JP2024511026A - Ｐｆｉｃ治療薬を発現させるための非ウイルス性ｄｎａベクター及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本出願は、導入遺伝子の送達及び発現のための直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターを記載する。ｃｅＤＮＡベクターは、２つのＩＴＲ配列に隣接する発現カセットを含み、発現カセットは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）をコードする導入遺伝子、例えば、表１から選択される導入遺伝子をコードする。一部のｃｅＤＮＡベクターは、調節スイッチを含むシス調節エレメントを更に含む。ｃｅＤＮＡベクターを使用した、インビトロ、エクスビボ、及びインビボでのＰＦＩＣ治療用タンパク質の信頼できる遺伝子発現のための方法及び細胞株が本明細書に更に提供される。細胞、組織、又は対象におけるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現に有用なｃｅＤＮＡベクターを含む方法及び組成物、並びにＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現する当該ｃｅＤＮＡベクターによる疾患の治療方法が本明細書に提供される。

Description

関連出願
本出願は、２０２１年３月１９日に出願された米国仮出願第６３／１６３，２８０号に対する優先権を主張し、その内容全体は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
配列表
本出願は、本明細書の配列表及び表１～１２の配列を含み、各々が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本開示は、対象又は細胞において導入遺伝子又は単離されたポリヌクレオチドを発現させるための非ウイルス性ベクターを含む、遺伝子療法の分野に関する。本開示はまた、ポリヌクレオチドを含む核酸構築物、プロモーター、ベクター、及び宿主細胞、並びに外因性ＤＮＡ配列を標的細胞、組織、器官、又は生物に送達する方法に関する。例えば、本開示は、非ウイルス性ｃｅＤＮＡベクターを使用して、細胞からＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現させるための方法、例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（Progressive familial intrahepatic cholestasis、ＰＦＩＣ）疾患を有する対象の治療のためにＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現させるための方法を提供する。本方法及び組成物は、例えば、疾患を治療することを必要とする対象の細胞又は組織においてＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現させることによって疾患を治療する目的のために適用することができる。
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子変異又は後天性疾患のいずれかを罹患している患者についての臨床転帰を向上することを目的とする。遺伝子療法は、障害、疾患、悪性腫瘍などをもたらし得る欠陥遺伝子又は異常な調節若しくは発現、例えば、過小発現若しくは過剰発現に起因する医学的状態の治療又は予防を含む。例えば、欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患又は障害は、修復遺伝物質の患者への送達によって治療、予防、若しくは改善され得るか、又は患者の中で遺伝物質の治療的発現をもたらす、例えば、患者に対する修復遺伝物質を用いて欠陥遺伝子を改変若しくはサイレンシングすることによって治療、予防、若しくは改善され得る。
遺伝子治療の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と呼ばれることもある）を供給することである。遺伝子療法を使用して、疾患又は悪性腫瘍を治療することができる。ヒト単一遺伝障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達及び発現によって治療することができる。患者の標的細胞中の修復遺伝子の送達及び発現は、操作されたウイルス及びウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行することができる。利用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組換えレトロウイルス、組換えレンチウイルス、組換えアデノウイルスなど）の中で、組換えアデノ随伴ウイルス（recombinant adeno-associated virus、ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
アデノ随伴ウイルス（adeno-associated viruse、ＡＡＶ）は、パルボウイルス科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶに由来するベクター（すなわち、組換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）又はＡＡＶベクター）は、（ｉ）筋細胞及びニューロンを含む多種多様な非分裂及び分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができ、（ｉｉ）それらはウイルス構造遺伝子を欠き、それによって、ウイルス感染に対する宿主細胞応答（例えば、インターフェロン媒介応答）を減少させ、（ｉｉｉ）野生型ウイルスは、ヒトにおいて非病的であると考えられ、（ｉｖ）宿主細胞ゲノムに組み込むことができる野生型ＡＡＶとは対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターはｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして存続し、したがって、挿入変異誘発又は遺伝毒性のリスクを制限し、並びに（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは一般に免疫原がほとんどないと考えられ、したがって、ベクターＤＮＡの持続性及び潜在的に治療用導入遺伝子の長期発現を得るので、遺伝物質を送達するのに魅力的である。
しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡの制限されたウイルスパッケージング能力であり（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０ｋＤａ未満のタンパク質コード能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補が、患者候補の身体からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングされる必要があることである。第３の欠点は、初回治療から除外されなかった患者への再投与を防ぐカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに応答して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。
追加的に、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、及びｃａｐ遺伝子を含有する１つ以上のプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。しかしながら、そのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞及び組織型を非効率的に形質導入し、カプシドはまた、免疫応答を誘導することもわかった。
したがって、遺伝子療法のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫応答に起因する）患者への単回投与、最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の制限された範囲、及び遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して制限される。
進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）は、慢性胆汁うっ滞症障害のクラスＰＦＩＣ１、ＰＦＩＣ２、ＰＦＩＣ３及びＰＦＩＣ４であり、各々乳児期に始まり、通常、生後１０年以内に肝内胆汁うっ滞に進行する。ＰＦＩＣは、治療しなければ小児期に致死性である。ＰＦＩＣ１型及び２型は稀であり、発生率は、出生の１：５０，０００～１：１００，０００と推定される。ＰＦＩＣ３は、更に稀である。ＰＦＩＣ４は、近年になって、既知の遺伝的構成成分を伴わない胆汁うっ滞疾患を調査する研究によって特徴付けられたものであり、非常に稀であることも予想される。
ＰＦＩＣの各サブタイプは、常染色体劣性遺伝を示す特定の遺伝的欠損に関連する。ＰＦＩＣ１（バイラー病としても既知）及びＰＦＩＣ２は、低いガンマ－グルタミルペプチダーゼ（gamma-glutamyl peptidase、ＧＧＴ）レベルを特徴とする。両方とも、小管輸出及び胆汁形成に必要な遺伝子産物の欠如によって引き起こされ、胆汁酸塩排出の欠陥を引き起こす。胆汁酸塩は、脂肪を消化するために使用される胆汁の成分である。胆汁酸塩は、肝細胞によって産生され、次いで細胞外に輸送されて胆汁を生成する。肝細胞からの胆汁酸塩の放出は、胆汁の正常な分泌にとって重要である。
ＰＦＩＣ１は、ＡＴＰ８Ｂ１遺伝子（ATPase PhospholipidTransporting8B1、ＡＴＰアーゼリン脂質輸送８Ｂ１）における変異によって引き起こされる。ＡＴＰ８Ｂ１遺伝子は、染色体１８ｑ２１－２２上にあり、ＦＩＣ１タンパク質（本明細書ではＡＴＰ８Ｂ１タンパク質としても知られ、言及される）をコードする。それは、肝臓及びいくつかの他の器官で発現される。ＡＴＰ８Ｂ１タンパク質は、肝細胞内膜において高濃度のリン脂質を維持することを担うＰ型ＡＴＰアーゼである。ＡＴＰ８Ｂ１活性の喪失は、胆汁酸塩排出の欠陥を引き起こす。このタンパク質における変異は、リン脂質膜の不安定性を引き起こし、胆汁酸輸送体の機能低下を引き起こすと考えられている。ＡＴＰ８Ｂ１機能の喪失はまた、蝸牛有毛細胞の進行性変性に関連する難聴を引き起こす。ＡＴＰ８Ｂ１遺伝子における変異はまた、良性再発性肝内胆汁うっ滞１型（benignrecurrent intrahepatic cholestasis type1、ＢＲＩＣ１）として既知である、より重症度の低い形態の胆汁うっ滞を引き起こす。ＢＲＩＣ１は、肝不全への進行を伴わずに消散するエピソード性黄疸及び掻痒を特徴とする。
ＰＦＩＣ２は、ＡＢＣＢ１１（ATP Binding CassetteSubfamily B Member11、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー１１）遺伝子における変異によって引き起こされる。ＡＢＣＢ１１遺伝子は、染色体２ｑ２４上にあり、胆汁酸塩排出ポンプ（bilesalt export pump、ＢＳＥＰ）をコードする。それはもっぱら肝臓で発現される。ＢＳＥＰは、肝細胞の頂端膜に位置するＡＴＰ結合カセット（ATP bindingcassette、ＡＢＣ）輸送体であり、主要な小管胆汁酸ポンプである。ＢＳＥＰは、抱合胆汁酸を細胞管腔から毛細胆管に移動させ、胆汁酸塩依存性胆汁流を駆動する。ＡＢＣＢ１１変異はまた、良性胆汁うっ滞性疾患ＢＲＩＣ２に関連する。
ＰＦＩＣ３は、タンパク質ＭＤＲ３（これも既知であり、本明細書ではＡＢＣＢ４タンパク質とも呼ばれる）をコードする染色体７ｑ２１上の遺伝子ＡＢＣＢ４（ATP Binding Cassette Subfamily B Member4、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＢメンバー４）における変異によって引き起こされ、小管膜を横切って胆汁にリン脂質を輸送するのに必須である脂質輸送体である。ＰＦＩＣ３では、患者は、胆管に対して毒性効果を有する不安定なミセルを産生する肝細胞リン脂質輸送が欠損しており、胆管栓及び胆管閉塞を引き起こす。リン脂質は、コレステロール及び胆汁酸塩の両方を緩衝化することによって胆道系を保護するのに役立つ。胆汁酸におけるリン脂質の欠乏は、胆嚢内結石、硬変、及び黄疸を引き起こす可能性がある。ＡＢＣＢ４タンパク質の唯一知られている生理学的機能は、ホスファチジルコリン（phosphatidylcholine、ＰＣ）が肝細胞形質膜を通過して毛細胆管に移行することである（Ｔｒａｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．，２７：７７－９８，２００７）。ＡＢＣＢ４は、肝細胞の小管膜上で発現され、ここで、ＡＢＣＢ４は、ＰＣを肝細胞から胆管管腔に移動させる（Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６：１２３－１４２，２００５）。ＡＢＣＢ４の適切な機能は、肝胆道ホメオスタシスを維持するために重要である。無数の疾患が、完全な又は部分的なタンパク質機能不全を引き起こすＡＢＣＢ４の多型から生じる。
ＰＦＩＣ４は、閉鎖帯２（zona occludens2、ＺＯ－２）としても既知である、染色体９ｑ１２上のＴＪＰ２（tightjunction protein2、密着結合タンパク質２）遺伝子におけるホモ接合変異によって引き起こされる。ＰＦＩＣ疾患とのこの関連は、最近、新たな胆汁うっ滞性遺伝子の検索を通じて同定された（Ｓａｍｂｒｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４６（４）：３２６－３２８（２０１４））。ＴＪＰ２タンパク質は、全てではないがほとんどの上皮において発現される細胞－細胞結合複合体の細胞質成分である。他のタンパク質とともに、それは、膜貫通密着結合タンパク質とアクチン細胞骨格との間の連結を作り出す。肝臓に存在しないと、胆管成分が傍細胞空間を通って肝実質に漏出する。ＴＪＰ２はまた、核への転座後の細胞周期複製に関与し得る。
したがって、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）の治療のために、細胞、組織、又は対象において治療用ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を可能にする技術がこの分野で強く必要とされている。
Ｔｒａｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．，２７：７７－９８，２００７ Ｄｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６：１２３－１４２，２００５ Ｓａｍｂｒｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．４６（４）：３２６－３２８（２０１４）
本明細書に記載の技術は、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（本明細書で「閉端ＤＮＡベクター」又は「ｃｅＤＮＡベクター」と呼ばれる）からのＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現によって進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）を治療するための方法及び組成物であって、ｃｅＤＮＡベクターが、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４若しくはＴＪＰ２）、又はそれらのコドン最適化態様をコードする核酸配列を含む、方法及び組成物に関する。これらのｃｅＤＮＡベクターを使用して、治療、モニタリング、及び診断用のＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）を産生することができる。進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）の治療のための対象へのＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターの適用は、（ｉ）送達において低侵襲性であり、繰り返し可能であり、用量効果があり、治療効果を迅速に発生させ、肝臓において修正ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４及びＴＪＰ２）の持続的発現をもたらし、欠陥酵素の適切な薬理学的レベルを達成する、疾患修正レベルのＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）を提供するのに有用である。
一態様では、細胞におけるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現を可能にするための、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする異種遺伝子を含む、共有結合性閉端を有するカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（本明細書で「閉端ＤＮＡベクター」又は「ｃｅＤＮＡベクター」と呼ばれる）が本明細書に開示される。いくつかの実施形態によれば、本開示は、２つの隣接する逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けされた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、異種ヌクレオチド配列が、本明細書に記載の１つ以上のＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする、ｃｅＤＮＡベクターを提供する。
本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）産生の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端（直鎖状、連続、及び非カプシド化構造）を有する相補的ＤＮＡの連続鎖から形成されるカプシド不含直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、５’逆位末端反復（inverted terminal repeat、ＩＴＲ）配列及び３’ＩＴＲ配列を含み、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、互いに対して同じ対称の三次元構成（すなわち、対称若しくは実質的に対称）を有し得るか、又は代替的に５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、互いに対して異なる三次元構成（すなわち、非対称ＩＴＲ）を有し得る。加えて、ＩＴＲは、同じ又は異なる血清型に由来し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるか、又は三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有するように、対称の三次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得る（すなわち、それらは同じであるか、又は互いに対して鏡像である）。いくつかの実施形態では、一方のＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。
したがって、本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、上に記載のＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の改善されたタンパク質発現及び／又は産生のためのｃｅＤＮＡベクターであって、ｃｅＤＮＡが、表１に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）をコードする核酸配列を含む異種核酸配列に隣接するＩＴＲ配列を含み、ＩＴＲ配列が、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲ及び少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる三次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、又は（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、又は（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択される、ｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、真核細胞中で産生され得、したがって昆虫細胞中の原核ＤＮＡ修飾及び細菌内毒素汚染を欠き得る。
本明細書に記載される方法及び組成物は、一部には、少なくとも１つのＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）、又は１つより多いＰＦＩＣタンパク質を細胞（限定されないが、肝臓の細胞を含む）から発現させるために使用することができる、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）の発見に関連する。
したがって、一態様では、ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）であって、２つの異なるＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）の間に位置付けされたプロモーターに作動可能に連結したそれらのＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）をコードする少なくとも１つの導入遺伝子をコードする少なくとも１つの異種核酸配列を含み、ＩＴＲの一方が、機能的ＡＡＶ末端分離部位及びＲｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲの一方が、他方のＩＴＲに対して欠失、挿入又は置換を含み、導入遺伝子が、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を含み、ＤＮＡが、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化された場合、非変性ゲル上で分析された場合の直鎖状かつ非連続的なＤＮＡ対照と比較して、直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を有する、ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）が本明細書で提供される。他の態様は、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターからインビボでそれを発現することによるＰＦＩＣ治療用タンパク質の送達、及び更に、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）をコードするｃｅＤＮＡベクターを使用するＰＦＩＣの治療を含む。本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターを含む細胞も本明細書に企図される。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、標的細胞内で１つ以上の導入遺伝子を送達及びコードすることができるｃｅＤＮＡベクターであって、例えば、ｃｅＤＮＡベクターがマルチシストロン配列を含むか、又は導入遺伝子及びその天然のゲノムコンテキスト（例えば、導入遺伝子、イントロン及び内因性の非翻訳領域）が一緒にｃｅＤＮＡベクターに組み込まれる、ｃｅＤＮＡベクターを提供する。導入遺伝子は、タンパク質をコードする転写物、非コード転写物、又はその両方である可能性がある。ｃｅＤＮＡベクターは、複数のコード配列、及び非標準的な翻訳開始部位、又はタンパク質をコードする転写物、非コード転写物若しくはその両方を発現するための１つより多いプロモーターを含み得る。導入遺伝子は、１つより多いタンパク質をコードする配列を含み得るか、又は非コード転写物の配列であり得る。発現カセットは、例えば、４０００ヌクレオチド、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、若しくは２０，０００ヌクレオチド、若しくは３０，０００ヌクレオチド、若しくは４０，０００ヌクレオチド、又は５０，０００ヌクレオチドより多く、又は約４０００～１０，０００ヌクレオチド、若しくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、又は５０，０００より多いヌクレオチドを含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が導入遺伝子の効率的な発現をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
いくつかの実施形態によれば、発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（internalribosome entry site、ＩＲＥＳ）及び／又は２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、並びにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分を含む。例えば、追加の調節構成成分は、本明細書に開示される調節スイッチであり得、ｃｅＤＮＡ感染細胞、並びに必要に応じて他の誘導性及び／又は抑制性エレメントを殺傷し得るキルスイッチを含むが、これに限定されない。
また、ｃｅＤＮＡベクターを使用して本明細書に記載の１つ以上の導入遺伝子を送達し、効率的かつ選択的に発現する方法が本開示によって提供される。ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドの非存在下で、宿主細胞中に取り込まれるとともに、核中に輸送される能力を有する。加えて、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを欠くため、カプシド含有ベクターに応答して生じ得る免疫応答を回避する。
本開示の態様は、本明細書に記載される細胞におけるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）のＰＦＩＣ治療用タンパク質発現に有用なｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法に関する。他の実施形態では、本明細書に提供される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターに関する。一実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）産生のためのカプシド不含（例えば、非ウイルス性）ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒ）は、第１の５’逆位末端反復（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）、異種核酸配列、及び３’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）をこの順序で含むポリヌクレオチド発現構築物テンプレートを含むプラスミド（本明細書では「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」と呼ばれる）から得られ、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、互いに対して非対称であってもよく、又は本明細書に定義されるように対称であってもよい（例えば、ＷＴ－ＩＴＲ又は修飾型対称ＩＴＲ）。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本開示を読むことにより、当業者に既知であろういくつかの手段によって取得可能である。例えば、本開示のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド発現構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＩＴＲの間に作動可能に位置付けられた制限クローニング部位（例えば、配列番号１２３及び／又は１２４）を含み、例えば、導入遺伝子、例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４及びＴＪＰ２）をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを挿入することができる。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４及びＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対称又は非対称ＩＴＲ（修飾型又はＷＴ ＩＴＲ）を含有するポリヌクレオチドテンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）から産生される。
許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下では、少なくとも２つのＩＴＲを有するポリヌクレオチドテンプレートが複製して、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４及びＴＪＰ２）を発現するｃｅＤＮＡベクターを産生する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、Ｒｅｐタンパク質を介したテンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、及び第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐタンパク質及びＲｅｐ結合部位は、当業者に周知である。当業者は、少なくとも１つの機能的ＩＴＲに基づいて、核酸配列に結合し、複製する血清型からＲｅｐタンパク質を選択することを理解する。例えば、複製可能ＩＴＲがＡＡＶ血清型２に由来する場合、対応するＲｅｐは、その血清型と共働するＡＡＶ血清型に由来し、例えばＡＡＶ２ＩＴＲはＡＡＶ２又はＡＡＶ４Ｒｅｐと共働するが、ＡＡＶ５Ｒｅｐとは共働しない。複製時に、共有結合性閉端ｃｅＤＮＡベクターは、許容細胞中で蓄積し続け、ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは標準複製条件下、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、長期間にわたって十分に安定して、例えば、少なくとも１ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも２ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも３ｐｇ／細胞、より好ましくは少なくとも４ｐｇ／細胞、更により好ましくは少なくとも５ｐｇ／細胞の量で蓄積する。
したがって、本開示の一態様は、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下かつ十分な時間、インキュベートするステップであって、ウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含む、そのようなＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを産生するプロセスに関する。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを産生する。但し、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ビリオン強制サイズ制限はない。
宿主細胞から単離されたＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現に有用なｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡを、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、及び消化されたＤＮＡ材料を変性ゲル及び非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して、特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
また本明細書では、細胞又は対象においてｃｅＤＮＡベクターを使用して、治療用途を有するＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）を発現する方法も提供される。このようなＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）は、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）の治療に使用することができる。したがって、本明細書では、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）の治療のための方法であって、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）をコードするｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）であって、ｃｅＤＮＡベクターが、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列が非対称、又は対称、又は実質的に対称であり得る２つの逆位末端反復配列の間に作動可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分離部位及びＲｅｐ結合部位を含み、任意選択的に異種核酸配列が、導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）ＰＦＩＣ治療用タンパク質）をコードし、ベクターがウイルスカプシドにはない、ｃｅＤＮＡベクターに関する。
本開示のこれらの及び他の態様は、下記で更に詳述される。
上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものとみなされるべきではない。
非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。この実施形態では、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、及びＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを含む。ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）をコードするオープンリーディングフレーム（open reading frame、ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位（Ｒ３／Ｒ４）に挿入され得る。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）（発現カセットの上流（５’端）の野生型ＡＡＶ２ＩＴＲ及び下流（３’端）の修飾型ＩＴＲ）に隣接しており、したがって、発現カセットに隣接する２つのＩＴＲは、互いに対して非対称である。 ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、及びＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有する非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。ＰＦＩＣ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入され得る。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）（発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲ及び下流（３’端）の野生型ＩＴＲ）に隣接している。 エンハンサー／プロモーター、ＰＦＩＣ導入遺伝子、転写後エレメント（posttranscriptional element、ＷＰＲＥ）、及びポリＡシグナルを含有する発現カセットを有する非対称ＩＴＲを含む、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位へのＰＦＩＣ導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、互いに非対称である２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲ及び下流（３’端）の修飾型ＩＴＲに隣接しており、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの両方は、修飾型ＩＴＲであるが、異なる修飾を有する（すなわち、同じ修飾を有しない）。 ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、及びＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称な修飾型ＩＴＲ又は実質的に対称な修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。ＰＦＩＣ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲ及び３’修飾型ＩＴＲが対称又は実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。 エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、及びポリＡシグナルを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称な修飾型ＩＴＲ又は実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ）の挿入を可能にする。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲ及び３’修飾型ＩＴＲが対称又は実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。 ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、及びＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称なＷＴ－ＩＴＲ又は実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲを含む、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ）をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ ＩＴＲが対称又は実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（wild type inverted terminal repeat、ＷＴ－ＩＴＲ）に隣接している。 エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする）、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、及びポリＡシグナルを含有する発現カセットを有する、本明細書で定義される対称な修飾型ＩＴＲ又は実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質）の挿入を可能にする。発現カセットは、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ ＩＴＲが対称又は実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）に隣接している。 Ａ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’アーム、Ｃ－Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥ及びＲＢＥ’）の特定とともに、ＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲ（配列番号５２）のＴ形ステム－ループ構造を提供し、また、末端分離部位（terminal resolution site、ｔｒｓ）も示す。ＲＢＥは、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８のいずれかと相互作用すると考えられる一連の４つの二重四量体を含有する。加えて、ＲＢＥ’はまた、構築物中の野生型ＩＴＲ又は変異型ＩＴＲ上で組み立てられたＲｅｐ複合体と相互作用すると考えられる。Ｄ及びＤ’領域は、転写因子結合部位及び他の保存構造を含有する。 Ａ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’アーム、Ｃ－Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥ及びＲＢＥ’）の特定とともに、ＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲのＴ形ステム－ループ構造を含む、野生型左ＩＴＲ（配列番号５３）における提案されたＲｅｐ触媒ニッキング及びライゲーション活性を示し、また、末端分離部位（ｔｒｓ）も示し、並びにいくつかの転写因子結合部位及び他の保存構造を含むＤ及びＤ’領域を示す。 野生型左ＡＡＶ２ＩＴＲ（配列番号５４）のＡ－Ａ’アーム並びにＣ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（ポリヌクレオチド配列）（左）並びに二次構造（右）を提供する。 左ＩＴＲについての例示的な変異型ＩＴＲ（修飾型ＩＴＲとも称される）配列を示す。例示的な変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ－１、左）（配列番号１１３）のＡ－Ａ’アーム、Ｃアーム、及びＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ部分の一次構造（左）及び予測された二次構造（右）が示される。 野生型右ＡＡＶ２ＩＴＲ（配列番号５５）のＡ－Ａ’ループ、並びにＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）並びに二次構造（右）を示す。 例示的な右修飾型ＩＴＲを示す。例示的な変異型右ＩＴＲ（ＩＴＲ－１、右）（配列番号１１４）のＡ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’及びＣアームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）及び予測された二次構造（右）が示される。左及び右のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ＩＴＲ又は他のウイルス血清型又は合成ＩＴＲ）の任意の組み合わせを、本明細書で教示されるように使用することができる。図３Ａ～図３Ｄのポリヌクレオチド配列の各々は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡを産生するために使用されるプラスミド又はバクミド／バキュロウイルスゲノムで使用される配列を指す。プラスミド又はバクミド／バキュロウイルスゲノムのｃｅＤＮＡベクター構成及び予測されたＧｉｂｂｓ自由エネルギー値から推定される対応するｃｅＤＮＡの二次構造もまた、図３Ａ～図３Ｄの各々に含まれる。 図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおける、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの産生に有用である、バキュロウイルス感染昆虫細胞（baculovirus infected insect cell、ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。 ｃｅＤＮＡの産生の例示的な方法の概略図である。 ｃｅＤＮＡベクターの産生を確認するための生化学的方法及びプロセスを示す。 図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｄは、左が未切断であるか、又は制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲル又は変性ゲルのいずれかで電気泳動に供される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖及び未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体及び二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体、及び単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から２番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断された場合、元のバンドが消え、切断後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さな）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは一本鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から２番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）又は塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件及び変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂ及び２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成することができる。図４Ｅはまた、直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件において１ｋｂ及び２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができるが、変性条件では、鎖は、接続されたままであり、２ｋｂ及び４ｋｂとして移動する一本鎖を産生する。 図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｄは、左が未切断であるか、又は制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲル又は変性ゲルのいずれかで電気泳動に供される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖及び未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体及び二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体、及び単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から２番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断された場合、元のバンドが消え、切断後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さな）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは一本鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から２番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）又は塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件及び変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂ及び２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成することができる。図４Ｅはまた、直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件において１ｋｂ及び２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができるが、変性条件では、鎖は、接続されたままであり、２ｋｂ及び４ｋｂとして移動する一本鎖を産生する。 エンドヌクレアーゼで消化した（＋）又は消化していない（－）ｃｅＤＮＡベクターの変性ゲル泳動例の例示的な写真である（ｃｅＤＮＡ構築物１及び２についてはＥｃｏＲＩ、ｃｅＤＮＡ構築物３及び４についてはＢａｍＨ１、ｃｅＤＮＡ構築物５及び６についてはＳｐｅＩ、及びｃｅＤＮＡ構築物７及び８についてはＸｈｏＩ）構築物１～８は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の実施例１に記載されている（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。アスタリスクで強調されたバンドのサイズを判定し、図の下に示した。 実施例７に記載される実験の結果を示し、具体的には、ＬＮＰ－ポリＣ対照（左端のマウス）で治療されたマウス及びＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼで治療された４匹のマウス（左端のマウス以外の全て）から得られたＩＶＩＳ画像を表す。４匹のｃｅＤＮＡで治療されたマウスは、マウスの肝臓を含む領域で有意な蛍光を示す。 実施例８に記載される実験の結果を表す。暗い斑点は、発現されたｃｅＤＮＡ導入遺伝子から生じるタンパク質の存在を示し、投与したＬＮＰ－ｃｅＤＮＡと肝細胞との会合を実証する。 実施例９に記載される眼の研究の結果を表す。図８Ａは、ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）－ｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼを注射したラットの眼（左上）からの、同じラットの注射していない眼（右上）、又はプラスミド－ルシフェラーゼＤＮＡを注射したラットの眼（左下）及び同じラットの注射していない眼（右下）に対する、代表的なＩＶＩＳ画像を示す。図８Ｂは、治療群の各々における治療された眼、又は対応する未治療の眼で観察された平均放射輝度のグラフを示す。ｃｅＤＮＡで治療したラットは、最小限の相対蛍光（したがって、ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現）が観察されたプラスミド－ルシフェラーゼで処置したラットとは明確な対照で、９９日間にわたって有意な蛍光（したがって、ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現）を実証した。 実施例９に記載される眼の研究の結果を表す。図８Ａは、ＪｅｔＰＥＩ（登録商標）－ｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼを注射したラットの眼（左上）からの、同じラットの注射していない眼（右上）、又はプラスミド－ルシフェラーゼＤＮＡを注射したラットの眼（左下）及び同じラットの注射していない眼（右下）に対する、代表的なＩＶＩＳ画像を示す。図８Ｂは、治療群の各々における治療された眼、又は対応する未治療の眼で観察された平均放射輝度のグラフを示す。ｃｅＤＮＡで治療したラットは、最小限の相対蛍光（したがって、ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現）が観察されたプラスミド－ルシフェラーゼで処置したラットとは明確な対照で、９９日間にわたって有意な蛍光（したがって、ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現）を実証した。 実施例１０に記載されるＲａｇ２マウスにおけるｃｅＤＮＡの持続及び再投与研究の結果を表す。図９Ａは、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ－Ｌｕｃで治療された野生型ｃ５７ｂｌ／６マウス又はＲａｇ２マウスで観察された経時的な全流束のグラフを示す。図９Ｂは、Ｒａｇ２マウスにおけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現レベルに対する再用量の影響を示すグラフを提供し、結果として、再用量後に観察される安定した発現の増加をもたらす（矢印は、再用量投与の時間を示す）。 実施例１０に記載されるＲａｇ２マウスにおけるｃｅＤＮＡの持続及び再投与研究の結果を表す。図９Ａは、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ－Ｌｕｃで治療された野生型ｃ５７ｂｌ／６マウス又はＲａｇ２マウスで観察された経時的な全流束のグラフを示す。図９Ｂは、Ｒａｇ２マウスにおけるルシフェラーゼ導入遺伝子の発現レベルに対する再用量の影響を示すグラフを提供し、結果として、再用量後に観察される安定した発現の増加をもたらす（矢印は、再用量投与の時間を示す）。 実施例１１に記載される治療されたマウスにおけるｃｅＤＮＡルシフェラーゼ発現研究からのデータを提供し、研究の期間にわたる各群のマウスにおける全流束を示す。高レベルの非メチル化ＣｐＧは、経時的にマウスで観察される全流束の低下と相関したが、肝臓特異的プロモーターの使用は、少なくとも７７日間にわたって、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の耐久性のある安定した発現と相関した。 本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするプラスミドを生成するためのｃｅＤＮＡベクターへのクローニングに使用される例示的な挿入物を示す。図１１Ａは、ＰＦＩＣ１治療用タンパクＡＴＰ８Ｂ１をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために、所望の治療用（ＴＴＸ）ベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。この実施形態では、プラスミドＴＴＸ－Ａ（上に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。プラスミドＴＴＸ－Ｂ（下に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｂは、ＰＦＩＣ２治療用タンパク質ＡＢＣＢ１１をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。プラスミドＴＴＸ－Ｃ（上部に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。プラスミドＴＴＸ－Ｄ（下に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｃは、ＰＦＩＣ３治療用タンパク質ＡＢＣＢ４をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。上部に示される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。下に示される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｄは、ＰＦＩＣ４治療用タンパク質ＴＪＰ２をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。上部に示される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。下に示される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。例示目的のために、図８Ａ～図８Ｄ及び実施例において、５’ＷＴ ＡＡＶ２ＩＴＲ及び３’変異型（又は修飾型）ＩＴＲを示し、非対称ＩＴＲ対の一例である。代替的な実施形態では、右（５’ＩＴＲ）及び左（３’ＩＴＲ）上のＩＴＲは、任意のＡＡＶに由来するものを含む任意のＩＴＲであってもよく、非対称、対称又は実質的に対称であってもよく、これらの用語は本明細書において定義される通りである。 本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするプラスミドを生成するためのｃｅＤＮＡベクターへのクローニングに使用される例示的な挿入物を示す。図１１Ａは、ＰＦＩＣ１治療用タンパクＡＴＰ８Ｂ１をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために、所望の治療用（ＴＴＸ）ベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。この実施形態では、プラスミドＴＴＸ－Ａ（上に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。プラスミドＴＴＸ－Ｂ（下に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｂは、ＰＦＩＣ２治療用タンパク質ＡＢＣＢ１１をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。プラスミドＴＴＸ－Ｃ（上部に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。プラスミドＴＴＸ－Ｄ（下に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｃは、ＰＦＩＣ３治療用タンパク質ＡＢＣＢ４をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。上部に示される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。下に示される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｄは、ＰＦＩＣ４治療用タンパク質ＴＪＰ２をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。上部に示される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。下に示される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。例示目的のために、図８Ａ～図８Ｄ及び実施例において、５’ＷＴ ＡＡＶ２ＩＴＲ及び３’変異型（又は修飾型）ＩＴＲを示し、非対称ＩＴＲ対の一例である。代替的な実施形態では、右（５’ＩＴＲ）及び左（３’ＩＴＲ）上のＩＴＲは、任意のＡＡＶに由来するものを含む任意のＩＴＲであってもよく、非対称、対称又は実質的に対称であってもよく、これらの用語は本明細書において定義される通りである。 本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするプラスミドを生成するためのｃｅＤＮＡベクターへのクローニングに使用される例示的な挿入物を示す。図１１Ａは、ＰＦＩＣ１治療用タンパクＡＴＰ８Ｂ１をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために、所望の治療用（ＴＴＸ）ベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。この実施形態では、プラスミドＴＴＸ－Ａ（上に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。プラスミドＴＴＸ－Ｂ（下に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｂは、ＰＦＩＣ２治療用タンパク質ＡＢＣＢ１１をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。プラスミドＴＴＸ－Ｃ（上部に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。プラスミドＴＴＸ－Ｄ（下に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｃは、ＰＦＩＣ３治療用タンパク質ＡＢＣＢ４をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。上部に示される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。下に示される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｄは、ＰＦＩＣ４治療用タンパク質ＴＪＰ２をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。上部に示される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。下に示される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。例示目的のために、図８Ａ～図８Ｄ及び実施例において、５’ＷＴ ＡＡＶ２ＩＴＲ及び３’変異型（又は修飾型）ＩＴＲを示し、非対称ＩＴＲ対の一例である。代替的な実施形態では、右（５’ＩＴＲ）及び左（３’ＩＴＲ）上のＩＴＲは、任意のＡＡＶに由来するものを含む任意のＩＴＲであってもよく、非対称、対称又は実質的に対称であってもよく、これらの用語は本明細書において定義される通りである。 本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするプラスミドを生成するためのｃｅＤＮＡベクターへのクローニングに使用される例示的な挿入物を示す。図１１Ａは、ＰＦＩＣ１治療用タンパクＡＴＰ８Ｂ１をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために、所望の治療用（ＴＴＸ）ベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。この実施形態では、プラスミドＴＴＸ－Ａ（上に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。プラスミドＴＴＸ－Ｂ（下に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｂは、ＰＦＩＣ２治療用タンパク質ＡＢＣＢ１１をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。プラスミドＴＴＸ－Ｃ（上部に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。プラスミドＴＴＸ－Ｄ（下に示される）を生成するために使用される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｃは、ＰＦＩＣ３治療用タンパク質ＡＢＣＢ４をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。上部に示される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。下に示される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。図１１Ｄは、ＰＦＩＣ４治療用タンパク質ＴＪＰ２をコードするｃｅＤＮＡのためのプラスミドを生成するために所望のＴＴＸベクター（例えば、ＴＴＸ－１）に挿入されるモジュール構成成分として各々使用することができる、２つの例示的な挿入物を示す。上部に示される挿入物は、ＣＡＧプロモーターを有し、構成的発現のためのものである。下に示される挿入物は、ＨＡＡＴプロモーターを有し、肝臓特異的発現のためのものである。例示目的のために、図８Ａ～図８Ｄ及び実施例において、５’ＷＴ ＡＡＶ２ＩＴＲ及び３’変異型（又は修飾型）ＩＴＲを示し、非対称ＩＴＲ対の一例である。代替的な実施形態では、右（５’ＩＴＲ）及び左（３’ＩＴＲ）上のＩＴＲは、任意のＡＡＶに由来するものを含む任意のＩＴＲであってもよく、非対称、対称又は実質的に対称であってもよく、これらの用語は本明細書において定義される通りである。 目的の遺伝子としてＡＢＣＢ４をコードし、示されるような異なるプロモーター領域を有する３つのｃｅＤＮＡベクターカセットの概略図を提供する。例示目的のために、図９は、５’ＷＴ ＡＡＶ２ＩＴＲ及び３’変異型（又は修飾型）ＡＡＶ２ＩＴＲを示し、非対称ＩＴＲ対の一例である。代替的な実施形態では、右（５’ＩＴＲ）及び左（３’ＩＴＲ）上のＩＴＲは、任意のＡＡＶに由来するものを含む任意のＩＴＲであってもよく、非対称、対称又は実質的に対称であってもよく、これらの用語は本明細書において定義される通りである。 実施例８に記載されるＨｅｐＧ２細胞における免疫細胞化学実験の結果を一連の免疫蛍光顕微鏡画像として示す。赤色蛍光は、細胞中のＡＢＣＢ４タンパク質の存在を示す。青色蛍光は、ＤＡＰＩ染色したＤＮＡを示し、緑色蛍光は、ＧＦＰの存在を示す（特定の対照のみ）。図１３Ａ～図１３Ｃの各々が、発現されたＡＢＣＢ４の存在を示す（赤色）。関連対照試料からの画像を図１３Ｄ～図１３Ｇに示す。図１３Ｄ～図１３Ｅの画像は、図１３Ａ～図１３Ｃに示されるものと同じ実験から収集された。図１３Ｆ及び図１３Ｇは、同様の条件下で別々に調製した。 実施例８に記載されるＨｅｐＧ２細胞における免疫細胞化学実験の結果を一連の免疫蛍光顕微鏡画像として示す。赤色蛍光は、細胞中のＡＢＣＢ４タンパク質の存在を示す。青色蛍光は、ＤＡＰＩ染色したＤＮＡを示し、緑色蛍光は、ＧＦＰの存在を示す（特定の対照のみ）。図１３Ａ～図１３Ｃの各々が、発現されたＡＢＣＢ４の存在を示す（赤色）。関連対照試料からの画像を図１３Ｄ～図１３Ｇに示す。図１３Ｄ～図１３Ｅの画像は、図１３Ａ～図１３Ｃに示されるものと同じ実験から収集された。図１３Ｆ及び図１３Ｇは、同様の条件下で別々に調製した。 実施例８に記載されるＨｅｐＧ２細胞における免疫細胞化学実験の結果を一連の免疫蛍光顕微鏡画像として示す。赤色蛍光は、細胞中のＡＢＣＢ４タンパク質の存在を示す。青色蛍光は、ＤＡＰＩ染色したＤＮＡを示し、緑色蛍光は、ＧＦＰの存在を示す（特定の対照のみ）。図１３Ａ～図１３Ｃの各々が、発現されたＡＢＣＢ４の存在を示す（赤色）。関連対照試料からの画像を図１３Ｄ～図１３Ｇに示す。図１３Ｄ～図１３Ｅの画像は、図１３Ａ～図１３Ｃに示されるものと同じ実験から収集された。図１３Ｆ及び図１３Ｇは、同様の条件下で別々に調製した。 実施例８に記載されるＨｅｐＧ２細胞における免疫細胞化学実験の結果を一連の免疫蛍光顕微鏡画像として示す。赤色蛍光は、細胞中のＡＢＣＢ４タンパク質の存在を示す。青色蛍光は、ＤＡＰＩ染色したＤＮＡを示し、緑色蛍光は、ＧＦＰの存在を示す（特定の対照のみ）。図１３Ａ～図１３Ｃの各々が、発現されたＡＢＣＢ４の存在を示す（赤色）。関連対照試料からの画像を図１３Ｄ～図１３Ｇに示す。図１３Ｄ～図１３Ｅの画像は、図１３Ａ～図１３Ｃに示されるものと同じ実験から収集された。図１３Ｆ及び図１３Ｇは、同様の条件下で別々に調製した。 実施例８に記載されるＨｅｐＧ２細胞における免疫細胞化学実験の結果を一連の免疫蛍光顕微鏡画像として示す。赤色蛍光は、細胞中のＡＢＣＢ４タンパク質の存在を示す。青色蛍光は、ＤＡＰＩ染色したＤＮＡを示し、緑色蛍光は、ＧＦＰの存在を示す（特定の対照のみ）。図１３Ａ～図１３Ｃの各々が、発現されたＡＢＣＢ４の存在を示す（赤色）。関連対照試料からの画像を図１３Ｄ～図１３Ｇに示す。図１３Ｄ～図１３Ｅの画像は、図１３Ａ～図１３Ｃに示されるものと同じ実験から収集された。図１３Ｆ及び図１３Ｇは、同様の条件下で別々に調製した。 実施例８に記載されるＨｅｐＧ２細胞における免疫細胞化学実験の結果を一連の免疫蛍光顕微鏡画像として示す。赤色蛍光は、細胞中のＡＢＣＢ４タンパク質の存在を示す。青色蛍光は、ＤＡＰＩ染色したＤＮＡを示し、緑色蛍光は、ＧＦＰの存在を示す（特定の対照のみ）。図１３Ａ～図１３Ｃの各々が、発現されたＡＢＣＢ４の存在を示す（赤色）。関連対照試料からの画像を図１３Ｄ～図１３Ｇに示す。図１３Ｄ～図１３Ｅの画像は、図１３Ａ～図１３Ｃに示されるものと同じ実験から収集された。図１３Ｆ及び図１３Ｇは、同様の条件下で別々に調製した。 実施例８に記載されるＨｅｐＧ２細胞における免疫細胞化学実験の結果を一連の免疫蛍光顕微鏡画像として示す。赤色蛍光は、細胞中のＡＢＣＢ４タンパク質の存在を示す。青色蛍光は、ＤＡＰＩ染色したＤＮＡを示し、緑色蛍光は、ＧＦＰの存在を示す（特定の対照のみ）。図１３Ａ～図１３Ｃの各々が、発現されたＡＢＣＢ４の存在を示す（赤色）。関連対照試料からの画像を図１３Ｄ～図１３Ｇに示す。図１３Ｄ～図１３Ｅの画像は、図１３Ａ～図１３Ｃに示されるものと同じ実験から収集された。図１３Ｆ及び図１３Ｇは、同様の条件下で別々に調製した。 流体力学的に注入された対照緩衝液で治療されたＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞の顕微鏡画像を示す（図１４Ａ）５μｇ ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４（図１４Ｂ）及び５０μｇ ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４（図１４Ｃ）、並びにＡＢＣＢ４タンパク質の免疫組織化学によって視覚化された。図１４Ａは、未治療ＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞を示す（１０倍）。図１４Ｂは、５μｇのｃｅＤＮＡを流体力学的に投与して治療したＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞の免疫ヒストグラム（１０倍）を示す。ｃｅＤＮＡは、コドン最適化ヒトＡＢＣＢ４の発現を駆動するｈＡＡＴプロモーターを有していた。図１４Ｃは、５０μｇのｃｅＤＮＡを流体力学的に投与して治療したＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞の免疫ヒストグラム（１０倍）を示す。ｃｅＤＮＡは、コドン最適化ヒトＡＢＣＢ４の発現を駆動するｈＡＡＴプロモーターを有していた。 流体力学的に注入された対照緩衝液で治療されたＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞の顕微鏡画像を示す（図１４Ａ）５μｇ ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４（図１４Ｂ）及び５０μｇ ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４（図１４Ｃ）、並びにＡＢＣＢ４タンパク質の免疫組織化学によって視覚化された。図１４Ａは、未治療ＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞を示す（１０倍）。図１４Ｂは、５μｇのｃｅＤＮＡを流体力学的に投与して治療したＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞の免疫ヒストグラム（１０倍）を示す。ｃｅＤＮＡは、コドン最適化ヒトＡＢＣＢ４の発現を駆動するｈＡＡＴプロモーターを有していた。図１４Ｃは、５０μｇのｃｅＤＮＡを流体力学的に投与して治療したＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞の免疫ヒストグラム（１０倍）を示す。ｃｅＤＮＡは、コドン最適化ヒトＡＢＣＢ４の発現を駆動するｈＡＡＴプロモーターを有していた。 流体力学的に注入された対照緩衝液で治療されたＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞の顕微鏡画像を示す（図１４Ａ）５μｇ ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４（図１４Ｂ）及び５０μｇ ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４（図１４Ｃ）、並びにＡＢＣＢ４タンパク質の免疫組織化学によって視覚化された。図１４Ａは、未治療ＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞を示す（１０倍）。図１４Ｂは、５μｇのｃｅＤＮＡを流体力学的に投与して治療したＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞の免疫ヒストグラム（１０倍）を示す。ｃｅＤＮＡは、コドン最適化ヒトＡＢＣＢ４の発現を駆動するｈＡＡＴプロモーターを有していた。図１４Ｃは、５０μｇのｃｅＤＮＡを流体力学的に投与して治療したＡＢＣＢ４－／－マウスの肝細胞の免疫ヒストグラム（１０倍）を示す。ｃｅＤＮＡは、コドン最適化ヒトＡＢＣＢ４の発現を駆動するｈＡＡＴプロモーターを有していた。 ＰＢＳ緩衝液で治療したＡＢＣＢ４－／－マウスの胆汁リン脂質レベルと比較した、５μｇのｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４ｃｅＤＮＡ又は５０μｇのｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４ｃｅＤＮＡで治療したＡＢＣＢ４－／－マウスの胆汁リン脂質レベル（μＭリン脂質）を示すチャートを示す。
特に希少疾患における療法の開発における最大のハードルの１つは、多数の個々の病態である。地球上で約３億５０００万人が希少障害を抱えて生活しており、国立衛生研究所は、希少障害を、診断されたヒトが２０万人未満の障害又は病態と定義している。これらの希少障害の約８０％は遺伝的起源であり、それらの約９５％はＦＤＡによって承認された治療を受けていない。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの利点の中には、複数の疾患、特に多くの遺伝性障害又は疾患の治療の現在の状態を有意義に変更することができる希少な単一遺伝子疾患に迅速に適応することができるアプローチを提供することにある。更に、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、調節スイッチを含み、したがって、送達後の制御可能な遺伝子発現を可能にする。
本明細書には、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４若しくはＴＪＰ２）、又はその断片（例えば、機能的断片）をコードする１つ以上の異種核酸を含むｃｅＤＮＡベクターが提供される。ベクターは、治療用薬物の特定及び研究のための疾患モデル系の作製において、並びに、ベクターからの細胞内発現によるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）のコード配列の送達及び発現を介したＰＦＩＣ疾患の治療においても、使用することができる。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４若しくはＴＪＰ２）又はその断片をコードする１つ以上の核酸を含むｃｅＤＮＡベクターを使用してＰＦＩＣ疾患を治療するための方法が本明細書に提供される。ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）をコードする表１からの１つ以上の異種核酸を含む、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターも本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現は、それが発現される細胞からの治療用タンパク質の分泌を含み得るか、又は代替的に、いくつかの実施形態では、発現されたＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）は、それが発現される細胞内で機能し、その効果を発揮することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、肝臓、対象の筋肉（例えば、骨格筋）、又は他の身体部分においてＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）を発現し、これは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の産生及び多くの全身区画への分泌のためのデポーとして作用し得る。
Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関連して使用される科学的及び技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図されない。免疫学及び分子生物学における一般用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．により発行，２０１１（ＩＳＢＮ９７８－０－９１１９１０－１９－３）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（編），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡにより発行（２０１３）、Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（編），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．により発行，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ９７８３５２７６００９０８）、及びＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により発行，１９９５（ＩＳＢＮ１－５６０８１－５６９－８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより発行，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（編），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより発行，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ１９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（編）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（編），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（編）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、これらの内容は全て、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」及び「導入遺伝子」という用語は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達及び発現され得る、目的の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」及び「転写カセット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な１つ以上のプロモーター又は他の調節配列に作動可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドコード配列、他のベクター配列、又は逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加的に、１つ以上のシス作用性配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、又はリプレッサー）、１つ以上のイントロン、及び１つ以上の転写後調節エレメントを含んでもよい。
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、又は多重鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、又はプリン及びピリミジン塩基若しくは他の天然、化学的修飾若しくは生化学的修飾、非天然、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」又は「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離するか、又は当該技術分野で既知である方法によって化学的に合成することができる。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センス又はアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又はそうでなければ天然に存在しなであろう様式で核酸のセグメントを含有するように修飾されるか、又は合成である、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本開示のコード配列の発現に必要な制御配列を含有する場合、「発現カセット」という用語と同義である。「発現カセット」は、プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。
「ハイブリダイズ可能」又は「相補的」若しくは「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、非共有結合的に結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対及び／又はＧ／Ｕ塩基対を形成する、温度及び溶液イオン強度の適切なインビトロ及び／又はインビボ条件下で配列特異的、逆平行様式で別の核酸に「アニール」又は「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸は、相補的核酸に特異的に結合する）のを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当該技術分野で既知であるように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、チミジン（Ｔ）とのアデニン（Ａ）対合、ウラシル（Ｕ）とのアデニン（Ａ）対合、及びシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対合が含まれる。加えて、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションのために、グアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）と対合することも、当該技術分野で既知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対合の状況で、遺伝コードの縮重（すなわち、冗長性）を部分的に担っている。この開示の文脈において、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であるとみなされ、逆もまた同様である。したがって、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置でＧ／Ｕ塩基対を作製できる場合、その位置は、非相補的であるとみなされないが、代わりに相補的であるとみなされる。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コード及び非コードアミノ酸、化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化されたアミノ酸、及び修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
特定のＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）を「コードする」ＤＮＡ配列は、特定のＲＮＡ及び／又はタンパク質に転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得るか、又はＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はＤＮＡ標的化ＲＮＡ、「非コード」ＲＮＡ又は「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードし得る。
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含むポリペプチドを指す。例えば、融合タンパク質は、（ｉ）ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）又はその断片、及び（ｉｉ）少なくとも１つの非ＧＯＩタンパク質を含み得る。本明細書に包含される融合タンパク質は、抗体、又はＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）、例えば、受容体、リガンド、酵素、若しくはペプチドの細胞外ドメインに融合した抗体のＦｃ若しくは抗原結合断片を含むが、これらに限定されない。融合タンパク質の一部であるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）又はその断片は、単一特異性抗体又は二重特異性若しくは多重特異的性抗体であり得る。
本明細書で使用される場合、「ゲノムセーフハーバー遺伝子」又は「セーフハーバー遺伝子」という用語は、内因性遺伝子活性に重大な悪影響を及ぼすことなく、又はがんを促進することなく、配列が予測可能な様式で統合及び機能し得る（例えば、関心対象のタンパク質を発現する）ように、核酸配列を挿入することができる遺伝子又は遺伝子座を指す。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子はまた、挿入された核酸配列が非セーフハーバー部位よりも効率的かつ高レベルで発現され得る遺伝子座又は遺伝子である。
本明細書で使用される場合、「遺伝子送達」という用語は、外来ＤＮＡが遺伝子療法の用途のために宿主細胞に導入されるプロセスを意味する。
本明細書で使用される場合、「末端反復」又は「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、及びパリンドロームヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端反復又は合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「Rep-binding sequence、ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）とも称される）及び末端分離部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳ及び少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補体であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」又は「ＩＴＲ」と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、及びプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書の本開示において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補体でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を遂行することができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、３つ以上のＩＴＲ又は非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲ若しくは非ＡＡＶ ＩＴＲであり得るか、又はＡＡＶ ＩＴＲ若しくは非ＡＡＶ ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルス及びディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含するＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に由来し得るか、又はＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、及び／若しくは付加によって更に修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。パルボウイルス科ウイルスは、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科及び無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科の２つの亜科で構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と称される。
「野生型ＩＴＲ」又は「ＷＴ－ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性及びＲｅｐニッキング能力を保持する、ＡＡＶ又は他のディペンドウイルスにおける天然に存在するＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コード又はドリフトの縮退に起因して天然に存在する正準配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ－ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に発生する天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ－ＩＴＲ配列を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」又は「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する野生型ＩＴＲである単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ－ＩＴＲの対を指す。例えば、変化が配列の特性及び全体的な三次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在する正準配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、正準配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ－ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥ又はＲＢＥ’）及び末端分離部位（ｔｒｓ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意選択的に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」又は「ｍｏｄ－ＩＴＲ」又は「変異型ＩＴＲ」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ－ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに変異を有するＩＴＲを指す。変異は、同じ血清型のＷＴ－ＩＴＲの三次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの１つ以上の変化をもたらし得、三次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその三次元構造）の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも称される「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補体ではない単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの三次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の三次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、三次元空間でのそれらのＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アーム及び／又は短いＢ－Ｂ’アームを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、又は点変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列であり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型又は合成ＩＴＲ配列）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ－ＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームを有することができ、他方のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ－ＩＴＲと比較して、異なる三次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、又は短いＢ－Ｂ’アームなど）を有し得る。
本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型ディペンドウイルスＩＴＲ配列に対して変異又は修飾され、それらの全長にわたって逆相補である単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内の一対のＩＴＲを指す。どちらのＩＴＲも野生型ＩＴＲ ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、それらは修飾型ＩＴＲであり、変異型ＩＴＲとも称される）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、又は点変異により、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」又は「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」又は「右ＩＴＲ」と称される。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ＩＴＲ」又は「実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のｃｅＤＮＡゲノム又はｃｅＤＮＡベクター内の修飾型ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性及び全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称な三次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、三次元空間に構成された同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ－ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称な三次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な三次元形状をもたらす変異を有する。例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来し得、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する変異を有し得（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称な三次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性又は全体的な形状に影響を及ぼさず、それらが三次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（modified ITR、ｍｏｄ－ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）又はデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、正準ｍｏｄ－ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有し、またそれらの三次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な三次元空間構成を有する。実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡ及びＢ－Ｂ’ループの同様の三次元構造を有する。
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に関する１つの核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ＡＢＣにおいて、ＢはＡ及びＣに隣接している。配列Ａ×Ｂ×Ｃについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前又は後に続くが、隣接される配列と連続している、又はすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端における末端反復を指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域を更に組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域を更に含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミド又はウイルスゲノムに組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡスペーサー領域」という用語は、ｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡゲノム中の機能的エレメントを分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、最適機能性のため所望の距離で２つの機能的エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、例えば、プラスミド又はバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供するか又は増大させる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、クローニング部位などに便利な位置を提供することによって、ｃｅＤＮＡゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、又は既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分離部位と、上流転写調節エレメントとの間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒなどを挿入する。同様に、スペーサーを、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分離部位との間に組み込むことができる。
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」、及び「ＲＢＳ」は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８又はＡＡＶ Ｒｅｐ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。ＲＢＳ配列及びその逆相補体は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたＲＢＳ配列である５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０）を含む。他の既知のＡＡＶ ＲＢＳ配列及び他の天然に既知の又は合成ＲＢＳ配列を含む、任意の既知のＲＢＳ配列が使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列ＧＣＴＣに結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、５’－（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）－３’（配列番号６０）に直接結合し、安定してアセンブリすると考えられる。加えて、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基及びホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性又は低配列特異性であり、タンパク質－ＤＮＡ複合体を安定させる。
本明細書で使用される場合、「末端分離部位」及び「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌデルタ又はＤＮＡ ｐｏｌイプシロンを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン－ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替的に、Ｒｅｐ－チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。受容体基質が相補的ＩＴＲである場合、得られる産物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたヘキサヌクレオチド配列である５’－ＧＧＴＴＧＡ－３’（配列番号６１）を含む。他の既知のＡＡＶ ＴＲＳ配列、ＡＧＴＴ（配列番号６２）、ＧＧＴＴＧＧ（配列番号６３）、ＡＧＴＴＧＧ（配列番号６４）、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号６５）などの他の天然に既知の又は合成ＴＲＳ配列、及びＲＲＴＴＲＲ（配列番号６６）などの他のモチーフを含む、任意の既知のＴＲＳ配列を使用することができる。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして作動し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」及び「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」という用語は、少なくとも１つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含ＤＮＡベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ」という用語は、合成又はその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖（double stranded、ｄｓ）二重鎖ＤＮＡを指すことを意味する。ｃｅＤＮＡの詳細な説明は、２０１７年３月３日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２０８２８号に記載されており、その全容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列及び構成を含むｃｅＤＮＡの産生のためのある特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号及び２０１８年１２月６日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の実施例１に記載されており、その各々は、その全体の参照により本明細書に組み込まれる。様々なＩＴＲ配列及び構成を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの生成のためのある特定の方法は、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／１４１２２号に記載されており、その全容は参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、閉端直鎖状二重鎖（closed-endedlinear duplex、ＣＥＬｉＤ）ＣＥＬｉＤ ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ＤＮＡベースのミニサークルである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、最小限の免疫学的に定義された遺伝子発現（minimalisticimmunological-defined gene expression、ＭＩＤＧＥ）ベクターである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ミニスタリングＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、発現カセットの５’及び３’末端にＩＴＲの２つのヘアピン構造を含むダンベル型の直鎖状二重鎖閉端ＤＮＡである。いくつかの実施形態によれば、ｃｅＤＮＡは、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（商標）ＤＮＡである。
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」、「ｃｅＤＮＡベクター」及び「ｃｅＤＮＡ」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも１つの末端パリンドロームを含む閉端ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。
本明細書で使用される場合、「合成ＡＡＶベクター」及び「ＡＡＶベクターの合成産生」という用語は、完全に無細胞環境でのＡＡＶベクター及びその合成産生方法を指すことを意味する。
本明細書で定義されるように、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、又は発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞又は生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起された場合に細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を生じる反応を触媒させ、β－ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産物に変換する。実験又は診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase、ＡＰ）、チミジンキナーゼ（thymidine kinase、ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（greenfluorescent protein、ＧＦＰ）、及び他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（chloramphenicolacetyltransferase、ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、並びに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、又は選択された薬剤若しくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを直接標的又は損傷する任意のタンパク質又はペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要なポリペプチドを標的とするプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、及びリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の応答性の範囲及び複雑性を拡張する。
転写調節因子は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質などの目的の遺伝子の転写を活性化又は抑制する、転写アクチベーター及びリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、並びに細胞条件及び環境条件に応じて、アクチベーター又はリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、及びロイシン－ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」又は「誘導因子タンパク質」は、調節配列エレメントに結合するタンパク質であり、調節配列エレメントに作動可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制又は活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサー及び誘導因子タンパク質は、少なくとも１つの入力剤又は環境入力の存在又は不在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合及び入力剤結合、又は応答性エレメント若しくはドメインを含む形態のモジュールである。
本明細書で使用される場合、「担体」としては、任意かつ全ての溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。薬学的に活性な物質に対するそのような媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与された場合に、毒性反応、アレルギー性反応、又は同様の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「入力剤応答性ドメイン」は、条件又は入力剤に結合するか、又はそうでなければ連結ＤＮＡ結合融合ドメインをその条件若しくは入力の存在に対して応答性にするように、条件又は入力剤に応答する転写因子のドメインである。一実施形態では、条件又は入力の存在は、入力剤応答性ドメイン又はそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。
「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中又は生物内で起こるアッセイ又はプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法又は使用は、細菌等の単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物又は植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞及び細胞株を含む）、形質転換細胞株、及び抽出組織又は細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実施される方法及び使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイ及び方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞又は細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質又はＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始及び速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子等の調節タンパク質及び分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現を調節する転写因子の発現を駆動することができる。プロモーター配列内では、転写開始部位、同様に、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され得、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又はエレメントを含むように上流（５’配向）に伸びる。
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質又は転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、５０～１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流又は遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内又はエキソン領域内に位置付けられ得る。
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、又は転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「作動可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された」、「制御下」、及び「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置及び／又は配向にあり、その配列の転写開始及び／又は発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節することができる。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
プロモーターは、所与の遺伝子又は配列のコードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子又は配列と天然に関連するものであり得る。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。
いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組換えプロモーター」又は「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方は、その自然環境において作動可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組換え又は異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス、又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在」しない合成プロモーター又はエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び／又は当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する変異を含み得る。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路及びモジュールに関して、ＰＣＲを含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたく、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。更に、ミトコンドリア、クロロプラスト等の非核性細胞小器官内の配列の転写及び／又は発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子若しくは誘導剤の存在下、それによって影響される場合、又はそれによって接触される場合に、転写活性を開始又は強化することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」又は「誘導剤」は、内因性であり得るか、又は誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方式で投与される、通常は外因性の化合物又はタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子又は誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、又はタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写又は発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成成分又はモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサー等のある特定の薬剤の不在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、及びマウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、並びに他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で交換可能に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳制御配列を指し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）又はコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチド若しくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供及び／若しくは調節し、かつ／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。
「作動可能に連結された」とは、そのように記載された構成成分が、それらが意図された方法で機能することを許可する関係にある並列を指す。例えば、プロモーターがその転写又は発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。「発現カセット」は、ｃｅＤＮＡベクターにおける導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーター又は他の調節配列に作動可能に連結されている異種ＤＮＡ配列を含む。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本開示によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒト又は動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、げっ歯類、飼育動物、又は狩猟動物等の脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、及びマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。げっ歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、及びハムスターが挙げられる。飼育動物及び狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、並びに魚、例えば、トラウト、ナマズ、及びサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類又はヒトである。対象は、男性又は女性であり得る。追加的に、対象は、幼児又は子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児又は胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、又はウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患及び障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。加えて、本明細書に記載される方法及び組成物は、飼育動物及び／又はペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、又は民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系等であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者又は他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、又は成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、又はヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、又は非ヒト胚若しくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸構築物又はｃｅＤＮＡ発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を含む。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞）、人工多能性幹細胞、又はいくつかの不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。代替的に、宿主細胞は、組織、器官、又は生物におけるインサイチュ又はインビボの細胞であり得る。
「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞に存在する物質を指す。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸又はポリペプチドをそのような細胞又は生物に導入することが望まれる、人間の手が関与するプロセスによって細胞又は生物等の生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）又はポリペプチドを指し得る。代替的に、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞又は生物における核酸又はポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現又はレベルをもたらすことが望まれる、人間の手が関与するプロセスによって細胞又は生物等の生物系に導入された核酸又はポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、「内因性」という用語は、生物系又は細胞に対して天然である物質を指す。
「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指す。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上記）を使用して決定される。使用される任意のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（－ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／アラインメントの長さ－アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
本明細書で使用される「相同性」又は「相同」という用語は、必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、標的染色体上の対応する配列のヌクレオチド残基と同一であるヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内である様々な方式で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、例えば相同性アームの核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）は、配列が、宿主細胞の対応する未変性又は未編集の核酸配列（例えば、ゲノム配列）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一である場合、「相同」とみなされる。
本明細書で使用される「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸又はタンパク質には見られないヌクレオチド又はポリペプチド配列を意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（又はそのバリアント）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、バリアントポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」及び「導入遺伝子」という用語は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達及び発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（又はそのバリアント）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、バリアントポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合バリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。目的の導入遺伝子には、ポリペプチドをコードする核酸、好ましくは治療的（例えば、医療、診断、若しくは獣医学的使用）又は免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、関心対象の核酸は、治療用ＲＮＡに転写される核酸を含む。本開示のｃｅＤＮＡベクターでの使用のために含まれる導入遺伝子は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、アプタマー、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴ若しくはポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、又はそれらの任意の組み合わせを発現又はコードするものを含むが、これらに限定されない。
「ベクター」又は「発現ベクター」は、細胞において結合されたセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入物」が結合され得る、プラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、又はコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、宿主細胞への送達のために、又は異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、起源及び／又は最終形態でウイルス性又は非ウイルス性であり得るが、本開示の目的のために、「ベクター」は、その用語が本明細書で使用される場合、一般にｃｅＤＮＡベクターを指す。「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝子エレメントを包含する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクター又は組換えベクターであり得る。
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡ又はポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、多くの場合、しかし必ずしもそうではないが、細胞にとって異種である。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、並びにクローニング及び増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。「発現」という用語は、ＲＮＡ及びタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写プロセシング、翻訳及びタンパク質の折りたたみ、修飾及びプロセシングを含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に作動可能に連結された場合に、インビトロ又はインビボでＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子には、コード領域の前後の領域、例えば、５’未翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列、同様に、個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる場合及び含まれない場合がある。
「組換えベクター」とは、異種核酸配列を含むベクター、又はインビボで発現することができる「導入遺伝子」を意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態では、他の好適な組成物及び療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における目的のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。
本明細書で使用される「遺伝性疾患」という語句は、ゲノムの１つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的又は完全に、直接的又は間接的に引き起こされる疾患を指す。異常は、変異、挿入、又は欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列又はその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性障害、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、及びテイ・サックス病であり得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、及び／又は「治療」という用語は、状態の進行を抑制する、実質的に阻害する、遅らせる、若しくは逆転させる、状態の臨床症状を実質的に改善する、又は状態の臨床症状の出現を実質的に防ぐ、有益な若しくは望ましい臨床結果を得ることを含む。治療することは、以下：（ａ）障害の重症度を低減すること、（ｂ）治療される障害に特徴的な症状の発症を制限すること、（ｃ）治療される障害に特徴的な症状の悪化を制限すること、（ｄ）以前に障害を有していた患者において障害の再発を制限すること、及び（ｅ）以前に障害に対して無症候性であった患者において症状の再発を制限すること、のうちの１つ以上を達成することを更に指す。
薬理学的及び／又は生理学的効果等の有益な又は所望の臨床結果は、疾患、障害又は状態の素因を有する可能性があるが、疾患の症状をまだ経験していないか、若しくは呈していない対象において疾患、障害又は状態が発生するのを防ぐこと（予防的治療）、疾患、障害又は状態の症状の緩和、疾患、障害又は状態の程度の減少、疾患、障害又は状態の安定化（すなわち、悪化させない）、疾患、障害又は状態の蔓延を防ぐこと、疾患、障害又は状態の進行を遅らせる又は遅くすること、疾患、障害又は状態の改善又は軽減、及びそれらの組み合わせ、同様に治療を受けていない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態によれば、疾患は、ＰＦＩＣである。
本明細書で使用される場合、活性剤（例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ脂質粒子）の「治療量」、「治療有効量」、「有効量」、又は「薬学的有効量」という用語は交換可能に使用され、治療の意図された利益を提供するのに十分な量を指す。しかしながら、投与量レベルは、傷害の種類、年齢、体重、性別、患者の病状、病状の重症度、投与経路、及び用いられる特定の活性剤を含む、多様な因子に基づく。したがって、投与計画は、大きく異なる可能性があるが、標準的な方法を使用して医師によって常套的に決定され得る。追加的に、「治療量」、「治療有効量」及び「薬学的有効量」という用語は、組成物の予防的（prophylactic）又は予防的（preventative）量を含む。予防的（prophylactic）又は予防的（preventative）用途において、薬学的組成物又は医薬品は、疾患、障害又は状態の生化学的、組織学的及び／又は行動症状、その合併症、並びに疾患、障害又は状態の発症中に現れる中間の病理学的表現型を含む、疾患、障害又は状態に罹患しやすい患者、又はそうでなければそのリスクがある患者に、リスクを排除若しくは低減するか、重症度を減少させるか、又は疾患、障害若しくは状態の発症を遅らせるのに十分な量で投与される。いくつかの医学的判断によれば、最大用量、すなわち最高の安全用量を使用することが一般に好ましい。「用量」及び「投与量」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「治療効果」という用語は、治療の結果を指し、その結果は、望ましくかつ有益であると判断される。治療効果としては、直接的又は間接的に、疾患症状（例えば、ＰＦＩＣ）の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。治療効果としてはまた、直接的又は間接的に、疾患症状の進行の阻止、低減、又は排除を挙げることができる。
本明細書に記載される任意の治療剤について、治療有効量は、予備的なインビトロ研究及び／又は動物モデルから最初に決定することができる。治療有効用量はまた、ヒトのデータから決定することができる。適用される用量は、投与される化合物の相対的な生物学的利用能及び効力に基づいて調整することができる。上記の方法及び他の周知の方法に基づいて最大の効力を達成するように用量を調整することは、当業者の能力の範囲内である。参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（２００１）の第１章に見出され得る治療有効性を決定するための一般原則を以下に要約する。
薬物動態学的原理は、許容できない副作用を最小限に抑えながら、望ましい程度の治療効果を得るために投与計画を変更するための基礎を提供する。薬物の血漿濃度を測定でき、治療濃度域に関連している状況では、投与量の変更に関する追加のガイダンスを入手することができる。
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」又は「含む（comprises）」という用語は、方法又は組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定エレメントの包含に対して開かれている、その組成物、方法、及びそれぞれの構成成分に関して使用される。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規又は機能的な特徴に物質的に影響を及ぼさないエレメントの存在を許容する。「含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意のエレメントを除いて、本明細書に記載される組成物、方法、及びそれらのそれぞれの構成成分を指す。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、及び／又は本開示などを読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、及び／又はステップを含む。同様に、「又は」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「及び」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、本開示の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料は、下記で説明される。略語「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、略語「例えば（e.g.）」は、「例えば（for example）」と同義である。
作動例又は別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。「約」という用語は、パーセンテージに関連して使用される場合、±１％を意味し得る。本開示は、以下の実施例によって更に詳細に説明されるが、本開示の範囲は、それに限定されるべきではない。
本明細書に開示される本開示の代替エレメント又は実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各郡のメンバーは、個別に、又は群の他のメンバー又は本明細書で見られる他のエレメントとの任意の組み合わせで参照及び主張することができる。群の１つ以上のメンバーは、利便性及び／又は特許性の理由から、群に含まれるか、又は群から削除することができる。そのような任意の包含又は削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されている全てのマーカッシュグループの記述を満たす。
態様のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業若しくは商業目的でのヒト胚の使用、又は人間若しくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、及びそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修正するためのプロセスに関係しない。
本明細書では、本開示の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。
本出願全体を通して引用される；参考文献、発行された特許、公開された特許出願、及び同時係属中の特許出願を含む全ての特許及び他の刊行物は、例えば、本明細書に記載の技術に関連して使用され得る、そのような刊行物に記載される方法論を説明及び開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行する開示のおかげで、又はいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関する全ての記述又はこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付又は内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、又は本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態及び実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップ又は機能は、所与の順序で提示されるが、代替的な実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、又は機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順又は方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、更なる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参照文献及び出願の組成物、機能、及び概念を用いて本開示の更なる実施形態を提供するように修正することができる。更に、生物学的機能の同等性の考慮により、種類又は量の生物学的又は化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更及び他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
前述の実施形態のいずれかの特定のエレメントは、他の実施形態のエレメントと組み合わせるか、又は置き換えることができる。更に、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、全ての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によって更に説明されており、決してこれらを更に限定するものと解釈されるべきではない。本開示は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図されない。
ＩＩ．ｃｅＤＮＡベクターからの進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）治療用タンパク質の発現
共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ｃｅＤＮＡ分子（ｃｅＤＮＡ）が本明細書で提供される。本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子などの挿入、及び必要に応じて、導入遺伝子の天然遺伝子調節エレメントの組み込みを可能にする。本開示の態様によれば、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ｃｅＤＮＡ分子（ｃｅＤＮＡ）は、１つ以上のＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列を表１に示す。
プラスミド系発現ベクターとは異なるｃｅＤＮＡベクターの多くの構造特徴が存在する。ｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴：元の（すなわち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠失、原核細胞複製起源の欠失、自蔵である（すなわち、Ｒｅｐ結合及び末端分離部位（ＲＢＳ及びＴＲＳ）を含む２つのＩＴＲ以外のいかなる配列も、ＩＴＲ間の外因性配列も必要としない）、真核起源（すなわち、それらは真核細胞中で産生される）のヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、並びに細菌型ＤＮＡメチル化、又は実際に哺乳動物宿主によって異常であるとみなされる任意の他のメチル化の不存在のうちの１つ以上を有し得る。一般に、本ベクターは、いかなる原核細胞ＤＮＡも含有しないことが好ましいが、いくつかの原核細胞ＤＮＡが、外因性配列として、非限定的な例としてプロモーター又はエンハンサー領域に挿入されてもよいことが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖状ＤＮＡであるが、プラスミドは、常に二本鎖ＤＮＡである。
プラスミドベースの発現ベクターに比べて、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターを使用することにはいくつかの利点がある。そのような利点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）プラスミドは、細菌ＤＮＡ配列を含有し、原核生物特異的メチル化（例えば、６－メチルアデノシン及び５－メチルシトシンのメチル化）を受けるが、カプシドを含まないＡＡＶベクター配列は、真核生物起源であり、原核生物特異的メチル化を受けない；結果として、カプシドを含まないＡＡＶベクターは、プラスミドと比較して炎症応答及び免疫応答を誘導する可能性が低い、２）プラスミドは産生プロセス中に耐性遺伝子の存在を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは必要としない、３）環状プラスミドは、細胞への導入時に核に送達されず、細胞ヌクレアーゼによる分解を回避するために過負荷を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスシスエレメント（すなわち、修飾型ＩＴＲ）を含有し、これは、ヌクレアーゼに対して耐性を付与し、核に標的化及び送達するように設計され得る。ＩＴＲ機能に不可欠な最小規定エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２の場合５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号５３１））及び末端分離部位（ＴＲＳ；ＡＡＶ２の場合５’－ＡＧＴＴＧＧ－３’（配列番号４８））＋ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列である。対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞及び組織型を効率的に標的とし得る。
ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイ及び電気泳動分析によって判定して、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組換えられて変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクター及びｃｅＤＮＡ－プラスミドは、構造（具体的には、直鎖状対環状）及びこれらの異なる対象物（下記を参照）を産生及び精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ－プラスミドの場合は原核細胞タイプ及びｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
本明細書に記載される技術は、一般に、非ウイルス性ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターからの細胞におけるＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現及び／又は産生を対象とする。ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書において「一般的なｃｅＤＮＡベクター」と題されたセクションに記載されている。具体的には、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、一対のＩＴＲ（例えば、本明細書に記載される対称又は非対称）、及びＩＴＲ対の間にＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする表１のうちのいずれかから選択される核酸を含み、核酸が、本明細書に記載されるようにプロモーター又は調節配列に作動可能に連結される。従来のＡＡＶベクター、更にはレンチウイルスベクターを超える、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現に対するｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、所望のタンパク質をコードする異種核酸配列にサイズの制約がないことである。ＰＦＩＣ治療用タンパク質。したがって、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、それを必要とする対象、例えば、ＰＦＩＣを有する対象においてＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）を発現することができる。ＰＦＩＣの兆候及び症状は、典型的には乳児期に始まり、胆汁蓄積及び肝疾患に関連する。したがって、いくつかの実施形態では、対象は、乳児である。
理解されるように、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクター技術は、任意のレベルの複雑さに適合させることができるか、又はＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の異なる構成成分の発現が独立した様式で制御され得るモジュール方式で使用することができる。例えば、本明細書で設計されたｃｅＤＮＡベクター技術は、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して単一の遺伝子配列（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質）を発現するのと同様に簡単であり得るか、又は複数のｃｅＤＮＡベクターを使用する場合と同様に複雑であり得、各ベクターは、異なるプロモーターによって各々独立して制御される複数のＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、表１の配列によってコードされるもののうちの１つ以上、又はＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４及びＴＪＰ２タンパク質のうちの１つ以上）ＰＦＩＣ治療用タンパク質に関連する補因子又はアクセサリータンパク質を発現することが特に企図される。以下の実施形態は、本明細書で具体的に企図され、必要に応じて当業者が適応させることができる。
実施形態では、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の単一の構成成分を発現することができる。代替的に、単一のｃｅＤＮＡベクターを使用して、単一のプロモーター（強力なプロモーターなど）の制御下で、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の複数の構成成分（例えば、少なくとも２つ）を発現することができ、任意選択的にＩＲＥＳ配列を使用して、構成成分の各々、例えば、補因子又はアクセサリータンパク質の適切な発現を確実にする。
また本明細書において、別の実施形態では、少なくとも２つの挿入物（例えば、重鎖又は軽鎖を発現する）を含む単一のｃｅＤＮＡベクターが企図され、各挿入物の発現はそれ自体のプロモーターの制御下にある。プロモーターは、同じプロモーターの複数のコピー、複数の異なるプロモーター、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。当業者が理解するように、多くの場合、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の構成成分を異なる発現レベルで発現させ、したがって、発現される個々の構成成分の化学量論を制御して、細胞における効率的なＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の折りたたみ及び組み合わせを確実にすることが望ましい。
ｃｅＤＮＡベクター技術の更なるバリエーションは、当業者によって想定され得るか、又は従来のベクターを使用するタンパク質産生方法から適合され得る。
Ａ．進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）をコードする導入遺伝子はまた、分泌配列もコードすることができ、それにより、ＰＦＩＣ治療用タンパク質がゴルジ装置及び小胞体に向けられ、そこでＰＦＩＣ治療用タンパク質がＥＲを通過して細胞から出ると、シャペロン分子によって正しい立体構造に折りたたまれる。例示的な分泌配列には、ＶＨ－０２（配列番号８８）及びＶＫ－Ａ２６（配列番号８９）及びＩｇκシグナル配列（配列番号１２６）、並びにタグ付きタンパク質がサイトゾルから分泌されるのを可能にするＧｌｕｃ分泌シグナル（配列番号１８８）、タグ付きタンパク質をゴルジ体に向けるＴＭＤ－ＳＴ分泌配列（配列番号１８９）が含まれるが、これらに限定されない。
調節スイッチを使用して、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を微調整することもでき、それによりＰＦＩＣ治療用タンパク質は、必要に応じて（所望の発現レベル又は量でのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を含むが、これに限定されない）、又は代替的に細胞シグナル伝達事象を含む特定のシグナルの存在又は不存在がある場合に発現される。例えば、本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現は、本明細書において「調節スイッチ」と題されたセクションに記載されるように、特定の状態が発生したときにオン又はオフにすることができる。
例えば、また単なる例示の目的のために、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を使用して、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の高すぎるレベルの産生などの望ましくない反応をオフにすることができる。ＰＦＩＣ遺伝子は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を所望の細胞にもたらすためにシグナルペプチドマーカーを含有し得る。しかしながら、いずれの状況でも、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を調節することが望ましい場合がある。ｃｅＤＮＡベクターは、調節スイッチの使用に容易に対応する。
従来のＡＡＶベクター、更にはレンチウイルスベクターを上回るｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする異種核酸配列にサイズの制約がないことである。したがって、全長ＰＦＩＣ治療用タンパク質、並びに任意選択的にいかなる補因子又は評価タンパク質でさえも、単一のｃｅＤＮＡベクターから発現することができる。加えて、必要な原子化学に応じて、同じＰＦＩＣ治療用タンパク質の複数のセグメントを発現させることができ、同じ又は異なるプロモーターを使用することができ、また調節スイッチを使用して各領域の発現を微調整することができる。例えば、実施例に示されるように、デュアルプロモーター系を含むｃｅＤＮＡベクターを使用することができ、それによりＰＦＩＣ治療用タンパク質の各ドメインに異なるプロモーターが使用される。ＰＦＩＣ治療用タンパク質を産生するためのｃｅＤＮＡプラスミドの使用は、機能的ＰＦＩＣ治療用タンパク質の形成のための各ドメインの適切な比率をもたらす、ＰＦＩＣ治療薬のドメインの発現のためのプロモーターの固有の組み合わせを含む。したがって、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の異なる領域を別々に（例えば、異なるプロモーターの制御下で）発現することができる。
別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターから発現されるＰＦＩＣ治療用タンパク質は、蛍光、酵素活性、分泌シグナル、又は免疫細胞アクチベーターなどの追加の機能を更に含む。
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするｃｅＤＮＡは、例えば、リンカードメインを更に含むことができる。本明細書で使用される場合、「リンカードメイン」は、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質のドメイン／領域のうちのいずれかを一緒に連結する、長さが約２～１００アミノ酸のオリゴ又はポリペプチド領域を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに対して自由に移動できるように、グリシン及びセリンなどの柔軟な残基を含むか、又はそれらから構成され得る。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないようにすることが望ましい場合は、より長いリンカーを使用することができる。リンカーは、切断可能であるか、又は切断不可能であり得る。切断可能なリンカーの例には、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー又はそれらの機能的同等物、及びそれらの組み合わせが含まれる。リンカーは、Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスに由来するＴ２Ａであるリンカー領域であり得る。
例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質などの既知の及び／又は公的に利用可能なタンパク質配列を取り、ｃＤＮＡ配列を逆操作して、そのようなタンパク質をコードすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。次いで、意図される宿主細胞と一致するようにｃＤＮＡをコドン最適化し、本明細書に記載されるようにｃｅＤＮＡベクターに挿入することができる。
Ｂ．ＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクター
所望のＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする１つ以上の配列を有するＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、プロモーター、分泌シグナル、ポリＡ領域、及びエンハンサーなどの調節配列を含むことができる。最低でも、ｃｅＤＮＡベクターは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする１つ以上の異種配列を含む。
非常に効率的かつ正確なＰＦＩＣ治療用タンパク質の組み立てを達成するために、いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質が小胞体ＥＲリーダー配列を含み、それをＥＲに導き、タンパク質の折りたたみが発生することが特に企図される。例えば、発現されたタンパク質を折りたたみのためにＥＲに向ける配列。
いくつかの実施形態では、細胞又は細胞外局在化シグナル（例えば、分泌シグナル、核局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナルなど）は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の分泌又は所望の細胞内局在化を指示するために、ｃｅＤＮＡベクターに含まれ、それによりＰＦＩＣ治療用タンパク質は、細胞内標的（例えば、イントラボディ）又は細胞外標的に結合することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、モジュール様式で任意の所望のＰＦＩＣ治療用タンパク質のアセンブリ及び発現を可能にする。本明細書で使用される場合、「モジュール」という用語は、構築物から容易に除去され得る、ｃｅＤＮＡ発現プラスミドにおけるエレメントを指す。例えば、ｃｅＤＮＡ生成プラスミドのモジュールエレメントは、構築物内の各エレメントに隣接する制限部位の固有の対を含み、個々のエレメントの排他的な操作を可能にする（例えば、図１Ａ～図１Ｇを参照されたい）。したがって、ｃｅＤＮＡベクタープラットフォームは、任意の所望のＰＦＩＣ治療用タンパク質構成の発現及びアセンブリを可能にすることができる。様々な実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする所望のｃｅＤＮＡベクターをアセンブリするのに必要な操作量を低減及び／又は最小化できるｃｅＤＮＡプラスミドベクターが本明細書に提供される。
Ｃ．ｃｅＤＮＡベクターによって発現される例示的なＰＦＩＣ治療用タンパク質
具体的には、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）の１つ以上の症状の治療、予防、及び／又は改善における使用のための、例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質、並びにそのバリアント及び／又は活性断片をコードすることができるが、これらに限定されない。一態様では、ＰＦＩＣ疾患は、ヒト進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）である。
（ｉ）ＰＦＩＣ治療用タンパク質及びその断片
本質的に、ＰＦＩＣ治療用タンパク質又はその断片（例えば、機能的断片）の任意のバージョンは、本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされ、ｃｅＤＮＡベクターにおいて及びｃｅＤＮＡベクターから発現され得る。当業者は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質が、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の全てのスプライスバリアント及びオルソログを含むことを理解するであろう。ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、無傷の分子並びにその断片（例えば、機能的）を含む。
従来のＡＡＶベクター、更にはレンチウイルスベクターよりもｃｅＤＮＡベクターの明確な利点は、所望のタンパク質をコードする異種核酸配列にサイズの制約がないことである。したがって、複数の全長ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、単一のｃｅＤＮＡベクターから発現することができる。
ｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質又はその断片の発現は、当該技術分野で知られているか、又は本明細書に記載されるように、本明細書に記載される調節スイッチを含む、１つ以上の誘導性又は抑制性プロモーターを使用して、空間的及び時間的の両方で達成することができる。
一実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質は「治療用タンパク質バリアント」であり、これは、対応する天然ＰＦＩＣ治療用タンパク質と比較して変更されたアミノ酸配列、組成物、又は構造を有するＰＦＩＣ治療用タンパク質を指す。一実施形態では、ＰＦＩＣは、機能的バージョン（例えば、野生型）である。例えば、疾患の動物モデル及び／又は進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）の薬物を評価するために、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）につながる点変異又は欠失変異などのＰＦＩＣ治療用タンパク質の変異型バージョンを発現することもまた有用であり得る。疾患モデルを生成するために、細胞又は動物モデル系への変異型又は修飾型ＰＦＩＣ治療用タンパク質の送達を行うことができる。そのような細胞又は動物モデルは、研究及び／又は薬物スクリーニングに使用することができる。ｃｅＤＮＡベクターから発現されるＰＦＩＣ治療用タンパク質は、蛍光、酵素活性、又は分泌シグナルなどの追加の機能を付与する配列／部分を更に含み得る。一実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質バリアントは、それがレシピエント宿主細胞における内因性ＰＦＩＣ治療用タンパク質と区別されることを可能にするための同定のための非天然タグ配列（例えば、免疫タグ）を含む。
例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の既知の及び／又は公的に利用可能なタンパク質配列を取り、ｃＤＮＡ配列を逆操作して、そのようなタンパク質をコードすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。次いで、意図される宿主細胞と一致するようにｃＤＮＡをコドン最適化し、本明細書に記載されるようにｃｅＤＮＡベクターに挿入することができる。
一実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質コード配列は、例えば、宿主から得られたｍＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲを使用して配列を増幅することによって、既存の宿主細胞又は細胞株に由来し得る。
（ｉｉ）ｃｅＤＮＡベクターを発現するＰＦＩＣ治療用タンパク質
所望のＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする１つ以上の配列を有するｃｅＤＮＡベクターは、プロモーター（例えば、表７を参照されたい）、分泌シグナル、ポリＡ領域（例えば、表１０を参照されたい）、及びエンハンサー（例えば、表８Ａ～８Ｃを参照されたい）などの調節配列を含むことができる。少なくとも、ｃｅＤＮＡベクターは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質又はその機能的断片をコードする１つ以上の異種配列を含む。ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターを生成するための例示的なカセット挿入を図１Ａ～図１Ｇに示す。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の表１に列挙されるＰＦＩＣ配列を含む。
表１：ＰＦＩＣ疾患（例えば、ＰＦＩＣ１、ＰＦＩＣ２、ＰＦＩＣ３又はＰＦＩＣ４）の治療のためのＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４又はＴＪＰ２）の発現のための例示的なＰＦＩＣ配列。
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（ｉｉｉ）ＰＦＩＣの治療のためのＰＦＩＣ治療用タンパク質及びその使用
治療用タンパク質を対象に送達するための方法であって、本方法が、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を対象に投与することを含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列がＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする、方法。
本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターを使用して、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の不適切な発現及び／又はＰＦＩＣ治療用タンパク質内の変異に関連するＰＦＩＣ疾患の治療のための治療用ＰＦＩＣ治療用タンパク質を送達することができる。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、任意の所望のＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現することができる。例示的な治療用ＰＦＩＣ治療用タンパク質には、本明細書の表１に示される配列によって発現される任意のＰＦＩＣ治療用タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、発現されたＰＦＩＣ治療用タンパク質は、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）の治療に機能的である。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、免疫系反応を引き起こさない。
別の実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質又はその断片（例えば、機能的断片）をコードするｃｅＤＮＡベクターを使用して、キメラタンパク質を生成することができる。したがって、キメラタンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターが、例えば、肝臓、腎臓、胆嚢、前立腺、副腎から選択されるいずれか１つ以上の組織に投与され得ることが本明細書で具体的に企図される。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣを発現するｃｅＤＮＡベクターが乳児に投与されるか、又は子宮内の対象に投与される場合、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）のインビボ若しくはエクスビボ治療のために、ＰＦＩＣを発現するｃｅＤＮＡベクターを、肝臓、副腎、心臓、腸、肺、及び胃から選択される任意の１つ以上の組織に、又はその肝臓幹細胞前駆体に投与することができる。
本方法は、本明細書に記載されるように、ＰＦＩＣ治療用タンパク質又はその断片（例えば、機能的断片）をコードするｃｅＤＮＡベクターを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む。当業者によって理解されるように、「有効量」という用語は、疾患又は障害の治療のための「治療有効量」でのタンパク質の発現をもたらす、投与されたｃｅＤＮＡ組成物の量を指す。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質又はその断片（例えば、機能的断片）をコードするｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の投与量範囲は、効力（例えば、プロモーターの効率）に依存し、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）の治療のために、所望の効果、例えば、所望のＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を生み出すのに十分な量を含む。投与量は、許容できない有害な副作用を引き起こすほど多くあるべきではない。一般に、投与量は、ｃｅＤＮＡベクターの特定の特性、発現効率、並びに患者の年齢、状態、及び性別によって異なるだろう。投与量は、当業者が決定でき、ｃｅＤＮＡベクターは反復投薬を防止する免疫活性化カプシドタンパク質を含まないため、従来のＡＡＶベクターとは異なって、合併症の場合には個々の医師により調整することもできる。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ組成物の投与は、限られた期間繰り返すことができる。いくつかの実施形態では、用量は、定期的に又はパルス投与によって与えられる。好ましい実施形態では、上に列挙された用量は、数ヶ月にわたって投与される。治療の持続期間は、対象の臨床的進歩及び治療への応答性に依存する。経時的なブースター治療が企図されている。更に、発現のレベルは、対象が成長するにつれて滴定することができる。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、対象において、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月／１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも３０年、少なくとも４０年、少なくとも５０年、又はそれ以上発現され得る。長期の発現は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを所定の又は所望の間隔で繰り返し投与することによって達成することができる。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、疾患バイオマーカーの発現の統計的に有意な測定可能な変化又は所与の疾患症状の低減をもたらすのに十分である、発現したＰＦＩＣ治療用タンパク質又はその機能的断片の量である（以下の「有効性の測定」を参照されたい）。そのような有効量は、所与のｃｅＤＮＡ組成物についての臨床試験並びに動物実験で評価することができる。
投与する必要のあるｃｅＤＮＡベクターの正確な量は、開業医の判断に依存し、各固体に特有である。投与に好適なレジームも様々であるが、最初の投与とそれに続くその後の注射又は他の投与による１つ以上の間隔での反復用量によって代表される。代替的に、特に急性疾患／障害の治療のために、インビボ治療のために指定された範囲内の血中濃度を維持するのに十分な連続静脈内注入が企図されている。
本明細書に記載される方法及び組成物において有用な薬剤は、局所的、静脈内（ボーラス又は連続注入による）、細胞内注射、組織内注射、経口、吸入、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内で投与することができ、必要に応じてぜん動手段によって、又は当業者による他の既知の手段によって送達することができる。薬剤は、必要に応じて、全身投与することができる。子宮内で投与することもできる。
ＰＦＩＣ１、ＰＦＩＣ２、ＰＦＩＣ３及びＰＦＩＣ４などのＰＦＩＣ疾患に対する所与の治療の有効性は、熟練した臨床医によって決定することができる。しかしながら、疾患又は障害の兆候又は症状のいずれか１つ又は全てが有益な方法で変更された場合、又は他の臨床的に許容される疾患の症状若しくはマーカーが、例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、又はＴＪＰ２をコードするｃｅＤＮＡベクター、又はその機能的断片での治療後に少なくとも１０％向上又は改善された場合、その用語が本明細書において使用されるように、治療は「有効な治療」とみなされる。例示的なマーカー及び症状は、実施例８で考察されている。有効性はまた、疾患の安定化、又は医療介入の必要性（すなわち、疾患の進行が停止するか、又は少なくとも遅くなる）によって評価される個人の悪化の失敗によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ／又は本明細書に記載される。治療は、個人又は動物（いくつかの非限定的な例としては、ヒト又は哺乳動物が挙げられる）における疾患の任意の治療を含み、以下：（１）疾患を阻害すること、例えば、疾患若しくは障害の進行の停止若しくは遅延させること、又は（２）疾患を緩和すること、例えば、症状の軽減を引き起こすこと、及び（３）疾患の発症の可能性を防止若しくは低減すること、又は疾患に関連する二次的疾患／障害（例えば、肝不全又は腎不全）を防止することを含む。疾患の治療のための有効量とは、それを必要とする哺乳動物に投与したとき、その用語が本明細書で定義されているように、その疾患に対して有効な治療をもたらすのに十分である量を意味する。
薬剤の有効性は、所与の疾患に特有の物理的指標を評価することによって決定することができる。疾患指標の標準的な分析方法は、当該技術分野で既知である。例えば、ＰＦＩＣの物理的指標としては、肝臓の炎症、胆管損傷、肝細胞損傷、及び胆汁うっ滞が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例として、胆汁うっ滞の血清マーカーとしては、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び胆汁酸（ＢＡ）が挙げられる。血性ビリルビン、血清中トリグリセリドレベル、及び血清中コレステロールレベルもまた、例えばＰＦＩＣによる肝損傷を示す。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（Serum alanine aminotransferase、ＡＬＴ）は、肝細胞損傷の１つのマーカーである。肝臓炎症及び管周囲線維症は、例えば、ＴＮＦ－α、Ｍｃｐ－１、及びＶｃａｍ－１のｍＲＮＡ発現、並びにＣｏｌ１ａ１及びＣｏｌ１ａ２などの胆管線維症マーカーの発現の測定によって分析することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、補因子若しくは他のポリペプチド、センス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡ（コード若しくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））もコードすることができ、それらは、ｃｅＤＮＡから発現されるＰＦＩＣ治療用タンパク質と併せて使用され得る。追加的に、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする配列を含む発現カセットはまた、実験又は診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばβ－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該技術分野において周知の他のものを含み得る。
一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＰＦＩＣ疾患の治療に機能的であるＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するための核酸配列を含む。好ましい実施形態では、治療用ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、それが望まれない限り、免疫系反応を引き起こさない。
ＩＩＩ．ＰＦＩＣ治療用タンパク質の産生に使用するための一般的なｃｅＤＮＡベクター
本開示の実施形態は、ＰＦＩＣ導入遺伝子を発現することができる、閉端線形二本鎖（ｃｅＤＮＡ）ベクターを含む方法及び組成物に基づく。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする配列である。本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、サイズによって制限されず、それにより、例えば、単一ベクターからの導入遺伝子の発現に必要な全ての構成成分の発現を可能にする。ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、３７℃で１時間以上、エキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩ又はエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。
一般に、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含む。ＩＴＲ配列は、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲ及び少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる三次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、又は（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、又は（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択される。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の産生のためのｃｅＤＮＡベクターを含む方法及び組成物が本明細書に包含され、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系を更に含み得る。使用のために包含される非限定的な例示的リポソームナノ粒子系が、本明細書に開示されている。いくつかの態様では、本開示は、ｃｅＤＮＡ及びイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたｃｅＤＮＡを用いて作製及び負荷される脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、本明細書に組み込まれる。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子などの挿入を許可する。
図１Ａ～図１Ｅは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のための非限定的な例示的ｃｅＤＮＡベクターの概略図、又は対応するｃｅＤＮＡプラスミドの配列を示す。ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはカプシドを含まず、第１のＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから得ることができる。発現カセットは、導入遺伝子の発現を可能にする及び／又は制御する１つ以上の調節配列を含み得、例えば、発現カセットは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、並びにポリアデニル化及び終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順番で含み得る。
発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）及び／又は２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、並びにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子、例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに記載されている、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を制御及び調節するための調節スイッチを含み、所望される場合、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、若しくは２０，０００ヌクレオチド、若しくは３０，０００ヌクレオチド、若しくは４０，０００ヌクレオチド、又は５０，０００ヌクレオチド、又は約４０００～１０，０００ヌクレオチド、若しくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、又は５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～５０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～７５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１０００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～５，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が効率的な導入遺伝子の発現をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
ｃｅＤＮＡ発現カセットは、例えば、レシピエント対象において存在しない、不活性、若しくは不十分な活性であるタンパク質をコードする発現可能な外因性配列（例えば、オープンリーディングフレーム）若しくは導入遺伝子、又は所望の生物学的若しくは治療的効果を有するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、欠陥遺伝子又は転写産物の発現を訂正するように機能することができる遺伝子産物をコードすることができる。原則として、発現カセットは、変異のために減少若しくは欠如しているタンパク質、ポリペプチド、若しくはＲＮＡをコードする、又は過剰発現が本開示の範囲内であるとみなされる場合に治療効果をもたらす任意の遺伝子を含み得る。
発現カセットは、任意の導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする）、例えば、対象におけるＰＦＩＣ疾患を治療するのに有用なＰＦＩＣ治療用タンパク質（すなわち、治療用ＰＦＩＣ治療用タンパク質）を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターを単独で、又はポリペプチドをコードする核酸若しくは非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲなど）、並びに対象のゲノム中のウイルス配列、例えば、ＨＩＶウイルス配列などを含む外因性遺伝子及びヌクレオチド配列と組み合わせて使用して、目的の任意のＰＦＩＣ治療用タンパク質を対象に送達し、発現させることができる。好ましくは、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、治療目的（例えば、医療、診断、若しくは獣医学的使用）又は免疫原性ポリペプチドに使用される。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、又はＲＮＡ（コード若しくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））、抗体、融合タンパク質、又はそれらの任意の組み合わせを含む、対象における任意の目的の遺伝子を発現させるのに有用である。
発現カセットはまた、ポリペプチド、センス若しくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はＲＮＡ（コード若しくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及びそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードし得る。発現カセットは、実験又は診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばβ－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該技術分野において周知の他のものを含み得る。
発現カセット、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの発現構築物で提供される配列は、標的宿主細胞に対してコドン最適化され得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」又は「コドン最適化」という用語は、目的の脊椎動物、例えばマウス又はヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、又は相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的に、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化及びカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０ Ｆｏｘ Ｍｉｌｌ Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）又は別の公開データベースを使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする核酸は、当該技術分野で知られているように、ヒト発現のために最適化され、かつ／又はヒトＰＦＩＣ治療用タンパク質若しくはその機能的断片である。
本明細書に開示されるように、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためにｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする。プラスミドベース発現ベクターとは異なるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの多くの構造特徴が存在する。ｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴：元の（すなわち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠失、原核細胞複製起源の欠失、自蔵である（すなわち、Ｒｅｐ結合及び末端分離部位（ＲＢＳ及びＴＲＳ）を含む２つのＩＴＲ以外のいかなる配列も、ＩＴＲ間の外因性配列も必要としない）、ヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、並びに細菌型ＤＮＡメチル化、又は実際に哺乳動物宿主によって異常であるとみなされる任意の他のメチル化の非存在のうちの１つ以上を有し得る。一般に、本ベクターは、いかなる原核細胞ＤＮＡも含有しないことが好ましいが、いくつかの原核細胞ＤＮＡが、外因性配列として、非限定的な例としてプロモーター又はエンハンサー領域に挿入されてもよいことが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖状ＤＮＡであるが、プラスミドは、常に二本鎖ＤＮＡである。
本明細書に提供される方法によって産生されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイによって決定される場合、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する（図４Ｄ）。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組換えられて変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクター及びｃｅＤＮＡ－プラスミドは、構造（具体的には、直鎖状対環状）及びこれらの異なる対象物（下記を参照されたい）を産生及び精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ－プラスミドの場合は原核細胞タイプ及びｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためにｃｅＤＮＡベクターを使用することには、プラスミドベースの発現ベクターよりもいくつかの利点があり、そのような利点としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）プラスミドは、細菌ＤＮＡ配列を含有し、原核生物特異的メチル化（例えば、６－メチルアデノシン及び５－メチルシトシンのメチル化）を受けるが、カプシドを含まないＡＡＶベクター配列は、真核生物起源であり、原核生物特異的メチル化を受けない、結果として、カプシドを含まないＡＡＶベクターは、プラスミドと比較して炎症応答及び免疫応答を誘導する可能性が低い、２）プラスミドは産生プロセス中に耐性遺伝子の存在を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは必要としない、３）環状プラスミドは、細胞への導入時に核に送達されず、細胞ヌクレアーゼによる分解を回避するために過負荷を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスシスエレメント（すなわち、ＩＴＲ）を含有し、これは、ヌクレアーゼに対して耐性を付与し、核に標的化及び送達するように設計され得る。ＩＴＲ機能に不可欠な最小規定エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２の場合５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０））及び末端分離部位（ＴＲＳ；ＡＡＶ２の場合５’－ＡＧＴＴＧＧ－３’（配列番号６４））＋ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列；及び４）である。ｃｅＤＮＡベクターは、Ｔｏｌｌ様ファミリーの受容体のメンバーに結合し、Ｔ細胞媒介性免疫応答を誘発すると報告されている原核生物由来プラスミドにおいてしばしば見られるＣｐＧジヌクレオチドの過剰提示を有しない。対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞及び組織型を効率的に標的とし得る。
ＩＶ．ＩＴＲ
本明細書に開示されているように、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた導入遺伝子又は異種核酸配列を含有し、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列は、非対称ＩＴＲ対又は対称若しくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲ及び少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる三次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、又は（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、又は（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ三次元空間構成を有する、対称若しくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、２つのサブファミリー：脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ及び昆虫に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅを含む、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルスに由来し得る。サブファミリーＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ（パルボウイルスと称される）は、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属を含み、そのメンバーは、ほとんどの条件下で、増殖性感染のためにアデノウイルス又はヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属は、通常はヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、及び６）又は霊長類（例えば、血清型１及び４）に感染するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、並びに他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルス）を含む。パルボウイルス及びＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科の他のメンバーは、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，「Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，」Ｃｈａｐｔｅｒ６９ ｉｎ ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ Ｅｄ．１９９６）に一般に記載されている。
ＩＴＲは、明細書において例証されており、本明細書における例は、ＡＡＶ２ＷＴ－ＩＴＲであるが、当業者であれば、上述のように、任意の既知のパルボウイルス、例えば、ディペンドウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノムからのＩＴＲを使用できることを認識する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１）、キメラＩＴＲ、又は任意の合成ＡＡＶ由来のＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、温血動物、例えば、鳥類（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、及びヒツジアデノ随伴ウイルスに感染し得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８８３）、マウス由来微小ウイルス（Minute Virus from Mouse、ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００１７０１）、ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）由来である。いくつかの実施形態では、本明細書で論じられるように、５’ＷＴ－ＩＴＲは、１つの血清型に由来し、３’ＷＴ－ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。
当業者であれば、ＩＴＲ配列が、二本鎖ホリデージャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ形又はＹ形ヘアピン構造であり（例えば、図２Ａ及び図３Ａを参照されたい）、各ＷＴ－ＩＴＲが、より大きなパリンドロームアーム（Ａ－Ａ’）に埋め込まれた２つのパリンドロームアーム又はループ（Ｂ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’）、並びに一本鎖Ｄ配列によって形成される（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップ又はフロップ配向を定義する）ことを知っている。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ６）由来のＩＴＲの構造解析及び配列比較を参照されたく、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６－４３９、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；３６４－３７９、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９；２６１；８－１４に記載される。当業者は、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡ－プラスミドで使用するための任意のＡＡＶ血清型からＷＴ－ＩＴＲ配列を容易に決定することができる。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ６、並びにトリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）及びウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ））由来のＩＴＲの配列比較を参照されたく、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６－４３９に記載され、他の血清型由来の左ＩＴＲに対するＡＡＶ２の左ＩＴＲの％同一性：ＡＡＶ－１（８４％）、ＡＡＶ－３（８６％）、ＡＡＶ－４（７９％）、ＡＡＶ－５（５８％）、ＡＡＶ－６（左ＩＴＲ）（１００％）、及びＡＡＶ－６（右ＩＴＲ）（８２％）を示す。
Ａ．対称ＩＴＲ対
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称又は実質的に対称であり、すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称の三次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、又は三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、Ｂ－Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、又は実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。代替的な実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応する又は同じ対称の三次元形状を有し得る。
（ｉ）野生型ＩＴＲ
いくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、又は実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ－ＩＴＲ）である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。
したがって、本明細書で開示されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの隣接する野生型逆位末端反復（ＷＴ－ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた導入遺伝子又は異種核酸配列を含有し、互いに逆相補（逆位）であるか、又は代替的に互いに実質的に対称である。すなわち、ＷＴ－ＩＴＲ対は、対称の三次元空間構成を有する。いくつかの実施形態では、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＷＴ－ＩＴＲ）は、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；例えば、ＡＡＶ２の５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’、配列番号６０）及び機能的末端分離部位（ＴＲＳ；例えば、５’－ＡＧＴＴ－３’（配列番号６２）を含む。
一態様では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つのＷＴ逆位末端反復配列（ＷＴ－ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ ＷＴ－ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ－ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ－ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称の三次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し、３’ＷＴ－ＩＴＲは、同じ又は異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲは、互いの鏡像であり、すなわち、それらは対称である。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型に由来する。
ＷＴ ＩＴＲは周知である。一実施形態では、２つのＩＴＲは、同じＡＡＶ２血清型に由来する。ある特定の実施形態では、他の血清型からのＷＴを使用することができる。相同であるいくつかの血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８がある。一実施形態では、密接に相同なＩＴＲ（例えば、類似のループ構造を有するＩＴＲ）を使用することができる。別の実施形態では、より多様なＡＡＶ ＷＴ ＩＴＲ、例えばＡＡＶ２及びＡＡＶ５を使用することができ、更に別の実施形態では、実質的にＷＴであるＩＴＲを使用することができる、すなわち、それはＷＴの基本ループ構造を有するが、特性を変更しないか又は影響しないいくつかの保存的ヌクレオチド変化を有する。同じウイルス血清型に由来するＷＴ－ＩＴＲを使用する場合、１つ以上の調節配列を更に使用することができる。ある特定の実施形態では、調節配列は、ｃｅＤＮＡの活性、例えば、コードされたＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現の調整を可能にする調節スイッチである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターに関し、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの野生型逆位末端反復配列（ＷＴ－ＩＴＲ）の間に作動可能に位置付けられたＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、ＷＴ－ＩＴＲは、同じ血清型、異なる血清型に由来し得るか、又は互いに対して実質的に対称であり得る（すなわち、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるように対称の三次元空間構成を有するか、又は三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループを有する）。いくつかの実施形態では、対称ＷＴ－ＩＴＲは、機能的末端分離部位及びＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシドにはない。
いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲは同じであるが、互いの逆相補体である。例えば、５’ＩＴＲの配列ＡＡＣＧは、対応する部位の３’ＩＴＲのＣＧＴＴ（すなわち、逆相補体）であり得る。一実施例では、５’ＷＴ－ＩＴＲセンス鎖は、ＡＴＣＧＡＴＣＧの配列を含み、対応する３’ＷＴ－ＩＴＲセンス鎖は、ＣＧＡＴＣＧＡＴ（すなわち、ＡＴＣＧＡＴＣＧの逆相補体）を含む。いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ ｃｅＤＮＡは、末端分離部位及び複製タンパク質結合部位（replication protein binding site、ＲＰＳ）（複製タンパク質結合部位と呼ばれることもある）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を更に含む。
ＷＴ－ＩＴＲを含むＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的なＷＴ－ＩＴＲ配列は、ＷＴ－ＩＴＲの対（５’ＷＴ－ＩＴＲ及び３’ＷＴ－ＩＴＲ）を示す本明細書の表３に示されている。
例示的な実施例として、本開示は、調節スイッチの有無にかかわらず、導入遺伝子（例えば、異種核酸配列）に作動可能に連結されたプロモーターを含むＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを提供し、ｃｅＤＮＡはカプシドタンパク質を欠き、（ａ）ＷＴ－ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡ－プラスミド（例えば、図１Ｆ～図１Ｇを参照されたい）から産生され、各ＷＴ－ＩＴＲは、そのヘアピン二次構成で同じ数の分子内二重化塩基対を有し（好ましくはこれらの参照配列と比較して、この構成のいかなるＡＡＡ又はＴＴＴ末端ループの欠失も除外する）、及び（ｂ）実施例１の未変性ゲル及び変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの特定のためのアッセイを使用してｃｅＤＮＡとして特定される。
いくつかの実施形態では、隣接するＷＴ－ＩＴＲは、互いに実質的に対称である。この実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲが同一の逆相補体ではないように、５’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶの１つの血清型に由来し、３’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶの異なる血清型に由来し得る。例えば、５’ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、３’ＷＴ－ＩＴＲは、異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２）に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、又は昆虫ＡＡＶのうちのいずれかから選択される２つの異なるパルボウイルスから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ ＩＴＲのそのような組み合わせは、ＡＡＶ２及びＡＡＶ６からのＷＴ－ＩＴＲの組み合わせである。一実施形態では、実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲは、一方が他方のＩＴＲに対して反転されたときに、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％、及びその間の全てのポイントであり、同じ対称の三次元空間構成を有する。いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ対は、それらが対称の三次元空間構成を有する（例えば、Ａ、Ｃ－Ｃ’。Ｂ－Ｂ’、及びＤアームの同じ三次元構成を有する）ため、実質的に対称である。一実施形態では、実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲ対は、他方に対して反転され、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％、及びその間の全てのポイントであり、一方のＷＴ－ＩＴＲは、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端分離部位（ｔｒｓ）を保持する。いくつかの実施形態では、実質的に対称のＷＴ－ＩＴＲ対は、互いに対して反転され、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％、及びその間の全てのポイントであり、一方のＷＴ－ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）及び末端分離部位（ｔｒｓ）を保持する。相同性は、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）、デフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなど、当該技術分野で周知の標準的な手段によって決定することができる。
いくつかの実施形態では、ＩＴＲの構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８又はＲｅｐ６８）との機能的相互作用に関与する任意の構造エレメントであり得る。ある特定の実施形態では、構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質との相互作用に対する選択性を提供する。すなわち、少なくとも部分的に、どのＲｅｐタンパク質がＩＴＲと機能的に相互作用するかを判定する。他の実施形態では、構造エレメントは、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに結合されたとき、大きなＲｅｐタンパク質と物理的に相互作用する。各構造エレメントは、例えば、ＩＴＲの二次構造、ＩＴＲのヌクレオチド配列、２つ以上のエレメント間の空間、又は上記のうちのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、構造エレメントは、Ａ及びＡ’アーム、Ｂ及びＢ’アーム、Ｃ及びＣ’アーム、Ｄアーム、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＥ）及びＲＢＥ’（すなわち、相補的ＲＢＥ配列）、並びに末端分離部位（ｔｒｓ）からなる群から選択される。
単なる例として、表２は、ＷＴ－ＩＴＲの例示的な組み合わせを示す。
表２：同じ血清型若しくは異なる血清型、又は異なるパルボウイルスからのＷＴ－ＩＴＲの例示的な組み合わせ。示されている順序は、ＩＴＲ位置を示すものではなく、例えば、「ＡＡＶ１、ＡＡＶ２」は、ｃｅＤＮＡが５’位置にＷＴ－ＡＡＶ１ＩＴＲ及び３’位置にＷＴ－ＡＡＶ２ＩＴＲ、又はその逆、５’位置にＷＴ－ＡＡＶ２ＩＴＲ及び３’位置にＷＴ－ＡＡＶ１ＩＴＲを含み得ることを明示する。略称：ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、又はＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノム（例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１）、温血動物由来のＩＴＲ（トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、及びヒツジＡＡＶ）、Ｂ１９パルボウイルス由来のＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ０００８８３）、マウス由来微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウ：ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１７０１）、ヘビ：ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）。
Figure 2024511026000036
Figure 2024511026000037
Figure 2024511026000038
Figure 2024511026000039
単なる例として、表３は、いくつかの異なるＡＡＶ血清型からの例示的なＷＴ－ＩＴＲの配列を示す。
Figure 2024511026000040
いくつかの実施形態では、ＷＴ－ＩＴＲ配列のヌクレオチド配列は、（例えば、１、２、３、４若しくは５個以上のヌクレオチド又はその中の任意の範囲を修飾することにより）修飾され得、それにより修飾は、相補的ヌクレオチドの置換、例えば、Ｃの場合はＧ、及びその逆、Ａの場合はＴ、及びその逆である。
ある特定の実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、配列番号１、２、５～１４のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列からなるＷＴ－ＩＴＲを有さない。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターが、配列番号１、２、５～１４のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含むＷＴ－ＩＴＲを有する場合、隣接するＩＴＲもＷＴであり、ｃｅＤＮＡは、例えば、本明細書及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に開示されているように、調節スイッチを含む（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表１１を参照）。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される調節スイッチ、及び配列番号１、２、５～１４からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択されたＷＴ－ＩＴＲを含む。
本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、作動可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、及びＲＢＥ’部分を保持するＷＴ－ＩＴＲ構造を含み得る。例示の目的で野生型ＩＴＲを使用する図２Ａ及び図２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の作動のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２の場合５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０））及び末端分離部位（ＴＲＳ；５’－ＡＧＴＴ（配列番号６２））を含む１つ以上の機能的ＷＴ－ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＷＴ－ＩＴＲは、機能的である。ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターが互いに実質的に対称である２つのＷＴ－ＩＴＲを含む代替的な実施形態では、少なくとも１つのＷＴ－ＩＴＲが機能的であり、少なくとも１つのＷＴ－ＩＴＲが非機能的である。
Ｂ．非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターの一般的な修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）
本明細書で論じられるように、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対称ＩＴＲ対又は非対称ＩＴＲ対を含み得る。どちらの場合も、一方又は両方のＩＴＲは修飾型ＩＴＲであり得、その違いは、第１の場合（すなわち、対称ｍｏｄ－ＩＴＲ）では、ｍｏｄ－ＩＴＲは、同じ三次元空間構成を有する（すなわち、同じＡ－Ａ’、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’アーム構成を有する）が、第２の場合（すなわち、非対称ｍｏｄ－ＩＴＲ）では、ｍｏｄ－ＩＴＲは、異なる三次元空間構成を有する（すなわち、Ａ－Ａ’、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’アームの異なる構成を有する）ことである。
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較して、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されるＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクター中のＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；例えば、ＡＡＶ２の場合５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’、配列番号６０）及び機能的末端分離部位（ＴＲＳ；例えば、５’－ＡＧＴＴ－３’（配列番号６２）を含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能的ＩＴＲである。一実施形態では、異なる又は修飾型ＩＴＲは各々、異なる血清型からの野生型ＩＴＲではない。
ＩＴＲの特定の変更及び変異が本明細書において詳細に説明されているが、ＩＴＲの文脈では、「変更型」又は「変異型」又は「修飾型」とは、ヌクレオチドが野生型、参照、又は元のＩＴＲ配列に対して挿入、欠失、及び／又は置換されたことを示す。変更型又は変異型ＩＴＲは、操作されたＩＴＲであり得る。本明細書で使用される場合、「操作された」とは、人間の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの態様、例えば、その配列が、人間の手によって操作され、それが天然に存在するときの態様とは異なるとき、「操作された」とみなされる。
いくつかの実施形態では、ｍｏｄ－ＩＴＲは、合成であり得る。一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づいている。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶベース配列を含まない。更に別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、又は全く有しない。いくつかの態様では、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐ又は特定血清型のＲｅｐと選好的に相互作用し得るか、又は場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、変異型Ｒｅｐによってのみ認識される。
当業者であれば、既知の手段によって他の血清型における対応する配列を判定することができる。例えば、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、又はＤ領域中に変化が存在するかどうかを判定し、別の血清型における対応する領域を判定する。ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）又は他の相同性アラインメントプログラムをデフォルト状態で使用して、対応する配列を判定することができる。本開示は、異なるＡＡＶ血清型の組み合わせからｍｏｄ－ＩＴＲを含む集団及び複数のｃｅＤＮＡベクターを更に提供する。すなわち、１つのｍｏｄ－ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他のｍｏｄ－ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。理論に束縛されるものではないが、一実施形態では、１つのＩＴＲは、ＡＡＶ２ＩＴＲ配列に由来し得るか、又はそれに基づき得、ｃｅＤＮＡベクターの他のＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、又はＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）の任意の１つ以上のＩＴＲ配列に由来し得るか、又はそれに基づき得る。
任意のパルボウイルスＩＴＲを、ＩＴＲとして、又は塩基ＩＴＲとして修飾に使用することができる。好ましくは、パルボウイルスは、ディペンドウイルスである。より好ましくは、ＡＡＶである。選択される血清型は、その血清型の組織向性に基づき得る。ＡＡＶ２は、広い組織向性を有し、ＡＡＶ１は、ニューロン及び骨格筋を選好的に標的し、ＡＡＶ５は、ニューロン、網膜色素上皮、及び光受容体を標的とする。ＡＡＶ６は、骨格筋及び肺を選好的に標的とする。ＡＡＶ８は、肝臓、骨格筋、心臓、及び膵臓組織を選好的に標的とする。ＡＡＶ９は、肝臓、骨格、及び肺組織を選好的に標的とする。一実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２ＩＴＲに基づいている。
より具体的には、構造エレメントが特定の大きなＲｅｐタンパク質と機能的に相互作用する能力は、構造エレメントを修飾することによって変更され得る。例えば、構造エレメントのヌクレオチド配列は、ＩＴＲの野生型配列と比較して修飾され得る。一実施形態では、ＩＴＲの構造エレメント（例えば、Ａアーム、Ａ’アーム、Ｂアーム、Ｂ’アーム、Ｃアーム、Ｃ’アーム、Ｄアーム、ＲＢＥ、ＲＢＥ’、及びｔｒｓ）を除去し、異なるパルボウイルスからの野生型構造エレメントと置き換えることができる。例えば、置換構造は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、又は昆虫ＡＡＶからのものであり得る。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ＩＴＲであり得、Ａ若しくはＡ’アーム又はＲＢＥは、ＡＡＶ５からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＩＴＲは、ＡＡＶ５ＩＴＲであり得、Ｃ又はＣ’アーム、ＲＢＥ、及びｔｒｓは、ＡＡＶ２からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ５ＩＴＲであり得、Ｂ及びＢ’アームは、ＡＡＶ２ＩＴＲ Ｂ及びＢ’アームで置き換えられる。
単なる例として、表４は、修飾型ＩＴＲの領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの例示的な修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を示し、Ｘは、対応する野生型ＩＴＲに対する、そのセクションにおける少なくとも１つの核酸の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を示す。いくつかの実施形態では、Ｃ及び／又はＣ’及び／又はＢ及び／又はＢ’の領域のうちのいずれかにおける少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。例えば、修飾が、単一アームＩＴＲ（例えば、単一Ｃ－Ｃ’アーム、若しくは単一Ｂ－Ｂ’アーム）、又は修飾型Ｃ－Ｂ’アーム若しくはＣ’－Ｂアーム、又は少なくとも１つの切断されたアーム（例えば、切断されたＣ－Ｃ’アーム及び／若しくは切断されたＢ－Ｂ’アーム）を有する２つのアームＩＴＲのうちのいずれかをもたらす場合、少なくとも単一アーム、又は２つのアームＩＴＲのアーム（１つのアームは切断され得る）のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。いくつかの実施形態では、切断されたＣ－Ｃ’アーム及び／又は切断されたＢ－Ｂ’アームは、末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を有する。
表４：ＩＴＲの異なるＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’領域又はアームに対する少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）の例示的な組み合わせ（Ｘは、ヌクレオチド修飾、例えば、領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、又は置換を示す）。
Figure 2024511026000041
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するためのｍｏｄ－ＩＴＲは、本明細書に開示される非対称ＩＴＲ対又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含み、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’とＣとの間、ＣとＣ’との間、Ｃ’とＢとの間、ＢとＢ’との間、及びＢ’とＡとの間から選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、Ｃ若しくはＣ’又はＢ若しくはＢ’領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、依然としてステム－ループの末端ループを保存する。いくつかの実施形態では、ＣとＣ’との間及び／又はＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。代替的な実施形態では、ＣとＣ’との間及び／又はＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ａヌクレオチド（すなわち、ＡＡＡ）を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’、Ａ、及び／又はＤから選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ領域における少なくとも１つの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）も含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ及び／又はＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表４に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＤ領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、及び／又は置換）を含み得る。
一実施形態では、構造エレメントのヌクレオチド配列を修飾して（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０以上のヌクレオチド、又はその中の任意の範囲）、修飾型構造エレメントを産生することができる。一実施形態では、ＩＴＲに対する特定の修飾が本明細書に例示されているか（例えば、配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、若しくは１６５～１８７）、又は２０１８年１２月６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図７Ａ～図７Ｂに示されている（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の配列番号９７～９８、１０１～１０３、１０５～１０８、１１１～１１２、１１７～１３４、５４５～５４）。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０以上のヌクレオチド、又はその中の任意の範囲を修飾することによって）修飾され得る。他の実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、若しくは１６５～１８７の修飾型ＩＴＲのうちの１つ、又は配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、若しくは１６５～１８７、又は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２～９（すなわち、配列番号１１０～１１２、１１５～１９０、２００～４６８）に示されている、Ａ－Ａ’アーム及びＣ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有セクションと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又はそれ以上の配列同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、例えば、特定アームの全部、例えば、Ａ－Ａ’アームの全部若しくは一部、又はＢ－Ｂ’アームの全部若しくは一部、又はＣ－Ｃ’アームの全部若しくは一部の除去又は欠失、又は代替的にステム（例えば、単一アーム）をキャップする最終ループが依然として存在する限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の塩基対の除去（例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図７ＡのＩＴＲ－２１を参照されたい）を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ－Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の塩基対の除去を含み得る（例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図３ＢのＩＴＲ－１又は図７ＡのＩＴＲ－４５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去、及びＢ－Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去を含み得る。塩基対の除去の任意の組み合わせが想起され、例えば、Ｃ－Ｃ’アームにおける６つの塩基対、及びＢ－Ｂ’アームにおける２つの塩基対が除去され得る。例示的な実施例として、図３Ｂは、修飾型ＩＴＲが、少なくとも１つのアーム（例えば、Ｃ－Ｃ’）が切断される２つのアームを含むように、Ｃ部分及びＣ’部分の各々から欠失された少なくとも７つの塩基対、Ｃ領域とＣ’領域との間のループ中のヌクレオチドの置換、並びにＢ領域及びＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を有する例示的な修飾型ＩＴＲを示す。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲはまた、Ｂ領域及びＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を含み、それによりＢ－Ｂ’アームもＷＴ ＩＴＲに対して切断される。
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１～５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０）ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長ＷＴ ＩＴＲ配列に対して１～３０ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して２～２０ヌクレオチド欠失を有する。
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＤＮＡ複製（例えば、Ｒｅｐタンパク質によるＲＢＥへの結合、若しくは末端分離部位でのニッキング）に干渉しないように、Ａ又はＡ’領域のＲＢＥ含有部分にいかなるヌクレオチド欠失も含まない。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のために包含される修飾型ＩＴＲは、本明細書に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、及び／又はＣ領域に１つ以上の欠失を有する。
いくつかの実施形態では、対称ＩＴＲ対又は非対称ＩＴＲ対を含むＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される調節スイッチ、及び配列番号３、４、１５～４７、１０１～１１６、又は１６５～１８７からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択された少なくとも１つの修飾型ＩＴＲを含む。
別の実施形態では、構造エレメントの構造は、修飾され得る。例えば、構造エレメントは、ステムの高さ及び／又はループ内のヌクレオチドの数の変化。例えば、ステムの高さは、約２、３、４、５、６、７、８、若しくは９ヌクレオチド以上、又はその中の任意の範囲であり得る。一実施形態では、ステムの高さは、約５ヌクレオチド～約９ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施形態では、ステム高さは、約７ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施例では、ステムの高さは、約３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０ヌクレオチド、又はそれ以上、又はその中の任意の範囲を有し得る。
別の実施形態では、ＲＢＥ又は伸長ＲＢＥ内のＧＡＧＹ結合部位又はＧＡＧＹ関連結合部位の数は、増加又は減少され得る。一実施例では、ＲＢＥ又は伸長ＲＢＥは、１、２、３、４、５、若しくは６以上のＧＡＧＹ結合部位、又はその中の任意の範囲を含み得る。各ＧＡＧＹ結合部位は、独立して、配列がＲｅｐタンパク質に結合するのに十分である限り、正確なＧＡＧＹ配列又はＧＡＧＹと同様の配列であり得る。
別の実施形態では、２つのエレメント（限定されないが、ＲＢＥ及びヘアピンなど）の間の空間を変更して（例えば、増加又は減少）、大きなＲｅｐタンパク質との機能的相互作用を変更することができる。例えば、空間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、若しくは２１ヌクレオチド以上、又はその中の任意の範囲であり得る。
本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２ＩＴＲ構造に関して修飾されるＩＴＲ構造を含み得るが、依然として作動可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、及びＲＢＥ’部分を保持する。図２Ａ及び図２Ｂは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２の場合５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０））及び末端分離部位（ＴＲＳ；５’－ＡＧＴＴ（配列番号６２））を含む１つ以上の機能的ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲ（野生型又は修飾型ＩＴＲ）は、機能的である。ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターが、互いに異なるか、又は非対称である２つの修飾型ＩＴＲを含む代替的な実施形態では、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、機能的であり、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、非機能的である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左又は右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断型アーム、又はスペーサー内に修飾を有する。ループアーム、切断型アーム、又はスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表２（すなわち、配列番号１３５～１９０、２００～２３３）、表３（例えば、配列番号２３４～２６３）、表４（例えば、配列番号２６４～２９３）、表５（例えば、本明細書の配列番号２９４～３１８）、表６（例えば、配列番号３１９～４６８）、及び表７～９（例えば、配列番号１０１～１１０、１１１～１１２、１１５～１３４）、又は表１０Ａ若しくは１０Ｂ（例えば、配列番号９、１００、４６９～４８３、４８４～４９９）に列挙されている。
いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含むＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための修飾型ＩＴＲは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２、３、４、５、６、７、８、９、及び１０Ａ～１０Ｂに示されるもののうちのいずれか、又はそれらの組み合わせから選択される。
上記のクラスの各々に非対称ＩＴＲ対又は対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対を含むＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するための追加の例示的な修飾型ＩＴＲを表５Ａ及び５Ｂに示す。表５Ａの右修飾型ＩＴＲの予測二次構造は、２０１８年１２月６日に出願された国際出願ＰＴＣ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図７Ａに示されており、表５Ｂの左修飾型ＩＴＲの予測二次構造は、２０１８年１２月６日に出願された国際出願ＰＴＣ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の図７Ｂに示されている。
表５Ａ及び表５Ｂは、例示的な右及び左修飾型ＩＴＲを示す。
表５Ａ：例示的な修飾型右ＩＴＲ。これらの例示的な修飾型ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０）、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号６９）、スペーサー補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号７０）、及びＲＢＥ’（すなわち、ＲＢＥの相補体）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号７１）を含み得る。
Figure 2024511026000042
表５Ｂ：例示的な修飾型左ＩＴＲ。これらの例示的な修飾型左ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０）、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号６９）、スペーサー相補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号７０）、及びＲＢＥ相補体（ＲＢＥ’）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号７１）を含み得る。
Figure 2024511026000043
一実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、目的のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、及び第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）及び第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに非対称である、すなわち、それらは互いに異なる三次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得るか、又はその逆であり、第１のＩＴＲは、変異型又は修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲ及び第２のＩＴＲは、両方ともｍｏｄ－ＩＴＲであるが、異なる配列を有するか、又は異なる修飾を有し、したがって同じ修飾型ＩＴＲではなく、異なる三次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ－ＩＴＲに対する１つのＩＴＲにおける任意の変化が他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを含むか、代替的には、非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合、互いに対して異なる配列及び異なる三次元形状を有し得る。ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクター中の、ｃｅＤＮＡ－プラスミドを生成するために使用するための例示的な非対称ＩＴＲは、表５Ａ及び図５Ｂに示されている。
代替的な実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、２つの対称的なｍｏｄ－ＩＴＲを含む。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ配列を有するが、互いの逆相補体（逆位）である。いくつかの実施形態では、対称ｍｏｄ－ＩＴＲ対は、同じＡＡＶ血清型からの野生型ＩＴＲ配列と比較して、欠失、挿入、又は置換の少なくとも１つ又は任意の組み合わせを含む。対称ＩＴＲの付加、欠失、又は置換は同じであるが、互いの逆相補体である。例えば、５’ＩＴＲのＣ領域への３ヌクレオチドの挿入は、３’ＩＴＲのＣ’領域の対応するセクションへの３つの逆相補ヌクレオチドの挿入に反映される。単に説明の目的でのみ、付加が５’ＩＴＲのＡＡＣＧである場合、付加は、対応する部位における３’ＩＴＲのＣＧＴＴである。例えば、５’ＩＴＲセンス鎖がＡＴＣＧＡＴＣＧであり、ＧとＡとの間にＡＡＣＧの付加を伴う場合、配列ＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧ（配列番号５１）がもたらされる。対応する３’ＩＴＲセンス鎖は、ＣＧＡＴＣＧＡＴ（ＡＴＣＧＡＴＣＧの逆相補体）であり、ＴとＣとの間にＣＧＴＴ（すなわち、ＡＡＣＧの逆相補体）の付加を伴い、配列ＣＧＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴ（配列番号４９）（ＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧの逆相補体）（配列番号５１）をもたらす。
代替的な実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応する又は同じ対称の三次元形状を有し得る。例えば、１つの修飾型ＩＴＲは、１つの血清型に由来し得、他の修飾型ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得るが、それらは同じ領域において同じ変異（例えば、ヌクレオチド挿入、欠失、又は置換）を有する。言い換えると、単なる説明の目的で、５’ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、Ｃ領域に欠失を有し、３’ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＡＡＶ５に由来し得、Ｃ’領域に対応する欠失を有する。５’ｍｏｄ－ＩＴＲ及び３’ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ又は対称な三次元空間構成を有することを条件として、それらは本明細書における修飾型ＩＴＲ対としての使用に包含される。
いくつかの実施形態では、実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対は、三次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’及びＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡ及びＢ－Ｂ’ループの同様の三次元構造を有する。単なる例として、実質的に対称のＩＴＲは、それらの構造が幾何学的空間において同じ形状であるように、対称空間構成を有し得る。これは、例えば、Ｇ－Ｃ対が、例えばＣ－Ｇ対に、若しくはその逆に修飾されたとき、又はＡ－Ｔ対がＴ－Ａ対に、若しくはその逆に修飾されたときに起こり得る。したがって、上記の例示的な例であるＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧ（配列番号５１）としての修飾型５’ＩＴＲ、及びＣＧＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴ（配列番号４９）としての修飾型３’ＩＴＲ（すなわち、ＡＴＣＧＡＡＣＧＡＴＣＧ（配列番号５１）の逆相補体）を使用して、これらの修飾型ＩＴＲは、例えば、５’ＩＴＲがＡＴＣＧＡＡＣＣＡＴＣＧ（配列番号５０）の配列を有する場合、依然として対称であろう（ここで、付加におけるＧが、Ｃに修飾され、実質的に対称な３’ＩＴＲが、ＣＧＡＴＣＧＴＴＣＧＡＴ（配列番号４９）の配列を有し、ａに加えてＴの対応する修飾がない）。いくつかの実施形態では、そのような修飾型ＩＴＲ対は、修飾型ＩＴＲ対が対称な立体化学を有するので、実質的に対称である。
表６は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで使用するための、例示的な対称修飾型ＩＴＲ対（すなわち、左修飾型ＩＴＲ及び対称右修飾型ＩＴＲ）を示す。配列の太字（赤）部分は、図３１Ａ～図４６Ｂにも示される、部分的なＩＴＲ配列（すなわち、Ａ－Ａ’、Ｃ－Ｃ’、及びＢ－Ｂ’ループの配列）を特定する。これらの例示的な修飾型ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号６０）、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号６９）、スペーサー補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号７０）、及びＲＢＥ’（すなわち、ＲＢＥの相補体）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号７１）を含み得る。
Figure 2024511026000044
Figure 2024511026000045
Figure 2024511026000046
いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対を含むＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の表９Ａ～９Ｂのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列若しくはＩＴＲ部分配列、あるいは２０１８年１２月６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号（その全体が本明細書に組み込まれる）の図７Ａ～図７Ｂに示されているか、又は２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０Ａ～１０Ｂに開示されている配列における修飾のうちのいずれかに対応する修飾を有するＩＴＲを含み得る。
Ｖ．例示的なｃｅＤＮＡベクター
上記のように、本開示は、組換えｃｅＤＮＡ発現ベクター、及び上記の非対称のＩＴＲ対、対称のＩＴＲ対、又は実質的に対称のＩＴＲ対のうちのいずれか１つを含むＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、隣接するＩＴＲ配列及び導入遺伝子を有するＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のための組換えｃｅＤＮＡベクターに関し、ＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、又は実質的に対称であり、ｃｅＤＮＡは、隣接するＩＴＲの間に位置する目的のヌクレオチド配列（例えば、導入遺伝子の核酸を含む発現カセット）を更に含み、当該核酸分子は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡ発現ベクターは、少なくとも１つのＩＴＲが変更されている場合、本明細書に記載されるヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができる任意のｃｅＤＮＡベクターであってもよい。本開示のＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターが導入される宿主細胞と適合性がある。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、直鎖状であってもよい。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、染色体外実体として存在し得る。ある特定の実施形態では、本開示のｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞のゲノムへのドナー配列の組み込みを可能にするエレメントを含有し得る。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」及び「異種ヌクレオチド配列」は同義であり、本明細書に記載されるように、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする。
ここで図１Ａ～図１Ｇを参照すると、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを作製するのに有用な２つの非限定的プラスミドの機能的構成成分の概略図が示されている。図１Ａ、図１Ｂ、図１Ｄ、及び図１Ｆは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの構築物又は対応するｃｅＤＮＡプラスミドの配列を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを含まず、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセット、及び第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから取得することができ、第１及び第２のＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、又は実質的に対称である。ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを含まず、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子（タンパク質又は核酸）、及び第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから取得することができ、第１及び第２のＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、又は実質的に対称である。いくつかの実施形態では、発現可能な導入遺伝子カセットは、必要に応じて、エンハンサー／プロモーター、１つ以上の相同性アーム、ドナー配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ、例えば、配列番号６７））、並びにポリアデニル化及び終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ、例えば、配列番号６８）を含む。
図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルである。ｃｅＤＮＡは、上記の図４Ａに関して、及び実施例で論じられるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。
Ａ．調節エレメント。
本明細書で定義される非対称のＩＴＲ対又は対称のＩＴＲ対を含む、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせを更に含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織及び細胞型特異的プロモーター、並びにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なプロモーターは、表７に列挙される。例示的なエンハンサーは、表８Ａ～８Ｃに列挙される。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子、例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、又はそのＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。本開示で使用され得る調節スイッチを含む調節エレメントは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号においてより完全に論じられている。
実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、調節配列、及びヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子調節配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、調節配列は、宿主細胞におけるヌクレアーゼの発現を制御するのに適している。ある特定の実施形態では、調節配列は、本開示のヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列などのプロモーター配列に作動可能に連結された遺伝子の転写を指示することができる、好適なプロモーター配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されたイントロン配列を含む。ある特定の実施形態では、エンハンサー配列がプロモーターの上流に提供されて、プロモーターの効力を増大させる。ある特定の実施形態では、調節配列は、エンハンサー及びプロモーターを含み、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列を含み、イントロンは、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含み、プロモーターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
合成的に（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１４１２２号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）又は本明細書において実施例に記載されるような細胞ベースの産生方法を使用して産生されたＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号６７）及びＢＧＨポリＡ（配列番号６８）などのシス調節エレメントの特定の組み合わせを更に含み得る。発現構築物における使用のための好適な発現カセットは、ウイルスカプシドによって課されるパッケージング制約によって制限されない。
（ｉ）．プロモーター：
当業者は、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで使用されるプロモーターが、それらが促進する特定の配列に対して適切に調整されるべきであることを理解するであろう。ｃｅＤＮＡベクターにおいて有用な導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質）に作動可能に連結された例示的なプロモーターは、本明細書の表７に開示されている。
Figure 2024511026000047
Figure 2024511026000048
Figure 2024511026000049
Figure 2024511026000050
Figure 2024511026000051
Figure 2024511026000052
Figure 2024511026000053
Figure 2024511026000054
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Figure 2024511026000056
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Figure 2024511026000059
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Figure 2024511026000066
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Figure 2024511026000069
Figure 2024511026000070
Figure 2024511026000071
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Figure 2024511026000074
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Figure 2024511026000078
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Figure 2024511026000083
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Figure 2024511026000086
Figure 2024511026000087
Figure 2024511026000088
Figure 2024511026000089
Figure 2024511026000090
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Figure 2024511026000104
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Figure 2024511026000110
Figure 2024511026000111
Figure 2024511026000112
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの発現カセットは、全体発現レベルとともに細胞特異性に影響を及ぼし得るプロモーター、例えば表７から選択されるプロモーターのうちのいずれかを含み得る。導入遺伝子発現、例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現の場合、それらは、非常に活発なウイルス由来の最初期プロモーターを含み得る。発現カセットは、導入遺伝子発現を特定の細胞型に制限し、無秩序な異所性発現から生じる毒性効果及び免疫応答を低減するために組織特異的真核生物プロモーターを含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、ＣＡＧプロモーター（配列番号７２）などのプロモーター又は合成調節エレメントを含み得る。ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（cytomegalovirus、ＣＭＶ）早期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエクソン及び第１のイントロン、並びに（ｉｉｉ）ウサギβ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替的に、発現カセットは、α－１－抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター（配列番号７３若しくは配列番号７４）、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモーター（配列番号７５若しくは配列番号７６）、又はヒト伸長因子－１α（ＥＦ１ａ）プロモーター（例えば、配列番号７７若しくは配列番号７８）を含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを有する）、又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを有する、例えば、配列番号７９）を含む。代替的に、誘導性プロモーター、導入遺伝子の未変性プロモーター、組織特異的プロモーター、又は当該技術分野において既知の様々なプロモーターを使用することができる。
表７に記載のもの及び上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、又はそれらは、原核生物又は真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルスの長い末端反復配列（long terminal repeat、ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（adenovirus majorlate promoter、Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus、ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、配列番号８０）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０，４９７－５００（２００２））、増強されたＵ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３年９月１日；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（例えば、配列番号８１又は配列番号１５５）、ＣＡＧプロモーター、ヒトα１－アンチトリプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号８２）などが挙げられる。ある特定の実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更され、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。
一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療用タンパク質をコードする遺伝子のネイティブプロモーターである。治療用タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーター及び他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、ＳＶ４０エンハンサー（配列番号１２６）を含むエンハンサー（例えば、配列番号７９及び配列番号８３）を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、ヒトユビキチンＣ（humanubiquitin C、ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、又はヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然又は合成の、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ヒトα１－抗トリプシン（ＨＡＡＴ）であり得る。一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（low-densitylipoprotein、ＬＤＬ）受容体を介して、肝細胞へのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的を使用して達成され得る。
本開示に従う使用のための好適なプロモーターの非限定的な例としては、表７に列挙されたプロモーターのうちのいずれか、又は例えば、ＣＡＧプロモーター（配列番号７２）、ＨＡＡＴプロモーター（配列番号８２）、ヒトＥＦ１－αプロモーター（配列番号７７）、又はＥＦ１ａプロモーター（配列番号７８）、ＩＥ２プロモーター（例えば、配列番号８４）、及びラットＥＦ１－αプロモーター（配列番号８５）、ｍＥＦ１プロモーター（配列番号５９）、若しくは１Ｅ１プロモーター断片（配列番号１２５）のうちのいずれかが挙げられる。
（ｉｉ）エンハンサー
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡは、１つ以上のエンハンサーを含む。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、プロモーター配列の５’に位置する。いくつかの実施形態では、エンハンサー配列は、プロモーター配列の３’に位置する。例示的なエンハンサーは、本明細書の表８Ａ～８Ｃに列挙される。
Figure 2024511026000113
Figure 2024511026000114
Figure 2024511026000115
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Figure 2024511026000128
Figure 2024511026000129
（ｉｉｉ）例示的な５’ＵＴＲ配列及びイントロン配列
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’ＵＴＲ配列及び／又は５’ＩＴＲ配列の３’に位置するイントロン配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、導入遺伝子、例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする配列の５’に位置する。表９Ａに列挙される例示的な５’ＵＴＲ配列。
Figure 2024511026000130
Figure 2024511026000131
Figure 2024511026000132
Figure 2024511026000133
（ｉｖ）３’ＵＴＲ配列
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、３’ＩＴＲ配列の５’に位置する３’ＵＴＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、導入遺伝子、例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする配列の３’に位置する。表９Ｂに列挙される例示的な３’ＵＴＲ配列。
Figure 2024511026000134
Figure 2024511026000135
Figure 2024511026000136
（ｖ）．ポリアデニル化配列：
ポリアデニル化配列をコードする配列は、ｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、及び核輸送及び翻訳を助けるために、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、又はそれ以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約４０～５５ヌクレオチド、約４５～５０ヌクレオチド、約３５～５０ヌクレオチド、又はその間の任意の範囲を含む。
発現カセットは、当技術分野で既知の任意のポリアデニル化配列又はその変形を含むことができる。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化（ポリＡ）配列は、表１０に列挙されたもののいずれかから選択される。当該技術分野で一般的に知られている他のポリＡ配列も使用することができ、例えば、ウシＢＧＨｐＡ（例えば、配列番号６８）又はウイルスＳＶ４０ｐＡ（例えば、配列番号８６）から単離された天然に存在する配列、又は合成配列（例えば、配列番号８７）を含むが、これらに限定されない。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（upstream enhancer、ＵＳＥ）配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＳＥ配列は、ＳＶ４０ｐＡ又は異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。ポリＡ配列は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする導入遺伝子の３’に位置する。
発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号６７）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルス又はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ－０２及びＶＫ－Ａ２６配列、例えば、配列番号８８及び配列番号８９に連結され得る。
Figure 2024511026000137
Figure 2024511026000138
（ｖｉ）．核局在化配列
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上の核局在化配列（nuclear localization sequence、ＮＬＳ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、アミノ末端又はその近く、カルボキシ末端又はその近く、又はこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳ及び／又はカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）に位置する。複数のＮＬＳが存在する場合、各々を他のＮＬＳから独立して選択することができ、それにより、単一のＮＬＳが複数のコピーに、及び／又は１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在する。ＮＬＳの非限定的な例を表１１に示す。
Figure 2024511026000139
Ｂ．ｃｅＤＮＡベクターの追加の構成成分
本開示のＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子発現のための他の構成成分をコードするヌクレオチドを含有し得る。例えば、特定の遺伝子標的事象を選択するには、保護ｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡに埋め込み、アルブミン遺伝子座などの高活性遺伝子座に部位特異的に統合するように設計された組換えｃｅＤＮＡベクターに挿入することができる。そのような実施形態は、Ｎｙｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｇｅｎｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｕｎｅ ８，２０１６に記載されているような任意の遺伝的背景における遺伝子修飾肝細胞のインビボ選択及び拡大のための系を提供し得る。本開示のｃｅＤＮＡベクターは、形質転換、トランスフェクト、形質導入などされた細胞の選択を可能にする１つ以上の選択可能なマーカーを含み得る。選択可能なマーカーは、その産物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性、ＮｅｏＲなどを提供する遺伝子である。ある特定の実施形態では、正の選択マーカーが、ＮｅｏＲなどのドナー配列に組み込まれる。負の選択マーカーは、ドナー配列の下流に組み込むことができ、例えば、負の選択マーカーをコードする核酸配列ＨＳＶ－ｔｋを、ドナー配列の下流の核酸構築物に組み込むことができる。
Ｃ．調節スイッチ
分子調節スイッチは、シグナルに応答して、状態の測定可能な変化を生成するものである。そのような調節スイッチは、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターと有用に組み合わせて、ｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現の出力を制御することができる。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を微調整するのに役立つ調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターにおけるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を制御可能かつ調節可能な様式で開始又は停止（すなわち、シャットダウン）するように設計された「オン／オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターでの使用に含まれる例示的な調節スイッチは、導入遺伝子の発現を調節するために使用することができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号においてより完全に論じられている。
（ｉ）バイナリ調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲの間に位置する発現カセットは、追加的に、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された調節領域、例えば、プロモーター、シスエレメント、リプレッサー、エンハンサーなどを含み得、この調節領域は、１つ以上の共因子又は外因性薬剤によって調節される。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチ又は誘導性若しくは抑制性プロモーターによって調節され得る。誘導性プロモーターの非限定的な例は、ホルモン誘導性又は金属誘導性プロモーターである。他の例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
（ｉｉ）小分子調節スイッチ
様々な当該技術分野において既知の小分子ベース調節スイッチは、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターと組み合わせて、調節スイッチによって制御されるｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０（２０１０）：１５に開示されている作動可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモーターとともに直交性リガンド／核受容体対、例えば、レチノイド受容体バリアント／ＬＧ３３５及びＧＲＱＣＩＭＦＩ、操作されたステロイド受容体（例えば、プロゲステロンに結合できないが、ＲＵ４８６（ミフェプリストン）に結合するＣ末端切断を有する修飾プロゲステロン受容体（米国特許第５，３６４，７９１号）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａからのエクジソン受容体及びそれらのエクジステロイドリガンド（Ｓａｅｚ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７（２６）（２０００），１４５１２－１４５１７、又はＳａｎｄｏ Ｒ ３ｒｄ；Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３，１０（１１）：１０８５－８に開示されるような抗生物質トリメトプリム（ＴＭＰ）のうちのいずれか１つ、又は組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第８，７７１，６７９号及び同第６，３３９，０７０号に開示されるものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。
（ｉｉｉ）「パスコード」調節スイッチ
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」又は「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能にする。すなわち、導入遺伝子の発現及び／又は抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件Ａ及びＢが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも２、又は少なくとも３、又は少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６、又は少なくとも７つ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの条件（例えば、Ａ、Ｂ条件）が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも３つの条件が起こる必要がある（例えば、Ａ、Ｂ、及びＣ又はＡ、Ｂ、及びＤ）。単なる例として、パスコード「ＡＢＣ」調節スイッチを有するｃｅＤＮＡからの遺伝子発現が起こるためには、条件Ａ、Ｂ、及びＣが存在しなければならない。条件Ａ、Ｂ、及びＣは、以下の通りであり得る：条件Ａは、病態又は疾患の存在であり、条件Ｂは、ホルモン応答であり、条件Ｃは、導入遺伝子の発現に対する応答である。例えば、導入遺伝子が欠陥ＥＰＯ遺伝子を編集する場合、条件Ａは、慢性腎疾患（Chronic Kidney Disease、ＣＫＤ）の存在であり、条件Ｂは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合に起こり、条件Ｃは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞（Erythropoietin-producingcell、ＥＰＣ）動員が不全であるか、又は代替的に、ＨＩＦ－２活性化が不全である。一旦酸素レベルが増加するか、又は所望のＥＰＯレベルに達すると、導入遺伝子は、３つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために包含されるパスコード調節スイッチ又は「パスコード回路」は、生物学的封じ込め条件を定義するために使用される環境シグナルの範囲及び複雑性を拡張するために、ハイブリッド転写因子（ＴＦ）を含む。既定条件の存在下で細胞死を誘起するデッドマンスイッチとは対照的に、「パスコード回路」は、特定の「パスコード」の存在下での細胞生存又は導入遺伝子発現を可能にし、所定の環境条件又はパスコードが存在する場合にのみ導入遺伝子発現及び／又は細胞生存を可能にするように容易に再プログラムされ得る。
本明細書に開示される調節スイッチ、例えば、小分子スイッチ、核酸ベーススイッチ、小分子－核酸ハイブリッドスイッチ、転写後導入遺伝子調節スイッチ、翻訳後調節放射線制御スイッチ、低酸素媒介性スイッチ、及び本明細書に開示される当業者に既知の他の調節スイッチのうちのいずれか及び全ての組み合わせを、本明細書に開示されるパスコード調節スイッチにおいて使用することができる。使用のために包含される調節スイッチはまた、レビュー論文Ｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．１２：２０１４１０００（２０１５）において考察され、Ｋｉｓの表１に要約される。１２：２０１４１０００（２０１５）に記載されており、Ｋｉｓの表１にまとめられている。いくつかの実施形態では、パスコード系で使用するための調節スイッチは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表１１に開示されるスイッチのうちのいずれか又はそれらの組み合わせから選択することができる。
（ｉｖ）．導入遺伝子発現を制御するための核酸系調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡによってＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を制御するための調節スイッチは、核酸ベース制御機序に基づく。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、米国特許出願公開第２００９／０３０５２５３号、同第２００８／０２６９２５８号、同第２０１７／０２０４４７７号、国際公開第２０１８／０２６７６２（Ａ１）号、米国特許第９，２２２，０９３号、及び欧州特許出願第２８８０７１号に開示されるもの、また、Ｖｉｌｌａ ＪＫ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ．２０１８ Ｍａｙ；６（３）によるレビューに開示されているものなどが挙げられる。国際公開第２０１８／０７５４８６号及び同第２０１７／１４７５８５号に開示されるものなどの、代謝物応答性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ）による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子の一部に対して相補的であるＲＮＡｉ分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質）がｃｅＤＮＡベクターによって発現されたとしてもそのようなＲＮＡｉが発現される場合、相補的ＲＮＡｉ分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がｃｅＤＮＡベクターによって発現されたときにＲＮＡｉが発現されない場合、導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質）は、ＲＮＡｉによってサイレンシングされない。
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許出願公開第２００２／００２２０１８号に開示される組織特異的自己不活化調節スイッチであり、これにより調節スイッチは、そうでなければ導入遺伝子発現が不利益となり得る部位において、導入遺伝子（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質）を意図的にスイッチオフする。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１２７１６２号及び米国特許第８，３２４，４３６号に開示されるリコンビナーゼ可逆的遺伝子発現系である。
（ｖ）．転写後及び翻訳後調節スイッチ。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによってＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を制御するための調節スイッチは、転写後修飾系である。例えば、そのような調節スイッチは、米国特許出願公開第２０１８／０１１９１５６号、ＧＢ２０１１／０７７６８、国際公開第２００１／０６４９５６（Ａ３）号、欧州特許第２７０７４８７号、及びＢｅｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，４（５），ｐｐ５２６－５３４；Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１６ Ｎｏｖ ２；５．ｐｉｉ：ｅ１８８５８に開示されているように、テトラサイクリン又はテオフィリンに感受性のあるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、及びリガンド感受性（オフスイッチ）アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性ｓｉＲＮＡの両方をコードすることができると想定される。
（ｖｉ）．他の例示的な調節スイッチ
任意の既知の調節スイッチをｃｅＤＮＡベクター中で使用して、環境変化によってトリガーされるものを含む、ｃｅＤＮＡベクターによってＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を制御することができる。更なる例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ８；１００５１（２０１８）のＢＯＣ法、遺伝暗号の拡大及び非生理的アミノ酸、放射線制御又は超音波制御オン／オフスイッチ（例えば、Ｓｃｏｔｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００ Ｊｕｌ；７（１３）：１１２１－５、米国特許第５，６１２，３１８号、同第５，５７１，７９７号、同第５，７７０，５８１号、同第５，８１７，６３６号、及び国際公開第１９９９／０２５３８５（Ａ１）号を参照されたい。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第７，８４０，２６３号、米国特許出願公開第２００７／０１９００２８（Ａ１）号に開示されている埋め込み型システムによって制御され、遺伝子発現が、ｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを活性化する電磁エネルギーを含む１つ以上の形態のエネルギーによって制御される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、低酸素媒介性又はストレス活性化スイッチ、例えば、国際公開第１９９９／０６０１４２（Ａ２）号、米国特許第５，８３４，３０６号、同第６，２１８，１７９号、同第６，７０９，８５８号、米国特許出願公開第２０１５／０３２２４１０号、Ｇｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ９，Ｓ３６８、並びにＦＲＯＧ、ＴＯＡＤ、及びＮＲＳＥエレメント、並びに条件的誘導性サイレンシングエレメント（低酸素応答エレメント（hypoxia response element、ＨＲＥ）、炎症応答エレメント（inflammatory responseelement、ＩＲＥ）、及び米国特許第９，３９４，５２６号に開示されている剪断応力活性化エレメント（shear-stress activatedelement、ＳＳＡＥ）が含まれる）に開示されているものである。そのような実施形態は、虚血後、又は虚血性組織及び／若しくは腫瘍において、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現をオンにするために有用である。
（ｉｖ）．キルスイッチ
本明細書に記載される他の実施形態は、キルスイッチを含む、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺滅されるか、又は導入されたｃｅＤＮＡベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターにおけるキルスイッチの使用が、通常は、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、又はアポトーシスが望ましい細胞型（例えば、がん細胞）へのｃｅＤＮＡベクターの標的と結び付けられることは、当業者によって理解されるであろう。全ての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナル又は他の指定条件の不在下でｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の急速かつロバストな細胞殺滅をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書に記載されるようなＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターによりコードされるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。そのようなキルスイッチは、対象におけるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを除去すること、又はコードされたＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現しないことを保証することが望ましいときに、生物学的封じ込め機能として役立つ。
当業者に既知の他のキルスイッチは、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０１７５１４１号、同第２０１３／０００９７９９号、同第２０１１／０１７２８２６号、同第２０１３／０１０９５６８号に開示されているもの、並びにＪｕｓｉａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；２０１４；１－５６、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００４；１０１；８４１９－９、Ｍａｒｃｈｉｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１１；４３；３１０－３１９、及びＲｅｉｎｓｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８，１１に開示されているキルスイッチの発現のためのｃｅＤＮＡベクターにおける使用に包含される。
したがって、いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、エフェクター毒素又はレポータータンパク質をコードする核酸を含むキルスイッチ核酸構築物を含むことができ、エフェクター毒素（例えば、死タンパク質）又はレポータータンパク質の発現は、所定の条件によって制御される。例えば、所定の条件は、例えば外因性物質などの環境物質の存在であり得、それがなければ、細胞はデフォルトでエフェクター毒素（例えば、死タンパク質）の発現を起こして殺傷される。代替的な実施形態では、所定の条件は、２つ以上の環境物質の存在であり、例えば、細胞は、２つ以上の必要な外因性物質が供給された場合のみに生き残り、いずれもなければ、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺傷される。
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を破壊するキルスイッチを組み込むように修飾され、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子のインビボ発現（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現）を効果的に終了させる。具体的には、ｃｅＤＮＡベクターは、通常の生理学的条件下で哺乳動物細胞では機能しないスイッチタンパク質を発現するように更に遺伝子操作される。このスイッチタンパク質を特異的に標的とする薬物又は環境条件を投与したときのみ、スイッチタンパク質を発現する細胞が破壊され、それにより治療用タンパク質又はペプチドの発現を終了させる。例えば、ＨＳＶ－チミジンキナーゼを発現する細胞は、ガンシクロビル及びシトシンデアミナーゼなどの薬物を投与すると殺傷される可能性があると報告された。例えば、Ｄｅｙ ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ－１ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＨＳＶ－ＴＫ）（Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１１）にＹｏｕにより編纂）、及びＢｅｌｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６（１５）：８６９９－８７０４（１９９９）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＩＳＥ（Ｄｅａｔｈ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｇｅｎｅ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ、生存遺伝子排除によって引き起こされる死）と称されるｓｉＲＮＡキルスイッチを含むことができる（Ｍｕｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７；８：８４６４３－８４６５８．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＩＳＥ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）。
ＶＩ．ｃｅＤＮＡベクターの産生の詳細な方法
Ａ．一般的な産生
本明細書で定義されるような非対称ＩＴＲ対又は対称ＩＴＲ対を含む、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターのある特定の産生方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号のセクションＩＶに記載されている。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に記載されるように、昆虫細胞を使用して産生され得る。代替的な実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号に開示されるように、合成的に、またいくつかの実施形態では無細胞法で産生することができる。
本明細書に記載されるように、一実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ａ）ポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベートするステップであって、Ｒｅｐタンパク質の存在下では、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠いており、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベートするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取し、単離するステップと、を含む、プロセスによって取得され得る。Ｒｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。但し、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ＡＡＶ又は他のウイルスベースベクターにおいて天然に課されるもの等のサイズ制限はない。
宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化し、消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
更に別の態様では、本開示は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されるように、非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルス等の第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐ及びヘルパーウイルスの存在下でのｃｅＤＮＡの切除及び増幅を可能にする。
一実施形態では、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、Ｒｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、例えば図４Ａ～図４Ｃ及び実施例１に記載される、ｃｅＤＮＡの非ウイルス性ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｒｅｐタンパク質を発現するために操作される。
次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から採取され、単離される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取及び収集するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖等を考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大部分がバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキット等のプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡ－ベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソーム又は微粒子として精製される。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、並びにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ材料及び未消化のＤＮＡ材料の両方を分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンド存在を確認することによって確認され得る。図４Ｃ及び図４Ｄは、本明細書におけるプロセスによって産生された閉端ｃｅＤＮＡベクターの存在を特定するための一実施形態を示す。
Ｂ．ｃｅＤＮＡプラスミド
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの後期産生に使用されるプラスミドである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、転写方向の作動可能に連結された構成成分として、少なくとも（１）修飾型５’ＩＴＲ配列、（２）シス調節エレメントを含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサーなど、及び（３）修飾型３’ＩＴＲ配列（３’ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲ配列に対して非対称である）を提供する既知の技法を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐ及びｃａｐコード領域を置き換える。
一態様では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書では、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、導入遺伝子を含む発現カセット、及び変異型又は修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードする「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」と称されるプラスミドから取得され、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（又は５’）修飾型又は変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２の（又は３’）修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’及び３’ＩＴＲは、互いに対して対称である。代替的な実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（又は５’）修飾型又は変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、及び第２の（又は３’）変異型又は修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’及び３’修飾型ＩＴＲは、同じ修飾を有する（すなわち、それらは互いに対して逆相補又は対称である）。
更なる実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。加えて、特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドはまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、機能的ＡＡＶ ｃａｐ及びＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ２の場合ＧＧ－３’）に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。
本開示のｃｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において周知の任意のＡＡＶ血清型のゲノムの天然ヌクレオチド配列を使用して生成され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、及びＡＡＶ－ＤＪ８ゲノムに由来する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒによって維持されているＵＲＬで入手可能なＫｏｔｉｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｗｗｗウェブアドレス：ｏｅｓｙｓ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｄｅ／ｖｉｒｕｓｅｓ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｍｋｃｈａｐｔｅｒ．ａｓｐ？ｖｉｒＩＤ＝４２．０４）（注記－ＵＲＬ又はデータベースに対する参照は、本出願の有効な出願日現在のＵＲＬ又はデータベースの内容を指す）。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。別の特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、これらのＡＡＶゲノムのうちの１つに由来する５’及び３’ＩＴＲに含まれるように遺伝子操作された合成骨格である。
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能又は選択マーカーを任意選択的に含み得る。一実施形態では、選択マーカーは、３’ＩＴＲ配列の下流（すなわち、３’）に挿入され得る。別の実施形態では、選択マーカーは、５’ＩＴＲ配列の上流（すなわち、５’）に挿入され得る。適切な選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシンなどであり得る。好ましい実施形態では、薬物選択マーカーは、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子である。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のための例示的なｃｅＤＮＡ（例えば、ｒＡＡＶ０）ベクターは、ｒＡＡＶプラスミドから産生される。ｒＡＡＶベクターの産生のための方法は、（ａ）宿主細胞に上記のようなｒＡＡＶプラスミドを提供することであって、宿主細胞及びプラスミドの両方が、カプシドタンパク質コード遺伝子を欠いている、提供することと、（ｂ）ｃｅＤＮＡゲノムの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、（ｃ）細胞を採取し、当該細胞から産生されたＡＡＶゲノムを単離することと、を含み得る。
Ｃ．ｃｅＤＮＡプラスミドからｃｅＤＮＡベクターを作製する例示的な方法
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのカプシドのないｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、特にインビボ実験に十分なベクターを提供するために十分に高い収率を有する方法もまた、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの産生方法は、（１）発現カセット及び２つの対称ＩＴＲ配列を含む核酸構築物を宿主細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中に導入するステップと、（２）任意選択的に、例えば、プラスミド上に存在する選択マーカーを使用することによってクローン細胞株を確立するステップと、（３）Ｒｅｐコード遺伝子を（当該遺伝子を担持するバキュロウイルスでのトランスフェクション又は感染のいずれかによって）当該昆虫細胞中に導入するステップと、（４）細胞を採取し、ｃｅＤＮＡベクターを精製するステップと、を含む。ｃｅＤＮＡベクターの産生のために上記の発現カセット及び２つのＩＴＲ配列を含む核酸構築物は、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、又は下記のようにｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミド若しくはバキュロウイルスの形態であり得る。核酸構築物は、トランスフェクション、ウイルス形質導入、安定した組み込み、又は当該技術分野において既知の他の方法によって宿主細胞中に導入され得る。
Ｄ．細胞株：
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの産生において使用される宿主細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９、Ｓｆ２１など）若しくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞に由来する昆虫細胞株、又は他の無脊椎動物、脊椎動物、若しくは哺乳動物細胞を含む他の真核細胞株を含み得る。当業者に既知の他の細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１ １８０、単球、並びに成熟及び未成熟樹状細胞を使用することもできる。宿主細胞株は、高収率のｃｅＤＮＡベクター産生のために、ｃｅＤＮＡ－プラスミドの安定した発現のためにトランスフェクトされ得る。
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において既知の試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）又は物理的手段（例えば、エレクトロポレーション）を使用し、一時的なトランスフェクションによってＳｆ９細胞中に導入され得る。代替的に、ｃｅＤＮＡ－プラスミドをそれらのゲノム中に安定して組み込んでいる安定したＳｆ９細胞株が確立され得る。そのような安定した細胞株は、選択マーカーを上記のｃｅＤＮＡ－プラスミド中に組み込むことによって確立され得る。細胞株をトランスフェクションするために使用されるｃｅＤＮＡ－プラスミドが、抗生物質などの選択マーカーを含む場合、ｃｅＤＮＡ－プラスミドでトランスフェクションされ、ｃｅＤＮＡ－プラスミドＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込んでいる細胞は、細胞増殖培地への抗生物質の添加によって選択され得る。次いで、細胞の耐性クローンは、単一細胞希釈又はコロニー移動技法によって単離され、伝播され得る。
Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターの単離及び精製：
ｃｅＤＮＡベクターを入手し、単離するためのプロセスの例は、図４Ａ～図４Ｅ及び下記の特定の実施例に記載される。本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡ－ベクターは、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を発現するプロデューサー細胞から取得され、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスで更に形質転換され得る。ｃｅＤＮＡベクターの産生に有用なプラスミドには、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするプラスミド、又は１つ以上のＲＥＰタンパク質をコードするプラスミドが含まれる。
一態様では、ポリヌクレオチドは、プラスミド（Ｒｅｐ－プラスミド）、バクミド（Ｒｅｐ－バクミド）、又はバキュロウイルス（Ｒｅｐ－バキュロウイルス）中のプロデューサー細胞に送達されたＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８若しくは６８）をコードする。Ｒｅｐ－プラスミド、Ｒｅｐ－バクミド、及びＲｅｐ－バキュロウイルスは、上記の方法によって生成され得る。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを産生する方法が本明細書に記載される。本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用される発現構築物は、プラスミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド）、バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－バクミド）、及び／又はバキュロウイルス（例えば、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）であり得る。単なる例として、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス及びＲｅｐ－バキュロウイルスに共感染した細胞から生成され得る。Ｒｅｐ－バキュロウイルスから産生されたＲｅｐタンパク質は、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを複製して、ｃｅＤＮＡベクターを生成し得る。代替的に、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ－プラスミド、Ｒｅｐ－バクミド、又はＲｅｐ－バキュロウイルス中で送達されるＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８／５２）をコードする配列を含む構築物で安定してトランスフェクトされた細胞から生成され得る。ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスは、細胞に一時的にトランスフェクトされ、Ｒｅｐタンパク質によって複製され、ｃｅＤＮＡベクターを産生し得る。
バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－バクミド）は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎｉ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞などの許容昆虫細胞中にトランスフェクトされ得、対称ＩＴＲ及び発現カセットを含む配列を含む組換えバキュロウイルスである、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを生成し得る。ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを昆虫細胞中に再度感染させて、次世代の組換えバキュロウイルスを取得することができる。任意選択的に、このステップを一回又は複数回繰り返して、より多い量の組換えバキュロウイルスを産生することができる。
本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを細胞から回収及び採取するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態、細胞増殖などを考慮して選択され得る。通常、細胞は、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大半がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、Ｑｉａｇｅｎ ＥＮＤＯ－ＦＲＥＥ ＰＬＡＳＭＩＤ（登録商標）キットなどのプラスミド精製キットを使用して、Ｓｆ９細胞から単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ｃｅＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の当該技術分野において既知の核酸精製方法、並びに市販のＤＮＡ抽出キットが採用され得る。
代替的に、細胞ペレットをアルカリ溶解プロセスに供し、得られた溶解物を遠心分離し、クロマトグラフィー分離を実施することによって、精製が実装され得る。１つの非限定例として、このプロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム（例えば、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ Ｑ（登録商標））上に上清を装填し、次いで溶出し（例えば、１．２Ｍ ＮａＣｌ溶液で）、ゲル濾過カラム（例えば、６高速流ＧＥ）上で更なるクロマトグラフィー精製を実施することによって実施され得る。次いで、カプシド不含ＡＡＶベクターは、例えば、沈殿によって回収される。
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、エキソソーム又は微粒子の形態で精製され得る。多くの細胞型が、膜微小胞の脱落を介して、可溶性タンパク質だけでなく、複合タンパク質／核酸カーゴも放出することは、当該技術分野において既知である（Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ，２００９、欧州特許第１０３０６２２６．１号）。そのような小胞は、微小胞（微粒子とも称される）及びエキソソーム（ナノ小胞とも称される）を含み、それらの両方が、タンパク質及びＲＮＡをカーゴとして含む。微小胞は、形質膜の直接出芽から生成され、エキソソームは、多小胞エンドソームと形質膜との融合時に細胞外環境に放出される。したがって、ｃｅＤＮＡベクターを含有する微小胞及び／又はエキソソームは、ｃｅＤＮＡプラスミド、又はｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミド若しくはバキュロウイルスで形質導入された細胞から単離され得る。
微小胞は、培養培地を濾過又は２０，０００×ｇでの超遠心分離に供することによって単離することができ、エキソソームは、１００，０００×ｇで単離することができる。超遠心分離の最適な持続時間は、実験的に決定することができ、小胞が単離される特定の細胞型に依存する。好ましくは、培養培地は、最初に低速遠心分離（例えば、２０００×ｇで５～２０分間）によって一掃され、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用し、スピン濃度に供される。微小胞及びエキソソームは、微小胞及びエキソソーム上に存在する特定の表面抗原を認識する特定の抗体を使用することによって、ＦＡＣＳ又はＭＡＣＳを介して更に精製され得る。他の微小胞及びエキソソーム精製方法としては、免疫沈殿、親和性クロマトグラフィー、濾過、及び特定の抗体又はアプタマーでコーティングされた磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。精製時に、小胞を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。ｃｅＤＮＡ含有小胞を送達するために微小胞又はエキソソームを使用する１つの利点は、これらの小胞が、それぞれの細胞型上の特定の受容体によって認識されるそれらの膜タンパク質上に含めることによって、様々な細胞型に標的化され得ることである。（欧州特許第１０３０６２２６号も参照されたい）
本明細書における本開示の別の態様は、ｃｅＤＮＡ構築物をそれら自体のゲノム中に安定して組み込んでいる宿主細胞株からｃｅＤＮＡベクターを精製する方法に関する。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソーム又は微粒子として精製される。
国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のｃｅＤＮＡ－プラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルを示す。ｃｅＤＮＡは、実施例の図４Ｄに関して考察されるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。
ＶＩＩ．薬学的組成物
別の態様では、薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクター、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、又は器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター及び薬学的に許容される担体を含む。例えば、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射などの細胞内注射もまた、企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つ又は組み合わせとともに、適切なバッファーに必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を組み込んだ後、ｃｅＤＮＡベクターを含む濾過滅菌によって調製することができ、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化して、その中の導入遺伝子又はドナー配列の治療的発現をもたらし得る。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的に活性な組成物は、細胞、例えば、対象の細胞に様々な目的のための導入遺伝子を送達するように製剤化することができる。
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造及び貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、又は高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注射可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、必要に応じて、上記で列挙した成分のうちの１つ又は組み合わせと組み込み、濾過滅菌によって調製され得る。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内）、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、房内、及び硝子体内）、蝸牛内、並びに粘膜（例えば、経口、直腸、経鼻）投与に好適な薬学的組成物に組み込むことができる。高圧静脈内又は動脈内注入を介した受動組織形質導入、同様に、核内微量注射若しくは細胞質内注射等の細胞内注射もまた、企図される。
いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のための１つ以上のｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に送達することを含む。本明細書ではまた、そのような方法によって産生される細胞、及びそのような細胞を含むか又はそのような細胞から産生される生物（動物、植物、又は真菌など）も提供される。核酸の送達方法としては、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン、又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、及び薬剤によって増強されたＤＮＡの取り込みが挙げられ得る。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、及び同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。送達は、細胞（例えば、インビトロ若しくはエクスビボ投与）又は標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。
核酸を細胞に送達するための様々な技法及び方法が、当該技術分野において既知である。例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡなどの核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、又はコアシェルナノ粒子中に製剤化され得る。典型的に、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）分子、１つ以上のイオン化又はカチオン性脂質（若しくはそれらの塩）、１つ以上の非イオン性又は中性脂質（例えば、リン脂質）、凝集を防ぐ分子（例えば、ＰＥＧ若しくはＰＥＧ－脂質コンジュゲート）、及び任意選択的にステロール（例えば、コレステロール）で構成される。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡなどの核酸を細胞に送達するための別の方法は、細胞によって内在化されるリガンドと核酸を複合することによるものである。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合的に連結され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的なコンジュゲートは、例えば、国際公開第２０１５／００６７４０号、同第２０１４／０２５８０５号、同第２０１２／０３７２５４号、同第２００９／０８２６０６号、同第２００９／０７３８０９号、同第２００９／０１８３３２号、同第２００６／１１２８７２号、同第２００４／０９０１０８号、同第２００４／０９１５１５号、及び同第２０１７／１７７３２６号に記載される。
ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡなどの核酸はまた、トランスフェクションによって細胞に送達され得る。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、又はリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））、２９３フェクチン、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標））、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ（登録商標），Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ－１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））、ＴＦＸ－２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））、ＴＦＸ－５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標））、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ（登録商標），Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ（登録商標））、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標），Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ１（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標），Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標））、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標））、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（登録商標））、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ（登録商標），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、及びＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス方法を介して細胞に送達され得る。
本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。投与は、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注射、注入、局所用途、及びエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって利用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりもより即時的であり、より効果的な反応を提供し得る。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のための核酸ベクターのｃｅＤＮＡベクター導入方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に記載される方法によって、例えば、造血幹細胞に送達され得る。
本開示によるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象中の細胞又は標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物又は活性製剤成分（active pharmaceutical ingredient、ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。化合物を含有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を含むが、これに限定されない例示的なリポソーム及びリポソーム製剤は、２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号及び２０１８年１２月６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示され、例えば、「薬学的製剤」と題されるセクションを参照されたい。
当該技術分野において既知の様々な送達方法又はそれらの修正を使用して、ｃｅＤＮＡベクターをインビトロ又はインビボで送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、又はレーザーベースエネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化された細胞へのＤＮＡ進入が促進される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、又は当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターのみが、裸のＤＮＡとして、肝臓、腎臓、胆嚢、前立腺、副腎、心臓、腸、肺、及び胃、皮膚、甲状腺、心筋、又は骨格筋から選択される任意の１つ以上の組織のうちのいずれか１つに直接注射される。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金又はタングステン球状粒子（１～３μｍ直径）は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。
本明細書では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクター及び薬学的に許容される担体を含む組成物が具体的に企図されている。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、脂質送達系、例えば、本明細書に記載されるリポソームで製剤化される。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、熟練した開業医によって望まれる任意の経路によって投与される。組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、口腔内投与を介した、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、及び関節内、又はそれらの組み合わせを含む異なる経路によって対象に投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的慣習に従って好適に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与計画及び投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「マイクロプロジェクタイルボンバードメントガン」、又はエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、又は超音波などの他の物理的方法によって投与することができる。
場合によっては、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、内臓及び肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物及び粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学的注射によって送達される。
場合によっては、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、膜中にナノスコピック孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓又は腫瘍の細胞へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進するため、プラスミドＤＮＡのサイズ及び濃度は、この系の効率性において大きな役割を果たす。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、磁場を使用することによってマグネトフェクションにより送達され、核酸を含有する粒子を標的細胞中に濃縮する。
場合によっては、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム／ミセル又はカチオン性ポリマーに属するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ－Ｌ－リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、及び脂質－ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
Ａ．エキソソーム：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームにパッケージ化されることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、Ｂ及びＴリンパ球、マスト細胞（mast cell、ＭＣ）、同様に、樹状細胞（dendritic cell、ＤＣ）を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、１０ｎｍ～１μｍ、２０ｎｍ～５００ｎｍ、３０ｎｍ～２５０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、又は特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本開示のカプシド不含ＡＡＶベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
Ｂ．微粒子／ナノ粒子：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ５（３）：４９８－５０７によって開示されるように、イオン化アミノ脂質（例えば、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びコート脂質（ポリエチレングリコール－ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約１０００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約３００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２５～約２００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物（例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、サイズ分布を有し、平均サイズ（例えば、直径）は、約７０ｎｍ～約２００ｎｍであり、より典型的に、平均サイズは、約１００ｎｍ以下である。
当該技術分野において既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第９，４０４，１２７号、同第９，００６，４１７号、及び同第９，５１８，２７２号に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、金ナノ粒子によって送達される。一般に、核酸は、金ナノ粒子に共有結合的に結合され得るか、又は金ナノ粒子に非共有結合的に結合され得（例えば、電荷－電荷相互作用によって結合され）、例えば、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（６）；１０７５－１０８３に記載されるように、結合され得る。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子－核酸コンジュゲートは、例えば、米国特許第６，８１２，３３４号に記載される方法を使用して産生される。
Ｃ．コンジュゲート
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、コンジュゲートされる（例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤に共有結合される）。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例えば、コレステロール、トコフェロールなど）、細胞貫通ペプチド（cell penetrating peptide、ＣＰＰ）（例えば、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂなど）、及びポリアミン（例えば、スペルミン）にコンジュゲートし得る。細胞取り込みを増加させる薬剤の更なる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１－８０９に開示されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療用ＰＦＩＣタンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ポリマー（例えば、ポリマー分子）又は葉酸塩分子（例えば、葉酸分子）に複合される。一般に、ポリマーに複合された核酸の送達は、例えば、国際公開第２０００／３４３４３号及び同第２００８／０２２３０９号に記載されるように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，９８７，３７７号によって記載されるように、ポリ（アミド）ポリマーに複合される。いくつかの実施形態では、本開示によって記載される核酸は、米国特許第８，５０７，４５５号に記載されるように、葉酸分子に複合される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号に記載されるように、炭水化物に複合される。
Ｄ．ナノカプセル
代替的に、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターのナノカプセル製剤が使用され得る。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方式で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
Ｅ．リポソーム
本開示によるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象中の細胞又は標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物又は活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
リポソームの形成及び使用は、一般に、当業者に既知である。向上された血清安定性及び循環半減期を有するリポソームが開発されている（米国特許第５，７４１，５１６号）。更に、潜在的な薬物担体としてのリポソーム及びリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、及び同第５，７９５，５８７号）。
Ｆ．例示的なリポソーム及び脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
本開示によるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、細胞、例えば、導入遺伝子の発現を必要とする細胞への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療薬送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物又は活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
ｃｅＤＮＡベクターを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号及び２０１８年１２月６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示されており、それらの全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターについての方法及び組成物での使用が想定されている。
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物に対する親水性及び疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。代替的に、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含む。そのような態様では、ＰＥＧ又はＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ～約５，０００Ｄａであり得る。
いくつかの態様では、本開示は、延長放出又は制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間～数週間の期間にわたって送達するであろうリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間～数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成成分を有するＡＰＩを封入する。
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリン及び本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコールコンジュゲート脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＤＳＰＥ（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）、ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）、ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）、ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）、ＳＭ（スフィンゴミエリン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）、ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）、ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）、ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）、ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステロール（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルコリン）、又はそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２～１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、及びＰＥＧ化脂質を含有するリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、及びＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、コレステロール、及びＰＥＧ化脂質を含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基及びコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－２０００－ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質コンジュゲート、及びコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、及びエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、及びステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、及びＤＯＰＥを含む。
いくつかの態様では、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロース及び／又はグリシンを更に含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、本開示は、単一ラメラ構造又は多ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子及び／又は発泡ベース粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０～２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を添加することにより、本明細書に開示又は記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製及び充填されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３まで増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に送る。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４～６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマー又は非ポリマー高電荷アニオン及びリポソーム内捕捉剤、例えば、ポリリン酸塩又はオクタ硫酸スクロースが利用される。
いくつかの態様では、本開示は、ｃｅＤＮＡ及びイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたｃｅＤＮＡを用いて作製及び負荷される脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に提出された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、本明細書に組み込まれる。これは、イオン化脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合及び核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈及び有機溶媒の除去によって更に安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。
一般に、脂質粒子は、約１０：１～３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量又は重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲内であり得る。脂質及びｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
イオン化脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、及び膜会合及び膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、イオン化脂質は、正に電荷される、又は例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。
例示的なイオン化脂質は、国際ＰＣＴ特許公開２０１５／０９５３４０号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１８／０１１６３３号、同第２０１７／０４９２４５号、同第２０１５／０６１４６７号、同第２０１２／０４０１８４号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１５／０７４０８５号、同第２０１６／０８１０２９号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１７／０７５５３１号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１１／０２２４６０号、同第２０１３／１４８５４１号、同第２０１３／１１６１２６号、同第２０１１／１５３１２０号、同第２０１２／０４４６３８号、同第２０１２／０５４３６５号、同第２０１１／０９０９６５号、同第２０１３／０１６０５８号、同第２０１２／１６２２１０号、同第２００８／０４２９７３号、同第２０１０／１２９７０９号、同第２０１０／１４４７４０号、同第２０１２／０９９７５５号、同第２０１３／０４９３２８号、同第２０１３／０８６３２２号、同第２０１３／０８６３７３号、同第２０１１／０７１８６０号、同第２００９／１３２１３１号、同第２０１０／０４８５３６号、同第２０１０／０８８５３７号、同第２０１０／０５４４０１号、同第２０１０／０５４４０６号、同第２０１０／０５４４０５号、同第２０１０／０５４３８４号、同第２０１２／０１６１８４号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１０／０４２８７７号、同第２０１１／０００１０６号、同第２０１１／０００１０７号、同第２００５／１２０１５２号、同第２０１１／１４１７０５号、同第２０１３／１２６８０３号、同第２００６／００７７１２号、同第２０１１／０３８１６０号、同第２００５／１２１３４８号、同第２０１１／０６６６５１号、同第２００９／１２７０６０号、同第２０１１／１４１７０４号、同第２００６／０６９７８２号、同第２０１２／０３１０４３号、同第２０１３／００６８２５号、同第２０１３／０３３５６３号、同第２０１３／０８９１５１号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／０９５３４６号、及び同第２０１３／０８６３５４号、並びに米国特許公開第２０１６／０３１１７５９号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０１５１２８４号、同第２０１７／０２１０６９７号、同第２０１５／０１４００７０号、同第２０１３／０１７８５４１号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１５／０１４１６７８号、同第２０１５／０２３９９２６号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１７／０１１９９０４号、同第２０１２／０１４９８９４号、同第２０１５／００５７３７３号、同第２０１３／００９０３７２号、同第２０１３／０２７４５２３号、同第２０１３／０２７４５０４号、同第２０１３／０２７４５０４号、同第２００９／００２３６７３号、同第２０１２／０１２８７６０号、同第２０１０／０３２４１２０号、同第２０１４／０２００２５７号、同第２０１５／０２０３４４６号、同第２０１８／０００５３６３号、同第２０１４／０３０８３０４号、同第２０１３／０３３８２１０号、同第２０１２／０１０１１４８号、同第２０１２／００２７７９６号、同第２０１２／００５８１４４号、同第２０１３／０３２３２６９号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１１／０２５６１７５号、同第２０１２／０２０２８７１号、同第２０１１／００７６３３５号、同第２００６／００８３７８０号、同第２０１３／０１２３３３８号、同第２０１５／００６４２４２号、同第２００６／００５１４０５号、同第２０１３／００６５９３９号、同第２００６／０００８９１０号、同第２００３／００２２６４９号、同第２０１０／０１３０５８８号、同第２０１３／０１１６３０７号、同第２０１０／００６２９６７号、同第２０１３／０２０２６８４号、同第２０１４／０１４１０７０号、同第２０１４／０２５５４７２号、同第２０１４／００３９０３２号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１６／０３１７４５８号、及び同第２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である：
Figure 2024511026000140
脂質ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９－８５３３（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、国際公開第２０１５／０７４０８５号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、脂質ＡＴＸ－００２である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、国際公開第２０１２／０４０１８４号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている（１３Ｚ，１６Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－ノニルドコサ－１３，１６－ジエン－１－アミン（化合物３２）である。
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／１９９９５２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される、化合物６又は化合物２２である。
限定なく、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の２０～９０％（ｍｏｌ）を含み得る。例えば、イオン化脂質モル含有量は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）、又は４０～５０％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％を含む。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質を更に含み得る。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、及びアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、又はアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を増強するために用いられる。
本明細書に開示される方法及び組成物での使用が想定される例示的な非カチオン性脂質は、２０１８年９月７日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号、及び２０１８年１２月６日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に記載されている。例示的な非カチオン性脂質は、国際公開第２０１７／０９９８２３号及び米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、非カチオン性脂質含有量は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）である。様々な実施形態では、イオン化脂質対中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を全く含まない。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、膜統合性を提供するために、ステロールなどの構成成分を更に含み得る。
脂質ナノ粒子中で使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロール及びその誘導体である。例示的なコレステロール誘導体は、国際出願第２００９／１２７０６０号及び米国特許公開第２０１０／０１３０５８８号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ステロールなどの膜統合性を提供する構成成分は、脂質ナノ粒子に存在する全脂質の０～５０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、そのような構成成分は、脂質ナノ粒子の全脂質含有量の２０～５０％（ｍｏｌ）、３０～４０％（ｍｏｌ）である。
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコンジュゲートした脂質分子を更に含み得る。一般に、これらを使用して、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、かつ／又は立体安定化を提供する。例示的な複合脂質としては、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、複合脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）－複合脂質である。例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－Ｏ－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－Ｏ－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許出願公開第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１、同第２００３／００７７８２９号、同第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１０／０１３０５８８号、同第２０１６／０３７６２２４号、及び同第２０１７／０１１９９０４号に記載されており、それら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号に定義されている化合物であり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１５／０３７６１１５号又は同第２０１６／０３７６２２４号に開示されており、これら両方の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（１－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施例では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］からなる群から選択され得る。
ＰＥＧ以外の分子と複合した脂質は、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート等）、及びカチオン性－ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲートを、ＰＥＧ－脂質の代わりに、又はそれに加えて使用することができる。例示的な複合脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、及びカチオン性ポリマー－脂質は、国際特許出願公開第１９９６／０１０３９２号、同第１９９８／０５１２７８号、同第２００２／０８７５４１号、同第２００５／０２６３７２号、同第２００８／１４７４３８号、同第２００９／０８６５５８号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１７／１１７５２８号、同第２０１７／０９９８２３号、同第２０１５／１９９９５２号、同第２０１７／００４１４３号、同第２０１５／０９５３４６号、同第２０１２／０００１０４号、同第２０１２／０００１０４号、及び同第２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号、同第２００５／０１７５６８２号、同第２００８／００２００５８号、同第２０１１／０１１７１２５号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１８／００２８６６４号、同第２０１５／０３７６１１５号、同第２０１６／０３７６２２４号、同第２０１６／０３１７４５８号、同第２０１３／０３０３５８７号、同第２０１３／０３０３５８７号、及び同第２０１１／０１２３４５３号、並びに米国特許第５，８８５，６１３号、同第６，２８７，５９１号、同第６，３２０，０１７号、及び同第６，５８６，５５９号に記載されており、これら全ての内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、所望の治療目的及び生物作用に従って選択され得る。例えば、ＬＮＰ内のｃｅＤＮＡが、ＰＦＩＣ疾患を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗ＰＦＩＣ疾患剤（例えば、化学療法剤、又は他のＰＦＩＣ疾患療法（小分子又は抗体を含むが、これらに限定されない）であり得る。別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗微生物剤（例えば、抗生物質又は抗ウイルス化合物）であり得る。更に別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患又は障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫応答を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、又は１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質又は異なる化合物（治療薬など）をコードするｃｅＤＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質ナノ粒子の異なるカクテルを、本開示の組成物及び方法で使用することができる。
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激剤である。本明細書では、産生された脂質ナノ粒子に封入された昆虫細胞、又は本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のための合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
いくつかの態様では、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤を更に含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、及び／又はグリシンを更に含む。
ｃｅＤＮＡベクターは、粒子の脂質部分と複合され得るか、又は脂質ナノ粒子の脂質位置に封入され得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、脂質ナノ粒子の脂質位置に完全に封入され得、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、又は６０分間のヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、若しくは６０分、又は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、若しくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。限定なく、非二層の形態には、例えば、三次元の管、ロッド、立方対称などが含まれ得る。例えば、脂質ナノ粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ－ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特徴付けられ得る。
いくつかの更なる実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造又は多ラメラ構造のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子及び／又は発泡ベース粒子を含む脂質ナノ粒子を提供する。
脂質構成成分の組成物及び濃度を制御することによって、脂質コンジュゲートが脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。加えて、例えば、ｐＨ、温度、又はイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化及び／又は制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質コンジュゲートの組成物及び濃度を制御することによって、脂質粒径を制御することができることも明らかとなるであろう。
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関させることができる（Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９－８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８，１７２－１７６（２０ｌ ０）を参照されたい（これらはいずれも、参照によりその全体が組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５～約７である。カチオン性脂質のｐＫａは、２－（ｐ－トルイジノ）－６－ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で決定され得る。
ＶＩＩＩ．使用の方法
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターはまた、目的のヌクレオチド配列（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする）を標的細胞（例えば、宿主細胞）に送達するための方法において使用され得る。この方法は、具体的には、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を、それを必要とする対象の細胞に送達するため、及びＰＦＩＣ疾患を治療するための方法であり得る。本開示は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現の治療効果が生じるように、対象の細胞内のｃｅＤＮＡベクターにコードされるＰＦＩＣ治療用タンパク質のインビボ発現を可能にする。これらの結果は、ｃｅＤＮＡベクター送達のインビボ及びインビトロ両方の形態で見られる。
加えて、本開示は、当該ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする本開示のｃｅＤＮＡベクターの複数回投与を含む、それを必要とする対象の細胞におけるＰＦＩＣ治療用タンパク質の送達のための方法を提供する。本開示のｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ウイルスベクターに対して典型的に観察されるような免疫応答を誘導しないため、そのような複数回投与戦略は、ｃｅＤＮＡベースの系においてより大きな成功を収めるであろう。ｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の十分なレベルの遺伝子導入及び発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路には、網膜投与（例えば、網膜下注射、脈絡膜上注射又は硝子体内注射）、静脈内（例えば、リポソーム製剤で）、選択された器官への直接送達（例えば、肝臓、腎臓、胆嚢、前立腺、副腎、心臓、腸、肺、及び胃から選択されるいずれか１つ以上の組織）、筋肉内、及び他の親投与経路が含まれるが、これらに限定されない。所望される場合、投与経路を組み合わせることができる。
本明細書に記載されるようなＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの送達は、発現されたＰＦＩＣ治療用タンパク質の送達に限定されない。例えば、従来の方法で産生される（例えば、細胞ベースの産生方法（例えば、昆虫細胞産生方法）を使用して）又は合成的に産生された本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子療法の一部を提供するために提供される他の送達系とともに使用され得る。本開示に従ってｃｅＤＮＡベクターと組み合わせることができる系の１つの非限定的な例は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターの効果的な遺伝子発現のために１つ以上の補因子又は免疫抑制因子を別々に送達する系を含む。
本開示はまた、治療有効量のｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象の標的細胞（具体的には筋細胞又は組織）に導入することを含む、対象におけるＰＦＩＣ疾患を治療する方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。選択されるｃｅＤＮＡベクターは、ＰＦＩＣ疾患を治療するために有用なＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的には、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のＰＦＩＣ治療用タンパク質の転写を指示することができる制御エレメントに作動可能に連結された所望のＰＦＩＣ治療用タンパク質配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記及び本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
本明細書に提供される組成物及びベクターを使用して、様々な目的のためにＰＦＩＣ治療用タンパク質を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質産物の機能を研究するために使用されることが意図されるＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、ＰＦＩＣ疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、コードされるＰＦＩＣ治療用タンパク質は、哺乳動物対象におけるＰＦＩＣ疾患状態の治療又は予防に有用である。ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、又は機能不全に関連したＰＦＩＣ疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。
原則として、発現カセットは、変異によって減少若しくは欠如しているＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする、又は過剰発現が本開示の範囲内であるとみなされる場合に、治療効果をもたらす核酸又は任意の導入遺伝子を含み得る。好ましくは、挿入されていない細菌ＤＮＡは存在せず、好ましくは、本明細書に提供されるｃｅＤＮＡ組成物中に細菌ＤＮＡは存在しない。
ｃｅＤＮＡベクターは、１種のｃｅＤＮＡベクターに限定されない。そのようなものとして、別の態様では、異なるタンパク質、又は異なるプロモーター若しくはシス調節エレメントに作動可能に連結されるが同じＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現する複数のｃｅＤＮＡベクターは、標的細胞、組織、器官、又は対象に同時に又は順次に送達され得る。したがって、この戦略では、複数のタンパク質の遺伝子療法又は遺伝子送達を同時に行うことができる。ＰＦＩＣ治療用タンパク質の異なる部分を別々のｃｅＤＮＡベクターに分離することも可能であり（例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の機能に必要な異なるドメイン及び／又は補因子）、同時に又は異なる時間に投与することができ、別々に調節可能であり得、それによって追加レベルのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現の制御を付加する。送達はまた、複数回、及び重要なことに、ウイルスカプシドの不在に起因する抗カプシド宿主免疫応答の欠失を仮定して、後に増加又は減少する用量で臨床状況において遺伝子療法のために実施され得る。カプシドが存在しないため、抗カプシド応答は起こらないと予想される。
本開示はまた、治療有効量の本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象の標的細胞（具体的には筋細胞又は組織）に導入することを含む、対象におけるＰＦＩＣ疾患を治療する方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、ＰＦＩＣ疾患を治療するために有用な目的のヌクレオチド配列を含む。具体的には、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、又はオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに作動可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記及び本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
ＩＸ．ＰＦＩＣ治療用タンパク質産生のためのｃｅＤＮＡベクターを送達する方法
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、様々な好適な方法によってインビトロ又はインビボで標的細胞に送達され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、単独で適用又は注射され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、トランスフェクション試薬又は他の物理的手段の助けなく細胞に送達され得る。代替的に、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、細胞へのＤＮＡの進入を促進する任意の当該技術分野において既知のトランスフェクション試薬又は他の当該技術分野において既知の物理的手段、例えば、リポソーム、アルコール、高ポリリジン化合物、高アルギニン化合物、リン酸カルシウム、微小胞、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して送達され得る。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが通常は困難である細胞及び組織型を効率的に標的とし得る。
本明細書に記載される技術の一態様は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を細胞に送達する方法に関する。典型的には、インビボ及びインビトロ方法では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される方法、並びに当該技術分野で既知の他の方法を使用して細胞に導入されてもよい。本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、生物学的に有効な量で細胞に投与される。ｃｅＤＮＡベクターがインビボで細胞に（例えば、対象に）投与される場合、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的有効量は、標的細胞におけるＰＦＩＣ治療用タンパク質の形質導入及び発現をもたらすのに十分な量である。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（又は卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格、横隔膜、及び／又は心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、及び動脈内）が挙げられる。投与は、肝臓又は他の部位（例えば、いずれかの腎臓、胆嚢、前立腺、副腎、心臓、腸、肺、及び胃）への全身的又は直接的な送達であり得る。
投与は、局所（例えば、気道表面を含む皮膚及び粘膜表面への、並びに経皮投与）、リンパ内など、並びに直接組織又は器官注射（例えば、限定されないが、肝臓、また眼、骨格筋、心筋、横隔膜を含む筋肉、若しくは脳への）であり得る。
ｃｅＤＮＡベクターの投与は、肝臓及び／又はまた眼、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。
任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、及び／又は予防される病態の性質及び重症度、並びに使用されている特定のｃｅＤＮＡベクターの性質に依存するであろう。追加的に、ｃｅＤＮＡは、単一のベクター又は複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に１つより多いＰＦＩＣ治療用タンパク質を投与することを可能にする。
Ａ．ｃｅＤＮＡベクターの筋肉内投与
いくつかの実施形態では、対象における疾患を治療する方法は、治療有効量のＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（具体的には筋細胞又は組織）に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象の筋組織に投与される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの投与は、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、又は眼の筋肉からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの、本発明に従う骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、及び／又は下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、及び／又は指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内、四肢灌流（任意選択的に、脚及び／若しくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ１０５：３４５８－３４６４を参照）並びに／又は直接筋肉内注入によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）の肝臓、眼、四肢灌流、任意選択的に単離された四肢灌流（例えば、静脈内又は動脈内投与による）によって四肢（腕及び／又は脚）に投与される。実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、「流体力学的」技法を用いることなく投与され得る。
例えば、従来のウイルスベクターの（例えば、網膜への）組織送達は、血管系内の圧力を増加させ、ウイルスベクターが内皮細胞バリアと交差する能力を促進する流体力学的技法（例えば、大容量での静脈内／静脈内投与）によってしばしば強化される。特定の実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、大量注入及び／又は血管内圧の上昇（例えば、通常の収縮期圧よりも高い、例えば通常の収縮期圧よりも血管内圧力の５％、１０％、１５％、２０％、２５％以下の増加）などの流体力学的技法の不在下で投与することができる。そのような方法は、浮腫、神経損傷、及び／又は区画症候群などの流体力学的技法に関連する副作用を低減又は回避することができる。
更に、骨格筋に投与される、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物は、四肢（例えば、上腕、下腕、上脚、及び／若しくは下肢）の骨格筋、背中、首、頭（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、及び／又は指に投与することができる。好適な骨格筋には、小指外転筋（手の）、小趾外転筋（足の）、母趾外転筋、第五中足骨外転筋（abductor ossis metatarsi quinti）、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、顎二腹筋、背側骨間筋（手の）、背側骨間筋（足の）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短趾伸筋、長趾伸筋、短母趾伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手の）、短小趾屈筋（足の）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大臀筋、中臀筋、小臀筋、薄筋、頸腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋（illiacus）、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋（intertransversi）、外側翼突筋、外直筋、広背筋、口角挙筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋（longrotators）、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手の）、虫様筋（足の）、咬筋、内側翼突筋、内直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頸半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋（shortrotators）、ヒラメ筋、頭棘筋、頸棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頸板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸部の筋、甲状舌骨筋、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋及び小頬骨筋、並びに当該技術分野において既知の任意の他の好適な骨格筋が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの、横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。いくつかの実施形態では、発現した導入遺伝子のｃｅＤＮＡベクターから標的組織への送達は、ｃｅＤＮＡベクターを含む合成デポーを送達することによって達成することもでき、ｃｅＤＮＡベクターを含むデポーは、骨格、平滑、心臓及び／若しくは横隔膜に移植されるか、又は筋肉組織は、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターを含むフィルム若しくは他のマトリックスと接触させることができる。そのような移植可能なマトリックス又は基質は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載されている。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの、心筋への投与には、左心房、右心房、左心室、右心室、及び／又は中隔への投与が含まれる。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、及び／又は冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの、平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、及び／又は腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、及び／又はその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。平滑筋の非限定的な例には、眼の虹彩、肺の細気管支、喉頭筋（声帯）、胃、食道、小腸及び大腸の筋肉層、胃腸管、尿管、膀胱の排尿筋、子宮筋層、陰茎、又は前立腺が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、骨格筋、横隔膜筋、及び／又は心筋に投与される。代表的な実施形態では、本開示によるｃｅＤＮＡベクターは、骨格筋、心臓筋及び／又は横隔膜筋の障害を治療及び／又は予防するために使用される。
具体的には、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物は、眼（例えば、外直筋、内直筋、上直筋、下直筋、上斜筋、下斜筋）、顔面筋（例えば、後頭前頭筋、側頭頭頂筋、鼻根筋、鼻筋、鼻中隔下制筋、眼輪筋、皺眉筋、眉毛下制筋、耳介筋、口輪筋、口角下制筋、笑筋、大頬骨筋、小頬骨筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、下唇下制筋、口角挙筋、頬筋、オトガイ筋）又は舌筋（例えば、オトガイ舌筋、舌骨舌筋、小角舌筋、茎突舌筋、口蓋舌筋、上縦舌筋、下縦舌筋、垂直舌筋、及び横舌筋）の１つ以上の筋肉に送達され得ることが企図される。
（ｉ）筋肉内注射：いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物は、対象における所定の筋肉、例えば、骨格筋（例えば、三角筋、外側広筋、背側臀筋の腹側臀筋、又は幼児の場合は前外側大腿））の１つ以上の部位に針を使用して注射され得る。ｃｅＤＮＡを含む組成物は、筋細胞の他のサブタイプに導入することができる。筋細胞サブタイプの非限定的な例には、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、及び／又は横隔膜筋細胞が含まれる。
筋肉内注射のための方法は当業者に知られており、したがって、本明細書では詳細に説明しない。しかしながら、筋肉内注射を実施する場合、適切な針のサイズは、患者の年齢及びサイズ、組成物の粘度、並びに注射部位に基づいて決定されるべきである。表１２は、例示的な注射部位及び対応する針のサイズについてのガイドラインを提供する。
Figure 2024511026000141
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、少ない体積、例えば、所与の対象について表１２に概説される例示的な体積で製剤化される。いくつかの実施形態では、必要に応じて、対象は、注射の前に全身麻酔又は局所麻酔を投与され得る。これは、上記の一般的な注射部位ではなく、複数回の注射が必要な場合、又はより深部の筋肉に注射される場合に特に望ましい。
いくつかの実施形態では、筋肉内注射を、エレクトロポレーション、送達圧力、又はトランスフェクション試薬の使用と組み合わせて、ｃｅＤＮＡベクターの細胞取り込みを増強することができる。
（ｉｉ）トランスフェクション試薬：いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、筋管又は筋肉組織へのベクターの取り込みを促進するための１つ以上のトランスフェクション試薬を含む組成物中で製剤化される。したがって、一実施形態では、本明細書に記載されている核酸は、本明細書の他の場所に記載されている方法を使用したトランスフェクションにより、筋細胞、筋管、又は筋組織に投与される。
（ｉｉｉ）エレクトロポレーション：ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡの細胞への侵入を促進するための担体の非存在下、又は生理学的に不活性な薬学的に許容される担体（すなわち、カプシド不含非ウイルス性ベクターの筋管への取り込みを改善又は増強しない担体）中で投与される。そのような実施形態では、カプシド不含非ウイルス性ベクターの取り込みは、細胞又は組織のエレクトロポレーションによって促進することができる。
細胞膜は、細胞外への細胞質への通過に自然に抵抗する。この抵抗を一時的に低減するための１つの方法は「エレクトロポレーション」であり、電界を使用して、細胞に永続的な損傷を与えることなく、細胞に細孔を作成する。これらの細孔は、ＤＮＡベクター、医薬品、ＤＮＡ、及び他の極性化合物が細胞の内部にアクセスできるように十分な大きさである。時間の経過とともに、細胞膜の孔が閉じ、細胞が再び不透過性になる。
エレクトロポレーションは、例えば、外因性ＤＮＡを生細胞に導入するために、インビトロ及びインビボの両方の適用で使用することができる。インビトロ適用は、典型的には、生細胞の試料を、例えば、ＤＮＡを含む組成物と混合する。次いで、細胞を平行板などの電極間に配置し、細胞／組成物混合物に電界を印加する。
インビボエレクトロポレーションにはいくつかの方法があり、電極は、例えば、治療される細胞の領域の上にある表皮を把持するキャリパーなどの様々な構成で提供することができる。代替的に、針状電極を組織に挿入して、より深部に位置する細胞にアクセスすることもできる。いずれの場合でも、例えば、核酸を含む組成物が治療領域に注射された後、電極は、領域に電界を印加する。いくつかのエレクトロポレーション適用では、この電界は、約１０～６０ｍｓ持続期間の１００～５００Ｖ／ｃｍ程度の単一の方形波パルスを含む。そのようなパルスは、例えば、Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．のＢＴＸ Ｄｉｖｉｓｉｏｎによって作製されたＥｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｐｏｒａｔｏｒ Ｔ８２０の既知のアプリケーションで生成されてもよい。
典型的には、例えば、核酸の取り込みの成功は、筋肉が速やかに電気的に刺激された場合、又は例えば筋肉への注射による組成物の投与直後にのみ起こる。
ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションは、電界のパルスを使用して、又は低電圧／長パルス治療計画を使用して（例えば、方形波パルスエレクトロポレーション系を使用して）達成される。パルス電界を生成することができる例示的なパルス発生器は、例えば、指数波形を生成することができるＥＣＭ６００、及び矩形波形を生成することができるＥｌｅｃｔｒｏＳｑｕａｒｅＰｏｒａｔｏｒ（Ｔ８２０）を含み、いずれもＧｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ（登録商標），Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）の部門であるＢＴＸから入手可能である。方形波エレクトロポレーション系は、設定された電圧まで急速に上昇し、設定された時間（パルス長）にわたってそのレベルに留まり、その後すぐにゼロまで低下する制御された電気パルスを送達する。
いくつかの実施形態では、局所麻酔剤は、例えば、本明細書に記載されるカプシド不含非ウイルス性ベクターを含む組成物の存在下で組織のエレクトロポレーションに関連し得る疼痛を軽減するために、治療部位への注射によって投与される。加えて、当業者は、筋肉の線維症、壊死、又は炎症をもたらす過剰な組織損傷を最小化及び／又は防止する組成物の用量が選択されるべきであることを理解するであろう。
（ｉｖ）送達圧力：いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの筋肉組織への送達は、大容量と四肢（例えば、腸骨動脈）に供給する動脈への迅速な注射との組み合わせを使用する送達圧力によって促進される。この投与方法は、典型的に筋肉が血管クランプの止血帯を使用して体循環から隔離されている間に、ｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を肢血管系に注入することを含む様々な方法によって達成され得る。１つの方法において、組成物は、四肢の脈管構造を通して循環されて、細胞への管外遊出を可能にする。別の方法では、血管内流体力学的圧力を増加させて血管床を拡張し、筋肉細胞又は組織へのｃｅＤＮＡベクターの取り込みを増加させる。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ組成物は、動脈に投与される。
（ｖ）脂質ナノ粒子組成物：いくつかの実施形態では、筋肉内送達のために本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の他の場所に記載されるリポソームを含む組成物中で製剤化される。
（ｖｉ）筋肉組織を標的とするｃｅＤＮＡベクターの全身投与：いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、間接的送達投与を介して筋肉を標的とするように製剤化され、ｃｅＤＮＡは、肝臓とは対照的に筋肉に輸送される。したがって、本明細書に記載される技術は、例えば、全身投与による、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の筋肉組織への間接投与を包含する。そのような組成物は、局所的、静脈内（ボーラス又は連続注入による）、細胞内注射、組織内注射、経口、吸入、腹腔内、皮下、腔内で投与することができ、必要に応じてぜん動手段によって、又は当業者による他の既知の手段によって送達することができる。薬剤は、必要に応じて、例えば静脈内注入によって全身投与することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの筋肉細胞／組織への取り込みは、ベクターを筋肉組織に優先的に向ける標的化剤又は部分を使用することによって増加する。したがって、いくつかの実施形態では、カプシド不含ｃｅＤＮＡベクターは、身体の他の細胞又は組織に存在するカプシド不含ｃｅＤＮＡベクターの量と比較して、筋肉組織に濃縮することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物は、筋細胞への標的化部分を更に含む。他の実施形態では、発現された遺伝子産物は、作用が望まれる組織に特異的な標的化部分を含む。標的化部分は、細胞又は組織の細胞内、細胞表面、又は細胞外バイオマーカーを標的化、相互作用、連結、及び／又は結合することができる任意の分子又は分子の複合体を含み得る。バイオマーカーは、例えば、細胞プロテアーゼ、キナーゼ、タンパク質、細胞表面受容体、脂質、及び／又は脂肪酸を含み得る。標的化部分が、標的、相互作用、連結、及び／又は結合して、特定の疾患に関連する分子を含むことができるバイオマーカーの他の例。例えば、バイオマーカーは、上皮成長因子受容体及びトランスフェリン受容体などの、がん発生に関係する細胞表面受容体を含み得る。標的化部分には、合成化合物、天然化合物又は産物、高分子実体、生体工学分子（例えば、ポリペプチド、脂質、ポリヌクレオチド、抗体、抗体断片）、及び標的筋組織で発現する分子に結合する小実体（例えば、小分子、神経伝達物質、基質、リガンド、ホルモン、元素化合物））が含まれ得るが、これらに限定されない。
ある特定の実施形態では、標的化部分は、例えば、標的細胞の特定の所望の分子を自然に認識する受容体を含む、受容体分子を更に含み得る。そのような受容体分子には、標的分子との相互作用の特異性を高めるために修飾された受容体、受容体によって自然に認識されない所望の標的分子と相互作用するように修飾された受容体、及びそのような受容体の断片が含まれる（例えば、Ｓｋｅｒｒａ，２０００，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，１３：１６７－１８７を参照されたい）。好ましい受容体は、ケモカイン受容体である。例示的なケモカイン受容体は、例えば、Ｌａｐｉｄｏｔ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ，３０：９７３－８１及びＯｎｕｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，２３：４５９－６７に記載されている。
他の実施形態では、追加の標的化部分は、例えば、トランスフェリン（Ｔｆ）リガンドなどの、標的細胞の特定の所望の受容体を自然に認識するリガンドを含むリガンド分子を含み得る。そのようなリガンド分子には、標的受容体との相互作用の特異性を高めるために修飾されたリガンド、リガンドによって自然に認識されない所望の受容体と相互作用するように修飾されたリガンド、及びそのようなリガンドの断片が含まれる。
更に他の実施形態では、標的化部分は、アプタマーを含み得る。アプタマーは、標的細胞の所望の分子構造に特異的に結合するように選択されるオリゴヌクレオチドである。アプタマーは、典型的には、ファージディスプレイの親和性選択（インビトロ分子進化としても知られている）と同様の親和性選択プロセスの産物である。このプロセスは、例えば、罹患した免疫原が結合している固体支持体を使用して親和性分離のいくつかのタンデム反復を実施し、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って免疫原に結合した核酸を増幅することを含む。したがって、親和性分離の各ラウンドは、所望の免疫原に首尾よく結合する分子の核酸集団を濃縮する。このようにして、核酸のランダムなプールを「教育」して、標的分子に特異的に結合するアプタマーを得ることができる。アプタマーは、典型的にはＲＮＡであるが、限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びホスホロチオエート核酸などのＤＮＡ又はその類似体又は誘導体であり得る。
いくつかの実施形態では、標的化部分は、カプシド不含非ウイルス性ベクター又は遺伝子産物が特定の組織に標的化されるように、例えば、集光ビームから放出される光分解性リガンド（すなわち、「ケージ化」リガンド）を含み得る。
本明細書では、組成物が対象の１つ以上の筋肉の複数の部位に送達されることも企図される。すなわち、注入は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００の注射部位において行われ得る。そのような部位は、単一の筋肉の領域に広がることができるか、又は複数の筋肉に分散することができる。
Ｂ．非筋肉部位へのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの投与
別の実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターが肝臓に投与される。ｃｅＤＮＡベクターはまた、角膜及び／又は視神経などの眼の異なる領域に投与されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターはまた、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、及び前頭葉、皮質、基底核、海馬、及び偏桃体（portaamygdala）を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、並びに下丘中に導入されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達されてもよい。ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、更に、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍又は脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与されてもよい。
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、当該技術分野において既知の任意の経路によって眼の所望の領域に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、及び眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、並びに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ中の所望の領域又は区画への直接注射（例えば、定位的注射）によって、液体製剤中で投与される。他の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の領域への局所適用によって、又はエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。更なる代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。更に追加の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患及び障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療、改善、及び／又は予防することができる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、筋組織に送達され得、そこからニューロン中に移動し得る。
Ｃ．エクスビボ治療
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボの治療のために対象から細胞を取り出し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照、その開示は、その全体が本明細書に組み込まれる）。代替的に、ｃｅＤＮＡベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、又は任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで形質導入された細胞は、好ましくは、薬学的担体と組み合わせて「治療有効量」で対象に投与される。当業者であれば、いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完全又は治癒的である必要はないことを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで細胞内で産生される、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質（導入遺伝子又は異種ヌクレオチド配列と呼ばれることもある）をコードすることができる。例えば、本明細書で論じられる治療方法における本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの使用とは対照的に、いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを培養した細胞に導入し、発現したＰＦＩＣ治療用タンパク質を、例えば、抗体及び融合タンパク質の産生のために細胞から単離することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む培養細胞は、抗体又は融合タンパク質の商業的産生に使用することができ、例えば、抗体又は融合タンパク質の小規模又は大規模バイオ製造の細胞源として役立つ。代替的な実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、小規模な産生を含む抗体又は融合タンパク質のインビボ産生並びに商業的な大規模ＰＦＩＣタンパク質産生のために、宿主非ヒト対象の細胞に導入される。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、獣医学及び医学の両方の用途で使用することができる。上記のエクスビボ遺伝子送達方法に好適な対象としては、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、及びキジ）及び哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、及びウサギ類）が挙げられ、哺乳動物が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、幼児、年少者、及び成人を含む。
Ｄ．用量範囲
本明細書では、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターを含む有効量の組成物を対象に投与することを含む治療方法が提供される。当業者によって理解されるように、「有効量」という用語は、ＰＦＩＣ疾患の治療のための「治療有効量」でのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現をもたらす、投与されたｃｅＤＮＡ組成物の量を指す。
インビボ及び／又はインビトロアッセイを任意選択的に用いて、使用のための最適投与量範囲を特定するのを助けることができる。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与経路及び病態の重症度に依存し、当業者の判断及び各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、例えば、インビトロ又は動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推定され得る。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに十分なレベルの遺伝子導入及び発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、「投与」セクションで上述されたもの、例えば選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内及び気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び他の非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与経路は、所望の場合、組み合わせることができる。
特定の「治療効果」を達成するために必要な、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの量の用量は、核酸投与の経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子又はＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患又は障害、及び遺伝子、ＲＮＡ産物、又は得られる発現タンパク質の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて変化するであろう。当業者は、前述の因子並びに当該技術分野において周知の他の因子に基づいて、特定疾患又は障害を有する患者を治療するためのｃｅＤＮＡベクター用量範囲を容易に判定することができる。
最適な治療応答を提供するように、投与量レジームを調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返し投与することができ、例えば、数回用量が毎日投与され得るか、又は治療状況の急迫によって示されるように、用量を比例的に低減することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるか、又は対象に投与されるかにかかわらず、対象オリゴヌクレオチドの投与の適切な用量及びスケジュールを容易に判定することができるであろう。
「治療有効量」は、臨床治験を通じて判定され得る比較的広い範囲内に含まれ、特定の用途に依存する（神経細胞は、極少量を必要とするが、全身注射は、多量を必要とする）であろう。例えば、ヒト対象の骨格筋又は心筋への直接インビボ注射の場合、治療有効量は、およそ約１μｇ～１００ｇのｃｅＤＮＡベクターとなるであろう。ｃｅＤＮＡベクターを送達するためにエキソソーム又は微粒子が使用される場合、治療有効量は、経験的に判定され得るが、１μｇ～約１００ｇのベクターを送達することが予想される。更に、治療有効量とは、疾患の１つ以上の症状の低減をもたらすが、著しいオフターゲット又は著しい有害副作用には至らない、対象に影響を与えるのに十分な量の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡベクターの量である。一実施形態では、「治療有効量」は、ＰＦＩＣ疾患バイオマーカーの発現の統計的に有意な測定可能な変化又は所与の疾患症状の低減をもたらすのに十分である、発現したＰＦＩＣ治療用タンパク質の量である。そのような有効量は、所与のｃｅＤＮＡベクター組成物についての臨床試験及び動物実験で評価することができる。
薬学的に許容される賦形剤及び担体溶液の配合は、様々な治療計画において本明細書に記載される特定の組成物を使用するための好適な投与及び治療計画の開発と同様に、当業者に周知である。
インビトロトランスフェクションの場合、細胞（１×１０６細胞）に送達される本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの有効量は、およそ０．１～１００μｇのｃｅＤＮＡベクター、好ましくは１～２０μｇ、より好ましくは１～１５μｇ又は８～１０μｇとなる。より大きなｃｅＤＮＡベクターは、より多い用量を必要とするであろう。エキソソーム又は微粒子が使用される場合、有効なインビトロ用量は、経験的に判定され得るが、一般に同量のｃｅＤＮＡベクターを送達することが意図される。
ＰＦＩＣ疾患の治療のために、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターの適切な投与量は、治療される特定のタイプの疾患、ＰＦＩＣ治療用タンパク質のタイプ、ＰＦＩＣ疾患の重症度及び経過、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存する。ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターは、一度に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。本明細書では、様々な時点にわたる単回投与又は複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない、様々な投与スケジュールが企図される。
疾患のタイプ及び重症度に応じて、ｃｅＤＮＡベクターは、コードされたＰＦＩＣ治療用タンパク質が、約０．３ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、１５ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、又はその範囲内の任意の投与量）で発現される量で、１回以上の別々の投与、又は持続注入によって投与される。ｃｅＤＮＡベクターの１つの典型的な１日用量は、上述の要因に応じて、約１５ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲でコードされたＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現をもたらすのに十分である。ｃｅＤＮＡベクターの１つの例示的な用量は、約１０ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの範囲の、本明細書に開示されるコードされたＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現をもたらすのに十分な量である。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、８０ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ、又は１００ｍｇ／ｋｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）でコードされたＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現をもたらすのに十分な量のｃｅＤＮＡベクターの１回以上の用量を患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、５０ｍｇ～２５００ｍｇの範囲の総用量について、コードされたＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現をもたらすのに十分な量である。ｃｅＤＮＡベクターの例示的な用量は、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約７２０ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１０５０ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１９００ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２０５０ｍｇ、約２１００ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２４００ｍｇ、又は約２５００ｍｇ（又はそれらの任意の組み合わせ）でコードされたＰＦＩＣ治療用タンパク質の総発現をもたらすのに十分な量である。ｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現は、本明細書の調節スイッチによって、又は代替的に対象に投与される複数回用量のｃｅＤＮＡベクターによって慎重に制御され得るため、ｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現は、発現されたＰＦＩＣ治療用タンパク質の用量が断続的に、例えば、毎週、２週間毎、３週間毎、４週間毎、毎月、２ヶ月毎、３ヶ月毎、又は６ヶ月毎に投与され得るような方法で制御され得る。この治療法の進行は、従来の技法及びアッセイによってモニタリングされ得る。
ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇの用量で、又は一定用量、例えば３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ以上で、コードされたＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現をもたらすのに十分な量で投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質が一定期間にわたって毎日、隔日、毎週、２週間毎、又は４週間毎に発現されるように制御される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質が一定期間にわたって２週間毎又は４週間毎に発現されるように制御される。ある特定の実施形態では、期間は、６ヶ月、１年、１８ヶ月、２年、５年、１０年、１５年、２０年、又は患者の生涯である。
治療は、単一用量又は複数回用量の投与を必要とし得る。いくつかの実施形態では、２回以上の用量が対象に投与され得る。実際、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルス性カプシドの不在に起因して、抗カプシド宿主免疫応答を誘起しないため、複数回用量が、必要に応じて投与され得る。そのようなものとして、当業者は、適切な用量数を判定することができる。投与される用量数は、例えば、およそ１～１００、好ましくは２～２０用量であり得る。
任意の特定の理論に束縛されるものではないが、本開示によって記載されるｃｅＤＮＡベクターの投与によって誘起される典型的な抗ウイルス免疫応答の欠失（すなわち、カプシド構成成分の不在）は、複数の場合にＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを宿主に投与することが可能になる。いくつかの実施形態では、異種核酸が対象に送達される場合の数は、２～１０回の範囲内（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回）である。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１１回以上対象に送達される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦日（例えば、２４時間）当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２、３、４、５、６、又は７暦日当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴週（例えば、７歴日）当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２週間に１回（例えば、２暦週期間に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦月当たり１回（例えば、３０歴日に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、６暦月当たり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴年（例えば、３６５日又は閏年では３６６日）当たり１回だけ対象に投与される。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの２回以上の投与（例えば、２、３、４回又はそれ以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間にわたって（例えば、毎日、毎週、毎月、毎年など）、所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターによってコードされる治療用ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、それが対象において少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１２ヶ月／１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも１５年、少なくとも２０年、少なくとも３０年、少なくとも４０年、少なくとも５０年以上にわたって発現されるように、調節スイッチ、誘導性又は抑制性プロモーターによって調節され得る。一実施形態では、発現は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを所定の又は所望の間隔で繰り返し投与することによって達成することができる。代替的に、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子編集系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼなど）の構成成分を更に含み、実質的に永久的な治療又は疾患の「治癒」のためのＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列の挿入を可能にし得る。遺伝子編集構成成分を含むそのようなｃｅＤＮＡベクターは、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／６４２４２号に開示されており、限定されないが、ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする核酸をアルブミン遺伝子又はＣＣＲ５遺伝子などのセーフハーバー領域に挿入するために、５’及び３’相同性アーム（例えば、配列番号１５１～１５４、又はそれと少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％の相同性を有する配列）を含み得る。例として、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターは、ＰＦＩＣ導入遺伝子をゲノムセーフハーバーに挿入するための少なくとも１つのゲノムセーフハーバー（genomic safe harbor、ＧＳＨ）特異的相同性アームを含むことができ、２０１９年３月１日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２０２２５号に開示されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
治療の持続期間は、対象の臨床的進歩及び治療への応答性に依存する。継続的で比較的低い維持用量は、初回のより高い治療用量の後に企図される。
Ｅ．単位剤形
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的組成物は、単位剤形で都合よく提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合されるであろう。いくつかの実施形態では、単位剤形は、液滴が眼に直接投与されるように適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、又は舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、又は皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、網膜下注射、脈絡膜上注射、又は硝子体内注射に適合される。
いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内又は脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と組み合わされ得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。
Ｘ．治療方法
本明細書に記載される技術はまた、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のための開示されるｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、並びにそれを様々な方法（例えば、エクスビボ、エクスサイチュ、インビトロ、及びインビボ適用、方法論、診断手順、並びに／又は遺伝子療法計画）で使用する方法を実証する。
一実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターから発現される発現された治療用ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、疾患の治療に機能的である。好ましい実施形態では、治療用ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、それが望まれない限り、免疫系反応を引き起こさない。
治療有効量の、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（例えば、筋細胞若しくは組織、又は他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象におけるＰＦＩＣ疾患を治療する方法が、本明細書に提供される。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実施されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。具体的には、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のＰＦＩＣ治療用タンパク質の転写を指示することができる制御エレメントに作動可能に連結された所望のＰＦＩＣ治療用タンパク質ＤＮＡ配列を含み得る。本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、上記及び本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
本開示のｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、１種以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、又は賦形剤と一緒に含む、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクター組成物及び製剤が、本明細書に開示される。そのような組成物は、ＰＦＩＣ疾患の１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するための、１つ以上の診断的又は治療的キットに含まれ得る。一態様では、疾患、傷害、障害、外傷、又は機能不全は、ヒト疾患、傷害、障害、外傷、又は機能不全である。
本明細書に記載される技術の別の態様は、診断的又は治療的に有効な量の本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象に提供するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示されるある量のｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象の細胞、組織、又は器官に、ｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を可能にするのに有効な時間にわたって提供し、それによって診断的又は治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクターによって発現されたＰＦＩＣ治療用タンパク質を対象に提供することを含む。更なる態様では、対象は、ヒトである。
本明細書に記載される技術の別の態様は、対象におけるＰＦＩＣ疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、又は外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するための方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくともＰＦＩＣ治療用タンパク質の産生のための開示されるｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、又は外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、又は改善するための量及び時間にわたって投与するステップを含む。そのような実施形態では、対象は、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の有効性、又は代替的に、対象におけるＰＦＩＣ治療用タンパク質若しくはＰＦＩＣ治療用タンパク質の組織位置（細胞及び細胞内位置を含む）の検出について評価され得る。したがって、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、例えば、がん又は他の適応症の検出のためのインビボ診断ツールとして使用することができる。更なる態様では、対象は、ヒトである。
別の態様は、ＰＦＩＣ疾患又は疾患状態の１つ以上の症状を治療又は低減するためのツールとしての、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターの使用である。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝性疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節又は構造タンパク質に関与し得るが、典型的に常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。不均衡疾患状態の場合、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを使用して、モデル系においてＰＦＩＣ疾患状態を作り出すことができ、次いでこれを使用して、その疾患状態に対処する試みに使用することができる。したがって、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、ＰＦＩＣ疾患状態は、疾患を引き起こす、又はそれをより重篤にする欠乏又は不均衡を部分的又は全体的に修繕することによって治療される。
Ａ．宿主細胞：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質導入遺伝子を対象の宿主細胞に送達する。いくつかの実施形態では、細胞は、光受容細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ＲＰＥ細胞である。いくつかの実施形態では、対象の宿主細胞は、ヒト宿主細胞であり、例えば、血液細胞、幹細胞、造血細胞、ＣＤ３４＋細胞、肝細胞、がん細胞、血管細胞、筋細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼若しくは網膜細胞、上皮若しくは内皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞、又は哺乳動物起源の任意の他の細胞（無制限に、肝（すなわち、肝臓）細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、横隔膜細胞、腎（すなわち、腎臓）細胞、ニューロン細胞、血液細胞、骨髄細胞、若しくは遺伝子療法が企図される対象のいずれか１つ以上の選択された組織を含む）が挙げられる。一態様では、対象宿主細胞は、ヒト宿主細胞である。
本開示はまた、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを含む、上述のような組換え宿主細胞に関する。したがって、当業者には明らかであるように、目的に応じて複数の宿主細胞を使用することができる。構築物、又はドナー配列を含む本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に導入して、ドナー配列が、前述のように染色体組み込み体として維持されるようにする。宿主細胞という用語は、複製中に生じる変異のために親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ドナー配列及びその供給源に大きく依存する。
宿主細胞はまた、哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞などの真核生物であってもよい。一実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞（例えば、初代細胞、幹細胞、又は不死化細胞株）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターをエクスビボで投与され、次いで遺伝子療法事象の後に対象に送達され得る。宿主細胞は、任意の細胞型、例えば、体細胞又は幹細胞、人工多能性幹細胞、又は血液細胞、例えば、Ｔ細胞若しくはＢ細胞、又は骨髄細胞であり得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、同種細胞である。例えば、Ｔ細胞ゲノム操作は、がん免疫療法、ＨＩＶ療法（例えば、ＣＸＣＲ４及びＣＣＲ５などの受容体ノックアウト）などの疾患調整、及び免疫不全療法に有用である。Ｂ細胞上のＭＨＣ受容体は、免疫療法の標的となり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾型宿主細胞、例えば、骨髄幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞、又は人工多能性幹細胞を、治療用タンパク質の発現のために患者に移植して戻すことができる。
Ｂ．遺伝子療法のための追加の疾患：
一般に、上記の説明に従って本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを使用して、任意のＰＦＩＣ治療用タンパク質を送達して、対象における異常タンパク質発現又は遺伝子発現に関するＰＦＩＣ疾患に関連する症状を治療、予防、又は改善することができる。
いくつかの実施形態では、血液中の分泌及び循環のためのＰＦＩＣ治療用タンパク質の産生のため、あるいは進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）疾患を治療、改善、及び／又は予防するための他の組織への全身送達のために、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを使用して、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を骨格筋、心筋、又は横隔膜筋に送達することができる。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターを、任意の好適な手段によって、任意選択的に、ｃｅＤＮＡベクターを含む呼吸域粒子のエアロゾル懸濁液を投与する（これを対象が吸入する）ことによって、対象の肺に投与することができる。呼吸域粒子は、液体又は固体であり得る。ｃｅＤＮＡベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に既知であるように、圧力駆動型エアロゾル噴霧器又は超音波噴霧器を用いるなど、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ｃｅＤＮＡベクターを含む固体粒子のエアロゾルは、薬学分野において既知の技法によって、任意の固体粒子状薬剤エアロゾル生成器を用いて同様に産生され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳、眼、脊髄液など）の組織に投与することができる。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで治療、改善、又は予防され得る眼障害としては、網膜、後視床路、及び視神経に関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性、糖尿病性網膜症、及び他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障）が挙げられる。多くの眼科疾患及び障害は、（１）血管新生、（２）炎症、及び（３）変性の３タイプの適応症の１つ以上に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、抗血管新生因子、抗炎症因子、細胞の変性をせるか、細胞温存を促進するか、又は細胞増殖を促進する因子、及び前述のものの組み合わせを送達するために用いることができる。糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体内）又は眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）のいずれかで１つ以上の抗血管新生抗体又は融合タンパク質を送達することによって治療され得る。本開示のｃｅＤＮＡベクターで治療、改善、又は予防され得る追加の眼疾患としては、地図状萎縮、血管性又は「滲出型」黄斑変性、ＰＫＵ、レーバー先天黒内障（Leber Congenital Amaurosis、ＬＣＡ）、アッシャー症候群、弾性線維性偽性黄色腫（pseudoxanthomaelasticum、ＰＸＥ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性（x-linked retinitis pigmentosa、ＸＬＲＰ）、Ｘ連鎖性網膜分離症（x-linkedretinoschisis、ＸＬＲＳ）、全脈絡膜萎縮、レーバー遺伝性視神経萎縮症（Leber hereditary optic neuropathy、ＬＨＯＮ）、色盲、錐体杆体変性、フックス角膜内皮変性症、糖尿病黄斑浮腫、並びに眼のがん及び腫瘍が挙げられる。
いくつかの実施形態では、炎症性眼疾患又は障害（例えば、ブドウ膜炎）は、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターによって治療、改善、又は予防され得る。１つ以上の抗炎症性抗体又は融合タンパク質は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの眼内（例えば、硝子体又は前眼房）投与によって発現され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、レポーターポリペプチドをコードする導入遺伝子（例えば、緑色蛍光タンパク質又はアルカリホスファターゼなどの酵素）に関連するＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードすることができる。いくつかの実施形態では、実験又は診断の目的で有用なレポータータンパク質をコードする導入遺伝子は、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、及び当該技術分野において周知の他のもののうちのいずれかから選択される。いくつかの態様では、レポーターポリペプチドに連結されたＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターを、診断目的のために、並びに有効性を決定するため、又はそれらが投与される対象におけるｃｅＤＮＡベクターの活性のマーカーとして使用することができる。
Ｃ．ｃｅＤＮＡベクターを使用した良好な遺伝子発現の試験
当該技術分野で周知のアッセイを使用して、ｃｅＤＮＡベクターによるＰＦＩＣ治療用タンパク質の遺伝子送達の効率を試験することができ、インビトロ及びインビボの両方のモデルで実施され得る。ｃｅＤＮＡによるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のレベルは、ＰＦＩＣ治療用タンパク質のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを測定することによって（例えば、逆転写ＰＣＲ、ウェスタンブロット分析、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ））当業者により評価され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡは、例えば、蛍光顕微鏡法又は発光プレートリーダーによりレポータータンパク質の発現を調べることによって、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を評価するために使用できるレポータータンパク質を含む。インビボ適用の場合、タンパク質機能アッセイを使用して、所与のＰＦＩＣ治療用タンパク質の機能を試験して、遺伝子発現が成功したかどうかを判断することができる。当業者は、インビトロ又はインビボでｃｅＤＮＡベクターによって発現されたＰＦＩＣ治療用タンパク質の機能を測定するための最良の試験を決定することができるであろう。
本明細書では、細胞又は対象におけるｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質の遺伝子発現の効果は、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１０ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも１８ヶ月、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年にわたって継続し得るか、又は永続的であり得ることが企図される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセット、発現構築物、又はｃｅＤＮＡベクター中のＰＦＩＣ治療用タンパク質は、宿主細胞に対して最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」又は「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウス又はヒト（例えば、ヒト化された）の細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、又は相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的に、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化及びカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）又は別の公的に入手可能なデータベースを使用して判定され得る。
Ｄ．ｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質発現を評価することによる有効性の決定
本質的に、タンパク質発現を決定するための当該技術分野で既知の任意の方法を使用して、ｃｅＤＮＡベクターからのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現を分析することができる。そのような方法／アッセイの非限定的な例には、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、親和性ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、連続希釈、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴分析、速度論的排除アッセイ、質量分析、ウェスタンブロット、免疫沈降、及びＰＣＲが含まれる。
インビボでのＰＦＩＣ治療用タンパク質発現を評価する場合、分析のために生物学的試料を対象から取得することができる。例示的な生体試料には、生体液試料、体液試料、血液（全血を含む）、血清、血漿、尿、唾液、生検及び／又は組織試料などが含まれる。生体試料又は組織試料はまた、腫瘍生検、便、脊髄液、胸膜液、乳頭吸引液、リンパ液、皮膚の外切片、呼吸器、腸管、尿生殖路、涙、唾液、母乳、細胞（血液細胞を含むがこれに限定されない）、腫瘍、臓器、及びインビトロ細胞培養成分の試料を含むがこれらに限定されない、個人から分離された組織又は体液の試料も指し得る。この用語はまた、上述の試料の混合物も含む。「試料」という用語は、未治療又は前治療済み（又は前処理済み）の生体試料も含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるアッセイ及び方法に使用される試料は、試験される対象から収集された血清試料を含む。
Ｅ．臨床パラメータによる発現されたＰＦＩＣ治療用タンパク質の有効性の決定
ＰＦＩＣ疾患のためのｃｅＤＮＡベクターによって発現される所与のＰＦＩＣ治療用タンパク質の有効性（すなわち、機能的発現）は、熟練した臨床医によって決定され得る。しかしながら、ＰＦＩＣの兆候又は症状のいずれか１つ又は全てが有益な方法で変更された場合、又は他の臨床的に許容される疾患の症状又はマーカーが、例えば、本明細書に記載される治療用ＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードするｃｅＤＮＡベクターでの治療後に少なくとも１０％向上又は改善された場合、その用語が本明細書において使用されるように、治療は「有効な治療」とみなされる。有効性はまた、ＰＦＩＣ疾患の安定化、又は医療介入の必要性（すなわち、疾患の進行が停止するか、少なくとも遅くなる）によって評価される個人の悪化の失敗によって測定することもできる。これらの指標を測定する方法は、当業者に既知であり、かつ／又は本明細書に記載される。治療は、個人又は動物（いくつかの非限定的な例としては、ヒト又は哺乳動物が挙げられる）における疾患の任意の治療を含み、以下：（１）ＰＦＩＣを阻害すること、例えば、ＰＦＩＣ疾患の進行の停止若しくは遅延させること、又は（２）ＰＦＩＣ疾患の症状を緩和すること、例えば、ＰＦＩＣ疾患症状の軽減を引き起こすこと、及び（３）ＰＦＩＣ疾患の発症の可能性を防止若しくは低減すること、又はＰＦＩＣ疾患に関連する二次的疾患／障害（例えば、関節リウマチによる手の変形、若しくはがん転移）を防止することを含む。疾患の治療のための有効量とは、それを必要とする哺乳動物に投与した場合、その用語が本明細書で定義されているように、その疾患に対して有効な治療をもたらすのに十分である量を意味する。薬剤の有効性は、ＰＦＩＣ疾患に特有の物理的指標を評価することによって決定することができる。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターの有効性は、所与のＰＦＩＣ疾患に特有の物理的指標を評価することによって決定することができる。疾患指標の標準的な分析方法は、当該技術分野で既知である。例えば、ＰＦＩＣの物理的指標としては、肝臓の炎症、胆管損傷、肝細胞損傷、及び胆汁うっ滞が挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な例として、胆汁うっ滞の血清マーカーとしては、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び胆汁酸（ＢＡ）が挙げられる。血性ビリルビン、血清中トリグリセリドレベル、及び血清中コレステロールレベルもまた、例えばＰＦＩＣによる肝損傷を示す。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）は、肝細胞損傷の１つのマーカーである。肝臓炎症及び管周囲線維症は、例えば、ＴＮＦ－α、Ｍｃｐ－１、及びＶｃａｍ－１のｍＲＮＡ発現、並びにＣｏｌ１ａ１及びＣｏｌ１ａ２などの胆管線維症マーカーの発現の測定によって分析することができる。
ＸＩ．抗体又は融合タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターの様々な適用
本明細書に開示されるように、本明細書に記載されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のための組成物及びｃｅＤＮＡベクターを使用して、一連の目的のためにＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現することができる。一実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターを使用して、例えば、ＰＦＩＣの機能又は疾患の進行を研究するために、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成することができる。いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターは、哺乳動物対象のＰＦＩＣ状態又は障害の治療、予防、又は改善に有用である。
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、発現の増加、遺伝子産物の活性の増加、又は遺伝子の不適切な上方調節に関連するＰＦＩＣ疾患を治療するのに十分な量で対象のｃｅＤＮＡベクターから発現され得る。
いくつかの実施形態では、ＰＦＩＣ治療用タンパク質は、タンパク質の発現の低下、発現の欠如、又は機能不全を含むものを治療するのに十分な量で対象のｃｅＤＮＡベクターから発現させることができる。
導入遺伝子は、それ自体が転写される遺伝子のオープンリーディングフレームでなくてもよく、代わりに、それが標的遺伝子のプロモーター領域又はリプレッサー領域であってもよく、ｃｅＤＮＡベクターがそのような領域を修飾して、ＰＦＩＣ遺伝子の発現をそのように調節してもよいことが、当業者によって理解されるであろう。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のための組成物及びｃｅＤＮＡベクターを使用して、上記のような様々な目的のためにＰＦＩＣ治療用タンパク質を送達することができる。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳動物対象におけるＰＦＩＣ疾患状態の治療、改善、又は予防に有用である、１つ以上のＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする。ｃｅＤＮＡベクターによって発現されたＰＦＩＣ治療用タンパク質は、異常な遺伝子配列に関連するＰＦＩＣ疾患を治療するのに十分な量で患者に投与され、これはタンパク質発現の増加、タンパク質の過剰活性、標的遺伝子又はタンパク質の発現の低減、発現の欠如、又は機能不全のうちのいずれか１つ以上をもたらし得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターは、診断及びスクリーニング方法における使用のために想定され、これによりＰＦＩＣ治療用タンパク質は、細胞培養系又は代替的にトランスジェニック動物モデルにおいて一時的又は安定して発現される。
本明細書に記載されている技術の別の態様は、本明細書に開示されているＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターで哺乳動物細胞の集団を形質導入する方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも有効量の本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を含む組成物を、その集団の１つ以上の細胞に導入するステップを含む。
追加的に、本開示は、１つ以上の追加の成分で製剤化されるか、又はそれらの使用のために１つ以上の指示で調製された、本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のための開示されるｃｅＤＮＡベクター又はｃｅＤＮＡ組成物のうちの１つ以上を含む、組成物、並びに治療及び／又は診断キットを提供する。
本明細書に開示されるＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現のためのｃｅＤＮＡベクターが投与される細胞は、任意のタイプのものであり得、神経細胞（末梢及び中枢神経系の細胞、具体的には脳細胞を含む）、肺細胞、腎細胞、上皮細胞（例えば、胃及び呼吸器上皮細胞）、筋細胞、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、細胞は、任意の前駆細胞であり得る。更なる代替として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝幹細胞）であり得る。なおも更なる代替として、細胞は、がん又は腫瘍細胞であり得る。更に、細胞は、上に示されるように、任意の種の起源に由来し得る。
Ａ．ＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現するｃｅＤＮＡベクターの産生及び精製
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、インビトロ又はインビボのいずれかでＰＦＩＣ治療用タンパク質を産生するために使用される。この方法で産生されたＰＦＩＣ治療用タンパク質は、単離され、所望の機能について試験され、研究での更なる使用又は治療的治療として精製され得る。タンパク質の産生の各系には、独自の利点／欠点がある。インビトロで産生されたタンパク質は容易に精製することができ、短時間でタンパク質を産生することができるが、インビボで産生されたタンパク質は、グリコシル化などの翻訳後修飾を有し得る。
ｃｅＤＮＡベクターを使用して産生されたＰＦＩＣ治療用タンパク質は、当業者に既知の任意の方法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、沈殿、又は電気泳動を使用して精製することができる。
本明細書に記載される方法及び組成物によって産生されたＰＦＩＣ治療用タンパク質は、所望の標的タンパク質への結合について試験することができる。
以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。本明細書に記載される野生型又は修飾型ＩＴＲのうちのいずれかからｃｅＤＮＡベクターを構築できること、及び以下の例示的な方法を使用して、そのようなｃｅＤＮＡベクターの活性を構築し、評価できることを当業者は理解するであろう。これらの方法は、ある特定のｃｅＤＮＡベクターを用いて例示されているが、それらは、説明に沿って任意のｃｅＤＮＡベクターに適用可能である。
実施例１：昆虫細胞ベースの方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを構築する
ポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用したｃｅＤＮＡベクターの産生は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の実施例１に記載される。例えば、本開示のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）及び発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複製する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、及び第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
ｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ－プラスミドに由来する。図１Ａ及び図１Ｂを参照すると、ｃｅＤＮＡ－プラスミドの各々のポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左修飾型ＩＴＲ及び右修飾型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列間に以下を有する：（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後応答エレメント例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、及び（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）由来）。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１～Ｒ６）（図１Ａ及び図１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入され、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号１２３）及びＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１２４）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中で操作される。これらの配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標）から取得したｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ Ｂプラスミドにクローニングした。
ｃｅＤＮＡ－バクミドの産生：
ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標））を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミド又は対照プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを生成した。バクミド及びトランスポサーゼプラスミドの形質転換体及び維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ－ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する細菌寒天プレート上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組換えバクミドを選択した。β－ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍｌの培地中で培養した。
組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを、Ｅ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍｌの培地で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞又は細胞残屑から分離した。
任意選択的に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０～５００ｍｌの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４～１５ｎｍのナイーブ直径から）１８～１９ｎｍの直径及び約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に到達するまで、細胞直径及び生存率をモニタリングした。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に採取し、細胞及び残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
試験構築物を含むｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性又は力価を決定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍｌの４×２０ｍｌ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５～２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度及び細胞周期停止、並びに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日判定した。
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の図８Ａに開示される「Ｒｅｐ－プラスミド」を、Ｒｅｐ７８（配列番号１３１若しくは１３３）及びＲｅｐ５２（配列番号１３２）又はＲｅｐ６８（配列番号１３０）及びＲｅｐ４０（配列番号１２９）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））において産生した。Ｒｅｐ－プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標））中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ－プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えバクミド（「Ｒｅｐ－バクミド」）を生成した。Ｘ－ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）を含む正の選択によって、組換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍｌの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン）中に播種した。組換えバクミド（Ｒｅｐ－バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ－バクミドをＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。
Ｓｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍｌの培地中で４日間培養し、感染性組換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ－バキュロウイルス」）を、培養物から単離した。任意選択的に、第１世代のＲｅｐ－バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０～５００ｍｌの培地中で培養した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、又は濾過若しくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を決定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベーションした。感染性は、細胞直径増加の速度及び細胞周期停止、並びに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日判定した。
ｃｅＤＮＡベクター生成及び特徴付け
図４Ｂを参照して、次いで、（１）ｃｅＤＮＡ－バクミド又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを含有する試料、及び（２）上記のＲｅｐ－バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍｌ、２０ｍｌ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００及び１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４～５日後に、細胞の直径及び生存率が検出される。生存率が約７０～８０％で細胞直径が１８～２０ｎｍに到達した場合、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを回収した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水又は緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ ＭＩＤＩ ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、カラム当たり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
Ｓｆ９昆虫細胞から産生及び精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定された。
ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに例示されるような未変性条件又は変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって同定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断及びゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、並びに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体及び二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。
単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、共感染Ｓｆ９細胞から得られたＤＮＡ（本明細書に記載されるように）を、制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、及びｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画したときに明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片について更に分析した。図４Ｄ及び図４Ｅに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクター及び直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂ及び２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有する非カプシド化ベクターは、２ｋｂ及び４ｋｂ断片を産生することが期待される。
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると同定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐ及び２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化及び電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的閉鎖状ＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さである場合（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐ及び２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的閉鎖状ＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐ及び４０００ｂｐ）で溶解するであろう。更に、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、及びｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片として全て溶解する（図４Ｄを参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「未変性ゲル及び変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３倍及び２／３倍のＤＮＡベクター長の産物を生成するであろう目的のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲル及び変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキット又は脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）Ｇ－２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０倍変性溶液（１０倍＝０．５Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、１０倍色素を添加し、緩衝せず、１０倍変性溶液を、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２００ｍＭ ＮａＯＨで以前にインキュベーションされた０．８～１．０％ゲル上で４倍に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲル及びゲルボックス中で均一であり、１倍変性溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズ及び所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解するであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１倍ＴＢＥ又はＴＡＥ中で中和し、蒸留水又は１倍ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを含む１倍ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標）のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（ＤＭＳＯ中１０，０００倍濃縮物）及び落射蛍光灯（青色）又はＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。
生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ－プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に充填し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミドタイトレーションを使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、又は純度パーセントを決定することができる。
比較目的のため、実施例１は、昆虫細胞ベースの方法及びポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用するｃｅＤＮＡベクターの産生を記載し、また参照により全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の実施例１にも記載される。例えば、実施例１に従って本開示のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、及び／又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）及び発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複合する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、及び第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
昆虫細胞を使用する方法でｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ－プラスミドに由来する。図１Ａ及び図１Ｂを参照すると、ｃｅＤＮＡ－プラスミドの各々のポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左修飾型ＩＴＲ及び右修飾型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列間に以下を有する：（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後応答エレメント例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、及び（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）由来）。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１～Ｒ６）（図１Ａ及び図１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入され、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号１２３）及びＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１２４）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中で操作される。これらの配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ Ｂプラスミドにクローニングした。
ｃｅＤＮＡ－バクミドの産生：
ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標））を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミド又は対照プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを生成した。バクミド及びトランスポサーゼプラスミドの形質転換体及び維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ－ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組換えバクミドを選択した。β－ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍｌの培地中で培養した。
組換えｃｅＤＮＡ－バクミドを、Ｅ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍｌの培地で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞又は細胞残屑から分離した。
任意選択的に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０～５００ｍｌの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４～１５ｎｍのナイーブ直径から）１８～１９ｎｍの直径及び約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度に到達するまで、細胞直径及び生存率をモニタリングした。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に採取し、細胞及び残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
試験構築物を含むｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性又は力価を決定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍｌの４×２０ｍｌ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５～２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度及び細胞周期停止、並びに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日判定した。
「Ｒｅｐ－プラスミド」は、Ｒｅｐ７８（配列番号１３１若しくは１３３）又はＲｅｐ６８（配列番号１３０）及びＲｅｐ５２（配列番号１３２）又はＲｅｐ４０（配列番号１２９）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））において産生された。Ｒｅｐ－プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標））中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ－プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組換えを誘導して、組換えバクミド（「Ｒｅｐ－バクミド」）を生成した。Ｘ－ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）を含む正の選択によって、組換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍｌの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラサイクリン）中に播種した。組換えバクミド（Ｒｅｐ－バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ－バクミドをＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。
Ｓｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍｌの培地中で４日間培養し、感染性組換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ－バキュロウイルス」）を、培養物から単離した。任意選択的に、第１世代のＲｅｐ－バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９又はＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０～５００ｍｌの培地中で培養した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、又は濾過若しくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を決定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベーションした。感染性は、細胞直径増加の速度及び細胞周期停止、並びに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日決定した。
ｃｅＤＮＡベクター生成及び特徴付け
次いで、（１）ｃｅＤＮＡ－バクミド又はｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを含有する試料、及び（２）上記のＲｅｐ－バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍｌ、２０ｍｌ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００及び１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４～５日後に、細胞の直径及び生存率が検出される。生存率が約７０～８０％で細胞直径が１８～２０ｎｍに到達した場合、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを回収した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水又は緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ ＭＩＤＩ ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）、カラム当たり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
Ｓｆ９昆虫細胞から産生及び精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定された。精製されたｃｅＤＮＡベクターは、実施例５に記載される電気泳動方法論を使用して、適切な閉端構成について評価され得る。
実施例２：二本鎖ＤＮＡ分子からの切除による合成ｃｅＤＮＡ産生
ｃｅＤＮＡベクターの合成産生は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１９年１月１８日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の実施例２～６に記載される。二本鎖ＤＮＡ分子の切除を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する１つの例示的な方法。簡潔には、ｃｅＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物を使用して生成され得る。例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の図７Ａ～図８Ｅを参照されたい。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物はｃｅＤＮＡプラスミドであり、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図６を参照されたい）。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチを含む。
例示の目的のため、実施例２は、この方法を使用して生成された例示的な閉端ＤＮＡベクターとして、ｃｅＤＮＡベクターを産生することを説明する。しかしながら、この実施例では、ＩＴＲ及び発現カセット（例えば、異種核酸配列）を含む二本鎖ポリヌクレオチドの切除に続いて、本明細書に記載される遊離３’及び５’末端のライゲーションによって閉端ＤＮＡベクターを生成するインビトロ合成産生方法を例証するためにｃｅＤＮＡベクターが例示されているが、当業者は、上で例証されるように、ドギーボーンＤＮＡ、ダンベルＤＮＡなどを含むが、これらに限定されない任意の所望の閉端ＤＮＡベクターが生成されるように、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド分子を修飾できることを認識する。実施例２に記載される合成産生方法により産生され得る抗体又は融合タンパク質の産生のための例示的なｃｅＤＮＡベクターは、「ＩＩＩ ｃｅＤＮＡベクター全般」と題されたセクションで論じられている。ｃｅＤＮＡベクターによって発現される例示的な抗体及び融合タンパク質は、「ＩＩＣ ｃｅＤＮＡベクターによって発現される例示的な抗体及び融合タンパク質」と題されたセクションに記載される。
本方法は、（ｉ）二本鎖ＤＮＡ構築物から発現カセットをコードする配列を切除することと、（ｉｉ）ＩＴＲのうちの１つ以上でヘアピン構造を形成することと、（ｉｉｉ）ライゲーションによって、例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって遊離５’及び３’末端を結合することと、を伴う。
二本鎖ＤＮＡ構築物は、５’から３’への順に、第１の制限エンドヌクレアーゼ部位、上流ＩＴＲ、発現カセットと、下流ＩＴＲ、及び第２の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。次いで、二本鎖ＤＮＡ構築物を１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させて、制限エンドヌクレアーゼ部位の両方で二本鎖切断を生成する。１つのエンドヌクレアーゼが両方の部位を標的とすることも、制限部位がｃｅＤＮＡベクターテンプレート内に存在しない限り、各部位を異なるエンドヌクレアーゼによって標的とすることもできる。これにより、制限エンドヌクレアーゼ部位の間の配列が、残りの二本鎖ＤＮＡ構築物から切除される（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の図９を参照されたい）。ライゲーションすると、閉端ＤＮＡベクターが形成される。
この方法で使用されるＩＴＲの一方又は両方は、野生型ＩＴＲであり得る。修飾型ＩＴＲが使用されてもよく、ここで修飾は、Ｂ及びＢ’アーム並びに／又はＣ及びＣ’アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含み得（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の図６～図８及び１０、図１１Ｂを参照されたい）、２つ以上のヘアピンループ（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の図６～図８、図１１Ｂを参照されたい）又は単一のヘアピンループ（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の図１０Ａ～図１０Ｂ、図１１Ｂを参照されたい）を有し得る。ヘアピンループ修飾型ＩＴＲは、既存のオリゴの遺伝子修飾によって、又は新規の生物学的合成及び／若しくは化学的合成によって生成され得る。
非限定的な例では、ＩＴＲ－６左及び右（配列番号１１１及び１１２）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ－Ｂ’及びＣ－Ｃ’アームに４０ヌクレオチドの欠失を含む。修飾型ＩＴＲに残っているヌクレオチドは、単一のヘアピン構造を形成すると予測される。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約－５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。機能的Ｒｅｐ結合部位又はＴＲＳ部位の任意の欠失を含む、ＩＴＲへの他の修飾を行うこともできる。
実施例３：オリゴヌクレオチドの構築によるｃｅＤＮＡの産生
様々なオリゴヌクレオチドの構築を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の実施例３に提供されており、ｃｅＤＮＡベクターは、５’オリゴヌクレオチド及び３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。国際出願ＰＴＣ／ＵＳ１９／１４１２２号の図１１Ｂは、５’ＩＴＲオリゴヌクレオチド及び３’ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。
本明細書に開示されるように、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、ＷＴ－ＩＴＲ（例えば、図３Ａ、図３Ｃを参照されたい）、又は修飾型ＩＴＲ（例えば、図３Ｂ及び図３Ｄを参照されたい）を含み得る。（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号（その全体が本明細書に組み込まれる）の図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａ、及び図７Ｂも参照されたい）。例示的なＩＴＲオリゴヌクレオチドには、限定されないが、配列番号１３４～１４５が含まれる（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の表７を参照されたい）。修飾型ＩＴＲは、Ｂ及びＢ’アーム並びに／又はＣ及びＣ’アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、又は置換を含み得る。無細胞合成で使用される、本明細書に記載されるＷＴ－ＩＴＲ又はｍｏｄ－ＩＴＲを含むＩＴＲオリゴヌクレオチドは、遺伝子修飾又は生物学的及び／若しくは化学的合成によって生成することができる。本明細書で論じられるように、実施例２及び３のＩＴＲオリゴヌクレオチドは、本明細書で論じられるように、対称又は非対称構成のＷＴ－ＩＴＲ又は修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）を含み得る。
実施例４：一本鎖ＤＮＡ分子によるｃｅＤＮＡ産生
合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２号の実施例４において提供され、センス発現カセット配列に隣接しアンチセンス発現カセットに隣接する２つのアンチセンスＩＴＲに共有結合的に結合される２つのセンスＩＴＲを含む一本鎖の直鎖状ＤＮＡを使用し、次いで、この一本鎖の直鎖状ＤＮＡの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖ＤＮＡ分子を合成及び／又は産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の１つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状ＤＮＡ分子を形成し、次いで遊離５’及び３’末端を互いにライゲーションして、閉鎖状一本鎖分子を形成する。
ｃｅＤＮＡベクターの産生のための例示的な一本鎖ＤＮＡ分子は、５’から３’に、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、アンチセンス第２のＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、及びアンチセンス第１のＩＴＲを含む。
実施例４の例示的な方法で使用するための一本鎖ＤＮＡ分子は、本明細書に記載される任意のＤＮＡ合成方法論、例えば、インビトロＤＮＡ合成によって形成され得るか、又はヌクレアーゼでＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）を切断し、得られたｄｓＤＮＡ断片を融解して、ｓｓＤＮＡ断片を提供することによって提供され得る。
アニーリングは、センス配列及びアンチセンス配列の対の計算された融解温度を下回って温度を下げることによって達成され得る。融解温度は、特定のヌクレオチド塩基含有量、及び使用している溶液の特性、例えば、塩濃度に依存する。任意の所与の配列及び溶液の組み合わせの融解温度は、当業者によって容易に計算される。
アニーリングされた分子の遊離５’及び３’末端は、互いにライゲーションされるか、又はヘアピン分子にライゲーションされてｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。好適な例示的ライゲーション方法論及びヘアピン分子は、実施例２及び３に記載される。
実施例５：ｃｅＤＮＡの精製及び／又は産生の確認
例えば、実施例１に記載される昆虫細胞ベースの産生方法、又は実施例２～４に記載される合成産生方法を含む、本明細書に記載される方法によって産生されたＤＮＡベクター産物のいずれも、例えば、熟練者に一般に知られている方法を使用して、不純物、未使用の構成成分、又は副産物を除去するために精製することができ、かつ／又は分析して、産生されたＤＮＡベクター（この例では、ｃｅＤＮＡベクター）が所望の分子であることを確認することができる。ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡの精製のための例示的な方法は、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｄｉ Ｐｌｕｓ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を使用すること及び／又はゲル精製によるものである。
以下は、ｃｅＤＮＡベクターの同一性を確認するための例示的な方法である。
ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに例示されるような未変性条件又は変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって同定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断及びゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、並びに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体及び二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。
単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、精製されたＤＮＡを、選択された制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、及びｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画した場合に明らかに見えるほど十分に大きな、得られる断片について更に分析した。図４Ｃ及び図４Ｄに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクター及び直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂ及び２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、２ｋｂ及び４ｋｂ断片を産生することが期待される。
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると同定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐ及び２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化及び電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的閉鎖状ＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さである場合（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐ及び２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的閉鎖状ＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐ及び４０００ｂｐ）で溶解するであろう。更に、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、及びｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片として全て溶解する（図４Ｅを参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「未変性ゲル及び変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３倍及び２／３倍のＤＮＡベクター長の産物を生成するであろう目的のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲル及び変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキット又は脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＩＬＵＳＴＲＡ ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ Ｇ－２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、（ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化することと、（ｉｉ）例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出することと、（ｉｉｉ）１０倍変性溶液（１０倍＝０．５Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加することと、（ｉｖ）１０倍色素を添加し、緩衝化せず、１０倍変性溶液を、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２００ｍＭ ＮａＯＨで以前にインキュベーションされた０．８～１．０％ゲル上で４倍に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲル及びゲルボックス中で均一であることを確保することと、（ｖ）１倍変性溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることと、を含む。当業者であれば、サイズ及び所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解するであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１倍ＴＢＥ又はＴＡＥ中で中和し、蒸留水又は１倍ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを含む１倍ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標）のＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（ＤＭＳＯ中１０，０００倍濃縮物）及び落射蛍光灯（青色）又はＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。前述のゲルベースの方法は、ｃｅＤＮＡベクターをゲルバンドから単離し、それを復元できるようにすることによって、精製目的に適合させることができる。
生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ－プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に充填し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミドタイトレーションを使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、又は純度パーセントを決定することができる。
実施例６：ｃｅＤＮＡからの制御された導入遺伝子発現：インビボでのｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子発現は、再用量投与によって持続及び／又は増加させることができる。
ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター（配列番号７２）及び非対称ＩＴＲ（例えば、５’ＷＴ－ＩＴＲ（配列番号２）及び３’ｍｏｄ－ＩＴＲ（配列番号３）の間に隣接した、例示的なＰＦＩＣ遺伝子としてのルシフェラーゼ導入遺伝子（配列番号５６）を含むｃｅＤＮＡプラスミドを使用して、上記の実施例１に記載される方法により産生され、異なる治療パラグラムにおいてインビボで評価された。このｃｅＤＮＡベクターは、実施例６～１０に記載されている全ての後続の実験で使用された。この実施例では、ｃｅＤＮＡベクターを精製し、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ ｃｅＤＮＡ）で製剤化し、各ＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウスの尾静脈に注射した。リポソームは、イオン化脂質（例えば、カチオン性脂質）、ヘルパー脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）リポソームを形成するための４つの構成成分を含む好適な脂質ブレンドで製剤化された。
ｃｅＤＮＡベクターからのインビボでの導入遺伝子の持続的な発現を長期間にわたって評価するために、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡをおよそ５～７週齢のＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウスへの尾静脈内注射によって滅菌ＰＢＳで投与した。３つの異なる投与量群：０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、及び１．０ｍｇ／ｋｇを、群当たり１０匹のマウス（群当たり１５匹のマウスを有していた１．０ｍｇ／ｋｇを除く）を評価した。注射は、０日目に投与された。各群からの５匹のマウスに、２８日目に追加の同一用量を注射した。ルシフェラーゼ発現は、ＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＷＴマウス）への静脈内投与後のＩＶＩＳ撮像によって測定された。ルシフェラーゼ発現は、３、４、７、１４、２１、２８、３１、３５、及び４２日目、並びに定期的に（例えば、毎週、隔週、又は１０日毎、又は２週間毎）、４２～１１０日に１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を腹腔内注射した後、ＩＶＩＳ撮像によって評価した。３つの異なる投与プロトコル後、少なくとも１３２日間のＩＶＩＳ撮像によって測定された例示的なＰＦＩＣ治療用としてのルシフェラーゼ導入遺伝子の発現（データには示さず）。
再用量、例えば、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡで治療した対象のＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ発現ルシフェラーゼの再投与の効果を調査するために、延長研究を実施した。具体的には、ｃｅＤＮＡベクターの１回以上の追加投与によって発現レベルが増加され得るかどうかを決定するために評価した。
この研究では、ｃｅＤＮＡベクターからのルシフェラーゼ発現の生体内分布を、０日目及び２８日目（群Ａ）における、１．０ｍｇ／ｋｇ（すなわち、プライミング用量）の初回静脈内投与後にＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウスにおけるＩＶＩＳによって評価した。ｃｅＤＮＡベクターの第２の投与は、８４日目に、１．２ｍＬの３ｍｇ／ｋｇ（Ｂ群）又は１０ｍｇ／ｋｇ（Ｃ群）の尾静脈注射によって投与した。この研究において、５匹のＣＤ－１（登録商標）マウスを、Ａ群、Ｂ群及びＣ群の各々において使用した。上記のような４９、５６、６３、及び７０日目の追加投与前、並びに８４日目と９１、９８、１０５、１１２、及び１３２日目の再用量後に、ルシフェラーゼ発現についてのマウスのＩＶＩＳ撮像を実施した。ルシフェラーゼ発現は、少なくとも１１０日（評価された最長期間）まで、群Ａ、Ｂ、及びＣの３つ全てにおいて評価され、検出された。
ルシフェリンの存在下でのルシフェラーゼ活性の評価によって決定されるように、ルシフェラーゼの発現レベルは、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡ－Ｌｕｃの再用量（すなわち、ｃｅＤＮＡ組成物の再投与）によって増加することが示された。３つの異なる投与プロトコル後、少なくとも１１０日間のＩＶＩＳ撮像によって測定された例示的なＰＦＩＣ治療用タンパク質としてのルシフェラーゼ導入遺伝子の発現（群Ａ、Ｂ、及びＣ）。追加の再用量（１ｍｇ／ｋｇプライミング用量（すなわち、群Ａ）治療を受けなかったマウスは、研究の期間にわたって安定したルシフェラーゼ発現が観察された。３ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターの再用量を投与されたＢ群のマウスは、Ｃ群のマウスと比較して、観察された放射輝度のおよそ７倍の増加を示した。驚くべきことに、１０ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターを再投与したマウスは、再投与を全く受けていないマウス（Ａ群）に対して、観察されたルシフェラーゼ放射輝度が１７倍増加した。
Ａ群は、０日目及び２８日目での尾静脈への１ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターの静脈内投与後の、ＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウスにおけるルシフェラーゼ発現を示す。Ｂ群及びＣ群は、第１の時点（０日目）で１ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターを投与され、８４日目の第２の時点でｃｅＤＮＡベクターの投与により再投与されたＣＤ－１（登録商標）ＩＧＳマウスにおけるルシフェラーゼ発現を示す。ｃｅＤＮＡベクターの第２の投与（すなわち、再用量）は、発現を少なくとも７倍、最大で１７倍まで増加させた。
Ｂ群の再用量投与におけるｃｅＤＮＡベクターの用量（すなわち、量）の３倍増加（すなわち、３ｍｇ／ｋｇが再用量で投与される）は、ルシフェラーゼの発現の７倍増加をもたらした。また、予期せぬことに、Ｃ群の再用量投与（すなわち、１０ｍｇ／ｋｇの再用量が投与される）におけるｃｅＤＮＡベクターの量の１０倍増加は、ルシフェラーゼの発現の１７倍増加をもたらした。したがって、ｃｅＤＮＡの第２の投与（すなわち、再用量）は、発現を少なくとも７倍、最大で１７倍まで増加させた。これは、再用量による導入遺伝子発現の増加が予想よりも大きく、再用量投与におけるｃｅＤＮＡベクターの用量又は量に依存することを示し、０日目での初回プライミング投与からの初期導入遺伝子発現と相乗的であるように見える。すなわち、導入遺伝子発現の用量依存的増加は相加的ではなく、むしろ導入遺伝子の発現レベルは用量依存的であり、各時点で投与されるｃｅＤＮＡベクターの量の合計よりも大きい。
群Ｂ及び群Ｃの両方は、第２の時点で、ｃｅＤＮＡベクターを再投与されなかった対照マウス（群Ａ）と比較して、ルシフェラーゼの発現に有意な用量依存的増加を示した。まとめると、これらのデータは、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現が、少なくとも第２の時点でｃｅＤＮＡベクターの再用量（すなわち、再投与）によって、用量依存的に増加され得ることを示す。
まとめると、これらのデータは、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子、例えば、ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現レベルが少なくとも８４日間にわたって持続レベルで維持され得、少なくとも第２の時点で投与されたｃｅＤＮＡベクターの再用量後にインビボで増加され得ることを実証する。
実施例７：ＬＮＰ製剤化ｃｅＤＮＡベクターのインビボでの持続的導入遺伝子発現
異なる脂質ナノ粒子を用いた実施例６の結果の再現性を、マウスにおいてインビボで評価した。０日目に、実施例６で使用したものとは異なるＬＮＰに封入されたＣＡＧプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ導入遺伝子を含むｃｅＤＮＡベクター、又はポリＣを含むがｃｅＤＮＡ又はルシフェラーゼ遺伝子を欠いている同じＬＮＰのいずれかをマウスに投与した。具体的には、およそ４週齢の雄ＣＤ－１（登録商標）マウスを、０．５ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ－ＴＴＸ－ルシフェラーゼ又は対照ＬＮＰ－ポリＣの単回注射で治療し、０日目に側尾静脈から静脈内投与した。１４日目に動物にルシフェリン１５０ｍｇ／ｋｇを２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注射により全身投与した。ルシフェリン投与後およそ１５分で、各動物をインビボ撮像系（「In Vivo Imaging System、ＩＶＩＳ」）を使用して画像化した。
図６に示されるように、４匹のｃｅＤＮＡ治療されたマウス全てにおいて肝臓の有意な蛍光が観察され、注射部位以外では動物において他の蛍光はほとんど観察されなかったことから、ＬＮＰがｃｅＤＮＡ構築物の肝臓特異的送達を媒介したこと、及び送達されたｃｅＤＮＡベクターが、投与後少なくとも２週間にわたって、その導入遺伝子の持続的発現を制御可能であったことを示す。
実施例８：ｃｅＤＮＡベクター投与によるインビボでの肝臓における持続的導入遺伝子発現
別の実験では、治療された動物の肝臓内のＬＮＰ送達されたｃｅＤＮＡの局在を評価した。目的の機能的導入遺伝子を含むｃｅＤＮＡベクターを、実施例７で使用したものと同じＬＮＰに封入し、静脈内注射により０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、インビボでマウスに投与した。６時間後、マウスを終了させ、肝臓試料を採取し、標準的なプロトコルを使用してホルマリン固定し、パラフィン包埋した。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）インサイチュハイブリダイゼーションアッセイを実施して、ｃｅＤＮＡ導入遺伝子に特異的なプローブを使用して、組織内のｃｅＤＮＡベクターを可視化し、発色反応及びヘマトキシリン染色（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標））を使用して検出した。図７は結果を示し、ｃｅＤＮＡが肝細胞に存在することを示す。当業者は、ルシフェラーゼがｃｅＤＮＡベクターで表１から選択される任意の核酸配列と置換できることを理解するであろう。
実施例９：インビボでのｃｅＤＮＡの持続的眼導入遺伝子発現
肝臓以外の組織でのｃｅＤＮＡベクター導入遺伝子発現の持続可能性を評価して、インビボでの眼内投与後のｃｅＤＮＡベクターの耐性及び発現を決定した。実施例９でルシフェラーゼを例示的な導入遺伝子として使用したが、当業者は、ルシフェラーゼ導入遺伝子を、表１に列挙されたものうちのいずれかからのＰＦＩＣ治療用タンパク質配列で容易に置換することができる。
０日目に、およそ９週齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、５μＬのｊｅｔＰＥＩ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ）で製剤化されたルシフェラーゼ導入遺伝子を含むｃｅＤＮＡベクター又はＪｅｔＰＥＩ（登録商標）で製剤化されたルシフェラーゼをコードするプラスミドＤＮＡのいずれかを、いずれも０．２５μｇ／μＬの濃度で網膜下注射した。各群において４匹のラットを試験した。動物を鎮静させ、３３ゲージ針を使用して、被験物質を右眼に網膜下注射した。各動物の左眼は未治療であった。注射直後、網膜下ブレブの存在を確認するために、光干渉トモグラフィー又は眼底撮像で眼を確認した。標準的な手順に従って、ラットをブプレノルフィン及び局所抗生物質軟膏で治療した。
７、１４、２１、２８、及び３５日目に、両群の動物に、新たに作製したルシフェリンを１５０ｍｇ／ｋｇの腹腔内注射で全身投与した。２．５ｍＬ／ｋｇでのルシフェリン投与の５～１５分後に、全ての動物をイソフルラン麻酔下でＩＶＩＳを用いて画像化した。眼を含む目的の領域の全流束［ｐ／ｓ］及び平均流束［ｐ／ｓ／ｓｒ／ｃｍ２）は、５分間の曝露で得られた。有意な蛍光は、ｃｅＤＮＡベクターで治療された眼において容易に検出可能であったが、プラスミドで治療された眼でははるかに弱かった（図８Ａ）。結果は、未治療の眼（「注射されていない」）の各治療群の平均放射輝度に対する、治療された眼（「注射された」）の各治療群の平均放射輝度としてグラフ化した（図８Ｂ）。３５日後、プラスミドを注射したラットは絶命したが、ｃｅＤＮＡで治療されたラットについて研究を継続し、４２、４９、５６、６３、７０、及び９９日目にルシフェリン注射及びＩＶＩＳ撮像を行った（図８Ｂ）。結果は、ラットの眼に単回注射で導入されたｃｅＤＮＡベクターが、インビボでの導入遺伝子発現を媒介し、その発現が少なくとも注射後９９日まで高レベルで持続されたことを実証する（図８Ｂ）。
実施例１０：Ｒａｇ２マウスにおけるｃｅＤＮＡベクターの持続投与及び再投与。
ｃｅＤＮＡベクターの遺伝子発現カセットにコードされている導入遺伝子のうちの１つ以上が、発現したタンパク質が外来であると認識される宿主環境（例えば、細胞又は対象）で発現される状況では、宿主が発現産物の望ましくない枯渇を引き起こし得る適応免疫応答を開始する可能性が存在し、これは、発現の欠如と混同される可能性がある。場合によっては、これは、通常の宿主環境に対して異種であるレポーター分子で起こり得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクター導入遺伝子の発現は、Ｂ細胞及びＴ細胞を欠くＲａｇ２マウスモデルにおいてインビボで評価されたため、ルシフェラーゼなどの非天然マウスタンパク質に対する適応免疫応答を開始しない。簡潔には、０日目に、ｃ５７ｂｌ／６及びＲａｇ２ノックアウトマウスに、０．５ｍｇ／ｋｇの、ルシフェラーゼを発現するＬＮＰ封入されたｃｅＤＮＡベクター又はポリＣ対照を尾静脈注射により静脈内投与し、２１日目に、ある特定のマウスに同じＬＮＰ封入されたｃｅＤＮＡベクターを同じ用量レベルで再投与した。全ての試験群は、各々４匹のマウスで構成された。実施例９に記載されているように、ルシフェリン注射後に週間隔でＩＶＩＳ撮像を実施した。
ＩＶＩＳ分析から観察された全流束を比較すると、ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクター－Ｌｕｃを投与した野生型マウス（発現されたルシフェラーゼの存在の間接的測定）で観察された蛍光は、２１日後に徐々に減少したが、同じ治療を施したＲａｇ２マウスは、４２日の実験にわたってルシフェラーゼの比較的一定の持続的発現を示した（図９Ａ）。野生型マウスで観察された減少のおよそ２１日の時点は、適応免疫応答がもたらされると予想され得る時間枠に対応する。Ｒａｇ２マウスにおけるＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターの再投与は、発現の顕著な増加をもたらし、これは、この研究で追跡された少なくとも２１日間にわたって持続した（図９Ｂ）。結果は、非天然タンパク質が、宿主においてｃｅＤＮＡベクターから発現されるときに適応免疫が役割を果たすことができ、初回投与から２０日以上の時間枠で観察された発現の減少が、発現の低下ではなく（又はそれに加えて）、発現された分子に対して交絡する適応免疫応答を知らせることができることを示唆する。注目すべきことに、宿主が発現された分子を自己として適切に認識し、そのような免疫応答を起こさないことが予想される宿主において未変性タンパク質を発現する場合、この応答は低いと予想される。
実施例１１：持続的発現に対する肝臓特異的発現及びＣｐＧ調節の影響
実施例１０に記載されているように、望ましくない宿主免疫応答は、場合によっては、導入されたｃｅＤＮＡベクターからの１つ以上の所望の導入遺伝子の持続的発現であるものを人工的に弱めることがある。ｃｅＤＮＡベクターからの持続的発現に対する潜在的な宿主免疫応答の回避及び／又は抑制の影響を評価するために、２つのアプローチが取られた。第一に、前の実施例で使用されたｃｅＤＮＡ－Ｌｕｃベクターは構成的ＣＡＧプロモーターの制御下にあったため、肝臓特異的プロモーター（ｈＡＡＴ）又は異なる構成的プロモーター（ｈＥＦ－１）を使用して同様の構築物を作製して、骨髄細胞又は非肝臓組織への長期曝露を回避することで、観察された免疫効果が低減したかどうかを判断した。第二に、ある特定のｃｅＤＮＡ－ルシフェラーゼ構築物は、宿主免疫応答の既知のトリガーであるＣｐＧ含有量が低減するように操作された。そのような操作され、プロモーターが切り替えられたｃｅＤＮＡベクターをマウスに投与した際のｃｅＤＮＡコード化ルシフェラーゼ遺伝子発現を測定した。
各々が導入遺伝子としてルシフェラーゼをコードする、３つの異なるｃｅＤＮＡベクターを使用した。第１のｃｅＤＮＡベクターは、多数の非メチル化ＣｐＧ（約３５０）を有し、構成的ＣＡＧプロモーターを含んでいた（「ｃｅＤＮＡ ＣＡＧ」）。第２は、中程度の数の非メチル化ＣｐＧ（約６０）を有し、肝臓特異的ｈＡＡＴプロモーターを含んでいた（「ｃｅＤＮＡ ｈＡＡＴ低ＣｐＧ」）。第３は、第２のメチル化形態であり、非メチル化ＣｐＧを含まず、ｈＡＡＴプロモーターも含んでいた（「ｃｅＤＮＡ ｈＡＡＴ ＣｐＧなし」）。他の点では、ｃｅＤＮＡベクターは同一であった。上記のようにベクターを調製した。
およそ４週齢の４匹の雄ＣＤ－１（登録商標）マウスの４つの群を、ＬＮＰに封入されたｃｅＤＮＡベクター又はポリＣ対照のうちの１つで治療した。０日目に、各マウスに０．５ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターを５ｍＬ／ｋｇの容量で、単回静脈内尾静脈注射で投与した。－１、０、１、２、３、７日目、及びその後マウスが絶命するまで毎週、体重を記録した。全血試料及び血清試料は、０、１、及び３５日目に採取した。生存中の撮像は、７、１４、２１、２８、及び３５日目、その後は毎週、インビボ撮像システム（in vivo imaging system、ＩＶＩＳ）を使用して実施した。撮像のために、各マウスに、２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注射を介して１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリンを注射した。１５分後、各マウスを麻酔し、画像化した。マウスは９３日目に絶命し、肝臓及び脾臓を含む終末組織を収集した。サイトカイン測定は、０日目の投与の６時間後に行った。
全てのｃｅＤＮＡ治療されたマウスは、７日目及び１４日目に有意な蛍光を示したが、蛍光は、ｃｅＤＮＡ ＣＡＧマウスでは１４日後に急速に減少し、残りの研究では徐々に減少した。対照的に、ｃｅＤＮＡ ｈＡＡＴ低ＣｐＧ及びＣｐＧなしで治療されたマウスの全流束は、安定した高レベルのままであった（図１０）。これは、ｃｅＤＮＡベクターの送達を特異的に肝臓に向けることで、単回注射後、少なくとも７７日間にわたってベクターからの持続的で耐久性のある導入遺伝子発現がもたらされたことを示唆していた。ＣｐＧが最小化されているか、又はＣｐＧ含有量が完全に存在しない構築物は、同様の耐久性のある持続的発現プロファイルを有していたが、高ＣｐＧ構成的プロモーター構築物は、経時的に発現の低下を呈し、ｃｅＤＮＡベクターの導入による宿主免疫活性化が、対象におけるそのようなベクターから観察された発現の減少において役割を果たし得ることを示唆している。これらの結果は、組織の制限されたプロモーターを選択すること、及び／又は宿主の免疫応答（潜在的に導入遺伝子特異的な応答）が観察された場合にｃｅＤＮＡベクターのＣｐＧ含有量を変更することによって、応用の持続時間を所望のレベルに調整する代替的な方法を提供する。
実施例１２：ＰＦＩＣ治療用タンパク質（例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、又はＴＪＰ２）のインビボ発現。
レシピエント細胞においてインビトロで適切なタンパク質発現及び機能を確認したら、実施例１に記載のように産生されたＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする配列を有するｃｅＤＮＡベクターを、脂質ナノ粒子とともに製剤化し、それぞれのタンパク質産生の機能的発現が欠損しているマウスに、様々な時点で（子宮内、新生児、４週齢、及び８週齢）、インビボでの発現及びタンパク質機能の検証のために投与した。ＡＴＰ８Ｂ１をコードするｃｅＤＮＡベクターを、以前に開発されたＡＴＰ８Ｂ１ヌルマウスに投与する（Ｓｈａｈ Ｓ，Ｓａｎｆｏｒｄ ＵＲ，Ｖａｒｇａｓ ＪＣ，Ｘｕ Ｈ，Ｇｒｏｅｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．，（２０１０ ＰＬＯＳ ＯＮＥ５（２）：ｅ８９８４）。ＡＢＣＢ１１をコードするｃｅＤＮＡベクターを、以前に開発されたＡＢＣＢ１１－／－ヌルマウスに投与する（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２８７，２４７８４－２４７９４）。ＡＢＣＢ４をコードするｃｅＤＮＡベクターを、以前に開発されたＡＢＣＢ４－／－ヌルマウスに投与する（Ｂａｇｈｄａｓａｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ．２００８ Ａｕｇ；２８（７）：９４８－５８、Ｂａｇｈｄａｓａｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１６；６４：６７４－６８１）。ＴＪＰ２をコードするｃｅＤＮＡを、ＴＪＰ２－／－ヌルマウス胚（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）に投与し（子宮内）、発現及びタンパク質機能について評価する。
ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡベクターは、１．２ｍＬの容量で０．３～５ｍｇ／ｋｇの用量でそれぞれのマウスに投与される。各用量は、静脈内流体力学的投与を介して投与されるか、又は例えば腹腔内注射によって投与される。正常なマウスへの投与は、対照として機能し、また、治療用タンパク質の存在及び量を検出するためにも使用され得る。
ＬＮＰ－ｃｅＤＮＡの急性投与、例えば、単回投与に続いて、レシピエントマウスの肝臓組織における発現は、例えば１０、２０、３０、４０、５０、１０００及び２００日以上などの様々な時点で決定される。具体的には、マウスの肝臓及び胆管の試料が得られ、組織切片の免疫染色を用いてタンパク質の存在が分析される。タンパク質の存在は、定量的に評価され、組織及びその中の細胞内の適切な局在化についても評価される。肝臓（例えば、肝及び上皮）並びに胆管（例えば、胆管細胞）の細胞は、タンパク質発現について評価される。
実施例１３：ＰＦＩＣ治療用タンパク質例えば、ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、又はＴＪＰ２の治療的投与。
実施例１２において考察される外因性治療用タンパク質発現の確認後、レシピエントヌルマウスは、標準的な方法によって胆汁うっ滞状態の治療的改善について評価される。評価は、投与の約２、４、及び８週間後に行われる。
Ｂａｇｈｄａｓａｒｙａｎｅｔ ａｌ．の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１６ ｖｏｌ．６４：６７４－６８１）に従って、肝臓組織学（胆管損傷の分析）に関して、レシピエントマウスを対照マウスと比較する。肝細胞損傷のマーカーである血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を評価する（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。胆汁うっ滞の血清マーカーアルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、及び胆汁酸（ＢＡ））を分析し（Ｂｉｌｅ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ Ｅｃｏｌｉｎｅ Ｓ＋ＤｉａＳｙｓ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＧｍｂＨ，Ｈｏｌｚｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから）、有意な減少は、胆汁うっ滞状態の有効な治療を示す。血清ビリルビン、血清トリグリセリドレベル、血清コレステロールレベルもまた、治療用タンパク質発現と相関する改善についてモニタリングする。肝臓重量及び脾臓重量も評価され、肝臓：体重、及び脾臓：体重の比率の減少は、有効な治療を示す。胆管増殖はまた、ＣＫ１９ＩＨＣ染色並びにｍＲＮＡ発現レベルの定量化及び分析によってモニタリングされる。
ｃｅＤＮＡレシピエントマウスを、肝臓損傷の病因に関与する主要な炎症促進性サイトカインの分析によって、肝臓炎症及び管周囲線維症に関して対照マウスと比較する。ＴＮＦ－α、Ｍｃｐ－１、及びＶｃａｍ－１のｍＲＮＡ発現、並びにＣｏｌ１ａ１及びＣｏｌ１ａ２などの胆管線維症マーカーの発現を評価する（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００３：１２５：８２５－８３８）。線維症を検出するためにシリウスレッド染色を行う。肝臓炎症及び管周囲線維症の減少は、有効な治療を示す。
胆汁ホメオスタシス及び肝細胞胆汁酸負荷も試験する。胆汁酸合成Ｆｇｆ１５の腸調節剤の遺伝子発現を評価し、減少は、有効な治療を示す（Ｉｎａｇａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２００５：２：２１７－２２５）。胆汁酸合成のための律速酵素（Ｃｙｐ７ａ１）の増加、並びに胆汁酸解毒酵素Ｃｙｐ３ａ１１、Ｕｇｔ１ａ１及びＵｇｔ２ｂ５、及び正弦関数型搬出輸送体（sinusoidal export transporter）Ｍｒｐ３の遺伝子発現の減少もまた、有効な治療を示す。
Ｂａｇｈｄａｓａｒｙａｎ ｅｔ ａｌ．の方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１６ ｖｏｌ．６４：６７４－６８１）によって、胆汁酸排出量及び胆汁酸組成を調べる。胆汁流量及び胆汁ＢＡ濃度の減少は、有効な治療を示す。胆嚢の生理機能も検査され、胆嚢サイズの減少は、有効な治療を示す。
実施例１４：ＰＦＩＣ治療用タンパク質内因性プロモーターの組み込み
ｃｅＤＮＡからのＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現における異なるプロモーター領域の活性を調べるために、一連の異なるｃｅＤＮＡベクターを調製した。構築物を図１１Ａ～図１１Ｄ及び図１２に模式的に示す。
コードされた治療用ＰＦＩＣ遺伝子を培養物中で発現させるｃｅＤＮＡベクターの各々の能力を評価した。上記ｃｅＤＮＡベクターを含むプラスミドを実施例１に記載のように調製し、培養されたＨｅｐＧ２細胞の一過性トランスフェクションに使用した。簡潔に述べると、培養細胞を、５％ＣＯ２を含む３７℃の１００％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））培地中のフラスコ中で成長させた。トランスフェクションの１日前に、ポリ－Ｌ－リジンで予めコーティングしたカバースリップ上に細胞を適切な密度で播種し、新鮮なプレート中、同様の条件下で成長させた。トランスフェクション当日に、各ｃｅＤＮＡ試料をトランスフェクション試薬リポフェクタミン３０００を２μｇ ＤＮＡ：３．７５μＬリポフェクタミン比で混合し、細胞に添加した。細胞を７２時間成長させた。細胞を各培養物から回収し、免疫細胞化学によって分析した。
免疫細胞化学分析を以下のように行った。培地を細胞から除去し、それらをＰＢＳ中で簡単にすすいだ。次いで、カバースリップをメタノール／アセトン４：１で－２０℃で３分間固定し、氷冷１×ＰＢＳ／０．０５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ｐＨ７．４）で１０分間洗浄した。次いで、カバースリップを氷冷ＰＢＳで３回洗浄した。
次いで、細胞をブロックし、免疫染色した。カバースリップに固定された細胞を、２２．５２ｍｇ／ｍＬグリシン及び０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含有するＰＢＳ中の１％ＢＳＡとともに１時間インキュベートして、抗体の非特異的結合をブロックし、続いて、一次マウス抗ＡＢＣＢ４抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標））を１：５０希釈で添加した同じ溶液中で、加湿容器中、４℃で一晩、細胞をインキュベートした。溶液をデカンテーションし、続いてＰＢＳで５分間、３回洗浄した。次いで、細胞を、暗所において室温で１時間、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡ中の蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４（登録商標）、マウスＩｇＧを特異的に認識する、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））とともにインキュベートした。インキュベーション溶液をデカンテーションし、細胞を再び暗所で、各々ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した）。カバースリップを、ＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（登録商標））を含むマウンティング溶液で取り付け、標準的な技術を使用して密封し、画像化するまで－２０℃で暗所に保存した。
以下の３つの異なる色が、蛍光評価下で潜在的に可視であった。赤色は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ二次抗体染色に起因する、発現されたＡＢＣＢ４タンパク質の存在を示した。青色は、ＤＡＰＩ染色に起因するＤＮＡの存在を示し、細胞核を同定し、緑色は、ＧＦＰの存在を示した（ＧＦＰ発現対照について）。図１３に示されるように、ＡＢＣＢ４タンパク質発現は、３つのプロモーターコンテキスト－ネイティブプロモーター（図１３Ａ）、ｈＡＡＴプロモーター（図１３Ｂ）、及びＣＡＧプロモーター（図１３Ｃ）の全てにおいて、ｃｅＤＮＡベクタープラスミドで形質導入されたＨｅｐＧ２細胞において観察された。
実施例１５：ＡＢＣＢ４－／－マウスにおけるＰＦＩＣの発現
ｈＡＡＴプロモーターに作動可能に連結されたヒトＡＢＣＢ４構築物を保有するｃｅＤＮＡがインビボで発現され得るかどうかを評価し、ＡＢＣＢ４を欠くマウス（ＡＢＣＢ４－／－）における有効性を提供するために、５μｇ又は５０μｇのｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４を、ＡＢＣＢ４－／－マウスに流体力学的に投与した。
研究は、２つの別個の０日目に開始し、群１～３はコホートＡに、群４～７はコホートＢであった。群８及び９はコホートＢに割り当てられ、ナイーブ対照組織収集の開始日はなかった。動物を標準的なマウス食餌（すなわち、Ｌａｂ Ｄｉｅｔ５０５８）で維持した。
胆汁収集（非生存手術）。７日目に、動物を、胆汁収集のために注射可能な麻酔薬を用いて手術面の麻酔まで麻酔した。群１～３については、剣状突起と恥骨結合部との間の腹部に正中切開を行い、横隔膜又は主要血管を傷つけることなく後腹膜腔に到達するように、腹腔を開いた。胆管を露出させ、結紮糸（非吸収性絹４－０縫合糸又は同等物）で閉塞させ、胆嚢にカニューレを挿入した（を有する３０ｇ針ＰＥ－１０チューブ又は同等物）。腹腔を、温かい滅菌生理食塩水で湿らせた。胆汁をクライオチューブに回収し、３０分毎に６０分間、個別に凍結させた（動物１匹当たり合計２本の個別回収チューブ）。最初の３０分間に収集された胆汁の量が２０μＬ未満である場合、残りの３０分間、同じクライオチューブを使用して胆汁収集を継続した。
群４～９については、剣状突起と恥骨結合部との間の腹部に正中切開を行い、腹腔を開き、横隔膜又は主要血管を傷つけることなく後腹膜腔に到達させた。胆嚢を検査した。胆汁が存在した場合、胆嚢全体を回収した。胆汁は、完全な胆嚢をスナップキャップチューブのキャップに懸濁し、８，０００ｇで１０～３０秒間遠心分離することによって収集した。チューブ全体をＬＮ２中に下げ、試料を公称－８０℃で保存した。胆嚢に目に見える胆汁が存在しなかった場合、群１～３について上述したように、胆管カニューレ挿入を進めた。胆汁が１０分以内に収集されなかった場合、収集を終了した。
マウスの肝臓試料において、抗ＡＢＣＢ４抗体を用いて免疫組織化学を行った。ＡＢＣＢ４染色は、陰性対照群（図１４Ａ）、５μｇ ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４群（図１４Ｂ）から、最も高いレベルの発現が観察された５０μｇ ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４群（図１４Ｃ）までの発現の用量依存的増加を明らかにした。一方、ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４は、治療された動物においてＡＢＣＢ４の散発的な（５％未満）中心周囲発現を示したが（図１４Ｂ及び図１４Ｃ）、その発現は、肝細胞において明らかであった。
胆汁リン脂質レベルを、１：５０希釈の胆汁（Ｓｉｇｍａ（登録商標）ＭＡＫ１２２）を使用するプレートベースの比色アッセイを使用して測定した。野生型マウスと比較して、ＡＢＣＢ４－／－マウスは、予想通り、検出可能なレベル未満の最小胆汁リン脂質レベルを示した（図１５）。しかしながら、ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４で治療されたＡＢＣＢ４－／－動物は、未治療のＡＢＣＢ４－／－と比較して、胆汁リン脂質の上昇を示した。特に、５０μｇのｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４の流体力学的送達は、ＡＢＣＢ４－／－マウスにおいて胆汁リン脂質レベルの上昇をもたらし、ＷＴレベルのおよそ１１％であった。このことは、ＰＢＳ緩衝液で治療したＡＢＣＢ４－／－マウスにおいて観察されたものよりも有意に大きく、ＡＢＣＢ４における欠損によって引き起こされる胆汁リン脂質欠乏が、ｃｅＤＮＡ：ｈＡＡＴ－ＡＢＣＢ４治療によって修正され得ることを示唆している。
参考文献
特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書及び本明細書の実施例で引用される全ての刊行物及び参考文献は、あたかも個々の刊行物又は参考文献が、完全に記載されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、それらの全体が参照により組み込まれる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物及び参考文献について上述した方法で、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (58)

  1. カプシド不含閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターであって、
    隣接する逆位末端反復（ＩＴＲ）間に少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）治療用タンパク質をコードする、ｃｅＤＮＡベクター。
  2. 少なくとも１つのＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、表１の配列のうちのいずれかから選択される、請求項１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  3. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、少なくとも１つのＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された、表７のプロモーターのうちのいずれかから選択されるプロモーターを含む、請求項１又は２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  4. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表８Ａ～８Ｃのエンハンサーのうちのいずれかから選択されるエンハンサーを含む、請求項１～３のいずれか一項から選択されるｃｅＤＮＡベクター。
  5. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表９Ａの５’ＵＴＲ及び／又はイントロン配列のうちのいずれかから選択される５’ＵＴＲ及び／又はイントロン配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  6. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表９Ｂの３’ＵＴＲのうちのいずれかから選択される３’ＵＴＲを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  7. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、表１０のポリＡ配列のうちのいずれかから選択される少なくとも１つのポリＡ配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  8. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーターを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  9. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、合成的に生成される、請求項１～８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  10. 少なくとも１つのＩＴＲが、機能的末端分離部位及びＲｅｐ結合部位を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  11. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項１～１０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  12. 前記隣接するＩＴＲが、対称又は非対称である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  13. 前記隣接するＩＴＲが、対称又は実質的に対称である、請求項１２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  14. 前記隣接するＩＴＲが、非対称である、請求項１２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  15. 前記ＩＴＲの一方若しくは両方が野生型であるか、又は前記ＩＴＲの両方が野生型である、請求項１～１４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  16. 前記隣接するＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項１～１５のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  17. 前記隣接するＩＴＲが、表２に示されるウイルス血清型の対に由来する、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  18. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、表３の配列から選択される配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  19. 前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、前記ＩＴＲの全体的な三次元立体構造に影響を与える欠失、付加、又は置換によって、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列から変更されている、請求項１～１８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  20. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  21. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、合成である、請求項１～２０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  22. 前記ＩＴＲの一方若しくは両方が野生型ＩＴＲでないか、又は前記ＩＴＲの両方が野生型でない、請求項１～２１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  23. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、及びＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている、請求項１～２２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  24. 前記欠失、挿入、及び／又は置換が、前記Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、又はＣ’領域によって通常形成されるステム－ループ構造の全部又は一部の欠失をもたらす、請求項２３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  25. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、前記Ｂ及びＢ’領域によって通常形成されるステム－ループ構造の全部又は一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  26. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、前記Ｃ及びＣ’領域によって通常形成されるステム－ループ構造の全部又は一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  27. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、前記Ｂ及びＢ’領域によって通常形成されるステム－ループ構造の一部、及び／又は前記Ｃ及びＣ’領域によって通常形成されるステム－ループ構造の一部の欠失をもたらす、欠失、挿入、及び／又は置換によって修飾されている、請求項１～２４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  28. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、通常、前記Ｂ及びＢ’領域によって形成される第１のステム－ループ構造と、前記Ｃ及びＣ’領域によって形成される第２のステム－ループ構造と、を含む領域に、単一のステム－ループ構造を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  29. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、通常、前記Ｂ及びＢ’領域によって形成される第１のステム－ループ構造と、前記Ｃ及びＣ’領域によって形成される第２のステム－ループ構造と、を含む領域に、単一のステム及び２つのループを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  30. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、通常、前記Ｂ及びＢ’領域によって形成される第１のステム－ループ構造と、前記Ｃ及びＣ’領域によって形成される第２のステム－ループ構造と、を含む領域に、単一のステム及び単一のループを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  31. 両方のＩＴＲは、前記ＩＴＲが互いに対して反転されたときに全体的な三次元対称性をもたらす様式で変更されている、請求項１～３０のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  32. 前記ＩＴＲの一方又は両方が、表３、５Ａ、５Ｂ、及び６の配列から選択される配列を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  33. 少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの調節スイッチの制御下にある、請求項１～３２のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  34. 少なくとも１つの調節スイッチが、バイナリ調節スイッチ、小分子調節スイッチ、パスコード調節スイッチ、核酸ベース調節スイッチ、転写後調節スイッチ、放射線制御又は超音波制御調節スイッチ、低酸素媒介調節スイッチ、炎症応答調節スイッチ、剪断活性化調節スイッチ、及びキルスイッチから選択される、請求項３３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  35. 細胞においてＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現させる方法であって、前記ＰＦＩＣ治療用タンパク質の発現にとって十分な量の時間、前記細胞を請求項１～３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターと接触させることを含む、方法。
  36. 前記細胞が、光受容細胞又は網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記細胞が、インビトロ又はインビボにある、請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、真核細胞での発現のためにコドン最適化される少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、表１のいずれかから選択される、請求項３８に記載の方法。
  40. 進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（ＰＦＩＣ）を有する対象を治療する方法であって、請求項１～３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターを前記対象に投与することを含み、前記ｃｅＤＮＡベクターが、少なくとも１つのＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含む、方法。
  41. 少なくとも１つのＰＦＩＣ治療用タンパク質をコードする前記少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、表１の配列のうちのいずれかから選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、光受容細胞、若しくはＲＰＥ細胞、又はそれらの両方に投与される、請求項４０又は４１に記載の方法。
  43. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、光受容細胞、若しくはＲＰＥ細胞、又はそれらの両方において前記ＰＦＩＣ治療用タンパク質を発現する、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、網膜下注射、脈絡膜上注射、又は硝子体内注射のうちのいずれか１つ以上によって投与される、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 請求項１～３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターを含む、薬学的組成物。
  46. 請求項１～３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターを含有する、細胞。
  47. 前記細胞が、光受容細胞、若しくはＲＰＥ細胞、又はそれらの両方である、請求項４６に記載の細胞。
  48. 請求項１～３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターと、脂質と、を含む、組成物。
  49. 前記脂質が、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である、請求項４８に記載の組成物。
  50. 請求項１～３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター、又は請求項４８若しくは４９に記載の組成物、又は請求項４６に記載の細胞を含む、キット。
  51. 前記ｃｅＤＮＡベクターが、（ａ）少なくとも１つのＲｅｐタンパク質の存在下でｃｅＤＮＡ発現構築物を保有する昆虫細胞の集団を、前記昆虫細胞内で前記ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するのに効果的な条件下かつ十分な時間、インキュベートするステップであって、前記ｃｅＤＮＡ発現構築物が、前記ｃｅＤＮＡベクターをコードする、ステップと、（ｂ）前記昆虫細胞から前記ｃｅＤＮＡベクターを単離するステップと、を含む、プロセスから得られる、請求項１～３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  52. 前記ｃｅＤＮＡ発現構築物が、ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、及びｃｅＤＮＡバキュロウイルスから選択される、請求項５１に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  53. 前記昆虫細胞が、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現する、請求項５１又は５２に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  54. 前記少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項５３に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  55. 前記少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、及びＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項５４に記載のｃｅＤＮＡベクター。
  56. 請求項１～３４のいずれか一項に記載のｃｅＤＮＡベクターをコードする、ｃｅＤＮＡ発現構築物。
  57. ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、又はｃｅＤＮＡバキュロウイルスである、請求項５６に記載のｃｅＤＮＡ発現構築物。
  58. 請求項５６又は５７に記載のｃｅＤＮＡ発現構築物を含む、宿主細胞。
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SG11202005281XA (en) * 2017-12-06 2020-07-29 Generation Bio Co Gene editing using a modified closed-ended dna (cedna)
CA3108799A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
CA3137135A1 (en) * 2019-04-19 2020-10-22 University Of Massachusetts Gene therapies for stargardt disease (abca4)

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