или Sadelain et al. Nature Reviews Cancer 12:51-58 (2012), содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки в их полном объеме.
[00116] Фиг. 17 является схематическим изображением и последовательностью целевого центра для локуса мышиного альбумина и донорной матрицы, кодирующей FIX. Фиг. 17 раскрывает SEQ ID NO: 835.
[00117] Фиг. 18А и Фиг. 18B - схематическое представление и последовательность целевого центра для плеч гомологичных локусов мышиных альбуминов и пример расположения направляющей РНК (Фиг. 18A) и направляющей RNAS (Фиг. 18B). На Фиг. 18А и 18В приведена SEQ ID NO: 835-841, соответственно, по порядку номеров.
[00118] Фиг. 19, представленный в данном документе, представляет собой схематическое изображение, показывающее примерные последовательности операций для экспериментальных протоколов редактирования генов, пригодных для способов и композиций, описанных в данном документе, включая (i) доставку в клетку экспрессионного вектора, (ii) конструирование нРНК, (iii) способы и оптимизация культивирования клеток, (iv) сборка RNP Cas9, (v) зкДНК-векторы, содержащие матрицы гомологично направляемой репарации, и (vi) детектирование успешного редактирования генов.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
I. Определения
[00119] Если в данном документе не указано иное, научные и технические термины, используемые применительно к настоящему изобретению, имеют значения, обычно подразумеваемые специалистами в области техники, к которой относится данное изобретение. Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретной методикой, протоколами и реагентами, и т.п., описанными в данном документе, и поэтому такие методики, протоколы и реагенты могут варьировать. Используемая в данном документе терминология служит только для описания конкретных вариантов реализации, и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который определен исключительно формулой изобретения. Определения распространенных терминов иммунологии и молекулярной биологии можно найти в следующих источниках: руководство The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 19е изд., издано Merck Sharp & Dohme Corp., 2011 (ISBN 978-0-911910-19-3); Robert S. Porter et al. (ред.), Fields Virology, 6е изд., издание Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, USA (2013), Knipe, D.M. and Howley, P.M. (ред.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, издание Blackwell Science Ltd., 1999-2012 (ISBN 9783527600908); и Robert A. Meyers (ред.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, издание VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, издание Elsevier, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (ред.), Taylor & Francis Limited, 2014 (ISBN 0815345305, 9780815345305); Lewin's Genes XI, издание Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4е изд.., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ред.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ред.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ред.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; и Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (ред.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737), содержание которых в полном объеме включено посредством ссылок в данный документ.
[00120] Используемые в данном документе термины «гетерологичная нуклеотидная последовательность» и «трансген» используются взаимозаменяемо и относятся к представляющей интерес нуклеиновой кислоте (отличной от нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид капсида), которая включена и может быть доставлена и экспрессирована с помощью зкДНК-вектор, как описано в данном документе.
[00121] В данном документе термины «экспрессионная кассета» и «транскрипционная кассета» используются взаимозаменяемо и относятся к линейному отрезку нуклеиновых кислот, который включает трансген, который функционально связан с одним или более промоторами или другими регуляторными последовательностями, достаточными для направления транскрипции указанного трансгена, однако не включает кодирующие капсид последовательности, другие последовательности вектора или области инвертированных концевых повторов. Экспрессионная кассета может, кроме того, содержать один или более цис-действующих последовательностей (например, промоторов, энхансеров или репрессоров), один или более интронов, и один или более посттранскрипционных регуляторных элементов.
[00122] Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксирибонуклеотидов. Таким образом, этот термин включает одно-, двух- или многоцепочечные ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, ДНК-РНК-гибриды или полимер, включающий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. «Олигонуклеотид» обычно относится к полинуклеотидам, содержащим от примерно 5 до примерно 100 нуклеотидов одно- или двухцепочечной ДНК. Однако для целей данного раскрытия, верхнего предела длины олигонуклеотида не существует. Олигонуклеотиды также известны как «олигомеры» или «олиго» и могут быть выделены из генов или химически синтезированы способами, известными в данной области техники. Термины «полинуклеотид» и «нуклеиновая кислота» следует понимать как включающие, применительно к описываемым вариантам реализации, одноцепочечные (такие как смысловые или антисмысловые) и двухцепочечные полинуклеотиды.
[00123] Используемый в данном документе термин «конструкт нуклеиновой кислоты» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, одноцепочечной или двухцепочечной, которая выделена из встречающегося в природе гена или модифицирована так, чтобы она содержала сегменты нуклеиновых кислот способом, не существующим в природе, или является синтетической. Термин «конструкт нуклеиновой кислоты» является синонимом термина «кассета экспрессии», когда конструкт нуклеиновой кислоты содержит контрольные последовательности, необходимые для экспрессии кодирующей последовательности по данному изобретению. «Кассета экспрессии» включает кодирующую последовательность ДНК, функционально связанную с промотором.
[00124] Под «гибридизуемым» или «комплементарным» или «по существу комплементарным» подразумевается, что нуклеиновая кислота (например, РНК) включает последовательность нуклеотидов, которая позволяет ей нековалентно связываться, т.е. формировать пары оснований по Уотсону-Крику и/или пары оснований G/U, подвергаться «отжигу» или «гибридизировать» с другой нуклеиновой кислотой специфичным для последовательности, антипараллельным образом (т.е. нуклеиновая кислота специфически связывается с комплементарной нуклеиновой кислотой) в пригодных in vitro и/или in vivo условиях температуры и ионной силы раствора. Как известно в данной области техники, стандартное спаривание оснований по Уотсону-Крику включает спаривание аденина (A) с тимидином (T), спаривание аденина (A) с урацилом (U) и спаривание гуанина (G) с цитозином (C). Кроме того, в данной области техники также известно, что для гибридизации двух молекул РНК (например, дцРНК) гуаниновое (G) основание спаривается с урацилом (U). Например, спаривание оснований G/U частично отвечает за вырожденность (т.е. избыточность) генетического кода в контексте спаривания оснований анти-кодонов тРНК с кодонами в мРНК. В контексте данного изобретения, гуанин (G) связывающего белок сегмента (дуплекса дцРНК) нацеливающей на ДНК молекулы РНК по данному изобретению считается комплементарным урацилу (U), и наоборот. Таким образом, когда пара оснований G/U может быть получена в данном нуклеотидном положении со связывающим белок сегментом (дуплекс дцРНК) нацеливающей на ДНК молекулы РНК по данному изобретению, это положение не рассматривается как некомплементарное, но вместо этого считается комплементарным.
[00125] Термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к полимерной форме аминокислот любой длины, которая может включать кодированные и некодированные аминокислоты, химически или биохимически модифицированные или дериватизированные аминокислоты и полипептиды, имеющие модифицированные основные цепи пептидов.
[00126] Последовательность ДНК, которая «кодирует» конкретную РНК или белок генного продукта, представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты ДНК, которая транскрибируется в конкретную РНК и/или белок. Полинуклеотид ДНК может кодировать РНК (мРНК), которая транслируется в белок, или полинуклеотид ДНК может кодировать РНК, которая не транслируется в белок (например, тРНК, рРНК или нацеливающую на ДНК РНК; также называемые «некодирующими» РНК или «нкРНК»).
[00127] Используемый в данном документе термин «молекула для редактирования генов» относится к одному или нескольким белкам или нуклеиновым кислотам, кодирующим белок, при этом белок выбирают из группы, содержащей транспозазу, нуклеазу, интегразу, направляющую РНК (нРНК), направляющую ДНК, рибонуклеопротеин (RNP) или РНК-активатор. Молекула нуклеазы для редактирования генов представляет собой белок, обладающий нуклеазной активностью, неограничивающие примеры которого включают: белок CRISPR (Cas), белок 9, связанный с CRISPR (Cas9); рестрикционный фермент типа IIS; подобную активатору транскрипции эффекторную нуклеазу (TALEN); и нуклеазу цинкового пальца (ZFN), мегануклеазу, сконструированные сайт-специфические нуклеазы или деактивированный CAS для систем CRISPRi или CRISPRa. Молекула для редактирования генов также может содержать ДНК-связывающий домен и нуклеазу. В некоторых вариантах реализации молекула для редактирования генов содержит ДНК-связывающий домен и нуклеазу. В определенных вариантах реализации ДНК-связывающий домен содержит направляющую РНК. В определенных вариантах реализации ДНК-связывающий домен содержит ДНК-связывающий домен TALEN. В определенных вариантах реализации по меньшей мере одна молекула для редактирования генов содержит один или несколько перемещаемых элементов. В определенных вариантах реализации один или несколько перемещаемых элементов содержат кольцевую ДНК. В определенных вариантах реализации один или несколько перемещаемых элементов содержат плазмидный вектор или вектор мини-кольцевой ДНК. В некоторых вариантах реализации ДНК-связывающий домен содержит ДНК-связывающий домен нуклеазы цинкового пальца. В определенных вариантах реализации по меньшей мере одна молекула для редактирования генов содержит один или несколько перемещаемых элементов. В определенных вариантах реализации один или несколько перемещаемых элементов содержат линейную ДНК. Линейная рекомбинантная и не встречающаяся в природе ДНК-последовательность, кодирующая транспозон, может быть получена in vitro. Линейные рекомбинантные и не встречающиеся в природе ДНК-последовательности по данному изобретению могут быть продуктом рестрикционного расщепления кольцевой ДНК. В определенных вариантах реализации кольцевая ДНК представляет собой плазмидный вектор или вектор мини-кольцевой ДНК. Линейные рекомбинантные и не встречающиеся в природе последовательности ДНК по данному изобретению могут быть продуктом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Линейные рекомбинантные и не встречающиеся в природе последовательности ДНК по данному изобретению могут представлять собой двухцепочечную doggybone™ ДНК-последовательность. ДНК-последовательности doggybone™ по данному изобретению могут быть получены ферментативным способом, при котором кодируется только экспрессионная кассета антигена, содержащая антиген, промотор, поли-А-хвост и теломерные концы.
[00128] Используемый в данном документе термин «функциональность редактирования генов» относится к вставке, делеции или замене ДНК в определенном сайте генома с потерей или усилением функции. Вставка, делеция или замена в определенном сайте ДНК могут быть выполнены, например, путем гомологичной репарации (HDR) или негомологичного присоединения конца (NHEJ), или редактирования с заменой одного основания. В некоторых вариантах реализации используется донорная матрица, например, для HDR, так что желаемая последовательность из донорной матрицы вставляется в геном посредством события гомологичной рекомбинации. В одном варианте реализации «донорная матрица» или «матрица репарации» содержит два гомологичных плеча (например, 5'-гомологичное плечо и 3'-гомологичное плечо), фланкирующих с обоих сторон донорную последовательность, содержащую желаемую мутацию или вставку в последовательность нуклеиновой кислоты, предназначенную для введения в геном хозяина. 5'- и 3'-гомологичные плечи по существу гомологичны геномной последовательности гена-мишени в сайте опосредованного эндонуклеазой разрезания. 3'-гомологичное плечо обычно расположено непосредственно после сайта мотива, прилегающего к протоспейсеру (PAM), в котором эндонуклеаза разрезает (например, разрезает двухцепочечную ДНК) или, в некоторых вариантах реализации, никирует ДНК.
[00129] Используемый в данном документе термин «система редактирования генов» относится к минимальным компонентам, необходимым для осуществления редактирования генома в клетке. Например, нуклеаза цинкового пальца или система TALEN могут требовать только экспрессии эндонуклеазы, слитой с нуклеиновой кислотой, комплементарной последовательности гена-мишени, тогда как для системы редактирования генов CRISPR/Cas минимальными требуемыми компонентами могут быть, например, эндонуклеаза Cas и направляющая РНК. Система редактирования генов может быть закодирована в одном зкДНК-векторе или нескольких векторах, по желанию. Специалисты в данной области техники легко поймут, какой компонент (компоненты) необходимы для системы редактирования генов.
[00130] Используемый в данном документе термин «фрагмент, редактирующий основание» относится к ферменту или ферментной системе, которые могут изменять один нуклеотид в последовательности, например, пару нуклеотидов цитозин/гуанин «G/C», на нуклеотидную пару аденин и тимин «T»/уридин «U» (A/T,U) (см., например, Shevidi et al. Dev Dyn 31 (2017) PMID:28857338; Kyoungmi et al. Nature Biotechnology 35:435-437 (2017), содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме), или нуклеотидную пару аденин/тимин "A/T" на нуклеотидную пару гуанин/цитозин "G/C" (см., например, Gaudelli et al. Nature (2017), в печати doi:10.1038/nature24644, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме).
[00131] Используемый в данном документе термин «ген безопасной гавани генома» или «ген безопасной гавани» относится к гену или локусам, в которые последовательность нуклеиновой кислоты может быть вставлена так, что последовательность может интегрироваться и функционировать предсказуемым образом (например, экспрессировать белок, представляющий интерес) без существенных негативных последствий для активности эндогенного гена или развития рака. В некоторых вариантах реализации ген безопасной гавани также представляет собой локус или ген, в которых вставленная последовательность нуклеиновой кислоты может экспрессироваться эффективно и на более высоких уровнях, чем в сайте, не являющемся «безопасной гаванью».
[00132] Используемый в данном документе термин «доставка гена» означает процесс, посредством которого чужеродная ДНК переносится в клетки-хозяева для геннотерапевтического применения.
[00133] Используемый в данном документе термин «CRISPR» означает «кластерные короткие палиндромные повторы, разделённые регулярными промежутками», которые являются отличительной чертой системы бактериальной защиты, составляющей основу технологии редактирования генома CRISPR-Cas9.
[00134] Используемый в данном документе термин «цинковый палец» означает небольшой белковый структурный мотив, который характеризуется координацией одного или несколькихионов цинка, для стабилизации складки.
[00135] Используемый в данном документе термин «гомологичная рекомбинация» означает тип генетической рекомбинации, при которой происходит обмен нуклеотидными последовательностями между двумя сходными или идентичными молекулами ДНК. Гомологичная рекомбинация также приводит к получению новых комбинаций последовательностей ДНК. Такие новые комбинации ДНК представляют собой генетическую вариацию. Гомологичная рекомбинация также используется при горизонтальном переносе генов для обмена генетическим материалом между различными штаммами и видами вирусов.
[00136] Используемый в данном документе термин «концевой повтор» или «TR» включает любой вирусный концевой повтор или синтетическую последовательность, которая содержит по меньшей мере одну минимально требуемую точку начала репликации и область, содержащую палиндромную шпилечную структуру. Rep-связывающая последовательность («RBS») и сайт концевого разрешения («TRS») вместе составляют «минимальную требуемую точку начала репликации» и, соответственно, концевой повтор (TR) содержит по меньшей мере одну RBS и по меньшей мере один TRS. Все TR, обратно комплементарные друг другу, в составе заданного отрезка последовательности полинуклеотидов, как правило, называют «инвертированными концевыми повторами», или «ITR». В контексте вируса ITR опосредуют репликацию, упаковку вируса, интеграцию и спасение провируса. Как было неожиданно обнаружено авторами данного изобретения, TR, не являющиеся обратно комплементарными по всей длине, могут, тем не менее, выполнять традиционные функции ITR, и, соответственно, термин ITR в данном документе относится к TR в зкДНК-геноме или зкДНК-векторе, который способен опосредовать репликацию зкДНК-вектора. Специалисту в данной области техники будет понятно, что в комплексных конфигурациях зкДНК могут присутствовать более двух ITR или пар асимметричных ITR. ITR может представлять собой ITR AAV или ITR не из AAV, или может происходить из ITR AAV или не-AAV ITR. Например, ITR может происходить из вируса семейства Parvoviridae, которое охватывает парвовирусы и депендовирусы (например, парвовирус собак, бычий парвовирус, парвовирус мышей, свиной парвовирус, парвовирус человека B-19), или шпилька SV40, которая служит точкой начала репликации SV40 может применяться в качестве ITR, который может дополнительно быть модифицирован путем усечения, замены, делеции, вставки и/или добавления. Вирусы семейства Parvoviridae состоят из два подсемейств: Parvovirinae, инфицирующих позвоночных животных, и Densovirinae, инфицирующих беспозвоночных животных. Депендопарвовирусы включают вирусное семейство аденоассоциированных вирусов (AAV), которые способны к репликации у позвоночных животных-хозяев, включая, без ограничений, виды человека, приматов, быков, собак, лошадей и овец. Для удобства в данном документе ITR, расположенный со стороны 5' (перед) от экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется "5'-ITR" или "левым ITR", а ITR, расположенный со стороны 3' (после) от экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, обозначается как «3'-ITR» или «правый ITR».
[00137] «ITR дикого типа» или «WT-ITR» относится к последовательности встречающейся в природе ITR-последовательности в AAV или другом депендовирусе, который сохраняет, например, активность связывания Rep и никующую способность Rep. Нуклеотидная последовательность WT-ITR из любого серотипа AAV может незначительно отличаться от канонической природной последовательности из-за вырожденности или дрейфа генетического кода и, следовательно, последовательности WT-ITR, пригодные для использования по данному изобретению, включают последовательности WT-ITR, образующиеся в результате естественных изменений, происходящих в процессе производства (например, ошибки репликации).
[00138] Используемый в данном документе термин «по существу симметричные WT-ITR» или «по существу симметричная пара WT-ITR» относится к паре WT-ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые оба представляют собой ITR дикого типа, имеющие обратно комплементарные последовательности по всей их длине. Например, ITR можно рассматривать как последовательность дикого типа, даже если она имеет один или несколько нуклеотидов, которые отклоняются от канонической природной последовательности, при условии, что указанные изменения не влияют на свойства и общую трехмерную структуру последовательности. В некоторых аспектах отклоняющиеся нуклеотиды представляют собой консервативные изменения последовательности. В качестве одного неограничивающего примера последовательность, имеющая идентичность последовательности по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с канонической последовательностью (измеренную, например, с использованием BLAST при настройках по умолчанию), также имеет (and also has) симметричную трехмерную пространственную организацию с другой WT-ITR, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. По существу симметричные WT-ITR имеют одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве. По существу симметричный WT-ITR можно функционально подтвердить как относящийся к дикому типу (WT), определив, что он имеет функциональный Rep-связывающий сайт (RBE или RBE') и сайт концевого разрешения (trs), который связывается с соответствующим белком Rep. Можно дополнительно проверить другие функции, включая экспрессию трансгена в пермиссивных условиях.
[00139] Используемые в данном документе фразы «модифицированный ITR» или «mod-ITR» или «мутантный ITR» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к ITR, который имеет мутацию по меньшей мере в одном или нескольких нуклеотидах по сравнению с WT-ITR из того же серотипа. Мутация может приводить к изменению одной или нескольких из областей A, C, C', B, B' в ITR, и может приводить к изменению трехмерной пространственной организации (т.е. ее трехмерной структуры в геометрическом пространстве). по сравнению с трехмерной пространственной организацией WT-ITR того же серотипа.
[00140] Используемый в данном документе термин «асимметричные ITR», также называемые «асимметричными парами ITR», относится к паре ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые не являются обратными комплементами по их полной длине. В качестве одного неограничивающего примера, асимметричная пара ITR не имеет симметричной трехмерной пространственной организации со своей родственной ITR, так что их трехмерные структуры имеют разные формы в геометрическом пространстве. Иными словами, асимметричная пара ITR имеет разные общие геометрические структуры, т.е. они имеют разную организацию своих A, C-C'- и B-B'-петель в трехмерном пространстве (например, одна ITR может иметь короткое плечо C-C' и/или короткое плечо B-B' по сравнению с родственной ITR). Различие в последовательностях между двумя ITR может быть связано с добавлением, делецией, усечением или точечной мутацией одного или нескольких нуклеотидов. В одном варианте реализации один ITR асимметричной пары ITR может быть последовательностью ITR AAV дикого типа, а другой ITR - модифицированным ITR, как определено в данном документе (например, последовательностью ITR не дикого типа или синтетической). В другом варианте реализации ни один из ITR асимметричной пары ITR не является последовательностью AAV дикого типа, и указанные два ITR представляют собой модифицированные ITR, которые имеют разные формы в геометрическом пространстве (т.е. разную общую геометрическую структуру). В некоторых вариантах реализации один mod-ITR асимметричной пары ITR может иметь короткое C-C'-плечо, а другой ITR может иметь другую модификацию (например, одно плечо или короткое B-B'-плечо и т.д.), так что они имеют различную трехмерную пространственную организацию по сравнению с родственным асимметричным mod-ITR.
[00141] Используемый в данном документе термин «симметричные ITR» относится к паре ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые мутированы или модифицированы относительно последовательностей депендовирусных ITR дикого типа и являются обратными комплементами по всей их длине. Ни один из ITR не является последовательностями ITR AAV2 дикого типа (т.е. они представляют собой модифицированный ITR, также называемый мутантным ITR) и может отличаться по последовательности от ITR дикого типа вследствие добавления, делеции, замены, усечения нуклеотидов или точечной мутации. Для удобства, в данном документе ITR, расположенный со стороны 5' от (перед) экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, называется "5'-ITR" или "левым ITR", а ITR, расположенный со стороны 3' от (после) экспрессионной кассеты в зкДНК-векторе, обозначается как «3'-ITR» или «правый ITR».
[00142] Используемый в данном документе термин «по существу симметричные модифицированные ITR» или «по существу симметричная пара mod-ITR» относится к паре модифицированных ITR в одном геноме зкДНК или зкДНК-векторе, которые оба имеют обратно комплементарные последовательности по всей своей длине. Например, модифицированный ITR может считаться по существу симметричным, даже имея некоторые нуклеотидные последовательности, отклоняющиеся от обратно комплементарной последовательности, если изменения не влияют на свойства и общую форму. В качестве одного неограничивающего примера, последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с канонической последовательностью (измеренную с использованием BLAST при настройках по умолчанию), также имеет (and also has) симметричную трехмерную пространственную организацию со своим родственным модифицированным ITR, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. Иными словами, по существу симметричная пара модифицированных ITR имеет одинаковые A, C-C' и B-B'-петли, организованные в трехмерном пространстве. В некоторых вариантах реализации ITR из пары mod-ITR могут иметь разные нуклеотидные последовательности обратного комплемента, но все же имеют одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию, т.е. оба ITR имеют мутации, которые приводят к одинаковой общей трехмерной форме. Например, один ITR (например, 5'-ITR) в паре mod-ITR может быть одного серотипа, а другой ITR (например, 3'-ITR) может принадлежать к другому серотипу, однако оба могут иметь одинаковые соответствующие мутации (например, если 5'ITR имеет делецию в области C, родственный модифицированный 3'ITR другого серотипа имеет делецию в соответствующей позиции в области C'), так что модифицированная пара ITR имеет одинаковую симметричную трехмерную пространственную организацию. В таких вариантах реализации каждый ITR в паре модифицированных ITR может принадлежать к разным серотипам (например, AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12), таким как комбинация AAV2 и AAV6, с модификацией одного ITR, отображенной в соответствующей позиции соответствующего ITR другого серотипа. В одном варианте реализации пара по существу симметричных модифицированных ITR относится к паре модифицированных ITR (mod-ITR), при условии, что разница в нуклеотидных последовательностях между ITR не влияет на свойства или общую форму, и они имеют по существу одинаковую форму в трехмерном пространстве. В качестве неограничивающего примера, mod-ITR имеет идентичность последовательности по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% с каноническим mod-ITR, определенную стандартными средствами, хорошо известными специалистам в данной области, такими как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (простое средство поиска локальных соответствий)) или BLASTN с настройками по умолчанию, а также имеет симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их трехмерные структуры имеют одинаковую форму в геометрическом пространстве. По существу симметричная пара mod-ITR имеет одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ITR в по существу симметричной паре mod-ITR имеет делецию плеча C-C', то родственный mod-ITR имеет соответствующую делецию петли C-C', а также имеет аналогичную трехмерную структуру остальных A и B-B'-петель одинаковой формы в геометрическом пространстве со своим родственным mod-ITR.
[00143] Термин «фланкирование» относится к относительному положению одной последовательности нуклеиновой кислоты по отношению к другой последовательности нуклеиновой кислоты. В общем, в последовательности ABC B фланкируется A и C. То же самое верно для расположения A×B×C. Таким образом, фланкирующая последовательность предшествует или следует за фланкированной последовательностью, но не обязательно должна быть смежной с, или непосредственно прилегающей к, фланкируемой последовательности. В одном варианте реализации термин фланкирование относится к концевым повторам на каждом конце линейного дуплексного зкДНК-вектора.
[00144] Используемый в данном документе термин «геном зкДНК» относится к кассете экспрессии, которая дополнительно включает по меньшей мере одну область инвертированного концевого повтора. Геном зкДНК может дополнительно содержать одну или несколько спейсерных областей. В некоторых вариантах реализации геном зкДНК включен в виде межмолекулярного дуплексного полинуклеотида ДНК в плазмиду или вирусный геном.
[00145] Используемый в данном документе термин «спейсерная область зкДНК» относится к промежуточной последовательности, которая разделяет функциональные элементы в указанном зкДНК-векторе или зкДНК-геноме. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК удерживают два функциональных элемента на требуемом расстоянии для оптимальной функциональности. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК обеспечивают или увеличивают генетическую стабильность зкДНК-генома в составе, например, плазмиды или бакуловируса. В некоторых вариантах реализации спейсерные области зкДНК облегчают подготовленную генетическую манипуляцию с зкДНК-геномом, обеспечивая удобное расположение сайтов клонирования и т.п. Например, в некоторых аспектах олигонуклеотидный «полилинкер», содержащий несколько сайтов рестрикции эндонуклеазами или последовательность не из открытой рамки считывания, сконструированный так, чтобы он не содержал известных сайтов связывания белка (например, транскрипционный фактор), может быть размещен в зкДНК-геноме для разделения цис-действующих факторов, например, со вставками 6-мера, 12-мера, 18-мера, 24-мера, 48-мера, 86-мера, 176-мера и т.п., между сайтом концевого разрешения и расположенным в направлении 5' регуляторным элементом транскрипции. Аналогично, спейсер может быть включен между сигнальной последовательностью полиаденилирования и 3'-концевым сайтом разрешения.
[00146] Используемые в данном документе термины «Rep-связывающий сайт», «элемент связывания Rep», «RBE» и «RBS» используются взаимозаменяемо и относятся к сайту связывания белка Rep (например, Rep 78 AAV или Rep 68 AAV), который после связывания белка Rep позволяет белку Rep проявлять свою сайт-специфическую эндонуклеазную активность в отношении последовательности, включающей RBS. Последовательность RBS и обратно-комплементарная ей последовательность вместе образуют один RBS. Последовательности RBS известны в данной области техники и включают, например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 531), представляющую собой последовательность RBS, идентифицированную в AAV2. Любая известная последовательность RBS может использоваться в вариантах реализации изобретения, включая другие известные последовательности RBS AAV и другие известные естественные или синтетические последовательности RBS. Без связи с какой-либо теорией, считается, что нуклеазный домен белка Rep связывается с дуплексной последовательностью нуклеотидов GCTC и, соответственно, на дуплексном олигонуклеотиде 5'-(GCGC)(GCTC)(GCTC)(GCTC)-3' (SEQ ID NO: 531) происходит прямое связывание и стабильная сборка двух известных белков Rep AAV. Кроме того, растворимые агрегированные конформеры (т.е. неопределенное число взаимосвязанных белков Rep) диссоциируют и связываются с олигонуклеотидами, которые содержат сайты связывания Rep. Каждый белок Rep взаимодействует как с азотистыми основаниями, так и с фосфодиэфирным остовом каждой цепи. Взаимодействия с азотистыми основаниями обеспечивают специфичность в отношении последовательности, тогда как взаимодействия с фосфодиэфирным остовом являются неспецифическими или менее специфическими в отношении последовательности и стабилизируют комплекс белок-ДНК.
[00147] Используемые в данном документе термины «сайт концевого разрешения» и «TRS» используются взаимозаменяемо и относятся к области, в которой Rep образует тирозин-фосфодиэфирную связь с 5'-тимидином, с образованием 3'-ОН, который служит субстратом для удлинения ДНК с помощью клеточной ДНК-полимеразы, например, ДНК-полимеразой дельта или ДНК-полимеразой эпсилон. Альтернативно, комплекс Rep-тимидин может принимать участие в скоординированной реакции лигирования. В некоторых вариантах реализации TRS минимально охватывает как минимум неспаренный тимидин. В некоторых вариантах реализации эффективность никирования TRS можно контролировать, по меньшей мере отчасти, расстоянием между ним и RBS в пределах одной молекулы. Если акцепторный субстрат представлен комплементарным ITR, итоговый продукт представляет собой внутримолекулярный дуплекс. TRS последовательности известны в данной области техники, и включают, например, 5'-GGTTGA-3' (SEQ ID NO: 45), представляющую собой гексануклеотидную последовательность, идентифицированную в AAV2. Согласно вариантам реализации данного изобретения может применяться любая известная последовательность TRS, в том числе другие известные последовательности TRS AAV и другие известные природные или синтетические последовательности TRS, такие как AGTT (SEQ ID NO: 46), GGTTGG (SEQ ID NO: 47), AGTTGG (SEQ ID NO: 48), AGTTGA (SEQ ID NO: 49); и другие мотивы, такие как RRTTRR (SEQ ID NO: 50).
[00148] Используемый в данном документе термин «зкДНК-плазмида» относится к плазмиде, которая содержит зкДНК-геном в виде межмолекулярного дуплекса.
[00149] Используемый в данном документе термин «зкДНК-бакмида» относится к геному инфекционного бакуловируса, включающему зкДНК-геном в виде межмолекулярного дуплекса, способному размножаться в E. coli в виде плазмиды и, соответственно, функционировать в качестве челночного вектора для бакуловируса.
[00150] Используемый в данном документе термин «зкДНК-бакуловирус» относится к бакуловирусу, который содержит зкДНК-геном в виде межмолекулярного дуплекса в составе генома бакуловируса.
[00151] Используемые в данном документе термины «инфицированная зкДНК-бакуловирусом клетка насекомого» и «зкДНК-BIIC» используются взаимозаменяемо и относятся к клетке-хозяину из беспозвоночного животного (включая, без ограничений, клетку насекомого (например, клетку Sf9)), инфицированной зкДНК-бакуловирусом.
[00152] Используемые в данном документе термины «вектор с ДНК с замкнутыми концами», «зкДНК-вектор» и «зкДНК» используются взаимозаменяемо и относятся к невирусному бескапсидному ДНК-вектору с по меньшей мере одним ковалентно-замкнутым концом (т.е. содержащему внутримолекулярный дуплекс). В некоторых вариантах реализации зкДНК содержит два ковалентно-замкнутых конца.
[00153] Как определено в данном документе, «репортеры» относятся к белкам, которые могут использоваться для обеспечения детектируемых показаний. Репортеры обычно продуцируют измеримый сигнал, например, флуоресцентный, цветовой или люминесцентный. Кодирующие последовательности репортерных белков кодируют белки, присутствие которых в клетке или организме легко поддается наблюдению. Например, флуоресцентные белки вызывают флуоресценцию клетки при возбуждении светом с определенной длиной волны, люциферазы приводят к катализу клеткой реакции, которая генерирует свет, а ферменты, такие как β-галактозидаза, превращают субстрат в окрашенный продукт. Типичные примеры репортерных полипептидов, пригодных для экспериментальных или диагностических целей, включают, без ограничения перечисленными, β-лактамазу, β-галактозидазу (LacZ), щелочную фосфатазу (AP), тимидинкиназу (TK), зеленый флуоресцентный белок (GFP) и другие флуоресцентные белки, хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), люциферазу и другие, хорошо известные в данной области техники.
[00154] Используемый в данном документе термин «эффекторный белок» относится к полипептиду, который обеспечивает детектируемые показания, либо, например, как репортерный полипептид, либо, более предпочтительно, как полипептид, убивающий клетку, например, токсин, или агент, придающий клетке чувствительность к киллингу определенным агентом или при отсутствии определенного агента. Эффекторные белки включают любой белок или пептид, который прямо нацелен на ДНК и/или РНК клетки-хозяина или повреждает ее. Например, эффекторные белки могут включать, без ограничения перечисленным, рестрикционную эндонуклеазу, которая нацелена на последовательность ДНК клетки-хозяина (геномный или внехромосомный элемент), протеазу, разлагающую полипептид-мишень, необходимый для выживания клетки, ингибитор ДНК-гиразы и токсин рибонуклеазного типа. В некоторых вариантах реализации экспрессия эффекторного белка, контролируемая синтетическим биологическим контуром, как описано в данном документе, может принимать участие в качестве фактора в другом синтетическом биологическом контуре, с расширением таким образом диапазона и сложности отклика системы биологического контура.
[00155] Регуляторы транскрипции относятся к активаторам и репрессорам транскрипции, которые либо активируют, либо подавляют транскрипцию гена, представляющего интерес. Промоторы представляют собой области нуклеиновой кислоты, которые инициируют транскрипцию конкретного гена. Активаторы транскрипции обычно связываются поблизости от транскрипционных промоторов и рекрутируют РНК-полимеразу, чтобы прямо инициировать транскрипцию. Репрессоры связываются с промоторами транскрипции и стерически затрудняют инициацию транскрипции РНК-полимеразой. Другие регуляторы транскрипции могут служить либо активатором, либо репрессором в зависимости от места их связывания и условий в клетке и окружающей среде. Неограничивающие примеры классов регуляторов транскрипции включают, без ограничений, гомеодоменные белки, белки цинкового пальца, белки с мотивом «крылатая спираль» (белки Forkhead) и белки лейциновой застежки.
[00156] При использовании в данном документе «белок-репрессор» или «белок-индуктор» представляет собой белок, который связывается с элементом регуляторной последовательности и подавляет или активирует, соответственно, транскрипцию последовательностей, функционально связанных с указанным элементом регуляторной последовательности. Предпочтительные белки-репрессоры и индукторы, как описано в данном документе, чувствительны к присутствию или отсутствию по меньшей мере одного вводимого агента или входного воздействия окружающей среды. Предпочтительные белки, как описано в данном документе, являются модульными по форме и содержат, например, отделяемые ДНК-связывающие, и связывающие входные агенты или откликающиеся на них элементы или домены.
[00157] Используемый в данном документе термин «носитель» ввключает любые растворители, дисперсионные среды, основы, покрытия, разбавители, антибактериальные и антимикотические агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты, буферы, растворы-носители, суспензии, коллоиды и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. Выспомогательные активные ингредиенты также могут быть включены в указанные композиции. Выражение «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным объектам и композициям, которые не приводят к токсической, аллергической или аналогичной нежелательной реакции при введении хозяину.
[00158] Используемый в данном документе термин «домен, реагирующий на вводимый агент», представляет собой домен транскрипционного фактора, который связывает или иначе отвечает на условие или вводимый агент, обеспечивая реакцию присоединенного к нему ДНК-связывающего слитого домена на наличие указанного условия или входного воздействия. В одном варианте реализации наличие условия или входного воздействия приводит к конформационному изменению в чувствительном домене вводимого агента или в слитом с ним белке, что модифицирует транскрипционно-модулирующую активность фактора транскрипции.
[00159] Термин «in vivo» относится к анализам или процессам, которые происходят в организме или в пределах организма, такого как многоклеточное животное. В некоторых аспектах, описанных в данном документе, можно сказать, что способ или применение происходят «in vivo», когда используется одноклеточный организм, такой как бактерия. Термин «ex vivo» относится к способам и применениям, которые осуществляют с использованием живой клетки с интактной мембраной, находящейся вне организма многоклеточного животного или растения, например, эксплантатов, культивированных клеток, в том числе первичных клеток и клеточных линий, трансформированных клеточных линий и экстрагированных тканей или клеток, в том числе клеток крови и т.п. Термин «in vitro» относится к анализам и способам, не требующим наличия клетки с интактной мембраной, например, проводимым на клеточных экстрактах, и может относиться к введению программируемого синтетического биологического контура в неклеточную систему, такую как среда, не содержащая клеток или клеточных систем, такая как клеточные экстракты.
[00160] Используемый в данном документе термин «промотор» относится к любой последовательности нуклеиновой кислоты, которая регулирует экспрессию другой последовательности нуклеиновой кислоты путем направления транскрипции указанной последовательности нуклеиновой кислоты, которая может представлять собой гетерологичный целевой ген, кодирующий белок, или РНК. Промоторы могут быть конститутивными, индуцибельными, репрессируемыми, тканеспецифическими, или любой их комбинацией. Промотор представляет собой контрольную область последовательности нуклеиновой кислоты, которая контролирует инициацию и уровень транскрипции остальной части последовательности нуклеиновой кислоты. Промотор может также содержать генетические элементы, в которых может происходить связывание регуляторных белков и молекул, таких как РНК-полимераза, и других транскрипционных факторов. В некоторых вариантах реализации аспектов, описанных в данном документе, промотор может управлять экспрессией транскрипционного фактора, который регулирует экспрессию самого промотора. В последовательности промотора будет присутствовать сайт инициации транскрипции, а также связывающие белки домены, отвечающие за связывание РНК-полимеразы. Эукариотические промоторы часто, однако не всегда, содержат «TATA»-боксы и «CAT»-боксы. Для управления экспрессией трансгенов в зкДНК-векторах, описанных в данном документе, могут применяться различные промоторы, в том числе индуцибельные промоторы. Промоторная последовательность может быть ограничена на своем 3'-конце сайтом инициации транскрипции и простирается в восходящем направлении (в направлении к 5'-концу), включая минимальное количество оснований или элементов, необходимых для инициирования транскрипции на уровнях, детектируемых выше фона.
[00161] Используемый в данном документе термин «энхансер» относится к цис-действующей регуляторной последовательности (например, 50-1500 пар оснований), которая связывает один или несколько белков (например, белков-активаторов или транскрипционного фактора) для повышения транскрипционной активации последовательности нуклеиновой кислоты. Энхансеры могут быть расположены на расстоянии до 1 000 000 пар оснований выше сайта начала гена или ниже сайта начала гена, который они регулируют. Энхансер может быть расположен в интронной области или в экзонной области не связанного с ним гена.
[00162] Можно сказать, что промотор управляет экспрессией или управляет транскрипцией последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует. Выражения «функционально связанный», «функционально расположенный», «под контролем» и «под транскрипционным контролем» указывают, что промотор находится в корректном функциональном положении и/или ориентации относительно последовательности нуклеиновой кислоты, которую он регулирует, для контроля инициации транскрипции и/или экспрессии этой последовательности. «Инвертированный промотор» в данном документе относится к промотору, последовательность нуклеиновой кислоты которого имеет обратную ориентацию, так чтобы кодирующая цепь становилась некодирующей, и наоборот. Последовательности инвертированных промоторов могут применяться в различных вариантах реализации для регуляции состояния переключателя. Кроме того, в различных вариантах реализации промотор может применяться в сочетании с энхансером.
[00163] Промотор может быть естественным образом ассоциирован с геном или последовательностью, что может быть достигнуто путем выделения 5'-некодирующих последовательностей, расположенных перед кодирующим сегментом и/или экзоном данного гена или последовательности. Такой промотор может называться «эндогенным». Аналогичным образом, в некоторых вариантах реализации энхансер может быть естественным образом ассоциирован с последовательностью нуклеиновой кислоты и расположен со стороны либо 3', либо 5' относительно указанной последовательности.
[00164] В некоторых вариантах реализации кодирующий сегмент нуклеиновой кислоты помещен под контроль «рекомбинантного промотора» или «гетерологичного промотора», причем оба термина относятся к промотору, который обычно не ассоциирован с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, с которой он функционально связан в его естественных условиях среды. Рекомбинантный или гетерологичный энхансер относится к энхансеру, который обычно не связан с данной последовательностью нуклеиновой кислоты в ее естественной среде. Такие промоторы или энхансеры могут включать промоторы или энхансеры других генов; промоторы или энхансеры, выделенные из любой другой прокариотической, вирусной или эукариотической клетки; и синтетические промоторы или энхансеры, которые не являются «встречающимися в природе», т.е. содержат различные элементы разных транскрипционных регуляторных областей и/или изменяющие экспрессию мутации, введенные с применением способов генетического конструирования, известных в данной области техники. Наряду с получением последовательностей нуклеиновых кислот промоторов и энхансером синтетическим путем, последовательности промоторов могут быть получены с использованием рекомбинантного клонирования и/или технологии амплификации нуклеиновых кислот, в том числе ПЦР, применительно к синтетическим биологическим контурам и модулям, раскрытым в данном документе (см., например, патент США №4683202, патент США №5928906, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки). Кроме того, предусмотрена также возможность применения контрольных последовательностей, которые направляют транскрипцию и/или экспрессию последовательностей в неядерных органеллах, таких как митохондрии, хлоропласты и т.п.
[00165] Как описано в данном документе, «индуцибельный промотор» представляет собой промотор, который характеризуется инициацией или усилением транскрипционной активности в присутствии, под влиянием, или при контакте с индуктором или индуцирующим агентом. «Индуктор» или «индуцирующий агент», как определено в данном документе, может быть эндогенным или экзогенным в норме соединением или белком, которые вводят таким образом, чтобы обеспечивать их активность по индуцированию транскрипционной активности индуцируемого промотора. В некоторых вариантах реализации индуктор или индуцирующий агент, т.е. химическое вещество, соединение или белок, может сам быть получен в результате транскрипции или экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты (т.е. индуктор может представлять собой белок-индуктор, экспрессируемый другим компонентом или модулем), который сам может находиться под контролем индуцируемого промотора. В некоторых вариантах реализации индуцибельный промотор индуцируется в отсутствие определенных агентов, таких как репрессор. Примеры индуцибельных промоторов включают, без ограничений, тетрациклин, металлотионин, экдизон, вирусы млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса и длинный концевой повтор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV-LTR)) и другие реагирующие на стероиды промоторы, реагирующие на рапамицин промоторы и т.п.
[00166] Термины «регуляторные последовательности ДНК», «контрольные элементы» и «регуляторные элементы», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к контрольным последовательностям транскрипции и трансляции, таким как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы, сигналы деградации белка и т.п., которые обеспечивают и/или регулируют транскрипцию некодирующей последовательности (например, нацеливающей на ДНК РНК) или кодирующей последовательности (например, сайт-направленного модифицирующего полипептида или полипептида Cas9/Csn1) и/или регулируют трансляцию кодируемого полипептида.
[00167] «Функционально связанный» относится к размещению в непосредственной близости, при котором описываемые компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать по назначению. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на ее транскрипцию или экспрессию. «Экспрессионная кассета» включает экзогенную последовательность ДНК, которая функционально связана с промотором или другой регуляторной последовательностью, достаточной для направления транскрипции трансгена в зкДНК-векторе. Подходящие промоторы включают, например, тканеспецифичные промоторы. Промоторы также могут иметь происхождение от AAV.
[00168] Используемый в данном документе термин «субъект» относится к человеку или животному, лечение которого, включая профилактическое лечение, проводится с помощью зкДНК-вектора в соответствии с данным изобретением. Обычно указанное животное представляет собой позвоночное животное, такое как, без ограничения, примат, грызун, домашнее животное или промысловое животное. Приматы включают, без ограничений, шимпанзе, яванских макак, коат и макак, например, макак-резусов. Грызуны включают мышей, крыс, сурков, хорьков, кроликов и хомяков. Домашние и промысловые животные включают, без ограничений, коров, лошадей, свиней, оленей, бизонов, буйволов, кошачьих, например, домашнюю кошку, собачьих, например, собак, лис, волков, птиц, например, кур, эму, страуса, и рыб, например, форель, сома и лосося. В определенных вариантах реализации аспектов, описанных в данном документе, указанным субъектом является млекопитающее, например, примат или человек. Субъект может быть мужского или женского пола. Кроме того, субъект может представлять собой младенца или ребенка. В некоторых вариантах реализации указанный субъект может представлять собой новорожденного или нерожденного субъекта, например, субъекта in utero. Предпочтительно, субъект является млекопитающим. Указанное млекопитающее может быть человеком, не являющимся человеком приматом, мышью, крысой, собакой, кошкой, лошадью или коровой, но не ограничивается этими примерами. Млекопитающие, отличные от людей, могут быть выгодно использованы в качестве субъектов, которые представляют животные модели заболеваний и расстройств. Кроме того, способы и композиции, описанные в данном документе, можно использовать для одомашненных животных и/или домашних животных. Человек может быть любого возраста, пола, принадлежать к любой расе или этнической группе, например, может быть европеоидом (белым), азиатом, африканцем, черным, афроамериканцем, афроевропейцем, испаноамериканцем, представителем ближневосточного этноса и т.д. В некоторых вариантах реализации субъект может представлять собой пациента или другого субъекта в клинических условиях. В некоторых вариантах реализации, указанный субъект уже проходит курс лечения. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой эмбрион, плод, новорожденного, младенца, ребенка, подростка или взрослого. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой плод человека, новорожденного, младенца, ребёнка, подростка или взрослого человека. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой эмбрион животного или эмбрион, не принадлежащий человеку, или эмбрион примата, не являющегося человеком. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой человеческий эмбрион.
[00169] Используемый в данном документе термин «клетка-хозяин» включает любой тип клеток, которые являются восприимчивыми к трансформации, трансфекции, трансдукции и т.п. с использованием конструкта нуклеиновой кислоты или вектора экспрессии зкДНК по данному изобретению. В качестве неограничивающих примеров клетка-хозяин может представлять собой выделенную первичную клетку, плюрипотентные стволовые клетки, клетки CD34+), индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или любые из ряда иммортализованных клеточных линий (например, клетки HepG2). Альтернативно, клетка-хозяин может представлять собой клетку in situ или in vivo в ткани, органе или организме.
[00170] Термин «экзогенный» относится к веществу, присутствующему в клетке, отличной от его природного источника. Термин «экзогенный» при использовании в данном документе может относиться к нуклеиновой кислоте (например, нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид) или полипептиду, которые были введены посредством процесса, связанного с воздействием человека, в биологическую систему, такую как клетка или организм, в которой они обычно не обнаруживаются, и ввеление нуклеиновой кислоты или полипептида в такую клетку или организм является желательным. Альтернативно, «экзогенный» может относиться к нуклеиновой кислоте или полипептиду, которые были введены посредством процесса, связанного с воздействием человека, в биологическую систему, такую как клетка или организм, в которой они присутствуют в относительно небольших количествах, и увеличение количества нуклеиновой кислоты или полипептида в клетке или организме является желательным, например, для создания эктопической экспрессии или уровней. В отличие от этого, термин «эндогенный» относится к веществу, которое является нативным для биологической системы или клетки.
[00171] Термин «идентичность последовательности» относится к сродству между двумя нуклеотидными последовательностями. Для целей данного изобретения степень идентичности последовательностей между двумя дезоксирибонуклеотидными последовательностями определяется с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, выше), реализованного в программе Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, выше), предпочтительно, версии 3.0.0 или более поздней. Используемые необязательные параметры: штраф за открытие пробела 10, штраф за расширение пробела 0,5 и матрица замещения EDNAFULL (версия EMBOSS NCBI NUC4.4). Выходной параметр Нидла, обозначенный как «самая длинная идентичность» (полученный с использованием параметра -nobrief), используется в качестве процентной идентичности и рассчитываются следующим образом: (Идентичные дезоксирибонуклеотиды × 100) / (Длина выравнивания - Общее число пробелов в выравнивании). Длина выравнивания предпочтительно составляет, по меньшей мере, 10 нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере 25 нуклеотидов, более предпочтительно, по меньшей мере 50 нуклеотидов, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 100 нуклеотидов.
[00172] Термин «гомология» или «гомологичный», используемый в данном документе, определяется как процент нуклеотидных остатков в гомологичном плече, которые идентичны нуклеотидным остаткам в соответствующей последовательности на хромосоме-мишени после выравнивания последовательностей и введения пробелов, при необходимости, для достижения максимальной процентной идентичности последовательности. Выравнивание в целях определения процентной гомологии нуклеотидных последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые доступны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как прикладные программы BLAST, BLAST-2, ALIGN, ClustalW2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты (например, последовательность ДНК), например, гомологичное плечо матрицы репарации, считается «гомологичной», когда последовательность является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более, идентичной соответствующей нативной или неотредактированной последовательности нуклеиновой кислоты (например, геномной последовательности) клетки-хозяина.
[00173] Используемый в данном документе термин «гомологичное плечо» относится к полинуклеотиду, который подходит для нацеливания донорной последовательности на геном посредством гомологичной рекомбинации. Как правило, два гомологичных плеча фланкируют донорную последовательность, при этом каждое гомологичное плечо содержит геномные последовательности перед и после локусов интеграции.
[00174] Используемый в данном документе термин «донорная последовательность» относится к полинуклеотиду, который должен быть вставлен или использован в качестве матрицы репарации для генома клетки-хозяина. Донорная последовательность может содержать модификацию, которую желательно сделать во время редактирования гена. Включаемая последовательность может быть введена в молекулу нуклеиновой кислоты-мишени путем гомологично направляемой репарации в последовательности-мишени, тем самым вызывая изменение последовательности-мишени от исходной последовательности-мишени к последовательности, содержащей донорную последовательность. Соответственно, последовательность, содержащаяся в донорной последовательности, может представлять собой, относительно последовательности-мишени, вставку, делецию, индел, точечную мутацию, репарацию мутации и т.д. Донорная последовательность может быть, например, одноцепочечной молекулой ДНК; двухцепочечной молекулой ДНК; гибридной молекулой ДНК/РНК; и гибридной молекулой ДНК/модРНК (модифицированная РНК). В одном варианте реализации донорная последовательность является чужеродной по отношению к гомологичным плечам. Редактирование может быть редактированием РНК, а также ДНК. Донорная последовательность может быть эндогенной или экзогенной по отношению к геному клетки-хозяина, в зависимости от природы желаемого редактирования гена.
[00175] Термин «гетерологичный», используемый в данном документе, означает нуклеотидную или полипептидную последовательность, которая не обнаружена в нативной нуклеиновой кислоте или белке, соответственно. Например, в химерном белке Cas9/Csn1 РНК-связывающий домен встречающегося в природе бактериального полипептида Cas9/Csn1 (или его варианта) может быть слит с гетерологичной полипептидной последовательностью (т.е. полипептидной последовательностью из белка, отличного от Cas9/Csn1, или полипептидной последовательностью из другого организма). Гетерологичная полипептидная последовательность может проявлять активность (например, ферментативную активность), которая также будет проявляться химерным белком Cas9/Csn1 (например, активность метилтрансферазы, активность ацетилтрансферазы, активность киназы, убиквитинирующая активность и т.д.). Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть связана с природной последовательностью нуклеиновой кислоты (или ее вариантом) (например, с помощью генной инженерии) для получения химерной нуклеотидной последовательности, кодирующей химерный полипептид. В качестве другого примера, в варианте слитого сайт-направленного полипептида Cas9 вариант сайт-направленного полипептида Cas9 может быть слит с гетерологичным полипептидом (т.е. полипептидом, отличным от Cas9), который проявляет активность, которая также будет проявляться у варианта слитого сайт-направленного полипептида Cas9. Гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты может быть связана с вариантом сайт-направленного полипептида Cas9 (например, с помощью генной инженерии) для получения нуклеотидной последовательности, кодирующей слитый вариант сайт-направленного полипептида Cas9.
[00176] «Вектор» или «вектор экспрессии» представляет собой репликон, такой как плазмида, бакмида, фаг, вирус, вирион или космида, к которому может быть присоединен другой сегмент ДНК, т.е. «вставка», чтобы вызвать репликацию присоединенного сегмента в клетке. Вектор может представлять собой конструкт нуклеиновой кислоты, предназначенный для доставки в клетку-хозяина или для переноса между различными клетками-хозяевами. Как используется в данном документе, вектор может быть вирусным или невирусным по происхождению и/или в конечной форме, однако для целей данного изобретения «вектор» обычно относится к зкДНК-вектору, как этот термин используется в данном документе. Термин «вектор» охватывает любой генетический элемент, который способен к репликации, когда связан с надлежащими контрольными элементами, и который может переносить генные последовательности в клетки. В некоторых вариантах реализации вектор может представлять собой вектор экспрессии или рекомбинантный вектор.
[00177] Используемый в данном документе термин «вектор экспрессии» относится к вектору, который направляет экспрессию РНК или полипептида из последовательностей, связанных с транскрипционными регуляторными последовательностями в векторе. Экспрессируемые последовательности часто, но не обязательно, будут гетерологичными по отношению к клетке. Вектор экспрессии может содержать дополнительные элементы, например, вектор экспрессии может иметь две системы репликации, что позволяет поддерживать его в двух организмах, например, в клетках человека для экспрессии и в прокариотическом хозяине для клонирования и амплификации. Термин «экспрессия» относится к клеточным процессам, участвующим в продуцировании РНК и белков и, при необходимости, в секретировании белков, включая, где это применимо, без ограничений, например, транскрипцию, процессинг транскрипта, трансляцию и укладку белка, модификацию и процессинг. «Продукты экспрессии» включают РНК, транскрибируемую с гена, и полипептиды, полученные путем трансляции мРНК, транскрибированной с гена. Термин «ген» означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (ДНК) в РНК in vitro или in vivo, когда она функционально связана с соответствующими регуляторными последовательностями. Ген может включать или не включать области, предшествующие и следующие за кодирующей областью, например, 5'-нетранслируемые (5'UTR) или "лидерные" последовательности и 3'-UTR или «трейлерные" последовательности, а также промежуточные последовательности (интроны) между индивидуальными кодирующими сегментами (экзонами).
[00178] Под «рекомбинантным вектором» подразумевается вектор, который содержит гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, или «трансген», который способен к экспрессии in vivo. Следует понимать, что векторы, описанные в данном документе, в некоторых вариантах реализации можно комбинировать с другими подходящими композициями и терапиями. В некоторых вариантах реализации вектор является эписомальным. Использование подходящего эписомального вектора обеспечивает средства поддержания представляющего интерес нуклеотида у субъекта в экстрахромосомной многокопийной ДНК, тем самым устраняя потенциальные эффекты интеграции хромосом.
[00179] Используемые в данном документе термины «коррекция», «редактирование генома» и «восстановление» относятся к изменению мутантного гена, который кодирует укороченный белок или вообще не кодирует белок, для достижения таким образом экспрессии полноразмерного функционального или частично полноразмерного функционального белка. Коррекция или восстановление мутантного гена может включать замену области гена, имеющего мутацию, или замену всего мутантного гена копией гена, не имеющей мутации, с помощью механизма репарации, такого как гомологични направленная репарация (HDR). Коррекция или восстановление мутантного гена может также включать исправление мутации со сдвигом рамки, которая приводит к появлению преждевременного стоп-кодона, аберрантного акцепторного сайта сплайсинга или аберрантного донорного сайта сплайсинга, путем создания двухцепочечного разрыва гена, который затем восстанавливается с использованием негомологичного присоединения концов (NHEJ). NHEJ во время репарации может добавить или удалить по крайней мере одну пару оснований, что может восстановить правильную рамку считывания и устранить преждевременный стоп-кодон. Коррекция или восстановление мутантного гена может также включать разрушение аберрантных акцепторного сайта сплайсинга или донорной последовательности сплайсинга. Коррекция или восстановление мутантного гена может также включать делецию несущественного генного сегмента одновременным действием двух нуклеаз на одну и ту же цепь ДНК для восстановления правильной рамки считывания путем удаления ДНК между двумя сайтами-мишенями нуклеаз и репарации разрыва ДНК с помощью NHEJ.
[00180] Используемая в данном документе фраза «генетическое заболевание» относится к заболеванию, частично или полностью, прямо или косвенно, вызванному одной или несколькими аномалиями в геноме, особенно, к состоянию, которое присутствует с рождения. Аномалия может быть мутацией, вставкой или делецией. Аномалия может влиять на кодирующую последовательность гена или его регуляторную последовательность. Генетическим заболеванием могут быть, без ограничений, МДД (мышечная дистрофия Дюшенна), гемофилия, муковисцидоз, хорея Гентингтона, семейная гиперхолестеринемия (дефект рецептора ЛПНП), гепатобластома, болезнь Вильсона, врожденная печеночная порфирия, наследственные нарушения метаболизма печени, синдром Леша-Нихана, серповидноклеточная анемия, талассемии, пигментная ксеродерма, анемия Фанкони, пигментный ретинит, атаксия-телеангиэктазия, синдром Блума, ретинобластома и болезнь Тея-Сакса.
[00181] Используемая в данном документе фраза «путь негомологичного присоединения конца (NHEJ)» относится к пути, который восстанавливает двухцепочечные разрывы ДНК путем прямого лигирования концов разрыва без необходимости в гомологичной матрице. Независимое от матрицы повторное лигирование концов ДНК с помощью NHEJ является стохастическим, подверженным ошибкам процессом репарации, который вводит случайные микровставки и микроделеции (инделы) в точке разрыва ДНК. Этот метод может использоваться для преднамеренного нарушения, удаления или изменения рамки считывания целевых последовательностей генов. NHEJ обычно использует короткие гомологичные последовательности ДНК, называемые микрогомологиями, для направления репарации. Эти микрогомологии часто присутствуют в одноцепочечных выступах на конце двухцепочечных разрывов. Когда выступы являются полностью совместимыми, NHEJ обычно исправляет разрыв, но может также происходить неточная репарация, приводящая к потере нуклеотидов, но гораздо чаще, при несовместимых выступах, «опосредованное нуклеазой NHEJ», в используемом в данном документе значении, относится к NHEJ, которое инициируется после того, как нуклеаза, такая как cas9 или другая нуклеаза, разрезает двухцепочечную ДНК. В системе CRISPR/CAS NHEJ может нацеливаться с использованием одной последовательности направляющей РНК.
[00182] Выражения «гомологични направленная репарация» или «HDR», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к механизму в клетках для репарации повреждений двухцепочечной ДНК, когда в ядре присутствует гомологичный фрагмент ДНК. HDR использует донорную ДНК-матрицу для проведения репарации и может быть использована для создания специфических изменений последовательности генома, включая целевое добавление целых генов. Если донорная матрица предусматривается вместе с сайт-специфической нуклеазой, такой как в системах на основе CRISPR/Cas9, то клеточный механизм будет восстанавливать разрыв посредством гомологичной рекомбинации, которая усиливается на несколько порядков при наличии расщепления ДНК. Когда отсутствует кусок гомологичной ДНК, вместо этого может иметь место негомологичное соединение концов. В системе CRISPR/Cas для HDR можно использовать одну направляющую РНК или две разные направляющие RNAS.
[00183] Выражения «repeat variable diresidue» (группа двух вариабельных остатков повтора) или «RVD», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к паре смежных аминокислотных остатков в мотиве распознавания ДНК (также известном как «модуль RVD»), включающем 33-35 аминокислот, ДНК-связывающего домена TALE. RVD определяет нуклеотидную специфичность модуля RVD. Модули RVD могут быть объединены для создания массива RVD. Используемый в данном документе термин «длина массива RVD» относится к количеству модулей RVD, которое соответствует длине нуклеотидной последовательности в пределах области-мишени TALEN, распознаваемой TALEN, т.е. области связывания.
[00184] Используемые в данном документе термины «сайт-специфическая нуклеаза» или «последовательность-специфическая нуклеаза» относятся к ферменту, способному специфически распознавать и расщеплять последовательности ДНК. Сайт-специфическая нуклеаза может быть генно-инженерной. Примеры сконструированных сайт-специфических нуклеаз включают нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), эффекторные нуклеазы TAL (TALEN) и системы на основе CRISPR/Cas, которые используют различные природные и неприродные ферменты Cas.
[00185] Используемый в данном документе термин «содержащий» или «содержит» используется в отношении композиций, способов и их соответствующих компонентов, которые важны для способа или композиции, но допускают включение неуточненных элементов, будь то существенных или нет.
[00186] Используемый в данном документе термин «состоящий по существу из» относится к таким элементам, необходимым для данного варианта реализации. Этот термин допускает присутствие элементов, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые или функциональные характеристики такого варианта реализации. Использование слова «содержащий» указывает на включение, а не на ограничение.
[00187] Термин «состоящий из» относится к композициям, способам и их соответствующим компонентам, как описано в данном документе, которые исключают любой элемент, не указанный в этом описании варианта реализации.
[00188] Используемый в данном документе термин «состоящий по существу из» относится к таким элементам, необходимым для данного варианта реализации. Этот термин допускает наличие дополнительных элементов, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые или функциональные характеристики этого варианта реализации изобретения.
[00189] Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа, в том числе сопровождаемые определением «указанный» (в английском тексте - с артиклями "a", "an" и "the») включают ссылки на формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, например, ссылки на «способ» включают один или несколько способов и/или этапов описанного в данном документе типа и/или таких, которые станут очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения данного изобретения и так далее. Аналогично, предполагается, что термин «или» включает «и», если из контекста явным образом не следует иное. Хотя при практической реализации или тестировании данного изобретения могут применяться способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, подходящие способы и материалы описаны ниже. Выражение «например» используется в данном документе для описания неограничивающего примера. Таким образом, сокращение «напр.» является синонимом термина «например».
[00190] За исключением рабочих примеров или иных указанных случаев, все числа, отражающие количества ингредиентов или условия реакции согласно настоящему изобретению, во всех случаях должны быть истолкованы как модифицированные термином «приблизительно». Термин «приблизительно» применительно к процентам может означать ±1%. Данное изобретение дополнительно более подробно объяснено в приведенных ниже примерах, однако объем данного изобретения ими не ограничен.
[00191] Группы альтернативных элементов или вариантов реализации изобретения, раскрытых в данном документе, не должны рассматриваться как ограничения. На каждый член группы можно ссылаться и заявлять его индивидуально или в любой комбинации с другими членами группы или другими элементами, представленными в данном документе. Один или несколько членов группы могут быть включены или исключены из группы по соображениям удобства и/или патентоспособности. При любом таком включении или исключении в данном документе считается, что описание изобретения содержит измененную группу, тем самым удовлетворяя условию письменного описания всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.
[00192] В некоторых вариантах реализации любого из аспектов изобретение, описанное в данном документе, не касается процесса клонирования людей, процессов модификации генетической идентичности зародышевой линии людей, использования человеческих эмбрионов в промышленных или коммерческих целях, или процессов модификации генетической идентичности животных, которые могут причинить им страдания без какой-либо существенной медицинской выгоды для человека или животного, а также животных, возникающих в результате таких процессов.
[00193] Другие термины определены в данном документе в описании различных аспектов изобретения.
[00194] Все патенты и другие публикации, включая литературные ссылки, выданные патенты, опубликованные патентные заявки и одновременно находящиеся на рассмотрении патентные заявки, упомянутые в настоящей заявке, явным образом включены в данный документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, методологий, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы в связи с технологией, описанной в данном документе. Эти публикации представлены исключительно по причине их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. Ничто в этом отношении не должно быть истолковано как признание того, что авторы изобретения не обладают правами на более раннее изобретение по отношению к такому раскрытию в силу предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все заявления относительно даты или представления относительно содержания этих документов основаны на информации, доступной заявителям, и не являются допущением каким-либо образом признания правильности дат или содержания этих документов.
[00195] Описание вариантов реализации изобретения не должно рассматриваться как исчерпывающее или ограничивающее изобретение точной раскрытой формой. Хотя в данном документе описаны в иллюстративных целях конкретные варианты реализации и примеры раскрытия, возможны различные эквивалентные модификации в пределах объема раскрытия, как будет понятно специалистам в соответствующей области техники. Например, хотя стадии или функции способа представлены в указанном порядке, в альтернативных вариантах реализации функции могут выполняться в другом порядке, или функции могут выполняться по существу одновременно. Принципиальные положения изобретения, предоставленные в данном документе, могут быть применены к другим процедурам или методам в зависимости от ситуации. Различные варианты реализации, описанные в данном документе, могут быть объединены для обеспечения дополнительных вариантов реализации. Аспекты раскрытия могут быть модифицированы, при необходимости, для использования составов, функций и концепций вышеупомянутых ссылок и применения для обеспечения дополнительных вариантов реализации изобретения. Кроме того, из соображений биологической функциональной эквивалентности могут быть сделаны некоторые изменения в структуре белка, не влияющие на биологическое или химическое действие в качественном или количественном отношении. Эти и другие изменения могут быть внесены в раскрытие в свете подробного описания. Все такие модификации предназначены для включения в объем прилагаемой формулы изобретения.
[00196] Конкретные элементы любого из вышеприведенных вариантов реализации могут быть объединены или заменены элементами других вариантов реализации. Кроме того, в то время как преимущества, связанные с некоторыми вариантами реализации изобретения, были описаны в контексте этих вариантов реализации, другие варианты реализации также могут демонстрировать такие преимущества, и не все варианты реализации должны обязательно демонстрировать такие преимущества, чтобы попадать в объем раскрытия.
[00197] Описанная в данном документе технология дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые никоим образом не следует истолковывать как дополнительные ограничения.
[00198] Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретной методикой, протоколами и реагентами, и т.п., описанными в данном документе, и поэтому такие методики, протоколы и реагенты могут варьировать. Используемая в данном документе терминология служит только для описания конкретных вариантов реализации, и не предназначена для ограничения объема данного изобретения, который определен исключительно формулой изобретения.
II. зкДНК-вектор для редактирования генов
[00199] Варианты реализации изобретения основаны на способах и композициях, содержащих линейные дуплексные векторы с замкнутыми концами (зкДНК), которые могут экспрессировать трансген, представляющий собой молекулу для редактирования генов в клетке-хозяине (например, трансген представляет собой нуклеазу, такую как ZFN, TALEN, Cas; одну или несколько направляющих РНК; CRISPR; рибонуклеопротеин (RNP) или любую их комбинацию) и приводящих к более эффективному редактированию генома. зкДНК-векторы, описанные в данном документе, не ограничены по размеру, что позволяет, например, экспрессировать все компоненты, необходимые для системы редактирования генов, из одного вектора (например, системы редактирования генов CRISPR/Cas (например, фермента Cas9 или модифицированного Cas9, направляющей РНК и/или матрицы гомологично направляемой репарации) или для системы TALEN или цинкового пальца). Однако, предусматривается также наличие только одного или двух таких компонентов, кодируемых в одном векторе, в то время как остальные компоненты (компонент) могут экспрессироваться отдельным зкДНК-вектором или, например, традиционной плазмидой.
[00200] Один аспект данного документа относится к новому зкДНК-вектору для способа (способов) вставки (knock-in) ДНК, например, для введения одной или нескольких экзогенных донорных последовательностей в специфический сайт-мишень на клеточной хромосоме с высокой эффективностью. В дополнение к использованию одного или нескольких зкДНК-векторов для редактирования генов, при котором зкДНК-вектор содержит последовательности ITR, выбранные из любых из: (i) по меньшей мере одного ITR дикого типа (WT) и по меньшей мере одного модифицированного инвертированного концевого повтора AAV (mod-ITR) (например, асимметричные модифицированные ITR); (ii) двух модифицированных ITR, причем пара mod-ITR имеют различную трехмерную пространственную организацию друг относительно друга (например, асимметричные модифицированные ITR), или (iii) симметричной или по существу симметричной пары ITR WT-WT, причем каждый WT-ITR имеет такую же трехмерную пространственную организацию или (iv) симметричную или по существу симметричную модифицированную пару ITR, где каждый mod-ITR имеет такую же трехмерную пространственную организацию, способы и композиции, раскрытые в данном документе, могут дополнительно включать систему доставки, такую как, без ограничений, систему доставки на основе липосомных наночастиц. Неограничивающие примеры систем липосомных наночастиц, пригодных для использования, раскрыты в данном документе. В некоторых аспектах изобретение предусматривает липидную наночастицу, содержащую зкДНК для редактирования генов и ионизируемый липид. Например, состав липидных наночастиц, который изготовлен и нагружен зкДНК для редактирования генов, полученной указанным способом, раскрыт в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 года, которая включена в данный документ.
[00201] В данном документе предложены новые невирусные бескапсидные молекулы зкДНК с ковалентно-замкнутыми концами (зкДНК). Указанные невирусные бескапсидные молекулы зкДНК могут продуцироваться в пермиссивных клетках-хозяевах с экспрессионного конструкта (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, зкДНК-бакуловируса, или линии клеток в интегрированном состоянии), содержащего гетерологичный ген (трансген), расположенный между двумя разными последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR), при этом ITR отличаются друг от друга. В некоторых вариантах реализации один из ITR модифицируют путем делеции, вставки и/или замещения по сравнению с последовательностью ITR дикого типа (например, ITR AAV); и по меньшей мере один из ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения (trs) и Rep-связывающий сайт. зкДНК-вектор предпочтительно является дуплексным, например, самокомплементарным, по меньшей мере в части молекулы, такой как кассета экспрессии (например, зкДНК не является двухцепочечной кольцевой молекулой). зкДНК-вектор имеет ковалентно замкнутые концы и, таким образом, устойчив к экзонуклеазному гидролизу (например, экзонуклеазой I или экзонуклеазой III), например, в течение часа при 37°C.
[00202] зкДНК-векторы для редактирования генов, как описано в данном документе, не имеют ограничений, связанных с упаковкой, накладываемых ограниченным пространством внутри вирусного капсида. зкДНК-векторы представляют собой жизнеспособную эукариотически продуцируемую альтернативу прокариотически-продуцируемым векторам плазмидной ДНК, в отличие от инкапсулированных геномов AAV. Это позволяет вставлять контрольные элементы, например, регуляторные переключатели, как описано в данном документе, большие трансгены, множественные трансгены и т.д.
[00203] В одном аспекте зкДНК-вектор для редактирования генов содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), представляющую интерес нуклеотидную последовательность (например, экспрессионную кассету как описано в данном документе) и второй ITR AAV. В некоторых вариантах реализации первый ITR (5'-ITR) и второй ITR (3'-ITR) являются асимметричными друг относительно друга, т.е. они имеют разные трехмерные пространственные конфигурации. В качестве примерного варианта реализации первый ITR может представлять собой ITR дикого типа, а второй ITR может представлять собой мутированный или модифицированный ITR, или наоборот, когда первый ITR может представлять собой мутированный или модифицированный ITR, а второй ITR может представлять собой ITR дикого типа. В другом варианте реализации первый ITR и второй ITR оба являются модифицированными, но представляют собой разные последовательности, или имеют разные модификации, или не являются идентично модифицированными ITR, и имеют разные трехмерные пространственные конфигурации. Иными словами, зкДНК-вектор для редактирования генов с асимметричными ITR содержит такие ITR, что любые изменения в одном ITR по сравнению с WT-ITR не отражаются в другом ITR; или, в качестве альтернативы, асимметричные ITR представляют собой пару модифицированных асимметричных ITR, которые могут иметь разные последовательности и разную трехмерную форму друг относительно друга. Типичные примеры асимметричных ITR в зкДНК-векторе и для использования при получении зкДНК-плазмиды описаны ниже в разделе, озаглавленном «Асимметричные ITR».
[00204] В другом аспекте зкДНК-вектор для редактирования генов, который содержит, в направлении от 5' к 3': первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), представляющую интерес нуклеотидную последовательность (например, экспрессионную кассету, как описано в данном документе) и второй ITR AAV, при этом первый ITR (5'-ITR) и второй ITR (3'-ITR) симметричны или по существу симметричны друг относительно друга, т.е. зкДНК-вектор для редактирования генов может содержать ITR-последовательности, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве, или имеют одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве. В таком варианте реализации пара симметричных ITR или пара по существу симметричных ITR могут быть модифицированными ITR (например, mod-ITR), которые не являются ITR дикого типа. Пара mod-ITR могут иметь одну и ту же последовательность, которая имеет одну или несколько модификаций по сравнению с ITR дикого типа, и являются обратно комплементарными (инвертированными) друг относительно друга. В альтернативных вариантах реализации модифицированная пара ITR, по существу, является симметричной, как определено в данном документе, т.е. пара модифицированных ITR могут иметь разные последовательности, но аналогичную или одинаковую симметричную трехмерную форму. В некоторых вариантах реализации симметричные ITR или, по существу, симметричные ITR могут быть дикого типа (WT-ITR), как описано в данном документе. То есть оба ITR имеют последовательность дикого типа, но не обязательно должны быть WT-ITR, принадлежащими к одному и тому же серотипу AAV. Таким образом, в некоторых вариантах реализации один WT-ITR может принадлежать к одному серотипу AAV, а другой WT-ITR может принадлежать к другому серотипу AAV. В таком варианте реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. они могут иметь одну или несколько консервативных модификаций нуклеотидов, сохраняя при этом симметричную трехмерную пространственную организацию.
[00205] Симметричные ITR или по существу симметричные ITR описаны ниже в разделе, озаглавленном «Симметричные пары ITR».
[00206] Последовательности ITR дикого типа или мутированные или иным образом модифицированные, представленные в данном документе, представляют собой последовательности ДНК, включенные в экспрессионный конструкт (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду, зкДНК-бакуловирус) для продуцирования зкДНК-вектора. Соответственно, последовательности ITR, фактически содержащиеся в указанном зкДНК-векторе, продуцируемом с зкДНК-плазмиды или другого экспрессионного конструкта, могут быть или не быть идентичными последовательностям ITR по данному изобретению, что обусловлено естественными изменениями, происходящими в процессе получения (например, ошибкой репликации).
[00207] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, описанный в данном документе, содержащий экспрессионную кассету с трансгеном, который представляет собой молекулу для редактирования генов или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов, может быть функционально связан с одной или несколькими регуляторными последовательностями, которые допускают или контролируют экспрессию трансгена. В одном варианте реализации указанный полинуклеотид содержит последовательность первого ITR и последовательность второго ITR, причем нуклеотидная последовательность, представляющая интерес, фланкирована указанными последовательностями первого и второго ITR, и указанные последовательности первого и второго ITR являются асимметричными друг относительно друга или симметричными друг относительно друга.
[00208] В одном варианте реализации в каждом из указанных аспектов экспрессионная кассета расположена между двумя ITR, содержащимися, в следующем порядке, вместе с чем-либо одним или более из перечисленного: промотор, функционально связанный с трансгеном, посттранскрипционный регуляторный элемент; и сигнал полиаденилирования и терминации. В одном варианте реализации промотор является регулируемым - индуцибельным или репрессируемым. Промотор может представлять собой любую последовательность, которая облегчает транскрипцию трансгена. В одном варианте реализации указанный промотор представляет собой промотор CAG (например, SEQ ID NO: 03) или его вариант. Указанный посттранскрипционный регуляторный элемент представляет собой последовательность, которая модулирует экспрессию трансгена, в неограничивающем примере - любую последовательность, образующая третичную структуру, которая усиливает экспрессию трансгена, представляющего собой молекулу для редактирования генов или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов.
[00209] В одном варианте реализации указанный посттранскрипционный регуляторный элемент содержит WPRE (например, SEQ ID NO: 08). В одном варианте реализации указанный сигнал полиаденилирования и терминации содержит поли(A) BGH (например, SEQ ID NO: 09). Дополнительно может быть использован любой цис-регуляторный элемент, известный в данной области техники, или их комбинация, например, энхансерная 5'-последовательность позднего сигнала полиаденилирования SV40 (USE), или другие элементы посттранскрипционного процессинга, в том числе, без ограничений, ген тимидинкиназы вируса простого герпеса или вируса гепатита B (HBV). В одном варианте реализации длина экспрессионной кассеты в 5'-3' направлении больше известной максимальной длины последовательности, заключаемой в капсид вириона AAV. В одном варианте реализации указанная длина составляет более 4,6 т.п.о., или более 5 т.п.о., или более 6 т.п.о., или более 7 т.п.о.Примеры различных экспрессионных кассет приведены в данном документе.
[00210] Указанная экспрессионная кассета может содержать более 4000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов или 20000 нуклеотидов, или 30000 нуклеотидов, или 40000 нуклеотидов, или 50000 нуклеотидов, или любой диапазон значений в пределах между примерно 4000 и 10000 нуклеотидов, или 10000-50000 нуклеотидов, или более 50000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации указанная кассета экспрессии может содержать трансген, который представляет собой молекулу для редактирования генов, или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов, имеющий длину в диапазоне от 500 до 50000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации указанная кассета экспрессии может содержать трансген, который представляет собой молекулу для редактирования генов, или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов, имеющий длину в диапазоне от 500 до 75000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации указанная кассета экспрессии может содержать трансген, который представляет собой молекулу для редактирования генов, или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов, имеющий длину в диапазоне от 500 до 10000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации указанная кассета экспрессии может содержать трансген, который представляет собой молекулу для редактирования генов, или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов, имеющий длину в диапазоне от 1000 до 10000 нуклеотидов. В некоторых вариантах реализации указанная кассета экспрессии может содержать трансген, который представляет собой молекулу для редактирования генов, или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов, имеющий длину в диапазоне от 500 до 5000 нуклеотидов. зкДНК-векторы не имеют ограничений по размеру, как инкапсидированные AAV-векторы и, соответственно, позволяют обеспечить доставку экспрессионной кассеты большого размера для обеспечения эффективной экспрессии трансгена, который представляет собой молекулу для редактирования генов, или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор лишен специфического прокариотического метилирования.
[00211] Кассета экспрессии также может содержать внутренний сайт входа в рибосому (IRES) и/или 2А-элемент. Цис-регуляторные элементы включают, без ограничений, промотор, рибопереключатель, инсулятор, mir-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации ITR может выступать в роли промотора для трансгена. В некоторых вариантах реализации указанный зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии указанного трансгена, например, регуляторные переключатели, которые описаны в данном документе в разделе «Регуляторные переключатели», для контроля и регуляции экспрессии указанного трансгена, и может содержать, при необходимости, регуляторный переключатель, который представляет собой «аварийный выключатель», позволяющий обеспечивать контролируемую клеточную смерть клетки, содержащей зкДНК-вектор.
[00212] На Фиг. 1А-1Е приведены схематические изображения неограничивающих примеров зкДНК-векторов, или соответствующая последовательность зкДНК-плазмид. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены с плазмиды, кодирующей, в указанном порядке: первый ITR, экспрессируемую трансгенную кассету и второй ITR, при этом по меньшей мере одна из последовательностей первого и/или второго ITR мутирована относительно соответствующей последовательности ITR AAV2 дикого типа. Кассета предпочтительно включает один или несколько из следующих элементов, в указанном порядке: энхансер/промотор, ORF-репортер (трансген), посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, polyA BGH).
[00213] Экспрессионная кассета может содержать любой трансген, который представляет собой молекулу для редактирования гена, или последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования гена. зкДНК-вектор для редактирования генов редактирует любой представляющий интерес ген у субъекта, включая, без ограничений, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, или некодирующие нуклеиновые кислоты (например, RNAi, miRs и т.д.), а также экзогенные гены и нуклеотидные последовательности, включая вирусные последовательности в геноме субъекта, например, последовательности вируса ВИЧ и т.п. Предпочтительно, зкДНК-вектор для редактирования генов, раскрытый в данном документе, используется для терапевтических целей (например, для медицинского, диагностического или ветеринарного применения), или иммуногенных полипептидов. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для редактирования генов может редактировать любой представляющий интерес ген у субъекта, который включает один или несколько полипептидов, пептидов, рибозимов, пептидных нуклеиновых кислот, миРНК, интерферирующих РНК (RNAi), антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов, антител, антигенсвязывающих фрагментов, или любую их комбинацию.
[00214] Экспрессионная кассета зкДНК может включать, например, экспрессируемую экзогенную последовательность (например, открытую рамку считывания), кодирующую белок, который либо отсутствует, либо неактивен, либо недостаточно активен у субъекта-реципиента, или ген, кодирующий белок, который имеет желаемый биологический или терапевтический эффект. Экзогенная последовательность, такая как донорная последовательность, может кодировать продукт гена, который может функционировать для коррекции экспрессии дефектного гена или транскрипта. Кассета экспрессии может также кодировать корректирующие цепи ДНК, кодировать полипептиды, смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды или РНК (кодирующие или некодирующие; например, миРНК, малые шпилечные РНК (shRNA), микро-РНК и их антисмысловые аналоги (например, антагомир (antagoMiR)). Кассеты экспрессии могут включать экзогенную последовательность, которая кодирует репортерный белок, который будет использоваться для экспериментальных или диагностических целей, такой как β-лактамаза, β-галактозидаза (LacZ), щелочная фосфатаза, тимидинкиназа, зеленый флуоресцентный белок (GFP), хлорамфениколацетилтрансфераза (CAT), люцифераза и другие, хорошо известные в данной области техники.
[00215] В принципе, кассета экспрессии может включать любой ген, кодирующий белок, полипептид или РНК, который либо редуцирован, либо отсутствует из-за мутации, либо который приносит терапевтическую пользу, когда сверхэкспрессия считается входящей в объем изобретения. Указанный зкДНК-вектор может содержать матричную или донорную нуклеотидную последовательность, используемую в качестве корректирующей цепи ДНК, которая должна быть вставлена после двухцепочечного разрыва (или ника), обеспечиваемого нуклеазой. зкДНК-вектор может включать матричную нуклеотидную последовательность, используемую в качестве корректирующей цепи ДНК для вставки после двухцепочечного разрыва (или ника), обеспечиваемого направляемой РНК нуклеазой, мегануклеазой или нуклеазой цинкового пальца. Предпочтительно, невставленная бактериальная ДНК не присутствует и, предпочтительно, бактериальная ДНК не присутствует в композициях зкДНК, представленных в данном документе. В некоторых случаях белок может изменять кодон без ника.
[00216] Последовательности, представленные в кассете экспрессии, конструкте экспрессии или донорной последовательности зкДНК-вектора, описанного в данном документе, могут быть оптимизированы по кодонам для клетки-хозяина. Используемый в данном документе термин «оптимизированный по кодонам» или «оптимизация по кодонам» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках позвоночного животного, представляющего интерес, например, мыши или человека, путем замены по меньшей мере одного, более чем одного, или значительного количества кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах этого позвоночного животного. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с использованием, например, платформы оптимизации кодонов и синтеза генов на заказ Aptagen Gene Forge® (Aptagen, Inc., 2190 Fox Mill Rd. Suite 300, Herndon, Va. 20171) или другой общедоступной базы данных.
[00217] Многие организмы демонстрируют тенденцию к использованию определенных кодонов для кодирования вставки конкретной аминокислоты в растущую пептидную цепь. Предпочтение кодонов или неоднозначность кодонов, различия в использовании кодонов между организмами, обусловлены вырожденностью генетического кода и хорошо документированы для многих организмов. Смещение кодонов часто коррелирует с эффективностью трансляции матричной РНК (мРНК), которая, в свою очередь, считается зависимой, в частности, от свойств транслируемых кодонов и доступности определенных транспортных РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке обычно отображает кодоны, наиболее часто используемые в синтезе пептидов. Соответственно, гены могут быть адаптированы для оптимальной экспрессии генов в данном организме на основе оптимизации кодонов.
[00218] Учитывая большое количество доступных последовательностей генов для широкого спектра видов животных, растений и микробов, можно рассчитать относительные частоты использования кодонов (Nakamura Y., et al. “Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000” Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)).
[00219] В некоторых вариантах реализации ген для редактирования генов (например, донорные последовательности) или направляющая РНК нацелены на терапевтический ген. В некоторых вариантах реализации направляющая РНК нацелена на антитело или фрагмент антитела, или его антигенсвязывающий фрагмент, например, нейтрализующее антитело или фрагмент антитела и т.п.
[00220] В частности, ген для редактирования генов (например, донорные последовательности) или направляющая РНК нацелены на один или несколько терапевтических агентов, включая, без ограничений, например, белок (белки), полипептид(ы), пептид(ы) фермент(ы), антитела, антигенсвязывающие фрагменты, а также их варианты и/или активные фрагменты для использования в лечении, профилактике и/или облегчении одного или нескольких симптомов заболевания, дисфункции, поражения и/или расстройства. Типичные гены для нацеливания с помощью направляющей РНК описаны в данном документе в разделе, озаглавленном «Способ лечения».
[00221] Существует много структурных особенностей зкДНК-векторов, которые отличаются от векторов экспрессии на основе плазмид. зкДНК-векторы могут характеризоваться одним или более из следующих признаков: отсутствие исходной (т.е. не-инсертированной) бактериальной ДНК, отсутствие прокариотической точки начала репликации, автономность, т.е. они не требуют наличия каких-либо последовательностей, кроме двух ITR, включающих Rep-связывающий сайт и сайт концевого разрешения (RBS и TRS), и экзогенной последовательности между указанными ITR, присутствие последовательностей ITR, которые образуют шпильки, эукариотического происхождения (т.е. они продуцируются в эукариотических клетках); и отсутствие метилирования ДНК бактериального типа или же любого другого метилирования, воспринимаемого как аномальное млекопитающим-хозяином. В целом, предпочтительно, чтобы предложенные векторы не содержали какой-либо прокариотической ДНК, однако предусматривается возможность инсерции какой-либо прокариотической ДНК в виде экзогенной последовательности, в качестве неограничивающего примера, в промоторной или энхансерной области. Другой важный признак, отличающий зкДНК-векторы от плазмидных экспрессионных векторов, заключается в том, что зкДНК-векторы представляют собой одноцепочечную линейную ДНК с замкнутыми концами, тогда как плазмиды всегда представлены двуцепочечной ДНК.
[00222] зкДНК-векторы для редактирования генов, полученные способами, представленными в данном документе, предпочтительно имеют линейную и непрерывную структуру, а не прерывистую структуру, при определении с помощью анализа расщепления рестриктазой (Фиг. 4D). Линейная и непрерывная структура считается более стабильной при атаке клеточных эндонуклеаз, а также с меньшей вероятностью подвергается рекомбинации и вызывает мутагенез. Таким образом, зкДНК-вектор для редактирования генов, имеющий линейную и непрерывную структуру, представляет собой предпочтительный вариант реализации. Непрерывный, линейный, одноцепочечный зкДНК-вектор с внутримолекулярными дуплексами может содержать ковалентно связанные концы, без последовательностей, кодирующих белки капсида AAV. Указанные зкДНК-векторы для редактирования генов структурно отличаются от плазмид (в том числе зкДНК-плазмид, описанных в данном документе), которые представляют собой кольцевые дуплексные молекулы нуклеиновых кислот бактериального происхождения. Комплементарные цепи плазмид могут быть разделены после денатурации с получением двух молекул нуклеиновой кислоты, тогда как зкДНК-векторы, напротив, хотя и содержат комплементарные цепи, представляют собой одну молекулу ДНК и, соответственно, даже после денатурации остаются в виде одной молекулы. В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут быть получены без метилирования оснований ДНК прокариотического типа, в отличие от плазмид. Соответственно, зкДНК-векторы и зкДНК-плазмиды отличаются как структурой (в частности, линейной или кольцевой), так и способами, применяемыми для получения и очистки указанных отличающихся объектов (см. ниже), а также характером метилирования ДНК, которое происходит по прокариотическому типу в зкДНК-плазмидах и по эукариотическому типу в зкДНК-векторе.
[00223] Существует несколько преимуществ использования зкДНК-вектора, как описано в данном документе, для редактирования генов по сравнению с векторами экспрессии на основе плазмиды, такие преимущества включают, без ограничений: 1) плазмиды содержат последовательности бактериальной ДНК и подвергаются специфическому прокариотическому метилированию, например, метилированию с образованием 6-метиладенозина и 5-метилцитозина, тогда как бескапсидные последовательности AAV-вектора имеют эукариотическое происхождение и не подвергаются специфическому прокариотическому метилированию; в результате бескапсидные AAV-векторы с меньшей вероятностью будут индуцировать воспалительные и иммунные ответы по сравнению с плазмидами; 2) если плазмиды требуют наличия гена устойчивости в процессе получения, то зкДНК-векторы - нет; 3) если кольцевая плазмида не доставляется в ядро при введении в клетку и требует избыточной нагрузки, чтобы обойти разложение клеточными нуклеазами, то зкДНК-векторы содержат вирусные цис-элементы, т.е. ITR, придающие устойчивость к нуклеазам, и могут быть сконструированы для нацеливания и доставки в ядро. Выдвинуто предположение, что минимальными определяющими элементами, обязательными для функции ITR, являются Rep-связывающий сайт (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) для AAV2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTTGG-3' (SEQ ID NO: 48) для AAV2), плюс вариабельная палиндромная последовательность, обеспечивающая образование шпильки; и 4) зкДНК-векторы не характеризуются часто обнаруживаемой в происходящих из прокариот плазмидах чрезмерной представленностью CpG-динуклеотидов, которые, по имеющимся данным, связываются с представителем Toll-подобного семейства рецепторов, вызывая опосредованный T-клетками иммунный ответ. Напротив, трансдукция бескапсидными AAV-векторами, раскрытыми в данном документе, может обеспечивать эффективное нацеливание на типы клеток и тканей, которые трудно трансдуцировать стандартными вирионами AAV, с применением различных реагентов для доставки.
III. Встраивание желаемой последовательности нуклеиновой кислоты
[00224] Описанные в данном документе зкДНК-векторы для редактирования генов, способы и композиции можно использовать для введения новой последовательности нуклеиновой кислоты, исправления мутации в геномной последовательности или введения мутации в последовательность гена-мишени в клетке-хозяине. Такие методы могут быть названы «системы встраивания в ДНК». Система встраивания в ДНК (DNA knock-in), как описано в данном документе, позволяет вставлять донорные последовательности в любой желаемый сайт-мишень с высокой эффективностью, обеспечивая возможность их использования во многих областях применения, таких как создание трансгенных животных, экспрессирующих экзогенные гены, получение моделей заболевания на клеточных культурах, подготовка скрининговых систем анализа, модификация экспрессии генов сконструированных тканевых конструктов, модификация (например, мутирование) геномного локуса и редактирование генов, например, путем добавления в геном экзогенной некодирующей последовательности (такой как метки последовательности или регуляторные элементы). Клетки и животные, полученные с использованием способов, представленных в данном документе, могут найти различные применения, например, в качестве клеточной терапии, как модели заболеваний, в качестве инструментов исследования и в качестве гуманизированных животных, полезных для различных целей.
[00225] Системы встраивания в ДНК по данному изобретению также делают возможными методы редактирования генов с использованием больших донорных последовательностей (<5 т.п.о.) для вставки в любом желаемом сайте-мишени генома, обеспечивая, таким образом, редактирование более крупных генов, чем это позволяют современные методы. Некоторые варианты реализации включают большие гомологичные плечи, например, от 50 пар оснований до двух тысяч пар оснований, обеспечивающие редактирование генов с высокой эффективностью (более высокая точность (on-target)) и высокой специфичностью (меньшая степень неточности (off-target)), а в некоторых вариантах реализации - HDR без использование нуклеаз.
[002226] Системы встраивания в ДНК по данному изобретению также предоставляют несколько преимуществ, касающихся введения донорных последовательностей для редактирования генов. Во-первых, введению зкДНК-векторов, как описано в данном документе, в частицах для доставки по данному изобретению не препятствует базовый иммунитет и, следовательно, они могут быть введены любому и, потенциально, всем пациентам с конкретным расстройством. Во-вторых, введение частиц по данному изобретению не создает адаптивного иммунного ответа на доставляемое терапевтическое средство, подобного тому, который обычно вызывают системы доставки на основе вирусного вектора, и поэтому варианты реализации могут при необходимости вводиться повторно для клинического эффекта. Введение одного или нескольких зкДНК-векторов в соответствии с данным изобретением, такое как доставка in vivo, является повторяемым и надежным.
[00227] В некоторых вариантах реализации редактирование генов с помощью зкДНК-векторов по данному изобретению можно контролировать с помощью соответствующих биомаркеров от получающих лечение пациентов для оценки эффективности коррекции гена, и повторные введения терапевтического продукта могут производиться до тех пор, пока не будет достигнут соответствующий уровень редактирования генов.
[00228] В другом аспекте, предложен способ генерирования генетически модифицированного животного путем использования системы встраивания гена, описанной в данном документе, с зкДНК-векторами по данному изобретению. Эти методы дополнительно описаны ниже.
[00229] В некоторых вариантах реализации данное изобретение относится к способам использования зкДНК-вектора для вставки донорной последовательности в предварительно определенном сайте вставки на хромосоме клетки-хозяина, такой как эукариотическая или прокариотическая клетка.
IV. Компоненты системы редактирования генов - Общие положения
[00230] В других вариантах реализации, таких как включающие РНК-направляемую нуклеазу, компоненты, необходимые для редактирования генов, могут включать нуклеазу, направляющую РНК (при использовании Cas9 или чего-то подобного), донорную последовательность и одно или несколько гомологичных плеч, включенных в один зкДНК-вектор по данному изобретению. Такие варианты реализации повышают эффективность редактирования генов по сравнению с подходами, которые требуют отдельных или различных частиц для доставки компонентов редактирования генов.
[00231] В других вариантах реализации нуклеаза может быть инактивирована/уменьшена после редактирования генов, уменьшая или исключая нецелевое редактирование, если таковое возможно, которое в противном случае могло бы происходить при сохранении введенной нуклеазы в клетках.
[00232] В другом аспекте данное изобретение относится к наборам, включающим один или несколько зкДНК-векторов для использования в любом из способов, описанных в данном документе.
[00233] Способы и композиции, описанные в данном документе, также предусматривают системы редактирования генов, содержащие клеточный переключатель, например, как описано Oakes et al. Nat. Biotechnol. 34:646-651 (2016), содержание которого в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
[00234] Также специально предусматривается, что способы и композиции, описанные в данном документе, могут осуществляться с высокой пропускной способностью с использованием способов, известных в данной области техники (см., например, Shalem et al. Nat Rev Genet 16:299-311 (2015); Shalem et al. Science 343:84-88 (2014), содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
V. ITR
[00299] Как описано в данном документе, зкДНК-векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования генов, расположенную между двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR), при этом последовательности ITR могут представлять собой асимметричную пару ITR или симметричную или по существу симметричную пару ITR, как эти термины определены в данном документе. зкДНК-вектор для редактирования генов, раскрытый в данном документе, может содержать последовательности ITR, которые выбраны из любого из: (i) по меньшей мере, одного ITR дикого типа (WT ITR) и, по меньшей мере, одного модифицированного инвертированного концевого повтора AAV (mod-ITR) (например, асимметричных модифицированных ITR); (ii) двух модифицированных ITR, причем пара mod-ITR имеет различную трехмерную пространственную организацию друг относительно друга (например, асимметричных модифицированных ITR), или (iii) симметричной или по существу симметричной пары WT-WT ITR, в которой каждый WT-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, или (iv) симметричной или по существу симметричной модифицированной пары ITR, в которой каждый mod-ITR имеет одинаковую трехмерную пространственную организацию, при этом способы по данному изобретению могут дополнительно включать систему доставки, такую как, без ограничений, система доставки на основе липосомных наночастиц.
[00236] А. Симметричные пары ITR
[00237] В некоторых вариантах реализации последовательность ITR может быть взята из вирусов семейства Parvoviridae, включающего два подсемейства: Parvovirinae, которые инфицируют позвоночных, и Densovirinae, которые инфицируют насекомых. Подсемейство Parvovirinae (называемое «парвовирусами») включает род Dependovirus, представителям которого для продуктивной инфекции, в большинстве условий, требуется коинфекция хелперным вирусом, таким как аденовирус или герпесвирус. Род Dependovirus включает аденоассоциированный вирус (AAV), обычно инфицирующий человека (например, серотипы 2, 3A, 3B, 5 и 6) или приматов (например, серотипы 1 и 4), и родственные вирусы, которые инфицируют других теплокровных животных (например, аденоассоциированные вирусы бычьих, собачьих, лошадиных и овечьих). Парвовирусы и другие представители семейства Parvoviridae в общем описаны в Kenneth I. Berns, "Parvoviridae: The Viruses and Their Replication," Chapter 69 in FIELDS VIROLOGY (3d Ed. 1996).
[00238] Хотя ITR, приведенные для иллюстрации в данном документе в описании и Примерах, представляют собой WT-ITR AAV2, специалисту в данной области техники известно, что, как было указано выше, можно использовать ITR из любого известного парвовируса, например, депендовируса, такого как AAV (например, из генома AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ и AAV-DJ8. Например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), химерные ITR или ITR из любого синтетического AAV. В некоторых вариантах реализации AAV может инфицировать теплокровных животных, например, аденоассоциированные вирусы птиц (AAAV), бычьих (BAAV), собачьих, лошадиных и овечьих. В некоторых вариантах реализации указанный ITR взят из парвовируса B19 (GenBank, № доступа NC 000883), мелкого вируса мышей (MVM) (GenBank, № доступа NC 001510); парвовируса гусей (GenBank, № доступа NC 001701); парвовируса змей 1 (GenBank, № доступа NC 006148). В некоторых вариантах реализации 5'-WT-ITR может быть от одного серотипа, а 3'-WT-ITR от другого серотипа, как описано в данном документе.
[00239] Среднему специалисту в данной области техники известно, что последовательности ITR устроены одинаково и содержат двуцепочечную структуру Холлидея, которая, как правило, представляет собой T-образную или Y-образную шпилечную структуру (см., например, Фиг. 2A и Фиг. 3A ), при этом каждый ITR образован двумя палиндромными плечами или петлями (B-B' и C-C'), встроенными в палиндромное плечо большего размера (A-A'), и одноцепочечной последовательностью D (где порядок указанных палиндромных последовательностей определяет поворот ориентации ITR). См., например, описание структурного анализа и сравнения последовательностей ITR из разных серотипов AAV (AAV1-AAV6) в источниках Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; Yan et al., J. Virology, 2005; 364-379; Duan et al., Virology 1999; 261; 8-14. Специалист в данной области техники может легко определить последовательности WT-ITR из любого серотипа AAV для применения в зкДНК-векторе или зкДНК-плазмиде, на основании примеров последовательностей ITR AAV2, приведенных в данном документе. См., например, сравнение последовательностей ITR из разных серотипов AAV (AAV1-AAV6, и AAV птиц (AAAV) и бычий AAV (BAAV)), описанные в: Grimm et al., J. Virology, 2006; 80(1); 426-439; где приведен % идентичности левого ITR AAV2 с левым ITR из других серотипов: AAV-1 (84%), AAV-3 (86%), AAV-4 (79%), AAV-5 (58%), AAV-6 (левый ITR) (100%) и AAV-6 (правый ITR) (82%).
[00240] Как обсуждалось в данном документе, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для редактирования генов может содержать симметричные последовательности ITR (например, симметричную пару ITR), при этом 5'-ITR и 3'-ITR могут иметь одинаковую симметричную трехмерную организацию по отношению друг к другу (т.е. симметричную или по существу симметричную). Таким образом, зкДНК-вектор для редактирования генов содержит последовательности ITR, которые имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве или имеет одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве (т.е. они одинаковы или являются зеркальным отражением друг друга). В таком варианте реализации пара симметричных ITR или пара по существу симметричных ITR могут быть модифицированными ITR (например, mod-ITR), которые не являются ITR дикого типа. Пара mod-ITR могут иметь одинаковые последовательности, которые имеют одну или несколько модификаций по сравнению с ITR дикого типа, и являются обратно комплементарными (инвертированными) друг относительно друга. В альтернативных вариантах реализации модифицированная пара ITR, по существу, является симметричной, как определено в данном документе, т.е. пара модифицированных ITR могут иметь разные последовательности, но аналогичную или одинаковую симметричную трехмерную форму.
[00241] (i) ITR дикого типа
[00242] В некоторых вариантах реализации симметричные ITR или по существу симметричные ITR относятся к дикому типу (WT-ITR), как описано в данном документе. То есть оба ITR имеют последовательность дикого типа, но не обязательно должны быть WT-ITR, принадлежащими к одному и тому же серотипу AAV. Таким образом, в некоторых вариантах реализации один WT-ITR может принадлежать к одному серотипу AAV, а другой WT-ITR может принадлежать к другому серотипу AAV. В таком варианте реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. они могут иметь одну или несколько консервативных модификаций нуклеотидов, сохраняя при этом симметричную трехмерную пространственную организацию.
[00243] Соответственно, как описано в данном документе, зкДНК-векторы для редактирования генов содержат последовательность редактирования генов, расположенную между двумя фланкирующими последовательностями инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR), которые являются либо обратно комплементарными (инвертированными) относительно друг друга, либо, альтернативно, являются по существу симметричными друг относительно друга - то есть пары WT-ITR имеют симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации последовательность ITR дикого типа (например, WT-ITR AAV) содержит функциональный Rep-связывающий сайт (RBS; например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' для AAV2, SEQ ID NO: 531) и функциональный сайт концевого разрешения (TRS; например, 5'-AGTT-3', SEQ ID NO: 46).
[00244] В одном аспекте зкДНК-векторы для редактирования генов можно получить из векторного полинуклеотида, который кодирует гетерологичную нуклеиновую кислоту, функционально расположенную между двумя инвертированными концевыми последовательностями дикого типа (WT-ITR) (например, WT-ITR AAV). То есть оба ITR имеют последовательность дикого типа, но не обязательно должны быть WT-ITR, принадлежащими к одному и тому же серотипу AAV. Таким образом, в некоторых вариантах реализации один WT-ITR может принадлежать к одному серотипу AAV, а другой WT-ITR может принадлежать к другому серотипу AAV. В таком варианте реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. они могут иметь одну или несколько консервативных модификаций нуклеотидов, сохраняя при этом симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации 5'-WT-ITR относится к одному серотипу AAV, а 3'-WT-ITR относится к тому же или другому серотипу AAV. В некоторых вариантах реализации 5'-WT-ITR и 3'-WT-ITR являются зеркальными изображениями друг друга, т.е. они симметричны. В некоторых вариантах реализации 5'-WT-ITR и 3'-WT-ITR относятся к одному и тому же серотипу AAV.
[00245] WT ITR хорошо известны. В одном варианте реализации два ITR имеют один и тот же серотип AAV2. В некоторых вариантах реализации можно использовать WT из других серотипов. Существует ряд серотипов, которые являются гомологичными, например, AAV2, AAV4, AAV6, AAV8. В одном варианте реализации могут использоваться близко гомологичные ITR (например, ITR с аналогичной структурой петли). В другом варианте реализации можно использовать WT-ITR AAV с большей степенью различий, например, AAV2 и AAV5, и еще в одном варианте реализации можно использовать ITR, который по существу относится к WT, т.е. он имеет базовую структуру петли, характерную для WT, но содержит некоторые консервативные замены нуклеотидов, которые не изменяют или не влияют на свойства. При использовании WT-ITR из одного и того же вирусного серотипа может быть дополнительно использована одна или несколько регуляторных последовательностей. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность представляет собой регуляторный переключатель, который позволяет модулировать активность зкДНК.
[00246] В некоторых вариантах реализации один из аспектов технологии, описанной в данном документе, относится к невирусному бескапсидному ДНК с ковалентно замкнутыми концами (зкДНК-вектор), при этом зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность, функционально расположенную между двумя последовательности инвертированных концевых повторов дикого типа (WT-ITR), причем WT-ITR могут принадлежать к одному и тому же серотипу, разным серотипам, или быть по существу симметричными друг относительно друга (т.е. иметь симметричную трехмерную пространственную организацию, так что их структура имеет одинаковую форму в геометрическом пространстве или иметь одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве). В некоторых вариантах реализации симметричные WT-ITR содержат функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт. В некоторых вариантах реализации гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует трансген и при этом вектор не заключен в вирусном капсиде.
[00247] В некоторых вариантах реализации WT-ITR являются одинаковыми, но обратно комплементарными друг относительно друга. Например, последовательности AACG в 5'-ITR может соответствовать CGTT (т.е. обратный комплемент) в соответствующем сайте 3'-ITR. В одном примере смысловая цепь 5'-WT-ITR содержит последовательность ATCGATCG, а соответствующая смысловая цепь 3'-WT-ITR содержит CGATCGAT (т.е. обратный комплемент ATCGATCG). В некоторых вариантах реализации зкДНК WT-ITR дополнительно содержит сайт концевого разрешения и сайт связывания белка репликации (RPS) (иногда называемый сайтом связывания репликативного белка), например, Rep-связывающий сайт.
[00248] Типичные последовательности WT-ITR для использования в зкДНК-векторах, содержащих WT-ITR, приведены в Таблице 2, где представлены пары WT-ITR (5'-WT-ITR и 3'-WT-ITR).
[00249] В качестве типичного примера, данное изобретение предлагает ДНК-вектор с замкнутыми концами, содержащий промотор, функционально связанный с трансгеном (например, последовательностью редактирования гена), с регуляторным переключателем или без него, при этом зкДНК лишена капсидных белков и: (а) продуцируется из зкДНК-плазмиды (например, см. Фиг. 1F-1G), которая кодирует WT-ITR, причем каждый WT-ITR имеет одинаковое количество пар оснований внутримолекулярных дуплексов в своей вторичной конфигурации шпильки (предпочтительно, исключая делецию любой концевой петли AAA или TTT в этой конфигурации по сравнению с такими референсными последовательностями), и (b) идентифицируется как зкДНК с использованием анализа идентификации зкДНК методом электрофореза в агарозном геле в нативном геле и в денатурирующих условиях в Примере 1.
[00250] В некоторых вариантах реализации фланкирующие WT-ITR по существу симметричны друг другу. В этом варианте реализации 5'-WT-ITR может быть от одного серотипа AAV, а 3'-WT-ITR - от другого серотипа AAV, так что WT-ITR не являются идентичными обратными комплементами. Например, 5'-WT-ITR может быть от AAV2, а 3'-WT-ITR - от другого серотипа (например, AAV1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12). В некоторых вариантах реализации WT-ITR могут быть выбраны из двух разных парвовирусов, выбранных из любых из: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, парвовируса змеи (например, парвовируса королевского питона), бычьего парвовируса, парвовируса коз, парвовируса птиц, парвовируса собак, парвовируса лошадей, парвовируса креветок, парвовируса свиней или AAV насекомых. В некоторых вариантах реализации такая комбинация WT-ITR является комбинацией WT-ITR из AAV2 и AAV6. В одном варианте реализации, WT-ITR являются по существу симметричными, когда один из них является инвертированным относительно другого ITR, по меньшей мере на 90% идентичного (when one is inverted relative to the other ITR at least 90% identical), по меньшей мере на 95% идентичного, по меньшей мере на 96% … 97% … 98% … 99% … 99,5%, включая все промежуточные значения, и имеет такую же симметричную трехмерную пространственную организацию. В некоторых вариантах реализации пара WT-ITR является по существу симметричной, поскольку они имеют симметричную трехмерную пространственную организацию, например, имеют одинаковую трехмерную организацию A, C-C', B-B' и D-плеч. В одном варианте реализации, по существу симметричная пара WT-ITR инвертирована друг относительно друга и идентична по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96% … 97% … 98% … 99% … 99,5%, включая все промежуточные значения, и один WT-ITR сохраняет Rep-связывающий сайт (RBS) 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) и сайт концевого разрешения (trs). В некоторых вариантах реализации, по существу симметричная пара WT-ITR инвертированы друг относительно друга и являются по меньшей мере на 95% идентичными, по меньшей мере на 96% … 97% … 98% … 99% … 99,5%, включая все промежуточные значения, и один WT-ITR сохраняет Rep-связывающий сайт (RBS) 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) и сайт концевого разрешения (trs), и в дополнение к вариабельной палиндромной последовательности, позволяющей формировать вторичную структуру шпильки. Гомология может быть определена стандартными средствами, хорошо известными в данной области техники, такими как BLAST (Basic Local Alignment Search Tool (простое средство поиска локальных соответствий)), BLASTN, при настройках по умолчанию.
[00251] В некоторых вариантах реализации структурным элементом ITR может быть любой структурный элемент, который участвует в функциональном взаимодействии ITR с большим белком Rep (например, Rep 78 или Rep 68). В некоторых вариантах реализации указанный структурный элемент обеспечивает селективность взаимодействия ITR с большим белком Rep, т.е. определяет, по меньшей мере отчасти, какой белок Rep функционально взаимодействует с ITR. В других вариантах реализации структурный элемент физически взаимодействует с большим белком Rep при связывании указанного белка Rep с ITR. Каждый структурный элемент может быть, например, вторичной структурой ITR, нуклеотидной последовательностью ITR, расстоянием между двумя или более элементами или комбинацией любых из вышеперечисленных элементов. В одном варианте реализации указанные структурные элементы выбраны из группы, состоящей из плеча A и плеча A', плеча B и плеча B', плеча C и плеча C', плеча D, сайта связывания Rep (RBE) и RBE' (т.е. последовательности, комплементарной RBE), и сайта концевого разрешения (trs).
[00252] Только в качестве примера, Таблица 1 указывает примеры комбинаций WT-ITR.
[00253] Таблица 1: Иллюстративные комбинации WT-ITR одного и того же серотипа или разных серотипов или разных паровирусов. Указанный порядок не указывает на положение ITR, например, «AAV1, AAV2» демонстрирует, что зкДНК может содержать WT-ITR AAV1 в положении 5' и WT-ITR AAV2 в положении 3' или, наоборот, WT-ITR AAV2 в положении 5' и WT-ITR AAV1 в положении 3'. Сокращения: AAV серотипа 1 (AAV1), AAV серотипа 2 (AAV2), AAV серотипа 3 (AAV3), AAV серотипа 4 (AAV4), AAV серотипа 5 (AAV5), AAV серотипа 6 (AAV6), AAV серотипа 7 (AAV7), AAV серотипа 8 (AAV8), AAV серотипа 9 (AAV9), AAV серотипа 10 (AAV10), AAV серотипа 11 (AAV11) или AAV серотипа 12 (AAV12); геном AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ и AAV-DJ8 (например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261), ITR теплокровных животных (птичий AAV (AAAV), бычий AAV (BAAV), AAV собак, лошадей и овец), ITR из парвовируса B19 (GenBank, № доступа: NC 000883), минутный вирус мыши (MVM) (GenBank, № доступа NC 001510); Гуси: парвовирус гусей (GenBank, № доступа NC 001701); змеи: змеиный парвовирус 1 (GenBank, № доступа NC 006148).
ТАБЛИЦА 1
AAV1, AAV1 AAV2, AAV2 AAV3, AAV3 AAV4, AAV4 AAV5, AAV5
AAV1, AAV2 AAV2, AAV3 AAV3, AAV4 AAV4, AAV5 AAV5, AAV6
AAV1, AAV3 AAV2, AAV4 AAV3, AAV5 AAV4, AAV6 AAV5, AAV7
AAV1, AAV4 AAV2, AAV5 AAV3, AAV6 AAV4, AAV7 AAV5, AAV8
AAV1, AAV5 AAV2, AAV6 AAV3, AAV7 AAV4, AAV8 AAV5, AAV9
AAV1, AAV6 AAV2, AAV7 AAV3, AAV8 AAV4, AAV9 AAV5, AAV10
AAV1, AAV7 AAV2, AAV8 AAV3, AAV9 AAV4, AAV10 AAV5, AAV11
AAV1, AAV8 AAV2, AAV9 AAV3, AAV10 AAV4, AAV11 AAV5, AAV12
AAV1, AAV9 AAV2, AAV10 AAV3, AAV11 AAV4, AAV12 AAV5, AAVRH8
AAV1, AAV10 AAV2, AAV11 AAV3, AAV12 AAV4, AAVRH8 AAV5, AAVRH10
AAV1, AAV11 AAV2, AAV12 AAV3, AAVRH8 AAV4, AAVRH10 AAV5, AAV13
AAV1, AAV12 AAV2, AAVRH8 AAV3, AAVRH10 AAV4, AAV13 AAV5, AAVDJ
AAV1, AAVRH8 AAV2, AAVRH10 AAV3, AAV13 AAV4, AAVDJ AAV5, AAVDJ8
AAV1, AAVRH10 AAV2, AAV13 AAV3, AAVDJ AAV4, AAVDJ8 AAV5, ПТИЧИЙ
AAV1, AAV13 AAV2, AAVDJ AAV3, AAVDJ8 AAV4, ПТИЧИЙ AAV5, БЫЧИЙ
AAV1, AAVDJ AAV2, AAVDJ8 AAV3, ПТИЧИЙ AAV4, БЫЧИЙ AAV5, СОБАЧИЙ
AAV1, AAVDJ8 AAV2, ПТИЧИЙ AAV3, БЫЧИЙ AAV4, СОБАЧИЙ AAV5, ЛОШАДЕЙ
AAV1, ПТИЧИЙ AAV2, БЫЧИЙ AAV3, СОБАЧИЙ AAV4, ЛОШАДЕЙ AAV5, КОЗИЙ
AAV1, БЫЧИЙ AAV2, СОБАЧИЙ AAV3, ЛОШАДЕЙ AAV4, КОЗИЙ AAV5, КРЕВЕТОК
AAV1, СОБАЧИЙ AAV2, ЛОШАДЕЙ AAV3, КОЗИЙ AAV4, КРЕВЕТОК AAV5, СВИНЕЙ
AAV1, ЛОШАДЕЙ AAV2, КОЗИЙ AAV3, КРЕВЕТОК AAV4, СВИНЕЙ AAV5, НАСЕКОМЫХ
AAV1, КОЗИЙ AAV2, КРЕВЕТОК AAV3, СВИНЕЙ AAV4, НАСЕКОМЫХ AAV5, ОВЕЦ
AAV1, КРЕВЕТОК AAV2, СВИНЕЙ AAV3, НАСЕКОМЫХ AAV4, ОВЕЦ AAV5, B19
AAV1, СВИНЕЙ AAV2, НАСЕКОМЫХ AAV3, ОВЕЦ AAV4, B19 AAV5, MVM
AAV1, НАСЕКОМЫХ AAV2, ОВЕЦ AAV3, B19 AAV4, MVM AAV5, ГУСЕЙ
AAV1, ОВЕЦ AAV2, B19 AAV3, MVM AAV4, ГУСЕЙ AAV5, ЗМЕЙ
AAV1, B19 AAV2, MVM AAV3, ГУСЕЙ AAV4, ЗМЕЙ  
AAV1, MVM AAV2, ГУСЕЙ AAV3, ЗМЕЙ    
AAV1, ГУСЕЙ AAV2, ЗМЕЙ      
AAV1, ЗМЕЙ        
AAV6, AAV6 AAV7, AAV7 AAV8, AAV8 AAV9, AAV9 AAV10, AAV10
AAV6, AAV7 AAV7, AAV8 AAV8, AAV9 AAV9, AAV10 AAV10, AAV11
AAV6, AAV8 AAV7, AAV9 AAV8, AAV10 AAV9, AAV11 AAV10, AAV12
AAV6, AAV9 AAV7, AAV10 AAV8, AAV11 AAV9, AAV12 AAV10, AAVRH8
AAV6, AAV10 AAV7, AAV11 AAV8, AAV12 AAV9, AAVRH8 AAV10, AAVRH10
AAV6, AAV11 AAV7, AAV12 AAV8, AAVRH8 AAV9, AAVRH10 AAV10, AAV13
AAV6, AAV12 AAV7, AAVRH8 AAV8, AAVRH10 AAV9, AAV13 AAV10, AAVDJ
AAV6, AAVRH8 AAV7, AAVRH10 AAV8, AAV13 AAV9, AAVDJ AAV10, AAVDJ8
AAV6, AAVRH10 AAV7, AAV13 AAV8, AAVDJ AAV9, AAVDJ8 AAV10, ПТИЧИЙ
AAV6, AAV13 AAV7, AAVDJ AAV8, AAVDJ8 AAV9, ПТИЧИЙ AAV10, БЫЧИЙ
AAV6, AAVDJ AAV7, AAVDJ8 AAV8, ПТИЧИЙ AAV9, БЫЧИЙ AAV10, СОБАЧИЙ
AAV6, AAVDJ8 AAV7, ПТИЧИЙ AAV8, БЫЧИЙ AAV9, СОБАЧИЙ AAV10, ЛОШАДЕЙ
AAV6, ПТИЧИЙ AAV7, БЫЧИЙ AAV8, СОБАЧИЙ AAV9, ЛОШАДЕЙ AAV10, КОЗИЙ
AAV6, БЫЧИЙ AAV7, СОБАЧИЙ AAV8, ЛОШАДЕЙ AAV9, КОЗИЙ AAV10, КРЕВЕТОК
AAV6, СОБАЧИЙ AAV7, ЛОШАДЕЙ AAV8, КОЗИЙ AAV9, КРЕВЕТОК AAV10, СВИНЕЙ
AAV6, ЛОШАДЕЙ AAV7, КОЗИЙ AAV8, КРЕВЕТОК AAV9, СВИНЕЙ AAV10, НАСЕКОМЫХ
AAV6, КОЗИЙ AAV7, КРЕВЕТОК AAV8, СВИНЕЙ AAV9, НАСЕКОМЫХ AAV10, ОВЕЦ
AAV6, КРЕВЕТОК AAV7, СВИНЕЙ AAV8, НАСЕКОМЫХ AAV9, ОВЕЦ AAV10, B19
AAV6, СВИНЕЙ AAV7, НАСЕКОМЫХ AAV8, ОВЕЦ AAV9, B19 AAV10, MVM
AAV6, НАСЕКОМЫХ AAV7, ОВЕЦ AAV8, B19 AAV9, MVM AAV10, ГУСЕЙ
AAV6, ОВЕЦ AAV7, B19 AAV8, MVM AAV9, ГУСЕЙ AAV10, ЗМЕЙ
AAV6, B19 AAV7, MVM AAV8, ГУСЕЙ AAV9, ЗМЕЙ  
AAV6, MVM AAV7, ГУСЕЙ AAV8, ЗМЕЙ    
AAV6, ГУСЕЙ AAV7, ЗМЕЙ      
AAV6, ЗМЕЙ        
AAV11, AAV11 AAV12, AAV12 AAVRH8, AAVRH8 AAVRH10, AAVRH10 AAV13, AAV13
AAV11, AAV12 AAV12, AAVRH8 AAVRH8, AAVRH10 AAVRH10, AAV13 AAV13, AAVDJ
AAV11, AAVRH8 AAV12, AAVRH10 AAVRH8, AAV13 AAVRH10, AAVDJ AAV13, AAVDJ8
AAV11, AAVRH10 AAV12, AAV13 AAVRH8, AAVDJ AAVRH10, AAVDJ8 AAV13, ПТИЧИЙ
AAV11, AAV13 AAV12, AAVDJ AAVRH8, AAVDJ8 AAVRH10, ПТИЧИЙ AAV13, БЫЧИЙ
AAV11, AAVDJ AAV12, AAVDJ8 AAVRH8, ПТИЧИЙ AAVRH10, БЫЧИЙ AAV13, СОБАЧИЙ
AAV11, AAVDJ8 AAV12, ПТИЧИЙ AAVRH8, БЫЧИЙ AAVRH10, СОБАЧИЙ AAV13, ЛОШАДЕЙ
AAV11, ПТИЧИЙ AAV12, БЫЧИЙ AAVRH8, СОБАЧИЙ AAVRH10, ЛОШАДЕЙ AAV13, КОЗИЙ
AAV11, БЫЧИЙ AAV12, СОБАЧИЙ AAVRH8, ЛОШАДЕЙ AAVRH10, КОЗИЙ AAV13, КРЕВЕТОК
AAV11, СОБАЧИЙ AAV12, ЛОШАДЕЙ AAVRH8, КОЗИЙ AAVRH10, КРЕВЕТОК AAV13, СВИНЕЙ
AAV11, ЛОШАДЕЙ AAV12, КОЗИЙ AAVRH8, КРЕВЕТОК AAVRH10, СВИНЕЙ AAV13, НАСЕКОМЫХ
AAV11, КОЗИЙ AAV12, КРЕВЕТОК AAVRH8, СВИНЕЙ AAVRH10, НАСЕКОМЫХ AAV13, ОВЕЦ
AAV11, КРЕВЕТОК AAV12, СВИНЕЙ AAVRH8, НАСЕКОМЫХ AAVRH10, ОВЕЦ AAV13, B19
AAV11, СВИНЕЙ AAV12, НАСЕКОМЫХ AAVRH8, ОВЕЦ AAVRH10, B19 AAV13, MVM
AAV11, НАСЕКОМЫХ AAV12, ОВЕЦ AAVRH8, B19 AAVRH10, MVM AAV13, ГУСЕЙ
AAV11, ОВЕЦ AAV12, B19 AAVRH8, MVM AAVRH10, ГУСЕЙ AAV13, ЗМЕЙ
AAV11, B19 AAV12, MVM AAVRH8, ГУСЕЙ AAVRH10, ЗМЕЙ  
AAV11, MVM AAV12, ГУСЕЙ AAVRH8, ЗМЕЙ    
AAV11, ГУСЕЙ AAV12, ЗМЕЙ      
AAV11, ЗМЕЙ        
AAVDJ, AAVDJ AAVDJ8, AVVDJ8 ПТИЧИЙ, ПТИЧИЙ БЫЧИЙ, БЫЧИЙ СОБАЧИЙ, СОБАЧИЙ
AAVDJ, AAVDJ8 AAVDJ8, ПТИЧИЙ ПТИЧИЙ, БЫЧИЙ БЫЧИЙ, СОБАЧИЙ СОБАЧИЙ, ЛОШАДЕЙ
AAVDJ, ПТИЧИЙ AAVDJ8, БЫЧИЙ ПТИЧИЙ, СОБАЧИЙ БЫЧИЙ, ЛОШАДЕЙ СОБАЧИЙ, КОЗИЙ
AAVDJ, БЫЧИЙ AAVDJ8, СОБАЧИЙ ПТИЧИЙ, ЛОШАДЕЙ БЫЧИЙ, КОЗИЙ СОБАЧИЙ, КРЕВЕТОК
AAVDJ, СОБАЧИЙ AAVDJ8, ЛОШАДЕЙ ПТИЧИЙ, КОЗИЙ БЫЧЬЯ, КРЕВЕТОК СОБАЧИЙ, СВИНЕЙ
AAVDJ, ЛОШАДЕЙ AAVDJ8, КОЗИЙ ПТИЧИЙ, КРЕВЕТОК КОРОВ, СВИНЕЙ СОБАЧИЙ, НАСЕКОМЫХ
AAVDJ, КОЗИЙ AAVDJ8, КРЕВЕТОК ПТИЧИЙ, СВИНЕЙ БЫЧИЙ, НАСЕКОМЫХ СОБАЧИЙ, ОВЕЦ
AAVDJ, КРЕВЕТОК AAVDJ8, СВИНЕЙ ПТИЧИЙ, НАСЕКОМЫХ БЫЧИЙ, ОВЕЦ СОБАЧИЙ, B19
AAVDJ, СВИНЕЙ AAVDJ8, НАСЕКОМЫХ ПТИЧИЙ, ОВЕЦ БЫЧИЙ, B19 СОБАЧИЙ, MVM
AAVDJ, НАСЕКОМЫХ AAVDJ8, ОВЕЦ ПТИЧИЙ, B19 БЫЧИЙ, MVM СОБАЧИЙ, ГУСЕЙ
AAVDJ, ОВЕЦ AAVDJ8, B19 ПТИЧИЙ, MVM БЫЧИЙ, ГУСЕЙ СОБАЧИЙ, ЗМЕЙ
AAVDJ, B19 AAVDJ8, MVM ПТИЧИЙ, ГУСЕЙ БЫЧИЙ, ЗМЕЙ  
AAVDJ, MVM AAVDJ8, ГУСЕЙ ПТИЧИЙ, ЗМЕЙ    
AAVDJ, ГУСЕЙ AAVDJ8, ЗМЕЙ      
AAVDJ, ЗМЕЙ        
ЛОШАДЕЙ, ЛОШАДЕЙ КОЗИЙ, КОЗИЙ КРЕВЕТОК, КРЕВЕТОК СВИНЕЙ, СВИНЕЙ НАСЕКОМЫХ, НАСЕКОМЫХ
ЛОШАДЕЙ, КОЗИЙ КОЗИЙ, КРЕВЕТОК КРЕВЕТОК, СВИНЕЙ СВИНЕЙ, НАСЕКОМЫХ НАСЕКОМЫХ, ОВЕЦ
ЛОШАДЕЙ, КРЕВЕТОК КОЗИЙ, СВИНЕЙ КРЕВЕТОК, НАСЕКОМЫХ СВИНЕЙ, ОВЕЦ НАСЕКОМЫХ, B19
ЛОШАДЕЙ, СВИНЕЙ КОЗИЙ, НАСЕКОМЫХ КРЕВЕТОК, ОВЕЦ СВИНЕЙ, B19 НАСЕКОМЫХ, MVM
ЛОШАДЕЙ, НАСЕКОМЫХ КОЗИЙ, ОВЕЦ КРЕВЕТОК, B19 СВИНЕЙ, MVM НАСЕКОМЫХ, ГУСЕЙ
ЛОШАДЕЙ, ОВЕЦ КОЗИЙ, B19 КРЕВЕТОК, MVM СВИНЕЙ, ГУСЕЙ НАСЕКОМЫХ, ЗМЕЙ
ЛОШАДЕЙ, B19 КОЗИЙ, MVM КРЕВЕТОК, ГУСЕЙ СВИНЕЙ, ЗМЕЙ  
ЛОШАДЕЙ, MVM КОЗИЙ, ГУСЕЙ КРЕВЕТОК, ЗМЕЙ    
ЛОШАДЕЙ, ГУСЕЙ КОЗИЙ, ЗМЕЙ      
ЛОШАДЕЙ, ЗМЕЙ        
ОВЕЦ, ОВЕЦ B19, B19 MVM, MVM ГУСЕЙ, ГУСЕЙ ЗМЕЙ, ЗМЕЙ
ОВЕЦ, B19 B19, MVM MVM, ГУСЕЙ ГУЗ, ЗМЕЙ  
ОВЕЦ, MVM B19, ГУСЕЙ MVM, ЗМЕЙ    
ОВЕЦ, ГУСЕЙ B19, ЗМЕЙ      
ОВЕЦ, ЗМЕЙ        
[00254] Только в качестве примера, в Таблице 2 приведены последовательности типичных WT-ITR из некоторых различных серотипов AAV.
[00255] ТАБЛИЦА 2
[00256] В некоторых вариантах реализации нуклеотидная последовательность WT-ITR может быть модифицирована (например, путем модификации 1, 2, 3, 4 или 5 или более нуклеотидов, или любого диапазона значений в указанных пределах), причем модификация представляет собой замену комплементарного нуклеотида. например, G на C и наоборот, и T на A и наоборот.
[00257] В определенных вариантах реализации данного изобретения зкДНК-вектор не имеет WT-ITR, состоящего из нуклеотидной последовательности, выбранной из любой из: SEQ ID NO: 550-557.
[00258] В альтернативных вариантах реализации данного изобретения, если зкДНК-вектор имеет WT-ITR, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из любой из: SEQ ID NO: 550-557, то фланкирующий ITR также относится к дикому типу (WT), а кДНК содержит регуляторный переключатель, например, как описано в данном документе и в PCT/US18/49996 (например, см. Таблицу 11 PCT/US18/49996). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель, как описано в данном документе, и выбранный WT-ITR имеет нуклеотидную последовательность, выбранную из любых из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 550-557.
[00259] зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может включать структуры WT-ITR, которые сохраняют функциональные части RBE, trs и RBE'. На Фиг. 2А и Фиг. 2B продемонстрирован, с использованием для иллюстрации ITR дикого типа, один из возможных механизмов функционирования сайта trs в части структуры ITR дикого типа зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит одну или несколько функциональных полинуклеотидных последовательностей WT-ITR, которые содержат Rep-связывающий сайт (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) для AAV2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 46)). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один WT-ITR является функциональным. В альтернативных вариантах реализации, когда зкДНК-вектор содержит два WT-ITR, которые являются по существу симметричными друг другу, по меньшей мере один WT-ITR является функциональным, и по меньшей мере один WT-ITR является нефункциональным.
[00260] B. Модифицированные ITR (mod-ITR) в общем для зкДНК-векторов, содержащих асимметричные пары ITR или симметричные пары ITR
[00261] Как описано в данном документе, зкДНК-вектор может содержать симметричную пару ITR или асимметричную пару ITR. В обоих случаях ITR могут быть модифицированными ITR - различие заключается в том, что в первом случае (т.е. симметричные mod-ITR) указанные mod-ITR имеют одинаковую трехмерную пространственную организацию (т.е. имеют одинаковые конфигурации A-A', C-C' и B-B'-плеч), тогда как во втором случае (т.е. асимметричные mod-ITR) указанные mod-ITR имеют разную трехмерную пространственную организацию (т.е. имеют разные конфигурации A-A', C-C' и B-B'-плеч).
[00262] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR представляет собой ITR, который модифицируют путем делеции, вставки и/или замещения по сравнению с последовательностью ITR дикого типа (например, ITR AAV). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один из ITR в зкДНК-векторе содержит функциональный Rep-связывающий сайт (RBS; например, 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' для AAV2, SEQ ID NO: 531) и функциональный сайт концевого разрешения (TRS; например, 5'-AGTT-3', SEQ ID NO: 46.). В одном варианте реализации, по меньшей мере один из указанных ITR является нефункциональным ITR. В одном варианте реализации разные или модифицированные ITR не представляют собой каждый ITR дикого типа из разных серотипов.
[00263] Конкретные изменения и мутации в ITR подробно описаны в данном документе, но в контексте ITR, «измененных» или «мутированных» или «модифицированных», это указывает на то, что нуклеотиды были вставлены, делетированы и/или замещены относительно дикого типа, референсной или исходной последовательности ITR. Измененный или мутированный ITR может быть рекомбинантным (engineered) ITR. Используемый в данном документе термин «рекомбинантный» относится к аспекту проведения манипуляций человеком. Например, полипептид считается «рекомбинантным», когда по меньшей мере один аспект полипептида, например, его последовательность, был подвергнут манипуляциям со стороны человека для создания отличий от аспекта, в котором он существует в природе.
[00264] В некоторых вариантах реализации mod-ITR может быть синтетическим. В одном варианте реализации синтетический ITR основан на последовательностях ITR из более чем одного серотипа AAV. В другом варианте реализации синтетический ITR не включает последовательности на основе AAV. В еще одном варианте реализации синтетический ITR сохраняет структуру ITR, описанную выше, хотя имеет лишь некоторые последовательности из AAV или не имеет их. В некоторых аспектах синтетический ITR может взаимодействовать преимущественно с Rep дикого типа или с Rep определенного серотипа, или, в некоторых случаях, не будет распознаваться Rep дикого типа и будет распознаваться только мутированным Rep.
[00265] Специалист в данной области может определить соответствующую последовательность в других серотипах известными способами. Например, путем определения того, находится ли изменение в области A, A', B, B', C, C' или D, и определения соответствующей области в другом серотипе. Можно использовать BLAST® (Basic Local Alignment Search Tool) или другие программы выравнивания для определения гомологии с настройками по умолчанию для определения соответствующей последовательности. Изобретение дополнительно предлагает популяции и множества зкДНК-векторов, содержащих mod-ITR из комбинации различных серотипов AAV, т.е. один mod-ITR может быть из одного серотипа AAV, а другой mod-ITR может быть из другого серотипа. Не желая быть связанными какой-либо теорией, в одном варианте реализации один ITR может быть взят из последовательности ITR AAV2 или быть на ней основан, а другой ITR зкДНК-вектора может быть взят из или быть основан на любой одной или нескольких последовательностях ITR серотипа 1 AAV (AAV1), серотипа 4 AAV (AAV4), серотипа 5 AAV (AAV5), серотипа 6 AAV (AAV6), серотипа 7 AAV (AAV7), серотипа 8 AAV (AAV8), серотипа 9 AAV (AAV9), серотипа 10 AAV (AAV10), серотипа 11 AAV (AAV11) или серотипа 12 AAV (AAV12).
[00266] Любой парвовирусный ITR может использоваться как ITR или в качестве базового ITR для модификации. Предпочтительно, парвовирус представляет собой депендовирус. Более предпочтительно - AAV. Выбранный серотип может быть основан на тканевом тропизме серотипа. AAV2 обладает тропизмом к широкому ряду тканей, AAV1 преимущественно нацелен на нервную ткань и скелетные мышцы, а AAV5 преимущественно нацелен на нервную ткань, пигментированный эпителий сетчатки и фоторецепторы. AAV6 преимущественно нацелен на скелетные мышцы и легкие. AAV8 преимущественно нацелен на печень, скелетные мышцы, сердце и ткани поджелудочной железы AAV9 преимущественно направлен на ткани печени, скелета и легких. В одном варианте реализации модифицированный ITR основан на ITR AAV2.
[00267] Более конкретно, способность структурного элемента функционально взаимодействовать с конкретным большим белком Rep может быть изменена путем модификации структурного элемента. Например, нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована по сравнению с последовательностью ITR дикого типа. В одном варианте реализации структурный элемент (например, плечо A, плечо A', плечо B, плечо B', плечо C, плечо C', плечо D, RBE, RBE' и trs) ITR может быть удален и заменен структурным элементом дикого типа из другого парвовируса. Например, заменяющая структура может быть взята из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, парвовируса змей (например, парвовируса королевского питона), парвовируса бычьих, парвовируса коз, парвовируса птиц, парвовирус собачьих, парвовируса лошадиных, парвовируса креветок, свиного парвовируса или AAV насекомых. Например, ITR может представлять собой ITR AAV2, а плечо A или A', или RBE могут быть заменены структурным элементом из AAV5. В другом примере, ITR может представлять собой ITR AAV5, а плечи C или C', RBE и trs могут быть заменены структурным элементом из AAV2. В другом примере ITR AAV может представлять собой ITR AAV5, где плечи B и B' заменены плечами B и B' ITR AAV2.
[00268] Только в качестве примера, в Таблице 3 приведены примеры модификаций по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замены) в областях модифицированных ITR, где X указывает на модификацию по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты (например, делецию, инсерцию и/или замену) в указанном отделе относительно соответствующего ITR дикого типа. В некоторых вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/или замены) в любой из областей C и/или C' и/или B и/или B' сохраняет три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) по меньшей мере в одной концевой петле. Например, если модификация приводит к чему-либо из: ITR с единственным плечом (например, с единственным плечом C-C' или единственным плечом B-B'), или с модифицированным плечом C-B' или плечом C'-B, или ITR с двумя плечами, содержащий по меньшей мере одно усеченное плечо (например, усеченное плечо C-C' и/или усеченное плечо B-B'), по меньшей мере в указанном единственном плече, или по меньшей мере в одном из плечей ITR с двумя плечами (причем одно плечо может быть усеченным) сохраняются три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) по меньшей мере в одной концевой петле. В некоторых вариантах реализации усеченное плечо C-C' и/или усеченное плечо B-B' содержит три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) в концевой петле.
[00269] Таблица 3: Примеры комбинаций модификаций по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеции, инсерции и/ или замены) в разных областях или плечах B-B' и C-C' ITR (X указывает на модификацию нуклеотида, например, добавление, делецию или замену по меньшей мере одного нуклеотида в области).
Область B Область B' Область С Область C'
X
X
X X
X
X
X X
X X
X X
X X
X X
X X X
X X X
X X X
X X X
X X X X
[00270] В некоторых вариантах реализации mod-ITR для использования в зкДНК-векторе для редактирования генов, содержащем асимметричную пару ITR или симметричную пару mod-ITR, как описано в данном документе, может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида в любой из одной или нескольких областей, выбранных из: между A' и C, между C и C', между C' и B, между B и B' и между B' и A. В некоторых вариантах реализации, любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) в областях C или C' или B или B' все еще сохраняет концевую петлю стебель-петля. В некоторых вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) между C и C' и/или B и B' сохраняет три последовательных нуклеотида T (т.е. TTT) по меньшей мере в одной концевой петле. В альтернативных вариантах реализации любая модификация по меньшей мере одного нуклеотида (например, делеция, вставка и/или замена) между C и C' и/или B и B' сохраняет три последовательных нуклеотида A (т.е. AAA) по меньшей мере в одной концевой петле. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в любой из одной или нескольких областей, выбраных из: A', A и/или D. Например, в некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере один нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области А. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области A'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области А и/или A'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования по данному изобретению может содержать любую одну из комбинаций модификаций, указанных в Таблице 3, а также модификацию по меньшей мере одного нуклеотида (например, делецию, вставку и/или замену) в области D.
[00271] В одном варианте реализации нуклеотидная последовательность структурного элемента может быть модифицирована (например, путем модификации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 17, 18, 19 или 20 или более нуклеотидов или любого диапазона значений) для получения модифицированного структурного элемента. Примеры конкретных модификаций ITR согласно одному варианту реализации приведены в данном документе (например, SEQ ID NO: 2, 52, 63, 64, 99-100, 469-499, или изображены в данном документе на Фиг. 7A-7B (например, 97- 98, 101-103, 105-108, 111-112, 117-134, 545-54). В некоторых вариантах реализации ITR может быть модифицирован (например, путем модификации 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 или более нуклеотидов или любого диапазона значений). В других вариантах реализации ITR может иметь по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или более, идентичности последовательности с одной из модифицированных ITR SEQ ID NOS: 469-499 или 545-547, или RBE-содержащего отдела плеча A-A' и плеч C-C' и B-B' SEQ ID NO: 97-98, 101- 103, 105-108, 111-112, 117-134, 545-547, или приведенных в Таблицах 2-9 (т.е. SEQ ID NO: 110-112, 115-190, 200-468) PCT/US18/49996, который включен в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
[00272] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может, например, содержать удаление или делецию всего конкретного плеча, например, всего или части плеча A-A', или всего или части плеча B-B' или всего или части плеча C-C' или, альтернативно, удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований, образующих стебель петли, при условии, что кэпирующая петля на конце стебля (например, одного плеча) все еще присутствует (например, см. ITR-21 на Фиг. 7A). В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может содержать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча B-B'. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может содержать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча C-C' (см., например, ITR-1 на Фиг. 3B). или ITR-45 на Фиг. 7А). В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может включать удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча C-C' и удаление 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или более пар оснований из плеча B-B'. Предусматривается любая комбинация удалений пар оснований, например, могут быть удалены 6 пар оснований в плече C-C' и 2 пары оснований в плече B-B'. В качестве иллюстративного примера на Фиг. 3B продемонстрирован пример модифицированного ITR с удалением по меньшей мере 7 пар оснований из каждой из части C и части C', заменой нуклеотида в петле между областью C и C', и удалением по меньшей мере одной пары оснований из каждой из области B и области B', так что модифицированный ITR содержит два плеча, по меньшей мере одно из которых (например, C-C') является усеченным. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR также содержит, по меньшей мере, одну делецию пары оснований из каждой из области B и области B', так что плечо B-B' также усечено по сравнению с ITR дикого типа.
[00273] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может иметь от 1 до 50 (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50) делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ITR дикого типа. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR может иметь от 1 до 30 делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности WT-ITR. В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR имеет от 2 до 20 делеций нуклеотидов относительно полноразмерной последовательности ITR дикого типа.
[00274] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR не содержит каких-либо нуклеотидных делеций в RBE-содержащей части областей A или A', чтобы не мешать репликации ДНК (например, связыванию с RBE белка Rep или никированию в сайте концевого разрешения). В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR, пригодный для использования по данному изобретению, имеет одну или несколько делеций в области B, B', C и/или C, как описано в данном документе.
[00275] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для редактирования генов, содержащий симметричную пару ITR или асимметричную пару ITR, содержит регуляторный переключатель, как раскрыто в данном документе, и по меньшей мере один модифицированный ITR, выбранный с нуклеотидной последовательностью, выбранной из любых членов группы, состоящей из: SEQ ID NO: 550-557.
[00276] В другом варианте реализации структура структурного элемента может быть модифицирована. Например, структурный элемент (имеет) измененную высоту стебля и/или количество нуклеотидов в петле. Например, высота стебля может составлять примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 нуклеотидов или более или соответствовать любому диапазону значений. В одном варианте реализации стебель может иметь высоту от примерно 5 нуклеотидов до примерно 9 нуклеотидов и функционально взаимодействовать с Rep. В другом варианте реализации стебель может иметь высоту около 7 нуклеотидов и функционально взаимодействовать с Rep. В другом примере петля может иметь 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов или более, или любой диапазон указанных значений.
[00277] В другом варианте реализации, число сайтов связывания GAGY или связанных с GAGY сайтов связывания в пределах RBE или расширенного RBE может быть увеличено или уменьшено. В одном примере RBE или расширенный RBE могут содержать 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или более сайтов связывания GAGY или любой диапазон указанных значений. Каждый сайт связывания GAGY может независимо представлять собой точную последовательность GAGY или последовательность, аналогичную GAGY, при условии, что эта последовательность является достаточной для связывания белка Rep.
[00278] В другом варианте реализации промежуток между двумя элементами (такими как, без ограничений, RBE и шпилька) может быть изменен (например, увеличен или уменьшен), для изменения функционального взаимодействия с большим белком Rep. Например, указанный промежуток может составлять приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 нуклеотидов или более, или любой диапазон указанных значений.
[00279] зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может включать структуру ITR, которая модифицирована относительно структуры ITR AAV2 дикого типа, раскрытой в данном документе, но все еще сохраняет функциональную часть RBE, trs и RBE'. На Фиг. 2А и Фиг. 2B продемонстрирован один из возможных механизмов работы сайта trs в части структуры ITR дикого типа зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит одну или несколько функциональных полинуклеотидных последовательностей ITR, которые содержат Rep-связывающий сайт (RBS; 5'-GCGCGCTCGCTCGCTC-3' (SEQ ID NO: 531) для AAV2) и сайт концевого разрешения (TRS; 5'-AGTT (SEQ ID NO: 46)). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один ITR (дикого типа или модифицированный ITR) является функциональным. В альтернативных вариантах реализации, в тех случаях, когда зкДНК-вектор содержит два модифицированных ITR, которые отличаются друг от друга или асимметричны друг относительно друга, по меньшей мере один модифицированный ITR является функциональным и по меньшей мере один модифицированный ITR является нефункциональным.
[00280] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор не имеет модифицированного ITR, выбранного из любой последовательности, состоящей из или состоящей по существу из: SEQ ID NO: 500-529, как предоставлено в данном документе. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор не имеет ITR, который выбирают из любой последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 500-529.
[00281] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR (например, левый или правый ITR) зкДНК-вектора, описанного в данном документе, имеет модификации в плече петли, усеченном плече или спейсере. Примеры последовательностей ITR, имеющих модификации в плече петли, усеченном плече или спейсере, перечислены в Таблице 2 (т.е. SEQ ID NO: 135-190, 200-233); Таблице 3 (например, SEQ ID NO: 234-263); Таблице 4 (например, SEQ ID NO: 264-293); Таблице 5 (например, SEQ ID NO: 294-318 в данном документе); Таблице 6 (например, SEQ ID NO: 319-468; и таблицах 7-9 (например, SEQ ID NO: 101-110, 111-112, 115-134) или Таблице 10A или 10B (например, SEQ ID Nos: 9, 100, 469-483, 484-499) заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.
[00282] В некоторых вариантах реализации модифицированный ITR для использования в зкДНК-векторе, содержащем асимметричную пару ITR или симметричную пару mod-ITR, выбирают из любых или из комбинации ITR, приведенных в Таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9 и 10A-10B заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
[00283] Дополнительные примеры модифицированных ITR для использования в зкДНК-векторе, содержащем асимметричную пару ITR или симметричную пару mod-ITR в каждом из вышеуказанных классов, представлены в Таблицах 4A и 4B. Предсказанная вторичная структура правых модифицированных ITR в таблице 4A показана на Фиг. 7A, и предсказанная вторичная структура левых модифицированных ITR в Таблице 4B показана на Фиг. 7B.
[00284] Таблица 4A и Таблица 4B показывают примеры правых и левых модифицированных ITR.
[00285] Таблица 4А: Примеры модифицированных правых ITR. Эти примеры модифицированных правых ITR могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 531), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 532), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 535) и RBE' (т.е. комплемент RBE) GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 536).
Таблица 4А: Примеры правых модифицированных ITR
Конструкт ITR Последовательность SEQ ID NO:
ITR-18 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 469
ITR-19 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 470
ITR-20 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 471
ITR-21 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCTTTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 472
ITR-22 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACAAAGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 473
ITR-23 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAAATCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 474
ITR-24 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAACGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 475
ITR-25 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCAAAGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 476
ITR-26 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 477
ITR-27 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGTTTCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 478
ITR-28 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGTTTCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 479
ITR-29 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCTTTGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 480
ITR-30 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCTTTGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 481
ITR-31 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCTTTGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 482
ITR-32 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGTTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 483
ITR-49 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 99
ITR-50 правый AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG 100
[00286] ТАБЛИЦА 4B: Примеры модифицированных левых ITR. Эти примеры модифицированных левых ITR могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 531), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 532), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 535) и комплемент RBE (RBE') GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 536).
Таблица 14B: Примеры модифицированных левых ITR
ITR-33 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 484
ITR-34 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 485
ITR-35 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 486
ITR-36 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 487
ITR-37 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCAAAGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 488
ITR-38 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACTTTGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 489
ITR-39 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGATTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 490
ITR-40 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 491
ITR-41 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCTTTGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 492
ITR-42 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 493
ITR-43 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGAAACCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 494
ITR-44 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGAAACGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 495
ITR-45 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCAAAGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 496
ITR-46 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCAAAGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 497
ITR-47 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCAAAGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 498
ITR-48 левый CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGAAACGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT 499
[00287] В одном варианте реализации зкДНК-вектор для редактирования генов содержит два симметричных mod-ITR, т.е. оба ITR имеют одинаковую последовательность, но являются обратными коплементами (инвертированными) друг друга. В некоторых вариантах реализации симметричная пара mod-ITR содержит по меньшей мере одну или любую комбинацию делеции, вставки или замены относительно последовательности ITR дикого типа из того же серотипа AAV. Добавления, делеции или замены в симметричном ITR являются одинаковыми, но обратно комплементарными друг к другу. Например, вставка 3 нуклеотидов в С-область 5'-ITR будет отображена во вставке 3 обратно комплементарных нуклеотидов в соответствующий участок С-области 3'-ITR. Только в целях иллюстрации, если в 5'-ITR добавление представляет собой AACG, то в 3'-ITR добавлением будет CGTT в соответствующем сайте. Например, если смысловая цепь 5' ITR представляет собой ATCGATCG с добавлением AACG между G и A, с получением в результате последовательности ATCG AACG ATCG. Соответствующая смысловая цепь 3' ITR представляет собой CGATCGAT (обратный комплемент ATCGATCG) с добавлением CGTT (т.е. обратного комплемента AACG) между T и C, что приводит к последовательности CGAT CGTT CGAT (обратный комплемент ATCG AACG ATCG).
[00288] В альтернативных вариантах реализации модифицированная пара ITR является по существу симметричной, как определено в данном документе, т.е. модифицированная пара ITR может иметь разные последовательности, но имеют аналогичную или одинаковую симметричную трехмерную форму. Например, один модифицированный ITR может быть из одного серотипа, а другой модифицированный ITR может быть из другого серотипа, но они имеют одинаковую мутацию (например, вставку, делецию или замену нуклеотида) в одной и той же области. Иными словами, только в иллюстративных целях, 5' mod-ITR может быть взята из AAV2 и иметь делецию в области C, а 3' mod-ITR может быть взята из AAV5 и иметь соответствующую делецию в области C', и при условии, что 5' mod-ITR и 3' mod-ITR имеют одинаковую или симметричную трехмерную пространственную организацию, они включены для использования по данному изобретению в качестве модифицированной пары ITR.
[00289] В некоторых вариантах реализации по существу симметричная пара mod-ITR имеет одинаковые A, C-C' и B-B'-петли в трехмерном пространстве, например, если модифицированный ITR в по существу симметричной паре mod-ITR имеет делецию плеча C-C', то родственный mod-ITR имеет соответствующую делецию петли C-C', а также имеет аналогичную трехмерную структуру оставшихся A и B-B'-петель одинаковой формы в геометрическом пространстве своего родственного mod-ITR. Только в качестве примера, по существу симметричные ITR могут иметь симметричную пространственную организацию, так чтобы их структура имела одинаковую форму в геометрическом пространстве. Это может происходить, например, когда пару G-C модифицируют, например, в пару C-G, или наоборот, или пару A-T модифицируют в пару T-A, или наоборот. Таким образом, используя приведенный выше иллюстративный пример модифицированного 5'-ITR в виде ATCG AACG ATCG (SEQ ID NO: 570) и модифицированного 3'-ITR в виде CGAT CGTT CGAT (SEQ ID NO: 571) (т.е. обратный комплемент ATCG AACG ATCG (SEQ ID NO: 570)), эти модифицированные ITR будут оставаться симметричными, если, например, 5'-ITR имеет последовательность ATCG AAC C ATCG (SEQ ID NO: 572), где G в добавлении модифицируют до C, и по существу симметричный 3'-ITR имеет последовательность CGAT CGTT CGAT (SEQ ID NO: 571), без соответствующей модификации T в добавление к A. В некоторых вариантах реализации такая модифицированная пара ITR является по существу симметричной, поскольку модифицированная пара ITR имеет симметричную стереохимию.
[00290] В Таблице 5 приведены примеры симметричных модифицированных пар ITR (т.е. модифицированный левый ITR и симметричный правый модифицированный ITR). Выделенная жирным шрифтом (красная) часть последовательностей идентифицирует частичные последовательности ITR (т.е. последовательности петель A-A', C-C' и B-B'), также показанные на Фиг. 31A-46B. Эти примеры модифицированных ITR могут содержать RBE GCGCGCTCGCTCGCTC-3′ (SEQ ID NO: 531), спейсер ACTGAGGC (SEQ ID NO: 532), комплемент спейсера GCCTCAGT (SEQ ID NO: 535) и RBE' (т.е. комплемент к RBE) GAGCGAGCGAGCGCGC (SEQ ID NO: 536).
Таблица 5: Примеры симметричных модифицированных пар ITR
ЛЕВЫЙ модифицированный ITR
(модифицированный 5'-ITR)		 Симметричный ПРАВЫЙ модифицированный ITR (модифицированный 3'-ITR)
SEQ ID NO: 484 (ITR-33 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 469 (ITR-18, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 485 (ITR-34 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 95 (ITR-51, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 486 (ITR-35 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 470 (ITR-19, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 487 (ITR-36 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 471 (ITR-20, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 488 (ITR-37 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCAAAGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 472 (ITR-21, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCTTTGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 489 (ITR-38 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACTTTGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 473 (ITR-22 правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACAAAGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 490 (ITR-39 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGATTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 474 (ITR-23, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAAATCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 491 (ITR-40 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGTTTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 475 (ITR-24, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAAACGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 492 (ITR-41 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCTTTGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 476 (ITR-25 правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCAAAGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 493 (ITR-42 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGAAACCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 477 (ITR-26 правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGTTTCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 494 (ITR-43 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGAAACCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 478 (ITR-27 правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGTTTCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 495 (ITR-44 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGAAACGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 479 (ITR-28 правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGTTTCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 496 (ITR-45 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCAAAGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 480 (ITR-29, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCTTTGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 497 (ITR-46 левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCAAAGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 481 (ITR-30, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCTTTGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 498 (ITR-47, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCAAAGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 482 (ITR-31, правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCTTTGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
SEQ ID NO: 499 (ITR-48, левый) CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGAAACGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT SEQ ID NO: 483 (ITR-32 правый) AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGTTTCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
[00291] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор для редактирования генов, содержащий асимметричную пару ITR, может содержать ITR с модификацией, соответствующей любой из модификаций последовательностей ITR или частичных последовательностей ITR, приведенных в любой одной или нескольких из Таблиц 4A-4B в данном документе или в последовательностях, приведенных на Фиг. 7А или 7В, или раскрытых в Таблицах 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10А-10В PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 г., которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки.
VI. Примеры зкДНК-векторов для редактирования генов
[00292] Как описано выше, данное изобретение относится к рекомбинантным векторам экспрессии зкДНК (например, донорным векторам (могут быть или не быть функционально связанными с промотором) и зкДНК-векторам, которые кодируют молекулы редактирования генов), содержащим любую из: асимметричной пары ITR, симметричной пары ITR или по существу симметричной пары ITR, как описано выше. В некоторых вариантах реализации раскрытие относится к рекомбинантным зкДНК-векторам, имеющим фланкирующие последовательности ITR и способность редактирования генов, причем последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе, и зкДНК дополнительно содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность (например, экспрессионную кассету последовательности редактирования гена или направляющую РНК), расположенную между фланкирующими ITR, при этом указанная молекула нуклеиновой кислоты лишена кодирующих последовательностей вирусного капсидного белка.
В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор включает по меньшей мере что-то одно из следующего: нуклеазу, одно или несколько гомологичных плеч, направляющую РНК, активирующую РНК и контрольный элемент. В некоторых вариантах реализации полинуклеотид включает 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо. Пригодные зкДНК-векторы в соответствии с данным изобретением могут быть получены в соответствии с приведенными ниже Примерами. В некоторых вариантах реализации, данное изобретение относится к рекомбинантным векторам экспрессии зкДНК, содержащим по меньшей мере два компонента системы редактирования генов, например, CAS и по меньшей мере одну нРНК, или два ZNF и т.д. Таким образом, в некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы содержат несколько компонентов системы редактирования генов.
[00293] Вектор экспрессии рекомбинантной зкДНК может представлять собой любой зкДНК-вектор, который может быть удобно подвергнут процедурам рекомбинантной ДНК, включающий нуклеотидную последовательность (последовательности), описанные в данном документе, при условии, что по меньшей мере один ITR был изменен. зкДНК-векторы по данному изобретению совместимы с клеткой-хозяином, в которую должен быть введен зкДНК-вектор. В определенных вариантах реализации зкДНК-векторы могут быть линейными. В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы могут существовать в виде внехромосомного объекта. В определенных вариантах реализации зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать элемент(ы), который позволяет интегрировать донорную последовательность в геном клетки-хозяина. При использовании в данном документе, «донорная последовательность» и «трансген» и «гетерологичная нуклеотидная последовательность» являются синонимами.
[00294] На Фиг. 1A-1G продемонстрированы схемы функциональных компонентов двух неограничивающих плазмид, пригодных для получения зкДНК-векторов по данному изобретению. Фиг. 1А, 1В, 1D, 1F изображают конструкт зкДНК-векторов для редактирования генов или соответствующие последовательности зкДНК-плазмид. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей, в указанном порядке: первый ITR, экспрессируемую трансгенную кассету, и второй ITR, при этом первая и вторая последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе. зкДНК-векторы являются бескапсидными и могут быть получены из плазмиды, кодирующей, в указанном порядке: первый ITR, экспрессируемый трансген (белок или нуклеиновая кислота) или донорная кассета (например, донор HDR), и второй ITR, при этом последовательности первого и второго ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе. В некоторых вариантах реализации экспрессируемая трансгенная кассета включает, при необходимости, энхансер/промотор, одно или несколько гомологичных плеч, донорную последовательность, посттранскрипционный регуляторный элемент (например, WPRE, например, SEQ ID NO: 8) и сигнал полиаденилирования и терминации (например, BGH polyA, например, SEQ ID NO: 7).
[00295] Фиг. 5 изображает гель, подтверждающий продуцирование зкДНК из множества плазмидных конструктов с использованием способа, описанного в Примерах. Присутствие зкДНК подтверждается характерной электрофореграммой в геле, как обсуждалось в отношении Фиг. 4А выше и в Примерах.
[00296] На Фиг. 8 представлен неограничивающий пример зкДНК-вектора в соответствии с данным изобретением, включающий первый и второй ITR, при этом последовательности ITR являются асимметричными, симметричными или по существу симметричными друг относительно друга, как определено в данном документе, первая нуклеотидная последовательность, включающая 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо, причем донорная последовательность обладает функциональностью редактирования генов. В некоторых вариантах реализации TR (например, ITR), как описано выше, включены на фланкирующих концах последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющую интерес молекулу для редактирования гена (например, нуклеазу (например, специфичную к последовательности нуклеазу), одну или несколько направляющих РНК, Cas или другой рибонуклеопротеин (RNP) или любую их комбинацию. Неограничивающие примеры конструктов нуклеиновых кислот по данному изобретению включают конструкт нуклеиновой кислоты, включающий функционирующий ITR дикого типа AAV2, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 51 и, дополнительно, измененный ITR AAV2, имеющий по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 65%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95%, идентичности последовательности с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 52. Дополнительные ITR описаны в WO 2017/152149 и заявке PCT PCT/US18/49996, которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.
[00297] На Фиг. 8, зкДНК может содержать вторую нуклеотидную последовательность перед первой нуклеотидной последовательностью, как изображено. В определенных вариантах реализации любого из зкДНК-векторов, описанных в данном документе, зкДНК-вектор может дополнительно содержать такую вторую нуклеотидную последовательность в направлении 5' или 3' от первой нуклеотидной последовательности, которая включает донорную последовательность и, необязательно, гомологичные плечи. В некоторых вариантах реализации, представленных на Фиг. 8, зкДНК-вектор может включать третью нуклеотидную последовательность, содержащую второй промотор, функционально связанный с одним или несколькими нуклеотидами, кодирующими направляющую последовательность и/или последовательность РНК-активатора. В некоторых вариантах реализации промотор представляет собой Pol III (U6 (SEQ ID NO: 18) или H1 (SEQ ID NO: 19)).
[00298] В другом варианте реализации зкДНК-вектор кодирует нуклеазу и одну или несколько направляющих РНК, которые направлены на каждую из ITR зкДНК или направлены за пределы областей домена гомологии, для высвобождения при кручении (torsional release) и более эффективной гомологично-направленной репарации (HDR). Нуклеаза не обязательно должна быть мутантной нуклеазой, например, донорная матрица HDR может высвобождаться из зкДНК путем такого расщепления.
[00299] В некоторых вариантах реализации в одном неограничивающем примере зкДНК-вектор для редактирования генов может содержать 5'- и 3'-гомологичное плечо к конкретному гену или целевой сайт интеграции, который имеет сайты рестрикции, специфичные к эндонуклеазе, описанной в данном документе, на любом конце 5'-гомологичного и 3'-гомологичного плеча. Когда зкДНК-вектор расщепляется одной или несколькими рестрикционными эндонуклеазами, специфичными к сайту (сайтам) рестрикции, получающаяся в результате кассета содержит 5'-гомологичное плечо-донорную последовательность-3'-гомологичное плечо и может легче рекомбинировать с желаемым геномным локусом. В определенных аспектах зкДНК-вектор может сам кодировать эндонуклеазу рестрикции, так чтобы при доставке зкДНК-вектора в ядро эндонуклеаза рестрикции экспрессировалась и была способна расщеплять вектор. В определенных аспектах эндонуклеаза рестрикции кодируется вторым зкДНК-вектором, который доставляется отдельно. В определенных аспектах эндонуклеазу рестрикции вводят в ядро с помощью средства доставки, не основанного на зкДНК. Соответственно, в некоторых вариантах реализации технология, описанная в данном документе, позволяет доставлять субъекту более чем одну зкДНК, редактирующую гены. Как описано в данном документе, в одном варианте реализации зкДНК может иметь гомологичные плечи, фланкирующие донорную последовательность, которая нацелена на конкретный ген-мишень или локус, и может в некоторых вариантах реализации также включать одну или несколько направляющих РНК (например, онРНК) для нацеливания разрезания геномной ДНК, как описано в данном документе, и другая зкДНК может содержать нуклеазный фермент и РНК-активатор, как описано в данном документе, для стадий фактического редактирования генов.
A. ДНК-эндонуклеазы
[00300] зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу, такую как последовательность-специфическая нуклеаза. Специфические к последовательности или сайт-специфические нуклеазы могут быть использованы для введения сайт-специфических двухцепочечных разрывов или ников в целевых геномных локусах. Такое расщепление нуклеотидов, например, расщепление ДНК или РНК, стимулирует естественный механизм репарации, например, механизм репарации ДНК, приводя к одному из двух возможных путей репарации. В отсутствие донорной матрицы разрыв будет устранен путем негомологичного присоединения конца (NHEJ), который представляет собой подверженный ошибкам путь восстановления, приводящий к небольшим вставкам или делециям ДНК (см., например, Suzuki et al. Nature 540:144-149 (2016), содержание которого включено посредством ссылки в полном объеме). Этот метод может использоваться для преднамеренного нарушения, удаления или изменения рамки считывания целевых последовательностей генов. Однако если в дополнение к нуклеазе предоставляется донорная матрица, то клеточный механизм будет восстанавливать разрыв методом гомологичной рекомбинации (HDR), которая усиливается на несколько порядков в присутствии расщепления ДНК, или путем вставки донорной матрицы посредством NHEJ.
[00301] Методы могут быть использованы для внесения специфических изменений в последовательность ДНК в сайтах-мишенях. Используемый в данном документе термин «сайт-специфическая нуклеаза» относится к ферменту, способному специфически распознавать и расщеплять конкретную последовательность ДНК. Сайт-специфическая нуклеаза может быть рекомбинантной. Примеры рекомбинантных сайт-специфических нуклеаз включают нуклеазы цинкового пальца (ZFN), эффекторные нуклеазы TAL (TALEN), мегануклеазы и CRISPR/Cas9-ферменты и рекомбинантные производные. Как будет понятно специалистам в данной области, эндонуклеазы, необходимые для редактирования генов, могут экспрессироваться транзиентно, так как обычно необходимость в эндонуклеазе после завершения редактирования генов отсутствует. Такая транзиентная экспрессия может снижать потенциал нецелевых эффектов и иммуногенности. Транзиентная экспрессия может быть выполнена любыми известными в данной области способами и может быть удобно осуществлена с использованием регуляторного переключателя, как описано в данном документе.
[00302] В некоторых вариантах реализации нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеазу, представляет собой кДНК. Неограничивающие примеры специфических к последовательности нуклеаз включают РНК-направляемую нуклеазу, нуклеазу цинкового пальца (ZFN), эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN) или мегануклеазу. Неограничивающие примеры подходящих РНК-направляемых нуклеаз включают ферменты CRISPR, как описано в данном документе.
[00303] Нуклеазы, описанные в данном документе, могут быть изменены, например, рекомбинированы для конструирования последовательность-специфической нуклеазы (см., например, патент США 8021867). Нуклеазы могут быть сконструированы с использованием способов, описанных, например, в Certo, MT et al. Nature Methods (2012) 9:073-975; патентах США №№ 8304222; 8021867; 8119381; 8124369; 8129134; 8133697; 8143015; 8143016; 8148098; или 8163514, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Альтернативно, нуклеазу с характеристиками сайт-специфичного разрезания можно получить с использованием коммерчески доступных технологий, например, технологии редактирования генома Precision BioSciences 'Directed Nuclease Editor™.
[00304] В определенных вариантах реализации, например, при использовании беспромоторного конструкта зкДНК, содержащего матрицу гомологично направляемой репарации, направляющую РНК и/или фермент Cas или любую другую нуклеазу доставляют в транс-конфигурации (in trans), например, путем введения i) нуклеиновой кислоты, кодирующей направляющую РНК, ii) или мРНК, кодирующей желаемую нуклеазу, например, фермент Cas, или другую нуклеазу, iii) или путем введения комплекса рибонуклеотидного белка (RNP), содержащего фермент Cas и направляющую РНК, или iv), например, доставки рекомбинантных белков нуклеазы вектором, например, вирусным, плазмидным или другим зкДНК-вектором. В определенных аспектах, молекулы, доставляемые в транс-конфигурации, доставляются с помощью одного или нескольких дополнительных зкДНК-векторов, которые могут вводиться совместно или последовательно с первым зкДНК-вектором.
[00305] Соответственно, в одном варианте реализации зкДНК-вектор может содержать эндонуклеазу (например, Cas9), которая транскрипционно регулируется индуцибельным промотором. В некоторых вариантах реализации эндонуклеаза находится в отдельном зкДНК-векторе, который может быть введен субъекту с помощью зкДНК, содержащей гомологичные плечи и донорную последовательность, которая необязательно может содержать также направляющую РНК (онРНК). В альтернативных вариантах реализации эндонуклеаза может находиться в векторе зкДНК «все в одном», как описано в данном документе.
[00306] В некоторых вариантах реализации зкДНК кодирует эндонуклеазу, как описано в данном документе, под контролем промотора. Неограничивающие примеры индуцибельных промоторов включают химически регулируемые промоторы, которые регулируют транскрипционную активность посредством присутствия или отсутствия, например, спиртов, тетрациклина, стероидов, металлов и связанных с патогенезом белков (например, салициловой кислотой, этиленом и бензотиадиазолом). и физически регулируемые промоторы, которые регулируют транскрипционную активность, например, посредством наличия или отсутствия света и низких или высоких температур. Модуляция индуцибельного промотора позволяет отключить или включить ген-редактирующую активность зкДНК-вектора. Индуцибельные промоторы Cas9 дополнительно рассмотрены, например, в Cao J., et al. Nucleic Acids Research. 44(19)2016, and Liu KI, et al. Nature Chemical Biol. 12: 90-987 (2016), которые в полном объеме включены в данный документ.
[00307] В одном варианте реализации зкДНК-вектор, описанный в данном документе, дополнительно содержит вторую эндонуклеазу, которая временно нацеливается на первую эндонуклеазу и ингибирует ее активность (например, Cas9). Специалисты в данной области могут определить эндонуклеазы, которые нацелены на другие эндонуклеазы и ингибируют их активность. В другом варианте реализации зкДНК-вектор, описанный в данном документе, дополнительно содержит временную экспрессию «гена анти-CRISPR» (например, ArcIIa L. monocytogenes). Используемый в данном документе термин «ген анти-CRISPR» относится к гену, который, как показано, ингибирует обычно используемую Cas9 S. pyogenes. В другом варианте реализации вторая эндонуклеаза, которая нацелена и ингибирует активность первой эндонуклеазной активности, или ген анти-CRISPR, содержится во втором зкДНК-векторе, который вводят после завершения редактирования нужного гена. Альтернативно, вторая эндонуклеаза нацеливается и ингибирует представляющий интерес ген, например, ген, который был транскрипционно усилен зкДНК-вектором, как описано в данном документе.
[00308] зкДНК-вектор или его композиция, как описано в данном документе, может включать нуклеотидную последовательность, кодирующую активатор транскрипции, который активирует ген-мишень. Например, активатор транскрипции может быть рекомбинированным. Например, рекомбинированный активатор транскрипции может представлять собой систему на основе CRISPR/Cas9, гибридный белок цинковых пальцев или гибридный белок TALE. Система, основанная на CRISPR/Cas9, как описано выше, может использоваться для активации транскрипции гена-мишени с помощью РНК. Система на основе CRISPR/Cas9 может включать гибридный белок, как описано выше, в котором второй полипептидный домен обладает активностью активации транскрипции или активностью модификации гистонов. Например, второй полипептидный домен может включать VP64 или p300. Альтернативно, активатор транскрипции может представлять собой гибридный белок цинкового пальца. ДНК-связывающие домены, нацеленные на цинковый палец, как описано выше, можно комбинировать с доменом, который обладает активностью активации транскрипции или активностью модификации гистонов. Например, домен может включать VP64 или p300. Гибридные белки TALE могут использоваться для активации транскрипции гена-мишени. Гибридный белок TALE может включать ДНК-связывающий домен TALE и домен, который обладает активностью активации транскрипции или активностью модификации гистонов. Например, домен может включать VP64 или p300.
[00309] Другой способ модуляции экспрессии генов на уровне транскрипции заключается в нацеливании на эпигенетические модификации с использованием модифицированных ДНК-эндонуклеаз, как описано в данном документе. Модуляция экспрессии генов на эпигенетическом уровне имеет то преимущество, что наследуется дочерними клетками с более высокой скоростью, чем активация/ингибирование, достигаемая с помощью CRISPRa или CRISPRi. В одном варианте реализации dCas9, слитый с каталитическим доменом ацетилтрансферазы р300, можно использовать со способами и композициями, описанными в данном документе, для осуществления эпигенетических модификаций (например, увеличения модификации гистонов) в желаемой области генома. Эпигенетические модификации также могут быть осуществлены с использованием модифицированных конструктов TALEN, таких как продукт слияния TALEN с каталитическим доменом деметилазы Tet1 (см., например, Maeder et al. Nature Biotechnology 31(12):1137-42 (2013)) или эффектор TAL, слитый с гистон-деметилазой LSD1 (Mendenhall et al. Nature Biotechnology 31(12):1133-6 (2013)).
(i) Модифицированные ДНК-эндонуклеазы, инактивированная Cas9 и их применение.
[00310] В отличие от вирусных векторов, зкДНК-векторы, как описано в данном документе, не имеют капсида, который ограничивает размер или количество последовательностей нуклеиновой кислоты, эффекторных последовательностей, регуляторных последовательностей и т.д., которые могут быть доставлены в клетку. Соответственно, зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут содержать нуклеиновые кислоты, кодирующие «мертвые» (nuclease-dead, с инактивированной нуклеазной активностью) ДНК-эндонуклеазы, никазы или другие ДНК-эндонуклеазы с модифицированной функцией (например, уникальной последовательностью связывания PAM) для усиленной продукции желаемого вектора и/или доставки вектора к клетке. Такие зкДНК-векторы могут также включать промоторные последовательности и другие регуляторные или эффекторные последовательности, по желанию. Учитывая отсутствие ограничений по размеру, специалист в данной области техники легко поймет, что, например, такая экспрессия желаемой нуклеазы с модифицированной функцией и, необязательно, по меньшей мере одной направляющей РНК, может проводиться из последовательностей нуклеиновых кислот в одном и том же векторе, и может находиться под контролем одних и тех же или разных промоторов. В настоящем изобретении также предусматривается, что по меньшей мере две различные модифицированные эндонуклеазы могут быть кодированы в одном и том же векторе, например, для модуляции экспрессии мультиплексированных генов (см. раздел «Модуляция экспрессии мультиплексированных генов» в данном документе) и находиться под контролем одних и тех же или разных промоторов. Таким образом, специалист в данной области может объединить желаемую функциональность по меньшей мере двух разных эндонуклеаз Cas9 (например, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10 или более), при необходимости, включая, например, регулируемую во времени экспрессию по меньшей мере двух различных модифицированных эндонуклеаз одним или несколькими индуцибельными промоторами.
[00311] В некоторых вариантах реализации ДНК-эндонуклеаза для использования со способами и композициями, описанными в данном документе, может быть модифицирована таким образом, чтобы ДНК-эндонуклеаза сохраняла активность связывания ДНК, например, в сайте-мишени генома, определяемом последовательностью направляющей РНК, но не сохраняла активность расщепления (например, «мертвая» нуклеаза Cas9 (dCas9)), или имела пониженную активность расщепления (например, на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере на 60%, при по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 99%) по сравнению с немодифицированной эндонуклеазой ДНК (например, никазой Cas9). В некоторых вариантах реализации модифицированная ДНК-эндонуклеаза используется в данном документе для ингибирования экспрессии гена-мишени. Например, поскольку модифицированная ДНК-эндонуклеаза сохраняет активность связывания ДНК, она может предотвращать связывание РНК-полимеразы и/или вытеснять РНК-полимеразу, что, в свою очередь, предотвращает транскрипцию гена-мишени. Таким образом, предотвращается экспрессия генного продукта (например, мРНК, белка) из желаемого гена.
[00312] Например, «деактивированная Cas9 (dCas9)», «мертвая нуклеаза Cas9» или инактивированная иным образом форма Cas9 может быть введена вместе с направляющей РНК, которая направляет связывание с конкретным геном. Такое связывание может уменьшать ингибирование экспрессии гена-мишени, если это желательно. В некоторых вариантах реализации может быть желательным обратить вспять такое ингибирование экспрессии генов. Это может быть достигнуто, например, путем обеспечения различных направляющих РНК для «мертвого» белка Cas9, чтобы ослабить связывание Cas9 с геномным сайтом. Такое обращение может происходить итеративным образом, когда последовательно вводятся по меньшей мере две или серия направляющих РНК, предназначенных для уменьшения стабильности связывания «мертвой» Cas9. Например, каждая последующая направляющая РНК может увеличивать нестабильность по сравнению со степенью нестабильности/стабильности связывания «мертвой» Cas9, полученной с помощью направляющей РНК в предыдущей итерации. Таким образом, в некоторых вариантах реализации можно использовать dCas9, нацеленную на последовательность гена-мишени с направляющей РНК для «инактивации желаемого гена» без расщепления геномной последовательности, так что представляющий интерес ген не экспрессируется в форме функционального белка. В альтернативных вариантах реализации направляющая РНК может быть сконструирована таким образом, чтобы стабильность связывания dCas9 снижалась, но не устранялась полностью. Таким образом, вытеснение РНК-полимеразы не является полным, что позволяет «уменьшить генную экспрессию» желаемого гена.
[00313] В некоторых вариантах реализации гибридные рекомбиназы могут быть пригодными для использования в зкДНК-векторах по данному изобретению для создания сайтов интеграции на ДНК-мишени. Например, гибридные рекомбиназы, основанные на активированных каталитических доменах, полученных из семейства резолвазы/инвертазы сериновых рекомбиназ, слитых с Cys2-His2 цинкового пальца или ДНК-связывающими доменами TAL-эффектора, представляют собой класс реагентов, способных улучшать специфичность нацеливания в клетках млекопитающих и достигать превосходных показателей сайт-специфической интеграции. Подходящие гибридные рекомбиназы, кодируемые нуклеотидами в зкДНК-векторах в соответствии с данным изобретением, включают описанные в Gaj et al., Enhancing the Specificity of Recombinase-Mediated Genome Engineering through Dimer Interface Redesign, Journal of the American Chemical Society, March 10, 2014 (включенна в данный документ посредством ссылки в полном объеме).
(ii) Эндонуклеазы цинкового пальца и TALEN
[00314] В технологии рестрикционной эндонуклеазы на основе ZFN и TALEN используется неспецифический фермент для разрезания ДНК, который связан со специфической последовательностью ДНК, распознающей пептид(ы), такой как цинковые пальцы, и эффекторы, подобные активатору транскрипции (TALE). Как правило, выбирают эндонуклеазу, в которой сайт распознавания ДНК и сайт расщепления отделены друг от друга, и выделяют ее участок расщепления, а затем связывают с пептидом распознавания последовательности, получая в результате эндонуклеазу с очень высокой специфичностью к желаемой последовательности. Типичным примером фермента рестрикции с такими свойствами является FokI. Кроме того, FokI обладает тем преимуществом, что он требует, чтобы димеризация имела нуклеазную активность, а это означает резкое возрастание специфичности, поскольку каждый партнер нуклеазы распознает уникальную последовательность ДНК. Для усиления этого эффекта были сконструированы нуклеазы FokI, которые могут функционировать только как гетеродимеры и обладают повышенной каталитической активностью. Функционирующие в виде гетеродимера нуклеазы исключают возможность нежелательной гомодимерной активности и, таким образом, увеличивают специфичность двухцепочечного разрыва.
[00315] Хотя нуклеазные части как ZFN, так и TALEN, имеют сходные свойства, разница между этими сконструированными нуклеазами заключается в их пептиде распознавания ДНК. ZFN основаны на цинковых пальцах Cys2-His2, а TALEN - на TALE. Оба этих пептидных домена, распознающих ДНК, характериузуются тем, что они естественным образом встречаются в комбинации в своих белках. Цинковые пальцы Cys2-His2 обычно встречаются в повторах, которые расположены на расстоянии 3 п.о. и находятся в различных комбинациях в различных белках, взаимодействующих с нуклеиновой кислотой, таких как факторы транскрипции. С другой стороны, TALE встречаются в повторах с отношением распознавания один к одному между аминокислотами и распознанными нуклеотидными парами. Поскольку и цинковые пальцы, и TALE встречаются в повторяющихся конфигурациях, можно испробовать разные комбинации для создания широкого спектра специфичности последовательностей. Подходы для создания сайт-специфических эндонуклеаз цинкового пальца включают, в числе прочего, например, модульную сборку (при которой цинковые пальцы, коррелированные с триплетной последовательностью, присоединяются последовательно, чтобы покрыть требуемую последовательность), OPEN (селекция в условиях низкой жесткости пептидных доменов по сравнению с триплетными нуклеотидами с последующей селекцией в условиях высокой жесткости комбинации пептидов по сравнению с конечной мишенью в бактериальных системах) и бактериального одногибридного скрининга библиотек цинковых пальцев. ZFN для использования со способами и композициями, описанными в данном документе, могут быть получены из коммерческих источников, например, от фирмы Sangamo Biosciences™ (Richmond, CA).
[00316] Термины «эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции» или «TALEN», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к рекомбинированным гибридным белкам каталитического домена нуклеазы, такой как эндонуклеаза FokI, и сконструированному ДНК-связывающему домену TALE, который может быть нацелен на индивидуальную (custom) последовательность ДНК. «Мономер TALEN» относится к рекомбинированному гибридному белку с каталитическим нуклеазным доменом и сконструированным ДНК-связывающим доменом TALE. Могут быть сконструированы два мономера TALEN для нацеливания и расщепления области-мишени TALEN.
[00317] Используемые в данном документе термины «эффектор, подобный активатору транскрипции» или «TALE» относятся к белковой структуре, которая распознает и связывается с определенной последовательностью ДНК. «ДНК-связывающий домен TALE» относится к ДНК-связывающему домену, который включает массив тандемных повторов 33-35 аминокислот, также известный как модули RVD, каждый из которых специфически распознает одну пару оснований ДНК. Модули RVD могут быть расположены в любом порядке для сборки массива, распознающего определенную последовательность. Специфичность связывания ДНК-связывающего домена TALE определяется массивом RVD, за которым следует один укороченный повтор из 20 аминокислот. ДНК-связывающий домен TALE может иметь от 12 до 27 модулей RVD, каждый из которых содержит RVD и распознает одну пару оснований ДНК. Были идентифицированы специфические RVD, которые распознают каждый из четырех возможных нуклеотидов ДНК (A, T, C и G). Поскольку ДНК-связывающие домены TALE являются модульными, повторы, распознающие четыре различных нуклеотида ДНК, могут быть связаны вместе для распознавания любой конкретной последовательности ДНК. Такие нацеленные ДНК-связывающие домены могут быть затем объединены с каталитическими доменами для создания функциональных ферментов, включая искусственные факторы транскрипции, метилтрансферазы, интегразы, нуклеазы и рекомбиназы.
[00318] TALEN могут включать нуклеазу и ДНК-связывающий домен TALE, который связывается с целевой последовательностью или геном в области-мишени TALEN. «Область-мишень TALEN» включает области связывания для двух TALEN и спейсерную область, которая расположена между областями связывания. Два TALEN связываются с различными областями связывания в пределах области-мишени TALEN, после чего область-мишень TALEN расщепляется. Примеры TALEN описаны в международной патентной заявке WO2013163628, которая включена посредством ссылки в полном объеме.
[00319] Термины «нуклеаза цинкового пальца» или «ZFN», используемые в данном документе взаимозаменяемо, относятся к молекуле химерного белка, содержащей по меньшей мере один ДНК-связывающий домен цинкового пальца, эффективно связанный с по меньшей мере одной нуклеазой или частью нуклеазы, способной расщеплять ДНК при полной сборке. «Цинковый палец» в контексте настоящего описания относится к структуре белка, которая распознает и связывается с последовательностями ДНК. Домен цинкового пальца является наиболее распространенным ДНК-связывающим мотивом в протеоме человека. Один цинковый палец содержит приблизительно 30 аминокислот, и домен обычно функционирует путем связывания 3 последовательных пар оснований ДНК посредством взаимодействий одной боковой цепи аминокислоты на пару оснований.
[00320] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы в соответствии с данным изобретением включают нуклеотидные последовательности, кодирующие рекомбиназы цинкового пальца (ZFR) или химерные белки, пригодные для введения целевых модификаций в клетки, такие как клетки млекопитающих. В отличие от целевых нуклеаз и традиционных систем SSR, специфичность ZFR является совместным продуктом модульного сайт-специфического распознавания ДНК и зависимого от последовательности катализа. Могут быть созданы ZFR с различными возможностями нацеливания в формате оперативной готовности к работе (plug-and-play). ZFR, включающие усиленные каталитические домены, демонстрируют повышенную специфичность и эффективность нацеливания и обеспечивают сайт-специфическую доставку терапевтических генов в геном человека с низкой токсичностью. Мутагенез интерфейса димера рекомбиназы Cre также улучшает специфичность рекомбинации.
[00321] В вариантах реализации зкДНК-векторы в соответствии с данным изобретением пригодны для использования в HDR-системах без нуклеаз, таких как описанные Porro et al., Promoterless gene targeting without nucleases rescues lethality of a Crigler-Najjar syndrome mouse model, EMBO Molecular Medicine, July 27, 2017 (в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки). В таких вариантах реализации подходы к нацеливанию на гены in vivo являются подходящими для применения зкДНК на основе вставки донорной последовательности без использования нуклеаз. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность может быть беспромоторной.
[00322] В то время как примеры TALEN и ZFN относятся к использованию зкДНК-вектора для редактирования ДНК (например, редактирования геномной ДНК), данное изобретение также охватывает использование функции mtZFN и mitoTALEN или адаптированной для митохондрий платформы CRISPR/Cas9 для использования зкДНК-векторов для редактирования митохондриальной ДНК (мтДНК), как описано Maeder, et al. "Genome-editing technologies for gene and cell therapy." Molecular Therapy 24.3 (2016): 430-446 и Gammage PA, et al. Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized. Trends Genet. 2018;34(2):101-110.
(iii)Эндонуклеазы, направляемые нуклеиновой кислотой
[00323] Различные типы эндонуклеаз, направляемых нуклеиновой кислотой, можно использовать в композициях и способах по изобретению для облегчения опосредованного зкДНК редактирования генов. Типичные неограничивающие примеры типов эндонуклеаз, направляемых нуклеиновой кислотой, пригодных для композиций и способов по изобретению, включают эндонуклеазы, РНК-направляемые, ДНК-направленные эндонуклеазы и редакторы одиночных оснований.
[00324] В некоторых вариантах реализации нуклеазой может представлять собой РНК-направляемую эндонуклеазу. Используемый в данном документе термин «РНК-направляемая эндонуклеаза» относится к эндонуклеазе, которая образует комплекс с молекулой РНК, содержащей область, комплементарную выбранной последовательности ДНК-мишени, так что молекула РНК связывается с выбранной последовательностью для направления активности эндонуклеазы на выбранную последовательностьь ДНК-мишени.
[00325] В одном варианте реализации РНК-направляемая эндонуклеаза представляет собой фермент CRISPR, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации РНК-направляемая эндонуклеаза содержит активность никазы. В некоторых вариантах реализации РНК-направляемая эндонуклеаза направляет расщепление одной или обеих цепей в месте нахождения последовательности-мишени, например, в последовательности-мишени и/или в комплементе последовательности-мишени. В некоторых вариантах реализации РНК-направляемая эндонуклеаза направляет расщепление одной или обеих цепей в пределах примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 или более пар оснований от первого или последнего нуклеотида последовательности-мишени. В других вариантах реализации активность никазы направлена на одну или несколько последовательностей на самих зкДНК-векторах, например, чтобы ослабления ограничений последовательности, так чтобы матрица HDR подвергалась HDR-взаимодействию с геномной последовательностью гена-мишени.
[00326] В определенных вариантах реализации предусматривается, что никаза разрезает по меньшей мере 1 сайт, по меньшей мере 2 сайта, по меньшей мере 3 сайта, по меньшей мере 4 сайта, по меньшей мере 5 сайтов, по меньшей мере 6 сайтов, по меньшей мере 7 сайтов, по меньшей мере 8 сайтов по меньшей мере 9 сайтов, по меньшей мере 10 сайтов или более, на желаемой последовательности нуклеиновой кислоты (например, одной или нескольких областей зкДНК-вектора). В другом варианте реализации предусматривается, что никаза разрезает 1 и/или 2 сайта посредством транс-никирования (trans-nicking). Транс-никирование может улучшить геномное редактирование с помощью HDR, которая является высокоточной, вносит меньше ошибок и, таким образом, уменьшает нежелательные ненаправленные эффекты.
[00327] В некоторых вариантах реализации экспрессионный конструкт или вектор кодируют РНК-направляемую эндонуклеазу, которая мутирована относительно соответствующего фермента дикого типа, так что мутированная эндонуклеаза лишена способности расщеплять одну цепь полинуклеотида-мишени, содержащего последовательность-мишень.
[00328] В некоторых вариантах реализации последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая РНК-направляемую эндонуклеазу, кодон-оптимизирована для экспрессии в конкретных клетках, таких как эукариотические клетки. Эукариотические клетки могут быть получены из конкретного организма, такого как млекопитающее животное. Неограничивающие примеры млекопитающих могут включать человека, мышь, крысу, кролика, собаку или не являющегося человеком примата. В общем, оптимизация кодонов относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в представляющих интерес клетках-хозяевах путем замены по меньшей мере одного кодона (например, примерно, или более чем примерно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 или более кодонов) нативной последовательности на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах данной клетки-хозяина, при сохранении нативной аминокислотной последовательности.
[00329] В некоторых вариантах реализации РНК-направляемая эндонуклеаза является частью гибридного белка, содержащего один или несколько гетерологичных белковых доменов (например, примерно, или более чем примерно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более доменов в дополнение к эндонуклеазе). Гибридный белок направляемой РНК эндонуклеазы может содержать любую дополнительную белковую последовательность и, необязательно, линкерную последовательность между любыми двумя доменами. Примеры белковых доменов, которые могут быть слиты с РНК-направляемой эндонуклеазой, включают, без ограничения, метки эпитопа, последовательности репортерных генов, метки очистки, флуоресцентные белки и белковые домены, обладающие одной или несколькими из следующих активностей: активность метилазы, активность деметилазы, активность активации транскрипции, активность репрессии транскрипции, активность высвобождения фактора транскрипции, активность модификации гистонов, активность расщепления РНК и активность связывания нуклеиновых кислот. Неограничивающие примеры меток эпитопа включают метки гистидина (His), метки V5, метки FLAG, метки гемагглютинина (HA) гриппа, метки Myc, метки VSV-G, глутатион-S-трансферазу (GST), хитин-связывающий белок (CBP) мальтозосвязывающий белок (MBP), поли(NANP), метку тандемной аффинной очистки (TAP), myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, SI, T7, биотин-карбоксилированный белок-носитель (BCCP), кальмодулин и тиоредоксин (Trx). Примеры репортерных генов включают, без ограничений, глутатион-S-трансферазу (GST), пероксидазу хрена (HRP), хлорамфениколацетилтрансферазу (CAT), бета-галактозидазу, бета-глюкуронидазу, люциферазу, зеленые флуоресцентные белки (например, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, мономерный Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), HcRed, DsRed, голубой флуоресцентный белок (CFP), желтые флуоресцентные белки (например, YFP, EYFP, цитрин, Venus YPet, PhiYFP, ZsYellow1), голубые флуоресцентные белки (например, ECFP, Cerulean, CyPet AmCyan1, Midoriishi-Cyan), красные флуоресцентные белки (например, mKate, mKate2, mPlum, мономер DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry, Jred), оранжевые флуоресцентные белки (например, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, мономерный Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) и аутофлуоресцентные белки, включая синий флуоресцентный белок (BFP). РНК-направляемая эндонуклеаза может быть слита с последовательностью гена, кодирующей белок или фрагмент белка, который связывает молекулы ДНК или связывается с другими клеточными молекулами, включая, без ограничений, мальтозосвязывающий белок (MBP), S-tag, продукты слияния ДНК-связывающего домена (DBD) Lex A, продукты слияния ДНК-связывающего домена GAL4 и продукты слияния белка BP16 вируса простого герпеса (HSV). В некоторых вариантах реализации используют меченую эндонуклеазу для идентификации местоположения последовательности-мишени.
[00330] В настоящем изобретении предусматривается, что по меньшей мере два (например, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12, по меньшей мере 15 или более) различных ферментов Cas вводятся или находятся в контакте с клеткой по существу одновременно. Предусматривается использование любой комбинации двухцепочечных индуцирующих разрыв ферментов Cas, Cas-никаз, каталитически неактивных Cas-ферментов (например, dCas9), модифицированных Cas-ферментов, усеченных Cas9 и т.п. в сочетании со способами и композициями, описанными в данном документе.
[00331] В некоторых вариантах реализации эндонуклеаза, направляемая нуклеиновой кислотой, представляет собой эндонуклеазу, направляемую ДНК. См., например, Varshney and Burgess Genome Biol. 17:187 (2016). В одном варианте реализации фермент, участвующий в репарации и/или репликации ДНК, может быть слит с эндонуклеазой с образованием нуклеазы, направляемой ДНК. Одним из неограничивающих примеров является слияние флэп-эндонуклеазы 1 (FEN-1) с эндонуклеазой Fok1 (Xu et al., Genome Biol. 17:186 (2016). В другом варианте реализации могут быть использованы природные ДНК-направляемые нуклеазы. Неограничивающими примерами таких встречающихся в природе нуклеаз являются прокариотические эндонуклеазы из семейства белков Argonaute (Kropocheva et al., FEBS Open Bio. 8(S1): P01-074 (2018). В некоторых вариантах реализации эндонуклеаза, направляемая нуклеиновой кислотой, представляет собой «редактор одиночных оснований», который является химерным белком, состоящим из нацеливающего ДНК-модуля и каталитического домена, способного модифицировать нуклеотидные основания одного типа (Rusk, N, Nature Methods 15:763 (2018); Eid et al., Biochem J. 475(11): 1955-64 (2018)). Поскольку такие редакторы одиночных оснований не генерируют двухцепочечные разрывы в целевой ДНК для осуществления редактирования основания ДНК, генерация вставок и делеций (например, инделов) ограничена, что улучшает точность процесса редактирования. Известны разные типы редакторов одиночных оснований. Например, цитидин-деаминазы (ферменты, которые катализируют превращение цитозина в урацил) могут быть связаны с нуклеазами, такими как APOBEC-dCas9, где APOBEC обеспечивает функциональность цитидин-деаминазы и направляется dCas9 для дезаминирования определенного цитидина в урацил. Получающиеся в результате несоответствия U-G устраняются с помощью механизмов репарации и образуют пары оснований U-A, которые транслируются в точечные мутации C-на-T (Komor et al., Nature 533: 420-424 (2016); Shimatani et al., Nat. Biotechnol. 35: 441-443 (2017)). Были сконструированы редакторы одиночных оснований ДНК на основе адениндеаминазы. Они дезаминируют аденозин с образованием инозина, который может образовывать пару оснований с цитидином и быть исправлен на гуанин, так что пара A-T может быть преобразована в пару G-C. Примеры таких редакторов включают TadA, ABE5.3, ABE7.8, ABE7.9 и ABE7.10 (Gaudelli et al., Nature 551: 464-471 (2017).
(iv) Системы CRISPR/Cas
[00332] Как известно в данной области техники, система CRISPR-CAS9 представляет собой особый набор систем на основе нуклеаз, направляемых нуклеиновыми кислотами, включающих комбинацию белка и рибонуклеиновой кислоты («РНК»), которая может изменять генетическую последовательность организма. Система CRISPR-CAS9 продолжает развиваться как мощный инструмент для модификации специфической дезоксирибонуклеиновой кислоты («ДНК») в геномах многих организмов, таких как микробы, грибы, растения и животные. Например, могут быть быстро разработаны мышиные модели заболеваний человека для ускорения изучения отдельных генов, и легкой замены сразу нескольких генов в клетках для изучения их взаимодействий. Специалист в данной области может выбирать между рядом известных систем CRISPR, таких как тип I, тип II и тип III. Система CRISPR-CAS типа II имеет хорошо известный механизм, включающий три компонента: (1) молекулу крДНК, которая называется «направляющей последовательностью» или «РНК-целеуказателем» (targeter-RNA); (2) «трансактивирующую (tracr) РНК» или «РНК-активатор»; и (3) белок под названием Cas9.
[00333] Чтобы изменить молекулу ДНК, в системе происходит ряд взаимодействий, включая: (1) связывание направляющей последовательности путем специфического спаривания оснований с определенной последовательностью представляющей интерес ДНК («ДНК-мишень»), (2) связывание направляющей последовательности посредством специфическое спаривание оснований в другой последовательности с РНК-активатором, и (3) взаимодействие РНК-активатора с белком Cas (например, белком Cas9), который затем выступает в роли нуклеазы для разрезания ДНК-мишени в определенном сайте. Подходящие системы для использования с зкДНК-векторами в соответствии с данным изобретением дополнительно описаны Van Nierop, et al. Stimulation of homology-directed gene targeting at an endogenous human locus by a nicking endonuclease, Nucleic Acid Research, August 2009, и Ran et al., Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.
[00334] зкДНК-векторы в соответствии с данным изобретением могут быть сконструированы так, чтобы включать нуклеотиды, кодирующие один или несколько компонентов этих систем, таких как направляющая последовательность, трансактивирующая (tracr) РНК или Cas (например, Cas9). В некоторых вариантах реализации один промотор управляет экспрессией направляющей последовательности и tracr-РНК, а отдельный промотор управляет экспрессией Cas (например, Cas9). Специалисту в данной области понятно, что определенные нуклеазы Cas требуют присутствия мотива протоспейсера (PAM) рядом с последовательностью нуклеиновой кислоты-мишени. В некоторых вариантах реализации PAM может быть расположен рядом или на расстоянии 1, 2, 3 или 4 нуклеотидов от 3'-конца последовательности-мишени. Длина и последовательность PAM могут зависеть от конкретного белка Cas. Типичные последовательности PAM включают NGG, NGGNG, NG, NAAAAN, NNAAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA, TTN и NNNNGATT (где N обозначает любой нуклеотид, а W обозначает A или T). В некоторых вариантах реализации последовательность PAM может находиться на направляющей РНК, например, при редактировании РНК.
[00335] В некоторых вариантах реализации РНК-направляемые нуклеазы, включая Cas и Cas9, являются подходящими для использования в зкДНК-векторах, предназначенных для обеспечения одного или нескольких компонентов для геномной инженерии с использованием системы CRISPR-Cas9. См., например, публикацию США 2014/0170753, включенную в данный документ посредством ссылки в полном объеме. CRISPR-Cas9 обеспечивает набор инструментов для Cas9-опосредованного редактирования генома посредством негомологичного присоединения концов (NHEJ) или гомологичной репарации (HDR) в клетках млекопитающих, а также создания модифицированных клеточных линий для последующих функциональных исследований. Чтобы минимизировать ненаправленное расщепление, система CRISPR-Cas9 может включать стратегию двойного никирования с использованием мутанта никазы Cas9 с парными направляющими РНК. Такая система известна в данной области техники и описана, например, в Ran et al., Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system, Nature Protocols, 24 October 2013, и Zhang, et al., Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage, Genome Biology, 2017 (оба источника в полном объеме включены в настоящее описание посредством ссылки).
[00336] В некоторых вариантах реализации система зкДНК включает нуклеазу и направляющие РНК, которые направлены на последовательность зкДНК. Например, никующий CAS, такой как nCAS9 D10A, может быть использован для повышения эффективности редактирования генов. Направляющие РНК могут направлять никирование кДНК с помощью nCAS, тем самым ослабляя вызванные скручиванием ограничения зкДНК для более эффективной репарации и/или экспрессии генов. Использование никующей нуклеазы ослабляет вызванные скручиванием ограничения при сохранении последовательности и структурной целостности, что позволяет никированной ДНК персистировать в ядре. Направляющие РНК могут быть направлены на одну и ту же цепь ДНК или на комплементарную цепь. Направляющие РНК могут быть направлены, например, на ITRS, или последовательности, проходящие промоторы (sequences proceeding promoters), или домены гомологии и т.д.
[00337] В одном варианте реализации РНК-направляемая эндонуклеаза представляет собой фермент CRISPR, такой как белок Cas. Неограничивающие примеры белков Cas включают Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5e (CasD), Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9 (также известен как Csn1 и Csx12), Cas10, Cas10d, Cas13, Cas13a, Cas13c, CasF, CasH, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx11, Csx16, CsaX, Csz1, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cul966, Cpf1, C2c1, C2c3, их гомологи или их модифицированные варианты. В одном варианте реализации белок Cas представляет собой Cas9. В другом варианте реализации белок Cas представляет собой «мертвую» нуклеазу Cas9 (dCas9) или никазу Cas9. В одном варианте реализации белок Cas представляет собой никующий фермент Cas (nCas).
[00338] Как правило, РНК-направляемая эндонуклеаза обладает активностью расщепления ДНК, такой как двухцепочечные разрывы, инициированные Cas9. В некоторых вариантах реализации РНК-направляемая эндонуклеаза представляет собой Cas9, например, Cas9 из S. pyogenes или S. pneumoniae. Другие неограничивающие бактериальные источники Cas9 включают: Streptococcus pyogenes, Streptococcus pasteurianus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Staphylococcus aureus, Alicyclobaccillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Francisella novicida, Wolinella succinogenes, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Listeria innocua, Lactobacillus gasseri, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Fibrobacter succinogene, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, Sutterella wadsworthensis, Gamma proteobacterium, Neisseria cinerea, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Parvibaculum lavamentivorans, Corneybacterium diphtheria, Pasteurella multocida, Rhodospirillum rubrum, Nocardiopsis dassonvillei, или Acaryochloris marina.
[00339] В одном варианте реализации никаза Cas9 содержит nCas9 D10A. Например, замена аспартата на аланин (D10A) в каталитическом домене RuvCI Cas9 из S. pyogenes превращает Cas9 из нуклеазы, которая расщепляет обе цепи, в никазу (расщепляет одну цепь). Другие примеры мутаций, которые делают Cas9 никазой, включают, без ограничений, H840A, N854A и N863A. В некоторых вариантах реализации никаза Cas9 может быть использована в комбинации с направляющей последовательностью (последовательностями), например, двумя направляющими последовательностями, которые нацелены соответственно на смысловые и антисмысловые цепи ДНК-мишени. Эта комбинация позволяет надрезать обе цепи и использовать их для индуцирования репарации путем негомологичного присоединения конца (NHEJ).
[00340] В некоторых вариантах реализации РНК-направляемая эндонуклеаза представляет собой Cas13. Каталитически неактивный Cas13 (dCas13) можно использовать для редактирования последовательностей мРНК, как описано, например, в Cox, D et al. RNA editing with CRISPR-Cas13 Science (2017) DOI: 10.1126/science.aaq0180, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.
[00341] В некоторых вариантах реализации кодирующий эндонуклеазу зкДНК-вектор, описанный в данном документе, представляет собой Cas9 (например, SEQ ID NO: 829) или аминокислотный или функциональный фрагмент нуклеазы, имеющий по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 65%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 829 ( Cas9) или состоящий из SEQ ID NO: 829. В некоторых вариантах реализации Cas 9 включает одну или несколько мутаций в каталитическом домене, делающих Cas 9 никазой, которая расщепляет одну цепь ДНК, такой как описанные в публикации патента США № 2017-0191078-A9 (включена в полном объеме посредством ссылки).
[00342] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы по данному изобретению являются подходящими для использования в системах и способах на основе РНК-запрограммированного Cas9, имеющего функциональность нацеливания на гены и редактирования генома. Например, зкДНК-векторы по данному изобретению являются подходящими для использования с кластерными регулярно перемежающимися короткими палиндромными повторами или CRISPR-ассоциированными (Cas) системами для нацеливания генов и редактирования генов. Системы CRISPR cas9 известны в данной области техники и описаны, например, в заявке на патент США № 13/842859, поданной в марте 2013 г., и в патентах США №№ 8697359, 8771945, 8795965, 8865406, 8871445, которые все включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
[00343] В настоящем изобретении также предусматривается, что Cas9, никаза Cas9 или деактивированный Cas9 (dCas9, также называемый «мертвой» нуклеазой Cas9 или «каталитически неактивным») также получают в виде гибридных белков с FokI, так что редактирование генов или модуляция экспрессии генов происходит при образовании гетеродимеров FokI.
[00344] Кроме того, dCas9 можно использовать для активации (CRISPRa) или ингибирования (CRISPRi) экспрессии желаемого гена на уровне регуляторных последовательностей, расположенных перед последовательностью гена-мишени. CRISPRa и CRISPRi могут осуществляться, например, путем слияния dCas9 с эффекторной областью (например, слияние dCas9/эффектор) и подачи направляющей РНК, которая направляет слитый белок dCas9/эффектор для связывания с последовательностью, расположенной выше желаемого гена или гена-мишени (например, в области промотора). Поскольку dCas9 не обладает нуклеазной активностью, он остается связанным с сайтом-мишенью в области промотора, и эффекторная часть слитого белка dCas9/эффектор может рекрутировать транскрипционные активаторы или репрессоры в сайт промотора. По существу, можно по желанию активировать или уменьшать экспрессию гена-мишени. Предшествующие работы, описанные в литературе, указывает на то, что использование множества направляющих РНК, коэкспрессированных с dCas9, может увеличить экспрессию желаемого гена (см., например, Maeder et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes Nat Methods 10(10):977-979 (2013). В некоторых вариантах реализации желательно дозволить индуцируемую репрессию желаемого гена. Это может быть достигнуто, например, путем использования сайтов связывания направляющей РНК в промоторных областях выше сайта начала транскрипции (см., например, Gao et al. Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators. Nature Methods (2016)). В некоторых вариантах реализации, вариант «мертвой» нуклеазы эндонуклеазы ДНК (например, dCas9) может быть использован для индуцируемой активации или увеличения экспрессии желаемого гена, например, путем введения агента, который взаимодействует с эффекторным доменом (например, небольшой молекулы или по крайней мере одной направляющей РНК) слитого белка dCas9/эффектор. В других вариантах реализации данного изобретения также предусматривается, что dCas9 может быть слит с индуцируемым химически или с помощью света доменом, так что экспрессия гена может модулироваться с использованием внешних сигналов. В одном варианте реализации ингибирование экспрессии гена-мишени осуществляют с использованием dCas9, слитого с репрессорным доменом KRAB, что может быть полезным для улучшенного ингибирования экспрессии гена в системах млекопитающих и приводить к меньшему количеству ненаправленных эффектов. Альтернативно, основанная на транскрипции активация гена может быть осуществлена с использованием dCas9, слитого с омега-субъединицей РНК-полимеразы, или активаторов транскрипции VP64 или p65.
[00345] Соответственно, в некоторых вариантах реализации способы и композиции, описанные в данном документе, например, зкДНК-векторы, могут содержать и/или использоваться для доставки систем CRISPRi (CRISPR-интерференция) и/или CRISPRa (CRISPR-активация) в клетку-хозяина. Системы CRISPRi и CRISPRa содержат деактивированную РНК-направляемую эндонуклеазу (например, Cas9), которая не может генерировать разрыв двойной цепи (DSB). Это позволяет эндонуклеазе в сочетании с направляющими РНК специфически связываться с последовательностью-мишенью в геноме и обеспечивать РНК-направляемый обратимый контроль транскрипции. В одном варианте реализации зкДНК-вектор содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую нуклеазу и/или направляющую РНК, но не содержит матрицу гомологично направляемой репарации или соответствующие гомологичные плечи.
[00346] В некоторых вариантах реализации CRISPRi указанная эндонуклеаза может содержать эффекторный домен KRAB. С эффекторным доменом KRAB, или без него, связывание деактивированной нуклеазы с геномной последовательностью может, например, блокировать инициацию или прогрессирование транскрипции и/или препятствовать связыванию транскрипционного механизма или факторов транскрипции.
[00347] В CRISPRa деактивированная эндонуклеаза может быть слита с одним или несколькими доменами активации транскрипции, тем самым увеличивая транскрипцию в сайте, на который нацелена эндонуклеаза, или около него. В некоторых вариантах реализации CRISPRa может дополнительно содержать нРНК, которые рекрутируют дополнительные домены активации транскрипции. Конструирование онРНК для CRISPRi и CRISPRa известно в данной области техники (см., например, Horlbeck et al. eLife. 5, e19760 (2016); Gilbert et al., Cell. 159, 647-661 (2014); и Zalatan et al., Cell. 160, 339-350 (2015); которые все включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме). CRISPRi и CRISPRa-совместимые онРНК для определенной мишени также могут быть получены из коммерческих источников (см., например, Dharmacon; Lafayette, CO). Дополнительное описание CRISPRi и CRISPRa приведено, например, в Qi et al., Cell. 152, 1173-1183 (2013); Gilbert et al., Cell. 154, 442-451 (2013); Cheng et al., Cell Res. 23, 1163-1171 (2013); Tanenbaum et al. Cell. 159, 635-646 (2014); Konermann et al., Nature. 517, 583-588 (2015); Chavez et al., Nat. Methods. 12, 326-328 (2015); Liu et al., Science. 355 (2017); и Goyal et al., Nucleic Acids Res. (2016); которые все включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
[00348] Соответственно, в некоторых вариантах реализации, в данном изобретении описывается зкДНК-вектор, содержащий деактивированную эндонуклеазу, например, РНК-направляемую эндонуклеазу и/или Cas9, при этом у деактивированной эндонуклеазы отсутствует эндонуклеазная активность, но сохраняется способность связывать ДНК сайт-специфическим образом, например, в сочетании с одной или несколькими направляющими РНК и/или онРНК. В некоторых вариантах реализации вектор может дополнительно содержать одну или несколько трансактивирующих РНК (tracrRNA), направляющих РНК или онРНК. В некоторых вариантах реализации деактивированная эндонуклеаза может дополнительно содержать домен активации транскрипции. В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы по данному изобретению также полезны для систем с деактивированной нуклеазой, таких как системы CRISPRi или CRISPRa dCas, системы nCas или Cas13, которые все являются хорошо известными специалистам.
[00349] В настоящем изобретении также предусматривается, что векторы, описанные в данном документе, можно использовать в комбинации с dCas9 для визуализации геномных локусов в живых клетках (см., например, Ma et al. Multicolor CRISPR labeling of chromosomal loci in human cells PNAS 112(10):3002-3007 (2015)). CRISPR-опосредованная визуализация генома и его организация в ядре также называется 4-мерным (4-D) нуклеомом. В одном варианте реализации dCas9 модифицируют так, чтобы он содержал флуоресцентную метку. Несколько локусов могут быть помечены разными цветами, например, с использованием ортологов, которые все слиты с разными флуоресцентными метками. Эта методика может быть расширена для изучения структуры генома, например, путем использования направляющих РНК, которые связывают последовательности Alu, чтобы помочь в картировании расположения повторов, заданных в направляющих РНК (см., например, McCaffrey et al. Nucleic Acids Res 44(2):e11 (2016)). Таким образом, в некоторых вариантах реализации данное изобретение предусматривает картирование клинически значимых локусов, например, для идентификации и/или диагностики болезни Гентингтона, среди прочего. Способы выполнения визуализации генома или генетического скрининга с помощью зкДНК-вектора (векторов), кодирующих систему редактирования генов, известны в данной области техники и/или описаны, например, в Chen et al. Cell 155:1479-1491 (2013); Singh et al. Nat Commun 7:1-8 (2016); Korkmaz et al. Nat Biotechnol 34:1-10 (2016); Hart et al. Cell 163:1515-1526 (2015); содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
[00350] В некоторых вариантах реализации может быть желательным редактировать в геноме единственное основание, например, модифицировать однонуклеотидный полиморфизм, связанный с конкретным заболеванием (см., например, Komor, AC et al. Nature 533:420-424 (2016); Nishida, K et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science (2016)). Редактирование одиночного нуклеотидного основания использует конвертирующий основание фермент, сцепленный с каталитически неактивной эндонуклеазой (например, «мертвой» нуклеазой Cas9), которая не разрезает локусы гена-мишени. После конвертирования основания ферментом, редактирующим основание, система делает надрез на противоположной, неотредактированной цепи, который восстанавливается с помощью собственных механизмов репарации ДНК клетки. Это приводит к замене исходного нуклеотида, который теперь является «несовпадающим нуклеотидом», тем самым завершая конверсию отдельной пары нуклеотидных оснований. Доступны эндогенные ферменты для осуществления преобразования пар нуклеотидов G/C в пары нуклеотидов A/T, например, цитидиндезаминазы, однако эндогенного фермента для катализа обратного превращения пар нуклеотидов A/T в пары G/C не существует. Адениндеаминазы (например, TadA), которые обычно воздействуют только на РНК для превращения аденина в инозин, эволюционно селектировались в бактериальных системах для идентификации мутантов адениндеаминазы, которые действуют на ДНК, превращая аденозин в инозин (см., например, Gaudelli et al. Nature (2017), в печати doi:10.1038/nature24644, содержание которой включено посредством ссылки в полном объеме).
[00351] В некоторых вариантах реализации dCas9 или модифицированный Cas9 с функцией никазы могут быть слиты с ферментом, имеющим функцию редактирования основания (например, цитидиндеаминазой APOBEC1 или мутантом TadA). Эффективность редактирования основания может быть дополнительно улучшена путем включения ингибитора эндогенных систем эксцизионной репарации, которые удаляют урацил из геномной ДНК. См. Gaudelli et al. (2017) programmable base editing of A-T to G-C in genomic DNA without DNA cleavage, Nature, опубликовано онлайн 25 октября 2017 г., в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки.
[00352] В настоящем изобретении также предусматривается, что желаемая эндонуклеаза модифицируется путем добавления убиквитина или полиубиквитиновой цепи. В некоторых вариантах реализации убиквитин может представлять собой убиквитин-подобный белок (UBL). Неограничивающие примеры убиквитин-подобных белков включают малый убиквитин-подобный модификатор (SUMO), перекрестно-реактивный белок убиквитина (UCRP, также известный как интерферон-стимулируемый ген 15 (ISG-15)), убиквитин-связанный модификатор-1 (URM1), экспрессируемый клетками-предшественниками нейронов подавляемый с развитием белок-8 (NEDD8, также называемый Rubl у S. cerevisiae), F-ассоциированный антиген лейкоцитов человека (FAT 10), аутофагия-8 (ATG8) и -12 (ATG12), убиквитин-подобный Fau-белок (FUB1), закрепленный на мембране UBL (убиквитин-подобный белок) (MUB), модификатор-1 убиквитин-складки (UFM1) и убиквитин-подобный белок-5 (UBL5).
[00353] зкДНК-векторы или их композиции могут кодировать модифицированные эндонуклеазы ДНК, как описано, например, в: Fu et al. Nat Biotechnol 32:279-284 (2013); Ran et al. Cell 154:1380-1389 (2013); Mali et al. Nat Biotechnol 31:833-838 (2013); Guilinger et al. Nat Biotechnol 32:577-582 (2014); Slaymaker et al. Science 351:84-88 (2015); Klenstiver et al. Nature 523:481-485 (2015); Bolukbasi et al. Nat Methods 12:1-9 (2015); Gilbert et al. Cell 154;442-451 (2012); Anders et al. Mol Cell 61:895-902 (2016); Wright et al. Proc Natl Acad Sci USA 112:2984-2989 (2015); Truong et al. Nucleic Acids Res 43:6450-6458 (2015); содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
(v) МегаТАЛы
[00354] В некоторых вариантах реализации описанная в данном документе эндонуклеаза может представлять собой мегаТАЛ (megaTAL). МегаТАЛ представляют собой слитые белки, которые включают эффекторный домен, подобный активатору транскрипции (TAL), и домен мегануклеазы. МегаТАЛ сохраняют присущую TAL простоту инженерии специфичности при одновременном снижении нецелевых эффектов и общего размера ферментов, и повышении активности. Конструирование и использование megaTAL более подробно описаны, например, в: Boissel et al. 2014 Nucleic Acids Research 42(4):2591-601 и Boissel 2015 Methods Mol Biol 1239:171-196; которые все включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Протоколы для megaTAL-опосредованного нокаута генов и редактирования генов известны в данной области, см., например, Sather et al. Science Translational Medicine 2015 7(307):ra156 и Boissel et al. 2014 Nucleic Acids Research 42(4):2591-601; которые все включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме. МегаТАЛ могут быть использованы в качестве альтернативной эндонуклеазы в любом из способов и композиций, описанных в данном документе.
(vi) Мультиплексная модуляция экспрессии генов и сложные системы
[00355] Отсутствие ограничений по размеру зкДНК-векторов, как описано в данном документе, особенно полезно при мультиплексном редактировании, CRISPRa или CRISPRi, потому что множество направляющих РНК могут быть экспрессированы из одного и того же зкДНК-вектора, если это желательно. CRISPR представляет собой надежную систему, и добавление множественных направляющих РНК существенно не влияет на эффективность редактирования генов, CRISPRa, CRISPRi или CRISPR-опосредованного мечения нуклеиновых кислот. Как описано в другом месте, множество направляющих РНК могут находиться под контролем одного промотора (например, полицистронного транскрипта) или под контролем множества промоторов (например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6 и т.д., до предельного соотношения последовательностей направляющая РНК:промотор, равного 1:1).
[00356] Мультиплексная система на основе CRISPR/Cas9 использует преимущества простоты и низкой стоимости конструирования онРНК и может быть полезна для использования достижений высокопроизводительных методов исследования генома с использованием технологии CRISPR/Cas9. Например, зкДНК-векторы, описанные в данном документе, полезны для экспрессии Cas9 и многочисленных одиночных направляющих РНК (онРНК) в сложных клеточных линиях. Мультиплексная система на основе CRISPR/Cas9 может использоваться таким же образом, как описанная выше система на основе CRISPR/Cas9. Мультиплексный CRISPR/Cas может быть выполнен, как описано в Cong, L et al. Science 819 (2013); Wang et al. Cell 153:910-918 (2013); Ma et al. Nat Biotechnol 34:528-530 (2016); содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
[00357] В дополнение к описанной активации транскрипции и функциональности нуклеаз эта система будет полезна для экспрессии других новых эффекторов на основе Cas9, которые контролируют эпигенетические модификации для разнообразных целей, включая исследование архитектуры генома и путей эндогенной регуляции генов. Поскольку эндогенная регуляция генов представляет собой тонкий баланс между несколькими ферментами, мультиплексные системы Cas9 с различными функциональными возможностями позволят исследовать сложные взаимодействия между различными регуляторными сигналами. Вектор, описанный в данном документе, должен быть совместим с аптамер-модифицированными нРНК и ортогональными Cas9 для обеспечения возможности независимых генетических манипуляций с использованием одного набора нРНК.
[00358] Мультиплексная система на основе CRISPR/Cas9 может использоваться для активации по крайней мере одного эндогенного гена в клетке. Способ включает контактирование клетки с модифицированным лентивирусным вектором. Эндогенный ген может быть транзиентно активирован или стабильно активирован. Эндогенный ген может быть транзиентно репрессирован или стабильно репрессирован. Слитый белок может экспрессироваться на уровнях, сходных с онРНК. Слитый белок может экспрессироваться на уровнях, отличных от онРНК. Клетка может быть первичной клеткой человека.
[00359] Мультиплексная система на основе CRISPR/Cas9 может использоваться в способе мультиплексного редактирования генов в клетке. Способ включает контактирование клетки с зкДНК-вектором. Мультиплексное редактирование гена может включать коррекцию мутантного гена или вставку трансгена. Коррекция мутантного гена может включать удаление, реаранжировку или замену мутантного гена. Коррекция мутантного гена может включать нуклеаза-опосредованное негомологичное присоединение конца или гомологично направляемую репарацию. Мультиплексное редактирование гена может включать делецию или коррекцию по меньшей мере одного гена, при этом ген представляет собой эндогенный нормальный ген или мутантный ген.
[00360] Мультиплексное редактирование генов может включать делецию или коррекцию по меньшей мере двух генов. Например, по меньшей мере два гена, по меньшей мере три гена, по меньшей мере четыре гена, по меньшей мере пять генов, по меньшей мере шесть генов, по меньшей мере семь генов, по меньшей мере восемь генов, по меньшей мере девять генов или по меньшей мере десять генов могут быть удалены или откорректированы.
[00361] Мультиплексная система на основе CRISPR/Cas9 может использоваться в методе мультиплексной модуляции экспрессии генов в клетке. Способ включает контактирование клетки с модифицированным лентивирусным вектором. Способ может включать модулирование уровней генной экспрессии по меньшей мере одного гена. Экспрессия по меньшей мере одного гена-мишени модулируется, когда уровни экспрессии по меньшей мере одного гена-мишени увеличиваются или уменьшаются по сравнению с нормальными уровнями экспрессии для по меньшей мере для одного гена-мишени. Уровни экспрессии гена могут быть уровнями РНК или белка.
[00362] В некоторых вариантах реализации данного изобретения также предусматривается, что экспрессия множества генов модулируется путем введения множества ортогональных Cas с множеством направляющих РНК (например, мультиплексная модуляция экспрессии генов или «ортогональные системы dCas9»). Например, разные белки Cas или белки Cas9. Специалисту в данной области понятно, что множество направляющих РНК должно быть спроектировано так, чтобы минимизировать нецелевые эффекты или взаимодействия РНК друг с другом. Ортогональные системы dCas9 допускают одновременную активацию определенных желаемых генов с репрессией других желаемых генов. Например, множество ортогональных белков Cas (например, белков Cas9), полученных из комбинации бактериальных видов, например, S. pyogenes, N. meninigitidis, S. thermophilus и T. denticola, можно использовать в комбинации, как описано, например, в Esvelt K et al. Nature Methods 10(11):1116-1121 (2013), которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки. В некоторых вариантах реализации множество последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих множество направляющих РНК, присутствуют в одном и том же векторе. Кроме того, каждый dCas9 может быть спарен с отдельной индуцибельной системой, которая может обеспечивать возможность независимого контроля активации и/или репрессии желаемых генов. Кроме того, такая индуцибельная ортогональная система dCas9 также может позволить регулировать экспрессию генов во времени (см., например, Gao et al. Nature Methods Complex transcriptional modulation with orthogonal and inducible dCas9 regulators (2016)).
B. Гомологично направляемые матрицы репарации
[00363] В некоторых вариантах реализации в зкДНК-векторе также предусматривается матрица гомологично направляемой рекомбинации или матрица «репарации», например, в качестве донорной последовательности и/или части донорной последовательности. В настоящем изобретении предусматривается, что матрица гомологично направляемой репарации может использоваться для восстановления последовательности гена или для вставки новой последовательности, например, для производства терапевтического белка. В некоторых вариантах реализации матрица репарации предназначена для использования в качестве матрицы в гомологичной рекомбинации, такой как внутри или вблизи последовательности-мишени, никированной или расщепленной нуклеазой, описанной в данном документе, например, РНК-направляемой эндонуклеазой, такой как фермент CRISPR, в качестве части комплекса CRISPR, или ZFN или TALE. Матричный полинуклеотид может иметь любую подходящую длину, такую как приблизительно 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000 или более нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах реализации матричный полинуклеотид является комплементарным части полинуклеотида, содержащей последовательность-мишень в геноме клетки-хозяина. При оптимальном выравнивании матричный полинуклеотид может перекрываться с одним или несколькими нуклеотидами последовательности-мишени (например, примерно или более чем примерно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более нуклеотидами). В некоторых вариантах реализации, когда матричная последовательность и полинуклеотид, содержащий последовательность-мишень, оптимально выровнены, ближайший нуклеотид матричного полинуклеотида находится в пределах примерно 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300. 400, 500, 1000, 5000, 10000 или более нуклеотидов от последовательности-мишени. В одном варианте реализации гомологичные плечи матрицы репарации являются направленными (т.е. не идентичными и, следовательно, связываются с последовательностью в определенной ориентации). В некоторых вариантах реализации предусмотрены две или более матриц HDR для репарации одного гена в клетке или двух разных генов в клетке. В некоторых вариантах реализации множественные копии по меньшей мере одной матрицы вводятся в клетку.
[00364] В некоторых вариантах реализации матричная последовательность может быть по существу идентична части последовательности эндогенного гена-мишени, но содержит по меньшей мере один измененный нуклеотид. В некоторых вариантах реализации репарация расщепленной молекулы нуклеиновой кислоты-мишени может привести, например, к (i) одному или нескольким нуклеотидным изменениям в РНК, экспрессируемой из гена-мишени, (ii) измененному уровню экспрессии гена-мишени, (iii) нокдауну гена, (iv) нокауту гена, (v) восстановлению функции гена, или (vi) нокауту гена и одновременной вставке гена. Как будет легко понятно специалисту в данной области техники, репарация расщепленной молекулы-мишени нуклеиновой кислоты с помощью матрицы может привести к изменению последовательности экзона, последовательности интрона, регуляторной последовательности, последовательности транскрипционного контроля, последовательности трансляционного контроля, сайта сплайсинга или некодирующей последовательности гена-мишени. В других вариантах реализации матричная последовательность может содержать экзогенную последовательность, которая может приводить к нокину гена. Интеграция экзогенной последовательности может привести к нокауту гена.
[00365] В некоторых вариантах реализации донорная последовательность находится в бескапсидном зкДНК-векторе, также включающем один или несколько элементов интеграции, таких как 5'-гомологичному плечу и/или 3'-гомологичное плечо. Как минимум, в некоторых таких вариантах реализации зкДНК содержит, в направлении от 5' к 3', 5' плечо HDR, донорную последовательность, 3' плечо HDR и по меньшей мере один ITR, при этом по меньшей мере один ITR находится выше 5' плеча HDR или ниже 3' плеча HDR. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность (такая как, без ограничений, фактор IX или фактор VIII (или, например, любой другой терапевтический белок, представляющий интерес), представляет собой нуклеотидную последовательность, которая должна быть вставлена в хромосому клетки-хозяина. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность изначально не присутствует в клетке-хозяине или может быть чужеродной для клетки-хозяина. В определенных вариантах реализации донорная последовательность представляет собой эндогенную последовательность, присутствующую в сайте, отличном от предварительно определенного сайта-мишени. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность представляет собой эндогенную последовательность, аналогичную последовательности предварительно определенного сайта-мишени (например, заменяет существующую ошибочную последовательность). В определенных вариантах реализации донорная последовательность представляет собой последовательность, эндогенную для клетки-хозяина, но присутствующую в сайте, отличном от предварительно определенного сайта-мишени. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность представляет собой кодирующую последовательность или некодирующую последовательность. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность представляет собой мутантный локус гена. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность может быть экзогенным геном, который должен быть вставлен в хромосому, модифицированной последовательностью, которая заменяет эндогенную последовательность в сайте-мишени, регуляторным элементом, меткой или кодирующей последовательностью, которая кодирует репортерный белок и/или РНК. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность может быть вставлена в рамке в кодирующую последовательность гена-мишени для экспрессии слитого белка. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность представляет собой не цельную ORF (кодирующую/донорную последовательность), а только корректирующую часть ДНК, которая предназначена для замены желаемой мишени. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность вставляется в рамке позади эндогенного промотора, так чтобы донорная последовательность регулировалась аналогично встречающейся в природе последовательности.
[00366] В определенных вариантах реализации донорная последовательность может необязательно включать промотор, как описано выше, для управления кодирующей последовательностью. Такие варианты реализации могут дополнительно включать поли-А-хвост в донорной последовательности для облегчения экспрессии.
[00367] В определенных вариантах реализации донорная последовательность может иметь заранее определенный размер, или ее размер определяется специалистом в данной области техники. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность может иметь в длину по меньшей мере, или приблизительно, любое значение из 10 пар оснований, 15 пар оснований, 20 пар оснований, 25 пар оснований, 50 пар оснований, 60 пар оснований, 75 пар оснований, 100 пар оснований, по меньшей мере 150 пар оснований, 200 пар оснований, 300 пар оснований, 500 пар оснований, 800 пар оснований, 1000 пар оснований, 1500 пар оснований, 2000 пар оснований, 2500 пар оснований, 3000 пар оснований, 4000 пар оснований, 4500 пар оснований и 5000 пар оснований, или от приблизительно 1 пары оснований до приблизительно 10 пар оснований, или от приблизительно 10 пар оснований до приблизительно 50 пар оснований, или от приблизительно 50 пар оснований до приблизительно 100 пар оснований, или от приблизительно 100 пар оснований до приблизительно 500 пар оснований, или от приблизительно 500 пар оснований до приблизительно 5000 пар оснований. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность включает только 1 пару оснований для восстановления одного мутанированного нуклеотида в геноме.
[00368] Неограничивающие примеры подходящей донорной последовательности (последовательностей) для использования в соответствии с данным изобретением включают беспромоторную кодирующую последовательность, соответствующую одной или нескольким связанным с заболеванием последовательностям, имеющую по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 65%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичности последовательности с одной из связанных с заболеванием молекул, описанных в данном документе. В одном варианте реализации кодирующая последовательность имеет по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 65%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере на 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 825 или с донорной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO: 825. В определенных вариантах реализации, таких как в случаях, когда последовательность добавляют, а не заменяют, может быть обеспечен промотор.
[00369] Для интеграции донорной последовательности в геном клетки-хозяина зкДНК-вектор может полагаться на полинуклеотидную последовательность, кодирующую донорную последовательность или любой другой элемент вектора для интеграции в геном посредством гомологичной рекомбинации, такой как 5'- и 3'-гомологичные плечи, представленные в данном документе (см., например, Фиг. 8). Например, зкДНК-вектор может содержать нуклеотиды, кодирующие 5'- и 3'-гомологичные плечи для направления интеграции путем гомологичной рекомбинации в геном клетки-хозяина в точном положении (положениях) в хромосоме (хромосомах). Чтобы увеличить вероятность интеграции в точном положении, 5'- и 3'-гомологичные плечи могут включать достаточное количество нуклеиновых кислот, такое как от 50 до 5000 пар оснований, или от 100 до 5000 пар оснований, или от 500 до 5000 пар оснований, которые имеют высокую степень идентичности последовательности или гомологии с соответствующей последовательностью-мишенью для повышения вероятности гомологичной рекомбинации. 5'- и 3'-гомологичные плечи могут быть любой последовательностью, которая является гомологичной последовательности-мишени в геноме клетки-хозяина. Кроме того, 5'- и 3'-гомологичные плечи могут быть некодирующими или кодирующими нуклеотидные последовательности. В некоторых вариантах реализации гомология между 5'-гомологичным плечом и соответствующей последовательностью в хромосоме составляет, по меньшей мере, любое значение из 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100%. В некоторых вариантах реализации гомология между 3'-гомологичным плечом и соответствующей последовательностью в хромосоме составляет, по меньшей мере, любое значение из 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100%. В некоторых вариантах реализации 5'- и/или 3'-гомологичные плечи могут быть гомологичными по отношению к последовательности, расположенной непосредственно перед и/или после сайта интеграции или расщепления ДНК на хромосоме. Альтернативно, 5'- и/или 3'-гомологичные плечи могут быть гомологичными к последовательности, которая удалена от сайта интеграции или расщепления ДНК, например, по меньшей мере, на 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400 или 500 п.о. от сайта интеграции или расщепления ДНК, или частично или полностью перекрываются с сайтом расщепления ДНК. В некоторых вариантах реализации 3'-гомологичное плечо нуклеотидной последовательности проксимально к измененному ITR.
[00370] В некоторых вариантах реализации эффективность интеграции донорной последовательности улучшается путем экстракции кассеты, содержащей донорную последовательность, из зкДНК-вектора перед интеграцией. В одном неограничивающем примере специфический сайт рестрикции может быть спроектирован в направлении 5' от 5'-гомологичного плеча, в направлении 3' от 3'-гомологичного плеча, или в обоих направлениях. Если такой сайт рестрикции присутствует в отношении обоих гомологичных плеч, то сайт рестрикции может быть одним и тем же или различными сайтами для двух гомологичных плечей. Когда зкДНК-вектор расщепляется одной или несколькими рестрикционными эндонуклеазами, специфичными к сконструированному сайту (сайтам) рестрикции, получающаяся в результате кассета содержит 5'-гомологичное плечо-донорную последовательность-3'-гомологичное плечо и может быть легче рекомбинирована с желаемым геномным локусом. Специалисту в данной области будет понятно, что эта расщепленная кассета может дополнительно содержать другие элементы, такие как, без ограничений, один или несколько из следующих: регуляторная область, нуклеаза и дополнительная донорная последовательность. В определенных аспектах зкДНК-вектор может сам кодировать эндонуклеазу рестрикции, так чтобы после доставки зкДНК-вектора в ядро эндонуклеаза рестрикции экспрессировалась и была способна расщеплять вектор. В определенных аспектах, эндонуклеаза рестрикции кодируется вторым зкДНК-вектором, который доставляется отдельно. В определенных аспектах эндонуклеазу рестрикции вводят в ядро с помощью средства доставки, не основанного на зкДНК. В некоторых вариантах реализации эндонуклеазу рестрикции вводят после доставки зкДНК-вектора в ядро. В некоторых вариантах реализации эндонуклеаза рестрикции и зкДНК-вектор переносятся в ядро одновременно. В некоторых вариантах реализации эндонуклеаза рестрикции уже присутствует при введении зкДНК-вектора.
[00371] В некоторых вариантах реализации донорная последовательность является чужеродной для 5'-гомологичного плеча или 3'-гомологичного плеча. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность эндогенно не обнаруживается между последовательностями, содержащими 5'-гомологичное плечо и 3'-гомологичное плечо. В некоторых вариантах реализации донорная последовательность не является эндогенной по отношению к нативной последовательности, содержащей 5'-гомологичное плечо или 3'-гомологичное плечо. В некоторых вариантах реализации 5'-гомологичное плечо является гомологичным по отношению к нуклеотидной последовательности, расположенной перед сайтом расщепления нуклеазой в хромосоме. В некоторых вариантах реализации 3'-гомологичное плечо является гомологичным по отношению к нуклеотидной последовательности, расположенной после сайта расщепления нуклеазой в хромосоме. В некоторых вариантах реализации 5'-гомологичное плечо или 3'-гомологичное плечо проксимально по меньшей мере к одному измененному ITR. В некоторых вариантах реализации 5'-гомологичное плечо или 3'-гомологичное плечо составляют примерно от 250 до 2000 п.о.
[00372] Неограничивающие примеры подходящих 5'-гомологичных плеч для использования в соответствии с данным изобретением и, в частности, для применения при редактировании генов клеток или тканей печени, включают 5'-гомологичное плечо альбумина, имеющее по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 65%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичности последовательности с подходящим сегментом в SEQ ID NO: 823 или SEQ ID NO: 826, или 5'-гомологичным плечом, состоящим из подходящего сегмента в SEQ ID NO: 823 или подходящего сегмента в SEQ ID NO: 826. Такими сегментами могут быть все соответствующие последовательности.
[00373] Неограничивающие примеры подходящих 3'-гомологичных плеч для использования в соответствии с данным изобретением включают 3'-гомологичное плечо альбумина, имеющее по меньшей мере 60%, более предпочтительно, по меньшей мере 65%, более предпочтительно, по меньшей мере 70%, более предпочтительно, по меньшей мере 75%, более предпочтительно, по меньшей мере 80%, более предпочтительно, по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно, по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 95% идентичности последовательности с подходящим сегментом в SEQ ID NO: 824 или SEQ ID NO: 827, или 3'-гомологичным плечом, состоящим из подходящего сегмента в SEQ ID NO: 824 или SEQ ID NO: 827. Такими сегментами могут быть все соответствующие последовательности.
[00374] В одном варианте реализации зкДНК-векторы для редактирования генов, которые содержат 5'- и 3'-гомологичные плечи, фланкирующие донорную последовательность, как описано в данном документе, могут быть введены в сочетании с другим вектором (например, дополнительным зкДНК-вектором, лентивирусным вектором, вирусным вектором или плазмидой), который кодирует никазу Cas (nCas; например, никазу Cas9). В настоящем изобретении предусматривается, что такой фермент nCas используется вместе с направляющей РНК, которая содержит гомологию с зкДНК-вектором, как описано в данном документе, и может использоваться, например, для высвобождения физически ограниченных последовательностей или для обеспечения высвобождения при скручивании. Высвобождение физически ограниченных последовательностей может, например, «разматывать» зкДНК-вектор, так чтобы гомологичное плечо (плечи) матрицы гомологичной репарации (HDR) внутри зкДНК-вектора вступали во взаимодействие с геномной последовательностью. Кроме того, в данном изобретении предусматривается, что такую систему можно использовать для деактивации зкДНК-векторов, если это необходимо. Специалисту в данной области будет понятно, что фермент Cas, который индуцирует двухцепочечный разрыв в зкДНК-векторе, был бы более сильным деактиватором таких зкДНК-векторов. В одном варианте реализации направляющая РНК содержит гомологию с последовательностью, вставленной в зкДНК-вектор, такой как последовательность, кодирующая нуклеазу или донорную последовательность или матрицу. В другом варианте реализации направляющая РНК содержит гомологию с инвертированным концевым повтором (ITR) или элементами гомологии/вставки зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, содержит ITR на каждом из 5'- и 3'-концов, таким образом, направляющая РНК с гомологией к ITR будет по существу одинаково никировать один или несколько ITR. В некоторых вариантах реализации направляющая РНК имеет гомологию с некоторой частью зкДНК-вектора и донорной последовательностью или матрицей (например, для помощи в разматывании зкДНК-вектора). В настоящем изобретении также предусматривается, что на зкДНК-векторах имеются определенные сайты, которые при никировании могут привести к неспособности зкДНК-вектора удерживаться в ядре. Специалист в данной области может легко идентифицировать такие последовательности и, таким образом, может избежать конструирования направляющей РНК к таким областям последовательности. Альтернативно, модификация субклеточной локализации зкДНК-вектора в область вне нуклеазы с использованием направляющей РНК, которая никирует последовательности, ответственные за ядерную локализацию, может быть использована в качестве метода деактивации зкДНК-вектора, если это необходимо или желательно.
[00375] В определенных вариантах реализации другие стратегии и компоненты интеграции являются пригодными для использования в соответствии с зкДНК-векторами по данному изобретению. Например, хотя это не показано на Фиг. 1A-1G или Фиг. 8 или Фиг. 9, в одном варианте реализации зкДНК-вектор в соответствии с данным изобретением может включать экспрессионную кассету, фланкированную последовательностями рибосомальной ДНК (рДНК), способными к гомологичной рекомбинации в геномную рДНК. Подобные стратегии были реализованы, например, в Lisowski, et al., Ribosomal DNA Integrating rAAV-rDNA Vectors Allow for Stable Transgene Expression, The American Society of Gene and Cell Therapy, 18 September 2012 (в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки), в которой были продемонстрированы векторы rAAV-рДНК. В некоторых вариантах реализации доставка векторов зкДНК-рДНК может интегрироваться в геномный локус рДНК с повышенной частотой, причем интеграции являются специфичными для локуса рДНК. Более того, вектор зкДНК-рДНК, содержащий экспрессионную кассету человеческого фактора IX (hFIX) или человеческого фактора VIII, увеличивает терапевтические уровни hFIX или человеческого фактора VIII сыворотки. Из-за относительной безопасности интеграции в локусе рДНК векторы зкДНК-рДНК расширяют использование зкДНК для терапии, требующей долгосрочного переноса гена в делящиеся клетки.
[00376] В одном варианте реализации беспромоторный зкДНК-вектор предусматривается для доставки матрицы гомологической репарации (например, последовательности репарации с двумя фланкирующими гомологическими плечами), но не содержит последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу или направляющую РНК.
[00377] Способы и композиции, описанные в данном документе, могут использоваться в способах, включающих гомологичную рекомбинацию, например, как описано в Rouet et al. Proc Natl Acad Sci 91:6064-6068 (1994); Chu et al. Nat Biotechnol 33:543-548 (2015); Richardson et al. Nat Biotechnol 33:339-344 (2016); Komor et al. Nature 533:420-424 (2016); содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.
[00378] Способы и композиции, описанные в данном документе, могут использоваться в способах, включающих гомологичную рекомбинацию, например, как описано в Rouet et al. Proc Natl Acad Sci 91:6064-6068 (1994); Chu et al. Nat Biotechnol 33:543-548 (2015); Richardson et al. Nat Biotechnol 33:339-344 (2016); Komor et al. Nature 533:420-424 (2016); содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.
C. Направляющие РНК (нРНК)
[00379] Как правило, направляющая последовательность представляет собой любую полинуклеотидную последовательность, имеющую достаточную комплементарность с полинуклеотидной последовательностью-мишенью для гибридизации с последовательностью-мишенью и направления специфичного к последовательности нацеливания РНК-направляемого эндонуклеазного комплекса на выбранную геномную последовательность-мишень. В некоторых вариантах реализации направляющая РНК связывается и, например, белок Cas может образовывать рибонуклеопротеин (RNP), например, комплекс CRISPR/Cas.
[00380] В некоторых вариантах реализации последовательность направляющей РНК (нРНК) содержит нацеливающую последовательность, которая направляет последовательность нРНК в нужный сайт в геноме, слитый с последовательностью crRNA и/или tracrRNA, которая позволяет связывать направляющую последовательность с РНК-направляемой эндонуклеазой. В некоторых вариантах реализации степень комплементарности между направляющей последовательностью и ее соответствующей последовательностью-мишенью при оптимальном выравнивании с использованием подходящего алгоритма выравнивания, составляет по меньшей мере 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%. 97,5%, 99% или более. Оптимальное выравнивание может быть определено с использованием любого подходящего алгоритма для выравнивания последовательностей, такого как алгоритм Смита-Уотермана, алгоритм Нидлмана-Вунша, алгоритмы, основанные на преобразовании Барроуза-Уилера (например, выравниватель Барроуза-Уилера (Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign (Novocraft Technologies, ELAND (Illumina, San Diego, Calif.), SOAP и Maq. В некоторых вариантах реализации направляющая последовательность имеет 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75 или более нуклеотидов в длину. В настоящем изобретении предусматривается, что нацеливающая последовательность направляющей РНК и целевая последовательность на молекуле нуклеиновой кислоты-мишени могут содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 несовпадений. В некоторых вариантах реализации последовательность направляющей РНК содержит палиндромную последовательность, например, самонацеливающаяся последовательность включает палиндром. Нацеливающая последовательность направляющей РНК обычно имеет длину 19-21 пар оснований и непосредственно предшествует шпильке, которая связывает всю направляющую РНК (нацеливающая последовательность + шпилька) с Cas, таким как Cas9. Когда палиндромная последовательность используется в качестве последовательности самоадресации направляющей РНК, инвертированный повторяющийся элемент может иметь длину, например, 9, 10, 11, 12 или более нуклеотидов. В тех случаях, когда нацеливающая последовательность направляющей РНК чаще всего составляет 19-21 п.о., элемент палиндромного инвертированного повтора из 9 или 10 нуклеотидов обеспечивает нацеливающую последовательность желаемой длины. В таком случае, комплекс Cas9-шпилька направляющей РНК может распознавать и вырезать любую нуклеотидную последовательность (ДНК или РНК), например, последовательность ДНК, которая соответствует последовательности из 19-21 пар оснований, и за которой следует последовательность «PAM», например, NGG или NGA, или другой PAM.
[00381] Способность направляющей последовательности направлять специфичное для последовательности связывание комплекса РНК-направляемой эндонуклеазы с последовательностью-мишенью можно оценить с помощью любого подходящего анализа. Например, компоненты системы РНК-направляемой эндонуклеазы, достаточные для образования комплекса РНК-направляемой эндонуклеазы, могут быть введены в клетку-хозяина, имеющую соответствующую последовательность-мишень, например, путем трансфекции векторами, кодирующими компоненты последовательности РНК-направляемой эндонуклеазы. с последующей оценкой преимущественного расщепления в последовательности-мишени, такой как с помощью анализа Surveyor (Transgenomic™, New Haven, CT). Аналогичным образом, расщепление полинуклеотидной последовательности-мишени может быть оценено с помощью лабораторного анализа (in a test tube) путем обеспечения последовательности-мишени, компонентов РНК-направляемого эндонуклеазного комплекса, включая направляющую последовательность, подлежащую тестированию, и контрольную направляющую последовательность, отличную от тестируемой направляющей последовательности, и сравнения связывания или скорости расщепления в целевой последовательности между реакциями тестируемой и контрольной направляющих последовательностей. Специалисту в данной области понятно, что другие анализы также можно использовать для тестирования последовательностей нРНК.
[00382] Направляющая последовательность может быть выбрана для нацеливания на любую последовательность-мишень. В некоторых вариантах реализации последовательность-мишень представляет собой последовательность в геноме клетки. В некоторых вариантах реализации последовательность-мишень представляет собой последовательность, кодирующую первую направляющую РНК в самоклонирующейся плазмиде, как описано в данном документе. Как правило, последовательность-мишень в геноме будет включать смежную с прото-спейсером (PAM) последовательность для связывания РНК-направляемой эндонуклеазы. Специалисту в данной области будет понятно, что последовательность PAM и РНК-направляемую эндонуклеазу следует выбирать из одного и того же (бактериального) вида, чтобы обеспечить надлежащее связывание эндонуклеазы с нацеливающей последовательностью. Например, последовательность PAM для CAS9 отличается от последовательности PAM для cpF1. Конструирование основано на соответствующей последовательности PAM. Чтобы предотвратить деградацию направляющей РНК, последовательность направляющей РНК не должна содержать последовательность PAM. В некоторых вариантах длина нацеливающей последовательности в направляющей РНК составляет 12 нуклеотидов; в других вариантах длина нацеливающей последовательности в направляющей РНК составляет 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35 или 40 нуклеотидов. Направляющая РНК может быть комплементарной к любой цепи последовательности-мишени ДНК. В некоторых вариантах реализации, когда модификация генома включает вставку или делецию, нРНК может быть нацелена ближе к N-концу области, кодирующей белок.
[00383] Специалисту в данной области должно быть понятно, что для целей целевого расщепления с помощью РНК-направляемой эндонуклеазы, последовательности-мишени, которые являются уникальными в геноме, будут более предпочтительными, чем последовательности-мишени, встречающиеся в геноме более одного раза. Программное обеспечение для биоинформатики может использоваться для прогнозирования и минимизации нецелевых эффектов направляющей РНК (см., например, Naito et al. “CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites” Bioinformatics (2014), epub; Heigwer, F., et al. “E-CRISP: fast CRISPR target site identification” Nat. Methods 11, 122-123 (2014); Bae et al. “Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases” Bioinformatics 30(10):1473-1475 (2014); Aach et al. «CasFinder: Flexible algorithm for identifying specific Cas9 targets in genomes» BioRxiv (2014), среди прочих).
[00384] Для Cas9 S. pyogenes, уникальная последовательность-мишень в геноме может включать сайт-мишень Cas9 в форме MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG (SEQ ID NO: 590), где NNNNNNNNNNNNXGG (SEQ ID NO: 591) (N представляет собой A, G, T или С, и Х может быть любым нуклеотидом) встречается в геноме один раз. Уникальная последовательность-мишень в геноме может включать сайт-мишень Cas9 S. pyogenes в форме MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG (SEQ ID NO: 592), где NNNNNNNNNNNXGG (SEQ ID NO: 593) (N представляет собой A, G, T или C; и X может быть любым нуклеотидом) встречается в геноме один раз. Для Cas9 CRISPR1 S. thermophilus уникальная последовательность-мишень в геноме может включать сайт-мишень Cas9 в форме MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 594), где NNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 595) (N представляет собой A, G, T или C, X может быть любым нуклеотидом, и W представляет собой A или T) встречается в геноме один раз. Уникальная последовательность-мишень в геноме может включать сайт-мишень Cas9 CRISPR 1 S. thermophilus в форме MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 596), где NNNNNNNNNNNXXAGAAW (SEQ ID NO: 597) (N представляет собой A, G, T или C, Х может быть любым нуклеотидом, и W представляет собой А или Т), встречается в геноме один раз. Для Cas9 S. pyogenes уникальная последовательность-мишень в геноме может включать сайт-мимшень Cas9 в форме MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 598), где NNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 599) (N представляет собой A, G, T или С, и Х может быть любым нуклеотидом) встречается в геноме один раз. Уникальная целевая последовательность в геноме может включать сайт-мишень Cas9 S. pyogenes в форме MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 600), где NNNNNNNNNNNXGGXG (SEQ ID NO: 601) (N представляет собой A, G, T или C, и X может быть любым нуклеотидом) встречается в геноме один раз. Во всех этих последовательностях «M» может представлять собой A, G, T или C, и не должно учитываться при идентификации последовательности как уникальной.
[00385] Как правило, термин «гибридная последовательность crRNA (CRISPR-ассоциированная РНК)/tracrRNA (трансактивирующих РНК)» в том смысле, в котором этот термин используется в данном документе, относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая слита с уникальной нацеливающей последовательностью и которая функционирует, обеспечивая возможность образования комплекса, содержащего направляющую РНК и РНК-направляемую эндонуклеазу. Такие последовательности могут быть смоделированы по образцу последовательностей CRISPR-РНК (crRNA) в прокариотах, которые включают (i) вариабельную последовательность, называемую «протоспейсер», которая соответствует последовательности-мишени, как описано в данном документе, и (ii) повтор CRISPR. Аналогично, являющаяся частью продукта слияния tracrRNA («трансактивирующая CRISPR-РНК») может быть спроектирована так, чтобы она содержала вторичную структуру, аналогичную последовательностям tracrRNA у прокариот (например, шпильке), для обеспечения возможности образования комплекса эндонуклеазы. В некоторых вариантах реализации указанный продукт слияния обладает достаточной комплементарностью с последовательностью tracrRNA для стимуляции одного или нескольких из: (1) вырезания направляющей последовательности, фланкируемой последовательностями tracrRNA, в клетке, содержащей соответствующую последовательность tracr; и (2) образования эндонуклеазного комплекса в последовательности-мишени, причем указанный комплекс включает последовательность crRNA, гибридизованную с последовательностью трансактивирующей РНК (tracrRNA). Как правило, степень комплементарности определяется по сравнению с оптимальным выравниванием последовательности crRNA и последовательности tracrRNA, по длине более короткой из двух указанных последовательностей. Оптимальное выравнивание может быть определено по любому подходящему алгоритму выравнивания и может дополнительно учитывать вторичные структуры, такие как самокомплементарность либо внутри последовательности tracrRNA, либо внутри последовательности crRNA. В некоторых вариантах реализации степень комплементарности между последовательностью tracrRNA и последовательностью crRNA по длине более короткой из двух последовательностей, при их оптимальном выравнивании, составляет примерно 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97,5%, 99% или более. В некоторых вариантах реализации последовательность tracrRNA имеет длину по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или более нуклеотидов (например, 70-80, 70-75, 75-80 нуклеотидов в длину). В одном варианте реализации длина crRNA составляет менее 60, менее 50, менее 40, менее 30 или менее 20 нуклеотидов. В других вариантах реализации crRNA имеет длину 30-50 нуклеотидов; в других вариантах реализации crRNA имеет длину 30-50, 35-50, 40-50, 40-45, 45-50 или 50-55 нуклеотидов в длину. В некоторых вариантах реализации последовательность crRNA и последовательность tracrRNA содержатся в одном транскрипте, так что гибридизация между ними дает транскрипт, имеющий вторичную структуру, такую как шпилька. В некоторых вариантах реализации петлеобразующие последовательности для использования в шпилечных структурах имеют четыре нуклеотида в длину, например, последовательность GAAA. Однако можно использовать более длинные или более короткие последовательности петли, а также альтернативные последовательности. Последовательности предпочтительно включают нуклеотидный триплет (например, AAA) и дополнительный нуклеотид (например, C или G). Примеры петлеобразующих последовательностей включают CAAA и AAAG. В одном варианте реализации последовательность транскрипта или транскрибированной нРНК содержит по меньшей мере одну шпильку. В одном варианте реализации транскрипт или транскрибированная полинуклеотидная последовательность имеет по меньшей мере две или более шпилек. В других вариантах реализации указанный транскрипт имеет две, три, четыре или пять шпилек. В дополнительном варианте реализации транскрипт имеет не более пяти шпилек. В некоторых вариантах реализации единый транскрипт дополнительно включает последовательность терминации транскрипции, такую как последовательность поли(Т) (polyT), например, шесть нуклеотидов T. Неограничивающими примерами отдельных полинуклеотидов, содержащих направляющую последовательность, последовательность crRNA и последовательность tracr, являются следующие (приведены в направлении от 5' к 3'), где «N» обозначает основание направляющей последовательности, первая группа строчных букв представляют последовательность crRNA, и вторая группа строчных букв представляет последовательность tracr, а конечная последовательность поли(T) является терминатором транскрипции:
(i) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataaggctt catgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (SEQ ID NO: 602); (ii) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAthcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT (SEQ ID NO: 603); (iii) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccgaaatca acaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT (SEQ ID NO: 604); (iv) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaa agtggcaccgagtcggtgcTTTTTT (SEQ ID NO: 605); (v) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaa aaagtTTTTTTT (SEQ ID NO: 606); и (vi) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTTTTT TTT (SEQ ID NO: 607). В некоторых вариантах реализации последовательности (i) - (iii) используются в комбинации с Cas9 из CRISPR1 S. thermophilus. В некоторых вариантах реализации последовательности (iv) - (vi) используются в комбинации с Cas9 из S. pyogenes. В некоторых вариантах реализации последовательность tracrRNA представляет собой отдельный транскрипт, отличный от транскрипта, содержащего последовательность crRNA.
[00386] В некоторых вариантах реализации направляющая РНК может содержать две молекулы РНК и называется в данном документе «двойная направляющая РНК» или «дгРНК» (dgRNA). В некоторых вариантах реализации дгРНК может содержать первую молекулу РНК, содержащую crRNA, и вторую молекулу РНК, содержащую tracrRNA. Первая и вторая молекулы РНК могут образовывать дуплекс РНК посредством спаривания оснований между «флагштоком» (flagpole) на crRNA и tracrRNA. При использовании dgRNA флагшток не должен иметь верхнего предела по длине.
[00387] В других вариантах реализации направляющая РНК может содержать одну молекулу РНК и называется в данном документе «одиночная направляющая РНК» или «онРНК». В некоторых вариантах реализации онРНК может содержать crRNA, ковалентно связанную с tracrRNA. В некоторых вариантах реализации crRNA и tracrRNA могут быть ковалентно связаны через линкер. В некоторых вариантах реализации онРНК может содержать структуру стебель-петля посредством спаривания оснований между флагштоком на crRNA и tracrRNA. В некоторых вариантах реализации длина одиночной направляющей РНК составляет по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, по меньшей мере 120 или более нуклеотидов (например, 75 -120, 75-110, 75-100, 75-90, 75-80, 80-120, 80-110, 80-100, 80-90, 85-120, 85-110, 85-100, 85-90, 90-120, 90-110, 90-100, 100-120, 100-120 нуклеотидов в длину). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор или его композиция содержит нуклеиновую кислоту, которая кодирует по меньшей мере 1 нРНК. Например, вторая полинуклеотидная последовательность может кодировать по меньшей мере 1 нРНК, по меньшей мере 2 нРНК, по меньшей мере 3 нРНК, по меньшей мере 4 нРНК, по меньшей мере 5 нРНК, по меньшей мере 6 нРНК, по меньшей мере 7 нРНК, по меньшей мере 8 нРНК, по меньшей мере 9 нРНК, по меньшей мере 10 нРНК, по меньшей мере 11 нРНК, по меньшей мере 12 нРНК, по меньшей мере 13 нРНК, по меньшей мере 14 нРНК, по меньшей мере 15 нРНК, по меньшей мере 16 нРНК, по меньшей мере 17 нРНК, по меньшей мере 18 нРНК, по меньшей мере 19 нРНК, по меньшей мере 20 нРНК, по меньшей мере 25 нРНК, по меньшей мере 30 нРНК, по меньшей мере 35 нРНК, по меньшей мере 40 нРНК, по меньшей мере 45 нРНК или по меньшей мере 50 нРНК. Вторая полинуклеотидная последовательность может кодировать от 1 до 50 нРНК, от 1 до 45 нРНК, от 1 до 40 нРНК, от 1 до 35 нРНК, от 1 до 30 нРНК, от 1 до 25 разных нРНК, от 1 до 20 нРНК, от 1 до 16 нРНК, от 1 до 8 разных нРНК, от 4 разных нРНК до 50 разных нРНК, от 4 разных нРНК до 45 разных нРНК, от 4 разных нРНК до 40 разных нРНК, между 4 разные рРНК и 35 разных рРНК, от 4 разных нРНК до 30 разных нРНК, от 4 разных нРНК до 25 разных нРНК, от 4 разных нРНК до 20 разных нРНК, от 4 разных нРНК до 16 разных нРНК, от 4 разных нРНК до 8 разными нРНК, от 8 разных нРНК до 50 разных нРНК, от 8 разных нРНК до 45 разных нРНК, от 8 разных нРНК до 40 разных нРНК, от 8 разных нРНК до 35 разных нРНК, от 8 разных нРНК до 30 разных рРНК, от 8 разных нРНК до 25 разных нРНК, от 8 разных нРНК до 20 разных нРНК, от 8 разных нРНК до 16 разных нРНК, от 16 разных нРНК до 50 разных нРНК, от 16 разных нРНК до 45 разных нРНК, от 16 разных нРНК до 40 разных нРНК, от 16 разных нРНК до 35 разных нРНК, от 16 разных нРНК до 30 разных нРНК, от 16 разных нРНК до 25 разных нРНК или от 16 разных нРНК до 20 разных нРНК. Каждая из полинуклеотидных последовательностей, кодирующих разные нРНК, может быть функционально связана с промотором. Промоторы, которые функционально связаны с разными нРНК, могут быть одним и тем же промотором. Промоторы, которые функционально связаны с разными рРНК, могут быть разными промоторами. Промотор может представлять собой конститутивный промотор, индуцибельный промотор, репрессируемый промотор или регулируемый промотор.
[00388] В некоторых экспериментах направляющие РНК будут нацелены на известные области, нацеленные на последовательность ZFN, с успешными нокинами или нокаутирующими делециями, или коррекцией дефектных генов. Множество последовательностей онРНК, которые связывают известные области-мишени ZFN, были сконструированы и описаны в таблицах 1-2 патентной публикации США 2015/0056705, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки и включает, например, последовательности нРНК для бета-глобина человека, BCLIIA человека, KLF1 человека, CCR5 человека, CXCR4 человека, PPP1R12C, HPRT мыши и человека, человеческого альбумина, человеческого фактора IX, человеческого фактора VIII, человеческого LRRK2, человеческого Htt, человеческого RH, МВТР (CFTR), TRAC, TRBC, человеческого PD1, человеческого CTLA-4, HLA c11, HLA A2, HLA A3, HLA B, HLA C, HLA c1, II DBp2, DRA, Tap 1 и 2, Тапасин (Tapasin), DMD, RFX5 и др.).
[00389] Модифицированные нуклеозиды или нуклеотиды могут присутствовать в направляющей РНК или мРНК, как описано в данном документе. мРНК, кодирующая направляющую РНК или эндонуклеазу ДНК (например, РНК-направляемую нуклеазу), может содержать один или несколько модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов; такие мРНК называются «модифицированными» для описания присутствия одного или нескольких неприродных и/или встречающихся в природе компонентов или конфигураций, которые используются вместо или в дополнение к каноническим остаткам A, G, C и U. В некоторых вариантах реализации модифицированная РНК синтезируется с неканоническим нуклеозидом или нуклеотидом, называемым здесь «модифицированным». Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды могут включать что-то одно или несколько из: (i) изменения, например, замены, одного или обоих несвязывающих фосфатных кислородов и/или одного или нескольких связывающих фосфатных кислородов в фосфодиэфирной основной цепи (типичный пример модификации основной цепи); (ii) изменения, например, замены компонента рибозного сахара, например, 2'-гидроксила на рибозном сахаре (типичный пример модификации сахара); (iii) полной замены фосфатного фрагмента «дефосфо»-линкерами (типичный пример модификации основной цепи); (iv) модификации или замены встречающегося в природе нуклеооснования, включая неканонические нуклеооснования (типичный пример модификации основания); (v) замены или модификации рибозофосфатного остова (типичный пример модификации основной цепи); (vi) модификации 3'-конца или 5'-конца олигонуклеотида, например, удаление, модификация или замена концевой фосфатной группы или конъюгация фрагмента, кэпа или линкера (такие модификации 3'- или 5'-кэпа могут включать модификацию сахара и/или основной цепи); и (vii) модификации или замены сахара (типичный пример модификации сахара). Немодифицированные нуклеиновые кислоты могут быть подвержены деградации, например, клеточными нуклеазами. Например, нуклеазы могут гидролизовать фосфодиэфирные связи нуклеиновых кислот. Соответственно, в одном аспекте описанные в данном документе направляющие РНК могут содержать один или несколько модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов, например, для введения стабильности по отношению к нуклеазам. В определенных вариантах реализации описанные в данном документе мРНК могут содержать один или несколько модифицированных нуклеозидов или нуклеотидов, например, для введения стабильности по отношению к нуклеазам. В одном варианте реализации модификация включает 2'-O-метилнуклеотиды. В других вариантах реализации модификация включает фосфоротиоатные (PS) связи.
[00390] Примеры модифицированных фосфатных групп включают фосфоротиоат, фосфороселенаты, боранофосфаты, боранофосфатные сложные эфиры, гидрофосфонаты, фосфороамидаты, алкил- или арилфосфонаты и фосфотриэфиры. Атом фосфора в немодифицированной фосфатной группе является ахиральным. Однако замена одного из не-мостиковых атомов кислорода на один из вышеуказанных атомов или групп атомов может сделать атом фосфора хиральным. Стереогенный атом фосфора может иметь либо конфигурацию «R» (в данном документе - Rp), либо конфигурацию «S» (в данном документе - Sp). Основную цепь можно также модифицировать путем замены мостикового кислорода (т.е. кислорода, связывающего фосфат с нуклеозидом) азотом (мостиковые фосфороамидаты), серой (мостиковые фосфоротиоаты) и углеродом (мостиковые метиленфосфонаты). Замена может происходить либо по любому из связывающих кислородов, либо по обоим связывающим кислородам. Фосфатная группа может быть заменена не содержащими фосфора соединительными группами в некоторых модификациях основной цепи. В некоторых вариантах реализации заряженная фосфатная группа может быть заменена нейтральным фрагментом. Примеры фрагментов, которые могут заменять фосфатную группу, могут включать, без ограничений, например, метилфосфонат, гидроксиламино, силоксан, карбонат, карбоксиметил, карбамат, амид, тиоэфир, этиленоксидный линкер, сульфонат, сульфонамид, тиоформацеталь, формацеталь, оксим, метиленимино, метиленметилимино, метиленгидразо, метилендиметилгидразо и метиленоксиметилимино.
[00391] Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды могут включать одну или несколько модификаций в сахарной группе, т.е. при модификации сахара. Например, 2'-гидроксильная группа (ОН) может быть модифицирована, например, заменена рядом различных «окси»- или «дезокси»-заместителей. В некоторых вариантах реализации модификации 2'-гидроксильной группы могут усиливать стабильность нуклеиновой кислоты, поскольку гидроксил больше не может депротонироваться с образованием 2'-алкоксидного иона. Примеры 2'-модификаций гидроксильной группы могут включать алкокси или арилокси (OR, где «R» может быть, например, алкилом, циклоалкилом, арилом, аралкилом, гетероарилом или сахаром); полиэтиленгликоли (ПЭГ), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, где R может быть, например, H или необязательно замещенным алкилом, и n может быть целым числом от 0 до 20 (например, от 0 до 4, от 0 до 8, от 0 до 10, от 0 до 16, от 1 до 4, от 1 до 8, от 1 до 10, от 1 до 16, от 1 до 20, от 2 до 4, от 2 до 8, от 2 до 10, от 2 до 16, от 2 до 20, от 4 до 8, от 4 до 10, от 4 до 16 и от 4 до 20). В некоторых вариантах реализации модификация 2'-гидроксильной группы может представлять собой 2'-O-Me. В некоторых вариантах реализации модификация 2'-гидроксильной группы может представлять собой модификацию 2“-фтором, в которой 2“-гидроксильная группа заменена фтором. В некоторых вариантах реализации модификация 2'-гидроксильной группы может включать «заблокированные" нуклеиновые кислоты (LNA), в которых 2'-гидроксил может быть связан, например, с помощью C1-6 алкиленового или C1-6 гетероалкиленового мостика, с 4'-углеродом того же рибозного сахара, причем типичные примеры мостиков могут включать метиленовые, пропиленовые, простые эфирные или амино-мостики; O-амино (где амино может представлять собой, например, NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино, этилендиамин или полиамино) и аминоалкокси, O(CH2)n-амино, (где амино может представлять собой, например, NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино, этилендиамин или полиамино). В некоторых вариантах реализации модификация 2'-гидроксильной группы может включать "разблокированные" нуклеиновые кислоты (UNA), у которых в рибозном кольце отсутствует связь C2'-C3'. В некоторых вариантах реализации модификация 2'-гидроксильной группы может включать метоксиэтильную группу (MOE) (OCH2CH2OCH3, например, производное ПЭГ).
[00392] Термин 2'-модификации «дезокси» может включать водород (т.е. дезоксирибозные сахара, например, на выступающих участках частично дцРНК); галоид (например, бром, хлор, фтор или йод); амино (где амино может представлять собой, например, -NH2, алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино, дигетероариламино или аминокислоту); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-амино (где амино может быть, например, таким, как описано в данном документе), -NHC(O)R (где R может быть, например, алкилом, циклоалкилом, арилом, аралкилом, гетероарилом или сахаром), циано; меркапто; алкилтиоалкил; тиоалкокси; и алкил, циклоалкил, арил, алкенил и алкинил, которые могут быть необязательно замещены, например, амино, как описано в данном документе. Модификация сахара может включать группу сахара, которая также может содержать один или несколько атомов углерода, имеющих стереохимическую конфигурацию, противоположную к соответствующему углероду в рибозе. Таким образом, модифицированная нуклеиновая кислота может включать нуклеотиды, содержащие в качестве сахара, например, арабинозу. Модифицированные нуклеиновые кислоты могут также включать сахара без основания. Такие сахара без основания также могут быть дополнительно модифицированы по одному или нескольким атомам, входящим в состав сахара. Модифицированные нуклеиновые кислоты могут также включать один или несколько сахаров, которые находятся в форме L, например, L-нуклеозиды.
[00393] Описанные в данном документе модифицированные нуклеозиды и модифицированные нуклеотиды, которые могут быть включены в модифицированную нуклеиновую кислоту, могут включать модифицированное основание, также называемое нуклеооснованием. Примеры нуклеооснований включают, без ограничений, аденин (A), гуанин (G), цитозин (C) и урацил (U). Эти нуклеооснования могут быть модифицированы или целиком заменены для обеспечения модифицированных остатков, которые могут быть включены в модифицированные нуклеиновые кислоты. Нуклеооснование нуклеотида может быть независимо выбрано из пурина, пиримидина, аналога пурина или аналога пиримидина. В некоторых вариантах нуклеооснование может включать, например, встречающиеся в природе и синтетические производные основания.
[00394] В вариантах реализации, использующих двойную направляющую РНК, каждая из crRNA и tracrRNA может содержать модификации. Такие модификации могут находиться на одном или обоих концах crRNA и/или tracrRNA. В некоторых вариантах реализации, содержащих онРНК, один или несколько остатков на одном или обоих концах онРНК могут быть химически модифицированы, или вся онРНК может быть химически модифицирована. Некоторые варианты реализации содержат 5'-концевую модификацию. Некоторые варианты реализации содержат 3'-концевую модификацию. В некоторых вариантах реализации один или несколько или все нуклеотиды в одноцепочечном выступе молекулы направляющей РНК представляют собой дезоксинуклеотиды. Модифицированная мРНК может содержать 5'-концевые и/или 3'-концевые модификации.
D. Регуляторные элементы
[00395] зкДНК-векторы для редактирования генов, содержащие асимметричную пару ITR или симметричную пару ITR, как определено в данном документе, могут быть получены из экспрессионных конструктов, которые дополнительно содержат специфическую комбинацию цис-регуляторных элементов. Цис-регуляторные элементы включают, без ограничений, промотор, рибопереключатель, инсулятор, mir-регулируемый элемент, посттранскрипционный регуляторный элемент, тканеспецифический и клеточноспецифический промотор и энхансер. В некоторых вариантах реализации указанный ITR может выступать в роли промотора для трансгена. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит дополнительные компоненты для регуляции экспрессии трансгена, например, регуляторные переключатели, как описано в данном документе, для регулирования экспрессии трансгена, или «аварийный выключатель», который может обеспечивать гибель клетки, содержащей зкДНК-вектор. Регуляторные элементы, включая регуляторные переключатели, которые можно использовать в данном изобретении, более полно обсуждаются в PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.
[00396] В вариантах реализации вторая нуклеотидная последовательность включает регуляторную последовательность и нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность гена функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность пригодна для контроля экспрессии нуклеазы в клетке-хозяине. В определенных вариантах реализации регуляторная последовательность включает подходящую промоторную последовательность, способную направлять транскрипцию гена, функционально связанного с промоторной последовательностью, такой как нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеазу (нуклеазы) по данному изобретению. В некоторых вариантах реализации вторая нуклеотидная последовательность включает интронную последовательность, связанную с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей нуклеазу. В некоторых вариантах реализации энхансерная последовательность обеспечивается перед промотором для повышения эффективности промотора. В некоторых вариантах реализации регуляторная последовательность включает энхансер и промотор, при этом вторая нуклеотидная последовательность включает интронную последовательность перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу, причем интрон включает один или несколько сайтов расщепления нуклеазой и промотор функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу.
[00397] зкДНК-векторы могут быть получены из экспрессирующих конструктов, которые дополнительно содержат специфическую комбинацию цис-регуляторных элементов, таких как посттранскрипционный регуляторный элемент WHP (WPRE) (например, SEQ ID NO: 8) и поли(А) BGH (SEQ ID NO: 9). Подходящие экспрессионные кассеты для использования в экспрессирующих конструктах не имеют ограничений упаковки, налагаемых вирусным капсидом.
(i). Промоторы:
[00398] Специалисту в данной области техники будет понятно, что промоторы, используемые в зкДНК-векторах для редактирования генов по изобретению, должны быть адаптированы к конкретным последовательностям, которые они стимулируют. Например, направляющая РНК может вообще не нуждаться в промоторе, поскольку его функция заключается в формировании дуплекса со специфической последовательностью-мишенью на нативной ДНК для осуществления события рекомбинации. Напротив, для нуклеазы, кодируемой зкДНК-вектором, промотор мог бы быть полезным для того, чтобы она могла эффективно экспрессироваться из вектора - и, необязательно, регулируемым образом.
[00399] Кассеты экспрессии по данному изобретению включают промотор, который может влиять на общие уровни экспрессии, а также на клеточную специфичность. Для экспрессии трансгена они могут включать высокоактивный немедленный ранний промотор вирусного происхождения. Экспрессионные кассеты могут содержать тканеспецифичные эукариотические промоторы для ограничения экспрессии трансгена определенными типами клеток и снижения токсических эффектов и иммунных реакций, возникающих в результате нерегулируемой эктопической экспрессии. В предпочтительных вариантах реализации кассета экспрессии может содержать синтетический регуляторный элемент, такой как промотор CAG (SEQ ID NO: 3). Промотор CAG включает (i) элемент раннего энхансера цитомегаловируса (CMV), (ii) промотор, первый экзон и первый интрон гена бета-актина курицы, и (iii) акцептор сплайсинга гена бета-глобина кролика. Альтернативно, экспрессионная кассета может содержать экспрессионная кассета может содержать промотор альфа-1-антитрипсина (AAT) (SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 74), печень-специфический (LP1) промотор (SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 16) или промотор фактора удлинения-1-альфа (EF1a) человека (например, SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 15). В некоторых вариантах реализации указанная экспрессионная кассета включает один или более конститутивных промоторов, например, ретровирусный промотор LTR вируса саркомы Рауса (RSV) (необязательно с энхансером RSV), или немедленный ранний промотор цитомегаловируса (CMV) (необязательно с энхансером CMV, например, SEQ ID NO: 22). Альтернативно, можно использовать индуцируемый промотор, нативный промотор трансгена, тканеспецифический промотор или различные промоторы, известные в данной области техники.
[00400] Подходящие промоторы, в том числе описанные выше, могут происходить из вирусов и могут, соответственно, называться вирусными промоторами, или они могут происходить из любого организма, в том числе прокариотических или эукариотических организмов. Подходящие промоторы можно использовать для управления экспрессией с помощью любой РНК-полимеразы (например, pol I, pol II, pol III). Типичные промоторы включают, без ограничений, ранний промотор SV40, промотор из длинного концевого повтора вируса опухоли молочной железы мышей (LTR); аденовирусный большой поздний промотор (Ad MLP); промотор вируса простого герпеса (HSV), промотор цитомегаловируса (CMV), такой как область немедленного раннего промотора CMV (CMVIE), промотор вируса саркомы Рауса (RSV), промотор U6 малой ядерной РНК человека (U6, например, SEQ ID NO: 18) (Miyagishi et al., Nature Biotechnology 20, 497-500 (2002)), усиленный промотор U6 (например, Xia et al., Nucleic Acids Res. 2003 Sep. 1; 31(17)), промотор H1 человека (H1) (например, SEQ ID NO: 19), промотор CAG, промотор альфа-1-антитрипсина человека (HAAT) (например, SEQ ID NO: 21), и т.п. В некоторых вариантах реализации эти промоторы изменены на содержащем 3′-интрон конце таким образом, чтобы они включали один или несколько сайтов расщепления нуклеазами. В некоторых вариантах реализации ДНК, содержащая сайт(ы) расщепления нуклеазой, является чужеродной для промотора ДНК.
[00401] В одном варианте реализации используемый промотор представляет собой нативный промотор гена, кодирующего терапевтический белок. Промоторы и другие регуляторные последовательности соответствующих генов, кодирующих терапевтические белки, известны и были охарактеризованы. Используемая область промотора может дополнительно включать одну или несколько дополнительных регуляторных последовательностей (например, нативных), например, энхансеров (например, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23).
[00402] Неограничивающие примеры подходящих промоторов для применения в соответствии с данным изобретением включают промотор CAG, например (SEQ ID NO: 3), промотор HAAT (SEQ ID NO: 21), промотор EF1-α человека (SEQ ID NO: 6) или фрагмент промотора EF1a (SEQ ID NO: 15), промотор IE2 (например, SEQ ID NO: 20) и промотор EF1-α крысы (SEQ ID NO: 24).
(ii) Последовательности полиаденилирования:
[00403] Последовательность, кодирующая последовательность полиаденилирования, может быть включена в зкДНК-вектор для стабилизации мРНК, экспрессируемой с указанного зкДНК-вектора, и для содействия ядерному экспорту и трансляции. В одном варианте реализации указанный зкДНК-вектор не содержит последовательности полиаденилирования. В других вариантах реализации указанный вектор включает по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 40, по меньшей мере 45, по меньшей мере 50 или более адениновых динуклеотидов. В некоторых вариантах реализации указанная последовательность полиаденилирования содержит приблизительно 43 нуклеотида, приблизительно 40-50 нуклеотидов, приблизительно 40-55 нуклеотидов, приблизительно 45-50 нуклеотидов, приблизительно 35-50 нуклеотидов, или в любом диапазоне между указанными значениями.
[00404] Кассеты экспрессии могут включать последовательность полиаденилирования, известную в данной области техники, или ее вариант, например, встречающуюся в природе последовательность, выделенную из бычьего гормона роста BGHpA (например, SEQ ID NO: 74) или из вируса SV40pA (например, SEQ ID NO: 10), или синтетическую последовательность (например, SEQ ID NO: 27). Некоторые кассеты экспрессии могут также включать энхансерную 5'-последовательность позднего поли(A)-сигнала SV40 (USE). В некоторых вариантах реализации USE можно использовать в комбинации с SV40pA или гетерологичным поли(A)-сигналом.
[00405] Кассеты экспрессии могут также включать посттранскрипционный элемент для увеличения экспрессии трансгена. В некоторых вариантах реализации для повышения экспрессии трансгена применяют посттранскрипционный регуляторный элемент (WPRE) вируса гепатита сурков (WHP) (например, SEQ ID NO: 8). Можно использовать другие элементы посттранскрипционного процессинга, такие как посттранскрипционный элемент из гена тимидинкиназы вируса простого герпеса или вируса гепатита B (HBV). К трансгенам могут быть присоединены секреторные последовательности, например, последовательности VH-02 и VK-A26, например, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26.
(iii). Последовательности ядерной локализации
[00406] В некоторых вариантах реализации вектор, кодирующий направляемую РНК эндонуклеазу, содержит одну или несколько последовательностей ядерной локализации (NLS), например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более NLS. В некоторых вариантах реализации одна или несколько NLS расположены на амино-конце или рядом с ним, на карбокси-конце или рядом с ним, или в их комбинации (например, одна или несколько NLS на амино-конце и/или одна или несколько NLS на карбокси-конце). В случае присутствия более чем одной NLS, каждая из них может быть выбрана независимо от других, так что одна NLS будет присутствовать в более чем одной копии и/или в сочетании с одной или несколькими другими NLS, присутствующими в одной или нескольких копиях. Неограничивающие примеры NLS приведены в Таблице 6.
[00407] Таблица 6: Сигналы ядерной локализации
ИСТОЧНИК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ SEQ ID NO.
большой Т-антиген вируса SV40 PKKKRKV (кодируется последовательностью CCCAAGAAGAAGAGGAAGGTG; SEQ ID NO: 574) 573
нуклеоплазмин KRPAATKKAGQAKKKK 575
c-myc PAAKRVKLD 576
RQRRNELKRSP 577
hRNPA1 M9 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY 578
Домен IBB импортина-альфа RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV 579
белок Т миомы VSRKRPRP 580
PPKKARED 581
р53 человека PQPKKKPL 582
c-abl IV мыши SALIKKKKKMAP 583
NS1 вируса гриппа DRLRR 584
PKQKKRK 585
антиген вируса гепатита дельта RKLKKKIKKL 586
белок Mx1 мыши REKKKFLKRR 587
полимераза поли(АДФ-рибозы) человека KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK 588
глюкокортикоид рецепторов стероидных гормонов (человека) RKCLQAGMNLEARKTKK 589
E. Дополнительные компоненты систем редактирования генов
[00408] зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать нуклеотиды, которые кодируют другие компоненты для редактирования генов. Например, для выбора специфических событий нацеливания на гены, защитная shRNA может быть встроена в микроРНК и вставлена в рекомбинантный зкДНК-вектор, предназначенный для сайт-специфической интеграции в высокоактивный локус, такой как локус альбумина. Такие варианты реализации могут предоставить систему для селекции in vivo и экспансии генно-модифицированных гепатоцитов на любом генетическом фоне, например, описанную Nygaard et al., A universal system to select gene-modified hepatocytes in vivo, Gene Therapy, June 8, 2016. зкДНК-векторы по данному изобретению могут содержать один или несколько селектируемых маркеров, которые позволяют отбирать трансформированные, трансфицированные, трансдуцированные или подобные клетки. Селектируемый маркер представляет собой ген, продукт которого обеспечивает устойчивость к биоцидам или вирусам, устойчивость к тяжелым металлам, прототрофию к ауксотрофам, NeoR и т.п. В определенных вариантах реализации маркеры позитивной селекции, такие как NeoR, включены в донорные последовательности. Маркеры негативной селекции могут быть включены после донорной последовательности, например, последовательность нуклеиновой кислоты HSV-tk, кодирующая маркер негативной селекции, может быть включена в конструкт нуклеиновой кислоты ниже донорной последовательности. На Фиг. 8, трансген необязательно слит с маркером селекции (NeoR) через сайт расщепления вирусного пептида 2А (2А), фланкированный протяженными на от 0,05 до 6 т.п.о. гомологичными плечами. В некоторых вариантах реализации маркер негативной селекции, такой как HSV TK) и экспрессирующая единица, которая позволяет контролировать и выбирать успешное правильное использование сайта, могут быть необязательно расположены вне гомологичных плеч.
[00409] В вариантах реализации зкДНК-вектор по данному изобретению может включать сайт полиаденилирования перед и вблизи 5'-гомологичного плеча.
[00410] На Фиг. 9 изображен зкДНК-вектор в соответствии с данным изобретением, включая специфический для зкДНК ITR. зкДНК-вектор включает экспрессирующую единицу онРНК, управляемую промотором Pol III (например, U6 и H1), с необязательной ориентацией относительно направления транскрипции. Последовательность-мишень онРНК для «никазы с двойной мутацией» необязательно обеспечивается для высвобождения кручения ниже 3'-гомологичного плеча вблизи мутантного ITR. Такие варианты реализации увеличивают отжиг и повышают частоту HDR.
[00411] В некоторых вариантах реализации нуклеаза, содержащая зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может быть инактивирована/уменьшена после редактирования гена. См., например, Пример 6 (см. также Фиг. 8, 9 и 13) в данном документе.
F. Регуляторные переключатели
[00412] Молекулярный регуляторный переключатель генерирует измеряемое изменение состояния в ответ на сигнал. Такие регуляторные переключатели могут быть успешно скомбинированы с зкДНК-векторами, описанными в данном документе, для контроля результатов применения зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации указанный зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель, который служит для точной настройки экспрессии трансгена. Например, он может служить для обеспечения функции биологического сдерживания зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации указанный переключатель представляет собой двухпозиционный переключатель, который сконструирован таким образом, чтобы начинать или останавливать (т.е. прекращать) экспрессию представляющего интерес гена в зкДНК контролируемым и регулируемым образом. В некоторых вариантах реализации указанный переключатель может включать «аварийный выключатель»», который может заставлять клетку, содержащую указанный зкДНК-вектор, переходить к запрограммированной клеточной смерти после активации переключателя. Типичные примеры регуляторных переключателей, предусматриваемые для использования в зкДНК для редактирования генов с целью регуляции экспрессии молекулы для редактирования генов (например, трансгена, например, кодирующего эндонуклеазу, направляющую РНК, нДНК, активатор РНК или донорную последовательность, более подробно описаны в PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
(i) Бинарные регуляторные переключатели
[00413] В некоторых вариантах реализации указанный зкДНК-вектор содержит регуляторный переключатель, который может служить для контролируемой модуляции экспрессии трансгена. Например, кассета экспрессии, расположенная между ITR указанного зкДНК-вектора, может дополнительно содержать регуляторную область, например, промотор, цис-элемент, репрессор, энхансер и т.п., функционально связанную с представляющим интерес геном, причем указанную регуляторную область регулируют один или более кофакторов или экзогенных агентов. Только в качестве примера, модулирование регуляторных областей могут осуществлять низкомолекулярные переключатели, или индуцируемые или репрессируемые промоторы. Неограничивающими примерами индуцибельных промоторов являются индуцируемые гормонами или индуцируемые металлом промоторы. Другие примеры индуцибельных промоторных/энхансерных элементов включают, без ограничений, RU486-индуцируемый промотор, экдизон-индуцируемый промотор, рапамицин-индуцируемый промотор и промотор металлотионеина.
(ii) Низкомолекулярные регуляторные переключатели
[00414] Различные известные в данной области регуляторные переключатели на основе малых молекул известны специалистам и могут быть объединены с раскрытыми в данном документе зкДНК-векторами для получения зкДНК-вектора, контролируемого регуляторным переключателем. В некоторых вариантах реализации, регуляторный переключатель может быть выбран из чего-либо одного или комбинации следующего: пара ортогональный лиганд/ядерный рецептор, вариант ретиноидного рецептора/LG335 и GRQCIMFI, наряду с искусственным промотором, контролирующим экспрессию функционально связанного трансгена, например, как описано в: Taylor, et al. BMC Biotechnology 10 (2010): 15; сконструированные стероидные рецепторы, например, модифицированный рецептор прогестерона, с усеченным C-концом, который не способен связывать прогестерон, но связывает RU486 (мифепристон) (патент США № 5364791); рецептор экдизона из Drosophila и его экдистероидные лиганды (Saez, et al., PNAS, 97(26)(2000), 14512-14517; или переключатель, контролируемый антибиотиком триметопримом (TMP), как описано в: Sando R 3rd; Nat Methods. 2013, 10(11):1085-8. В некоторых вариантах указанный регуляторный переключатель, для контроля трансгена, или экспрессируемый зкДНК-вектором, представляет собой переключатель активации пролекарства, такой как описанный в патентах США 8771679 и 6339070.
(iii) Регуляторные переключатели с «паролем»
[00415] В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель может представлять собой «переключатель с паролем» (passcode switch) или «контур с паролем». Переключатели с паролем позволяют обеспечить точную настройку контроля экспрессии указанного трансгена из зкДНК-вектора при возникновении специфических условий - т.е. комбинации условий, наличие которых необходимо для осуществления экспрессии и/или репрессии трансгена. Например, для экспрессии трансгена необходимо наличие по меньшей мере условий A и B. Регуляторный переключатель с паролем может иметь любое количество условий, например, по меньшей мере 2, или по меньшей мере 3, или по меньшей мере 4, или по меньшей мере 5, или по меньшей мере 6 или по меньшей мере 7 или более условий, необходимых для протекания трансгенной экспрессии. В некоторых вариантах реализации необходимо наличие по меньшей мере 2 условий (например, условий A, B), и в некоторых вариантах реализации необходимо наличие по меньшей мере 3 условий (например, A, B и C, или A, B и D). Только в качестве примера, для генной экспрессии из зкДНК, содержащей регуляторный переключатель с паролем «ABC», должны присутствовать условия A, B и C. Условия A, B и C могут быть следующими; условие A представляет собой присутствие состояния или заболевания, условие B представляет собой гормональный ответ, и условие C представляет собой ответ на трансгенную экспрессию. Например, если трансген редактирует дефектный ген EPO, условие A представлено присутствием хронической болезни почек (CKD), условие B выполняется при наличии состояния гипоксии в почках субъекта, условие C заключается в нарушении рекрутинга эритропоэтин-продуцирующих клеток (ЭПК) в почках; или, альтернативно, в нарушении активации HIF-2. После того, как уровни кислорода увеличатся, или будет достигнут требуемый уровень EPO, трансген (например, EPO) снова отключается до момента выполнения 3 условий, при которых он опять включится.
[00416] В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель с паролем или «контур с паролем», предусматриваемый для применения в указанном зкДНК-векторе, содержит гибридные транскрипционные факторы (ТФ) для увеличения диапазона и сложности сигналов окружающей среды, используемых для задания условий биологического сдерживания. В отличие от блокирующего выключателя, который запускает клеточную смерть при наличии заранее заданного условия, «контур с паролем» позволяет обеспечить выживание клеток или трансгенную экспрессию при наличии определенного «пароля», и может быть легко перепрограммирован, чтобы позволять трансгенную экспрессию и/или выживание клеток только при наличии заранее заданного условия окружающей среды или пароля.
[00417] Любые комбинации регуляторных переключателей, раскрытых в данном документе, например, низкомолекулярные переключатели, переключатели на основе нуклеиновых кислот, гибридные переключатели на основе малых молекул и нуклеиновых кислот, посттранскрипционные регуляторные переключатели трансгенов, посттрансляционная регуляция, контролируемые излучением переключатели, опосредованные гипоксией переключатели и другие регуляторные переключатели, известные специалистам в данной области техники согласно описанию в данном документе, могут применяться в регуляторном переключателе с паролем, как раскрыто в данном документе. Регуляторные переключатели, предусматриваемые для применения, также описаны в обзорной статье Kis et al., J R Soc Interface. 12: 20141000 (2015), и обобщены в Таблице 1 статьи Kis. В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель для применения в системе с паролем может быть выбран из любых переключателей, или их комбинации, приведенных в Таблице 11.
(iv). Регуляторные переключатели на основе нуклеиновых кислот для контроля трансгенной экспрессии
[00418] В некоторых вариантах регуляторный переключатель для контроля трансгена, экспрессируемого зкДНК, основан на механизме контроля на основе нуклеиновой кислоты. Типичные примеры механизмов контроля на основе нуклеиновых кислот известны в данной области техники и предусмотрены для применения. Например, такие механизмы включают рибопереключатели, такие как описанные, например, в US2009/0305253, US2008/0269258, US2017/0204477, WO2018026762A1, в патенте США 9222093 и заявке на европейский патент EP288071, а также в обзоре Villa JK et al., Microbiol Spectr. 2018 May;6(3). Также включены реагирующие на метаболиты транскрипционные биосенсоры, такие как описанные в WO2018/075486 и WO2017/147585. Другие известные в данной области техники механизмы, предусмотренные для применения, включают сайленсинг указанного трансгена молекулой миРНК или РНК-интерференции (RNAi) (например, miR, мшРНК). Например, зкДНК-вектор может содержать регуляторный переключатель, который кодирует молекулу РНК-интерференции, комплементарную трансгену, экспрессируемому указанным зкДНК-вектором. При экспрессии такой RNAi, даже при экспрессии трансгена зкДНК-вектором, происходит его сайленсинг за счет действия комплементарной молекулы РНК-интерференции, а при отсутствии экспрессии RNAi, если указанный трансген экспрессируется зкДНК-вектором, сайленсинг указанного трансгена за счет РНК-интерференции не происходит.
[00419] В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель представляет собой тканеспецифический самоинактивирующийся регуляторный переключатель, например, как описано в US2002/0022018, при этом регуляторный переключатель целенаправленно выключает трансгенную экспрессию в сайте, где трансгенная экспрессия может, напротив, быть неблагоприятной. В некоторых вариантах указанный регуляторный переключатель представляет собой рекомбиназную обратимую систему генной экспрессии, например, как описано в US2014/0127162 и патенте США 8324436.
(v). Посттранскрипционные и посттрансляционные регуляторные переключатели.
[00420] В некоторых вариантах указанный регуляторный переключатель для контроля трансгена или представляющего интерес гена, экспрессируемого зкДНК-вектором, представляет собой систему посттранскрипционной модификации. Например, такой регуляторный переключатель может представлять собой рибопереключатель-аптазим, чувствительный к тетрациклину или теофиллину, как описано в US2018/0119156, GB201107768, WO2001/064956A3, патенте EP 2707487 и Beilstein et al., ACS Synth. Biol., 2015, 4 (5), pp.526-534; Zhong et al., Elife. 2016 Nov 2;5. pii: e18858. В некоторых вариантах реализации предполагается, что специалист в данной области техники может кодировать как трансген, так и ингибиторную миРНК, которая содержит чувствительный к лиганду (отрицательный переключатель) аптамер, с получением в итоге лиганд-чувствительного положительного переключателя.
(vi). Другие примеры регуляторных переключателей
[00421] Для контроля генной экспрессии трансгена, экспрессируемого зкДНК-вектором, в указанном зкДНК-векторе может применяться любой известный регуляторный переключатель, в том числе запускаемый изменениями окружающей среды. Дополнительные примеры включают, без ограничений; метод BOC согласно Suzuki et al., Scientific Reports 8; 10051 (2018); расширение генетического кода и нефизиологическую аминокислоту; контролируемые излучением или ультразвуком положительные/отрицательные переключатели (см., например, Scott S et al., Gene Ther. 2000 Jul; 7(13):1121-5; патенты США 5612318; 5571797; 5770581; 5817636; и WO1999/025385A1. В некоторых вариантах реализации указанный регуляторный переключатель контролируется имплантируемой системой, например, как раскрыто в патентах США 7840263; US2007/0190028A1, где генная экспрессия контролируется одной или несколькими формами энергии, включая электромагнитную энергию, которая активирует промоторы, функционально связанные с трансгеном в зкДНК-векторе.
[00422] В некоторых вариантах реализации регуляторный переключатель, предусмотренный для применения в указанном зкДНК-векторе, представляет собой опосредуемый гипоксией или стресс-активируемый переключатель, например, такой как описанные в: WO1999060142A2, патентах США 5834306; 6218179; 6709858; US2015/0322410; Greco et al., (2004) Targeted Cancer Therapies 9, S368, а также элементы FROG, TOAD и NRSE и условно-индуцируемые элементы сайленсинга, в том числе элементы ответа на гипоксию (HRE), элементы воспалительного ответа (IRE) и активируемые сдвиговым напряжением элементы (SSAE), например, как раскрыто в патенте США 9394526. Такой вариант реализации подходит для включения экспрессии указанного трансгена с зкДНК-вектора после ишемии или в ишемических тканях, и/или в опухолях.
(iv). «Аварийные выключатели»
[00423] Другие варианты реализации данного изобретения относятся к зкДНК-вектору, содержащему «аварийный выключатель». «Аварийный выключатель», как описано в данном документе, позволяет обеспечить киллинг клетки, содержащей зкДНК-вектор, или ее переход к запрограммированной гибели в качестве способа окончательного устранения введенного зкДНК-вектора из системы субъекта. Специалисту в данной области техники будет понятно, что применение «аварийных выключателей» в зкДНК-векторах согласно настоящему изобретению, как правило, сопряжено с нацеливанием указанного зкДНК-вектора на ограниченное число клеток, потеря которых является приемлемой для субъекта, или на тип клеток, апоптоз которых желателен (например, на раковые клетки). Во всех аспектах «аварийный выключатель», как раскрыто в данном документе, разработан так, чтобы обеспечивать быстрый и устойчивый киллинг клетки, содержащей указанный зкДНК-вектор, в отсутствие входного сигнала выживания или другого специфического условия. Другими словами, «аварийный выключатель», кодируемый зкДНК-вектором согласно настоящему изобретению, может ограничивать выживание клетки, содержащей зкДНК-вектор, окружающей средой, заданной специфическими входными сигналами. Такие «аварийные выключатели» служат для обеспечения функции биологического сдерживания, если требуется либо удалить зкДНК-вектор из субъекта, либо обеспечить отсутствие экспрессии кодируемого трансгена.
VI. Подробное описание способа получения зкДНК-вектора
А. Получение в целом
[00424] Определенные способы получения зкДНК-вектора для редактирования генов, содержащего асимметричную пару ITR или симметричную пару ITR, как определено в данном документе, описаны в разделе IV PCT/US18/49996, поданной 7 сентября 2018 года, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки. Как описано в данном документе, зкДНК-вектор может быть получен с применением способа, включающего стадии: a) инкубации популяции клеток-хозяев (например, клеток насекомых), несущих полинуклеотидную матрицу экспрессионного конструкта (например, зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус), которая не содержит кодирующих последовательностей вирусного капсида, в присутствии белка Rep в условиях, эффективных для, и на протяжении времени, достаточного для индукции продуцирования указанного зкДНК-вектора в клетках-хозяевах, при этом указанные клетки-хозяева не содержат кодирующих последовательностей вирусного капсида; и b) сбора и выделения зкДНК-вектора из клеток-хозяев. Присутствие белка Rep индуцирует репликацию векторного полинуклеотида с модифицированным ITR для продуцирования зкДНК-вектора в клетке-хозяине. Однако вирусные частицы (например, вирионы AAV) не экспрессируются. Таким образом, отсутствуют ограничения по размеру, такие как естественным образом накладываемые в AAV или других вирусных векторах.
[00425] Присутствие зкДНК-вектора, выделенного из клеток-хозяев, может быть подтверждено путем расщепления ДНК, выделенной из клетки-хозяина рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания на зкДНК-векторе, и анализа указанного расщепленного ДНК-материала на неденатурирующем геле для подтверждения присутствия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличающихся от полос линейной и прерывистой ДНК.
[00426] В еще одном аспекте изобретение предусматривает применение линий клеток-хозяев, которые стабильно интегрировали полинуклеотидную матрицу экспрессионного ДНК-вектора (зкДНК-матрицу) в собственный геном, для получения невирусного ДНК-вектора, например, как описано в: Lee, L. et al. (2013) Plos One 8(8): e69879. Предпочтительно Rep добавляют в клетки-хозяева с MOI, равной приблизительно 3. Если линия клеток-хозяев представляет собой линию клеток млекопитающего, например, клетки HEK293, указанные линии клеток могут содержать стабильно интегрированную полинуклеотидную векторную матрицу, и второй вектор, например, герпесвирусный, может применяться для введения в клетки белка Rep, обеспечивающего эксцизию и амплификацию зкДНК в присутствии Rep и хелперного вируса.
[00427] В одном варианте реализации клетки-хозяева, используемые для получения зкДНК-векторов, описанных в данном документе, представляют собой клетки насекомых, и бакуловирус используют для доставки как полинуклеотида, который кодирует белок Rep, так и полинуклеотидного экспрессионного матричного конструкта невирусного ДНК-вектора для зкДНК, например, как описано в Фиг. 4A-4C и Примере 1. В некоторых вариантах реализации указанную клетку-хозяина конструируют таким образом, чтобы она экспрессировала белок Rep.
[00428] зкДНК-вектор затем собирают и выделяют из клеток-хозяев. Время сбора и извлечения зкДНК-векторов, описанных в данном документе, из клеток может быть выбрано и оптимизировано так, чтобы обеспечить высокопродуктивное получение указанных зкДНК-векторов. Например, время сбора может быть выбрано с учетом жизнеспособности клеток, морфологии клеток, роста клеток и т.д. В одном варианте реализации клетки культивируют в достаточных условиях и собирают через достаточное время после инфекции бакуловирусом для получения зкДНК-векторов, но до начала гибели большинства клеток вследствие токсичности бакуловируса. Указанные ДНК-векторы могут быть выделены с применением наборов для очищения плазмид, таких как наборы Endo-Free Plasmid фирмы Qiagen. Другие способы, разработанные для выделения плазмид, также могут быть адаптированы для ДНК-векторов. Как правило, могут быть использованы любые способы очистки нуклеиновых кислот.
[00429] ДНК-векторы могут быть очищены любыми способами очистки ДНК, известными специалистам в данной области техники. В одном варианте реализации зкДНК-векторы очищают как молекулы ДНК. В другом варианте реализации зкДНК-векторы очищают в виде экзосом или микрочастиц.
[00430] Присутствие указанного зкДНК-вектора может быть подтверждено путем расщепления векторной ДНК, выделенной из клеток, рестрикционным ферментом, имеющим один сайт распознавания на ДНК-векторе, и анализа как расщепленного, так и нерасщепленного ДНК-материала с применением гель-электрофореза для подтверждения присутствия характеристических полос линейной и непрерывной ДНК, отличных от полос линейной и прерывистой ДНК. Фиг. 4C и Фиг.4D иллюстрируют один вариант реализации для идентификации присутствия зкДНК-векторов с замкнутыми концами, продуцируемых в соответствии с описанными в данном документе способами.
B. зкДНК-плазмида
[00431] зкДНК-плазмида представляет собой плазмиду, используемую для последующего получения зкДНК-вектора. В некоторых вариантах реализации зкДНК-плазмида может быть сконструирована с применением известных методик для обеспечения по меньшей мере нижеперечисленного в виде функционально связанных компонентов, в направлении транскрипции: (1) модифицированной 5'-последовательности ITR; (2) экспрессионной кассеты, содержащей цис-регуляторный элемент, например, промотор, индуцибельный промотор, регуляторный переключатель, энхансеры и т.п.; и (3) модифицированной 3'-последовательности ITR, причем 3'-последовательность ITR является симметричной к 5'-последовательности ITR. В некоторых вариантах реализации указанная экспрессионная кассета, фланкированная ITR, содержит сайт клонирования для введения экзогенной последовательности. Указанная экспрессионная кассета заменяет кодирующие области rep и cap геномов AAV.
[00432] В одном аспекте зкДНК-вектор получают из плазмиды, называемой в данном документе «зкДНК-плазмида», кодирующей, в указанном порядке: первый инвертированный концевой повтор (ITR) аденоассоциированного вируса (AAV), экспрессионную кассету, содержащую трансген, и мутированный или модифицированный ITR AAV, причем указанная зкДНК-плазмида не содержит кодирующих последовательностей капсидного белка AAV. В альтернативных вариантах реализации указанная зкДНК-плазмида кодирует, в указанном порядке: первый (или 5') модифицированный или мутированный ITR AAV, экспрессионную кассету, содержащую трансген, и второй (или 3') модифицированный ITR AAV, причем указанная зкДНК-плазмида не содержит кодирующих последовательностей капсидного белка AAV, а 5'- и 3'-ITR являются симметричными друг относительно друга. В альтернативных вариантах реализации указанная зкДНК-плазмида кодирует, в указанном порядке: первый (или 5') модифицированный или мутированный ITR AAV, экспрессионную кассету, содержащую трансген, и второй (или 3') мутированный или модифицированный ITR AAV, причем указанная зкДНК-плазмида не содержит кодирующих последовательностей капсидного белка AAV, а модифицированные 5'- и 3'-ITR имеют одинаковые модификации (т.е. они являются обратным комплементарными или симметричными друг относительно друга).
[00433] В дополнительном варианте реализации система зкДНК-плазмиды лишена кодирующих последовательностей вирусного капсидного белка (т.е. она не содержит генов капсида AAV, а также генов капсидов других вирусов). Кроме того, в конкретном варианте реализации зкДНК-плазмида также лишена кодирующих последовательностей белка Rep AAV. Соответственно, в предпочтительном варианте реализации зкДНК-плазмида не содержит функциональных генов cap AAV и rep AAV, GG-3' для AAV2), а также вариабельной палиндромной последовательности, обеспечивающей образование шпилек.
[00434] зкДНК-плазмида по данному изобретению может быть получена с использованием природных нуклеотидных последовательностей геномов любых серотипов AAV, хорошо известных в данной области техники. В одном варианте реализации, основную цепь плазмиды зкДНК получают из генома AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV 5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV 11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAV-DJ и AAV-DJ8. Например, NCBI: NC 002077; NC 001401; NC001729; NC001829; NC006152; NC 006260; NC 006261; из указателя вирусов Kotin and Smith («The Springer Index of Viruses»), доступного по ссылке, поддерживаемой Springer (веб-адрес: oesys.springer.de/viruses/database/mkchapter.asp?virID=42.04.) (примечание: при указании ссылки или базы данных подразумевается содержание доступного по ссылке ресурса или базы данных на действующую дату подачи настоящей заявки). В конкретном варианте реализации основную цепь плазмиды зкДНК получают из генома AAV2. В другом конкретном варианте реализации, основная цепь зкДНК-плазмиды представляет собой синтетический остов, генетически сконструированный таким образом, чтобы он включал на 5'- и 3'-концах ITR, происходящие из одного из указанных геномов AAV.
[00435] Плазмида зкДНК может необязательно включать селектируемый или селекционный маркер для использования при создании линии клеток, продуцирующей зкДНК-вектор. В одном варианте реализации селекционный маркер может быть вставлен ниже 3'-последовательности ITR (т.е. в направлении 3'). В другом варианте реализации селекционный маркер может быть вставлен выше 5'-последовательности ITR (т.е. в направлении 5'). Подходящие селекционные маркеры включают, например, маркеры, придающие устойчивость к лекарственному средству. Селекционными маркерами могут быть, например, ген устойчивости к бластицидину S, канамицину, генетицину и т.п. В предпочтительном варианте реализации селекционный маркер лекарственного средства представляет собой ген устойчивости к бластицидину S.
[00436] Типичный пример зкДНК (например, rAAV0) продуцируют из плазмиды rAAV. Способ получения вектора rAAV может включать: (а) доставку в клетку-хозяина rAAV-плазмиды как описано выше, причем как клетка-хозяин, так и плазмида лишены кодирующих капсидный белок генов, (b) культивирование указанной клетки-хозяина в условиях, обеспечивающих возможность получения зкДНК-генома; и (c) сбор клеток и выделение генома AAV, продуцируемого указанными клетами.
C. Примеры способа получения зкДНК-векторов из зкДНК-плазмид
[00437] В данном документе также предложены способы получения бескапсидных зкДНК-векторов, а именно, способ с достаточно высоким выходом для обеспечения достаточного количества вектора для экспериментов in vivo.
[00438] В некоторых вариантах реализации способ получения зкДНК-вектора включает стадии: (1) введения конструкта нуклеиновой кислоты, содержащего экспрессионную кассету и две симметричных последовательности ITR в клетку-хозяина (например, клетки Sf9), (2) необязательно, получения клональной линии клеток, например, с применением селективного маркера, присутствующего на плазмиде, (3) введения кодирующего Rep гена (путем трансфекции или инфекции бакуловирусом, несущим указанный ген) в указанную клетку насекомого; и (4) сбора указанных клеток и очистки зкДНК-вектора. Конструкт нуклеиновой кислоты, содержащий экспрессионную кассету и две последовательности ITR, описанные выше, для получения зкДНК-вектора, может иметь форму зкДНК-плазмиды или бакмиды или бакуловируса, полученных с помощью плазмиды кДНК, как описано ниже. Конструкт нуклеиновой кислоты может быть введен в клетку-хозяина путем трансфекции, вирусной трансдукции, стабильной интеграции или другими способами, известными в данной области.
D. Клеточные линии:
[00439] Линии клеток-хозяев, используемые для получения зкДНК-вектора, могут включать линии клеток насекомых, полученные из Spodoptera frugiperda (совка кукурузная листовая), такие как клетки Sf9 Sf21, или Trichoplusia ni (металловидка серая), или другие линии клеток беспозвоночных, позвоночных или других эукариотических клеток, включая клетки млекопитающих. Также могут быть использованы другие клеточные линии, известные специалисту в данной области, такие как HEK293, Huh-7, HeLa, HepG2, HeplA, 911, CHO, COS, MeWo, NIH3T3, A549, HT1 180, моноциты, а также зрелые и незрелые дендритные клетки. Линии клеток-хозяев могут быть трансфицированы для стабильной экспрессии зкДНК-плазмиды для продуцирования зкДНК-вектора с высоким выходом.
[00440] зкДНК-плазмиды могут быть введены в клетки Sf9 путем транзиентной трансфекции с использованием реагентов (например, липосом, фосфата кальция) или физических средств (например, электропорации), известных в данной области. Альтернативно, могут быть созданы стабильные клеточные линии Sf9 со стабильно интегрированной в свои геномы зкДНК-плазмидой. Такие стабильные клеточные линии могут быть созданы путем включения селективного маркера в зкДНК-плазмиду, как описано выше. Если зкДНК-плазмида, используемая для трансфекции линии клеток, включает селективный маркер, такой как антибиотик, клетки, которые были трансфицированы указанной зкДНК-плазмидой и интегрировали ДНК зкДНК-плазмиды в свои геномы, могут быть отобраны путем добавления указанного антибиотика в клеточные ростовые среды. Устойчивые клоны клеток могут быть затем выделены методами разведения отдельных клеток или переноса колоний и размножены.
E. Выделение и очистка зкДНК-векторов:
[00441] Примеры способа получения и выделения зкДНК-векторов для редактирования генов описаны на Фиг. 4А-4Е и в конкретных примерах, приведенных ниже. Раскрытые в данном документе зкДНК-векторы могут быть получены из клетки-продуцента, экспрессирующей белок (белки) Rep AAV, дополнительно трансформированный зкДНК-плазмидой, зкДНК-бакмидой или зкДНК-бакуловирусом. Плазмиды, пригодные для получения зкДНК-векторов, включают плазмиды, представленные на Фиг. 6А (пригодна для продуцирования Rep BIIC), Фиг. 6B (плазмида, используемая для получения зкДНК-вектора).
[00442] В одном аспекте полинуклеотид кодирует белок Rep AAV (Rep 78 или 68), доставляемый в клетку-продуцент в плазмиде (Rep-плазмида), бакмиде (Rep-бакмида) или бакуловирусе (Rep-бакуловирус). Rep-плазмида, Rep-бакмид и Rep-бакуловирус могут быть получены способами, описанными выше.
[00443] Способы получения зкДНК-вектора, который представляет собой пример зкДНК-вектора, описаны в данном документе. Экспрессионные конструкты, используемые для генерирования зкДНК-векторов по данному изобретению, могут представлять собой плазмиду (например, зкДНК-плазмиды), бакмиду (например, зкДНК-бакмида) и/или бакуловирус (например, зкДНК-бакуловирус). Исключительно в качестве примера, зкДНК-вектор может быть получен из клеток, коинфицированных зкДНК-бакуловирусом и Rep-бакуловирусом. Белки Rep, продуцируемые из Rep-бакуловируса, могут реплицировать зкДНК-бакуловирус для получения зкДНК-векторов. Альтернативно, зкДНК-векторы могут быть получены из клеток, стабильно трансфицированных конструктом, содержащим последовательность, кодирующую белок Rep AAV (Rep78/52), доставленным в Rep-плазмидах, Rep-бакмидах или Rep-бакуловирусе. зкДНК-бакуловирус может быть транзиентно трансфицирован в клетки, реплицироваться белком Rep и продуцировать зкДНК-векторы.
[00444] Бакмида (например, зкДНК-бакмида) может быть трансфицирована в пермиссивные клетки насекомых, такие как клетки Sf9, Sf21, клетки Tni (Trichoplusia ni), клетки High Five, и генерировать зкДНК-бакуловирус, который представляет собой рекомбинантный бакуловирус, включающий последовательности, содержащие симметричные ITR и экспрессионную кассету. Клетки насекомых могут быть снова инфицированы ЗкДНК-бакуловирусом для получения следующего поколения рекомбинантного бакуловируса. Необязательно, указанная стадия может быть повторена один или несколько раз для получения рекомбинантного бакуловируса в большем количестве.
[00445] Время сбора и извлечения из клеток зкДНК-векторов, описанных в данном документе, может быть выбрано и оптимизировано так, чтобы обеспечить высокопродуктивное получение указанных зкДНК-векторов. Например, время сбора может быть выбрано с учетом жизнеспособности клеток, морфологии клеток, роста клеток и т.д. Обычно, клетки можно собирать по истечении времени после инфицирования бакуловирусом, достаточного для продуцирования зкДНК-векторов (например, зкДНК-векторов), но до того, как большинство клеток начнет погибать из-за токсичности вируса. зкДНК-векторы могут быть выделены из клеток Sf9 с использованием наборов для очистки плазмид, таких как наборы Qiagen ENDO-FREE PLASMID®. Другие методы, разработанные для выделения плазмиды, также могут быть адаптированы для зкДНК-векторов. Обычно могут быть использованы любые известные в данной области техники способы очистки нуклеиновых кислот, а также коммерчески доступные наборы для экстракции ДНК.
[00446] Альтернативно, очистка может быть осуществлена путем проведения процесса щелочного лизиса клеточного осадка, центрифугирования полученного лизата и проведения хроматографического разделения. В качестве одного неограничивающего примера, указанный процесс может быть осуществлен путем загрузки супернатанта на ионообменную колонку (например, SARTOBIND Q®), которая удерживает нуклеиновые кислоты, с последующей элюцией (например, 1,2 M раствором NaCl), и проведения дополнительной хроматографической очистки на гель-фильтрационной колонке (например, 6 Fast Flow GE). Затем бескапсидный AAV-вектор выделяют, например, путем осаждения.
[00447] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы также могут быть очищены в форме экзосом или микрочастиц. В данной области техники известно, что многие типы клеток высвобождают не только растворимые белки, но и комплексные грузы с белками/нуклеиновыми кислотами путем шеддинга мембранных микровезикул (Cocucci et al, 2009; EP 10306226.1). Такие везикулы включают микровезикулы (также называемые микрочастицами) и экзосомы (также называемые нановезикулами), которые содержат в качестве груза белки и РНК. Микровезикулы образуются путем непосредственного отпочковывания от плазматической мембраны, а экзосомы высвобождаются во внеклеточную среду после слияния мультивезикулярных эндосом с плазматической мембраной. Таким образом, микровезикулы и/или экзосомы, содержащие зкДНК-вектор, могут быть выделены из клеток, которые были трансдуцированы зкДНК-плазмидой или бакмидой или бакуловирусом, сгенерированными с помощью зкДНК-плазмиды.
[00448] Микровезикулы могут быть выделены путем фильтрации или ультрацентрифугирования культуральной среды при 20000 ×g, а экзосомы - при 100000 ×g. Оптимальная продолжительность ультрацентрифугирования может быть определена экспериментально и будет зависеть от конкретного типа клеток, из которых выделяют везикулы. Предпочтительно, культуральную среду сначала очищают путем низкоскоростного центрифугирования (например, при 2000 ×g на протяжении 5-20 минут), и подвергают центрифужному концентрированию с использованием, например, центрифужной колонки AMICON® (Millipore, Watford, UK). Микровезикулы и экзосомы могут быть дополнительно очищены посредством FACS или MACS с использованием специфических антител, которые распознают специфические поверхностные антигены, присутствующие на микровезикулах и экзосомах. Другие способы очистки микровезикул и экзосом включают, без ограничений, иммунопреципитацию, аффинную хроматографию, фильтрацию и магнитные шарики, покрытые специфическими антителами или аптамерами. После очистки везикулы промывают, например, забуференным фосфатом солевым раствором. Одним из преимуществ использования микровезикул или экзосом для доставки зкДНК-содержащих везикул является то, что эти везикулы могут быть нацелены на клетки различных типов путем включения в их мембраны белков, распознаваемых специфическими рецепторами на соответствующих типах клеток (см. также EP 10306226).
[00449] Другой аспект данного изобретения относится к способам очистки зкДНК-векторов от линий клеток-хозяев, имеющих стабильно интегрированный в свой геном зкДНК-конструкт. В одном варианте реализации зкДНК-векторы очищают в виде молекул ДНК. В другом варианте реализации зкДНК-векторы очищают в виде экзосом или микрочастиц.
[00450] На Фиг. 5 PCT/US18/49996 продемонстрирован гель, подтверждающий продуцирование зкДНК из множества конструктов зкДНК-плазмид с использованием способа, описанного в Примерах. Наличие зкДНК подтверждается характеристическим паттерном полос на геле, как обсуждалось в отношении Фиг. 4D в Примерах.
VIII. Фармацевтические композиции
[00451] В другом аспекте предложены фармацевтические композиции. Фармацевтическая композиция содержит зкДНК-вектор для редактирования генов, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
[00452] Описанные в данном документе ДНК-векторы для редактирования генов могут быть включены в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъекту для in vivo доставки в клетки, ткани или органы субъекта. Как правило, фармацевтическая композиция содержит зкДНК-вектор, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Например, зкДНК-векторы, описанные в данном документе, могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для желаемого пути терапевтического введения (например, парентерального введения). Также предусматривается пассивная трансдукция ткани посредством внутривенного или внутриартериального вливания под высоким давлением, а также внутриклеточной инъекции, такой как внутриядерная микроинъекция или внутрицитоплазматическая инъекция. Фармацевтические композиции для терапевтических целей могут быть составлены в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения состава зкДНК-вектора в необходимом количестве в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием, включая зкДНК-вектор, который может быть приготовлен для доставки трансгена в нуклеиновой кислоте в клетки реципиента, что приводит к терапевтической экспрессии в ней трансгена или донорной последовательности. Композиция также может включать фармацевтически приемлемый носитель.
[00453] Фармацевтически активные композиции, содержащие зкДНК-вектор, могут быть составлены для доставки трансгена или донорной последовательности для различных целей в клетку, например, в клетки субъекта.
[00454] Фармацевтические композиции для терапевтических целей обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения состава зкДНК-вектора в требуемом количестве в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием.
[00455] зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может быть включен в фармацевтическую композицию, пригодную для местного, системного, внутриамниотического, интратекального, внутричерепного, внутриартериального, внутривенного, внутрилимфатического, внутрибрюшинного, подкожного, трахеального, внутритканевого (например, внутримышечного, внутрисердечного, внутрипеченочного, внутрипочечного, интрацеребрального), интратекального, интравезикального, конъюнктивального (например, экстраорбитального, интраорбитального, ретроорбитального, интраретинального, субретинального, хориоидального, субхориоидального, интрастромального, интракамерального и интравитреального), интракохлеарного и мукозального, например, ректального, назального) введения. Также предусматривается пассивная трансдукция ткани посредством внутривенного или внутриартериального вливания под высоким давлением, а также внутриклеточной инъекции, такой как внутриядерная микроинъекция или внутрицитоплазматическая инъекция.
[00456] Фармацевтические композиции для терапевтических целей обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосом или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации зкДНК-вектора. Стерильные растворы для инъекций могут быть получены путем включения состава зкДНК-вектора в требуемом количестве в соответствующий буфер с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием.
[00457] В некоторых аспектах способы, предлагаемые в данном документе, включают доставку одного или нескольких зкДНК-векторов для редактирования генов, как описано в данном документе, в клетку-хозяина. В данном документе также предлагаются клетки, продуцируемые такими способами, и организмы (такие как животные, растения или грибы), содержащие или полученные из таких клеток. Методы доставки нуклеиновых кислот могут включать липофекцию, нуклеофекцию, микроинъекцию, биолистику, липосомы, иммунолипосомы, поликатион или конъюгаты липид:нуклеиновая кислота, «голую» ДНК и усиленное агентом поглощение ДНК. Липофекция описана, например, в патенте США №№ 5049386, 4946787 и 4897355), и реагенты для липофекции продаются коммерчески (например, Transfectam™ и Lipofectin™). Доставка может осуществляться в клетки (например, введение in vitro или ex vivo) или в ткани-мишени (например, введение in vivo).
[00458] В данной области техники известны различные методы и способы доставки нуклеиновых кислот в клетки. Так, например, нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК, могут быть приготовлены в виде липидных наночастиц (LNP), липидоидов, липосом, липидных наночастиц, липоплексов или наночастиц типа ядро-оболочка. Как правило, LNP состоят из молекул нуклеиновой кислоты (например, зкДНК), одного или нескольких ионизируемых или катионных липидов (или их солей), одного или нескольких неионных или нейтральных липидов (например, фосфолипидов), молекулы, которая предотвращает агрегацию (например, ПЭГ или конъюгат ПЭГ-липид) и, необязательно, стерола (например, холестерина).
[00459] Другим способом доставки нуклеиновых кислот, таких как зкДНК, в клетку, является конъюгирование нуклеиновой кислоты с лигандом, который интернализуется клеткой. Например, лиганд может связываться с рецептором на поверхности клетки и интернализоваться посредством эндоцитоза. Лиганд может быть ковалентно связан с нуклеотидом в нуклеиновой кислоте. Типичные примеры конъюгатов для доставки нуклеиновых кислот в клетку описаны, например, в WO2015/006740, WO2014/025805, WO2012/037254, WO2009/082606, WO2009/073809, WO2009/018332, WO2006/112872, WO2004/090108, WO2004/091515 и WO2017/177326.
[00460] Нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК, также могут быть доставлены в клетку путем трансфекции. Пригодные способы трансфекции включают, без ограничений, опосредованную липидами трансфекцию, опосредованную катионными полимерами трансфекцию или осаждение фосфатом кальция. Реагенты для трансфекции хорошо известны в данной области и включают, без ограничений, реагент для трансфекции TurboFect (Thermo Fisher Scientific), реагент Pro-Ject (Thermo Fisher Scientific), белковый реагент для трансфекции TRANSPASS™ P (New England Biolabs), белковый реагент для доставки CHARIOT™ (Active Motif), белковый реагент для трансфекции PROTEOJUICE™ (EMD Millipore), 293-фектин, липофектамин (LIPOFECTAMINE™ 2000), LIPOFECTAMINE™ 3000 (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), липофектин (LIPOFECTIN™, Thermo Fisher Scientific), DMRIE-C, CELLFECTIN™ (Thermo Fisher Scientific), OLIGOFECTAMINE™ (Thermo Fisher Scientific), LIPOFECTACE™, FUGENE™ (Roche, Базель, Швейцария), FUGENE™ HD (Roche), TRANSFECTAM™ (трансфектам, Promega, Мэдисон, Висконсин), TFX-10™ (Promega), TFX-20™ (Promega), TFX-50™ (Promega), трансфектин (TRANSFECTIN™, BioRad, Геркулес, Калифорния), SILENTFECT™ (Bio-Rad), Effectene™ (Qiagen, Валенсия, Калифорния), DC-chol (Avanti Polar Lipids), GENEPORTER™ (Gene Therapy Systems, Сан-Диего, Калифорния), DHARMAFECT 1™ (Dharmacon, Лафайет, Колорадо), DHARMAFECT 2™ (Dharmacon), DHARMAFECT 3™ (Dharmacon), DHARMAFECT 4™ (Dharmacon), ESCORT™ III (Sigma, Сент-Луис, Миссури), и ESCORT™ IV (Sigma Chemical Co.). Нуклеиновые кислоты, такие как зкДНК, также могут быть доставлены в клетку методами микрофлюидики, известными специалистам в данной области.
[00461] Способы невирусной доставки нуклеиновых кислот in vivo или ex vivo включают электропорацию, липофекцию (см. патент США №5049386; 4946787; и коммерчески доступные реагенты, такие как трансфектам (Transfectam™) и липофектин (Lipofectin™)), микроинъекцию, биолистику, виросомы, липосомы (см., например, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); патенты США № 4186183, №4217344, №4235871, №4261975, №4485054, №4501728, №4774085, №4837028 и №4946787), иммунолипосомы, конъюгаты нуклеиновых кислот с поликатионами или липидами, «голую» ДНК и усиленное агентами поглощение ДНК. Сонопорация с использованием, например, системы Sonitron 2000 (Rich-Mar) также может применяться для доставки нуклеиновых кислот.
[00462] зкДНК-векторы, как описано в данном документе, можно также вводить непосредственно в организм для трансдукции клеток in vivo. Введение осуществляется любым путем, обычно используемым для введения молекулы в непосредственный контакт с клетками крови или ткани, включая, без ограничений, инъекцию, инфузию, местное применение и электропорацию. Подходящие способы введения таких нуклеиновых кислот доступны и хорошо известны специалистам в данной области и, хотя для введения конкретной композиции можно использовать более одного пути, определенный путь часто может обеспечить более быструю и более эффективную реакцию, чем другой путь.
[00463] Способы введения вектора нуклеиновой кислоты, например, зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может быть введен в гемопоэтические стволовые клетки, например, способами, описанными, например, в патенте США № 5928638.
[00464] зкДНК-векторы в соответствии с данным изобретением могут быть добавлены к липосомам для доставки в клетку или орган-мишень у субъекта. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы обычно используют в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтических разработок. Они работают путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды.
[00465] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомному составу, который включает одно или несколько соединений с функциональной группой полиэтиленгликоля (ПЭГ) (так называемые «пегилированные соединения»), которая может уменьшать иммуногенность/антигенность и обеспечивать гидрофильность и гидрофобность указанного соединения (соединений), и снижать частоту дозирования. В других случаях, указанный липосомный состав просто включает полимер полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве дополнительного компонента. В таких аспектах молекулярная масса ПЭГ или функциональной группы ПЭГ может составлять от 62 Да до примерно 5000 Да.
[00466] В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, которая доставляет АФИ с профилем пролонгированного или контролируемого высвобождения на протяжении периода времени от нескольких часов до недель. В некоторых родственных аспектах указанная липосомная композиция может содержать водные камеры, ограниченные липидными бислоями. В других родственных аспектах указанная липосомная композиция инкапсулирует АФИ с компонентами, которые претерпевают физический переход при повышенной температуре, высвобождающий указанный АФИ на протяжении периода времени от нескольких часов до недель.
[00467] В некоторых аспектах липосомная композиция содержит сфингомиелин и один или несколько липидов, раскрытых в данном документе. В некоторых аспектах липосомная композиция содержит оптисомы.
[00468] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которая включает один или несколько липидов, выбранных из: натриевой соли N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль 2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, (дистеароил-sn-глицеро-фосфоэтаноламина), MPEG (метоксиполиэтиленгликоль)-конъюгированного липида, HSPC (гидрогенизированного соевого фосфатидилхолина); ПЭГ (полиэтиленгликоля); DSPE (дистеароил-sn-глицерофосфоэтаноламина); DSPC (дистеароилфосфатидилхолина); DOPC (диолеоилфосфатидилхолина); DPPG (дипальмитоилфосфатидилглицерина); EPC (яичного фосфатидилхолина); DOPS (диолеоилфосфатидилсерина); POPC (пальмитоилолеоилфосфатидилхолина); SM (сфингомиелина); MPEG (метоксиполиэтиленгликоля); DMPC (димиристоилфосфатидилхолина); DMPG (димиристоилфосфатидилглицерина); DSPG (дистеароилфосфатидилглицерина); DEPC (диерукоилфосфатидилхолина); DOPE (диолеоил-sn-глицерофосфоэтаноламина), холестерилсульфата (CS), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), DOPC (диолеоли-sn-глицерофосфатидилхолина) или любой комбинации перечисленного.
[00469] В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую фосфолипид, холестерин и пегилированный липид в молярном соотношении 56:38:5. В некоторых аспектах общее содержание липидов в липосомной композиции составляет от 2 до 16 мг/мл. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, липид, содержащий функциональную группу этаноламина, и пегилированный липид. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, липид, содержащий функциональную группу этаноламина, и пегилированный липид в молярном соотношении 3:0,015:2, соответственно. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, холестерин и пегилированный липид. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, и холестерин. В некоторых аспектах пегилированный липид представляет собой PEG-2000-DSPE. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую DPPG, соевый фосфатидилхолин (PC), липидный конъюгат MPEG-DSPE и холестерин.
[00470] В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую один или несколько липидов, содержащих функциональную группу фосфатидилхолина, и один или несколько липидов, содержащих функциональную группу этаноламина. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую один или несколько из: липидов, содержащих функциональную группу фосфатидилхолина, липидов, содержащих функциональную группу этаноламина, и стеринов, например, холестерина. В некоторых аспектах липосомная композиция содержит DOPC/DEPC; и DOPE.
[00471] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, дополнительно содержащей один или несколько фармацевтических эксципиентов, например, сахарозу и/или глицин.
[00472] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которая имеет однослойную или многослойную структуру. В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которая включает мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены. В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции липосом, размер которых больше обычных наночастиц и составляет примерно от 150 до 250 нм. В некоторых аспектах липосомная композиция представляет собой лиофилизированный порошок.
[00473] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которую получают и нагружают зкДНК-векторами, раскрытыми или описанными в данном документе, путем добавления слабого основания к смеси, содержащей выделенную зкДНК вне липосомы. Такое добавление повышает рН вне липосом до значения, равного примерно 7,3, и направляет АФИ в липосому. В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, имеющей кислый рН внутри липосом. В таких случаях рН внутри липосомы может составлять 4-6,9, более предпочтительно, 6,5. В других аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, полученной с использованием технологии внутрилипосомной стабилизации лекарственного средства. В таких случаях используются полимерные или неполимерные сильнозаряженные анионы и внутрилипосомные захватывающие агенты, например, полифосфат или октасульфат сахарозы.
[00474] В других аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин.
[00475] Реагенты для доставки, такие как липосомы, нанокапсулы, микрочастицы, микросферы, липидные частицы, везикулы и т.п., можно использовать для введения композиций по данному изобретению в подходящие клетки-хозяева. В частности, композиции нуклеиновых кислот могут быть составлены для доставки в инкапсулированном виде в липидной частице, липосоме, везикуле, наносфере, наночастице, частице золота и т.п. Такие составы могут быть предпочтительными для введения фармацевтически приемлемых композиций нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе.
[00476] Различные способы доставки, известные в данной области, или их модификации, могут быть использованы для доставки зкДНК-векторов in vitro или in vivo. Например, в некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы доставляют путем транзиентного проникновения в клеточную мембрану с использованием механической, электрической, ультразвуковой, гидродинамической или лазерной энергии таким образом, чтобы облегчить вхождение ДНК в клетки-мишени. Например, зкДНК-вектор может быть доставлен путем транзиентного нарушения клеточной мембраны, путем проталкивания клетки через канал с ограниченным размером, или другими способами, известными в данной области техники. В некоторых случаях отдельно взятый зкДНК-вектор вводят прямой инъекцией «голой» ДНК в кожу, тимус, сердечную мышцу, скелетную мышцу или клетки печени.
[00477] В некоторых случаях зкДНК-вектор доставляют с помощью генной пушки. Сферические частицы золота или вольфрама (диаметром 1-3 мкм), покрытые бескапсидными векторами AAV, могут быть разогнаны до высокой скорости с помощью газа под давлением для проникновения в клетки ткани-мишени.
[00478] Композиции, содержащие зкДНК-вектор и фармацевтически приемлемый носитель, конкретно предусматриваются настоящим документом. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор состоит из липидной системы доставки, например, липосом, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации такие композиции вводят любым путем, желательным для квалифицированного специалиста. Композиции могут быть введены субъекту различными путями, включая пероральный, парентеральный, сублингвальный, трансдермальный, ректальный, трансмукозальный, местный, путем ингаляции, путем буккального введения, внутриплевральный, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, подкожный, внутримышечный, интраназальный, интратекальный и внутрисуставный, или их комбинации. Для ветеринарного применения композиция может быть введена в виде достаточно приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринарный врач может легко определить режим дозирования и способ введения, наиболее подходящий для конкретного животного. Композиции можно вводить с помощью традиционных шприцев, безыгольных инъекционных устройств, «генных пушек для бомбардировок микрочастицами» или других физических методов, таких как электропорация («ЭП»), «гидродинамический метод» или ультразвук.
[00479] Композиция может быть доставлена субъекту с помощью нескольких технологий, включая инъекцию ДНК (также называемую ДНК-вакцинацией) с электропорацией in vivo и без нее, опосредованной липосомами или с применением наночастиц, как описано в данном документе.
[00480] В некоторых вариантах реализации для доставки зкДНК-векторов применяют электропорацию. Электропорация вызывает временную дестабилизацию клеточных мембран клеточной ткани-мишени путем введения пары электродов в ткань, чтобы молекулы ДНК в среде, окружающей дестабилизированную мембрану, могли проникать в цитоплазму и нуклеоплазму клетки. Электропорация использовалась in vivo для многих типов тканей, таких как кожа, легкие и мышцы.
[00481] В некоторых случаях зкДНК-вектор доставляется гидродинамической инъекцией, которая представляет собой простой и высокоэффективный метод прямой внутриклеточной доставки любых водорастворимых соединений и частиц во внутренние органы и скелетные мышцы во всей конечности.
[00482] В некоторых случаях зкДНК-векторы доставляют с помощью ультразвука путем создания наноскопических пор в мембране для облегчения внутриклеточной доставки частиц ДНК в клетки внутренних органов или опухолей, поэтому размер и концентрация плазмидной ДНК имеют большое значение для эффективности системы. В некоторых случаях зкДНК-векторы доставляют магнитофекцией с использованием магнитных полей для концентрации частиц, содержащих нуклеиновую кислоту, в клетках-мишенях.
[00483] В некоторых случаях могут применяться химические системы доставки, например, с использованием наномерных комплексов, которые включают компактизацию отрицательно заряженной нуклеиновой кислоты поликатионными наномерными частицами, принадлежащими к катионным липосомам/мицеллам или катионным полимерам. Катионные липиды, используемые в указанном способе доставки, включают, без ограничений, моновалентные катионные липиды, поливалентные катионные липиды, гуанидин-содержащие соединения, соединения - производные холестерина, катионные полимеры (например, поли(этиленимин), поли-L-лизин, протамин, другие катионные полимеры), и гибриды липид-полимер.
[00484] А. Экзосомы:
[00485] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как раскрыто в данном документе, доставляют путем упаковки в экзосому. Экзосомы представляют собой небольшие мембранные везикулы эндоцитарного происхождения, которые высвобождаются во внеклеточную среду после слияния мультивезикулярных телец с плазматической мембраной. Их поверхность состоит из липидного бислоя из клеточной мембраны донорной клетки, они содержат цитозоль из клетки, продуцирующей экзосому, и экспонируют на поверхности мембранные белки из родительской клетки. Экзосомы продуцируются различными типами клеток, включая эпителиальные клетки, В- и Т-лимфоциты, тучные клетки (МС), а также дендритные клетки (ДК). Некоторые варианты реализации предусматривают использование экзосом диаметром от 10 нм до 1 мкм, от 20 нм до 500 нм, от 30 нм до 250 нм, от 50 нм до 100 нм. Экзосомы могут быть выделены для доставки в клетки-мишени с использованием либо их донорных клеток, либо путем введения в них специфических нуклеиновых кислот. Для получения экзосом, содержащих бескапсидные векторы AAV по данному изобретению, могут быть использованы различные подходы, известные в данной области техники.
[00486] B. Микрочастицы/наночастицы:
[00487] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, доставляют посредством липидной наночастицы. Как правило, липидные наночастицы содержат ионизируемый аминополипид (например, гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил 4-(диметиламино)бутаноат, DLin-MC3-DMA, фосфатидилхолин (1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин, DSPC), холестерин и липид оболочки (полиэтиленгликоль-димиристолглицерин, PEG-DMG), например, как описано Tam et al. (2013), Advances in Lipid Nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceuticals 5(3): 498-507.
[00488] В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет средний диаметр от примерно 10 до примерно 1000 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр менее 300 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр от примерно 10 до примерно 300 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации липидная наночастица имеет диаметр от примерно 25 до примерно 200 нм. В некоторых вариантах реализации препарат липидных наночастиц (например, композиция, содержащая множество липидных наночастиц) имеет распределение по размерам, при котором средний размер (например, диаметр) составляет от примерно 70 нм до примерно 200 нм, и более типично средний размер составляет примерно 100 нм или меньше.
[00489] Различные липидные наночастицы, известные в данной области, могут быть использованы для доставки зкДНК-вектора, раскрытого в данном документе. Например, различные способы доставки с использованием липидных наночастиц описаны в патентах США №№ 9404127, 9006417 и 9518272.
[00490] В некоторых вариантах реализации раскрытый в данном документе зкДНК-вектор доставляют с помощью наночастиц золота. Как правило, нуклеиновая кислота может быть ковалентно связана с наночастицей золота или нековалентно связана с наночастицей золота (например, связана посредством заряд-зарядного взаимодействия), например, как описано Ding et al. (2014), Gold Nanoparticles for Nucleic Acid Delivery. Mol. Ther. 22(6); 1075-1083. В некоторых вариантах реализации конъюгаты наночастиц золота с нуклеиновой кислотой получают с использованием способов, описанных, например, в патенте США № 6812334.
[00491] C. Конъюгаты
[00492] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как раскрыто в данном документе, конъюгирован (например, ковалентно связан) с агентом, который увеличивает клеточное поглощение. «Агент, который увеличивает клеточное поглощение», представляет собой молекулу, которая облегчает транспорт нуклеиновой кислоты через липидную мембрану. Например, нуклеиновая кислота может быть конъюгирована с липофильным соединением (например, холестерином, токоферолом и т.д.), проникающим в клетки пептидом (CPP) (например, пенетратином, TAT, Syn1B и т.д.) и полиаминами (например, спермином). Дополнительные примеры агентов, которые повышают клеточное поглощение, раскрыты, например, в Winkler (2013), Oligonucleotide conjugates for therapeutic applications. Ther. Deliv. 4(7); 791-809.
[00493] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, конъюгирован с полимером (например, полимерной молекулой) или молекулой фолата (например, молекулой фолиевой кислоты). В общем, доставка нуклеиновых кислот, конъюгированных с полимерами, известна в данной области, например, как описано в WO2000/34343 и WO2008/022309. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, конъюгирован с поли(амидным) полимером, например, как описано в патенте США № 8987377. В некоторых вариантах реализации нуклеиновая кислота, описанная в данном документе, конъюгирована с молекулой фолиевой кислоты, как описано в патенте США № 8550455.
[00494] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, конъюгирован с углеводом, например, как описано в патенте США № 8450467.
[00495] D. Нанокапсула
[00496] Альтернативно, могут быть использованы нанокапсульные композиции зкДНК-вектора, как описано в данном документе. В общем случае, вещества могут быть заключены в нанокапсулы стабильным и воспроизводимым способом. Чтобы избежать побочных эффектов, обусловленных избыточной внутриклеточной нагрузкой полимерами, такие сверхмелкие частицы (размером около 0,1 мкм) необходимо разрабатывать с использованием полимеров, способных деградировать in vivo. Предусматривается использование биоразлагаемых полиалкил-цианоакрилатных наночастиц, которые удовлетворяют таким требованиям.
[00497] Е. Липосомы
[00498] зкДНК-векторы в соответствии с данным изобретением могут быть добавлены к липосомам для доставки в клетку или орган-мишень у субъекта. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы обычно используют в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтических разработок. Они работают путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды.
[00499] Образование и использование липосом в целом известно специалистам в данной области техники. Были разработаны липосомы с улучшенной стабильностью в сыворотке и временем полувыведения из кровотока (патент США № 5741516). Кроме того, были описаны различные способы получения липосом и липосомоподобных препаратов в качестве потенциальных носителей лекарственных средств (патенты США №№ 5567434; 5552157; 5565213; 5738868 и 5795587).
[00500] Липосомы успешно использовались для нескольких типов клеток, обычно устойчивых к трансфекции при использовании других процедур. Кроме того, липосомы свободны от ограничений по длине ДНК, типичных для систем доставки на основе вирусов. Липосомы эффективно применяли для введения генов, лекарственных средств, радиотерапевтических агентов, вирусов, факторов транскрипции и аллостерических эффекторов в различные культивируемые клеточные линии и животных. Кроме того, было завершено несколько успешных клинических испытаний, посвященных изучению эффективности доставки лекарств, опосредованной липосомами.
[00501] Липосомы образуются из фосфолипидов, которые диспергированы в водной среде и спонтанно образуют мультиламеллярные концентрические двухслойные везикулы (также называемые мультиламеллярными везикулами (MLV). MLV обычно имеют диаметр от 25 нм до 4 мкм. Обработка MLV ультразвуком приводит к образованию малых однослойных везикул (SUV) диаметром от 200 до 500 Å (ANG), содержащих в сердцевине водный раствор.
[00502] В некоторых вариантах реализации липосома содержит катионные липиды. Термин «катионный липид» включает липиды и синтетические липиды, имеющие как полярные, так и неполярные домены, которые способны заряжаться положительно при значениях рН, соответствующих физиологическому или близких к нему, и которые связываются с полианионами, такими как нуклеиновые кислоты, и облегчают доставку нуклеиновых кислот в клетки. В некоторых вариантах реализации катионные липиды включают насыщенные и ненасыщенные алкильные и алициклические простые эфиры и сложные эфиры аминов, амидов или их производных. В некоторых вариантах реализации катионные липиды включают неразветвленные, разветвленные алкильные, алкенильные группы, или любую комбинацию вышеуказанного. В некоторых вариантах реализации катионные липиды содержат от 1 до примерно 25 атомов углерода (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 атомов углерода). В некоторых вариантах реализации катионные липиды содержат более 25 атомов углерода. В некоторых вариантах реализации линейные или разветвленные алкильные или алкеновые группы содержат шесть или более атомов углерода. Катионный липид также может содержать, в некоторых вариантах реализации, одну или несколько алициклических групп. Неограничивающие примеры алициклических групп включают холестерин и другие стероидные группы. В некоторых вариантах реализации получают катионные липиды с одним или несколькими противоионами. Примеры противоионов (анионов) включают, без ограничений, Cl-, Br-, I-, F-, ацетат, трифторацетат, сульфат, нитрит и нитрат.
[00503] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомному составу, который включает одно или несколько соединений с функциональной группой полиэтиленгликоля (ПЭГ) (так называемые «пегилированные соединения»), которая может уменьшать иммуногенность/антигенность и обеспечивать гидрофильность и гидрофобность указанного соединения (соединений), и снижать частоту дозирования. В других случаях, указанный липосомный состав просто включает полимер полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве дополнительного компонента. В таких аспектах молекулярная масса ПЭГ или функциональной группы ПЭГ может составлять от 62 Да до примерно 5000 Да.
[00504] В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, которая доставляет АФИ с профилем пролонгированного или контролируемого высвобождения на протяжении периода времени от нескольких часов до недель. В некоторых родственных аспектах указанная липосомная композиция может содержать водные камеры, ограниченные липидными бислоями. В других родственных аспектах указанная липосомная композиция инкапсулирует АФИ с компонентами, которые претерпевают физический переход при повышенной температуре, высвобождающий указанный АФИ на протяжении периода времени от нескольких часов до недель.
[00505] В некоторых аспектах липосомная композиция содержит сфингомиелин и один или несколько липидов, раскрытых в данном документе. В некоторых аспектах липосомная композиция содержит оптисомы.
[00506] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которая включает один или несколько липидов, выбранных из: натриевой соли N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль 2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, (дистеароил-sn-глицеро-фосфоэтаноламина), MPEG (метоксиполиэтиленгликоль)-конъюгированного липида, HSPC (гидрогенизированного соевого фосфатидилхолина); ПЭГ (полиэтиленгликоля); DSPE (дистеароил-sn-глицерофосфоэтаноламина); DSPC (дистеароилфосфатидилхолина); DOPC (диолеоилфосфатидилхолина); DPPG (дипальмитоилфосфатидилглицерина); EPC (яичного фосфатидилхолина); DOPS (диолеоилфосфатидилсерина); POPC (пальмитоилолеоилфосфатидилхолина); SM (сфингомиелина); MPEG (метоксиполиэтиленгликоля); DMPC (димиристоилфосфатидилхолина); DMPG (димиристоилфосфатидилглицерина); DSPG (дистеароилфосфатидилглицерина); DEPC (диерукоилфосфатидилхолина); DOPE (диолеоил-sn-глицерофосфоэтаноламина), холестерилсульфата (CS), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), DOPC (диолеоли-sn-глицерофосфатидилхолина) или любой комбинации перечисленного.
[00507] В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую фосфолипид, холестерин и пегилированный липид в молярном соотношении 56:38:5. В некоторых аспектах общее содержание липидов в липосомной композиции составляет от 2 до 16 мг/мл. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, липид, содержащий функциональную группу этаноламина, и пегилированный липид. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, липид, содержащий функциональную группу этаноламина, и пегилированный липид в молярном соотношении 3:0,015:2, соответственно. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, холестерин и пегилированный липид. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, и холестерин. В некоторых аспектах пегилированный липид представляет собой PEG-2000-DSPE. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую DPPG, соевый фосфатидилхолин (PC), липидный конъюгат MPEG-DSPE и холестерин.
[00508] В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую один или несколько липидов, содержащих функциональную группу фосфатидилхолина, и один или несколько липидов, содержащих функциональную группу этаноламина. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую один или несколько из: липидов, содержащих функциональную группу фосфатидилхолина, липидов, содержащих функциональную группу этаноламина, и стеринов, например, холестерина. В некоторых аспектах липосомная композиция содержит DOPC/DEPC; и DOPE.
[00509] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, дополнительно содержащей один или несколько фармацевтических эксципиентов, например, сахарозу и/или глицин.
[00510] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которая имеет однослойную или многослойную структуру. В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которая включает мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены. В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции липосом, размер которых больше обычных наночастиц и составляет примерно от 150 до 250 нм. В некоторых аспектах липосомная композиция представляет собой лиофилизированный порошок.
[00511] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которую получают и нагружают зкДНК-векторами, раскрытыми или описанными в данном документе, путем добавления слабого основания к смеси, содержащей выделенную зкДНК вне липосомы. Такое добавление повышает рН вне липосом до значения, равного примерно 7,3, и направляет АФИ в липосому. В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, имеющей кислый рН внутри липосом. В таких случаях рН внутри липосомы может составлять 4-6,9, более предпочтительно, 6,5. В других аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, полученной с использованием технологии внутрилипосомной стабилизации лекарственного средства. В таких случаях используются полимерные или неполимерные сильнозаряженные анионы и внутрилипосомные захватывающие агенты, например, полифосфат или октасульфат сахарозы.
[00512] В других аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин.
[00513] Неограничивающие примеры катионных липидов включают полиэтиленимин, полиамидоаминные (PAMAM) сверхразветвленные дендримеры Starburst, липофектин (комбинация DOTMA и DOPE), липофектазу, липофектамин (LIPOFECTAMINE™) (например, LIPOFECTAMINE™ 2000), DOPE, цитофектин (Gilead Sciences, Фостер Сити, Калифорния) и эуфектины (JBL, Сан-Луис-Обиспо, Калифорния). Типичные катионные липосомы могут быть получены из N-[1-(2,3-диолеолокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорида (DOTMA), N-[1-(2,3-диолеолокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония метилсульфата (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерина (DC-Chol), 2,3,-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанаминия трифторацетата (DOSPA), 1,2-димиристилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония бромида; и диметилдиоктадециламмония бромида (DDAB). Нуклеиновые кислоты (например, CELiD) также могут образовывать комплекс, например, с поли-(L-лизином) или авидином, и указанная смесь может включать или не включать липиды, например, стерил-поли-(L-лизин).
[00514] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, доставляют с использованием катионного липида, описанного в патенте США № 8158601, или полиаминового соединения или липида, как описано в патенте США № 8034376.
[00515] F. Типичные композиции липосом и липидных наночастиц (LNP)
[00516] зкДНК-векторы в соответствии с данным изобретением могут быть добавлены к липосомам для доставки в клетку, нуждающуюся в редактировании генов, например, нуждающуюся в донорной последовательности. Липосомы представляют собой везикулы, которые содержат по меньшей мере один липидный бислой. Липосомы обычно используют в качестве носителей для доставки лекарственных/терапевтических средств в контексте фармацевтических разработок. Они работают путем слияния с клеточной мембраной и перегруппировки ее липидной структуры для доставки лекарственного средства или активного фармацевтического ингредиента (АФИ). Липосомные композиции для такой доставки состоят из фосфолипидов, в частности, соединений, содержащих фосфатидилхолиновую группу, однако указанные композиции могут также включать другие липиды.
[00517] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомному составу, который включает одно или несколько соединений с функциональной группой полиэтиленгликоля (ПЭГ) (так называемые «пегилированные соединения»), которая может уменьшать иммуногенность/антигенность и обеспечивать гидрофильность и гидрофобность указанного соединения (соединений), и снижать частоту дозирования. В других случаях, указанный липосомный состав просто содержит полимер полиэтиленгликоля (ПЭГ) в качестве дополнительного компонента. В таких аспектах молекулярная масса ПЭГ или функциональной группы ПЭГ может составлять от 62 Да до примерно 5000 Да.
[00518] В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, которая доставляет АФИ с профилем пролонгированного или контролируемого высвобождения на протяжении периода времени от нескольких часов до недель. В некоторых родственных аспектах указанная липосомная композиция может содержать водные камеры, ограниченные липидными бислоями. В других родственных аспектах указанная липосомная композиция инкапсулирует АФИ с компонентами, которые претерпевают физический переход при повышенной температуре, высвобождающий указанный АФИ на протяжении периода времени от нескольких часов до недель.
[00519] В некоторых аспектах липосомная композиция содержит сфингомиелин и один или несколько липидов, раскрытых в данном документе. В некоторых аспектах липосомная композиция содержит оптисомы.
[00520] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которая включает один или несколько липидов, выбранных из: натриевой соли N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль 2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина, (дистеароил-sn-глицеро-фосфоэтаноламина), MPEG (метоксиполиэтиленгликоль)-конъюгированного липида, HSPC (гидрогенизированного соевого фосфатидилхолина); ПЭГ (полиэтиленгликоля); DSPE (дистеароил-sn-глицерофосфоэтаноламина); DSPC (дистеароилфосфатидилхолина); DOPC (диолеоилфосфатидилхолина); DPPG (дипальмитоилфосфатидилглицерина); EPC (яичного фосфатидилхолина); DOPS (диолеоилфосфатидилсерина); POPC (пальмитоилолеоилфосфатидилхолина); SM (сфингомиелина); MPEG (метоксиполиэтиленгликоля); DMPC (димиристоилфосфатидилхолина); DMPG (димиристоилфосфатидилглицерина); DSPG (дистеароилфосфатидилглицерина); DEPC (диерукоилфосфатидилхолина); DOPE (диолеоил-sn-глицерофосфоэтаноламина), холестерилсульфата (CS), дипальмитоилфосфатидилглицерина (DPPG), DOPC (диолеоли-sn-глицерофосфатидилхолина) или любой комбинации перечисленного.
[00521] В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую фосфолипид, холестерин и пегилированный липид в молярном соотношении 56:38:5. В некоторых аспектах общее содержание липидов в липосомной композиции составляет от 2 до 16 мг/мл. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, липид, содержащий функциональную группу этаноламина, и пегилированный липид. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, липид, содержащий функциональную группу этаноламина, и пегилированный липид в молярном соотношении 3:0,015:2, соответственно. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, холестерин и пегилированный липид. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую липид, содержащий функциональную группу фосфатидилхолина, и холестерин. В некоторых аспектах пегилированный липид представляет собой PEG-2000-DSPE. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую DPPG, соевый фосфатидилхолин (PC), липидный конъюгат MPEG-DSPE и холестерин.
[00522] В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую один или несколько липидов, содержащих функциональную группу фосфатидилхолина, и один или несколько липидов, содержащих функциональную группу этаноламина. В некоторых аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую один или несколько из: липидов, содержащих функциональную группу фосфатидилхолина, липидов, содержащих функциональную группу этаноламина, и стеринов, например, холестерина. В некоторых аспектах липосомная композиция содержит DOPC/DEPC; и DOPE.
[00523] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, дополнительно содержащей один или несколько фармацевтических эксципиентов, например, сахарозу и/или глицин.
[00524] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которая является либо однослойной, либо многослойной по структуре. В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которая включает мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены. В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции липосом, размер которых больше обычных наночастиц и составляет примерно от 150 до 250 нм. В некоторых аспектах липосомная композиция представляет собой лиофилизированный порошок.
[00525] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, которую получают и нагружают зкДНК-векторами, раскрытыми или описанными в данном документе, путем добавления слабого основания к смеси, содержащей выделенную зкДНК вне липосомы. Такое добавление повышает рН вне липосом до значения, равного примерно 7,3, и направляет АФИ в липосому. В некоторых аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, имеющей кислый рН внутри липосом. В таких случаях рН внутри липосомы может составлять 4-6,9, более предпочтительно, 6,5. В других аспектах данное изобретение относится к липосомной композиции, полученной с использованием технологии внутрилипосомной стабилизации лекарственного средства. В таких случаях используются полимерные или неполимерные сильнозаряженные анионы и внутрилипосомные захватывающие агенты, например, полифосфат или октасульфат сахарозы.
[00526] В других аспектах данное изобретение предлагает липосомную композицию, содержащую фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин. В некоторых вариантах реализации липосомальная композиция представляет собой композицию, описанную Таблице 7 ниже.
Таблица 7: Типичные липосомальные композиции
Композиция pH Композиция pH
MPEG-DSPE (3,19 мг/мл)
HSPC (9,58 мг/мл)
Холестерин (3,19 мг/мл)		 6,5 DSPC (28,16 мг/мл)
Холестерин (6,72 мг/мл)		 4,9-6,0
DOPC (5,7 мг/мл)
Холестерин (4,4 мг/мл)
Триолеин (1,2 мг/мл)
DPPG (1,0 мг/мл)		 5,5-8,5 Яичный фосфатидилхолин:холестерин (молярное соотношение 55:45) [восстановленный из лиофилизата в натрий-карбонатном буфере] 7,8
DOPS:POPC (мольное соотношение 3:7)
1 г общих липидов/флакон [восстановленный из лиофилизата, 0,9% NaCl]		 4,5-7,0 Сфингомиелин (2,37 мг/мл, 73,5 мг/31 мл)
Холестерин (0,95 мг/мл,
29,5 мг/31 мл) [восстановленный из лиофилизата в растворе фосфата натрия]		 7,2-7,6
DSPC (6,81 мг/мл)
Холестерин (2,22 мг/мл)
MPEG-2000-DSPE (0,12 мг/мл)		 6,8-7,6 DMPC (3,4 мг/мл)
DMPG (1,5 мг/мл)
в молярном соотношении 7:3		 5,0-7,0
HSPC (17,75 мг/мл,
213 мг/12 мл)
Холестерин (4,33 мг/мл,
52 мг/12 мл)
DSPG (7,0 мг/мл,
84 мг/12 мл) [восстановленный из лиофилизата в стерильной воде]		 5,0-6,0 Холестерилсульфат натрия (2,64 мг/мл) [восстановленный из лиофилизата в стерильной воде]
DMPC и EPG
(молярное соотношение 1:8) [восстановлены из лиофилизата в стерильной воде]		 DOPC (4,2 мг/мл)
Холестерин (3,3 мг/мл)
DPPG (0,9 мг/мл)
Трикаприлин (0,3 мг/мл)
Триолеин (0,1 мг/мл)		 5,0-8,0
Холестерин (4,7 мг/мл)
DPPG (0,9 мг/мл)
Трикаприлин (2,0 мг/мл)
DEPC (8,2 мг/мл)		 5,8-7,4 DOPC:DOPE
(молярное соотношение 75:25)
[00527] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липидной наночастице, содержащей зкДНК и ионизируемый липид. Например, состав липидных наночастиц, который изготавливают и нагружают зкДНК, полученной способом, раскрытым в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., которая включена в данный документ. Это может быть достигнуто путем высокоэнергетического смешивания этанольных липидов с водной зкДНК при низком рН, который протонирует ионизируемый липид и обеспечивает благоприятную энергетику для связывания зкДНК/липид и нуклеации частиц. Частицы могут быть дополнительно стабилизированы путем разбавления водой и удаления органического растворителя. Частицы могут быть сконцентрированы до желаемого уровня.
[00528] Как правило, липидные частицы получают при соотношении общего липида к зкДНК (массовом или весовом) от примерно 10:1 до 30:1. В некоторых вариантах реализации отношение липида к зкДНК (массовое соотношение; отношение мас./мас.) может находиться в диапазоне от примерно 1:1 до примерно 25: 1, от примерно 10:1 до примерно 14:1, от примерно 3:1 до примерно 15:1, от примерно 4:1 до примерно 10:1, от примерно 5:1 до примерно 9:1 или от примерно 6:1 до примерно 9:1. Количество липидов и зкДНК можно регулировать для обеспечения желаемого отношения N/P, например, отношения N/P, равного 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или выше. Обычно общее содержание липидов в композиции липидных частиц может составлять от примерно 5 до примерно 30 мг/мл.
[00529] Ионизируемый липид обычно используется для конденсации груза нуклеиновой кислоты, например, зкДНК при низком рН, и для стимулирования ассоциации мембран и их фузогенности. Обычно ионизируемые липиды представляют собой липиды, содержащие по меньшей мере одну аминогруппу, которая положительно заряжена или протонируется в кислых условиях, например, при рН 6,5 или ниже. Ионизируемые липиды также называются в данном документе катионными липидами.
[00530] Типичные ионизируемые липиды описаны в патентных публикациях РСТ WO2015/095340, WO2015/199952, WO2018/011633, WO2017/049245, WO2015/061467, WO2012/040184, WO2012/000104, WO2015/074085, WO2016/081029, WO2017/004143, WO2017/075531, WO2017/117528, WO2011/022460, WO2013/148541, WO2013/116126, WO2011/153120, WO2012/044638, WO2012/054365, WO2011/090965, WO2013/016058, WO2012/162210, WO2008/042973, WO2010/129709, WO2010/144740, WO2012/099755, WO2013/049328, WO2013/086322, WO2013/086373, WO2011/071860, WO2009/132131, WO2010/048536, WO2010/088537, WO2010/054401, WO2010/054406, WO2010/054405, WO2010/054384, WO2012/016184, WO2009/086558, WO2010/042877, WO2011/000106, WO2011/000107, WO2005/120152, WO2011/141705, WO2013/126803, WO2006/007712, WO2011/038160, WO2005/121348, WO2011/066651, WO2009/127060, WO2011/141704, WO2006/069782, WO2012/031043, WO2013/006825, WO2013/033563, WO2013/089151, WO2017/099823, WO2015/095346 и WO2013/086354, и публикациях патентов США US2016/0311759, US2015/0376115, US2016/0151284, US2017/0210697, US2015/0140070, US2013/0178541, US2013/0303587, US2015/0141678, US2015/0239926, US2016/0376224, US2017/0119904, US2012/0149894, US2015/0057373, US2013/0090372, US2013/0274523, US2013/0274504, US2013/0274504, US2009/0023673, US2012/0128760, US2010/0324120, US2014/0200257, US2015/0203446, US2018/0005363, US2014/0308304, US2013/0338210, US2012/0101148, US2012/0027796, US2012/0058144, US2013/0323269, US2011/0117125, US2011/0256175, US2012/0202871, US2011/0076335, US2006/0083780, US2013/0123338, US2015/0064242, US2006/0051405, US2013/0065939, US2006/0008910, US2003/0022649, US2010/0130588, US2013/0116307, US2010/0062967, US2013/0202684, US2014/0141070, US2014/0255472, US2014/0039032, US2018/0028664, US2016/0317458 и US2013/0195920, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
[00531] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой MC3 (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (DLin-MC3-DMA или MC3), имеющий следующую структуру:
.
[00532] Липид DLin-MC3-DMA описан в Jayaraman et al. Angew. Chem. Int. Ed Engl. (2012), 51(34): 8529-8533, содержание которого в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки.
[00533] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой липид ATX-002, имеющий следующую структуру:
.
[00534] Липид ATX-002 описан в WO 2015/074085, содержание которого в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
[00535] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой (13Z,16Z)-N,N-диметил-3-нонилдокоса-13,16-диен-1-амин (Соединение 32), имеющий следующую структуру:
.
[00536] Соединение 32 описано в WO2012/040184, содержание которого в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки.
[00537] В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид представляет собой Соединение 6 или Соединение 22, имеющие следующие структуры:
[00538] Соединения 6 и 22 описаны в WO 2015/1992, содержание которого в полном объеме включено в настоящее описание посредством ссылки.
[00539] Без ограничений, ионизируемый липид может составлять 20-90% (мол.) от общего липида, присутствующего в липидной наночастице. Например, молярное содержание ионизируемого липида может составлять 20-70% (мол.), 30-60% (мол.) или 40-50% (мол.) от общего липида, присутствующего в липидной наночастице. В некоторых вариантах реализации ионизируемый липид составляет от примерно 50 % мол. до примерно 90 % мол. от общего липида, присутствующего в липидной наночастице.
[00540] В некоторых аспектах липидная наночастица может дополнительно содержать некатионный липид. Неионные липиды включают амфипатические липиды, нейтральные липиды и анионные липиды. Соответственно, не-катионный липид может быть нейтральным незаряженным, цвиттерионным, или анионным липидом. Некатионные липиды обычно используются для усиления фузогенности.
[00541] Примеры не-катионных липидов включают, без ограничений, дистеароил-sn-глицерофосфоэтаноламин, дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (POPC), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоилфосфатидилэтаноламин-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal), дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароилфосфатидилэтаноламин (DSPE), монометилфосфатидилэтаноламин (такой как 16-O-монометил-PE), диметилфосфатидилэтаноламин (такой как 16-O-диметил-PE), 18-1-транс-PE, 1-стеароил-2-олеоилфосфатидиэтаноламин (SOPE), гидрогенизированный соевый фосфатидилхолин (HSPC), яичный фосфатидилхолин (EPC), диолеоилфосфатидилсерин (DOPS), сфингомиелин (SM), димиристоилфосфатидилхолин (DMPC), димиристоилфосфатидилглицерин (DMPG), дистеароилфосфатидилглицерин (DSPG), диэрукоилфосфатидилхолин (DEPC), пальмитоилолеоилфосфатидилглицерин (POPG), диэлаидоилфосфатидилэтаноламин (DEPE), лецитин, фосфатидилэтаноламин, лизолецитин, лизофосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, сфингомиелин, яичный сфингомиелин (ESM), цефалин, кардиолипин, фосфатидная кислота, цереброзиды, дицетилфосфат, лизофосфатидилхолин, дилинолеоилфосфатидилхолин, или их смеси. Понятно, что могут быть использованы также другие фосфолипиды на основе диацилфосфатидилхолина и диацилфосфатидилэтаноламина. Ацильные группы в этих липидах предпочтительно представляют собой ацильные группы, производные от жирных кислот, имеющих C10-C24-углеродные цепи, например, лауроил, миристоил, пальмитоил, стеароил или олеоил.
[00542] Другие примеры некатионных липидов, пригодных для использования в липидных наночастицах, включают не-фосфорсодержащие липиды, такие как, например, стеариламин, додециламин, гексадециламин, ацетилпальмитат, глицеринрицинолеат, гексадецилстеарат, изопропилмиристат, амфотерные акриловые полимеры, триэтилэтаноламинлаурилсульфат, полиэтилоксилированные алкил-арилсульфатами амиды жирных кислот, диоктадецилдиметиламмония бромид, церамид, сфингомиелин и т.п.
[00543] В некоторых вариантах реализации некатионный липид представляет собой фосфолипид. В некоторых вариантах реализации некатионный липид выбирают из DSPC, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE и SM. В некоторых предпочтительных вариантах реализации некатионный липид представляет собой DPSC.
[00544] Типичные некатионные липиды описаны в публикации РСТ WO2017/099823 и публикации патента США US2018/0028664, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В некоторых примерах некатионный липид представляет собой олеиновую кислоту или соединение формулы (I), формулы (II) или формулы (IV) , как указано в US2018/0028664, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
[00545] Некатионный липид может составлять 0-30% (мол.) от общего липида, присутствующего в липидной наночастице. Например, содержание некатионных липидов составляет 5-20% (мол.) или 10-15% (мол.) от общего липида, присутствующего в липидной наночастице. В различных вариантах реализации молярное отношение ионизируемого липида к нейтральному липиду составляет от примерно 2:1 до примерно 8:1.
[00546] В некоторых вариантах реализации липидные наночастицы не содержат каких-либо фосфолипидов.
[00547] В некоторых аспектах липидная наночастица может дополнительно содержать такой компонент, как стерин, для обеспечения целостности мембраны.
[00548] Один пример стерина, который может быть использованы в липидной наночастице, представляет собой холестерин и его производные. Неограничивающие примеры производных холестерина включают полярные аналоги, такие как 5α-холестанол, 5β-копростанол, холестерил-(2''-гидрокси)этиловый эфир, холестерил-(4'-гидрокси)бутиловый эфир и 6-кетохолестанол; неполярные аналоги, такие как 5α-холестан, холестенон, 5α-холестанон, 5β-холестанон и холестерилдеканоат; и их смеси. В некоторых вариантах реализации производное холестерина представляет собой полярный аналог, такой как холестерил-(4'-гидрокси)бутиловый эфир.
[00549] Типичные производные холестерина описаны в публикации РСТ WO2009/127060 и публикации патента США US2010/0130588, содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
[00550] Компонент, обеспечивающий целостность мембраны, такой как стерол, может составлять 0-50% (мол.) от общего липида, присутствующего в липидной наночастице. В некоторых вариантах реализации такой компонент составляет 20-50% (мол.) 30-40% (мол.) от общего липида в липидной наночастице.
[00551] В некоторых аспектах липидная наночастица может дополнительно содержать полиэтиленгликоль (ПЭГ) или конъюгированную молекулу липида. Обычно они используются для ингибирования агрегации липидных наночастиц и/или обеспечения стерической стабилизации. Типичные конъюгированные липиды включают, без ограничений, конъюгаты ПЭГ-липид, конъюгаты полиоксазолин (POZ)-липид, конъюгаты полиамид-липид (такие как конъюгаты АТТА-липид), конъюгаты катионный полимер-липид (CPL) и их смеси. В некоторых вариантах реализации конъюгированная липидная молекула представляет собой конъюгат ПЭГ-липид, например, (метоксиполиэтиленгликоль)-конъюгированные липиды.
[00552] Типичные конъюгаты ПЭГ-липид включают, без ограничений, ПЭГ-диацилглицерин (DAG) (такой как 1-(монометоксиполиэтиленгликоль)-2,3-димиристоилглицерин (ПЭГ-DMG)), ПЭГ-диалкилоксипропил (DAA), ПЭГ-фосфолипид, ПЭГ-церамид (Cer), пегилированный фосфатидилэтаноламин (PEG-PE), ПЭГ-сукцинатдиацилглицерол (PEGS-DAG) (такой как 4-O-(2',3'-ди(тетрадеканоилокси)пропил-1-O)-(w-метокси(полиэтокси)этил)бутандиоат (PEG-S-DMG)), PEG-диалкоксипропилкарбам, N-(карбонилметоксиполиэтиленгликоль 2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламина натриевая соль, или их смесь. Дополнительные примеры конъюгатов ПЭГ-липид описаны, например, в US5885613, US6287591, US2003/0077829, US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2010/0130588, US2016/0376224 и US2017/0119904, содержание которых включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме.
[00553] В некоторых вариантах реализации ПЭГ-липид представляет собой соединение формулы (III), , формулы (III-a-I), , формулы (III-a-2), , формулы (III-b-1), , формулы (III-b-2), или формулы (V), , как определено в US2018/0028664, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
[00554] В некоторых вариантах реализации ПЭГ-липид предсставляет собой соединений формулы (II), , как определено в US20150376115 или в US2016/0376224, содержание которых включено в данное описание посредством ссылки в полном объеме.
[00555] Конъюгатом ПЭГ-DAA может быть, например, ПЭГ-дилаурилоксипропил, ПЭГ-димиристилоксипропил, ПЭГ-дипалмитилоксипропил или ПЭГ-дистеарилоксипропил. ПЭГ-липид может представлять собой один или несколько из ПЭГ-DMG, ПЭГ-дилаурилглицерина, ПЭГ-дипальмитоилглицерина, ПЭГ-дистерилглицерина, ПЭГ-дилаурилгликамида, ПЭГ-димиристилгликамида, ПЭГ-дипальмитоилгликамида, ПЭГ-дистерилгликамида, ПЭГ-холестерина (1-[8''-(холест-5-ен-3β-окси)карбоксамидо-3',6'-диоксаоктанил]карбамоил-[омега]-метилполи(этиленгликоль), ПЭГ-DMB (простой эфир 3,4-дитетрадекоксилбензил-[омега]-метилполи(этиленгликоля)) и 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000]. В некоторых примерах ПЭГ-липид может быть выбран из группы, состоящей из ПЭГ-DMG, 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000],
, , , и .
[00556] Вместо ПЭГ-липида можно также использовать липиды, конъюгированные с молекулой, отличной от ПЭГ. Например, конъюгаты полиоксазолин (POZ)-липид, конъюгаты полиамид-липид (например, конъюгаты АТТА-липид) и конъюгаты катионный полимер-липид (CPL) могут быть использованы вместо ПЭГ-липида или в дополнение к нему.
[00557] Типичные примеры конъюгированных липидов, т.е. ПЭГ-липиды, конъюгаты (POZ)-липид, конъюгаты АТТА-липид и (катионный полимер)-липиды, описаны в публикациях патентных заявок РСТ WO1996/010392, WO1998/051278, WO2002/087541, WO2005/026372, WO2008/147438, WO2009/086558, WO2012/000104, WO2017/117528, WO2017/099823, WO2015/199952, WO2017/004143, WO2015/095346, WO2012/000104, WO2012/000104 и WO2010/006282, публикациях заявок на патент США US2003/0077829, US2005/0175682, US2008/0020058, US2011/0117125, US2013/0303587, US2018/0028664, US2015/0376115, US2016/0376224, US2016/0317458, US2013/0303587, US2013/0303587 и US20110123453, а также патентов США US5885613, US6287591, US6320017 и US6586559, содержание которых в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки.
[00558] ПЭГ или конъюгированный липид может составлять 0-20% (мол.) от общего липида, присутствующего в липидной наночастице. В некоторых вариантах реализации содержание ПЭГ или конъюгированного липида составляет 0,5-10% или 2-5% (мол.) от общего липида, присутствующего в липидной наночастице.
[00559] Молярные соотношения ионизируемого липида, некатионного липида, стерина и ПЭГ/конъюгированного липида могут изменяться по мере необходимости. Например, липидная частица может содержать 30-70% ионизируемого липида на моль или от общего веса композиции, 0-60% холестерина на моль или от общего веса композиции, 0-30% некатионного липида на моль или от общего веса композиции и 1-10% конъюгированного липида на моль или от общего веса композиции. Предпочтительно, композиция содержит 30-40% ионизируемого липида на моль или от общего веса композиции, 40-50% холестерина на моль или от общего веса композиции и 10-20% некатионного липида на моль или от общего веса композиции. В некоторых других вариантах реализации композиция содержит 50-75% ионизируемого липида на моль или от общего веса композиции, 20-40% холестерина на моль или от общего веса композиции, и от 5 до 10% некатионного липида на моль или от общего веса композиции и 1-10% конъюгированного липида на моль или от общего веса композиции. Композиция может содержать 60-70% ионизируемого липида на моль или от общего веса композиции, 25-35% холестерина на моль или от общего веса композиции и 5-10% некатионного липида на моль или от общего веса композиции. Композиция также может содержать до 90% ионизируемого липида на моль или от общего веса композиции и от 2 до 15% некатионного липида на моль или от общего веса композиции. Композиция также может представлять собой композицию липидных наночастиц, например, содержащую 8-30% ионизируемого липида на моль или от общего веса композиции, 5-30% некатионного липида на моль или от общего веса композиции и 0-20% холестерина на моль или от общего веса композиции; 4-25% ионизируемого липида на моль или от общего веса композиции, 4-25% некатионного липида на моль или от общего веса композиции, от 2 до 25% холестерина на моль или от общего веса композиции, от 10 до 35% конъюгированного липида на моль или от общего веса композиции и 5% холестерина на моль или от общего веса композиции; или 2-30% ионизируемого липида на моль или от общего веса композиции, 2-30% некатионного липида на моль или от общего веса композиции, от 1 до 15% холестерина на моль или от общего веса композиции, от 2 до 35% конъюгированного липида на моль или от общего веса композиции и 1-20% холестерина на моль или от общего веса композиции; или даже до 90% ионизируемого липида на моль или от общего веса композиции и 2-10% некатионных липидов на моль или от общего веса композиции, или даже до 100% катионного липида на моль или от общего веса композиции. В некоторых вариантах реализации композиция липидных частиц содержит ионизируемый липид, фосфолипид, холестерин и пегилированный липид в молярном соотношении 50:10:38,5:1,5. В некоторых других вариантах реализации композиция липидных частиц содержит ионизируемый липид, холестерин и пегилированный липид в молярном соотношении 60:38,5:1,5.
[00560] В некоторых вариантах реализации липидная частица содержит ионизируемый липид, некатионный липид (например, фосфолипид), стерин (например, холестерин) и пегилированный липид, причем молярное соотношение липидов находится в диапазоне от 20 до 70 мольных процентов для ионизируемого липида, с целевым диапазоном 40-60, мольный процент некатионного липида находится в диапазоне от 0 до 30, с целевым диапазоном от 0 до 15, мольный процент стерина находится в диапазоне от 20 до 70, с целевым диапазоном от 30 до 50, и мольный процент пегилированного липида находится в диапазоне от 1 до 6, с целевым диапазоном от 2 до 5.
[00561] Липидные наночастицы (LNP), содержащие зкДНК, раскрыты в международной заявке PCT/US2018/050042, поданной 7 сентября 2018 г., которая в полном объеме включена в данный документ и предназначена для использования в способах и композициях, раскрытых в данном документе.
[00562] Размер липидных наночастиц может быть определен методом квазиупругого светорассеяния с использованием прибора Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, Великобритания) и составляет приблизительно 50-150 нм в диаметре, приблизительно 55-95 нм в диаметре, или приблизительно 70-90 нм в диаметре.
[00563] Значение pKa композиций катионных липидов может коррелировать с эффективностью LNP для доставки нуклеиновых кислот (см. Jayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010), которые оба включены посредством ссылки в полном объеме). Предпочтительный диапазон значений рКа составляет от ок.5 до ок.7. pKa каждого катионного липида определяют в липидных наночастицах с использованием анализа, основанного на флуоресценции 2-(п-толуидино)-6-нафталинсульфоновой кислоты (TNS). Липидные наночастицы, содержащие катионный липид/DSPC/холестерин/ПЭГ-липид (50/10/38,5/1,5 % мол.) в фосфатно-солевом буфере (PBS) при концентрации 0,4 мМ общего липида, могут быть получены с использованием поточного процесса, как описано в данном документе и в других источниках. TNS может быть приготовлен в виде 100 мкМ исходного раствора в дистиллированной воде. Везикулы могут быть разбавлены до 24 мкМ липида в 2 мл забуференных растворов, содержащих 10 мМ HEPES, 10 мМ MES, 10 мМ ацетата аммония, 130 мМ NaCl, при этом рН имеет значение в диапазоне от 2,5 до 11. Аликвота раствора TNS может быть добавлена до получения конечной концентрации 1 мкМ, и после этого интенсивность флуоресценции при перемешивании на вихревой мешалке измеряют при комнатной температуре на люминесцентном спектрофотометре SLM Aminco Series 2, используя длины волн возбуждения и излучения, равные 321 нм и 445 нм. Анализ наилучшего соответствия с использованием уравнения сигмоидальной кривой может быть применен к данным флуоресценции, и pKa измеряют как значение pH, дающее полумаксимальную интенсивность флуоресценции.
[00564] Относительная активность может быть определена путем измерения экспрессии люциферазы в печени через 4 часа после введения путем инъекции в хвостовую вену. Активность сравнивают в дозе 0,3 и 1,0 мг зкДНК/кг и выражают в нг люциферазы/г печени, при измерении через 4 часа после введения.
[00565] Без ограничений, липидные наночастицы по изобретению включают липидную композицию, которая может быть использована для доставки бескапсидного невирусного ДНК-вектора к участку-мишени, представляющему интерес (например, клетке, ткани, органу и т.п.). Обычно липидная наночастица содержит бескапсидный невирусный ДНК-вектор и ионизируемый липид или его соль.
[00566] В некоторых вариантах реализации липидная частица содержит ионизируемый липид / некатионный липид / стерол / конъюгированный липид при мольном соотношении 50:10:38,5:1,5.
[00567] В других аспектах данное изобретение относится к композиции липидных наночастиц, содержащей фосфолипиды, лецитин, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин.
[00568] В некоторых вариантах реализации также могут быть включены одно или несколько дополнительных соединений. Эти соединения можно вводить отдельно, или дополнительные соединения могут быть включены в липидные наночастицы по изобретению. Другими словами, липидные наночастицы могут содержать другие соединения в дополнение к зкДНК или, по меньшей мере, вторую зкДНК, отличную от первой. Без ограничений, другие дополнительные соединения могут быть выбраны из группы, состоящей из малых или крупных органических или неорганических молекул, моносахаридов, дисахаридов, трисахаридов, олигосахаридов, полисахаридов, пептидов, белков, аналогов пептидов и их производных, пептидомиметиков, нуклеиновых кислот, аналогов и производных нуклеиновых кислот, экстракта из биологических материалов или любых их комбинаций.
[00569] В некоторых вариантах реализации одно или несколько дополнительных соединений могут представлять собой терапевтической средство. Терапевтическое средство может быть выбрано из любого класса, подходящего для достижения терапевтической цели. Другими словами, терапевтическое средство может быть выбрано из любого класса, подходящего для достижения терапевтической цели. Другими словами, терапевтическое средство может быть выбрано в соответствии с целью лечения и желаемым биологическим действием. Например, если зкДНК в LNP полезна для лечения рака, дополнительное соединение может представлять собой противораковое средство (например, химиотерапевтическое средство, таргетную терапию рака (включая, без ограничений, малую молекулу, антитело или конъюгат антитело-лекарственное средство). В другом примере, если LNP, содержащие зкДНК, полезны для лечения инфекции, дополнительное соединение может представлять собой антимикробный агент (например, антибиотик или противовирусное соединение). В еще одном примере, если LNP, содержащие зкДНК, полезны для лечения иммунного заболевания или расстройства, дополнительное соединение может представлять собой соединение, которое модулирует иммунный ответ (например, иммунодепрессант, иммуностимулирующее соединение или соединение, модулирующее один или несколько специфических иммунных путей). В некоторых вариантах реализации в композициях и способах по изобретению могут быть использованы различные коктейли различных липидных наночастиц, содержащих разные соединения, такие как зкДНК, кодирующая другой белок или другое соединение, такое как терапевтическое средство.
[00570] В некоторых вариантах реализации дополнительное соединение представляет собой иммуномодулирующий агент. Например, дополнительное соединение представляет собой иммунодепрессант. В некоторых вариантах дополнительное соединение является иммуностимулирующим.
[00571] Данное изобретение также предлагает фармацевтическую композицию, содержащую липидную наночастицу и фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент.
[00572] В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции липидных наночастиц, дополнительно содержащей один или несколько фармацевтических эксципиентов. В некоторых вариантах реализации композиция липидных наночастиц дополнительно содержит сахарозу, трис, трегалозу и/или глицин.
[00573] Обычно липидные наночастицы по изобретению имеют средний диаметр, выбранный для обеспечения предполагаемого терапевтического эффекта. Соответственно, в некоторых аспектах липидная наночастица имеет средний диаметр от примерно 30 нм до примерно 150 нм, более типично, от примерно 50 нм до примерно 150 нм, более типично, от примерно 60 нм до примерно 130 нм, более типично, от примерно 70 нм до примерно 110 нм, наиболее типично, от примерно 85 нм до примерно 105 нм и, предпочтительно, около 100 нм. В некоторых аспектах данное изобретение относится к липидным частицам, размер которых больше, чем у обычных наночастиц, и составляет от 150 до 250 нм. Размер липидных наночастиц может быть определен методом квазиупругого рассеяния света с использованием, например, системы Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, UK).
[00574] В зависимости от предполагаемого использования липидных частиц, пропорции компонентов могут варьироваться, и эффективность доставки конкретной композиции может быть измерена с использованием, например, анализа параметра высвобождения эндосомы (ERP).
[00575] зкДНК может образовывать комплекс с липидной частью частицы или быть инкапсулированным в липидной части (position) липидной наночастицы. В некоторых вариантах реализации зкДНК может быть полностью инкапсулирована в липидной части липидной наночастицы, тем самым защищая ее от деградации нуклеазой, например, в водном растворе. В некоторых вариантах реализации зкДНК в липидной наночастице не деградирует существенно после воздействия на липидную наночастицу нуклеазой при 37 °С в течение по меньшей мере примерно 20, 30, 45 или 60 минут. В некоторых вариантах реализации зкДНК в липидной наночастице существенно не деградирует после инкубации частицы в сыворотке при 37°С в течение по меньшей мере примерно 30, 45 или 60 минут или по меньшей мере примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34 или 36 часов.
[00576] В некоторых вариантах реализации липидные наночастицы по существу нетоксичны для субъекта, например, млекопитающего, такого как человек.
[00577] В некоторых аспектах композиция липидных наночастиц представляет собой лиофилизированный порошок.
[00578] В некоторых вариантах реализации, липидные наночастицы представляют собой твердые частицы сердцевины, имеющие по меньшей мере один липидный бислой. В других вариантах, липидные наночастицы имеют не-двухслойную структуру, т.е. не-ламеллярную (т.е. не-бислойную) морфологию. Без ограничений, не-бислойная морфология может включать, например, трехмерные трубки, стержни, частицы кубической симметрии и т.д. Не-ламеллярную морфологию (то есть, не-бислойную структуру) липидных частиц можно определить с использованием аналитических методов, известных в данной области и применяемых специалистами. Такие методики включают, без ограничений, криотрансмиссионную электронную микроскопию («Крио-ТЭМ» (Cryo-TEM)), дифференциальную сканирующую калориметрию («ДСК»), рентгеновскую дифракцию и т.п. Например, морфологию липидных наночастиц (ламеллярных или неламеллярных) можно легко оценить и охарактеризовать с использованием, например, анализа Cryo-TEM, как описано в US 2010/0130588, содержание которого включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
[00579] В некоторых других вариантах реализации липидные наночастицы, имеющие неламеллярную морфологию, являются электронно-плотными.
[00580] В некоторых аспектах данное изобретение относится к липидной наночастице, которая является либо однослойной, либо мультиламеллярной по структуре. В некоторых аспектах данное изобретение относится к композиции липидных наночастиц, которая включает мультивезикулярные частицы и/или частицы на основе пены.
[00581] Контролируя состав и концентрацию липидных компонентов, можно контролировать скорость обмена липидным конъюгатом из липидной частицы, и, в свою очередь, скорость превращения липидной наночастицы в фузогенную. Кроме того, другие переменные, включая, например, pH, температуру или ионную силу, могут использоваться для изменения и/или контроля скорости, с которой липидная наночастица становится фузогенной. Другие способы, которые можно использовать для контроля скорости превращения липидной наночастицы в фузогенную, будут очевидны для специалистов в данной области техники на основании описания данного изобретения. Также будет очевидно, что, контролируя состав и концентрацию липидного конъюгата, можно контролировать размер липидных частиц.
[00582] Значение pKa композиций катионных липидов может коррелировать с эффективностью LNP для доставки нуклеиновых кислот (см. Jayaraman et al., Angewandte Chemie, International Edition (2012), 51(34), 8529-8533; Semple et al, Nature Biotechnology 28, 172-176 (2010), которые оба включены посредством ссылки в полном объеме). Предпочтительный диапазон значений рКа составляет от ок.5 до ок.7. Значение pKa катионного липида в липидных наночастицах может быть определено с использованием анализа, основанного на флуоресценции 2-(п-толуидино)-6-нафталинсульфоновой кислоты (TNS).
[00583] Инкапсуляция зкДНК в липидных частицах может быть определена путем проведения анализа исключения мембранно-непроницаемого флуоресцентного красителя, в котором используют краситель, обладающий повышенной флуоресценцией при ассоциации с нуклеиновой кислотой, например, анализа с использованием Oligreen® или PicoGreen®. Как правило, капсулирование определяют путем добавления красителя к композиции липидных частиц, измерения результирующей флуоресценции и сравнения ее с флуоресценцией, наблюдаемой при добавлении небольшого количества неионогенного детергента. Опосредованное детергентом разрушение липидного бислоя высвобождает инкапсулированную зкДНК, позволяя ей взаимодействовать с мембранно-непроницаемым красителем. Инкапсуляция зкДНК может быть рассчитана как E=(I0-I)/I0, где I и I0 относятся к интенсивностям флуоресценции до и после добавления детергента.
IX. Способы доставки зкДНК-векторов
[00584] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может быть доставлен в клетку-мишень in vitro или in vivo различными подходящими способами. Могут быть нанесены или инъецированы отдельно взятые зкДНК-векторы. зкДНК-векторы могут быть доставлены в клетку без помощи реагента для трансфекции или других физических средств. Альтернативно, зкДНК-векторы могут быть доставлены с использованием любого известного в данной области реагента для трансфекции или других известных в технике физических средств, которые облегчают проникновение ДНК в клетку, например, липосом, спиртов, соединений, богатых полилизином, соединений, богатых аргинином, фосфата кальция, микровезикул. микроинъекции, электропорации и т.п.
[00585] Напротив, трансдукция бескапсидными AAV-векторами, раскрытыми в данном документе, может обеспечивать эффективное нацеливание на типы клеток и тканей, которые трудно трансдуцировать стандартными вирионами AAV, с применением различных реагентов для доставки.
[00586] В другом варианте реализации зкДНК-вектор вводят в ЦНС (например, в головной мозг или в глаз). зкДНК-вектор может быть введен в спинной мозг, ствол головного мозга (продолговатый мозг, варолиев мост), средний мозг (гипоталамус, таламус, эпиталамус, гипофиз, черная субстанция, шишковидная железа), мозжечок, конечный мозг (полосатое тело, большой мозг, в том числе затылочные, височные, теменные и лобные доли, кору, базальные ганглии, гиппокамп и воротное миндалевидное тело (portaamygdala)), лимбическая система, неокортекс, полосатое тело, большой мозг и нижний холмик. зкДНК-вектор также можно вводить в различные области глаза, такие как сетчатка, роговица и/или зрительный нерв. зкДНК-вектор может быть доставлен в спинномозговую жидкость (например, посредством люмбальной пункции). Дополнительно, зкДНК-вектор может быть введен в ЦНС внутрисосудисто в ситуациях, когда гематоэнцефалический барьер нарушен (например, опухоль головного мозга или инфаркт головного мозга).
[00587] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может быть введен в желаемую область (области) ЦНС любым путем, известным в данной области техники, включая, без ограничения, интратекальную, внутриглазную, интрацеребральную, интравентрикулярную, внутривенную (например, в присутствии сахара, такого как маннит), интраназальную, внутриушную, внутриглазную (например, внутристекловидную, субретинальную, в переднюю камеру) и периокулярную (например, в субтеноновую область) доставку, а также внутримышечную доставку с ретроградной доставкой к мотонейронам.
[00588] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор вводят в жидкой композиции путем прямой инъекции (например, стереотаксической инъекции) в желаемую область или компартмент ЦНС. В других вариантах реализации зкДНК-вектор может быть введен путем местного нанесения на желаемую область или путем интраназального введения аэрозольной композиции. Введение в глаз может осуществляться путем местного нанесения капель жидкости. В качестве дополнительной альтернативы зкДНК-вектор может быть введен в виде твердой композиции с замедленным высвобождением (см., например, патент США № 7201898). В дополнительных вариантах реализации, зкДНК-вектор может использоваться для ретроградного транспорта для лечения, облегчения и/или предотвращения заболеваний и расстройств, связанных с двигательными нейронами (например, боковой амиотрофический склероз (ALS); спинальная мышечная атрофия (SMA) и т.д.). Например, зкДНК-вектор может быть доставлен в мышечную ткань, из которой он может мигрировать в нейроны.
X. Дополнительные применения зкДНК-векторов
[00589] Композиции и зкДНК-векторы, представленные в данном документе, можно использовать для редактирования гена-мишени для различных целей. В некоторых вариантах реализации полученный трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования в исследовательских целях, например, для создания соматической модели трансгенного животного, содержащей трансген, например, для изучения функции продукта трансгена. В другом примере трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования с целью создания животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации полученный трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения, профилактики или облегчения болезненных состояний или расстройств у млекопитающего-субъекта. Полученный трансген может быть перенесен субъекту (например, экспрессироваться у субъекта) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена. В некоторых вариантах реализации полученный трансген может экспрессироваться у субъекта в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с повышенной экспрессией, активностью продукта гена или неадекватной повышающей регуляцией гена, который полученный трансген подавляет или иным образом вызывает снижение его экспрессии. В других вариантах реализации полученный трансген заменяет или дополняет дефектную копию нативного гена. Специалисту в данной области должно быть понятно, что трансген может не быть открытой рамкой считывания гена, который сам должен транскрибироваться; вместо этого, он может быть областью промотора или областью репрессора гена-мишени, и зкДНК-вектор редактирования гена может модифицировать такую область, модулируя в результате экспрессию представляющего интерес гена.
[00590] В некоторых вариантах реализации трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования при создании животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения или профилактики болезненных состояний у млекопитающего-субъекта. Трансгенная или донорная последовательность может быть перенесена пациенту (например, экспрессироваться у пациента) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена. В некоторых вариантах реализации трансген представляет собой молекулу для редактирования генов (например, нуклеазу). В некоторых вариантах реализации нуклеаза представляет собой CRISPR-ассоциированную нуклеазу (Cas-нуклеазу).
XI. Методы применения
[00591] зкДНК-вектор для редактирования генов, как описано в данном документе, также может применяться в способе доставки представляющей интерес нуклеотидной последовательности (например, молекулы для редактирования генов, например, нуклеазы или направляющей последовательности) в клетку-мишень (например, клетку-хозяина). Указанный способ, в частности, может представлять собой способ доставки молекулы для редактирования генов в клетку нуждающегося в этом субъекта и редактирования гена-мишени, представляющего интерес. Изобретение обеспечивает экспрессию in vivo молекулы для редактирования генов, например, нуклеазы или направляющей последовательности, кодируемой в зкДНК-векторе, в клетке субъекта, вызывая терапевтический эффект механизма редактирования генов. Такие результаты наблюдаются как при in vivo, так и при in vitro способах доставки зкДНК-вектора.
[00592] Кроме того, изобретение обеспечивает способ доставки молекулы для редактирования генов в клетку нуждающегося в этом субъекта, включающий многократное введение зкДНК-вектора по изобретению, содержащего указанную нуклеиновую кислоту, представляющую интерес. Поскольку зкДНК-вектор по изобретению не индуцирует иммунный ответ, подобный тому, который обычно наблюдается против инкапсидированных вирусных векторов, такая стратегия множественного введения, вероятно, будет иметь больший успех в системе на основе зкДНК.
[00593] Нуклеиновую кислоту (кислоты) зкДНК-вектора вводят в достаточных количествах для трансфекции клеток желаемой ткани и для обеспечения достаточных уровней переноса и экспрессии генов без нежелательных побочных эффектов. Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, без ограничений, внутривенный (например, в составе липосом), прямую доставку в выбранный орган (например, внутрипортальную доставку в печень), внутримышечный и другие парентеральные (parental) пути введения. Пути введения могут быть скомбинированы, если это желательно.
[00594] Доставка зкДНК не ограничивается доставкой всех нуклеотидов, кодирующих компоненты редактирования генов, с помощью зкДНК-вектора. Например, зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут использоваться с другими системами доставки, предусматриваемыми для обеспечения части компонентов редактирования генов. Один неограничивающий пример системы, которая может комбинироваться с зкДНК-векторами в соответствии с данным изобретением, включает системы для отдельной доставки Cas9 в клетку-хозяина, нуждающуюся в лечении или редактировании гена. В некоторых вариантах реализации Cas9 может быть доставлен в наночастице, такой как описанные в Lee et al., Nanoparticle delivery of Cas9 ribonucleotideprotein and donor DNA in vivo induces homology-directed DNA repair, Nature Biomedical Engineering, 2017 (включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме), тогда как другие компоненты, такие как донорная последовательность, доставляются с помощью зкДНК.
[00595] Изобретение также относится к способу лечения заболевания у субъекта, включающему введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (в частности, в мышечную клетку или ткань) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор может быть введен вместе с носителем, такой носитель не является необходимым. Предусматриваемый в данном изобретении зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, полезную для лечения заболевания. В частности, зкДНК-вектор может содержать желаемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными направлять транскрипцию желаемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого последовательностью экзогенной ДНК, при введении субъекту. зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах настоящего описания.
[00596] Композиции и векторы, представленные в данном документе, могут быть использованы для доставки трансгена с различными целями. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования в исследовательских целях, например, для создания соматической модели трансгенного животного, содержащей трансген, например, для изучения функции продукта трансгена. В другом примере трансген кодирует белок или функциональную РНК, которая предназначена для использования с целью создания животной модели заболевания. В некоторых вариантах реализации трансген кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения или профилактики болезненных состояний у млекопитающего-субъекта. Трансген может быть перенесен пациенту (например, экспрессироваться у пациента) в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с пониженной экспрессией, отсутствием экспрессии или дисфункцией гена. В некоторых вариантах реализации трансген представляет собой молекулу для редактирования генов (например, нуклеазу). В некоторых вариантах реализации нуклеаза представляет собой CRISPR-ассоциированную нуклеазу (Cas-нуклеазу).
[00597] В принципе, экспрессионная кассета может включать нуклеиновую кислоту или нуклеазу, нацеленную на любой ген, кодирующий белок или полипептид, который либо редуцирован, либо отсутствует из-за мутации, либо который приносит терапевтическую пользу, когда сверхэкспрессия считается входящей в объем изобретения. зкДНК-вектор содержит матричную нуклеотидную последовательность, используемую в качестве корректирующей цепи ДНК, для вставки после двухцепочечного разрыва, создаваемого мегануклеазой или нуклеазой цинкового пальца. зкДНК-вектор может содержать матричную нуклеотидную последовательность, используемую в качестве корректирующей цепи ДНК, для вставки после двухцепочечного разрыва, создаваемого мегануклеазой или нуклеазой цинкового пальца. Предпочтительно, неинсертированная бактериальная ДНК не присутствует и, предпочтительно, бактериальная ДНК отсутствует в композициях зкДНК по данному изобретению.
[00598] Доставка зкДНК-вектора для редактирования генов не ограничивается одним видом зкДНК-вектора. По существу, в другом аспекте множество зкДНК-векторов, содержащих разные донорные последовательности и/или последовательности редактирования генов, может доставляться в клетку-мишень, ткань, орган или субъекту одновременно или последовательно. Следовательно, эта стратегия может позволять редактировать несколько генов одновременно. Также возможно разделить разные части функциональности редактирования генов на отдельные зкДНК-векторы, которые можно вводить одновременно или в разное время и которые можно регулировать по отдельности. Доставка также может осуществляться неоднократно и, что важно для генной терапии в клинических условиях, с последующим увеличением или уменьшением доз, учитывая отсутствие иммунного ответа хозяина против капсида из-за отсутствия вирусного капсида. Ожидается, что никакой реакции против капсида возникать не будет из-за отсутствия капсида.
[00599] Изобретение также относится к способу лечения заболевания у субъекта, включающему введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (в частности, в мышечную клетку или ткань) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора для редактирования генов, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор может быть введен вместе с носителем, такой носитель не является необходимым. Предусматриваемый в данном изобретении зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, полезную для лечения заболевания. В частности, зкДНК-вектор может содержать желаемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными направлять транскрипцию желаемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого последовательностью экзогенной ДНК, при введении субъекту. зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах настоящего описания.
XII. Способы лечения
[00600] Описанная в данном документе технология также демонстрирует способы получения, а также способы применения раскрытых зкДНК-векторов различными образом, включая, например, применения, методологии, диагностические процедуры и/или схемы генной терапии ex situ, in vitro и in vivo.
[00601] В данном документе предложен способ лечения заболевания или расстройства у субъекта, включающий введение в нуждающуюся в этом клетку-мишень (например, мышечную клетку или ткань, или другой тип пораженных клеток) субъекта терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, необязательно, с фармацевтически приемлемым носителем. Хотя зкДНК-вектор может быть введен вместе с носителем, такой носитель не является необходимым. Предусматриваемый в данном изобретении зкДНК-вектор содержит представляющую интерес нуклеотидную последовательность, полезную для лечения заболевания. В частности, зкДНК-вектор может содержать желаемую последовательность экзогенной ДНК, функционально связанную с контрольными элементами, способными направлять транскрипцию желаемого полипептида, белка или олигонуклеотида, кодируемого последовательностью экзогенной ДНК, при введении субъекту. зкДНК-вектор может быть введен любым подходящим путем, как указано выше и в других разделах настоящего описания.
[00602] В данном документе раскрыты композиции и составы зкДНК-векторов, которые включают один или несколько зкДНК-векторов по данному изобретению вместе с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми буферами, разбавителями или эксципиентами. Такие композиции могут быть включены в один или несколько диагностических или терапевтических наборов для диагностики, профилактики, лечения или облегчения одного или нескольких симптомов заболевания, поражения, расстройства, травмы или нарушения функции. В одном аспекте заболевание, поражение, расстройство, травма или нарушение функции представляют собой заболевание, поражение, расстройство, травма или нарушение функции у человека.
[00603] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, предусматривает способ введения субъекту, нуждающемуся в этом, диагностически или терапевтически эффективного количества зкДНК-вектора, причем способ введение в клетку, ткань или орган субъекта, нуждающегося в этом, некоторого количества зкДНК-вектора, как описано в данном документе; и в течение периода времени, обеспечивающего возможность эффективной экспрессии трансгена из зкДНК-вектора, обеспечивая тем самым для субъекта диагностически или терапевтически эффективное количество белка, пептида, нуклеиновой кислоты, экспрессируемого зкДНК-вектором. В дополнительном аспекте, субъект является человеком.
[00604] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, предусматривает способ диагностики, предотвращения, лечения или облегчения по меньшей мере одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства, дисфункции, поражения, аномального состояния или травмы у субъекта. В общем, способ включает, по меньшей мере, стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, одного или нескольких раскрытых зкДНК-векторов, в количестве и в течение времени, достаточных для диагностики, предотвращения, лечения или облегчения одного или нескольких симптомов заболевания, расстройства, дисфункции, поражения, аномального состояния или травмы у субъекта. В дополнительном аспекте, субъект является человеком.
[00605] Другим аспектом является применение зкДНК-вектора в качестве инструмента для лечения или ослабления одного или нескольких симптомов заболевания или болезненных состояний. Существует ряд наследственных заболеваний, для которых известны дефектные гены, и которые, как правило, делятся на два класса: состояния недостаточности, как правило, недостаточности ферментов, которые обычно наследуются рецессивным образом, и разбалансированные состояния, в которые могут быть вовлечены регуляторные или структурные белки, и которые, как правило, но не всегда, наследуются доминантным образом. В случае заболеваний с состояниями недостаточности зкДНК-векторы могут применяться для доставки трансгенов, чтобы ввести в пораженные ткани нормальный ген для проведения заместительной терапии, а также, в некоторых вариантах реализации, для создания животных моделей заболевания с применением антисмысловых мутаций. В случае разбалансированных болезненных состояний, зкДНК-векторы могут применяться для создания модели болезненного состояния в модельной системе, которая затем может использоваться в рамках усилий, направленных на противодействие указанному болезненному состоянию. Таким образом, зкДНК-векторы и способы, раскрытые в данном документе, позволяют лечить генетические заболевания. Согласно настоящему документу, лечение болезненного состояния осуществляют путем частичного или полного устранения недостаточности или разбалансированности, которые вызывают заболевание или увеличивают его тяжесть.
А. Клетки-хозяева:
[00606] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор доставляет трансген в клетку-хозяина по данному изобретению. В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин по данному изобретению представляет собой клетку-хозяина человека, включая, например, клетки крови, стволовые клетки, гемопоэтические клетки, клетки CD34+, клетки печени, раковые клетки, сосудистые клетки, мышечные клетки, клетки поджелудочной железы, нервные клетки, глазные клетки или клетки сетчатки, эпителиальные или эндотелиальные клетки, дендритные клетки, фибробласты или любые другие клетки млекопитающих, включая, без ограничений, гепатоциты (т.е. клетки печени), клетки легкого, клетки сердца, клетки поджелудочной железы, клетки кишечника, диафрагмальные клетки, почечные клетки (т.е. клетки почек), нервные клетки, клетки крови, клетки костного мозга, или любой одной или нескольких выбранных тканей субъекта, для которого предусматривается проведение генной терапии. В одном аспекте клетка-хозяин по данному изобретению представляет собой клетку-хозяина человека.
[00607] Данное изобретение также относится к рекомбинантным клеткам-хозяевам, как упомянуто выше, включающим зкДНК-векторы, как описано в данном документе. Таким образом, можно использовать несколько клеток-хозяев в зависимости от цели, что очевидно для специалиста в данной области. Конструкт или зкДНК-вектор, включающий донорную последовательность, вводят в клетку-хозяина так, чтобы донорная последовательность поддерживалась как интегрированный в хромосому элемент, как было описано ранее. Термин «клетка-хозяин» охватывает любое потомство родительской клетки, которое не идентично родительской клетке из-за мутаций, возникающих во время репликации. Выбор клетки-хозяина будет в значительной степени зависеть от донорной последовательности и ее источника. Клетка-хозяин также может представлять собой эукариота, такого как клетка млекопитающего, насекомого, растения или гриба. В одном из вариантов реализации клетка-хозяин представляет собой клетку человека (например, первичные клетки, стволовые клетки, или иммортализированную клеточную линию). В некоторых вариантах реализации клетка-хозяин генетически отредактирована для коррекции дефектного гена или для уничтожения экспрессии гена. Например, CRISPR/CAS можно использовать для редактирования генома с помощью одной или нескольких рРНК путем репарации NHEJ или HDR, а также другими системами редактирования генов, например, ZFN или TALE. Клеткой-хозяином может быть клетка любого типа, например, соматическая клетка или стволовая клетка, индуцированная плюрипотентная стволовая клетка или клетка крови, например, Т-клетка или В-клетка, или клетка костного мозга. В определенных вариантах реализации клетка-хозяин представляет собой аллогенную клетку. Например, Т-клеточная геномная инженерия полезна для иммунотерапий рака, модуляции заболеваний, такой как терапия ВИЧ (например, нокаут рецептора, такого как CXCR4 и CCR5), и терапий иммунодефицита. Мишенями иммунотерапии могут быть рецепторы МНС на В-клетках. Стволовые клетки костного мозга с отредактированным геномом, например, клетки CD34+, или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки могут быть трансплантированы пациенту обратно для экспрессии терапевтического белка.
B. Примеры заболеваний для лечения с помощью зкДНК для редактирования генов
[00608] зкДНК-векторы для редактирования генов также полезны для коррекции дефектного гена в отсутствие донорной ДНК, например, одиночная направляющая РНК, которая нацелена на акцептор сплайсинга или донор сплайсинга, может в системе зкДНК CRISPR/CAS исправлять мутацию сдвига рамки в дефектном гене и приводить к экспрессии функционального белка. В качестве неограничивающего примера, ген DMD мышечной дистрофии Дюшенна был исправлен путем пропуска экзонов с использованием NHEJ одиночной направляющей РНК, и путем использования нескольких направляющих РНК, для экспрессии функционального дистрофина, см., например, US 2016/0201089, который включен в настоящий окумент посредством ссылки в полном объеме.
[00609] зкДНК-векторы для редактирования генов также полезны для уничтожения экспрессии генов. Например, в одном варианте реализации зкДНК-вектор может быть использован для создания бессмысленного индела (например, вставки или делеции некодирующих пар оснований), чтобы вызвать нокдаун гена-мишени, например, путем мутации сдвига рамки. В качестве неограничивающего примера, экспрессия рецепторов ВИЧ CXCR4 и CCR5, была успешно уничтожена в первичных Т-клетках человека путем индукции путей NHEJ или HDR с использованием CAS9 RNP и одной или нескольких направляющих РНК, см. Schumann et al. (2015) Generation of knock in primary human cells using Cas9 ribonucleoproteins, PNAS 112(33): 10437-10442, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Эта система требует только одиночную направляющую РНК и RNP (например, CAS9). зкДНК-векторы можно также использовать для нацеливания на локус PD-1 с целью уничтожения экспрессии. PD-1 экспрессирует рецептор клеточной поверхности иммунной контрольной точки на хронически активных Т-клетках, что происходит при злокачественном образовании. См. Schumann et al. выше.
[00610] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы для редактирования генов используются для коррекции дефектного гена с помощью вектора, нацеленного на пораженный ген. В одном варианте реализации зкДНК-векторы, как описано в данном документе, можно использовать для вырезания желаемой области ДНК для исправления мутации со сдвигом рамки, например, для лечения мышечной дистрофии Дюшенна или для удаления мутированных интронов LCA10 при лечении врожденного амавроза Лебера. Неограничивающие примеры заболеваний или расстройств, поддающихся лечению путем редактирования генов с использованием зкДНК-векторов, перечислены в таблицах A-C, вместе с относящимися к ним и связанными с ними генами, в патентной публикации США 2014/0170753, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В альтернативных вариантах реализации зкДНК-векторы используются для вставки экспрессионной кассеты для экспрессии терапевтического белка или репортерного белка в гене безопасной гавани, например, в неактивном интроне. В определенных вариантах реализации беспромоторную кассету вставляют в ген безопасной гавани. В таких вариантах реализации беспромоторная кассета может использовать преимущества регуляторных элементов гена безопасной гавани (промоторов, энхансеров и сигнальных пептидов), неограничивающим примером вставки в локус безопасной гавани является вставка в локус альбумина, которая описана в Blood (2015) 126 (15): 1777-1784, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Инсерция в альбумин имеет то преимущество, что позволяет секретировать трансген в кровь (см., например, Пример 22). Кроме того, геномный сайт безопасной гавани может быть определен с использованием методов, известных в данной области техники и описанных, например, в Papapetrou, Papapetrou, ER & Schambach, A. Molecular Therapy 24(4):678-684 (2016) или Sadelain et al. Nature Reviews Cancer 12:51-58 (2012), содержание которых включено в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В данном документе специально предусматривается, что сайты безопасной гавани в геноме аденоассоциированного вируса (AAV) (например, сайт безопасной гавани AAVS1) можно использовать со способами и композициями, описанными в данном документе (см., например, Oceguera-Yanez et al. Methods 101:43-55 (2016) or Tiyaboonchai, A et al. Stem Cell Res 12(3):630-7 (2014), содержание которых включено посредством ссылки в полном объеме). Например, геномный сайт безопасной гавани AAVS1 можно использовать с векторами и композициями зкДНК, как описано в данном документе, для целей гематопоэтической специфической экспрессии трансгена и сайленсинга генов в эмбриональных стволовых клетках (например, человеческих эмбриональных стволовых клетках) или индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPS-клетках). Кроме того, в данном документе предусматривается, что синтетические или коммерчески доступные донорные матрицы гомологично направленной репарации для вставки в сайт безопасной гавани AASV1 на хромосоме 19 можно использовать с векторами или композициями зкДНК, как описано в данном документе. Например, матрицы гомологично направленной репарации и направляющая РНК могут быть приобретены из коммерческих источников, например, у фирмы System Biosciences, Пало-Альто, Калифорния, и клонированы в зкДНК-вектор.
[00611] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы используются для нокаутирования или редактирования гена в Т-клетке, например, для конструирования Т-клетки для улучшенной адоптивной клеточной передачи и/или терапий CAR-T (см., например, Пример 24). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может представлять собой вектор для редактирования генов, как описано в данном документе. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может содержать эндонуклеазу, матричную последовательность нуклеиновой кислоты или комбинацию эндонуклеазы и матричной нуклеиновой кислоты, как описано в других разделах данного документа. Неограничивающие примеры терапевтически значимых нокаутов и редактирования генов Т-клеток описаны в PNAS (2015) 112(33):10437-10442, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки.
[00612] зкДНК-вектор для редактирования генов или его композицию можно использовать для лечения любого наследственного заболевания. В качестве неограничивающего примера, зкДНК-вектор или его композиция, например, могут быть использованы для лечения транстиретинового амилоидоза (ATTR), редкого заболевания, при котором мутантный белок подвергается неправильной укладке и агрегирует в нервах, сердце, желудочно-кишечной системе и т.д. В данном документе предусматривается, что указанное заболевание можно лечить путем делеции мутантного гена заболевания (mutTTR) с использованием систем редактирования генов, описанных в данном документе. Такое лечение наследственных заболеваний может остановить прогрессирование заболевания и может привести к регрессу установленного заболевания или уменьшению по меньшей мере одного симптома заболевания по меньшей мере на 10%.
[00613] В другом варианте реализации зкДНК-вектор или его композицию можно использовать для лечения дефицита орнитин-транскарбамилазы (дефицит ОТК), гипераммонемии или других нарушений цикла мочевины, которые ухудшают способность новорожденного или ребенка детоксифицировать аммиак. Как и при всех заболеваниях врожденного метаболизма, в данном изобретении предусматривается, что даже частичное восстановление активности фермента по сравнению с контролями дикого типа (например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%) может быть достаточным для уменьшения по меньшей мере одного симптома ОТК и/или улучшения качества жизни для субъекта с дефицитом ОТК. В одном варианте реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую ОТК, можно вставить после эндогенного промотора альбумина для замены белка in vivo.
[00614] В другом варианте реализации зкДНК-вектор или его композицию можно использовать для лечения фенилкетонурии (PKU) путем доставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент фенилаланин-гидроксилазу, для уменьшения накопления пищевого фенилаланина, который может быть токсичным для пациентов, страдающих фенилкетонурией. Как и при всех заболеваниях врожденного метаболизма, в данном изобретении предусматривается, что даже частичное восстановление активности фермента по сравнению с контролями дикого типа (например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%) может быть достаточным для уменьшения по меньшей мере одного симптома фенилкетонурии и/или улучшения качества жизнь для субъекта с фенилкетонурией. В одном варианте реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую фенилаланин-гидроксилазу, можно вставить после эндогенного промотора альбумина для замены белка in vivo.
[00615] В другом варианте реализации зкДНК-вектор или его композицию можно использовать для лечения гликогеновой болезни (GSD) путем доставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фермент, для коррекции аберрантного синтеза или расщепления гликогена у субъектов с гликогеновой болезнью. Неограничивающие примеры ферментов, которые можно откорректировать с использованием способов редактирования генов, описанных в данном документе, включают гликоген-синтазу, глюкозо-6-фосфатазу, кислую альфа-глюкозидазу, гликоген-деветвящий фермент, гликоген-ветвящий фермент, мышечную гликогенфосфорилазу, гликогенфосфорилазу печени, мышечную фосфофруктокиназу, киназу фосфорилазы, глюкозный транспортёр-2 (GLUT-2), альдолазу A, бета-енолазу, фосфоглюкомутазу-1 (PGM-1) и гликогенин-1. Как и при всех заболеваниях врожденного метаболизма, в данном изобретении предусматривается, что даже частичное восстановление активности фермента по сравнению с контролями дикого типа (например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 99%) может быть достаточным для уменьшения по меньшей мере одного симптома гликогеновой болезни и/или улучшения качества жизни для субъекта с гликогеновой болезнью. В одном варианте реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую фермент для коррекции аберрантного накопления гликогена, можно вставить после эндогенного промотора альбумина для замены белка in vivo.
[00616] Также предусматривается использование описанных в данном документе зкДНК-векторов при репарации in vivo врожденного амавроза Лебера (LCA), полиглутаминовых болезней, включая polyQ-повторы, и дефицита альфа-1-антитрипсина (A1AT). Врожденный амавроз Лебера - это редкое врожденное заболевание глаз, приводящее к слепоте, которое может быть вызвано мутацией в одном из следующих генов: GUCY2D, RPE65, SPATA7, AIPL1, LCA5, RPGRIP1, CRX, CRB1, NMNAT1, CEP290, IMPDH1, RD3, RDH12, LRAT, TULP1, KCNJ13, GDF6 и/или PRPH2. В настоящем изобретении предусматривается, что способы и композиции для редактирования генов, как описано в данном документе, могут быть адаптированы для доставки одного или нескольких генов, связанных с врожденным амаврозом Лебера, чтобы исправить ошибку в гене (генах), ответственных за симптомы врожденного амавроза Лебера. К полиглутаминовым болезням относятся, без ограничений: денторубральная атрофия, болезнь Гентингтона, спинальная и бульбарная мышечная атрофия и спино-мозжечковая атаксия типов 1, 2, 3 (также известна как болезнь Мачадо-Джозефа), 6, 7 и 17. В данном документе особо предусматривается, что способы редактирования генов с использованием зкДНК-векторов можно использовать для репарации мутаций ДНК, приводящих к экспансиям тринуклеотидных повторов (например, polyQ-повторов), таких связанные с полиглутаминовыми болезнями. Дефицит А1АТ - это генетическое заболевание, которое вызывает дефект продуцирования альфа-1-антитрипсина, что приводит к снижению активности фермента в крови и легких, что, в свою очередь, может привести к эмфиземе или хронической обструктивной болезни легких у пораженных субъектов. В данном документе конкретно предусматривается устранение дефицита A1AT с использованием зкДНК-векторов или их композиций, как описано в данном документе. В настоящем изобретении предусматривается, что нуклеиновая кислота, кодирующая желаемый белок для лечения врожденного амавроза Лебера, полиглутаминовых заболеваний или дефицита A1AT, может быть вставлена после эндогенного промотора альбумина для замены белка in vivo.
[00617] В других вариантах реализации композиции, содержащие зкДНК-вектор, как описано в данном документе, можно использовать для редактирования, в том числе, гена в вирусной последовательности, последовательности патогена, хромосомной последовательности, места стыка транслокаций (например, транслокации, связанной с раком), некодирующего РНК-гена или РНК-последовательности, связанного с заболеванием гена.
[00618] Любая представляющая интерес нуклеиновая кислота или ген-мишень могут быть отредактированы с использованием зкДНК-вектора для редактирования гена, как описано в данном документе. Нуклеиновые кислоты-мишени и гены-мишени включают, без ограничений, нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды, или некодирующие нуклеиновые кислоты (например, RNAi, miRs и т.д.), предпочтительно, терапевтические (например, для медицинского, диагностического или ветеринарного применения) или иммуногенные (например, для вакцин) полипептиды. В некоторых вариантах реализации нуклеиновые кислоты-мишени или гены-мишени, на которые нацелены зкДНК-векторы для редактирования генов, как описано в данном документе, кодируют один или несколько полипептидов, пептидов, рибозимов, пептидных нуклеиновых кислот, миРНК, RNAi, антисмысловых олигонуклеотидов, антисмысловых полинуклеотидов, антител, антигенсвязывающих фрагментов, или любую их комбинацию.
[00619] В частности, ген-мишень для редактирования генов с помощью зкДНК-вектора, раскрытого в данном документе, может кодировать, например, без ограничений, белок (белки), полипептид(ы), пептид(ы), фермент(ы), антитела, антигенсвязывающие фрагменты, а также их варианты и/или активные фрагменты, для использования при лечении, профилактике и/или облегчении одного или нескольких симптомов заболевания, дисфункции, поражения и/или расстройства. В одном аспекте, заболевание, дисфункция, травма, поражение и/или расстройство представляет собой заболевание, дисфункцию, травму, поражение и/или расстройство человека.
[00620] Как отмечено в данном документе, ген-мишень для редактирования генов с использованием зкДНК-вектора, раскрытого в данном документе, может кодировать белок или пептид, или последовательность терапевтической нуклеиновой кислоты, или терапевтический агент, включая, без ограничений, один или несколько агонистов, антагонистов, антиапоптозных факторов, ингибиторов, рецепторов, цитокинов, цитотоксинов, эритропоэтических агентов, гликопротеинов, факторов роста, рецепторов факторов роста, гормонов, гормональных рецепторов, интерферонов, интерлейкинов, рецепторов интерлейкина, факторов роста нервов, нейроактивных пептидов, рецепторов нейроактивных пептидов, протеаз, ингибиторов протеаз, белковых декарбоксилаз, протеинкиназ, ингибиторов протеинкиназы, ферментов, рецептор-связывающих белков, транспортных белков или одного или нескольких их ингибиторов, серотониновых рецепторов или одного или нескольких ингибиторов их поглощения, серпинов, рецепторов серпина, опухолевых супрессоров, диагностических молекул, химиотерапевтических агентов, цитотоксинов, или любую их комбинацию.
C. Дополнительные заболевания для редактирования генов:
[00621] В общем, зкДНК-вектор, описанный в данном документе, можно использовать для доставки любого трансгена в соответствии с приведенным выше описанием для лечения, предотвращения или облегчения симптомов, ассоциированных с любым расстройством, связанным с генной экспрессией. Иллюстративные примеры болезненных состояний включают, без ограничений: муковисцидоз (и другие заболевания легких), гемофилию A, гемофилию B, талассемию, анемию и другие расстройства крови, СПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, амиотрофический боковой склероз, эпилепсию и другие неврологические расстройства, рак, сахарный диабет, мышечные дистрофии (например, Дюшенна, Беккера), болезнь Гурлера, недостаточность аденозиндезаминазы, метаболические дефекты, дегенеративные заболевания сетчатки глаза (и другие заболевания глаз), митохондриопатии (например, наследственную оптическую нейропатию Лебера (LHON), синдром Лея и подострую склерозирующую энцефалопатию), миопатии (например, плече-лопаточно-лицевую миопатию (FSHD) и кардиомиопатии), заболевания солидных органов (например, головного мозга, печени, почек, сердца); и т.п. В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы, описанные в данном документе, могут быть благоприятным образом использованы в лечении индивидуумов с метаболическими нарушениями (например, недостаточностью орнитинтранскарбамилазы).
[00622] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может применяться для лечения, облегчения и/или предотвращения заболевания или расстройства, вызываемого мутацией в гене или генном продукте. Типичные примеры заболеваний или расстройств, лечение которых может проводиться с применением зкДНК-векторов, включают, без ограничений, метаболические заболевания или расстройства (например, болезнь Фабри, болезнь Гоше, фенилкетонурию (ФКУ), гликогеновую болезнь); болезни или расстройства цикла мочевины (например, недостаточность орнитинтранскарбамилазы (OTC)); болезни или расстройства лизосомного накопления (например, метахроматическую лейкодистрофию (МЛД), мукополисахаридоз типа II (MPSII; синдром Гунтера)); заболевания или расстройства печени (например, прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз (ПСВХ); заболевания или расстройства крови (например, гемофилию (A и B), талассемию и анемию); раковые заболевания и опухоли, а также генетические заболевания или расстройства (например, муковисцидоз).
[00623] В еще одном аспекте зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может применяться для доставки гетерологичной последовательности нуклеотидов в ситуациях, когда желательна регуляция уровня трансгенной экспрессии (например, трансгенов, кодирующих гормоны или факторы роста, как описано в данном документе).
[00624] Соответственно, в некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, описанный в данном документе, может применяться для коррекции аномального уровня и/или функции генного продукта (например, отсутствия или дефекта белка), который приводит к заболеванию или расстройству. Указанный зкДНК-вектор может продуцировать функциональный белок и/или модифицировать уровни указанного белка для облегчения или снижения симптомов, являющихся результатом конкретного заболевания или расстройства, или обеспечивать преимущества при конкретном заболевании или расстройстве, вызываемом отсутствием или дефектом белка. Например, лечение недостаточности ОТК может быть осуществлено путем продуцирования функционального фермента ОТК; лечение гемофилии A и B может быть осуществлено путем модификации уровней фактора VIII, фактора IX и фактора X; лечение фенилкетонурии может быть осуществлено путем модификации уровней фермента фенилаланингидроксилазы; лечение болезни Фабри или болезни Гоше может быть осуществлено путем продуцирования функциональной альфа-галактозидазы или бета-глюкоцереброзидазы, соответственно; лечение МЛД или MPSII может быть осуществлено путем продуцирования функциональной арилсульфатазы A или идуронат-2-сульфатазы, соответственно; лечение муковисцедоза может быть осуществлено путем продуцирования функционального регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе; лечение гликогеновой болезни может быть осуществлено путем восстановления функции функционального фермента глюкозо-6-фосфатазы; и лечение ПСВХ может быть осуществлено путем продуцирования функциональных генов ATP8B1, ABCB11, ABCB4 или TJP2.
[00625] В альтернативных вариантах реализации зкДНК-векторы, описанные в данном документе, могут применяться для обеспечения клетки антисмысловой нуклеиновой кислотой in vitro или in vivo. Например, если трансген представляет собой молекулу РНК-интерференции (RNAi), экспрессия антисмысловой нуклеиновой кислоты или РНК-интерференции в целевой клетке снижает уровень экспрессии конкретного белка указанной клеткой. Соответственно, трансгены, представляющие собой молекулы РНК-интерференции или антисмысловые нуклеиновые кислоты, могут вводиться для снижения экспрессии конкретного белка у нуждающегося в этом субъекта. Антисмысловые нуклеиновые кислоты также можно вводить в клетки in vitro для регулирования физиологии клеток, например, для оптимизации систем культивирования клеток или тканей.
[00626] В некоторых вариантах реализации типичные примеры трансгенов, кодируемых зкДНК-вектором, включают, без ограничений: X, лизосомальные ферменты (например, гексозаминидазу A, ассоциированную с болезнью Тея-Сакса, или идуронатсульфатазу, ассоциированную с синдромом Гунтера/MPS II), эритропоэтин, ангиостатин, эндостатин, супероксиддисмутазу, глобин, лептин, каталазу, тирозингидроксилазу, а также цитокины (например, интерферон, β-интерферон, интерферон-γ, интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин 12, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, лимфотоксин и т.п.), пептидные факторы роста и гормоны (например, соматотропин, инсулин, инсулиноподобные факторы роста 1 и 2, тромбоцитарный фактор роста (ТРФ), эпидермальный фактор роста (ЭФР), фактор роста фибробластов (ФРФ), фактор роста нервов (ФРН), нейротрофический фактор-3 и 4, нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), глиальный фактор роста (GDNF), трансформирующие факторы роста α и β; и т.п.), рецепторы (например, рецептор фактора некроза опухоли). В некоторых примерных вариантах реализации указанный трансген кодирует моноклональное антитело, специфическое в отношении одной или более требуемых мишеней. В некоторых примерных вариантах реализации зкДНК-вектор кодирует более одного трансгена. В некоторых примерных вариантах реализации указанный трансген кодирует слитый белок, содержащий два разных представляющих интерес полипептида. В некоторых вариантах реализации указанный трансген кодирует антитело, в том числе полноразмерное антитело или фрагмент антитела, как определено в данном документе. В некоторых вариантах реализации указанное антитело представляет собой последовательность антигенсвязывающего домена или вариабельного домена иммуноглобулина, как определено в данном документе. Другие иллюстративные примеры трансгенных последовательностей кодируют продукты суицидных генов (тимидинкиназу, цитозиндезаминазу, дифтерийный токсин, цитохром P450, дезоксицитидинкиназу и фактор некроза опухоли), белки, придающие устойчивость к лекарственному средству, применяемому в противораковой терапии, и продукты генов-супрессоров опухолей.
[00627] В репрезентативном варианте реализации экспрессируемый зкДНК-вектором трансген может применяться для лечения мышечной дистрофии у нуждающегося в этом субъекта, при этом указанный способ включает: введение эффективного для лечения, облегчения или предотвращения количества зкДНК-вектора, описанного в данном документе, причем указанный зкДНК-вектор содержит гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую дистрофин, минидистрофин, микродистрофин, пропептид миостатина, фоллистатин, растворимый рецептор активина II типа, ИПФР-1, противовоспалительные полипептиды, такие как доминантный мутант I-каппа-B, саркоспан, утрофин, микродистрофин, ламинин-α2, α-саркогликан, β-саркогликан, γ-саркогликан, δ-саркогликан, ИПФР-1, антитело или фрагмент антитела к миостатину или пропептиду миостатина, и/или RNAi к миостатину. В конкретных вариантах реализации указанный зкДНК-вектор может быть введен в скелетную, диафрагмальную и/или сердечную мышцу, как описано в других разделах данного документа.
[00628] В некоторых вариантах реализации указанный зкДНК-вектор может применяться для доставки трансгена в скелетную, сердечную или диафрагмальную мышцу, для продуцирования полипептида (например, фермента) или функциональной РНК (например, РНК-интерференции, микроРНК, антисмысловой РНК), которая в норме циркулирует в крови, или для системной доставки в другие ткани, для лечения, облегчения и/или предотвращения расстройства (например, метаболического расстройства, такого как диабет (например, инсулина), гемофилии (например, VIII), мукополисахаридозного расстройства (например, синдрома Слая, синдрома Гурлер, синдрома Шейе, синдрома Гурлер-Шейе, синдрома Гунтера, синдрома Санфилиппо A, B, C, D, синдрома Моркио, синдрома Марото-Лами и т.п.) или расстройства лизосомального накопления (такого как болезнь Гоше [глюкоцереброзидаза], болезнь Помпе [лизосомальная кислая альфа-глюкозидаза] или болезнь Фабри [альфа-галактозидаза A]) или расстройства накопления гликогена (такие как болезнь Помпе [лизосомальная кислая альфа-глюкозидаза]). Другие подходящие белки для лечения, облегчения и/или предотвращения метаболических расстройств описаны выше.
[00629] В других вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может применяться для доставки трансгена в способе лечения, облегчения и/или предотвращения метаболического нарушения у нуждающегося в этом субъекта. Иллюстративные примеры метаболических нарушений и трансгенов, кодирующих полипептиды, описаны в данном документе. Необязательно, указанный полипептид секретируется (например, полипептид, который представляет собой секретируемый полипептид в его естественном состоянии или сконструированный для секреции, например, за счет образования функциональной связи с секреторной сигнальной последовательностью, как известно в данной области техники).
[00630] Другой аспект данного изобретения относится к способу лечения, облегчения и/или предотвращения врожденной сердечной недостаточности или ЗПА у нуждающегося в этом субъекта, при этом указанный способ включает введение зкДНК-вектора, как описано в данном документе, субъекту-млекопитающему, причем указанный зкДНК-вектор содержит трансген, кодирующий, например, Ca2+-АТФазу саркоплазматического эндоретикулума (SERCA2a), ангиогенный фактор, ингибитор фосфатазы I (I-1), RNAi к фосфоламбану; фосфоламбановую ингибиторную или доминантно-негативную молекулу, такую как фосфоламбан S16E, белок с цинковыми пальцами, который регулирует ген фосфоламбана, β2- адренергический рецептор, бета-2-адренергическую рецепторную киназу (BARK), PI3-киназу, кальсаркан, ингибитор бета-адренергической рецепторной киназы (βARKct), ингибитор 1 протеинфосфатазы 1, S100A1, парвальбумин, аденилилциклазу типа 6, молекулу, которая осуществляет нокдаун сопряженной с G-белком рецепторной киназы типа 2, такую как усеченный конститутивно активный βARKct, Pim-1, PGC-1α, SOD-1, SOD-2, EC-SOD, калликреин, HIF, тимозин-β4, mir-1, mir-133, mir-206 и/или mir-208.
[00631] Описанные в данном документе зкДНК-векторы могут быть введены в легкие субъекта любым подходящим способом, необязательно, путем введения аэрозольной суспензии вдыхаемых частиц, содержащих зкДНК-векторы, которые субъект вдыхает. Указанные вдыхаемые частицы могут быть жидкими или твердыми. Аэрозоли из жидких частиц, содержащих зкДНК-векторы, могут быть получены любым подходящим способом, например, с помощью пневматического аэрозольного небулайзера или ультразвукового небулайзера, как известно специалистам в данной области техники. См., например, патент США №4501729. Аэрозоли из твердых частиц, содержащих зкДНК-векторы, могут сходным образом быть получены с помощью любого генератора медикаментозных аэрозолей из твердых частиц, с применением методик, известных в области фармацевтики.
[00632] В некоторых вариантах реализации указанные зкДНК-векторы могут быть введены в ткани ЦНС (например, головной мозг, глаз). В конкретных вариантах реализации зкДНК-векторы, как описано в данном документе, можно вводить для лечения, облегчения или предотвращения заболеваний ЦНС, в том числе генетических нарушений, нейродегенеративных нарушений, нарушений психики и опухолей. Иллюстративные примеры заболеваний ЦНС включают, без ограничений, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Гентингтона, болезнь Канавана, болезнь Лея, болезнь Рефсума, синдром Туретта, первичный боковой склероз, амиотрофический боковой склероз, прогрессирующую мышечную атрофию, болезнь Пика, мышечную дистрофию, рассеянный склероз, тяжелую миастению, болезнь Бинсвангера, травму в результате повреждения спинного мозга или головы, болезнь Тея-Сакса, болезнь Леша-Нихена, эпилепсию, церебральные инфаркты, нарушения психики, в том числе расстройства настроения (например, депрессию, биполярное аффективное расстройство, устойчивое аффективное расстройство, вторичное расстройство настроения), шизофрению, лекарственную или наркотическую зависимость (например, алкоголизм и зависимости от других веществ), неврозы (например, тревожность, обсессивное расстройство, соматоформное расстройство, диссоциативное расстройство, состояние горя, послеродовую депрессию), психоз (например, галлюцинации и бред), деменцию, паранойю, связанные с дефицитом внимания нарушения, психосексуальные нарушения, нарушения сна, связанные с болью нарушения, связанные с питанием или массой тела нарушения (например, ожирение, кахексию, нервную анорексию и булимию), рак и опухоли ЦНС (например, опухоли гипофиза).
[00633] Глазные расстройства, которые можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов по изобретению, включают офтальмологические расстройства, затрагивающие сетчатку, задний путь и зрительный нерв (например, пигментный ретинит, диабетическую ретинопатию и другие дегенеративные заболевания сетчатки глаза, увеит, возрастную макулярную дегенерацию, глаукому). Многие офтальмологические заболевания и расстройства ассоциированы с одним или несколькими из трех типов признаков: (1) ангиогенез, (2) воспаление и (3) дегенерация. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, можно применять для доставки антиангиогенных факторов; противовоспалительных факторов; факторов, замедляющих дегенерацию клеток, способствующих сохранению клеток или способствующих росту клеток, и комбинаций вышеперечисленного. Например, диабетическая ретинопатия характеризуется ангиогенезом. Диабетическую ретинопатию можно лечить путем доставки одного или нескольких антиангиогенных факторов либо интраокулярно (например, в стекловидное тело), либо периокулярно (например, в субтеноново пространство). Совместно могут быть доставлены один или более нейротрофических факторов, интраокулярно (например, интравитреально) либо периокулярно. Дополнительные заболевания глаз, которые можно лечить или предотвращать с применением зкДНК-векторов по данному изобретению, включают географическую атрофию, сосудистую или «влажную» макулодистрофию, болезнь Штаргардта, врожденный амавроз Лебера (LCA), синдром Ушера, эластическую псевдоксантому (PXE), Х-сцепленный пигментный ретинит (XLRP), Х-сцепленное расслоение сетчатки (XLRS), хороидеремию, врожденную нейропатию зрительного нерва Лебера (LHON), ахроматопсию, палочко-колбочковую дистрофию, эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, диабетический макулярный отек; рак и опухоли глаз.
[00634] В некоторых вариантах реализации воспалительные глазные заболевания или расстройства (например, увеит) можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью зкДНК-векторов по данному изобретению. Один или более противовоспалительных факторов могут быть экспрессированы за счет интраокулярного введения (например, в камеру стекловидного тела или переднюю камеру) зкДНК-вектора, как описано в данном документе. В других вариантах реализации заболевания глаз или расстройства, характеризующиеся дегенерацией сетчатки (например, пигментный ретинит), можно лечить, облегчать или предотвращать с помощью кДНК-векторов по данному изобретению. Для лечения таких заболеваний, связанных с дегенерацией сетчатки, можно использовать внутриглазное (например, витреальное введение) зкДНК-вектора, описанного в данном документе, кодирующего один или несколько нейротрофических факторов. В некоторых вариантах реализации заболевания или расстройства, которые включают как ангиогенез, так и дегенерацию сетчатки (например, возрастную макулярную дегенерацию), можно лечить с помощью зкДНК-векторов по изобретению. Лечение возрастной макулярной дегенерации может осуществляться путем введения зкДНК-вектора, как описано в данном документе, кодирующего один или несколько нейротрофических факторов, интраокулярно (например, в стекловидное тело), и/или кодирующего один или несколько антиангиогенных факторов, интраокулярно или периокулярно (например, в субтеноново пространство). Глаукома характеризуется повышенным глазным давлением и утратой ганглиозных клеток сетчатки. Лечение глаукомы включает введение одного или нескольких нейропротекторных агентов, которые защищают клетки от эксайтотоксичного повреждения, с использованием зкДНК-вектора, как описано в данном документе. Соответственно, такие агенты включают антагонисты N-метил-D-аспартата (NMDA), цитокины и нейротрофические факторы, которые могут быть доставлены интраокулярно, необязательно, интравитреально, с применением зкДНК-вектора, как описано в данном документе.
[00635] В других вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, можно использовать для лечения судорог, например, для снижения возникновения, частоты или тяжести судорог. Эффективность терапевтического лечения судорог может быть оценена на основании поведенческих признаков (например, дрожь, глазные или ротовые тики) и/или электрографическими способами (большинство судорог характеризуются отличительными электрографическими аномалиями). Таким образом, зкДНК-вектор, описанный в данном документе, также может быть использован для лечения эпилепсии, для которой характерны множественные припадки в различные моменты времени. В одном репрезентативном варианте реализации соматостатин (или его активный фрагмент) вводят в мозг с использованием зкДНК-вектора, как описано в данном документе, для лечения опухоли гипофиза. В соответствии с этим вариантом реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, кодирующий соматостатин (или его активный фрагмент), вводят в гипофиз путем микроинфузии. Аналогично, такое лечение может быть использовано для лечения акромегалии (аномальной секреции гормона роста гипофизом). Последовательность нуклеиновой кислоты (например, GenBank, № доступа J00306) и аминокислотная последовательность (например, GenBank, № доступа P01166; содержит процессированные активные пептиды соматостатин-28 и соматостатин-14) соматостатинов, известны в данной области техники. В конкретных вариантах реализации зкДНК-вектор может кодировать трансген, который содержит секреторный сигнал, как описано в патенте США № 7071172.
[00636] Другой аспект изобретения относится к применению зкДНК-вектора, как описано в данном документе, для получения антисмысловой РНК, РНКи (RNAi) или другой функциональной РНК (например, рибозима) для системной доставки субъекту in vivo. Соответственно, в некоторых вариантах реализации указанный зкДНК-вектор может содержать трансген, который кодирует антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим (например, как описано в патенте США №5877022), РНК, которые влияют на опосредованный сплайсосомой транс-сплайсинг (см. Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17:246; патент США №6013487; патент США №6083702), интерферирующую РНК (RNAi), опосредующую сайленсинг генов (см. Sharp et al., (2000) Science 287:2431), или другие нетранслируемые РНК, такие как направляющие РНК (Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; патент США № 5869248, выданный на имя Yuan et al.), и т.п.
[00637] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может дополнительно содержать трансген, который кодирует репортерный полипептид (например, фермент, такой как зеленый флуоресцентный белок или щелочная фосфатаза). В некоторых вариантах реализации трансген, который кодирует репортерный белок, пригодный для экспериментальных или диагностических целей, выбирают из любого из: β-лактамазы, β-галактозидазы (LacZ), щелочной фосфатазы, тимидинкиназы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT), люциферазы и других, хорошо известных в данной области техники. В некоторых аспектах зкДНК-векторы, содержащие трансген, кодирующий репортерный полипептид, могут использоваться для диагностических целей или в качестве маркеров активности зкДНК-вектора у субъекта, которому они вводятся.
[00638] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может содержать трансген или гетерологичную нуклеотидную последовательность, которая обладает гомологией в отношении локуса на хромосоме хозяина и рекомбинируется с ним. Указанный подход может быть использован для коррекции генетического дефекта в клетке-хозяине.
[00639] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может содержать трансген, который можно использовать для экспрессии иммуногенного полипептида у субъекта, например, для вакцинации. Трансген может кодировать любой представляющий интерес иммуноген, известный в данной области, включая, без ограничений, иммуногены вируса иммунодефицита человека, вируса гриппа, белков gag, опухолевых антигенов, раковых антигенов, бактериальных антигенов, вирусных антигенов и т.п.
[00640] D. Тестирование на успешное редактирование генов с использованием зкДНК-вектора для редактирования генов
[00641] Анализы, хорошо известные в данной области техники, могут использоваться для проверки эффективности редактирования генов с помощью зкДНК в моделях как in vitro, так и in vivo. Специалист в данной области может оценить нокин или нокаут желаемого трансгена с помощью зкДНК путем измерения уровней мРНК и белка желаемого трансгена (например, ПЦР с обратной транскрипцией, вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ (ИФА)). Изменения нуклеиновой кислоты с помощью зкДНК (например, точечные мутации или делеция областей ДНК) можно оценить методом глубокого секвенирования геномной ДНК-мишени. В одном варианте реализации зкДНК содержит репортерный белок, который можно использовать для оценки экспрессии желаемого трансгена, например, путем исследования экспрессии репортерного белка с помощью флуоресцентной микроскопии или люминесцентного планшет-ридера. Для применений in vivo анализы функции белка можно использовать для тестирования функциональности данного гена и/или генного продукта, чтобы определить, успешно ли произошло редактирование гена. Например, предусматривается, что точечная мутация в гене трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (МВТР (CFTR)), ингибирующая (inhibits) способность МВТР перемещать анионы (например, Cl-) по анионному каналу, может быть скорректирована с помощью способности зкДНК редактировать гены. После введения зкДНК специалист в данной области может оценить способность анионов перемещаться по анионному каналу, чтобы определить, была ли исправлена точечная мутация МВТР. Специалист сможет определить лучший тест для измерения функциональности белка in vitro или in vivo.
[00642] В настоящем изобретении предусматривается, что эффекты редактирования генов в клетке или у субъекте могут продолжаться на протяжении по меньшей мере 1 месяца, по меньшей мере 2 месяцев, по меньшей мере 3 месяца, по меньшей мере 4 месяцев, по меньшей мере 5 месяцев, по меньшей мере шесть месяцев, по меньшей мере 10 месяцев, по меньшей мере 12 месяцев, по меньшей мере 18 месяцев, по меньшей мере 2 лет, по меньшей мере 5 лет, по меньшей мере 10 лет, по меньшей мере 20 лет, или могут быть постоянными.
[00643] В некоторых вариантах реализации трансген в экспрессионной кассете, экспрессионном конструкте или зкДНК-векторе, описанном в данном документе, может быть кодон-оптимизирован для клетки-хозяина. Используемый в данном документе термин «оптимизированный по кодонам» или «оптимизация по кодонам» относится к процессу модификации последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в клетках представляющих интерес позвоночных, например, мыши или человека (например, гуманизированных), путем замены по меньшей мере одного, более чем одного или значительного числа кодонов нативной последовательности (например, прокариотической последовательности) на кодоны, которые чаще или наиболее часто используются в генах данного позвоночного. Различные виды проявляют особую склонность к определенным кодонам конкретной аминокислоты. Как правило, оптимизация кодонов не изменяет аминокислотную последовательность исходного транслированного белка. Оптимизированные кодоны могут быть определены с использованием, например, платформы для оптимизации кодонов и пользовательского синтеза генов Gene Forge® фирмы Aptagen (Aptagen, Inc.) или другой общедоступной базы данных.
XIII. Введение
[00644] В конкретных вариантах реализации может быть использовано более одного введения (например, два, три, четыре или более введений) для достижения желаемого уровня экспрессии гена на протяжении периодов времени различной продолжительности, например, ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно и т.д.
[00645] Примеры способов введения зкДНК-вектора, раскрытого в данном документе, включают пероральное, ректальное, трансмукозальное, интраназальное, ингаляционное (например, в аэрозоле), буккальное (например, сублингвальное), вагинальное, интратекальное, внутриглазное, чрескожное, интраэндотелиальное введение, введение in utero (или in ovo), парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрикожное, интракраниальное, внутримышечное [в том числе введение в скелетную, диафрагмальную и/или сердечную мышцу], интраплевральное, интрацеребральное и внутрисуставное), местное (например, на поверхности кожи и слизистых оболочек, в том числе поверхности дыхательных путей, и чрескожное введение), внутрилимфатическое введение и т.п., а также прямую инъекцию в ткань или орган (например, в печень, глаз, скелетные мышцы, сердечную мышцу, диафрагмальную мышцу или головной мозг).
[00646] Может осуществляться введение указанного зкДНК-вектора в любой сайт в организме субъекта, включая, без ограничений, сайт, выбранный из группы, состоящей из головного мозга, скелетных мышц, гладких мышц, сердца, диафрагмы, эпителия дыхательных путей, печени, почек, селезенки, поджелудочной железы, кожи и глаз. Может также осуществляться введение указанного зкДНК-вектора в опухоль (например, внутрь опухоли или лимфатического узла или возле них). Наиболее подходящий путь в любом конкретном случае будет зависеть от природы и тяжести состояния, лечение, облегчение и/или предотвращение которого проводится, и от природы конкретного используемого зкДНК-вектора. Кроме того, зкДНК позволяет вводить более одного трансгена в одном векторе или в нескольких зкДНК-векторах (например, коктейль зкДНК).
[00647] Введение зкДНК-вектора, описанного в данном документе, в скелетные мышцы в соответствии с данным изобретением включает, без ограничений, введение в скелетные мышцы в конечностях (например, в плече, предплечье, бедре и/или голени), спине, шее, голове (например, язык), грудной клетки, брюшной полости, тазу/промежности и/или пальцах. зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может быть доставлен в скелетные мышцы путем внутривенного введения, внутриартериального введения, внутрибрюшинного введения, перфузии конечности, (необязательно, перфузии изолированной конечности - ноги и/или руки; см., например, Arruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464), и/или прямой внутримышечной инъекции. В конкретных вариантах реализации зкДНК-вектор, описанный в данном документе, вводят в конечность (руку и/или ногу) субъекта (например, субъекта с мышечной дистрофией, такой как мышечная дистрофия Дюшенна (DMD)) путем перфузии конечности, необязательно, перфузии изолированной конечности (например, путем внутривенного или внутрисуставного введения). В определенных вариантах реализации зкДНК-вектор, как описано в данном документе, можно вводить без использования «гидродинамических» методов.
[00648] Введение зкДНК-вектора, как описано в данном документе, в сердечную мышцу включает введение в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек и/или перегородку. зкДНК-вектор, как описано в данном документе, может быть доставлен в сердечную мышцу путем внутривенного введения, внутриартериального введения, такого как интрааортальное введение, прямой инъекции в сердце (например, в левое предсердие, правое предсердие, левый желудочек, правый желудочек) и/или перфузии коронарной артерии. Введение в диафрагмальную мышцу может быть осуществлено любым подходящим способом, в том числе путем внутривенного введения, внутриартериального введения и/или внутрибрюшинного введения. Введение в гладкую мышцу может осуществляться любым подходящим способом, включая внутривенное введение, внутриартериальное введение и/или внутрибрюшинное введение. В одном варианте реализации введение может быть осуществлено введение в эндотелиальные клетки, присутствующие в гладких мышцах, возле и/или на них.
[00649] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор по данному изобретению вводят в скелетные мышцы, диафрагмальную мышцу и/или сердечную мышцу (например, для лечения, облегчения и/или предотвращения мышечной дистрофии или заболевания сердца (например, ЗПА или застойной сердечной недостаточности).
А. Лечение ex vivo
[00650] В некоторых вариантах реализации клетки извлекают из субъекта, вводят в них зкДНК-вектор и возвращают в организм субъекта. Способы извлечения клеток из организма субъекта для лечения ex vivo, с последующим введением обратно в организм субъекта, известны в данной области техники (см., например, патент США № 5399346; описание которого в полном объеме включено в данный документ). Альтернативно, зкДНК-вектор вводят в клетки от другого субъекта, в культивируемые клетки или в клетки из любого другого подходящего источника, и указанные клетки вводят нуждающемуся в этом субъекту.
[00651] Клетки, трансдуцированные зкДНК-вектором, предпочтительно вводят субъекту в «терапевтически эффективном количестве» в комбинации с фармацевтическим носителем. Специалистам в данной области техники будет понятно, что терапевтические эффекты не обязательно должны быть полными или обеспечивать излечение, при условии, что субъект получает некоторую пользу.
[00652] В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор может кодировать трансген (иногда называемый гетерологичной нуклеотидной последовательностью), который представляет собой любой полипептид, продуцирование которого желательно в клетке in vitro, ex vivo или in vivo. Например, в отличие от использования зкДНК-векторов в способе лечения, как описано в данном документе, в некоторых вариантах реализации указанные зкДНК-векторы могут быть введены в культивированные клетки и экспрессируемый генный продукт выделен из них, например, для получения антигенов или вакцин.
[00653] зкДНК-векторы могут применяться как в ветеринарии, так и в медицине. Подходящие субъекты для способов доставки генов ex vivo, как описано выше, включают как птиц (например, кур, уток, гусей, перепелов, индеек и фазанов), так и млекопитающих (например, людей, бычьих, овец, козьих, лошадиных, кошачьих, собчьих и зайцеобразных), причем млекопитающие являются предпочтительными. Люди являются наиболее предпочтительными субъектами. Люди включают новорожденных, младенцев, подростков и взрослых.
[00654] Один аспект технологии, описанной в данном документе, относится к способу доставки трансгена в клетку. Как правило, в способах in vitro указанный зкДНК-вектор может быть введен в клетку с применением способов, раскрытых в данном документе, а также других способов, известных в данной области техники. Раскрытые в данном документе зкДНК-векторы предпочтительно вводят в клетку в биологически эффективном количестве. Если зкДНК-вектор вводят в клетку in vivo (например, субъекту), биологически эффективное количество указанного зкДНК-вектора представляет собой количество, достаточное для обеспечения трансдукции и экспрессии указанного трансгена в клетке-мишени.
Б. Диапазоны доз
[00655] Анализы in vivo и/или in vitro необязательно можно использовать для определения оптимальных диапазонов дозировки при применении. Точная доза для использования в композиции будет также зависеть от пути введения и серьезности состояния и должна определяться на основании решения специалиста в данной области техники и с учетом обстоятельств каждого субъекта. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных из тест-систем in vitro или на животных моделях.
[00656] зкДНК-вектор вводят в достаточных количествах для трансфекции клеток требуемой ткани и обеспечения достаточных уровней переноса генов и экспрессии без чрезмерных нежелательных явлений. Обычные и фармацевтически приемлемые пути введения включают, без ограничений, описанные выше в разделе «Введение», такие как прямая доставка в выбранный орган (например, интрапортальная доставка в печень), пероральная доставка, ингаляция (в том числе интраназальная и внутритрахеальная), интраокулярная, внутривенная, внутримышечная, подкожная, внутрикожная, внутриопухолевая доставка; и другие пути парентерального введения. Пути введения могут быть скомбинированы, если это желательно.
[00657] Доза количества зкДНК-вектора, необходимого для достижения определенного «терапевтического эффекта», будет варьироваться в зависимости от нескольких факторов, включая, без ограничений: путь введения нуклеиновой кислоты, уровень экспрессии гена или РНК, необходимый для достижения терапевтического эффекта, конкретное заболевание или расстройство, лечение которого проводят, и стабильность гена (генов), продукта (продуктов) РНК или итогового экспрессируемого белка (белков). Специалист в данной области может легко определить диапазон доз зкДНК-вектора для лечения пациента, имеющего конкретное заболевание или расстройство, на основе вышеупомянутых факторов, а также других факторов, хорошо известных в данной области техники.
[00658] Режим дозирования может быть скорректирован для обеспечения оптимального терапевтического ответа. Например, олигонуклеотид может быть введен неоднократно, например, ежедневно может вводиться несколько доз, или доза может быть пропорционально снижена с учетом диктуемой терапевтической ситуацией необходимости. Специалист в данной области техники легко сможет определить подходящие дозы и схемы введения рассматриваемых олигонуклеотидов, как для введения в клетки, так и для введения субъектам.
[00659] «Терапевтически эффективная доза» будет находиться в относительно широком диапазоне, который может быть определен с помощью клинических испытаний, и будет зависеть от конкретного применения (нервные клетки потребуют очень небольших количеств, в то время как системные инъекции потребуют значительных количеств). Например, для прямой инъекции in vivo в скелетную или сердечную мышцу человека субъект терапевтически величина терапевтически эффективной дозы будет составлять от примерно 1 мкг до 100 г зкДНК-вектора. Если для доставки зкДНК-вектора используются экзосомы или микрочастицы, то терапевтически эффективная доза может быть определена экспериментально, однако предположительно будет доставлено от 1 мкг до примерно 100 г вектора. Кроме того, терапевтически эффективная доза представляет собой количество зкДНК-вектора, которое экспрессирует достаточное количество молекулы редактирования генов для воздействия на редактирование гена-мишени, приводящего к уменьшению одного или нескольких симптомов заболевания, но не приводящего к редактированию нецелевых генов.
[00660] Состав фармацевтически приемлемых эксципиентов и растворов носителей хорошо известен специалистам в данной области, как и разработка подходящих режимов дозирования и лечения для применения конкретных композиций, описанных в данном документе, в различных схемах лечения.
[00661] Для трансфекции in vitro эффективное количество зкДНК-вектора, доставляемого в клетки (1×106 клеток), будет составлять порядка 0,1-100 мкг зкДНК-вектора, предпочтительно, от 1 до 20 мкг, и более предпочтительно, от 1 до 15 мкг или от 8 до 10 мкг. Для зкДНК-векторов большего размера необходимы более высокие дозы. Если используются экзосомы или микрочастицы, эффективная in vitro доза может быть определена экспериментально, однако она должна обеспечивать доставку, в общем, такого же количества зкДНК-вектора.
[00662] Лечение может включать введение разовой дозы или нескольких доз. В некоторых вариантах реализации субъекту может быть введено более одной дозы; фактически, при необходимости может быть введено несколько доз, поскольку зкДНК-вектор не вызывает у хозяина иммунного ответа против капсида ввиду отсутствия вирусного капсида. Таким образом, специалист в данной области может легко определить подходящее количество доз. Количество вводимых доз может составлять, например, порядка 1-100, предпочтительно, 2-20 доз.
[00663] Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, укажем, что отсутствие типичного противовирусного иммунного ответа, вызываемого введением зкДНК-вектора, как описано в данном изобретении (т.е. отсутствие капсидных компонентов), позволяет неоднократно вводить зкДНК-вектор хозяину. Согласно некоторым вариантам реализации, число введений гетерологичной нуклеиновой кислоты субъекту составляет от 2 до 10 раз (например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз). В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор доставляется субъекту более 10 раз.
[00664] В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в календарный день (например, за 24-часовой период). В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза за 2, 3, 4, 5, 6 или 7 календарных дней. В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза в календарную неделю (например, за 7 календарных дней). В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в две недели (например, один раз в течение двух календарных недель). В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза в календарный месяц (например, один раз за 30 календарных дней). В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не чаще одного раза в шесть календарных месяцев. В некоторых вариантах реализации дозу зкДНК-вектора вводят субъекту не более одного раза в течение календарного года (например, за 365 дней, или за 366 дней в високосном году).
C. Единичные лекарственные формы
[00665] В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции могут быть удобно представлены в виде единичной лекарственной формы. Единичная лекарственная форма обычно будет адаптирована к одному или нескольким конкретным путям введения фармацевтической композиции. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения путем ингаляции. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью испарителя. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью небулайзера. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для введения с помощью генератора аэрозоля. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для перорального введения, для буккального введения или для сублингвального введения. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для внутривенного, внутримышечного или подкожного введения. В некоторых вариантах реализации единичная лекарственная форма адаптирована для интратекального или интрацеребровентрикулярного введения. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция составлена для местного применения. Количество активного ингредиента, которое может быть скомбинировано с материалом носителя для получения единичной лекарственной формы, обычно представлено таким количеством указанного соединения, которое обеспечивает терапевтический эффект.
XIV. Различные варианты применения
[00666] Композиции и зкДНК-векторы, представленные в данном документе, можно использовать для доставки молекулы для редактирования генов для различных целей, как описано выше. В некоторых вариантах реализации молекула для редактирования гена, нацелена на ген-мишень, например, белок или функциональную РНК, которые должны быть отредактированы для исследовательских целей, например, для создания соматической модели трансгенного животного, содержащей одну или несколько мутаций или исправленную последовательность гена, например, для изучения функции гена-мишени. В другом примере молекула для редактирования генов используется для редактирования генов-мишеней, которые кодируют белок или функциональную РНК для создания животной модели заболевания.
[00667] В некоторых вариантах реализации ген-мишень молекулы для редактирования генов кодирует один или несколько пептидов, полипептидов или белков, которые полезны для лечения, облегчения или предотвращения болезненных состояний у субъекта-млекопитающего. Молекула для редактирования генов может быть перенесена (например, экспрессирована в) посредством зкДНК-вектора пациенту в количестве, достаточном для лечения заболевания, связанного с аномальной последовательностью генов, что может привести к любому одному или нескольким из следующего: снижение экспрессии, отсутствие экспрессии, или нарушение функции гена-мишени.
[00668] В некоторых вариантах реализации зкДНК-векторы предусматриваются для использования в способах диагностики и скрининга, в результате чего молекула для редактирования генов транзиентно или стабильно экспрессируется в системе клеточной культуры или, альтернативно, в модели трансгенного животного.
[00669] Другой аспект технологии, описанной в данном документе, обеспечивает способ трансдукции популяции клеток млекопитающих. В общем и широком смысле способ включает по меньшей мере стадию введения в одну или несколько клеток популяции композицию, которая содержит эффективное количество одной или нескольких раскрытых в данном документе кДНК.
[00670] Кроме того, данное изобретение предлагает композиции, а также терапевтические и/или диагностические наборы, которые включают один или несколько раскрытых зкДНК-векторов или композиций зкДНК, составленных с использованием одного или нескольких дополнительных ингредиентов, или подготовленных вместе с одной или несколькими инструкциями по их применению.
[00671] Клетка для введения зкДНК-вектора, как раскрыто в данном документе, может быть любого типа, включая, без ограничений, нервные клетки (включая клетки периферической и центральной нервной системы, в частности, клетки головного мозга), клетки легкого, клетки сетчатки, эпителиальные клетки. (например, кишечные и респираторные эпителиальные клетки), мышечные клетки, дендритные клетки, клетки поджелудочной железы (включая островковые клетки), клетки печени, клетки миокарда, костные клетки (например, стволовые клетки костного мозга), гемопоэтические стволовые клетки, клетки селезенки, кератиноциты, фибробласты, эндотелиальные клетки, клетки предстательной железы, зародышевые клетки и т.п. Альтернативно, клетка может быть любой клеткой-предшественником. В качестве дополнительной альтернативы, клетка может быть стволовой клеткой (например, нервной стволовой клеткой, стволовой клеткой печени). В качестве еще одной альтернативы, клетка может быть раковой или опухолевой клеткой. Кроме того, указанные клетки могут происходить из любого вида, как указано выше.
[00672] В некоторых вариантах реализации данная заявка может быть определена любым из следующих пунктов:
1. зкДНК-вектор, содержащий: (i) по меньшей мере один измененный инвертированный концевой повтор (ITR) AAV; и (ii) первую нуклеотидную последовательность, содержащую 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо, причем по меньшей мере указанная донорная последовательность обладает функциональностью редактирования генов.
2. зкДНК-вектор по п. 1, в котором первая нуклеотидная последовательность дополнительно содержит вторую нуклеотидную последовательность перед первой нуклеотидной последовательностью, при этом вторая нуклеотидная последовательность содержит регуляторную последовательность гена и нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу, причем последовательность регуляторного гена функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу.
3. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-2, в котором нуклеаза представляет собой специфичную к последовательности нуклеазу.
4. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-3, в котором последовательность-специфическая нуклеаза представляет собой РНК-направляемую нуклеазу, нуклеазу цинкового пальца (ZFN) или эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN).
5. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-4, в котором РНК-направляемая нуклеаза представляет собой Cas или Cas9.
6. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-5, в котором регуляторная последовательность содержит энхансер и промотор, в котором вторая последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность интрона перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу, причем интрон содержит сайт расщепления нуклеазой, и промотор функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу.
7. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-6, дополнительно содержащий третью нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую направляющую последовательность и/или последовательность РНК-активатора.
8. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-7, в котором третья нуклеотидная последовательность дополнительно содержит промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей направляющую последовательность и/или последовательность РНК-активатора.
9. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-8, в котором сайт поли(А) расположен перед и вблизи к указанному гомологичному плечу.
10. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-9, в котором донорная последовательность является чужеродной по отношению к 5'-гомологичному плечу или 3'-гомологичному плечу.
11. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-10, в котором 5'-гомологичное плечо является гомологичным к нуклеотидной последовательности, расположенной перед сайтом расщепления нуклеазой в хромосоме.
12. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-11, в котором 3'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной после сайта расщепления нуклеазой в хромосоме.
13. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-12, в котором 5'-гомологичное плечо или 3'-гомологичное плечо являются проксимальными к по меньшей мере одному измененному ITR.
14. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-13, в котором 5'-гомологичное плечо и 3'-гомологичное плечо составляют примерно 250-2000 п.о.
15. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-14, в котором нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеазу, представляет собой кДНК.
16. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-15, в котором промотор представляет собой промотор CAG.
17. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-17, в котором промотор представляет собой Pol III, U6 или H1.
18. Способ вставки донорной последовательности в заранее определенном сайте вставки на хромосоме в клетке-хозяине, включающий: введение в клетку-хозяина зкДНК-вектора, имеющего по меньшей мере один измененный ITR, при этом зкДНК-вектор содержит нуклеотидную последовательность, содержащую 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо, причем донорная последовательность вставлена в хромосому по месту или рядом с сайтом вставки посредством гомологичной рекомбинации.
19. Способ по п. 18, дополнительно включающий введение в клетку нуклеотидной последовательности, кодирующей направляющую РНК (нРНК), распознающую сайт вставки.
20. Способ по п. 18 или 19, дополнительно включающий введение в клетку нуклеотидной последовательности, кодирующей последовательность-специфическую нуклеазу, которая расщепляет хромосому в сайте вставки или рядом с ним.
21. Способ по любому из пп. 18-20, в котором последовательность-специфическая нуклеаза представляет собой РНК-направляющую нуклеазу, нуклеазу цинкового пальца (ZFN), или эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN).
22. Способ по любому из пп. 18-21, в котором РНК-направляющая нуклеаза представляет собой Cas или Cas9.
23. Способ по любому из пп. 18-22, в котором на стадии введения отсутствует капсид.
24. Способ по любому из пп. 18-23, в котором 5'-гомологичное плечо является гомологичным к последовательности перед сайтом расщепления нуклеазой на хромосоме.
25. Способ по любому из пп. 18-24, в котором 3'-гомологичное плечо гомологично последовательности после сайта расщепления нуклеазой на хромосоме.
26. Способ по любому из пп. 18, в котором 5'-гомологичное плечо или 3'-гомологичное плечо являются проксимальными к измененному ITR.
27. Способ по любому из пп. 18-26, в котором 5'-гомологичное плечо и 3'-гомологичное плечо состоят из по меньшей мере примерно 50-2000 пар оснований.
28. Способ по любому из пп. 18-27, в котором нуклеотидная последовательность дополнительно содержит 5'-фланкирующую последовательность перед 5'-гомологичным плечом и 3'-фланкирующую последовательность после 3'-гомологичного плеча.
29. Способ получения генетически модифицированного животного, содержащего донорную последовательность, вставленную в предварительно определенный сайт вставки на хромосоме животного, включающий: а) получение клетки с донорной последовательностью, вставленной в предварительно определенный сайт вставки на хромосоме, в соответствии с п. 18; и b) введение клетки, полученной в а), животному-носителю для получения генетически модифицированного животного.
30. Способ по п. 29, в котором клетка представляет собой зиготу или плюрипотентную стволовую клетку.
31. Генетически модифицированное животное, полученное способом по п. 29 или 30.
32. Набор для вставки донорной последовательности в сайт вставки на хромосоме в клетке, содержащий: (а) первый зкДНК-вектор, содержащий: (i) по меньшей мере один измененный инвертированный концевой повтор (ITR) AAV; и (ii) первую нуклеотидную последовательность, содержащую 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо, при этом донорная последовательность обладает функциональностью редактирования генов; и (b) второй зкДНК-вектор, содержащий: (i) по меньшей мере один измененный инвертированный концевой повтор (ITR) AAV; и (ii) нуклеотидную последовательность, кодирующую нуклеазу, причем 5'-гомологичное плечо гомологично последовательности перед сайтом расщепления нуклеазой в хромосоме, и 3'-гомологичное плечо гомологично последовательности после сайта расщепления нуклеазой на хромосоме; и при этом 5'-гомологичное плечо или 3'-гомологичное плечо проксимальны к измененному ITR.
33. Способ вставки донорной последовательности в предварительно определенный сайт вставки на хромосоме в клетке-хозяине, включающий: (а) введение в клетку-хозяина первого зкДНК-вектора, имеющего по меньшей мере один измененный ITR, при этом зкДНК-вектор содержит первую линейную нуклеиновую кислоту, содержащую 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо; и (b) введение в клетку-хозяина второго зкДНК-вектора, имеющего по меньшей мере один измененный ITR, при этом второй зкДНК-вектор содержит вторую линейную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность-специфическую нуклеазу, которая расщепляет хромосому в сайте вставки или рядом с ним, причем донорная последовательность вставлена в хромосому в сайте вставки или рядом с ним посредством гомологичной рекомбинации.
34. Способ по любому из пп. 18-33, отличающийся тем, что второй зкДНК-вектор дополнительно содержит третью нуклеотидную последовательность, кодирующую направляющую последовательность, распознающую сайт вставки.
35. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-17, дополнительно включающий по меньшей мере один из элемента, усиливающего трансген, и сайт (cite) поли(А), расположенный после и проксимально к 3'-гомологичному плечу.
36. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-17 или 35, дополнительно содержащий альтернативную последовательность-мишень нуклеазы, проксимальную к измененному ITR.
37. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-17 или 35-36, дополнительно содержащий 2А и сайт маркера селекции перед 3'-гомологичным плечом и вблизи него.
38. Композиция зкДНК-вектора нуклеиновой кислоты, содержащая: фланкирующие концевые повторы (TR); и по меньшей мере одну последовательность редактирующей ген нуклеиновой кислоты, при этом вектор представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами.
39. Композиция по п. 38, в которой терминальные повторы являются инвертированными TR (ITR).
40. Композиция по п. 38 или 39, в которой по меньшей мере один из терминальных повторов является модифицированным.
41. Композиция по любому из пп. 38-40, в которой вектор представляет собой одноцепочечную кольцевую ДНК в условиях денатурирования нуклеиновой кислоты.
42. Композиция по любому из пп. 38-41, в которой редактирующая ген последовательность нуклеиновой кислоты кодирует молекулу для редактирования гена, выбранную из группы, состоящей из: последовательность-специфической нуклеазы, одной или нескольких направляющих РНК, CRISPR/Cas, рибонуклеопротеина (RNP) или деактивированного CAS для систем CRISPRi или CRISPRa, или любой их комбинации.
43. Композиция по любому из пп. 38-42, в которой последовательность-специфическая нуклеаза содержит: ТАЛ-нуклеазу, нуклеазы цинкового пальца (ZFN), мегануклеазу, мегаTAL или РНК-направляемую эндонуклеазу (например, cas9, cpf1, dCAS9, nCAS9).
44. Композиция по любому из пп. 38-43, дополнительно содержащая по меньшей мере два измененных ITR.
45. Композиция по любому из пп. 38-44, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, представляющую интерес.
46. Композиция по любому из пп. 38-45, в которой последовательность нуклеиновой кислоты, редактирующая ген, представляет собой матрицу гомологичной репарации.
47. Композиция по любому из пп. 38-46, в которойматрицу гомологично-направленной репарации включает 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо.
48. Композиция по любому из пп. 38-47, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндонуклеазу, при этом эндонуклеаза расщепляет или никирует специфический сайт эндонуклеазы на ДНК гена-мишени или сайта-мишени в зкДНК-векторе.
49. Композиция по любому из пп. 38-48, в которой 5'-гомологичное плечо гомологично к нуклеотидной последовательности перед сайтом ДНК эндонуклеазы на хромосоме.
50. Композиция по любому из пп. 38-49, в которой 3'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности после сайта ДНК эндонуклеазы.
51. Композиция по любому из пп. 38-40, в которой гомологичные плечи составляют каждое примерно 250-2000 п.о.
52. Композиция по любому из пп. 38-52, в которой ДНК-эндонуклеаза содержит: TAL-нуклеазу, нуклеазу цинкового пальца (ZFN), или РНК-направляемую эндонуклеазу (например, Cas9 или Cpf1).
53. Композиция по любому из пп. 38-52, в которой РНК-направляемая эндонуклеаза содержит фермент Cas.
54. Композиция по любому из пп. 38-53, в которой фермент Cas представляет собой Cas9.
55. Композиция по любому из пп. 38-53, в которой фермент Cas представляет собой никующий Cas9 (nCas9).
56. Композиция по любому из пп. 38-55, в которой nCas9 содержит мутацию в домене HNH или RuVc Cas.
57. Композиция по любому из пп. 38-53, в которой фермент Cas представляет собой деактивированную нуклеазу Cas (dCAS), которая образует комплекс с нРНК, нацеленной на промоторную область гена-мишени.
58. Композиция по любому из пп. 38-57, дополнительно содержащая эффекторный домен KRAB.
59. Композиция по любому из пп. 38-57, в которой dCAS слит с гетерологичным доменом активации транскрипции, который может быть направлен на область промотора.
60. Композиция по любому из пп. 38-59, в которой слияние dCAS направлено на область промотора гена-мишени с помощью направляющей РНК, которая рекрутирует дополнительные домены трансактивации для увеличения экспрессии гена-мишени.
61. Композиция по любому из пп. 38-57, в которой dCAS представляет собой dCas9 S. pyogenes.
62. Композиция по любому из пп. 38-61, в которой направляющие последовательности РНК нацелены на близость промотора гена-мишени и CRISPR сайленсирует ген-мишень (система CRISPRi).
63. Композиция по любому из пп. 38-61, в которой последовательность направляющей РНК нацелена на сайт начала транскрипции гена-мишени и активирует ген-мишень (система CRISPRa).
64. Композиция по любому из пп. 38-63, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере одну направляющую РНК (нРНК) для РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы.
65. Композиция по любому из пп. 38-64, в которой направляющая РНК (онРНК) нацелена на сайт акцептора сплайсинга или донора сплайсинга дефектного гена для осуществления негомологичного присоединения конца (NHEJ) и коррекции дефектного гена.
66. Композиция по любому из пп. 38-65, в которой указанный вектор кодирует несколько копий одной последовательности направляющей РНК.
67. Композиция по любому из пп. 38-66, дополнительно содержащая регуляторную последовательность, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей нуклеазу.
68. Композиция по любому из пп. 38-67, в которой регуляторная последовательность содержит энхансер и/или промотор.
69. Композиция по любому из пп. 38-68, в которой промотор функционально связан с нуклеиновой кислотой, кодирующей последовательность ДНК-эндонуклеазы, при этом последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей ДНК-эндонуклеазу, дополнительно содержит последовательность интрона перед последовательностью эндонуклеазы, и интрон содержит сайт расщепления нуклеазой.
70. Композиция по любому из пп. 38-69, в которой сайт поли(А) расположен перед и в непосредственной близости к 5'-гомологичному плечу.
71. Композиция по любому из пп. 47***, в которой донорная последовательность является чужеродной для 5'-гомологичного плеча или 3'-гомологичного плеча.
72. Композиция по любому из пп. 47, в которой 5'-гомологичное плечо или 3'-гомологичное плечо являются проксимальными к по меньшей мере одному модифицированному ITR.
73. Композиция по любому из пп. 48, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая нуклеазу, представляет собой кДНК.
74. Композиция по любому из пп. 68, в которой промотор представляет собой промотор CAG.
75. Композиция по любому из пп. 68, в которой промотор представляет собой Pol III, U6 или H1.
76. Клетка, содержащая вектор по любому из пп. 38-75.
77. Композиция, содержащая: вектор по любому из пп. 38-75 и липид.
78. Набор, включающий вектор по любому из пп. 38-75, или клетку по п. 76.
79. Способ редактирования генома, включающий: контактирование клетки с системой редактирования генов, при этом один или несколько компонентов системы редактирования генов доставляют в клетку путем контактирования клетки с композицией вектора нуклеиновой кислоты с ДНК с замкнутыми концами (зкДНК), причем композиция нуклеиновой кислоты зкДНК-вектора представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, содержащую последовательности фланкирующих концевых повторов (TR) и, необязательно, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования гена, имеющую область, комплементарную по меньшей мере одному гену-мишени.
80. Способ по п. 79, в котором концевые повторы представляют собой инвертированные TR (ITR).
81. Способ по п. 79 или 80, в котором ITR представляет собой модифицированный ITR.
82. Способ по любому из пп. 79-81, в котором систему редактирования гена выбирают из группы, состоящей из: системы TALEN, системы эндонуклеазы цинкового пальца (ZFN), системы CRISPR/Cas и системы мегануклеазы.
83. Способ по любому из пп. 79-82, в котором по меньшей мере один ген для редактирования последовательности нуклеиновой кислоты кодирует молекулу для редактирования гена, выбранную из группы, состоящей из: РНК-направляемой нуклеазы, направляющей РНК, TALEN и эндонуклеазы цинкового пальца (ZFN).
84. Способ по любому из пп. 79-83, в котором одиночный зкДНК-вектор содержит все компоненты системы редактирования гена.
85. Способ по любому из пп. 79-84, в котором стадия контактирования клеток дополнительно включает введение реагента для трансфекции или липидного реагента в комбинации с системой редактирования генов.
86. Способ по любому из пп. 79-85, в котором система редактирования генов дополнительно содержит реагент трансфекции или липосомный реагент.
87. Способ по любому из пп. 79-86, в котором композиция нуклеиновой кислоты зкДНК-вектора определяется по любому из пп. 1-77.
88. Способ по любому из пп. 79-87, в котором экспрессия гена-мишени изменена.
89. Способ по любому из пп. 79-88, в котором контактирующая клетка является эукариотической клеткой.
90. Способ по любому из пп. 79-88, в котором белок Cas кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке.
91. Способ редактирования генома, включающий введение в клетку эффективного количества композиции зкДНК по любому из пп. 1-77, в подходящих условиях и в течение периода времени, достаточного для редактирования гена-мишени.
92. Способ по любому из пп. 79-91, в котором нацеливание на ген-мишень осуществляется с помощью одной или нескольких последовательностей направляющих РНК, и редактирование проводится путем гомологично направляемой репарации (HDR) в присутствии донорной матрицы HDR.
93. Способ по любому из пп. 79-91, в котором нацеливание на ген-мишень осуществляется с помощью одной или нескольких последовательностей направляющих РНК и ген-мишень редактируют путем негомологичного присоединения конца (NHEJ).
94. Способ по любому из пп. 79-93, в котором способ осуществляют in vivo для коррекции однонуклеотидного полиморфизма (SNP), связанного с заболеванием.
95.Способ по любому из пп. 94, в котором заболевание включает серповидноклеточную анемию, наследственный гемохроматоз или рак, наследственную слепоту.
96. Способ по любому из пп. 91, в котором в зкДНК-векторе присутствуют по меньшей мере 2 различных белка Cas, и при этом один из белков Cas является каталитически неактивным (Cas-i), причем направляющая РНК, связанная с Cas-I, нацелена на промотор клетки-мишени, и ДНК, кодирующая Cas-I, находится под контролем индуцибельного промотора, так что он может отключать экспрессию гена-мишени в нужное время.
97. Способ редактирования отдельной пары нуклеотидных оснований в гене-мишени клетки, включающий контактирование клетки с системой редактирования генов CRISPR/Cas, в котором один или несколько компонентов системы редактирования генов CRISPR/Cas доставляются в клетку путем контактирования клетки с композицией вектора нуклеиновой кислоты с ДНК с замкнутыми концами (зкДНК), при этом композиция нуклеиновой кислоты зкДНК-вектора представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, содержащую фланкирующие последовательности концевых повторов (TR) и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты для редактирования гена, имеющую область, комплементарную к по меньшей мере одному гену-мишени или регуляторной последовательности гена-мишени, и
при этом белок Cas, экспрессируемый из вектора, является каталитически неактивным и слит с фрагментом редактирования основания,
при этом способ осуществляют в условиях и в течение периода времени, достаточного для модуляции экспрессии гена-мишени.
98. Способ по любому из пп. 79-97, в котором концевые повторы являются инвертированными TR (ITR).
99. Способ по любому из пп. 79-98, в котором по меньшей мере один из фланкирующих концевых повторов представляет собой модифицированный концевой повтор.
100. Способ по любому из пп. 79-99, в котором фрагмент редактирования основания содержит специфическую к одноцепочечным последовательностям цитидиндеаминазу, ингибитор урацилгликозилазы, или аденозиндезаминазу тРНК.
101. Способ по любому из пп. 79-100, в котором каталитически неактивный белок Cas, экспрессируемый из указанного вектора, представляет собой dCas9.
102. Способ по любому из пп. 79-101, в котором зкДНК-вектор имеет структуру по любому из пп. 1-77, при этом контактирующая клетка представляет собой Т-клетку или CD34+.
103. Способ по любому из пп. 79-102, в котором ген-мишень кодирует белок программируемой смерти (PD1), антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами (CTLA4) или фактор некроза опухоли-α (ФНО-α).
104. Способ по любому из пп. 79-103, дополнительно включающий введение клеток, полученных в соответствии с п. 102, нуждающемуся в этом субъекту.
105. Способ по п. 104, в котором нуждающийся в этом субъект имеет генетическое заболевание, вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, рак или аутоиммунное заболевание.
106. Способ модуляции экспрессии двух или более генов-мишеней в клетке, включающий: введение в клетку:
(i) композиции, содержащей вектор, который содержит: фланкирующие последовательности концевых повторов (TR) и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере две направляющие РНК, комплементарные двум или более генам-мишеням, при этом вектор представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами,
(ii) второй композиции, содержащей вектор, который содержит: последовательности фланкирующих концевых повторов (TR) и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере две каталитически неактивные эндонуклеазы ДНК, каждая из которых ассоциирована с направляющей РНК и связывается с двумя или более генами-мишенями, причем вектор представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, и
(iii) третьей композиции, содержащей вектор, который содержит: последовательности фланкирующих концевых повторов (TR) и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере два белка или домена регулятора транскрипции, при этом вектор представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, и
при этом указанные по меньшей мере две направляющих РНК, указанные по меньшей мере две каталитически неактивные РНК-направляемые эндонуклеазы и указанные по меньшей мере два белка или домена регулятора транскрипции экспрессируются в клетке,
при этом два или более комплексов ко-локализации образуются между направляющей РНК, каталитически неактивной РНК-направляемой эндонуклеазой, белком или доменом регулятора транскрипции и геном-мишенью, и
при этом указанный белок или домен регулятора транскрипции регулирует экспрессию по меньшей мере двух генов-мишеней.
107. Способ по п. 106, в котором концевые повторы являются инвертированными TR (ITR).
108. Способ по пп. 106 или 107, в котором по меньшей мере одна из фланкирующих последовательностей TR является модифицированной TR.
109. Способ вставки последовательности нуклеиновой кислоты ген безопасной гавани геномав ген безопасной гавани генома, включающий: контактирование клетки с (i) системой редактирования генов и (ii) матрицей гомологично направляемой репарации, имеющей гомологию с геном безопасной гавани генома и содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, представляющий интерес,
при этом один или несколько компонентов системы редактирования генов доставляют в клетку путем контактирования клетки с композицией вектора нуклеиновой кислоты с ДНК с замкнутыми концами (зкДНК), при этом композиция нуклеиновой кислоты зкДНК-вектора представляет собой линейную дуплексную ДНК с замкнутыми концами, содержащую последовательности фланкирующих концевых повторов (TR), и по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, редактирующую ген, и
при этом способ осуществляют в условиях и в течение времени, достаточных для вставки последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес белок, ген безопасной гавани геномав ген безопасной гавани генома.
110. Способ по п. 109, в котором концевые повторы являются инвертированными TR (ITR).
111. Способ по пп. 109 или 110, в котором по меньшей мере одна из фланкирующих последовательностей TR является модифицированным TR.
112. Способ по любому из пп. 109-111, в котором ген безопасной гавани генома содержит активный интрон вблизи к по меньшей мере одной кодирующей последовательности, известной как экспрессирующая белки с высокими уровнями экспрессии.
113. Способ по любому из пп. 109-112, в котором зкДНК-вектор содержит структуру в соответствии с любым из пп. 1-77.
114. Способ по любому из пп. 109-113, в котором ген безопасной гавани генома содержит сайт в пределах или вблизи от гена альбумина.
115. Способ по любому из пп. 109-114, в котором представляющий интерес белок является рецептором, токсином, гормоном, ферментом или белком клеточной поверхности.
116. Способ по любому из пп. 109-115, в котором представляющий интерес белок является секретируемым белком.
117. Способ по любому из пп. 109-116, в котором представляющий интерес белок содержит фактор VIII (FVIII) или фактор IX (FIX).
118. Способ по любому из пп. 109-117, в котором способ осуществляют in vivo для лечения гемофилии А или гемофилии B.
ПРИМЕРЫ
[00673] Следующие примеры приведены в качестве иллюстрации, а не для ограничения. Специалисту в данной области должно быть понятно, что зкДНК-векторы могут быть сконструированы из любых ITR дикого типа или модифицированных ITR, описанных в данном документе, и что приведенные далее примеры способов могут быть использованы для конструирования и оценки активности таких зкДНК-векторов. Несмотря на то что способы иллюстрируются конкретными зкДНК-векторами, они применимы к любому зкДНК-вектору в соответствии с описанием.
Пример 1. Конструирование зкДНК-векторов
[00674] Получение зкДНК-векторов с использованием матрицы полинуклеотидного конструкта описано в Примере 1 PCT/US18/49996. Например, матрица полинуклеотидного конструкта, используемая для генерирования зкДНК-векторов по данному изобретению, может представлять собой зкДНК-плазмиду, зкДНК-бакмиду и/или зкДНК-бакуловирус. Не ограничиваясь теорией, в пермиссивной клетке-хозяине, в присутствии, например, Rep, матрица полинуклеотидного конструкта, имеющая два симметричных ITR и экспрессионный конструкт, причем по меньшей мере один из ITR модифицирован относительно последовательности ITR дикого типа, реплицируется с получением зкДНК-векторов. Получение зкДНК-вектора проходит в два этапа: во-первых, эксцизия («спасение») матрицы из остова матрицы (например, зкДНК-плазмиды, зкДНК-бакмиды, генома зкДНК-бакуловируса и т.п.) посредством белков Rep, и, во-вторых, опосредованная Rep репликация вырезанного зкДНК-вектора.
[00675] Способ получения зкДНК-векторов проиллюстрирован на примере зкДНК-плазмиды, как описано в данном документе. На Фиг. 1А и 1В матрица полинуклеотидного конструкта каждой из зкДНК-плазмид включает как левый модифицированный ITR, так и правый модифицированный ITR со следующими, расположенными между ITR, последовательностями: (i) энхансер/промотор; (ii) сайт клонирования трансгена; (iii) посттранскрипционный ответный элемент (например, посттранскрипционный регуляторный элемент вируса гепатита сурка (WPRE)); и (iv) сигнал полиаденилирования (например, из гена бычьего гормона роста (BGHpA). Уникальные сайты распознавания рестрикционной эндонуклеазы (R1-R6) (показаны на Фиг. 1A и Фиг. 1B) также были введены между всеми компонентами, чтобы облегчить введение новых генетических компонентов в конкретные сайты конструкта. Сайты ферментов R3 (PmeI) GTTTAAAC (SEQ ID NO: 7) и R4 (PacI) TTAATTAA (SEQ ID NO: 542) встраивают в сайт клонирования для введения открытой рамки считывания трансгена. Эти последовательности были клонированы в плазмиду pFastBac HT B, полученную от ThermoFisher Scientific.
[00676] Вкратце, ряд зкДНК-векторов для редактирования генов получали из конструктов зкДНК-плазмиды с использованием процесса, показанного на Фиг. 4А-4С. В Таблице 8 показаны типичные примеры конструктов для получения зкДНК-векторов для редактирования генов для использования по данному изобретению, которые также могут содержать последовательности, например, сайт белка репликации (RPS) (например, Rep-связывающий сайт) на любом конце промотора, функционально связанного с молекулой редактирования гена. Числа в Таблице 8 относятся к значениям SEQ ID NO в данном документе, соответствующим последовательностям каждого компонента. Плазмиды в Таблице 8 были сконструированы с WPRE, содержащим SEQ ID NO: 8, за которым следует BGHpA, содержащий SEQ ID NO: 9, в 3'-нетранслируемой области между трансгеном и правым ITR.
[00677] Таблица 8: Примеры конструктов, содержащих асимметричную пару ITR или симметричную пару mod-ITR, для получения типичных зкДНК-векторов для редактирования генов.
Плазмида 5 ' -модифицированный ITR Трансген 3 ' -модифицированный ITR (симметричный относительно 5 ' -ITR)
Конструкт-1 SEQ ID NO: 51 Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 2
Конструкт-2 SEQ ID NO: 52 Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 1
Конструкт-3 SEQ ID NO: 51 Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 2
Конструкт-4 SEQ ID NO: 52 Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 1
Конструкт-5 SEQ ID NO: 51 Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 2
Конструкт-6 SEQ ID NO: 52 Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 1
Конструкт-7 SEQ ID NO: 51 Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 2
Конструкт-8 SEQ ID NO: 52 Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 1
Конструкт-11 (SEQ ID NO: 63) Молекула для редактирования генов (SEQ ID NO: 1)
Конструкт-12 (SEQ ID NO: 51) Молекула для редактирования генов (SEQ ID NO: 64)
Конструкт-13 (SEQ ID NO: 63) Молекула для редактирования генов (SEQ ID NO: 1)
Конструкт-14 (SEQ ID NO: 51) Молекула для редактирования генов (SEQ ID NO: 64)
Конструкт-15 SEQ ID NO: 484 (ITR-33 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 469 (ITR-18, правый)
Конструкт-16 SEQ ID NO: 485 (ITR-34 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 95 (ITR-51, правый)
Конструкт-17 SEQ ID NO: 486 (ITR-35 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 470 (ITR-19, правый)
Конструкт-18 SEQ ID NO: 487 (ITR-36 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 471 (ITR-20, правый)
Конструкт-19 SEQ ID NO: 488 (ITR-37 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 472 (ITR-21, правый)
Конструкт-20 SEQ ID NO: 489 (ITR-38 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 473 (ITR-22 правый)
Конструкт-21 SEQ ID NO: 490 (ITR-39 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 474 (ITR-23, правый)
Конструкт-22 SEQ ID NO: 491 (ITR-40 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 475 (ITR-24, правый)
Конструкт-23 SEQ ID NO: 492 (ITR-41 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 476 (ITR-25 правый)
Конструкт-24 SEQ ID NO: 493 (ITR-42 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 477 (ITR-26 правый)
Конструкт-25 SEQ ID NO: 494 (ITR-43 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 478 (ITR-27 правый)
Конструкт-26 SEQ ID NO: 495 (ITR-44 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 479 (ITR-28 правый)
Конструкт-27 SEQ ID NO: 496 (ITR-45 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 480 (ITR-29, правый)
Конструкт-28 SEQ ID NO: 497 (ITR-46 левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 481 (ITR-30, правый)
Конструкт-29 SEQ ID NO: 498 (ITR-47, левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 482 (ITR-31, правый)
Конструкт-30 SEQ ID NO: 499 (ITR-48, левый) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 483 (ITR-32 правый)
Конструкт- 31 SEQ ID NO: 51 (WT-ITR) Молекула для редактирования генов SEQ ID NO: 1 (WT-ITR)
[00678] В некоторых вариантах реализации конструкт для создания зкДНК-векторов для редактирования генов содержит промотор, который представляет собой регуляторный переключатель, как описано в данном документе, например, индуцибельный промотор.
[00679] Получение зкДНК-бакмид:
[00680] Как изображено на Фиг. 4А, компетентные клетки DH10Bac (компетентные клетки MAX EFFICIENCY® DH10Bac™, Thermo Fisher) трансформировали либо тестируемой, либо контрольной плазмидой согласно протоколу в соответствии с инструкциями производителя. Рекомбинацию между плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac индуцировали для получения рекомбинантных зкДНК-бакмид. Рекомбинантные бактерии отбирали путем скрининга с положительным отбором, основанного на сине-белом скрининге в E.coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащей X-gal и IPTG с антибиотиками для отбора трансформантов, и поддержания бакмиды и плазмид с транспозазой. Белые колонии, появляющиеся в результате транспозиции, которая разрушает β-галактозидный индикаторный ген, собирали и культивировали в 10 мл среды.
[00681] Рекомбинантные зкДНК-бакмиды выделяли из E. coli и трансфицировали ими клетки насекомых Sf9 или Sf21 с применением FugeneHD для получения инфекционного бакуловируса. Адгезивные клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в колбах T25 при 25°С. Через 4 дня культуральную среду (содержащую вирус P0) отделяли от клеток, фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм, отделяя инфекционные бакуловирусные частицы от клеток или клеточного дебриса.
[00682] Необязательно, первое поколение бакуловируса (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых Sf9 или Sf21 в 50-500 мл среды. Клетки выдерживали в суспензионных культурах в инкубаторе с орбитальным шейкером при 130 об/мин при 25°С, отслеживая диаметр и жизнеспособность клеток до тех пор, пока клетки не достигнут диаметра 18-19 нм (от диаметра наивных клеток, равного 14-15 нм) и плотности ок. 4.0E+6 клеток/мл. Через 3-8 дней после инфицирования бакуловирусные частицы P1 в среде собирали после центрифугирования для удаления клеток и дебриса, с последующей фильтрацией через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
[00683] зкДНК-бакуловирус, содержащий тестируемые конструкты, собирали и определяли инфекционную активность или титр бакуловируса. В частности, 4×20 мл культур клеток Sf9 с плотностью 2,5E+6 клеток/мл обрабатывали бакуловирусом P1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали при 25-27°C. Инфекционность определяли ежедневно на протяжении 4-5 дней по показателю увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток.
[00684] Как показано на Фиг. 4А, «Rep-плазмиду» согласно, например, Фиг. 7A, получали в экспрессионном векторе pFASTBAC™-Dual (ThermoFisher), содержащем как Rep78 (SEQ ID NO: 13) или Rep68 (SEQ ID NO: 12), так и Rep52 (SEQ ID NO: 14) или Rep40 (SEQ ID NO: 11).
[00685] Указанной Rep-плазмидой трансформировали компетентные клетки DH10Bac (MAX EFFICIENCY® DH10Bac™ Competent Cells (Thermo Fisher)), в соответствии с предложенным производителем протоколом. Рекомбинацию между Rep-плазмидой и бакуловирусным челночным вектором в клетках DH10Bac индуцировали для получения рекомбинантных бакмид («Rep-бакмиды»). Рекомбинантные бакмиды отбирали с применением положительного отбора, который включал - сине-белый скрининг в E. coli (маркер Φ80dlacZΔM15 обеспечивает α-комплементацию гена β-галактозидазы из бакмидного вектора) на чашке с бактериальным агаром, содержащим X-gal и и IPTG. Изолированные белые колонии собирали и инокулировали в 10 мл селективной среды (канамицин, гентамицин, тетрациклин в бульоне LB). Рекомбинантные бактерии (Rep-бакмида) выделяли из E.coli, и указанными Rep-бакмидами трансфицировали клетки насекомых Sf9 или Sf21 для получения инфекционного бакуловируса.
[00686] Клетки насекомых Sf9 или Sf21 культивировали в 50 мл среды в течение 4 дней и выделяли из культуры инфекционный рекомбинантный бакуловирус («Rep-бакуловирус»). Необязательно, Rep-бакуловирус первого поколения (P0) амплифицировали путем инфицирования наивных клеток насекомых Sf9 или Sf21 и культивировали в 50-500 мл среды. Через 3-8 дней после инфицирования бакуловирусные частицы P1 в среде собирали, отделяя клетки путем центрифугирования или фильтрации, или используя другой способ фракционирования. Rep-бакуловирус собирали и определяли инфекционную активность бакуловируса. В частности, 4×20 мл культур клеток Sf9 с плотностью 2,5×106 клеток/мл обрабатывали бакуловирусом P1 в следующих разведениях: 1/1000, 1/10000, 1/50000, 1/100000, и инкубировали. Инфекционность определяли ежедневно на протяжении 4-5 дней по показателю увеличения диаметра клеток и остановке клеточного цикла, а также изменению жизнеспособности клеток.
[00687] Получение и характеризация зкДНК-вектора
[00688] Как показано на Фиг. 4B, затем добавляли культуральную среду для клеток насекомых Sf9, содержащую либо (1) образец, содержащий зкДНК-бакмиду или зкДНК-бакуловирус, либо (2) Rep-бакуловирус, описанные выше, в свежую культуру клеток Sf9 (2,5E+6 клеток/мл, 20 мл) в соотношении 1:1000 и 1:10000, соответственно. Затем клетки культивировали при 130 об/мин при 25°С. Через 4-5 дней после коинфекции определяют диаметр и жизнеспособность клеток. Когда диаметр клеток достигал 18-20 нм при жизнеспособности ок. 70-80%, клеточные культуры центрифугировали, среду удаляли и собирали клеточные осадки. Клеточные осадки сначала ресуспендировали в достаточном объеме водной среды - воды или буфера. зкДНК-вектор выделяли и очищали из клеток с использованием протокола очистки Qiagen MIDI PLUS™ (Qiagen, обработка 0,2 мг массы клеточного осадка на колонку).
[00689] Значения выхода для зкДНК-векторов, продуцированных и очищенных из клеток насекомых Sf9, первоначально определяли на основании УФ-поглощения при 260 нм.
[00690] Оценка зкДНК-векторов может быть проведена путем идентификации с применением электрофореза на агарозном геле в нативных или денатурирующих условиях, как проиллюстрировано на Фиг. 4D, где (a) присутствие характеристических полос, мигрирующих на вдвое большее расстояние на денатурирующих гелях по сравнению с нативными гелями после расщепления рестрикционной эндонуклеазой и гель-электрофоретического анализа, и (b) наличие полос мономера и димера (2×) на денатурирующих гелях для нерасщепленного материала характерно для присутствия зкДНК-вектора.
[00691] Структуры выделенных зкДНК-векторов дополнительно анализировали путем расщепления ДНК, полученной из коинфицированных клеток Sf9 (как описано в данном документе) рестрикционными эндонуклеазами, выбранными на основании a) присутствия только одного сайта разрезания в зкДНК-векторах, и b) получения итоговых фрагментов, достаточно больших, чтобы быть явно видимыми при фракционировании на 0,8% денатурирующем агарозном геле (>800 п.о.). Как показано на Фиг. 4D и 4E, линейные ДНК-векторы с прерывистой структурой и зкДНК-вектор с линейной и непрерывной структурой можно различить по размерам их продуктов реакции - например, ДНК-вектор с прерывистой структурой предположительно дает фрагменты размером 1 т.п.о. и 2 т.п.о., в то время как не заключенный в капсид вектор с непрерывной структурой предположительно дает фрагменты размером 2 т.п.о. и 4 т.п.о.
[00692] Соответственно, чтобы качественным образом продемонстрировать, что выделенные зкДНК-векторы имеют ковалентно замкнутые концы, что требуется по определению, указанные образцы расщепляли рестрикционной эндонуклеазой, идентифицируемой в контексте специфической последовательности ДНК-вектора как имеющая единственный сайт рестрикции, предпочтительно, дающей два продукта расщепления неравного размера (например, 1000 п.о. и 2000 п.о.). После расщепления и электрофореза на денатурирующем геле (который разделяет две комплементарные цепи ДНК) линейная ковалентно не замкнутая ДНК будет разделяться на фрагменты размером 1000 п.о. и 2000 п.о., тогда как ковалентно замкнутая ДНК (т.е. зкДНК-вектор) будет разделяться на фрагменты вдвое бóльшего размера (2000 п.о. и 4000 п.о.), поскольку две цепи ДНК соединены, а в данных обстоятельствах развернуты и имеют в два раза бóльшую длину (хотя и являются одноцепочечными). Кроме того, при расщеплении мономерных, димерных и n-мерных форм ДНК-векторов все они будут разделяться на фрагменты одинаковых размеров из-за связывания концов мультимерных ДНК-векторов (см. Фиг. 4D).
[00693] В данном документе фраза «анализ для идентификации ДНК-векторов с помощью электрофореза в агарозном геле в условиях нативного и денатурирующего геля» относится к анализу для оценки наличия замкнутых концов зкДНК путем проведения расщепления рестрикционной эндонуклеазой с последующей электрофоретической оценкой продуктов расщепления. Один пример такого анализа приведен ниже, хотя специалисту в данной области техники будет понятно, что возможны многие известные в данной области техники варианты указанного примера. Рестрикционную эндонуклеазу выбирают таким образом, чтобы она представляла собой фермент, разрезающий представляющий интерес зкДНК-вектор в одном месте таким образом, чтобы образовывались продукты с длиной, составляющей приблизительно 1/3× и 2/3× длины ДНК-вектора. Это обеспечивает разделение полос как на нативном, так и на денатурирующем геле. Перед денатурацией важно удалить буфер из образца. Набор для очистки продуктов ПЦР фирмы Qiagen PCR или обессоливающие «центрифужные колонки», например, колонки GE HEALTHCARE ILUSTRA™ MICROSPIN™ G-25, представляют собой некоторые известные в данной области техники варианты средств, используемых при анализе расщепления эндонуклеазами. Указанный анализ включает, например, i) расщепление ДНК подходящей рестрикционной эндонуклеазой (эндонуклеазами), 2) нанесение, например, на набор для очистки продуктов ПЦР фирмы Qiagen, элюирование дистиллированной водой, iii) добавление 10× денатурирующего раствора (10× = 0,5 M NaOH, 10 мМ ЭДТА), добавление 10X красителя, не забуференного, и анализ вместе с ДНК-маркерами молекулярного веса, полученными путем добавления 10X денатурирующего раствора в 4×, на 0,8-1,0 % геле, ранее инкубированном с 1 мМ ЭДТА и 200 мМ NaOH для обеспечения однородности концентрации NaOH в геле и гелевой камере, и осуществляют прогонку геля в присутствии 1× денатурирующего раствора (50 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА). Специалисту в данной области техники будет понятно, какое напряжение использовать для проведения электрофореза в зависимости от размеров и желаемого времени получения результатов. После электрофореза гели осушают и нейтрализуют в 1× TBE или TAE и переносят в дистиллированную воду или 1× TBE/TAE с 1× SYBR Gold. Затем полосы могут быть визуализированы, например, с применением красителя SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain фирмы Thermo Fisher (концентрат 10000X в ДМСО) и эпифлуоресцентного света (синего) или УФ (312 нм).
[00694] Оценка чистоты полученного зкДНК-вектора может быть проведена с применением любого известного в данной области техники способа. Согласно одному неограничивающему примеру способа вклад зкДНК-плазмиды в общее поглощение УФ образцом может быть рассчитан путем сравнения интенсивности флуоресцентности зкДНК-вектора и стандарта. Например, если, на основании поглощения УФ, на гель было загружено 4 мкг зкДНК-вектора, и интенсивность флуоресцентности зкДНК-вектора эквивалентна полосе 2 т.п.о. с известной массой 1 мкг, значит, имеется 1 мкг зкДНК-вектора, и зкДНК-вектор составляет 25% от общего количества материала, поглощающего УФ. Затем строят график зависимости интенсивности полосы на геле от вычисленного введенного количества, которому соответствует полоса - например, если весь зкДНК-вектор соответствует 8 т.п.о., а вырезанная сравнительная полоса соответствует 2 т.п.о., то интенсивность полосы на графике будет составлять 25% от общего введенного количества, что в указанном случае составит 0,25 мкг при введении 1,0 мкг. Используя титрование плазмиды зкДНК-вектора для построения калибровочной кривой, затем используют уравнение линии регрессии для расчета количества полосы зкДНК-вектора, которое затем можно использовать для определения процента общего ввода, представленного зкДНК-вектором, или процента чистоты.
ПРИМЕР 2: зкДНК-векторы экспрессируют трансген люциферазы in vitro
[00695] Конструкты получали путем введения открытой рамки считывания, кодирующей репортерный ген люциферазы, в сайт клонирования конструктов зкДНК-плазмида: конструкты 15-30 (см. выше в Таблице 8), включающие кодирующую последовательность люциферазы. Клетки HEK293 культивировали и трансфицировали 100 нг, 200 нг или 400 нг плазмидных конструктов 1-31, используя FUGENE® (Promega Corp.) в качестве агента для трансфекции. Экспрессию люциферазы из каждой плазмиды определяли на основе активности люциферазы в каждой клеточной культуре, с подтверждением того, что активность люциферазы обусловлена экспрессией гена из плазмиды.
ПРИМЕР 3: Экспрессия трансгенного белка люциферазы с зкДНК-векторов in vivo
[00696] Экспрессия белка трансгена in vivo из зкДНК-векторов, полученных из конструктов, может быть оценена на мышах. Например, были протестированы зкДНК-векторы, полученные из конструктов зкДНК-плазмид 1-31 (как описано в Таблице 8), и продемонстрировали устойчивую и длительную экспрессию трансгена люциферазы в мышиной модели после гидродинамической инъекции конструкта зкДНК без липосомы, повторного дозирования (в день 28) и долговечность (до дня 42) экзогенной зкДНК люциферазы светлячка. В других экспериментах оценивают экспрессию люциферазы выбранными зкДНК-векторами in vivo, при этом зкДНК-векторы содержат трансген люциферазы, а 5'-ITR и 3'-ITR выбраны из любой пары ITR, перечисленных в любой из Таблицы 2, Таблицы 4А, Таблицы 4B или Таблицы 5, или любой из модифицированных пар ITR, представленных на Фиг. 7А-7B. Для оценки экспрессии белка in vivo из зкДНК-векторов были использованы следующие примеры способов.
[00697] Экспрессия люциферазы in vivo. Самцам мышей CD-1 IGS в возрасте 5-7 недель (Charles River Laboratories) вводят 0,35 мг/кг зкДНК-вектора, экспрессирующего люциферазу, в объеме 1,2 мл путем внутривенного (i.v.) гидродинамического введения в хвостовую вену в день 0. Экспрессию люциферазы оценивают с помощью визуализации IVIS в дни 3, 4, 7, 14, 21, 28, 31, 35 и 42. Вкратце, мышам вводят внутрибрюшинной инъекцией 150 мг/кг субстрата люциферина, а затем оценивают люминесценцию всего тела с помощью визуализации IVIS®.
[00698] Визуализацию IVIS проводят в день 3, день 4, день 7, день 14, день 21, день 28, день 31, день 35, и день 42, и собранные органы визуализируют ex vivo после умерщвления в день 42.
[00699] На протяжении исследования животных ежедневно взвешивают и проводят мониторинг общего состояния здоровья и самочувствия. При умерщвлении кровь каждого животного собирают путем терминальной пункции сердца, разделяют на два части и обрабатывают для получения 1) плазмы и 2) сыворотки, причем плазму мгновенно замораживают, а сыворотку используют для панели анализов на ферменты печени, после чего мгновенно замораживают. Кроме того, собирают печень, селезенки, почки и паховые лимфатические узлы (LN) и визуализируют ex vivo с применением IVIS.
[00700] Экспрессию люциферазы в печени оценивают с помощью ИФА-анализа MAXDISCOVERY® Luciferase ELISA (BIOO Scientific/PerkinElmer), кПЦР на люциферазу образцов печени, гистопатологии образцов печени и/или панели анализов на ферменты печени в сыворотке (VetScanVS2; Abaxis Preventive Care Profile Plus).
ПРИМЕР 4: Скрининг модифицированных ITR
A. Скрининг модифицированных ITR для зкДНК-векторов, содержащих асимметричные и симметричные пары ITR.
[00701] Анализ взаимосвязи структуры mod-ITR с образованием зкДНК может быть выполнен, как описано в заявке PCT PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки. Ряд mod-ITR, изображенных на Фиг. 7A-7B и в Таблицах 4A и 4B в данном документе, были сконструированы для оценки влияния специфических структурных изменений на образование зкДНК и способность экспрессировать закодированный в зкДНК трансген. Конструирование мутантов, анализ образования зкДНК и оценка трансгенной экспрессии зкДНК в культуре клеток человека более подробно описаны ниже. Как и ожидалось, три отрицательных контроля (только среда, ложная трансфекция без донорной ДНК и образец, который обрабатывали в отсутствие клеток с Rep-содержащим бакуловирусом) не продемонстрировали значимой экспрессии люциферазы. Устойчивая экспрессия люциферазы наблюдалась в каждом из мутантных образцов, указывая на успешную трансфекцию и экспрессию закодированного в зкДНК трансгена для каждого образца независимо от мутации. Таким образом, мутантные образцы, очевидно, правильно формируют зкДНК, содержащую асимметричную пару mod-ITR. Mod-ITR может быть использован в композициях и способах по изобретению и может быть подвергнут скринингу на активность с использованием следующих примеров способов.
[00702] зкДНК-векторы с симметричными парами ITR были сгенерированы и сконструированы, как описано в Примере 1 выше и изображено на Фиг. 4В. Анализ взаимосвязи симметричного mod-ITR и симметричных WT-ITR проводили в соответствии со способами, описанными в PCT/US18/49996, которая включена в данный документ в полном объеме посредством ссылки. Мутации в последовательности ITR создавали симметрично в областях как правого, так и левого ITR. Библиотека содержала 16 правосторонних двойных мутантов (например, симметричные пары mod-ITR), как показано в Таблице 5.
ПРИМЕР 5: Получение зкДНК-вектора для редактирования гена
[00703] В иллюстративных целях описано получение типичного примера зкДНК-вектора для редактирования гена с целью получения зкДНК-вектора для редактирования фактора VIII, как описано ниже. Однако, хотя в данном Примере был использован фактор VIII, чтобы проиллюстрировать способы получения зкДНК-вектора для редактирования генов, полезного в описанных в данном документе способах и конструктах, специалисту в данной области техники понятно, что, как указано выше, может быть использован любой ген, когда требуется редактирование генов. Примеры генов для редактирования описаны в данном документе, например, в разделах, озаглавленных «Примеры заболеваний для лечения с помощью зкДНК для редактирования генов» и «Дополнительные заболевания для редактирования генов».
[00704] Получение зкДНК для редактирования гена фактора VIII: вставляют открытую рамку считывания, включающую представляющий интерес трансген (например, в качестве одного неограничивающего примера, фактор VIII), в зкДНК-вектор, фланкированный большими (до 2 т.п.о. каждый) гомологичными плечами последовательности геномной ДНК, прилегающими к открытой рамке считывания, для облегчения HDR в эндогенном локусе трансгена у пациентов, имеющих заболевание или расстройство, связанное с дефектной нативной копией трансгена (в случае фактора VIII - у пациентов, страдающих гемофилией A). Открытая рамка считывания сайт-специфической нуклеазы необязательно включается в вектор вместе с любыми необходимыми вспомогательными компонентами, такими как онРНК, с нуклеазой, специфичной к сайту, расположенному в или около нативного локуса трансгена (например, локуса фактора VIII), и эффективно увеличивающей рекомбинацию. зкДНК-вектор также может быть сконструирован так, чтобы нуклеаза была дополнительно специфична к сайтам на самом зкДНК-векторе, которые отключают экспрессию нуклеазы из зкДНК-вектора. Такая дополнительная специфичность обеспечивается дополнительными нРНК, экспрессируемыми зкДНК-вектором. зкДНК может быть доставлена, например, в липидных наночастицах (LNP), как описано в данном документе.
[00705] Конструкт зкДНК-трансген может быть дополнительно сконструирован так, чтобы включать нуклеазу (например, Cas9, TALE, MegaTale или ZFN) и, при необходимости, направляющую РНК, которая обеспечивает специфичность ДНК для процесса редактирования генов. Следовательно, такой одиночный ('all-in-one') конструкт зкДНК содержит следующие элементы в дополнение к центральным элементам остова зкДНК: последовательность, кодирующую трансген (например, трансген, кодирующий фактор VIII); две области геномной гомологии (например, области гомологии (HR), специфичные к локусу эндогенного фактора VIII); область, кодирующую нуклеазу, и промотор для управления экспрессией нуклеазы; и, в случае использования системы CRISPR, направляющую РНК (например, в случае Cas9). Можно сконструировать зкДНК-вектор так, чтобы он содержал экспрессионные кассеты онРНК и Cas9 в цис-положении с трансгеном, а онРНК и Cas9 находились вне гомологичных плеч и, следовательно, не интегрировались в клеточный геном. После события редактирования гена линейная зкДНК после HDR будет иметь выступающие концы ДНК и, следовательно, будет деградированной, уменьшая тем самым экспрессию с этого конструкта.
[00706] Пример зкДНК-вектора, имеющего конструкт фактора VIII, можно дополнительно модифицировать, чтобы получить последовательность ДНК, встроенную в последовательность нуклеазы (или ее промотор), которая будет индуцировать свою собственную инактивацию. Например, при продуцировании белка Cas9, он не только индуцирует редактирование генов (т.е. желаемый эффект), но также связывается и вызывает двухцепочечный разрыв ДНК в зкДНК, тем самым обеспечивая подавление/элиминацию Cas9 (для уменьшения вероятности нецелевых разрывов ДНК, вызываемых персистирующим Cas9).
[00707] зкДНК-вектор для редактирования генов, кодирующий фактор VIII, может быть создан геномными гомологичными плечами к локусу альбумина или другим геномным локусам (рядом с сильным промотором для управления экспрессией вставленного фактора VIII). Различные эксперименты, приведенные в Примере 5, повторяются в этом контексте.
[00708] На Фиг. 10А показана единица экспрессии тест-вектора в соответствии с данным изобретением, фланкированная 5'- и 3'-гомологичными плечами, которые включены в конструкцию зкДНК. В этом варианте реализации зкДНК конструируют с открытой рамкой считывания фактора IX (FIX), фланкированной 5'- и 3'-гомологичными плечами, которые гибридизуются с геномным локусом альбумина и, следовательно, управляют экспрессией FIX под эндогенным промотором альбумина. Контролями являются представляющее собой только экспрессионную единицу 5'-гомологичное плечо; и последовательность, содержащая только 3'-гомологичное плечо (Фиг. 10B и 10C, соответственно). Единица экспрессии, представляющая собой репортерный ген, например, GFP, включая промотор, элемент WPRE, pA, может использоваться для экспериментального подтверждения экспрессии (Фиг. 10D).
[00709] зкДНК-вектор, содержащий экспрессирующую единицу нуклеазы, может быть доставлен в транс-конфигурации, такой как мРНК Cas9, нуклеазы цинкового пальца (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), мутированная эндонуклеаза «никаза», система CRISPR/Cas класса II (CPF1) (Фиг. 10E). LNP, описанные в данном документе, могут использоваться в качестве варианта доставки. Транспорт экспрессирующей нуклеазу единицы к ядрам может быть увеличен или улучшен путем использования сигнала ядерной локализации (NLS), слитого с 5' или 3' пептидной последовательностью фермента (например, экспрессирующей единицы нуклеазы, такой как Cas9, ZFN, TALEN и т.д.). В зависимости от нуклеазы, экспрессируемой зкДНК, для индуцирования двухцепочечного разрыва (DSB) в желаемом сайте могут быть также доставлены в транс-конфигурации одна или несколько одиночных направляющих РНК. Например, либо как вектор, экспрессирующий онРНК, либо как химически синтезированная синтетическая онРНК. (sg = последовательность-мишень одиночной направляющей РНК) (Фиг. 10F). Вектор онРНК может быть зкДНК-вектором или другим экспрессионным вектором. Последовательности одиночной направляющей РНК могут быть выбраны и проверены с использованием свободно доступного программного обеспечения/алгоритма. Были выбраны и проверены 4 потенциальные последовательности-кандидаты. (Общедоступные ресурсы, такие как размещенные на сайте tools.genome-engineering.org, могут быть использованы для выбора подходящих последовательностей одиночной направляющей РНК.)
[00710] Примеры 5'- и 3'-гомологичных плеч: 5 'и/или 3'-гомологичное плечо может иметь длину около 350 п.о. для использования в конструктах кДНК, как изображено на Фиг. 8, 9 и 10А-10F. Например, 5'-гомологичное плечо может варьироваться от 50 до 2000 п.о. Аналогично, 3'-гомологичное плечо может иметь длину около 2000 п.о. и может находиться в диапазоне значений от 50 до 2000 п.о. Специалист в данной области техники может модифицировать длину 5' и/или 3' гомологичного плеча и/или частоту рекомбинации, как описано в Zhang, Jian-Ping, et al. "Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage." Genome biology 18.1 (2017): 35. и Wang, Yuanming, et al. "Systematic evaluation of CRISPR-Cas systems reveals design principles for genome editing in human cells." Genome biology 19.1 (2018): 62. Как показано в данном документе на Фиг. 16, FIX или FVIII могут быть заменены на любую беспромоторную открытую рамку считывания (ORF). Дополнительные элементы, включая, без ограничений, WPRE и сигнал полиаденилирования, такой как BGHpA, могут быть добавлены в конструкт зкДНК для редактирования генов. Например, экспрессией вставляемого гена (например, FIX или FVII в качестве типичных примеров генов) управляет эндогенный и очень сильный промотор альбумина. Элемент, усиливающий транскрипцию, такой как WPRE, добавляют в положении 3' от ORF. Может быть также добавлен сигнал полиаденилирования (например, BGH-pA). Как раскрыто в данном документе, конструкты зкДНК имеют большую емкость, что позволяет вставвлять между ITR фрагменты ДНК с длиной более 15 т.п.о. Соответственно, предусматривается использование систем зкДНК-векторов с большими ORF. Также могут быть использованы другие единицы экспрессии с сильной промоторной единицей. Можно использовать зкДНК-векторы с гомологичними плечами, которые нацелены на другие локусы безопасной гавани, например, имеющие гомологичние плечи, которые вместо нацеливания на локус альбумина нацелены на другие локусы безопасной гавани, такие как, без ограничений, CCR5 или локус AAV-safe-habor-S1 (AAVS1). Это позволяет вставить молекулу для редактирования гена или ген-мишень в сайт интрона без каких-либо воздействий на клетку или ткань-мишень. Как показано на Фиг. 11, экспрессионные конструкты могут быть получены для титрования самоинактивирующей способности нуклеазной активности путем введения последовательностей онРНК в интрон единицы синтетического промотора, например, промотора CAG, описанного для зкДНК-вектора. Степень инактивации регулируется количеством последовательностей (seq) онРНК или их комбинации и/или последовательностей-мишеней мутированной (деоптимизированной) онРНК. (Zhang et al., NatPro, 2013 Regulation of Cas9 activity by using de-optimized онРНК recognition target sequence.) На Фиг. 11, онРНК присутствуют поодиночке или группами (например, по четыре), и в некоторых вариантах реализации могут состоять из одной или нескольких уникальных последовательностей-мишеней, изображенных разными оттенками черного или белого цвета.
[00711] На Фиг. 12 изображен пример, в котором зкДНК-вектор может иметь различные схемы расположения промоторной единицы Pol III для управления экспрессией одной или нескольких онРНК. В этом примере между ITR размещено более одного выбранного промотора. Транскрипция может происходить в направлении, соответствующем прямой или обратной ориентации. SgRNA могут быть скомбинированы и/или дублированы. На Фиг. 14 продемонстрирован другой пример, в котором зкДНК может экспрессировать несколько онРНК (sg1, sg2, sg3 или sg4), например, с использованием промотора U6.
[00712] Соответственно, зкДНК-векторы для редактирования генов для использования по данному изобретению могут содержать любую одну или несколько из таких модификаций.
ПРИМЕР 6: Одиночный зкДНК-вектор для редактирования генов с основной ORF
[00713] Можно создать зкДНК-вектор для редактирования генов, содержащий элементы, изображенные на Фиг. 15. Неотмеченным включенным элементом является экспрессионная единица нуклеазы (включающая выделенный перекрестной штриховкой нуклеазный элемент) и интрон, расположенный после промотора, имеющего изображенную последовательность нацеливания на онРНК. Указанные элементы включают специфичные к зкДНК ITR; экспрессирующую единицу sgРНК, управляемая промотором Pol III (U6 или H1) с необязательной ориентацией относительно направления транскрипции; экспрессирующую единицу нуклеазы, управляемую синтетическим промотором (например, Cas9, никаза с двойной мутацией, Talen или другие мутанты), которая может содержать последовательности, нацеленные на онРНК, деоптимизированную или нет (в экспериментах с расположением, отличным от указанного); трансген (например, FIX), потенциально слитый с маркером селекции (например, NeoR) через сайт расщепления вирусного пептида 2А (2А), фланкируемый от 0,05 до 6 т.п.о. расправленными гомологичными плечами. (О 2A-системах см.: Chan et al, Comparison of IRES and F2A-Based Locus-Specific Multicistronic Expression in Stable Mouse LinesHSV-TK suicide, PLOS 2011 HSV-TK suicide gene system; Fesnak et al, Engineered T Cells: The Promise and Challenges of Cancer Immunotherapy, NatRevCan 2016.)
[00714] Если это целесообразно, предусматривается наличие маркера отрицательной селекции (например, HSV TK) и экспрессирующей единицы, которая позволяет контролировать и осуществлять селекцию по успешному использованию правильного сайта, расположенного вне гомологичных плеч. Другие регуляторные элементы или регуляторные переключатели, раскрытые в данном документе, также включены вместо, или в дополнение к, гену маркера отрицательной селекции.
[00715] Пример зкДНК-вектора, содержащего гомологичные плечи для вставки HDR-элемента, изображен на Фиг. 13 В таком зкДНК-векторе, в случае случайной интеграции, весь вектор с маркером отрицательной селекции интегрируется в геном. Такие неправильно трансфицированные клетки могут быть уничтожены с помощью соответствующих лекарственных средств, таких как GVC для маркера отрицательной селекции HSV TK. Альтернативно, указанный маркер отрицательной селекции может быть заменен регуляторным переключателем, как описано в данном документе, например, геном «аварийного выключателя» или любым геном, раскрытым в Таблице 11 заявки PCT/US18/49996, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки.
[00716] На Фиг. 9 изображен другой пример зкДНК-вектора, который аналогичен описанному в данном примере, но с заменой маркера отрицательной селекции на последовательность-мишень онРНК для «никазы с двойной мутацией» (обозначена сплошной направленной вниз стрелкой). Введение одноцепочечного разреза ДНК (никирование) может способствовать высвобождению кручения следом за 3'-гомологичным плечом рядом с мутантным ITR и увеличивать отжиг и, следовательно, увеличивать частоту HDR. В таком зкДНК-векторе используется отрицательный маркер с последовательностью-мишенью онРНК для «никазы с двойной мутацией».
[00717] зкДНК-векторы, описанные в этом Примере, приведены только с иллюстративными целями и могут быть модифицированы рядовым специалистом для вставки различных генов-мишеней, например, для использования фактора XIII вместо FIX и использования FIX вместо фактора XIII. Аналогично, специалисту в данной области техники известно, что для редактирования гена можно использовать любой ген-мишень.
ПРИМЕР 7: Получение зкДНК-вектора для редактирования генов для лечения заболевания.
[00718] В иллюстративных целях в Примере 7 описано получение типичных примеров редактирующих гены зкДНК-векторов для лечения различных заболеваний. Однако, хотя в этом Примере приводятся в качестве примера гены муковисцидоза, расстройств печени, системных расстройств, расстройств ЦНС и мышечных расстройств для иллюстрации способов получения зкДНК-вектора для редактирования генов, полезного в способах и конструктах, описанных в данном документе, специалисту в данной области техники будет известно, что, как указано выше, можно модифицировать ген-мишень для лечения любого заболевания, при котором требуется редактирование гена. Примеры заболеваний или генетических нарушений, для которых желательной стратегией лечения заболевания является редактирование генов с помощью редактирующего зкДНК-вектора, как описано в данном документе, обсуждаются в разделах, озаглавленных «Примеры заболеваний для лечения с помощью зкДНК для редактирования генов» и «Дополнительные заболевания для редактирования генов».
[00719] В одном примере может быть получен зкДНК-вектор, который содержит онРНК с множественными сайтами расщепления нуклеазами, например, от 2 до 4, помещенными в что-то одно или оба из предшествующего интрона для нуклеазы и 5'-гомологичного плеча. Они могут иметь специфичность, обусловленную различными или общими онРНК. Пример одиночного (“All-In-One”) зкДНК-вектора, содержащего все эти элементы, изображен на Фиг. 15.
[00720] Типичный зкДНК-вектор, заменяющий или обеспечивающий трансген, может быть сконструирован для индукции редактирования генов другими трансгенами для других генетических расстройств, включая расстройства печени (например, ОТС, GSD1a, Криглера-Найяра (Crigler-Najar), фенилкетонурия (PKU) и т.п.) или системные расстройства (например, MPSII, MLD, MPSIIIA, Гоше, Фабри, Помпе и т.п.).
[00721] Пример редактирующего ген зкДНК-вектора для лечения генетического расстройства или заболевания может быть схожим с описанным в Примере 6 в том, что зкДНК-вектор может быть модифицирован для индукции редактирования генов в легких, например, при муковисцидозе (МВ). Такой зкДНК-вектор получают таким образом, чтобы он кодировал МВТР, представляющий собой ген, мутирующий при МВ. МВТР представляет собой большой ген, который не может быть заключен в AAV. Следовательно, зкДНК-вектор обеспечивает уникальное решение и в некоторых вариантах может вводиться субъекту внутривенно и/или в виде распыляемой композиции, чтобы вызвать редактирование гена в эпителии легкого. Как было указано выше, зкДНК-вектор для редактирования гена сконструирован так, чтобы МВТР был вставлен в эндогенный локус МВТР. В таком примере зкДНК-вектор также может содержать нуклеазу и направляющую РНК, а также использовать большие гомологичные плечи для повышения эффективности и точности редактирования генов.
[00722] Пример редактирующего ген зкДНК-вектора для редактирования генов расстройств ЦНС аналогичен описанному в Примере 6, где зкДНК модифицируют, чтобы вызвать редактирование генов в ЦНС, при расстройствах, включающих нейродегенеративные нарушения (например, семейные формы болезней Альцгеймера, Паркинсона, Гентигтона), расстройства лизосомального накопления (например, MPSII, MLD, MPSIIIA, Канавана, Баттена и т.п.) или расстройства нервного развития (например, SMA, синдром Ретта и т.п.)
[00723] Пример редактирующего ген зкДНК-вектора для лечения генетического расстройства или заболевания мышц может быть схожим с описанным в Примере 6 в том, что зкДНК-вектор может быть модифицирован, чтобы вызывать редактирование генов в мышцах, при расстройствах, включающих, без ограничений. мышечную дистрофию Дюшенна, лице-лопаточно-плечевую (fascioscapulohumeral) дистрофию и т.п.
[00724] зкДНК для редактирования генов (т.е. зкДНК-вектор, замещающий или обеспечивающий трансген), описанный и проиллюстрированный в Примерах 6-7, может быть доставлен к клеткам-мишеням в животной модели дефектного трансгена, для оценки эффективности редактирования генов, а также создания клеток, продуцирующих более эффективный генный продукт.
ПРИМЕР 8: зкДНК пригодна для использования при редактировании генов в случаях целевого двухцепочечного разрыва (DSB) мегануклеазой.
[00725] зкДНК-вектор редактирования генов может содержать матричную нуклеотидную последовательность в качестве корректирующей цепи ДНК, которая будет вставлена после двухцепочечного разрыва, обеспечиваемого мегануклеазой. В иллюстративных целях далее описан пример зкДНК-вектора для редактирования генов, касающийся создания зкДНК-вектора для редактирования и коррекции гена Apo A-I. Однако, хотя в этом примере представлена коррекция гена Apo A-I, чтобы проиллюстрировать способы получения зкДНК-вектора для редактирования гена, полезного для использования в описанных в данном документе способах и конструктах, специалисту в данной области техники известно, что можно, как указано выше, использовать зкДНК-векторы для коррекции последовательности любого другого гена, если требуется редактирование гена. Примеры генов для редактирования описаны в данном документе, например, в разделах, озаглавленных «Примеры заболеваний для лечения с помощью зкДНК для редактирования генов» и «Дополнительные заболевания для редактирования генов».
[00726] Индуцированная мегануклеазой коррекция мутированного гена ApoAI человека in vivo
[00727] Используют индуцированную двухцепочечным разрывом (DSB) конверсию генов у млекопитающих in vivo путем прямого введения смеси экспрессионной кассеты мегануклеазы и зкДНК в кровоток. Предуусматривается система, основанная на репарации трансгена Apo A-I человека у мышей in vivo. Аполипопротеин A-I (APO A-I) является основным белковым компонентом липопротеинов высокой плотности (HDL) и играет важную роль в метаболизме HDL. Липопротеины высокой плотности играют главную кардиозащитную роль в качестве основного медиатора обратного транспорта холестерина. Ген Apo A-I экспрессируется в печени, а белок секретируется в кровь. Кроме того, дефицит Apo A-I у человека приводит к преждевременной ишемической болезни сердца. Все вместе, эти критерии делают ген Apo A-I хорошим кандидатом для изучения индуцированной мегануклеазой коррекции генов, включающей зкДНК.
[00728] Трансген: для конструирования трансгена используют геномную последовательность, кодирующую ген Apo A-I человека. Экспрессия гена Apo A-I управляется его собственным минимальным промотором (328 п.о.), который, как было показано, является достаточным для стимуляции экспрессии трансгена в печени (Walsh et al., J. Biol. Chem., 1989, 264, 6488-6494). Вкратце, ген Apo A-I человека получают с помощью ПЦР на геномной ДНК печени человека (Clontech) и клонируют в плазмиду pUC19. Сайт I-SceI, содержащий два стоп-кодона, вставляют с помощью ПЦР в начале подходящего экзона, такого как экзон 4 (Фиг. 17 в US 20120288943 A9). Получают мутированный ген (1-SceI-hApo A-I) для кодирования усеченной формы нативного человеческого APO A-I (80 остатков против 267 аминокислот для АРО A-I дикого типа). Все конструкты секвенируют и сравнивают с последовательностью гена Apo A-I человека.
[00729] Получение трансгенных мышей: Для получения трансгенных родоначальников используют фрагмент геномной ДНК EcoRI/XbaI, несущий мутированный человеческий ген Apo A-I. Делают микроинъекции в оплодотворенные ооциты от скрещивания самцов, нокаутированных по гену apo a-I мыши (мыши WT KO) (The Jackson Laboratory, #002055) и самок B6SJLF1 (Janvier). Трансгенных мышей-родоначальников (F0) идентифицируют с помощью ПЦР и Саузерн-блоттинга геномной ДНК, выделенной из хвоста. Затем F0 спаривают с мышами WT KO, чтобы получить трансгенные линии I-SceI-hApo A-I с нокаутным генетическим фоном по эндогенному мышиному гену apo a-I. Всего было изучено семь независимых трансгенных линий. Молекулярная характеризация интеграции трансгена проводится с помощью экспериментов Саузерн-блоттинга.
[00730] Анализ экспрессии трансгена в каждой трансгенной линии проводят с помощью ОТ-ПЦР на тотальной РНК, выделенной из печени (Trizol Reagent, Invitrogen). Во избежание перекрестной реакции с мышиным транскриптом, используют праймеры, специфичные к трансгенной кДНК I-SceI-hApo A-I человека. Актиновые праймеры используют в качестве внутреннего контроля.
[00731] Гидродинамическая трансдукция in vivo: Трансдукцию трансгенных клеток печени мыши in vivo осуществляют путем гидродинамической инъекции в хвостовую вену. Животным весом от 10 до 20 г вводят инъекцией в PBS кольцевую плазмидную ДНК в объеме, составляющем одну десятую от их массы, менее чем за 10 секунд. Смесь 20 или 50 мкг зкДНК, кодирующей I-SceI, под контролем промотора CMV.
[00732] Анализ генной коррекции: Коррекцию трансгена у мышей после инъекции экспрессионной кассеты I-SceI и матрицы репарации зкДНК анализируют с помощью вложенной ПЦР на тотальной РНК печени, подвергнутой обратной транскрипции с использованием случайных гексамеров. Для обнаружения откорректированного гена, но не нескорректированного, используют наборы праймеров, которые специфически амплифицируют восстановленный трансген. Специфичность достигается за счет использования обратных олигонуклеотидов, охватывающих сайт I-SceI, а прямые были расположены вне матрицы репарации. Актиновые праймеры использовались в качестве внутреннего контроля.
[00733] Результаты:
[00734] В этих экспериментах использовались различные трансгенные линии, несущие одну или несколько копий трансгена I-SceI-hapo A-I. Мышам вводят инъекцией либо смесь вектора, экспрессирующего I-SceI, и зкДНК, либо вектор, несущий как кассету, экспрессирующую I-SceI, так и зкДНК. Репарацию мутированного гена Apo A-I человека контролируют с помощью ОТ-ПЦР на тоттальной РНК печени с использованием праймеров, специально сконструированных для спаривания только с исправленным геном Apo A-I человека. Фрагменты ПЦР специфически визуализируют у трансгенных мышей, которым инъецировали экспрессирующую I-SceI кассету и матрицу репарации зкДНК. Коррекция гена детектируется во всех протестированных трансгенных линиях, содержащих одну или несколько копий трансгена.
[00735] Показано, что индуцированная мегануклеазой конверсия генов может быть использована для проведения хирургии генома in vivo, и что мегануклеазы могут быть использованы в качестве лекарственных средств для такого применения. зкДНК-вектор включает матричную нуклеотидную последовательность, используемую в качестве корректирующей цепи ДНК, которая должна быть встроена после двухцепочечного разрыва, обеспечиваемого мегануклеазой.
ПРИМЕР 9: Трансдукция AAV in vitro первичных гепатоцитов человека
[00736] Чашки для клеточных культур (48-луночные; CM1048; Lifetech) можно приобрести с предварительно нанесенным покрытием, или планшеты (3548; VWR) можно покрыть смесью 250 мл BDMatrigel (BD Biosciences) в 10 мл базальной среды гепатоцитов (CC-3199; Lonza), по 150 мл на лунку. Планшеты инкубируют в течение 1 часа при 37°C. Среда для размораживания/культивирования на чашках готовится путем объединения 18 мл среды InVitroGRO CP (BioreclamationIVT) и 400 мл смеси антибиотиков Torpedo (Celsis In vitro Technologies). После подготовки чашек, гепатоциты человека для высевания (№ партии АКБ; № по каталогу F00995-P) переносят из фазы паров жидкого азота непосредственно в водяную баню с температурой 37°C. Флакон осторожно перемешивают до полного оттаивания клеток. Клетки переносят непосредственно в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую 5 мл предварительно подогретой среды для размораживания/посева. Для полного переноса клеток флакон промывают 1 мл среды для размораживания/посева. Клетки ресуспендируют, осторожно вращая пробирку. Небольшую аликвоту (20 мл) отбирают для подсчета клеток и определения жизнеспособности клеток с использованием раствора трипанового синего 1:5 (25-900-C1; Cellgro). Затем клетки центрифугируют при 75g в течение 5 минут. Супернатант полностью декантируют и клетки ресуспендируют при 13106 клеток/мл. Смесь матригеля аспирируют из лунок, и клетки высевают по 23105 клеток на лунку на 48-луночный планшет. Затем клетки инкубируют в инкубаторе с 5% CO2 при 37°C. Во время трансдукции клетки переносят на культуральную среду гепатоцитов (HCM) для поддержания (базальная среда гепатоцитов, CC-3199, Lonza; HCM, CC-4182, SingleQuots). зкДНК-вектор, как описано в данном документе, и матричную РНК (мРНК) mAlb ZFN [или в экспериментах заменяют на мРНК Cas9 и нРНК mAlb или TALEN или MN, каждый из которых нацелен на тот же сайт, что и мессенджер ZFN; или в экспериментах объединяют экспрессируемые элементы на зкДНК] трансфицируют липофектамином RNAiMAX™ (Lifetech) (или другими подходящими реагентами, как описано в данном документе). Через 24 часа среду заменяют свежей HCM, и делают это ежедневно для обеспечения максимальной жизннеспособности первичных культур гепатоцитов. Для экспериментов, в которых требуется обнаружение hFIX методом ИФА (ELISA), среду иногда не заменяют на протяжении нескольких дней, чтобы обеспечить накопление hFIX в супернатантах.
ПРИМЕР 10. зкДНК-векторы для лечения гемофилии in vivo с использованием системы ZFN.
[00737] Также могут быть сконструированы зкДНК-векторы, содержащие системы редактирования генов на основе нуклеазы цинкового пальца. В иллюстративных целях, описан пример зкДНК-вектора для редактирования гена, касающийся создания зкДНК-вектора, кодирующего нуклеазу цинкового пальца (ZFN) в качестве трансгена нуклеазы, как описано ниже. Однако, хотя в этом Примере представлен ZFN в качестве примера для иллюстрации способов получения зкДНК для редактирования генов, кодирующей нуклеазу, полезную для использования в описанных в данном документе способах и конструктах, специалисту в данной области техники известно, что, как указано выше, можно использовать любую нуклеазу, описанную в данном документе, например, без ограничений: нуклеазы цинкового пальца (ZFN), эффекторные нуклеазы TAL (TALEN), мегануклеазы и CRISPR/Cas9-ферменты и рекомбинантные сайт-специфические производные нуклеазы. Типичные нуклеазы, которые должны кодироваться зкДНК-вектором, описаны в данном документе, например, в разделе, озаглавленном «ДНК-эндонуклеазы», и в его подразделах.
[00738] Используя методы, описанные в предыдущих примерах, нуклеазой, которая должна быть включена в качестве трансгена в зкДНК-вектор, может быть нуклеаза цинкового пальца (ZFN). В качестве одного неограничивающего примера, ZFN-опосредованное нацеливание терапевтических трансгенов на локус альбумина, описанное Sharma et al. (Blood 126: 1777-1784 (2015), может быть осуществлено с использованием зкДНК-векторов по изобретению. Такие зкДНК-векторы позволяют интегрировать человеческий фактор VIII и/или фактор IX в локус альбумина у субъекта-мишени посредством активности кодируемой зкДНК ZFN, нацеленной на этот локус. зкДНК-векторы могут вводиться пациентам с использованием любого из способов доставки, описанных в данном документе. Этот метод обеспечивает достижение долгосрочной экспрессии, например, человеческих факторов VIII и IX (hFVIII и hFIX) в мышиных моделях гемофилии A и B, на терапевтических уровнях.
ПРИМЕР 11. зкДНК-векторы для лечения муковисцидоза in vivo с использованием системы ZFN.
[00739] Подход, аналогичный экспериментам из Примера 10, применяется для индукции редактирования генов в легких, например, у субъекта с муковисцидозом (МВ). В этом эксперименте получают зкДНК для кодирования МВТР дикого типа, который представляет собой ген, мутирующий при МВ. МВТР является большим геном, который не может быть заключен в AAV. зкДНК вмещает значительно большие по размеру вставки нуклеиновой кислоты, чем AAV, и, таким образом, обеспечивает уникальное решение для лечения МВТР. зкДНК-вектор, кодирующий ZFN МВТР-специфичную систему редактирования генов, можно вводить внутривенно или в виде распыляемой композиции для индукции редактирования генов эпителия легких. Как указано выше, в экспериментах МВТР вставляется в эндогенный локус МВТР посредством активности кодируемой ZFN, нацеленной на этот локус, а упаковка нуклеазы и направляющей РНК и использование больших гомологичных плеч может увеличить эффективность и точность редактирования генов.
ПРИМЕР 12. зкДНК-векторы для лечения мышечной дистрофии Дюшенна in vivo .
[00740] Подход, аналогичный экспериментам Примеров 10 и 11, применяется для индукции ZFN-опосредованного редактирования генов в мышечной ткани, например, при мышечной дистрофии Дюшенна, путем коррекции мутаций в гене дистрофина.
[00741] Альтернативно, создаются зкДНК-векторы для кодирования эндонуклеаз (например, ZNF или TALES), которые создают по меньшей мере два ника и/или двухцепочечные разрывы (DSB), фланкирующие акцептор сплайсинга экзона 51 гена дистрофина. Репарация этих ников и/или разрывов приводит к делеции экзона 51. Делеция экзона 51 приводит к исключению экзона 51 из транскриптов дистрофина и, таким образом, корректирует определенные мутации, вызывающие МДД (DMD), например, делецию экзонов 48-50. Большая полезная нагрузка зкДНК-векторов, описанных в данном документе, позволяет осуществлять доставку двух эндонуклеаз (например, двух ZFN, как описано в Ousterout et al. Molecular Therapy 2015 doi: 10.1038/mt.2014.234; которая включена в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме) или РНК-направляемой эндонуклеазы и множественных sgRNAs в мышечную клетку в одном векторе, обеспечивая повышенную эффективность. зкДНК-векторы можно вводить внутривенно или внутримышечно, чтобы вызвать редактирование генов мышечной ткани.
[00742] Кроме того, зкДНК-векторы для редактирования генов, которые экспрессируют только одну последовательность-мишень направляющей РНК (например, с одной или многочисленными копиями), и/или нуклеазу CRISPR/Cas (в цис- или транс-конфигурации), можно использовать для нацеливания на отдельный сайт донора сплайсинга или акцептора сплайсинга в гене DMD. Это приводит к NHEJ, которое вызывает пропуск экзона (например, пропуск экзона 51) и коррекцию гена для экспрессии функционального белка. Множественные направляющие РНК, которые нацелены на ген DMD, были определены в документе US 2016/0201089, в полном объеме включенном в данный документ посредством ссылки, см., например, Примеры 5-11 в нем. Коррекция экспрессии дистрофина может быть проверена на линии миобластных клеток DMD.
ПРИМЕР 13: зкДНК-векторы для редактирования генов для длительной терапевтической экспрессии из геномного гена безопасной гавани.
[00743] зкДНК-векторы для редактирования генов, содержащие домены гомологии, можно использовать для нацеливания на геномные гены безопасной гавани для вставки и экспрессии терапевтических трансгенов. зкДНК-векторы получают в соответствии с Примером 1. Любой локус безопасной гавани может быть использован в качестве мишени, такими безопасными гаванями являются, например, известные неактивные интроны или, альтернативно, активные интроны, близкие к кодирующим последовательностям, которые, как известно, экспрессируют белки с высоким уровнем экспрессии. Вставка в ген безопасной гавани не оказывает существенного негативного воздействия по сравнению с отсутствием вставки. Например, сывороточный альбумин является прототипом мишени, представляющей интерес, из-за его высокого уровня экспрессии и присутствия в клетках печени. Интеграция беспромоторной кассеты, которая несет акцепторный сайт сплайсинга и трансген, в интронные последовательности альбумина будет поддерживать экспрессию и секрецию многих различных белков, поскольку первый экзон альбумина кодирует секреторный пептид, который отщепляется от конечного белкового продукта. По меньшей мере один зкДНК-вектор кодирует пару цинковых пальцев, которая нацелена на интрон 1. Примеры пар цинковых пальцев подробно описаны в Blood (2015) 126 (15): 1777-1784 (например, дополнительная фигура 6, пары A-B и C-D), которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки. Кроме того, из-за отсутствия рестрикции зкДНК-вектора, зкДНК-вектор сконструирован так, чтобы обеспечивать донорную ДНК на том же самом или на другом зкДНК-векторе.
[00744] Пример зкДНК-вектора для редактирования генов описан, в иллюстративных целях, по отношению к созданию зкДНК-вектора, содержащего гомологичные плечи (также называемые доменами гомологии), которые нацелены на безопасную гавань альбумина, и описан ниже. Однако, хотя в этом Примере представлен пример редактирующей гены зкДНК с гомологичними плечами для направленной вставки трансгена (или донорной ДНК) в интрон 1 альбумина, чтобы проиллюстрировать способы создания редактирующей ген зкДНК с гомологичними плечами для направленной вставки трансгена (или донорной ДНК), пригодной для использования в описанных в данном документе способах и конструктах, специалисту в данной области техники ивестно, что, как указано выше, можно использовать гомологичные плечи для любого гена, включая, без ограничений, гены локуса безопасной гавани, например, CCR5 или локуса AAV-safe-habor-S1.
[00745] На Фиг. 16 показана схема, изображающая несколько беспромоторных конструктов для интеграции донорной ДНК в интронные последовательности целевого альбумина, причем такие конструкты будут находиться в том же векторе, что и нуклеаза, или в другом. В одном варианте реализации беспромоторный конструкт зкДНК содержит последовательность вставки/репарации, фланкированную концевыми повторами (например, ITR), и нуклеаза/направляющая РНК обеспечивается с использованием отдельного конструкта (например, второго зкДНК-вектора, мРНК, кодирующей нуклеазу, рекомбинантные нуклеазы, комплекс RNP и т.д.). зкДНК, кодирующую любой трансген, например, FVIII или фактор IX, или GFP, или GFP и neo, без промотора (беспромоторную), получают с геномными гомологичними плечами локуса альбумина (см. Пример 4). В некоторых экспериментах вместо ZFN в зкДНК-вектор встраивают Cas9 или нуклеазу cpf1, и направляющие РНК, предназначенные для нацеливания на области ZFN. В некоторых экспериментах одна и та же зкДНК будет дополнительно модифицирована для экспрессии направляющих РНК (см., например, Фиг. 14, 15 и 16), и в случае использования фермента CAS или cpf1, CRISPR может быть обеспечен либо на той же, либо на другой зкДНК, или на плазмиде. Направляющие РНК конструируют для обеспечения связывания, например, последовательностей-мишеней ZFN, указанных в Sharma et al. Blood (2015) 126 (15): 1777-1784 (например, дополнительная фигура 6, пары A-B и C-D), путем выравнивая последовательности-мишень и идентификации мотива PAM, относящиегося к используемому ферменту CAS (например, saCAS9, или sp CAS 9, или cpf1 и т.д.). Один идеальный центр зкДНК в альбумине для направляющей РНК продемонстрирован на Фиг. 17 Аналогичный сайт используется для человеческого альбумина.
[00746] Систему редактирования генов на основе зкДНК для приведенной в качестве примера вставки в ген альбумина с целью экспрессии приведенного в качестве примера трансгена (например, секретируемого белка, например, фактора IX) тестируют in vitro в первичных гепатоцитах человека (например, гепатоцитах человека фирмы Thermo Scientific) при использовании направляющих РНК, направленных на гены-мишени человека, и в мышиной модели для тестирования in vivo. Например, печень мыши извлекают после системного введения системы зкДНК для измерения уровней мРНК фактора IX и измерения активности фактора IX с использованием хромогенных анализов и антигенов, как описано в Sharma et al., выше. В системах, включающих фактор IX, известные в данной области техники и коммерчески доступные тесты уровней мРНК, анализы активности белка и вестерн-блоттинг являются пригодными для оценки нокина любого желаемого трансгена и для тестирования коррекции как в первичных клетках человека in vitro, так и в мышиных моделях in vivo. Инсерция в локус альбумина позволяет секретировать секретируемые белки, например, в кровь. Уровни трансгена в плазме будут оцениваться. Секреция человеческого фактора VIII и фактора IX будет тестироваться in vivo на животных моделях гемофилии. Специалисту в данной области будет понятно, что любой секретируемый белок может быть «встроен» в альбумин с использованием зкДНК, описанных в данном документе. Неограничивающие примеры включают, α-галактозидазы, идуронат (iduranate)-2-сульфатазы, бета-глюкозидазы, α-L-идуронидазы и т.д., и могут быть проверены на соответствующих животных моделях. В одном варианте реализации изобретения нокины находятся под контролем индуцибельного промотора, такого как Gal1.
[00747] Дополнительно предусматривается, что ограничение скручивания зкДНК-вектора удаляется посредством никазы nCas9 в комбинации с направляющей РНК, нацеленной на сам зкДНК-вектор. Такое высвобождение от ограничения скручивания может улучшить способность одного или нескольких гомологичных плеч в HDR-матрице, присутствующей в зкДНК-векторе. Кроме того, в данном изобретении дополнительно предусматривается, что направляющая РНК, нацеленная на ITR, может использоваться с Cas9 в комбинации с направляющей РНК для хромосомы. Может быть сконструирована одиночная направляющая РНК, которая нацелена как на область ITR (или гомологии) зкДНК-вектора, так и на сайт-мишень в хромосоме. Сайт разреза внутри зкДНК-вектора может быть расположен на одном или обоих концах ДНК-вектора.
ПРИМЕР 14: Типичные примеры целевых генов и онРНК для использования в зкДНК-векторах
[00748] В иллюстративных целях описан пример зкДНК-вектора для редактирования генов, касающийся получения зкДНК-вектора, содержащего sgDNA для нуклеаз ZNF, для редактирования, как описано ниже. Однако, хотя последовательности онРНК для нуклеаз ZNF для редактирования генов представлены в данном Примере в качестве примера для иллюстрации способов получения зкДНК-вектора для редактирования генов, полезного в описанных в данном документе способах и конструктах, специалисту в данной области известно, что можно, как указано выше, использовать онРНК любой нуклеазы, как описано в данном документе, включая онРНК нуклеаз цинкового пальца (ZFN), эффекторных нуклеаз TAL (TALEN), мегануклеаз и CRISPR/Cas9 и модифицированных сайт-специфических нуклеаз, как описано в разделе, озаглавленном «ДНК-эндонуклеазы» и его подразделах.
[00749] Неограничивающие примеры генов-мишеней и пар последовательностей-мишеней для ZNF представлены в Таблице 9; а также последовательности нРНК, основанные на последовательности-мишени ZNF. зкДНК-векторы сконструированы для экспрессии ZNF, которые нацелены на эти последовательности для коррекции и/или модуляции гена-мишени. зкДНК-векторы сконструированы так, чтобы экспрессировать такие типичные нРНК для коррекции гена-мишени с использованием, например, любой системы CRISPR/Cas. Соответственно, в определенных вариантах реализации зкДНК-вектор нацелен на ген, выбранный из Таблицы 9 или Таблицы 10. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит направляющую РНК, выбранную из Таблицы 9. В некоторых вариантах реализации зкДНК-вектор содержит ген, который кодирует ZFN, нацеленный на последовательность-мишень, выбранную из следующей Таблицы 9.
[00750] Таблица 9: онРНК для нацеливания на последовательности-мишени ZFN
Ген-мишень Последовательность-мишень для ZFN Seq ID NO: Последовательность, кодирующая онРНК Seq ID NO:
β-глобин человека GGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGG 608 GTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG 756
″ TGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTG 609 GTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG 756
″ AGAGTCAGGTGCACCATGGTGTCTGTTT 610 GTAACGGCAGACTTCaCCTCAGG 757
″ GTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGT 611 GTAACGGCAGACTTCaCCTCAGG 757
″ ACAGGAGTCAGGTGCACCATGGTGTCTG 612 GTAACGGCAGACTTCaCCTCAGG 757
″ GAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGG 613 GTAACGGCAGACTTCaCCTCAGG 757
″ TAACGGCAGACTTCTCCACAGGAGTCAG 614 GTAACGGCAGACTTCaCCTCAGG 757
″ GCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATG 615 GTAACGGCAGACTTCaCCTCAGG 757
″ GGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGG 608 GTAACGGCAGACTTCaCCTCAGG 757
″ TGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTG 609 GTAACGGCAGACTTCaCCTCAGG 757
″ CACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCT 616 GTAACGGCAGACTTCaCCTCAGG 757
″ GGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTG 617 GTAACGGCAGACTTCaCCTCAGG 757
BCL11A человека ATCCCATGGAGAGGTGGCTGGGAAGGAC 618 GCAATATGAATCCCATGGAGAGG 758
″ ATATTGCAGACAATAACCCCTTTAACCT 619 GCAATATGAATCCCATGGAGAGG 758
″ CATCCCAGGCGTGGGGATTAGAGCTCCA 620 GCATATTCTGCACTCATCCCAGG 759
″ GTGCAGAATATGCCCCGCAGGGTATTTG 621 GCATATTCTGCACTCATCCCAGG 759
KLF1 человека GGGAAGGGGCCCAGGGCGGTCAGTGTGC 622 GGGCCCCTTCCCGGACACACAGG 760
″ ACACACAGGATGACTTCCTCAAGGTGGG 623 GGGCCCCTTCCCGGACACACAGG 760
″ CGCCACCGGGCTCCGGGCCCGAGAAGTT 624 GCAGGTCTGGGGCGCGCCACCGG 761
″ CCCCAGACCTGCGCTCTGGCGCCCAGCG 625 GCAGGTCTGGGGCGCGCCACCGG 761
″ GGCTCGGGGGCCGGGGCTGGAGCCAGGG 626 GGCCCCCGAGCCCAAGGCGCTGG 762
″ AAGGCGCTGGCGCTGCAACCGGTGTACC 627 GGCCCCCGAGCCCAAGGCGCTGG 762
″ TTGCAGCGCCAGCGCCTTGGGCTCGGGG 628 GCGCTGCAACCGGTGTACCCGGG 763
″ CGGTGTACCCGGGGCCCGGCGCCGGCTC 629 GCGCTGCAACCGGTGTACCCGGG 763
Человеческий γ-регуляторный TTGCATTGAGATAGTGTGGGGAAGGGGC 630 GCATTGAGATAGTGTGGGGAAGG 764
″ ATCTGTCTGAAACGGTCCCTGGCTAAAC 631 GCATTGAGATAGTGTGGGGAAGG 764
″ TTTGCATTGAGATAGTGTGGGGAAGGGG 632 GCATTGAGATAGTGTGGGGAAGG 764
″ CTGTCTGAAACGGTCCCTGGCTAAACTC 633 GCATTGAGATAGTGTGGGGAAGG 764
″ TATTTGCATTGAGATAGTGTGGGGAAGG 634 GCATTGAGATAGTGTGGGGAAGG 764
″ CTGTCTGAAACGGTCCCTGGCTAAACTC 633 GCATTGAGATAGTGTGGGGAAGG 764
CTTGACAAGGCAAAC 635 GCTATTGGTCAAGGCAAGGCTGG 765
GTCAAGGCAAGGCTG 636 GCTATTGGTCAAGGCAAGGCTGG 765
CCR5 человека GATGAGGATGAC 637 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ GATGAGGATGAC 637 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ GATGAGGATGAC 637 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ GATGAGGATGAC 637 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ GATGAGGATGAC 637 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ GATGAGGATGAC 637 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ GATGAGGATGAC 637 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ AAACTGCAAAAG 638 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ AAACTGCAAAAG 638 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ AAACTGCAAAAG 638 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ AAACTGCAAAAG 638 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ AAACTGCAAAAG 638 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ AAACTGCAAAAG 638 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ AAACTGCAAAAG 638 GTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGG 766
″ GACAAGCAGCGG 639 GGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGG 767
″ CATCTGCTACTCG 640 GGTCCTGCCGCTGCTTGTCATGG 767
CXCR4 человека ATGACTTGTGGGTGGTTGTGTTCCAGTT 641 GCTTCTACCCCAATGACTTGTGG 768
″ GGGTAGAAGCGGTCACAGATATATCTGT 642 GCTTCTACCCCAATGACTTGTGG 768
″ AGTCAGAGGCCAAGGAAGCTGTTGGCTG 643 GCCTCTGACTGTTGGTGGCGTGG 769
″ TTGGTGGCGTGGACGATGGCCAGGTAGC 644 GCCTCTGACTGTTGGTGGCGTGG 769
″ CAGTTGATGCCGTGGCAAACTGGTACTT 645 GCCGTGGCAAACTGGTACTTTGG 770
″ CCAGAAGGGAAGCGTGATGACAAAGAGG 646 GCCGTGGCAAACTGGTACTTTGG 770
PPP1R12C ACTAGGGACAGGATTG 647 GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG 771
″ CCCCACTGTGGGGTGG 648 GGGGCCACTAGGGACAGGATTGG 771
PPP1R12C ACTAGGGACAGGATTG 647 GTCACCAATCCTGTCCCTAGTGG 772
″ CCCCACTGTGGGGTGG 648 GTCACCAATCCTGTCCCTAGTGG 772
PPP1R12C ACTAGGGACAGGATTG 647 GTGGCCCCACTGTGGGGTGGAGG 773
″ CCCCACTGTGGGGTGG 648 GTGGCCCCACTGTGGGGTGGAGG 773
HPRT мыши и человека ACCCGCAGTCCCAGCGTCGTGGTGAGCC 649 GTCGGCATGACGGGACCGGTCGG 774
″ GCATGACGGGACCGGTCGGCTCGCGGCA 650 GTCGGCATGACGGGACCGGTCGG 774
″ TGATGAAGGAGATGGGAGGCCATCACAT 651 GATGTGATGAAGGAGATGGGAGG 775
″ ATCTCGAGCAAGACGTTCAGTCCTACAG 652 GATGTGATGAAGGAGATGGGAGG 775
″ AAGCACTGAATAGAAATAGTGATAGATC 653 GTGCTTTGATGTAATCCAGCAGG 776
″ ATGTAATCCAGCAGGTCAGCAAAGAATT 654 GTGCTTTGATGTAATCCAGCAGG 776
″ GGCCGGCGCGCGGGCTGACTGCTCAGGA 655 GTCGCCATAACGGAGCCGGCCGG 777
″ GCTCCGTTATGGCGACCCGCAGCCCTGG 656 GTCGCCATAACGGAGCCGGCCGG 777
″ TGCAAAAGGTAGGAAAAGGACCAACCAG 657 GTATTGCAAAAGGTAGGAAAAGG 778
″ ACCCAGATACAAACAATGGATAGAAAAC 658 GTATTGCAAAAGGTAGGAAAAGG 778
″ CTGGGATGAACTCTGGGCAGAATTCACA 659 GCATATCTGGGATGAACTCTGGG 779
″ ATGCAGTCTAAGAATACAGACAGATCAG 660 GCATATCTGGGATGAACTCTGGG 779
″ TGCACAGGGGCTGAAGTTGTCCCACAGG 661 GCCTCCTGGCCATGTGCACAGGG 780
″ TGGCCAGGAGGCTGGTTGCAAACATTTT 662 GCCTCCTGGCCATGTGCACAGGG 780
″ TTGAATGTGATTTGAAAGGTAATTTAGT 663 GAAGCTGATGATTTAAGCTTTGG 781
″ AAGCTGATGATTTAAGCTTTGGCGGTTT 664 GAAGCTGATGATTTAAGCTTTGG 781
″ GTGGGGTAATTGATCCATGTATGCCATT 665 GATCAATTACCCCACCTGGGTGG 782
″ GGGTGGCCAAAGGAACTGCGCGAACCTC 666 GATCAATTACCCCACCTGGGTGG 782
″ ATCAACTGGAGTTGGACTGTAATACCAG 667 GATGTCTTTACAGAGACAAGAGG 783
″ CTTTACAGAGACAAGAGGAATAAAGGAA 668 GATGTCTTTACAGAGACAAGAGG 783
Человеческий альбумин CCTATCCATTGCACTATGCTTTATTTAA 669 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ CCTATCCATTGCACTATGCTTTATTTAA 669 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ CCTATCCATTGCACTATGCTTTATTTAA 669 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ CCTATCCATTGCACTATGCTTTATTTAA 669 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ CCTATCCATTGCACTATGCTTTATTTAA 669 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ CCTATCCATTGCACTATGCTTTATTTAA 669 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ TTTGGGATAGTTATGAATTCAATCTTCA 670 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ TTTGGGATAGTTATGAATTCAATCTTCA 670 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ TTTGGGATAGTTATGAATTCAATCTTCA 670 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ TTTGGGATAGTTATGAATTCAATCTTCA 670 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ CCTGTGCTGTTGATCTCATAAATAGAAC 671 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ CCTGTGCTGTTGATCTCATAAATAGAAC 671 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ TTGTGGTTTTTAAATAAAGCATAGTGCA 672 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ TTGTGGTTTTTAAATAAAGCATAGTGCA 672 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ ACCAAGAAGACAGACTAAAATGAAAATA 673 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
″ CTGTTGATAGACACTAAAAGAGTATTAG 674 GATCAACAGCACAGGTTTTGTGG 784
Человеческий фактор IX TGACACAGTACCTGGCACCATAGTTGTA 675 GTCAGGGTACTAGGGGTATGGGG 785
″ GTACTAGGGGTATGGGGATAAACCAGAC 676 GTCAGGGTACTAGGGGTATGGGG 785
LRRK2 человека GCAAAGATTGCTGACTACGGCATTGCTC 677 GTCAGCAATCTTTGCAATGATGG 786
″ TGATGGCAGCATTGGGATACAGTGTGAA 678 GTCAGCAATCTTTGCAATGATGG 786
″ GCAAAGATTGCTGACTACAGCATTGCTC 679 GTCAGCAATCTTTGCAATGATGG 786
Htt человека GGGGCGATGCTGGGGACGGGGACATTAG 680
″ ACGCTGCGCCGGCGGAGGCGGGGCCGCG 681 GTCTGGGACGCAAGGCGCCGTGG 787
″ AAGGCGCCGTGGGGGCTGCCGGGACGGG 682 GTCTGGGACGCAAGGCGCCGTGG 787
″ AGTCCCCGGAGGCCTCGGGCCGACTCGC 683 GGAGGCCTCGGGCCGACTCGCGG 788
″ GCGCTCAGCAGGTGGTGACCTTGTGGAC 684 GCCGGTGATATGGGCTTCCTGGG 789
″ ATGGTGGGAGAGACTGTGAGGCGGCAGC 685 GAGACTGTGAGGCGGCAGCTGGG 790
″ ATGGCGCTCAGCAGGTGGTGACCTTGTG 686 GAGACTGTGAGGCGGCAGCTGGG 790
″ TGGGAGAGACTGTGAGGCGGCAGCTGGG 687 GAGACTGTGAGGCGGCAGCTGGG 790
RHO человека GCCAGGTAGTACTGTGGGTACTCGAAGG 688 GGCTCAGCCAGGTAGTACTGTGG 791
″ GAGCCATGGCAGTTCTCCATGCTGGCCG 689 GGCTCAGCCAGGTAGTACTGTGG 791
″ CAGTGGGTTCTTGCCGCAGCAGATGGTG 690 GAACCCACTGGGTGACGATGAGG 792
″ GTGACGATGAGGCCTCTGCTACCGTGTC 691 GAACCCACTGGGTGACGATGAGG 792
″ GGGGAGACAGGGCAAGGCTGGCAGAGAG 692 GCCCTGTCTCCCCCATGTCCAGG 793
″ ATGTCCAGGCTGCTGCCTCGGTCCCATT 693 GCCCTGTCTCCCCCATGTCCAGG 793
CFTR ATTAGAAGTGAAGTCTGGAAATAAAACC 694 GGGAGAACTGGAGCCTTCAGAGG 794
″ AGTGATTATGGGAGAACTGGATGTTCACAGTCAGTCCACACGTC 695 GGGAGAACTGGAGCCTTCAGAGG 794
″ CATCATAGGAAACACCAAAGATGATATT 696 GAGGGTAAAATTAAGCACAGTGG 795
″ ATATAGATACAGAAGCGTCATCAAAGCA 697 GAGGGTAAAATTAAGCACAGTGG 795
″ GCTTTGATGACGCTTCTGTATCTATATT 698 GAGGGTAAAATTAAGCACAGTGG 795
″ CCAACTAGAAGAGGTAAGAAACTATGTG 699 GAGGGTAAAATTAAGCACAGTGG 795
″ CCTATGATGAATATAGATACAGAAGCGT 700 GAGGGTAAAATTAAGCACAGTGG 795
″ ACACCAATGATATTTTCTTTAATGGTGC 701 GAGGGTAAAATTAAGCACAGTGG 795
TRAC CTATGGACTTCAAGAGCAACAGTGCTGT 702 GAGAATCAAAATCGGTGAATAGG 796
″ CTCATGTCTAGCACAGTTTTGTCTGTGA 703 GAGAATCAAAATCGGTGAATAGG 796
″ GTGCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGA 704 GAGAATCAAAATCGGTGAATAGG 796
″ TTGCTCTTGAAGTCCATAGACCTCATGT 705 GAGAATCAAAATCGGTGAATAGG 796
″ GCTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACT 706 GACACCTTCTTCCCCAGCCCAGG 797
″ CTGTTGCTCTTGAAGTCCATAGACCTCA 707 GACACCTTCTTCCCCAGCCCAGG 797
″ CTGTGGCCTGGAGCAACAAATCTGACTT 708 GACACCTTCTTCCCCAGCCCAGG 797
″ CTGACTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAA 709 GACACCTTCTTCCCCAGCCCAGG 797
″ TTGTTGCTCCAGGCCACAGCACTGTTGC 710 GACACCTTCTTCCCCAGCCCAGG 797
″ TGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCAT 711 GACACCTTCTTCCCCAGCCCAGG 797
″ AGGAGGATTCGGAACCCAATCACTGACA 712 GATTAAACCCGGCCACTTTCAGG 798
″ GAGGAGGATTCGGAACCCAATCACTGAC 713 GATTAAACCCGGCCACTTTCAGG 798
″ TGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCAT 711 GATTAAACCCGGCCACTTTCAGG 798
TRBC CCGTAGAACTGGACTTGACAGCGGAAGT 714 GCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGG 799
″ TCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGA 715 GCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGG 799
″ TCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGA 715 GCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGG 799
″ TCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGA 715 GCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGG 799
″ TCTCGGAGAATGACGAGTGGACCCAGGA 715 GCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGG 799
″ CCGTAGAACTGGACTTGACAGCGGAAGT 714 GCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGG 799
″ CCGTAGAACTGGACTTGACAGCGGAAGT 714 GCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGG 799
″ CCGTAGAACTGGACTTGACAGCGGAAGT 714 GCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGG 799
″ CCGTAGAACTGGACTTGACAGCGGAAGT 714 GCTGTCAAGTCCAGTTCTACGGG 799
PD1 человека CCAGGGCGCCTGTGGGATCTGCATGCCT 716 GGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGG 800
″ CAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGG 717 GGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGG 800
″ GAACACAGGCACGGCTGAGGGGTCCTCC 718 GTCCACAGAGAACACAGGCACGG 801
″ CTGTGGACTATGGGGAGCTGGATTTCCA 719 GTCCACAGAGAACACAGGCACGG 801
″ CAGTCGTCTGGGCGGTGCT 720 GGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGG 800
CTLA-4 человека ACAGTGCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGG 721 GCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGG 802
″ ACCCGGACCTCAGTGGCTTTGCCTGGAG 722 GCTTCGGCAGGCTGACAGCCAGG 802
″ ACTACCTGGGCATAGGCAACGGAACCCA 723 GTACCCACCGCCATACTACCTGG 803
″ TGGCGGTGGGTACATGAGCTCCACCTTG 724 GTACCCACCGCCATACTACCTGG 803
HLA Cl1: HLA A2 GTATGGCTGCGACGTGGGGTCGGACGGG 725 GCTGCGACGTGGGGTCGGACGGG 804
″ TTATCTGGATGGTGTGAGAACCTGGCCC 726 GCAGCCATACATTATCTGGATGG 805
″ TCCTCTGGACGGTGTGAGAACCTGGCCC 727 GCAGCCATACATCCTCTGGACGG 806
HLA A3 ATGGAGCCGCGGGCGCCGTGGATAGAGC 728 GTGGATAGAGCAGGAGGGGCCGG 807
″ CTGGCTCGCGGCGTCGCTGTCGAACCGC 729 GAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGG 808
HLA B TCCAGGAGCTCAGGTCCTCGTTCAGGGC 730 GGACCTGAGCTCCTGGACCGCGG 809
″ CGGCGGACACCGCGGCTCAGATCACCCA 731 GGACCTGAGCTCCTGGACCGCGG 809
″ AGGTGGATGCCCAGGACGAGCTTTGAGG 732 GATGCCCAGGACGAGCTTTGAGG 810
″ AGGGAGCAGAAGCAGCGCAGCAGCGCCA 733 GCGCTGCTTCTGCTCCCTGGAGG 811
″ CTGGAGGTGGATGCCCAGGACGAGCTTT 734 GCGCTGCTTCTGCTCCCTGGAGG 811
″ GAGCAGAAGCAGCGCAGCAGCGCCACCT 735 GCGCTGCTTCTGCTCCCTGGAGG 811
HLA C CCTCAGTTTCATGGGGATTCAAGGGAAC 736 GGGGATTCAAGGGAACACCCTGG 812
″ CCTAGGAGGTCATGGGCATTTGCCATGC 737 GCAAATGCCCATGACCTCCTAGG 813
″ TCGCGGCGTCGCTGTCGAACCGCACGAA 738 GAGCCAGAGGATGGAGCCGCGGG 808
″ CCAAGAGGGGAGCCGCGGGAGCCGTGGG 739 GGCGCCCGCGGCTCCCCTCTTGG 814
HLA кл.II: DBP2 GAAATAAGGCATACTGGTATTACTAATG 740 GTTCACATCTCCCCCGGGCCTGG 815
″ GAGGAGAGCAGGCCGATTACCTGACCCA 741 GTTCACATCTCCCCCGGGCCTGG 815
DRA TCTCCCAGGGTGGTTCAGTGGCAGAATT 742 GGAGAATGCGGGGGAAAGAGAGG 816
″ GCGGGGGAAAGAGAGGAGGAGAGAAGGA 743 GGAGAATGCGGGGGAAAGAGAGG 816
TAP1 AGAAGGCTGTGGGCTCCTCAGAGAAAAT 744 GCCCACAGCCTTCTGTACTCTGG 817
″ ACTCTGGGGTAGATGGAGAGCAGTACCT 745 GCCCACAGCCTTCTGTACTCTGG 817
TAP2 TTGCGGATCCGGGAGCAGCTTTTCTCCT 746 GTTGATTCGAGACATGGTGTAGG 818
″ TTGATTCGAGACATGGTGTAGGTGAAGC 747 GTTGATTCGAGACATGGTGTAGG 818
Тапасин CCACAGCCAGAGCCTCAGCAGGAGCCTG 748 GCTCTGGCTGTGGTCGCAAGAGG 819
″ CGCAAGAGGCTGGAGAGGCTGAGGACTG 749 GCTCTGGCTGTGGTCGCAAGAGG 819
″ CTGGATGGGGCTTGGCTGATGGTCAGCA 750 GCAGAACTGCCCGCGGGCCCTGG 820
″ GCCCGCGGGCAGTTCTGCGCGGGGGTCA 751 GCAGAACTGCCCGCGGGCCCTGG 820
CIITA GCTCCCAGGCAGCGGGCGGGAGGCTGGA 752 GCTGCCTGGGAGCCCTACTCGGG 821
″ CTACTCGGGCCATCGGCGGCTGCCTCGG 753 GCTGCCTGGGAGCCCTACTCGGG 821
RFX5 TTGATGTCAGGGAAGATCTCTCTGATGA 754 GCCTTCGAGCTTTGATGTCAGGG 822
″ GCTCGAAGGCTTGGTGGCCGGGGCCAGT 755 GCCTTCGAGCTTTGATGTCAGGG 822
[00751] Таблица 10: Типичные примеры генов для нацеливания (см., например, US 2015/0056705, который в полном объеме включен в настоящее описание посредством ссылки)
Название гена расположение Репрезентативный доступ (кДНК) RefSeq
HBB chr11: 5246696-5248301 (NM_000518)
BCL11A chr2: 60684329-60780633 (NM_022893)
KLF1 chr19: 12995237-12998017 (NM_006563)
HBG1 chr11: 5269502-5271087 (NM_000559)
CCR5 chr3: 46411633-46417697 (NM_000579)
CXCR4 chr2: 136871919-136873813 (NM_001008540)
PPP1R12C chr19: 55602281-55628968 (NM_017607)
HPRT chrX: 133594175-133634698 (NM_000194)
HPRT мыши chrX: 52988078-53021660 (NM_013556)
(сборка GRCm38/mm10)
ALB chr4: 74269972-74287129 (NM_000477)
Фактор VIII chrX: 154064064-154250998 (NM_000132.3)
Фактор IX chrX: 138612895-138645617 (NM_000133)
LRRK2 chr12: 40618813-40763086 (NM_198578)
Htt chr4: 3076237-3245687 (NM_002111)
RHO chr3: 129247482-129254187 (NM_000539)
CFTR chr7: 117120017-117308718 (NM_000492)
TCRA chr6: 42883727-42893575 (NM_001243168)
TCRB chr7: 142197572-142198055 L36092.2
PD-1 chr2: 242792033-242795132 (NM_005018)
CTLA-4 chr2: 204732511-204738683 (NM_001037631)
HLA-A chr6: 29910247-29912868 (NM_002116)
HLA-B chr6: 31236526-31239913 NM_005514.6
HLA-C chr6: 31236526-31239125 (NM_001243042)
HLA-DPA chr6: 33032346-33048555 (NM_033554.3)
HLA-DQ chr6: 32605183-32611429 (NM_002122)
HLA-DRA chr6_ssto_hap7: 3754283- (NM_019111)
3759493
LMP7 chr6_dbb_hap3: 4089872- (X66401)
4093057
Тапасин chr6: 33271410-33282164 (NM_172208)
RFX5 chr1: 151313116-151319769 (NM_001025603)
CIITA chr16: 10971055-11002744 (NM_000246)
TAP1 chr6: 32812986-32821748 (NM_000593)
TAP2 chr6: 32793187-32806547 (NM_000544)
TAPBP chr6: 33267472-33282164
DMD chrX: 31137345-33229673 (NM_004006)
RFX5 chr1: 151313116-151319769 (NM_000449)
B. napus FAD3 См. публикацию PCT JN992612
WO2014/039684
B. napus FAD2 См. публикацию PCT JN992609
WO2014/039692
FAD2 сои См. US20140090116
Zea mays ZP15 См. пат. США № 8329986 GBWI-61522 (MaizeCyc)
B-кетоацил АСР См. пат. США № 8592645
синтаза II
(KASII)
MDH томата См. US 20130326725 AY725474
B. napus EPSPS См. пат. США № 8399218
паралоги C + D
Паралог D См. пат. США № 8399218
Паралог A + B См. пат. США № 8399218
PPP1R12C chr19: 55602840-55624858 (NM_017607)
(AAVS1)
GR 5: 142646254-142783254 (NM_000176)
IL2RG chrX: 70327254-70331481 (NM_000206)
SFTPB chr2: 85884440-85895374 (NM_198843)
ПРИМЕР 15: зкДНК-векторы для редактирования генов для конструирования Т-клеток
[00752] Как раскрыто в данном документе, зкДНК-векторы для редактирования генов, описанные в данном документе, могут использоваться для редактирования, репарации и/или нокаутирования генов в геноме любой клетки, например, в Т-клетке. В иллюстративных целях описан пример зкДНК-вектора для редактирования генов, касающийся создания зкДНК-вектора для редактирования любого из генов CXCR4, CCR5, PD-1 в Т-клетках, как описано ниже. Однако, хотя нацеливание на гены CXCR4, CCR5 или PD-1 приведено в качестве примера в данном Примере, чтобы проиллюстрировать способы получения зкДНК-вектора для редактирования генов, полезные в способах и конструктах, описанных в данном документе, специалисту в данной области техники известно, что можно, как указано выше, использовать любой ген, для которого требуется редактирование гена, например, как описано в данном документе в разделах, озаглавленных «Примеры заболеваний для лечения с помощью зкДНК для редактирования генов» и «Дополнительные заболевания для редактирования гена». Кроме того, хотя геном Т-клеток модифицируется в данном иллюстративном примере, специалисту в данной области известно, что любая клетка может быть модифицирована ex vivo или in vivo, например, любая клетка, как описано в разделе XII.A данного документа, озаглавленном «Клетки-хозяева». Кроме того, хотя в этом иллюстративном примере указано, что геномная ДНК модифицируется, предполагается, что зкДНК-векторы также могут быть модифицированы рядовым специалистом с целью модификации митохондриальной ДНК (мтДНК), например, для кодирования функции mtZFN и mitoTALEN или митохондриально-адаптированной платформы CRISPR/Cas9, как описано в Maeder, et al. "Genome-editing technologies for gene and cell therapy." Molecular Therapy 24.3 (2016): 430-446 и Gammage PA, et al. Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized. Trends Genet. 2018;34(2):101-110.
[00753] Любой терапевтически релевантный ген может выступать в роли мишени (например, CXCR4 или CCR5, корецептор для проникновения ВИЧ) и может быть удален, отредактирован, восстановлен или заменен (в случае CXCR4, например, для предотвращения проникновения ВИЧ). В еще одном неограничивающем примере PD-1, медиатор истощения Т-клеток, может быть удален. Абляция генов-мишеней осуществляется с матричной последовательностью нуклеиновой кислоты, например, донорной HDR-матрицы, или без нее. Использование одиночной направляющей РНК (онРНК) и соответствующей нуклеазы в отсутствие матрицы HDR приводит к негомологичному соединению концов (NHEJ).
[00754] Может производиться нацеливание на любой терапевтически релевантный локус, такими локусами-мишенями являются, например, известные регуляторы истощения Т-клеток, вирусные корецепторы и т.п. зкДНК-векторы для редактирования генов могут содержать любую эндонуклеазу, как описано в данном документе, включая РНК-направляемые эндонуклеазы, например, CRISPR/Cas9 и другие эндонуклеазы, включая нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), эффекторные нуклеазы TAL (TALEN), мегануклеазы и сконструированные сайт-специфические производные нуклеазы. как описано в данном документе, например, в разделе, озаглавленном «ДНК-эндонуклеазы», и в его подразделах. Примеры подходящих эндонуклеаз и матричных нуклеиновые кислоты для HDR CXCR4 и PD-1 подробно описаны в Schumann et al., PNAS (2015) 112(33):10437-10442, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки (см., например, Рис. 1-4 в Schumann et al.).
[00755] Кроме того, из-за отсутствия для зкДНК ограничений по размеру зкДНК-вектор может быть сконструирован так, чтобы обеспечивать донорную ДНК и/или молекулы для редактирования генов в одном и том же зкДНК-векторе. Альтернативно, донорная ДНК и/или молекулы для редактирования генов могут обеспечиваться одним или несколькими различными зкДНК-векторами.
[00756] зкДНК, кодирующая матричные нуклеиновые кислоты, подходящие для абляции локуса-мишени, например, разрушения промотора или вставки преждевременного стоп-кодона или миссенс-мутации, будут получены с геномными гомологичными плечами локуса-мишени (см., например, Пример 10). Таким образом, в модифицированной клетке ген будет усечен или подвергнут сайленсингу. В некоторых экспериментах нуклеаза Cas9 или cpf1 будет встроена в тот же или в другой зкДНК-вектор. В некоторых экспериментах зкДНК будет дополнительно модифицирован для экспрессии направляющих РНК (см., например, Фиг. 12, 15, 16), и при использовании фермента Cas или cpf1, он может обеспечиваться той же или другой зкДНК, либо плазмидой, или мРНК, или рекомбинантным белком. Направляющие РНК были сконструированы для связывания, например, последовательностей-мишеней, в PNAS (2015) 112 (33): 10437-10442, путем выравнивания последовательности-мишени и идентификации мотива PAM, относящегося к используемому ферменту Cas (например, saCas9, или spCas9, или cpf1 и т.д.).
[00757] В некоторых экспериментах направляющие РНК будут нацелены на другие известные области последовательности. Множественные последовательности онРНК, которые связывают известные области-мишени, описаны в таблицах 1-2 патентной публикации США 2015/0056705, которая в полном объеме включена в настоящее описание посредством ссылки и включает, например, последовательности нРНК для человеческого бета-глобина, BCLIIA человека, KLF1 человека, человеческого CCR5, человеческого CXCR4, PPP1R12C, HPRT мыши и человека, человеческого альбумина, человеческого фактора IX, человеческого фактора VIII, человеческого LRRK2, человеческого Htt, человеческого RH, МВТР, TRAC, TRBC, человеческого PD1, человеческого CTLA-4, HLA c11, HLA A2, HLA A3, HLA B, HLA C, HLA c1. II DBp2. DRA, Tap 1 и 2, тапасина, DMD, RFX5 и др.).
[00758] зкДНК-векторы будут доставляться в Т-клетки ex vivo, но данное изобретение также предусматривает системную доставку. В некоторых экспериментах вместо нуклеазы Cas9 или cpf1 в тот же или другой зкДНК-вектор будут встроены нуклеаза цинкового пальца, TALEN или megaTAL.
Пример 16. Редактирование генов ex vivo для лечения синдрома Вискотта-Олдрича (WAS).
[00759] Редактирование генов ex vivo с использованием AAV является сложной задачей, так как AAV является единственным источником матрицы гомологичной репарации или матрицы донорной ДНК. Векторы AAV содержат инкапсидированную ДНК, что ограничивает размер гомологичных плеч, которые могут быть доставлены. Кроме того, сложность и высокая стоимость, связанные с AAV, ограничивают его полезность в отношении редактирования генов ex vivo. Кроме того, чтобы индуцировать достаточную направленную гомологию репарацию в культивируемых клетках, необходимы векторы AAV с очень высокими титрами.
[00760] зкДНК-векторы, как описано в данном документе, могут преодолеть многие из проблем, связанных с доставкой донорной матрицы ДНК, опосредованной вектором AAV. Например, зкДНК-векторы позволяют использовать донорные шаблоны, имеющие более длинные гомологичные плечи, чем используемые с обычными векторами AAV, что обеспечивает преимущество, заключающееся в более эффективном редактировании генов с более высокой точностью и меньшими нецелевыми эффектами.
[00761] В иллюстративных целях описан пример зкДНК-вектора для редактирования гена, касающийся создания зкДНК-вектора для редактирования генов WAS стволовых клеток CD34+ ex vivo, как описано ниже. Однако, хотя в данном Примере представлено нацеливание на ген WAS для иллюстрации способов создания зкДНК-вектора для редактирования гена, полезного в описанных в данном документе способах и конструктах, специалисту в данной области известно, что можно, как указано выше, использовать любой ген, когда требуется редактирование генов. Примеры генов для редактирования описаны в данном документе, например, в разделах, озаглавленных «Примеры заболеваний для лечения с помощью зкДНК для редактирования генов» и «Дополнительные заболевания для редактирования генов». Кроме того, хотя геном гематопоэтических CD34+ клеток модифицирован в этом иллюстративном примере, специалисту в данной области известно, что любая клетка, включая соматические клетки, культивируемые клетки, а также стволовые клетки и/или плюрипотентные клетки, может быть модифицирована ex vivo или in vivo, например, любая клетка, как описано в разделе XII.A данного документа, озаглавленном «Клетки-хозяева».
[00762] Эксперименты ex vivo будут проводиться с использованием человеческих CD34+ гемопоэтических стволовых клеток для проверки способности зкДНК-вектора, кодирующего открытую рамку считывания (ORF) гена синдрома Вискотта-Олдрича (WAS), осуществлять редактирование генов в культуре. Пример эксперимента, включающего пять различных лечебных групп, описан ниже.
[00763] Сначала, зкДНК-векторы будут использоваться для доставки конструкта, который в настоящее время доставляется с использованием векторов AAV, и который кодирует ORF WAS (миниген, только экзоны) и области гомологии. Эффективность результатов редактирования генов будет сравниваться с эффективностью, достигнутой с использованием AAV (30-40%), и позволит определять, может ли доставка на основе зкДНК-вектора соответствовать или превышать эффективность AAV-опосредованной доставки того же самого минигена.
[00764] Затем зкДНК-векторы будут использоваться для доставки минигена WAS (только экзоны) с сохранением интрона-1. Было обнаружено, что интрон-1 является критическим для экспрессии белка WAS, но интрон-1 превышает ограничения по размеру для векторов AAV. Таким образом, успешная доставка минигена WAS + интрон-1 продемонстрирует, что зкДНК-векторы превосходят векторы AAV по показателям редактирования генов, адресной доставки минигена WAS + интрона-1 и успешной экспрессии белка WAS.
[00765] Далее предполагается, что зкДНК-векторы, содержащие миниген ORF WAS или миниген WAS + интрон-1, будут сконструированы с более длинными гомологичними плечами, чтобы оценить, влияет ли увеличенная длина таких гомологичных плеч на повышенную точность или неточность редактирования генов.
[00766] Предполагается, что затем зкДНК-векторы, содержащие миниген ORF WAS или миниген WAS + интрон-1, будут сконструированы так, чтобы они включали сайт расщепления Cas9 на зкДНК, для определения того, повышает ли присутствие сайта Cas9 эффективность зкДНК, выступающей в роли донорной матрицы, путем высвобождения напряжения скручивания зкДНК-вектора. Наконец, зкДНК-векторы, кодирующие репортерные конструкты, такие как зкДНК-GFP/зкДНК-LUC, могут быть сконструированы для оптимизации и/или максимизации эффективности электропорации зкДНК-векторов в клетки ex vivo.
ПРИМЕР 17: Пример метода (методов) рабочего процесса редактирования генов в культивируемых клетках
[00767] В другом примере способы, изображенные на Фиг. 19, используются в данном документе для осуществления редактирования генов в культивируемых клетках. Например, любой из кДНК-векторов по изобретению может быть доставлен способами, описанными в заявке и примерах, в культивируемую клетку, такую как культура клеток печени. Затем клетки инкубируют в течение времени и в условиях, достаточных для осуществления редактирования генов с использованием либо пути NHEJ (в случае, когда вектор зкДНК не содержит HDR-матрицы), либо пути HDR (в случае, когда зкДНК вектор включает матрицу HDR). Чтобы определить, успешно ли прошло редактирование гена, клетки можно проанализировать на экспрессию донорного матричного белка, например, фактора IX (FIX), или путем глубокого секвенирования геномной ДНК-мишени, чтобы определить, произошло ли успешное включение донорной матрицы. Дополнительные соображения, касающиеся данного примера, изложены ниже.
[00768] Конструирование направляющей РНК. Любой метод, известный в данной области техники, может использоваться для конструирования и/или синтеза специализированной направляющей РНК (нРНК), имеющей гомологию с сайтом редактирования гена-мишени, для включения в зкДНК-вектор по изобретению. В данном документе специально предусматривается, что специализированная нРНК может быть сконструирована и синтезирована посредством различных поставщиков, например, ThermoFisher.
[00769] Первичные культуры клеток. В некоторых вариантах реализации может быть желательным нацеливание на сайт редактирования генов в клетке печени, такой как гепатоцит. Это может быть достигнуто, например, путем использования сайта редактирования гена в гене альбумина. Специалисту в данной области понятно, что успешное выделение и рост первичных клеток, включая клетки печени, может быть затруднительным и может потребовать оптимизации процедур оттаивания и посева, нанесения покрытия на чашки, Matrigel™ и/или ростовой среды (например, базальной среды гепатоцитов). В одном варианте реализации способы культивирования клеток печени являются производными от способов, известных в данной области, например, Sharma Blood (2017) (выше), содержание которой в полном объеме включено в данный документ посредством ссылки. Условия роста первичных клеток печени могут быть оптимизированы с использованием реагентов, например, поставляемых фирмой ThermoFisher, таких как среда для оттаивания, среда для посева, среда для инкубации и матричные реагенты (GelTrex™, MatriGel™).
[00770] HDR-матрица зкДНК. В неограничивающем примере зкДНК-вектор, содержащий матрицу HDR, сконструирован, как изображено на Фиг. 19. Например, зкДНК-вектор может содержать 5'-гомологичное плечо желаемой длины и 3'-гомологичное плечо желаемой длины. Чтобы исключить неспецифические эффекты, в данном документе специально предусматривается, что контроли зкДНК, включающие (i) 5'-гомологичное плечо отдельно, с донорной матричной последовательностью или без нее, или (ii) 3'-гомологичное плечо отдельно, донорной матричной последовательностью или без нее, могут использоваться в по существу аналогичном протоколе в качестве зкДНК-вектора, содержащего полную матрицу HDR (например, 5'-гомологичное плечо, последовательность донорной матрицы и 3'-гомологичное плечо). Такие контроли позволят специалисту в данной области техники распознавать неспецифические или нецелевые эффекты, если таковые имеются, которые могут быть созданы выделенными гомологичними плечами.
Пример 18. Пример метода (методов) рабочего процесса для редактирования генов in vivo у субъекта.
[00771] Способы и конструкты зкДНК, описанные в Примере 17, могут быть адаптированы для проведения редактирования генов в многоклеточном организме, например, животном или человеке. зкДНК-векторы могут быть доставлены в эмбриональные стволовые клетки организма (например, мыши) любым удобным способом. В некоторых примерах организм не является человеческим организмом. Организм может быть грызуном или животным (например, приматом, не являющимся человеком) для создания животной модели заболевания. Полученные клетки подвергают скринингу для обеспечения присутствия надлежащим образом рекомбинированного трансгена. Положительные клетки могут быть имплантированы в организмы дикого типа (например, мышам и грызунам, отличным от человека), и полученное потомство подвергается скринингу на присутствие трансгена. Поскольку целевые мутации могут быть выполнены в представляющем интерес гене любого штамма организма (например, мышей), обратное скрещивание потомства не требуется для получения трансгенного потомства на желаемом генетическом фоне.
[00772] В иллюстративных целях в данном примере обсуждается использование примера зкДНК-вектора для редактирования генов, касающегося создания зкДНК-вектора для редактирования клеток с целью создания животной модели. Однако, хотя модификация животных (например, мыши) представлена в данном Примере в качестве примера, иллюстрирующего способы использования зкДНК-вектора для редактирования генов, как описано в данном документе, специалисту в данной области техники известно, что, как указано выше, можно использовать зкДНК-вектор на клетках любого организма или субъекта, для которых требуется редактирование генов. Примеры субъектов для редактирования генов описаны в определении «субъекта» в данном документе.
ССЫЛКИ НА ИСТОЧНИКИ
[00773] Все публикации и ссылки, включая, без ограничений, патенты и патентные заявки, упоминаемые в данном описании и примерах, приведенных в данном документе, включены посредством ссылки в полном объеме, как если бы для каждой отдельной публикации или ссылки было специально и индивидуально указано про ее включение посредством ссылки в данный документ явным образом. Любая патентная заявка, в отношении которой данная заявка испрашивает приоритет, также включена в данный документ посредством ссылки способом, описанным выше для публикаций и ссылок.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ДЖЕНЕРЕЙШЕН БИО КО.
<120> РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДНК С
ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)
<130> 080170-090470WOPT
<140>
<141>
<150> 62/607,069
<151> 2017-12-18
<150> 62/595,328
<151> 2017-12-06
<160> 841
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 141
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 1
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc
120
gagcgcgcag ctgcctgcag g
141
<210> 2
<211> 130
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 2
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc
120
tgcctgcagg
130
<210> 3
<211> 1923
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 3
tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta
60
ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc
120
aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg
180
gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc
240
gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat
300
agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc
360
ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga
420
cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg
480
gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg
540
cttcactctc cccatctccc ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta
600
attattttgt gcagcgatgg gggcgggggg gggggggggg cgcgcgccag gcggggcggg
660
gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg gcggcagcca atcagagcgg
720
cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg cggcggccct ataaaaagcg
780
aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgac gctgccttcg ccccgtgccc cgctccgccg
840
ccgcctcgcg ccgcccgccc cggctctgac tgaccgcgtt actcccacag gtgagcgggc
900
gggacggccc ttctcctccg ggctgtaatt agcgcttggt ttaatgacgg cttgtttctt
960
ttctgtggct gcgtgaaagc cttgaggggc tccgggaggg ccctttgtgc gggggggagc
1020
ggctcggggg gtgcgtgcgt gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg cccgcgctgc
1080
ccggcggctg tgagcgctgc gggcgcggcg cggggctttg tgcgctccgc agtgtgcgcg
1140
aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg gggctgcgag gggaacaaag
1200
gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg tgtgggcgcg gcggtcgggc
1260
tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg
1320
gggctccgta cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg
1380
ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc
1440
ggcccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttatgg
1500
taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct
1560
gggaggcgcc gccgcacccc ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg
1620
aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc
1680
cagcctcggg gctgtccgcg gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg
1740
ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt tttagccttc
1800
ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcatttgtcg
1860
acagaattcc tcgaagatcc gaaggggttc aagcttggca ttccggtact gttggtaaag
1920
cca
1923
<210> 4
<211> 1272
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 4
aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc
60
ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc
120
tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc
180
cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc
240
tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt
300
ggtttaggta gtgtgagagg gtccgggttc aaaaccactt gctgggtggg gagtcgtcag
360
taagtggcta tgccccgacc ccgaagcctg tttccccatc tgtacaatgg aaatgataaa
420
gacgcccatc tgatagggtt tttgtggcaa ataaacattt ggtttttttg ttttgttttg
480
ttttgttttt tgagatggag gtttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag tgacacaatc
540
tcatctcacc acaaccttcc cctgcctcag cctcccaagt agctgggatt acaagcatgt
600
gccaccacac ctggctaatt ttctattttt agtagagacg ggtttctcca tgttggtcag
660
cctcagcctc ccaagtaact gggattacag gcctgtgcca ccacacccgg ctaatttttt
720
ctatttttga cagggacggg gtttcaccat gttggtcagg ctggtctaga ggtaccggat
780
cttgctacca gtggaacagc cactaaggat tctgcagtga gagcagaggg ccagctaagt
840
ggtactctcc cagagactgt ctgactcacg ccaccccctc caccttggac acaggacgct
900
gtggtttctg agccaggtac aatgactcct ttcggtaagt gcagtggaag ctgtacactg
960
cccaggcaaa gcgtccgggc agcgtaggcg ggcgactcag atcccagcca gtggacttag
1020
cccctgtttg ctcctccgat aactggggtg accttggtta atattcacca gcagcctccc
1080
ccgttgcccc tctggatcca ctgcttaaat acggacgagg acagggccct gtctcctcag
1140
cttcaggcac caccactgac ctgggacagt gaatccggac tctaaggtaa atataaaatt
1200
tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt tctctctttt agattccaac
1260
ctttggaact ga
1272
<210> 5
<211> 547
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 5
ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc
60
tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc
120
cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag
180
gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag
240
gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct
300
gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt
360
gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca
420
ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa
480
gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg
540
gaactga
547
<210> 6
<211> 1179
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 6
ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca cagtccccga gaagttgggg
60
ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt
120
gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca
180
gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg ccagaacaca ggtaagtgcc
240
gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg gcccttgcgt gccttgaatt
300
acttccacct ggctgcagta cgtgattctt gatcccgagc ttcgggttgg aagtgggtgg
360
gagagttcga ggccttgcgc ttaaggagcc ccttcgcctc gtgcttgagt tgaggcctgg
420
cctgggcgct ggggccgccg cgtgcgaatc tggtggcacc ttcgcgcctg tctcgctgct
480
ttcgataagt ctctagccat ttaaaatttt tgatgacctg ctgcgacgct ttttttctgg
540
caagatagtc ttgtaaatgc gggccaagat ctgcacactg gtatttcggt ttttggggcc
600
gcgggcggcg acggggcccg tgcgtcccag cgcacatgtt cggcgaggcg gggcctgcga
660
gcgcggccac cgagaatcgg acgggggtag tctcaagctg gccggcctgc tctggtgcct
720
ggtctcgcgc cgccgtgtat cgccccgccc tgggcggcaa ggctggcccg gtcggcacca
780
gttgcgtgag cggaaagatg gccgcttccc ggccctgctg cagggagctc aaaatggagg
840
acgcggcgct cgggagagcg ggcgggtgag tcacccacac aaaggaaaag ggcctttccg
900
tcctcagccg tcgcttcatg tgactccacg gagtaccggg cgccgtccag gcacctcgat
960
tagttctcga gcttttggag tacgtcgtct ttaggttggg gggaggggtt ttatgcgatg
1020
gagtttcccc acactgagtg ggtggagact gaagttaggc cagcttggca cttgatgtaa
1080
ttctccttgg aatttgccct ttttgagttt ggatcttggt tcattctcaa gcctcagaca
1140
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtga
1179
<210> 7
<211> 8
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 7
gtttaaac
8
<210> 8
<211> 581
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 8
gagcatctta ccgccattta ttcccatatt tgttctgttt ttcttgattt gggtatacat
60
ttaaatgtta ataaaacaaa atggtggggc aatcatttac atttttaggg atatgtaatt
120
actagttcag gtgtattgcc acaagacaaa catgttaaga aactttcccg ttatttacgc
180
tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tgatattctt
240
aactatgttg ctccttttac gctgtgtgga tatgctgctt tatagcctct gtatctagct
300
attgcttccc gtacggcttt cgttttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt
360
ttagaggagt tgtggcccgt tgtccgtcaa cgtggcgtgg tgtgctctgt gtttgctgac
420
gcaaccccca ctggctgggg cattgccacc acctgtcaac tcctttctgg gactttcgct
480
ttccccctcc cgatcgccac ggcagaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca
540
ggggctaggt tgctgggcac tgataattcc gtggtgttgt c
581
<210> 9
<211> 225
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 9
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct
60
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct
120
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg
180
ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc
225
<210> 10
<211> 213
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 10
taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta
60
tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag
120
ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt
180
tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg gta
213
<210> 11
<211> 1260
<212> ДНК
<213> Аденоассоциированный ввирус - 2
<400> 11
atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag
60
gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag
120
gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg
180
gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta
240
aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc
300
ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg
360
gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt
420
cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc
480
aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa
540
tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg
600
tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg
660
atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag
720
gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc
780
tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag
840
cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc
900
aactacgcag acaggtacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg
960
tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga
1020
cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa
1080
aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc
1140
actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataaatgatt
1200
taaatcaggt atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga
1260
<210> 12
<211> 1932
<212> ДНК
<213> Аденоассоциированный ввирус - 2
<400> 12
atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc
60
ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat
120
tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag
180
cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg
240
caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg
300
aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt
360
taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc
420
gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa
480
acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg
540
aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag
600
gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact
660
tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag
720
cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg
780
tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc
840
cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa
900
attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc
960
acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag
1020
accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc
1080
aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg
1140
aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc
1200
gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc
1260
aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg
1320
ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag
1380
gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg
1440
gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca
1500
gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg
1560
gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg
1620
aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc
1680
ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt
1740
tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg
1800
ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa
1860
caataaatga tttaaatcag gtatggctgc cgatggttat cttccagatt ggctcgagga
1920
cactctctct ga
1932
<210> 13
<211> 1876
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 13
cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg
60
gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt
120
gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga
180
gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct
240
tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac
300
caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat
360
tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac
420
cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt
480
gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag
540
cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc
600
gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag
660
atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac
720
ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc
780
caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac
840
taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg
900
gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct
960
gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac
1020
taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt
1080
aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg
1140
ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag
1200
caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat
1260
cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca
1320
ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga
1380
ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt
1440
ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc
1500
cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac
1560
gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca
1620
cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc
1680
aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc
1740
tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat
1800
gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg
1860
catctttgaa caataa
1876
<210> 14
<211> 1194
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 14
atggagctgg tcgggtggct cgtggacaag gggattacct cggagaagca gtggatccag
60
gaggaccagg cctcatacat ctccttcaat gcggcctcca actcgcggtc ccaaatcaag
120
gctgccttgg acaatgcggg aaagattatg agcctgacta aaaccgcccc cgactacctg
180
gtgggccagc agcccgtgga ggacatttcc agcaatcgga tttataaaat tttggaacta
240
aacgggtacg atccccaata tgcggcttcc gtctttctgg gatgggccac gaaaaagttc
300
ggcaagagga acaccatctg gctgtttggg cctgcaacta ccgggaagac caacatcgcg
360
gaggccatag cccacactgt gcccttctac gggtgcgtaa actggaccaa tgagaacttt
420
cccttcaacg actgtgtcga caagatggtg atctggtggg aggaggggaa gatgaccgcc
480
aaggtcgtgg agtcggccaa agccattctc ggaggaagca aggtgcgcgt ggaccagaaa
540
tgcaagtcct cggcccagat agacccgact cccgtgatcg tcacctccaa caccaacatg
600
tgcgccgtga ttgacgggaa ctcaacgacc ttcgaacacc agcagccgtt gcaagaccgg
660
atgttcaaat ttgaactcac ccgccgtctg gatcatgact ttgggaaggt caccaagcag
720
gaagtcaaag actttttccg gtgggcaaag gatcacgtgg ttgaggtgga gcatgaattc
780
tacgtcaaaa agggtggagc caagaaaaga cccgccccca gtgacgcaga tataagtgag
840
cccaaacggg tgcgcgagtc agttgcgcag ccatcgacgt cagacgcgga agcttcgatc
900
aactacgcag accgctacca aaacaaatgt tctcgtcacg tgggcatgaa tctgatgctg
960
tttccctgca gacaatgcga gagaatgaat cagaattcaa atatctgctt cactcacgga
1020
cagaaagact gtttagagtg ctttcccgtg tcagaatctc aacccgtttc tgtcgtcaaa
1080
aaggcgtatc agaaactgtg ctacattcat catatcatgg gaaaggtgcc agacgcttgc
1140
actgcctgcg atctggtcaa tgtggatttg gatgactgca tctttgaaca ataa
1194
<210> 15
<211> 141
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 15
aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt
60
cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc
120
tgcggcgcgc gcagcacctt t
141
<210> 16
<211> 556
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 16
ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc
60
tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc
120
cactcgaccc cttggaattt cggtggagag gagcagaggt tgtcctggcg tggtttaggt
180
agtgtgagag gggaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc
240
aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt
300
ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc
360
ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacactcg agggccctgt ctcctcagct
420
tcaggcacca ccactgacct gggacagtga atccggacat cgattctaag gtaaatataa
480
aatttttaag tgtataattt gttaaactac tgattctaat tgtttctctc ttttagattc
540
caacctttgg aactga
556
<210> 17
<211> 80
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 17
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct
60
cagtgagcga gcgagcgcgc
80
<210> 18
<211> 241
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 18
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag
60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga
120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat
180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga
240
c
241
<210> 19
<211> 215
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 19
gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa
60
cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc
120
tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg
180
gatttgggaa tcgtataaga actgtatgag accac
215
<210> 20
<211> 150
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 20
ataaacgata acgccgttgg tggcgtgagg catgtaaaag gttacatcat tatcttgttc
60
gccatccggt tggtataaat agacgttcat gttggttttt gtttcagttg caagttggct
120
gcggcgcgcg cagcaccttt gcggccatct
150
<210> 21
<211> 546
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 21
ccctaaaatg ggcaaacatt gcaagcagca aacagcaaac acacagccct ccctgcctgc
60
tgaccttgga gctggggcag aggtcagaga cctctctggg cccatgccac ctccaacatc
120
cactcgaccc cttggaattt ttcggtggag aggagcagag gttgtcctgg cgtggtttag
180
gtagtgtgag aggggaatga ctcctttcgg taagtgcagt ggaagctgta cactgcccag
240
gcaaagcgtc cgggcagcgt aggcgggcga ctcagatccc agccagtgga cttagcccct
300
gtttgctcct ccgataactg gggtgacctt ggttaatatt caccagcagc ctcccccgtt
360
gcccctctgg atccactgct taaatacgga cgaggacagg gccctgtctc ctcagcttca
420
ggcaccacca ctgacctggg acagtgaatc cggactctaa ggtaaatata aaatttttaa
480
gtgtataatg tgttaaacta ctgattctaa ttgtttctct cttttagatt ccaacctttg
540
gaactg
546
<210> 22
<211> 317
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 22
ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt
60
agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca
120
tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa
180
ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag
240
aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag
300
gcctaggctt ttgcaaa
317
<210> 23
<211> 576
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 23
tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa
60
cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata
120
atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag
180
tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc
240
cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta
300
tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg
360
cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt
420
ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca
480
aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag
540
gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcag
576
<210> 24
<211> 1313
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 24
ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc gcaaggggag agcccaggga
60
ccgtccctaa attctcacag acccaaatcc ctgtagccgc cccacgacag cgcgaggagc
120
atgcgcccag ggctgagcgc gggtagatca gagcacacaa gctcacagtc cccggcggtg
180
gggggagggg cgcgctgagc gggggccagg gagctggcgc ggggcaaact gggaaagtgg
240
tgtcgtgtgc tggctccgcc ctcttcccga gggtggggga gaacggtata taagtgcggt
300
agtcgccttg gacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgtc agaacgcagg tgagtggcgg
360
gtgtggcttc cgcgggcccc ggagctggag ccctgctctg agcgggccgg gctgatatgc
420
gagtgtcgtc cgcagggttt agctgtgagc attcccactt cgagtggcgg gcggtgcggg
480
ggtgagagtg cgaggcctag cggcaacccc gtagcctcgc ctcgtgtccg gcttgaggcc
540
tagcgtggtg tccgccgccg cgtgccactc cggccgcact atgcgttttt tgtccttgct
600
gccctcgatt gccttccagc agcatgggct aacaaaggga gggtgtgggg ctcactctta
660
aggagcccat gaagcttacg ttggatagga atggaagggc aggaggggcg actggggccc
720
gcccgccttc ggagcacatg tccgacgcca cctggatggg gcgaggcctg tggctttccg
780
aagcaatcgg gcgtgagttt agcctacctg ggccatgtgg ccctagcact gggcacggtc
840
tggcctggcg gtgccgcgtt cccttgcctc ccaacaaggg tgaggccgtc ccgcccggca
900
ccagttgctt gcgcggaaag atggccgctc ccggggccct gttgcaagga gctcaaaatg
960
gaggacgcgg cagcccggtg gagcgggcgg gtgagtcacc cacacaaagg aagagggcct
1020
tgcccctcgc cggccgctgc ttcctgtgac cccgtggtct atcggccgca tagtcacctc
1080
gggcttctct tgagcaccgc tcgtcgcggc ggggggaggg gatctaatgg cgttggagtt
1140
tgttcacatt tggtgggtgg agactagtca ggccagcctg gcgctggaag tcattcttgg
1200
aatttgcccc tttgagtttg gagcgaggct aattctcaag cctcttagcg gttcaaaggt
1260
attttctaaa cccgtttcca ggtgttgtga aagccaccgc taattcaaag caa
1313
<210> 25
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 25
Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ala His Ser
<210> 26
<211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 26
Met Leu Pro Ser Gln Leu Ile Gly Phe Leu Leu Leu Trp Val Pro Ala
1 5 10 15
Ser Arg Gly
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 27
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<400> 29
000
<210> 30
<400> 30
000
<210> 31
<400> 31
000
<210> 32
<400> 32
000
<210> 33
<400> 33
000
<210> 34
<400> 34
000
<210> 35
<400> 35
000
<210> 36
<400> 36
000
<210> 37
<400> 37
000
<210> 38
<400> 38
000
<210> 39
<400> 39
000
<210> 40
<400> 40
000
<210> 41
<400> 41
000
<210> 42
<400> 42
000
<210> 43
<400> 43
000
<210> 44
<400> 44
000
<210> 45
<211> 6
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 45
ggttga
6
<210> 46
<211> 4
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 46
agtt
4
<210> 47
<211> 6
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 47
ggttgg
6
<210> 48
<211> 6
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 48
agttgg
6
<210> 49
<211> 6
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 49
agttga
6
<210> 50
<211> 6
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 50
rrttrr
6
<210> 51
<211> 141
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 51
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc
60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca
120
actccatcac taggggttcc t
141
<210> 52
<211> 130
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 52
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt
60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact
120
aggggttcct
130
<210> 53
<400> 53
000
<210> 54
<400> 54
000
<210> 55
<400> 55
000
<210> 56
<400> 56
000
<210> 57
<400> 57
000
<210> 58
<400> 58
000
<210> 59
<400> 59
000
<210> 60
<400> 60
000
<210> 61
<400> 61
000
<210> 62
<400> 62
000
<210> 63
<211> 126
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 63
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcc
60
cgggcgcctc agtgagcgag cgagcgcgca gagagggagt ggccaactcc atcactaggg
120
gttcct
126
<210> 64
<211> 120
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 64
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgcccggga aacccgggcg tgcgcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg
120
<210> 65
<400> 65
000
<210> 66
<211> 141
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 66
aataaacgat aacgccgttg gtggcgtgag gcatgtaaaa ggttacatca ttatcttgtt
60
cgccatccgg ttggtataaa tagacgttca tgttggtttt tgtttcagtt gcaagttggc
120
tgcggcgcgc gcagcacctt t
141
<210> 67
<211> 1876
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 67
cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga
60
gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt
120
gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga
180
gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct
240
tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac
300
caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat
360
tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac
420
cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt
480
gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag
540
cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc
600
gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag
660
atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac
720
ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc
780
caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac
840
taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg
900
gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct
960
gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac
1020
taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt
1080
aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg
1140
ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag
1200
caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat
1260
cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca
1320
ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga
1380
ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt
1440
ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc
1500
cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac
1560
gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca
1620
cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc
1680
aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc
1740
tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat
1800
gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg
1860
catctttgaa caataa
1876
<210> 68
<211> 129
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 68
atcatggaga taattaaaat gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc
60
gtaacagttt tgtaataaaa aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca
120
tcgggcgcg
129
<210> 69
<211> 1203
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 69
gccgccacca tggagttggt gggctggctc gtggacaaag gcattacttc ggaaaagcag
60
tggattcagg aggatcaggc atcttacatc tcattcaacg ctgccagtaa ctcgaggtcc
120
cagatcaagg cagcgctgga caacgcggga aagattatga gtctgaccaa aactgctcca
180
gactacctcg ttggtcagca accggtggaa gatatctcca gcaacaggat ctacaagatt
240
ctggagctca acggctacga ccctcaatac gctgcctcag tgttcttggg ttgggccacc
300
aagaaattcg gcaagagaaa cactatctgg ctgttcggcc ccgctaccac tggaaagaca
360
aacatcgcag aagcgattgc tcacacggtg ccattctacg gctgcgtcaa ctggacaaac
420
gagaacttcc cgttcaacga ctgtgtcgat aagatggtta tctggtggga ggaaggaaag
480
atgacggcca aagtggtcga aagcgccaag gcaattctgg gtggctctaa agtgcgcgtc
540
gaccagaagt gcaaatcttc agctcaaatc gatcctaccc ccgttattgt gacatcaaac
600
acgaacatgt gtgccgtgat cgacggaaac agtacaacgt tcgaacacca gcaacctctc
660
caggatcgta tgttcaagtt cgagctcacc cgccgtttgg accatgattt cggcaaggtc
720
actaaacaag aggttaagga cttcttccgc tgggctaaag atcacgttgt ggaggttgaa
780
catgagttct acgtcaagaa aggaggtgct aagaaacgtc cagccccgtc ggacgcagat
840
atctccgaac ctaagagggt gagagagtcg gtcgcacagc caagcacttc tgacgcagaa
900
gcttccatta actacgcaga taggtaccaa aacaagtgca gcagacacgt gggtatgaac
960
ttgatgctgt tcccatgccg ccagtgtgag cgtatgaacc aaaactctaa catctgtttc
1020
acacatggcc agaaggactg cctcgaatgt ttccctgtgt cagagagtca gcccgtctca
1080
gtcgttaaga aagcttacca aaagttgtgc tacatccacc atattatggg taaagtccct
1140
gatgcctgta ccgcttgtga tctggtcaac gtggatttgg acgactgtat tttcgagcaa
1200
taa
1203
<210> 70
<400> 70
000
<210> 71
<400> 71
000
<210> 72
<400> 72
000
<210> 73
<211> 225
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 73
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct
60
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct
120
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg
180
ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggc
225
<210> 74
<211> 1177
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 74
ggctcagagg ctcagaggca cacaggagtt tctgggctca ccctgccccc ttccaacccc
60
tcagttccca tcctccagca gctgtttgtg tgctgcctct gaagtccaca ctgaacaaac
120
ttcagcctac tcatgtccct aaaatgggca aacattgcaa gcagcaaaca gcaaacacac
180
agccctccct gcctgctgac cttggagctg gggcagaggt cagagacctc tctgggccca
240
tgccacctcc aacatccact cgaccccttg gaatttcggt ggagaggagc agaggttgtc
300
ctggcgtggt ttaggtagtg tgagagggtc cgggttcaaa accacttgct gggtggggag
360
tcgtcagtaa gtggctatgc cccgaccccg aagcctgttt ccccatctgt acaatggaaa
420
tgataaagac gcccatctga tagggttttt gtggcaaata aacatttggt ttttttgttt
480
tgttttgttt tgttttttga gatggaggtt tgctctgtcg cccaggctgg agtgcagtga
540
cacaatctca tctcaccaca accttcccct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca
600
agcatgtgcc accacacctg gctaattttc tatttttagt agagacgggt ttctccatgt
660
tggtcagcct cagcctccca agtaactggg attacaggcc tgtgccacca cacccggcta
720
attttttcta tttttgacag ggacggggtt tcaccatgtt ggtcaggctg gtctagaggt
780
accggatctt gctaccagtg gaacagccac taaggattct gcagtgagag cagagggcca
840
gctaagtggt actctcccag agactgtctg actcacgcca ccccctccac cttggacaca
900
ggacgctgtg gtttctgagc caggtacaat gactcctttc ggtaagtgca gtggaagctg
960
tacactgccc aggcaaagcg tccgggcagc gtaggcgggc gactcagatc ccagccagtg
1020
gacttagccc ctgtttgctc ctccgataac tggggtgacc ttggttaata ttcaccagca
1080
gcctcccccg ttgcccctct ggatccactg cttaaatacg gacgaggaca gggccctgtc
1140
tcctcagctt caggcaccac cactgacctg ggacagt
1177
<210> 75
<400> 75
000
<210> 76
<400> 76
000
<210> 77
<400> 77
000
<210> 78
<400> 78
000
<210> 79
<400> 79
000
<210> 80
<400> 80
000
<210> 81
<400> 81
000
<210> 82
<400> 82
000
<210> 83
<400> 83
000
<210> 84
<400> 84
000
<210> 85
<400> 85
000
<210> 86
<400> 86
000
<210> 87
<400> 87
000
<210> 88
<400> 88
000
<210> 89
<400> 89
000
<210> 90
<400> 90
000
<210> 91
<400> 91
000
<210> 92
<400> 92
000
<210> 93
<400> 93
000
<210> 94
<400> 94
000
<210> 95
<211> 122
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 95
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca
120
gg
122
<210> 96
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 96
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc
60
gagcgagcgc gc
72
<210> 97
<211> 80
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 97
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct
60
cagtgagcga gcgagcgcgc
80
<210> 98
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 98
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc
60
gagcgagcgc gc
72
<210> 99
<211> 122
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 99
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca
120
gg
122
<210> 100
<211> 130
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 100
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc
120
tgcctgcagg
130
<210> 101
<211> 70
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 101
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtgcgcct cagtgagcga
60
gcgagcgcgc
70
<210> 102
<211> 70
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 102
gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcacgc ccgggtttcc cgggcggcct cagtgagcga
60
gcgagcgcgc
70
<210> 103
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 103
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc
60
gagcgagcgc gc
72
<210> 104
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 104
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacggc ctcagtgagc
60
gagcgagcgc gc
72
<210> 105
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 105
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggc ctcagtgagc
60
gagcgagcgc gc
72
<210> 106
<211> 72
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 106
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc
60
gagcgagcgc gc
72
<210> 107
<211> 83
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 107
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg ctttgcccgg
60
cctcagtgag cgagcgagcg cgc
83
<210> 108
<211> 83
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 108
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggca aagcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg
60
cctcagtgag cgagcgagcg cgc
83
<210> 109
<211> 77
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 109
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgaaac gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag
60
tgagcgagcg agcgcgc
77
<210> 110
<211> 77
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 110
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgtt tcggcctcag
60
tgagcgagcg agcgcgc
77
<210> 111
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 111
gcgcgctcgc tcgctcactg aggcaaagcc tcagtgagcg agcgagcgcg c
51
<210> 112
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 112
gcgcgctcgc tcgctcactg aggctttgcc tcagtgagcg agcgagcgcg c
51
<210> 113
<211> 80
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 113
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcgtcgggc gacctttggt cgcccggcct
60
cagtgagcga gcgagcgcgc
80
<210> 114
<211> 80
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 114
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcggcct
60
cagtgagcga gcgagcgcgc
80
<210> 115
<400> 115
000
<210> 116
<211> 79
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 116
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggcgcctc
60
agtgagcgag cgagcgcgc
79
<210> 117
<211> 89
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 117
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgactttgtc
60
gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc
89
<210> 118
<211> 89
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 118
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg acaaagtcgc ccgacgcccg ggctttgccc
60
gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc
89
<210> 119
<211> 87
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 119
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgattttcgc
60
ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc
87
<210> 120
<211> 87
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 120
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaaatcgccc gacgcccggg ctttgcccgg
60
gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc
87
<210> 121
<211> 85
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 121
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgtttcgccc
60
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc
85
<210> 122
<211> 85
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 122
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg aaacgcccga cgcccgggct ttgcccgggc
60
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc
85
<210> 123
<211> 89
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 123
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggaaacccgg gcgtcgggcg acctttggtc
60
gcccggcctc agtgagcgag cgagcgcgc
89
<210> 124
<211> 89
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 124
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggtttccc
60
gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgc
89
<210> 125
<211> 87
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 125
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg gaaaccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc
60
ccggcctcag tgagcgagcg agcgcgc
87
<210> 126
<211> 87
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 126
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cggtttccgg
60
gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgc
87
<210> 127
<211> 85
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 127
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg aaacgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc
60
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc
85
<210> 128
<211> 85
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 128
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgtttcgggc
60
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgc
85
<210> 129
<211> 83
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 129
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccca aagggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg
60
cctcagtgag cgagcgagcg cgc
83
<210> 130
<211> 83
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 130
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc ctttgggcgg
60
cctcagtgag cgagcgagcg cgc
83
<210> 131
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 131
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgccaa aggcgtcggg cgacctttgg tcgcccggcc
60
tcagtgagcg agcgagcgcg c
81
<210> 132
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 132
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc tttggcggcc
60
tcagtgagcg agcgagcgcg c
81
<210> 133
<211> 79
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 133
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcaaa gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc
60
agtgagcgag cgagcgcgc
79
<210> 134
<211> 79
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 134
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgct ttgcggcctc
60
agtgagcgag cgagcgcgc
79
<210> 135
<400> 135
000
<210> 136
<400> 136
000
<210> 137
<400> 137
000
<210> 138
<400> 138
000
<210> 139
<400> 139
000
<210> 140
<400> 140
000
<210> 141
<400> 141
000
<210> 142
<400> 142
000
<210> 143
<400> 143
000
<210> 144
<400> 144
000
<210> 145
<400> 145
000
<210> 146
<400> 146
000
<210> 147
<400> 147
000
<210> 148
<400> 148
000
<210> 149
<400> 149
000
<210> 150
<400> 150
000
<210> 151
<400> 151
000
<210> 152
<400> 152
000
<210> 153
<400> 153
000
<210> 154
<400> 154
000
<210> 155
<400> 155
000
<210> 156
<400> 156
000
<210> 157
<400> 157
000
<210> 158
<400> 158
000
<210> 159
<400> 159
000
<210> 160
<400> 160
000
<210> 161
<400> 161
000
<210> 162
<400> 162
000
<210> 163
<400> 163
000
<210> 164
<400> 164
000
<210> 165
<400> 165
000
<210> 166
<400> 166
000
<210> 167
<400> 167
000
<210> 168
<400> 168
000
<210> 169
<400> 169
000
<210> 170
<400> 170
000
<210> 171
<400> 171
000
<210> 172
<400> 172
000
<210> 173
<400> 173
000
<210> 174
<400> 174
000
<210> 175
<400> 175
000
<210> 176
<400> 176
000
<210> 177
<400> 177
000
<210> 178
<400> 178
000
<210> 179
<400> 179
000
<210> 180
<400> 180
000
<210> 181
<400> 181
000
<210> 182
<400> 182
000
<210> 183
<400> 183
000
<210> 184
<400> 184
000
<210> 185
<400> 185
000
<210> 186
<400> 186
000
<210> 187
<400> 187
000
<210> 188
<400> 188
000
<210> 189
<400> 189
000
<210> 190
<400> 190
000
<210> 191
<400> 191
000
<210> 192
<400> 192
000
<210> 193
<400> 193
000
<210> 194
<400> 194
000
<210> 195
<400> 195
000
<210> 196
<400> 196
000
<210> 197
<400> 197
000
<210> 198
<400> 198
000
<210> 199
<400> 199
000
<210> 200
<400> 200
000
<210> 201
<400> 201
000
<210> 202
<400> 202
000
<210> 203
<400> 203
000
<210> 204
<400> 204
000
<210> 205
<400> 205
000
<210> 206
<400> 206
000
<210> 207
<400> 207
000
<210> 208
<400> 208
000
<210> 209
<400> 209
000
<210> 210
<400> 210
000
<210> 211
<400> 211
000
<210> 212
<400> 212
000
<210> 213
<400> 213
000
<210> 214
<400> 214
000
<210> 215
<400> 215
000
<210> 216
<400> 216
000
<210> 217
<400> 217
000
<210> 218
<400> 218
000
<210> 219
<400> 219
000
<210> 220
<400> 220
000
<210> 221
<400> 221
000
<210> 222
<400> 222
000
<210> 223
<400> 223
000
<210> 224
<400> 224
000
<210> 225
<400> 225
000
<210> 226
<400> 226
000
<210> 227
<400> 227
000
<210> 228
<400> 228
000
<210> 229
<400> 229
000
<210> 230
<400> 230
000
<210> 231
<400> 231
000
<210> 232
<400> 232
000
<210> 233
<400> 233
000
<210> 234
<400> 234
000
<210> 235
<400> 235
000
<210> 236
<400> 236
000
<210> 237
<400> 237
000
<210> 238
<400> 238
000
<210> 239
<400> 239
000
<210> 240
<400> 240
000
<210> 241
<400> 241
000
<210> 242
<400> 242
000
<210> 243
<400> 243
000
<210> 244
<400> 244
000
<210> 245
<400> 245
000
<210> 246
<400> 246
000
<210> 247
<400> 247
000
<210> 248
<400> 248
000
<210> 249
<400> 249
000
<210> 250
<400> 250
000
<210> 251
<400> 251
000
<210> 252
<400> 252
000
<210> 253
<400> 253
000
<210> 254
<400> 254
000
<210> 255
<400> 255
000
<210> 256
<400> 256
000
<210> 257
<400> 257
000
<210> 258
<400> 258
000
<210> 259
<400> 259
000
<210> 260
<400> 260
000
<210> 261
<400> 261
000
<210> 262
<400> 262
000
<210> 263
<400> 263
000
<210> 264
<400> 264
000
<210> 265
<400> 265
000
<210> 266
<400> 266
000
<210> 267
<400> 267
000
<210> 268
<400> 268
000
<210> 269
<400> 269
000
<210> 270
<400> 270
000
<210> 271
<400> 271
000
<210> 272
<400> 272
000
<210> 273
<400> 273
000
<210> 274
<400> 274
000
<210> 275
<400> 275
000
<210> 276
<400> 276
000
<210> 277
<400> 277
000
<210> 278
<400> 278
000
<210> 279
<400> 279
000
<210> 280
<400> 280
000
<210> 281
<400> 281
000
<210> 282
<400> 282
000
<210> 283
<400> 283
000
<210> 284
<400> 284
000
<210> 285
<400> 285
000
<210> 286
<400> 286
000
<210> 287
<400> 287
000
<210> 288
<400> 288
000
<210> 289
<400> 289
000
<210> 290
<400> 290
000
<210> 291
<400> 291
000
<210> 292
<400> 292
000
<210> 293
<400> 293
000
<210> 294
<400> 294
000
<210> 295
<400> 295
000
<210> 296
<400> 296
000
<210> 297
<400> 297
000
<210> 298
<400> 298
000
<210> 299
<400> 299
000
<210> 300
<400> 300
000
<210> 301
<400> 301
000
<210> 302
<400> 302
000
<210> 303
<400> 303
000
<210> 304
<400> 304
000
<210> 305
<400> 305
000
<210> 306
<400> 306
000
<210> 307
<400> 307
000
<210> 308
<400> 308
000
<210> 309
<400> 309
000
<210> 310
<400> 310
000
<210> 311
<400> 311
000
<210> 312
<400> 312
000
<210> 313
<400> 313
000
<210> 314
<400> 314
000
<210> 315
<400> 315
000
<210> 316
<400> 316
000
<210> 317
<400> 317
000
<210> 318
<400> 318
000
<210> 319
<400> 319
000
<210> 320
<400> 320
000
<210> 321
<400> 321
000
<210> 322
<400> 322
000
<210> 323
<400> 323
000
<210> 324
<400> 324
000
<210> 325
<400> 325
000
<210> 326
<400> 326
000
<210> 327
<400> 327
000
<210> 328
<400> 328
000
<210> 329
<400> 329
000
<210> 330
<400> 330
000
<210> 331
<400> 331
000
<210> 332
<400> 332
000
<210> 333
<400> 333
000
<210> 334
<400> 334
000
<210> 335
<400> 335
000
<210> 336
<400> 336
000
<210> 337
<400> 337
000
<210> 338
<400> 338
000
<210> 339
<400> 339
000
<210> 340
<400> 340
000
<210> 341
<400> 341
000
<210> 342
<400> 342
000
<210> 343
<400> 343
000
<210> 344
<400> 344
000
<210> 345
<400> 345
000
<210> 346
<400> 346
000
<210> 347
<400> 347
000
<210> 348
<400> 348
000
<210> 349
<400> 349
000
<210> 350
<400> 350
000
<210> 351
<400> 351
000
<210> 352
<400> 352
000
<210> 353
<400> 353
000
<210> 354
<400> 354
000
<210> 355
<400> 355
000
<210> 356
<400> 356
000
<210> 357
<400> 357
000
<210> 358
<400> 358
000
<210> 359
<400> 359
000
<210> 360
<400> 360
000
<210> 361
<400> 361
000
<210> 362
<400> 362
000
<210> 363
<400> 363
000
<210> 364
<400> 364
000
<210> 365
<400> 365
000
<210> 366
<400> 366
000
<210> 367
<400> 367
000
<210> 368
<400> 368
000
<210> 369
<400> 369
000
<210> 370
<400> 370
000
<210> 371
<400> 371
000
<210> 372
<400> 372
000
<210> 373
<400> 373
000
<210> 374
<400> 374
000
<210> 375
<400> 375
000
<210> 376
<400> 376
000
<210> 377
<400> 377
000
<210> 378
<400> 378
000
<210> 379
<400> 379
000
<210> 380
<400> 380
000
<210> 381
<400> 381
000
<210> 382
<400> 382
000
<210> 383
<400> 383
000
<210> 384
<400> 384
000
<210> 385
<400> 385
000
<210> 386
<400> 386
000
<210> 387
<400> 387
000
<210> 388
<400> 388
000
<210> 389
<400> 389
000
<210> 390
<400> 390
000
<210> 391
<400> 391
000
<210> 392
<400> 392
000
<210> 393
<400> 393
000
<210> 394
<400> 394
000
<210> 395
<400> 395
000
<210> 396
<400> 396
000
<210> 397
<400> 397
000
<210> 398
<400> 398
000
<210> 399
<400> 399
000
<210> 400
<400> 400
000
<210> 401
<400> 401
000
<210> 402
<400> 402
000
<210> 403
<400> 403
000
<210> 404
<400> 404
000
<210> 405
<400> 405
000
<210> 406
<400> 406
000
<210> 407
<400> 407
000
<210> 408
<400> 408
000
<210> 409
<400> 409
000
<210> 410
<400> 410
000
<210> 411
<400> 411
000
<210> 412
<400> 412
000
<210> 413
<400> 413
000
<210> 414
<400> 414
000
<210> 415
<400> 415
000
<210> 416
<400> 416
000
<210> 417
<400> 417
000
<210> 418
<400> 418
000
<210> 419
<400> 419
000
<210> 420
<400> 420
000
<210> 421
<400> 421
000
<210> 422
<400> 422
000
<210> 423
<400> 423
000
<210> 424
<400> 424
000
<210> 425
<400> 425
000
<210> 426
<400> 426
000
<210> 427
<400> 427
000
<210> 428
<400> 428
000
<210> 429
<400> 429
000
<210> 430
<400> 430
000
<210> 431
<400> 431
000
<210> 432
<400> 432
000
<210> 433
<400> 433
000
<210> 434
<400> 434
000
<210> 435
<400> 435
000
<210> 436
<400> 436
000
<210> 437
<400> 437
000
<210> 438
<400> 438
000
<210> 439
<400> 439
000
<210> 440
<400> 440
000
<210> 441
<400> 441
000
<210> 442
<400> 442
000
<210> 443
<400> 443
000
<210> 444
<400> 444
000
<210> 445
<400> 445
000
<210> 446
<400> 446
000
<210> 447
<400> 447
000
<210> 448
<400> 448
000
<210> 449
<400> 449
000
<210> 450
<400> 450
000
<210> 451
<400> 451
000
<210> 452
<400> 452
000
<210> 453
<400> 453
000
<210> 454
<400> 454
000
<210> 455
<400> 455
000
<210> 456
<400> 456
000
<210> 457
<400> 457
000
<210> 458
<400> 458
000
<210> 459
<400> 459
000
<210> 460
<400> 460
000
<210> 461
<400> 461
000
<210> 462
<400> 462
000
<210> 463
<400> 463
000
<210> 464
<400> 464
000
<210> 465
<400> 465
000
<210> 466
<400> 466
000
<210> 467
<400> 467
000
<210> 468
<400> 468
000
<210> 469
<211> 120
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 469
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
cgcacgcccg ggtttcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg
120
<210> 470
<211> 122
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 470
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca gctgcctgca
120
gg
122
<210> 471
<211> 129
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 471
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gcgcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct
120
gcctgcagg
129
<210> 472
<211> 101
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 472
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ctttgcctca gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag g
101
<210> 473
<211> 139
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 473
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgaca aagtcgcccg acgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga
120
gcgcgcagct gcctgcagg
139
<210> 474
<211> 137
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 474
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgaaa atcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc
120
gcgcagctgc ctgcagg
137
<210> 475
<211> 135
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 475
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgaaa cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc
120
gcagctgcct gcagg
135
<210> 476
<211> 133
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 476
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcaaag cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc
120
agctgcctgc agg
133
<210> 477
<211> 139
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 477
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gtttcccggg cggcctcagt gagcgagcga
120
gcgcgcagct gcctgcagg
139
<210> 478
<211> 137
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 478
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg tttccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc
120
gcgcagctgc ctgcagg
137
<210> 479
<211> 135
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 479
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgt ttcgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc
120
gcagctgcct gcagg
135
<210> 480
<211> 133
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 480
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccctt tgggcggcct cagtgagcga gcgagcgcgc
120
agctgcctgc agg
133
<210> 481
<211> 131
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 481
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgccttt ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag
120
ctgcctgcag g
131
<210> 482
<211> 129
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 482
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgctttg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct
120
gcctgcagg
129
<210> 483
<211> 127
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 483
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgtttcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc
120
ctgcagg
127
<210> 484
<211> 120
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 484
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtgcg
60
cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct
120
<210> 485
<211> 122
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 485
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgt cgggcgacct ttggtcgccc
60
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc
120
ct
122
<210> 486
<211> 122
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 486
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc
60
ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc aactccatca ctaggggttc
120
ct
122
<210> 487
<211> 129
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 487
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcgcc cgggcgtcgg gcgacctttg
60
gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta
120
ggggttcct
129
<210> 488
<211> 101
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 488
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggcaaa gcctcagtga gcgagcgagc
60
gcgcagagag ggagtggcca actccatcac taggggttcc t
101
<210> 489
<211> 139
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 489
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc
60
gggcgacttt gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac
120
tccatcacta ggggttcct
139
<210> 490
<211> 137
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 490
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc
60
gggcgatttt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc
120
catcactagg ggttcct
137
<210> 491
<211> 135
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 491
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc
60
gggcgtttcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca
120
tcactagggg ttcct
135
<210> 492
<211> 133
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 492
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc
60
gggctttgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc
120
actaggggtt cct
133
<210> 493
<211> 139
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 493
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggaaacc cgggcgtcgg
60
gcgacctttg gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac
120
tccatcacta ggggttcct
139
<210> 494
<211> 137
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 494
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccggaaaccg ggcgtcgggc
60
gacctttggt cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc
120
catcactagg ggttcct
137
<210> 495
<211> 135
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 495
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgaaacggg cgtcgggcga
60
cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca
120
tcactagggg ttcct
135
<210> 496
<211> 133
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 496
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccaaagggcg tcgggcgacc
60
tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc caactccatc
120
actaggggtt cct
133
<210> 497
<211> 131
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 497
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc caaaggcgtc gggcgacctt
60
tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca actccatcac
120
taggggttcc t
131
<210> 498
<211> 129
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 498
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc aaagcgtcgg gcgacctttg
60
gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta
120
ggggttcct
129
<210> 499
<211> 127
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 499
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccga aacgtcgggc gacctttggt
60
cgcccggcct cagtgagcga gcgagcgcgc agagagggag tggccaactc catcactagg
120
ggttcct
127
<210> 500
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 500
gcccgctggt ttccagcggg ctgcgggccc gaaacgggcc cgc
43
<210> 501
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 501
cgggcccgtg cgggcccaaa gggcccgc
28
<210> 502
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 502
gcccgggcac gcccgggttt cccgggcg
28
<210> 503
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 503
cgtgcgggcc caaagggccc gc
22
<210> 504
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 504
cgggcgacca aaggtcgccc g
21
<210> 505
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 505
cgcccgggct ttgcccgggc
20
<210> 506
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 506
cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gc
42
<210> 507
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 507
cgggcgacca aaggtcgccc g
21
<210> 508
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 508
cgcccgggct ttgcccgggc
20
<210> 509
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 509
cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg cggc
34
<210> 510
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 510
cgggcgacca aaggtcgccc g
21
<210> 511
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 511
cgcccgggct ttgcccgggc
20
<210> 512
<211> 30
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 512
cggggcccga cgcccgggct ttgcccgggc
30
<210> 513
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 513
cgggcgacca aaggtcgccc g
21
<210> 514
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 514
cgcccgggct ttgcccgggc
20
<210> 515
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 515
cgggcccgac gcccgggctt tgcccgggc
29
<210> 516
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 516
cgggcgacca aaggtcgccc g
21
<210> 517
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 517
cgcccgggct ttgcccgggc
20
<210> 518
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 518
gcccgggcaa agcccgggcg
20
<210> 519
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 519
cgggcgacct ttggtcgccc g
21
<210> 520
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 520
gcccgggcaa agcccgggcg tcgggcgacc tttggtcgcc cg
42
<210> 521
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 521
gcccgggcaa agcccgggcg
20
<210> 522
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 522
gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc g
31
<210> 523
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 523
gcccgggcaa agcccgggcg
20
<210> 524
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 524
cgggcgacct ttggtcgccc g
21
<210> 525
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 525
gccgcccggg cgacgggcga cctttggtcg cccg
34
<210> 526
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 526
gcccgggcaa agcccgggcg
20
<210> 527
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 527
cgggcgacct ttggtcgccc g
21
<210> 528
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 528
gcccgggcgt cgggcgacct ttggtcgccc g
31
<210> 529
<211> 21
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 529
cgggcgacct ttggtcgccc g
21
<210> 530
<400> 530
000
<210> 531
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 531
gcgcgctcgc tcgctc
16
<210> 532
<211> 8
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 532
actgaggc
8
<210> 533
<400> 533
000
<210> 534
<400> 534
000
<210> 535
<211> 8
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 535
gcctcagt
8
<210> 536
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 536
gagcgagcga gcgcgc
16
<210> 537
<400> 537
000
<210> 538
<211> 165
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 538
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg
60
ccgcccgggc aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc
120
gagcgcgcag agagggagtg gccaactcca tcactagggg ttcct
165
<210> 539
<211> 140
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 539
cccctagtga tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc
60
cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg
120
cgcagagaga tcactagggg
140
<210> 540
<211> 91
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 540
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgcccg ggcaaagccc gggcgtcggg cgacctttgg
60
tcgcccggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c
91
<210> 541
<211> 91
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 541
gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc
60
ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg c
91
<210> 542
<211> 8
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 542
ttaattaa
8
<210> 543
<400> 543
000
<210> 544
<400> 544
000
<210> 545
<211> 79
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 545
gcgcgctcgc tcgctcactg aggcgcccgg gcgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc
60
agtgagcgag cgagcgcgc
79
<210> 546
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 546
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg tttcggcctc
60
agtgagcgag cgagcgcgca g
81
<210> 547
<211> 81
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 547
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgaa acgtcgggcg acctttggtc gcccggcctc
60
agtgagcgag cgagcgcgca g
81
<210> 548
<400> 548
000
<210> 549
<400> 549
000
<210> 550
<211> 144
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 550
aggaacccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc
60
cgcccgggca aagcccgggc gtcgggcgac ctttggtcgc ccggcctcag tgagcgagcg
120
agcgcgcaga gagggagtgg ccaa
144
<210> 551
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 551
gcccgctggt ttccagcggg ctgcgggccc gaaacgggcc cgc
43
<210> 552
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 552
cgggcccgtg cgggcccaaa gggcccgc
28
<210> 553
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 553
gcccgggcac gcccgggttt cccgggcg
28
<210> 554
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 554
cgtgcgggcc caaagggccc gc
22
<210> 555
<211> 43
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 555
gcgggccgga aacgggcccg ctgcccgctg gtttccagcg ggc
43
<210> 556
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 556
cgcccgggaa acccgggcgt gcccgggc
28
<210> 557
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 557
gggccgcccg ggaaacccgg gcgtgccc
28
<210> 558
<211> 29
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(1)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (3)..(3)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (25)..(25)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 558
ntntctctct tttctctctc tctcncagg
29
<210> 559
<211> 10
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(1)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 559
naggtagagt
10
<210> 560
<211> 143
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 560
ttgcccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcggtgggg cctgcggacc aaaggtccgc
60
agacggcaga ggtctcctct gccggcccca ccgagcgagc gacgcgcgca gagagggagt
120
gggcaactcc atcactaggg taa
143
<210> 561
<211> 144
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 561
ttggccactc cctctatgcg cactcgctcg ctcggtgggg cctggcgacc aaaggtcgcc
60
agacggacgt gggtttccac gtccggcccc accgagcgag cgagtgcgca tagagggagt
120
ggccaactcc atcactagag gtat
144
<210> 562
<211> 127
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 562
ttggccactc cctctatgcg cgctcgctca ctcactcggc cctggagacc aaaggtctcc
60
agactgccgg cctctggccg gcagggccga gtgagtgagc gagcgcgcat agagggagtg
120
gccaact
127
<210> 563
<211> 166
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 563
tcccccctgt cgcgttcgct cgctcgctgg ctcgtttggg ggggcgacgg ccagagggcc
60
gtcgtctggc agctctttga gctgccaccc ccccaaacga gccagcgagc gagcgaacgc
120
gacagggggg agagtgccac actctcaagc aagggggttt tgtaag
166
<210> 564
<211> 144
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 564
ttgcccactc cctctaatgc gcgctcgctc gctcggtggg gcctgcggac caaaggtccg
60
cagacggcag aggtctcctc tgccggcccc accgagcgag cgagcgcgca tagagggagt
120
gggcaactcc atcactaggg gtat
144
<210> 565
<211> 143
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 565
ttaccctagt gatggagttg cccactccct ctctgcgcgc gtcgctcgct cggtggggcc
60
ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga
120
gcgcgcagag agggagtggg caa
143
<210> 566
<211> 144
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 566
atacctctag tgatggagtt ggccactccc tctatgcgca ctcgctcgct cggtggggcc
60
ggacgtggaa acccacgtcc gtctggcgac ctttggtcgc caggccccac cgagcgagcg
120
agtgcgcata gagggagtgg ccaa
144
<210> 567
<211> 127
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 567
agttggccac attagctatg cgcgctcgct cactcactcg gccctggaga ccaaaggtct
60
ccagactgcc ggcctctggc cggcagggcc gagtgagtga gcgagcgcgc atagagggag
120
tggccaa
127
<210> 568
<211> 166
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 568
cttacaaaac ccccttgctt gagagtgtgg cactctcccc cctgtcgcgt tcgctcgctc
60
gctggctcgt ttgggggggt ggcagctcaa agagctgcca gacgacggcc ctctggccgt
120
cgccccccca aacgagccag cgagcgagcg aacgcgacag ggggga
166
<210> 569
<211> 144
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 569
atacccctag tgatggagtt gcccactccc tctatgcgcg ctcgctcgct cggtggggcc
60
ggcagaggag acctctgccg tctgcggacc tttggtccgc aggccccacc gagcgagcga
120
gcgcgcatta gagggagtgg gcaa
144
<210> 570
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 570
atcgaacgat cg
12
<210> 571
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 571
cgatcgttcg at
12
<210> 572
<211> 12
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 572
atcgaaccat cg
12
<210> 573
<211> 7
<212> PRT
<213> Обезьяний вирус 40
<400> 573
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 574
<211> 21
<212> ДНК
<213> Обезьяний вирус 40
<400> 574
cccaagaaga agaggaaggt g
21
<210> 575
<211> 16
<212> PRT
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Бипартатная последовательность NLS нуклеоплазмина
<400> 575
Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 576
<211> 9
<212> PRT
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность NLS C-myc
<400> 576
Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp
1 5
<210> 577
<211> 11
<212> PRT
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность NLS C-myc
<400> 577
Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro
1 5 10
<210> 578
<211> 38
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 578
Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly
1 5 10 15
Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro
20 25 30
Arg Asn Gln Gly Gly Tyr
35
<210> 579
<211> 42
<212> PRT
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
IBB-домен из последовательности импортина-альфа
<400> 579
Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu
1 5 10 15
Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys
20 25 30
Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val
35 40
<210> 580
<211> 8
<212> PRT
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность T-белка миомы
<400> 580
Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro
1 5
<210> 581
<211> 8
<212> PRT
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность T-белка миомы
<400> 581
Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp
1 5
<210> 582
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 582
Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu
1 5
<210> 583
<211> 12
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 583
Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro
1 5 10
<210> 584
<211> 5
<212> PRT
<213> Вирус гриппа
<400> 584
Asp Arg Leu Arg Arg
1 5
<210> 585
<211> 7
<212> PRT
<213> Вирус гриппа
<400> 585
Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys
1 5
<210> 586
<211> 10
<212> PRT
<213> Вирус гепатита дельта
<400> 586
Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu
1 5 10
<210> 587
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 587
Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg
1 5 10
<210> 588
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 588
Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys
1 5 10 15
Lys Ser Lys Lys
20
<210> 589
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 589
Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys
1 5 10 15
Lys
<210> 590
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 590
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg
23
<210> 591
<211> 15
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(12)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (13)..(13)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 591
nnnnnnnnnn nnngg
15
<210> 592
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 592
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg
23
<210> 593
<211> 14
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(11)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (12)..(12)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 593
nnnnnnnnnn nngg
14
<210> 594
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (21)..(22)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 594
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagaaw
27
<210> 595
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(12)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (13)..(14)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 595
nnnnnnnnnn nnnnagaaw
19
<210> 596
<211> 27
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (21)..(22)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 596
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagaaw
27
<210> 597
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(11)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (12)..(13)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 597
nnnnnnnnnn nnnagaaw
18
<210> 598
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (24)..(24)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 598
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nggng
25
<210> 599
<211> 17
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(12)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (13)..(13)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (16)..(16)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 599
nnnnnnnnnn nnnggng
17
<210> 600
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (21)..(21)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (24)..(24)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 600
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nggng
25
<210> 601
<211> 16
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(11)
<223> a, c, t, или g
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (12)..(12)
<223> a, c, t, или g, неизвестное или другое
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (15)..(15)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 601
nnnnnnnnnn nnggng
16
<210> 602
<211> 137
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 602
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtttttgtac tctcaagatt tagaaataaa tcttgcagaa
60
gctacaaaga taaggcttca tgccgaaatc aacaccctgt cattttatgg cagggtgttt
120
tcgttattta atttttt
137
<210> 603
<211> 123
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 603
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtttttgtac tctcagaaat hcagaagcta caaagataag
60
gcttcatgcc gaaatcaaca ccctgtcatt ttatggcagg gtgttttcgt tatttaattt
120
ttt
123
<210> 604
<211> 110
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 604
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtttttgtac tctcagaaat gcagaagcta caaagataag
60
gcttcatgcc gaaatcaaca ccctgtcatt ttatggcagg gtgttttttt
110
<210> 605
<211> 102
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 605
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc
60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt
102
<210> 606
<211> 87
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 606
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc
60
cgttatcaac ttgaaaaagt ttttttt
87
<210> 607
<211> 76
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<220>
<221> модифицированное_основание
<222> (1)..(20)
<223> a, c, t, g, неизвестное или другое
<400> 607
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc
60
cgttatcatt tttttt
76
<210> 608
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 608
gggcagtaac ggcagacttc tcctcagg
28
<210> 609
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 609
tggggcaagg tgaacgtgga tgaagttg
28
<210> 610
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 610
agagtcaggt gcaccatggt gtctgttt
28
<210> 611
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 611
gtggagaagt ctgccgttac tgccctgt
28
<210> 612
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 612
acaggagtca ggtgcaccat ggtgtctg
28
<210> 613
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 613
gagaagtctg ccgttactgc cctgtggg
28
<210> 614
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 614
taacggcaga cttctccaca ggagtcag
28
<210> 615
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 615
gccctgtggg gcaaggtgaa cgtggatg
28
<210> 616
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 616
cacagggcag taacggcaga cttctcct
28
<210> 617
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 617
ggcaaggtga acgtggatga agttggtg
28
<210> 618
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 618
atcccatgga gaggtggctg ggaaggac
28
<210> 619
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 619
atattgcaga caataacccc tttaacct
28
<210> 620
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 620
catcccaggc gtggggatta gagctcca
28
<210> 621
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 621
gtgcagaata tgccccgcag ggtatttg
28
<210> 622
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 622
gggaaggggc ccagggcggt cagtgtgc
28
<210> 623
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 623
acacacagga tgacttcctc aaggtggg
28
<210> 624
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 624
cgccaccggg ctccgggccc gagaagtt
28
<210> 625
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 625
ccccagacct gcgctctggc gcccagcg
28
<210> 626
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 626
ggctcggggg ccggggctgg agccaggg
28
<210> 627
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 627
aaggcgctgg cgctgcaacc ggtgtacc
28
<210> 628
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 628
ttgcagcgcc agcgccttgg gctcgggg
28
<210> 629
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 629
cggtgtaccc ggggcccggc gccggctc
28
<210> 630
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 630
ttgcattgag atagtgtggg gaaggggc
28
<210> 631
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 631
atctgtctga aacggtccct ggctaaac
28
<210> 632
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 632
tttgcattga gatagtgtgg ggaagggg
28
<210> 633
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 633
ctgtctgaaa cggtccctgg ctaaactc
28
<210> 634
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 634
tatttgcatt gagatagtgt ggggaagg
28
<210> 635
<211> 15
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 635
cttgacaagg caaac
15
<210> 636
<211> 15
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 636
gtcaaggcaa ggctg
15
<210> 637
<211> 12
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 637
gatgaggatg ac
12
<210> 638
<211> 12
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 638
aaactgcaaa ag
12
<210> 639
<211> 12
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 639
gacaagcagc gg
12
<210> 640
<211> 13
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 640
catctgctac tcg
13
<210> 641
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 641
atgacttgtg ggtggttgtg ttccagtt
28
<210> 642
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 642
gggtagaagc ggtcacagat atatctgt
28
<210> 643
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 643
agtcagaggc caaggaagct gttggctg
28
<210> 644
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 644
ttggtggcgt ggacgatggc caggtagc
28
<210> 645
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 645
cagttgatgc cgtggcaaac tggtactt
28
<210> 646
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 646
ccagaaggga agcgtgatga caaagagg
28
<210> 647
<211> 16
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность PPP1R12C
<400> 647
actagggaca ggattg
16
<210> 648
<211> 16
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность PPP1R12C
<400> 648
ccccactgtg gggtgg
16
<210> 649
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 649
acccgcagtc ccagcgtcgt ggtgagcc
28
<210> 650
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 650
gcatgacggg accggtcggc tcgcggca
28
<210> 651
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 651
tgatgaagga gatgggaggc catcacat
28
<210> 652
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 652
atctcgagca agacgttcag tcctacag
28
<210> 653
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 653
aagcactgaa tagaaatagt gatagatc
28
<210> 654
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 654
atgtaatcca gcaggtcagc aaagaatt
28
<210> 655
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 655
ggccggcgcg cgggctgact gctcagga
28
<210> 656
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 656
gctccgttat ggcgacccgc agccctgg
28
<210> 657
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 657
tgcaaaaggt aggaaaagga ccaaccag
28
<210> 658
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 658
acccagatac aaacaatgga tagaaaac
28
<210> 659
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 659
ctgggatgaa ctctgggcag aattcaca
28
<210> 660
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 660
atgcagtcta agaatacaga cagatcag
28
<210> 661
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 661
tgcacagggg ctgaagttgt cccacagg
28
<210> 662
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 662
tggccaggag gctggttgca aacatttt
28
<210> 663
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 663
ttgaatgtga tttgaaaggt aatttagt
28
<210> 664
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 664
aagctgatga tttaagcttt ggcggttt
28
<210> 665
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 665
gtggggtaat tgatccatgt atgccatt
28
<210> 666
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 666
gggtggccaa aggaactgcg cgaacctc
28
<210> 667
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 667
atcaactgga gttggactgt aataccag
28
<210> 668
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность HPRT
<400> 668
ctttacagag acaagaggaa taaaggaa
28
<210> 669
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 669
cctatccatt gcactatgct ttatttaa
28
<210> 670
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 670
tttgggatag ttatgaattc aatcttca
28
<210> 671
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 671
cctgtgctgt tgatctcata aatagaac
28
<210> 672
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 672
ttgtggtttt taaataaagc atagtgca
28
<210> 673
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 673
accaagaaga cagactaaaa tgaaaata
28
<210> 674
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 674
ctgttgatag acactaaaag agtattag
28
<210> 675
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 675
tgacacagta cctggcacca tagttgta
28
<210> 676
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 676
gtactagggg tatggggata aaccagac
28
<210> 677
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 677
gcaaagattg ctgactacgg cattgctc
28
<210> 678
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 678
tgatggcagc attgggatac agtgtgaa
28
<210> 679
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 679
gcaaagattg ctgactacag cattgctc
28
<210> 680
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 680
ggggcgatgc tggggacggg gacattag
28
<210> 681
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 681
acgctgcgcc ggcggaggcg gggccgcg
28
<210> 682
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 682
aaggcgccgt gggggctgcc gggacggg
28
<210> 683
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 683
agtccccgga ggcctcgggc cgactcgc
28
<210> 684
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 684
gcgctcagca ggtggtgacc ttgtggac
28
<210> 685
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 685
atggtgggag agactgtgag gcggcagc
28
<210> 686
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 686
atggcgctca gcaggtggtg accttgtg
28
<210> 687
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 687
tgggagagac tgtgaggcgg cagctggg
28
<210> 688
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 688
gccaggtagt actgtgggta ctcgaagg
28
<210> 689
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 689
gagccatggc agttctccat gctggccg
28
<210> 690
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 690
cagtgggttc ttgccgcagc agatggtg
28
<210> 691
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 691
gtgacgatga ggcctctgct accgtgtc
28
<210> 692
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 692
ggggagacag ggcaaggctg gcagagag
28
<210> 693
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 693
atgtccaggc tgctgcctcg gtcccatt
28
<210> 694
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность CFTR
<400> 694
attagaagtg aagtctggaa ataaaacc
28
<210> 695
<211> 44
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность CFTR
<400> 695
agtgattatg ggagaactgg atgttcacag tcagtccaca cgtc
44
<210> 696
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность CFTR
<400> 696
catcatagga aacaccaaag atgatatt
28
<210> 697
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность CFTR
<400> 697
atatagatac agaagcgtca tcaaagca
28
<210> 698
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность CFTR
<400> 698
gctttgatga cgcttctgta tctatatt
28
<210> 699
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность CFTR
<400> 699
ccaactagaa gaggtaagaa actatgtg
28
<210> 700
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность CFTR
<400> 700
cctatgatga atatagatac agaagcgt
28
<210> 701
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность CFTR
<400> 701
acaccaatga tattttcttt aatggtgc
28
<210> 702
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 702
ctatggactt caagagcaac agtgctgt
28
<210> 703
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 703
ctcatgtcta gcacagtttt gtctgtga
28
<210> 704
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 704
gtgctgtggc ctggagcaac aaatctga
28
<210> 705
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 705
ttgctcttga agtccataga cctcatgt
28
<210> 706
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 706
gctgtggcct ggagcaacaa atctgact
28
<210> 707
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 707
ctgttgctct tgaagtccat agacctca
28
<210> 708
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 708
ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactt
28
<210> 709
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 709
ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaa
28
<210> 710
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 710
ttgttgctcc aggccacagc actgttgc
28
<210> 711
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 711
tgaaagtggc cgggtttaat ctgctcat
28
<210> 712
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 712
aggaggattc ggaacccaat cactgaca
28
<210> 713
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRAC
<400> 713
gaggaggatt cggaacccaa tcactgac
28
<210> 714
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRBC
<400> 714
ccgtagaact ggacttgaca gcggaagt
28
<210> 715
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TRBC
<400> 715
tctcggagaa tgacgagtgg acccagga
28
<210> 716
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 716
ccagggcgcc tgtgggatct gcatgcct
28
<210> 717
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 717
cagtcgtctg ggcggtgcta caactggg
28
<210> 718
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 718
gaacacaggc acggctgagg ggtcctcc
28
<210> 719
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 719
ctgtggacta tggggagctg gatttcca
28
<210> 720
<211> 19
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 720
cagtcgtctg ggcggtgct
19
<210> 721
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 721
acagtgcttc ggcaggctga cagccagg
28
<210> 722
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 722
acccggacct cagtggcttt gcctggag
28
<210> 723
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 723
actacctggg cataggcaac ggaaccca
28
<210> 724
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 724
tggcggtggg tacatgagct ccaccttg
28
<210> 725
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 725
gtatggctgc gacgtggggt cggacggg
28
<210> 726
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 726
ttatctggat ggtgtgagaa cctggccc
28
<210> 727
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 727
tcctctggac ggtgtgagaa cctggccc
28
<210> 728
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 728
atggagccgc gggcgccgtg gatagagc
28
<210> 729
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 729
ctggctcgcg gcgtcgctgt cgaaccgc
28
<210> 730
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 730
tccaggagct caggtcctcg ttcagggc
28
<210> 731
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 731
cggcggacac cgcggctcag atcaccca
28
<210> 732
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 732
aggtggatgc ccaggacgag ctttgagg
28
<210> 733
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 733
agggagcaga agcagcgcag cagcgcca
28
<210> 734
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 734
ctggaggtgg atgcccagga cgagcttt
28
<210> 735
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 735
gagcagaagc agcgcagcag cgccacct
28
<210> 736
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 736
cctcagtttc atggggattc aagggaac
28
<210> 737
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 737
cctaggaggt catgggcatt tgccatgc
28
<210> 738
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 738
tcgcggcgtc gctgtcgaac cgcacgaa
28
<210> 739
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 739
ccaagagggg agccgcggga gccgtggg
28
<210> 740
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 740
gaaataaggc atactggtat tactaatg
28
<210> 741
<211> 28
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 741
gaggagagca ggccgattac ctgaccca
28
<210> 742
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность DRA
<400> 742
tctcccaggg tggttcagtg gcagaatt
28
<210> 743
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность DRA
<400> 743
gcgggggaaa gagaggagga gagaagga
28
<210> 744
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TAP1
<400> 744
agaaggctgt gggctcctca gagaaaat
28
<210> 745
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TAP1
<400> 745
actctggggt agatggagag cagtacct
28
<210> 746
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TAP2
<400> 746
ttgcggatcc gggagcagct tttctcct
28
<210> 747
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность TAP2
<400> 747
ttgattcgag acatggtgta ggtgaagc
28
<210> 748
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность тапасина
<400> 748
ccacagccag agcctcagca ggagcctg
28
<210> 749
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность тапасина
<400> 749
cgcaagaggc tggagaggct gaggactg
28
<210> 750
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность тапасина
<400> 750
ctggatgggg cttggctgat ggtcagca
28
<210> 751
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность тапасина
<400> 751
gcccgcgggc agttctgcgc gggggtca
28
<210> 752
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность CIITA
<400> 752
gctcccaggc agcgggcggg aggctgga
28
<210> 753
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность CIITA
<400> 753
ctactcgggc catcggcggc tgcctcgg
28
<210> 754
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность RFX5
<400> 754
ttgatgtcag ggaagatctc tctgatga
28
<210> 755
<211> 28
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность RFX5
<400> 755
gctcgaaggc ttggtggccg gggccagt
28
<210> 756
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 756
gtctgccgtt actgccctgt ggg
23
<210> 757
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 757
gtaacggcag acttcacctc agg
23
<210> 758
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 758
gcaatatgaa tcccatggag agg
23
<210> 759
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 759
gcatattctg cactcatccc agg
23
<210> 760
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 760
gggccccttc ccggacacac agg
23
<210> 761
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 761
gcaggtctgg ggcgcgccac cgg
23
<210> 762
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 762
ggcccccgag cccaaggcgc tgg
23
<210> 763
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 763
gcgctgcaac cggtgtaccc ggg
23
<210> 764
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 764
gcattgagat agtgtgggga agg
23
<210> 765
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 765
gctattggtc aaggcaaggc tgg
23
<210> 766
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 766
gtgttcatct ttggttttgt ggg
23
<210> 767
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 767
ggtcctgccg ctgcttgtca tgg
23
<210> 768
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 768
gcttctaccc caatgacttg tgg
23
<210> 769
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 769
gcctctgact gttggtggcg tgg
23
<210> 770
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 770
gccgtggcaa actggtactt tgg
23
<210> 771
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 771
ggggccacta gggacaggat tgg
23
<210> 772
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 772
gtcaccaatc ctgtccctag tgg
23
<210> 773
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 773
gtggccccac tgtggggtgg agg
23
<210> 774
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 774
gtcggcatga cgggaccggt cgg
23
<210> 775
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 775
gatgtgatga aggagatggg agg
23
<210> 776
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 776
gtgctttgat gtaatccagc agg
23
<210> 777
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 777
gtcgccataa cggagccggc cgg
23
<210> 778
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 778
gtattgcaaa aggtaggaaa agg
23
<210> 779
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 779
gcatatctgg gatgaactct ggg
23
<210> 780
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 780
gcctcctggc catgtgcaca ggg
23
<210> 781
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 781
gaagctgatg atttaagctt tgg
23
<210> 782
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 782
gatcaattac cccacctggg tgg
23
<210> 783
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 783
gatgtcttta cagagacaag agg
23
<210> 784
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 784
gatcaacagc acaggttttg tgg
23
<210> 785
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 785
gtcagggtac taggggtatg ggg
23
<210> 786
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 786
gtcagcaatc tttgcaatga tgg
23
<210> 787
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 787
gtctgggacg caaggcgccg tgg
23
<210> 788
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 788
ggaggcctcg ggccgactcg cgg
23
<210> 789
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 789
gccggtgata tgggcttcct ggg
23
<210> 790
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 790
gagactgtga ggcggcagct ggg
23
<210> 791
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 791
ggctcagcca ggtagtactg tgg
23
<210> 792
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 792
gaacccactg ggtgacgatg agg
23
<210> 793
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 793
gccctgtctc ccccatgtcc agg
23
<210> 794
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 794
gggagaactg gagccttcag agg
23
<210> 795
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 795
gagggtaaaa ttaagcacag tgg
23
<210> 796
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 796
gagaatcaaa atcggtgaat agg
23
<210> 797
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 797
gacaccttct tccccagccc agg
23
<210> 798
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 798
gattaaaccc ggccactttc agg
23
<210> 799
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 799
gctgtcaagt ccagttctac ggg
23
<210> 800
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 800
ggcgccctgg ccagtcgtct ggg
23
<210> 801
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 801
gtccacagag aacacaggca cgg
23
<210> 802
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 802
gcttcggcag gctgacagcc agg
23
<210> 803
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 803
gtacccaccg ccatactacc tgg
23
<210> 804
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 804
gctgcgacgt ggggtcggac ggg
23
<210> 805
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 805
gcagccatac attatctgga tgg
23
<210> 806
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 806
gcagccatac atcctctgga cgg
23
<210> 807
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 807
gtggatagag caggaggggc cgg
23
<210> 808
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 808
gagccagagg atggagccgc ggg
23
<210> 809
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 809
ggacctgagc tcctggaccg cgg
23
<210> 810
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 810
gatgcccagg acgagctttg agg
23
<210> 811
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 811
gcgctgcttc tgctccctgg agg
23
<210> 812
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 812
ggggattcaa gggaacaccc tgg
23
<210> 813
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 813
gcaaatgccc atgacctcct agg
23
<210> 814
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 814
ggcgcccgcg gctcccctct tgg
23
<210> 815
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 815
gttcacatct cccccgggcc tgg
23
<210> 816
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 816
ggagaatgcg ggggaaagag agg
23
<210> 817
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 817
gcccacagcc ttctgtactc tgg
23
<210> 818
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 818
gttgattcga gacatggtgt agg
23
<210> 819
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 819
gctctggctg tggtcgcaag agg
23
<210> 820
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 820
gcagaactgc ccgcgggccc tgg
23
<210> 821
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 821
gctgcctggg agccctactc ggg
23
<210> 822
<211> 23
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 822
gccttcgagc tttgatgtca ggg
23
<210> 823
<211> 573
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<400> 823
gtaagagttt tatgtttttt catctctgct tgtatttttc tagtaatgga agcctggtat
60
tttaaaatag ttaaattttc ctttagtgct gatttctaga ttattattac tgttgttgtt
120
gttattattg tcattatttg catctgagaa cccttaggtg gttatattat tgatatattt
180
ttggtatctt tgatgacaat aatgggggat tttgaaagct tagctttaaa tttcttttaa
240
ttaaaaaaaa atgctaggca gaatgactca aattacgttg gatacagttg aatttattac
300
ggtctcatag ggcctgcctg ctcgaccatg ctatactaaa aattaaaagt gtgtgttact
360
aattttataa atggagtttc catttatatt tacctttatt tcttatttac cattgtctta
420
gtagatattt acaaacatga cagaaacact aaatcttgag tttgaatgca cagatataaa
480
cacttaacgg gttttaaaaa taataatgtt ggtgaaaaaa tataactttg agtgtagcag
540
agaggaacca ttgccacctt cagattttcc tgt
573
<210> 824
<211> 1993
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<400> 824
acgatcggga actggcatct tcagggagta gcttaggtca gtgaagagaa gaacaaaaag
60
cagcatatta cagttagttg tcttcatcaa tctttaaata tgttgtgtgg tttttctctc
120
cctgtttcca cagacaagag tgagatcgcc catcggtata atgatttggg agaacaacat
180
ttcaaaggcc tgtaagttat aatgctgaaa gcccacttaa tatttctggt agtattagtt
240
aaagttttaa aacacctttt tccaccttga gtgtgagaat tgtagagcag tgctgtccag
300
tagaaatgtg tgcattgaca gaaagactgt ggatctgtgc tgagcaatgt ggcagccaga
360
gatcacaagg ctatcaagca ctttgcacat ggcaagtgta actgagaagc acacattcaa
420
ataatagtta attttaattg aatgtatcta gccatgtgtg gctagtagct cctttcctgg
480
agagagaatc tggagcccac atctaacttg ttaagtctgg aatcttattt tttatttctg
540
gaaaggtcta tgaactatag ttttgggggc agctcactta ctaactttta atgcaataag
600
atctcatggt atcttgagaa cattattttg tctctttgta gtactgaaac cttatacatg
660
tgaagtaagg ggtctatact taagtcacat ctccaacctt agtaatgttt taatgtagta
720
aaaaaatgag taattaattt atttttagaa ggtcaatagt atcatgtatt ccaaataaca
780
gaggtatatg gttagaaaag aaacaattca aaggacttat ataatatcta gccttgacaa
840
tgaataaatt tagagagtag tttgcctgtt tgcctcatgt tcataaatct attgacacat
900
atgtgcatct gcacttcagc atggtagaag tccatattcc tttgcttgga aaggcaggtg
960
ttcccattac gcctcagaga atagctgacg ggaagaggct ttctagatag ttgtatgaaa
1020
gatatacaaa atctcgcagg tatacacagg catgatttgc tggttgggag agccacttgc
1080
ctcatactga ggtttttgtg tctgcttttc agagtcctga ttgccttttc ccagtatctc
1140
cagaaatgct catacgatga gcatgccaaa ttagtgcagg aagtaacaga ctttgcaaag
1200
acgtgtgttg ccgatgagtc tgccgccaac tgtgacaaat cccttgtgag taccttctga
1260
ttttgtggat ctactttcct gctttctgga actctgtttc aaagccaatc atgactccat
1320
cacttaaggc cccgggaaca ctgtggcaga gggcagcaga gagattgata aagccagggt
1380
gatgggaatt ttctgtggga ctccatttca tagtaattgc agaagctaca atacactcaa
1440
aaagtctcac cacatgactg cccaaatggg agcttgacag tgacagtgac agtagatatg
1500
ccaaagtgga tgagggaaag accacaagag ctaaaccctg taaaaagaac tgtaggcaac
1560
taaggaatgc agagagaaga agttgccttg gaagagcata ccaactgcct ctccaatacc
1620
aatggtcatc cctaaaacat acgtatgaat aacatgcaga ctaagcaggc tacatttagg
1680
aatatacatg tatttacata aatgtatatg catgtaacaa caatgaatga aaactgaggt
1740
catggatctg aaagagagca agggggctta catgagaggg tttggaggga ggggttggag
1800
ggagggaggt attattcttt agttttacag ggaacgtagt aaaaacatag gcttctccca
1860
aaggagcaga gcccatgagg agctgtgcaa ggttccccag cttgatttta cctgctcctc
1920
aaattccctt gatttgtttt tattataatg actttactcc tagcttttag tgtcagatag
1980
aaaacatgga agg
1993
<210> 825
<211> 1301
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Кодирующая последовательность беспромоторного фактора IX
<400> 825
tgacagtgtt tttagaccat gaaaatgcca acaagattct caacagaccc aagaggtaca
60
acagtggcaa gctggaggaa tttgtgcagg gcaacctgga aagagaatgc atggaggaga
120
agtgctcatt tgaagaggcc agggaggtct ttgagaacac agagaggacc acagagttct
180
ggaagcagta tgtggatggg gaccagtgtg agagcaaccc ctgccttaat gggggcagct
240
gtaaagatga tattaatagc tatgaatgct ggtgcccctt tggatttgag gggaaaaact
300
gtgaattgga tgttacttgc aacatcaaaa atggtagatg tgagcagttc tgcaagaact
360
ctgcagacaa taaagtggtc tgctcctgca ctgaagggta cagactggca gaaaaccaga
420
agagttgtga gccagctgtg cccttcccct gtggcagagt ttctgtgagc cagaccagca
480
aactcaccag agctgaggct gtctttccag atgtggacta tgtgaactcc acagaagctg
540
agactatcct ggacaacatt actcagagca cccagtcctt caatgacttc acaagggtgg
600
ttggaggaga agatgccaag ccagggcagt ttccctggca ggtggtactg aatggaaaag
660
ttgatgcttt ctgtggaggg agcattgtga atgaaaaatg gattgtcact gctgcccact
720
gtgtggaaac tggggtgaag atcactgtgg tggctgggga gcataatatt gaagaaacag
780
agcacactga acagaaaaga aatgtgatca ggatcatccc ccaccacaac tacaatgcag
840
ccatcaacaa atacaaccat gacattgccc tgctggagct ggatgagccc ctggtgctga
900
acagctatgt gacccccatc tgtattgctg acaaggagta cacaaatatc ttcctgaagt
960
ttggctctgg ctatgtgagt ggctggggca gagtgttcca caagggaaga tctgccctgg
1020
tgctgcagta cctgagggtg ccactggtgg acagggccac ctgcctgagg agcacaaagt
1080
tcaccattta taacaacatg ttttgtgctg gcttccatga gggaggcagg gacagctgcc
1140
agggagattc tggagggccc catgtgactg aggtggaggg cacctccttt ctgacaggca
1200
ttatcagctg gggagaggag tgtgccatga agggcaagta tggcatctac accaaggtgt
1260
ccagatatgt caactggatc aaggaaaaga ccaaactgac c
1301
<210> 826
<211> 1350
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 826
taggaggctg aggcaggagg atcgcttgag cccaggagtt cgagaccagc ctgggcaaca
60
tagtgtgatc ttgtatctat aaaaataaac aaaattagct tggtgtggtg gcgcctgtag
120
tccccagcca cttggagggg tgaggtgaga ggattgcttg agcccgggat ggtccaggct
180
gcagtgagcc atgatcgtgc cactgcactc cagcctgggc gacagagtga gaccctgtct
240
cacaacaaca acaacaacaa caaaaaggct gagctgcacc atgcttgacc cagtttctta
300
aaattgttgt caaagcttca ttcactccat ggtgctatag agcacaagat tttatttggt
360
gagatggtgc tttcatgaat tcccccaaca gagccaagct ctccatctag tggacaggga
420
agctagcagc aaaccttccc ttcactacaa aacttcattg cttggccaaa aagagagtta
480
attcaatgta gacatctatg taggcaatta aaaacctatt gatgtataaa acagtttgca
540
ttcatggagg gcaactaaat acattctagg actttataaa agatcacttt ttatttatgc
600
acagggtgga acaagatgga ttatcaagtg tcaagtccaa tctatgacat caattattat
660
acatcggagc cctgccaaaa aatcaatgtg aagcaaatcg cagcccgcct cctgcctccg
720
ctctactcac tggtgttcat ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcat cctcatcctg
780
ataaactgca aaaggctgaa gagcatgact gacatctacc tgctcaacct ggccatctct
840
gacctgtttt tccttcttac tgtccccttc tgggctcact atgctgccgc ccagtgggac
900
tttggaaata caatgtgtca actcttgaca gggctctatt ttataggctt cttctctgga
960
atcttcttca tcatcctcct gacaatcgat aggtacctgg ctgtcgtcca tgctgtgttt
1020
gctttaaaag ccaggacggt cacctttggg gtggtgacaa gtgtgatcac ttgggtggtg
1080
gctgtgtttg cgtctctccc aggaatcatc tttaccagat ctcaaaaaga aggtcttcat
1140
tacacctgca gctctcattt tccatacagt cagtatcaat tctggaagaa tttccagaca
1200
ttaaagatag tcatcttggg gctggtcctg ccgctgcttg tcatggtcat ctgctactcg
1260
ggaatcctaa aaactctgct tcggtgtcga aatgagaaga agaggcacag ggctgtgagg
1320
cttatcttca ccatcatgat tgtttatttt
1350
<210> 827
<211> 1223
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 827
tgacagagac tcttgggatg acgcactgct gcatcaaccc catcatctat gcctttgtcg
60
gggagaagtt cagaaactac ctcttagtct tcttccaaaa gcacattgcc aaacgcttct
120
gcaaatgctg ttctattttc cagcaagagg ctcccgagcg agcaagctca gtttacaccc
180
gatccactgg ggagcaggaa atatctgtgg gcttgtgaca cggactcaag tgggctggtg
240
acccagtcag agttgtgcac atggcttagt tttcatacac agcctgggct gggggtgggg
300
tgggagaggt cttttttaaa aggaagttac tgttatagag ggtctaagat tcatccattt
360
atttggcatc tgtttaaagt agattagatc ttttaagccc atcaattata gaaagccaaa
420
tcaaaatatg ttgatgaaaa atagcaacct ttttatctcc ccttcacatg catcaagtta
480
ttgacaaact ctcccttcac tccgaaagtt ccttatgtat atttaaaaga aagcctcaga
540
gaattgctga ttcttgagtt tagtgatctg aacagaaata ccaaaattat ttcagaaatg
600
tacaactttt tacctagtac aaggcaacat ataggttgta aatgtgttta aaacaggtct
660
ttgtcttgct atggggagaa aagacatgaa tatgattagt aaagaaatga cacttttcat
720
gtgtgatttc ccctccaagg tatggttaat aagtttcact gacttagaac caggcgagag
780
acttgtggcc tgggagagct ggggaagctt cttaaatgag aaggaatttg agttggatca
840
tctattgctg gcaaagacag aagcctcact gcaagcactg catgggcaag cttggctgta
900
gaaggagaca gagctggttg ggaagacatg gggaggaagg acaaggctag atcatgaaga
960
accttgacgg cattgctccg tctaagtcat gagctgagca gggagatcct ggttggtgtt
1020
gcagaaggtt tactctgtgg ccaaaggagg gtcaggaagg atgagcattt agggcaagga
1080
gaccaccaac agccctcagg tcagggtgag gatggcctct gctaagctca aggcgtgagg
1140
atgggaagga gggaggtatt cgtaaggatg ggaaggaggg aggtattcgt gcagcatatg
1200
aggatgcaga gtcagcagaa ctg
1223
<210> 828
<211> 1515
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 828
gaacagagaa acaggagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc
60
cggctcaggg ccaagaacag ttggaacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt
120
aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc
180
tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc
240
ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc
300
tccccgagct ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgcc tggagacgcc
360
atccacgctg ttttgacttc catagaagga tctcgaggcc accatggtga gcaagggcga
420
ggagctgttc accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca
480
caagttcagc gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa
540
gttcatctgc accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac
600
ctacggcgtg cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa
660
gtccgccatg cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa
720
ctacaagacc cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct
780
gaagggcatc gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta
840
caacagccac aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt
900
caagatccgc cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa
960
cacccccatc ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc
1020
cgccctgagc aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac
1080
cgccgccggg atcactctcg gcatggacga gctgtacaag taaactagat aatcaacctc
1140
tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc
1200
tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca
1260
ttttctcctc cttgtataaa tcctggttag ttcttgccac ggcggaactc atcgccgcct
1320
gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtgggtagcg
1380
cttgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca
1440
ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt
1500
gggaggtttt ttaaa
1515
<210> 829
<211> 4107
<212> ДНК
<213> Неизвестно
<220>
<223> Описание неизвестного:
Последовательность Cas9
<400> 829
atggataaga aatactcaat aggcttagat atcggcacaa atagcgtcgg atgggcggtg
60
atcactgatg aatataaggt tccgtctaaa aagttcaagg ttctgggaaa tacagaccgc
120
cacagtatca aaaaaaatct tataggggct cttttatttg acagtggaga gacagcggaa
180
gcgactcgtc tcaaacggac agctcgtaga aggtatacac gtcggaagaa tcgtatttgt
240
tatctacagg agattttttc aaatgagatg gcgaaagtag atgatagttt ctttcatcga
300
cttgaagagt cttttttggt ggaagaagac aagaagcatg aacgtcatcc tatttttgga
360
aatatagtag atgaagttgc ttatcatgag aaatatccaa ctatctatca tctgcgaaaa
420
aaattggtag attctactga taaagcggat ttgcgcttaa tctatttggc cttagcgcat
480
atgattaagt ttcgtggtca ttttttgatt gagggagatt taaatcctga taatagtgat
540
gtggacaaac tatttatcca gttggtacaa acctacaatc aattatttga agaaaaccct
600
attaacgcaa gtggagtaga tgctaaagcg attctttctg cacgattgag taaatcaaga
660
cgattagaaa atctcattgc tcagctcccc ggtgagaaga aaaatggctt atttgggaat
720
ctcattgctt tgtcattggg tttgacccct aattttaaat caaattttga tttggcagaa
780
gatgctaaat tacagctttc aaaagatact tacgatgatg atttagataa tttattggcg
840
caaattggag atcaatatgc tgatttgttt ttggcagcta agaatttatc agatgctatt
900
ttactttcag atatcctaag agtaaatact gaaataacta aggctcccct atcagcttca
960
atgattaaac gctacgatga acatcatcaa gacttgactc ttttaaaagc tttagttcga
1020
caacaacttc cagaaaagta taaagaaatc ttttttgatc aatcaaaaaa cggatatgca
1080
ggttatattg atgggggagc tagccaagaa gaattttata aatttatcaa accaatttta
1140
gaaaaaatgg atggtactga ggaattattg gtgaaactaa atcgtgaaga tttgctgcgc
1200
aagcaacgga cctttgacaa cggctctatt ccccatcaaa ttcacttggg tgagctgcat
1260
gctattttga gaagacaaga agacttttat ccatttttaa aagacaatcg tgagaagatt
1320
gaaaaaatct tgacttttcg aattccttat tatgttggtc cattggcgcg tggcaatagt
1380
cgttttgcat ggatgactcg gaagtctgaa gaaacaatta ccccatggaa ttttgaagaa
1440
gttgtcgata aaggtgcttc agctcaatca tttattgaac gcatgacaaa ctttgataaa
1500
aatcttccaa atgaaaaagt actaccaaaa catagtttgc tttatgagta ttttacggtt
1560
tataacgaat tgacaaaggt caaatatgtt actgaaggaa tgcgaaaacc agcatttctt
1620
tcaggtgaac agaagaaagc cattgttgat ttactcttca aaacaaatcg aaaagtaacc
1680
gttaagcaat taaaagaaga ttatttcaaa aaaatagaat gttttgatag tgttgaaatt
1740
tcaggagttg aagatagatt taatgcttca ttaggtacct accatgattt gctaaaaatt
1800
attaaagata aagatttttt ggataatgaa gaaaatgaag atatcttaga ggatattgtt
1860
ttaacattga ccttatttga agatagggag atgattgagg aaagacttaa aacatatgct
1920
cacctctttg atgataaggt gatgaaacag cttaaacgtc gccgttatac tggttgggga
1980
cgtttgtctc gaaaattgat taatggtatt agggataagc aatctggcaa aacaatatta
2040
gattttttga aatcagatgg ttttgccaat cgcaatttta tgcagctgat ccatgatgat
2100
agtttgacat ttaaagaaga cattcaaaaa gcacaagtgt ctggacaagg cgatagttta
2160
catgaacata ttgcaaattt agctggtagc cctgctatta aaaaaggtat tttacagact
2220
gtaaaagttg ttgatgaatt ggtcaaagta atggggcggc ataagccaga aaatatcgtt
2280
attgaaatgg cacgtgaaaa tcagacaact caaaagggcc agaaaaattc gcgagagcgt
2340
atgaaacgaa tcgaagaagg tatcaaagaa ttaggaagtc agattcttaa agagcatcct
2400
gttgaaaata ctcaattgca aaatgaaaag ctctatctct attatctcca aaatggaaga
2460
gacatgtatg tggaccaaga attagatatt aatcgtttaa gtgattatga tgtcgatcac
2520
attgttccac aaagtttcct taaagacgat tcaatagaca ataaggtctt aacgcgttct
2580
gataaaaatc gtggtaaatc ggataacgtt ccaagtgaag aagtagtcaa aaagatgaaa
2640
aactattgga gacaacttct aaacgccaag ttaatcactc aacgtaagtt tgataattta
2700
acgaaagctg aacgtggagg tttgagtgaa cttgataaag ctggttttat caaacgccaa
2760
ttggttgaaa ctcgccaaat cactaagcat gtggcacaaa ttttggatag tcgcatgaat
2820
actaaatacg atgaaaatga taaacttatt cgagaggtta aagtgattac cttaaaatct
2880
aaattagttt ctgacttccg aaaagatttc caattctata aagtacgtga gattaacaat
2940
taccatcatg cccatgatgc gtatctaaat gccgtcgttg gaactgcttt gattaagaaa
3000
tatccaaaac ttgaatcgga gtttgtctat ggtgattata aagtttatga tgttcgtaaa
3060
atgattgcta agtctgagca agaaataggc aaagcaaccg caaaatattt cttttactct
3120
aatatcatga acttcttcaa aacagaaatt acacttgcaa atggagagat tcgcaaacgc
3180
cctctaatcg aaactaatgg ggaaactgga gaaattgtct gggataaagg gcgagatttt
3240
gccacagtgc gcaaagtatt gtccatgccc caagtcaata ttgtcaagaa aacagaagta
3300
cagacaggcg gattctccaa ggagtcaatt ttaccaaaaa gaaattcgga caagcttatt
3360
gctcgtaaaa aagactggga tccaaaaaaa tatggtggtt ttgatagtcc aacggtagct
3420
tattcagtcc tagtggttgc taaggtggaa aaagggaaat cgaagaagtt aaaatccgtt
3480
aaagagttac tagggatcac aattatggaa agaagttcct ttgaaaaaaa tccgattgac
3540
tttttagaag ctaaaggata taaggaagtt aaaaaagact taatcattaa actacctaaa
3600
tatagtcttt ttgagttaga aaacggtcgt aaacggatgc tggctagtgc cggagaatta
3660
caaaaaggaa atgagctggc tctgccaagc aaatatgtga attttttata tttagctagt
3720
cattatgaaa agttgaaggg tagtccagaa gataacgaac aaaaacaatt gtttgtggag
3780
cagcataagc attatttaga tgagattatt gagcaaatca gtgaattttc taagcgtgtt
3840
attttagcag atgccaattt agataaagtt cttagtgcat ataacaaaca tagagacaaa
3900
ccaatacgtg aacaagcaga aaatattatt catttattta cgttgacgaa tcttggagct
3960
cccgctgctt ttaaatattt tgatacaaca attgatcgta aacgatatac gtctacaaaa
4020
gaagttttag atgccactct tatccatcaa tccatcactg gtctttatga aacacgcatt
4080
gatttgagtc agctaggagg tgactga
4107
<210> 830
<211> 215
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 830
gaacgctgac gtcatcaacc cgctccaagg aatcgcgggc ccagtgtcac taggcgggaa
60
cacccagcgc gcgtgcgccc tggcaggaag atggctgtga gggacagggg agtggcgccc
120
tgcaatattt gcatgtcgct atgtgttctg ggaaatcacc ataaacgtga aatgtctttg
180
gatttgggaa tcttataagt tctgtatgag accac
215
<210> 831
<211> 1876
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 831
cgcagccacc atggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg
60
gcatctgccc ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt
120
gccgccagat tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga
180
gaagctgcag cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct
240
tttctttgtg caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac
300
caccggggtg aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat
360
tcagagaatt taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac
420
cagaaatggc gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt
480
gctccccaaa acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag
540
cgcctgtttg aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc
600
gcagacgcag gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag
660
atcaaaaact tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac
720
ctcggagaag cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc
780
caactcgcgg tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac
840
taaaaccgcc cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg
900
gatttataaa attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct
960
gggatgggcc acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac
1020
taccgggaag accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt
1080
aaactggacc aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg
1140
ggaggagggg aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag
1200
caaggtgcgc gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat
1260
cgtcacctcc aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca
1320
ccagcagccg ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga
1380
ctttgggaag gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt
1440
ggttgaggtg gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc
1500
cagtgacgca gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac
1560
gtcagacgcg gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca
1620
cgtgggcatg aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc
1680
aaatatctgc ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc
1740
tcaacccgtt tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat
1800
gggaaaggtg ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg
1860
catctttgaa caataa
1876
<210> 832
<211> 7116
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 832
ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga
60
ctgaatatca acgcttattt gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc
120
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct
180
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg
240
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga
300
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt
360
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg
420
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc
480
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat
540
attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg
600
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat
660
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat
720
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt
780
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag
840
cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa
900
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg
960
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct
1020
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac
1080
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca
1140
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat
1200
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact
1260
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc
1320
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga
1380
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg
1440
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg
1500
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca
1560
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta
1620
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca
1680
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg
1740
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga
1800
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa
1860
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc
1920
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg
1980
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac
2040
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct
2100
acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc
2160
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg
2220
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg
2280
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct
2340
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga
2400
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg
2460
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca
2520
tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct ggcaaaatcg gttacggttg
2580
agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa
2640
caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga
2700
aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt tgttatggct aaagcaaact
2760
cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggc caagggcatg
2820
gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc
2880
gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg tcgatatcaa agtgcatcac
2940
ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg ggatcgtcac cgtaatctgc
3000
ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca tgcttgagga gattgatgag
3060
cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact gcgagatcat agatatagat
3120
ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc gcgagagcgc caacaaccgc
3180
ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta cggagcaagt tcccgaggta
3240
atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct ccgaactcac gaccgaaaag
3300
atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg agcctacatg tgcgaatgat
3360
gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt
3420
gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg
3480
cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa acagtcataa caagccatga
3540
aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg
3600
agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca ggcttatgtc aactgggttc
3660
gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg
3720
aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg
3780
cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc
3840
aggagatcgg tagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag
3900
tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt gttcgcccag gactctagct
3960
atagttctag tggttggcct acgtacccgt agtggctatg gcagggcttg ccgccccgac
4020
gttggctgcg agccctgggc cttcacccga acttgggggt tggggtgggg aaaaggaaga
4080
aacgcgggcg tattggtccc aatggggtct cggtggggta tcgacagagt gccagccctg
4140
ggaccgaacc ccgcgtttat gaacaaacga cccaacaccc gtgcgtttta ttctgtcttt
4200
ttattgccgt catagcgcgg gttccttccg gtattgtctc cttccgtgtt tcagttagcc
4260
tcccccatct cccggtaccg catgcgtcga cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca
4320
ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg
4380
cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct cctgcaggtg tagttaatga
4440
ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgcggcgc gccgccatag agcccaccgc
4500
atccccagca tgcctgctat tgtcttccca atcctccccc ttgctgtcct gccccacccc
4560
accccccaga atagaatgac acctactcag acaatgcgat gcaatttcct cattttatta
4620
ggaaaggaca gtgggagtgg caccttccag ggtcaaggaa ggcacggggg aggggcaaac
4680
aacagatggc tggcaactag aaggcacaga caacaccacg gaattatcag tgcccagcaa
4740
cctagcccct gtccagcagc gggcaaggca ggcggcgatg agttctgccg tggcgatcgg
4800
gagggggaaa gcgaaagtcc cagaaaggag ttgacaggtg gtggcaatgc cccagccagt
4860
gggggttgcg tcagcaaaca cagagcacac cacgccacgt tgacggacaa cgggccacaa
4920
ctcctctaaa agagacagca accaggattt atacaaggag gagaaaacga aagccgtacg
4980
ggaagcaata gctagataca gaggctataa agcagcatat ccacacagcg taaaaggagc
5040
aacatagtta agaatatcag tcaatctttc acaaattttg taatccagag gttgattaac
5100
aggaacagag cgtaaataac gggaaagttt cttaacatgt ttgtcttgtg gcaatacacc
5160
tgaactagta attacatatc cctaaaaatg taaatgattg ccccaccatt ttgttttatt
5220
aacatttaaa tgtataccca aatcaagaaa aacagaacaa atatgggaat aaatggcggt
5280
aagatgctct taattaatta ggtcagtttg gtcttttcct tgatccagtt gacatatctg
5340
gacaccttgg tgtagatgcc atacttgccc ttcatggcac actcctctcc ccagctgata
5400
atgcctgtca gaaaggaggt gccctccacc tcagtcacat ggggccctcc agaatctccc
5460
tggcagctgt ccctgcctcc ctcatggaag ccagcacaaa acatgttgtt ataaatggtg
5520
aactttgtgc tcctcaggca ggtggccctg tccaccagtg gcaccctcag gtactgcagc
5580
accagggcag atcttccctt gtggaacact ctgccccagc cactcacata gccagagcca
5640
aacttcagga agatatttgt gtactccttg tcagcaatac agatgggggt cacatagctg
5700
ttcagcacca ggggctcatc cagctccagc agggcaatgt catggttgta tttgttgatg
5760
gctgcattgt agttgtggtg ggggatgatc ctgatcacat ttcttttctg ttcagtgtgc
5820
tctgtttctt caatattatg ctccccagcc accacagtga tcttcacccc agtttccaca
5880
cagtgggcag cagtgacaat ccatttttca ttcacaatgc tccctccaca gaaagcatca
5940
acttttccat tcagtaccac ctgccaggga aactgccctg gcttggcatc ttctcctcca
6000
accacccttg tgaagtcatt gaaggactgg gtgctctgag taatgttgtc caggatagtc
6060
tcagcttctg tggagttcac atagtccaca tctggaaaga cagcctcagc tctggtgagt
6120
ttgctggtct ggctcacaga aactctgcca caggggaagg gcacagctgg ctcacaactc
6180
ttctggtttt ctgccagtct gtacccttca gtgcaggagc agaccacttt attgtctgca
6240
gagttcttgc agaactgctc acatctacca tttttgatgt tgcaagtaac atccaattca
6300
cagtttttcc cctcaaatcc aaaggggcac cagcattcat agctattaat atcatcttta
6360
cagctgcccc cattaaggca ggggttgctc tcacactggt ccccatccac atactgcttc
6420
cagaactctg tggtcctctc tgtgttctca aagacctccc tggcctcttc aaatgagcac
6480
ttctcctcca tgcattctct ttccaggttg ccctgcacaa attcctccag cttgccactg
6540
ttgtacctct tgggtctgtt gagaatcttg ttggcatttt catggtctaa aaacactgtc
6600
actgggcaag ggaagaaaaa aaaggattgt taaatactga agaagcggcc gctctagagc
6660
atggctacgt agataagtag catggcgggt taatcattaa ctacaaggaa cccctagtga
6720
tggagttggc cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg
6780
tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagctgcc
6840
tgcaggggcc ggccgcctag gagatccgaa ccagataagt gaaatctagt tccaaactat
6900
tttgtcattt ttaattttcg tattagctta cgacgctaca cccagttccc atctattttg
6960
tcactcttcc ctaaataatc cttaaaaact ccatttccac ccctcccagt tcccaactat
7020
tttgtccgcc cacagcgggg catttttctt cctgttatgt ttttaatcaa acatcctgcc
7080
aactccatgt gacaaaccgt catcttcggc tacttt
7116
<210> 833
<211> 7817
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 833
ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga
60
ctgaatatca acgcttattt gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc
120
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct
180
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg
240
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga
300
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt
360
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg
420
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc
480
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat
540
attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg
600
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat
660
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat
720
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt
780
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag
840
cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa
900
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg
960
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct
1020
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac
1080
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca
1140
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat
1200
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact
1260
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc
1320
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga
1380
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg
1440
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg
1500
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca
1560
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta
1620
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca
1680
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg
1740
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga
1800
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa
1860
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc
1920
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg
1980
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac
2040
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct
2100
acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc
2160
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg
2220
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg
2280
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct
2340
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga
2400
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg
2460
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca
2520
tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct ggcaaaatcg gttacggttg
2580
agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa
2640
caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga
2700
aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt tgttatggct aaagcaaact
2760
cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggc caagggcatg
2820
gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc
2880
gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg tcgatatcaa agtgcatcac
2940
ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg ggatcgtcac cgtaatctgc
3000
ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca tgcttgagga gattgatgag
3060
cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact gcgagatcat agatatagat
3120
ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc gcgagagcgc caacaaccgc
3180
ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta cggagcaagt tcccgaggta
3240
atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct ccgaactcac gaccgaaaag
3300
atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg agcctacatg tgcgaatgat
3360
gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt
3420
gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg
3480
cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa acagtcataa caagccatga
3540
aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg
3600
agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca ggcttatgtc aactgggttc
3660
gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg
3720
aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg
3780
cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc
3840
aggagatcgg tagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag
3900
tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt gttcgcccag gactctagct
3960
atagttctag tggttggcct acgtacccgt agtggctatg gcagggcttg ccgccccgac
4020
gttggctgcg agccctgggc cttcacccga acttgggggt tggggtgggg aaaaggaaga
4080
aacgcgggcg tattggtccc aatggggtct cggtggggta tcgacagagt gccagccctg
4140
ggaccgaacc ccgcgtttat gaacaaacga cccaacaccc gtgcgtttta ttctgtcttt
4200
ttattgccgt catagcgcgg gttccttccg gtattgtctc cttccgtgtt tcagttagcc
4260
tcccccatct cccggtaccg catgcgtcga cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca
4320
ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg
4380
cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct cctgcaggtg tagttaatga
4440
ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgcggcgc gccgtctttc tgtcaatgca
4500
cacatttcta ctggacagca ctgctctaca attctcacac tcaaggtgga aaaaggtgtt
4560
ttaaaacttt aactaatact accagaaata ttaagtgggc tttcagcatt ataacttaca
4620
ggcctttgaa atgttgttct cccaaatcat tataccgatg ggcgatctca ctcttgtctg
4680
tggaaacagg gagagaaaaa ccacacaaca tatttaaaga ttgatgaaga caactaactg
4740
taatatgctg ctttttgttc ttctcttcac tgacctaagc tactccctga agatgccagt
4800
tcccgatcgg ccatagagcc caccgcatcc ccagcatgcc tgctattgtc ttcccaatcc
4860
tcccccttgc tgtcctgccc caccccaccc cccagaatag aatgacacct actcagacaa
4920
tgcgatgcaa tttcctcatt ttattaggaa aggacagtgg gagtggcacc ttccagggtc
4980
aaggaaggca cgggggaggg gcaaacaaca gatggctggc aactagaagg cacagacaac
5040
accacggaat tatcagtgcc cagcaaccta gcccctgtcc agcagcgggc aaggcaggcg
5100
gcgatgagtt ctgccgtggc gatcgggagg gggaaagcga aagtcccaga aaggagttga
5160
caggtggtgg caatgcccca gccagtgggg gttgcgtcag caaacacaga gcacaccacg
5220
ccacgttgac ggacaacggg ccacaactcc tctaaaagag acagcaacca ggatttatac
5280
aaggaggaga aaacgaaagc cgtacgggaa gcaatagcta gatacagagg ctataaagca
5340
gcatatccac acagcgtaaa aggagcaaca tagttaagaa tatcagtcaa tctttcacaa
5400
attttgtaat ccagaggttg attaacagga acagagcgta aataacggga aagtttctta
5460
acatgtttgt cttgtggcaa tacacctgaa ctagtaatta catatcccta aaaatgtaaa
5520
tgattgcccc accattttgt tttattaaca tttaaatgta tacccaaatc aagaaaaaca
5580
gaacaaatat gggaataaat ggcggtaaga tgctcttaat taattaggtc agtttggtct
5640
tttccttgat ccagttgaca tatctggaca ccttggtgta gatgccatac ttgcccttca
5700
tggcacactc ctctccccag ctgataatgc ctgtcagaaa ggaggtgccc tccacctcag
5760
tcacatgggg ccctccagaa tctccctggc agctgtccct gcctccctca tggaagccag
5820
cacaaaacat gttgttataa atggtgaact ttgtgctcct caggcaggtg gccctgtcca
5880
ccagtggcac cctcaggtac tgcagcacca gggcagatct tcccttgtgg aacactctgc
5940
cccagccact cacatagcca gagccaaact tcaggaagat atttgtgtac tccttgtcag
6000
caatacagat gggggtcaca tagctgttca gcaccagggg ctcatccagc tccagcaggg
6060
caatgtcatg gttgtatttg ttgatggctg cattgtagtt gtggtggggg atgatcctga
6120
tcacatttct tttctgttca gtgtgctctg tttcttcaat attatgctcc ccagccacca
6180
cagtgatctt caccccagtt tccacacagt gggcagcagt gacaatccat ttttcattca
6240
caatgctccc tccacagaaa gcatcaactt ttccattcag taccacctgc cagggaaact
6300
gccctggctt ggcatcttct cctccaacca cccttgtgaa gtcattgaag gactgggtgc
6360
tctgagtaat gttgtccagg atagtctcag cttctgtgga gttcacatag tccacatctg
6420
gaaagacagc ctcagctctg gtgagtttgc tggtctggct cacagaaact ctgccacagg
6480
ggaagggcac agctggctca caactcttct ggttttctgc cagtctgtac ccttcagtgc
6540
aggagcagac cactttattg tctgcagagt tcttgcagaa ctgctcacat ctaccatttt
6600
tgatgttgca agtaacatcc aattcacagt ttttcccctc aaatccaaag gggcaccagc
6660
attcatagct attaatatca tctttacagc tgcccccatt aaggcagggg ttgctctcac
6720
actggtcccc atccacatac tgcttccaga actctgtggt cctctctgtg ttctcaaaga
6780
cctccctggc ctcttcaaat gagcacttct cctccatgca ttctctttcc aggttgccct
6840
gcacaaattc ctccagcttg ccactgttgt acctcttggg tctgttgaga atcttgttgg
6900
cattttcatg gtctaaaaac actgtcactg ggcaagggaa gaaaaaaaag gattgttaaa
6960
tactgaagaa acaggaaaat ctgaaggtgg caatggttcc tctctgctac actcaaagtt
7020
atattttttc accaacatta ttatttttaa aacccgttaa gtgtttatat ctgtgcattc
7080
aaactcaaga tttagtgttt ctgtcatgtt tgtaaatatc tactaagaca atggtaaata
7140
agaaataaag gtaaatataa atggaaactc catttataaa attagtaaca cacactttta
7200
atttttagta tagcatggtc gagcaggcag gccctatgag accgtaataa attcaactgt
7260
atccaacgta atttgagtca ttctgcctag catttttttt taattaaaag aaatttaaag
7320
ctaagctttc aaaatccccc attatgcggc cgctctagag catggctacg tagataagta
7380
gcatggcggg ttaatcatta actacaagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc
7440
tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt
7500
tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc cggccgccta
7560
ggagatccga accagataag tgaaatctag ttccaaacta ttttgtcatt tttaattttc
7620
gtattagctt acgacgctac acccagttcc catctatttt gtcactcttc cctaaataat
7680
ccttaaaaac tccatttcca cccctcccag ttcccaacta ttttgtccgc ccacagcggg
7740
gcatttttct tcctgttatg tttttaatca aacatcctgc caactccatg tgacaaaccg
7800
tcatcttcgg ctacttt
7817
<210> 834
<211> 9661
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полинуклеотид
<400> 834
ttctctgtca cagaatgaaa atttttctgt catctcttcg ttattaatgt ttgtaattga
60
ctgaatatca acgcttattt gcagcctgaa tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc
120
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct
180
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg
240
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga
300
ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt
360
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg
420
aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc
480
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat
540
attaacgttt acaatttcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg
600
tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat
660
gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat
720
tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt
780
aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag
840
cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa
900
agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg
960
ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct
1020
tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac
1080
tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca
1140
caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat
1200
accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgtagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact
1260
attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc
1320
ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga
1380
taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg
1440
taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg
1500
aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca
1560
agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta
1620
ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca
1680
ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg
1740
cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga
1800
tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa
1860
tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc
1920
tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg
1980
tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac
2040
ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct
2100
acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc
2160
ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg
2220
gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg
2280
ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct
2340
ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga
2400
taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg
2460
cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca
2520
tctgtgcggt atttcacacc gcagaccagc cgcgtaacct ggcaaaatcg gttacggttg
2580
agtaataaat ggatgccctg cgtaagcggg tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa
2640
caaaatagat ctaaactatg acaataaagt cttaaactag acagaatagt tgtaaactga
2700
aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat actggacttt tgttatggct aaagcaaact
2760
cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc gtattaaaga ggggcgtggc caagggcatg
2820
gtaaagacta tattcgcggc gttgtgacaa tttaccgaac aactccgcgg ccgggaagcc
2880
gatctcggct tgaacgaatt gttaggtggc ggtacttggg tcgatatcaa agtgcatcac
2940
ttcttcccgt atgcccaact ttgtatagag agccactgcg ggatcgtcac cgtaatctgc
3000
ttgcacgtag atcacataag caccaagcgc gttggcctca tgcttgagga gattgatgag
3060
cgcggtggca atgccctgcc tccggtgctc gccggagact gcgagatcat agatatagat
3120
ctcactacgc ggctgctcaa acctgggcag aacgtaagcc gcgagagcgc caacaaccgc
3180
ttcttggtcg aaggcagcaa gcgcgatgaa tgtcttacta cggagcaagt tcccgaggta
3240
atcggagtcc ggctgatgtt gggagtaggt ggctacgtct ccgaactcac gaccgaaaag
3300
atcaagagca gcccgcatgg atttgacttg gtcagggccg agcctacatg tgcgaatgat
3360
gcccatactt gagccaccta actttgtttt agggcgactg ccctgctgcg taacatcgtt
3420
gctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg
3480
cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtacaaaaaa acagtcataa caagccatga
3540
aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg
3600
agcgcatacg ctacttgcat tacagtttac gaaccgaaca ggcttatgtc aactgggttc
3660
gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg
3720
aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg
3780
cattggcggc cttgctgttc ttctacggca aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc
3840
aggagatcgg tagacctcgg ccgtcgcggc gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag
3900
tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg agcatcgttt gttcgcccag gactctagct
3960
atagttctag tggttggcct acgtacccgt agtggctatg gcagggcttg ccgccccgac
4020
gttggctgcg agccctgggc cttcacccga acttgggggt tggggtgggg aaaaggaaga
4080
aacgcgggcg tattggtccc aatggggtct cggtggggta tcgacagagt gccagccctg
4140
ggaccgaacc ccgcgtttat gaacaaacga cccaacaccc gtgcgtttta ttctgtcttt
4200
ttattgccgt catagcgcgg gttccttccg gtattgtctc cttccgtgtt tcagttagcc
4260
tcccccatct cccggtaccg catgcgtcga cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca
4320
ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg
4380
cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct cctgcaggtg tagttaatga
4440
ttaacccgcc atgctactta tctacgtagc catgcggcgc gccccttcca tgttttctat
4500
ctgacactaa aagctaggag taaagtcatt ataataaaaa caaatcaagg gaatttgagg
4560
agcaggtaaa atcaagctgg ggaaccttgc acagctcctc atgggctctg ctcctttggg
4620
agaagcctat gtttttacta cgttccctgt aaaactaaag aataatacct ccctccctcc
4680
aacccctccc tccaaaccct ctcatgtaag cccccttgct ctctttcaga tccatgacct
4740
cagttttcat tcattgttgt tacatgcata tacatttatg taaatacatg tatattccta
4800
aatgtagcct gcttagtctg catgttattc atacgtatgt tttagggatg accattggta
4860
ttggagaggc agttggtatg ctcttccaag gcaacttctt ctctctgcat tccttagttg
4920
cctacagttc tttttacagg gtttagctct tgtggtcttt ccctcatcca ctttggcata
4980
tctactgtca ctgtcactgt caagctccca tttgggcagt catgtggtga gactttttga
5040
gtgtattgta gcttctgcaa ttactatgaa atggagtccc acagaaaatt cccatcaccc
5100
tggctttatc aatctctctg ctgccctctg ccacagtgtt cccggggcct taagtgatgg
5160
agtcatgatt ggctttgaaa cagagttcca gaaagcagga aagtagatcc acaaaatcag
5220
aaggtactca caagggattt gtcacagttg gcggcagact catcggcaac acacgtcttt
5280
gcaaagtctg ttacttcctg cactaatttg gcatgctcat cgtatgagca tttctggaga
5340
tactgggaaa aggcaatcag gactctgaaa agcagacaca aaaacctcag tatgaggcaa
5400
gtggctctcc caaccagcaa atcatgcctg tgtatacctg cgagattttg tatatctttc
5460
atacaactat ctagaaagcc tcttcccgtc agctattctc tgaggcgtaa tgggaacacc
5520
tgcctttcca agcaaaggaa tatggacttc taccatgctg aagtgcagat gcacatatgt
5580
gtcaatagat ttatgaacat gaggcaaaca ggcaaactac tctctaaatt tattcattgt
5640
caaggctaga tattatataa gtcctttgaa ttgtttcttt tctaaccata tacctctgtt
5700
atttggaata catgatacta ttgaccttct aaaaataaat taattactca tttttttact
5760
acattaaaac attactaagg ttggagatgt gacttaagta tagacccctt acttcacatg
5820
tataaggttt cagtactaca aagagacaaa ataatgttct caagatacca tgagatctta
5880
ttgcattaaa agttagtaag tgagctgccc ccaaaactat agttcataga cctttccaga
5940
aataaaaaat aagattccag acttaacaag ttagatgtgg gctccagatt ctctctccag
6000
gaaaggagct actagccaca catggctaga tacattcaat taaaattaac tattatttga
6060
atgtgtgctt ctcagttaca cttgccatgt gcaaagtgct tgatagcctt gtgatctctg
6120
gctgccacat tgctcagcac agatccacag tctttctgtc aatgcacaca tttctactgg
6180
acagcactgc tctacaattc tcacactcaa ggtggaaaaa ggtgttttaa aactttaact
6240
aatactacca gaaatattaa gtgggctttc agcattataa cttacaggcc tttgaaatgt
6300
tgttctccca aatcattata ccgatgggcg atctcactct tgtctgtgga aacagggaga
6360
gaaaaaccac acaacatatt taaagattga tgaagacaac taactgtaat atgctgcttt
6420
ttgttcttct cttcactgac ctaagctact ccctgaagat gccagttccc gatcgtgcca
6480
tagagcccac cgcatcccca gcatgcctgc tattgtcttc ccaatcctcc cccttgctgt
6540
cctgccccac cccacccccc agaatagaat gacacctact cagacaatgc gatgcaattt
6600
cctcatttta ttaggaaagg acagtgggag tggcaccttc cagggtcaag gaaggcacgg
6660
gggaggggca aacaacagat ggctggcaac tagaaggcac agacaacacc acggaattat
6720
cagtgcccag caacctagcc cctgtccagc agcgggcaag gcaggcggcg atgagttctg
6780
ccgtggcgat cgggaggggg aaagcgaaag tcccagaaag gagttgacag gtggtggcaa
6840
tgccccagcc agtgggggtt gcgtcagcaa acacagagca caccacgcca cgttgacgga
6900
caacgggcca caactcctct aaaagagaca gcaaccagga tttatacaag gaggagaaaa
6960
cgaaagccgt acgggaagca atagctagat acagaggcta taaagcagca tatccacaca
7020
gcgtaaaagg agcaacatag ttaagaatat cagtcaatct ttcacaaatt ttgtaatcca
7080
gaggttgatt aacaggaaca gagcgtaaat aacgggaaag tttcttaaca tgtttgtgca
7140
atacacctga actagtaatt acatatccct aaaaatgtaa atgattgccc caccattttg
7200
ttttattaac ccaaatcaag aaaaacagaa caaatatggg aataaatggc ggtaagatgc
7260
tcttaattaa ttaggtcagt ttggtctttt ccttgatcca gttgacatat ctggacacct
7320
tggtgtagat gcatacttgc ccttcatggc acactcctct ccccagctga taatgcctgt
7380
cagaaaggag gtgccctcca cctcagtcac atggggccct ccagaatctc cctggcagct
7440
gtccctgcct ccctcatgga agccagcaca aaacatgttg ttataaatgg tgaactttgt
7500
gctcctcagg caggtggccc tgtccaccag tggcaccctc aggtactgca gcaccagggc
7560
agatcttccc ttgtggaaca ctctgcccca gccactcaca tagccagagc caaacttcag
7620
gaagatattt gtgtactcct tgtcagcaat acagatgggg gtcacatagc tgttcagcac
7680
caggggctca tccagctcca gcagggcaat gtcatggttg tatttgttga tggctgcatt
7740
gtagttgtgg tgggggatga tcctgatcac atttcttttc tgttcagtgt gctctgtttc
7800
ttcaatatta tgctccccag ccaccacagt gatcttcacc ccagtttcca cacagtgggc
7860
agcagtgaca atccattttt cattcacaat gctccctcca cagaaagcat caacttttcc
7920
attcagtacc acctgccagg gaaactgccc tggcttggca tcttctcctc caaccaccct
7980
tgtgaagtca ttgaaggact gggtgctctg agtaatgttg tccaggatag tctcagcttc
8040
tgtggagttc acatagtcca catctggaaa gacagcctca gctctggtga gtttgctggt
8100
ctggctcaca gaaactctgc cacaggggaa gggcacagct ggctcacaac tcttctggtt
8160
ttctgccagt ctgtaccctt cagtgcagga gcagaccact ttattgtctg cagagttctt
8220
gcagaactgc tcacatctac catttttgat gttgcaagta acatccaatt cacagttttt
8280
cccctcaaat ccaaaggggc accagcattc atagctatta atatcatctt tacagctgcc
8340
cccattaagg caggggttgc tctcacactg gtccccatcc acatactgct tccagaactc
8400
tgtggtcctc tctgtgttct caaagacctc cctggcctct tcaaatgagc acttctcctc
8460
catgcattct ctttccaggt tgccctgcac aaattcctcc agcttgccac tgttgtacct
8520
cttgggtctg ttgagaatct tgttggcatt ttcatggtct aaaaacactg tcactgggca
8580
agggaagaaa aaaaaggatt gttaaatact gaagaaacag gaaaatctga aggtggcaat
8640
ggttcctctc tgctacactc aaagttatat tttttcacca acattattat ttttaaaacc
8700
cgttaagtgt ttatatctgt gcattcaaac tcaagattta gtgtttctgt catgtttgta
8760
aatatctact aagacaatgg taaataagaa ataaaggtaa atataaatgg aaactccatt
8820
tataaaatta gtaacacaca cttttaattt ttagtatagc atggtcgagc aggcaggccc
8880
tatgagaccg taataaattc aactgtatcc aacgtaattt gagtcattct gcctagcatt
8940
tttttttaat taaaagaaat ttaaagctaa gctttcaaaa tcccccatta ttgtcatcaa
9000
agataccaaa aatatatcaa taatataacc acctaagggt tctcagatgc aaataatgac
9060
aataataaca acaacaacag taataataat ctagaaatca gcactaaagg aaaatttaac
9120
tattttaaaa taccaggctt ccattactag aaaaatacaa gcagagatga aaaaacataa
9180
aactcttacg cggccgctct agagcatggc tacgtagata agtagcatgg cgggttaatc
9240
attaactaca aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg
9300
ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca
9360
gtgagcgagc gagcgcgcag ctgcctgcag gggccggccg cctaggagat ccgaaccaga
9420
taagtgaaat ctagttccaa actattttgt catttttaat tttcgtatta gcttacgacg
9480
ctacacccag ttcccatcta ttttgtcact cttccctaaa taatccttaa aaactccatt
9540
tccacccctc ccagttccca actattttgt ccgcccacag cggggcattt ttcttcctgt
9600
tatgttttta atcaaacatc ctgccaactc catgtgacaa accgtcatct tcggctactt
9660
t
9661
<210> 835
<211> 60
<212> ДНК
<213> Mus musculus
<400> 835
ggaaccattg ccaccttcag attttcctgt acgatcggga actggcatct tcagggagta
60
<210> 836
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 836
gatcgggaac tggcatcttc
20
<210> 837
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 837
gatcgtacag gaaaatctga
20
<210> 838
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 838
atcgggaact ggcatcttca
20
<210> 839
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 839
cgtacaggaa aatctgaagg
20
<210> 840
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 840
tcagattttc ctgtacgatc
20
<210> 841
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
олигонуклеотид
<400> 841
tttcctgtac gatcgggaac
20
<---

Claims (68)

1. Способ вставки донорной последовательности в предварительно определенный сайт вставки на хромосоме в клетке-хозяине, включающий:
введение в клетку-хозяина направляющей РНК (нРНК) и мРНК, кодирующей фермент Cas; и композиции, содержащей липидную наночастицу (LNP), содержащую бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК); при этом зкДНК-вектор содержит нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность редактирующей ген нуклеиновой кислоты, содержащую 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность матрицы репарации и 3'-гомологичное плечо, и причем донорная последовательность вставлена в хромосому в указанном сайте вставки или рядом с ним посредством гомологичной рекомбинации.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нРНК содержит первую нРНК.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный фермент Cas выбран из группы, состоящей из Cas9, никующей Cas9 (nCas9) и деактивированной Cas (dCas).
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что указанный фермент Cas представляет собой деактивированную нуклеазу Cas (dCas), которая образует комплекс с нРНК, нацеленной на промоторную область гена-мишени.
5. Способ по п. 4, дополнительно включающий эффекторный домен KRAB.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нРНК направлена на сайт начала транскрипции гена-мишени и активирует ген-мишень (система CRISPRa).
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нРНК содержит первую рРНК и вторую нРНК.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нРНК нацелена на акцепторный сайт сплайсинга или донорный сайт сплайсинга.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор содержит 5'- гомологичное плечо и 3'-гомологичное плечо по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что указанное 5'-гомологичное плечо и указанное 3'-гомологичное плечо состоят из приблизительно от 250 до 2000 п.о.
11. Способ по п. 9, где указанное 5'-гомологичное плечо и/или указанное 3'-гомологичное плечо проксимальны к ITR; где по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность расположена между указанным 5'-гомологичным плечом и указанным 3'-гомологичным плечом; и/или где по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность, которая расположена между указанным 5'-гомологичным плечом и указанным 3'-гомологичным плечом, содержит ген-мишень.
12. Способ по п. 9, включающий первый сайт рестрикции эндонуклеазой, расположенный
перед указанным 5'-гомологичным плечом и/или второй сайт рестрикции эндонуклеазой после указанного 3'-гомологичного плеча; необязательно где указанный первый сайт рестрикции эндонуклеазой и указанный второй сайт рестрикции эндонуклеазой являются
одинаковыми сайтами рестрикции эндонуклеазой.
13. Способ по п. 9, где указанный зкДНК-вектор дополнительно содержит один или несколько сайтов поли(А); где указанный зкДНК-вектор содержит по меньшей мере одно из регуляторного элемента трансгена и сайта поли(А) после 3'-гомологичного плеча и близко к нему и/или перед 5'-гомологичным плечом и близко к нему; где указанный зкДНК-вектор содержит 2А и сайт маркера селекции перед 3'-гомологичным плечом и близко к нему; где указанное 5'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной перед сайтом расщепления нуклеазой в хромосоме;
где указанное 3'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной после сайта расщепления нуклеазой в хромосоме; где указанный зкДНК-вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую энхансер гомологичной рекомбинации; необязательно где указанный энхансер гомологичной рекомбинации выбирают из группы, состоящей из вышерасположенной последовательности позднего энхансера полиА-сигнала SV40, раннего энхансерного элемента цитомегаловируса, энхансера RSV и энхансера CMV; и/или где по меньшей мере один ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт.
14. Способ по п. 1, отличающийся тем, что: по меньшей мере один ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт; указанные фланкирующие ITR являются симметричными или асимметричными; один или более из указанных ITR являются синтетическими; один или более из указанных ITR не являются ITR дикого типа; по меньшей мере один из указанных ITR модифицируют путем делеции, вставки и/или замены в по меньшей мере одной из областей указанного ITR, выбранной из группы, состоящей из A, A', B, B', С, С', D и D', где указанная делеция, вставка и/или замена приводит к удалению всей или части структуры стебель - петля, образуемой указанными областями A, A', B, B', C или C'; оба ITR изменяют таким образом, чтобы это приводило к общей трехмерной симметрии, когда указанные ITR инвертированы относительно друг друга, причем указанное изменение представляет собой делецию, вставку и/или замену в областях указанного ITR, выбранных из A, A', B, B', C, C', D и D'; и/или один или более из указанных фланкирующих ITR получены из серотипа AAV, выбранного из группы, состоящей AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV 10, AAV11 и AAV12.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанные фланкирующие ITR являются асимметричными, причем по меньшей мере один из указанных ITR изменен по сравнению с последовательностью ITR AAV дикого типа посредством делеции, добавления или замены, которые влияют на общую трехмерную конформацию указанного ITR.
16. Способ по п. 11, отличающийся тем, что ген-мишень кодирует терапевтический белок.
17. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение указанной клетки-хозяина нуждающемуся в этом субъекту.
18. Способ по п. 17, причем указанный нуждающийся в этом субъект имеет генетическое заболевание, вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, рак или аутоиммунное заболевание.
19. Способ по любому из пп. 1-18, отличающийся тем, что указанный способ осуществляют in vivo для коррекции однонуклеотидного полиморфизма (SNP), ассоциированного с заболеванием.
20. Способ по любому из пп. 1-19, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.
21. Способ по любому из пп. 1-20, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой Т-клетку или CD34+ клетку.
22. Способ по любому из пп. 1-21, дополнительно включающий введение указанной клетки-хозяина нуждающемуся в этом субъекту.
23. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную направляющую РНК и/или мРНК, кодирующую фермент Cas, доставляют в транс-конфигурации (in trans).
24. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная донорная последовательность является беспромоторной.
25. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная матрица репарации представляет собой полинуклеотид для вставки в хромосому клетки-хозяина.
26. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная донорная последовательность представляет собой полинуклеотид, который подлежит вставке в хромосому клетки-хозяина для изготовления терапевтического белка.
27. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанная нРНК представляет собой одиночную направляющую РНК (онРНК).
28. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанное генетическое заболевание является заболеванием печени.
29. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанное генетическое заболевание является глазным заболеванием.
30. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанное генетическое заболевание выбрано из группы, состоящей из гемофилии A, гемофилии B, болезни Гоше и фенилкетонурии.
31. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанное генетическое заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Штаргардта, врожденного амавроза Лебера (LCA), синдрома Ушера и сосудистой или влажной макулодистрофии.
32. Способ по п. 4, отличающийся тем, что ген-мишень выбран из группы, состоящей из β-глобина человека, BCL11A человека, KLF1 человека, человеческого γ-регуляторного гена, CCR5 человека, CXCR4 человека, PPP1R12C, HPRT мыши и человека, человеческого альбумина, человеческого фактора IX, LRRK2 человека, Htt человека, RHO человека, CFTR, TRAC, TRBC, PD1 человека, CTLA-4 человека, HLA Cl1: HLA A2, HLA A3, HLA B, HLAC, HLA кл.II: DBP2, DRA, TAP1, TAP2, Тапасина, CIITA, RFX5, или выбран из группы, состоящей из HBB, BCL11A, KLF1, HBG1, CCR5, CXCR4, HPRT, ALB, Фактор VIII, Фактор IX, LRRK2, Htt, RHO, TCRA, TCRB, PD-1, CTLA-4, HLA-A, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, LMP7, TAPBP, DMD, RFX5, B. napus FAD3, B. napus FAD2, FAD2 сои, Zea mays ZP15, B-кетоацил АСР, синтаза II (KASII), MDH томата, B. napus EPSPS, паралоги C + D, Паралог D, Паралог A + B, (AAVS1), GR, IL2RG и SFTPB.
33. Способ по п. 6, отличающийся тем, что ген-мишень выбран из группы, состоящей из β-глобина человека, BCL11A человека, KLF1 человека, человеческого γ-регуляторного гена, CCR5 человека, CXCR4 человека, PPP1R12C, HPRT мыши и человека, человеческого альбумина, человеческого фактора IX, LRRK2 человека, Htt человека, RHO человека, CFTR, TRAC, TRBC, PD1 человека, CTLA-4 человека, HLA Cl1: HLA A2, HLA A3, HLA B, HLAC, HLA кл.II: DBP2, DRA, TAP1, TAP2, Тапасина, CIITA, RFX5, или выбран из группы, состоящей из HBB, BCL11A, KLF1, HBG1, CCR5, CXCR4, HPRT, ALB, Фактор VIII, Фактор IX, LRRK2, Htt, RHO, TCRA, TCRB, PD-1, CTLA-4, HLA-A, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, LMP7, TAPBP, DMD, RFX5, B. napus FAD3, B. napus FAD2, FAD2 сои, Zea mays ZP15, B-кетоацил АСР синтаза II (KASII), MDH томата, B. napus EPSPS, паралоги C + D, Паралог D, Паралог A + B, (AAVS1), GR, IL2RG и SFTPB.
34. Способ по п. 11, отличающийся тем, что ген-мишень выбран из группы, состоящей из β-глобина человека, BCL11A человека, KLF1 человека, человеческого γ-регуляторного гена, CCR5 человека, CXCR4 человека, PPP1R12C, HPRT мыши и человека, человеческого альбумина, человеческого фактора IX, LRRK2 человека, Htt человека, RHO человека, CFTR, TRAC, TRBC, PD1 человека, CTLA-4 человека, HLA Cl1: HLA A2, HLA A3, HLA B, HLAC, HLA кл.II: DBP2, DRA, TAP1, TAP2, Тапасина, CIITA, RFX5, или выбран из группы, состоящей из HBB, BCL11A, KLF1, HBG1, CCR5, CXCR4, HPRT, ALB, Фактор VIII, Фактор IX, LRRK2, Htt, RHO, TCRA, TCRB, PD-1, CTLA-4, HLA-A, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, LMP7, TAPBP, DMD, RFX5, B. napus FAD3, B. napus FAD2, FAD2 сои, Zea mays ZP15, B-кетоацил АСР синтаза II (KASII), MDH томата, B. napus EPSPS, паралоги C + D, Паралог D, Паралог A + B, (AAVS1), GR, IL2RG и SFTPB.
35. Способ редактирования генов хромосомы в клетке-хозяине, включающий:
введение в клетку-хозяина направляющей РНК (нРНК) и мРНК, кодирующей фермент Cas; и композиции, содержащей липидную наночастицу (LNP), содержащую бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК); при этом зкДНК-вектор содержит нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна нуклеотидная последовательность представляет собой последовательность редактирующей ген нуклеиновой кислоты, причем последовательность редактирующей ген нуклеиновой кислоты содержит донорную последовательность, причем указанную хромосому восстанавливают с использованием негомологичного присоединения концов (NHEJ).
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанный фермент Cas выбран из группы, состоящей из Cas9, никующей Сas9 (nCas9) и деактивированной Cas (dCas).
37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что указанный фермент Cas представляет собой деактивированную нуклеазу Cas (dCas), которая образует комплекс с нРНК, нацеленной на промоторную область гена-мишени.
38. Способ по п. 35, отличающийся тем, что нРНК направлена на сайт начала транскрипции гена-мишени и активирует ген-мишень (система CRISPRa).
39. Способ по п. 35, отличающийся тем, что нРНК содержит первую нРНК; или первую нРНК и вторую нРНК.
40. Способ по п. 35, отличающийся тем, что нРНК нацелена на акцепторный сайт сплайсинга или донорный сайт сплайсинга.
41. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанная донорная последовательность содержит ген-мишень.
42. Способ по п. 41, отличающийся тем, что ген-мишень кодирует терапевтический белок.
43. Способ по п. 35, отличающийся тем, что:
по меньшей мере один ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт; указанные фланкирующие ITR являются симметричными или асимметричными; один или более из указанных ITR являются синтетическими; один или более из указанных ITR не являются ITR дикого типа; по меньшей мере один из указанных ITR модифицируют путем делеции, вставки и/или замены в по меньшей мере одной из областей указанного ITR, выбранной из группы, состоящей из A, A', B, B', С, С', D и D', где указанная делеция, вставка и/или замена приводит к удалению всей или части структуры стебель - петля, образуемой указанными областями A, A', B, B', C или C'; оба ITR изменяют таким образом, чтобы это приводило к общей трехмерной симметрии, когда указанные ITR инвертированы относительно друг друга, причем указанное изменение представляет собой делецию, вставку и/или замену в областях указанного ITR, выбранных из A, A', B, B', C, C', D и D'; и/или один или более из указанных фланкирующих ITR получены из серотипа AAV, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
44. Способ по п. 43, отличающийся тем, что указанные фланкирующие ITR являются асимметричными, причем по меньшей мере один из указанных ITR изменен по сравнению с последовательностью ITR AAV дикого типа посредством делеции, добавления или замены, которые влияют на общую трехмерную конформацию указанного ITR.
45. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.
46. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанный способ осуществляют in vivo для коррекции однонуклеотидного полиморфизма (SNP), ассоциированного с заболеванием.
47. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанная клетка-хозяин представляет собой Т-клетку или CD34+ клетку.
48. Способ по п. 35, дополнительно включающий введение указанной клетки-хозяина нуждающемуся в этом субъекту.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что указанный нуждающийся в этом субъект имеет генетическое заболевание, вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, рак или аутоиммунное заболевание.
50. Способ по п. 49, отличающийся тем, что указанное генетическое заболевание является заболеванием печени.
51. Способ по п. 49, отличающийся тем, что указанное генетическое заболевание является глазным заболеванием.
52. Способ по п. 49, отличающийся тем, что указанное генетическое заболевание выбрано из группы, состоящей из гемофилии A, гемофилии B, болезни Гоше и фенилкетонурии.
53. Способ по п. 49, отличающийся тем, что указанное генетическое заболевание выбрано из группы, состоящей из болезни Штаргардта, врожденного амавроза Лебера (LCA), синдрома Ушера и сосудистой или влажной макулодистрофии.
54. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанную направляющую РНК и/или мРНК, кодирующую фермент Cas, доставляют в транс-конфигурации (in trans).
55. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанная донорная последовательность является беспромоторной.
56. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанная донорная последовательность представляет собой матрицу репарации.
57. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанная донорная последовательность представляет собой полинуклеотид для вставки в хромосому клетки-хозяина.
58. Способ по п. 35, отличающийся тем, что указанная донорная последовательность представляет собой полинуклеотид, который подлежит вставке в хромосому клетки-хозяина для изготовления терапевтического белка.
59. Способ по п.35, отличающийся тем, что указанная нРНК представляет собой одиночную направляющую РНК (онРНК).
60. Способ по п. 37, отличающийся тем, что ген-мишень выбран из группы, состоящей из β-глобина человека, BCL11A человека, KLF1 человека, человеческого γ-регуляторного гена, CCR5 человека, CXCR4 человека, PPP1R12C, HPRT мыши и человека, человеческого альбумина, человеческого фактора IX, LRRK2 человека, Htt человека, RHO человека, CFTR, TRAC, TRBC, PD1 человека, CTLA-4 человека, HLA Cl1: HLA A2, HLA A3, HLA B, HLAC, HLA кл.II: DBP2, DRA, TAP1, TAP2, Тапасина, CIITA, RFX5, или выбран из группы, состоящей из HBB, BCL11A, KLF1, HBG1, CCR5, CXCR4, HPRT, ALB, Фактор VIII, Фактор IX, LRRK2, Htt, RHO, TCRA, TCRB, PD-1, CTLA-4, HLA-A, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, LMP7, TAPBP, DMD, RFX5, B. napus FAD3, B. napus FAD2, FAD2 сои, Zea mays ZP15, B-кетоацил АСР синтаза II (KASII), MDH томата, B. napus EPSPS, паралоги C + D, Паралог D, Паралог A + B, (AAVS1), GR, IL2RG и SFTPB.
61. Способ по п. 38, отличающийся тем, что ген-мишень выбран из группы, состоящей из β-глобина человека, BCL11A человека, KLF1 человека, человеческого γ-регуляторного гена, CCR5 человека, CXCR4 человека, PPP1R12C, HPRT мыши и человека, человеческого альбумина, человеческого фактора IX, LRRK2 человека, Htt человека, RHO человека, CFTR, TRAC, TRBC, PD1 человека, CTLA-4 человека, HLA Cl1: HLA A2, HLA A3, HLA B, HLAC, HLA кл.II: DBP2, DRA, TAP1, TAP2, Тапасина, CIITA, RFX5, или выбран из группы, состоящей из HBB, BCL11A, KLF1, HBG1, CCR5, CXCR4, HPRT, ALB, Фактор VIII, Фактор IX, LRRK2, Htt, RHO, TCRA, TCRB, PD-1, CTLA-4, HLA-A, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, LMP7, TAPBP, DMD, RFX5, B. napus FAD3, B. napus FAD2, FAD2 сои, Zea mays ZP15, B-кетоацил АСР синтаза II (KASII), MDH томата, B. napus EPSPS, паралоги C + D, Паралог D, Паралог A + B, (AAVS1), GR, IL2RG и SFTPB.
62. Способ по п. 41, отличающийся тем, что ген-мишень выбран из группы, состоящей из β-глобина человека, BCL11A человека, KLF1 человека, человеческого γ-регуляторного гена, CCR5 человека, CXCR4 человека, PPP1R12C, HPRT мыши и человека, человеческого альбумина, человеческого фактора IX, LRRK2 человека, Htt человека, RHO человека, CFTR, TRAC, TRBC, PD1 человека, CTLA-4 человека, HLA Cl1: HLA A2, HLA A3, HLA B, HLAC, HLA кл.II: DBP2, DRA, TAP1, TAP2, Тапасина, CIITA, RFX5, или выбран из группы, состоящей из HBB, BCL11A, KLF1, HBG1, CCR5, CXCR4, HPRT, ALB, Фактор VIII, Фактор IX, LRRK2, Htt, RHO, TCRA, TCRB, PD-1, CTLA-4, HLA-A, HLA-DPA, HLA-DQ, HLA-DRA, LMP7, TAPBP, DMD, RFX5, B. napus FAD3, B. napus FAD2, FAD2 сои, Zea mays ZP15, B-кетоацил АСР синтаза II (KASII), MDH томата, B. napus EPSPS, паралоги C + D, Паралог D, Паралог A + B, (AAVS1), GR, IL2RG и SFTPB.
RU2020121128A 2017-12-06 2018-12-06 РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК) RU2811724C2 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762595328P 2017-12-06 2017-12-06
US62/595,328 2017-12-06
US201762607069P 2017-12-18 2017-12-18
US62/607,069 2017-12-18
PCT/US2018/064242 WO2019113310A1 (en) 2017-12-06 2018-12-06 Gene editing using a modified closed-ended dna (cedna)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2020121128A RU2020121128A (ru) 2022-01-11
RU2811724C2 true RU2811724C2 (ru) 2024-01-16

Family

ID=

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2267533C2 (ru) * 1994-05-13 2006-01-10 Транскариотик Терапиз Инк. Конструкция днк для осуществления гомологичной рекомбинации (варианты), транскрипционная единица (варианты), способ получения гомологично рекомбинированной клетки и способ изменения экспрессии гена-мишени в клетке (варианты)
US20140107186A1 (en) * 2011-03-11 2014-04-17 Association Institut De Myologie Capsid-free aav vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery
WO2017152149A1 (en) * 2016-03-03 2017-09-08 University Of Massachusetts Closed-ended linear duplex dna for non-viral gene transfer
WO2019051255A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 Generation Bio Co. CLOSED-ENDED DNA (CEDNA) MODIFIED

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2267533C2 (ru) * 1994-05-13 2006-01-10 Транскариотик Терапиз Инк. Конструкция днк для осуществления гомологичной рекомбинации (варианты), транскрипционная единица (варианты), способ получения гомологично рекомбинированной клетки и способ изменения экспрессии гена-мишени в клетке (варианты)
US20140107186A1 (en) * 2011-03-11 2014-04-17 Association Institut De Myologie Capsid-free aav vectors, compositions, and methods for vector production and gene delivery
WO2017152149A1 (en) * 2016-03-03 2017-09-08 University Of Massachusetts Closed-ended linear duplex dna for non-viral gene transfer
WO2019051255A1 (en) * 2017-09-08 2019-03-14 Generation Bio Co. CLOSED-ENDED DNA (CEDNA) MODIFIED

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20200093635A (ko) 변형된 폐쇄된 말단 dna (cedna)를 사용한 유전자 편집
US20210054405A1 (en) Closed-ended dna (cedna) vectors for insertion of transgenes at genomic safe harbors (gsh) in humans and murine genomes
CN111868242A (zh) 能从无细胞合成中获得的封闭端DNA载体和用于获得ceDNA载体的方法
KR20210102881A (ko) 인자 ix의 발현을 위한 조성물 및 방법
US20220127625A1 (en) Modulation of rep protein activity in closed-ended dna (cedna) production
CA3130515A1 (en) Crispr/rna-guided nuclease-related methods and compositions for treating rho-associated autosomal-dominant retinitis pigmentosa (adrp)
KR20220066225A (ko) 선택적 유전자 조절을 위한 조성물 및 방법
CN113316640A (zh) 包含对称的被修饰的反向末端重复序列的被修饰的封闭端dna(cedna)
JP2022513376A (ja) レトロウイルスインテグラーゼ－Ｃａｓ９融合タンパク質を使用した指向性非相同ＤＮＡ挿入によるゲノム編集
KR20230003477A (ko) 비-바이러스성 dna 벡터 및 인자 ix 치료제 발현을 위한 이의 용도
KR20210151785A (ko) 비바이러스성 dna 벡터 및 fviii 치료제 발현을 위한 이의 용도
RU2811724C2 (ru) РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)
WO2023039440A9 (en) Hbb-modulating compositions and methods
KR20230003478A (ko) 비-바이러스성 dna 벡터 및 고셰 치료제 발현을 위한 이의 용도
CN117642173A (zh) 用于诱导对基因递送靶媒剂的免疫耐受性的方法和试剂盒
RU2812852C2 (ru) Невирусные днк-векторы и варианты их применения для экспрессии терапевтического средства на основе фактора viii (fviii)
RU2812850C2 (ru) Модуляция активности rep белка при получении днк с замкнутыми концами (зкднк)
RU2816963C2 (ru) МОДИФИЦИРОВАННАЯ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК), СОДЕРЖАЩАЯ СИММЕТРИЧНЫЕ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ИНВЕРТИРОВАННЫЕ КОНЦЕВЫЕ ПОВТОРЫ
US20240002839A1 (en) Crispr sam biosensor cell lines and methods of use thereof
US20240042058A1 (en) Tissue-specific methods and compositions for modulating a genome
KR20240055835A (ko) 치료용 단백질의 발현을 위한 간 특이적 발현 카세트, 벡터 및 이들의 용도
WO2023225471A2 (en) Helitron compositions and methods
JP2024515715A (ja) レトロウイルスインテグラーゼ－Ｃａｓ融合タンパク質を使用した指向性非相同ＤＮＡ挿入によるゲノム編集及び治療の方法
CA3202459A1 (en) Protoparvovirus and tetraparvovirus compositions and methods for gene therapy