JP2022520803A - 閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の産生におけるＲＥＰタンパク質活性の調節 - Google Patents

閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の産生におけるＲＥＰタンパク質活性の調節 Download PDF

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Abstract

本明細書で提供されるのは、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＲｅｐタンパク質のみの存在下において、細胞内でのＤＮＡの産生を誘導するのに有効な条件下および十分な時間、第１および第２のＡＡＶ逆位末端反復ＤＮＡポリヌクレオチド配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に配置された異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドを内包する細胞の集団を、ＡＡＶ野生型ＩＴＲに対応するヌクレオチド配列を有する少なくとも１つのＩＴＲと共にインキュベーションすることと、その結果得られるＩＴＲを有するＤＮＡを細胞から採取および単離することと、を含む、ＤＮＡベクターを産生するための方法である。

Description

関連出願
本出願は、２０１９年２月１５日に出願された米国仮出願第６２／８０６，０７６号の優先権を主張するものであり、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年２月１３日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、１３１６９８－０５４２０＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは３８８，８９６バイトである。
本発明は、標的細胞、組織、器官、または生物への外因性ＤＮＡ配列の送達を含む、遺伝子療法の分野に関する。
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子変異または後天性疾患のいずれかを罹患している患者の臨床転帰を改善することを目的とする。遺伝子療法は、欠陥遺伝子、または障害、疾患、悪性腫瘍などをもたらし得る異常調節もしくは発現、例えば過小発現もしくは過剰発現から生じる病状の治療または予防を含む。例えば、欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患または障害は、患者の体内で遺伝物質の治療的発現をもたらす、患者への補正遺伝物質の送達によって治療、予防、または改善され得る。遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と称される場合がある）を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、または腫瘍溶解効果などの別の結果をもたらし得る。ヒト単一遺伝子障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達および発現によって治療され得る。患者の標的細胞中の補正遺伝子の送達および発現は、操作されたウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。使用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組み換えレトロウイルス、組み換えレンチウイルス、組み換えアデノウイルス等）の中で、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶゲノムは、およそ４．７キロベース（ｋｂ）を含有し、非構造的Ｒｅｐ（複製）および構造的Ｃａｐ（カプシド）タンパク質をコードする２つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）からなる直鎖状一本鎖ＤＮＡ分子で構成される。アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするｃａｐ遺伝子内の第２のＯＲＦが特定された。ＡＡＶコード領域に隣接するＤＮＡは、およそ１４５ヌクレオチド長の２つのシス作用性逆位末端反復（ＩＴＲ）配列であり、ＤＮＡ複製のプライマーとして機能するエネルギー的に安定したヘアピン構造に折り畳まれ得る中断パリンドローム配列を有する。ＤＮＡ複製におけるそれらの役割に加えて、ＩＴＲ配列は、細胞ゲノム中のウイルスＤＮＡ組み込み、宿主ゲノムまたはプラスミドからのレスキュー、および成熟ビリオン中のウイルス核酸のカプシド化に関与することが示された（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９）。
ＡＡＶ由来のベクター（すなわち、組み換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）またはＡＡＶベクター）は、（ｉ）それらが筋細胞およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができるため、（ｉｉ）それらがウイルス構造遺伝子を欠いていることによって、ウイルス感染に対する宿主細胞反応、例えばインターフェロン媒介性反応を減少させるため、（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理的であるとみなされるため、（ｉｖ）宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして持続し、したがって挿入変異または遺伝毒性の危険性を制限するため、ならびに（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは、一般に比較的不良な免疫原であるとみなされるため、著しい免疫反応を誘起せず（ｉｉを参照）、したがって治療導入遺伝子のベクターＤＮＡおよび潜在的に長期発現の持続を得るため、遺伝物質を送達するために魅力的である。ＡＡＶベクターはまた、高力価で産生および製剤化され、動脈内、静脈内、または腹腔内注入を介して送達され得、齧歯類（Ｇｏｙｅｎｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｆｏｕｇｅｒｏｕｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｋｏｐｐａｎａｔｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９）およびイヌにおける単回注入による重要な筋領域へのベクター分布および遺伝子導入を可能にする。脊髄性筋萎縮症１型を治療するための臨床研究では、ＡＡＶベクターを、脳を標的とし、明らかな臨床改善をもたらすことを意図して、全身的に送達した。
しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡの制限されたウイルスパッケージング能力である（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２００４、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０ｋＤａ未満のタンパク質コード能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補を、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングする必要があることである。第３の欠点は、初回治療から排除されなかった患者への再投与を予防するカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに反応して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。二本鎖ＤＮＡベクターを構築することによって、この問題を回避することが試みられているが、この戦略は、ＡＡＶベクターに組み込まれ得る導入遺伝子発現カセットのサイズをさらに制限する（ＭｃＣａｒｔｙ，２００８、Ｖａｒｅｎｉｋａ ｅｔ ａｌ．，２００９、Ｆｏｕｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００９）。
追加として、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含有する１つ以上のプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。トランスにおけるこれらのヘルパープラスミドの導入時に、ＡＡＶゲノムは、宿主ゲノムから「レスキュー」され（すなわち、放出された後に増幅され）、さらにカプシド化されて（ウイルスカプシド）、生物学的に活性なＡＡＶベクターを産生する。しかしながら、そのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞および組織型を非効率的に形質導入することがわかった。カプシドはまた、免疫反応を誘導する。
したがって、遺伝子療法のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫反応に起因する）患者への単回投与、関連ＡＡＶカプシドの最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の制限された範囲、ならびに遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して制限される。ｒＡＡＶ臨床遺伝子療法のための適用は、同系マウスモデルにおける、または他のモデル種における用量反応によって予測されない患者間の変動性によってさらに妨げられる。
組み換えカプシド不含ＡＡＶベクターは、発現可能な導入遺伝子、ならびにＲｅｐ結合部位および末端分解部位（ＴＲＳ）を含む２つの野生型ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）によって隣接されるプロモーター領域を含む、単離された直鎖状核酸分子として取得され得る。これらの組み換えＡＡＶベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列を欠いており、２つの野生型ＩＴＲパリンドローム配列を通して共有結合された一方または両方の末端を有する一本鎖、二本鎖、または二重鎖であり得る（例えば、ＷＯ２０１２／１２３４３０、米国特許第９，５９８，７０３号）。それらは、導入遺伝子能力がはるかに高く、導入遺伝子発現の始まりが速く、患者の免疫系がＤＮＡ分子を一掃されるべきウイルスとして認識するという点で、ＡＡＶ媒介性遺伝子療法の多くを回避する。しかしながら、導入遺伝子の定常発現は、すべての例において望ましくない場合があり、ＡＡＶ正準野生型ＩＴＲは、ｃｅＤＮＡ機能のために最適化されない場合がある。したがって、制御可能な組み換えＤＮＡベクターならびに向上した産生および／または発現特性に対する重要な要求が対処されないままである。
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９
本明細書に記載される発明は、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（本明細書では「閉端ＤＮＡベクター」または「ｃｅＤＮＡベクター」と称される）の産生向上に関する。本明細書に記載される方法により産生されるｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有する相補的ＤＮＡの連続鎖（直鎖状で連続的な非カプシド化構造）から形成されたカプシド不含の直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、互いに関して異なるか、または非対称である５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＩＴＲ配列を含む。
本明細書に記載の技術は、細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞）または単一のＲｅｐタンパク質種を有する無細胞系におけるｃｅＤＮＡベクターまたはＡＡＶベクターの産生に関する。特に、本開示は、部分的に、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のいずれか単独で、細胞におけるｃｅＤＮＡベクターまたはＡＡＶベクターの産生に十分であるという意外な知見に基づいている。これは、従来技術に記載されているよりも改善されたより効率的なｃｅＤＮＡベクター産生方法であり、ＡＡＶまたはｃｅＤＮＡベクターが、２つのＲｅｐタンパク質、例えば、少なくとも１つの小さなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０）および少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８）を必要とする細胞（例えば、昆虫細胞）で産生される。すなわち、先行技術は、ｃｅＤＮＡベクターまたはＡＡＶベクターの産生が、それぞれプロモーターに作動可能に連結された別個の核酸構築物にコードされる２つのＲｅｐタンパク質、または単一のプロモーターに作動可能に連結され、２つの開始部位を有する単一の核酸構築物にコードされる２つのＲｅｐタンパク質を使用して実行されることを記載している。
したがって、本明細書に記載する技術の一態様は、細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞）および無細胞系におけるＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターおよび他の組み換えパルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）ベクターを産生するための核酸構築物に関し、例えば、昆虫細胞または無細胞系は、単一のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有さず、第１の開始コドンの下流に機能的開始コドンを欠いており、かつ／またはエクソンスキッピングを防ぐ選択的スプライシング部位を欠いていることにより、昆虫細胞または無細胞系の後の開始コドン（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０のいずれか１つ以上）で追加のＲｅｐタンパク質を翻訳することなく、単一のパルボウイルスＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８タンパク質）のみの翻訳を可能にする。すなわち、Ｒｅｐ７８をコードする核酸は、Ｒｅｐ５２タンパク質も産生せず、同様に、Ｒｅｐ６８をコードする核酸はＲｅｐ４０タンパク質を産生しない。さらに、他のＲｅｐタンパク質は、該系に存在または発現しない。
いくつかの実施形態では、単一のＲｅｐタンパク質を使用するための本明細書に記載の方法および組成物は、２０１８年９月７日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６（例えば、実施例１～４を参照）に開示されるような非対称ＩＴＲＳを含むｃｅＤＮＡベクター、２０１８年１２月６日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／６４２４２（例えば、実施例１～７を参照）に開示されるような遺伝子編集用のｃｅＤＮＡベクター、または２０１９年２月１４日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１８０１６（例えば、実施例１～４を参照）に開示されるような抗体もしくは融合タンパク質の産生用のｃｅＤＮＡベクターを含むがこれらに限定されない任意のｃｅＤＮＡベクターの産生において使用され得、これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、単一のＲｅｐタンパク質を使用する本明細書に記載の方法および組成物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１９年１月１８日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／１４１２２に開示されるように、例えば、ｃｅＤＮＡ産生の無細胞または無昆虫系において、ｃｅＤＮＡベクターの合成産生で使用され得ることも想定され、単一のＲｅｐタンパク質は、その中のＩＴＲオリゴヌクレオチドのタンパク質補助連結に使用することができる。
本明細書に記載される技術は、少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および発現可能な導入遺伝子を含有するｃｅＤＮＡベクターの改良された産生方法に関する。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、記載方法にしたがって、真核細胞中で産生され、したがって昆虫細胞中の原核ＤＮＡ修飾および細菌内毒素汚染を欠き得る。
本発明の態様は、本明細書に記載の単一のＲｅｐタンパク質を使用して、ｃｅＤＮＡベクターおよびＡＡＶベクターを産生するための方法および組成物に関する。他の実施形態は、本明細書に提供される方法および組成物によって産生されるｃｅＤＮＡベクターに関する。
一態様では、本明細書に記載の方法により産生される共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、好ましくは直鎖状二重鎖分子であり、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能であり、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（複製的タンパク質結合部位と称される場合がある）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲのうちの１つは、他のＩＴＲに関する欠失、挿入、または置換を含む。すなわち、ＩＴＲのうちの１つは、他のＩＴＲに対して非対称である。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、ＡＡＶ ＩＴＲ、例えば、野生型ＡＡＶ ＩＴＲまたは修飾型ＡＡＶ ＩＴＲである。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、他のＩＴＲに対する修飾型ＩＴＲであり、すなわち、ｃｅＤＮＡは、互いに対して非対称であるＩＴＲを含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能的ＩＴＲである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物により産生されるｃｅＤＮＡベクターは、（１）シス調節エレメント、プロモーター、および少なくとも１つの導入遺伝子を含む発現カセット、または（２）少なくとも１つの導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、および（３）２つの自己相補的配列、例えば、前述の発現カセットに隣接するＩＴＲを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドタンパク質と関連していない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶゲノム中で見出される２つの自己相補的配列を含み、少なくとも１つは、操作的Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）（本明細書では「ＲＢＳ」と称される場合もある）およびＡＡＶの末端分解部位（ｔｒｓ）またはＲＢＥの機能的バリアント、および導入遺伝子に操作可能に連結された１つ以上のシス調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに記載されている、導入遺伝子の発現を制御および調節するための調節スイッチを含み、例えば、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
いくつかの実施形態では、２つの自己相補的配列は、任意の既知のパルボウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２）などのディペンドウイルスからのＩＴＲ配列であり得る。ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号５３１）などのＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する修飾型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号５３１）などの機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ＴＲＳ）を保持する合成ＩＴＲ配列である。いくつかの例では、修飾型ＩＴＲ配列は、ＲＢＳ、ｔｒｓの配列、ならびに野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの対応する配列からの１つのＩＴＲヘアピン二次構造の末端ループ部分を形成するＲｅｐ結合エレメントの構造および位置を保持する。
本明細書に記載の方法および組成物により産生されるｃｅＤＮＡベクターで使用する例示的なＩＴＲ配列は、表２～１０Ａおよび１０Ｂ、または配列番号２、５２、１０１～４９９、および５４５～５４７、または図２６Ａ～２６Ｂに示される部分ＩＴＲ配列のうちのいずれか１つ以上であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物により産生されるｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００～５２９から選択される任意の配列を含むＩＴＲを有しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物により産生されるｃｅＤＮＡベクターは、本明細書において表２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａ、および１０Ｂのうちのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列またはＩＴＲ部分配列の修飾のうちのいずれかに対応するＩＴＲの修飾を有するＩＴＲを含み得る。
例示的な例として、本明細書に記載の方法および組成物により産生される閉端ＤＮＡベクターは、導入遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを含み、ｃｅＤＮＡはカプシドタンパク質を欠き、（ａ）そのヘアピン二次構成（好ましくは、これらの参照配列と比較して、この構成での任意のＡＡＡもしくはＴＴＴ末端ループの欠失を除外する）において配列番号２と同数の分子内的に二重化した塩基対を有する変異型右側ＡＡＶ２ ＩＴＲまたは配列番号５１と同数の分子内的に二重化した塩基対を有する変異型左側ＡＡＶ２ ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡ－プラスミド（例えば、実施例１～２および／もしくは図１Ａ～Ｂを参照）から産生され、（ｂ）実施例１における未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの同定のためのアッセイを使用して、ｃｅＤＮＡとして同定される。そのような修飾型ＩＴＲ配列の例は、本明細書の表２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａおよび１０Ｂに提供される。
本明細書に記載される技術はさらに、標的細胞で１つ以上の導入遺伝子を送達およびコードするために使用され得るｃｅＤＮＡベクターの産生に関し、例えば、ｃｅＤＮＡベクターはマルチシストロン配列を含む、または導入遺伝子およびその天然ゲノムコンテキスト（例えば、導入遺伝子、イントロンおよび内因性非翻訳領域）は共にｃｅＤＮＡベクターに組み込まれる。導入遺伝子は、タンパク質をコードする転写物、非コード転写物、またはその両方である可能性がある。本明細書に記載の方法および組成物により産生されるｃｅＤＮＡベクターは、複数のコード配列、および非標準的な翻訳開始部位、またはタンパク質をコードする転写物、非コード転写物もしくはその両方を発現するための２つ以上のプロモーターを含み得る。導入遺伝子は、２つ以上のタンパク質をコードする配列を含み得るか、または非コード転写物の配列であり得る。発現カセットは、例えば、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、もしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチド、または５０，０００ヌクレオチド、または約４０００～１０，０００ヌクレオチド、もしくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、または５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。本明細書に記載の方法および組成物により産生されるｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が導入遺伝子の効率的な発現をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物により産生されるｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
本明細書に記載の方法および組成物により産生されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセットは、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および／または２Ａエレメントも含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分を含む。例えば、追加の調節構成成分は、本明細書に開示される調節スイッチであり得、ｃｅＤＮＡ感染細胞、ならびに必要に応じて他の誘導性および／または抑制性エレメントを殺傷し得るキルスイッチを含むが、これに限定されない。
本明細書に記載の技術は、１つ以上の導入遺伝子を選択的に発現することができるｃｅＤＮＡベクターまたは他のＡＡＶベクターを効率的に産生する新規の方法をさらに提供する。本明細書に記載の方法および組成物により産生されるｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドの不在下で、宿主細胞中に取り込まれると共に、核中に輸送される能力を有する。さらに、本明細書に記載の方法および組成物により産生されるｃｅＤＮＡベクターは、カプシドを欠くため、カプシド含有ベクターに反応して生じ得る免疫反応を回避する。
一実施形態では、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）は、第１の５’逆位末端反復（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）、発現カセット、および３’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）をこの順に含むポリヌクレオチド発現構築物テンプレートを含むプラスミド（本明細書では「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」と称される）から取得され、５’および３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、修飾型ＩＴＲであるか、または５’および３’ＩＴＲの両方が修飾されているとき、それらは互いに異なる修飾を有し、同じ配列ではない。そのような実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、実施例に例示され、本明細書の図４Ａ～４Ｄに示されるプロセスによって得られ、単一のＲｅｐタンパク質のみが産生に必要とされる。
ｃｅＤＮＡベクターは、本開示の読後に当業者に知られるいくつかの手段によって取得される。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド発現構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ－プラスミド（例えば、表１２もしくは図１０Ｂを参照）、ｃｅＤＮＡ－バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＩＴＲの間に操作可能に位置付けられた制限クローニング部位（例えば、配列番号７）を含み、例えば、導入遺伝子、例えばレポーター遺伝子および／または治療的遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを挿入することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、対応する隣接のＡＡＶ３ ＩＴＲまたは野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列と比較して修飾されたＩＴＲを含むポリヌクレオチドテンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）から産生され、修飾は、欠失、挿入、および／または置換のうちのいずれか１つ以上である。
いくつかの態様によれば、本開示は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞）または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、単球、ならびに成熟および未成熟の樹状細胞）においてｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法を提供し、本方法は、単一のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む昆虫細胞または哺乳動物細胞を培養することを含み、第１のヌクレオチド配列は、第１の開始コドンの下流に機能的開始コドンを欠き、エクソンスキッピングを防ぐ選択的スプライシング部位を欠き、それにより、細胞における後の開始コドン（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０のいずれか１つ以上）または全長のスプライシングされたバリアント（例えば、Ｒｅｐ６８）で追加のＲｅｐタンパク質を翻訳することなく、単一のＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８）のみの翻訳を可能にする。
他のいくつかの態様によれば、本開示は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞）または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、単球、ならびに成熟および未成熟の樹状細胞）において、ｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法を提供し、本方法は、単一のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む昆虫細胞または哺乳動物細胞を培養することを含み、第１のヌクレオチド配列は、第１の開始コドンの下流に機能的開始コドンを欠き、カルボキシ末端スプライシング配列の欠失を含有し（例えば、ｃ末端イントロン／スキッピングされたエクソンの任意部分または全長）、それにより、細胞において後の開始コドンで追加のＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０のいずれか１つ以上）または全長のＲｅｐ７２タンパク質を翻訳することなく、単一のＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ６８）のみの翻訳を可能にする。
他のいくつかの態様によれば、本開示は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞）または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、単球、ならびに成熟および未成熟の樹状細胞）において、ｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法を提供し、本方法は、１つまたは２つのＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８タンパク質）をコードする第１のヌクレオチド配列を含む昆虫細胞または哺乳動物細胞を培養することを含み、第１のヌクレオチド配列は、第１の開始コドンの下流の機能的開始コドンおよび無傷の選択的スプライシング部位を欠き、それにより、後の開始コドン（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０のいずれか１つ以上）で追加のＲｅｐタンパク質を翻訳することなく、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８タンパク質のみの翻訳を可能にする。
上記の方法に記載された細胞は、第１の配列が発現してＲｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８を産生する場合、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０の存在なしに、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８タンパク質によってｃｅＤＮＡが産生されるような条件下で、異種配列に隣接する少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む第２のヌクレオチド配列をさらに含み得る。次いで、ｃｅＤＮＡベクターを細胞から回収することができる。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのＡＡＶを含むヌクレオチド配列は、発現構築物の一部である。いくつかの実施形態によれば、異種配列は治療用核酸を含む。いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は発現構築物の一部である。いくつかの実施形態によれば、細胞は、マーカーとして機能する核酸をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、マーカーとして機能する核酸は、発現構築物の一部である。
許容宿主細胞において、例えば、単一のＲｅｐタンパク質の存在下、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲを有するポリヌクレオチドテンプレートは、複製してｃｅＤＮＡベクターを産生し、ｃｅＤＮＡベクターの産生は、２つのステップ、すなわち、（ｉ）単一のＲｅｐタンパク質が、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）ステップをもたらすステップ、および（ｉｉ）単一のＲｅｐタンパク質が、切除されたｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介するステップ、を経る。切除および複製のステップ（ｉ）および（ｉｉ）に必要な単一のＲｅｐタンパク質は、本明細書に記載の任意のＲｅｐタンパク質であり得る。様々なＡＡＶ血清型のＲｅｐタンパク質およびＲｅｐ結合部位は、当業者に周知である。
当業者は、少なくとも１つの機能的ＩＴＲに基づいて、核酸配列に結合し、複製する血清型からＲｅｐタンパク質を選択することを理解する。例えば、複製可能ＩＴＲがＡＡＶ血清型２に由来する場合、対応するＲｅｐは、その血清型と共働するＡＡＶ血清型に由来し、例えばＡＡＶ２ ＩＴＲはＡＡＶ２またはＡＡＶ４ Ｒｅｐと共働するが、ＡＡＶ５ Ｒｅｐとは共働しない。複製時（すなわち、ステップ（ｉｉ）の後）に、共有結合性閉端ｃｅＤＮＡベクターは、許容細胞中で蓄積し続け、ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは標準複製条件下、単一のＲｅｐタンパク質の存在下では、長期間にわたって十分に安定して、例えば、少なくとも１ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも２ｐｇ／細胞、好ましくは少なくとも３ｐｇ／細胞、より好ましくは少なくとも４ｐｇ／細胞、さらにより好ましくは少なくとも５ｐｇ／細胞の量で蓄積する。
したがって、本発明の一態様は、ａ）単一のＲｅｐタンパク質の存在下において、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下および十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠くポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベーションするステップであって、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベーションするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスに関する。単一のＲｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ビリオン強制サイズ制限はない。Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸配列が大きなＲｅｐタンパク質、例えば、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８タンパク質をコードする場合、より小さいＲｅｐタンパク質の開始コドンは、大きいＲｅｐタンパク質のみが細胞で発現するように修飾されることが想定される。
いくつかの態様によれば、本開示は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞）または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、単球、ならびに成熟および未成熟の樹状細胞）を提供し、昆虫細胞または哺乳動物細胞系統は、単一のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列は、第１の開始コドンの下流に機能的開始コドンを欠き、エクソンスキッピングを防ぐ選択的スプライシング部位を欠き、それにより、細胞における後の開始コドン（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０のいずれか１つ以上）または全長のスプライシングされたバリアント（例えば、Ｒｅｐ６８）で追加のＲｅｐタンパク質を翻訳することなく、単一のＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８）のみの翻訳を可能にする。
他のいくつかの態様によれば、本開示は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞）または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、単球、ならびに成熟および未成熟の樹状細胞）を提供し、昆虫細胞または哺乳動物細胞は、単一のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列は、第１の開始コドンの下流に機能的開始コドンを欠き、カルボキシ末端スプライシング配列の欠失を含有し（例えば、ｃ末端イントロン／スキッピングされたエクソンの任意部分または全長）、それにより、細胞において後の開始コドンで追加のＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０のいずれか１つ以上）または全長のＲｅｐ７２タンパク質を翻訳することなく、単一のＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ６８）のみの翻訳を可能にする。
他のいくつかの態様によれば、本開示は、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞）または哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、単球、ならびに成熟および未成熟の樹状細胞）を提供し、昆虫細胞または哺乳動物細胞系統は、１つまたは２つのＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８タンパク質）をコードする第１のヌクレオチド配列を含み、第１のヌクレオチド配列は、第１の開始コドンの下流の機能的開始コドンおよび無傷の選択的スプライシング部位を欠き、それにより、後の開始コドン（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０のいずれか１つ以上）で追加のＲｅｐタンパク質を翻訳することなく、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８タンパク質のみの翻訳を可能にする。
上記に記載された細胞は、第１の配列が発現してＲｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８を産生する場合、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０の存在なしに、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８タンパク質によってｃｅＤＮＡが産生されるような条件下で、異種配列に隣接する少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む第２のヌクレオチド配列をさらに含み得る。次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、細胞から回収され得る。いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのＡＡＶを含むヌクレオチド配列は、発現構築物の一部である。いくつかの実施形態によれば、異種配列は治療用核酸を含む。いくつかの実施形態によれば、治療用核酸は発現構築物の一部である。いくつかの実施形態によれば、細胞は、マーカーとして機能する核酸をさらに含む。いくつかの実施形態によれば、マーカーとして機能する核酸は、発現構築物の一部である。
いくつかの態様によれば、本開示は、単一のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む無細胞系を提供し、ヌクレオチド配列は、第１の開始コドンの下流に機能的開始コドンを欠き、かつ／またはエクソンスキッピングを防ぐ選択的スプライシング部位を欠き、それにより、無細胞系において、後の開始コドン（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０のいずれか１つ以上）で追加のＲｅｐタンパク質を翻訳することなく、単一のパルボウイルスＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８タンパク質）のみの翻訳を可能にする。いくつかの実施形態によれば、Ｒｅｐ７８をコードする核酸はまた、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０タンパク質を産生しない。いくつかの実施形態によれば、Ｒｅｐ６８をコードする核酸は、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０タンパク質を産生しない。いくつかの実施形態によれば、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または無細胞系は、他のいかなるＲｅｐタンパク質も発現しない。
単一のＲｅｐタンパク質を使用して本明細書に記載の方法にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から単離され、その存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を変性および未変性のゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的ＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的ＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することによって確認され得る。
本明細書に記載の方法および組成にしたがって、単一のＲｅｐタンパク質を使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。この実施形態では、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを含む。導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位（Ｒ３／Ｒ４）に挿入される。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）－発現カセットの上流（５’端）の野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲによって隣接され、したがって、発現カセットに隣接する２つのＩＴＲは、互いに対して非対称である。当業者は、任意のＩＴＲを使用できることを理解するであろう。例示の目的で、この図および本明細書の実施例におけるｃｅＤＮＡ構築物のＩＴＲは、修飾型ＩＴＲおよびＷＴ ＩＴＲである。しかしながら、本明細書では、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種核酸配列（例えば、導入遺伝子）を含有するｃｅＤＮＡベクターが包含され、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列は、非対称ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、リポソームナノ粒子送達システムなどであるがこれに限定されない送達システムを含む組成物に製剤化されるｃｅＤＮＡベクターを産生するために単一のｒｅｐタンパク質を使用することを包含する。 本明細書に記載の方法および組成にしたがって、単一のＲｅｐタンパク質を使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示し、ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを含む。ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）－発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の野生型ＩＴＲによって隣接される。図１Ａで論じられるように、当業者は、これらの用語が本明細書で定義されるように、非対称ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＩＴＲ対となるようにＩＴＲ配列を容易に選択することができる。 本明細書に記載の方法および組成にしたがって、単一のＲｅｐタンパク質を使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示し、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを挿入するためにエンハンサー／プロモーター、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有する発現カセットを含む。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、互いに対して非対称である２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲによって隣接され、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方は、修飾型ＩＴＲであるが、異なる修飾を有する（すなわち、同じ修飾を有しない）。図１Ａで論じられるように、当業者は、これらの用語が本明細書で定義されるように、非対称ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＩＴＲ対となるようにＩＴＲ配列を容易に選択することができる。 Ａ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’アーム、Ｃ－Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）の同定を有するＡＡＶ２（配列番号５３８）の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を提供し、末端分解部位（ｔｒｓ）も示す。ＲＢＥは、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のいずれかと相互作用すると考えられる一連の４つの二重四量体を含有する。さらに、ＲＢＥ’はまた、構築物中の野生型ＩＴＲまたは変位型ＩＴＲ上で集成したＲｅｐ複合体と相互作用すると考えられる。ＤおよびＤ’領域は、転写因子結合部位および他の保存構造を含有する。 Ａ－Ａ’アーム、Ｂ－Ｂ’アーム、Ｃ－Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）、および末端分解部位（ＴＲＳ）の同定を有するＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を含む、野生型左ＩＴＲ（配列番号５３９）中の提案されたＲｅｐ触媒ニッキングおよび結紮活性を示し、またいくつかの転写因子結合部位を含むＤおよびＤ’領域、および他の保存構造も示す。 野生型左ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号５４０）のＡ－Ａ’アームおよびＣ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（ポリヌクレオチド配列）（左）および二次構造（右）を提供する。 左ＩＴＲの例示的な変異型ＩＴＲ（修飾型ＩＴＲとも称される）配列を示す。例示的な変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ－１、左）（配列番号１１３）のＡ－Ａ’アーム、Ｃアーム、およびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。 野生型右ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号５４１）のＡ－Ａ’ループ、ならびにＢ－Ｂ’およびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および二次構造（右）を示す。 例示的な右修飾型ＩＴＲを示す。例示的な変異型右ＩＴＲ（ＩＴＲ－１、右）（配列番号１１４）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’およびＣアームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。左ＩＴＲが非対称であるか、または右ＩＴＲとは異なる限り、左および右ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲまたは他のウイルス血清型または合成ＩＴＲ）の任意の組み合わせを使用することができる。図３Ａ～３Ｄのポリヌクレオチド配列の各々は、本明細書に記載されるようにｃｅＤＮＡを産生するために使用されるプラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中で使用される配列を指す。プラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中のｃｅＤＮＡベクター構成および予測されたＧｉｂｂｓ自由エネルギー値から推定される対応するｃｅＤＮＡ二次構造もまた、図３Ａ～３Ｄの各々に含まれる。 図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおけるｃｅＤＮＡの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。この実施形態では、２つのバクミドは、ｃｅＤＮＡプラスミドまたはＲｅｐプラスミド（単一のＲｅｐタンパク質をコードする）をバキュロウイルス発現ベクターに転位して、ｃｅＤＮＡベクターバクミド（すなわち、バクミド－１）および単一のＲｅｐバクミド（Ｒｅｐ－バクミド）を生成することにより生成され、これらは、昆虫細胞をトランスフェクションして、バキュロウイルスを注入した昆虫細胞、それぞれＢＩＩＣ－１およびＢＩＣＣ－２（単一のＲｅｐ）を産生するために使用される。 単一のＲｅｐタンパク質の核酸配列を含むＲｅｐ－バクミドを含む昆虫細胞（例えば、ＢＩＣＣ－２）を使用した例示的なｃｅＤＮＡ産生方法の概略図である。 本明細書に記載の単一Ｒｅｐタンパク質方法を使用して、ｃｅＤＮＡベクター産生を確認するための生化学方法およびプロセスを示す。 図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を同定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一の認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から２番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、切断後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは一本鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から２番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される一本鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。 図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を同定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一の認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状かつ連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から２番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、切断後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは一本鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から２番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、一本鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される一本鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。 エンドヌクレアーゼでの消化を有する（＋）または有しない（－）ｃｅＤＮＡベクターの変性ゲル流動例の例示的な図である（ｃｅＤＮＡ構築物１および２の場合ＥｃｏＲＩ、ｃｅＤＮＡ構築物３および４の場合ＢａｍＨ１、ｃｅＤＮＡ構築物５および６の場合ＳｐｅＩ、ならびにｃｅＤＮＡベクター７および８の場合ＸｈｏＩ）。アスタリスクで強調されたバンドのサイズを判定し、図の下に示した。 ｘ軸上で同定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物－１、構築物－３、構築物－５、構築物－７）（表１２）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞中のルシフェラーゼ活性（ｙ軸、ＲＱ（Ｌｕｃ））を測定するインビトロタンパク質発現アッセイからの結果を示す。 ｘ軸上で同定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物－２、構築物－４、構築物－６、構築物－８）（表１２）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞中で測定されたルシフェラーゼ活性（ｙ軸、ＲＱ（Ｌｕｃ））を示す。いかなるプラスミドも含まないＦｕｇｅｎｅで処理したＨＥＫ２９３細胞中（「Ｆｕｇｅｎｅ」）または未処理のＨＥＫ２９３細胞中（「未処理」）で測定されたルシフェラーゼ活性もまた提供される。 ｘ軸上で同定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物－１、構築物－３、構築物－５、構築物－７）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞（ｙ軸）の生存能力を示す。 ｘ軸上で同定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物－２、構築物－４、構築物－６、構築物－８）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞（ｙ軸）の生存能力を示す。 修飾型Ｒｅｐ７８タンパク質の核酸配列を含むｐＦＢＤＬＳＲプラスミドの例示的なＲｅｐ－バクミドであり、修飾型Ｒｅｐ７８タンパク質は、配列番号５３０のアミノ酸残基２２５（Ｍｅｔ）の修飾であり、アミノ酸残基２２５は、グリシン（Ｇｌｙ）（例えば、Ｍ２２５ＧまたはＭｅｔ２２５Ｇｌｙ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）（例えば、Ｍ２２５ＴまたはＭｅｔ２２５Ｔｈｒ）に変更される。この例示的なＲｅｐ－バクミドは、ＩＥ１プロモーター断片（配列番号６６）、第１の開始コドンの下流に機能的開始コドンを欠く修飾型Ｒｅｐ７８タンパク質をコードするＲｅｐ７８ヌクレオチド配列を含み、これにより、単一のＲｅｐ７８タンパク質の翻訳が可能になる。当業者が理解するように、任意の単一Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０）をコードする核酸であって、単一の開始コドンを有するように修飾され、したがって単一のＲｅｐタンパク質をコードする核酸を用いて、この修飾型Ｒｅｐ７８バクミドまたは修飾型Ｒｅｐ７８プラスミドを修飾することができる。 ｗｔ－Ｌ ＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、ルシフェラーゼ導入遺伝子、ＷＰＲＥおよびポリアデニル化配列、ならびにｍｏｄ－Ｒ ＩＴＲを有する、例示的なｃｅＤＮＡ－プラスミド－１の概略図である。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－２（左）」配列番号１０１）のＡ－Ａ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－２（右）」配列番号１０２）のＡ－Ａ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。それらは、単一アーム（Ｃ－Ｃ’）および単一不対ループを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－７２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－３（左）」配列番号１０３）のＡ－Ａ’アームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－３（右）」配列番号１０４）のＡ－Ａ’アームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。それらは、単一アーム（Ｂ－Ｂ’）および単一不対ループを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－７４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－４（左）」配列番号１０５）のＡ－Ａ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－４（右）」配列番号１０６）のＡ－Ａ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。それらは、単一アーム（Ｃ－Ｃ’）および単一不対ループを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－７６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲのＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’部分のＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示し、Ｃ－Ｂ’およびＣ’－Ｂ部分（「ＩＴＲ－１０（左）」配列番号１０７）の相補的塩基対合を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲのＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’およびＣ－Ｃ’部分のＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示し、Ｂ－Ｃ’およびＢ’－Ｃ部分（「ＩＴＲ－１０（右）」配列番号１０８）の相補的塩基対合を示す。それらは、単一アーム（Ｃ’－ＢおよびＣ－Ｂ’の部分またはＢ’－ＣおよびＢ－Ｃ’の部分）ならびに単一不対ループを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－８３．７ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１７（左）」配列番号１０９）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’部分のＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１７（右）」配列番号１１０）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’部分のＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－１７（左）およびＩＴＲ－１７（右）の両方は、単一アーム（Ｂ－Ｂ’）および単一不対ループを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－７３．３ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型ＩＴＲ（「ＩＴＲ－６（左）」配列番号１１１）のＡ－Ａ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型ＩＴＲ（「ＩＴＲ－６（右）」配列番号１１２）のＡ－Ａ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－６（左）およびＩＴＲ－６（右）の両方は、単一アームを有する構造を形成すると予測される。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１（左）」配列番号１１３）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣアームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１（右）」配列番号１１４）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣアームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－１（左）およびＩＴＲ－１（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのアームのうちの１つは切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－７４．７ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－５（左）」配列番号５４５）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ’アームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－５（右）」配列番号１１６）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’アームおよびＣ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－５（左）およびＩＴＲ－５（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つ（例えば、Ｃ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－７３．４ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－７（左）」配列番号１１７）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’アームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－７（右）」配列番号１１８）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－１７（左）およびＩＴＲ－１７（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つ（例えば、Ｂ－Ｂ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－８９．６ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－８（左）」配列番号１１９）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’アームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－８（右）」配列番号１２０）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－８（左）およびＩＴＲ－８（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つは切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－８６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－９（左）」配列番号１２１）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’アームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－９（右）」配列番号１２２）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－９（左）およびＩＴＲ－９（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つは切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－８５．０ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１１（左）」配列番号１２３）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’アームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１１（右）」配列番号１２４）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－１１（左）およびＩＴＲ－１１（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つは切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－８９．５ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１２（左）」配列番号１２５）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’アームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１２（右）」配列番号１２６）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－１２（左）およびＩＴＲ－１２（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つは切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－８６．２ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１３（左）」配列番号１２７）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’アームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１３（右）」配列番号１２８）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－１３（左）およびＩＴＲ－１３（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つ（例えば、Ｃ－Ｃ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－８２．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１４（左）」配列番号１２９）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’アームおよびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１４（右）」配列番号１３０）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－１４（左）およびＩＴＲ－１４（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つ（例えば、Ｃ－Ｃ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－８０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１５（左）」配列番号１３１）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’アームおよびＢ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１５（右）」配列番号１３２）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－１５（左）およびＩＴＲ－１５（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つ（例えば、Ｃ－Ｃ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－７７．２ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 例示的な修飾型左ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１６（左）」配列番号１３３）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’アームおよびＢ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。 例示的な修飾型右ＩＴＲ（「ＩＴＲ－１６（右）」配列番号１３４）のＡ－Ａ’アーム、ならびにＢ－Ｂ’アームおよびＣ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された最低エネルギー構造を示す。ＩＴＲ－１６（左）およびＩＴＲ－１６（右）の両方は、２つのアームを有する構造を形成すると予測され、それらのうちの１つ（例えば、Ｃ－Ｃ’アーム）は切断されている。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、－７３．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。 表１０Ａに列挙される例示的な修飾型右ＩＴＲのＡ－Ａ’アーム、ならびに修飾型Ｂ－Ｂ’アームおよび／または修飾型Ｃ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された構造を示す。 表１０Ａに列挙される例示的な修飾型右ＩＴＲのＡ－Ａ’アーム、ならびに修飾型Ｂ－Ｂ’アームおよび／または修飾型Ｃ－Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された構造を示す。 表１０Ｂに列挙される例示的な修飾型左ＩＴＲのＡ－Ａ’アーム、ならびに修飾型Ｃ－Ｃ’アームおよび／または修飾型Ｂ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の予測された構造を示す。示される構造は、予測された最低自由エネルギー構造である。カラーコード：赤色＝確率９９％超、橙色＝確率９９％～９５％、ベージュ色＝確率９５～９０％、濃緑色９０％～８０％、明緑色＝８０％～７０％、明青色＝７０％～６０％、濃青色６０％～５０％、およびピンク色＝５０％未満。 表１０Ａおよび１０Ｂから選択される非対称ＩＴＲ変異体バリアントでトランスフェクションされたＳｆ９ ＧｌｙｃｏＢａｃ昆虫細胞のルシフェラーゼ活性を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、野生型ＩＴＲおよび表１０Ａまたは１０Ｂから選択される修飾型非対称ＩＴＲによって隣接されるルシフェラーゼ遺伝子を有していた。「ＩＴＲ－５０右 ｒｅｐなし」は、Ｒｅｐ含有バキュロウイルスの共感染のない既知のレスキュー可能な変異体である。「模擬」条件は、ドナーＤＮＡを含まない、トランスフェクション試薬のみである。 表１０Ａに開示される様々な変異体右ＩＴＲから選択される他のＩＴＲと共に左ｗｔ－ＩＴＲを含むｃｅＤＮＡ－プラスミドでトランスフェクションされたＳｆ９昆虫細胞培養物からの代表的な粗ｃｅＤＮＡ抽出物の未変性アガロースゲル（１％アガロース、１×ＴＡＥ緩衝液）を示す。レーンあたり２ｕｇの全抽出物をロードした。左から右へ、レーン１）１ｋｂ＋ラダー、レーン２）ＩＴＲ－１８右、レーン３）ＩＴＲ－４９右、レーン４）ＩＴＲ－１９右、レーン５）ＩＴＲ－２０右、レーン６）ＩＴＲ－２１右、レーン７）ＩＴＲ－２２右、レーン８）ＩＴＲ－２３右、レーン９）ＩＴＲ－２４右、レーン１０）ＩＴＲ－２５右、レーン１１）ＩＴＲ－２６右、レーン１２）ＩＴＲ－２７右、レーン１３）ＩＴＲ－２８右、レーン１４）ＩＴＲ－５０右、レーン１５）１ｋｂ＋ラダー。 ＩＴＲ変異体ライブラリからの代表的な構築物の変性ゲル（０．８％アルカリアガロース）を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、表１０Ａに開示される様々な変異体右ＩＴＲから選択される他のＩＴＲと共に左ｗｔ－ＩＴＲを含むプラスミド構築物から産生される。左から右へ、レーン１）１ｋｂ＋ＤＮＡラダー、レーン２）ＩＴＲ－１８右 未切断、レーン３）ＩＴＲ－１８右 制限消化、レーン４）ＩＴＲ－１９右 未切断、レーン５）ＩＴＲ－１９右 制限消化、レーン６）ＩＴＲ－２１右 未切断、レーン７）ＩＴＲ－２１右 制限消化、レーン８）ＩＴＲ－２５右 未切断、レーン９）ＩＴＲ－２５右 制限消化。抽出物をＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで処理した。各変異体ｃｅＤＮＡは、２つの特徴的な断片、約２，０００ｂｐおよび約３，０００ｂｐ（それぞれ変性条件下で約４，０００および約６，０００ｂｐに達する）を産生する単一ＥｃｏＲＩ認識部位を有することが予想される。未処理のｃｅＤＮＡ抽出物は、約５，０００ｂｐであり、変性条件下で約１１，０００ｂｐで移動すると予想される。 ＩＴＲ変異体ＩＴＲ－１８右、ＩＴＲ－１９右、ＩＴＲ－２１右、およびＩＴＲ－２５右、およびＩＴＲ－４９のＨＥＫ２９３細胞におけるインビトロでのルシフェラーゼ活性を示し、ｃｅＤＮＡベクター中の左ＩＴＲは、ＷＴ ＩＴＲである。「模擬」条件は、ドナーＤＮＡを含まずトランスフェクション試薬のみであり、陰性対照は未処理である。 異なるＲｅｐタンパク質種（例えば、野生型Ｒｅｐ７８、野生型Ｒｅｐ６８、野生型Ｒｅｐ５２および野生型Ｒｅｐ４０）および修飾型Ｒｅｐ６８種のさまざまな特性および活性（例えば、ＤＮＡ結合、ＤＮＡニッキング、ヘリカーゼ活性、ＡＴＰアーゼ活性、およびＺｎフィンガー活性）を示す表であり、例えば、Ｒｅｐ７８タンパク質のアミノ酸は、Ｙ１５６、Ｋ３４０Ｈ、Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）のいずれかに修飾される。Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）のＲｅｐ７８の修飾は、野生型Ｒｅｐ７８タンパク質のすべての特性および活性を維持した。 安定性の高いＤＮＡベクターおよび特徴的なバンドの存在を示す非変性ゲルであり、本明細書に記載の方法を使用して単一のＲｅｐタンパク質で作製された安定性の高い閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターの存在を確認する。図３２Ａにおいて、野生型Ｒｅｐ７８をコードする核酸を使用した産生（レーン５）と比較して、Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）（レーン１）またはＲｅｐ Ｍｅｔ→Ｔｈｒ（Ｍ２２５Ｔ）（レーン２）のＲｅｐ７８の修飾を有する修飾型Ｒｅｐ７８の核酸を使用してより大量のｃｅＤＮＡベクターが産生され、核酸はＲｅｐ７８／６８タンパク質およびＲｅｐ５２／４０タンパク質の両方を発現する。Ｇｌｙ（Ｙ１５６Ｆ）（レーン３）またはＴｈｒ（Ｙ１５６Ｆ）（レーン４）の修飾を含むＲｅｐ７８結合／ニッキング変異ではｃｅＤＮＡベクターは産生されなかった。図３２Ｂでは、Ｒｅｐ６８ Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）およびＲｅｐ６８ Ｍｅｔ→Ｔｈｒ（Ｍ２２５Ｔ）変異も、Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）またはＲｅｐ Ｍｅｔ→Ｔｈｒ（Ｍ２２５Ｔ）のＲｅｐ７８の修飾を有する修飾型Ｒｅｐ７８の核酸を使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターの量以上のレベルまでｃｅＤＮＡベクターを産生した。ＤＬＳＲ：長い（Ｒｅｐ７８）および短い（Ｒｅｐ５２）Ｒｅｐタンパク質をタンデムで発現するプラスミド構築物、ｐＩＥ７８：野生型全長Ｒｅｐ７８配列、Ｒｅｐ７８Ｍ→Ｇ：Ｍ２２５Ｇ単一変異を含有する全長Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ７８Ｍ→Ｔ：Ｍ２２５Ｔ単一変異を含有する全長Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ７８Ｙ１５６Ｆ：ニッカーゼドメインに単一変異を有する全長Ｒｅｐ７８。 安定性の高いＤＮＡベクターおよび特徴的なバンドの存在を示す非変性ゲルであり、本明細書に記載の方法を使用して単一のＲｅｐタンパク質で作製された安定性の高い閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターの存在を確認する。図３２Ａにおいて、野生型Ｒｅｐ７８をコードする核酸を使用した産生（レーン５）と比較して、Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）（レーン１）またはＲｅｐ Ｍｅｔ→Ｔｈｒ（Ｍ２２５Ｔ）（レーン２）のＲｅｐ７８の修飾を有する修飾型Ｒｅｐ７８の核酸を使用してより大量のｃｅＤＮＡベクターが産生され、核酸はＲｅｐ７８／６８タンパク質およびＲｅｐ５２／４０タンパク質の両方を発現する。Ｇｌｙ（Ｙ１５６Ｆ）（レーン３）またはＴｈｒ（Ｙ１５６Ｆ）（レーン４）の修飾を含むＲｅｐ７８結合／ニッキング変異ではｃｅＤＮＡベクターは産生されなかった。図３２Ｂでは、Ｒｅｐ６８ Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）およびＲｅｐ６８ Ｍｅｔ→Ｔｈｒ（Ｍ２２５Ｔ）変異も、Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）またはＲｅｐ Ｍｅｔ→Ｔｈｒ（Ｍ２２５Ｔ）のＲｅｐ７８の修飾を有する修飾型Ｒｅｐ７８の核酸を使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターの量以上のレベルまでｃｅＤＮＡベクターを産生した。ＤＬＳＲ：長い（Ｒｅｐ７８）および短い（Ｒｅｐ５２）Ｒｅｐタンパク質をタンデムで発現するプラスミド構築物、ｐＩＥ７８：野生型全長Ｒｅｐ７８配列、Ｒｅｐ７８Ｍ→Ｇ：Ｍ２２５Ｇ単一変異を含有する全長Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ７８Ｍ→Ｔ：Ｍ２２５Ｔ単一変異を含有する全長Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ７８Ｙ１５６Ｆ：ニッカーゼドメインに単一変異を有する全長Ｒｅｐ７８。
Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．，２０１１（ＩＳＢＮ ９７８－０－９１１９１０－１９－３）、Ｒｏｂｅｒｔ Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３），Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９９－２０１２（ＩＳＢＮ ９７８３５２７６００９０８）、およびＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｂｙ Ｗｅｒｎｅｒ Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ－１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｒｉｃｈａｒｄ Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ Ｍ Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ Ｈ Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ Ｍ Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、これらの内容はすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」および「導入遺伝子」という用語は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達および発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。関心対象の導入遺伝子には、ポリペプチドをコードする核酸、好ましくは治療的（例えば、医療、診断、もしくは獣医学的用途）または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、関心対象の核酸は、治療用ＲＮＡに転写される核酸を含む。本発明のｃｅＤＮＡベクターでの使用のために含まれる導入遺伝子は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、アプタマー、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴもしくはポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせを発現またはコードするものを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「転写カセット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な１つ以上のプロモーターまたは他の調節配列に操作可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドをコードする配列、他のベクター配列、または逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加として、１つ以上のシス作用性配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー）、１つ以上のイントロン、および１つ以上の転写後調節エレメントを含んでもよい。
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、およびパリンドロームヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端配列または合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）とも称される）および末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳおよび少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補体であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ＩＴＲ］と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補鎖でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を行うことができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、３つ以上のＩＴＲまたは非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲであり得るか、またはＡＡＶ ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、またはＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によってさらに修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科ウイルスは、脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅおよび無脊椎動物に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅの２つの亜科で構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
「野生型ＩＴＲ」または「ＷＴ－ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性およびＲｅｐニッキング能力を保持する、ＡＡＶまたは他のディペンドウイルスにおける天然に存在するＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ－ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コードまたはドリフトの縮退のために、天然に存在する正準配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ－ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に発生する天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ－ＩＴＲ配列を含む。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ」または「実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する野生型ＩＴＲである単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ－ＩＴＲの対を指す。例えば、変化が配列の特性および全体的な３次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在する正準配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ－ＩＴＲに対して対称な３次元空間構成を有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、３次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループを有する。実質的に対称なＷＴ－ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥまたはＲＢＥ’）および末端分解部位（ｔｒｓ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意選択的に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」または「ｍｏｄ－ＩＴＲ」または「変異体ＩＴＲ」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ－ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに変異を有するＩＴＲを指す。変異は、同じ血清型のＷＴ－ＩＴＲの３次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの１つ以上の変化をもたらし得、３次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその３次元構造）の変化をもたらし得る。
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも呼ばれる「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補鎖ではない単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの３次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、３次元空間でのそれらのＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームおよび／または短いＢ－Ｂ’ループを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、または点変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列であり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型または合成ＩＴＲ配列）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ－ＩＴＲは、短いＣ－Ｃ’アームを有することができ、他方のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ－ＩＴＲと比較して、異なる３次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、または短いＢ－Ｂ’アームなど）を有し得る。
本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型ディペンドウイルスＩＴＲ配列に対して変異または修飾され、それらの全長にわたって逆相補である単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の一対のＩＴＲを指す。どちらのＩＴＲも野生型ＩＴＲ ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、それらは修飾型ＩＴＲであり、変異型ＩＴＲとも呼ばれる）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、または点変異により、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ＩＴＲ」または「実質的に対称のｍｏｄ－ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の修飾型ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性および全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称な３次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、３次元空間に構成された同じＡ、Ｃ－Ｃ’、およびＢ－Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ－ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称な３次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な３次元形状をもたらす変異を有する。例えば、ｍｏｄ－ＩＴＲ対の１つのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来し得、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する変異を有し得（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称な３次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称な修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性または全体的な形状に影響を与えず、それらが３次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ－ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ－ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）またはデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、正準ｍｏｄ－ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称な３次元空間構成を有する。実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対は、３次元空間で同じＡ、Ｃ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称なｍｏｄ－ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ－Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ－ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ－ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡおよびＢ－Ｂ’ループの同様の３次元構造を有する。
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ＡＢＣでは、Ｂの両側にＡおよびＣが隣接している。配置ＡｘＢｘＣについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端における末端反復を指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域をさらに組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミドまたはウイルスゲノムに組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡスペーサー領域」という用語は、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡゲノム中の機能的エレメントを分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、最適機能性のため所望の距離で２つの機能エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、例えば、プラスミドまたはバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供する、または増大させる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、クローニング部位などに便利な位置を提供することによって、ｃｅＤＮＡゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、または既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分解部位と、上流転写調節エレメントとの間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒなどを挿入する。同様に、スペーサーを、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分解部位との間に組み込むことができる。
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」、および「ＲＢＳ」は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８またはＡＡＶ Ｒｅｐ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実施することを可能にする。ＲＢＳ配列およびその逆相補体は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において同定されたＲＢＳ配列である５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号５３１）を含む。任意の既知のＲＢＳ配列は、他の既知のＡＡＶ ＲＢＳ配列および他の天然に既知のまたは合成ＲＢＳ配列を含む、本発明の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列ＧＣＴＣに結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、５’－（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）－３’（配列番号５３１）に直接結合し、安定に集成すると考えられる。加えて、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基およびホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性または低配列特異性であり、タンパク質－ＤＮＡ複合体を安定させる。
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」および「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ ｐｏｌ δまたはＤＮＡ ｐｏｌ εを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン－ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替的に、Ｒｅｐ－チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。受容体基質が相補的ＩＴＲであるとき、得られる産物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において同定されたヘキサヌクレオチド配列である５’－ＧＧＴＴＧＡ－３’（配列番号４５）を含む。他の既知のＡＡＶ ＴＲＳ配列、ＡＧＴＴ（配列番号４６）、ＧＧＴＴＧＧ（配列番号４７）、ＡＧＴＴＧＧ（配列番号４８）、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号４９）などの他の天然に既知のまたは合成ＴＲＳ配列、およびＲＲＴＴＲＲ（配列番号５０）などの他のモチーフを含む、任意の既知のＴＲＳ配列を、本発明の実施形態において使用することができる。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして操作し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス感染昆虫細胞」および「ｃｅＤＮＡ－ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ」という用語は、合成またはその他の非ウイルス遺伝子導入のためのカプシド不含閉端直鎖状二本鎖（ｄｓ）二重鎖ＤＮＡを指す。ｃｅＤＮＡの詳細な説明は、２０１７年３月３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２０８２８の国際出願に記載されており、その全容は参照により本明細書に明示的に組み込まれる。細胞ベースの方法を使用して様々な逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および構成を含むｃｅＤＮＡの産生のためのある特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号および２０１８年１２月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の実施例１に記載されており、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。様々なＩＴＲ配列および構成を含む合成ｃｅＤＮＡベクターの産生のためのある特定の方法は、例えば、２０１９年１月１８日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／１４１２２号に記載されており、その全容は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」という用語は、少なくとも１つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含ＤＮＡベクターを指す。
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」および「ｃｅＤＮＡ」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも１つの末端パリンドロームを含む閉端ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。
本明細書で使用される場合、「ｎｅＤＮＡ」または「ニックの入ったｃｅＤＮＡ」という用語は、オープンリーディングフレーム（例えば、発現されるプロモーターおよび導入遺伝子）の５’上流のステム領域またはスペーサー領域に１～１００塩基対のニックまたはギャップを有する閉端ＤＮＡを指す。
本明細書で使用される場合、「ギャップ」および「ニック」という用語は交換可能に使用され、本発明の合成ＤＮＡベクターの中断された部分を指し、その他の二本鎖ｃｅＤＮＡには一本鎖ＤＮＡ部分のストレッチが作成される。ギャップは、二重鎖ＤＮＡの一本鎖の長さが１塩基対～１００塩基対の長さであり得る。本明細書に記載される方法によって設計および作成された典型的なギャップ、および当該方法によって生成された合成ベクターは、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０ｂｐの長さであり得る。本開示における例示的なギャップは、１ｂｐ～１０ｂｐの長さ、１～２０ｂｐの長さ、１～３０ｂｐの長さであり得る。
本明細書で定義されるように、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起されたときに細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を生成する反応を触媒させ、β－ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産物に変換する。実験または診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ならびに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、または選択された薬剤もしくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを直接標的または損傷する任意のタンパク質またはペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要なポリペプチドを標的とするプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、およびリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の反応性の範囲および複雑性を拡張する。
転写調節因子は、関心対象の遺伝子の転写を活性化または抑制する、転写アクチベーターおよびリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、ならびに細胞条件および環境条件に応じて、アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、およびロイシン－ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」または「誘導因子タンパク質」は、調節配列エレメントに結合するタンパク質であり、調節配列エレメントに操作可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制または活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサーおよび誘導因子タンパク質は、少なくとも１つの入力剤または環境入力の存在または不在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合および入力剤結合、または反応性エレメントもしくはドメインを含む形態のモジュールである。
本明細書で使用される場合、「担体」としては、ありとあらゆる溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。医薬活性物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されたときに、毒性反応、アレルギー性反応、または同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
本明細書で使用される場合、「入力剤反応性ドメイン」は、条件または入力剤に結合するか、またはそうでなければ連結ＤＮＡ結合融合ドメインをその条件もしくは入力の存在に対して反応性にするように、条件または入力剤に反応する転写因子のドメインである。一実施形態では、条件または入力の存在は、入力剤反応性ドメインまたはそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。
「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中または生物内で起こるアッセイまたはプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法または使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物または植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞および細胞株を含む）、形質転換細胞株、および抽出組織または細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実行される方法および使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイおよび方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞または細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質またはＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現を調節する転写因子、または本明細書に記載される合成生体回路の別のモジュール構成要素で使用される別のプロモーターの転写因子の発現を駆動することができる。プロモーター配列内では、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質または転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、５０～１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流または遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内またはエクソン領域内に位置付けられ得る。
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動すると言うことができる。「作動可能に連結された」、「作動可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置および／または配向にあり、その配列の転写開始および／または発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節する。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子または配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。
いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組み換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方が、その自然環境において操作可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組み換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する変異を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路およびモジュールに関して、ＰＣＲを含む組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたく、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核性細胞小器官内の配列の転写および／または発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子または誘導剤の存在下、それによって影響されるとき、またはそれによって接触されるときに、転写活性を開始または強化することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方式で投与される、通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子または誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成要素またはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の不在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ））、ならびに他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、齧歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、トラウト、ナマズ、およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類またはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。追加として、対象は、幼児または子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、疾患および障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。追加として、本明細書に記載される方法および組成物は、飼育動物および／またはペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、または民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、ラテンアメリカ系、中東系などであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者または他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、すでに治療を受けている。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むがこれらに限定されない様々な抗体構造を包含する。「抗体断片」は、無傷の抗体が結合するのと同じ抗原に結合する無傷の抗体の一部分を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。一実施形態では、抗体または抗体断片は、免疫グロブリン鎖または抗体断片および少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。抗体またはその断片の例としては、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆａｂ’－ＳＨ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、重鎖、軽鎖、重鎖および軽鎖、完全抗体（例えば、Ｆｃ、Ｆａｂ、重鎖、軽鎖、可変領域などの各々を含む）、二重特異性抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体、イントラボディ、モノクローナル抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、または多量体抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体またはその断片は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含むがこれらに限定されない任意のクラス、およびＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないその任意のサブクラスのものであり得る。さらに、抗体は、任意の哺乳動物、例えば霊長類、ヒト、ラット、マウス、ウマ、ヤギなどに由来し得る。一実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化されている。いくつかの実施形態では、抗体は、修飾抗体である。いくつかの実施形態では、抗体の成分は、抗体がタンパク質成分の発現後に自己集成するように、別々に発現させることができる。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトにおける免疫原性反応を低減するために「ヒト化」される。いくつかの実施形態では、抗体は、疾患または疾患の症状を治療する目的で、所望の機能、例えば、所望のタンパク質の相互作用および阻害を有する。一実施形態では、抗体または抗体断片は、フレームワーク領域またはＦｃ領域を含む。
本明細書で使用される場合、抗体分子の「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原結合に関与する抗体分子、例えば免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の部分を指す。実施形態では、抗原結合部位は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖の可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖の可変領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、超可変領域と称され、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存された隣接ストレッチの間に配置される。ＦＲは、免疫グロブリンの超可変領域の間およびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列である。実施形態では、抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間において互いに対して配置されて、結合した抗原の３次元表面に相補的である抗原結合表面を形成する。重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。フレームワーク領域およびＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７において定義され、記載されている。各可変鎖（例えば、可変重鎖および可変軽鎖）は、典型的に３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４のアミノ酸順序で配置される。
本明細書で使用される場合、「全長抗体」という用語は、例えば、天然に存在し、通常の免疫グロブリン遺伝子断片の組み換えプロセスによって形成される、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えば、ＩｇＧ抗体）を指す。
本明細書で使用される場合、「機能的抗体断片」という用語は、無傷の（例えば、全長）抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する断片を指す。「抗体断片」または「機能的断片」という用語はまた、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」断片などの可変領域からなる単離された断片、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーによって接続される組み換え一本鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、Ｆｃ断片または単一のアミノ酸残基など、抗原結合活性のない抗体の部分を含まない。
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することができるアミノ酸配列を指す。例えば、配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列の全部または一部を含み得る。例えば、配列は、１、２、もしくはそれ以上のＮもしくはＣ末端アミノ酸を含んでも含まなくてもよく、またはタンパク質構造の形成に適合する他の変更を含んでもよい。
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基もしくは他の天然、化学的修飾もしくは生化学的修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの約５～約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離するか、または当該技術分野で既知である方法によって化学的に合成することができる。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。ＤＮＡは、例えば、アンチセンス分子、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖、事前に凝縮されたＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ベクター（Ｐ１、ＰＡＣ、ＢＡＣ、ＹＡＣ、人工染色体）、発現カセット、キメラ配列、染色体ＤＮＡ、またはこれらのグループの誘導体および組み合わせの形態であり得る。ＤＮＡは、ミニサークル、プラスミド、バクミド、ミニ遺伝子、ミニストリングＤＮＡ（直鎖状の共有結合的に閉じたＤＮＡベクター）、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ＣＥＬｉＤまたはｃｅＤＮＡ）、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡ、ダンベル型ＤＮＡ、最小限度に免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、ウイルスベクター、または非ウイルスベクターの形態であり得る。ＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）、およびそれらの組み合わせの形態であり得る。核酸としては、既知のヌクレオチド類似体または修飾型骨格残基もしくは連結を含有する核酸が挙げられ、これらは、合成、天然に存在する、および天然に存在しないものであり、参照核酸と同様の結合特性を有する。そのような類似体および／または修飾残基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（モルホリノ）、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。別途限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。別途明記しない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的修飾型バリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的配列、ならびに明示的に示された配列を暗黙的に包含する。
「ヌクレオチド」は、糖デオキシリボース（ＤＮＡ）またはリボース（ＲＮＡ）、塩基、およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介して共に連結している。
「塩基」には、プリンおよびピリミジンが含まれ、プリンおよびピリミジンは、天然化合物のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類似体、ならびにプリンおよびピリミジンの合成誘導体がさらに含まれ、該誘導体には、アミン、アルコール、チオール、カルボキシレート、およびアルキルハライドなどであるがこれらに限定されない新しい反応基を配置する修飾が含まれるが、これらに限定されない。
「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、非共有結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成する、温度および溶液イオン強度の適切なインビトロおよび／またはインビボ条件下で配列特異的、逆平行方法で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸は、相補的核酸に特異的に結合する）のを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当該技術分野で既知であるように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、チミジン（Ｔ）とのアデニン（Ａ）対合、ウラシル（Ｕ）とのアデニン（Ａ）対合、およびシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対合が含まれる。さらに、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションのために、グアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）と対合することも当該技術分野で既知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対合の状況で、遺伝コードの縮重（すなわち、冗長性）を部分的に担っている。この開示の文脈において、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であるとみなされ、逆もまた同様である。したがって、対象のＤＮＡ標的ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置でＧ／Ｕ塩基対を作製できる場合、その位置は、非相補的であるとみなされないが、代わりに相補的であるとみなされる。
本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ天然に存在しないような方法で核酸のセグメントを含有するように修飾されるか、または合成のものである、一本鎖または二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本開示のコード配列の発現に必要な制御配列を含有する場合、「発現カセット」という用語と同義である。「発現カセット」は、プロモーターに操作可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。
本明細書で使用される場合、「核酸治療」、「治療用核酸」および「ＴＮＡ」という語句は交換可能に使用され、疾患または障害を治療するための治療剤の活性成分として核酸を使用する治療の任意のモダリティを指す。本明細書で使用される場合、これらの語句は、ＲＮＡベースの治療剤およびＤＮＡベースの治療剤を指す。ＲＮＡベースの治療剤の非限定的な例としては、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタマー、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ダイサー基質ｄｓＲＮＡ、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。ＤＮＡベースの治療剤の非限定的な例としては、ミニサークルＤＮＡ、ミニ遺伝子、ウイルスＤＮＡ（例えば、レンチウイルスまたはＡＡＶゲノム）もしくは非ウイルス合成ＤＮＡベクター、閉端直鎖状二重鎖ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ／ＣＥＬｉＤ）、プラスミド、バクミド、ｄｏｇｇｙｂｏｎｅ（ｄｂＤＮＡ（商標））ＤＮＡベクター、最小限度に免疫学的に定義された遺伝子発現（ＭＩＤＧＥ）ベクター、非ウイルスミニストリングＤＮＡベクター（直鎖状の共有結合性閉鎖ＤＮＡベクター）、またはダンベル型ＤＮＡミニマルベクター（「ダンベルＤＮＡ」）が挙げられる。
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
本明細書で使用される場合、「合成ＡＡＶベクター」および「ＡＡＶベクターの合成産生」という用語は、完全に無細胞環境でのＡＡＶベクターおよびその合成産生方法を指す。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定要素の包含に対して開かれている、その組成物、方法、およびそれぞれの構成成分に関して使用される。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要なエレメントを指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴に物質的に影響を及ぼさないエレメントの存在を許容する。
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意のエレメントを除いて、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成成分を指す。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、および／または本開示などを読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、および／またはステップを含む。同様に、「または」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記で説明される。省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、「例えば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
作動例または別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。パーセンテージに関連して使用される「約」という用語は、±１％を意味する場合がある。本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲は、それに限定されるべきではない。
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。
ＩＩ．複製開始（Ｒｅｐ）タンパク質
本明細書に記載されるように、本明細書に記載される技術は、ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターまたは単一のＲｅｐタンパク質種を有するＡＡＶベクターの組成および改善された産生方法に関する。いくつかの態様によれば、本開示は、ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター、または単一のＲｅｐタンパク質を使用するＡＡＶベクターを産生する方法を提供し、Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０ではない。いくつかの実施形態によれば、単一のＲｅｐタンパク質はＲｅｐ７８である。いくつかの実施形態によれば、単一のＲｅｐタンパク質はＲｅｐ６８である。これは、Ｒｅｐ７８または６８およびＲｅｐ５２または４０（例えば、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２、図３２を参照）を含む２つのＲｅｐタンパク質を使用する従来技術に記載の方法よりも優れたｃｅＤＮＡベクター収量を産生するｃｅＤＮＡベクター産生の改善されたより効率的な方法である。実際、本発明以前は、ＡＡＶ粒子を産生するために、１つは長く（例えば、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８）１つは短い（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０）、２つのＲｅｐタンパク質が存在しなければならないと考えられていた。特に、ＡＡＶ粒子を産生するには、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２が単一のユニットとして、またはＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質の単一のコード配列を使用して存在する必要があると考えられていた。
したがって、本明細書に記載される技術の一態様は、ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクター、または２つのＲｅｐタンパク質ではなく単一のＲｅｐタンパク質を使用するＡＡＶベクターを産生する方法に関する。いくつかの実施形態によれば、単一のＲｅｐタンパク質はＲｅｐ７８である。いくつかの実施形態によれば、単一のＲｅｐタンパク質はＲｅｐ６８である。いくつかの実施形態によれば、Ｒｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８であり得るが、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０ではない。
本明細書に記載される技術の別の態様は、単一のパルボウイルスＲｅｐタンパク質をコードする第１のヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む組成物に関し、ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有さず、第１の開始コドンの下流に機能的開始コドンを欠き、かつ／またはエクソンスキッピングを防ぐ選択的スプライシング部位を欠き、それにより、昆虫細胞または無細胞系で追加のＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０のいずれか１つ以上）を翻訳することなく、単一のパルボウイルスＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８タンパク質）の翻訳を可能にする。すなわち、Ｒｅｐ７８をコードする核酸は、Ｒｅｐ５２タンパク質も産生せず、同様に、Ｒｅｐ６８をコードする核酸はＲｅｐ４０タンパク質を産生しない。さらに、他のＲｅｐタンパク質は、該系に存在または発現しない。ＤＮＡベクターを産生するための核酸構築物に対して、細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞）および無細胞系、例えば、昆虫細胞または無細胞系における、例えば、ｃｅＤＮＡベクターおよび他の組み換えパルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）ベクター。
一般的なＲｅｐタンパク質
Ｒｅｐ遺伝子はウイルスゲノムを複製するように機能する。Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８をコードする野生型核酸では、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のいずれかのＲｅｐオープンリーディングフレームにおけるスプライシング事象により、翻訳時に２つのＲｅｐタンパク質、それぞれＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０が生じる。すなわち、Ｒｅｐ７８タンパク質およびＲｅｐ６８タンパク質は、差次的スプライシングを受けてＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８の両方を産生する単一の核酸によってコードされる。同様に、Ｒｅｐ５２タンパク質およびＲｅｐ４０タンパク質は、差次的スプライシングを受けてＲｅｐ５２およびＲｅｐ４０の両タンパク質を産生する単一の核酸によってコードされる。Ｒｅｐ７８は、本来の第１の翻訳開始部位から産生された全長タンパク質である一方、Ｒｅｐ５２は、下流の内部「第２（ＡＵＧ）」翻訳開始部位からの翻訳産物である。したがって、全長野生型ＡＡＶゲノムが発現する場合、２つの異なる翻訳開始部位およびカルボキシ末端近くに存在する選択的スプライシング部位が主因で、全４種のＲｅｐタンパク質が通常存在する（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０）。Ｒｅｐタンパク質は、例えば、ＤＮＡニッキング、ＤＮＡ結合、ヘリカーゼ、リガーゼ、およびＡＴＰアーゼ活性などのさまざまな機能性をそれぞれ含む。所与のＲｅｐタンパク質の機能性は、さらに図３１に記載されている。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質の両方が、例えば、昆虫細胞および哺乳動物細胞系などのさまざまな系におけるＡＡＶベクターまたはｃｅＤＮＡベクターの産生に必要であることが以前報告されている。しかしながら、本明細書で論じられるように、本発明者らは、単一のＲｅｐタンパク質のみ、あるいは、短いＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）ではなく、少なくとも長いＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）の組み合わせが、ＡＡＶベクターの産生またはｃｅＤＮＡベクターの産生に使用できることを実証する。本明細書に記載の組成物および方法において有用な単一種のＲｅｐタンパク質は、ＤＮＡニッキング、ＤＮＡ結合およびＤＮＡライゲーション機能性の全３つの機能を含む。ある特定の実施形態では、単一のＲｅｐタンパク質は、ヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼ機能性をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法において有用な単一種のＲｅｐタンパク質は、ＩＴＲが血清型２（例えば、ＡＡＶ２）に由来する場合、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質である。代替の実施形態では、単一のＲｅｐタンパク質は、４２個のＡＡＶ血清型のいずれかから、またはより好ましくは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２ Ｒｅｐタンパク質からのものであり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物で使用するために包含される単一のＲｅｐタンパク質は、ＩＴＲが血清型２（例えば、ＡＡＶ２）に由来する場合、動物パルボウイルスＲｅｐタンパク質に対応する。Ｒｅｐタンパク質は、ＩＴＲを含む系の一部として機能し、ＩＴＲに結合して末端分解複製を開始し、閉端ｃｅＤＮＡベクター分子の形成を触媒する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法において有用な単一のＲｅｐタンパク質は、Ｒｅｐ７８である。代替の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法において有用な単一のＲｅｐタンパク質、すなわちＲｅｐ６８。代替の実施形態では、Ｒｅｐタンパク質の単一種は、例えば、ＤＮＡ結合、ＤＮＡニッキング、ヘリカーゼ、およびＡＴＰアーゼ活性を有するように、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８の機能性を含むように修飾されたＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０である。あるいは、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法において有用なＲｅｐタンパク質は、短いＲｅｐタンパク質であるＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０を含まない、長いＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）の組み合わせであり得る。
本明細書に記載される技術の別の態様は、単一のＲｅｐタンパク質をコードする核酸構築物に関し、核酸は、第２のＲｅｐタンパク質の発現を誘導しないまたは可能にしない。したがって、一態様では、単一のＲｅｐタンパク質をコードする核酸構築物は、別のＲｅｐタンパク質の機能的開始コドンを欠くように修飾される。
一実施形態では、単一のＲｅｐ種の存在（例えば、他の種が存在しない）は、ｐ１９ Ｒｅｐの翻訳を妨げる特定の変異によって、および当分野で既知の抗Ｒｅｐ抗体を使用するウエスタンブロット上に他のＲｅｐ種が存在しないことによって決定される。
修飾型Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸構築物
一実施形態では、単一種のＲｅｐタンパク質は、修飾型Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列によってコードされ、例えば、修飾型Ｒｅｐ７８タンパク質をコードすることができるが、ヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２タンパク質をコードするための機能的開始コドンを有しない、またはＲｅｐ６８もしくはＲｅｐ４０を産生するためのエクソンスキッピング用のスプライシング部位もない。例えば、修飾型Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列は、Ｒｅｐ５２の開始コドン（例えば、ＡＵＧ）がもはやメチオニンをコードしないように変更され、むしろ異なるアミノ酸をコードするように、Ｒｅｐ５２の開始コドンにおける修飾または変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ７８核酸配列のＲｅｐ５２の開始コドン（Ｍｅｔ）は、グリシン（例えば、ＡＵＧは、ＧｌｙをコードするＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧのうちの１つに変異する）、またはスレオニン（例えば、ＡＵＧは、ＴｈｒをコードするＡＣＴ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、およびＡＣＧのうちの１つに変異する）のアミノ酸をコードするように変異する。
修飾型Ｒｅｐタンパク質
いくつかの実施形態では、修飾型Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列は、配列番号５３０のアミノ酸残基２２５（Ｍｅｔ）の修飾を含む修飾型Ｒｅｐ７８タンパク質をコードし、アミノ酸残基２２５は、グリシン（Ｇｌｙ）（例えば、Ｍ２２５ＧまたはＭｅｔ２２５Ｇｌｙ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）（例えば、Ｍ２２５ＴまたはＭｅｔ２２５Ｔｈｒ）に変更される。一実施形態では、変異型Ｒｅｐ７８タンパク質は、配列番号５３０の配列を含むか、または配列番号５３０に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を有する配列を含み、２２５位のアミノ酸はＭｅｔではなく、修飾型Ｒｅｐタンパク質は少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有し、それをコードする遺伝子は、第２のＲｅｐタンパク質の産生を促進しない。当業者は、例えば、部位特異的変異誘発を使用して点変異を生成することができるであろう。ヌクレオチド配列の変異が正しく生成されたか否かを評価するために、野生型Ｒｅｐタンパク質と比較して、修飾型Ｒｅｐタンパク質（すなわち、点変異を含むＲｅｐタンパク質）との配列アラインメントを実施することができる。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法において有用な単一のＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に位置する、本明細書に記載のプロモーター、シス調節エレメント、または調節スイッチなどの発現制御配列を含み、核酸配列にはＲｅｐ５２の機能的開始コドンがない。一実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法において有用な単一のＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流の発現制御配列を含み、核酸配列は、Ｒｅｐ６８をコードするための機能的スプライシング部位を有しない。
すなわち、いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ７８をコードする核酸は、１つの開始コドンのみを有し、それにより、Ｒｅｐ７８タンパク質またはＲｅｐ６８タンパク質のみの翻訳を可能にする。そのような実施形態では、Ｒｅｐ７８核酸は、Ｒｅｐ７８タンパク質の翻訳を可能にする第１の機能的開始コドンを有するが、最初の開始コドンの下流の開始コドンが修飾され（または非機能的）、その結果、Ｒｅｐ５２が発現されない。
すべての場合において、別のＲｅｐをコードする他のベクターは使用されない。また、本明細書に記載の方法にしたがって、ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターまたはＡＡＶベクターを生成する方法で使用される昆虫細胞または哺乳動物細胞にＲｅｐタンパク質はすでに存在しない。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法において有用な単一のＲｅｐタンパク質は、パルボウイルス科に由来する。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法において有用な単一のＲｅｐタンパク質は、好ましくは、ディペンドウイルス亜科ウイルスＲｅｐからのものである。別の実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法において有用な単一のＲｅｐタンパク質は、より好ましくは、ＡＡＶ Ｒｅｐである。
一実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐ６８タンパク質をコードする発現制御配列を含み、核酸配列は、Ｒｅｐ４０の機能的開始コドンを有しないが、そのカルボキシ末端のイントロン配列に欠失を有し、Ｒｅｐ６８をもたらす。別の実施形態では、核酸配列は、全長Ｒｅｐ７８のイントロン配列に欠失を有し、Ｒｅｐ６８のみに翻訳され得る転写物をもたらす他の機能的スプライシング部位を有しない。すなわち、いくつかの実施形態では、Ｒｅｐ６８をコードする核酸は、１つの開始コドンのみを有し、それにより、ｃ末端イントロン配列が削除されたＲｅｐ６８タンパク質のみの翻訳を可能にする。そのような実施形態では、Ｒｅｐ６８核酸は、Ｒｅｐ６８タンパク質の翻訳を可能にする第１の機能的開始コドンを有するが、最初の開始コドンの下流の開始コドンは、変異によって修飾されるか、または非機能的である（例えば、発現されないＲｅｐ４０をもたらすＭ２２５ＧまたはＭ２２５Ｔ。あるいは、Ｒｅｐ６８をコードする核酸は、第２の開始コドンが変異（例えば、Ｍ２２５ＧまたはＭ２２５Ｔ）によって修飾されるか、または非機能的であるように修飾されるが、下流のｃ末端スプライシング部位は操作可能であり、Ｒｅｐ７８タンパク質およびＲｅｐ６８タンパク質の発現を可能にする。
配列番号５３０のヌクレオチド配列に対して実質的に同一である配列は、配列番号５３０の少なくとも６０％、７０％、８０％または９０％の同一性を有する配列である。
ＩＩＩ．単一のＲｅｐタンパク質を使用したｃｅＤＮＡベクターの詳細な産生方法
Ａ．一般的な産生
本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、２つ以上、例えば、２つのＲｅｐタンパク質とは対照的に、１つのＲｅｐタンパク質のみを使用するプロセスによって取得することができる。したがって、本発明の一態様は、ａ）単一のＲｅｐタンパク質の存在下において、宿主細胞内のｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下および十分な時間にわたってウイルスカプシドコード配列を欠くポリヌクレオチド発現構築物テンプレート（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）を内包する宿主細胞（例えば、昆虫細胞）の集団をインキュベーションするステップであって、宿主細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、インキュベーションするステップと、ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞から採取および単離するステップと、を含む方法に関する。単一のＲｅｐタンパク質の存在は、修飾型ＩＴＲを有するベクターポリヌクレオチドの複製を誘導して、宿主細胞中でｃｅＤＮＡベクターを産生する。しかしながら、ウイルス粒子（例えば、ＡＡＶビリオン）は発現されない。したがって、ＡＡＶまたは他のウイルス系ベクターにおいて天然に課されるものなどのサイズ制限はない。
宿主細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターの存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化し、消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
さらに別の態様では、本発明は、例えば、Ｌｅｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ８（８）：ｅ６９８７９に記載されるように、非ウイルスＤＮＡベクターの産生において、ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現テンプレート（ｃｅＤＮＡテンプレート）をそれら自体のゲノムに安定して組み込んでいる宿主細胞株の使用を提供する。好ましくは、Ｒｅｐは、約３のＭＯＩで宿主細胞に付加される。宿主細胞株が哺乳動物細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である場合、細胞株は、安定して組み込まれたポリヌクレオチドベクターテンプレートを有し得、ヘルペスウイルスなどの第２のベクターを使用して、Ｒｅｐタンパク質を細胞に導入することができ、Ｒｅｐおよびヘルパーウイルスの存在下でのｃｅＤＮＡの切除および増幅を可能にする。
一実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを作製するために使用される宿主細胞は、昆虫細胞であり、バキュロウイルスは、単一のＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、例えば図４Ａ～４Ｃおよび実施例１に記載される、ｃｅＤＮＡの非ウイルス性ＤＮＡベクターポリヌクレオチド発現構築物テンプレートとを両方送達するために使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単一のＲｅｐタンパク質を発現するために操作される。
次いで、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から採取および単離される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。一実施形態では、細胞は、十分な条件下で増殖し、ｃｅＤＮＡベクターを産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の大部分がバキュロウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取される。ＤＮＡ－ベクターは、Ｑｉａｇｅｎ Ｅｎｄｏ－Ｆｒｅｅプラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ＤＮＡ－ベクターに対して適合され得る。一般に、任意の核酸精製方法が採用され得る。
ＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に既知の任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
ｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、ならびにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ材料および未消化のＤＮＡ材料の両方を分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状かつ連続的なＤＮＡの存在を確認することによって確認され得る。図４Ｃおよび４Ｅは、本明細書におけるプロセスによって産生された閉端ｃｅＤＮＡベクターの存在を同定するための一実施形態を示す。例えば、図５は、実施例に記載されるこれらのベクターを産生するための一実施形態を使用し、複数のプラスミド構築物からのｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルである。
Ｂ．ｃｅＤＮＡプラスミド
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクターの後期産生に使用されるプラスミドである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、転写方向の操作可能に連結された構成成分として、少なくとも（１）５’ＩＴＲ配列、（２）シス調節エレメントを含有する発現カセット、例えば、プロモーター、誘導性プロモーター、調節スイッチ、エンハンサーなど、および（３）３’ＩＴＲ配列を提供する既知の技法を使用して構築され、３’ＩＴＲ配列は、５’ＩＴＲ配列に対して非対称である。いくつかの実施形態では、ＩＴＲによって隣接された発現カセットは、外因性配列を導入するためのクローニング部位を含む。発現カセットは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐおよびｃａｐコード領域を置き換える。
一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書では、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、導入遺伝子を含む発現カセット、および変異型または修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードする「ｃｅＤＮＡ－プラスミド」と参照されるプラスミドから取得され、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いている。代替の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（または５’）修飾型または変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２の（または３’）野生型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’および３’ＩＴＲは、互いに対して非対称である。代替の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、第１の（または５’）修飾型または変異型ＡＡＶ ＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２の（または３’）変異型または修飾型ＡＡＶ ＩＴＲをこの順序でコードし、当該ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ＡＡＶカプシドタンパク質コード配列を欠いており、５’および３’修飾型ＩＴＲは、相違し、同じ修飾を有しない。
さらなる実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド系は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている（すなわち、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子も欠いている）。追加として、特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドはまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、機能的ＡＡＶ ｃａｐおよびＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子（ＡＡＶ２の場合ＧＧ－３’）に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列を欠いている。
本発明のｃｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において周知の任意のＡＡＶ血清型のゲノムの天然ヌクレオチド配列を使用して生成され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、およびＡＡＶ－ＤＪ８ゲノムに由来する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７、ＮＣ００１４０１、ＮＣ００１７２９、ＮＣ００１８２９、ＮＣ００６１５２、ＮＣ００６２６０、ＮＣ００６２６１、Ｓｐｒｉｎｇｅｒによって維持されるＵＲＬで入手可能なＫｏｔｉｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｔｈｅ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｄｅｘ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｗｗｗウェブアドレス：ｏｅｓｙｓ．ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｄｅ／ｖｉｒｕｓｅｓ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｍｋｃｈａｐｔｅｒ．ａｓｐ？ｖｉｒＩＤ＝４２．０４）（注記－ＵＲＬまたはデータベースに対する参照は、本出願の有効な出願日現在のＵＲＬまたはデータベースの内容を指す）。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、ＡＡＶ２ゲノムに由来する。別の特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡ－プラスミド骨格は、これらのＡＡＶゲノムのうちの１つに由来する５’および３’ＩＴＲに含まれるように遺伝子操作された合成骨格である。
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、ｃｅＤＮＡベクター産生細胞株の確立における使用のための選択可能または選択マーカーを任意選択的に含み得る。一実施形態では、選択マーカーは、３’ＩＴＲ配列の下流（すなわち、３’）に挿入され得る。別の実施形態では、選択マーカーは、５’ＩＴＲ配列の上流（すなわち、５’）に挿入され得る。適切な選択マーカーは、例えば、薬物耐性を付与するものを含む。選択マーカーは、例えば、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子、カナマイシン、ゲネチシンなどであり得る。好ましい実施形態では、薬物選択マーカーは、ブラスチシジンＳ耐性遺伝子である。
例示的なｃｅＤＮＡ（例えば、ｒＡＡＶ０）は、ｒＡＡＶプラスミドから産生される。ｒＡＡＶベクターの産生のための方法は、（ａ）宿主細胞に上記のようなｒＡＡＶプラスミドを提供することであって、宿主細胞およびプラスミドの両方が、カプシドタンパク質コード遺伝子を欠いている、提供することと、（ｂ）ｃｅＤＮＡゲノムの産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、（ｃ）細胞を採取し、当該細胞から産生されたＡＡＶゲノムを単離することと、を含み得る。
Ｃ．ｃｅＤＮＡプラスミドからｃｅＤＮＡベクターを作製する例示的な方法
カプシド不含ｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、特にインビボ実験に十分なベクターを提供するために十分に高い収率を有する方法もまた、本明細書に提供される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの産生方法は、（１）発現カセットおよび２つの非対称ＩＴＲ配列を含む核酸構築物を宿主細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）中に導入するステップと、（２）任意に、例えば、プラスミド上に存在する選択マーカーを使用することによってクローン細胞株を確立するステップと、（３）Ｒｅｐコード遺伝子を（当該遺伝子を担持するバキュロウイルスでのトランスフェクションまたは感染のいずれかによって）当該昆虫細胞中に導入するステップと、（４）細胞を採取し、ｃｅＤＮＡベクターを精製するステップと、を含む。カプシド不含ＡＡＶベクターの産生のために上記の発現カセットおよび２つのＩＴＲ配列を含む核酸構築物は、ｃｆＡＡＶ－プラスミド、または下記のようにｃｆＡＡＶ－プラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスの形態であり得る。核酸構築物は、トランスフェクション、ウイルス形質導入、安定した組み込み、または当該技術分野において既知の他の方法によって宿主細胞中に導入され得る。
Ｄ．細胞株：
ｃｅＤＮＡベクターの産生において使用される宿主細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９、Ｓｆ２１など）もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞に由来する昆虫細胞株、または他の無脊椎動物、脊椎動物、もしくは哺乳動物細胞を含む他の真核細胞株を含み得る。当業者に既知の他の細胞株、例えば、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、単球、ならびに成熟および未成熟樹状細胞を使用することもできる。宿主細胞株は、高収率のｃｅＤＮＡベクター産生のために、ｃｅＤＢＡ－プラスミドの安定した発現のためにトランスフェクションされ得る。
ｃｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において既知の試薬（例えば、リポソーム、リン酸カルシウム）または物理的手段（例えば、電気穿孔）を使用し、一時的なトランスフェクションによってＳｆ９細胞中に導入され得る。代替として、ｃｅＤＮＡ－プラスミドをそれらのゲノム中に安定して組み込んでいる安定したＳｆ９細胞株が確立され得る。そのような安定した細胞株は、選択マーカーを上記のｃｅＤＮＡ－プラスミド中に組み込むことによって確立され得る。細胞株をトランスフェクションするために使用されるｃｅＤＮＡ－プラスミドが、抗生物質などの選択マーカーを含む場合、ｃｅＤＮＡ－プラスミドでトランスフェクションされ、ｃｅＤＮＡ－プラスミドＤＮＡをそれらのゲノム中に組み込んでいる細胞は、細胞増殖培地への抗生物質の添加によって選択され得る。次いで、細胞の耐性クローンは、単一細胞希釈またはコロニー移動技法によって単離され、伝播され得る。
Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターを単離し、精製する
ｃｅＤＮＡベクターを入手し、単離するためのプロセスの例は、図４Ａ～４Ｅおよび下記の特定の実施例に記載される。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡ－ベクターは、単一のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質を発現するプロデューサー細胞から取得され、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスでさらに形質転換され得る。ｃｅＤＮＡベクターの産生に有用なプラスミドとしては、図８Ａ（Ｒｅｐ ＢＩＩＣ産生に有用な）、図８Ｂ（ｃｅＤＮＡベクターを取得するために使用されるプラスミド）に示されるプラスミドが挙げられる。
一態様では、ポリヌクレオチドは、プラスミド（Ｒｅｐ－プラスミド）、バクミド（Ｒｅｐ－バクミド）、またはバキュロウイルス（Ｒｅｐ－バキュロウイルス）中のプロデューサー細胞に送達された単一のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８もしくは６８）をコードする。Ｒｅｐ－プラスミド、Ｒｅｐ－バクミド、およびＲｅｐ－バキュロウイルスは、上記の方法によって生成され得る。
例示的なｃｅＤＮＡベクターである、ｃｅＤＮＡベクターを産生するための方法は、本明細書に記載される。本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用される発現構築物は、プラスミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド）、バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－バクミド）、および／またはバキュロウイルス（例えば、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）であり得る。単なる例として、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスおよびＲｅｐ－バキュロウイルスに共感染した細胞から生成され得る。Ｒｅｐ－バキュロウイルスから産生されたＲｅｐタンパク質は、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを複製して、ｃｅＤＮＡベクターを生成する。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ－プラスミド、Ｒｅｐ－バクミド、またはＲｅｐ－バキュロウイルス中で送達される単一のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ５２）をコードする配列を含む構築物で安定してトランスフェクションされた細胞から生成され得る。ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスは、細胞に一時的にトランスフェクションされ、Ｒｅｐタンパク質によって複製され、ｃｅＤＮＡベクターを産生し得る。
バクミド（例えば、ｃｅＤＮＡ－バクミド）は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｎｉ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞などの許容昆虫細胞中にトランスフェクションされ得、非対称ＩＴＲおよび発現カセットを含む配列を含む組み換えバキュロウイルスである、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを生成し得る。ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを昆虫細胞中に再度感染させて、次世代の組み換えバキュロウイルスを取得することができる。任意選択的に、このステップを一回または複数回繰り返して、より多い量の組み換えバキュロウイルスを産生することができる。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを細胞から採取するための時間は、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、細胞生存率、細胞形態論、細胞増殖などを考慮して選択され得る。通常、細胞は、ｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）を産生するためのバキュロウイルス感染から十分な時間が経過した後、但し細胞の対部分がウイルスの毒性のために死滅し始める前に採取され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、Ｑｉａｇｅｎ ＥＮＤＯ－ＦＲＥＥ ＰＬＡＳＭＩＤ（登録商標）キットなどのプラスミド精製キットを使用して、Ｓｆ９細胞から単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法もまた、ｃｅＤＮＡベクターに対して適合され得る。一般に、任意の当該技術分野において既知の核酸精製方法、ならびに市販のＤＮＡ抽出キットが採用され得る。
代替として、細胞ペレットをアルカリ溶解プロセスに供し、得られた溶解物を遠心分離し、クロマトグラフィー分離を実施することによって、精製が実装され得る。１つの非限定例として、このプロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム（例えば、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ Ｑ（登録商標））上に上澄をロードし、次いで溶出し（例えば、１．２Ｍ ＮａＣｌ溶液で）、ゲル濾過カラム（例えば、６高速流ＧＥ）上でさらなるクロマトグラフィー精製を実施することによって実施され得る。次いで、カプシド不含ＡＡＶベクターは、例えば、沈殿によって回収される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターはまた、エキソソームまたは微粒子の形態で精製され得る。多くの細胞型が、膜微小胞の脱落を介して、可溶性タンパク質だけでなく、複合タンパク質／核酸カーゴも放出することは、当該技術分野において既知である（Ｃｏｃｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ，２００９、ＥＰ１０３０６２２６．１）。そのような小胞は、微小胞（微粒子とも称される）およびエキソソーム（ナノ小胞とも称される）を含み、それらの両方が、タンパク質およびＲＮＡをカーゴとして含む。微小胞は、形質膜の直接出芽から生成され、エキソソームは、多小胞エンドソームと形質膜との融合時に細胞外環境に放出される。したがって、ｃｅＤＮＡベクターを含有する微小胞および／またはエキソソームは、ｃｅＤＮＡプラスミド、またはｃｅＤＮＡプラスミドで生成されたバクミドもしくはバキュロウイルスで形質導入された細胞から単離され得る。
微小胞は、培養培地を２０，０００ｘｇでの濾過または超遠心分離、および１００，０００ｘｇでのエキソソームにかけることによって単離され得る。超遠心分離の最適な期間は、実験的に決定することができ、小胞が単離される特定の細胞型に依存するであろう。好ましくは、培養培地は、最初に低速遠心分離（例えば、２０００×ｇで５～２０分間）によって一掃され、例えば、ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）スピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）を使用し、スピン濃度に供される。微小胞およびエキソソームは、微小胞およびエキソソーム上に存在する特定の表面抗原を認識する特定の抗体を使用することによって、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを介してさらに精製され得る。他の微小胞およびエキソソーム精製方法としては、免疫沈殿、親和性クロマトグラフィー、濾過、および特定の抗体またはアプタマーでコーティングされた磁気ビーズが挙げられるが、これらに限定されない。精製時に、小胞を、例えば、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄する。ｃｅＤＮＡ含有小胞を送達するために微小胞またはエキソソームを使用する１つの利点は、これらの小胞が、それぞれの細胞型上の特定の受容体によって認識されるそれらの膜タンパク質上に含めることによって、様々な細胞型に標的化され得ることである。（ＥＰ１０３０６２２６も参照）
本明細書における本発明の別の態様は、ｃｅＤＮＡ構築物をそれら自体のゲノム中に安定して組み込んでいる宿主細胞株からｃｅＤＮＡベクターを精製する方法に関する。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。別の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームまたは微粒子として精製される。
図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のｃｅＤＮＡプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルを示す。ｃｅＤＮＡは、実施例の図４Ｄに関して考察されるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。ｃｅＤＮＡ産生プロセスおよび中間体の他の特徴は、実施例に記載されるように、図６Ａおよび６Ｂならびに図７Ａおよび７Ｂに要約される。
ＩＶ．ｃｅＤＮＡベクター
本明細書に記載されるように、単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物は、共有結合性閉端（ｃｅＤＮＡ）ベクターを有するカプシド不含ｃｅＤＮＡ分子の産生において有用である。いくつかの実施形態では、これらのｃｅＤＮＡベクターは、単一のＲｅｐタンパク質を含む許容宿主細胞において産生され、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列間に位置する異種遺伝子（導入遺伝子）を含有する発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス、または組み込まれた細胞系統）から産生され、ＩＴＲ配列は、これらの用語が本明細書で定義される通り、非対称ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る。本明細書に開示されるようなＮＬＳを含むｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ－ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ－ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ－ＷＴ ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ－ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。
ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間超３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。
本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を用いて本方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージングの制約を有しない。ｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子等の挿入を許可する。
一態様では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を用いて本方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、５’～３’方向に、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、互いに関して非対称であり、すなわち、それらは互いに異なる。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは野生型ＩＴＲであり、第２のＩＴＲは変異型または修飾型ＩＴＲであり得る。いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲは、変異型または修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、両方とも修飾されているが、異なる配列であるか、または異なる修飾を有するか、または同一の修飾型ＩＴＲではない。言い換えれば、ＩＴＲは、１つのＩＴＲの任意の変化が他のＩＴＲに反映されていない非対称であるか、あるいはＩＴＲは、互いに関して異なる。ｃｅＤＮＡベクター中の、ｃｅＤＮＡ－プラスミドを生成するために使用するための例示的なＩＴＲは、「ＩＴＲ」と題するセクションで後述されている。
本明細書に提供される野生型または変異型または他の方法で修飾されたＩＴＲ配列は、ｃｅＤＮＡベクターの産生のために発現構築物（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス）に含まれるＤＮＡ配列を表す。したがって、ｃｅＤＮＡ－プラスミドまたは他の発現構築物から産生されたｃｅＤＮＡベクター中に実際に含有されるＩＴＲ配列は、産生プロセス中に起こる天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果として、本明細書に提供されるＩＴＲ配列に対して同一であっても同一でなくてもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を用いて本方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子を有する発現カセットを含み、導入遺伝子は、例えば、調節配列、核酸をコードする配列（例えば、ｍｉＲまたはアンチセンス配列など）、またはポリペプチドをコードする配列（例えば、導入遺伝子など）であり得る。一実施形態では、導入遺伝子は、導入遺伝子の発現を可能にするかまたは制御する１つ以上の調節配列に操作可能に連結され得る。一実施形態では、ポリヌクレオチドは、第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列を含み、関心対象のヌクレオチド配列は、第１および第２のＩＴＲ配列によって隣接され、第１および第２のＩＴＲ配列は、互いに対して非対称である。
これらの態様の各々における一実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲ間に位置し、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、転写後調節エレメント、ならびにポリアデニル化および終結シグナルのうちの１つ以上をこの順に含む。一実施形態では、プロモーターは、調節可能－誘導可能または抑制可能である。プロモーターは、導入遺伝子の転写を促進する任意の配列であり得る。一実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（例えば、配列番号０３）またはその変形である。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の発現を調節する配列、非限定例として、導入遺伝子の発現を強化する三次構造を作成する任意の配列である。
一実施形態では、転写後調節エレメントは、ＷＰＲＥ（例えば、配列番号０８）を含む。一実施形態では、ポリアデニル化および終結シグナルは、ＢＧＨポリＡ（例えば、配列番号０９）を含む。当該技術分野において既知の任意のシス調節エレメント、またはその組み合わせ、例えば、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー配列（ＵＳＥ）または他の転写後処理エレメント（限定されないが、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子を含む）が追加として使用され得る。一実施形態では、５’～３’配向の発現カセット長は、ＡＡＶビリオン中でカプシド化されることが知られている最大長を超える。一実施形態では、長さは、４．６ｋｂ超、または５ｋｂ超、または６ｋｂ超、または７ｋｂ超である。様々な発現カセットが、本明細書に例示される。
本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を用いて本方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、もしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチド、または５０，０００ヌクレオチド、または約４０００～１０，０００ヌクレオチド、もしくは１０，０００～５０，０００ヌクレオチドの任意の範囲、または５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～５０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～７５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１０００～１０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００～５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が導入遺伝子の効率的な発現をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターにおける発現カセットは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）および／または２Ａエレメントも含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに記載されている、導入遺伝子の発現を制御および調節するための１つ以上の調節スイッチを含み、所望される場合、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
図１Ａ～１Ｃは、非限定の例示的なｃｅＤＮＡベクター、またはｃｅＤＮＡプラスミドの対応する配列の概略図を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセットおよび第２のＩＴＲをこの順にコードするプラスミドから取得され、第１および／または第２のＩＴＲ配列のうちの少なくとも１つは、対応する野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に関して変異される。発現可能な導入遺伝子カセットは、好ましくは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、ならびにポリアデニル化および終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順序で含む。
本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセットは、関心対象の任意の導入遺伝子を含むことができる。関心対象の導入遺伝子には、ポリペプチドをコードする核酸、または非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲなど）、好ましくは治療的（例えば、医療、診断、もしくは獣医学的用途）もしくは免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、発現カセット中の導入遺伝子は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、治療遺伝子またはマーカータンパク質である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、模倣体もしくは抗体もしくは抗体断片、またはその抗原結合断片、例えば、中和抗体もしくは抗体断片などを標的とする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に定義されるように、全長抗体または抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書で定義されるように、抗原結合ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列である。
特に、導入遺伝子は、例えば、疾患、機能不全、傷害、および／または障害のうちの１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善における使用のための、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、酵素、抗体、抗原結合断片、ならびにそのバリアントおよび／または活性断片を含むが、これらに限定されない１つ以上の治療剤である。例示的な治療遺伝子は、本明細書において「治療の方法」と題されたセクションに記載される。
本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を用いて本方法および組成物にしたがって産生され、プラスミド系発現ベクターとは異なるｃｅＤＮＡベクターの多くの構造特徴が存在する。ｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴：元の（すなわち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠失、原核細胞複製起源の欠失、自蔵である（すなわち、Ｒｅｐ結合および末端分解部位（ＲＢＳおよびＴＲＳ）を含む２つのＩＴＲ以外のいかなる配列も、ＩＴＲ間の外因性配列も必要としない）、真核起源（すなわち、それらは真核細胞中で産生される）のヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、ならびに細菌型ＤＮＡメチル化、または実際に哺乳動物宿主によって異常であるとみなされる任意の他のメチル化の不在のうちの１つ以上を有し得る。一般に、本ベクターは、いかなる原核細胞ＤＮＡも含有しないことが好ましいが、いくつかの原核細胞ＤＮＡが、外因性配列として、非限定例としてプロモーターまたはエンハンサー領域に挿入されてもよいことが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖状ＤＮＡであるが、プラスミドは、常に二本鎖ＤＮＡである。
本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を用いて本方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイによって判定されるように、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する（図４Ｄ）。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組み換えられて変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクターおよびｃｅＤＮＡ－プラスミドは、構造（特に、直鎖状対環状）およびこれらの異なる対象物（下記を参照）を産生および精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ－プラスミドの場合は原核細胞タイプおよびｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
プラスミド系発現ベクターを超える本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターのいくつかの利点としては、次のことが挙げられるが、これらに限定されない。１）プラスミドは、細菌ＤＮＡ配列を含有し、原核細胞特異的メチル化、例えば、６－メチルアデノシンおよび５－メチルシトシンメチル化に供されるが、カプシド不含ＡＡＶベクター配列は、真核細胞起源であり、原核細胞特異的メチル化を受けず、結果として、カプシド不含ＡＡＶベクターは、プラスミドと比較して炎症および免疫反応を誘導する可能性が低い。２）プラスミドは、産生プロセス中に耐性遺伝子の存在を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは必要としない。３）環状プラスミドは、細胞への導入時に核に送達されず、細胞ヌクレアーゼによる分解をバイパスするために過負荷を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼに対する耐性を付与するウイルスシスエレメント、すなわちＩＴＲを含有し、核に対して標的化され、送達されるように設計され得る。ＩＴＲ機能に不可欠な最小定義エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号５３１））および末端分解部位（ＴＲＳ、ＡＡＶ２の場合５’－ＡＧＴＴＧＧ－３’（配列番号４８））に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列であると仮定する。４）ｃｅＤＮＡベクターは、報告によれば受容体のＴｏｌｌ様ファミリーのメンバーに結合し、Ｔ細胞媒介性免疫反応を誘起する原核細胞由来のプラスミドにおいてしばしば見出されるＣｐＧジヌクレオチドの過剰提示を有しない。対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞および組織型を効率的に標的とし得る。
Ｖ．ＩＴＲ
本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、互いに異なる（すなわち、非対称ＩＴＲである）２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置する異種遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ）と比較して欠失、挿入、および／または置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、例えば、ＡＡＶ２の場合５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’、配列番号５３１）および機能的末端分解部位（ＴＲＳ、例えば、５’－ＡＧＴＴ－３’、配列番号４６）を含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能的ＩＴＲである。一実施形態では、異なるＩＴＲは、異なる血清型からの各野生型ＩＴＲではない。
ＩＴＲは、明細書において例証されており、本明細書における例は、ＡＡＶ２ ＩＴＲであるが、当業者であれば、上述のように、任意の既知のパルボウイルス、例えば、ディペンドウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、およびＡＡＶ－ＤＪ８ゲノムからのＩＴＲを使用できることを認識する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ００６２６０；ＮＣ００６２６１）、キメラＩＴＲ、または任意の合成ＡＡＶからのＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、温血動物、例えば、鳥類（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ随伴ウイルスに感染し得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１７０１）、ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）に由来する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲ配列は、２つの亜科：脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅおよび昆虫に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅを含む、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスに由来し得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ（パルボウイルスと称される）は、Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属を含み、そのメンバーは、ほとんどの条件下で、増殖性感染のためにアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ディペンドウイルス族は、通常はヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、および６）または霊長類（例えば、血清型１および４）に感染するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ならびに他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ随伴ウイルス）を含む。パルボウイルスおよびＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科の他のメンバーは、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ： Ｔｈｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”Ｃｈａｐｔｅｒ ６９ ｉｎ ＦＩＥＬＤＳ ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ Ｅｄ．１９９６）に一般に記載されている。
熟練者であれば、ＩＴＲ配列は、二本鎖ホリデージャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ形またはＹ形ヘアピン構造であり（例えば、図２Ａおよび図３Ａ）、各ＩＴＲは、より大きなパリンドロームアーム（Ａ－Ａ’）に埋め込まれた２つのパリンドロームアームまたはループ（Ｂ－Ｂ’およびＣ－Ｃ’）、ならびに一本鎖Ｄ配列によって形成され（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップまたはフロップ配向を定義する）、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ－プラスミドにおける使用のための、任意のＡＡＶ血清型からの対応する修飾型ＩＴＲ配列を容易に判定することができる。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ６）に由来するＩＴＲの構造分析および配列比較を参照されたい。Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６－４３９、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；３６４－３７９、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９；２６１；８－１４に記載されている。
ＩＴＲにおける特定の変更および変異が本明細書に詳細に記載されているが、ＩＴＲの文脈において、「変更型」または「変異型」は、ヌクレオチドが、野生型配列、参照配列、または元のＩＴＲ配列に対して挿入、欠失、および／または置換されており、２つの隣接するＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクター中の他の隣接するＩＴＲに対して変更され得ることを示す。変更型または変異型ＩＴＲは、操作されたＩＴＲであり得る。本明細書で使用される場合、「操作された」とは、人の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの態様、例えば、その配列が、人の手によって操作され、それが天然に存在するときの態様とは異なるとき、「操作された」とみなされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲは、合成であり得る。一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づく。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶ系配列を含まない。さらに別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、または全く有しない。いくつかの態様では、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐまたは特定血清型のＲｅｐと選好的に相互作用し得るか、または場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、変異型Ｒｅｐによってのみ認識される。
ＩＴＲ配列は、二本鎖ホリデージャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ形またはＹ形ヘアピン構造であり（例えば、図２Ａおよび図３Ａ）、各ＩＴＲは、より大きなパリンドロームアーム（Ａ－Ａ’）に埋め込まれた２つのパリンドロームアームまたはループ（Ｂ－Ｂ’およびＣ－Ｃ’）、ならびに一本鎖Ｄ配列によって形成される（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップまたはフロップ配向を定義する）。当業者は、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ－プラスミドにおいて使用するための任意のＡＡＶ血清型からＩＴＲ配列または修飾型ＩＴＲ配列を容易に判定することができる。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６－４３９に記載される異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ６、ならびにトリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）およびウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ））からのＩＴＲの配列比較を参照されたい。これは、他の血清型からの左ＩＴＲに対するＡＡＶ２の左ＩＴＲの同一性％を示す：ＡＡＶ－１（８４％）、ＡＡＶ－３（８６％）、ＡＡＶ－４（７９％）、ＡＡＶ－５（５８％）、ＡＡＶ－６（左ＩＴＲ）（１００％）、およびＡＡＶ－６（右ＩＴＲ）（８２％）。
したがって、ＡＡＶ２ ＩＴＲは、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの例示的なＩＴＲとして使用されるが、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、またはＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）を含む任意の既知のＡＡＶ血清型のＩＴＲで調製され得るか、またはそれに基づき得る。当業者であれば、既知の手段によって他の血清型における対応する配列を判定することができる。例えば、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、またはＤ領域中に変化が存在するかどうかを判定し、別の血清型における対応する領域を判定する。ＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）または他の相同性アラインメントプログラムをデフォルト状態で使用して、対応する配列を判定することができる。本発明は、異なるＡＡＶ血清型の組み合わせからＩＴＲを含む集団および複数のｃｅＤＮＡベクターをさらに提供する。すなわち、１つのＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他のＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。理論に束縛されるものではないが、一実施形態では、１つのＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列に由来し得るか、またはそれに基づき得、ｃｅＤＮＡベクターの他のＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、またはＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）の任意の１つ以上のＩＴＲ配列に由来し得るか、またはそれに基づき得る。
任意のパルボウイルスＩＴＲを、ＩＴＲとして、または塩基ＩＴＲとして修飾に使用することができる。好ましくは、パルボウイルスは、ディペンドウイルスである。より好ましくは、ＡＡＶである。選択される血清型は、その血清型の組織向性に基づき得る。ＡＡＶ２は、広い組織向性を有し、ＡＡＶ１は、ニューロンおよび骨格筋を選好的に標的し、ＡＡＶ５は、ニューロン、網膜色素上皮、および光受容体を標的とする。ＡＡＶ６は、骨格筋および肺を選好的に標的とする。ＡＡＶ８は、肝臓、骨格筋、心臓、および膵臓組織を選好的に標的とする。ＡＡＶ９は、肝臓、骨格、および肺組織を選好的に標的とする。一実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲに基づく。例えば、配列番号２および配列番号５２からなる群から選択される。これらの態様のそれぞれの一実施形態では、ベクターポリヌクレオチドは、配列番号１および配列番号５２ならびに配列番号２および配列番号５１からなる群から選択される１対のＩＴＲを含む。これらの態様のそれぞれの一実施形態では、ベクターポリヌクレオチドまたは共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、配列番号１０１および配列番号１０２、配列番号１０３、および配列番号１０４、配列番号１０５、および配列番号１０６、配列番号１０７、および配列番号１０８、配列番号１０９、および配列番号１１０、配列番号１１１、および配列番号１１２、配列番号１１３および配列番号１１４、および配列番号１１５および配列番号１１６からなる群から選択される異なる１対のＩＴＲを含む。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、配列番号２、５２、６３、６４、１０１～４９９、または５４５～５４７のＩＴＲまたは部分ＩＴＲ配列のうちのいずれかから選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、本明細書において表２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａ、および１０Ｂのうちのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列もしくはＩＴＲ部分配列、または図２６Ａもしくは２６Ｂに示される配列の修飾のうちのいずれかに対応するＩＴＲの修飾を有するＩＴＲを含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、分子内二本鎖二次構造を形成することができる。第１のＩＴＲおよび非対称の第２のＩＴＲの二次構造は、野生型ＩＴＲ（例えば、図２Ａ、３Ａ、および３Ｃを参照）ならびに修飾型ＩＴＲ構造（例えば、図２Ｂ、および図３Ｂ、３Ｄを参照）の文脈において例証されている。二次構造は、ｃｅＤＮＡベクターの産生に使用されるプラスミドのＩＴＲ配列に基づいて推測または予測される。ステムループ構造の一部が欠失される修飾型ＩＴＲの例示的な二次構造は、図９Ａ～２５Ｂおよび図２６Ａ～２６Ｂに示され、また表１０Ａおよび１０Ｂにも示される。単一ステムおよび２つのループを含む修飾型ＩＴＲの例示的な二次構造は、図９Ａ～１３Ｂに示される。単一ステムおよび単一ループを有する修飾型ＩＴＲの例示的な二次構造は、図１４に示される。いくつかの実施形態では、二次構造は、折り畳み自由エネルギー変化によって定量化される構造の安定性を予測する最近傍規則に基づく熱力学的方法を使用して、本明細書に示すように推測することができる。例えば、構造は、最も低い自由エネルギー構造を見つけることによって予測することができる。いくつかの実施形態では、Ｒｅｕｔｅｒ，Ｊ．Ｓ．，＆Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｈ．（２０１０）ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ：ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ．ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．１１，１２９に開示され、ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅソフトウェア（ワールドワイドウェブアドレス「ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ」で入手可能）に実装されるアルゴリズムを使用して、ＩＴＲ構造を予測することができる。このアルゴリズムには、３７℃での自由エネルギー変化パラメータおよび実験文献から導き出されたエンタルピー変化パラメータの両方を含めることもでき、任意の温度での立体構造の安定性を予測することができる。ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅソフトウェアを使用して、修飾型ＩＴＲ構造のいくつかは、図３Ａ～３Ｄに示される生理学的条件下での推定Ｇｉｂｂｓ展開自由エネルギー（ΔＧ）を有する修飾されたＴ形ステムループ構造として予測することができる。ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅソフトウェアを使用すると、３タイプの修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲ（－９２．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）よりも高いＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーを有すると予測され、次のとおりである：（ａ）本明細書で提供される単一アーム／単一不対ループ構造は、－８５～－７０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーを有すると予測される。（ｂ）本明細書で提供される単一ヘアピン構造を有する修飾型ＩＴＲは、－７０～－４０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーを有すると予測される。（ｃ）本明細書で提供される２アーム構造を有する修飾型ＩＴＲは、－９０～－７０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲のＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーを有すると予測される。理論に縛られることを望まないが、Ｇｉｂｂｓの自由エネルギーが高い構造は、Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ７８複製タンパク質による複製のために展開するのが簡単である。したがって、Ｇｉｂｂｓの展開自由エネルギーが高い修飾型ＩＴＲ（例えば、単一アーム／単一不対ループ構造、単一ヘアピン構造、切断構造）は、野生型ＩＴＲよりも効率的に複製される傾向がある。
一実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの左ＩＴＲは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶ ＩＴＲ構造に関して修飾または変異され、右ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの右ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ構造に関して修飾され、左ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲである。そのような実施形態では、ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）の修飾は、ＡＡＶゲノムに由来する野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換によって生成することができる。
本明細書で使用されるＩＴＲは、分解可能および分解不可能であり得、ｃｅＤＮＡベクターで使用するために選択されるのは、好ましくはＡＡＶ配列であり、血清型１、２、３、４、５、６、７、８および９が好ましい。分解可能なＡＡＶ ＩＴＲは、末端反復が所望の機能（例えば、複製、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキューなど）を媒介する限り、野生型ＩＴＲ配列を必要としない（例えば、内因性または野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、切断、および／またはミスセンス変異によって変更される場合がある）。通常、必ずしもそうとは限らないが、ＩＴＲは同じＡＡＶ血清型に由来する。例えば、ｃｅＤＮＡベクターの両方のＩＴＲ配列はＡＡＶ２に由来する。ＩＴＲは、ＡＡＶ逆位末端反復として機能する合成配列、例えばＳａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，４７８，７４５号に記載される「二重Ｄ配列」であってもよい。必須ではないが、ＩＴＲは、同じパルボウイルスからのものであり得、例えば、両方のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２からのものである。
一実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＩＴＲのうちの１つに関して変異しているが、変異または修飾型ＩＴＲが依然として操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥまたはＲＢＥ’）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する、ＩＴＲ構造を含み得る。一実施形態では、変異体ｃｅＤＮＡ ＩＴＲは、機能的複製タンパク質部位（ＲＰＳ－１）を含み、ＲＰＳ－１部位に結合する複製可能なタンパク質が産生に使用される。
一実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲのうちの少なくとも１つは、Ｒｅｐ結合および／またはＲｅｐニッキングに関して欠陥のあるＩＴＲである。一実施形態では、欠陥は、野生型還元ＩＴＲに対して少なくとも３０％であり、他の実施形態では、少なくとも３５％…、５０％…、６５％…、７５％…、８５％…、９０％…、９５％…、９８％…であるか、またはその間の関数もしくは任意の点を完全に欠いている。宿主細胞はウイルスカプシドタンパク質を発現せず、ポリヌクレオチドベクターテンプレートはウイルスカプシドコード配列を欠いている。一実施形態では、ＡＡＶカプシド遺伝子を欠くポリヌクレオチドベクターテンプレートおよび宿主細胞、ならびに得られるタンパク質もまた、他のウイルスのカプシド遺伝子をコードまたは発現しない。追加として、特定の実施形態では、核酸分子はまた、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。
いくつかの実施形態では、ＩＴＲの構造エレメントは、ＩＴＲと単一の大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８）との機能的相互作用に関与する任意の構造エレメントであり得る。ある特定の実施形態では、構造エレメントは、ＩＴＲと単一の大きなＲｅｐタンパク質との相互作用に対する選択性を提供する。すなわち、少なくとも部分的に、どのＲｅｐタンパク質がＩＴＲと機能的に相互作用するかを判定する。他の実施形態では、構造エレメントは、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに結合されたとき、単一の大きなＲｅｐタンパク質と物理的に相互作用する。各構造エレメントは、例えば、ＩＴＲの二次構造、ＩＴＲのヌクレオチド配列、２つ以上のエレメント間の空間、または上記のうちのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、構造エレメントは、ＡおよびＡ’アーム、ＢおよびＢ’アーム、ＣおよびＣ’アーム、Ｄアーム、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＥ）およびＲＢＥ’（すなわち、相補的ＲＢＥ配列）、ならびに末端分解部位（ｔｒｓ）からなる群から選択される。
より具体的には、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲの構造エレメントが、特定の単一のＲｅｐタンパク質、例えば、大きなＲｅｐタンパク質または小さなＲｅｐタンパク質と機能的に相互作用する能力は、構造エレメントを改変することで変更できる。例えば、構造エレメントのヌクレオチド配列は、ＩＴＲの野生型配列と比較して修飾され得る。一実施形態では、ＩＴＲの構造エレメント（例えば、Ａアーム、Ａ’アーム、Ｂアーム、Ｂ’アーム、Ｃアーム、Ｃ’アーム、Ｄアーム、ＲＢＥ、ＲＢＥ’、およびｔｒｓ）を除去し、異なるパルボウイルスからの野生型構造エレメントと置き換えることができる。例えば、置換構造は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、または昆虫ＡＡＶからのものであり得る。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ２ ＩＴＲであり得、ＡもしくはＡ’アームまたはＲＢＥは、ＡＡＶ５からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＩＴＲは、ＡＡＶ５ ＩＴＲであり得、ＣまたはＣ’アーム、ＲＢＥ、およびｔｒｓは、ＡＡＶ２からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ５ ＩＴＲであり得、ＢおよびＢ’アームは、ＡＡＶ２ ＩＴＲ ＢおよびＢ’アームで置き換えられる。
単なる例として、表１は、修飾型ＩＴＲの領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの例示的な修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を示し、Ｘは、対応する野生型ＩＴＲに対する、そのセクションにおける少なくとも１つの核酸の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を示す。いくつかの実施形態では、Ｃおよび／またはＣ’および／またはＢおよび／またはＢ’の領域のうちのいずれかにおける少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。例えば、修飾が、単一アームＩＴＲ（例えば、単一Ｃ－Ｃ’アーム、もしくは単一Ｂ－Ｂ’アーム）、または修飾型Ｃ－Ｂ’アームもしくはＣ’－Ｂアーム、または少なくとも１つの切断されたアーム（例えば、切断されたＣ－Ｃ’アームおよび／もしくは切断されたＢ－Ｂ’アーム）を有する２つのアームＩＴＲのうちのいずれかをもたらす場合、少なくとも単一アーム、または２つのアームＩＴＲのアーム（１つのアームは切断され得る）のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。いくつかの実施形態では、切断されたＣ－Ｃ’アームおよび／または切断されたＢ－Ｂ’アームは、末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を有する。
Figure 2022520803000001
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターで使用するための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’とＣとの間、ＣとＣ’との間、Ｃ’とＢとの間、ＢとＢ’との間、およびＢ’とＡとの間から選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣもしくはＣ’またはＢもしくはＢ’領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、依然としてステムループの末端ループを保存する。いくつかの実施形態では、ＣとＣ’との間および／またはＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。代替の実施形態では、ＣとＣ’との間および／またはＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続「Ａ」ヌクレオチド（すなわち、ＡＡＡ）を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターで使用するための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’、Ａ、および／またはＤから選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ領域における少なくとも１つの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）も含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターで使用するための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡおよび／またはＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表１に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＤ領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。
一実施形態では、ＩＴＲの構造エレメントのヌクレオチド配列を修飾して（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲）、修飾型構造エレメントを産生することができる。一実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲに対する特定の修飾は、本明細書において例示されている（例えば、配列番号２、５２、６３、６４、１０１～４９９、または５４５～５４７）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲは、（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲を修飾することによって）修飾され得る。他の実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲは、配列番号４６９～４９９もしくは５４５～５４７の修飾型ＩＴＲ、または配列番号１０１～１３４もしくは５４５～５４７のＡ－Ａ’アーム、ならびにＣ－Ｃ’およびＢ－Ｂ’アームのＲＢＥ含有セクションのうちの１つと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲは、例えば、特定アームの全部、例えば、Ａ－Ａ’アームの全部もしくは一部、またはＢ－Ｂ’アームの全部もしくは一部、またはＣ－Ｃ’アームの全部もしくは一部の除去または欠失、あるいはステム（例えば、単一アーム）をキャップする最終ループが依然として存在する限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去（例えば、ＩＴＲ－６を参照）を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ－Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去、およびＢ－Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対の除去を含み得る。塩基対の除去の任意の組み合わせが想起され、例えば、Ｃ－Ｃ’アームにおける６つの塩基対、およびＢ－Ｂ’アームにおける２つの塩基対が除去され得る。例示的な実施例として、図１３Ａ～１３Ｂは、修飾型ＩＴＲが、少なくとも１つのアーム（例えば、Ｃ－Ｃ’）が切断される２つのアームを含むように、Ｃ部分およびＣ’部分の各々から欠失された少なくとも７つの塩基対、Ｃ領域とＣ’領域との間のループ中のヌクレオチドの置換、ならびにＢ領域およびＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を有する例示的な修飾型ＩＴＲを示す。この実施例では、修飾型ＩＴＲが、Ｂ領域およびＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を含むので、Ｂ－Ｂ’アームもＷＴ ＩＴＲに対して切断されることに留意されたい。
いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の相補的塩基対が、Ｃ－Ｃ’アームのＣ部分およびＣ’部分の各々から除去され、それによりＣ－Ｃ’アームが切断される。すなわち、Ｃ－Ｃ’アームのＣ部分の塩基が除去されると、Ｃ’部分の相補的塩基対が除去され、それによってＣ－Ｃ’アームが切断される。そのような実施形態では、２、４、６、８以上の塩基対が、Ｃ－Ｃ’アームから除去され、それによりＣ－Ｃ’アームが切断される。代替の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対が、Ｃ－Ｃ’アームのＣ部分から除去され、それによりアームのＣ’部分のみが残る。代替の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対が、Ｃ－Ｃ’アームのＣ’部分から除去され、それによりアームのＣ部分のみが残る。
いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の相補的塩基対が、Ｂ－Ｂ’アームのＢ部分およびＢ’部分の各々から除去され、それによりＢ－Ｂ’アームが切断される。すなわち、Ｂ－Ｂ’アームのＢ部分の塩基が除去されると、Ｂ’部分の相補的塩基対が除去され、それによってＢ－Ｂ’アームが切断される。そのような実施形態では、２、４、６、８以上の塩基対がＢ－Ｂ’アームから除去され、それによりＢ－Ｂ’アームが切断される。代替の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対が、Ｂ－Ｂ’アームのＢ部分から除去され、それによりアームのＢ’部分のみが残る。代替の実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９以上の塩基対が、Ｂ－Ｂ’アームのＢ’部分から除去され、それによりアームのＢ部分のみが残る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１～５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１～３０ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して２～２０ヌクレオチド欠失を有す。
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、２つの対向する長さ方向に非対称のステムループを形成し、例えば、Ｃ－Ｃ’ループは、Ｂ－Ｂ’ループに対して異なる長さである。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲの対向する長さ方向の非対称ステムループのうちの１つは、長さが８～１０塩基対の範囲のＣ－Ｃ’および／またはＢ－Ｂ’ステム部分、ならびに２～５不対デオキシリボヌクレオチドを有するループ部分（例えば、ＣとＣ’との間もしくはＢとＢ’との間）を有する。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲの１つの長さ方向の非対称ステムループは、長さが８未満または７、６、５、４、３、２、１塩基対未満のＣ－Ｃ’および／またはＢ－Ｂ’ステム部分、ならびに０～５ヌクレオチドを有するループ部分（例えば、ＣとＣ’との間もしくはＢとＢ’との間）を有する。いくつかの実施形態では、長さ方向の非対称なステムループを有する修飾型ＩＴＲは、長さが３塩基対未満のＣ－Ｃ’および／またはＢ－Ｂ’ステム部分を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲは、ＤＮＡ複製（例えば、Ｒｅｐタンパク質によるＲＢＥへの結合、もしくは末端分解部位でのニッキング）に干渉しないように、ＡまたはＡ’領域のＲＢＥ含有部分にいかなるヌクレオチド欠失も含まない。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターで使用するために包含される修飾型ＩＴＲは、本明細書に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、および／またはＣ領域に１つ以上の欠失を有する。修飾型ＩＴＲのいくつかの非限定例は、図９Ａ～２６Ｂに示される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲは、Ｃ－Ｃ’アームが残るように、Ｂ－Ｂ’アームの欠失を含み得る。例えば、図９Ａ～９Ｂに示される例示的なＩＴＲ－２（左）およびＩＴＲ－２（右）、ならびにＩＴＲ－４（左）およびＩＴＲ－４（右）（図１１Ａ～１１Ｂ）を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ－Ｂ’アームが残るように、Ｃ－Ｃ’アームの欠失を含み得る。例えば、図１０Ａ～１０Ｂに示される例示的なＩＴＲ－３（左）およびＩＴＲ－３（右）を参照されたい。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、単一ステムループが残るように、Ｂ－Ｂ’アームおよびＣ－Ｃ’アームの欠失を含み得る。例えば、図１４Ａ～１４Ｂに示される例示的なＩＴＲ－６（左）およびＩＴＲ－６（右）、ならびにＩＴＲ－２１およびＩＴＲ－３７を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲは、切断されたＣループおよびＢ－Ｂ’アームが残るように、Ｃ’領域の欠失を含み得る。例えば、図１５Ａ～１５Ｂに示される例示的なＩＴＲ－１（左）およびＩＴＲ－１（右）を参照されたい。同様に、いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、切断されたＣ’ループおよびＢ－Ｂ’アームが残るように、Ｃ領域の欠失を含み得る。例えば、図１６Ａ～１６Ｂに示される例示的なＩＴＲ－５（左）およびＩＴＲ－５（右）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲは、Ｃ部分、Ｃ’部分、Ｂ部分、またはＢ’部分のうちのいずれか１つ以上における塩基対の欠失を含み得、それによりＣ－Ｂ’部分およびＣ’－Ｂ部分の間で相補的塩基対合が起こり、単一アームを産生する。例えば、ＩＴＲ－１０（右）およびＩＴＲ－１０（左）（図１２Ａ～１２Ｂ）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、Ｃ、Ｃ’、Ｂおよび／またはＢ’領域における１つ以上のヌクレオチドの修飾に加えて、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターで使用するための修飾型ＩＴＲは、Ａ’とＣとの間、ＣとＣ’との間、Ｃ’とＢとの間、ＢとＢ’との間、およびＢ’とＡとの間から選択される１つ以上の領域における少なくとも１、２、３、４、５、６ヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、置換または付加）を含み得る。例えば、修飾型右ＩＴＲにおけるＢ’とＣとの間のヌクレオチドは、ＡからＧ、Ｃ、またはＡに置換するか、欠失するか、１つ以上のヌクレオチドを付加することができる。修飾型左ＩＴＲにおけるＣ’とＢとの間のヌクレオチドは、ＴからＧ、Ｃ、またはＡに変更するか、欠失するか、１つ以上のヌクレオチドを付加することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５５０～５５７のいずれかから選択されるヌクレオチド配列からなる修飾型ＩＴＲを有しない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５５０～５５７のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含む修飾型ＩＴＲを有しない。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるような調節スイッチ、および配列番号５５０～５５７からなる群のいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択された修飾型ＩＴＲを含む。
別の実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲの構造エレメントの構造を改変することができる。例えば、構造エレメントは、ステムの高さおよび／またはループ内のヌクレオチドの数の変化。例えば、ステムの高さは、約２、３、４、５、６、７、８、もしくは９ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。一実施形態では、ステムの高さは約５ヌクレオチド～約９ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用し得る。別の実施形態では、ステムの高さは、約７ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用し得る。別の実施例では、ループは３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲を有し得る。
別の実施形態では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥ内のＧＡＧＹ結合部位またはＧＡＧＹ関連結合部位の数は、増加または減少され得る。一実施例では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥは、１、２、３、４、５、もしくは６以上のＧＡＧＹ結合部位、またはその中の任意の範囲を含み得る。各ＧＡＧＹ結合部位は、独立して、配列がＲｅｐタンパク質に結合するのに十分である限り、正確なＧＡＧＹ配列またはＧＡＧＹと同様の配列であり得る。
別の実施形態では、２つのエレメント（限定されないが、ＲＢＥおよびヘアピンなど）の間の空間を変更して（例えば、増加または減少）、単一の大きなＲｅｐタンパク質との機能的相互作用を変更することができる。例えば、空間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。
本明細書に開示され本明細書に記載される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ構造に関して修飾されるＩＴＲ構造を含み得るが、依然として操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、およびＲＢＥ’部分を保持する。図２Ａおよび図２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ－結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’（配列番号５３１））および末端分解部位（ＴＲＳ、５’－ＡＧＴＴ（配列番号４６））を含む１つ以上の機能的ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲ（野生型または修飾型ＩＴＲ）は、機能的である。ｃｅＤＮＡベクターが、互いに異なるか、または非対称である２つの修飾型ＩＴＲを含む代替の実施形態では、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、機能的であり、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、非機能的である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に提供されるように、配列番号５００～５２９からなる、または本質的にそれからなる任意の配列から選択される修飾型ＩＴＲを有しない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００～５２９から選択される任意の配列から選択されるＩＴＲを有しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内に修飾を有する。ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、表２に列挙されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアーム、および切断アーム内に修飾を有する。ループアームおよび切断アーム内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、表３に列挙されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアーム、およびスペーサー内に修飾を有する。ループアームおよびスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、表４に列挙されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、切断アームおよびスペーサー内に修飾を有する。切断アームおよびスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、表５に列挙されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断アームおよびスペーサー内に修飾を有する。ループアーム、切断アーム、およびスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、表６に列挙されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、それが最低展開エネルギー（「低エネルギー構造」）を含むように修飾される。低エネルギーは、野生型ＩＴＲと比較して、低減したＧｉｂｂｓ自由エネルギーを有するであろう。低い（すなわち、低減した）展開エネルギーに修飾されるＩＴＲの例示的な配列は、本明細書において表７～９に提示される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲは、表２～９、１０Ａもしくは１０Ｂに示されるもののうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択される。
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本明細書に開示されるように、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来する野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含むように生成され得る。修飾型ＩＴＲは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ中のプラスミドにおける増殖中の遺伝子修飾によって、またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中のバキュロウイルスゲノムとして、または例えば、インビトロでポリメラーゼ連鎖反応もしくは化学合成を使用する他の生物学的方法によって生成され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２（左）の野生型ＩＴＲ（配列番号５１）またはＡＡＶ２（右）の野生型ＩＴＲ（配列番号１）からの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得る。具体的には、１つ以上のヌクレオチドが、Ｔ形ステムループ構造のＢ－Ｃ’またはＣ－Ｃ’から削除、挿入、または置換されている。さらに、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲのＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）および末端分解部位（ｔｒｓ）に修飾を含まないが、ＲＢＥ’（ＴＴＴ）は、テンプレートが一巡の複製を受け、それによってＡＡＡ三重項を相補的ＲＢＥ’－ＴＴＴに変換したかどうかに依存して存在してもしなくてもよい。
３つの修飾型ＩＴＲの種類が例示される。（１）単一アームおよび単一不対ループを含む最低エネルギー構造（「単一アーム／単一不対ループ構造」）を有する修飾型ＩＴＲ、（２）単一ヘアピンを有する最低エネルギー構造（「単一ヘアピン構造」）を有する修飾型ＩＴＲ、ならびに（３）２つのアーム（１つが切断されている）を有する最低エネルギー構造（「切断構造」）を有する修飾型ＩＴＲ。
単一アーム／単一不対ループ構造を有する修飾型ＩＴＲ
野生型ＩＴＲは、単一アームおよび単一不対ループを含む二次構造（すなわち、「単一アーム／単一不対ループ構造」）を形成するように修飾され得る。構造のＧｉｂｂｓの展開自由エネルギー（ΔＧ）は、－８５ｋｃａｌ／ｍｏｌ～－７０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり得る。修飾型ＩＴＲの例示的な構造が提供される。
単一アーム／単一不対ループ構造を形成すると予測される修飾型ＩＴＲは、ＢおよびＢ’アームならびに／またはＣおよびＣ’アームを形成する配列中に、野生型ＩＴＲから１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得る。修飾型ＩＴＲは、遺伝子修飾または生合成および／もしくは化学合成によって生成され得る。
例えば、図９Ａ～９Ｂに提供されるＩＴＲ－２左および右（配列番号１０１および１０２）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲ中のＣ－Ｃ’アームから２つのヌクレオチドの欠失、およびＢ－Ｂ’アームから１６ヌクレオチドの欠失を有するように生成される。修飾型ＩＴＲのＢ－Ｂ’アームに残る３つのヌクレオチドは、相補的対合を作製しない。したがって、ＩＴＲ－２左および右は、単一Ｃ－Ｃ’アームおよび単一不対ループを有する最低エネルギー構造を有する。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約－７２．６ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
図１０Ａおよび１０Ｂに提供されるＩＴＲ－３左および右（配列番号１０３および１０４）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＣ－Ｃ’アームに１９ヌクレオチド欠失を含むように生成される。修飾型ＩＴＲのＢ－Ｂ’アームに残る３つのヌクレオチドは、相補的対合を作製しない。したがって、ＩＴＲ－３左および右は、単一Ｂ－Ｂ’アームおよび単一不対ループを有する最低エネルギー構造を有する。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約－７４．８ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
図１１Ａおよび１１Ｂに提供されるＩＴＲ－４左および右（配列番号１０５および１０６）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ－Ｂ’アームに１９ヌクレオチド欠失を含むように生成される。修飾型ＩＴＲのＢ－Ｂ’アームに残る３つのヌクレオチドは、相補的対合を作製しない。したがって、ＩＴＲ－４左および右は、単一Ｃ－Ｃ’アームおよび単一不対ループを有する最低エネルギー構造を有する。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約－７６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
図１２Ａおよび１２Ｂに提供されるＩＴＲ－１０左および右（配列番号１０７および１０８）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ－Ｂ’アームに８ヌクレオチド欠失を含むように生成される。Ｂ－Ｂ’およびＣ－Ｃ’アームに残るヌクレオチドは、ＢモチーフとＣ’モチーフとの間（ＩＴＲ－１０左）またはＣモチーフとＢ’モチーフとの間（ＩＴＲ－１０右）に新たな相補的結合を作製する。したがって、ＩＴＲ－１０左および右は、単一Ｂ－Ｃ’アームまたはＣ－Ｂ’アームおよび単一不対ループを有する最低エネルギー構造を有する。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約－８３．７ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
図１３Ａおよび１３Ｂに提供されるＩＴＲ－１７左および右（配列番号１０９および１１０）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＣ－Ｃ’アームに１４ヌクレオチド欠失を含むように生成される。Ｃ－Ｃ’アームに残る８ヌクレオチドは、相補的結合を作製しない。結果として、ＩＴＲ－１７左および右は、単一Ｂ－Ｂ’アームおよび単一不対ループを有する最低エネルギー構造を有する。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約－７３．３ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
野生型ＩＴＲ左または右（上）、および単一アーム／単一不対ループ構造を形成すると予測される様々な修飾型ＩＴＲ左または右（下）の配列は整列され、下記の表７に提供される。
Figure 2022520803000020
Figure 2022520803000021
Figure 2022520803000022
単一ヘアピン構造を有する修飾型ＩＴＲ
野生型ＩＴＲは、単一ヘアピン構造を含む最低エネルギー構造を有するように修飾され得る。構造のＧｉｂｂｓの展開自由エネルギー（ΔＧ）は、－７０ｋｃａｌ／ｍｏｌ～－４０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であり得る。修飾型ＩＴＲの例示的な構造は、図１４Ａおよび１４Ｂに提供される。
単一ヘアピン構造を形成すると予測される修飾型ＩＴＲは、ＢおよびＢ’アームならびに／またはＣおよびＣ’アームを形成する配列中に、野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得る。修飾型ＩＴＲは、遺伝子修飾または生合成および／もしくは化学合成によって生成され得る。
例えば、図１４Ａおよび１４Ｂに提供されるＩＴＲ－６左および右（配列番号１１１および１１２）は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ－Ｂ’およびＣ－Ｃ’アームに４０ヌクレオチド欠失を含む。修飾型ＩＴＲに残っているヌクレオチドは、単一のヘアピン構造を形成すると予測される。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約－５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。
野生型ＩＴＲおよびＩＴＲ－６（左および右の両方）の配列は整列され、下記の表８に提供される。
Figure 2022520803000023
切断構造を有する修飾型ＩＴＲ
野生型ＩＴＲは、１つが切断される２つのアームを含む最低エネルギー構造を有するように修飾され得る。それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギー（ΔＧ）は、－９０～－７０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲である。したがって、それらのＧｉｂｂｓの展開自由エネルギーは、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲよりも低い。
修飾型ＩＴＲは、ＢおよびＢ’アームならびに／またはＣおよびＣ’アームを形成する配列中に、野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、例えば、特定ループ、例えば、Ａ－Ａ’ループ、Ｂ－Ｂ’ループ、もしくはＣ－Ｃ’ループのすべての除去、または代替として、ステムの最後の最終ループが依然として存在する限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。修飾型ＩＴＲは、遺伝子修飾または生合成および／もしくは化学合成によって生成され得る。
切断構造を有する修飾型ＩＴＲの例示的な構造は、図１５Ａ～１５Ｂに提供される。
切断構造を形成すると予測される様々な修飾型ＩＴＲの配列は、野生型ＩＴＲの配列と整列され、下記の表９に提供される。
Figure 2022520803000024
Figure 2022520803000025
Figure 2022520803000026
Figure 2022520803000027
Figure 2022520803000028
本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターで使用するための上記クラスの各々の追加の例示的な修飾型ＩＴＲは、表１０Ａおよび１０Ｂに提供される。表１０Ａの右修飾型ＩＴＲの予測される二次構造は、図２６Ａに示され、表１０Ｂの左修飾型ＩＴＲの予測される二次構造は、図２６Ｂに示される。
表１０Ａおよび表１０Ｂは、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターにおける例示的な右および左の修飾型ＩＴＲを示す。
Figure 2022520803000029
Figure 2022520803000030
Figure 2022520803000031
Figure 2022520803000032
本発明の実施形態では、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５５０、５５１、５５２、５５３、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７の群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する修飾型ＩＴＲを有しない。
本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターが修飾型ＩＴＲを有する範囲で、本出願の特許請求の範囲のうちのいずれか１つ以上において、または本出願において、もしくはそれから派生する任意の特許において今後提出され得る補正された特許請求の範囲において定義される任意の発明内で定義される、配列番号５５０～５５７に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、またはＣ’領域に修飾のうちの１つを有し、またその特許請求の範囲（複数可）に対する任意の関連国（複数可）の法律が適用する範囲で、我々は、ここで当該開示を本出願の特許請求の範囲またはそれから派生する任意の特許から、本出願またはそれから派生する任意の特許の無効化を防ぐために必要な範囲で放棄する権利を留保する。
例えば、無制限に、本出願の任意の特許請求の範囲（現在の、もしくは今後補正される）、またはそれから派生する任意の特許から、以下の主題のうちのいずれか１つを放棄する権利を留保する。
Ａ．調節スイッチのない、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターで使用される配列番号２、５２、６３ ６４、１１３、１１４、５５０、５５１；５５２、５５３、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７からなる群のいずれかから選択される修飾型ＩＴＲ
Ｂ．調節配列のない、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターの上記Ａ．において指定された修飾型ＩＴＲ。異種核酸は、ＡＢＣＡ４、ＵＳＡ２Ａ ｖａｒ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＥＰ２９０、ＢＤＤ第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、第ＶＩＩＩ因子、ｖＷＦ＿Ｈｉｓ、ｖＷＦ、レシチンコレステロールアセチルトランスフェラーゼ、ＰＡＨ、Ｇ６ＰＣ、またはＣＦＴＲをコードする。
ＶＩ．調節エレメント。
ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に記載のｃｅＤＮＡベクターまたはＡＡＶベクターを産生する方法において有用な組成物は、単一の修飾型Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸配列を含み、調節エレメント、例えば、単一の修飾型Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸の上流にあるか、または作動可能に連結されている、本明細書に記載のシス調節エレメントをさらに含むことができる。例えば、修飾型Ｒｅｐタンパク質をコードする、例えば、修飾型Ｒｅｐ７８タンパク質をコードするが、Ｒｅｐ５２タンパク質をコードするための機能的開始コドン、またはＲｅｐ６８もしくはＲｅｐ４０を産生するためのエクソンスキッピング用のスプライシング部位を含まないヌクレオチド配列は、調節エレメント、例えば、シス調節エレメントに作動可能に連結されている。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法において有用な単一のＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流に位置する、本明細書に記載のプロモーター、シス調節エレメント、または調節スイッチなどの発現制御配列を含み、核酸配列には、Ｒｅｐ５２の機能的開始コドン、および／またはＲｅｐ６８もしくはＲｅｐ４０を産生するためのエクソンスキッピング用のスプライシング部位を有しない。一実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法において有用な単一のＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、パルボウイルスＲｅｐ７８タンパク質をコードするヌクレオチド配列の開始コドンの上流の発現制御配列を含み、核酸配列は、Ｒｅｐ６８をコードするための機能的スプライシング部位を有しない。
同様に、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含む発現構築物から産生され得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、またはｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。
同様に、本明細書に開示される単一のＲｅｐタンパク質を使用する方法および組成物にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号８）およびＢＧＨポリＡ（配列番号９）などのシス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含む発現構築物から産生され得る。発現構築物における使用のための好適な発現カセットは、ウイルスカプシドによって課されるパッケージング制約によって制限されない。本発明の発現カセットは、全体発現レベルと共に細胞特異性に影響を及ぼし得るプロモーターを含む。導入遺伝子発現の場合、それらは、非常に活発なウイルス由来の最初期プロモーターを含み得る。発現カセットは、導入遺伝子発現を特定の細胞型に制限し、無秩序な異所性発現から生じる毒性効果および免疫反応を低減するために組織特異的真核細胞プロモーターを含有し得る。
好ましい実施形態では、修飾型単一Ｒｅｐタンパク質を発現する際に、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセットにおいて使用するためのプロモーターまたは調節エレメントは、ＣＡＧプロモーター（配列番号：３）などの合成調節エレメントを含有し得る。ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）プロモーター、ニワトリβ－アクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびに（ｉｉｉ）ウサギβ－グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替として、修飾型単一Ｒｅｐタンパク質を発現する際に、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセットにおいて使用するためのプロモーターまたは調節エレメントは、アルファ－１－抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター（配列番号４もしくは配列番号７４）、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモーター（配列番号５もしくは配列番号１６）、またはヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター（例えば、配列番号６もしくは配列番号１５）を含有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型単一Ｒｅｐタンパク質を発現する際に、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセットにおいて使用するためのプロモーターまたは調節エレメントは、１つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意選択的にＲＳＶエンハンサーを有する）、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（任意選択的にＣＭＶエンハンサーを有する、例えば、配列番号２２）から選択される。あるいは、誘導性プロモーター、導入遺伝子の天然プロモーター、組織特異的プロモーター、または当技術分野で知られている様々なプロモーターは、修飾型単一Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結され得る、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセットに存在し得る。
上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。修飾型単一Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結され得る、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセットに存在し得る例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、配列番号１８）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７－５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（例えば、配列番号１９）、ＣＡＧプロモーター、ヒトα１－抗トリプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号２１）などが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更されて、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。
プロモーターは、１つ以上の特定の転写調節配列を含むことにより、発現をさらに増強する、および／またはその空間的発現および／または時間的発現を変更することができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が起こる細胞、組織または器官に関して、または発現が起こる発達段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、または誘導剤などの外部刺激に応答して、構成的または示差的に遺伝子成分の発現を調節し得る。修飾型単一Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結され得る、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターの発現カセットに存在し得るプロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーターおよびＣＭＶ ＩＥプロモーター、ならびに以下に列挙されるプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。そのようなプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用して、関心対象の任意の遺伝子、例えば、遺伝子編集用分子、ドナー配列、治療用タンパク質など）を発現させることができる。例えば、ベクターは、治療用タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結されるプロモーターを含み得る。治療用タンパク質コード配列に操作可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターであってもよい。プロモーターはまた、天然または合成の、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓特異的プロモーター、例えば、ヒトα１－抗トリプシン（ＨＡＡＴ）であり得る。一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介して、肝細胞へのｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的を使用して達成され得る。
一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子の未変性プロモーターである。治療タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーターおよび他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、エンハンサー（例えば、配列番号２２および配列番号２３）をさらに含み得る。
修飾型単一Ｒｅｐタンパク質の発現で、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターで使用するための好適なプロモーターの非限定例としては、例えば、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）、ｈＡＡＴプロモーター（配列番号２１）、ヒトＥＦ１－αプロモーター（配列番号６）、またはＥＦ１ａプロモーター（配列番号１５）の断片、ＩＥ２プロモーター（例えば、配列番号２０）、およびラットＥＦ１－αプロモーター（配列番号２４）が挙げられる。
ポリアデニル化配列：いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列をコードする配列は、修飾型単一Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結され得る、または発現するｍＲＮＡを安定化するためにおよび／または核外輸送および翻訳を補助するために本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターに存在し得る。一実施形態では、修飾型単一Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸を含む構築物、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。代替の実施形態では、修飾型単一Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸を含む構築物、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０～５０ヌクレオチド、約４０～５５ヌクレオチド、約４５～５０ヌクレオチド、約３５～５０ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲を含む。
修飾型単一Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸を含む構築物、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列またはその変形、例えば、ウシＢＧＨｐＡ（例えば、配列番号７４）もしくはウイルスＳＶ４０ｐＡ（例えば、配列番号１０）から単離された天然に存在する配列、または合成配列（例えば、配列番号２７）を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡまたは異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号８）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ－０２およびＶＫ－Ａ２６配列、例えば、配列番号２５および配列番号２６に連結され得る。
ＶＩ．調節スイッチ
分子調節スイッチは、シグナルに反応して、状態の測定可能な変化を生成するものである。そのような調節スイッチは、修飾型単一Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸、またはｃｅＤＮＡベクターの出力を制御するために本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターを含む構築物と有用に組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、修飾型単一Ｒｅｐタンパク質をコードする核酸、または本明細書に開示される方法によって産生されるｃｅＤＮＡベクターを含む構築物は、ｃｅＤＮＡベクターにおける単一のＲｅｐタンパク質または導入遺伝子の発現を微調整するのに役立つ調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターにおける関心対象の遺伝子の、制御可能かつ調節可能な発現を開始または停止（すなわち、シャットダウン）するように設計された「オン／オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。
Ａ．バイナリ調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。そのような実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲの間に位置する発現カセットは、追加として、関心対象の遺伝子に操作可能に連結された調節領域、例えば、プロモーター、シスエレメント、リプレッサー、エンハンサーなどを含み得、この調節領域は、１つ以上の共因子または外因性薬剤によって調節される。したがって、一実施形態では、１つ以上の共因子または外因性薬剤が細胞内に存在する場合にのみ、ｃｅＤＮＡベクターからの関心対象の遺伝子の転写および発現が起こる。別の実施形態では、１つ以上の共因子または外因性薬剤を使用して、関心対象の遺伝子の転写および発現を抑制解除し得る。
当業者によって知られている任意の核酸調節領域は、調節スイッチを含むように設計されたｃｅＤＮＡベクターに用いられ得る。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターによって調節され得る。誘導性プロモーターの非限定例は、ホルモン誘導性または金属誘導性プロモーターである。他の例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。（Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２０３－１２０８（２０００））に開示されるものを含む、古典的なテトラサイクリン系または他の抗生物質系スイッチが使用のために包含される。
Ｂ．小分子調節スイッチ
様々な当該技術分野において既知の小分子系調節スイッチは、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターと組み合わせて、調節スイッチによって制御されるｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、直交リガンド／核受容体対、例えば、レチノイド受容体バリアント／ＬＧ３３５およびＧＲＱＣＩＭＦＩ（Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ ａｌ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０（２０１０）：１５に開示されているものなどの、操作可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモーターと共に）；操作されたステロイド受容体、例えば、プロゲステロンに結合することはできないが、ＲＵ４８６（ミフェプリストン）には結合するＣ末端切断を有する修飾型プロゲステロン受容体（米国特許第５，３６４，７９１号）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａからのエクジソン受容体およびそれらのエクジステロイドリガンド（Ｓａｅｚ，ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７（２６）（２０００），１４５１２－１４５１７）、またはＳａｎｄｏ Ｒ ３ｒｄ；Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３，１０（１１）：１０８５－８に開示されるような抗生物質トリメトプリム（ＴＭＰ）によって制御されるスイッチのうちのいずれか１つまたは組み合わせから選択され得る。
当業者によって知られている他の小分子系調節スイッチもまた、ｃｅＤＮＡの導入遺伝子発現を制御するために使用することが想定されており、Ｂｕｓｋｉｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ；Ｃｈｅｍ ａｎｄ Ｂｉｏｌ．，２００５；１２（２）；１５１－１６１に開示されるもの；アブシジン酸感受性ＯＮスイッチ；Ｌｉａｎｇ，Ｆ．－Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，４（１６４）に開示されるものなど；外因性Ｌ－アルギニン感受性ＯＮスイッチ、Ｈａｒｔｅｎｂａｃｈ，ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５（２０），２００７に開示されるものなど；合成胆汁酸感受性ＯＮスイッチ、Ｒｏｓｓｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ．２０１４，２１：８１－９０に開示されるものなど；ビオチン感受性ＯＮスイッチ、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．２００９ Ｍａｒ；１１（２）：１１７－１２４に開示されるものなどが含まれるが、これらに限定されない。二重入力食品添加物安息香酸塩／バニリン感受性調節スイッチ、例えば、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４；４２（１４）；ｅ１１６に開示されるものなど；４－ヒドロキシタモキシフェン感受性スイッチ、例えば、Ｇｉｕｓｅｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，６（５），６５３－６６３に開示されるものなど；および、フラボノイド（フロレチン）感受性調節スイッチ、例えば、Ｇｉｔｚｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ．２００９ Ｊｕｎ ３０；１０６（２６）：１０６３８－１０６４３に開示されるものなどを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第８，７７１，６７９号および同第６，３３９，０７０号に開示されるものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。
ｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的な調節スイッチには、表１１のものが含まれるが、これらに限定されない。
Ｃ．「パスコード」調節スイッチ
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能にする。すなわち、導入遺伝子の発現および／または抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件ＡおよびＢが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７つ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの条件（例えば、Ａ、Ｂ条件）が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも３つの条件が起こる必要がある（例えば、Ａ、Ｂ、およびＣまたはＡ、Ｂ、およびＤ）。単なる例として、パスコード「ＡＢＣ」調節スイッチを有するｃｅＤＮＡからの遺伝子発現が起こるためには、条件Ａ、Ｂ、およびＣが存在しなければならない。条件Ａ、Ｂ、およびＣは、以下の通りであり得る。条件Ａは、病態または疾患の存在であり、条件Ｂは、ホルモン反応であり、条件Ｃは、導入遺伝子の発現に対する反応である。単なる例示的な例として、導入遺伝子がインスリンである場合、対象が糖尿病である場合に条件Ａが起こり、血中の糖レベルが高い場合に条件Ｂが起こり、条件Ｃは必要な量で発現されない内因性インスリンのレベルである。糖レベルが低下するか、インスリンの望ましいレベルが達成されると、導入遺伝子（例えば、インスリン）は、３つの条件が起こるまで再びオフになり、オンに戻る。別の例示的な例では、導入遺伝子がＥＰＯである場合、条件Ａは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）の存在であり、条件Ｂは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合に起こり、条件Ｃは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞（ＥＰＣ）動員が不全であるか、または代替としてＨＩＦ－２活性化が不全であることである。酸素レベルが増大するか、ＥＰＯの望ましいレベルが達成されると、導入遺伝子（例えば、ＥＰＯ）は、３つの条件が起こるまで再びオフになり、オンに戻る。
パスコード調節スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を微調整するのに有用である。例えば、パスコード調節スイッチは、複数のスイッチ、例えば、ある特定のレベルの代謝産物の存在下でのみオンになる組織特異的で誘導性のプロモーターを含むという点でモジュール式であり得る。そのような実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子発現が起こるためには、誘導剤が、所望の細胞型（条件Ｂ）に存在しなければならず（条件Ａ）、代謝産物は、ある特定の閾値よりも高い、または低い（条件Ｃ）。代替の実施形態では、パスコード調節スイッチは、条件ＡおよびＢが存在する場合に導入遺伝子発現がオンであるが、条件Ｃが存在する場合にオフになるように設計することができる。そのような実施形態は、発現された導入遺伝子の直接の結果として条件Ｃが起こる場合に有用である。すなわち、条件Ｃは、導入遺伝子が十分な量の所望の治療硬化を有するときに、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子発現をオフにするためのループへの正のフィードバックとして機能する。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターで使用するために包含されるパスコード調節スイッチは、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」または「パスコードキルスイッチ」と呼ばれるスイッチを記載するＷＯ２０１７／０５９２４５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示され、このスイッチは、ハイブリッド転写因子（ＴＦ）を使用して、細胞の生存のための複雑な環境要件を構築する合成生物学的回路である。ＷＯ２０１７／０５９２４５に記載されるパスコード調節スイッチは、回路の活性化を制御する環境条件と細胞運命を制御する出力モジュールの両方の観点からモジュール式でカスタマイズ可能であるため、ｃｅＤＮＡベクターでの使用に特に有用である。さらに、パスコード回路は、適切な「パスコード」分子がないと、必要な所定の条件が存在する場合にのみ導入遺伝子の発現が可能になるため、ｃｅＤＮＡベクターで使用するのに特に有用である。細胞に問題が発生した場合、または何らかの理由でさらなる導入遺伝子の発現が不要になった場合は、関連するキルスイッチ（つまり、デッドマンスイッチ）をトリガーすることができる。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために包含されるパスコード調節スイッチまたは「パスコード回路」は、生物学的封じ込め条件を定義するために使用される環境シグナルの範囲および複雑性を拡張するために、ハイブリッド転写因子（ＴＦ）を含む。既定条件の存在下で細胞死をトリガーするデッドマンスイッチとは異なり、「パスコード回路」は、特定の「パスコード」が存在する場合に細胞生存または導入遺伝子の発現を可能にし、所定の環境条件またはパスコードが存在する場合にのみ導入遺伝子の発現および／または細胞生存を可能にするように容易に再プログラムされ得る。
一態様では、細胞増殖を少なくとも２つの選択された薬剤の所定のセットの存在に制限する「パスコード」システムは、ｉ）宿主細胞に対して毒性である毒素をコードする毒素発現モジュールであって、毒素をコードする配列が、第１のハイブリッドリプレッサータンパク質ｈＲＰ１の結合によって抑制されるプロモーターＰ１に操作可能に連結されている、モジュール、ｉｉ）第１のハイブリッドリプレッサータンパク質ｈＲＰ１をコードする第１のハイブリッドリプレッサータンパク質発現モジュールであって、ｈＲＰ１の発現が、２つのハイブリッド転写因子ｈＴＦ１およびｈＴＦ２によって形成されるＡＮＤゲートによって制御され、その結合または活性が薬剤Ａ１およびＡ２に対して反応性であり、その結果、薬剤Ａ１およびＡ２の両方がｈＲＰ１の発現に必要となり、Ａ１またはＡ２のいずれかが存在しないと、ｈＲＰ１の発現が毒素プロモーターモジュールＰ１および毒素産生を抑制するには不十分となり、その結果、宿主細胞が死滅する、モジュール、を含む発現モジュールをコードする１つ以上の核酸構築物を含む。このシステムでは、ハイブリッド因子ｈＴＦ１、ｈＴＦ２、およびｈＲＰ１は各々、１つの転写因子からの環境感知モジュールと、異なる転写因子からのＤＮＡ認識モジュールとを含み、これは、それぞれのパスコード調節スイッチの結合を環境物質Ａ１またはＡ２の存在に対して感受性にし、それぞれのサブユニットが通常自然に結合するものとは異なる。
したがって、ｃｅＤＮＡベクターは、出力モジュールを活性化するために特定の分子の存在および／または不在を必要とする「パスコード調節回路」を含み得る。細胞毒素をコードする遺伝子が出力モジュールに配置されるいくつかの実施形態では、このパスコード調節回路は、導入遺伝子発現を調節するために使用することができるだけでなく、セルが望ましくない動作をする場合（例えば、センサードメインによって定義された特定の環境を離れたり、別の細胞型に分化したりする場合）には、回路が細胞を殺傷するキルスイッチ機序を作成するためにも使用することができる。１つの非限定例では、ハイブリッド転写因子のモジュール性、回路アーキテクチャ、および出力モジュールは、当該技術分野において理解されるように、他の環境シグナルを感知し、他の方法で環境シグナルに反応し、誘導される細胞死に加えて細胞中の他の機能を制御するように、回路が再構成されるのを可能にする。
本明細書に開示される調節スイッチ、例えば、小分子スイッチ、核酸系スイッチ、小分子－核酸ハイブリッドスイッチ、転写後導入遺伝子調節スイッチ、翻訳後調節放射線制御スイッチ、低酸素媒介性スイッチ、および本明細書に開示される当業者に既知の他の調節スイッチのうちのいずれかおよびすべての組み合わせを、本明細書に開示されるパスコード調節スイッチにおいて使用することができる。使用のために包含される調節スイッチはまた、レビュー論文Ｋｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．１２：２０１４１０００（２０１５）において考察され、Ｋｉｓの表１に要約されている。いくつかの実施形態では、パスコード系における使用のための調節スイッチは、表１１のスイッチのうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択され得る。
Ｄ．導入遺伝子発現を制御するための核酸系調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡによって発現された導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序に基づく。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、ＵＳ２００９／０３０５２５３、ＵＳ２００８／０２６９２５８、ＵＳ２０１７／０２０４４７７、ＷＯ２０１８／０２６７６２Ａ１、米国特許第９，２２２，０９３号、および欧州特許出願第ＥＰ２８８０７１号に開示されるもの（これらの全てが参照により全体が本明細書に組み込まれる）、またＶｉｌｌａ ＪＫ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ．２０１８ Ｍａｙ；６（３）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によるレビューに開示されるものなどが挙げられる。ＷＯ２０１８／０７５４８６およびＷＯ２０１７／１４７５８５（全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるものなどの、代謝物反応性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ）による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子に対して相補的であるＲＮＡｉ分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子は、ｃｅＤＮＡベクターによって発現されたとしてもそのようなＲＮＡｉが発現される場合、相補的ＲＮＡｉ分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がｃｅＤＮＡベクターによって発現されたときにＲＮＡｉが発現されない場合、導入遺伝子は、ＲＮＡｉによってサイレンシングされない。遺伝子発現を制御する、または調節スイッチとしてのＲＮＡｉ分子のそのような例は、ＵＳ２０１７／０１８３６６４に開示される。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を遮断するリプレッサーを含む。いくつかの実施形態では、オン／オフスイッチは、例えば、Ｃｈａｐｐｅｌｌ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１５ Ｍａｒ；１１（３）：２１４－２０；ａｎｄ Ｃｈａｐｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｓｐｅｃｔｒ．２０１８ Ｍａｙ；６（３．に開示されるものなどの、低分子転写活性化ＲＮＡ（ＳＴＡＲ）系スイッチである。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、ＵＳ２００９／０１９１５４６、ＵＳ２０１６／００７６０８３、ＷＯ２０１７／０８７５３０、ＵＳ２０１７／０２０４４７７、ＷＯ２０１７／０７５４８６、およびＧｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０１４；１５９（４）；９２５－９３９に開示されるようなトゥホールドスイッチであり、これらの全ては参照により全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２００２／００２２０１８に開示される組織特異的自己不活化調節スイッチであり、これにより調節スイッチは、そうでなければ導入遺伝子発現が不利益となり得る部位において、導入遺伝子発現を意図的にスイッチオフする。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２０１４／０１２７１６２および米国特許第８，３２４，４３６号に開示されるリコンビナーゼ可逆的遺伝子発現系である。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序および小分子調節システムのハイブリッドである。そのようなシステムは当業者に周知であり、本明細書での使用が想定される。そのような調節スイッチの例としては、例えば、ＵＳ２０１０／０１７５１４１およびＤＥＡＮＳ Ｔ．ＥＴ ＡＬ．，ＣＥＬＬ．，２００７，１３０（２）；３６３－３７２、ＷＯ２００８／０５１８５４および米国特許第９，３８８，４２５号に開示されるような、ＬＴＲｉシステムまたは「Ｌａｃ－Ｔｅｔ－ＲＮＡｉ」システムが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第８，３３８，１３８号に開示されるような循環置換を伴う。そのような実施形態では、分子スイッチは多安定である、すなわち少なくとも２つの状態の間で切り替えることができるか、あるいは双安定である、すなわち状態は「オン」または「オフ」のいずれかであり、例えば発光することができるかできないか、結合することができるかできないか、触媒作用を及ぼすことができるかできないか、電子を伝達することができるかできないかなどである。別の態様では、分子スイッチは融合分子を使用するため、スイッチは３つ以上の状態を切り替えることができる。例えば、挿入配列またはアクセプター配列によって示される特定の閾値状態に応答して、融合のそれぞれの他の配列は、ある範囲の状態（例えば、ある範囲の結合活性、ある範囲の酵素触媒作用など）を示し得る。したがって、「オン」または「オフ」から切り替えるのではなく、融合分子は刺激に対して段階的な応答を示すことができる。
いくつかの実施形態では、核酸系調節スイッチは、表１１のスイッチのいずれかまたはそれらの組み合わせから選択することができる。
Ｅ．転写後および翻訳後調節スイッチ
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、転写後修飾系である。例えば、そのような調節スイッチは、ＵＳ２０１８／０１１９１５６、ＧＢ２０１１／０７７６８、ＷＯ２００１／０６４９５６Ａ３、欧州特許第２７０７４８７号、およびＢｅｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，４（５），ｐｐ ５２６－５３４、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１６ Ｎｏｖ ２；５．ｐｉｉ：ｅ１８８５８に開示されるように、テトラサイクリンまたはテオフィリンに感受性であるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、およびリガンド感受性（オフスイッチ）アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性ｓｉＲＮＡの両方をコードすることができると想定される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、翻訳後修飾系である。代替の実施形態では、関心対象の遺伝子またはタンパク質は、プロタンパク質またはプレプロタンパク質として発現されるか、または発現されたタンパク質に付着したシグナル応答エレメント（ＳＲＥ）または不安定化ドメイン（ＤＤ）を有し、それにより、翻訳後修飾が発生するまで、正しいタンパク質の折り畳みおよび／または活性が妨げられる。不安定化ドメイン（ＤＤ）またはＳＲＥの場合、不安定化ドメインは、外因性薬剤または小分子の存在下で翻訳後に切断される。当業者は、米国特許第８，１７３，７９２号およびＰＣＴ出願第ＷＯ２０１７／１８０５８７号に開示されるような制御方法を利用することができる。機能的導入遺伝子活性を制御するためにｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される他の転写後制御スイッチは、Ｒａｋｈｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１４；２１（９）：１２３８－５２ およびＮａｖａｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１６；１９；１１（８）：２１０１－２１０４Ａに開示されている。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、導入遺伝子コード配列にリガンド感受性インテインを組み込み、それにより導入遺伝子または発現されたタンパク質をスプライシングの前に阻害する翻訳後修飾系である。例えば、これは、４－ヒドロキシタモキシフェンおよび甲状腺ホルモンの両方を使用して実証されている（例えば、米国特許第７，５４１，４５０号、同第９，２００，０４５号、同第７，１９２，７３９号、Ｂｕｓｋｉｒｋ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２００４ Ｊｕｌ ２０；１０１（２９）：１０５０５－１０５１０、ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｌ．２０１６ Ｄｅｃ １６；５（１２）：１４７５－１４８４、および２００５ Ｆｅｂ；１４（２）：５２３－５３２を参照）。いくつかの実施形態では、核酸系調節スイッチは、表１１のスイッチのいずれかまたはそれらの組み合わせから選択することができる。
Ｆ．他の例示的な調節スイッチ
任意の既知の調節スイッチをｃｅＤＮＡベクター中で使用して、環境変化によってトリガーされるものを含む、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された導入遺伝子の遺伝子発現を制御することができる。追加の例としては、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ８；１００５１（２０１８）のＢＯＣ方法、遺伝コード拡張および非生理的アミノ酸、放射線制御型または超音波制御型オン／オフスイッチが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｃｏｔｔ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０００ Ｊｕｌ；７（１３）：１１２１－５、米国特許第５，６１２，３１８号、同第５，５７１，７９７号、同第５，７７０，５８１号、同第５，８１７，６３６号、およびＷＯ１９９９／０２５３８５Ａ１を参照）。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第７，８４０，２６３号、ＵＳ２００７／０１９００２８Ａ１に開示される、埋め込み可能な系によって制御され、遺伝子発現は、ｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを活性化する電磁エネルギーを含む、１つ以上のエネルギー形態によって制御される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、低酸素媒介性またはストレス活性化スイッチ、例えば、ＷＯ１９９９／０６０１４２Ａ２、米国特許第５，８３４，３０６号、同第６，２１８，１７９号、同第６，７０９，８５８号、ＵＳ２０１５／０３２２４１０、Ｇｒｅｃｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ９，Ｓ３６８に開示されるものなど、ならびにＦＲＯＧ、ＴＯＡＤ、およびＮＲＳＥエレメント、および条件的に誘導可能なサイレンスエレメント（例えば、米国特許第９，３９４，５２６号に開示される、低酸素反応エレメント（ＨＲＥ）、炎症反応エレメント（ＩＲＥ）、および剪断応力活性化エレメント（ＳＳＡＥ）を含む）である。そのような実施形態は、虚血後、または虚血性組織および／もしくは腫瘍において、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現をオンにするために有用である。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、光遺伝学的（例えば、光制御）調節スイッチ、例えば、Ｐｏｌｅｓｓｋａｙａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０１８；１９（Ｓｕｐｐｌ １）：１２においてレビューされたスイッチのうちの１つなどであり、それらもまた、本明細書における使用が想定される。そのような実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、光感受性であり、可視波長（例えば、青、近赤外）に応答して導入遺伝子発現を調節することができる遺伝子エレメントを含み得る。光遺伝学的調節スイッチを含むｃｅＤＮＡベクターは、皮膚、目、筋肉などの、光源を受け取ることができる身体の場所で導入遺伝子を発現する場合に有用であり、光シグナルが好適な手段（例えば、本明細書に開示されるような埋め込み型デバイス）によって提供され得る内臓および組織内でｃｅＤＮＡベクターが導入遺伝子を発現している場合にも使用することができる。そのような光遺伝学的調節スイッチとしては、光応答エレメント、または光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）（例えば、２０１４／０２８７９３８で開示）、Ｌｉｇｈｔ－Ｏｎシステム（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１２ Ｆｅｂ １２；９（３）：２６６－９に開示；ここには、インスリン導入遺伝子であるＣｒｙ２／ＣＩＢ１システムの発現のインビボ制御を可能にすることが報告されている（例えば、Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ；７，９７３－９７５（２０１０）で開示）、およびＦＫＦ１／ＧＩＧＡＮＴＥＡシステム（例えば、Ｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９ Ｏｃｔ；２７（１０）：９４１－５で開示）が挙げられる。
Ｇ．キルスイッチ
本発明の他の実施形態は、キルスイッチを含むｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺滅されるか、または導入されたｃｅＤＮＡベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。本発明のｃｅＤＮＡベクターにおけるキルスイッチの使用が、通常は、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、またはアポトーシスが望ましい細胞型（例えば、癌細胞）へのｃｅＤＮＡベクターの標的と結び付けられることは、当業者によって理解されるであろう。すべての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナルまたは他の指定条件の不在下でｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の急速かつロバストな細胞殺滅をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書においてｃｅＤＮＡベクターによりコードされるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。そのようなキルスイッチは、対象からｃｅＤＮＡベクターを除去すること、またはコードされた導入遺伝子を発現しないことを保証することが望ましいときに、生物学的封じ込め機能として役立つ。したがって、キルスイッチは、環境シグナルをｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の条件付き生存と結び付けるｃｅＤＮＡベクター内の合成生物学的回路である。いくつかの実施形態では、異なるｃｅＤＮＡベクターは、異なるキルスイッチを有するように設計され得る。これにより、ｃｅＤＮＡベクターのカクテルを使用した場合にどの導入遺伝子発現細胞を殺傷するかを制御することができる。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、モジュール式の生物学的封じ込め回路であるキルスイッチを含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターでの使用のために包含されるキルスイッチは、ＷＯ２０１７／０５９２４５に開示され、ここには、環境シグナルが構築物中の２番目の分子の活性を抑制する（例えば、小分子結合転写因子を使用して、毒素産生の抑制に起因する「生存」状態を生じさせる）ように、少なくとも２つの抑制可能な配列の相互に阻害性の配置を含む「デッドマンキルスイッチ」と呼ばれるスイッチが記載される。デッドマンキルスイッチを含むｃｅＤＮＡベクターを含む細胞では、環境シグナルが失われると、回路は恒久的に「死」状態に切り替わり、毒素が抑制解除され、その結果、毒素が産生されて細胞を殺傷する。別の実施形態では、ハイブリッド転写因子（ＴＦ）を使用して細胞生存のための複雑な環境要件を構築する「パスコード回路」または「パスコードキルスイッチ」と呼ばれる合成生物学的回路が提供される。ＷＯ２０１７／０５９２４５に記載されるデッドマンおよびパスコードキルスイッチは、回路の活性化を制御する環境条件と細胞運命を制御する出力モジュールの両方の観点からモジュール式でカスタマイズ可能であるため、ｃｅＤＮＡベクターでの使用に特に有用である。エンドヌクレアーゼを含むが、これに限定されない毒素、例えば、ＥｃｏＲＩの適切な選択により、ｃｅＤＮＡベクターに存在するパスコード回路を使用して、ｃｅＤＮＡベクターを含む宿主細胞を殺滅するだけでなく、そのゲノムおよび付随プラスミドを分解することができる。
当業者に知られている他のキルスイッチは、例えばＵＳ２０１０／０１７５１４１、ＵＳ２０１３／０００９７９９、ＵＳ２０１１／０１７２８２６、ＵＳ２０１３／０１０９５６８に開示される、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクター、ならびにＪｕｓｉａｋ ｅｔ ａｌ，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；２０１４；１－５６、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００４；１０１；８４１９－９、Ｍａｒｃｈｉｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０１１；４３；３１０－３１９、およびＲｅｉｎｓｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８，１１に開示されるキルスイッチでの使用に包含される。
したがって、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、エフェクター毒素またはレポータータンパク質をコードする核酸を含むキルスイッチ核酸構築物を含むことができ、エフェクター毒素（例えば、死タンパク質）またはレポータータンパク質の発現は、所定の条件によって制御される。例えば、所定の条件は、例えば外因性物質などの環境物質の存在であり得、それがなければ、細胞はデフォルトでエフェクター毒素（例えば、死タンパク質）の発現を起こして殺傷される。代替の実施形態では、所定の条件は、２つ以上の環境物質の存在であり、例えば、細胞は、２つ以上の必要な外因性物質が供給された場合のみに生き残り、いずれもなければ、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺傷される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を破壊するキルスイッチを組み込むように修飾され、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子のインビボ発現を効果的に終了させる（例えば、治療用遺伝子、タンパク質またはペプチド）。具体的には、ｃｅＤＮＡベクターは、通常の生理学的条件下で哺乳動物細胞では機能しないスイッチタンパク質を発現するようにさらに遺伝子操作される。このスイッチタンパク質を特異的に標的とする薬物または環境条件を投与したときのみ、スイッチタンパク質を発現する細胞が破壊され、それにより治療用タンパク質またはペプチドの発現を終了させる。例えば、ＨＳＶ－チミジンキナーゼを発現する細胞は、ガンシクロビルおよびシトシンデアミナーゼなどの薬物を投与すると殺傷される可能性があると報告された。例えば、Ｄｅｙ ａｎｄ Ｅｖａｎｓ，Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｂｙ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ Ｖｉｒｕｓ－１ Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ（ＨＳＶ－ＴＫ），ｉｎ Ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｙｏｕ（２０１１）、およびＢｅｌｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６（１５）：８６９９－８７０４（１９９９）を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＩＳＥ（生存遺伝子排除によって引き起こされる死）と称されるｓｉＲＮＡキルスイッチを含むことができる（Ｍｕｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７；８：８４６４３－８４６５８．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＩＳＥ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）。
いくつかの態様では、デッドマンキルスイッチは、細胞増殖環境における薬剤、例えば外因性薬剤の欠如などの所定の条件に対して細胞応答を感受性にする生物学的回路またはシステムである。そのような回路またはシステムは、所定の条件に感受性のあるデッドマン調節回路を形成する発現モジュールを含む核酸構築物を含むことができる。構築物は調節回路を形成する発現モジュールを含み、構築物としては、
ｉ）第１のリプレッサータンパク質発現モジュールであって、第１のリプレッサータンパク質が第１のリプレッサータンパク質核酸結合エレメントに結合し、かつ、第１のリプレッサータンパク質結合エレメントを含むコード配列からの転写を抑制し、第１のリプレッサータンパク質の抑制活性が、第１の外因性薬剤による阻害、所定の条件を確立する第１の外因性薬剤の存在または不在に対して感受性である、第１のリプレッサータンパク質発現モジュール、
ｉｉ）第２のリプレッサータンパク質発現モジュールであって、第２のリプレッサータンパク質が第２のリプレッサータンパク質核酸結合エレメントに結合し、かつ、第２のリプレッサータンパク質結合エレメントを含むコード配列からの転写を抑制し、第２のリプレッサータンパク質が第１のリプレッサータンパク質とは異なる、第２のリプレッサータンパク質発現モジュール、および
ｉｉｉ）エフェクター発現モジュールであって、第２のリプレッサータンパク質の発現がエフェクター発現からのエフェクター発現の抑制を引き起こすように、第２のリプレッサータンパク質の結合エレメントを含む遺伝子エレメントに操作可能に連結された、エフェクタータンパク質をコードする核酸配列を含み、エレメントが第１のリプレッサータンパク質によって結合されるときに、第２の発現モジュールが、第２のリプレッサータンパク質の転写の抑制を可能にする第１のリプレッサータンパク質核酸結合エレメントを含み、第１の外因性薬剤がない場合に、第１のリプレッサータンパク質が、第１のリプレッサータンパク質発現モジュールから産生され、かつ、第２のリプレッサータンパク質発現モジュールからの転写を抑制するようにそれぞれのモジュールが調節回路を形成し、それにより、第２のリプレッサータンパク質によるエフェクター発現の抑制が緩和され、エフェクタータンパク質の発現をもたらすが、第１の外因性薬剤がある場合、第１のリプレッサータンパク質の活性が阻害され、第２のリプレッサータンパク質の発現が可能になり、エフェクタータンパク質発現の発現を「オフ」状態に維持し、それにより、第１の外因性薬剤が、エフェクタータンパク質の発現を「オフ」状態に維持するために回路に必要とされ、第１の外因性薬剤の除去または不在が、エフェクタータンパク質の発現を生じさせない、エフェクター発現モジュール、が挙げられる。
いくつかの実施形態では、エフェクターは、細胞死プログラムを誘導する毒素またはタンパク質である。宿主細胞に毒性である任意のタンパク質を使用することができる。いくつかの実施形態では、毒素は、それが発現されるそれらの細胞のみを殺傷する。他の実施形態では、毒素は、同じ宿主生物の他の細胞を殺傷する。細胞死につながる多数の生成物のうちのいずれかを、デッドマンキルスイッチで用いることができる。ＤＮＡ複製、タンパク質翻訳または他のプロセスを阻害する薬剤、または例えば、宿主細胞の核酸を分解する薬剤は、特に有用である。回路の活性化時に宿主細胞を殺傷する効率的な機序を同定するために、宿主細胞のＤＮＡまたはＲＮＡに直接損傷を与えるいくつかの毒素遺伝子を試験した。エンドヌクレアーゼｅｃｏＲＩ２１、ＤＮＡジャイレースｃｃｄＢ２２、およびリボヌクレアーゼ型毒素のＭａｚＦ２３は、十分に特徴付けられ、Ｅ．ｃｏｌｉに対してネイティブであり、かつ殺傷機序の範囲を提供するので、それらを試験した。回路のロバスト性を高め、回路依存性細胞死の独立した方法を提供するために、システムは、例えば、死遺伝子を「オフ」状態に維持するリプレッサーをさらに妨害する標的化プロテアーゼまたはヌクレアーゼなどを発現するようにさらに適合させることができる。生存シグナルの喪失または撤回により、例えば、リプレッサータンパク質またはそのメッセージの活発な分解によって、死遺伝子の抑制がさらに効率的に除去される。非限定的な例として、ｍｆ－Ｌｏｎプロテアーゼを使用して、ＬａｃＩを分解するだけでなく、分解のために必須タンパク質を標的化した。ｍｆ－Ｌｏｎ分解タグｐｄｔ＃１は、タンパク質産物がｍｆ－Ｌｏｎ分解２０に特に感受性である５つの必須遺伝子の３’末端に付加することができ、ＡＴｃの除去後に細胞生存率を測定した。試験された必須遺伝子標的の中で、ペプチドグリカン生合成遺伝子ｍｕｒＣは、最強かつ最速の細胞死表現型を提供した（６時間以内の生存率＜１×１０－４）。
本明細書で使用される場合、「所定の入力」という用語は、既知の様式で転写因子ポリペプチドの活性に影響を与える薬剤または状態を指す。一般に、そのような薬剤は、転写因子ポリペプチドに結合および／またはその立体構造を変化させ、それによって転写因子ポリペプチドの活性を改変することができる。所定の入力の例には、所与の宿主生物の生存に必要とされない（すなわち、本明細書に記載される合成生物学的回路がない場合）環境入力剤が含まれるが、これらに限定されない。所定の入力を提供することができる条件としては、温度（例えば、１つ以上の因子の活性が温度感受性である場合）、光（所与の波長スペクトルの光を含む）の有無、およびガス、塩、金属または鉱物の濃度が挙げられる。環境入力剤としては、小分子、生物学的薬剤（フェロモン、ホルモン、増殖因子、代謝産物、栄養素など）およびそれらの類似体、化学物質、環境副産物、金属イオンおよびその他のそのような分子もしくは薬剤の濃度、光のレベル、温度、機械的応力もしくは圧力、または電気シグナル（電流および電圧など）などが挙げられる。
いくつかの実施形態では、レポーターを使用して、本発明のモジュールまたはプログラム可能な合成生物学的回路によって受信されたシグナルの強度または活性を定量化する。いくつかの実施形態では、レポーターは、タンパク質が細胞または生物のどこに位置するかを同定するために、他のタンパク質コード配列にインフレームで融合され得る。ルシフェラーゼは、本明細書に記載される様々な実施形態のエフェクタータンパク質として使用することができ、例えば、細胞はルシフェラーゼの不在下でバックグラウンド発光をほとんどまたは全く持たない傾向があるため、低レベルの遺伝子発現を測定する。他の実施形態では、着色基質を生成する酵素は、分光光度計、またはプレートリーダーを含む吸光度測定を行うことができる他の機器を使用して定量化することができる。ルシフェラーゼと同様に、β－ガラクトシダーゼなどの酵素は、低シグナルを増幅する傾向があるため、低レベルの遺伝子発現の測定に使用できる。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、所与の毒素を分解するか、さもなければ破壊することができる酵素であり得る。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、基質を匂い物質生成物に変換する匂い物質酵素であり得る。いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、小分子または他のタンパク質のいずれかをリン酸化または脱リン酸化する酵素、または他のタンパク質またはＤＮＡをメチル化または脱メチル化する酵素であり得る。
いくつかの実施形態では、エフェクタータンパク質は、受容体、リガンド、または溶解タンパク質であり得る。受容体は３つのドメインを持つ傾向がある：タンパク質、ペプチドまたは小分子などのリガンドを結合するための細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびリン酸化などのある種のシグナル伝達イベントに頻繁に関与することができる細胞内または細胞質ドメイン。いくつかの実施形態では、トランスポーター、チャネル、またはポンプ遺伝子配列は、エフェクタータンパク質として使用される。本明細書に記載されるキルスイッチと共に使用するための非限定的な例およびエフェクタータンパク質の配列は、ワールドワイドウェブのｐａｒｔｓ．ｉｇｅｍ．ｏｒｇの標準生物学的部品の登録簿（Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐａｒｔｓ）に見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「モジュレータータンパク質」は、標的核酸配列からの発現を調節するタンパク質である。モジュレータータンパク質としては、例えば、とりわけ転写活性化因子およびリプレッサーを含む転写因子、ならびに転写因子に結合またはそれを修飾してその活性に影響を与えるタンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、モジュレータータンパク質としては、例えば、標的核酸配列からの発現の調節に関与するタンパク質因子を分解するプロテアーゼが挙げられる。好ましいモジュレータータンパク質としては、例えば、ＤＮＡ結合および入力剤結合または応答性エレメントまたはドメインが分離可能かつ転移可能であり、それにより、例えば、最初のモジュレータータンパク質のＤＮＡ結合ドメインの、２番目のモジュレータータンパク質の入力剤応答性ドメインへの融合により、最初のタンパク質によって認識されるＤＮＡ配列を結合するが、２番目のタンパク質が通常応答する入力剤に感受性である新たなタンパク質が得られる、モジュレータータンパク質が挙げられる。したがって、本明細書で使用される場合、「モジュレーターポリペプチド」という用語、およびより具体的な「リプレッサーポリペプチド」は、特定のポリペプチドに加えて、例えば、「ＬａｃＩ（リプレッサー）ポリペプチド」、バリアント、または別のまたはバリアントの入力剤に応答するそのようなポリペプチドの誘導体を含む。したがって、ＬａｃＩポリペプチドの場合、ラクトースまたはＩＰＴＧ以外の薬剤に結合するＬａｃＩ変異体またはバリアントが含まれる。広範なかかる薬剤が当該技術分野で知られている。
Figure 2022520803000033
Figure 2022520803000034
Figure 2022520803000035
Figure 2022520803000036
Figure 2022520803000037
Figure 2022520803000038
ＶＩＩ．薬学的組成物
別の態様では、医薬組成物が提供される。典型的に、医薬組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
本明細書に開示されるＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な医薬組成物に組み込まれ得る。典型的に、医薬組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。例えば、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な医薬組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。治療目的のための医薬組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと組み込み、濾過滅菌することによって調製され得る。
ｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化され得、その中の導入遺伝子の治療的発現をもたらす。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、房内、および硝子体内）、蝸牛内、ならびに粘膜（例えば、経口、直腸、経鼻）投与に好適な医薬組成物に組み込むことができる。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。
治療目的のための医薬組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせと組み込み、濾過滅菌することによって調製され得る。
核酸を細胞に送達するための様々な技法および方法が、当該技術分野において既知である。例えば、ｃｅＤＮＡなどの核酸は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、またはコアシェルナノ粒子中に製剤化され得る。典型的に、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）分子、１つ以上のイオン化またはカチオン性脂質（もしくはそれらの塩）、１つ以上の非イオン性または中性脂質（例えば、リン脂質）、凝集を防ぐ分子（例えば、ＰＥＧもしくはＰＥＧ－脂質複合体）、および任意選択的にステロール（例えば、コレステロール）で構成される。
ｃｅＤＮＡなどの核酸を細胞に送達するための別の方法は、細胞によって内在化されるリガンドと核酸を複合することによるものである。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的な複合体は、例えば、ＷＯ２０１５／００６７４０、ＷＯ２０１４／０２５８０５、ＷＯ２０１２／０３７２５４、ＷＯ２００９／０８２６０６、ＷＯ２００９／０７３８０９、ＷＯ２００９／０１８３３２、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００４／０９０１０８、ＷＯ２００４／０９１５１５、およびＷＯ２０１７／１７７３２６に記載されている。
ｃｅＤＮＡなどの核酸はまた、トランスフェクションによって細胞に送達され得る。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、またはリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ－Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３フェクチン、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ－１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ－２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ－５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、およびＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス方法を介して細胞に送達され得る。
インビボまたはエクスビボでの核酸の非ウイルス性送達の方法としては、電気穿孔、リポフェクション（米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、ならびにＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）などの市販試薬）、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４０４－４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２：２９１－２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：３８２－３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．５：６４７－６５４（１９９４）、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：４８１７－４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、同第４，２１７，３４４号、同第４，２３５，８７１号、同第４，２６１，９７５号、同第４，４８５，０５４号、同第４，５０１，７２８号、同第４，７７４，０８５号、同第４，８３７，０２８号、および同第４，９４６，７８７号）、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、ならびにＤＮＡの薬剤により強化された取り込みが挙げられる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００システム（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションもまた、核酸の送達のために使用され得る。
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターはまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与され得る。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注入、注射、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって使用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応をもたらし得る。
本明細書に開示される核酸ベクターのｃｅＤＮＡベクター導入方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に記載される方法によって、例えば造血幹細胞に送達され得る。
本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、対象中の細胞または標的器官への送達のためにリポソームに付加され得る。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物に対する親水性および疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含む。そのような態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ～約５，０００Ｄａであり得る。
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間～数週間の期間にわたって送達するであろうリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間～数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成成分を有するＡＰＩを封入する。
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）複合脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステリル（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－ホスファチジルコリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２～１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を含有するリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－２０００－ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質複合体、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、およびＤＯＰＥを含む。
いくつかの態様では、本開示は、１つ以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多重ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０～２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を付加することにより、本明細書に開示または記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製され、ロードされたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３まで増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に送る。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４～６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンを含むリポソーム製剤を提供する。
例えば、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、微小球、脂質粒子、小胞等の送達試薬は、好適な宿主細胞中への本開示の組成物の導入のために使用され得る。特に核酸は、送達のために製剤化され得るか、または脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノ粒子、金粒子等に封入され得る。そのような製剤は、本明細書に開示される核酸の薬学的に許容される製剤の導入のために好ましい場合がある。
当該技術分野において既知の様々な送達方法またはそれらの修正を使用して、ｃｅＤＮＡベクターをインビトロまたはインビボで送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、またはレーザー系エネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化細胞へのＤＮＡ進入が促進される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、または当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは単独で、裸のＤＮＡとして皮膚、甲状腺、心筋、骨格筋、または肝臓細胞中に直接注入される。
場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金またはタングステン球状粒子（１～３μｍ径）は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。
いくつかの実施形態では、電気穿孔を使用して、ｃｅＤＮＡベクターを送達する。電気穿孔は、組織への電極対の挿入によって細胞膜標的細胞組織の一時的な不安定化を引き起こし、それにより不安定化した膜の周囲媒質中のＤＮＡ分子は、細胞の細胞質および核質中に貫通することができる。電気穿孔は、皮膚、肺、および筋肉などの多くの組織型にインビボで使用されている。
場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、内臓および肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物および粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学的注入によって送達される。
場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、膜中にナノスコピック孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓または腫瘍の細胞へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進するため、プラスミドＤＮＡのサイズおよび濃度は、この系の効率性において大きな役割を果たす。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、磁場を使用することによってマグネトフェクションにより送達され、核酸を含有する粒子を標的細胞中に濃縮する。
場合によっては、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム／ミセルまたはカチオン性ポリマーに属するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ－Ｌ－リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、および脂質－ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
Ａ．エキソソーム：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、エキソソームにパッケージ化されることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生した細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、ＢおよびＴリンパ球、マスト細胞（ＭＣ）、ならびに樹状細胞（ＤＣ）を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、１０ｎｍ～１μｍ、２０ｎｍ～５００ｎｍ、３０ｎｍ～２５０ｎｍ、５０ｎｍ～１００ｎｍの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、または特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本発明のカプシド不含ＡＡＶベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
Ｂ．微粒子／ナノ粒子：
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ５（３）：４９８－５０７によって開示されているイオン化アミノ脂質（例えば、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびコート脂質（ポリエチレングリコール－ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ－ＤＭＧ）を含む。
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約１０００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０～約３００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２５～約２００ｎｍの直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物（例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、サイズ分布を有し、平均サイズ（例えば、直径）は、約７０ｎｍ～約２００ｎｍであり、より典型的に、平均サイズは、約１００ｎｍ以下である。
当該技術分野において既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第９，４０４，１２７号、同第９，００６，４１７号、および同第９，５１８，２７２号に記載される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、金ナノ粒子によって送達される。一般に、核酸は、例えば、Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）．Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（６）；１０７５－１０８３によって記載されるように、金ナノ粒子に共有結合され得るか、または金ナノ粒子に非共有結合され得る（例えば、電荷－電荷相互作用によって結合される）。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子－核酸複合体は、例えば、米国特許第６，８１２，３３４号に記載される方法を使用して産生される。
Ｃ．リポソーム
リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に既知である。改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、および同第５，７９５，５８７号）。
リポソームは、通常は他の手順によるトランスフェクションに対して耐性があるいくつかの細胞型と共に良好に使用されている。加えて、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長さの制約を含まない。リポソームは、遺伝子、薬物、放射線療法剤、ウイルス、転写因子、アロステリックエフェクターを、様々な培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。加えて、リポソーム媒介性薬物送達の有効性を調べるいくつかの良好な臨床治験が完了している。
リポソームは、水性媒質中に分散されるリン脂質から形成され、同時に多重ラメラ同心円二層小胞（多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成する。ＭＬＶは、一般に、２５ｎｍ～４μｍの直径を有する。ＭＬＶの音波処理は、コアに水溶液を含有する、２００～５００ＡＮＧの範囲の直径を有する小さい単一ラメラ小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。
いくつかの実施形態では、リポソームは、カチオン性脂質を含む。「カチオン性脂質」という用語は、極性ドメインおよび非極性ドメインの両方を有し、生理的ｐＨまたはその付近で正に電荷されることができ、核酸などのポリアニオンに結合し、細胞への核酸の送達を促進する脂質および合成脂質を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、飽和および不飽和アルキル、およびアミンの脂環式エーテルおよびエステル、またはそれらの誘導体を含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、直鎖、分岐鎖アルキル、アルケニル基、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、１～約２５個の炭素原子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、２６個以上の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、直鎖または分岐鎖アルキルまたはアルケン基は、６個以上の炭素原子を有する。カチオン性脂質はまた、いくつかの実施形態では、１つ以上の脂環式基を含み得る。脂環式基の非限定例としては、コレステロールおよび他のステロイド基が挙げられる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、１つ以上の対イオンで調製される。対イオン（アニオン）の例としては、Ｃｌ－、Ｂｒ－、Ｉ－、Ｆ－、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、硫酸塩、亜硝酸塩、および硝酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
カチオン性脂質の非限定例としては、ポリエチレンイミン、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）星形デンドリマー、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥの組み合わせ）、リポフェクターゼ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００）、ＤＯＰＥ、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ（Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）、およびＥｕｆｅｃｔｉｎ（ＪＢＬ，Ｓａｎ Ｌｕｉｓ Ｏｂｉｓｐｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。例示的なカチオン性リポソームは、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオロキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオロキシ）－プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムメチル硫酸塩（ＤＯＴＡＰ）、３β－［Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、２，３，－ジオレイロキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロ酢酸塩（ＤＯＳＰＡ）、１，２－ジミリスチルオキシプロピル－３－ジメチル－ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物、およびジメチルジオクタデシルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）から作製され得る。核酸（例えば、ＣＥＬｉＤ）はまた、例えばポリ（Ｌ－リジン）またはアビジンと複合され得、脂質は、この混合物、例えばステリル－ポリ（Ｌ－リジン）に含まれ得るか、または含まれない場合がある。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、米国特許第８，１５８，６０１号に記載されるカチオン性脂質、または米国特許第８，０３４，３７６号に記載される脂質を使用して送達される。
Ｄ．複合体
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、複合される（例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤に共有結合される）。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例えば、コレステロール、トコフェロールなど）、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）（例えば、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂなど）、およびポリアミン（例えば、スペルミン）に複合され得る。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１－８０９に開示されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、ポリマー（例えば、ポリマー分子）または葉酸塩分子（例えば、葉酸分子）に複合される。一般に、ポリマーに複合された核酸の送達は、例えば、ＷＯ２０００／３４３４３およびＷＯ２００８／０２２３０９に記載されるように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，９８７，３７７号によって記載されるように、ポリ（アミド）ポリマーに複合される。いくつかの実施形態では、本開示によって記載される核酸は、米国特許第８，５０７，４５５号に記載されるように、葉酸分子に複合される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号に記載されるように、炭水化物に複合される。
Ｅ．ナノカプセル
代替として、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターのナノカプセル製剤が使用され得る。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方式で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル－シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
ＶＩＩＩ．ｃｅＤＮＡベクターを送達する方法
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、様々な好適な方法によってインビトロまたはインビボで標的細胞に送達され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、単独で適用または注入され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、トランスフェクション試薬または他の物理的手段の助けなく細胞に送達され得る。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、細胞へのＤＮＡの進入を促進する任意の当該技術分野において既知のトランスフェクション試薬または他の当該技術分野において既知の物理的手段、例えば、リポソーム、アルコール、高ポリリジン化合物、高アルギニン化合物、リン酸カルシウム、微小胞、マイクロインジェクション、電気穿孔などを使用して送達され得る。
対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞および組織型を効率的に標的とし得る。
ＩＸ．ｃｅＤＮＡベクターの追加の使用
本明細書に提供される組成物およびｃｅＤＮＡベクターを使用して、様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳動物対象における病態または障害の治療、予防または改善に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象に導入され得る（例えば、発現され得る）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、発現の増加、遺伝子産物の活性、または遺伝子の不適切な上方調節（導入遺伝子が、その発現を抑制する、または他の方法でその発現を低減させる）に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象に導入（例えば、発現）され得る。
Ｘ．使用の方法
本発明のｃｅＤＮＡベクターはまた、関心対象のヌクレオチド配列を標的細胞に送達するための方法において使用され得る。この方法は、特に、関心対象の治療用遺伝子を、それを必要とする対象の細胞に送達するための方法であり得る。本発明は、ポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの治療レベルが発現されるように、対象の細胞における治療用外因性ＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドのインビボ発現を可能にする。これらの結果は、ｃｅＤＮＡベクター送達のインビボおよびインビトロ両方の形態で見られる。
対象の細胞における関心対象の核酸の送達のための方法は、関心対象の当該核酸を含む本発明のｃｅＤＮＡベクターの当該対象への投与を含み得る。加えて、本発明は、関心対象の核酸を含む本発明のｃｅＤＮＡベクターの複数回投与を含む、それを必要とする対象の細胞に関心対象の当該核酸を送達するための方法を提供する。本発明のｃｅＤＮＡベクターは免疫応答を誘導しないので、そのような複数回投与戦略は、カプシド化されたベクターで観察されるものとは反対に、本発明のｃｅＤＮＡベクターに対する宿主免疫系応答によって損なわれない。
ｃｅＤＮＡベクター核酸は、所望の組織の細胞をトランスフェクションし、過度の有害作用なしに、十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、静脈内（例えば、リポソーム製剤）、選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、筋肉内、および他の投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。所望される場合、投与経路を組み合わせることができる。
ＣｅＤＮＡベクターは、１種のｃｅＤＮＡベクターに限定されない。そのようなものとして、別の態様では、異なる外因性ＤＮＡ配列を含む複数のｃｅＤＮＡベクターは、標的細胞、組織、器官、または対象に同時にまたは順次に送達され得る。したがって、この戦略では、複数の遺伝子の発現を同時に行うことができる。送達はまた、複数回、および重要なことに、ウイルスカプシドの不在に起因する抗カプシド宿主免疫反応の欠失を仮定して、後に増加または減少する用量で臨床状況において遺伝子療法のために実施され得る。カプシドが存在しないため、抗カプシド反応は起こらないと予想される。
本発明はまた、治療有効量のｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体と共に、それを必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
ＸＩ．治療方法
本明細書に記載される技術はまた、開示されるｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、ならびにそれを様々な方法（例えば、原位置外、インビトロおよびインビボ適用、方法論、診断手順、ならびに／または遺伝子療法レジメン）で使用する方法を実証する。
治療有効量のｃｅＤＮＡベクターを、任意選択的に薬学的に許容される担体と共に、治療を必要とする対象の標的細胞（例えば、筋細胞もしくは組織、または他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象における疾患または障害を治療する方法が、本明細書に提供される。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
任意の導入遺伝子は、本明細書に開示されるように、ｃｅＤＮＡベクターによって送達され得る。関心対象の導入遺伝子には、ポリペプチドをコードする核酸、または非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲなど）、好ましくは治療的（例えば、医療、診断、もしくは獣医学的用途）もしくは免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が含まれる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせを発現またはコードする。
特に、導入遺伝子は、例えば、疾患、機能不全、傷害、および／または障害のうちの１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善における使用のための、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、酵素、抗体、抗原結合断片、ならびにそのバリアントおよび／または活性断片、アゴニスト、アンタゴニスト、模倣体を含むが、これらに限定されない１つ以上の治療剤である。一態様では、疾患、機能不全、外傷、傷害、および／または障害は、ヒト疾患、機能不全、外傷、傷害、および／または障害である。
本明細書に記載されるように、導入遺伝子は、治療用タンパク質もしくはペプチド、または治療用核酸配列もしくは治療剤をコードすることができ、または治療剤としては、１つ以上のアゴニスト、アンタゴニスト、抗アポトーシス因子、阻害剤、受容体、サイトカイン、細胞毒、エリスロポエチン剤、糖タンパク質、増殖因子、増殖因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、神経増殖因子、向神経活性ペプチド、向神経活性ペプチド受容体、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、酵素、受容体結合タンパク質、輸送タンパク質もしくはその１つ以上の阻害剤、セロトニン受容体、またはその１つ以上の取り込み阻害剤、セルピン、セルピン受容体、腫瘍抑制剤、診断的分子、化学療法剤、細胞毒、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセット、発現構築物、またはｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子は、宿主細胞に対して最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」または「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウスまたはヒト（例えば、ヒト化された）の細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的に、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）または別の公的に入手可能なデータベースを使用して判定され得る。
本発明のｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、１つ以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、または賦形剤と一緒に含む、ｃｅＤＮＡベクター組成物および製剤が、本明細書に開示される。そのような組成物は、疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための、１つ以上の診断的または治療的キットに含まれ得る。一態様では、疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全は、ヒト疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全である。
本明細書に記載される技術の別の態様は、診断的または治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象に提供するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示されるある量のｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象の細胞、組織、または器官に、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を可能にするのに有効な時間にわたって提供し、それによって診断的または治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクターによって発現されるタンパク質、ペプチド、核酸を対象に提供することを含む。さらなる態様では、対象は、ヒトである。
本明細書に記載される技術の別の態様は、対象における疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも開示されるｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための量および時間にわたって投与するステップを含む。さらなる態様では、対象は、ヒトである。
別の態様は、疾患または疾患状態の１つ以上の症状を治療または低減するためのツールとしての、ｃｅＤＮＡベクターの使用である。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節または構造タンパク質に関与し得るが、典型的に常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の疾患の場合、ｃｅＤＮＡベクターを使用し、導入遺伝子を送達して、置換療法のために正常な遺伝子を罹患した組織に運び入れると共に、いくつかの実施形態では、アンチセンス変異を使用して、疾患の動物モデルを創り出すことができる。不均衡疾患状態の場合、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、モデルシステムにおいて病態を創り出すことができ、次いでこれを使用して、その病態に対処する試みに使用することができる。したがって、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターおよび方法は、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、病態は、疾患を引き起こす、またはそれをより重篤にする欠乏または不均衡を部分的または全体的に修繕することによって治療される。
なおもさらなる態様として、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを用いて、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される、ホルモンまたは増殖因子をコードする導入遺伝子）の発現レベルを調節することが望ましい状況において、異種ヌクレオチド配列を送達することができる。
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、疾患または障害をもたらす遺伝子産物の異常なレベルおよび／または機能（例えば、タンパク質中の不在または欠損）を訂正することができる。ｃｅＤＮＡベクターは、機能的タンパク質を産生し、かつ／またはタンパク質のレベルを修正して、タンパク質中の不在もしくは欠損によって引き起こされる特定の疾患もしくは障害から生じる症状を緩和もしくは低減するか、または利益を付与することができる。例えば、ＯＴＣ欠損症の治療は、機能的ＯＴＣ酵素を産生することによって達成され得る。血友病ＡおよびＢの治療は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子のレベルを修正することによって達成され得る。ＰＫＵの治療は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素のレベルを修正することによって達成され得る。ファブリー病またはゴーシェ病の治療は、それぞれ機能的αガラクトシダーゼまたはβグルコセレブロシダーゼを産生することによって達成され得る。ＭＬＤまたはＭＰＳＩＩの治療は、それぞれ機能的アリールスルファターゼＡまたはイズロネート－２－スルファターゼを産生することによって達成され得る。嚢胞性線維症の治療は、機能的嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節剤を産生することによって達成され得る。グリコーゲン蓄積疾患の治療は、機能的Ｇ６Ｐａｓｅ酵素機能を回復することによって達成され得る。ＰＦＩＣの治療は、機能的ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、またはＴＪＰ２遺伝子を産生することによって達成され得る。
代替の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、アンチセンス核酸をインビトロまたはインビボで細胞に提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ＲＮＡｉ分子である場合、標的細胞中のアンチセンス核酸またはＲＮＡｉの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンス核酸である導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞または組織培養系を最適化することもできる。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる例示的な導入遺伝子としては、Ｘ、リソソーム酵素（例えば、タイ・サックス病に関連するヘキソサミニダーゼＡ、またはハンター症候群／ＭＰＳ ＩＩに関連するイズロネートスルファターゼ）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ならびにサイトカイン（例えば、インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、インターロイキン１２、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、ペプチド増殖因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子－３および４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、形質転換増殖因子－αおよび－β等）、受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の所望の標的に特異的なモノクローナル抗体をコードする。いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の導入遺伝子が、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、関心対象の２つの異なるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に定義されるように、全長抗体または抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書で定義されるように、抗原結合ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列である。他の例示的な導入遺伝子配列は、自殺遺伝子産生物（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、および腫瘍壊死因子）、癌治療において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、および腫瘍抑制因子遺伝子産生物をコードする。
代表的な実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象における治療のために使用され得る。この方法は、治療、改善、または予防に有効な量の、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを投与することを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、異種核酸をコードするジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ウトロフィン、マイクロジストロフィン、ラミニン－α２、α－サルコグリカン、β－サルコグリカン、γ－サルコグリカン、δ－サルコグリカン、ＩＧＦ－１、ミオスタチンもしくはミオスタチンポリペプチドに対する抗体もしくは抗体断片、および／またはミオスタチンに対するＲＮＡｉを含む。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の別の場所に記載されるように、骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋に投与され得る。
いくつかの実施形態では、通常は血液中で循環するポリペプチド（例えば、酵素）もしくは機能的ＲＮＡ（例えば、ＲＮａｉ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の産生のため、あるいは障害（例えば、代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、ＶＩＩＩ）、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群等）またはリソソーム蓄積症（ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンペ病［リソソーム酸α－グルコシダーゼ］もしくはファブリー病［α－ガラクトシダーゼＡ］）またはグリコーゲン蓄積疾患（ポンペ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ）を治療、改善、および／または予防するための他の組織への全身送達のため、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、導入遺伝子を骨格筋、心筋、または横隔膜筋に送達することができる。代謝障害を治療、改善、および／または予防するための他の好適なタンパク質は、上に記載される。
他の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、代謝障害の治療、改善、および／または予防を必要とする対象においてそれを行う方法において、導入遺伝子を送達することができる。例示的な代謝障害およびポリペプチドをコードする導入遺伝子が、本明細書に記載される。任意選択的に、ポリペプチドが分泌される（例えば、その未変性状態の分泌ポリペプチドであるポリペプチド、または例えば、当該技術分野において既知のような分泌シグナル配列との操作可能な会合によって分泌されるように操作されたポリペプチド）。
他の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、発作を治療する、例えば、発作の徴候、発生率、または重症度を低減することができる。発作の治療的処置の有効性は、動作的（例えば、揺動、眼もしくは口のチック）および／または電子記録的手段（ほとんどの発作は、シグネチャー電子記録的異常を有する）によって評価され得る。したがって、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、経時的に複数の発作によってマークされる癲癇を治療することもできる。代表的な一実施形態では、脳下垂体腫瘍を治療するために、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して、ソマトスタチン（またはその活性断片）が脳に投与される。この実施形態に従い、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、脳下垂体への微小注入によって投与される。同様に、そのような治療を使用して、末端肥大症（脳下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療することができる。ソマトスタチンの核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６、処理された活性ペプチドソマトスタチン－２８およびソマトスタチン－１４を含有する）配列は、当該技術分野において既知の通りである。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載される分泌シグナルを含む導入遺伝子をコードすることができる。
本発明の別の態様は、インビボでの対象への全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、または他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を産生するための、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの使用に関する。したがって、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されるように）、スプライソソーム媒介性トランススプライシングに影響を及ぼすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６、米国特許第６，０１３，４８７号、米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを媒介する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照）または他の非翻訳ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９、Ｙｕａｎらへの米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードする導入遺伝子を含み得る。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターはまた、レポーターポリペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質またはアルカリホスファターゼなどの酵素）をコードする導入遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、実験または診断の目的で有用なレポータータンパク質をコードする導入遺伝子は、β－ラクタマーゼ、β－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知の他のもののうちのいずれかから選択される。いくつかの態様では、レポーターポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むｃｅＤＮＡベクターを、診断目的のために、またはそれらが投与される対象におけるｃｅＤＮＡベクターの活性のマーカーとして使用することができる。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、宿主染色体と相同性を共有し、宿主染色体上の遺伝子座と組み替える、導入遺伝子または異種ヌクレオチド配列を含み得る。このアプローチを利用して、宿主細胞中の遺伝子欠陥を訂正することができる。
ＸＩＩ．投与
特定の実施形態では、２回以上の投与（例えば、２、３、４回以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間にわたって（例えば、毎日、毎週、毎月、毎年など）、所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる。
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格、横隔膜、および／または心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、および動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面への、ならびに経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接組織または器官注入（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、もしくは脳への）が挙げられる。
ｃｅＤＮＡベクターの投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、および眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。ｃｅＤＮＡベクターの投与はまた、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内またはその付近）に対するものであり得る。任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、および／または予防される病態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のｃｅＤＮＡベクターの性質に依存するであろう。追加として、ｃｅＤＮＡは、単一のベクターまたは複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に２つ以上の導入遺伝子を投与することを可能にする。
Ａ．用量範囲
インビボおよび／またはインビトロアッセイを任意選択的に用いて、使用のための最適投与量範囲を同定するのを助けることができる。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与経路および病態の重症度に依存し、当業者の判断および各対象の状況にしたがって決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推定され得る。
ｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクションし、過度の副作用なしに十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、「投与」セクションで上述されたもの、例えば選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与経路は、所望の場合、組み合わせることができる。
特定の「治療効果」を達成するために必要なｃｅＤＮＡベクターの量の用量は、核酸投与の経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子またはＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患または障害、および遺伝子、ＲＮＡ産物、または得られる発現タンパク質の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて変化するであろう。当業者は、前述の因子ならびに当該技術分野において周知の他の因子に基づいて、特定疾患または障害を有する患者を治療するためのｃｅＤＮＡベクター用量範囲を容易に判定することができる。
最適な治療反応を提供するように、投与量レジームを調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返し投与することができ、例えば、数回用量が毎日投与され得るか、または治療状況の急迫によって示されるように、用量を比例的に低減することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるか、または対象に投与されるかにかかわらず、対象オリゴヌクレオチドの投与の適切な用量およびスケジュールを容易に判定することができるであろう。
「治療有効量」は、臨床治験を通じて判定され得る比較的広い範囲内に含まれ、特定の用途に依存する（神経細胞は、極少量を必要とするが、全身注入は、多量を必要とする）であろう。例えば、ヒト対象の骨格筋または心筋への直接インビボ注入の場合、治療有効量は、およそ約１μｇ～１００ｇのｃｅＤＮＡベクターとなるであろう。ｃｅＤＮＡベクターを送達するためにエキソソームまたは微粒子が使用される場合、治療有効量は、経験的に判定され得るが、１μｇ～約１００ｇのベクターを送達することが予想される。
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の配合は、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための好適な投与および治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。
インビトロトランスフェクションの場合、細胞（１×１０６細胞）に送達されるｃｅＤＮＡベクターの有効量は、およそ０．１～１００μｇのｃｅＤＮＡベクター、好ましくは１～２０μｇ、より好ましくは１～１５μｇまたは８～１０μｇとなる。より大きなｃｅＤＮＡベクターは、より多い用量を必要とするであろう。エキソソームまたは微粒子が使用される場合、有効なインビトロ用量は、経験的に判定されるが、一般に同量のｃｅＤＮＡベクターを送達することが意図される。
治療は、単一用量または複数用量の投与を必要とし得る。いくつかの実施形態では、２以上の用量を対象に投与することができ、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシドの不在に起因して、抗カプシド宿主免疫反応を誘起する誘起しないため、実際に、必要に応じて複数の用量を投与することができる。そのようなものとして、当業者は、適切な用量数を判定することができる。投与される用量数は、例えば、およそ１～１００、好ましくは２～２０用量であり得る。
任意の特定の理論に束縛されるものではないが、本開示によって記載されるｃｅＤＮＡベクターの投与によって誘起される典型的な抗ウイルス免疫反応の欠失（すなわち、カプシド構成成分の不在）は、複数の場合にｃｅＤＮＡベクターを宿主に投与することが可能になる。いくつかの実施形態では、異種核酸が対象に送達される場合の数は、２～１０回の範囲内（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回）である。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１１回以上対象に送達される。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦日（例えば、２４時間）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴週（例えば、７歴日）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２週間に１回（例えば、２暦週期間に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦月あたり１回（例えば、３０歴日に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、６暦月あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴年（例えば、３６５日または閏年では３６６日）あたり１回だけ対象に投与される。
Ｂ．単位剤形
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単位剤形で便宜的に提示され得る。単位剤形は、典型的に、医薬組成物の１つ以上の特定の投与経路に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と複合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となるであろう。
ＸＩＩＩ．様々な適用
本明細書に提供される組成物およびｃｅＤＮＡベクターを使用して、上記のような様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳動物対象における病態の治療、改善、または予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、診断およびスクリーニング方法における使用のために想定され、これにより導入遺伝子は、細胞培養系または代替としてトランスジェニック動物モデルにおいて一時的または安定して発現される。
本明細書に記載される技術の別の態様は、哺乳動物細胞の集団を形質導入する方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも有効量の本明細書に開示されるｃｅＤＮＡのうちの１つ以上を含む組成物を、その集団の１つ以上の細胞に導入するステップを含む。
追加として、本発明は、１つ以上の追加の成分で製剤化されるか、またはそれらの使用のために１つ以上の指示で調製された、開示されるｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ組成物の１つ以上を含む、組成物、ならびに治療および／または診断キットを提供する。
以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。
実施例１：ｃｅＤＮＡベクターを構築する
ポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用したｃｅＤＮＡベクターの産生について説明する。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞において、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つのＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが修飾されている）および発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、複製してｃｅＤＮＡベクターを産生する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ－プラスミド、ｃｅＤＮＡ－バクミド、ｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（レスキュー）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
ｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ－プラスミドに由来する。図１Ａおよび１Ｂを参照すると、各ｃｅＤＮＡ－プラスミドのポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左ＩＴＲおよび右変異型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列の間には、（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後応答エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、および（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）から）を有する。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１～Ｒ６）（図１Ａおよび図１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入して、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号７）およびＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号５４２）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中に設計される。これらの配列を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ Ｂプラスミドにクローニングした。
簡潔に言えば、一連のｃｅＤＮＡベクターは、図４Ａ～４Ｃに示されるプロセスを使用して、表１２に示されるｃｅＤＮＡ－プラスミド構築物から取得した。表１２は、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターのいずれかの末端上の複製タンパク質部位（ＲＰＳ）（例えば、Ｒｅｐ結合部位）として活性な配列を含む、各成分に対応するポリヌクレオチド配列の数を示す。表１２の番号は、各構成成分の配列に対応する、本文書中の配列番号を指す。
Figure 2022520803000039
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチ、例えば、誘導性プロモーターである、プロモーターを含む。ルシフェラーゼ導入遺伝子に操作可能に連結されたＭＮＤまたはＨＬＣＲプロモーターを含む、他の構築物、例えば、構築物１０、構築物１１、構築物１２、および構築物１３（例えば、表１４Ａを参照）を使用して、ｃｅＤＮＡベクターを作製した。
ｃｅＤＮＡ－バクミドの産生：
図４Ａを参照して、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルにしたがって、試験プラスミドまたは制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えｃｅＤＮＡ－バクミドを生成した。バクミドおよびトランスポサーゼプラスミドの形質転換体および維持のために選択する抗生物質と共に、Ｘ－ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組み換えバクミドを選択した。β－ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍＬの培地中で培養した。
組み換えｃｅＤＮＡ－バクミドをＥ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍＬの培地で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞または細胞残屑から分離した。
任意選択的に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０～５００ｍＬの培地中で増幅させた。オービタルシェーカーインキュベーター内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４～１５ｎｍのナイーブ直径から）１８～１９ｎｍの直径に到達するまで、細胞直径および生存率、ならびに約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度を監視した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に収集し、細胞および残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
試験構築物を含むｃｅＤＮＡ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性または力価を判定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５～２７℃でインキュベーションした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日判定した。
図４Ａを参照すると、単一のＲｅｐタンパク質（例えば、例えば、図８Ａを参照）を含む「Ｒｅｐプラスミド」が、ｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）－二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で産生された。
Ｒｅｐ－プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルにしたがって、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ－プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド（「Ｒｅｐ－バクミド」）を生成した。Ｘ－ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ－ガラクトシダーゼ遺伝子のα－相補性を提供する）を含む正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍＬの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラシクリン）中に播種した。組み換えバクミド（Ｒｅｐ－バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ－バクミドをＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクションして、感染性バキュロウイルスを産生した。
Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍＬの培地中で４日間培養し、感染性組み換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ－バキュロウイルス）を、培養物から単離した。任意選択的に、第１世代のＲｅｐ－バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０～５００ｍＬの培地中で培養した。感染３日後～８日後に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、または濾過もしくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ－バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベーションした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存率の変化によって４～５日間にわたって毎日判定した。
ｃｅＤＮＡベクター生成および特徴付け
図４Ｂを参照して、次に、（１）ｃｅＤＮＡ－バクミドを含有する試料またはｃｅＤＮＡ－バキュロウイルス、および（２）上記のＲｅｐ－バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬ、２０ｍＬ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００および１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４～５日後に、細胞の直径および生存率が検出される。生存率が約７０～８０％で細胞直径が１８～２０ｎｍに到達したとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水または緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ ＭＩＤＩ ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラムあたり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
Ｓｆ９昆虫細胞から産生および精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定された。ＵＶ吸光度に基づいて判定された様々なｃｅＤＮＡベクターの収率を表１３に提供する。
Figure 2022520803000040
ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｄに例示されるような未変性条件または変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって同定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断およびゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、ならびに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体および二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。
単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、共感染Ｓｆ９細胞から得られたＤＮＡ（本明細書に記載されるように）を、制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、およびｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画したときに明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片についてさらに分析した。図４Ｅに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクターおよび直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂおよび２ｋｂ断片を産生することが予想されるが、連続的な構造を有する非カプシド化ベクターは、２ｋｂおよび４ｋｂ断片を産生することが予想される。
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると同定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的に閉じたＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さであるとき（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的に閉じたＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐおよび４０００ｂｐ）で溶解するであろう。さらに、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、およびｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解する（図４Ｄを参照）。
図５は、エンドヌクレアーゼによる消化を伴う（＋）または伴わない（－）、次のようなｃｅＤＮＡベクター：構築物－１、構築物－２、構築物－３、構築物－４、構築物－５、構築物－６、構築物－７、および構築物－８（すべて上記の表１２に記載される）を有する変性ゲルの例示的な図を提供する。構築物－１～構築物－８の各ｃｅＤＮＡベクターは、エンドヌクレアーゼ反応後に２つのバンド（＊）を産生した。サイズマーカーに基づいて決定された２つのバンドのサイズは、写真の下に表示される。バンドサイズは、構築物－１～構築物－８を含むプラスミドから産生されたｃｅＤＮＡベクターの各々が、連続的な構造を有することを確認する。
本明細書で使用される場合、「未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの同定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３×および２／３×のＤＮＡベクター長の産物を生成するであろう関心対象のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットまたは脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）Ｇ－２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼで消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０×変性溶液（１０×＝０．５Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、１０×色素を添加し、緩衝せず、１０×変性溶液を、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ ＮａＯＨで以前にインキュベーションされた０．８～１．０％ゲル上で４×に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲルおよびゲルボックス中で均一であり、１×変性溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズおよび所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解するであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１×ＴＢＥまたはＴＡＥ中で中和し、蒸留水または１×ＳＹＢＲ Ｇｏｌｄを含む１×ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（ＤＭＳＯ中１０，０００×濃縮物）および落射蛍光灯（青色）またはＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。
生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ－プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に装填し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミドタイトレーションを使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、または純度パーセントを判定することができる。
実施例２：ｃｅＤＮＡ細胞におけるウイルスＤＮＡ産生
ｃｅＤＮＡベクターはまた、表１４Ａに示される構築物１１、１２、１３、および１４から生成された。構築物１１～１４を含むｃｅＤＮＡ－プラスミドは、当該技術分野において周知の分子クローニング方法によって生成された。表１４Ａのプラスミドは、導入遺伝子と右側ＩＴＲとの間の３’未翻訳領域において、配列番号８を含むＷＰＲＥ、続いて配列番号９を含むＢＧＨｐＡにより構築された。
Figure 2022520803000041
構築物１１～１４の構築物のバックボーンベクターは次のとおりである。（ｉ）ｐＦＢ－ＨＴｂのａｓｙｍＩＴＲ－ＭＮＤ－ルシフェラーゼ－ｗＰＲＥ－ＢＧＨ－ポリＡ－ＩＴＲ（構築物１１）、（ｉｉ）ＩＴＲ－ＭＮＤ－ルシフェラーゼ－ｗＰＲＥ－ｐＦＢ－ＨＴｂのＢＧＨ－ポリＡ－ａｓｙｍＩＴＲ（構築物１２）、（ｉｉｉ）ｐＦＢ－ＨＴｂのａｓｙｍＩＴＲ－ＨＬＣＲ－ＡＡＴ－ｌｕｃ－ｗＰＲＥ（Ｏ）－ＢＧＨ－ポリＡ－ＩＴＲ（構築物１３）；およびｐＦＢ－ＨＴｂ中のＩＴＲ－ＨＬＣＲ－ＡＡＴ－ｌｕｃ－ｗＰＲＥ（Ｏ）－ＢＧＨ－ポリＡ－ａｓｙｍＩＴＲ（構築物１４）、各構築物は、互いに少なくとも１つの非対称ＩＴＲを有する。これらの構築物は、以下の配列のうちの１つ以上も含む。ｗＰＲＥ０（配列番号７２）およびＢＧＨ－ポリＡ配列（配列番号７３）、またはそれに対する少なくとも８５％、または少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性の配列。
次に、ｃｅＤＮＡベクター産生は、図４Ａ～４Ｃの手順、例えば、（ａ）組み換えｃｅＤＮＡ－バクミドＤＮＡの生成および組み換えｃｅＤＮＡ－バクミドＤＮＡによる昆虫細胞のトランスフェクション、（ｂ）Ｐ１ストック（低力価）、Ｐ２ストック（高力価）の生成および定量的ＰＣＲによるウイルス力価の判定にしたがって実施して、送達可能な５ｍＬ、＞１Ｅ＋７プラーク形成または感染単位「ｐｆｕ」／ｍＬ ＢＶストック、ＢＶ ストックＣＯＡを得た。ｃｅＤＮＡベクター単離は、以下の感染対のＢＶストックによる５０ｍＬの昆虫細胞の共感染によって実施した。本明細書に開示されるＲｅｐ－バクミドおよび以下の構築物のうちの少なくとも１つ：構築物１１、構築物１２、構築物１３および構築物１４。ｃｅＤＮＡベクターの単離は、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉキットを使用して実施し、さらなる分析のために精製されたＤＮＡ材料を得た。表１４Ｂおよび表１４Ｃは、構築物１１～１４から産生されたｃｅＤＮＡベクターの収率（ＯＤ検出によって検出された）を示す。
Figure 2022520803000042
Figure 2022520803000043
実施例３：ｃｅＤＮＡベクターは、ルシフェラーゼ導入遺伝子をインビトロで発現する
構築物は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを、ｃｅＤＮＡ－プラスミド構築物：構築物－１、構築物－３、構築物－５、および構築物－７のクローニング部位に導入することによって生成された。ルシフェラーゼコード配列を含むｃｅＤＮＡ－プラスミド（表１２の上記を参照）は、それぞれプラスミド構築物１－Ｌｕｃ、ｃプラスミド構築物－３－Ｌｕｃ、プラスミド構築物－５－Ｌｕｃ、およびプラスミド構築物７－Ｌｕｃと呼ばれている。
ＨＥＫ２９３細胞を培養し、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）をトランスフェクション剤として使用し、１００ｎｇ、２００ｎｇ、または４００ｎｇのプラスミド構築物１、３、５、および７でトランスフェクションした。プラスミドの各々からのルシフェラーゼの発現を、各細胞培養物中のルシフェラーゼ活性に基づいて判定し、結果を図６Ａに提供する。ルシフェラーゼ活性は、未処理の対照細胞（「未処理」）またはＦｕｇｅｎｅ単独で処理した細胞（「Ｆｕｇｅｎｅ」）から検出されず、そのルシフェラーゼ活性がプラスミドからの遺伝子発現から生じたことを確認する。図６Ａおよび図６Ｂに示されるように、ルシフェラーゼのロバストな発現は、構築物１および７から検出された。構築物－７からの発現は、ルシフェラーゼを発現し、ルシフェラーゼ活性の用量依存的増加が検出された。
プラスミドの各々でトランスフェクションした細胞の増殖および生存率もまた判定し、図７Ａおよび７Ｂに提示した。トランスフェクション細胞の細胞増殖および生存率は、異なる構築物で処理された細胞の異なる群間で有意に異ならなかった。
したがって、各群において測定され、細胞増殖および生存率に基づいて正規化されたルシフェラーゼ活性は、正規化なしにルシフェラーゼ活性とは異ならなかった。構築物１－Ｌｕｃを有するｃｅＤＮＡ－プラスミドは、正規化を伴う、または伴わないルシフェラーゼの最もロバストな発現を示した。
したがって、図６Ａ、６Ｂ、７Ａ、および７Ｂに提示されるデータは、５’～３’－ＷＴ－ＩＴＲ（配列番号５１）、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）、Ｒ３／Ｒ４クローニング部位（配列番号７）、ＷＰＲＥ（配列番号８）、ＢＧＨｐＡ（配列番号９）、および修飾型ＩＴＲ（配列番号２）を含む構築物１が、ｃｅＤＮＡベクター内で導入遺伝子のタンパク質を発現し得るｃｅＤＮＡベクターを産生する際に有効であることを実証する。
実施例４：ｃｅＤＮＡベクターからのルシフェラーゼ導入遺伝子のインビボタンパク質発現。
上記の構築物１～８から産生されるｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子のインビボタンパク質発現は、マウスにおいて評価される。ｃｅＤＮＡ－プラスミド構築物１から取得されたｃｅＤＮＡベクター（表１２に記載される）を試験し、外因性ホタルルシフェラーゼｃｅＤＮＡのリポソームを含まないｃｅＤＮＡ構築物の流体力学的注入後のマウスモデルにおける持続した耐性のあるルシフェラーゼ導入遺伝子発現、再投与（２８日目）、および耐性（４２日目まで）を実証した。異なる実験では、選択されたｃｅＤＮＡベクターのルシフェラーゼ発現は、インビボで評価され、ｃｅＤＮＡベクターは、ルシフェラーゼ導入遺伝子、および表１０Ａ～１０Ｂに示される任意のものから選択された少なくとも１つの修飾型ＩＴＲ、または図２６Ａ～２６Ｂに示される少なくとも１つの配列を含むＩＴＲを含む。
インビボルシフェラーゼ発現：５～７週齢の雄ＣＤ－１ ＩＧＳマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、０日目の尾静脈への静脈内流体力学的投与を介して１．２ｍＬ量のルシフェラーゼを発現する０．３５ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクターを投与する。３、４、７、１４、２１、２８、３１、３５、および４２日目に、ルシフェラーゼ発現をＩＶＩＳ撮像によって評価する。手短に言えば、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を腹腔内的に注入した後、全身発光をＩＶＩＳ（登録商標）撮像を介して評価する。
ＩＶＩＳ撮像を、３日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、３５日目、および４２日目に実施し、収集した器官を４２日目の屠殺後にエクスビボで撮像する。
研究の経過中、動物を計量し、健康全般および幸福について毎日監視する。屠殺後、終端心臓穿刺によって各動物から血液を収集し、２つの部分に分割し、１）血漿および２）血清に処理し、血漿は急速冷凍し、血清は肝臓酵素パネルに使用した後に急速冷凍する。追加として、肝臓、脾臓、腎臓、および鼠径リンパ節（ＬＮ）を収集し、ＩＶＩＳによってエクスビボで撮像する。
ルシフェラーゼ発現を、ＭＡＸＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（登録商標）ルシフェラーゼＥＬＩＳＡアッセイ（ＢＩＯＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、肝臓試料のルシフェラーゼのためのｑＰＣＲ、肝臓試料の組織病理学、および／または血清肝臓酵素パネル（ＶｅｔＳｃａｎＶＳ２、Ａｂａｘｉｓ Ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ Ｃａｒｅ Ｐｒｏｆｉｌｅ Ｐｌｕｓ）によって、肝臓において評価する。
実施例５：ＩＴＲ Ｗａｌｋ変異スクリーニング
ＩＴＲ構造とｃｅＤＮＡ形成との関係のさらなる分析を実施した。一連の変異体は、ｃｅＤＮＡ形成およびｃｅＤＮＡコード導入遺伝子を発現する能力に対する特定の構造変化の影響を調べるために構築した。ヒト細胞培養物中の変異体構築、ｃｅＤＮＡ形成のアッセイ、およびｃｅＤＮＡ導入遺伝子発現の評価を、以下でさらに詳細に説明する。
Ａ．変異体ＩＴＲ構築
固有の非対象ＡＡＶ ＩＩ型ＩＴＲ変異体カセットを有する３１プラスミドのライブラリをコンピューターで設計し、その後、Ｓｆ９昆虫細胞およびヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３）中で評価した。各ＩＴＲカセットには、昆虫細胞での発現用のｐ１０プロモーター配列および哺乳動物細胞での発現用のＣＡＧプロモーター配列によって駆動されるルシフェラーゼ（ＬＵＣ）または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子のいずれかが含有されていた。ＩＴＲ配列に対する変異は、右ＩＴＲ領域または左ＩＴＲ領域のいずれかで作成した。ライブラリは、本明細書における表１０Ａおよび１０Ｂ、ならびに図２６Ａおよび２６Ｂに開示される１５右側（ＲＳ）および１６左側（ＬＳ）変異体を含有していた。
Ｓｆ９浮遊培養物を、ベント付き２００ｍＬ組織培養フラスコ内のＳｆ９００ＩＩＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。培養物を４８時間ごとに継代し、ＶｉＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、細胞数および増殖指標を各継代前に測定した。培養物を、２７℃で振とう条件下（１インチ軌道、１３０ｒｐｍ）で維持した。ＨＥＫ２９３細胞の付着培養を、２５０ｍＬの組織培養フラスコ中、１％ウシ胎児血清および０．１％ＰｅｎＳｔｒｅｐを含むＧｌｕｔｉＭａｘ ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）内に３７℃、５％ＣＯ２で維持した。培養物をトリプシン処理し、９６時間ごとに継代した。９０～１００％コンフルエントフラスコの１：１０希釈液を使用して、各継代に播種した。
ｃｅＤＮＡベクターを、上記の実施例１で説明したように生成および構築した。簡潔に言えば、図４Ｂを参照すると、プラスミド構築物で形質導入されたＳｆ９細胞を、２７℃での定常条件下で２４時間付着的に増殖させた。２４時間後、トランスフェクションされたＳｆ９細胞を、バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を介してＲｅｐベクターに感染させた。ＢＩＩＣは、感染性を特徴付けるために以前にアッセイされており、１：２０００の最終希釈で使用された。Ｓｆ９００昆虫細胞培地で１：１００に希釈したＢＩＩＣを、以前にトランスフェクションした各細胞ウェルに添加した。非ＲｅｐベクターＢＩＩＣを陰性対照としてウェルのサブセットに追加した。プレートロッカー上で２分間穏やかに揺り動かしてプレートを混合した。次に、細胞を定常条件下で２７℃でさらに４８時間増殖させた。すべての実験構築物および対照を、３回アッセイした。
４８時間後、９６ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、室温まで短時間平衡化し、ルシフェラーゼ発現をアッセイした（ＯｎｅＧｌｏルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍシリーズマイクロプレートリーダーを使用して全発光を測定した。複製を平均化した。結果を図２７に示す。予想される通り、３つの陰性対照（培地のみ、模擬トランスフェクション欠失ドナーＤＮＡ、およびＲｅｐ含有バキュロウイルス細胞の不在下で処理された試料）は、著しいルシフェラーゼ発現を示さなかった。変異体試料の各々においてロバストルシフェラーゼ発現が観察され、各試料について、ｃｅＤＮＡをコードした導入遺伝子が、良好にトランスフェクションされ、変異にかかわらず発現されたことを示す。
Ｂ．ｃｅＤＮＡ形成のアッセイ
先行研究において生成されたｃｅＤＮＡが、予想される閉端構造であることを保証するために、実験を実施して、十分な量の各ｃｅＤＮＡを産生し、それらは後に適切な構造について試験され得る。手短に言えば、Ｓｆ９懸濁培養物を、ライブラリからの単一ＩＴＲ変異体プラスミドに属するＤＮＡでトランスフェクションした。培養物を、ガス交換が制限された三角培養フラスコに１．２５×１０６個の細胞／ｍＬで播種した。ＤＮＡ：脂質トランスフェクション複合体を、製造元の指示に従い、ＦｕＧｅｎｅトランスフェクション試薬を使用して調製した。複合体混合物を調製し、ルシフェラーゼプレートアッセイについて以前に記載されているものと同じ方法で、トランスフェクションされる細胞の数に比例して体積を増加させてインキュベーションした。レポーター遺伝子アッセイと同様に、４．５：１（容量試薬／質量ＤＮＡ）の比率を使用した。模擬（トランスフェクション試薬のみ）および未処理の増殖対照を、実験培養と並行して調製した。トランスフェクション試薬を添加した後、培養物を室温で１０～１５分間穏やかに回転させながら回復させた後、２７℃の振とうインキュベーターに移した。振とう条件下で２４時間培養した後、ＶｉＣｅｌｌカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、すべてのフラスコ（実験および対照）の細胞数と増殖指標を測定した。すべてのフラスコ（増殖対照を除く）は、最終希釈率１：５，０００のＲｅｐベクターを含有するＢＩＩＣに感染させた。ｃｅＤＮＡ産生のために確立されたＢＩＩＣ二重感染手順を使用する陽性対照も調製した。二重感染培養物には、すべての実験培養物の平均生細胞数に等しい細胞数を播種した。二重感染対照を、各構築物について１：５，０００の最終希釈でＲｅｐおよびレポーター遺伝子ＢＩＩＣにそれぞれ感染させた。感染後、培養物を前述の振とう条件下でインキュベーターに戻した。感染後３日間、すべてのフラスコの細胞数、増殖、生存率の指標を毎日測定した。新たに感染させた培養物を振とうインキュベーション条件下で約２時間回復させた後、Ｔ＝０時点の測定を行った。３日後、１５分間の遠心分離により細胞を採取した。上澄を廃棄し、ペレットの質量を記録し、ＤＮＡ抽出までペレットを－８０℃で凍結した。
推定の粗ｃｅＤＮＡを、製造元の「高収率」プロトコルにしたがってＱｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｄｉ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、すべてのフラスコ（実験および対照）から抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ ＯｎｅＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）から得られた光学密度測定を使用して、溶出液を定量化した。得られたｃｅＤＮＡ抽出物を４℃で保存した。
前述のｃｅＤＮＡ抽出物は、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１：１０，０００希釈液で調製した未変性アガロース（１％アガロース、１×ＴＡＥ緩衝液）ゲル上でＴｒａｃｋＩｔ １ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダーと共に泳動した。続いて、ＵＶ／青色照明下でＧｂｏｘ Ｍｉｎｉ Ｉｍａｇｅｒを使用してゲルを可視化した。前述されるように、未変性ゲル上で泳動させたｃｅＤＮＡ試料中で２つの一次バンドが予想され、約５，５００ｂｐバンドは、単量体種を表し、約１１，０００ｂｐバンドは、二量体種に対応する。すべての変異体試料を試験し、未変性アガロースゲル上の予想される単量体バンドおよび二量体バンドを示した。変異体の代表的な試料の結果を図２８に示す。小規模産生のための推定の粗ＩＴＲ－変異体ｃｅＤＮＡおよび対照抽出物を、連結された制限消化および変性アガロースゲルを使用してさらにアッセイして、ｃｅＤＮＡを診断する二本鎖ＤＮＡ構造を確認した。各変異体ｃｅＤＮＡは、単一ＥｃｏＲ１制限部位を有するため、適切に形成された場合、ＥｃｏＲ１消化時に２つの特徴的な断片を産生すると予想される。高忠実度制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、製造元の指示にしたがって推定のｃｅＤＮＡ抽出物を消化した。ＮａｎｏＤｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用する分光光度定量化および未変性アガロースゲル分析により、溶出液中に検出可能なｃｅＤＮＡ／プラスミド様産物がないことが明らかになったため、模擬および増殖対照からの抽出物はアッセイされなかった。精製された消化材料をＱｉａｇｅｎ溶出緩衝液の代わりにヌクレアーゼを含まない水中で溶出したことを除いて、製造元の指示にしたがってＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、消化材料を精製した。アルカリ性アガロースゲル（０．８％アルカリ性アガロース）を平衡化緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、２００ｍＭ ＮａＯＨ）で４℃で一晩平衡化した。精製したｃｅＤＮＡ消化物と対応する未消化のｃｅＤＮＡ（合計１ｕｇ）の試料に１０倍の変性溶液（５０ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、試料を６５℃で１０分間加熱した。１０倍のローディング色素（ブロモフェノールブルー、５０％グリセロール）を各変性試料に添加し、混合した。ＴｒａｃｋＩｔ １ｋｂ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）も参照としてゲルにロードした。ゲルを４℃、定電圧（２５Ｖ）で約１８時間泳動した後、脱イオンＨ２Ｏでリンスし、１×ＴＡＥ（Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ、ＥＤＴＡ）緩衝液（ｐＨ ７．６）で２０分間穏やかに撹拌しながら中和した。次に、ゲルを１×ＴＡＥ／１ｘＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ溶液に、穏やかに撹拌しながら約１時間移した。次に、Ｇｂｏｘ Ｍｉｎｉ Ｉｍａｇｅｒ（Ｓｙｎｇｅｎｅ）を使用して、ＵＶ／青色照明下でゲルを可視化した。未切断の変性試料は、約１１，０００ｂｐで移動すると予想され、ＥｃｏＲＩ処理した試料は、２つのバンド（１つは約４，０００ｂｐおよび１つは約６，０００ｂｐ）を有すると予想された。
この実験では、すべての変異体試料が同様の結果を有していた。ＥｃｏＲ１処理した試料中の各試料レーンにおいて２つの重要なバンドを見ることができ、予想される約１１，０００ｂｐサイズで移動した未消化の変異体試料とは明確に対照的に、予想されるサイズで変性ゲル上で移動する。図２７は、変異体の代表的な試料の結果を示し、未消化の変異体試料中で目に見える単一バンドと比較して、各消化変異体試料について２つのバンドが背景上に見られる。したがって、変異体試料は、ｃｅＤＮＡを正しく形成すると思われる。
Ｃ．ヒト細胞培養物中の機能的発現
小規模産生プロセスによって産生された変異体ＩＴＲ ｃｅＤＮＡの機能性を評価するために、ＨＥＫ２９３細胞をいくつかの代表的な変異体ｃｅＤＮＡ試料でトランスフェクションした。活発に分裂ＨＥＫ２９３細胞を、ウェルあたり３×１０６個の細胞（８０％コンフルエント）で、９６ウェルマイクロタイタープレートに播種し、付着ＨＥＫ２９３培養のための以前に記載された条件で２４時間インキュベーションした。２４時間後、合計２００ｎｇの粗小規模ｃｅＤＮＡを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してトランスフェクションした。製造元の指示にしたがってトランスフェクション複合体を調製し、全量１０ｕＬのトランスフェクション複合体を使用して、以前に置かれたＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションした。すべての実験構築物および対照を、３回アッセイした。トランスフェクションした細胞を、前述の条件で７２時間インキュベーションした。７２時間後、９６ウェルプレートをインキュベーターから取り除き、手短に室温に平衡させた。ＯｎｅＧｌｏルシフェラーゼアッセイを実施した。オービタルシェーカー上で１０分後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍシリーズマイクロプレートリーダーを使用して、全発光を測定した。複製を平均化した。結果を図３０に示す。試験した変異体試料の各々は、ヒト細胞培養物中でルシフェラーゼを発現し、ｃｅＤＮＡが、正しく形成され、ヒト細胞の設定において各試料に対して発現されたことを示す。
実施例６：Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のみを含む構築物は、ｃｅＤＮＡを産生することができる
ＡＡＶ複製（Ｒｅｐ）遺伝子は、同じオープンリーディングフレームからの４つの非構造タンパク質または複製（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする。Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの移動度から推定される見かけの分子量に由来している（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８６．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．６０：８２３－８３２）。Ｒｅｐ７８／６８は、マップユニット５（Ｐ５）の転写プロモーターに由来するｍＲＮＡから翻訳される。Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、ウイルス複製起点内の同種結合部位を認識するウイルス複製開始タンパク質として機能し、末端分解部位で起点にニックを入れる。ニッキング事象は、ウイルスＤＮＡ合成を刺激する遊離の３’－ヒドロキシル基を提供する。ＤＮＡ結合および部位特異的エンドヌクレアーゼ活性に加えて、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８は、ヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼ活性を有することが示されている。Ｒｅｐ５２／４０タンパク質は、マップユニット１９（Ｐ１９）の転写プロモーターに由来するｍＲＮＡから翻訳される。Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０タンパク質はウイルス構築を媒介する。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質は、それぞれＰ５およびＰ１９プロモーターからスプライシングされたｍＲＮＡから翻訳されるという点で、より長い対応物とは異なる。スプライシングは、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質のカルボキシル末端から９２アミノ酸残基を切除し、それらをＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０のＣ末端に位置する９アミノ酸と置き換える。
Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のみの存在がｃｅＤＮＡ形成に十分であるか否かを決定するために実験を実行した。上記の実施例１に記載されているように、ｃｅＤＮＡ形成に及ぼすＲｅｐ５２／４０の欠失の影響を調査するために、点変異を加えて、ｐ１９プロモーター（Ｍ－＞ＧおよびＭ－＞Ｔ）によるＲｅｐ５２翻訳を排除した。したがって、Ｒｅｐ５２（例えば、アミノ酸２２５ Ｍ－＞ＧおよびＭ－＞Ｔ）点変異で修飾された構築物は、Ｒｅｐ７８からのｃｅＤＮＡ産物のみを示す。Ｒｅｐ６８がｃｅＤＮＡ形成に何らかの活性を有するか否かを決定するために、２つの追加の構築物が作製された。Ｒｅｐ６８ Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）およびＲｅｐ６８ Ｍｅｔ→Ｔｈｒ（Ｍ２２５Ｔ）変異は、内部翻訳部位およびｃ末端イントロン配列（上記のように９２アミノ酸残基および９アミノ酸での置換）を除去するために構築された。ニッカーゼ活性ドメイン（Ｙ１５６Ｆ）に点変異を有する追加の変異を作製した。図３２Ａおよび３２Ｂは、安定性の高いＤＮＡベクターおよび特徴的なバンドの存在を示す非変性ゲルを表し、本明細書に記載の方法を使用して単一のＲｅｐタンパク質で作製された安定性の高い閉端ＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）ベクターの存在を確認する。図３２Ａにおいて、野生型Ｒｅｐ７８をコードする核酸を使用した産生（レーン５）と比較して、Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）（レーン１）またはＲｅｐ Ｍｅｔ→Ｔｈｒ（Ｍ２２５Ｔ）（レーン２）のＲｅｐ７８の修飾をもつ修飾型Ｒｅｐ７８の核酸を使用してより大量のｃｅＤＮＡベクターが産生され、核酸はＲｅｐ７８タンパク質とＲｅｐ５２タンパク質の両方を発現する。Ｇｌｙ（Ｙ１５６Ｆ）（レーン３）またはニッカーゼ変異を有するＴｈｒ（Ｙ１５６Ｆ）（レーン４）の修飾を含むＲｅｐ７８結合変異ではｃｅＤＮＡベクターは産生されなかった。図３２Ｂはさらに、Ｒｅｐ６８ Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）およびＲｅｐ６８ Ｍｅｔ→Ｔｈｒ（Ｍ２２５Ｔ）変異も、Ｍｅｔ→Ｇｌｙ（Ｍ２２５Ｇ）またはＲｅｐ Ｍｅｔ→Ｔｈｒ（Ｍ２２５Ｔ）のＲｅｐ７８の修飾がありｃ末端イントロンが欠失する修飾型Ｒｅｐ７８の核酸を使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターの量以上のレベルまで、ｃｅＤＮＡベクターを産生したことを示す。

したがって、これらの実験は、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０が存在しなくても、Ｒｅｐ７８のみまたはＲｅｐ６８のみがｃｅＤＮＡ形成に十分であることを示した。
参考文献
特許、特許出願、国際特許出願および刊行物を含む、明細書および実施例に記載および開示されるすべての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
ＲＥＰ配列
配列番号５５８は、ＡＡＶ１からのＲｅｐ４０のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（配列番号５５８）
配列番号５５９は、ＡＡＶ２からのＲｅｐ４０のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５９）
配列番号５６０は、ＡＡＶ３ＡからのＲｅｐ４０のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ（配列番号５６０）
配列番号５６１は、ＡＡＶ３ＢからのＲｅｐ４０のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ（配列番号５６１）
配列番号５６２は、ＡＡＶ４からのＲｅｐ４０のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（配列番号５６２）
配列番号５６３は、ＡＡＶ５からのＲｅｐ４０のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｃｙｓ
Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｓｎ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｒｐ（配列番号５６３）
配列番号５６４は、ＡＡＶ６からのＲｅｐ４０のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（配列番号５６４）
配列番号５６５は、ＡＡＶ７からのＲｅｐ４０のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（配列番号５６５）
配列番号５６６は、ＡＡＶ８からのＲｅｐ４０のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（配列番号５６６）
配列番号５６７は、配列番号５５８～５６６の共通アミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｘａａ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｘａａ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（配列番号５６７）
配列番号５６８は、ＡＡＶ１からのＲｅｐ５２のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５６８）
配列番号５６９は、ＡＡＶ２からのＲｅｐ５２のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５６９）
配列番号５７０は、ＡＡＶ３ＡからのＲｅｐ５２のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｃｙｓ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５７０）
配列番号５７１は、ＡＡＶ３ＢからのＲｅｐ５２のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｃｙｓ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５７１）
配列番号５７２は、ＡＡＶ４からのＲｅｐ５２のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｃｙｓ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５７２）
配列番号５７３は、ＡＡＶ５からのＲｅｐ５２のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ
Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｃｙｓ
Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｓｎ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ
Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｐ
Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｙ
Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｓｐ
Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５７３）
配列番号５７４は、ＡＡＶ６からのＲｅｐ５２のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５７４）
配列番号５７５は、ＡＡＶ７からのＲｅｐ５２のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５７５）
配列番号５７６は、ＡＡＶ８からのＲｅｐ５２のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５７６）
配列番号５７７は、配列番号５６８～５７６の共通アミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｘａａ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｘａａ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｘａａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｘａａ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｘａａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｘａａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｘａａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｘａａ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７７）
配列番号５７８は、ＡＡＶ１からのＲｅｐ６８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（配列番号５７８）
配列番号５７９は、ＡＡＶ２からのＲｅｐ６８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７９）
配列番号５８０は、ＡＡＶ３ＡからのＲｅｐ６８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ（配列番号５８０）
配列番号５８１は、ＡＡＶ３ＢからのＲｅｐ６８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｐｈｅ（配列番号５８１）
配列番号５８２は、ＡＡＶ４からのＲｅｐ６８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（配列番号５８２）
配列番号５８３は、ＡＡＶ５からのＲｅｐ６８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ
Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ
Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｒｐ（配列番号５８３）
配列番号５８４は、ＡＡＶ６からのＲｅｐ６８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（配列番号５８４）
配列番号５８５は、ＡＡＶ７からのＲｅｐ６８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（配列番号５８５）
配列番号５８６は、ＡＡＶ８からのＲｅｐ６８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ
Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ
Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ
Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８６）
配列番号５８７は、ＡＡＶ１からのＲｅｐ７８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５８７）
配列番号５８８は、ＡＡＶ２からのＲｅｐ７８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８８）
配列番号５８９は、ＡＡＶ３ＡのＲｅｐ７８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｃｙｓ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５８９）
配列番号５９０は、ＡＡＶ３ＢからのＲｅｐ７８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｃｙｓ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５９０）
配列番号５９１は、ＡＡＶ４からのＲｅｐ７８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｍｅｔ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｃｙｓ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５９１）
配列番号５９２は、ＡＡＶ５からのＲｅｐ７８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｙ
Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｇｌｎ
Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｒｇ
Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｎ
Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｌａ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ
Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ
Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ
Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｓｐ
Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ
Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｎ
Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｔｒｐ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５９２）
配列番号５９３は、ＡＡＶ６からのＲｅｐ７８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｓｐ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５９３）
配列番号５９４は、ＡＡＶ７からのＲｅｐ７８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｍｅｔ
Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ（配列番号５９４）
配列番号５９５は、ＡＡＶ８からのＲｅｐ７８のアミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ
Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ
Ａｌａ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ
Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ
Ｔｒｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ
Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ
Ｔｈｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ
Ｖａｌ Ａｒｇ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ
Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ
Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ
Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ
Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ（配列番号５９５）
配列番号５９６は、配列番号５８７～５９５のＲｅｐ７８の共通アミノ酸配列である。
Ｍｅｔ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ
Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ
Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ
Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｘａａ Ｘａａ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｌｅｕ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ
Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ
Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｉｌｅ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ
Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ａｓｎ
Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ａｒｇ Ｔｙｒ
Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｇｌｎ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｙｓ
Ｉｌｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｘａａ Ｓｅｒ
Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ａｌａ
Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｐｒｏ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｔｒｐ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｓｐ
Ｃｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｒｇ
Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｖａｌ
Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｍｅｔ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ
Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｌａ
Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ａｌａ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｓｐ
Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｈｉｓ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｘａａ Ｇｌｎ Ｍｅｔ Ｌｅｕ
Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ａｓｎ Ｘａａ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｃｙｓ
Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｘａａ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｘａａ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｓｅｒ
Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｘａａ Ｖａｌ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｘａａ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｘａａ
Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｃｙｓ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｎ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
単一のＲｅｐタンパク質を使用して本明細書に記載の方法にしたがって産生されるｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞から単離され、その存在は、宿主細胞から単離されたＤＮＡをｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を変性および未変性のゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的ＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的ＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することによって確認され得る。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
ベクターポリヌクレオチドから得られるＤＮＡベクターであって、前記ベクターポリヌクレオチドが、第１の逆位末端反復ＤＮＡポリヌクレオチド配列（ＩＴＲ）と第２のＩＴＲとの間に作動可能に配置された異種核酸をコードし、前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、単一種のＲｅｐタンパク質の存在下で、細胞における前記ＤＮＡベクターの複製を誘導するためのＡＡＶ Ｒｅｐ結合配列に対応するヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡベクターが、
ａ．少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＲｅｐタンパク質の存在下において、前記細胞内の前記ＤＮＡベクターの産生を誘導するのに有効な条件下および十分な時間、ウイルスカプシドコード配列を欠く前記ベクターポリヌクレオチドを内包する細胞の集団をインキュベーションするステップであって、前記細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まず、他種のＲｅｐタンパク質が存在しない、インキュベーションするステップと、
ｂ．その結果得られるＤＮＡベクターを前記細胞から採取および単離するステップと、を含む方法から得ることができる、ＤＮＡベクター。
(項目２)
前記細胞が、第２のＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列と接触していない、項目１に記載のＤＮＡベクター。
(項目３)
前記単一のＲｅｐタンパク質が、ヘリカーゼ、リガーゼ、およびＡＴＰアーゼの機能性をさらに有する、項目１に記載のＤＮＡベクター。
(項目４)
前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質である、項目１に記載のＤＮＡベクター。
(項目５)
前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２ Ｒｅｐタンパク質のいずれかから選択される、項目４に記載のＤＮＡベクター。
(項目６)
前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ６８タンパク質である、項目４に記載のＤＮＡベクター。
(項目７)
前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８タンパク質である、項目４に記載のＤＮＡベクター。
(項目８)
前記Ｒｅｐ７８タンパク質が、Ｒｅｐ５２の機能的翻訳開始コドンを有しない変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列によってコードされる、項目７に記載のＤＮＡベクター。
(項目９)
前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０のアミノ酸位置２２５に変異を含む変異Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする、項目８に記載のＤＮＡベクター。
(項目１０)
配列番号５３０のアミノ酸位置２２５が、グリシン（Ｇｌｙ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）に変異している、項目９に記載のＤＮＡベクター。
(項目１１)
前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０の配列を含むか、または配列番号５３０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有し、第２のＲｅｐタンパク質を発現しない、項目８に記載のＤＮＡベクター。
(項目１２)
前記ＩＴＲが、パルボウイルスＩＴＲである、項目１に記載のＤＮＡベクター。
(項目１３)
前記パルボウイルスが、ディペンドウイルスである、項目１２に記載のＤＮＡベクター。
(項目１４)
前記ＤＮＡベクターが、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含二本鎖ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）である、項目１に記載のＤＮＡベクター。
(項目１５)
前記細胞から単離された前記ｃｅＤＮＡベクターの存在が、前記細胞から単離されたＤＮＡを、前記ＤＮＡベクター上に単一の認識部位を有する制限酵素で消化し、前記消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することによって確認され得る、項目１４に記載のＤＮＡベクター。
(項目１６)
ベクターポリヌクレオチドから得られるＤＮＡベクターであって、前記ベクターポリヌクレオチドが、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に配置された異種核酸をコードし、前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む機能的ＩＴＲであり、単一種のＲｅｐタンパク質の存在が、細胞における前記ベクターポリヌクレオチドの複製および前記ＤＮＡベクターの産生を誘導し、前記ＤＮＡベクターが、
ａ．少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＲｅｐタンパク質の存在下において、前記細胞内の前記ＤＮＡベクターの産生を誘導するのに有効な条件下および十分な時間、ウイルスカプシドコード配列を欠く前記ベクターポリヌクレオチドを内包する細胞の集団をインキュベーションするステップであって、前記細胞が、前記細胞内でＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０をコードする任意の核酸を含まず、他種のＲｅｐが前記細胞において存在しない、インキュベーションするステップと、
ｂ．前記ＤＮＡベクターを前記細胞から採取および単離するステップと、を含む方法から得ることができる、ＤＮＡベクター。
(項目１７)
少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＲｅｐタンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターを生成するためのポリヌクレオチド。
(項目１８)
前記Ｒｅｐタンパク質が、ヘリカーゼ、リガーゼ、およびＡＴＰアーゼの機能性を有する、項目１７に記載のポリヌクレオチド。
(項目１９)
前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質である、項目１７に記載のポリヌクレオチド。
(項目２０)
前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２ Ｒｅｐタンパク質のいずれかから選択される、項目１９に記載のポリヌクレオチド。
(項目２１)
前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質である、項目１９に記載のポリヌクレオチド。
(項目２２)
前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８タンパク質である、項目１９に記載のポリヌクレオチド。
(項目２３)
前記Ｒｅｐ７８タンパク質が、Ｒｅｐ５２の機能的開始コドンを有しない変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列によってコードされる、項目２２に記載のポリヌクレオチド。
(項目２４)
前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０のアミノ酸位置２２５に変異を含む変異Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする、項目２３に記載のポリヌクレオチド。
(項目２５)
配列番号５３０のアミノ酸２２５が、グリシン（Ｇｌｙ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）に変異している、項目２４に記載のポリヌクレオチド。
(項目２６)
前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０の配列を含むか、または配列番号５３０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有し、第２のＲｅｐタンパク質を発現しない、項目２３に記載のポリヌクレオチド。
(項目２７)
前記少なくとも１つの発現制御配列が、ＩＥプロモーター、ΔＩＥプロモーター、またはＣＭＶプロモーターをコードする、項目１７に記載のポリヌクレオチド。
(項目２８)
前記ＤＮＡベクターが、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含二本鎖ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）である、項目１７に記載のポリヌクレオチド。
(項目２９)
前記細胞から単離された前記ｃｅＤＮＡベクターの存在が、前記細胞から単離されたＤＮＡを、前記ＤＮＡベクター上に単一の認識部位を有する制限酵素で消化し、前記消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することによって確認され得る、項目２８に記載のポリヌクレオチド。
(項目３０)
ＤＮＡベクターを産生する方法であって、
細胞を、
（１）少なくとも１つの発現制御配列に連結された、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８）をコードするヌクレオチド配列であって、前記細胞が、いかなる他種のＲｅｐタンパク質も発現せず、いかなる他種のＲｅｐタンパク質とも接触していない、ヌクレオチド配列と、
（２）二本鎖ＤＮＡ構築物であって、
発現カセットと、
前記発現カセットの上流（５´末端）にある第１のＩＴＲと、
前記発現カセットの下流（３´末端）にある第２のＩＴＲと、を含む、二本鎖ＤＮＡ構築物と、接触させることと、
（３）前記ＤＮＡベクターを採取することと、を含む、方法。
(項目３１)
前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質である、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２ Ｒｅｐタンパク質のいずれかから選択される、項目３１に記載の方法。
(項目３３)
前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ６８タンパク質である、項目３１に記載の方法。
(項目３４)
前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８タンパク質である、項目３１に記載の方法。
(項目３５)
Ｒｅｐ７８タンパク質が、Ｒｅｐ５２の機能的開始コドンを有しない変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列によってコードされる、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０のアミノ酸位置２２５に変異を含む変異Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする、項目３５に記載の方法。
(項目３７)
配列番号５３０のアミノ酸２２５が、グリシン（Ｇｌｙ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）に変異している、項目３６に記載の方法。
(項目３８)
前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０の配列を含むか、または配列番号５３０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する、項目３５に記載の方法。
(項目３９)
前記少なくとも１つの発現制御配列が、ＩＥプロモーター、ΔＩＥプロモーター、またはＣＭＶプロモーターをコードする、項目３０に記載の方法。
(項目４０)
前記二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子である、項目３０～３９のいずれか一項に記載の方法。
(項目４１)
前記発現カセットの上流の前記第１のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、項目３０～４０のいずれか一項に記載の方法。
(項目４２)
前記発現カセットの上流の前記第１のＩＴＲおよび前記発現カセットの下流の前記第２のＩＴＲが、対称もしくは実質的に対称であるか、または互いに非対称である、項目３０～４１のいずれか一項に記載の方法。
(項目４３)
前記ＩＴＲ配列が、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／６５２４２の表２、４Ａ、４Ｂおよび５に列挙されたもののうちのいずれかから選択される、項目３０～４２のいずれか一項に記載の方法。
(項目４４)
前記野生型ＩＴＲが、配列番号５１のポリヌクレオチドを含む、項目４１に記載の方法。
(項目４５)
前記発現カセットの下流の前記第２のＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、項目３０～４４のいずれか一項に記載の方法。
(項目４６)
前記修飾型ＩＴＲが、配列番号２のポリヌクレオチドを含む、項目４５に記載の方法。
(項目４７)
前記発現カセットの上流の前記第１のＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、項目３０～４０のいずれか一項に記載の方法。
(項目４８)
前記修飾型ＩＴＲが、配列番号５２のポリヌクレオチドを含む、項目４７に記載の方法。
(項目４９)
前記発現カセットの下流の前記第２のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、項目４７～４８のいずれか一項に記載の方法。
(項目５０)
前記野生型ＩＴＲが、配列番号１のポリヌクレオチドを含む、項目４９に記載の方法。
(項目５１)
前記ＩＴＲが、複製可能である、項目３０～５０のいずれか一項に記載の方法。
(項目５２)
前記ＩＴＲが、ＡＡＶ ＩＴＲである、項目３０～５１のいずれか一項に記載の方法。
(項目５３)
前記発現カセットが、シス調節エレメントを含む、項目３０～５２のいずれか一項に記載の方法。
(項目５４)
前記シス調節エレメントが、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、項目５３に記載の方法。
(項目５５)
前記転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、項目５４に記載の方法。
(項目５６)
前記発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターをさらに含む、項目３０～３９のいずれかに記載の方法。
(項目５７)
前記発現カセットが、配列番号３、配列番号７、配列番号８および配列番号９のポリヌクレオチドを含む、項目３０～５６のいずれか一項に記載の方法。
(項目５８)
前記発現カセットが、外因性配列をさらに含む、項目３０～５７のいずれか一項に記載の方法。
(項目５９)
前記外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、項目５８に記載の方法。
(項目６０)
前記外因性配列が、タンパク質をコードする、項目５８または項目５９に記載の方法。
(項目６１)
前記外因性配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、項目５８に記載の方法。
(項目６２)
前記ＤＮＡベクターが、直鎖状かつ連続的な構造を有する、項目３０～６１のいずれかに記載の方法。
(項目６３)
項目３０～６２のいずれかに記載の方法によって生成される、ＤＮＡベクター。
(項目６４)
項目６３に記載のＤＮＡベクターと、任意選択的に、賦形剤と、を含む、医薬組成物。
(項目６５)
ＤＮＡベクターを産生するためのキットであって、
少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列、または調節スイッチ、あるいはその両方を挿入するための少なくとも１つの制限部位を含む、発現構築物であって、前記少なくとも１つの制限部位が、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に作動可能に配置され、前記非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、発現構築物と、
単一種のＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、昆虫細胞において前記単一種のＲｅｐタンパク質を発現するのに好適である、ベクターと、を含む、キット。
(項目６６)
項目６３に記載のＤＮＡベクターを産生するのに好適である、項目６５に記載のキット。
(項目６７)
ウイルスカプシドコード配列を欠く昆虫細胞の集団をさらに含み、単一種のＲｅｐタンパク質の存在下で、前記ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導することができる、項目６５または項目６６に記載のキット。
(項目６８)
少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８）をコードするヌクレオチド配列であって、前記細胞が、いかなる他のパルボウイルスＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０）も発現せず、いかなる他種のＲｅｐタンパク質とも接触していない、ヌクレオチド配列と、任意選択的に、発現カセット、前記発現カセットの上流（５’末端）にある第１のＩＴＲ、および前記発現カセットの下流（３’末端）にある第２のＩＴＲを含む二本鎖ＤＮＡ構築物と、を含む、細胞。
(項目６９)
前記細胞が、昆虫細胞である、項目６８に記載の細胞。
(項目７０)
前記昆虫細胞が、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞からなる群から選択される、項目６９に記載の細胞。
(項目７１)
前記昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞である、項目７０に記載の細胞。
(項目７２)
前記昆虫細胞が、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞である、項目７０に記載の細胞。
(項目７３)
前記細胞が、哺乳動物細胞である、項目６８に記載の細胞。
(項目７４)
前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、単球、ならびに成熟および未成熟の樹状細胞からなる群から選択される、項目７３に記載の細胞。
(項目７５)
前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３である、項目７４に記載の細胞。
(項目７６)
前記単一種のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８をコードする、項目６８に記載の細胞。
(項目７７)
前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０の機能的開始コドンを有しない、項目７６に記載の細胞。
(項目７８)
前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする、項目７７に記載の細胞。
(項目７９)
前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ６８タンパク質をコードする、項目７７に記載の細胞。
(項目８０)
前記ヌクレオチド配列が、配列番号５３０のアミノ酸位置２２５に変異を含む変異Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８タンパク質をコードする、項目７７に記載の細胞。
(項目８１)
配列番号５３０のアミノ酸２２５（メチオニン）が、グリシン（Ｇｌｙ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）に変異している、項目８０に記載の方法。
(項目８２)
前記ヌクレオチド配列が、カルボキシ末端の選択的スプライシング部位における１つ以上の修飾をさらに含み、Ｒｅｐ６８の産生につながるスプライシング事象を防止し、それにより、Ｒｅｐ７８の産生のみを可能にする、項目８０に記載の方法。
(項目８３)
前記ヌクレオチド配列が、全長であり、前記カルボキシ末端に無傷の選択的スプライシング部位を含有し、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の両方の産生をもたらす、項目７７に記載の細胞。
(項目８４)
カルボキシ末端イントロン配列の欠失を含有する前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ６８の産生のみをもたらす、項目７７に記載の細胞。
(項目８５)
前記ヌクレオチド配列が、配列番号５３０の配列を含むか、または配列番号５３０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する、項目７７に記載の細胞。

Claims (85)

  1. ベクターポリヌクレオチドから得られるＤＮＡベクターであって、前記ベクターポリヌクレオチドが、第１の逆位末端反復ＤＮＡポリヌクレオチド配列（ＩＴＲ）と第２のＩＴＲとの間に作動可能に配置された異種核酸をコードし、前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、単一種のＲｅｐタンパク質の存在下で、細胞における前記ＤＮＡベクターの複製を誘導するためのＡＡＶ Ｒｅｐ結合配列に対応するヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡベクターが、
    ａ．少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＲｅｐタンパク質の存在下において、前記細胞内の前記ＤＮＡベクターの産生を誘導するのに有効な条件下および十分な時間、ウイルスカプシドコード配列を欠く前記ベクターポリヌクレオチドを内包する細胞の集団をインキュベーションするステップであって、前記細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まず、他種のＲｅｐタンパク質が存在しない、インキュベーションするステップと、
    ｂ．その結果得られるＤＮＡベクターを前記細胞から採取および単離するステップと、を含む方法から得ることができる、ＤＮＡベクター。
  2. 前記細胞が、第２のＲｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列と接触していない、請求項１に記載のＤＮＡベクター。
  3. 前記単一のＲｅｐタンパク質が、ヘリカーゼ、リガーゼ、およびＡＴＰアーゼの機能性をさらに有する、請求項１に記載のＤＮＡベクター。
  4. 前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質である、請求項１に記載のＤＮＡベクター。
  5. 前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２ Ｒｅｐタンパク質のいずれかから選択される、請求項４に記載のＤＮＡベクター。
  6. 前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ６８タンパク質である、請求項４に記載のＤＮＡベクター。
  7. 前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８タンパク質である、請求項４に記載のＤＮＡベクター。
  8. 前記Ｒｅｐ７８タンパク質が、Ｒｅｐ５２の機能的翻訳開始コドンを有しない変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列によってコードされる、請求項７に記載のＤＮＡベクター。
  9. 前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０のアミノ酸位置２２５に変異を含む変異Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする、請求項８に記載のＤＮＡベクター。
  10. 配列番号５３０のアミノ酸位置２２５が、グリシン（Ｇｌｙ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）に変異している、請求項９に記載のＤＮＡベクター。
  11. 前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０の配列を含むか、または配列番号５３０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有し、第２のＲｅｐタンパク質を発現しない、請求項８に記載のＤＮＡベクター。
  12. 前記ＩＴＲが、パルボウイルスＩＴＲである、請求項１に記載のＤＮＡベクター。
  13. 前記パルボウイルスが、ディペンドウイルスである、請求項１２に記載のＤＮＡベクター。
  14. 前記ＤＮＡベクターが、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含二本鎖ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）である、請求項１に記載のＤＮＡベクター。
  15. 前記細胞から単離された前記ｃｅＤＮＡベクターの存在が、前記細胞から単離されたＤＮＡを、前記ＤＮＡベクター上に単一の認識部位を有する制限酵素で消化し、前記消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することによって確認され得る、請求項１４に記載のＤＮＡベクター。
  16. ベクターポリヌクレオチドから得られるＤＮＡベクターであって、前記ベクターポリヌクレオチドが、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に作動可能に配置された異種核酸をコードし、前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む機能的ＩＴＲであり、単一種のＲｅｐタンパク質の存在が、細胞における前記ベクターポリヌクレオチドの複製および前記ＤＮＡベクターの産生を誘導し、前記ＤＮＡベクターが、
    ａ．少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＲｅｐタンパク質の存在下において、前記細胞内の前記ＤＮＡベクターの産生を誘導するのに有効な条件下および十分な時間、ウイルスカプシドコード配列を欠く前記ベクターポリヌクレオチドを内包する細胞の集団をインキュベーションするステップであって、前記細胞が、前記細胞内でＲｅｐ５２またはＲｅｐ４０をコードする任意の核酸を含まず、他種のＲｅｐが前記細胞において存在しない、インキュベーションするステップと、
    ｂ．前記ＤＮＡベクターを前記細胞から採取および単離するステップと、を含む方法から得ることができる、ＤＮＡベクター。
  17. 少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＲｅｐタンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡベクターを生成するためのポリヌクレオチド。
  18. 前記Ｒｅｐタンパク質が、ヘリカーゼ、リガーゼ、およびＡＴＰアーゼの機能性を有する、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  19. 前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質である、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  20. 前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２ Ｒｅｐタンパク質のいずれかから選択される、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  21. 前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐタンパク質である、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  22. 前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８タンパク質である、請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
  23. 前記Ｒｅｐ７８タンパク質が、Ｒｅｐ５２の機能的開始コドンを有しない変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列によってコードされる、請求項２２に記載のポリヌクレオチド。
  24. 前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０のアミノ酸位置２２５に変異を含む変異Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
  25. 配列番号５３０のアミノ酸２２５が、グリシン（Ｇｌｙ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）に変異している、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
  26. 前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０の配列を含むか、または配列番号５３０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有し、第２のＲｅｐタンパク質を発現しない、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
  27. 前記少なくとも１つの発現制御配列が、ＩＥプロモーター、ΔＩＥプロモーター、またはＣＭＶプロモーターをコードする、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  28. 前記ＤＮＡベクターが、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含二本鎖ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）である、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
  29. 前記細胞から単離された前記ｃｅＤＮＡベクターの存在が、前記細胞から単離されたＤＮＡを、前記ＤＮＡベクター上に単一の認識部位を有する制限酵素で消化し、前記消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状かつ非連続的なＤＮＡと比較して直鎖状かつ連続的なＤＮＡの特徴的なバンドの存在を確認することによって確認され得る、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
  30. ＤＮＡベクターを産生する方法であって、
    細胞を、
    （１）少なくとも１つの発現制御配列に連結された、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８）をコードするヌクレオチド配列であって、前記細胞が、いかなる他種のＲｅｐタンパク質も発現せず、いかなる他種のＲｅｐタンパク質とも接触していない、ヌクレオチド配列と、
    （２）二本鎖ＤＮＡ構築物であって、
    発現カセットと、
    前記発現カセットの上流（５´末端）にある第１のＩＴＲと、
    前記発現カセットの下流（３´末端）にある第２のＩＴＲと、を含む、二本鎖ＤＮＡ構築物と、接触させることと、
    （３）前記ＤＮＡベクターを採取することと、を含む、方法。
  31. 前記Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質である、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２ Ｒｅｐタンパク質のいずれかから選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ６８タンパク質である、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質が、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８タンパク質である、請求項３１に記載の方法。
  35. Ｒｅｐ７８タンパク質が、Ｒｅｐ５２の機能的開始コドンを有しない変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０のアミノ酸位置２２５に変異を含む変異Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする、請求項３５に記載の方法。
  37. 配列番号５３０のアミノ酸２２５が、グリシン（Ｇｌｙ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）に変異している、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記変異Ｒｅｐ７８ヌクレオチド配列が、配列番号５３０の配列を含むか、または配列番号５３０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する、請求項３５に記載の方法。
  39. 前記少なくとも１つの発現制御配列が、ＩＥプロモーター、ΔＩＥプロモーター、またはＣＭＶプロモーターをコードする、請求項３０に記載の方法。
  40. 前記二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項３０～３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記発現カセットの上流の前記第１のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、請求項３０～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記発現カセットの上流の前記第１のＩＴＲおよび前記発現カセットの下流の前記第２のＩＴＲが、対称もしくは実質的に対称であるか、または互いに非対称である、請求項３０～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記ＩＴＲ配列が、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１８／６５２４２の表２、４Ａ、４Ｂおよび５に列挙されたもののうちのいずれかから選択される、請求項３０～４２のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記野生型ＩＴＲが、配列番号５１のポリヌクレオチドを含む、請求項４１に記載の方法。
  45. 前記発現カセットの下流の前記第２のＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、請求項３０～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記修飾型ＩＴＲが、配列番号２のポリヌクレオチドを含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記発現カセットの上流の前記第１のＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、請求項３０～４０のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記修飾型ＩＴＲが、配列番号５２のポリヌクレオチドを含む、請求項４７に記載の方法。
  49. 前記発現カセットの下流の前記第２のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、請求項４７～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記野生型ＩＴＲが、配列番号１のポリヌクレオチドを含む、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記ＩＴＲが、複製可能である、請求項３０～５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記ＩＴＲが、ＡＡＶ ＩＴＲである、請求項３０～５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記発現カセットが、シス調節エレメントを含む、請求項３０～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記シス調節エレメントが、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 前記転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項５４に記載の方法。
  56. 前記発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターをさらに含む、請求項３０～３９のいずれかに記載の方法。
  57. 前記発現カセットが、配列番号３、配列番号７、配列番号８および配列番号９のポリヌクレオチドを含む、請求項３０～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. 前記発現カセットが、外因性配列をさらに含む、請求項３０～５７のいずれか一項に記載の方法。
  59. 前記外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記外因性配列が、タンパク質をコードする、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
  61. 前記外因性配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、請求項５８に記載の方法。
  62. 前記ＤＮＡベクターが、直鎖状かつ連続的な構造を有する、請求項３０～６１のいずれかに記載の方法。
  63. 請求項３０～６２のいずれかに記載の方法によって生成される、ＤＮＡベクター。
  64. 請求項６３に記載のＤＮＡベクターと、任意選択的に、賦形剤と、を含む、医薬組成物。
  65. ＤＮＡベクターを産生するためのキットであって、
    少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列、または調節スイッチ、あるいはその両方を挿入するための少なくとも１つの制限部位を含む、発現構築物であって、前記少なくとも１つの制限部位が、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に作動可能に配置され、前記非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、発現構築物と、
    単一種のＲｅｐタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、昆虫細胞において前記単一種のＲｅｐタンパク質を発現するのに好適である、ベクターと、を含む、キット。
  66. 請求項６３に記載のＤＮＡベクターを産生するのに好適である、請求項６５に記載のキット。
  67. ウイルスカプシドコード配列を欠く昆虫細胞の集団をさらに含み、単一種のＲｅｐタンパク質の存在下で、前記ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導することができる、請求項６５または請求項６６に記載のキット。
  68. 少なくとも１つの発現制御配列に作動可能に連結された、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する単一種のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８）をコードするヌクレオチド配列であって、前記細胞が、いかなる他のパルボウイルスＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０）も発現せず、いかなる他種のＲｅｐタンパク質とも接触していない、ヌクレオチド配列と、任意選択的に、発現カセット、前記発現カセットの上流（５’末端）にある第１のＩＴＲ、および前記発現カセットの下流（３’末端）にある第２のＩＴＲを含む二本鎖ＤＮＡ構築物と、を含む、細胞。
  69. 前記細胞が、昆虫細胞である、請求項６８に記載の細胞。
  70. 前記昆虫細胞が、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ細胞、およびＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞からなる群から選択される、請求項６９に記載の細胞。
  71. 前記昆虫細胞が、Ｓｆ９細胞である、請求項７０に記載の細胞。
  72. 前記昆虫細胞が、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞である、請求項７０に記載の細胞。
  73. 前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項６８に記載の細胞。
  74. 前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ－７、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐｌＡ、９１１、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＭｅＷｏ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ａ５４９、ＨＴ１０８０、単球、ならびに成熟および未成熟の樹状細胞からなる群から選択される、請求項７３に記載の細胞。
  75. 前記哺乳動物細胞が、ＨＥＫ２９３である、請求項７４に記載の細胞。
  76. 前記単一種のＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ７８および／またはＲｅｐ６８をコードする、請求項６８に記載の細胞。
  77. 前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ５２またはＲｅｐ４０の機能的開始コドンを有しない、請求項７６に記載の細胞。
  78. 前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ７８タンパク質をコードする、請求項７７に記載の細胞。
  79. 前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ６８タンパク質をコードする、請求項７７に記載の細胞。
  80. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号５３０のアミノ酸位置２２５に変異を含む変異Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８タンパク質をコードする、請求項７７に記載の細胞。
  81. 配列番号５３０のアミノ酸２２５（メチオニン）が、グリシン（Ｇｌｙ）またはスレオニン（Ｔｈｒ）に変異している、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記ヌクレオチド配列が、カルボキシ末端の選択的スプライシング部位における１つ以上の修飾をさらに含み、Ｒｅｐ６８の産生につながるスプライシング事象を防止し、それにより、Ｒｅｐ７８の産生のみを可能にする、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記ヌクレオチド配列が、全長であり、前記カルボキシ末端に無傷の選択的スプライシング部位を含有し、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の両方の産生をもたらす、請求項７７に記載の細胞。
  84. カルボキシ末端イントロン配列の欠失を含有する前記ヌクレオチド配列が、Ｒｅｐ６８の産生のみをもたらす、請求項７７に記載の細胞。
  85. 前記ヌクレオチド配列が、配列番号５３０の配列を含むか、または配列番号５３０に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、少なくともＤＮＡ結合およびＤＮＡニッキング機能性を有する、請求項７７に記載の細胞。
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