JP2022523806A - 閉端ｄｎａ（ｃｅｄｎａ）および免疫調節化合物 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、細胞への所望の導入遺伝子の投与が、ｃｅＤＮＡ構築物の１つ以上の用量での導入遺伝子の送達によって達成される場合、修飾されたデキサメタゾン化合物を使用して免疫応答を最小化することに関する、方法および構築物が、提供される。いくつかの態様によれば、本開示は、細胞中で導入遺伝子を発現する場合に免疫応答を阻害するための方法であって、細胞に、ｃｅＤＮＡベクターが２つの異なるＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含むように、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）および修飾されたデキサメタゾンを含む組成物を同時投与することを含む、方法を提供する。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年３月６日に出願された米国仮出願第６２／８１４，４７７号に対する優先権を主張し、その内容は、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体の参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０２０年３月５日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、１３１６９８－０５５２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、１１６，７２７バイトのサイズである。
本発明の実施形態は、標的の細胞、組織、器官または生物への外因性ＤＮＡ配列の送達、ならびにそれらに対する自然免疫応答を調節するための修飾および方法を含む、遺伝子療法の分野に関する。
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子変異または後天性疾患のいずれかを罹患している患者についての臨床転帰を向上することを目的とする。遺伝子療法は、障害、疾患、悪性腫瘍などをもたらし得る欠陥遺伝子または異常な調節もしくは発現、例えば、過小発現もしくは過剰発現に起因する医学的状態の治療または予防を含む。例えば、欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患または障害は、修復遺伝物質の患者への送達によって治療、予防、もしくは改善され得るか、または患者の中で遺伝物質の治療的発現をもたらす、例えば、患者に対する修復遺伝物質を用いて欠陥遺伝子を改変もしくはサイレンシングすることによって治療、予防、もしくは改善され得る。
遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と称される場合がある）を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、または別の結果をもたらし得る。そのような結果は、抗体、機能性酵素、または融合タンパク質などの治療用タンパク質の発現に起因し得る。遺伝子療法を使用して、他の因子によって引き起こされる疾患または悪性腫瘍を治療することもできる。ヒト単一遺伝子障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達および発現によって治療され得る。患者の標的細胞中の修復遺伝子の送達および発現は、操作されたウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。利用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスなど）の中で、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属し、より具体的には、ディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶ由来のベクター（すなわち、組換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）またはＡＡＶベクター）は、（ｉ）それらが筋細胞およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができるため、（ｉｉ）それらがウイルス構造遺伝子を欠いていることによって、ウイルス感染に対する宿主細胞応答、例えば、インターフェロン媒介性応答を減少させるため、（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理的であるとみなされるため、（ｉｖ）宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして持続し、したがって挿入変異または遺伝毒性の危険性を限定するため、ならびに（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは、一般に比較的不良な免疫原であるとみなされ、したがって著しい免疫応答を誘起せず（ｉｉを参照されたい）、したがって治療導入遺伝子のベクターＤＮＡおよび潜在的に長期発現の持続を得るため、遺伝物質を送達するために魅力的である。
しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡのその限定されたウイルスパッケージング能力であり（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コーディング能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補が、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングされる必要があることである。第３の欠点は、初回治療から除外されなかった患者への再投与を防ぐカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに応答して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。
追加的に、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含有するプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。しかしながら、そのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞および組織型を非効率的に形質導入することがわかり、カプシドはまた、免疫応答を誘導する。したがって、遺伝子療法のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫応答に起因する）患者への単回投与、最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の限定された範囲、および遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して、限定される。
哺乳動物系は、外来ＤＮＡを検出し、そのようなＤＮＡの除去および／または破壊につながる免疫応答に関与する系を含む、微生物攻撃に対する多様な防御を発達させてきた。特に、マクロファージ系統細胞は、ＴＬＲ９経路、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路、およびインフラマソーム経路を含む、複数のＤＮＡセンサー経路を有する。
概念的には明解だが、ヒト疾患を治療するための遺伝子療法に核酸分子を使用する見通しは、不確かなままである。この不確実性の主な原因は、核酸治療薬に対する宿主の自然免疫応答に関する明らかな有害事象であり、したがって、これらの材料が免疫応答の文脈においてそれらの意図された標的の発現を調節する方法である。臨床応用のために採用され得る核酸分子の作成、機能、挙動および最適化を取り巻く技術の現況は、特に次の点に焦点を当てている：（１）翻訳および遺伝子発現を直接調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二重鎖ＲＮＡ、（２）長期的なエピジェネティック修飾をもたらす転写型遺伝子サイレンシングＲＮＡ、（３）遺伝子スプライシングパターンと相互作用し、それらを改変するアンチセンスオリゴヌクレオチド、（４）天然に存在するＡＡＶまたはレンチウイルスゲノムの生理学的機能を模倣する合成ベクターまたはウイルスベクターの作成、ならびに（５）治療用オリゴヌクレオチドのインビボ送達。しかしながら、最近の臨床成果において明らかである核酸治療薬の開発が進歩しているにもかかわらず、遺伝子療法の分野は、治療用核酸自体によって誘起されるレシピエントの望ましくない有害事象によって依然厳しく限定される。
遺伝子療法のための外因性ＤＮＡの投与は、目的のコードされた遺伝子の所望の細胞内位置または発現に到達する前に、クリアランスおよび／または破壊と競合する可能性がある。外因性ＤＮＡに対するそのような宿主免疫防御を調節することは、遺伝子療法の有効性を促進する上で潜在的に有益であろう。
したがって、多種多様な疾患を治療するために、細胞、組織または対象における治療用タンパク質の発現を可能にするベクターまたは核酸の対象への投与時に免疫応答を阻害する（例えば、低減、改善、軽減、予防する）新しい技術のための分野が必要である。
本開示は、遺伝性障害に罹患し、遺伝子または核酸療法（「核酸治療薬」または「治療用核酸」（ＴＮＡ））を受けている対象における自然免疫応答を最小化または低減するための方法および薬学的組成物を提供する。本明細書ではまた、自然免疫応答を最小化および低減するための阻害剤を含む組成物中の共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）、ならびにそれらを含む方法が、提供される。
いくつかの態様によれば、本開示は、細胞中で導入遺伝子を発現する場合に免疫応答を阻害するための方法であって、細胞に、ｃｅＤＮＡベクターが２つの異なるＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含むように、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）および修飾されたデキサメタゾンを含む組成物を同時投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲＳのうちの１つは、機能的ＡＡＶ末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲのうちの１つは、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾンは、パルミチン酸デキサメタゾンである。
いくつかの態様では、本明細書ではまた、対象における疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、ｃｅＤＮＡベクターが２つの異なるＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含むように、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）を含む組成物を投与することを含む、方法が、提供される。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲのうちの１つは、機能的ＡＡＶ末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲのうちの１つは、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する。いくつかの実施形態によれば、方法は、修飾されたデキサメタゾンを別々に投与することを含む。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、少なくとも１つの脂肪酸を含む。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、パルミチン酸デキサメタゾンである。いくつかの実施形態によれば、投与は、ｃｅＤＮＡベクターの投与の前である。いくつかの実施形態によれば、投与は、ｃｅＤＮＡベクターの投与と同時である。いくつかの実施形態によれば、投与は、ｃｅＤＮＡベクターの投与に続く。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化される。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化されない。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、細胞に投与されているｃｅＤＮＡベクターと同時投与されるが、ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化されない。いくつかの実施形態によれば、細胞中のｃｅＤＮＡベクターの量を増加させることは、細胞中の導入遺伝子の発現を増加させる。いくつかの実施形態によれば、異種核酸配列は治療用導入遺伝子をコードし、導入遺伝子の発現の所望のレベルは治療有効量である。
前述の実施形態および態様のうちのいずれかによれば、少なくとも１つの追加の自然免疫経路阻害剤が、投与される。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路、ＴＬＲ９経路、またはインフラマソーム媒介性経路のうちの１つ以上の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ＴＬＲ９経路の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、インフラマソーム媒介性経路の阻害剤である。
別の態様によれば、本開示は、（ｉ）共有結合性閉端を有する直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、ｃｅＤＮＡベクターが、２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含む、直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター、および（ｉｉ）修飾されたデキサメタゾン化合物を含む、組成物を提供する。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的ＡＡＶ末端分解部位（ＴＲＳ）およびＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態によれば、両方のＩＴＲは、同じＡＡＶ株からの天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲ株である。いくつかの実施形態によれば、１つのＩＴＲは、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む。いくつかの実施形態によれば、１つのＩＴＲは、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含み、どちらのＩＴＲも、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲでない。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、少なくとも１つの脂肪酸を含む。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、パルミチン酸デキサメタゾンである。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化される。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化されない。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、細胞に投与されているｃｅＤＮＡベクターと同時投与されるが、ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化されない。
前述の実施形態および態様のうちのいずれかによれば、組成物は、少なくとも１つの追加の自然免疫経路阻害剤をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路、ＴＬＲ９経路、またはインフラマソーム媒介性経路のうちの１つ以上の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ＴＬＲ９経路の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、インフラマソーム媒介性経路の阻害剤である。
いくつかの態様によれば、本開示は、細胞中で導入遺伝子を発現する場合に免疫応答を阻害するための方法を提供し、（ｉ）共有結合性閉端を有する直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、ｃｅＤＮＡベクターが、２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含む、直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター、および（ｉｉ）修飾されたデキサメタゾン化合物を含む。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲのうちの１つは、機能的ＡＡＶ末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲのうちの１つは、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、少なくとも１つの脂肪酸を含む。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、パルミチン酸デキサメタゾンである。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化される。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化されない。いくつかの実施形態によれば、両方のＩＴＲは、同じＡＡＶ株からの天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲ株である。別の態様では、１つのＩＴＲは、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む。別の態様では、１つのＩＴＲは、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含み、どちらのＩＴＲも、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲでない。別の態様では、２つのＩＴＲは、（ａ）配列番号１（３’ＷＴ－ＩＴＲ）および配列番号４（５’ｍｏｄ ＩＴＲ）、ならびに（ｂ）配列番号３（３’ｍｏｄ ＩＴＲ）および配列番号２（５’ＷＴ－ＩＴＲ）からなる群から選択される一対のＩＴＲである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態によれば、細胞中のｃｅＤＮＡベクターの量を増加させることは、細胞中の導入遺伝子の発現を増加させる。別の態様では、異種核酸配列は治療用導入遺伝子をコードし、導入遺伝子の発現の所望のレベルは治療有効量である。
前述の実施形態および態様のうちのいずれかによれば、少なくとも１つの追加の自然免疫経路阻害剤が、投与される。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路、ＴＬＲ９経路、またはインフラマソーム媒介性経路のうちの１つ以上の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ＴＬＲ９経路の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、インフラマソーム媒介性経路の阻害剤である。
別の態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、（ａ）Ｒｅｐタンパク質の存在下、昆虫細胞内で閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクターの産生を誘導するのに有効な条件下かつそれを行うのに十分な時間、ウイルス性カプシドコード配列を欠くｃｅＤＮＡベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、昆虫細胞が、昆虫細胞内に閉端直鎖状カプシド不含ＤＮＡの産生を含まない、ステップと、（ｂ）閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡを昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから得られ、昆虫細胞から単離された直鎖状のカプシド不含ＤＮＡの存在は、昆虫細胞から単離されたＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することによって確認され得る。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、無細胞合成によって得られる。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、カプセル化される。いくつかの実施形態によれば、カプセル化は、リポソームを用いるものである。いくつかの実施形態によれば、カプセル化は、脂質ナノ粒子によるものである。
いくつかの態様によれば、本開示は、対象における疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、（ｉ）共有結合性閉端を有する直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、ｃｅＤＮＡベクターが、２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含む、直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター、および（ｉｉ）修飾されたデキサメタゾン化合物を含む組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲのうちの１つは、機能的ＡＡＶ末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態によれば、ＩＴＲのうちの１つは、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、少なくとも１つの脂肪酸を含む。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、パルミチン酸デキサメタゾンである。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化される。いくつかの実施形態によれば、修飾されたデキサメタゾン化合物は、ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化されない。いくつかの実施形態によれば、両方のＩＴＲは、同じＡＡＶ株からの天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲ株である。別の態様では、１つのＩＴＲは、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む。別の態様では、１つのＩＴＲは、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含み、どちらのＩＴＲも、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲでない。別の態様では、２つのＩＴＲは、（ａ）配列番号１（３’ＷＴ－ＩＴＲ）および配列番号４（５’ｍｏｄ ＩＴＲ）、ならびに（ｂ）配列番号３（３’ｍｏｄ ＩＴＲ）および配列番号２（５’ＷＴ－ＩＴＲ）からなる群から選択される一対のＩＴＲである。
別の態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される。別の態様では、細胞中のｃｅＤＮＡベクターの量を増加させることは、細胞中の導入遺伝子の発現を増加させる。別の態様では、異種核酸配列は治療用導入遺伝子をコードし、導入遺伝子の発現の所望のレベルは治療有効量である。
前述の実施形態および態様のうちのいずれかでは、少なくとも１つの追加の自然免疫経路阻害剤は、ｃｅＤＮＡベクターおよび修飾されたデキサメタゾン化合物と同時投与される。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路、ＴＬＲ９経路、またはインフラマソーム媒介性経路のうちの１つ以上の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、ＴＬＲ９経路の阻害剤である。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤は、インフラマソーム媒介性経路の阻害剤である。
別の態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、（ａ）Ｒｅｐタンパク質の存在下、昆虫細胞内で閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクターの産生を誘導するのに有効な条件下かつそれを行うのに十分な時間、ウイルス性カプシドコード配列を欠くｃｅＤＮＡベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、昆虫細胞が、昆虫細胞内に閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡの産生を含まない、ステップと、（ｂ）閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡを昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから得られる、いくつかの実施形態によれば、昆虫細胞から単離された直鎖状のカプシド不含ＤＮＡの存在は、昆虫細胞から単離されたＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することによって確認され得る。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、無細胞合成によって得られる。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、無細胞合成によって得られる。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡベクターは、カプセル化される。いくつかの実施形態によれば、カプセル化は、リポソームを用いるものである。いくつかの実施形態によれば、カプセル化は、脂質ナノ粒子によるものである。
非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。この実施形態では、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを含む。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位（Ｒ３／Ｒ４）に挿入され得る。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）－発現カセットの上流（５’端）の野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲに隣接しており、したがって、発現カセットに隣接する２つのＩＴＲは、互いに対して非対称である。 ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを有する非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入され得る。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）－発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の野生型ＩＴＲに隣接している。 エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含む発現カセットを有する非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、互いに対して非対称である２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲに隣接しており、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方は、修飾型ＩＴＲであるが、異なる修飾を有する（すなわち、同じ修飾を有しない）。 ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを有する、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲおよび３’修飾型ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。 エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含む発現カセットを有する、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲおよび３’修飾型ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。 ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを有する、本明細書で定義される対称のＷＴ－ＩＴＲまたは実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’ＷＴ－ＩＴＲおよび３’ＷＴ ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）に隣接している。 エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含む発現カセットを有する、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示される導入遺伝子産生のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、５’ＷＴ－ＩＴＲおよび３’ＷＴ ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）に隣接している。 Ａ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’アーム、Ｃ－Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）の特定と共にＡＡＶ２（配列番号５２）の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を提供し、末端分解部位（ＴＲＳ）も示す。ＲＢＥは、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のいずれかと相互作用すると考えられる一連の４つの二重四量体を含有する。加えて、ＲＢＥ’はまた、構築物中の野生型ＩＴＲまたは変異型ＩＴＲ上で集成したＲｅｐ複合体と相互作用すると考えられる。ＤおよびＤ’領域は、転写因子結合部位および他の保存構造を含有する。 Ａ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’アーム、Ｃ－Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）の特定と共にＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を含む、野生型左ＩＴＲ（配列番号５３）中の提案されたＲｅｐ触媒ニッキングおよびライゲーション活性を示し、また末端分解部位（ＴＲＳ）、ならびにいくつかの転写因子結合部位を含むＤおよびＤ’領域ならびに他の保存構造も示す。 野生型左ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号５４）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（ポリヌクレオチド配列）（左）ならびに二次構造（右）を提供する。 左ＩＴＲについての例示的な変異型ＩＴＲ（修飾型ＩＴＲとも称される）配列を示す。例示的な変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ－１、左）（配列番号１１３）のＡ－Ａ’アーム、Ｃアーム、およびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ部分の一次構造（左）および予測された二次構造（右）が、示される。 野生型右ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号５５）のＡ－Ａ’ループ、ならびにＢ－Ｂ’およびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）ならびに二次構造（右）を示す。 例示的な右修飾型ＩＴＲを示す。例示的な変異体左ＩＴＲ（ＩＴＲ－１、右）（配列番号１１４）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’およびＣアームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および予測された二次構造（右）が、示される。左および右のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたは他のウイルス血清型または合成ＩＴＲ）の任意の組み合わせを、本明細書で教示されるように使用することができる。図３Ａ～３Ｄポリヌクレオチド配列の各々は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡを産生するために使用されるプラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中で使用される配列を指す。プラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中のｃｅＤＮＡベクター構成および予測されたＧｉｂｂｓ自由エネルギー値から推定される対応するｃｅＤＮＡ二次構造もまた、図３Ａ～３Ｄの各々に含まれる。 図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおける、本明細書に開示される抗体または融合タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。 ｃｅＤＮＡの産生の例示的な方法の概略図であり、図４Ｃは、ｃｅＤＮＡベクター産生を確認するための生化学的方法およびプロセスを示す。図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。 ｃｅＤＮＡの産生の例示的な方法の概略図であり、図４Ｃは、ｃｅＤＮＡベクター産生を確認するための生化学的方法およびプロセスを示す。図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。 未切断のままであるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかの上での電気泳動に供される、例示的なｃｅＤＮＡについての概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動するより小さな単量体、および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する多重バンドを示す。左から２番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断された場合、元のバンドが消え、切断後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さな）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは、一本鎖であり、相補鎖が共有結合的に連結するため、未変性ゲル上で観察されるものの２倍大きな種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様の結合分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって、観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」は、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態において観察される一本鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態において観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示すために使用される。 非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成することができる。図４Ｅはまた、直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができるが、変性条件では、鎖は、接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する一本鎖を産生する。 デキサメタゾンおよびパルミチン酸デキサメタゾンの化学構造を示す。 実施例６に記載される実験からのデータを示すグラフを提供する。図６Ａは、経時的に処置されたマウスの体重を示し、ｃｅＤＮＡ／パルミチン酸デキサメタゾン処置が、ｃｅＤＮＡ／ポリＣ処置対照動物に対する体重低下の減少をもたらすことを示す。図６Ｂは、ｃｅＤＮＡ／ポリＣ処置動物およびｃｅＤＮＡ／パルミチン酸デキサメタゾン処置動物からのルシフェラーゼの観察された発現が同様であったことを示し、パルミチン酸デキサメタゾンが、投与されたｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の取り込み、核移行または発現を阻害しないことを示す。図６Ｃは、投与後に採取された血清試料からのサイトカイン分析の結果を提供し、パルミチン酸デキサメタゾンが、ある特定のサイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ、およびＲＡＮＴＥＳ）のレベルを顕著に低減したが、他のレベルには影響を与えなかったことを示している。 実施例６に記載される実験からのデータを示すグラフを提供する。図６Ａは、経時的に処置されたマウスの体重を示し、ｃｅＤＮＡ／パルミチン酸デキサメタゾン処置が、ｃｅＤＮＡ／ポリＣ処置対照動物に対する体重低下の減少をもたらすことを示す。図６Ｂは、ｃｅＤＮＡ／ポリＣ処置動物およびｃｅＤＮＡ／パルミチン酸デキサメタゾン処置動物からのルシフェラーゼの観察された発現が同様であったことを示し、パルミチン酸デキサメタゾンが、投与されたｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の取り込み、核移行または発現を阻害しないことを示す。図６Ｃは、投与後に採取された血清試料からのサイトカイン分析の結果を提供し、パルミチン酸デキサメタゾンが、ある特定のサイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ、およびＲＡＮＴＥＳ）のレベルを顕著に低減したが、他のレベルには影響を与えなかったことを示している。 実施例６に記載される実験からのデータを示すグラフを提供する。図６Ａは、経時的に処置されたマウスの体重を示し、ｃｅＤＮＡ／パルミチン酸デキサメタゾン処置が、ｃｅＤＮＡ／ポリＣ処置対照動物に対する体重低下の減少をもたらすことを示す。図６Ｂは、ｃｅＤＮＡ／ポリＣ処置動物およびｃｅＤＮＡ／パルミチン酸デキサメタゾン処置動物からのルシフェラーゼの観察された発現が同様であったことを示し、パルミチン酸デキサメタゾンが、投与されたｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の取り込み、核移行または発現を阻害しないことを示す。図６Ｃは、投与後に採取された血清試料からのサイトカイン分析の結果を提供し、パルミチン酸デキサメタゾンが、ある特定のサイトカイン（ＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファ、およびＲＡＮＴＥＳ）のレベルを顕著に低減したが、他のレベルには影響を与えなかったことを示している。
核酸導入ベクターおよび治療薬は、遺伝子発現およびその調節などの多様な用途のための有望な治療薬である。ウイルス導入ベクターは、タンパク質または核酸をコードする導入遺伝子を含み得る。そのような例は、ＡＡＶベクター、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、同様にメッセンジャーＲＮＡ（小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）など）における変異部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。残念ながら、これらの治療薬の展望はまだ実現されておらず、その大部分は、ウイルス導入ベクターに対して指向する細胞性および体液性免疫応答に起因する。これらの免疫応答は、抗体、Ｂ細胞およびＴ細胞の応答を含み、多くの場合、ウイルス性カプシドまたはその外被タンパク質またはペプチドなどのウイルス性導入ベクターのウイルス性抗原に特異的である。
現在、多くの潜在的な患者は、ウイルス導入ベクターの基礎となっているウイルスに対して、ある程度のレベルの既存の免疫を内包する。実際、ウイルス核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方）またはタンパク質に対する抗体は、ヒト集団において非常に広まっている。加えて、例えば、ウイルス導入ベクターの低い免疫原性に起因して既存の免疫のレベルが低い場合でも、そのような低いレベルは、形質導入の成功を依然として妨げる可能性がある（例えば、Ｊｅｕｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：５９－６７（２０１３））。したがって、既存の免疫の低いレベルでさえも、患者における特定のウイルス導入ベクターの使用を妨げる可能性があり、臨床医は、それほど効果的ではない可能性のある異なる血清型のウイルスに基づいたウイルス導入ベクターを選択する必要があるか、または、別のウイルス導入ベクター療法が利用できない場合は、異なる種類の療法を完全に免除することさえある。
追加的に、アデノ随伴ベクターなどのウイルス性ベクターは、免疫原性が高く、特に再投与に関して有効性を損なう可能性のある体液性および細胞性免疫を誘発し得る。実際、ウイルス導入ベクターに対する細胞性および体液性免疫応答は、ウイルス導入ベクターの単回投与後に発生する可能性がある。ウイルス導入ベクターの投与後、中和抗体価は、数年間増加して高いままであり、ウイルス導入ベクターの再投与の有効性を低減する可能性がある。実際、ウイルス導入ベクターの反復投与は、一般に、増強された望ましくない免疫応答をもたらす。加えて、ウイルス導入ベクター特異的なＣＤ８＋ Ｔ細胞が、生じ、例えば、ウイルス抗原様ウイルス核酸またはカプシドタンパク質への再曝露時に、所望の導入遺伝子産物を発現する形質導入細胞を排除することができる。例えば、ＡＡＶ核酸またはカプシド抗原は、ＡＡＶウイルス導入ベクターで形質導入された肝細胞の免疫媒介性破壊を誘起できることが示されている。多くの治療用途では、ウイルス導入ベクターの複数回の投与は、長期的な利益のために必要であることが考えられている。しかしながら、特に再投与が必要な場合、本明細書で提供される方法および組成物がなければ、そうする能力は著しく限定されるであろう。
ウイルスまたは非ウイルス（合成）導入ベクター、および治療のための他の核酸治療薬を含む、多様な核酸治療薬の効果的な使用に対する前述の障壁への解決策を提案する方法および組成物が、提供される。
本開示は、標的の細胞、組織、器官または生物への外因性ＤＮＡ配列の送達、ならびにそれらに対する自然免疫応答を阻害するための組成物および方法を含む、遺伝子療法の分野に関する。自然免疫応答を阻害するためのそのような組成物および方法は、例えば、導入遺伝子発現の持続時間を増強するために使用され得る。
ＤＮＡ導入ベクターに対する自然免疫応答は、本明細書で提供される方法および関連する組成物を用いて減衰され得ることが、予期せず発見されている。したがって、方法および組成物は、ウイルス導入ベクターおよび他の治療用核酸分子での治療の有効性を潜在的に増加させ、ウイルス導入ベクターまたは他の核酸治療薬の投与が繰り返された場合でも、長期的な治療効果を提供することができる。
Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図されない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．，２０１１（ＩＳＢＮ９７８－０－９１１９１０－１９－３）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３），Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ９７８３５２７６００９０８）、およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ１－５６０８１－５６９－８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ１９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見いだすことができ、これらの内容はすべて、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「投与」、「投与する」という用語およびそれらの変形は、組成物または薬剤（例えば、本明細書に記載される治療用核酸または免疫抑制剤）を対象に導入することを指し、１つ以上の組成物または薬剤の同時および連続導入を含む。「投与」は、例えば、治療、薬物動態、診断、研究、プラセボ、および実験方法を指し得る。「投与」は、インビトロおよびエクスビボ治療も包含する。組成物または薬剤の対象への導入は、経口、肺、鼻腔内、非経口（静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、直腸、リンパ管内、腫瘍内、または局所を含む任意の好適な経路による。組成物または薬剤の対象への導入は、エレクトロポレーションによる。投与は、自己投与および他者による投与を含む。投与は、任意の好適な経路によって実行され得る。好適な投与経路は、組成物または薬剤がその意図された機能を遂行することを可能にする。例えば、好適な経路が静脈内である場合、組成物は、組成物または薬剤を対象の静脈に導入することによって投与される。
本明細書で使用される場合、「核酸治療」、「治療用核酸」および「ＴＮＡ」という語句は、交換可能に使用され、疾患または障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。本明細書で使用される場合、これらの語句は、ＲＮＡベースの治療薬およびＤＮＡベースの治療薬を指す。ＲＮＡベースの治療薬の非限定的な例は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を含む。ＤＮＡベースの治療薬の非限定的な例は、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶゲノム）もしくは非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状の二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡベクター、最小限度に免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、またはダンベル形ＤＮＡミニマルベクター（「ダンベルＤＮＡ」）を含む。
本明細書で使用される場合、免疫抑制剤および／または治療用核酸などの活性剤または治療剤の「有効量」または「治療有効量」は、治療用核酸および／または免疫抑制剤の不在下で検出された発現レベルと比較して、所望の効果、例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の正常化または低減および標的配列の発現または発現阻害を生じるのに十分な量である。標的遺伝子または標的配列の発現を測定するための好適なアッセイは、例えば、ドットブロット、ノーザンブロット、インサイチュハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、酵素機能、同様に当業者に既知の表現型アッセイなどの、当業者に既知の技法を使用するタンパク質またはＲＮＡレベルの検査を含む。しかしながら、投与量レベルは、傷害の種類、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重症度、投与経路、用いられる特定の活性剤を含む、多様な因子に基づく。したがって、投与計画は、大きく異なる可能性があるが、標準的な方法を使用して医師によって常套的に決定され得る。追加的に、「治療量」、「治療有効量」および「薬学的有効量」という用語は、記載された本発明の組成物の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）量を含む。記載された発明の予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）用途において、薬学的組成物または薬剤は、疾患、障害または状態の生化学的、組織学的および／または行動症状、その合併症、ならびに疾患、障害または状態の発症中に現れる中間の病理学的表現型を含む、疾患、障害または状態に罹患しやすい患者、またはそうでなければそのリスクがある患者に、リスクを排除もしくは低減するか、重症度を減少させるか、または疾患、障害もしくは状態の発症を遅らせるのに十分な量で投与される。いくつかの医学的判断によれば、最大用量、すなわち最高の安全用量を使用することが一般に好ましい。「用量」および「投与量」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的または間接的に、疾患症状の阻止、低減、または排除を挙げることができる。治療効果としてはまた、直接的または間接的に、疾患症状の進行の阻止、低減、または排除を挙げることができる。
本明細書に記載される任意の治療剤について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究および／または動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定することができる。適用される用量は、投与される化合物の相対的な生物学的利用能および効力に基づいて調整することができる。上記の方法および他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章に見いだされ得る治療有効性を決定するための一般原則を以下に要約する。
薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定でき、治療濃度域に関連している状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを入手することができる。
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」および「導入遺伝子」という用語は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達および発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「転写カセット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な１つ以上のプロモーターまたは他の調節配列に操作可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドコード配列、他のベクター配列、または逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加的に、１つ以上のシス作用性配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー）、１つ以上のイントロン、および１つ以上の転写後調節エレメントを含んでもよい。
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然、化学的修飾もしくは生化学的修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離するか、または当該技術分野で既知である方法によって化学的に合成することができる。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖、事前に凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらのグループの誘導体および組み合わせの形態であり得る。ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖状の共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、閉端直鎖状の二重鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤまたはｃｅＤＮＡ）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形ＤＮＡ、最小限度に免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルス性ベクターまたは非ウイルス性ベクターの形態にあり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルス性ＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、およびそれらの組み合わせの形態にあり得る。核酸としては、既知のヌクレオチド類似体または修飾型骨格残基もしくは連結を含有する核酸が挙げられ、これらは、合成、天然に存在する、および天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体および／または修飾残基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノ）、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。別途限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾型バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列、同様に、明示的に示された配列を暗黙的に包含する。
「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介して共に連結している。
「塩基」には、プリンおよびピリミジンが含まれ、それらには、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類似体、ならびにプリンおよびピリミジンの合成誘導体がさらに含まれ、それらには、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびアルキルハライドなどであるがこれらに限定されない新しい反応基を配置する修飾が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「干渉ＲＮＡ」または「ＲＮＡｉ」または「干渉ＲＮＡ配列」という用語は、一本鎖ＲＮＡ（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ、ｓｓＲＮＡｉオリゴヌクレオチド、ｓｓＤＮＡｉオリゴヌクレオチド）、二本鎖ＲＮＡ（すなわち、ｓｉＲＮＡなどの二本鎖ＲＮＡ、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、またはプレｍｉＲＮＡ）、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０７８９４１号を参照されたい）、または干渉ＲＮＡが標的の遺伝子もしくは配列と同じ細胞に存在する場合、（例えば、分解を媒介するか、または干渉ＲＮＡ配列に相補的なｍＲＮＡの翻訳を阻害することによって）標的の遺伝子もしくは配列の発現を低減もしくは阻害することができるＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッド（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／１０４１９９号を参照されたい）を含む。したがって、干渉ＲＮＡは、標的ｍＲＮＡ配列に相補的な一本鎖ＲＮＡ、または２つの相補鎖または単一の自己相補鎖によって形成される二本鎖ＲＮＡを指す。干渉ＲＮＡは、標的の遺伝子または配列に対して実質的なもしくは完全な同一性を有し得るか、またはミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含み得る。干渉ＲＮＡの配列は、全長の標的遺伝子またはその部分配列に対応し得る。好ましくは、干渉ＲＮＡ分子は化学的に合成される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
干渉ＲＮＡには、「低分子干渉ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」、例えば、長さ約１５～６０、１５～５０、または１５～４０（二重鎖）ヌクレオチド、より典型的には長さ約１５～３０、１５～２５、または１９～２５（二重鎖）ヌクレオチドの干渉ＲＮＡを含み、好ましくは長さ約２０～２４、２１～２２、または２１～２３（二重鎖）ヌクレオチドである（例えば、二本鎖ｓｉＲＮＡの各相補配列は、長さ１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５ヌクレオチドであり、好ましくは長さ約２０～２４、２１～２２、または２１～２３ヌクレオチドであり、二本鎖ｓｉＲＮＡは、長さ約１５～６０、１５～５０、１５～４０、１５～３０、１５～２５、または１９～２５塩基対であり、好ましくは長さ約１８～２２、１９～２０、または１９～２１塩基対である）。ｓｉＲＮＡ二重鎖は、約１～約４ヌクレオチドまたは約２～約３ヌクレオチドの３’オーバーハングおよび５’ホスフェート末端を含み得る。ｓｉＲＮＡの例には、２つの別個の鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子（一方の鎖はセンス鎖であり、他方は相補的アンチセンス鎖である）、一本鎖分子から組み立てられた二本鎖ポリヌクレオチド分子（センスおよびアンチセンス領域が核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結される）、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を有するヘアピン二次構造を有する二本鎖ポリヌクレオチド分子、ならびに２つ以上のループ構造および自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有するステムを有する環状一本鎖ポリヌクレオチド分子（環状ポリヌクレオチドはインビボまたはインビトロでプロセシングされ、活性な二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を生成し得る）が含まれるが、限定されない。本明細書で使用される場合、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ－ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドを含む（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０７８９４１号を参照されたい）。
本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ天然に存在しなであろう様式で核酸のセグメントを含有するように修飾されるか、または合成のものである、一本鎖または二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本開示のコード配列の発現に必要な制御配列を含有する場合、「発現カセット」という用語と同義である。「発現カセット」は、プロモーターに操作可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。
「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、非共有結合的に結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成する、温度および溶液イオン強度の適切なインビトロおよび／またはインビボ条件下で配列特異的、逆平行様式で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸は、相補的核酸に特異的に結合する）のを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当該技術分野で既知であるように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、チミジン（Ｔ）とのアデニン（Ａ）対合、ウラシル（Ｕ）とのアデニン（Ａ）対合、およびシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対合が含まれる。加えて、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションのために、グアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）と対合することも、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対合の文脈において、遺伝コードの縮重（すなわち、冗長性）を部分的に担っている。この開示の文脈において、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であるとみなされ、逆もまた同様である。したがって、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置でＧ／Ｕ塩基対を作製できる場合、その位置は、非相補的であるとみなされないが、代わりに相補的であるとみなされる。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
特定のインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）を「コードする」ＤＮＡ配列は、特定のＲＮＡおよび／またはタンパク質に転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得るか、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはＤＮＡ標的化ＲＮＡ、「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードし得る。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含むポリペプチドを指す。例えば、融合タンパク質は、（ｉ）インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）またはその断片、および（ｉｉ）少なくとも１つの非対象遺伝子（ＧＯＩ）タンパク質、または代替的に、異なるインフラマソームアンタゴニストタンパク質を含み得る。本明細書に包含される融合タンパク質には、インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）、例えば、受容体の細胞外ドメイン、リガンド、酵素またはペプチドと融合した抗体、または抗体のＦｃもしくは抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されない。融合タンパク質の一部であるインフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３インフラマソーム経路の阻害剤、またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤、またはそれらの任意の組み合わせのうちのいずれか１つ以上）またはその断片は、単一特異性抗体または二重特異性または多重特異性の抗体であり得る。
本明細書で使用される場合、「ゲノムセーフハーバー遺伝子」または「セーフハーバー遺伝子」という用語は、内因性遺伝子活性に重大な悪影響を及ぼすことなく、または癌を促進することなく、配列が予測可能な様式で統合および機能し得る（例えば、関心対象のタンパク質を発現する）ように、核酸配列を挿入することができる遺伝子または遺伝子座を指す。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子はまた、挿入された核酸配列が非セーフハーバー部位よりも効率的かつ高レベルで発現され得る遺伝子座または遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「遺伝子送達」という用語は、外来ＤＮＡが遺伝子療法の用途のために宿主細胞に導入されるプロセスを意味する。
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、およびパリンドロームヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端配列または合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）とも称される）および末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳおよび少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補体であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ＩＴＲ」と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見いだされたように、全長にわたって逆相補鎖でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を行うことができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、３つ以上のＩＴＲまたは非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲであり得るか、またはＡＡＶ ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、またはＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によってさらに修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスは、脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅおよび無脊椎動物に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅの２つの亜科で構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
「野生型ＩＴＲ」または「ＷＴ－ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性およびＲｅｐニッキング能力を保持する、ＡＡＶまたは他のディペンドウイルスにおける天然に存在するＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コードまたはドリフトの縮退に起因して天然に存在する正準配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ－ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に発生する天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ－ＩＴＲ配列を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」または「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する野生型ＩＴＲである単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ－ＩＴＲの対を指す。例えば、変化が配列の特性および全体的な３次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在する正準配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ－ＩＴＲに対して対称な３次元空間構成を有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、３次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループを有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥまたはＲＢＥ’）および末端分解部位（ＴＲＳ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意選択的に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」または「ｍｏｄ－ＩＴＲ」または「変異体ＩＴＲ」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ－ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに変異を有するＩＴＲを指す。変異は、同じ血清型のＷＴ－ＩＴＲの３次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの１つ以上の変化をもたらし得、３次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその３次元構造）の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも呼ばれる「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補鎖ではない単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの３次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、３次元空間でのそれらのＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームおよび／または短いＢ－Ｂ’ループを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、または点変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列であり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型または合成ＩＴＲ配列）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ－ＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームを有することができ、他方のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ－ＩＴＲと比較して、異なる３次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、または短いＢ－Ｂ’アームなど）を有し得る。
本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型または変異型（例えば、野生型に対して修飾された）ディペンドウイルスＩＴＲ配列であり、かつそれらの全長にわたって逆相補である、単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の一対のＩＴＲを指す。非限定的な一例において、両ＩＴＲは、ＡＡＶ２からの野生型ＩＴＲ配列である。別の例では、いずれのＩＴＲも野生型ＩＴＲ ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、それらは、修飾型ＩＴＲであり、変異体ＩＴＲとも称される）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、または点変異に起因して、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ＩＴＲ」または「実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の修飾型ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性および全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称な３次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、３次元空間に構成された同じＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ－ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称な３次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な３次元形状をもたらす変異を有する。例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来し得、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する変異を有し得（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称な３次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性または全体的な形状に影響を与えず、それらが３次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）またはデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、正準ｍｏｄ－ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な３次元空間構成を有する。実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、３次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡおよびＢ－Ｂ’ループの同様の３次元構造を有する。
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に関する１つの核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ＡＢＣでは、Ｂの両側にＡおよびＣが隣接している。配置ＡｘＢｘＣについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端における末端反復を指す。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、および／または「治療」という用語は、状態の進行を抑制する、実質的に阻害する、遅らせる、もしくは逆転させる、状態の臨床症状を実質的に改善する、または臨床症状の出現を実質的に防ぐ、有益なもしくは望ましい臨床結果を得ることを含む。治療することは、（ａ）障害の重症度を低減すること、（ｂ）治療されている障害に特徴的な症状の発症を限定すること、（ｃ）治療されている障害に特徴的な症状の悪化を限定すること、（ｄ）以前に障害を有していた患者における障害の再発を限定すること、および（ｅ）以前は障害に関して無症候性であった患者の症状の再発を限定することのうちの１つ以上を達成することをさらに指す。薬理学的および／または生理学的効果などの有益なまたは所望の臨床結果は、疾患、障害または状態の素因を有する可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、もしくは呈していない対象において疾患、障害または状態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害または状態の症状の緩和、疾患、障害または状態の程度の減少、疾患、障害または状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害または状態の蔓延を防ぐこと、疾患、障害または状態の進行を遅らせるまたは遅くすること、疾患、障害または状態の改善または軽減、およびそれらの組み合わせ、同様に治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「増加する」、「増強する」、「上昇させる」という用語（および同様の用語）は、一般に、天然、予測もしくは平均に対して、または対照条件に対して、直接的または間接的に、濃度、レベル、機能、活性、または挙動を増加させる作用を指す。
本明細書で使用される場合、「最小化させる」、「低減する」、「低下させる」、および／または「阻害する」という用語（ならびに同様の用語）は、一般に、天然、予想もしくは平均に対して、または対照条件に対して、直接的または間接的のいずれかで、濃度、レベル、機能、活性、または挙動を低減する作用を指す。免疫抑制剤による免疫応答（例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答））が「低下」、「低下すること」、「低減」、または「低減すること」とは、所与の免疫抑制剤に対する検出可能な免疫応答の減少を意味することを意図する。免疫抑制剤による免疫応答の低下量は、免疫抑制剤の存在下における免疫応答のレベルと比較して決定され得る。検出可能な低下は、免疫抑制剤の存在下で検出された免疫応答よりも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％以下であり得る。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域をさらに組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミドまたはウイルスゲノムに組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして操作し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」および「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ」という用語は、合成またはその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖（ｄｓ）二重鎖ＤＮＡを指す。ｃｅＤＮＡの詳細な説明は、２０１７年３月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２０８２８の国際出願に記載されており、その全容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および構成を含むｃｅＤＮＡの産生のためのある特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号および２０１８年１２月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の実施例１に記載されており、その各々は、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。様々なＩＴＲ配列および構成を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの産生のためのある特定の方法は、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／１４１２２号に記載されており、その全容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」という用語は、少なくとも１つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含ＤＮＡベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」および「ｃｅＤＮＡ」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも１つの末端パリンドロームを含む閉端ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。
本明細書で使用される場合、「ｎｅＤＮＡ」または「ニックの入ったｃｅＤＮＡ」という用語は、オープンリーディングフレーム（例えば、発現されるプロモーターおよび導入遺伝子）の５’上流のステム領域またはスペーサー領域に１～１００塩基対のニックまたはギャップを有する閉端ＤＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「ギャップ」および「ニック」という用語は交換可能に使用され、本発明の合成ＤＮＡベクターの中断された部分を指し、その他の二本鎖ｃｅＤＮＡには一本鎖ＤＮＡ部分のストレッチが作成される。ギャップは、二重鎖ＤＮＡの一本鎖の長さが１塩基対～１００塩基対の長さであり得る。本明細書に記載される方法によって設計および作成された典型的なギャップ、および当該方法によって生成された合成ベクターは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｂｐの長さであり得る。本開示における例示的なギャップは、１ｂｐ～１０ｂｐの長さ、１～２０ｂｐの長さ、１～３０ｂｐの長さであり得る。
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」、および「ＲＢＳ」は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８またはＡＡＶ Ｒｅｐ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。ＲＢＳ配列およびその逆相補体は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたＲＢＳ配列である５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０）を含む。任意の既知のＲＢＳ配列は、他の既知のＡＡＶ ＲＢＳ配列および他の天然に既知のまたは合成ＲＢＳ配列を含む、本発明の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列ＧＣＴＣに結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、５’－（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）－３’（配列番号６０）に直接結合し、安定に集成すると考えられる。加えて、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基およびホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性または低配列特異性であり、タンパク質－ＤＮＡ複合体を安定させる。
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」および「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌデルタまたはＤＮＡ ｐｏｌイプシロンを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン－ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替的に、Ｒｅｐ－チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。受容体基質が相補的ＩＴＲである場合、得られる産物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたヘキサヌクレオチド配列である５’－ＧＧＴＴＧＡ－３’（配列番号６１）を含む。他の既知のＡＡＶ ＴＲＳ配列、ＡＧＴＴ（配列番号６２）、ＧＧＴＴＧＧ（配列番号６３）、ＡＧＴＴＧＧ（配列番号６４）、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号６５）などの他の天然に既知のまたは合成ＴＲＳ配列、およびＲＲＴＴＲＲ（配列番号６６）などの他のモチーフを含む、任意の既知のＴＲＳ配列を、本発明の実施形態において使用することができる。
本明細書で使用される場合、「センス」および「アンチセンス」という用語は、ポリヌクレオチド上の構造要素の配向を指す。エレメントのセンスバージョンおよびアンチセンスバージョンは、互いの逆相補体である。
本明細書で使用される場合、「合成ＡＡＶベクター」および「ＡＡＶベクターの合成産生」という用語は、完全に無細胞環境でのＡＡＶベクターおよびその合成産生方法を指す。
本明細書で使用される場合、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起された場合に細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を生じる反応を触媒させ、β－ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産物に変換する。実験または診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリンホスファターゼ（ＡＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ならびに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、または選択された薬剤もしくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを直接標的または損傷する任意のタンパク質またはペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要なポリペプチドを標的とするプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、およびリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の応答性の範囲および複雑性を拡張する。
転写調節因子は、関心対象の遺伝子、例えば、インフラマソームアンタゴニスト（例えば、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の１つ以上の阻害剤、またはカスパーゼ１の阻害剤）の転写を活性化または抑制する、転写アクチベーターおよびリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、ならびに細胞条件および環境条件に応じて、アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、およびロイシン－ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」または「誘導因子タンパク質」は、調節配列エレメントに結合するタンパク質であり、調節配列エレメントに操作可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制または活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサーおよび誘導因子タンパク質は、少なくとも１つの入力剤または環境入力の存在または不在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合および入力剤結合、または応答性エレメントもしくはドメインを含む形態のモジュールである。
本明細書で使用される場合、「担体」としては、任意かつすべての溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。医薬活性物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与された場合に、毒性反応、アレルギー性反応、または同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「入力剤応答性ドメイン」は、条件または入力剤に結合するか、またはそうでなければ連結ＤＮＡ結合融合ドメインをその条件もしくは入力の存在に対して応答性にする様式で、条件または入力剤に応答する、転写因子のドメインである。一実施形態では、条件または入力の存在は、入力剤応答性ドメインまたはそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。
「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中または生物内で起こるアッセイまたはプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法または使用は、細菌などの単細胞生物が使用される場合に「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物または植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞および細胞株を含む）、形質転換細胞株、および抽出組織または細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実行される方法および使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイおよび方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞または細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質またはＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現を調節する転写因子の発現を駆動することができる。プロモーター配列内では、転写開始部位、同様に、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見いだされるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’配向）に伸びる。
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質または転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、５０～１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流または遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内またはエクソン領域内に位置付けられ得る。
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動すると言うことができる。「作動可能に連結された」、「作動可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置および／または配向にあり、その配列の転写開始および／または発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節する。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子または配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。
いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方は、その自然環境において操作可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する変異を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路およびモジュールに関して、ＰＣＲを含む組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたく、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核性細胞小器官内の配列の転写および／または発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子もしくは誘導剤の存在下、それによって影響される場合、またはそれによって接触される場合に、転写活性を開始または強化することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方式で投与される、通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子または誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成要素またはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の不在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、ならびに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で交換可能に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、および「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写および翻訳制御配列を指し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）またはコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチドもしくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供および／もしくは調節し、かつ／またはコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。
「作動可能に連結された」という語句は、そのように記載された構成要素が、それらが意図された様式で機能することを許可する関係にある並列を指す。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。「発現カセット」は、ｃｅＤＮＡベクターにおける導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーターまたは他の調節配列に作動可能に連結されている異種ＤＮＡ配列を含む。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、齧歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、トラウト、ナマズ、およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類またはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。追加的に、対象は、幼児または子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患および障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。加えて、本明細書に記載される方法および組成物は、飼育動物および／またはペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、または民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系などであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者または他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、または成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、またはヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、または非ヒト胚もしくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸構築物またはｃｅＤＮＡ発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を含む。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞）、人工多能性幹細胞、またはいくつかの不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。代替的に、宿主細胞は、組織、器官、または生物における原位置またはインビボの細胞であり得る。
「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞に存在する物質を指す。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸またはポリペプチドをそのような細胞または生物に導入することが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチドを指し得る。代替的に、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞または生物における核酸またはポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現またはレベルをもたらすことが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、「内因性」という用語は、生物系または細胞に対して天然である物質を指す。
「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指す。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上記）を使用して決定される。使用される任意のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
本明細書で使用される「相同性」または「相同」という用語は、必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、標的染色体上の対応する配列のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内である様々な方式で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、例えば相同性アームの核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）は、配列が、宿主細胞の対応する未変性または未編集の核酸配列（例えば、ゲノム配列）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一である場合、「相同」とみなされる。
本明細書で使用される「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸またはタンパク質には見られないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（またはそのバリアント）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、変異体ポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。
「ベクター」または「発現ベクター」は、細胞において結合されたセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入」が結合され得る、プラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、またはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、起源および／または最終形態でウイルス性または非ウイルス性であり得るが、本開示の目的のために、「ベクター」は、その用語が本明細書で使用される場合、一般にｃｅＤＮＡベクターを指す。「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝子エレメントを包含する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組換えベクターであり得る。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、多くの場合、しかし必ずしもそうではないが、細胞にとって異種である。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、ならびにクローニングおよび増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。「発現」という用語は、ＲＮＡおよびタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳およびタンパク質の折りたたみ、修飾およびプロセシングを含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結された場合に、インビトロまたはインビボでＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子には、コード領域の前後の領域、例えば、５’未翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、同様に、個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる場合と含まれない場合がある。
「組換えベクター」とは、異種核酸配列を含むベクター、またはインビボで発現することができる「導入遺伝子」を意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態では、他の好適な組成物および療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。
本明細書で使用される「遺伝性疾患」という語句は、ゲノムの１つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的または完全に、直接的または間接的に引き起こされる疾患を指す。異常は、変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性疾患、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病であり得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される「阻害ポリヌクレオチド」は、第２の（標的）ポリヌクレオチドの発現（転写または翻訳）を低減または防止するＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。阻害ポリヌクレオチドには、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、および外部ガイド配列が含まれる。「阻害ポリヌクレオチド」という用語はさらに、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子、例えばリボザイムをコードするＤＮＡ分子などの実際の阻害種をコードするＲＮＡｉを含む。
本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ分子、例えばｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの活性に関する「遺伝子サイレンシング」または「遺伝子サイレンシングされた」とは、細胞における標的遺伝子（例えばＮＬＲＰ３、ＡＩＭ２またはカスパーゼ－１ ｍＲＮＡ）のｍＲＮＡレベルにおいて、ｍｉＲＮＡまたはＲＮＡ干渉分子が存在しない細胞で見られるｍＲＮＡレベルの少なくとも約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％の低下を指す。好ましい一実施形態では、ｍＲＮＡレベルは、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約１００％低下する。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ」という用語は、ｓｉＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡｉ、内因性マイクロＲＮＡ、および人工マイクロＲＮＡを含むがこれらに限定されない、任意のタイプの干渉ＲＮＡを指す。例えば、ＲＮＡの下流プロセシングのメカニズムに関係なく、以前にｓｉＲＮＡとして同定された配列が含まれる（すなわち、ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断をもたらす特定のインビボプロセシング方法を有すると考えられているが、そのような配列を本明細書に記載される隣接配列の状況文脈におけるベクターに組み込むことができる）。「ＲＮＡｉ」という用語は、遺伝子サイレンシングＲＮＡｉ分子、および遺伝子の発現を活性化するＲＮＡｉエフェクター分子の両方を含み得る。単なる一例として、いくつかの実施形態では、阻害する働きをする、または遺伝子サイレンシングのＲＮＡｉ剤は、本明細書に開示される方法、キットおよび組成物において、例えば免疫応答（例えば、自然免疫応答）を阻害するために有用である。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定要素の包含に対して開かれている、その組成物、方法、およびそれぞれの構成要素に関して使用される。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意のエレメントを除いて、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成要素を指す。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、および／または本開示などを読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、および／またはステップを含む。同様に、「または」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記で説明される。省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
作動例または別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。パーセンテージに関連して使用される「約」という用語は、±１％を意味する場合がある。本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲は、それに限定されるべきではない。
本明細書に開示される本発明の代替的な要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書で見られる他の要素との任意の組み合わせで参照および主張することができる。グループの１つ以上のメンバーは、利便性および／または特許性の理由から、グループに含める、またはグループから削除することができる。そのような任意の包含または削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修飾されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されているすべてのマーカッシュグループの記述を満たす。
いずれかの態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝子同一性を修正するプロセス、産業もしくは商業目的でのヒト胚の使用、または人もしくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、およびそのようなプロセスから生じる動物の遺伝子同一性を修飾するためのプロセスに関係しない。
本明細書では、本発明の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。
ＩＩ．核酸
核酸は大きく、高電荷であり、急速に分解されて身体から排出され、一般に薬理学的特性は低い。なぜなら、身体にとって異物として認識され、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の標的になるためである。したがって、治療用核酸または研究目的に使用される核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはウイルス性ベクター）などのある特定の核酸は、多くの場合、インビボで免疫応答を誘起できる。本開示は、対象レシピエントの低減した免疫応答状態で核酸の持続性を最大化することを通して発現レベルを増加させることにより、そのような免疫応答を改善、低減または排除し、核酸の効力を増強し得る薬学的組成物および方法を提供する。これにより、遺伝子療法の過程で器官損傷または他の毒性につながり得る潜在的な有害事象を最小化することができる。本明細書で提供される組成物および方法の多くは、核酸（例えば、治療用核酸または研究目的に使用される核酸）と併せた免疫応答（例えば、自然免疫応答）の特異的阻害剤の投与に関し、これにより、核酸の存在によって誘起される免疫応答（例えば、自然免疫応答）が低減される。
免疫応答（例えば、自然免疫応答）のアンタゴニストと併せた潜在的な治療用途の核酸分子の特性評価および開発が、本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、必要に応じて、改変および向上されたインビボ特性（送達、安定性、寿命、フォールディング、標的特異性）を目的としたオリゴヌクレオチドの化学的修飾、同様に、治療用途と直接相関するそれらの生物学的機能およびメカニズムが、記載される。
免疫刺激性であり得、かつ本明細書に開示される免疫抑制剤の使用を必要とし得る、本開示の例示的な治療用核酸としては、ミニ遺伝子、プラスミド、ミニサークル、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、リボザイム、閉端二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃｅＤＮＡ、ＣＥＬｉＤ、直鎖状の共有結合的閉鎖状ＤＮＡ（「ミニストリング」）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、プロテロメア閉端ＤＮＡ、またはダンベル直鎖状ＤＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、およびＤＮＡウイルス性ベクター、ウイルス性ＲＮＡベクター、ならびにそれらの任意の組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセスを通じて特定のタンパク質の細胞内レベルを下方調節することができるｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡもまた、本発明によって核酸治療薬であると企図される。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡが宿主細胞の細胞質に導入された後、これらの二本鎖ＲＮＡ構築物はＲＩＳＣと呼ばれるタンパク質に結合することができる。ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのセンス鎖はＲＩＳＣ複合体によって除去される。ＲＩＳＣ複合体は、相補的ｍＲＮＡと結合すると、ｍＲＮＡを切断し、切断された鎖を放出する。ＲＮＡｉは、対応するタンパク質の下方調節をもたらすｍＲＮＡの特異的破壊を誘導することによるものである。
タンパク質へのｍＲＮＡ翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）およびリボザイムは、核酸治療薬となり得る。アンチセンス構築物の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質ｍＲＮＡの配列に相補的な配列を有し、ワトソンは、クリック塩基対合によってｍＲＮＡに結合することができる。この結合は、標的ｍＲＮＡの翻訳を防ぎ、かつ／またはｍＲＮＡ転写産物のＲＮａｓｅＨ分解を誘起する。その結果、アンチセンスオリゴヌクレオチドは作用の特異性（すなわち、特定の疾患関連タンパク質の下方調節）を高めた。
本明細書で提供される方法のいずれにおいても、治療用核酸は治療用ＲＮＡであり得る。治療用ＲＮＡは、ｍＲＮＡ翻訳の阻害剤、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の薬剤、触媒的に活性なＲＮＡ分子（リボザイム）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、またはｍＲＮＡ転写物（ＡＳＯ）、タンパク質もしくは他の分子リガンドに結合するＲＮＡ（アプタマー）であり得る。本明細書で提供される方法のいずれにおいても、ＲＮＡｉの薬剤は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ、または三重らせん形成オリゴヌクレオチドであり得る。
いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は、閉端二本鎖ＤＮＡ、例えば、ｃｅＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、細胞における治療用タンパク質の発現および／または産生は、非ウイルス性ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターに由来する。従来のＡＡＶベクター、さらにはレンチウイルスベクターを超える、治療用タンパク質の発現に対するｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、所望のタンパク質をコードする異種核酸配列にサイズの制約がないことである。したがって、大きな治療用タンパク質でさえ、単一のｃｅＤＮＡベクターから発現することができる。したがって、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、それを必要とする対象において治療用タンパク質を発現させることができる。
一般に、本明細書に開示されるような治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ＩＴＲ配列は、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾されたＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択される。
ＩＩＩ．閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクター
本明細書に記載されるのは、１つ以上の修飾されたデキサメタゾン化合物と併せて組成物で投与される共有結合性閉端を有する新規の非ウイルス性のカプシド不含ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターである。また、提供されるのは、修飾されたデキサメタゾン化合物をさらに投与することによって細胞または対象へのｃｅＤＮＡベクターの投与時に発生する自然免疫反応を阻害する方法である。ある特定の実施形態では、修飾されたデキサメタゾン化合物は、パルミチン酸デキサメタゾンである。
非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種核酸、例えば導入遺伝子を含む発現構築物（例えば、プラスミド、バクミド、バキュロウイルス、または統合された細胞株）からの許容宿主細胞中で産生される。いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較した欠失、挿入、および／または置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的末端分解部位（ＴＲＳ）およびＲｅｐ結合部位を含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、対応するＡＡＶ ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２の場合、野生型３’および５’ＩＴＲについてそれぞれ配列番号１、または配列番号２）に関して少なくとも１つのポリヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を有して、Ｒｅｐタンパク質の存在下で宿主細胞におけるＤＮＡベクターの複製を誘導する。上で考察されるように、任意のＩＴＲを使用できることが、想定される。例示的な目的のため、表１Ａおよび実施例におけるｃｅＤＮＡ構築物中のＩＴＲは、修飾型ＩＴＲおよびＷＴ ＩＴＲである。しかしながら、本明細書では、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種核酸配列（例えば、導入遺伝子）を含むｃｅＤＮＡベクターが包含され、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列は、非対称ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る（例えば、図１Ａ～１Ｅを参照されたい）。本明細書に開示されるＮＬＳを含むｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、２０１８年９月７日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（例えば、実施例１～４を参照されたい）に開示される非対称ＩＴＲＳを含むｃｅＤＮＡベクター、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／６４２４２号（例えば、実施例１～７を参照されたい）に開示される遺伝子編集用ｃｅＤＮＡベクター、または２０１９年２月１４日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１８０１６号（例えば、実施例１～４を参照されたい）に開示される抗体もしくは融合タンパク質の産生用ｃｅＤＮＡベクター、または２０１９年２月２２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１８９２７号に開示される制御された導入遺伝子発現用ｃｅＤＮＡベクターを含むがこれに限定されない任意のｃｅＤＮＡベクターと同時投与するための本明細書に開示される修飾されたデキサメタゾン化合物の使用に関し、それらの各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される修飾されたデキサメタゾン化合物を使用する本明細書に記載される方法および組成物は、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター、例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号に開示される、ｃｅＤＮＡ産生の無細胞または無昆虫系において産生されるｃｅＤＮＡベクターと共に使用され得ることも、想定される。
ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、分子、例えば導入遺伝子の少なくとも一部にわたって二重鎖または自己相補的である。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、３７℃で１時間超エキソヌクレアーゼ消化（例えば、ＥｘｏＩまたはＥｘｏ ＩＩＩ）に対して耐性であることが好ましい。宿主細胞（例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞）におけるＲｅｐタンパク質の存在は、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターの産生を誘導する修飾型ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターポリヌクレオチドテンプレートの複製を促進する。共有結合性閉端分子は、複製中、許容細胞で蓄積し続け、Ｒｅｐタンパク質の存在下、標準複製条件下で、経時的に十分に安定であることが好ましく、例えば、少なくとも１ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも２ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも３ｐｇ／細胞、より好ましくは少なくとも４ｐｇ／細胞、さらにより好ましくは少なくとも５ｐｇ／細胞の量で蓄積する。
特に、一実施形態では、ＤＮＡベクターは、２つの異なるＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）、およびＩＴＲ間に位置付けられた関心対象のヌクレオチド配列（異種核酸、発現カセット）を含むポリヌクレオチドベクターテンプレート（例えば、発現構築物）を内包する細胞（例えば、昆虫細胞または哺乳動物細胞、例えば、２９３細胞など）を提供することにより産生され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、他のＩＴＲと比べて挿入、置換、または欠失を含む修飾型ＩＴＲである。本明細書に記載されるポリヌクレオチドベクターテンプレートは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２の場合、例えば、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０））および機能的末端分解部位（ＴＲＳ；例えば、５’－ＡＧＴＴ（配列番号６２））を含む少なくとも１つの機能的ＩＴＲを含む。細胞は、ウイルス性カプシドタンパク質を発現せず、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは、ウイルス性カプシドコード配列を欠いている。
Ｒｅｐの存在下で、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドテンプレートが複製して、ｃｅＤＮＡを産生する。ｃｅＤＮＡ産生は、２つのステップを経る。第１に、Ｒｅｐタンパク質を介したベクター骨格（例えば、プラスミド、バクミド、ゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、および第２に、切除されたベクターゲノムのＲｅｐ媒介複製である。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐタンパク質およびＲｅｐ結合部位は、当業者に周知である。当業者は、機能的ＩＴＲに結合して複製する血清型からＲｅｐタンパク質を選択することを理解する。
ベクターポリヌクレオチドを内包する細胞は、Ｒｅｐを既に含むか（例えば、誘導性ｒｅｐを有する細胞株）、Ｒｅｐを含むベクターで形質導入後、ｃｅＤＮＡベクターの複製および放出を可能にする条件下で増殖する。次いで、ｃｅＤＮＡベクターのＤＮＡは、細胞から採取され、単離される。カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡのｃｅＤＮＡベクターの存在は、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で細胞から単離されたベクターＤＮＡを消化することと、消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することとによって確認され得る。例えば、図６は、実施例に記載されるこれらのベクターを産生するための一実施形態を使用して、複数のＴＴＸプラスミド構築物からのｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルである。ｃｅＤＮＡは、図４Ｄに関して考察されるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。
ベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（例えば、ＴＴＸ－プラスミド、バクミドなど）、および／またはｉｉ）Ｒｅｐをコードするポリヌクレオチドは、トランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム、ナノ粒子、またはリポソーム）、またはウイルス性ベクター、例えばＨＳＶもしくはバキュロウイルスによる導入を含むが、これらに限定されない当業者に周知の任意の手段を用いて細胞に導入され得る。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートは、プラスミド（例えば、ＴＴＸ－プラスミド、例えば、図４Ｂを参照されたい）、バクミド（例えば、ＴＴＸ－バクミド）、および／またはバキュロウイルス（例えば、ＴＴＸ－バキュロウイルス）であり得る。一実施形態では、ＴＴＸ－プラスミドは、異種核酸（例えば、レポーター遺伝子または治療用核酸を含む発現カセット）を挿入できるＩＴＲ間に作動可能に位置付けられた制限クローニング部位（例えば、配列番号７）を含む。
好ましい一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は昆虫細胞である。別の好ましい実施形態では、バキュロウイルスを使用して、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびｃｅＤＮＡ用の非ウイルス性ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築テンプレートの両方を送達する。ｃｅＤＮＡベクターを入手し単離するためのそのようなプロセスの例は、以下の実施例１に記載される。
いくつかの実施形態によれば、合成ｃｅＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡ分子からの切除を介して産生される。ｃｅＤＮＡベクターの合成産生は、全体の参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の実施例２～６に記載される。二本鎖ＤＮＡ分子の切除を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する１つの例示的な方法。手短に言えば、ｃｅＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物を使用して生成され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図７Ａ～８Ｅを参照されたい。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物はｃｅＤＮＡプラスミドであり、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図６を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチを含む。
様々なオリゴヌクレオチドの集成を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例３に提供されており、ｃｅＤＮＡベクターは、５’オリゴヌクレオチドおよび３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。全体の参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図１１Ｂは、５’ＩＴＲオリゴヌクレオチドおよび３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。
合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する例示的な方法は、全体の参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例４において提供され、センス発現カセット配列に隣接しアンチセンス発現カセットに隣接する２つのアンチセンスＩＴＲに共有結合的に結合される２つのセンスＩＴＲを含む一本鎖の直鎖状ＤＮＡを使用し、次いで、この一本鎖の直鎖状ＤＮＡの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖ＤＮＡ分子を合成および／または産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の１つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状ＤＮＡ分子を形成し、次いで遊離５’および３’末端を互いにライゲーションして、閉鎖状一本鎖分子を形成する。
さらに別の態様では、本発明は、非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生に使用するため、本明細書に記載されるＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株を提供する。そのような細胞株を産生する方法は、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。好ましくは、Ｒｅｐタンパク質（例えば、実施例１に記載されるとおり）は、３のＭＯＩで宿主細胞に添加される。一実施形態では、宿主細胞株は無脊椎動物の細胞株、好ましくは昆虫Ｓｆ９細胞である。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、好ましくは２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐの存在下でのｃｅＤＮＡの切除および増幅を可能にする。
任意のプロモーターは、ベクターポリヌクレオチドの異種核酸（例えば、レポーター核酸または治療用導入遺伝子）に作動可能に連結することができる。発現カセットは、ＣＡＧプロモーターなどの合成調節エレメントを含有し得る。ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）プロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびに（ｉｉ）ウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替的に、発現カセットは、アルファ－１－アンチトリプシン（ＡＡＴ）プロモーター、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモーター、またはヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ１－α）プロモーターを含むことができる。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを有する）を含む。代替的に、誘導性もしくは抑制性プロモーター、導入遺伝子の未変性プロモーター、組織特異的プロモーター、または当該技術分野において既知の様々なプロモーターを使用することができる。遺伝子療法のための好適な導入遺伝子は、当業者に周知である。
カプシド不含ｃｅＤＮＡベクターはまた、シス調節エレメント、またはシス調節エレメントの組み合わせをさらに含むベクターポリヌクレオチド発現構築物から産生され得、非限定的な例は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）およびＢＧＨポリＡ、または例えば、ベータ－グロビンポリＡを含む。他の転写後プロセシングエレメントは、例えば、単純ヘルペスウイルス、またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子を含む。発現カセットは、例えば、ウシＢＧＨｐＡもしくはウイルスＳＶ４０ｐＡから単離された天然、または合成などの、当該技術分野において既知の任意のポリアデニル化配列またはその変形を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡまたは異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
本明細書に記載されるＤＮＡベクターを細胞から採取および収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態、細胞増殖などを考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ＤＮＡ－ベクター（例えば、ＴＴＸ－ベクター）を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
一実施形態では、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターは、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、外因性ＤＮＡの発現カセット）および修飾ＡＡＶ ＩＴＲをこの順で含むポリヌクレオチドテンプレートを含むプラスミドを含むか、またはそれから得られ、該テンプレート核酸分子は、ＡＡＶカプシドタンパク質コードを欠いている。さらなる実施形態では、本発明の核酸テンプレートは、ウイルス性カプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。加えて、特定の実施形態では、テンプレート核酸分子はまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、機能的なＡＡＶキャップおよびＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子の両方を欠いている。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲに関して変異したＩＴＲ構造を含み得るが、依然として操作可能なＲＢＥ、ＴＲＳ、およびＲＢＥ’部分を保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００～５２９から選択される任意の配列を含むＩＴＲを有しない。
ＩＶ．薬学的組成物
本発明は、治療用核酸および本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾンまたはパルミチン酸デキサメタゾン）の１つ以上の阻害剤を含む、薬学的組成物および製剤を企図する。いくつかの実施形態では、治療用核酸および免疫応答（例えば、自然免疫応答）の１つ以上の阻害剤を含む薬学的組成物は薬学的に許容される賦形剤または担体を含み得る。
ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。例えば、本発明のＴＴＸ－ベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注入もしくは細胞質内注入などの細胞内注入もまた、企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ＴＴＸ－ベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のＴＴＸ－ベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと組み込み、続いて濾過滅菌によって調製され得る。
ＴＴＸ－ベクターを含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化され得、その中の導入遺伝子の治療的発現をもたらす。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
本明細書に提供される組成物およびベクターを使用して、様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳動物対象における疾患状態の治療または予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、遺伝子編集分子（例えば、ヌクレアーゼ）である。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓヌクレアーゼ）である。
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。
ある特定の状況では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡ組成物を、本明細書に開示される好適に製剤化された薬学的組成物で、皮下、膵臓内、鼻腔内、非経口、静脈内、筋肉内、髄腔内、全身投与、または経口、腹腔内、または吸入によって送達することが望ましい。
本明細書に記載される技術は、一般に、特にｃｅＤＮＡベクターによって例示される、閉端ＤＮＡベクターを対象に投与するための方法に関する。閉端ＤＮＡベクターには、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター、ならびにミニサークルＤＮＡ、ドッグボーンＤＮＡ、ダンベルＤＮＡなどが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、閉端ＤＮＡベクターは、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターである。代替的な実施形態では、閉端ＤＮＡベクターは、例えばダンベルＤＮＡベクターまたはドッグボーンＤＮＡベクターである（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／００８６６２６を参照されたい）。
別の態様では、薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、本明細書に記載される閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。例えば、本明細書に記載されるそのような閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注入もしくは細胞質内注入などの細胞内注入もまた、企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高い閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせと共に、適切な緩衝液に必要量の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクター化合物を組み込んだ後、ｃｅＤＮＡベクター含む濾過滅菌によって調製することができ、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化して、その中の導入遺伝子またはドナー配列の治療的発現をもたらし得る。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを含む薬学的に活性な組成物は、細胞、例えば対象の細胞に様々な目的のための導入遺伝子を送達するように製剤化され得る。
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度の閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクターに好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量の閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせに組み込んだ後、濾過滅菌によって調製され得る。
本明細書に記載され本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ管内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、前房内、および硝子体内）、蝸牛内、ならびに粘膜（例えば、経口、直腸、鼻）投与に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注入もしくは細胞質内注入などの細胞内注入もまた、企図される。
単位投与量
いくつかの実施形態によれば、薬学的組成物は、単位剤形で提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合されるであろう。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。
Ｖ．投与および投薬
いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む１つ以上の閉端ＤＮＡベクターを宿主細胞に送達することを含む。本明細書ではまた、そのような方法によって産生される細胞、およびそのような細胞を含むかまたはそのような細胞から産生される生物（動物、植物、または真菌など）も提供される。核酸の送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、微量注入、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、およびＤＮＡでの薬剤増強取り込みが含まれ得る。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。送達は、細胞（例えば、インビトロもしくはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。
いくつかの実施形態によれば、自然免疫応答の阻害剤および核酸は、任意の組み合わせで対象または患者に投与され得る。例えば、免疫応答の１つ以上の阻害剤（例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）を投与され得る。いくつかの実施形態によれば、対象または患者は、本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤、および核酸（例えば、ミニサークル、ミニ遺伝子、ミニストリング共有結合性閉鎖ＤＮＡ、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形ＤＮＡ、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡおよびＣＥＬｉＤ）、プラスミド系環状ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）が投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、免疫応答の１つ以上のの阻害剤（例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）および１つ以上の核酸（例えば、ミニサークル、ミニ遺伝子、ミニストリング共有結合性閉鎖ＤＮＡ、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形ＤＮＡ、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡおよびＣＥＬｉＤ）、プラスミド系環状ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）を同時に投与され得る。例えば、方法は、免疫応答の阻害剤（例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）および核酸治療薬を、２つの別個の製剤としてだが同時に、対象に投与することを含み得る。別の例では、方法は、免疫応答の阻害剤（例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）および治療用核酸を１つの製剤で同時に対象に同時投与することを含み得る。
いくつかの実施形態では、対象は、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の１つ以上の阻害剤および１つ以上の核酸（例えば、ミニサークル、ミニ遺伝子、ミニストリング共有結合性閉鎖ＤＮＡ、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル形ＤＮＡ、直鎖状閉端二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡおよびＣＥＬｉＤ）、プラスミド系環状ベクター、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）を連続して投与され得る。例えば、免疫応答の阻害剤は、治療用核酸の投与前に投与され得る。
連続投与の場合、免疫応答の１つ以上の阻害剤（例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）とＴＮＡの投与間に遅延期間があってもよい。例えば、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、ＴＮＡ投与の数時間、数日、または数週間前に（例えば、核酸の投与の少なくとも３０分、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間前、および少なくとも約４週間前）投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答の阻害剤（例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）は、ＴＮＡの投与の約３０分前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約１時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約２時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約３時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約４時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約５時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約６時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約７時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約８時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約９時間前に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、核酸の投与の約１０時間前に投与され得る。
一実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または２４時間以下前に投与される。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約１日、約２日、約３日、約４日、約６日、または約７日以下前に投与され得る。
いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または２４時間後に投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫応答の阻害剤（例えば、デキサメタゾンまたはパルミチン酸デキサメタゾン）は、核酸の投与の約１日、約２日、約３日、約４日、約６日、または約７日後に投与され得る。
一実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、または２４時間以下後に投与される。いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の阻害剤は、核酸の投与の約１日、約２日、約３日、約４日、約６日、または約７日以下後に投与され得る。
いくつかの実施形態では、免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の１つ以上の阻害剤は、核酸の投与の前、同時、および／または後に複数回投与され得る。
いくつかの実施形態では、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）は、単回用量または複数回用量として投与され得る。いくつかの実施形態によれば、２回用量以上を対象に投与され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルス性カプシドの不在に起因して、抗カプシド宿主免疫応答を誘起しないため、複数回用量が、必要に応じて投与され得る。いくつかの実施形態によれば、投与される用量の数は、例えば、２～１０以上の用量、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上であり得る。
いくつかの実施形態では、核酸は、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の１つ以上の阻害剤と併せて、複数回、投与および再投薬することができる。例えば、治療用核酸は、初回投薬計画における投与核酸の前、後、または同時に投与される、免疫応答の１つ以上の阻害剤と共に、０日目に投与され得る。０日目の初回治療に続いて、核酸、好ましくは本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答、例えば、デキサメタゾン／パルミチン酸デキサメタゾン）の１つ以上の阻害剤を用いた初回治療の約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、または約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、または約１年、約２年、約３年、約４年、約５年、約６年、約７年、約８年、約９年、約１０年、約１１年、約１２年、約１３年、約１４年、約１５年、約１６年、約１７年、約１８年、約１９年、約２０年、約２１年、約２２年、約２３年、約２４年、約２５年、約２６年、約２７年、約２８年、約２９年、約３０年、約３１年、約３２年、約３３年、約３４年、約３５年、約３６年、約３７年、約３８年、約３９年、約４０年、約４１年、約４２年、約４３年、約４４年、約４５年、約４６年、約４７年、約４８年、約４９年または約５０年後に、２回目の投薬（再投薬）を実施することができる。
いくつかの実施形態によれば、核酸の再投薬は、核酸の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態によれば、初回投薬後の核酸の発現と比較して、再投薬後の核酸の発現の増加は、核酸の再投薬後、約０．５倍～約１０倍、約１倍～約５倍、約１倍～約２倍、または約０．５倍、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、または約１０倍高い。
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されるタンパク質の産生のための核酸（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の２回以上の投与（例えば、２、３、または４回以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間にわたって、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年など、所望の遺伝子発現レベルを達成することができる。
本明細書に開示される実施形態のいずれかによれば、核酸は治療用核酸であり得る。
一般に、投与量は、ｃｅＤＮＡベクターの特定の特性、発現効率、ならびに患者の年齢、状態、および性別によって異なるだろう。投与量は、当業者が決定でき、ｃｅＤＮＡベクターは反復投薬を防止する免疫活性化カプシドタンパク質を含まないため、従来のＡＡＶベクターとは異なって、合併症の場合には個々の医師により調整することもできる。
核酸を細胞に送達するための様々な技法および方法が、当該技術分野において既知である。例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、またはコアシェルナノ粒子に製剤化され得る。典型的に、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）分子、１つ以上のイオン化またはカチオン性脂質（もしくはそれらの塩）、１つ以上の非イオン性または中性脂質（例えば、リン脂質）、凝集を防ぐ分子（例えば、ＰＥＧもしくはＰＥＧ－脂質コンジュゲート）、および任意選択的にステロール（例えば、コレステロール）で構成される。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを細胞に送達するための別の方法は、細胞により内在化されるリガンドと核酸をコンジュゲートすることによる。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合的に連結され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的なコンジュゲートは、例えば、各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１５／００６７４０、ＷＯ２０１４／０２５８０５、ＷＯ２０１２／０３７２５４、ＷＯ２００９／０８２６０６、ＷＯ２００９／０７３８０９、ＷＯ２００９／０１８３３２、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００４／０９０１０８、ＷＯ２００４／０９１５１５、およびＷＯ２０１７／１７７３２６に記載される。
核酸、および本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターはまた、トランスフェクションによって細胞に送達され得る。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、またはリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））、２９３フェクチン、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ（登録商標），Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ－１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））、ＴＦＸ－２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））、ＴＦＸ－５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ（登録商標），Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標），Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、およびＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）が含まれるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス方法を介して細胞に送達され得る。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注入、注射、局所用途、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応を提供し得る。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの導入のための方法は、例えば、全体の参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９２８，６３８号に記載される方法により、造血幹細胞に送達することができる。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、対象における細胞または標的器官への送達のためにリポソームに添加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。例示的なリポソームおよびリポソーム製剤は、各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号および２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示され、例えば、「薬学的製剤」と題されるセクションを参照されたい。
当該技術分野で既知の様々な送達方法またはそれらのの修正を使用して、インビトロまたはインビボで本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、またはレーザー系エネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化された細胞へのＤＮＡ進入が促進される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、または当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは単独で、裸のＤＮＡとして皮膚、甲状腺、心筋、骨格筋、または肝臓細胞中に直接注入される。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金またはタングステン球状粒子（１～３μｍ直径）は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物は、本明細書で具体的に企図される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、脂質送達系、例えば、本明細書に記載されるリポソームで製剤化される。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、熟練した開業医によって望まれる任意の経路によって投与される。組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、口腔内投与を介した、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせを含む異なる経路によって対象に投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的慣習に従って好適に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な投薬計画および投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「マイクロプロジェクタイルボンバードメント遺伝子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与され得る。
場合によっては、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、内臓および肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物および粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学的注入によって送達される。
場合によっては、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、膜中にナノスコピック孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓または腫瘍の細胞へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進するため、閉端ＤＮＡのサイズおよび濃度は、系の効率において大きな役割を果たす。場合によっては、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、磁場を使用してマグネトフェクションによって送達され、核酸を含む粒子を標的細胞に濃縮する。
場合によっては、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム／ミセルまたはカチオン性ポリマーに属するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ－Ｌ－リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、および脂質－ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
Ａ．エキソソーム：
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、エキソソームに被包されることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、ＢおよびＴリンパ球、マスト細胞（ＭＣ）、同様に、樹状細胞（ＤＣ）を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、１０ｎｍ～１μｍ、２０ｎｍ～５００ｎｍ、３０ｎｍ～２５０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、または特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本発明のカプシド不含ＡＡＶベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
Ｂ．微粒子／ナノ粒子：
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ５（３）：４９８－５０７によって開示されるように、イオン化アミノ脂質（例えば、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびコート脂質（ポリエチレングリコール－ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約１０００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約３００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２５～約２００ｎｍの直径を有する。いくつかの他の実施形態では、治療用核酸および／または免疫抑制剤を含む脂質粒子は、効果的な送達を保証するため、典型的には、約２０ｎｍ～約１００ｎｍ、３０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約９０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０～約９０ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、または約３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、または１５０ｎｍの平均直径を有する。核酸含有脂質粒子およびそれらの調製方法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１８／５００４２、米国特許公開第２００４／０１４２０２５号および同第２００７／００４２０３１号に開示されており、これらの開示は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物（例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、サイズ分布を有し、平均サイズ（例えば、直径）は、約７０ｎｍ～約２００ｎｍであり、より典型的に、平均サイズは、約１００ｎｍ以下である。
いくつかの実施形態によれば、核酸（例えば、治療用核酸、研究目的に使用される核酸）および／または本発明の免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤を含む液体薬学的組成物は、脂質粒子で製剤化され得る。いくつかの実施形態では、核酸を含む脂質粒子は、カチオン性脂質から形成することができる。いくつかの他の実施形態では、核酸を含む脂質粒子は、非カチオン性脂質から形成され得る。好ましい実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸を含有する脂質粒子であり、これは、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶゲノム）または非ウイルス性合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡベクター、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルス性ミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、またはダンベル形ＤＮＡ最小ベクター（「ダンベルＤＮＡ」）からなる群から選択される核酸を含むカチオン性脂質から形成される。
当該技術分野で既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む、閉端ＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第９，４０４，１２７号、同第９，００６，４１７号、および同第９，５１８，２７２号に記載される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、金ナノ粒子によって送達される。一般に、核酸は、金ナノ粒子に共有結合的に結合され得るか、または金ナノ粒子に非共有結合的に結合され得（例えば、電荷－電荷相互作用によって結合され）、例えば、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（６）；１０７５－１０８３によって記載される。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子－核酸コンジュゲートは、例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８１２，３３４号に記載される方法を使用して産生される。
Ｃ．コンジュゲート
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および／または本明細書に記載され本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、コンジュゲートする（例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤と共有結合的に結合する。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例えば、コレステロール、トコフェロールなど）、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）（例えば、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂなど）、およびポリアミン（例えば、スペルミン）にコンジュゲートし得る。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ． Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１－８０９に開示される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および／または本明細書に記載され本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、ポリマー（例えば、ポリマー分子）または葉酸塩分子（例えば、葉酸分子）にコンジュゲートする。一般に、ポリマーにコンジュゲートした核酸の送達は、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０００／３４３４３およびＷＯ２００８／０２２３０９に記載されるように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，９８７，３７７号によって記載されるように、ポリ（アミド）ポリマーにコンジュゲートする。いくつかの実施形態では、本開示によって記載される核酸は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，５０７，４５５号に記載されるように、葉酸分子にコンジュゲートする。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および／または本明細書に記載され本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４５０，４６７号に記載される炭水化物にコンジュゲートする。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、凝集を防止するために他の部分とコンジュゲートしてもよい。そのような脂質コンジュゲートには、例えば、ジアルキルオキシプロピルと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲート）、ジアシルグリセロールと共役したＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＡＧコンジュゲート）、コレステロールと共役したＰＥＧ、ホスファチジルエタノールアミンと共役したＰＥＧ、およびセラミドと共役したＰＥＧ（例えば、米国特許第５，８８５，６１３号を参照されたい）などのＰＥＧ－脂質コンジュゲート、カチオン性ＰＥＧ脂質、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート（例えば、ＰＯＺ－ＤＡＡコンジュゲート、例えば、２０１０年１月１３日に出願された米国仮出願第６１／２９４，８２８号、および２０１０年１月１４日に出願された米国仮出願第６１／２９５，１４０号を参照されたい）、ポリアミドオリゴマー（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）ならびにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ＰＯＺ－脂質コンジュゲートの追加の例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／００６２８２号に記載され、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。ＰＥＧまたはＰＯＺは、脂質に直接結合するか、リンカー部分を介して脂質にコンジュゲートできる。例えば、非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む、ＰＥＧまたはＰＯＺを脂質に結合するのに好適な任意のリンカー部分を使用することができる。ある特定の好ましい実施形態では、アミドまたはカルバメートなどの非エステル含有リンカー部分が使用される。上記の各特許文書の開示内容は、あらゆる目的で参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｄ．ナノカプセル
代替的に、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および／または本明細書に記載され本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤のナノカプセル製剤を使用することができる。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方式で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
Ｅ．リポソーム
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターおよび免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、対象における細胞または標的器官への送達のためにリポソームに添加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に既知である。向上された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発されている（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が、記載されている（各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、および同第５，７９５，５８７号）。
Ｆ．例示的なリポソームおよび脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクター、および本明細書に記載される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤は、細胞、例えば、導入遺伝子の発現を必要としている細胞への送達のためにリポソームに添加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
ｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号および２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示されており、各々が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される方法および組成物での使用が想定される。
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物に対する親水性および疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成要素として含む。そのような態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ～約５，０００Ｄａであり得る。
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間～数週間の期間にわたって送達するであろうリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間～数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成要素を有するＡＰＩを封入する。
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）コンジュゲート脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステリル（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルコリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２～１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を含有するリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－２０００－ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質コンジュゲート、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、およびＤＯＰＥを含む。
いくつかの態様では、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０～２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を添加することにより、本明細書に開示または記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製および充填されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３まで増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に送る。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４～６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクター、および／または免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤およびイオン化脂質を含む、脂質ナノ粒子を提供する。例えば、全体の産所により本明細書に組み込まれる、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されるプロセスにより得られたｃｅＤＮＡで作製および充填される、脂質ナノ粒子製剤。これは、イオン化脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合および核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈および有機溶媒の除去によってさらに安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。
一般に、脂質粒子は、約１０：１～３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量または重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、または約６：１～約９：１の範囲内であり得る。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約１５：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約４０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する。本明細書の態様または実施形態のいずれかのいくつかの実施形態によれば、組成物は、約５０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ比を有する。脂質およびｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る
イオン化脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、および膜会合および膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、イオン化脂質は、正に電荷される、または例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。
例示的なイオン化脂質は、国際ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１５／０９５３４０号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１８／０１１６３３号、同第ＷＯ２０１７／０４９２４５号、同第ＷＯ２０１５／０６１４６７号、同第ＷＯ２０１２／０４０１８４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１５／０７４０８５号、同第ＷＯ２０１６／０８１０２９号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１７／０７５５３１号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１１／０２２４６０号、同第ＷＯ２０１３／１４８５４１号、同第ＷＯ２０１３／１１６１２６号、同第ＷＯ２０１１／１５３１２０号、同第ＷＯ２０１２／０４４６３８号、同第ＷＯ２０１２／０５４３６５号、同第ＷＯ２０１１／０９０９６５号、同第ＷＯ２０１３／０１６０５８号、同第ＷＯ２０１２／１６２２１０号、同第ＷＯ２００８／０４２９７３号、同第ＷＯ２０１０／１２９７０９号、同第ＷＯ２０１０／１４４７４０号、同第ＷＯ２０１２／０９９７５５号、同第ＷＯ２０１３／０４９３２８号、同第ＷＯ２０１３／０８６３２２号、同第ＷＯ２０１３／０８６３７３号、同第ＷＯ２０１１／０７１８６０号、同第ＷＯ２００９／１３２１３１号、同第ＷＯ２０１０／０４８５３６号、同第ＷＯ２０１０／０８８５３７号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０１号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０６号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０５号、同第ＷＯ２０１０／０５４３８４号、同第ＷＯ２０１２／０１６１８４号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１０／０４２８７７号、同第ＷＯ２０１１／０００１０６号、同第ＷＯ２０１１／０００１０７号、同第ＷＯ２００５／１２０１５２号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０５号、同第ＷＯ２０１３／１２６８０３号、同第ＷＯ２００６／００７７１２号、同第ＷＯ２０１１／０３８１６０号、同第ＷＯ２００５／１２１３４８号、同第ＷＯ２０１１／０６６６５１号、同第ＷＯ２００９／１２７０６０号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０４号、同第ＷＯ２００６／０６９７８２号、同第ＷＯ２０１２／０３１０４３号、同第ＷＯ２０１３／００６８２５号、同第ＷＯ２０１３／０３３５６３号、同第ＷＯ２０１３／０８９１５１号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、および同第ＷＯ２０１３／０８６３５４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１６／０３１１７５９号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０１５１２８４号、同第ＵＳ２０１７／０２１０６９７号、同第ＵＳ２０１５／０１４００７０号、同第ＵＳ２０１３／０１７８５４１号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１５／０１４１６７８号、同第ＵＳ２０１５／０２３９９２６号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１７／０１１９９０４号、同第ＵＳ２０１２／０１４９８９４号、同第ＵＳ２０１５／００５７３７３号、同第ＵＳ２０１３／００９０３７２号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５２３号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２００９／００２３６７３号、同第ＵＳ２０１２／０１２８７６０号、同第ＵＳ２０１０／０３２４１２０号、同第ＵＳ２０１４／０２００２５７号、同第ＵＳ２０１５／０２０３４４６号、同第ＵＳ２０１８／０００５３６３号、同第ＵＳ２０１４／０３０８３０４号、同第ＵＳ２０１３／０３３８２１０号、同第ＵＳ２０１２／０１０１１４８号、同第ＵＳ２０１２／００２７７９６号、同第ＵＳ２０１２／００５８１４４号、同第ＵＳ２０１３／０３２３２６９号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１１／０２５６１７５号、同第ＵＳ２０１２／０２０２８７１号、同第ＵＳ２０１１／００７６３３５号、同第ＵＳ２００６／００８３７８０号、同第ＵＳ２０１３／０１２３３３８号、同第ＵＳ２０１５／００６４２４２号、同第ＵＳ２００６／００５１４０５号、同第ＵＳ２０１３／００６５９３９号、同第ＵＳ２００６／０００８９１０号、同第ＵＳ２００３／００２２６４９号、同第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号、同第ＵＳ２０１３／０１１６３０７号、同第ＵＳ２０１０／００６２９６７号、同第ＵＳ２０１３／０２０２６８４号、同第ＵＳ２０１４／０１４１０７０号、同第ＵＳ２０１４／０２５５４７２号、同第ＵＳ２０１４／００３９０３２号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、同第ＵＳ２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡまたはＭＣ３）である：
Figure 2022523806000002
 。
脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９－８５３３（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／０７４０８５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、脂質ＡＴＸ－００２である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１２／０４０１８４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（化合物３２）である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／１９９９５２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、化合物６または化合物２２である。
限定なく、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の２０～９０％（ｍｏｌ）を含み得る。例えば、イオン化脂質モル含有量は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）、または４０～５０％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を含む。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質をさらに含み得る。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、およびアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を増強するために用いられる。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む、ＤＮＡベクターを含む方法および組成物での使用が想定される例示的な非カチオン性脂質は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号、および２０１８年１２月６日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号（これはその全体が本明細書に取り込まれる）に記載される。
例示的な非カチオン性脂質は、国際出願公開第ＷＯ２０１７／０９９８２３号および米国特許公開第ＵＳ２０１８／００２８６６４号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を含み得る。例えば、非カチオン性脂質含有量は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の５～２０％（ｍｏｌ）または１０～１５％（ｍｏｌ）である。様々な実施形態では、イオン化脂質対中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を全く含まない。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、膜統合性を提供するために、ステロールなどの構成要素をさらに含み得る。
脂質ナノ粒子中で使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロールおよびその誘導体である。例示的なコレステロール誘導体は、国際出願第ＷＯ２００９／１２７０６０号および米国特許公開第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
ステロールなどの膜統合性を提供する構成要素は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の０～５０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、そのような構成要素は、脂質ナノ粒子の全脂質含有量の２０～５０％（ｍｏｌ）、３０～４０％（ｍｏｌ）である。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはコンジュゲートした脂質分子をさらに含み得る。一般に、これらを使用して、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、かつ／または立体安定化を提供する。例示的な複合脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、コンジュゲートした脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）－コンジュゲート脂質である。例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ））、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、およびＵＳ２０１７／０１１９９０４に記載されており、これらのすべての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＵＳ２０１８／００２８６６４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される化合物である。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＵＳ２０１５／０３７６１１５またはＵＳ２０１６／０３７６２２４（これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に開示される。
ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、および１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施例では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］からなる群から選択され得る。
ＰＥＧ以外の分子とコンジュゲートした脂質は、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、およびカチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲートを、ＰＥＧ－脂質の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。例示的な複合脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、およびカチオン性ポリマー－脂質は、国際特許出願公開第ＷＯ１９９６／０１０３９２号、同第ＷＯ１９９８／０５１２７８号、同第ＷＯ２００２／０８７５４１号、同第ＷＯ２００５／０２６３７２号、同第ＷＯ２００８／１４７４３８号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、および同第ＷＯ２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２００３／００７７８２９号、同第ＵＳ２００５／０１７５６８２号、同第ＵＳ２００８／００２００５８号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、および同第ＵＳ２０１１／０１２３４５３号、ならびに米国特許第ＵＳ５，８８５，６１３号、同第ＵＳ６，２８７，５９１号、同第ＵＳ６，３２０，０１７号、および同第ＵＳ６，５８６，５５９号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、所望の治療目的および生物作用に従って選択され得る。例えば、ＬＮＰ内のｃｅＤＮＡが、癌を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗癌剤（例えば、化学療法剤、標的癌療法（小分子、抗体、または抗体－薬物コンジュゲートを含むが、これらに限定されない）であり得る。別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗微生物剤（例えば、抗生物質または抗ウイルス化合物）であり得る。さらに別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患または障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫応答を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、または１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質または異なる化合物（治療剤など）をコードするｃｅＤＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質ナノ粒子の異なるカクテルを、本発明の組成物および方法で使用することができる。
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激剤である。
本明細書では、脂質ナノ粒子でカプセル化されたｃｅＤＮＡベクター、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、薬学的組成物もまた、提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に開示される修飾されたデキサメタゾン化合物をさらに含み得る。代替的な実施形態では、脂質ナノ粒子でカプセル化されたｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物は、修飾されたデキサメタゾン化合物を含む薬学的組成物と共に対象に同時投与される。代替的な実施形態では、脂質ナノ粒子でカプセル化されたｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物は、本明細書に記載される修飾されたデキサメタゾン化合物を含む。
いくつかの態様では、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤をさらに含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、および／またはグリシンをさらに含む。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、粒子の脂質部分と複合体化するか、脂質ナノ粒子の脂質位置にカプセル化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡを含むＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子の脂質位置に完全にカプセル化され得、それによって、例えば、水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子において本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、または６０分間のヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。限定なく、非二層の形態には、例えば、３次元のチューブ、ロッド、立方対称などが含まれ得る。例えば、脂質ナノ粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。
いくつかのさらなる実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含む脂質ナノ粒子を提供する。
脂質構成要素の組成物および濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化および／または制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質コンジュゲートの組成物および濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８，１７２－１７６（２０１０）を参照。それらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。カチオン性脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で決定され得る。
ＶＩ．ｃｅＤＮＡおよび修飾されたデキサメタゾン化合物を含む方法および組成物
デキサメタゾンは、他の糖質コルチコイドと同様に、免疫抑制剤として長い間知られている。変形性関節症、滑液包炎、腱炎、関節リウマチの発赤、上顆炎、腱鞘炎、痛風性関節炎に対する治療として承認されている。デキサメタゾンは、炎症誘発性シグナル伝達経路の阻害においてＤＵＳＰ１と相互作用し、腫瘍壊死因子、シクロオキシゲナーゼ２、ＮＦκＢ、インターロイキン１αおよび１βを含むいくつかの炎症誘発性遺伝子の抑制をもたらす（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．（１９９７）７２（２）：１４１－５、Ａｂｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．（２００６）２０３（８）：１８８３－１８８９）。デキサメタゾンは、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ、ＴＬＲ９、またはインフラマソーム経路と直接相互作用しないが、これらの経路の多くによって刺激される炎症性メディエーターを阻害する。しかしながら、デキサメタゾンは、ｃｅＤＮＡとの同時送達のためにＬＮＰにカプセル化することが困難である。これに対する１つの解決策は、１つ以上の脂肪酸鎖を結合することによるなどの、デキサメタゾンを誘導体化してその疎水性を高めることである。一実施形態では、パルミチン酸デキサメタゾンが、使用される。
ＶＩＩ．治療効果
自然免疫系を抑制または低減するための、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター、または追加の免疫抑制剤（例えば、デキサメタゾンまたはパルミチン酸デキサメタゾン）と共に投与されたｃｅＤＮＡベクターの有効性は、当業者によって決定され得る。いくつかの実施形態によれば、自然免疫応答の兆候または症状のいずれか１つもしくはすべてが有益な様式で低減および／もしくは改変される場合、または疾患の他の臨床的に許容される症状もしくはマーカーが、例えば、本明細書に開示される免疫応答（例えば、自然免疫応答）の阻害剤をコードするｃｅＤＮＡベクターを用いた治療後に少なくとも１０％向上もしくは改善される場合、「有効な治療」という用語が本明細書で使用されるように、治療は「有効な治療」とみなされる。例示的なマーカーおよび症状は、本明細書の実施例で考察されている。有効性はまた、疾患の安定化、または医療介入の必要性（すなわち、疾患の進行が停止するか、少なくとも遅くなる）によって評価される個人の悪化の失敗によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ／または本明細書に記載される。治療は、個人または動物（いくつかの非限定的な例としては、ヒトまたは哺乳動物が挙げられる）における疾患の任意の治療を含み、以下：（１）疾患を阻害すること、例えば、疾患もしくは障害の進行を停止もしくは遅延させること、または（２）疾患を緩和すること、例えば、症状の軽減を引き起こすこと、および（３）疾患の発症の可能性を防止もしくは低減すること、または疾患に関連する二次的疾患／障害、例えば、肝不全または腎不全を防止することを含む。疾患の治療のための有効量とは、それを必要とする哺乳動物に投与した場合、その用語が本明細書で定義されているように、その疾患に対して有効な治療をもたらすのに十分である量を意味する。
薬剤の有効性は、所与の疾患に特有の物理的指標を評価することによって決定することができる。疾患指標の標準的な分析方法は、当該技術分野で既知である。例えば、自然免疫系の物理的指標には、例えば、血漿または血液中の可溶性ＣＤ１４（ｓＣＤ１４）およびＩＬ－１８、ＩＬ－２２、ＣＳＦまたは血液中のＡＩＭ２、ＮＬＲＰ３、ＮＬＲＰ１、ＡＳＣおよびカスパーゼ１などのインフラマソームタンパク質が含まれるが、これらに限定されず、サイトカイン経路の活性化は、ＮＬＲＰ３および／またはＡＩＭ２インフラマソーム経路の活性化、またはカスパーゼ１活性化の機能的な読み出しとして使用でき、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１８、インターフェロン（ＩＦＮ）－γ、インターフェロン（ＩＦＮ）－α、単球化学誘因タンパク質（ＭＣＰ）－１、および／または腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）－αなどのバイオマーカーが含まれるが、これらに限定されない。
文献参照、発行済み特許、公開済みの特許出願、および係属中の特許出願を含む、本出願を通して引用されるすべての特許および他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行発明のおかげで、またはいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関するすべての記述またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人に利用可能である情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態および実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップまたは機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、または機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献および出願の構成、機能、および概念を用いて本開示のさらなる実施形態を提供するように修正することができる。さらに、生物学的機能の同等性の考慮により、種類または量の生物学的または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更および他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
前述の実施形態のうちのいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または置き換えることができる。さらに、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、すべての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によってさらに説明されており、決してこれらをさらに限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図されない。
以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。本明細書に記載される野生型または修飾型ＩＴＲのうちのいずれかからｃｅＤＮＡベクターを構築できること、および以下の例示的な方法を使用して、そのようなｃｅＤＮＡベクターの活性を構築し、評価できることを当業者は理解するであろう。これらの方法は、ある特定のｃｅＤＮＡベクターを用いて例示されているが、それらは、説明に沿って任意のｃｅＤＮＡベクターに適用可能である。
実施例１：昆虫細胞ベースの方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを構築する
ポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用したｃｅＤＮＡベクターの産生は、全体の参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の実施例１に記載される。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）および発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複合する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
ｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ－プラスミドに由来する。図１Ａおよび１Ｂを参照すると、各ｃｅＤＮＡ－プラスミドのポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左修飾型ＩＴＲおよび右修飾型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列の間には、（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後応答エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）から）を有する。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１～Ｒ６）（図１Ａおよび図１Ｂに示される）もまた、各構成要素の間に導入して、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成要素の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号１２３）およびＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１２４）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中に設計される。これらの配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ Ｂプラスミドにクローニングした。
ｃｅＤＮＡ－バクミドの産生：
ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミドまたは制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを生成した。バクミドおよびトランスポサーゼプラスミドの形質転換体および維持のために選択する抗生物質と共に、Ｘ－ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組換えバクミドを選択した。β－ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍＬの培地中で培養した。
組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを、Ｅ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍＬの培地で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞または細胞残屑から分離した。
任意選択的に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０～５００ｍＬの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４～１５ｎｍのナイーブ直径から）１８～１９ｎｍの直径に到達するまで、細胞直径および生存性、ならびに約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度を監視した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に収集し、細胞および残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
試験構築物を含むｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性または力価を判定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５～２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日判定した。
全体の参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の図８Ａに開示される「Ｒｅｐ－プラスミド」を、Ｒｅｐ７８（配列番号１３１または１３３）およびＲｅｐ５２（配列番号１３２）またはＲｅｐ６８（配列番号１３０）およびＲｅｐ４０（配列番号１２９）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において産生した。Ｒｅｐ－プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ－プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えバクミド（「Ｒｅｐ－バクミド」）を生成した。Ｘ－ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）を含む正の選択によって、組換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍＬの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン）中に播種した。組換えバクミド（Ｒｅｐ－バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ－バクミドをＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。
Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍＬの培地中で４日間培養し、感染性組換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ－バキュロウイルス」）を、培養物から単離した。任意選択的に、第１世代のＲｅｐ－バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０～５００ｍＬの培地中で培養した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、または濾過もしくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベーションした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日判定した。
ｃｅＤＮＡベクター生成および特徴付け
図４Ｂを参照して、次に、（１）ｃｅＤＮＡ－バクミドを含有する試料またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス、および（２）上記のＲｅｐ－バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬ、２０ｍＬ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００および１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４～５日後に、細胞の直径および生存率が検出される。生存率が約７０～８０％で細胞直径が１８～２０ｎｍに到達した場合、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水または緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ ＭＩＤＩ ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラムあたり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
Ｓｆ９昆虫細胞から産生および精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定された。精製されたｃｅＤＮＡベクターは、実施例５に記載される電気泳動方法論を使用して、適切な閉端構成について評価され得る。
比較目的のため、実施例１は、昆虫細胞ベースの方法およびポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用するｃｅＤＮＡベクターの産生を記載し、また全体の参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の実施例１にも記載される。例えば、実施例１に従って本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）および発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複合する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
実施例２：二本鎖ＤＮＡ分子からの切除による合成ｃｅＤＮＡ産生
ｃｅＤＮＡベクターの合成産生は、全体の参照により本明細書に組み込まれる、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の実施例２～６に記載される。二本鎖ＤＮＡ分子の切除を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する１つの例示的な方法。手短に言えば、ｃｅＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物を使用して生成され得る。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図７Ａ～８Ｅを参照されたい。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物はｃｅＤＮＡプラスミドであり、例えば、全体の参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号における図６を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチを含む。
例示の目的のため、実施例２は、この方法を使用して生成された例示的な閉端ＤＮＡベクターとして、ｃｅＤＮＡベクターを産生することを説明する。しかしながら、この実施例では、ＩＴＲおよび発現カセット（例えば、異種核酸配列）を含む二本鎖ポリヌクレオチドの切除に続いて、本明細書に記載される遊離３’および５’末端のライゲーションによって閉端ＤＮＡベクターを生成するインビトロ合成産生方法を例証するためにｃｅＤＮＡベクターが例示されているが、当業者は、上で例証されるように、ドギーボーンＤＮＡ、ダンベルＤＮＡなどを含むが、これらに限定されない任意の所望の閉端ＤＮＡベクターが生成されるように、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド分子を修飾できることを認識する。実施例２に記載される合成産生方法により産生され得る抗体または融合タンパク質の産生のための例示的なｃｅＤＮＡベクターは、「ＩＩＩ ｃｅＤＮＡベクター全般」と題されたセクションで考察されている。ｃｅＤＮＡベクターによって発現される例示的な抗体および融合タンパク質は、「ＩＩＣ ｃｅＤＮＡベクターによって発現される例示的な抗体および融合タンパク質」と題されたセクションに記載される。
この方法は、（ｉ）二本鎖ＤＮＡ構築物から発現カセットをコードする配列を切除することと、（ｉｉ）ＩＴＲのうちの１つ以上でヘアピン構造を形成することと、（ｉｉｉ）ライゲーションによって、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって遊離５’および３’末端を結合することとを伴う。
二本鎖ＤＮＡ構築物は、５’から３’に順番に、第１の制限エンドヌクレアーゼ部位、上流ＩＴＲ、発現カセット、下流ＩＴＲ、および第２の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。次いで、二本鎖ＤＮＡ構築物を１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させて、制限エンドヌクレアーゼ部位の両方で二本鎖切断を生成する。１つのエンドヌクレアーゼが両方の部位を標的とすることも、制限部位がｃｅＤＮＡベクターテンプレート内に存在しない限り、各部位を異なるエンドヌクレアーゼによって標的とすることもできる。これにより、制限エンドヌクレアーゼ部位の間の配列が、残りの二本鎖ＤＮＡ構築物から切除される（ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図９を参照されたい）。ライゲーションすると、閉端ＤＮＡベクターが形成される。
この方法で使用されるＩＴＲの一方または両方は、野生型ＩＴＲであり得る。修飾型ＩＴＲが使用されてもよく、ここで修飾は、ＢおよびＢ’アームならびに／またはＣおよびＣ’アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図６～８および１０、図１１Ｂを参照されたい）、２つ以上のヘアピンループ（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図６～８、図１１Ｂを参照されたい）または単一のヘアピンループ（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図１０Ａ～１０Ｂ、図１１Ｂを参照されたい）を有し得る。ヘアピンループ修飾型ＩＴＲは、既存のオリゴの遺伝子修飾によって、または新規の生物学的合成および／もしくは化学的合成によって生成され得る。
非限定的な例では、ＩＴＲ－６左および右（配列番号１１１および１１２）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ－Ｂ’およびＣ－Ｃ’アームに４０ヌクレオチドの欠失を含む。修飾型ＩＴＲに残っているヌクレオチドは、単一のヘアピン構造を形成すると予測される。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約－５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。機能的Ｒｅｐ結合部位またはＴｒｓ部位の任意の欠失を含む、ＩＴＲへの他の修飾を行うこともできる。
実施例３：オリゴヌクレオチドの構築によるｃｅＤＮＡの産生
様々なオリゴヌクレオチドの集成を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の実施例３に提供されており、ｃｅＤＮＡベクターは、５’オリゴヌクレオチドおよび３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図１１Ｂは、５’ＩＴＲオリゴヌクレオチドおよび３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。
本明細書に開示されるように、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、ＷＴ－ＩＴＲ（例えば、図３Ａ、図３Ｃを参照されたい）、または修飾型ＩＴＲ（例えば、図３Ｂおよび図３Ｄを参照されたい）を含み得る。（例えば、全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、および７Ｂも参照されたい）。例示的なＩＴＲオリゴヌクレオチドには、配列番号１３４～１４５が含まれるが、これらに限定されない（例えば、全体の参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２の表７を参照されたい）。修飾型ＩＴＲは、ＢおよびＢ’アームならびに／またはＣおよびＣ’アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得る。無細胞合成で使用される、本明細書に記載されるＷＴ－ＩＴＲまたはｍｏｄ－ＩＴＲを含むＩＴＲオリゴヌクレオチドは、遺伝子修飾または生物学的および／もしくは化学的合成によって生成することができる。本明細書で考察されるように、実施例２および３のＩＴＲオリゴヌクレオチドは、本明細書で考察されるように、対称または非対称構成のＷＴ－ＩＴＲまたは修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）を含み得る。
実施例４：一本鎖ＤＮＡ分子によるｃｅＤＮＡ産生
合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、全体の参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１９／／１４１２２の実施例４において提供され、センス発現カセット配列に隣接しアンチセンス発現カセットに隣接する２つのアンチセンスＩＴＲに共有結合的に結合される２つのセンスＩＴＲを含む一本鎖の直鎖状ＤＮＡを使用し、次いで、この一本鎖の直鎖状ＤＮＡの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖ＤＮＡ分子を合成および／または産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の１つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状ＤＮＡ分子を形成し、次いで遊離５’および３’末端を互いにライゲーションして、閉鎖状一本鎖分子を形成する。
ｃｅＤＮＡベクターの産生のための例示的な一本鎖ＤＮＡ分子は、５’から３’へ、第１のセンスＩＴＲ、センス発現カセット配列、第２のセンスＩＴＲ、第２のアンチセンスＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、および第１のアンチセンスＩＴＲを含む。
実施例４の例示的な方法で使用するための一本鎖ＤＮＡ分子は、本明細書に記載される任意のＤＮＡ合成方法論、例えば、インビトロＤＮＡ合成によって形成され得るか、またはヌクレアーゼでＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）を切断し、得られたｄｓＤＮＡ断片を融解して、ｓｓＤＮＡ断片を提供することによって提供され得る。
アニーリングは、センス配列およびアンチセンス配列の対の計算された融解温度を下回って温度を下げることによって達成され得る。融解温度は、特定のヌクレオチド塩基含有量、および使用している溶液の特性、例えば、塩濃度に依存する。任意の所与の配列および溶液の組み合わせの融解温度は、当業者によって容易に計算される。
アニーリングされた分子の遊離５’および３’末端は、互いにライゲーションされるか、またはヘアピン分子にライゲーションされてｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。好適な例示的ライゲーション方法論およびヘアピン分子は、実施例２および３に記載される。
実施例５：ｃｅＤＮＡの精製および／または産生の確認
例えば、実施例１に記載される昆虫細胞ベースの産生方法、または実施例２～４に記載される合成産生方法を含む、本明細書に記載される方法によって産生されたＤＮＡベクター産物のいずれも、例えば、熟練者に一般に知られている方法を使用して、不純物、未使用の構成要素、または副産物を除去するために精製することができ、かつ／または分析して、産生されたＤＮＡベクター（この例では、ｃｅＤＮＡベクター）が所望の分子であることを確認することができる。ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡの精製のための例示的な方法は、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ Ｐｌｕｓ精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することおよび／またはゲル精製によるものである。
以下は、ｃｅＤＮＡベクターの同一性を確認するための例示的な方法である。
ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに例示されるような未変性条件または変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって同定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断およびゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、ならびに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体および二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。
単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、精製されたＤＮＡを、選択された制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、およびｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画した場合に明らかに見えるほど十分に大きな、得られる断片についてさらに分析した。図４Ｃおよび４Ｄに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクターおよび直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂおよび２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、２ｋｂおよび４ｋｂ断片を産生することが期待される。
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると同定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的閉鎖状ＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さである場合（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的閉鎖状ＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐおよび４０００ｂｐ）で溶解するであろう。さらに、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、およびｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解する（図４Ｅを参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３倍および２／３倍のＤＮＡベクター長の産物を生成するであろう関心対象のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットまたは脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）Ｇ－２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０倍変性溶液（１０倍＝０．５Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、１０倍色素を添加し、緩衝せず、１０倍変性溶液を、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ ＮａＯＨで以前にインキュベーションされた０．８～１．０％ゲル上で４倍に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲルおよびゲルボックス中で均一であり、１倍変性溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズおよび所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解するであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１倍ＴＢＥまたはＴＡＥ中で中和し、蒸留水または１倍ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを含む１倍ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（ＤＭＳＯ中１０，０００倍濃縮物）および落射蛍光灯（青色）またはＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。前述のゲルベースの方法は、ｃｅＤＮＡベクターをゲルバンドから単離し、それを復元できるようにすることによって、精製目的に適合させることができる。
生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ－プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に充填し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミドタイトレーションを使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、または純度パーセントを判定することができる。
実施例６：ＣＤ－１マウスにおける発現および宿主応答
肝臓へのｃｅＤＮＡの標的化を増強し、ｃｅＤＮＡベクター自体に対する自然免疫応答を低下させるパルミチン酸デキサメタゾンの能力を評価するために、マウスでのインビボ実験を実施した。
野生型ＡＡＶ２左ＩＴＲおよび変異体右ＩＴＲおよびｈＡＡＴプロモーターを有する、導入遺伝子（配列番号５６）としてルシフェラーゼをコードするｃｅＤＮＡベクターを、使用した。ｃｅＤＮＡベクターを、上記のように調製した。ＬＮＰカプセル化されたｃｅＤＮＡベクター試料を、ポリＣまたはパルミチン酸デキサメタゾンのいずれかと同時投与し、最大５ｍＬ／ｋｇの容量で０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、約４週齢の雄ＣＤ－１マウスに尾静脈注入を介して静脈内投与した。各試料群には４つの反復が含まれていた。体重を、０、１、２、３、７、１４、２１、および２８日目に記録した。生存中の撮像を、４、７、１４、２１、および２８日目に、インビボ撮像システム（ＩＶＩＳ）を使用して実施した。撮像のために、各マウスに、２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注入を介して１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注入した。１５分後、各マウスを麻酔し、撮像した。
体重低下は、両方のグループで観察されたが、ポリＣグループに対してパルミチン酸デキサメタゾングループにおいて顕著に減衰した（図１０Ａ）。この発見は、パルミチン酸デキサメタゾン治療と同時投与されたｃｅＤＮＡが、ｃｅＤＮＡ治療単独の場合よりも顕著に少ないＩＬ－６、ＴＮＦ－アルファおよびＲＡＮＴＥＳの誘導をもたらしたことを示したサイトカイン分析結果と相関した（図６Ｃ）。同等レベルの総光束（導入されたｃｅＤＮＡベクターからのルシフェラーゼ発現を表す）は、４日目および７日目の時点でのｃｅＤＮＡ投与動物の両方のグループで観察され（図６Ｂ）、パルミチン酸デキサメタゾン治療が導入遺伝子の発現自体に影響を与えないことを示している。パルミチン酸デキサメタゾン処置は、１つ以上の自然免疫経路を不注意に誘起する効果から治療された生物を保護し、したがって、付随する負の副作用を伴う望ましくない免疫反応を回避する手段を提供する。
本明細書で、かつ明細書および実施例全体を通して引用されるすべての参考文献は、それらの全体の参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (50)

  1. （ｉ）共有結合性閉端を有する直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含む、直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター、および（ｉｉ）修飾されたデキサメタゾン化合物を含む、組成物。
  2. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、前記ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的ＡＡＶ末端分解部位（ＴＲＳ）およびＲｅｐ結合部位を含む、請求項１に記載の組成物。
  4. 両方のＩＴＲが、同じＡＡＶ株からの天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲ株である、請求項１に記載の組成物。
  5. １つのＩＴＲが、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む、請求項１に記載の組成物。
  6. １つのＩＴＲが、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含み、どちらのＩＴＲも、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲでない、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、パルミチン酸デキサメタゾンである、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、前記ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、前記ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化されない、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記組成物が、少なくとも１つの追加の自然免疫経路阻害剤をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤が、前記ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路、ＴＬＲ９経路、またはインフラマソーム媒介性経路の阻害剤である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 細胞中で導入遺伝子を発現する場合に免疫応答を阻害するための方法であって、（ｉ）共有結合性閉端を有する直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含む、直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター、および（ｉｉ）修飾されたデキサメタゾン化合物を含む、方法。
  13. 前記ＩＴＲのうちの１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、前記ＩＴＲのうちの１つが、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記ｃｅＤＮＡが、前記ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する、請求項１２に記載の方法。
  15. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、前記細胞に投与されている前記ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化される、請求項１２に記載の方法。
  16. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、前記細胞に投与されている前記ｃｅＤＮＡベクターと同時投与されるが、前記ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化されない、請求項１２に記載の方法。
  17. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、前記ｃｅＤＮＡベクターの前記投与の前、同時、または後に投与される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、パルミチン酸デキサメタゾンである、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 両方のＩＴＲが、同じＡＡＶ株からの天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲ株である、請求項１２に記載の方法。
  20. １つのＩＴＲが、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む、請求項１２に記載の方法。
  21. １つのＩＴＲが、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含み、どちらのＩＴＲも、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲでない、請求項１２に記載の方法。
  22. 前記２つのＩＴＲが、
    ａ．配列番号１および配列番号４、ならびに
    ｂ．配列番号３および配列番号２からなる群から選択される一対のＩＴＲである、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、請求項１２～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記細胞中の前記ｃｅＤＮＡベクターの量を増加させることが、前記細胞中の前記導入遺伝子の発現を増加させる、請求項１２に記載の方法。
  25. 前記異種核酸配列が治療用導入遺伝子をコードし、前記導入遺伝子の発現の所望のレベルが治療有効量である、請求項１２に記載の方法。
  26. 少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤が、前記ｃｅＤＮＡベクターおよび前記修飾されたデキサメタゾン化合物と同時投与される、請求項１２に記載の方法。
  27. 前記少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤が、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路、ＴＬＲ９経路、またはインフラマソーム媒介性経路のうちの１つ以上の阻害剤である、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、
    ａ．Ｒｅｐタンパク質の存在下、昆虫細胞内で閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクターの産生を誘導するのに有効な条件下かつそれを行うのに十分な時間、ウイルス性カプシドコード配列を欠くｃｅＤＮＡベクターポリヌクレオチドを内包する前記昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、前記昆虫細胞が、前記昆虫細胞内に閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡの産生を含まない、ステップと、
    ｂ．前記閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡを前記昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから得られる、請求項１２～２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記昆虫細胞から単離された前記直鎖状のカプシド不含ＤＮＡの存在が、前記昆虫細胞から単離されたＤＮＡを前記ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することによって確認され得る、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、無細胞合成によって得られる、請求項１２～２７のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、カプセル化されている、請求項１２～３０のいずれかに記載の方法。
  32. 対象における疾患を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、（ｉ）共有結合性閉端を有する直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた導入遺伝子をコードする異種核酸配列を含む、直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクター、および（ｉｉ）修飾されたデキサメタゾン化合物を含む組成物を投与することを含む、方法。
  33. 前記ＩＴＲのうちの１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、前記ＩＴＲのうちの１つが、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、前記細胞に投与されている前記ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化される、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、前記細胞に投与されている前記ｃｅＤＮＡベクターと同時投与されるが、前記ｃｅＤＮＡベクターと同時カプセル化されない、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、前記ｃｅＤＮＡベクターの前記投与の前、同時、または後に投与される、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記修飾されたデキサメタゾン化合物が、パルミチン酸デキサメタゾンである、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 両方のＩＴＲが、同じＡＡＶ株からの天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲ株である、請求項３２に記載の方法。
  39. １つのＩＴＲが、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含む、請求項３２に記載の方法。
  40. １つのＩＴＲが、他方のＩＴＲに対する欠失、挿入、または置換を含み、どちらのＩＴＲも、天然に存在するＡＡＶ ＩＴＲでない、請求項３２に記載の方法。
  41. 前記２つのＩＴＲが、
    ａ．配列番号１および配列番号４、ならびに
    ｂ．配列番号３および配列番号２からなる群から選択される一対のＩＴＲである、請求項２７に記載の方法。
  42. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される、請求項３２～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記細胞中の前記ｃｅＤＮＡベクターの量を増加させることが、前記細胞中の前記導入遺伝子の発現を増加させる、請求項３２に記載の方法。
  44. 前記異種核酸配列が治療用導入遺伝子をコードし、前記導入遺伝子の発現の所望のレベルが治療有効量である、請求項３２に記載の方法。
  45. 少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤が、前記ｃｅＤＮＡベクターおよび前記修飾されたデキサメタゾン化合物と同時投与される、請求項３２に記載の方法。
  46. 前記少なくとも１つの追加の自然免疫阻害剤が、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路、ＴＬＲ９経路、またはインフラマソーム媒介性経路のうちの１つ以上の阻害剤である、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、
    ａ．Ｒｅｐタンパク質の存在下、昆虫細胞内で閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡベクターの産生を誘導するのに有効な条件下かつそれを行うのに十分な時間、ウイルス性カプシドコード配列を欠くｃｅＤＮＡベクターポリヌクレオチドを内包する前記昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、前記昆虫細胞が、前記昆虫細胞内に閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡの産生を含まない、ステップと、
    ｂ．前記閉端直鎖状のカプシド不含ＤＮＡを前記昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから得られる、請求項３２～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記昆虫細胞から単離された閉端直鎖状のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、前記昆虫細胞から単離されたＤＮＡを前記ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することによって確認され得る、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、無細胞合成によって得られる、請求項３２～４７のいずれかに記載の方法。
  50. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、カプセル化されている、請求項３２～４９のいずれかに記載の方法。
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