KR20240049821A - 바큘로바이러스 발현 시스템 - Google Patents

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KR20240049821A
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통야오 리우
에이제이 마고디아
필립 자카스
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바이오버라티브 테라퓨틱스 인크.
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Abstract

원하는 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템이 본원에 제공된다. 일 양태에서, 원하는 단백질은 바이러스 파보비리다에(Parvoviridae) 과의 구성원의 게놈으로부터 유래된 야생형 및/또는 절두된 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자이다.

Description

바큘로바이러스 발현 시스템
관련 출원
본 출원은 2021 년 8 월 23 일에 출원된 국제 출원 번호 PCT/US2021/047218, 및 2022 년 2 월 14 일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/310,038에 대한 우선권을 주장하며, 이들의 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록의 참조
ASCII 텍스트 파일로 전자 제출된 서열 목록(명칭: 732841_SA9-474BPC_ST26.xml; 크기: 86.2 KB; 및 생성 일자: 2022 년 8 월 17 일)의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
유전자 요법은 다양한 질환을 치료하는 지속적인 수단에 대한 잠재력을 제공한다. 유전자 요법 치료의 최근 개발에서는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 사용을 이용한다. 현재 몇몇 기술이 유전자 요법 벡터를 생산하는 데 사용되고 있다.
예를 들어, 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템(BEVS)은 유전자 요법 벡터의 생산을 위해 확립된 시스템이다. 이 시스템에서는, 곤충 숙주 세포가 재조합 바큘로바이러스로 감염된다. 곤충 숙주 세포는 재조합 바큘로바이러스에 의해 인코딩된 산물을 생산하기 위해, 필요한 단백질 가공 기구(protein processing machinery)를 제공한다. BEVS는 백신, 치료 단백질, 단백질 결정학, 및 기초 및 응용 연구용 산물을 포함하는, 다수의 상이한 적용을 위한 제품을 생산하는 데 사용되어 왔다. 유전자 요법을 위한 바이러스 벡터를 생산할 때, 대개 몇몇 바큘로바이러스 발현 벡터가 사용되며 곤충 숙주 세포 내로 감염된다. 바큘로바이러스 발현 벡터 각각의 생성은 시간 소모적이며, 생산 비용을 급등시킨다.
따라서, 기존 시스템의 한계를 피하면서, 개선된 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 대한 필요가 당업계에 존재한다.
바큘로바이러스 셔틀 벡터(박미드(bacmid)) 및/또는 치료 약물 제품을 생산하도록 조작된 안정 세포주를 포함하는 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템이 본원에 제공된다. 본원에 제공되는 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템은 2 개 이상의 외래 서열 삽입 부위를 포함하는 재조합 박미드, 및 외래 서열 삽입 부위로의 외래 서열(예를 들어, 이종 유전자)의 삽입을 매개할 수 있는 하나 이상의 공여체 벡터를 포함한다.
일 양태에서, 다음을 포함하는 박미드가 본원에 제공된다: 박테리아 레플리콘; 선택 가능한 마커 서열; 트랜스포존의 삽입을 위한 제1 우선 표적 부위를 포함하는 제1 리포터 유전자; 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 리포터 유전자; 및 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 제2 우선 표적 부위.
소정의 예시적 구현예에서, 박테리아 레플리콘은 카피수가 적은 레플리콘이다. 소정의 예시적 구현예에서, 카피수가 적은 레플리콘은 mini-F 레플리콘이다.
소정의 예시적 구현예에서, 선택 가능한 마커 서열은 항생제 저항성 유전자를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 항생제 저항성 유전자는 카나마이신 저항성 유전자이다.
소정의 예시적 구현예에서, 제1 리포터 유전자는 발색성 기질을 대사할 수 있는 효소를 인코딩한다. 소정의 예시적 구현예에서, 효소는 LacZα 또는 이의 기능적 부분이다. 소정의 예시적 구현예에서, 발색성 기질은 블루-gal 또는 X-gal이다.
소정의 예시적 구현예에서, 트랜스포존의 삽입을 위한 제1 우선 표적 부위는 제1 리포터 유전자의 리딩 프레임을 파괴하지 않는다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 우선 표적 부위는 박테리아 트랜스포존에 대한 부착 부위이다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 우선 표적 부위는 T7 트랜스포존에 대한 부착 부위이다. 소정의 예시적 구현예에서, 트랜스포존은 T7 트랜스포존이다.
소정의 예시적 구현예에서, 제2 리포터 유전자는 형광 단백질을 인코딩한다. 소정의 예시적 구현예에서, 형광 단백질은 적색 형광 단백질이다.
소정의 예시적 구현예에서, 바큘로바이러스-유도성 프로모터는 39K 프로모터이다.
소정의 예시적 구현예에서, 제2 우선 표적 부위는 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개된다.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 박미드가 본원에 제공된다: mini-F 레플리콘; 항생제 저항성 유전자; T7 트랜스포존에 대한 부착 부위를 포함하는 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분; 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및 LoxP 부위 또는 이의 변이체.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공된다: 박테리아 레플리콘; 제1 선택 가능한 마커 서열; 제1 리포터 유전자 내로 삽입된 이종 서열로서, 제1 리포터 유전자의 리딩 프레임을 파괴하는 삽입된 이종 서열; 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 리포터 유전자; 및 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 우선 표적 부위.
소정의 예시적 구현예에서, 이종 서열은 이종 유전자를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 이종 유전자는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 이종 서열은 발현 제어 서열을 추가로 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 발현 제어 서열은 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된다.
소정의 예시적 구현예에서, 발현 제어 서열은 바큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 바큘로바이러스 프로모터는 전초기, 초기, 후기, 또는 극후기(very late) 유전자 프로모터이다. 소정의 예시적 구현예에서, 바큘로바이러스 프로모터는 폴리헤드린 프로모터, 전초기1 프로모터, 및 전초기2 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적 구현예에서, 발현 제어 서열은 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 단백질은 바이러스 파보비리다에(Parvoviridae) 과의 구성원의 게놈으로부터 단리된 Rep 단백질이다. 소정의 예시적 구현예에서, 단백질은 파보바이러스 Rep 단백질이다. 소정의 예시적 구현예에서, 파보바이러스 Rep 단백질은 B19 Rep, AAV2 Rep, HBoV1 Rep, 및 GPV Rep로 구성된 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적 구현예에서, 이종 서열은 제2 선택 가능한 마커 서열을 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 제2 선택 가능한 마커 서열은 젠타마이신 저항성 유전자를 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 박테리아 레플리콘은 mini-F 레플리콘이다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 선택 가능한 마커 서열은 카나마이신 저항성 유전자를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 리포터 유전자는 LacZα 또는 이의 기능적 부분을 인코딩한다. 소정의 예시적 구현예에서, 제2 리포터 유전자는 적색 형광 단백질을 인코딩한다. 소정의 예시적 구현예에서, 바큘로바이러스-유도성 프로모터는 39K 프로모터이다. 소정의 예시적 구현예에서, 제2 우선 표적 부위는 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개된다.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공된다: mini-attTn7 부위 내로 삽입된 이종 서열로서, 이종 서열은 Rep를 인코딩하고, 삽입된 Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 이종 서열; 및 LoxP 부위 또는 이의 변이체.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공된다: 박테리아 레플리콘; 제1 항생제 저항성 유전자; mini-attTn7 부위 내로 삽입된 이종 서열로서, 이종 서열은 Rep를 인코딩하고, 삽입된 Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 이종 서열; 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및 LoxP 부위 또는 이의 변이체.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공된다: 박테리아 레플리콘; 제1 항생제 저항성 유전자; mini-attTn7 부위 내로 삽입된 이종 서열로서, 이종 서열은 B19 Rep를 인코딩하고, 삽입된 B19 Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 이종 서열; 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및 LoxP 부위 또는 이의 변이체.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공된다: 박테리아 레플리콘; 제1 항생제 저항성 유전자; mini-attTn7 부위 내로 삽입된 이종 서열로서, 이종 서열은 GPV Rep를 인코딩하고, 삽입된 GPV Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 이종 서열; 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및 LoxP 부위 또는 이의 변이체.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공된다: 박테리아 레플리콘; 제1 항생제 저항성 유전자; mini-attTn7 부위 내로 삽입된 이종 서열로서, 이종 서열은 AAV2 Rep를 인코딩하고, 삽입된 AAV2 Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 이종 서열; 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및 LoxP 부위 또는 이의 변이체.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 핵산 벡터가 본원에 제공된다: 제1 박테리아 균주에서 핵산 벡터를 증식시키기 위한 제1 복제 원점으로서, 조건부 복제 원점인 제1 복제 원점; 제2 박테리아 균주에서 핵산 벡터를 증식시키기 위한 제2 복제 원점; 이종 서열의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위; 선택 가능한 마커 서열; 리포터 유전자; 및 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 우선 표적 부위.
소정의 예시적 구현예에서, 제1 복제 원점은 pi 단백질의 존재를 조건으로 한다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 복제 원점은 R6Kγ이다.
소정의 예시적 구현예에서, 제1 박테리아 균주는 pi 단백질을 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 제2 복제 원점은 pUC57이다.
소정의 예시적 구현예에서, 선택 가능한 마커 서열은 항생제 저항성 유전자를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 항생제 저항성 유전자는 암피실린 저항성 유전자이다.
소정의 예시적 구현예에서, 리포터 유전자는 형광 단백질을 인코딩한다. 소정의 예시적 구현예에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질이다.
소정의 예시적 구현예에서, 우선 표적 부위는 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개된다.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 핵산 벡터가 본원에 제공된다: 제1 박테리아 균주에서 핵산 벡터를 증식시키기 위한 제1 복제 원점으로서, 조건부 복제 원점인 제1 복제 원점; 제2 박테리아 균주에서 핵산 벡터를 증식시키기 위한 제2 복제 원점; 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위; 선택 가능한 마커 서열; 리포터 유전자; 및 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 우선 표적 부위.
소정의 예시적 구현예에서, 이종 서열은 이종 유전자를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 이종 유전자는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 이종 서열은 발현 제어 서열을 추가로 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 발현 제어 서열은 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된다. 소정의 예시적 구현예에서, 발현 제어 서열은 조직-특이적 프로모터를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 조직-특이적 프로모터는 트리스테트라프롤린(TTP) 또는 뮤린 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터이다. 소정의 예시적 구현예에서, 발현 제어 서열은 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호이다. 소정의 예시적 구현예에서, 발현 제어 서열은 전사-후 조절 요소를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 전사-후 조절 요소는 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)이다.
소정의 예시적 구현예에서, 단백질은 치료 단백질이다. 소정의 예시적 구현예에서, 치료 단백질은 응고 인자이다. 소정의 예시적 구현예에서, 응고 인자는 인자 VIII(FVIII)이다. 소정의 예시적 구현예에서, 응고 인자는 FVIII-XTEN이다.
소정의 예시적 구현예에서, 이종 서열은 5' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 이종 서열은 3' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 파보바이러스로부터 유래된다. 소정의 예시적 구현예에서, 파보바이러스는 B19, GPV, HBoV1, 및 AAV2로 구성된 군으로부터 선택된다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR은 B19로부터 유래된 야생형 또는 변이체 5' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR은 GPV로부터 유래된 야생형 또는 변이체 5' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR은 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 변이체 5' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR은 HBoV1로부터 유래된 야생형 또는 변이체 5' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 변이체 5' ITR은 절두된 5' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 3' ITR은 B19로부터 유래된 야생형 또는 변이체 3' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 3' ITR은 GPV로부터 유래된 야생형 또는 변이체 3' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 3' ITR은 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 변이체 3' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 변이체 3' ITR은 절두된 3' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 3' ITR은 HBoV1로부터 유래된 야생형 3' ITR이다.
소정의 예시적 구현예에서, 제1 복제 원점은 pi 단백질의 존재를 조건으로 한다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 복제 원점은 R6Kγ이다.
소정의 예시적 구현예에서, 제1 박테리아 균주는 pi 단백질을 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 제2 복제 원점은 pUC57이다.
소정의 예시적 구현예에서, 선택 가능한 마커 서열은 항생제 저항성 유전자를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 항생제 저항성 유전자는 암피실린 저항성 유전자이다.
소정의 예시적 구현예에서, 리포터 유전자는 형광 단백질을 인코딩한다. 소정의 예시적 구현예에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질이다.
소정의 예시적 구현예에서, 우선 표적 부위는 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개된다.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공된다: 제1 리포터 유전자 내로 삽입된 제1 이종 서열로서, 삽입된 이종 서열이 제1 리포터 유전자의 리딩 프레임을 파괴하는, 제1 이종 서열; 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 제1 우선 표적 부위; 제2 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위; 및 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 제2 우선 표적 부위.
소정의 예시적 구현예에서, 제1 이종 서열은 제1 이종 유전자를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 이종 서열은 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 발현 제어 서열은 바큘로바이러스 프로모터를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 바큘로바이러스 프로모터는 전초기, 초기, 후기, 또는 극후기 프로모터이다. 소정의 예시적 구현예에서, 바큘로바이러스 프로모터는 폴리헤드린 프로모터, 전초기1 프로모터, 및 전초기2 프로모터로 구성된 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적 구현예에서, 단백질은 바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 게놈으로부터 단리된 Rep 단백질이다. 소정의 예시적 구현예에서, 단백질은 파보바이러스 Rep 단백질이다. 소정의 예시적 구현예에서, 파보바이러스 Rep 단백질은 B19 Rep, AAV2 Rep, HBoV1 Rep, 및 GPV Rep로 구성된 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적 구현예에서, 제2 이종 서열은 제2 이종 유전자를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 제2 이종 서열은 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 발현 제어 서열은 조직-특이적 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사-후 조절 요소를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 조직-특이적 프로모터는 트리스테트라프롤린(TTP) 또는 뮤린 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터이다. 소정의 예시적 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호이다. 소정의 예시적 구현예에서, 전사-후 조절 요소는 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)이다.
소정의 예시적 구현예에서, 단백질은 치료 단백질이다. 소정의 예시적 구현예에서, 치료 단백질은 응고 인자이다. 소정의 예시적 구현예에서, 응고 인자는 인자 VIII(FVIII)이다. 소정의 예시적 구현예에서, 응고 인자는 FVIII-XTEN이다.
소정의 예시적 구현예에서, 제2 이종 서열은 5' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 제2 이종 서열은 3' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR은 바이러스 파보비리다에 과의 제1 구성원의 게놈으로부터 유래되고, 3' ITR은 바이러스 파보비리다에 과의 제2 구성원의 게놈으로부터 유래된다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 및 제2 구성원은 동일하다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 및 제2 구성원은 상이하다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 B19, GPV, 및 AAV2로 구성된 군으로부터 선택된 파보바이러스로부터 유래된다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR은 B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR은 GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR은 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR은 HBoV1로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 3' ITR은 B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 3' ITR은 GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 3' ITR은 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' ITR이다. 소정의 예시적 구현예에서, 5' ITR은 HBoV1로부터 유래된 야생형 3' ITR이다.
소정의 예시적 구현예에서, 재조합 박미드는 박테리아 레플리콘을 추가로 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 박테리아 레플리콘은 mini-F 레플리콘이다.
소정의 예시적 구현예에서, 재조합 박미드는 하나 이상의 선택 가능한 마커 서열을 추가로 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 하나 이상의 선택 가능한 마커 서열은 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 하나 이상의 항생제 저항성 유전자는 암피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 및 젠타마이신 저항성 유전자로 구성된 군으로부터 선택된다.
소정의 예시적 구현예에서, 제1 리포터 유전자는 LacZα 또는 이의 기능적 부분을 인코딩한다.
소정의 예시적 구현예에서, 재조합 박미드는 적어도 제2 및 제3 리포터 유전자를 추가로 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 제2 및 제3 리포터 유전자는 각각 형광 단백질을 인코딩한다. 소정의 예시적 구현예에서, 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질이다.
소정의 예시적 구현예에서, 제1 및 제2 우선 표적 부위는 각각 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개된다.
또 다른 양태에서, mini-attTn7 부위 내로 삽입된 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 Rep는 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, 바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 제1 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 제2 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 바이러스 파보비리다에 과의 제1 및 제2 게놈은 동일하다. 소정의 예시적 구현예에서, 바이러스 파보비리다에 과의 제1 및 제2 게놈은 상이하다.
소정의 예시적 구현예에서, Rep는 바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 제1 또는 제2 게놈으로부터 유래된다.
또 다른 양태에서, mini-attTn7 부위 내로 삽입된 B19 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 B19 Rep는 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
또 다른 양태에서, mini-attTn7 부위 내로 삽입된 GPV Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 GPV Rep는 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
또 다른 양태에서, mini-attTn7 부위 내로 삽입된 AAV2 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 AAV2 Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
또 다른 양태에서, mini-attTn7 부위 내로 삽입된 AAV2 HBoV1 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 HBoV1 Rep는 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, HBoV1로부터 유래된 야생형 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 HBoV1로부터 유래된 야생형 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 단백질은 치료 단백질이다. 소정의 예시적 구현예에서, 치료 단백질은 응고 인자이다. 소정의 예시적 구현예에서, 응고 인자는 인자 VIII(FVIII)이다. 소정의 예시적 구현예에서, 응고 인자는 FVIII-XTEN이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 박미드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 재조합 박미드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 또 다른 양태에서, 본원에 기재된 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 본원에 기재된 재조합 박미드를 생성하는 방법이 본원에 제공된다: 박테리아 세포 내로 본원에 기재된 박미드; 및 본원에 기재된 이종 서열을 포함하는 트랜스포존에 작동 가능하게 연결된 박테리아 레플리콘을 포함하는 공여체 핵산 분자를 도입하는 단계; 전위가 발생하는 조건 하에서 박테리아 세포를 인큐베이션시키는 단계; 및 박테리아 세포로부터 재조합 박미드를 단리하는 단계.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 본원에 기재된 재조합 박미드를 생성하는 방법이 본원에 제공된다: 박테리아 세포 내로 본원에 기재된 재조합 박미드; 본원에 기재된 벡터; 및 Cre 재조합효소를 도입하는 단계; 부위-특이적 재조합이 발생하는 조건 하에서 박테리아 세포를 인큐베이션시키는 단계; 및 박테리아 세포로부터 재조합 박미드를 단리하는 단계.
또 다른 양태에서, 적절한 조건 하에서 본원에 기재된 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법이 본원에 제공된다: 적절한 조건 하에서 본원에 기재된 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및 적절한 조건 하에서 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 야생형 또는 절두된 B19 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법이 본원에 제공된다: 적절한 조건 하에서 야생형 또는 절두된 B19 역위 말단 반복부를 포함하는 본원에 기재된 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및 적절한 조건 하에서 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 야생형 또는 절두된 GPV 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법이 본원에 제공된다: 적절한 조건 하에서 야생형 또는 절두된 GPV 역위 말단 반복부를 포함하는 본원에 기재된 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및 적절한 조건 하에서 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 야생형 또는 절두된 AAV2 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법이 본원에 제공된다: 적절한 조건 하에서 야생형 또는 절두된 AAV2 역위 말단 반복부를 포함하는 본원에 기재된 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및 적절한 조건 하에서 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계.
또 다른 양태에서, 다음을 포함하는, 야생형 HBoV1 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법이 본원에 제공된다: 적절한 조건 하에서 야생형 HBoV1 역위 말단 반복부를 포함하는 본원에 기재된 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및 적절한 조건 하에서 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계.
또 다른 양태에서, 5'에서 3'으로 다음을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 플라스미드가 본원에 제공된다: 바이러스 파보비리다에 과의 제1 구성원의 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 바이러스 파보비리다에 과의 제2 구성원의 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부.
일부 구현예에서, 제1 박미드 및 제2 박미드를 포함하는 재조합 박미드 세트가 본원에 개시되며, 여기서 제1 박미드는 mini-attTn7 부위 내로 삽입된 Rep를 인코딩하는 서열을 포함하고, 삽입된 Rep는 리포터 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하며; 제2 박미드는 이종 서열을 포함하고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, 바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 제1 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부(ITR); 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 제2 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 B19, GPV, HBoV1, 및 AAV2로 구성된 군으로부터 선택된 파보바이러스로부터 유래된다.
소정의 예시적 구현예에서, 하나 이상의 발현 제어 서열은 조직-특이적 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사-후 조절 요소를 포함한다. 소정의 예시적 구현예에서, 조직-특이적 프로모터는 트리스테트라프롤린(TTP) 또는 뮤린 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터이다. 소정의 예시적 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호이다. 소정의 예시적 구현예에서, 전사-후 조절 요소는 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)이다.
소정의 예시적 구현예에서, 단백질은 치료 단백질이다. 소정의 예시적 구현예에서, 치료 단백질은 응고 인자이다. 소정의 예시적 구현예에서, 응고 인자는 인자 VIII(FVIII)이다. 소정의 예시적 구현예에서, 응고 인자는 FVIII-XTEN이다.
소정의 예시적 구현예에서, 제1 및/또는 제2 구성원은 B19, GPV, HBoV1, 및 AAV2로 구성된 군으로부터 선택된다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 및/또는 제2 구성원은 동일하다. 소정의 예시적 구현예에서, 제1 및/또는 제2 구성원은 상이하다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 핵산 서열을 포함하는 안정 세포주가 본원에 제공되며, 여기서 핵산 서열은 안정 세포주의 게놈에 안정적으로 통합된다.
소정의 예시적 구현예에서, 안정 세포주는 안정 곤충 세포주이다. 소정의 예시적 구현예에서, 안정 곤충 세포주는 Sf9이다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 재조합 박미드를 본원에 기재된 안정 세포주 내로 도입하는 단계를 포함하는, 야생형 또는 절두된 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 양태에서, 숙주 세포 내로 다음을 도입하는 단계를 포함하는, 야생형 또는 절두된 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법이 본원에 제공된다: 본원에 기재된 플라스미드; 및 본원에 기재된 재조합 박미드.
소정의 예시적 구현예에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 소정의 예시적 구현예에서, 곤충 세포는 Sf9이다.
도 1의 A 내지 도 1의 D는 본 발명의 일 구현예에 따른 재조합 박미드의 도식적 표현이다. 도 1의 A는 카나마이신 저항성 마커(KanR), LacZα와 인-프레임(in-frame) 융합된 mini-attTn7 삽입 부위, 및 mini-F 복제 원점(mini-F)을 인코딩하는 bMON14272의 개략도를 보여준다. 도 1의 B는 AcMNPV 39K 프로모터(p39K) 하의 적색 형광 단백질(RFP)을 인코딩하는 유전자, 이어서 ets 폴리아데닐화 신호(etsPAS), LoxP 재조합 부위, 및 EGT 측접 유전자 서열을 포함하는 합성 전달 벡터의 도식적 선형 맵(map)을 보여준다. 도 1의 C는 카나마이신 저항성 마커(KanR), LacZα와 인-프레임 융합된 mini-attTn7 삽입 부위, mini-F 복제 원점(mini-F), AcMNPV 39K 프로모터(p39K) 하의 적색 형광 단백질(RFP) 유전자를 인코딩하는 유전자, 이어서 ets 폴리아데닐화 신호(etsPAS), 및 LoxP 재조합 부위를 인코딩하는 재조합 박미드(BIVVBac)의 개략도를 보여준다. 도 1의 D는 BIVVBac 박미드 및 전위효소를 인코딩하는 Tn7 헬퍼 플라스미드를 보유하는 이.콜라이(E. coli) 균주(BIVVBacDH10B)의 개략도를 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 Cre-LoxP 공여체 벡터의 도식적 표현이다. 도 2a는 AcMNPV 전사 인핸서 hr5 요소가 앞에 있고 AcMNPV p10 폴리아데닐화 신호(p10 PAS)가 뒤에 있는 AcMNPV 전초기1(pIE1) 프로모터 하의 강화된 GFP를 인코딩하는 유전자, LoxP 재조합 부위(LoxP), 암피실린 항생제 저항성 유전자, 다중 클로닝 부위(MCS), ColE1, 및 R6Kγ 복제 원점(Ori)을 포함하는 합성 DNA의 도식적 선형 맵을 보여준다. 도 2b는 합성 DNA(도 2a)를 pUC57 벡터 내로 삽입하여 만든 본 발명의 일 구현예에 따른 Cre-LoxP 공여체 벡터의 도식적 맵을 보여준다.
도 3a 내지 도 3f는 본 발명의 구현예에 따른 복제(Rep) 단백질 발현 작제물의 도식적 표현이다. 도 3a는 SV40 폴리아데닐화 신호(SV40 PAS)가 뒤에 있는 AcMNPV 폴리헤드린 또는 전초기1(ie1) 프로모터 하의 B19 Rep 유전자를 인코딩하는 합성 DNA의 도식적 선형 맵을 보여준다. 도 3b는 B19.Rep 합성 DNA(도 3a)를 pFastBac1 벡터(Invitrogen) 내로 삽입하여 만든 본 발명의 구현예에 따른 Tn7 전달 벡터의 도식적 맵을 보여준다. 도 3c는 sv40 폴리아데닐화 신호(SV40 PAS)가 뒤에 있는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 GPV Rep78 및 Rep52 스플라이싱된 유전자를 인코딩하는 합성 DNA의 도식적 선형 맵을 보여준다. 변형된 mRNA 전사물(mRNA)은 Rep78의 비-표준 시작 코돈(CUG), Rep52의 표준 시작 코돈(AUG), 및 정지 코돈(UAA)을 갖는 물결선으로 나타난다. 도 3d는 GPV.Rep 합성 DNA(도 3c)를 pFastBac1 벡터(Invitrogen) 내로 삽입하여 만든 본 발명의 구현예에 따른 Tn7 전달 벡터의 도식적 맵을 보여준다. 도 3e는 sv40 폴리아데닐화 신호(SV40 PAS)가 뒤에 있는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 AAV2 Rep78 및 Rep52 스플라이싱된 유전자를 인코딩하는 합성 DNA의 도식적 선형 맵을 보여준다. 변형된 mRNA 전사물(mRNA)은 Rep78의 비-표준 시작 코돈(CUG), Rep52의 표준 시작 코돈(AUG), 및 정지 코돈(UAA)을 갖는 물결선으로 나타난다. 도 3f는 AAV2.Rep 합성 DNA(도 3e)를 pFastBac1 벡터(Invitrogen) 내로 삽입하여 만든 본 발명의 구현예에 따른 Tn7 전달 벡터의 도식적 맵을 보여준다.
도 4a 및 도 4b는 인간 FVIIIco6XTEN 발현 작제물의 도식적 표현이다. 도 4a는 간-특이적 TTPp 프로모터, 우드척 전사후 조절 요소(WPRE), 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(bGHpA) 신호의 조절 하의 XTEN 144 펩티드를 포함하는 코돈-최적화된 인간 인자 VIII(FVIIIco6)(FVIIIco6XTEN)를 인코딩하는 발현 작제물의 도식적 선형 맵을 보여준다. hFVIIIco6XTEN 발현 카세트에는 각각 B19(Δ135, WT), GPV(Δ162, WT, 및 Asy), 또는 AAV2(WT, Asy1, Asy2, Asy3)의 대칭 절두된(Δ), 대칭 야생형(WT), 및 비대칭(Asy) ITR이 측접한다. 표시된 ITR 서열은 표 1에서 찾을 수 있다. 도 4b는 도 2b에 기재된 Cre-LoxP 공여체 벡터 내로 클로닝된 도 4a에 기재된 B19, GPV, 또는 AAV2의 ITR이 측접하는 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트를 인코딩하는 Cre-LoxP 공여체 벡터의 도식적 선형 맵을 보여준다.
도 5a 내지 도 5g는 Rep를 인코딩하는 서열을 포함하는 재조합 바큘로바이러스 발현 벡터(BEV)의 도식, 및 이의 확인 연구를 보여준다. 도 5a는 모 BIVVBac 및 bMON14272 박미드와 비교하여 B19.Rep, GPV.Rep, 또는 AAV2.Rep를 인코딩하는 재조합 BIVVBac 박미드(각각 BIVVBac.IE1.B19.RepTn7, BIVVBac.Polh.GPV.RepTn7, 및 BIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7)의 제한 효소 맵핑의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. 도 5b는 AcBIVVBac.IE1.B19.RepTn7의 도식적 맵을 보여준다. 도 5c는 AcBIVVBac.Polh.GPV.RepTn7의 도식적 맵을 보여준다. 도 5d는 AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7의 도식적 맵을 보여준다. 도 5e는 일차 항체로서 다클론 항-B19 NS1(1:2500) 그리고 이차 항체로서 IRDye@680RD 당나귀 항-토끼 LI-COR(1:10,000)을 사용한 재조합 AcBIVVBac.IE1.B19.RepTn7 BEV의 플라크 정제된 클론(클론 1 내지 6; Cl#1, Cl#2, Cl#3, Cl#4, Cl#5, Cl#6)에서의 B19.REP 면역블롯팅을 보여준다. 프리시젼 플러스 프로테인™ 듀얼 컬러(Precision Plus Protein™ Dual Color)(바이오-라드(Bio-Rad))가 표준으로 사용되었으며 왼쪽에 나타나 있다. 도 5f는 일차 항체로서 다클론 항-GPV REP 펩티드 항체(1:500) 그리고 이차 항체로서 IRDye@680RD 당나귀 항-토끼 LI-COR(1:10,000)을 사용한 재조합 AcBIVVBac.Polh.GPV.RepTn7 BEV의 플라크 정제된 클론(클론 1 내지 6; Cl#1, Cl#2, Cl#3, Cl#4, Cl#5, Cl#6)에서의 GPV.REP 면역블롯팅을 보여준다. 프리시젼 플러스 프로테인™ 듀얼 컬러(바이오-라드)가 표준으로 사용되었으며 왼쪽에 나타나 있다. 도 5g는 일차 항체로서 단일클론 항-AAV2 Rep(1:500) 그리고 이차 항체로서 IRDye@800CW 당나귀 항-마우스 LI-COR(1:10,000)을 사용한 재조합 AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV의 플라크 정제된 클론에서의 AAV2.REP 면역블롯팅을 보여준다. 프리시젼 플러스 프로테인™ 듀얼 컬러(바이오-라드)가 표준으로 사용되었으며 왼쪽에 나타나 있다.
도 6a 내지 도 6c는 Rep 및 hFVIIIco6XTEN을 인코딩하는 서열을 포함하는 BEV의 도식적 표현이다. 도 6a는 표시된 바와 같이 B19.Rep 발현 카세트 및 B19 ITR이 측접하는 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트(AcBIVVBac(B19.Rep)FVIII.B19.ITRsLoxP)를 인코딩하는 재조합 BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 6b는 표시된 바와 같이 GPV.Rep 발현 카세트 및 GPV ITR이 측접하는 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트(AcBIVVBac(GPV.Rep)FVIII.GPV.ITRsLoxP)를 인코딩하는 재조합 BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 6c는 AAV2.Rep 발현 카세트 및 AAV2 ITR이 측접하는 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트(AcBIVVBac(AAV2.Rep)FVIII.AAV2.ITRsLoxP)를 인코딩하는 재조합 BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 6a 내지 도 6c에 표시된 ITR 서열은 표 1에서 찾을 수 있다.
도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 일 구현예에 따른 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 사용한 인간 FVIIIco6XTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 7a는 GPV.Rep 발현 카세트 및 GPV 비대칭 ITR이 측접하는 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트(AcBIVVBac(GPV.Rep)FVIII.GPV.Asy.ITRsLoxP)를 인코딩하는 재조합 BEV의 도식적 맵이다. 표시된 ITR 서열은 표 1에서 찾을 수 있다. 도 7b는 AcBIVVBac(GPV.Rep)FVIII.GPV.Asy.ITRsLoxP BEV의 플라크 정제된 클론(클론 1 내지 6; Cl#1, Cl#2, Cl#3, Cl#4, Cl#5, Cl#6)으로 감염된 Sf9 세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. hFVIIIco6XTEN의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다. 도 7c는 상이한 부피로 로딩된 재조합 AcBIVVBac(GPV.Rep)FVIII.GPV.Asy.ITRsLoxP BEV 클론#4(도 7b에 나타남)로부터 얻어진 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. hFVIIIco6XTEN의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
도 8a 및 도 8b는 안정 인간 FVIIIco6XTEN 인코딩 곤충 세포주를 생성하는 데 사용되는 물질을 보여준다. 도 8a는 전사 인핸서 hr5 요소가 앞에 있고 AcMNPV p10 폴리아데닐화 신호가 뒤에 있는 AcMNPV 전초기(ie1) 프로모터 하의 네오마이신 저항성 마커를 인코딩하는 플라스미드의 도식적 맵을 보여준다. 도 8b는 Sf9 세포 게놈 내로 안정적으로 통합되어 안정 세포주를 생성하는, B19, GPV, 또는 AAV2 ITR이 측접하는 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트의 도식적 맵을 보여준다. 생성된 안정 세포주의 목록은 표 5에 나타나 있으며, ITR의 서열은 표 1에 나타나 있다.
도 9a 내지 도 9c는 안정 세포주로부터의 인간 FVIIIco6XTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여주는 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. 도 9a는 hFVIIIco6XTEN을 인코딩하며, 각각 대칭 절두된(B19Δ135) 또는 대칭 야생형(B19.WT) ITR이 측접하는, Sf 세포주-1 및 -2로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. 도 9b는 hFVIIIco6XTEN을 인코딩하며, 각각 대칭 절두된(GPVΔ162), 대칭 야생형(GPV.WT), 또는 비대칭(GPV.Asy) ITR이 측접하는, Sf 세포주-3, -4, 및 -5로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. 도 9c는 hFVIIIco6XTEN을 인코딩하며, 각각 대칭 야생형(AAV2.WT), 비대칭1(AAV2.Asy1), 비대칭2(AAV2.Asy2), 또는 비대칭3(AAV2.Asy3)이 측접하는 Sf 세포주-6, -7, -8, 및 -9로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. 도 9a 내지 도 9c에 사용된 안정 세포주는 표 5에 나타나 있고, ITR의 서열은 표 1에 나타나 있다.
도 10은 크로모제닉스 코테스트(Chromogenix Coatest)® SP 인자 VIII 발색 검정에 의해 측정된 hFVIII 활성을 보여주는 도표이다. 안정 세포주로부터 단리된 ceDNA를 Huh7 세포에 형질감염시켰고, 형질감염 후 48 및 72 시간째에 무-세포 상층액을 수확하고 발색 검정에 의한 hFVIII 검출을 위해 테스트했다. 실선은 ceDNA 샘플을 나타내고 점선은 대조군으로 사용된 플라스미드 DNA 샘플을 나타낸다.
도 11a 내지 도 11f는 본 발명의 구현예에 따른 복제(Rep) 단백질 발현 작제물의 도식적 표현이다. 도 11a는 sv40 폴리아데닐화 신호(SV40 PAS)가 뒤에 있는 OpMNPV 전초기(OpIE2) 프로모터 하의 B19 Rep 유전자를 인코딩하는 합성 DNA의 도식적 선형 맵을 보여준다. 도 11b는 도 3b에 나타난 pFastBac.IE1.B19.Rep 작제물에서 IE1 프로모터를 OpIE2로 대체함으로써 만든 일시적 발현 플라스미드의 도식적 맵을 보여준다. 도 11c는 sv40 폴리아데닐화 신호(SV40 PAS)가 뒤에 있는 OpMNPV 전초기(OpIE2) 프로모터 하의 GPV Rep78 및 Rep52 스플라이싱된 유전자를 인코딩하는 합성 DNA의 도식적 선형 맵을 보여준다. 변형된 mRNA 전사물(mRNA)은 Rep78의 비-표준 시작 코돈(CUG), Rep52의 표준 시작 코돈(AUG), 및 정지 코돈(UAA)을 갖는 물결선으로 나타난다. 도 11d는 도 3d에 나타난 pFastBac.Polh.GPV.Rep 작제물에서 폴리헤드린 프로모터를 OpIE2로 대체함으로써 만든 일시적 발현 플라스미드의 도식적 맵을 보여준다. 도 11e는 sv40 폴리아데닐화 신호(SV40 PAS)가 뒤에 있는 OpMNPV 전초기(OpIE2) 프로모터 하의 AAV2 Rep78 및 Rep52 스플라이싱된 유전자를 인코딩하는 합성 DNA의 도식적 선형 맵을 보여준다. 변형된 mRNA 전사물(mRNA)은 Rep78의 비-표준 시작 코돈(CUG), Rep52의 표준 시작 코돈(AUG), 및 정지 코돈(UAA)을 갖는 물결선으로 나타난다. 도 11f는 도 3f에 나타난 pFastBac.Polh.AAV2.Rep 작제물에서 폴리헤드린 프로모터를 OpIE2로 대체함으로써 만든 일시적 발현 플라스미드의 도식적 맵을 보여준다.
도 12a 내지 도 12c는 본 발명의 구현예에 따른 파보바이러스 ITR을 갖는 변형된 FVIIIXTEN 발현 카세트, 간-특이적 변형된 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터(mTTR482), 및 (V2.0) 코돈-최적화된 BDDco-FVIIIXTEN 전이유전자(V2.0 FVIIIXTEN)의 도식적 표현이다(SEQ ID NO: 19). 도 12a는 AAV2 WT ITR(SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6)이 측접하는 변형된 FVIIIXTEN 발현 카세트의 도식적 선형 맵을 보여준다. 도 12b는 B19 WT(SEQ ID NO: 2) 또는 B19 최소(SEQ ID NO: 16)가 측접하는 변형된 FVIIIXTEN 발현 카세트의 도식적 선형 맵을 보여준다. 도 12c는 GPVΔ120(SEQ ID NO: 17) 또는 GPVΔ186(SEQ ID NO: 18)이 측접하는 변형된 FVIIIXTEN 발현 카세트의 도식적 선형 맵을 보여준다.
도 13a 내지 도 13c는 본 발명의 일 구현예에 따른 바큘로바이러스 시스템에서의 ceDNA 생산을 위해 사용되는 접근법의 도식적 표현이다. 도 13a는 1 BAC(One BAC) 접근법의 개략도를 보여주며, 여기서 ceDNA 생산을 위한 Sf9 세포의 감염을 위해 상이한 유전자좌에서 V2.0 FVIIIXTEN 및 Rep 유전자를 인코딩하는 단일 재조합 BEV를 사용하였다. 도 13b는 2 BAC(Two BAC) 접근법의 개략도를 보여주며, 여기서 Sf9 세포는 ceDNA 생산을 위해 V2.0 FVIIIXTEN 및/또는 Rep 유전자를 인코딩하는 재조합 BEV로 공동-감염시켰다. 도 13c는 안정 세포주 접근법의 개략도를 보여주며, 여기서 FVIIIXTEN 발현 카세트를 Sf9 세포 게놈 내로 안정적으로 통합시켰고 ceDNA 생산을 위해 Rep 유전자를 인코딩하는 재조합 BEV를 감염시킴으로써 구제(rescue)했다.
도 14a 내지 도 14c는 본 발명의 일 구현예에 따른 AAV2 1 BAC로부터의 인간 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 14a는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 AAV2 Rep 유전자 및 V2.0 FVIIIXTEN을 포함하고 AAV2 WT ITR이 측접하는 인간 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 재조합 BEV(AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITRs)Polh.AAV2.RepLoxP)를 사용하여 Sf9 세포에서 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산의 1 BAC 접근법의 개략도이다. 도 14b는 AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITRs)Polh.AAV2.RepLoxP BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 14c는 AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITRs) Polh.AAV2.RepLoxP BEV의 적정된 바이러스 모액(P2)으로 감염된 Sf9 세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. FVIIIXTEN ceDNA(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
도 15a 내지 도 15c는 본 발명의 일 구현예에 따른 B19 1 BAC로부터의 인간 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 15a는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 B19 NS1 유전자 및 V2.0 FVIIIXTEN을 포함하고 B19 WT ITR이 측접하는 인간 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 재조합 BEV(AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITRs)Polh.B19.NS1LoxP)를 사용하여 Sf9 세포에서 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산의 1 BAC 접근법의 개략도이다. 도 15b는 AcBIVVBac(mTTR. FVIIIXTEN.B19.WT.ITRs)Polh.B19.NS1LoxP BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 15c는 AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITRs)Polh.B19.NS1LoxP BEV의 적정된 바이러스 모액(P2)으로 감염된 Sf9 세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. FVIIIXTEN ceDNA(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
도 16a 내지 도 16c는 본 발명의 일 구현예에 따른 AAV2 2 BAC로부터의 인간 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 16a는 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산의 2 BAC 접근법의 개략도이며, 여기서 Sf9 세포는 V2.0 FVIIIXTEN을 포함하고 AAV2 WT ITR이 측접하는 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 (AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITRsTn7) 및/또는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 AAV2 Rep 유전자를 인코딩하는 (AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7) 재조합 BEV로 공동-감염된다. 도 16b는 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITRsTn7 및 AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 16c는 표시된 바와 같은 상이한 MOI의 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITRsTn7 및 AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV로 공동-감염된 Sf9 세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. FVIIIXTEN ceDNA 벡터(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
도 17a 내지 도 17c는 본 발명의 일 구현예에 따른 B19 2 BAC로부터의 인간 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 17a는 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산의 2 BAC 접근법의 개략도이며, 여기서 Sf9 세포는 V2.0 FVIIIXTEN을 포함하고 B19 WT ITR이 측접하는 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 (AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITRsTn7) 및/또는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 B19 NS1 유전자를 인코딩하는 (AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7) 재조합 BEV로 공동-감염된다. 도 17b는 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITRsTn7 및 AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7 BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 17c는 표시된 바와 같은 상이한 MOI의 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITRsTn7 및 AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7 BEV로 공동-감염된 Sf9 세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. FVIIIXTEN ceDNA 벡터(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
도 18a 내지 도 18c는 본 발명의 일 구현예에 따른 GPV 2 BAC로부터의 인간 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 18a는 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산의 2 BAC 접근법의 개략도이며, 여기서 Sf9 세포는 V2.0 FVIIIXTEN을 포함하고 GPVΔ120 ITR이 측접하는 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 (AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.GPVΔ120.ITRsTn7) 및/또는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 GPV NS1 유전자를 인코딩하는 (AcBIVVBac.Polh.GPV.NS1Tn7) 재조합 BEV로 공동-감염된다. 도 18b는 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.GPVΔ120.ITRsTn7 및 AcBIVVBac.Polh. GPV.NS1Tn7 BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 18c는 표시된 바와 같은 상이한 MOI의 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN. GPVΔ120.ITRsTn7 및 AcBIVVBac.Polh.GPV.NS1Tn7 BEV로 공동-감염된 Sf9 세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. FVIIIXTEN ceDNA 벡터(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
도 19a 내지 도 19c는 본 발명의 일 구현예에 따른 AAV2 안정 세포주로부터의 인간 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 19a는 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산의 안정 세포주 접근법의 개략도를 보여주며, 여기서 V2.0 FVIIIXTEN을 포함하고 AAV2 WT ITR이 측접하는 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 안정 세포주는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 AAV2 Rep 유전자를 인코딩하는 재조합 BEV(AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7)로 감염된다. 도 19b는 AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 19c는 표시된 바와 같은 상이한 MOI의 AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV로 감염된 AAV2 안정 세포주로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. FVIIIXTEN ceDNA 벡터(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
도 20a 내지 도 20c는 본 발명의 일 구현예에 따른 B19 안정 세포주로부터의 인간 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 20a는 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산의 안정 세포주 접근법의 개략도를 보여주며, 여기서 V2.0 FVIIIXTEN을 포함하고 B19 최소 ITR이 측접하는 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 안정 세포주는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 B19 NS1 유전자를 인코딩하는 재조합 BEV(AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7)로 감염된다. 도 20b는 AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7 BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 20c는 표시된 바와 같은 상이한 MOI의 AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7 BEV로 감염된 B19 안정 세포주로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. FVIIIXTEN ceDNA 벡터(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
도 21a 내지 도 21c는 본 발명의 일 구현예에 따른 GPV 안정 세포주로부터의 인간 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 21a는 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산의 안정 세포주 접근법의 개략도를 보여주며, 여기서 V2.0 FVIIIXTEN을 포함하고 GPVΔ120 ITR이 측접하는 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 안정 세포주는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 GPV NS1 유전자를 인코딩하는 재조합 BEV(AcBIVVBac.Polh.GPV.NS1Tn7)로 감염된다. 도 21b는 AcBIVVBac.Polh.GPV.NS1Tn7 BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 21c는 표시된 바와 같은 상이한 MOI의 AcBIVVBac.Polh.GPV.NS1Tn7 BEV로 감염된 GPV 안정 세포주로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. FVIIIXTEN ceDNA 벡터(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
도 22의 A 내지 도 22의 E는 본 발명의 일 구현예에 따른 2 BAC 접근법을 사용한 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산 및 정제의 작업흐름을 보여준다. 도 22의 A는 Sf9 세포 확장 및 지속기간(0 내지 2 일차)의 도식을 보여주며, 여기서 세포는 소규모(0.5 L)에서 대규모 배양(1.5 L) 플라스크로 순차적으로 규모가 확대되어 무-혈청 ESF921 배지 내 2.5 내지 3.0 x 106/mL의 세포 밀도를 달성한다. 도 22의 B는 Sf9 대형 배양(1.5 L) 플라스크 감염 및 인큐베이션 지속기간(2 내지 6 일차)의 도식을 보여주며, 여기서 세포는 V2.0 FVIIIXTEN을 포함하고 HBoV1 ITR이 측접하는 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 (AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRsTn7) 및/또는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 HBoV1 NS1 유전자를 인코딩하는 (AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1Tn7) 재조합 BEV로 각각 0.1 및 0.01 플라크-형성 단위(pfu)/세포의 MOI에서 공동-감염된다. 도 22의 C는 가공 지속기간(6 내지 7 일차)과 함께 플라스미드 기가 프렙 정제 키트(Plasmid Giga Prep Purification kit) 및 아가로스 겔 전기영동의 이미지를 보여주며, 여기서 감염된 세포의 세포 밀도 및 생존력이 매일 측정되고, 세포 생존력이 70 내지 80%에 도달했을 때 저속 원심분리에 의해 세포를 펠렛화했다. FVIIIXTEN ceDNA 벡터는 퓨어링크™ 하이퓨어 엑스피 플라스미드 기가프렙 키트(PureLinkTM HiPure Expi Plasmid Gigaprep Kit)(Invitrogen)에 의해 감염된 세포 펠렛으로부터 정제하였으며 분취량을 아가로스 겔 전기영동 상에서 러닝(run)하여 FVIIIXTEN ceDNA(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및/또는 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 생산성을 결정했다. 도 22의 D는 가공 지속기간(7 내지 12 일차)과 함께 바이오-라드 모델 491 프렙 셀(Bio-Rad Model 491 Prep Cell) 및 아가로스 겔 전기영동의 이미지를 보여주며, 여기서 고분자량 DNA로부터 FVIIIXTEN ceDNA(약 8.5 kb 단편)를 분리하기 위해 프렙 셀에서 분취용 아가로스 겔 상에 기가-프렙 정제된 DNA를 로딩하였다. 분취용 아가로스 겔 전기영동으로부터 70 내지 80 분 간격으로 수집한 용출 분획을 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 상에서 분석하여 FVIIIXTEN ceDNA의 순도를 결정했다. 도 22의 E는 아가로스 겔 전기영동의 이미지를 보여주며, 여기서 프렙 셀로부터 수집된 분획은 1/10 부피의 3M NaOAc(pH 5.5) 및 3 부피의 100% 에탄올과 조합하고 침전시켜 정제된 FVIIIXTEN ceDNA를 얻었다. 겔 이미지는 출발 물질과 비교한 FVIIIXTEN ceDNA의 순도를 보여주며, 화살표는 FVIIIXTEN ceDNA 벡터(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드를 나타낸다.
도 23은 크로모제닉스 코테스트® SP 인자 VIII 발색 검정에 의해 측정된 혈장 FVIII 활성 수준의 그래프 표현을 보여준다. 도 23은 80, 40, 또는 12 μg/kg의 FVIIIXTEN HBoV1(wtHBoV1) 또는 AAV2(wtAAV2) ITR ceDNA를 사용하여 유체역학적 꼬리-정맥 주사를 통해 전신 주사된 hFVIIIR593C+/+/HemA 마우스로부터 상이한 간격으로 수집한 혈액 샘플 내에서 측정된 혈장 FVIII 활성 수준의 그래프 도표를 보여준다.
도 24a 내지 도 24c는 본 발명의 일 구현예에 따른 1 BAC 접근법을 사용한 인간 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 24a는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 HBoV1 NS1 유전자 및 HBoV1 ITR이 측접하는 인간 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 재조합 BEV (AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1LoxP)를 사용하여 Sf9 세포에서 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산의 1 BAC 접근법의 개략도이다. 도 24b는 AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1LoxP BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 24c는 (AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1LoxP)BEV의 적정된 바이러스 모액(P2)으로 감염된 Sf9 세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. FVIIIXTEN ceDNA(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
도 25a 내지 도 25c는 본 발명의 일 구현예에 따른 2 BAC 접근법을 사용한 인간 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산을 보여준다. 도 25a는 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산의 2 BAC 접근법의 개략도이며, 여기서 Sf9 세포는 HBoV1 ITR이 측접하는 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 (AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRsTn7) 및/또는 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 HBoV1 NS1 유전자를 인코딩하는 (AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1Tn7) 재조합 BEV로 공동-감염된다. 도 25b는 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRsTn7 및 AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1Tn7 BEV의 도식적 맵을 보여준다. 도 25c는 표시된 바와 같은 일정한 비의 상이한 MOI 또는 일정한 MOI의 상이한 비의 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRsTn7 및 AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1Tn7 BEV로 공동-감염된 Sf9 세포로부터 단리된 ceDNA 벡터의 아가로스 겔 전기영동 이미지이다. FVIIIXTEN ceDNA 벡터(ceDNA), 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 및 Sf9 세포 게놈 DNA(gDNA)의 크기에 해당하는 DNA 밴드는 화살표로 표시된다.
2 개 이상의 외래 서열의 발현에 적합한 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템이 본원에 제공된다. 예를 들어, ceDNA를 생산하기 위해, 본원에 기재된 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 사용하는 방법도 제공된다.
I. 정의
단수형("a" 또는 "an") 엔티티는 그 엔티티 중 하나 이상을 지칭한다는 것에 유의해야 하며, 예를 들어, "뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 유사하게, "치료 단백질" 및 "miRNA"는 각각 하나 이상의 치료 단백질 및 하나 이상의 miRNA를 나타내도록 이해된다. 따라서, 단수형 용어("a" (또는 "an")), 용어 "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.
용어 "약"은 대략, 거의, 가량 또는 ~한 정도를 의미하기 위해 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 기재된 수치값의 위와 아래로 경계를 확장하여 그 범위를 수식한다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 10 퍼센트 위 또는 아래의(더 높거나 더 낮은) 변량만큼 언급된 값보다 높은 및 낮은 수치값을 수식하도록 사용된다.
본원에 또한 사용된 바와 같이, "및/또는"은 대안("또는")으로 해석될 때 연관된 기재된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 및 조합의 결여를 지칭하고 포함한다.
"핵산", "핵산 분자", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드(들) 서열" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호교환 가능하게 사용되고, 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체 형태, 또는 임의의 이의 포스포에스테르 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 및 티오에스테르(단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 나선)를 지칭한다. 단일 가닥 핵산 서열은 단일 가닥 DNA(ssDNA) 또는 단일 가닥 RNA(ssRNA)를 지칭한다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA, 및 RNA-RNA 나선이 가능하다. 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자라는 용어는 분자의 일차 및 이차 구조만을 지칭하며, 이를 임의의 특정한 삼차 형태로 제한하지는 않는다. 따라서, 이 용어는 특히 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들어, 제한 단편)로 발견되는 이중 가닥 DNA, 플라스미드, 초나선 DNA 및 염색체를 포함한다. 특정한 이중 가닥 DNA 분자의 구조를 논의하는 데 있어서, 서열은 DNA의 비전사된 가닥(즉, mRNA에 상동성인 서열을 갖는 가닥)을 따라 오직 5'에서 3' 방향으로의 서열만 제공하는 일반 관례에 따라 본원에 기재될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA, 및 반-합성 DNA를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 개시내용의 "핵산 조성물"은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "역위 말단 반복부"(또는 "ITR")는 뉴클레오티드 세트(초기 서열), 이어서 다운스트림에 그 역상 보체, 즉 회문 서열을 포함하는, 단일 가닥 핵산 서열의 5' 또는 3' 말단에 위치한 핵산 하위서열을 지칭한다. 초기 서열과 역상 보체 사이의 개재 뉴클레오티드 서열은 0을 포함하는 임의의 길이일 수 있다. 일 구현예에서, 본 개시내용에 유용한 ITR은 하나 이상의 "회문 서열"을 포함한다. ITR은 임의의 수의 기능을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 ITR은 헤어핀 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, ITR은 T-형상 헤어핀 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, ITR은 비-T-형상 헤어핀 구조, 예를 들어 U-형상 헤어핀 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 장기간 생존을 촉진한다. 일부 구현예에서, ITR은 (예를 들어, 세포의 수명 전제에 대해) 세포의 핵에서 핵산 분자의 영구적인 생존을 촉진한다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 안정성을 촉진한다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 유지를 촉진한다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 지속성을 촉진한다. 일부 구현예에서, ITR은 세포의 핵에서 핵산 분자의 분해를 저해하거나 방지한다.
따라서, 본원에서 사용되는 "ITR"은 자체적으로 다시 폴딩되어 이중 가닥 세그먼트를 형성할 수 있다. 예를 들어, 서열 GATCXXXXGATC는, 폴딩되어 이중 나선을 형성할 때 GATC의 초기 서열 및 이의 보체(3'CTAG5')를 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 초기 서열과 역상 보체 사이에 연속 회문 서열(예를 들어, GATCGATC)을 포함한다. 일부 구현예에서, ITR은 초기 서열과 역상 보체 사이에 중단된 회문 서열(예를 들어, GATCXXXXGATC)을 포함한다. 일부 구현예에서, 연속 또는 중단된 회문 서열의 상보성 섹션은 서로 상호작용하여 "헤어핀 루프" 구조를 형성한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "헤어핀 루프" 구조는 단일 가닥 뉴클레오티드 분자에서의 적어도 2 개의 상보성 서열이 염기 쌍을 이루어 이중 가닥 섹션을 형성할 때 생긴다. 일부 구현예에서, ITR의 일부만이 헤어핀 루프를 형성한다. 다른 구현예에서는, ITR 전체가 헤어핀 루프를 형성한다.
본 개시내용에서, 적어도 하나의 ITR은 비-아데노바이러스 연관된 바이러스(비-AAV)의 ITR이다. 소정의 구현예에서, ITR은 바이러스 파보비리다에 과의 비-AAV 구성원의 ITR이다. 일부 구현예에서, ITR은 데펜도바이러스(Dependovirus) 속 또는 에리트로바이러스(Erythrovirus) 속의 비-AAV 구성원의 ITR이다. 특정한 구현예에서, ITR은 거위 파보바이러스(GPV), 머스코비(Muscovy) 오리 파보바이러스(MDPV), 또는 에리트로바이러스 파보바이러스 B19(파보바이러스 B19로도 공지됨 - 본원에서는 "B19", 영장류 에리트로파보바이러스 1, B19 바이러스, 및 에리트로바이러스로도 지칭됨)의 ITR이다. 소정의 구현예에서, 2 개의 ITR 중 하나의 ITR은 AAV의 ITR이다. 다른 구현예에서, 작제물에 있는 2 개의 ITR 중 하나의 ITR은 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 AAV 혈청형의 ITR이다. 하나의 특정한 구현예에서, ITR은 AAV 혈청형 2로부터 유래된다(예를 들어, AAV 혈청형 2의 ITR).
본 개시내용의 소정의 양태에서, 핵산 분자는 2 개의 ITR, 즉 5' ITR 및 3' ITR을 포함하고, 여기서 5' ITR은 핵산 분자의 5' 말단에 위치하고, 3' ITR은 핵산 분자의 3' 말단에 위치한다. 5' ITR 및 3' ITR은 동일한 바이러스 또는 상이한 바이러스로부터 유래될 수 있다. 소정의 구현예에서, 5' ITR은 AAV로부터 유래되고, 3' ITR은 AAV 바이러스로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 비-AAV). 일부 구현예에서, 3' ITR은 AAV로부터 유래되고, 5' ITR은 AAV 바이러스로부터 유래되지 않는다(예를 들어, 비-AAV). 다른 구현예에서, 5' ITR은 AAV 바이러스로부터 유래되지 않고(예를 들어, 비-AAV), 3' ITR은 동일한 또는 상이한 비-AAV 바이러스로부터 유래된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "파보바이러스"는 비제한적으로 자율 복제 파보바이러스 및 데펜도바이러스를 포함하는 파보비리다에 과를 포함한다. 자율적 파보바이러스는 예를 들어 보카바이러스(Bocavirus), 데펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스(Amdovirus), 파보바이러스(Parvovirus), 덴소바이러스(Densovirus), 이테라바이러스(Iteravirus), 콘트라바이러스(Contravirus), 아베파보바이러스(Aveparvovirus), 코피파보바이러스(Copiparvovirus), 프로토파보바이러스(Protoparvovirus), 테트라파보바이러스(Tetraparvovirus), 암비덴소바이러스(Ambidensovirus), 브레비덴소바이러스(Brevidensovirus), 헤판덴소바이러스(Hepandensovirus) 및 펜스틸덴소바이러스(Penstyldensovirus) 속의 구성원을 포함한다.
예시적인 자율적 파보바이러스는 돼지 파보바이러스, 마우스 미세 바이러스, 개 파보바이러스, 밍크 장염 바이러스, 소 파보바이러스, 닭 파보바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 파보바이러스, 거위 파보바이러스, H1 파보바이러스, 머스코비 오리 파보바이러스, 뱀 파보바이러스 및 B19 바이러스를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 다른 자율적 파보바이러스는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참고한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "비-AAV"는 파보비리다에 과의 임의의 아데노-연관된 바이러스(AAV)를 제외하고 파보비리다에 과로부터의 핵산, 단백질 및 바이러스를 포함한다. "비-AAV"는 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스, 파보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파보바이러스, 코피파보바이러스, 프로토파보바이러스, 테트라파보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스 및 펜스틸덴소바이러스 속의 자율 복제 구성원을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "아데노-연관된 바이러스"(AAV)는 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3(유형 3A 및 3B를 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 문헌[Gao et al. (J. Virol. 78:6381 (2004))] 및 문헌[Moris et al. (Virol. 33:375 (2004))]에 의해 개시된 AAV 혈청형 및 클레이드, 및 현재 공지되어 있거나 나중에 발견되는 임의의 기타 AAV를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 예를 들어, 문헌[FIELDS et al. VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)]을 참고한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "~로부터 유래된"은 특정된 분자 또는 유기체로부터 단리되거나 이를 사용하여 만들어진 성분, 또는 특정된 분자 또는 유기체로부터의 정보(예를 들어, 아미노산 또는 핵산 서열)를 지칭한다. 예를 들어, 제2 핵산 서열(예를 들어, ITR)로부터 유래된 핵산 서열(예를 들어, ITR)은 제2 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 경우에, 유래된 종은 예를 들어 천연 발생 돌연변이유발, 인공적으로 유도된 돌연변이유발 또는 인공 무작위 돌연변이유발에 의해 얻어질 수 있다. 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 유도하도록 사용된 돌연변이유발은 의도적으로 유도되거나 의도적으로 무작위이거나, 각각의 혼합일 수 있다. 제1로부터 유래된 상이한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 생성하기 위한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 돌연변이유발은 무작위 사건일 수 있고(예를 들어, 중합효소 불충실(polymerase infidelity)에 의해 야기됨), 유래된 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 식별은 예를 들어 본원에 논의된 적절한 스크리닝 방법에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드의 돌연변이유발은 전형적으로 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 조작을 수반한다. 일부 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 유래된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 각각 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, 여기서 제1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 다른 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)과 적어도 90% 동일하고, 여기서 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)과 적어도 80% 동일하고, 여기서 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)과 적어도 70% 동일하고, 여기서 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)과 적어도 60% 동일하고, 여기서 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)과 적어도 50% 동일하고, 여기서 비-AAV(또는 AAV) ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다.
소정의 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 단편은 적어도 약 5 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 10 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 15 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 20 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 25 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 30 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 35 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 40 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 45 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 50 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 55 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 60 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 65 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 70 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 75 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 80 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 85 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 90 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 95 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 100 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 125 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 150 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 175 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 200 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 225 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 250 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 275 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 300 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 325 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 350 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 375 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 400 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 425 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 450 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 475 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 500 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 525 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 550 개의 뉴클레오티드, 적어도 약 575 개의 뉴클레오티드, 또는 적어도 약 600 개의 뉴클레오티드를 포함하고; 여기서 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 소정의 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 단편은 적어도 약 129 개의 뉴클레오티드를 포함하고, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다. 소정의 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 단편은 적어도 약 102 개의 뉴클레오티드를 포함하고, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 기능적 특성을 보유한다.
일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 단편을 포함하거나 이로 구성되고, 여기서 단편은 비-AAV(또는 AAV)의 ITR의 길이의 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98% 또는 적어도 약 99%를 포함한다.
소정의 구현예에서, 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열로부터 유래된 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 적절히 정렬될 때 각각 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 상동성 부분과 적어도 50%, 적어도 51%, 적어도 52%, 적어도 53%, 적어도 54%, 적어도 55%, 적어도 56%, 적어도 57%, 적어도 58%, 적어도 59%, 적어도 60%, 적어도 61%, 적어도 62%, 적어도 63%, 적어도 64%, 적어도 65%, 적어도 66%, 적어도 67%, 적어도 68%, 적어도 69%, 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖고, 여기서 제1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 다른 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 적절히 정렬될 때 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 상동성 부분과 적어도 90% 동일하고, 여기서 제1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 적절히 정렬될 때 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 상동성 부분과 적어도 80% 동일하고, 여기서 제1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 적절히 정렬될 때 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 상동성 부분과 적어도 70% 동일하고, 여기서 제1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 적절히 정렬될 때 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 상동성 부분과 적어도 60% 동일하고, 여기서 제1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다. 일부 구현예에서, 비-AAV(또는 AAV)의 ITR로부터 유래된 ITR은 적절히 정렬될 때 비-AAV ITR(또는 각각 AAV ITR)의 상동성 부분과 적어도 50% 동일하고, 여기서 제1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다.
"무-캡시드" 또는 "캡시드가 적은" 벡터 또는 핵산 분자는 캡시드가 없는 벡터 작제물을 지칭한다. 일부 구현예에서, 캡시드가 적은 벡터 또는 핵산 분자는 예를 들어 AAV Rep 단백질을 인코딩하는 서열을 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 무-캡시드 또는 캡시드가 적은 벡터는 본원에서 "폐쇄 말단 DNA(ceDNA)"로 지칭되는, 공유결합적으로 폐쇄된 말단을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 ceDNA는 본 발명의 바큘로바이러스 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있으며, ceDNA는 일반적으로 양쪽에 ITR(예를 들어 AAV 또는 비-AAV ITR)이 측접하는 이종 유전자 산물을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역 가능한 코돈으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않음에도 불구하고 코딩 영역의 부분인 것으로 간주될 수 있지만, 임의의 측접 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사 종결자, 인트론 등은 코딩 영역의 부분이 아니다. 코딩 영역의 경계는 전형적으로, 생성된 폴리펩티드의 아미노 말단을 인코딩하는 5' 말단에서의 시작 코돈 및 생성된 폴리펩티드의 카르복실 말단을 인코딩하는 3' 말단에서의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 2 개 이상의 코딩 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 작제물에, 예를 들어 단일 벡터 상에, 또는 별개의 폴리뉴클레오티드 작제물에, 예를 들어 별개의(상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 그러면, 따라서 단일 벡터는 단지 단일 코딩 영역을 함유하거나 2 개 이상의 코딩 영역을 포함할 수 있다.
조면 소포체에 걸쳐 성장하는 단백질 쇄의 배출이 개시되면 포유류 세포에 의해 분비된 소정의 단백질은 성숙 단백질로부터 절단되는 분비 신호 펩티드와 회합된다. 당업자는 신호 펩티드가 일반적으로 폴리펩티드의 N-말단에 융합되고 완전한 또는 "전장" 폴리펩티드로부터 절단되어 분비된 또는 "성숙한" 형태의 폴리펩티드를 생산한다는 것을 알고 있다. 소정의 구현예에서, 천연 신호 펩티드 또는 그 서열의 기능적 유도체는 그와 작동 가능하게 회합된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유한다. 대안적으로, 이종 포유류 신호 펩티드, 예를 들어 인간 조직 플라스미노겐 활성자(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제 신호 펩티드, 또는 이의 기능적 유도체를 사용할 수 있다.
용어 "다운스트림"은 참조 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 다운스트림 뉴클레오티드 서열은 전사의 출발점 뒤의 서열과 관련된다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 시작 부위의 다운스트림에 위치한다.
용어 "업스트림"은 참조 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 업스트림 뉴클레오티드 서열은 코딩 영역의 5'측 또는 전사의 출발점에 위치한 서열과 관련된다. 예를 들어, 대부분의 프로모터는 전사의 시작 부위의 업스트림에 위치한다.
본원에서 사용되는 용어 "유전적 카세트" 또는 "발현 카세트"는 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 적절한 숙주 세포에서 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 지시할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 유전적 카세트는 코딩 영역의 업스트림(5' 비-코딩 서열), 내부, 또는 다운스트림(3' 비-코딩 서열)에 위치하여, 회합된 코딩 영역의 전사, RNA 가공, 안정성, 또는 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서 발현되도록 의도된 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3'에 위치할 것이다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 유전자 산물을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 miRNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
산물, 예를 들어 miRNA 또는 유전자 산물(예를 들어, 치료 단백질과 같은 폴리펩티드)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 코딩 영역과 작동 가능하게 회합된 프로모터 및/또는 다른 발현(예를 들어, 전사 또는 번역) 제어 서열을 포함할 수 있다. 작동 가능한 회합에서, 유전자 산물, 예를 들어 폴리펩티드에 대한 코딩 영역은 유전자 산물의 발현을 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 두는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 회합된다. 예를 들어, 코딩 영역 및 프로모터는, 프로모터 기능의 유도가 코딩 영역에 의해 인코딩된 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 초래하는 경우, 및 프로모터와 코딩 영역 사이의 연결의 성질이 유전자 산물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동 가능하게 회합"된 것이다. 프로모터 외에 다른 발현 제어 서열, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호가 또한 유전자 산물 발현을 지시하도록 코딩 영역과 작동 가능하게 회합될 수 있다.
"발현 제어 서열"은 숙주 세포에서 코딩 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인핸서, 종결자 등과 같은 조절 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일반적으로 발현 제어 서열은 작동 가능하게 연결된 코딩 핵산의 효율적인 전사 및 번역을 용이하게 하는 임의의 조절 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현 제어 서열의 비제한적인 예는 프로모터, 인핸서, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 부위, 이펙터 결합 부위, 또는 스템-루프 구조를 포함한다. 다양한 발현 제어 서열이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 비제한적으로 사이토메갈로바이러스(인트론-A와 함께, 전초기 프로모터), 유인원 바이러스 40(초기 프로모터), 및 레트로바이러스(예컨대 라우스 육종 바이러스)로부터의 프로모터 및 인핸서 세그먼트와 같은, 척추동물 세포에서 기능하는 발현 제어 서열을 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 다른 발현 제어 서열은 척추동물 유전자로부터 유래된 것들, 예컨대 액틴, 열충격 단백질, 소 성장 호르몬, 및 토끼 β-글로빈, 뿐만 아니라 진핵 세포에서 유전자 발현을 제어할 수 있는 다른 서열을 포함한다. 추가의 적합한 발현 제어 서열은 조직-특이적 프로모터 및 인핸서, 뿐만 아니라 림포카인-유도성 프로모터(예를 들어, 인터페론 또는 인터류킨에 의해 유도 가능한 프로모터)를 포함한다. 다른 발현 제어 서열은 인트론 서열, 전사-후 조절 요소, 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 추가의 예시적 발현 제어 서열은 본 개시내용의 다른 곳에서 논의된다.
유사하게, 다양한 번역 제어 요소가 당업자에게 공지되어 있다. 이들은, 리보솜 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 피코나바이러스로부터 유래된 요소(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, 또는 IRES))를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 유전자 산물, 예를 들어, RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 프로세스를 지칭한다. 이는 비제한적으로 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA(tRNA), 작은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA) 또는 임의의 다른 RNA 산물로의 폴리뉴클레오티드의 전사, 및 폴리펩티드로의 mRNA의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에 사용된 바와 같이, 유전자 산물은 핵산, 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생산된 메신저 RNA 또는 전사물로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 산물은 전사 후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산 또는 번역 후 변형, 예를 들어 메틸화, 글리코실화, 지질의 추가, 다른 단백질 서브유닛과의 회합 또는 단백질 분해 절단을 갖는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "수율"은 유전자의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드의 양을 지칭한다.
"벡터"는 숙주 세포 내로의 핵산의 전달 및/또는 클로닝을 위한 임의의 비히클을 지칭한다. 벡터는 부착된 세그먼트의 복제를 발생시키도록 또 다른 핵산 세그먼트가 부착될 수 있는 레플리콘일 수 있다. "레플리콘"은 생체내에서 복제의 자율 단위로서의 기능을 하는, 즉 자체적인 제어 하에 복제될 수 있는 임의의 유전 요소(예를 들어, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포 내로 핵산을 도입하기 위한 비히클을 포함한다. 많은 수의 벡터는 당업계에서 공지되고 사용되며, 이는 예를 들어 플라스미드, 변형된 진핵 바이러스 또는 변형된 박테리아 바이러스를 포함한다. 적합한 벡터 내로 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것은 상보성 돌출 말단을 갖는 선택된 벡터 내에 적절한 폴리뉴클레오티드 단편을 라이게이션시킴으로써 달성될 수 있다.
벡터는 벡터가 혼입된 세포의 선택 또는 식별을 제공하는 선택 가능한 마커 또는 리포터를 인코딩하도록 조작될 수 있다. 선택 가능한 마커 또는 리포터의 발현은 벡터 상에 함유된 다른 코딩 영역을 혼입하고 발현하는 숙주 세포의 식별 및/또는 선택을 가능하게 한다. 당업계에서 공지되고 사용되는 선택 가능한 마커 유전자의 예는 다음을 포함한다: 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 술폰아미드 등에 대한 저항성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자 등. 당업계에서 공지되고 사용되는 리포터의 예는 다음을 포함한다: 루시퍼라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등. 선택 가능한 마커는 또한 리포터인 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "숙주 세포"는 예를 들어 ssDNA 또는 벡터의 수혜자로서 사용될 수 있거나 사용되었던 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유류 세포를 지칭한다. 이 용어는 형질도입된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 "숙주 세포"는 일반적으로, 외인성 DNA 서열로 형질도입된 세포를 지칭한다. 단일 모 세포의 자손이 자연적, 우발적, 또는 의도적 돌연변이로 인해 원래의 모체와 형태 또는 게놈 또는 전체 DNA 보체에서 완전히 동일할 필요는 없는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 시험관내 숙주 세포일 수 있다.
용어 "선택 가능한 마커"는 식별 인자, 일반적으로 마커 유전자의 효과, 즉 항생제에 대한 저항성, 제초제에 대한 저항성에 기초하여 선택될 수 있는 항생제 또는 화학물질 저항성 유전자, 비색 마커, 효소, 형광 마커 등을 지칭하고, 여기서 효과는 관심 핵산의 유전성을 추적하고/하거나, 관심 핵산을 유전시킨 세포 또는 유기체를 식별하기 위해 사용된다. 당업계에서 공지되고 사용되는 선택 가능한 마커 유전자의 예는 다음을 포함한다: 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 술폰아미드 등에 대한 저항성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자 등.
용어 "리포터 유전자"는 리포터 유전자의 효과에 기초하여 식별될 수 있는 식별 인자를 인코딩하는 핵산을 지칭하고, 여기서 효과는 관심 핵산의 유전성을 추적하고/하거나, 관심 핵산을 유전시킨 세포 또는 유기체를 식별하고/하거나, 유전자 발현 유도 또는 전사를 측정하는 데 이용된다. 당업계에서 공지되고 사용되는 리포터 유전자의 예는 다음을 포함한다: 루시퍼라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등. 선택 가능한 마커 유전자는 또한 리포터 유전자인 것으로 간주될 수 있다.
"프로모터" 및 "프로모터 서열"은 상호교환 가능하게 사용되고, 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 그 전체가 천연 유전자로부터 유래되거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성되거나, 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 당업자는 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음을 이해한다. 대부분의 경우 대부분의 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 흔히 "항시적 프로모터"로 지칭된다. 특정 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 흔히 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로 지칭된다. 특정 발달 또는 세포 분화 단계에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 흔히 "발달-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로 지칭된다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 광 등으로 세포를 노출시키거나 처리한 후 유도되고 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 흔히 "유도성 프로모터" 또는 "조절 가능한 프로모터"로 지칭된다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지는 않았기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편은 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인식된다.
프로모터 서열은 전형적으로 이의 3' 말단에서 전사 개시 부위와 경계를 이루고, 배경 위의 검출 가능한 수준에서 전사를 개시하기 위해 필요한 염기 또는 요소의 최소 수를 포함하도록 업스트림(5' 방향)으로 연장한다. (편리하게는 예를 들어 뉴클레아제 S1을 이용한 맵핑에 의해 정의된) 전사 개시 부위, 뿐만 아니라 RNA 중합효소의 결합에 관여하는 단백질 결합 도메인(공통 서열)이 프로모터 서열 내에서 발견될 것이다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 소정의 구현예에서, 조직 특이적 프로모터는 간, 예를 들어 간세포 및/또는 내피 세포에서 치료 단백질, 예를 들어 응고 인자의 발현을 구동한다. 특정한 구현예에서, 프로모터는 마우스 트랜스티레틴 프로모터(mTTR), 천연 인간 인자 VIII 프로모터, 인간 알파-1-안티트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 트리스테트라프롤린(TTP) 프로모터, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 간 특이적 프로모터(예를 들어, α1-안티트립신(AAT)), 근육 특이적 프로모터(예를 들어, 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 및 데스민(DES)), 합성 프로모터(예를 들어, SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, 및 tMCK), 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다. 하나의 특정한 구현예에서, 프로모터는 TTP 프로모터를 포함한다.
용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소"는 상호교환 가능하게 사용되고, 이중 가닥 DNA 내의 특이적 뉴클레오티드 서열에 결합하고 그 내부를 절단하는 효소를 지칭한다.
용어 "플라스미드"는, 세포의 중추 대사의 부분이 아니고 일반적으로 원형 이중 가닥 DNA 분자의 형태인 유전자를 운반하는 경우가 많은 염색체외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 임의의 공급원로부터 유래된, 선형, 원형 또는 초나선, 단일 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA의 자율 복제 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있는데, 여기서 세포 내로 적절한 3' 비번역된 서열과 함께 선택된 유전자 산물에 대한 DNA 서열 및 프로모터 단편을 도입할 수 있는 고유한 작제물로 다수의 뉴클레오티드 서열이 연결되거나 재조합된다.
사용될 수 있는 진핵 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관된 바이러스 벡터, 폭스바이러스, 예를 들어 백시니아 바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 또는 헤르페스바이러스 벡터를 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리포솜, 전기적으로 하전된 지질(시토펙틴), DNA-단백질 복합체, 및 바이오폴리머를 포함한다.
"클로닝 벡터"는 순차적으로 복제되는 핵산의 단위 길이이고, 부착된 세그먼트의 복제를 발생시키도록 또 다른 핵산 세그먼트가 부착될 수 있는 복제 원점, 예컨대 플라스미드, 파지 또는 코스미드를 포함하는 "레플리콘"을 지칭한다. 소정의 클로닝 벡터는 하나의 세포 유형, 예를 들어 박테리아에서의 복제 및 또 다른, 예를 들어 진핵 세포에서의 발현을 할 수 있다. 클로닝 벡터는 전형적으로 벡터를 포함하는 세포의 선택에 사용될 수 있는 하나 이상의 서열 및/또는 관심 핵산 서열의 삽입을 위한 하나 이상의 다중 클로닝 부위를 포함한다.
용어 "발현 벡터"는 숙주 세포로의 삽입 후 삽입된 핵산 서열의 발현을 가능하게 하도록 설계된 비히클을 지칭한다. 삽입된 핵산 서열은 상기 기재된 바와 같은 조절 영역과 작동 가능하게 회합되도록 배치된다.
벡터는 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어 형질감염, 전기천공, 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 인산칼슘 침전, 리포펙션(리소좀 융합), 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 수송체에 의해 숙주 세포 내로 도입된다. 본원에 사용된 바와 같이 "배양", "~에 대한 배양" 및 "배양하는"은 세포 성장 또는 분열을 가능하게 하는 시험관내 조건 하에 세포를 인큐베이션시키거나, 세포를 살아 있는 상태로 유지하는 것을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이 "배양된 세포"는 시험관내에서 증식되는 세포를 의미한다.
당업계에 공지된 바와 같이 용어 "동일성 퍼센트"는, 서열을 비교하여 결정된 바와 같은, 2 개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2 개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당업계에서, "동일성"은 또한, 이러한 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정된 바와 같이, 경우에 따라서는, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 문헌[ Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); and Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991)]에 기재된 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 사이의 최고의 매치를 주도록 설계된다. 동일성을 결정하기 위한 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 코드화된다. 서열 정렬 및 동일성 퍼센트 계산은 서열 분석 소프트웨어, 예컨대 LASERGENE bioinformatics computing suite의 Megalign 프로그램(DNASTAR Inc., Madison, WI), 프로그램의 GCG 스위트(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990)) 및 DNASTAR(DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA)를 이용하여 수행될 수 있다. 본 출원의 맥락 내에, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우, 분석의 이 결과가, 달리 특정되지 않는 한, 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초할 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이 "디폴트 값"은 처음에 초기설정될 때 소프트웨어에 의해 원래 로딩하는 값 또는 파라미터의 임의의 세트를 의미할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 본 개시내용의 특정 서열에서의 뉴클레오티드에 상응하는 뉴클레오티드는 참조 서열과의 동일성을 최대화하기 위해 본 개시내용의 서열의 정렬에 의해 식별된다. 참조 서열에서의 동등한 아미노산을 식별하기 위해 사용된 수는 본 개시내용의 서열에서의 상응하는 아미노산을 식별하기 위해 사용된 수에 기초한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "이종" 또는 "외인성"은 주어진 맥락, 예를 들어 세포 또는 폴리펩티드에서 보통 발견되지 않는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 외인성 또는 이종 분자는 세포 내로 도입될 수 있고, 단지 예를 들어 형질감염 또는 다른 형태의 유전자 조작에 의한 세포의 조작 후 존재하거나, 이종 아미노산 서열은 이것이 자연에서 발견되지 않는 단백질에 존재할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "이종 뉴클레오티드 서열"은 주어진 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 자연에서 발생하지 않는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일 구현예에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 치료 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII의 반감기를 연장할 수 있는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또 다른 구현예에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 치료 단백질, 예를 들어 응고 인자, 예를 들어 FVIII의 유체역학적 반경을 증가시키는 폴리펩티드를 인코딩한다. 다른 구현예에서, 이종 뉴클레오티드 서열은 생물학적 활성 또는 기능(예를 들어, 응혈 활성)에 유의미하게 영향을 미치지 않으면서 치료 단백질의 하나 이상의 약동학적 특성을 개선하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 링커에 의해 이종 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드에 연결되거나 접속된다. 이종 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 모이어티의 비제한적인 예에는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 부분, 알부민 또는 이의 단편, 알부민 결합 모이어티, 트랜스페린, 미국 특허 출원 번호 20100292130의 PAS 폴리펩티드, HAP 서열, 트랜스페린 또는 이의 단편, 인간 융모성 성선 자극 호르몬의 β 서브유닛의 C-말단 펩티드(CTP), 알부민 결합 소분자, XTEN 서열, FcRn 결합 모이어티(예를 들어, 완전한 Fc 영역 또는 FcRn에 결합하는 이의 부분), 단일쇄 Fc 영역(예를 들어 US 2008/0260738, WO 2008/012543, 또는 WO 2008/1439545에 기재된 ScFc 영역), 폴리글리신 링커, 폴리세린 링커, 특히, 50% 미만에서 50% 초과까지 다양한 정도의 이차 구조를 갖는, 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로부터 선택된 두 가지 유형의 아미노산의 6 내지 40 개 아미노산의 된 펩티드 및 짧은 폴리펩티드, 또는 이들의 둘 이상의 조합이 포함된다. 일부 구현예에서, 이종 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 폴리펩티드는 비-폴리펩티드 모이어티에 연결된다. 비-폴리펩티드 모이어티의 비제한적인 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 알부민 결합 소분자, 폴리시알산, 하이드록시에틸 전분(HES), 이의 유도체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오티드 서열과 관련하여, 용어 "최적화된"은 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열은 그 폴리뉴클레오티드 서열의 특성을 강화하도록 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 최적화는 전사 수준을 증가시키거나, 번역 수준을 증가시키거나, 항정-상태 mRNA 수준을 증가시키거나, 조절 단백질, 예컨대 일반적인 전사 인자의 결합을 증가시키거나 감소시키거나, 스플라이싱을 증가시키거나 감소시키거나, 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 생산된 폴리펩티드의 수율을 증가시키기 위해 수행된다. 폴리뉴클레오티드 서열을 최적화하기 위해 그에 이루어질 수 있는 변화의 예는 코돈 최적화, G/C 함량 최적화, 반복 서열의 제거, AT 풍부 요소의 제거, 은성 스플라이스 부위의 제거, 전사 또는 번역을 억제하는 시스 작용성 요소의 제거, 폴리-T 또는 폴리-A 서열의 추가 또는 제거, 전사를 강화하는 전사 시작 부위 주위의 서열, 예컨대 코작(Kozak) 공통 서열의 추가, 스템 루프 구조를 형성할 수 있는 서열의 제거, 불안정화 서열의 제거, 및 2 개 이상의 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "박미드"는 이.콜라이 및 곤충 세포 둘 모두에서 증식할 수 있는 셔틀 벡터를 지칭한다. 재조합 박미드는 이종 서열(예를 들어, 이종 유전자를 인코딩하는 이종 서열)을 포함하는 박미드를 지칭한다.
II. 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템
바큘로바이러스 셔틀 벡터(박미드) 및/또는 치료 약물 제품을 생산하도록 조작된 안정 세포주를 포함하는 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템이 본원에 제공된다. 본원에 제공되는 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템은 2 개 이상의 외래 서열 삽입 부위를 포함하는 재조합 박미드, 및 외래 서열 삽입 부위로의 외래 서열(예를 들어, 이종 유전자)의 삽입을 매개할 수 있는 하나 이상의 공여체 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 치료 약물 제품은 단백질이다. 일부 구현예에서, 치료 약물 제품은 핵산이다. 일부 구현예에서, 치료 약물 제품은 예를 들어, 백신, 단백질 대체 요법(예를 들어 효소 대체 요법), 및 기초 및 응용 연구를 위한 재조합 단백질을 포함하는 다양한 적용에 사용될 수 있는 재조합 단백질이다. 소정의 구현예에서, 치료 약물 제품은 표적 서열을 인코딩하는 플라스미드-유사, 무 캡시드, 핵산 분자인 DNA 치료 약물 물질이다. DNA 치료 약물 물질은 공유결합적으로 폐쇄된-말단 DNA(ceDNA)의 형태일 수 있다. 일반적으로 ceDNA는 제1 역위 말단 반복부(5' ITR)와 제2 ITR(3' ITR) 사이에 위치한 치료 단백질-코딩 유전자를 포함한다.
소정의 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 아데노-연관된 바이러스(AAV) ITR 또는 비-AAV ITR이다. 소정의 구현예에서, 비-AAV ITR은 바이러스 파보비리다에 과의 구성원으로부터 얻어진 ITR이다. 적합한 ITR 서열은 당업자에게 공지된 AAV 혈청형의 AAV ITR을 포함한다. 적합한 AAV 및 비-AAV ITR 서열은 PCT 공개 번호 WO2019032898A1, WO2020033863A1, 및 WO2017152149A1에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 비-AAV ITR 서열은 거위 파보바이러스(GPV) 또는 파보바이러스 B19(본원에서 "B19"로도 지칭됨)로부터 유래될 수 있다.
A. 바큘로바이러스 셔틀 벡터(박미드)
바큘로바이러스는 곤충을 감염시키는 가장 유명한 바이러스이다. 500 가지가 넘는 바큘로바이러스 단리물이 식별되었으며, 그 중 대부분은 인시목(Lepidoptera) 곤충에서 비롯되었다. 가장 흔한 두 가지 단리물은 아우토그라파 칼리포니카 다중 핵다각체병바이러스(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) 및 누에 핵다각체병바이러스 (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)이다. 유전자 요법을 위한 바이러스 또는 비-바이러스 벡터를 생산할 때 대개 몇몇 바큘로바이러스 발현 벡터가 곤충 숙주 세포 내로 감염되는 것이 요구된다. 바큘로바이러스 발현 벡터 각각의 생성은 시간 소모적이며, 생산 비용을 급등시키며, 이는 본 발명 이전의 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템의 유의미한 단점에 해당한다.
소정의 구현예에서, 본원에 제공된 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템은, 본원에서 "BIVVBac"로 지칭되는, 재조합 박미드를 포함한다. BIVVBac의 대표적 도식은 도 1의 C에 나타나 있다. 소정의 구현예에서, BIVVBac는 적어도 2 개의 외래 서열 삽입 부위를 포함하는 유전적으로 변형된 AcMNPV이다. 적어도 2 개의 외래 서열 삽입 부위를 포함하는 박미드를 포함하는 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템은 생성될 필요가 있는 바큘로바이러스 발현 벡터의 총 수의 감소를 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 유전자 요법 벡터를 생산하기 위해서는 본 발명의 단일 바큘로바이러스 발현 벡터가 필요하다.
소정의 구현예에서, BIVVBac는 제1 및 제2 외래 서열 삽입 부위를 포함한다. 제1 및 제2 외래 서열 삽입 부위는 상이할 수 있으며, 외래 서열(예를 들어, 이종 서열, 이종 유전자)의 삽입을 구동하기 위해 상이한 기구를 활용한다. 외래 서열의 삽입은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 구동될 수 있다. 예를 들어, 외래 서열은 전위 또는 부위-특이적 재조합에 의해 삽입될 수 있다. 외래 서열 삽입 부위는 외래 서열의 삽입 시 리포터 유전자가 파괴되도록 리포터 유전자 내에 포함되는 것으로 설계될 수 있다. 리포터 유전자의 파괴는 삽입된 외래 서열을 내부에 갖는 박미드 클론의 식별에 도움이 될 수 있다. 이러한 구현예에서는, 외래 서열 삽입 부위가 리포터 유전자와 인-프레임 융합되거나, 리포터 유전자가 외래 서열 삽입 부위와 인-프레임 융합된다.
소정의 구현예에서, 제1 및 제2 외래 서열 삽입 부위는 AcMNPV 내의 상이한 유전자좌에 위치한다. 소정의 구현예에서, 제1 및 제2 외래 서열 삽입 부위는 AcMNPV 내의 상이한 비-필수 유전자좌에 위치한다. AcMNPV의 다양한 비-필수 유전자좌는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리헤드린 유전자 및 EGT 유전자는 곤충 세포에서의 바이러스 복제를 위한 비-필수 AcMNPV 유전자이다. 따라서, 소정의 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 AcMNPV의 폴리헤드린 유전자좌에 위치하고, 제2 외래 서열 삽입 부위는 AcMNPV의 EGT 유전자좌에 위치한다.
소정의 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 전위를 통한 외래 서열의 삽입을 가능하게 한다. 소정의 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 트랜스포존의 삽입을 위한 우선 표적 부위를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 트랜스포존의 삽입을 위한 우선 표적 부위이다. 소정의 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 박테리아 트랜스포존에 대한 부착 부위인 우선 표적 부위이다. 적합한 박테리아 트랜스포존 및 이의 상응하는 부착 부위는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 트랜스포존 Tn7은 박테리아 염색체의 특정 부위(attTn7)로 높은 빈도로 전위되는 능력으로 공지되어 있다. 따라서, 소정의 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 Tn7 트랜스포존에 대한 부착 부위(예를 들어 attTn7)인 우선 표적 부위이다. 일부 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 mini-Tn7 트랜스포존에 대한 부착 부위(예를 들어, mini-attTn7, Tn7 전위 인자에 의한 인식 및 Tn7 트랜스포존의 삽입에 필요한 최소 DNA 서열)인 우선 표적 부위이다.
소정의 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 리포터 유전자와 인-프레임 융합된다. 리포터 유전자는 예를 들어 루시퍼라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 특정 색상의 형광 단백질, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 리포터 유전자일 수 있다. 소정의 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 발색성 기질을 대사할 수 있는 효소를 인코딩하는 리포터 유전자와 인-프레임 융합된다. 발색성 기질을 대사할 수 있는 효소는 동일한 특성을 갖는 당업계에 공지된 임의의 효소, 예를 들어 LacZ 또는 이의 기능적 부분일 수 있다. 발색성 기질을 대사할 수 있는 효소를 인코딩하는 리포터 유전자는 양성 삽입 사건에 대한 색상-기반 스크리닝에 사용된다. 예를 들어 LacZ는 블루-화이트 스크리닝에 사용되며, 여기서 기능적 LacZ 유전자 산물이 발색성 기질 X-gal 또는 블루-gal을 절단하여 청색 색소의 생산을 초래한다. 블루-화이트 스크리닝에서, 알파 보완에 의한 기능적 LacZ의 존재는 삽입 사건이 실패했음을 의미하며, 청색 콜로니는 외래 서열이 삽입되지 않은 클론에 해당한다. 반면, 백색 콜로니는 외래 서열이 성공적으로 삽입되어, 기능적 LacZ 유전자 산물의 생산을 방해하고 발색성 기질(예를 들어 X-gal)의 절단을 방지하는 클론에 해당한다.
따라서, 소정의 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 LacZα 또는 이의 기능적 부분을 인코딩하는 서열과 인-프레임 융합된 박테리아 트랜스포존에 대한 우선 표적 부위이다. 소정의 구현예에서, 제1 외래 서열 삽입 부위는 LacZα 또는 이의 기능적 부분을 인코딩하는 서열과 인-프레임 융합된 Tn7 트랜스포존에 대한 부착 부위(예를 들어 attTn7)인 우선 표적 부위이다. 성공적인 전위 시, 트랜스포존은 LacZα를 인코딩하는 서열을 파괴하여, 기능적 LacZ 유전자 산물의 생산 방해를 초래한다.
소정의 구현예에서, 제2 외래 서열 삽입 부위는 부위-특이적 재조합을 통한 외래 서열의 삽입을 가능하게 한다. 소정의 구현예에서, 제2 외래 서열 삽입 부위는 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 우선 표적 부위를 포함한다. 다양한 부위-특이적 재조합효소 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, Cre-loxP 시스템은 loxP 부위로 불리는 34 개 염기 쌍 DNA 서열을 인식할 수 있는 Cre 재조합효소를 통해 부위-특이적 재조합을 매개한다. 따라서, 제2 외래 서열 삽입 부위는 Cre 매개 재조합을 위한 우선 표적 부위이다. 소정의 구현예에서, 제2 외래 서열 삽입 부위는 loxP 부위 또는 Cre 재조합효소에 의해 인식될 수 있는 이의 변이체를 포함하는 우선 표적 부위이다.
본 발명의 재조합 박미드는 박테리아(예를 들어, 이.콜라이)와 곤충 세포 둘 모두에서 증식되는 능력에 필요한 다른 요소를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 박미드는 박테리아 레플리콘을 포함한다. 소정의 구현예에서, 박미드는 박테리아 레플리콘을 포함한다. 다양한 박테리아 레플리콘이 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 F 플라스미드 유래 기원의 레플리콘을 포함한다. 소정의 구현예에서, 적합한 박테리아 레플리콘은 복제 및 조절에 필요한 DNA 영역 oriS 및 incC로 구성된 F 플라스미드의 유도체인 mini-F 레플리콘이다. 소정의 구현예에서, 박테리아 레플리콘은 카피수가 적은 레플리콘이다. 소정의 구현예에서, 카피수가 적은 레플리콘은 mini-F 레플리콘이다.
본 발명의 재조합 박미드의 다른 요소는 하나 이상의 선택 가능한 마커 서열, 및 다른 리포터 유전자를 포함한다. 당업계에서 공지되고 사용되는 선택 가능한 마커 유전자의 예는 다음을 포함한다: 암피실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 비알라포스 제초제, 술폰아미드 등에 대한 저항성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자 등. 소정의 구현예에서, 재조합 박미드는 항생제 저항성 유전자를 포함하는 선택 가능한 마커 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 항생제 저항성 유전자는 카나마이신 저항성 유전자이고 카나마이신에 대한 저항성을 부여한다. 당업계에서 공지되고 사용되는 리포터의 예는 다음을 포함한다: 루시퍼라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등. 일부 경우에, 선택 가능한 마커는 리포터로 간주될 수 있다. 소정의 구현예에서, 재조합 박미드는 형광 단백질을 인코딩하는 리포터 유전자를 포함한다. 소정의 구현예에서, 형광 단백질은 적색 형광 단백질이다.
당업자는 본원에 기재된 재조합 박미드의 다양한 요소가 서로 작동 가능하게 연결되어 있음을 인식할 것이다. 박미드 내의 다양한 코딩 서열 각각은 예를 들어 프로모터 서열을 포함하는 조절 영역과 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 프로모터 서열이 적합할 수 있다.
따라서, 본 발명의 재조합 박미드는 mini-F 레플리콘, 항생제 저항성 유전자, Tn7 트랜스포존에 대한 부착 부위를 포함하는 LacZα 또는 이의 기능적 부분, 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자, 및 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 본 발명의 재조합 박미드는 도 1의 C에 나타난 BIVVBac이다. 소정의 구현예에서, BIVVBac는 AcMNPV C6 게놈을 인코딩하고 다음 2 개의 외래 서열 삽입 부위를 인코딩하도록 조작되었다: 1) 폴리헤드린 유전자좌에서의 mini-attTn7 및 2) EGT 유전자좌에서의 LoxP. mini-attTn7 삽입 서열은 Tn7-매개 전위 후 재조합 박미드의 X-gal-매개 블루/화이트 스크리닝을 위한 Lac-프로모터-구동 이.콜라이 LacZα 단편과 인-프레임 융합되고 LoxP 부위는 Cre-매개 시험관내 또는 생체내 재조합을 위한 것이다. BIVVBac는 또한 AcMNPV 39K 프로모터의 제어 하의 적색 형광 단백질 유전자를 포함하며 ets 폴리아데닐화 신호가 뒤따른다.
소정의 예시적 구현예에서, BIVVBac는 Tn7 매개 전위를 가능하게 할 수 있는 박테리아 균주 내로 도입된다. 소정의 구현예에서, 박테리아 균주는 이.콜라이 균주이다. 소정의 구현예에서, 박테리아 균주는 이.콜라이 DH10B 박테리아이다. 소정의 구현예에서, Tn7 전위효소 유전자 tnsA-E 및 테트라사이클린 저항성을 인코딩하는 헬퍼 플라스미드가 BIVVBac를 보유하는 DH10B 이.콜라이 내로 도입된다. BIVVBac 및 헬퍼 플라스미드를 보유하는 DH10B 이.콜라이는 본원에서 BIVVBacDH10B로 지칭된다.
임의의 외래 서열(예를 들어, 이종 서열)은 Tn7 매개 전위를 통해 BIVVBac 내로 도입될 수 있다. 소정의 구현예에서, 외래 서열을 포함하는 Tn7 전달 벡터를 BIVVBacDH10B 내로 도입함으로써 Tn7 매개 전위를 통해 외래 서열이 BIVVBac 내로 도입되어, 외래 서열을 포함하는 BIVVBac가 생성된다. 소정의 구현예에서, 외래 서열을 포함하는 BIVVBac는 박테리아 레플리콘, 제1 선택 가능한 마커 서열, 제1 리포터 유전자 내로 삽입된 외래 서열(예를 들어, 이종 서열)로서, 제1 리포터 유전자의 리딩 프레임을 파괴하는 삽입된 외래 서열, 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 리포터 유전자, 및 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 우선 표적 부위를 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 유전자 요법 벡터를 생산하려는 목적으로, AAV 또는 비-AAV Rep 유전자는 Tn7 매개 전위를 통해 BIVVBac 내로 도입된다. 소정의 구현예에서, AAV 또는 비-AAV Rep 유전자를 포함하는 Tn7 전달 벡터가 BIVVBacDH10B 내로 도입되어, Rep 유전자를 포함하는 BIVVBac가 생성된다. 소정의 구현예에서, 재조합 박미드는 다음을 포함한다: mini-F 레플리콘; 제1 항생제 저항성 유전자; LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된 B19 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 B19 Rep는 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및 LoxP 부위 또는 이의 변이체. 소정의 구현예에서, 재조합 박미드는 다음을 포함한다: mini-F 레플리콘; 제1 항생제 저항성 유전자; LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된 GPV Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 GPV Rep는 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및 LoxP 부위 또는 이의 변이체. 소정의 구현예에서, 재조합 박미드는 다음을 포함한다: mini-F 레플리콘; 제1 항생제 저항성 유전자; LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된 AAV2 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 AAV2 Rep가 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및 LoxP 부위 또는 이의 변이체.
임의의 외래 서열(예를 들어, 이종 서열)은 Cre 매개 재조합을 통해 BIVVBac 내로 도입될 수 있다. 소정의 구현예에서, 외래 서열은 Cre 매개 재조합을 통해 BIVVBac 내로 도입되며, 여기서 외래 서열은 본원에 기재된 Cre-LoxP 전달 벡터 상에 존재한다. Cre 매개 재조합 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
소정의 예시적 구현예에서, 유전자 요법 벡터를 생산하려는 목적으로, 대칭 또는 비대칭 AAV 또는 비-AAV 역위 말단 반복부(ITR)가 측접하는 치료 단백질-코딩 유전자가 Cre 매개 재조합을 통해 BIVVBac 내로 도입된다. 소정의 구현예에서, 재조합 박미드는 다음을 포함한다: mini-F 레플리콘; 항생제 저항성 유전자; T7 트랜스포존에 대한 부착 부위를 포함하는 LacZα 또는 이의 기능적 부분; 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 제1 우선 표적 부위(예를 들어, 제1 LoxP 부위); 대칭 또는 비대칭 AAV 또는 비-AAV ITR이 측접하는 치료 단백질-코딩 유전자; 및 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 제2 우선 표적 부위(예를 들어, 제2 LoxP 부위).
따라서, 유전자 요법 벡터를 생산하려는 목적으로, 재조합 박미드는 LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된 B19 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 B19 Rep는 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, 파보바이러스 B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 파보바이러스 B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
따라서, 유전자 요법 벡터를 생산하려는 목적으로, 재조합 박미드는 LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된 GPV Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 GPV Rep는 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
따라서, 유전자 요법 벡터를 생산하려는 목적으로, 재조합 박미드는 LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된 AAV2 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 AAV2 Rep가 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
따라서, 유전자 요법 벡터를 생산하려는 목적으로, 재조합 박미드는 mini-attTn7 부위, LacZα, 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된 인간 보카바이러스(HBoV1) Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 HBoV1 Rep는 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, HBoV1로부터 유래된 야생형 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 HBoV1로부터 유래된 야생형 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
소정의 구현예에서, BIVVBac 박미드는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA)를 생산하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, ceDNA는 단일 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 생산된다. 이 "1 BAC" 접근법에서, 단일 바큘로바이러스 발현 벡터(예를 들어 BIVVBac)는 바큘로바이러스 시스템에서의 ceDNA 생산에 필요한 모든 필수 요소를 인코딩하며 ceDNA 생산을 위해 임의의 바큘로바이러스 허용 세포주에서 잠재적으로 사용될 수 있다. 이 접근법은 도 13a에 도시되어 있다.
소정의 구현예에서, ceDNA는 다수의 다중 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 생산된다. 이 "2 BAC" 접근법에서, ceDNA 생산에 필요한 필수 요소는 2 개의 상이한 바큘로바이러스(예를 들어 2 개의 BIVVBac 박미드) 내로 삽입되고 바큘로바이러스 감염이 허용되는 임의의 세포주에서 공동-감염을 위해 잠재적으로 사용될 수 있다. 이 접근법은 도 13b에 도시되어 있다.
소정의 구현예에서, ceDNA는 안정 세포주에 의해 생산된다. 이 접근법에서, ceDNA 생산에 필요한 필수 요소는 바큘로바이러스 시스템의 두 성분 모두에 삽입된다. 이 접근법은 도 13c에 도시되어 있다. 바큘로바이러스 유전자 프로모터(예를 들어, 바큘로바이러스 항시적 유전자 프로모터)의 제어 하에 단백질 인코딩 서열을 안정적으로 통합함으로써 안정 세포주를 생성할 수 있다. 소정의 구현예에서, 안정 세포주는 안정 곤충 세포주이다.
B. 전달 벡터
본원에 기재된 재조합 박미드는 적어도 2 개의 외래 서열 삽입 부위를 포함한다. 소정의 구현예에서, 적어도 2 개의 외래 서열 삽입 부위는 1) Tn7-매개 전위를 위한 mini-attTn7, 및 2) Cre-매개 부위-특이적 재조합을 위한 LoxP이다. 따라서, 본 발명의 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템은 재조합 박미드의 외래 서열 삽입 부위 내로 삽입될 외래 서열을 포함하는 2 개 이상의 전달 벡터를 추가로 포함한다.
Tn7 전달 벡터
소정의 구현예에서, 전달 벡터는 재조합 박미드의 mini-attTn7 내로 삽입될 외래 서열을 포함한다. 소정의 구현예에서, 전달 벡터는 Tn7 전달 벡터이다. 소정의 구현예에서, 전달 벡터는 mini-Tn7 전달 벡터이다. 소정의 구현예에서, Tn7 전달 벡터는 재조합 박미드의 mini-attTn7로의 외래 서열의 전위를 매개할 수 있는 Tn7의 왼쪽 및 오른쪽 말단(Tn7L 및 Tn7R)을 포함한다.
소정의 예시적 구현예에서, 유전자 요법 벡터를 생산하려는 목적으로, Tn7 전달 벡터는 AAV 또는 비-AAV Rep에 대한 코딩 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, Rep 발현 작제물이 제공되며, 여기서 Rep 유전자는 pFastBac1 전달 벡터(Invitrogen) 내 바큘로바이러스 유전자 프로모터의 조절 하에 클로닝된 비-AAV 또는 AAV를 갖는다. 소정의 구현예에서, 바큘로바이러스 유전자 프로모터는 전초기(ie1)에 대한 프로모터이다. 소정의 구현예에서, 바큘로바이러스 유전자 프로모터는 폴리헤드린 유전자에 대한 프로모터이다. 적합한 바큘로바이러스 유전자 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 소정의 구현예에서, 적합한 바큘로바이러스 유전자 프로모터는 전초기, 초기, 후기, 또는 극후기 유전자 프로모터이다
소정의 구현예에서, Rep 코딩 서열은 Rep78의 표준 시작 코돈이 비-표준 시작 코돈으로 변형되도록 변형된다. 소정의 구현예에서, Rep52의 시작 코돈 앞의 다른 AUG 코돈은 침묵 돌연변이(아웃-오브-프레임(out-of-frame)의 경우)를 지니거나 보존적 아미노산 치환(인-프레임의 경우)을 인코딩하도록 돌연변이되어, 리키(leaky) 리보솜 스캐닝 메커니즘을 통해 단일 mRNA 전사물로부터 Rep78 및 Rep52 폴리펩티드의 발현을 가능하게 한다.
소정의 구현예에서, Tn7 전달 벡터는 Rep 유전자에 작동 가능하게 연결된 바큘로바이러스 유전자 프로모터에 측접하는 Tn7의 왼쪽 및 오른쪽 말단(Tn7L 및 Tn7R)을 포함한다. 소정의 구현예에서, Rep 유전자는 B19 Rep, GPV Rep, HBoV1, 및 AAV2 Rep로 구성된 군으로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, Tn7 전달 벡터는 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, B19 Rep에 작동 가능하게 연결된 폴리헤드린 프로모터에 측접하는 Tn7의 왼쪽 및 오른쪽 말단을 포함한다. 소정의 구현예에서, Tn7 전달 벡터는 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, B19 Rep에 작동 가능하게 연결된 ie1 프로모터에 측접하는 Tn7의 왼쪽 및 오른쪽 말단을 포함한다. 소정의 구현예에서, Tn7 전달 벡터는 도 3c 및 도 3d에 나타난 바와 같이, GPV Rep에 작동 가능하게 연결된 폴리헤드린 프로모터에 측접하는 Tn7의 왼쪽 및 오른쪽 말단을 포함한다. 소정의 구현예에서, Tn7 전달 벡터는 도 3e 및 도 3f에 나타난 바와 같이, AAV2 Rep에 작동 가능하게 연결된 폴리헤드린 프로모터에 측접하는 Tn7의 왼쪽 및 오른쪽 말단을 포함한다. 소정의 구현예에서, Tn7 전달 벡터는 HBoV1 Rep에 작동 가능하게 연결된 폴리헤드린 프로모터에 측접하는 Tn7의 왼쪽 및 오른쪽 말단을 포함한다(데이터는 제공되지 않음).
Cre-LoxP 전달 벡터
소정의 구현예에서, 전달 벡터는 Cre-LoxP 전달 벡터이다. 소정의 구현예에서, Cre-LoxP 전달 벡터는 다음을 포함하는 핵산 벡터이다: 제1 박테리아 균주에서 핵산 벡터를 증식시키기 위한 제1 복제 원점으로서, 조건부 복제 원점인 제1 복제 원점; 제2 박테리아 균주에서 핵산 벡터를 증식시키기 위한 제2 복제 원점; 외래 서열(예를 들어 이종 서열)의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위; 선택 가능한 마커 서열; 리포터 유전자; 및/또는 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 우선 표적 부위. 소정의 구현예에서, 제1 복제 원점은, R6Kγ 복제 원점과 같이, pi 단백질의 존재를 조건으로 한다. 소정의 구현예에서, 제1 복제 원점은 R6Kγ 복제 원점이다. 따라서, 소정의 구현예에서, 제1 박테리아 균주는 pi 단백질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 제2 복제 원점은 pUC57 복제 원점이다. 소정의 구현예에서, 부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 우선 표적 부위는 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하고, 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개된다. 본원에 기재된 Cre-LoxP 전달 벡터는 벡터를 포함하는 숙주 세포의 적절한 식별에 적합한 임의의 다른 요소를 가질 수 있다. 예를 들어, 당업자에게 공지된 임의의 선택 가능한 마커 서열 및/또는 리포터 유전자가 본원에 기재된 Cre-LoxP 전달 벡터에 혼입될 수 있다.
소정의 구현예에서, Cre-LoxP 전달 벡터는 다음을 포함하는 pUC57 벡터이다: LoxP 재조합 부위, 전사 인핸서 hr5 요소가 앞에 있고 AcMNPV p10 폴리아데닐화 신호가 뒤에 있는 AcMNPV ie1 프로모터 하의 강화된 GFP(eGFP) 마커 유전자, 암피실린 저항성 마커, 조건부 R6Kγ 복제 원점, 및 다중 클로닝 부위. Cre-LoxP 전달 벡터의 특징은 다음을 포함한다: 1) 전이유전자 삽입을 위한 다중 클로닝 부위(MCS); 2) Cre-매개 시험관내 또는 생체내 재조합을 위한 LoxP 부위; 3) 다음의 2 개의 복제 원점: i) DH5α, NEB 안정, PMC103, 및 DH10B와 같은 이.콜라이 균주 내로 이 벡터를 증식시키기 위한 ColE1 Ori; 및 ii) pir+ 및 pir116과 같은 π(pi) 단백질을 발현하는 이.콜라이 균주 내로 이 벡터를 증식시키기 위한 조건부 R6Kγ Ori; 4) Cre 매개 재조합에 의해 BIVVBac 내 LoxP 부위에 Cre-LoxP 공여체 벡터를 삽입한 후 카나마이신 및 암피실린을 이용하여 재조합 박미드를 선택하기 위한 암피실린 항생제-저항성 유전자; 및 5) 연속 계대에 걸쳐 곤충 세포에서 복제되는 동안 재조합 BEV에서의 전이유전자의 안정성을 결정하기 위한 강화된 GFP 리포터 유전자. 외래 서열(예를 들어, 전이유전자)을 포함하는 Cre-LoxP 전달 벡터에서 다중 클로닝 부위가 유지되는지 여부는 외래 서열이 그 안에 삽입되는 방법(예를 들어, 말단 제한 부위를 사용하는 것 또는 비-말단 제한 부위를 사용하는 것, 또는 외래 서열을 클로닝하는 데 사용되는 제한 효소의 성질에 의해)에 좌우된다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
소정의 예시적 구현예에서, 유전자 요법 벡터를 생산하려는 목적으로, Cre-LoxP 전달 벡터는 외래 서열(예를 들어, 이종 서열)을 포함한다. 예를 들어, 소정의 구현예에서, Cre-LoxP 전달 벡터는 대칭 또는 비대칭 AAV 또는 비-AAV 역위 말단 반복부(ITR)가 측접하는 치료 단백질-코딩 유전자를 포함한다. 소정의 구현예에서, 대칭 또는 비대칭 AAV 또는 비-AAV ITR이 측접하는 치료 단백질-코딩 유전자는 Cre-LoxP 전달 벡터의 다중 클로닝 부위의 위치에 존재한다.
Tn7 전달 벡터 및 Cre-LoxP 전달 벡터는 본 발명의 재조합 박미드를 생성하기 위해 외래 서열의 삽입에 이용될 수 있는 전달 벡터의 예라는 것이 당업자에게 인식될 것이다. 소정의 구현예에서, 본원에 기재된 전달 벡터를 사용하여 삽입될 외래 서열은 전달 벡터 간에 상호교환 가능하다. 예를 들어, 유전자 요법 벡터를 생산하려는 목적으로, Rep 유전자는 Tn7 전달 벡터에 의해 재조합 박미드 내로 도입될 수 있고, 치료 단백질-코딩 유전자는 Cre-LoxP 전달 벡터에 의해 도입될 수 있다. 또 다른 예에서, 유전자 요법 벡터를 생산하려는 목적으로, Rep 유전자는 Cre-LoxP 전달 벡터에 의해 재조합 박미드 내로 도입될 수 있고, 치료 단백질-코딩 유전자는 Tn7 전달 벡터에 의해 도입될 수 있다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 Cre-LoxP 전달 벡터는 LoxP 서열 및 강화된 녹색 형광 단백질(eGFP) 코딩 유전자를 포함하고, 치료 단백질-코딩 유전자를 클로닝하는 데 사용된다(예를 들어, 측접 대칭 또는 비대칭 ITR을 갖는 hFVIIIco6XTEN; 여기서 ITR은 비-AAV 또는 AAV를 가짐).
소정의 구현예에서, 재조합 박미드가 제공되며, 여기서 Rep 코딩 유전자는 전위를 통해 폴리헤드린 유전자좌 내 mini-attTn7 부위에 삽입되고, 대칭 또는 비대칭 ITR을 갖는 치료 단백질-코딩 유전자는 Cre 매개 재조합을 통해 EGT 유전자좌 내 LoxP 부위에 삽입된다. 소정의 구현예에서, Rep 유전자 및 ITR은 비-AAV 또는 AAV를 갖는다.
따라서, 소정의 구현예에서, LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된(예를 들어, LacZα 내의 mini-attTn7 부위 내로 삽입된) AAV Rep(예를 들어, AAV2 Rep)를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 Rep가 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, 유래된 야생형 또는 절두된 AAV 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 야생형 또는 절두된 AAV 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
소정의 구현예에서, LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된(예를 들어, LacZα 내의 mini-attTn7 부위 내로 삽입된) 비-AAV Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 Rep가 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, 제1 파보바이러스 비-AAV 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 비-AAV 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 제2 파보바이러스 비-AAV 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 비-AAV 3' 역위 말단 반복부를 포함한다. 소정의 구현예에서, 제1 및 제2 파보바이러스 비-AAV 게놈은 상이하다.
소정의 구현예에서, LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된(예를 들어, LacZα 내의 mini-attTn7 부위 내로 삽입된) B19 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 B19 Rep는 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, 파보바이러스 B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 파보바이러스 B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
소정의 구현예에서, LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된(예를 들어, LacZα 내의 mini-attTn7 부위 내로 삽입된) GPV Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 GPV Rep는 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
소정의 구현예에서, LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된(예를 들어, LacZα 내의 mini-attTn7 부위 내로 삽입된) AAV2 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 AAV2 Rep가 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
소정의 구현예에서, LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된(예를 들어, LacZα 내의 mini-attTn7 부위 내로 삽입된) HBoV1 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 HBoV1 Rep는 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 본원에 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, HBoV1로부터 유래된 야생형 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 HBoV1로부터 유래된 야생형 3' 역위 말단 반복부를 포함한다.
소정의 구현예에서, LacZα 또는 이의 기능적 부분 내로 삽입된(예를 들어, LacZα 내의 mini-attTn7 부위 내로 삽입된) 비-AAV Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 Rep가 LacZα 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위를 포함하는 재조합 박미드가 제공되고, 이종 서열은 5'에서 3'으로, 야생형 또는 절두된 비-AAV 5' 역위 말단 반복부; 단백질을 인코딩하는 서열; 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및 야생형 또는 절두된 비-AAV 3' 역위 말단 반복부를 포함한다. 소정의 구현예에서 비-AAV Rep 및 비-AAV 역위 말단 반복부는 바이러스 파보비리다에 과로부터의 비-AAV 게놈의 ITR로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 동일한 파보바이러스 비-AAV 게놈을 갖는다. 소정의 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 파보바이러스 비-AAV 게놈을 갖는다. 이러한 구현예에서, 비-AAV Rep는 파로바이러스 비-AAV 게놈 중 적어도 하나의 Rep이다. 이러한 구현예에서, 당업자는 5' ITR 및 3' ITR이 상이한 파보바이러스 비-AAV 게놈을 갖는 구현예에서 사용되기에 가장 적합한 Rep를 결정할 수 있을 것이다.
소정의 구현예에서, 재조합 박미드는 야생형 또는 절두된 AAV 5' ITR, 및 야생형 또는 절두된 파보바이러스 비-AAV 3' ITR을 포함한다. 소정의 구현예에서, 재조합 박미드는 야생형 또는 절두된 파보바이러스 비-AAV 5' ITR, 및 야생형 또는 절두된 AAV 3' ITR을 포함한다. 이러한 구현예에서, 당업자는 5' ITR 및 3' ITR이 상이한 파보바이러스 게놈을 갖는 구현예에서 사용되기에 가장 적합한 Rep를 결정할 수 있을 것이다.
III. 외래 서열
본원에 기재된 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템이 임의의 원하는 산물의 생산에 사용될 수 있음이 당업자에게 인식될 것이다. 예를 들어, 본원에 기재된 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템은 재조합 단백질, 또는 유전자 치료제용 바이러스 또는 비-바이러스 벡터의 생산을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 핵산 분자의 생산에 대한 다음 설명은 어떠한 방식으로든 제한하는 것이어서는 안 된다.
핵산 분자
소정의 구현예에서, 본원에 기재된 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템은 핵산 분자의 생산에 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전자 요법을 위한 핵산 분자의 생산. 따라서, 본원에 기재된 소정의 구현예는 표적 서열을 인코딩하는 플라스미드-유사, 무 캡시드, 핵산 분자의 생산에 관한 것이다. 바이러스의 단백질 외피인 캡시드는 바이러스의 유전 물질을 둘러싼다. 캡시드는 바이러스 게놈을 보호하고, 게놈을 숙주에 전달하고, 숙주와 상호작용하여 비리온의 기능을 돕는 것으로 공지되어 있다. 그럼에도 불구하고, 바이러스 캡시드는 특히 유전자 요법에 사용될 때 벡터의 패키징 능력을 제한하고/하거나 면역 반응을 유도하는 요인일 수 있다.
AAV 벡터는 유전자 요법 벡터의 보다 흔한 유형 중 하나로 등장하였다. 그러나, 캡시드의 존재는 유전자 요법에서의 AAV 벡터의 유용성을 제한한다. 특히, 캡시드 자체는 4.5 kb 미만만큼 낮도록, 벡터에 포함된 전이유전자의 크기를 제한할 수 있다. 유전자 요법에 유용할 수 있는 다양한 치료 단백질은 발현 제어 서열이 추가되기 전에도 이 크기를 쉽게 초과할 수 있다.
또한, 캡시드를 구성하는 단백질은 대상체의 면역계에 의해 표적화될 수 있는 항원으로서의 역할을 할 수 있다. AAV는 일반 인구에서 매우 흔하며 대부분의 사람들은 평생 AAV에 노출되어 왔다. 결과적으로, 대부분의 잠재적인 유전자 요법 수혜자는 이미 AAV에 대한 면역 반응을 발달시켰을 가능성이 있으므로 요법을 받아들이지 않을 가능성이 더 크다.
소정의 구현예에서, 본 발명은, 제1 ITR, 제2 ITR, 및 예를 들어 치료 단백질 및/또는 miRNA를 인코딩하는 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자의 생산에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 제1 ITR 및 제2 ITR은 이종 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전적 카세트에 측접한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 캡시드 단백질, 복제 단백질, 및/또는 어셈블리 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 치료 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 응고 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 miRNA를 인코딩한다. 소정의 구현예에서, 유전적 카세트는 제1 ITR과 제2 ITR 사이에 위치한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 하나 이상의 비코딩 영역을 추가로 포함한다. 소정의 구현예에서, 하나 이상의 비-코딩 영역은 프로모터 서열, 인트론, 전사-후 조절 요소, 3' UTR 폴리(A) 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일 구현예에서, 유전적 카세트는 단일 가닥 핵산이다. 또 다른 구현예에서, 유전적 카세트는 이중 가닥 핵산이다.
본 개시내용의 일부 양태는, 예를 들어 치료 단백질 및/또는 miRNA를 인코딩하는, 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 치료 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 치료 단백질은 응고 인자를 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산 분자는 적어도 하나의 비코딩 영역을 추가로 포함한다. 소정의 구현예에서, 적어도 하나의 비-코딩 영역은 프로모터 서열, 인트론, 전사-후 조절 요소, 3' UTR 폴리(A) 서열, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 핵산 분자는 인트론 또는 인트론 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 천연 발생 인트론 서열이다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 합성 서열이다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 천연 발생 인트론 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 하이브리드 합성 인트론 또는 키메라 인트론이다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 닭 베타-액틴/토끼 베타-글로빈 인트론으로 구성되는 키메라 인트론이며, 잘못된 번역 시작을 줄이기 위해 5 개의 기존 ATG 서열을 제거하도록 변형되었다. 소정의 구현예에서, 인트론 서열은 SV40 작은 T 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 FVIII 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 키메라 인트론은 mTTR 프로모터와 같은 프로모터 서열의 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 키메라 인트론은 SEQ ID NO: 23의 핵산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 유전적 카세트는 단일 가닥 핵산이다. 또 다른 구현예에서, 유전적 카세트는 이중 가닥 핵산이다. 또 다른 구현예에서, 유전적 카세트는 폐쇄 말단 이중 가닥 핵산(ceDNA)이다.
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 FVIII 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 mTTR 프로모터에 의해 구동되는 코돈 최적화된 FVIII를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 및 합성 인트론을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 국제 출원 번호 PCT/US2017/015879에 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 그 전체가 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 PCT/US2017/015879에 기재된 "hFVIIIco6XTEN" 유전적 카세트이다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 XTEN 144 펩티드와 융합된 B-도메인 결실(BDD) 코돈-최적화된 인간 인자 VIII(BDDcoFVIII)를 인코딩하는 코돈 최적화된 cDNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 mTTR 프로모터에 의해 구동되는 코돈 최적화된 FVIII를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, mTTR 프로모터는 SEQ ID NO: 22의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 A1MB2 인핸서 요소를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, A1MB2 인핸서 요소는 SEQ ID NO: 21의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 키메라 또는 합성 인트론을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 인트론은 닭 베타-액틴/토끼 베타-글로빈 인트론으로 구성되며, 잘못된 번역 시작을 줄이기 위해 5 개의 기존 ATG 서열을 제거하도록 변형되었다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 FVIII 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열의 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 키메라 인트론은 mTTR 프로모터와 같은 프로모터 서열의 5'에 위치한다. 일부 구현예에서, 키메라 인트론은 SEQ ID NO: 23의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 우드척 전사후 조절 요소(WPRE)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, WPRE는 SEQ ID NO: 24의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(bGHpA) 신호를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, bGHpA 신호는 SEQ ID NO: 25의 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 A1MB2 인핸서 요소, 하이브리드 합성 인트론(키메라 인트론), 우드척 전사후 조절 요소(WPRE), 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(bGHpA) 신호를 포함하는 간-특이적 변형된 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터(mTTR482)에 의해 구동되는 코돈 최적화된 FVIII 및 XTEN 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 SEQ ID NO: 19와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
역위 말단 반복부
소정의 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 아데노-연관된 바이러스(AAV) ITR 또는 비-AAV ITR이다. 소정의 구현예에서, 비-AAV ITR은 바이러스 파보비리다에 과의 구성원으로부터 얻어진 ITR이다. 적합한 ITR 서열은 당업자에게 공지된 AAV 혈청형의 AAV ITR을 포함한다. 적합한 AAV 및 비-AAV ITR 서열은 PCT 공개 번호 WO2019032898A1, WO2020033863A1, 및 WO2017152149A1에 기재되어 있으며, 이들의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, 비-AAV ITR 서열은 거위 파보바이러스(GPV) 또는 파보바이러스 B19(본원에서 "B19"로도 지칭됨)로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, ITR은 AAV 게놈으로부터 유래되지 않는다. 일부 구현예에서, ITR은 비-AAV의 ITR이다. 일부 구현예에서, ITR은 비제한적으로 보카바이러스, 데펜도바이러스, 에리트로바이러스, 암도바이러스, 파보바이러스, 덴소바이러스, 이테라바이러스, 콘트라바이러스, 아베파보바이러스, 코피파보바이러스, 프로토파보바이러스, 테트라파보바이러스, 암비덴소바이러스, 브레비덴소바이러스, 헤판덴소바이러스, 펜스틸덴소바이러스, 및 이들의 임의의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 바이러스 파보비리다에 과로부터의 비-AAV 게놈의 ITR이다. 소정의 구현예에서, ITR은 에리트로바이러스 파보바이러스 B19(인간 바이러스; 본원에서 "B19"로도 지칭됨)로부터 유래된다. 또 다른 구현예에서, ITR은 머스코비 오리 파보바이러스(MDPV) 균주로부터 유래된다. 소정의 구현예에서, MDPV 균주는 약독화된다(예를 들어, MDPV 균주 FZ91-30). 다른 구현예에서, MDPV 균주는 병원성이다(예를 들어, MDPV 균주 YY). 일부 구현예에서, ITR은 돼지 파보바이러스, 예를 들어 돼지 파보바이러스 U44978로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 마우스 미세 바이러스, 예를 들어 마우스 미세 바이러스 U34256으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 개 파보바이러스, 예를 들어 개 파보바이러스 M19296으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 밍크 장염 바이러스, 예를 들어 밍크 장염 바이러스 D00765로부터 유래된다. 일부 구현예에서, ITR은 데펜도파보바이러스(Dependoparvovirus)로부터 유래된다. 일 구현예에서, 데펜도파보바이러스는 데펜도바이러스 거위 파보바이러스(GPV) 균주이다. 구체적인 구현예에서, GPV 균주는 약독화된다(예를 들어, GPV 균주 82-0321V). 또 다른 구체적인 구현예에서, GPV 균주는 병원성이다(예를 들어, GPV 균주 B). 적합한 파보바이러스 ITR 서열의 예는 표 1에 제시되어 있다.
[표 1]
파보바이러스 ITR 서열
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
치료 단백질
일부 양태에서, 제1 ITR, 제2 ITR, 및 표적 서열을 인코딩하는 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자의 생산이 본원에 제공되며, 여기서 표적 서열은 치료 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 하나의 치료 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 하나 초과의 치료 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 동일한 치료 단백질의 2 개 이상의 카피를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 동일한 치료 단백질의 2 개 이상의 변이체를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 2 개 이상의 상이한 치료 단백질을 인코딩한다.
본 개시내용의 소정의 구현예는 제1 ITR, 제2 ITR, 및 치료 단백질을 인코딩하는 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 비제한적으로 응고 인자의 생산을 포함하여, 본 개시내용의 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 의해 임의의 치료 단백질이 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 응고 인자는 FI, FII, FIII, FIV, FV, FVI, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI, FXII, FXIII, VWF, 프리칼리크레인, 고분자량 키니노겐, 피브로넥틴, 안티트롬빈 III, 헤파린 보조인자 II, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 단백질 Z-관련 프로테아제 저해제(ZPI), 플라스미노겐, 알파 2-항플라스민, 조직 플라스미노겐 활성자(tPA), 우로키나제, 플라스미노겐 활성자 저해제-1(PAI-1), 플라스미노겐 활성자 저해제-2(PAI2), 이의 임의의 지모겐, 이의 임의의 활성 형태, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 응고 인자는 FVIII 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 FIX 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 FVII 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 응고 인자는 VWF 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함한다.
성장 인자
일부 양태에서, 제1 ITR, 제2 ITR, 및 표적 서열을 인코딩하는 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자의 생산이 본원에 제공되며, 표적 서열은 치료 단백질을 인코딩하고, 치료 단백질은 성장 인자를 포함한다. 성장 인자는 당업계에 공지된 임의의 성장 인자로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 호르몬이다. 다른 구현예에서, 성장 인자는 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 케모카인이다.
일부 구현예에서, 성장 인자는 아드레노메둘린(AM)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 안지오포이에틴(Ang)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 자가분비 운동성 인자이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 골 형성 단백질(BMP)이다. 일부 구현예에서, BMP는 BMP2, BMP4, BMP5, 및 BMP7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 섬모 신경영양 인자 패밀리 구성원이다. 일부 구현예에서, 섬모 신경영양 인자 패밀리 구성원은 섬모 신경영양 인자(CNTF), 백혈병 저해 인자(LIF), 인터류킨-6(IL-6)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 콜로니-자극 인자이다. 일부 구현예에서, 콜로니-자극 인자는 대식세포 콜로니-자극 인자(m-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF), 및 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 표피 성장 인자(EGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 에프린이다. 일부 구현예에서, 에프린은 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 및 에프린 B3으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 에리트로포이에틴(EPO)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 섬유모세포 성장 인자(FGF)이다. 일부 구현예에서, FGF는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF5, FGF6, FGF7, FGF8, FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, 및 FGF23으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 소 태아 소마토트로핀(FBS)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 GDNF 패밀리 구성원이다. 일부 구현예에서, GDNF 패밀리 구성원은 신경아교세포주-유래 신경영양 인자(GDNF), 뉴투린, 페르세핀, 및 아르테민으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 성장 분화 인자-9(GDF9)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 간세포 성장 인자(HGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 간세포암-유래 성장 인자(HDGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 인슐린이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 인슐린-유사 성장 인자이다. 일부 구현예에서, 인슐린-유사 성장 인자는 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 또는 IGF-2이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 인터류킨(IL)이다. 일부 구현예에서, IL은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, 및 IL-7로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 각질세포 성장 인자(KGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 이동-자극 인자(MSF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 대식세포-자극 단백질(MSP 또는 간세포 성장 인자-유사 단백질(HGFLP))이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 마이오스타틴(GDF-8)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 뉴레귤린이다. 일부 구현예에서, 뉴레귤린은 뉴레귤린 1(NRG1), NRG2, NRG3, 및 NRG4로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 뉴로트로핀이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 뇌-유래 신경영양 인자(BDNF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 신경 성장 인자(NGF)이다. 일부 구현예에서, NGF는 뉴로트로핀-3(NT-3) 또는 NT-4이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 태반 성장 인자(PGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 혈소판-유래 성장 인자(PDGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 레날라제(RNLS)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 T-세포 성장 인자(TCGF)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 트롬보포이에틴(TPO)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 형질전환 성장 인자이다. 일부 구현예에서, 형질전환 성장 인자는 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α) 또는 TGF-β이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)이다. 일부 구현예에서, 성장 인자는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)이다.
마이크로 RNA(miRNA)
마이크로RNA(miRNA)는 번역을 저해하거나 메신저 RNA(mRNA) 분해를 유도하여 유전자 발현을 부정적으로 조절하는 작은 비-코딩 RNA 분자(약 18 내지 22 개의 뉴클레오티드)이다. 이들이 발견된 이후로, miRNA는 아폽토시스, 분화, 및 세포 증식을 포함하는 다양한 세포 과정에 영향을 미치는 것으로 여겨져 왔고, 발암에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 유전자 발현을 조절하는 miRNA의 능력은 생체내에서의 miRNA의 발현을 유전자 요법에서 귀중한 툴로 만든다.
일부 양태에서, 제1 ITR, 제2 ITR, 및 표적 서열을 인코딩하는 유전적 카세트를 포함하는 핵산 분자의 생산이 본원에 제공되며, 여기서 표적 서열은 miRNA를 인코딩하고, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-아데노-연관된 바이러스의 ITR이다(예를 들어, 제1 ITR 및/또는 제2 ITR은 비-AAV로부터의 것임). miRNA는 당업계에 공지된 임의의 miRNA일 수 있다. 일부 구현예에서, miRNA는 표적 유전자의 발현을 하향조절한다. 소정의 구현예에서, 표적 유전자는 SOD1, HTT, RHO, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 유전적 카세트는 하나의 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 하나 초과의 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 2 개 이상의 상이한 miRNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 동일한 miRNA의 2 개 이상의 카피를 인코딩한다. 일부 구현예에서, 유전적 카세트는 동일한 치료 단백질의 2 개 이상의 변이체를 인코딩한다. 소정의 구현예에서, 유전적 카세트는 하나 이상의 miRNA 및 하나 이상의 치료 단백질을 인코딩한다.
일부 구현예에서, miRNA는 천연 발생 miRNA이다. 일부 구현예에서, miRNA는 조작된 miRNA이다. 일부 구현예에서, miRNA는 인공 miRNA이다. 소정의 구현예에서, miRNA는 문헌[Evers et al., Molecular Therapy 26(9):1-15 (epub ahead of print June 2018)]에 의해 개시된 miHTT 조작된 miRNA를 포함한다. 소정의 구현예에서, miRNA는 문헌[Dirren et al., Annals of Clinical and Translational Neurology 2(2):167-84 (February 2015)]에 의해 개시된 miR SOD1 인공 miRNA를 포함한다. 소정의 구현예에서, miRNA는 RHO를 표적화하는 miR-708을 포함한다(문헌[Behrman et al., JCB 192(6):919-27 (2011)] 참고).
일부 구현예에서, miRNA는 유전자의 저해제의 발현을 하향조절하여 유전자의 발현을 상향조절한다. 일부 구현예에서, 저해제는 천연, 예를 들어 야생형 저해제이다. 일부 구현예에서, 저해제는 돌연변이된, 이종성, 및/또는 잘못 발현된 유전자로부터 생긴다.
발현 제어 요소
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 의해 생산된 핵산 분자 또는 벡터는 적어도 하나의 발현 제어 서열을 추가로 포함한다. 본원에서 사용되는 발현 제어 서열은 작동 가능하게 연결된 코딩 핵산의 효율적인 전사 및 번역을 촉진하는 프로모터 서열 또는 프로모터-인핸서 조합과 같은 임의의 조절 뉴클레오티드 서열이다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법에 의해 생산된 단리된 핵산 분자는 적어도 하나의 전사 제어 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
유전자 발현 제어 서열은 예를 들어 포유류 또는 바이러스 프로모터, 예컨대 항시적 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 항시적 포유류 프로모터는 하기 유전자에 대한 프로모터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴 프로모터, 및 다른 항시적 프로모터. 진핵 세포에서 항시적으로 기능하는 예시적인 바이러스 프로모터는 예를 들어 사이토메갈로바이러스(CMV), 유인원 바이러스(예를 들어, SV40), 파필로마 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 라우스 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 몰로니 백혈병 바이러스의 긴 말단 반복부(LTR) 및 다른 레트로바이러스로부터의 프로모터, 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다.
다른 항시적 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 본 개시내용의 유전자 발현 서열로서 유용한 프로모터는 유도성 프로모터도 포함한다. 유도성 프로모터는 유도제의 존재 하에 발현된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터는 특정 금속 이온의 존재 하에서 전사 및 번역을 촉진하도록 유도된다. 다른 유도성 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다.
일 구현예에서, 본 개시내용은 조직 특이적 프로모터 및/또는 인핸서의 제어 하에서의 전이유전자의 발현을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 프로모터 또는 다른 발현 제어 서열은 선택적으로 간 세포에서 전이유전자의 발현을 강화한다. 간 특이적 프로모터의 예는 마우스 트랜스티레틴 프로모터(mTTR), 천연 인간 인자 VIII 프로모터, 천연 인간 인자 IX 프로모터, 인간 알파-1-안티트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 및 마우스 알부민 프로모터를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 특정한 구현예에서, 프로모터는 mTTR 프로모터를 포함한다. mTTR 프로모터는 문헌[R. H. Costa et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6:4697]에 기재되어 있다. F8 프로모터는 문헌[Figueiredo and Brownlee, 1995, J. Biol. Chem. 270:11828-11838]에 기재되어 있다. 소정의 구현예에서, 프로모터는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 US2019/0048362에 개시된 바와 같은 mTTR 프로모터(예를 들어, mTTR202 프로모터, mTTR202opt 프로모터, mTTR482 프로모터) 중 임의의 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 핵산 분자는 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 소정의 구현예에서, 조직 특이적 프로모터는 간, 예를 들어 간세포 및/또는 내피 세포에서 치료 단백질, 예를 들어 응고 인자의 발현을 구동한다. 특정한 구현예에서, 프로모터는 마우스 트랜스티레틴 프로모터(mTTR), 천연 인간 인자 VIII 프로모터, 인간 알파-1-안티트립신 프로모터(hAAT), 인간 알부민 최소 프로모터, 마우스 알부민 프로모터, 트리스테트라프롤린(TTP) 프로모터, CASI 프로모터, CAG 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 간 특이적 프로모터(예를 들어, α1-안티트립신(AAT)), 근육 특이적 프로모터(예를 들어, 근육 크레아틴 키나제(MCK), 미오신 중쇄 알파(αMHC), 미오글로빈(MB), 및 데스민(DES)), 합성 프로모터(예를 들어, SPc5-12, 2R5Sc5-12, dMCK, 및 tMCK), 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된다.
발현 수준은 하나 이상의 인핸서를 사용하여 치료 효능을 달성하도록 추가로 강화될 수 있다. 하나 이상의 인핸서는 단독으로 또는 하나 이상의 프로모터 요소와 함께 제공될 수 있다. 전형적으로, 발현 제어 서열은 복수의 인핸서 요소 및 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 일 구현예에서, 인핸서는 α-1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서의 하나 이상의 카피를 포함한다(Rouet et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:20765-20773; Rouet et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:395-404; Rouet et al., 1998, Biochem. J. 334:577-584; Ill et al., 1997, Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30). 또 다른 구현예에서, 인핸서는 EBP, DBP, HNF1, HNF3, HNF4, HNF6과 같은 간 특이적 전사 인자의 결합 부위로부터 유래되며, Enh1은 HNF1, (센스)-HNF3, (센스)-HNF4, (안티센스)-HNF1, (안티센스)-HNF6, (센스)-EBP, (안티센스)-HNF4(안티센스)를 포함한다.
구체적 예에서, 본 개시내용에 유용한 프로모터는 GenBank 번호 AY661265로도 공지된 ET 프로모터이다. 또한, 문헌[Vigna et al., Molecular Therapy 11(5):763 (2005)]을 참고한다. 다른 적합한 벡터 및 발현 제어 서열의 예는 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO 02/092134, EP1395293, 미국 특허 번호 6,808,905, 7,745,179, 또는 7,179,903에 기재되어 있다.
일반적으로, 발현 제어 서열은, 필요한 경우, 각각 전사 및 번역의 개시에 관여된 5' 비전사 및 5' 비번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열 등을 포함할 것이다. 특히, 이러한 5' 비전사 서열은 작동 가능하게 연결된 코딩 핵산의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 유전자 발현 서열은 원하는 경우 인핸서 서열 또는 업스트림 활성자 서열을 선택적으로 포함한다.
소정의 구현예에서, 본원에 기재된 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템에 의해 생산된 핵산 분자는 예를 들어 전이유전자에 작동 가능하게 연결되는 하나 이상의 miRNA 표적 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 골수성 수임 전구세포에서 가장 효과적으로, 그리고 보다 원시적인 HSPC에서 적어도 부분적으로 발현을 차단하는 것으로 보고된 miR-223 표적이다. miR-223 표적은 과립구, 단핵구, 대식세포, 골수 수지상 세포를 포함하는 분화된 골수성 세포에서 발현을 차단할 수 있다. miR-223 표적은 또한 림프계 또는 적혈구 계통에서 강력한 전이유전자 발현에 의존하는 유전자 요법 적용에 적합할 수 있다. miR-223 표적은 또한 인간 HSC에서 매우 효과적으로 발현을 차단할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 miR-142 표적이다. 일부 구현예에서, miR-142(142T)와 같은 조혈 특이적 마이크로RNA의 상보성 서열은 전이유전자를 포함하는 핵산 분자에 혼입하여, 전이유전자-인코딩 전사물을 miRNA-매개 하향조절에 민감해지도록 만든다. 이 방법에 의해, 조혈 계통 항원 제시 세포(APC)에서는 전이유전자 발현이 방지될 수 있는 한편, 비-조혈 세포에서는 유지될 수 있다(Brown et al., Nat Med 2006). 이 전략은 전이유전자 발현에 대한 엄격한 전사-후 제어를 가할 수 있으므로 전이유전자의 안정적인 전달 및 장기적 발현을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, miR-142 조절은 형질도입된 세포의 면역-매개 제거를 방지하고/하거나 항원-특이적 조절 T 세포(T reg)를 유도하고 전이유전자-인코딩된 항원에 대한 강력한 면역학적 내성을 매개한다.
일부 구현예에서, 표적 서열은 miR181 표적이다. 문헌[Chen C-Z and Lodish H, Seminars in Immunology (2005) 17(2):155-165]에는 마우스 골수 내의 B 세포에서 특이적으로 발현된 miRNA인 miR-181이 개시되어 있다(Chen and Lodish, 2005). 일부 인간 miRNA가 백혈병과 연관되어 있다는 것도 개시되어 있다.
표적 서열은 miRNA에 대해 완전히 또는 부분적으로 상보성일 수 있다. 용어 "완전히 상보성인"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 대해 100% 상보성인 핵산 서열을 가짐을 의미한다. 용어 "부분적으로 상보성인"은 표적 서열이 이를 인식하는 miRNA의 서열에 대해 단지 부분적으로 상보성이며, 이에 의해 부분적 상보성 서열이 여전히 miRNA에 의해 인식된다는 것을 의미한다. 바꾸어 말하면, 본 개시내용의 맥락에서 부분적 상보성 표적 서열은 상응하는 miRNA를 인식하고 그 miRNA를 발현하는 세포에서 전이유전자 발현의 방지 또는 감소를 초래하는 데 효과적이다. miRNA 표적 서열의 예는 WO2007/000668, WO2004/094642, WO2010/055413, 또는 WO2010/125471에 기재되어 있으며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
이종 모이어티
일부 구현예에서, 전이유전자는 이종 아미노산 서열을 인코딩한다. 이종 아미노산 서열은 전이유전자 산물에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 전이유전자 산물의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 예를 들어, FVIII를 인코딩하는 전이유전자와 관련하여, 이종 아미노산 서열은 FVIII 아미노산 서열의 N-말단 또는 C-말단에 연결되거나 FVIII 아미노산 서열 내의 2 개의 아미노산 사이에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 국제 공개 번호 WO 2013/123457 A1 및 WO 2015/106052 A1 또는 미국 공개 2015/0158929 A1에 개시된 임의의 부위에서 FVIII 폴리펩티드 내에 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 이종 아미노산 서열은 FVIII의 B 도메인 또는 이의 단편 내에 삽입된다.
일부 구현예에서, 이종 모이어티는 하나 이상의 XTEN 서열, 이의 단편, 변이체 또는 유도체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "XTEN 서열"은 주로 작은 친수성 아미노산으로 구성되는 비천연 발생, 실질적으로 비반복적인 서열을 갖는 연장된 길이의 폴리펩티드를 지칭하고, 서열은 생리적 조건 하에서 낮은 정도의 이차 또는 삼차 구조를 갖거나 이차 또는 삼차 구조를 갖지 않는다. 이종 모이어티로서, XTEN은 반감기 연장 모이어티로서의 역할을 할 수 있다. 추가적으로, XTEN은 강화된 약동학 파라미터 및 용해도 특성을 포함하지만 이로 제한되지 않는 원하는 특성을 제공할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 유용한 XTEN 서열은 약 20 개, 30 개, 40 개, 50 개, 60 개, 70 개, 80 개, 90 개, 100 개, 150 개, 200 개, 250 개, 300 개, 350 개, 400 개, 450 개, 500 개, 550 개, 600 개, 650 개, 700 개, 750 개, 800 개, 850 개, 900 개, 950 개, 1000 개, 1200 개, 1400 개, 1600 개, 1800 개, 또는 2000 개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 소정의 구현예에서, XTEN은 약 20 개 초과 내지 약 3000 개의 아미노산 잔기, 30 개 초과 내지 약 2500 개의 잔기, 40 개 초과 내지 약 2000 개의 잔기, 50 개 초과 내지 약 1500 개의 잔기, 60 개 초과 내지 약 1000 개의 잔기, 70 개 초과 내지 약 900 개의 잔기, 80 개 초과 내지 약 800 개의 잔기, 90 개 초과 내지 약 700 개의 잔기, 100 개 초과 내지 약 600 개의 잔기, 110 개 초과 내지 약 500 개의 잔기 또는 120 개 초과 내지 약 400 개의 잔기를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 하나의 특정한 구현예에서, XTEN은 42 개보다 긴 아미노산 및 144 개보다 짧은 아미노산 길이의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용의 XTEN 서열은 서열 모티프와 적어도 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 5 개 내지 14 개(예를 들어, 9 개 내지 14 개)의 아미노산 잔기 또는 아미노산 서열의 하나 이상의 서열 모티프를 포함할 수 있고, 여기서 모티프는 글리신(G), 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 글루타메이트(E) 및 프롤린(P)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 4 개 내지 6 개 유형의 아미노산(예를 들어, 5 개 아미노산)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 이로 구성된다. 본 개시내용의 키메라 단백질에서 이종 모이어티로서 사용될 수 있는 XTEN 서열의 예는, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, 또는 2011/0172146 A1, 또는 국제 특허 공개 번호 WO 2010/091122 A1, WO 2010/144502 A2, WO 2010/144508 A1, WO 2011/028228 A1, WO 2011/028229 A1, 또는 WO 2011/028344 A2에 개시되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
IV. 숙주 세포
적합한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다. "숙주 세포"는 임의의 관심 물질을 보유하거나 보유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 숙주 세포는 곤충 기원이다. 일부 구현예에서, 적합한 곤충 숙주 세포는 예를 들어 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda, Sf)로부터 단리된 세포주 또는 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni, Tni)로부터 단리된 세포주를 포함한다. 당업자는 임의의 Sf 또는 Tni 세포주의 적합성을 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 예시적인 곤충 숙주 세포에는, 비제한적으로, Sf9 세포, Sf21 세포, 하이 파이브(High Five)™ 세포가 포함된다. 예시적인 곤충 숙주 세포에는, 비제한적으로, 외래성 바이러스 오염이 없는 임의의 Sf 또는 Tni 세포주, 예를 들어 Sf-랍도바이러스-음성(Sf-RVN) 및 Tn-노다바이러스-음성(Tn-NVN) 세포도 포함된다. 다른 적합한 숙주 곤충 세포는 당업자에게 공지되어 있다. 하나의 특정한 구현예에서, 곤충 숙주 세포는 Sf9 세포이다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 숙주 세포는 박테리아 기원이다. 일부 구현예에서, 적합한 박테리아 숙주 세포는 당업자에게 공지된 임의의 박테리아 숙주 세포일 수 있다. 소정의 구현예에서, 적합한 박테리아 숙주 세포는 십자형 DNA 구조를 분해할 수 없다. 소정의 구현예에서, 적합한 박테리아 숙주 균주는 SbcCD 복합체에서의 파괴를 포함한다. 일부 구현예에서, SbcCD 복합체에서의 파괴는 SbcC 유전자 및/또는 SbcD 유전자에서의 유전적 파괴를 포함한다. 소정의 구현예에서, SbcCD 복합체에서의 파괴는 SbcC 유전자에서의 유전적 파괴를 포함한다. SbcC 유전자에서의 유전적 파괴를 포함하는 다양한 박테리아 숙주 균주는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 박테리아 숙주 균주 PMC103은 유전자형 sbcC, recD, mcrA, ΔmcrBCF를 포함하고; 박테리아 숙주 균주 PMC107은 유전자형 recBC, recJ, sbcBC, mcrA, ΔmcrBCF를 포함하고; 박테리아 숙주 균주 SURE는 유전자형 recB, recJ, sbcC, mcrA, ΔmcrBCF, umuC, uvrC를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하기에 적합한 숙주 세포는 포유류 기원, 예를 들어 인간 기원이다. 당업자는 목적에 가장 잘 맞는 특정 숙주 세포주를 우선적으로 결정하는 능력을 갖고 있는 것으로 인정된다. 예시적인 숙주 세포주는 CHO, DG44 및 DUXB11(중국 햄스터 난소주, DHFR 마이너스), HELA(인간 경부암종), CVI(원숭이 신장주), COS(SV40 T 항원을 갖는 CVI 의 유도체), R1610(중국 햄스터 섬유모세포) BALBC/3T3(마우스 섬유모세포), HAK(햄스터 신장주), SP2/O(마우스 골수종), P3.times.63-Ag3.653(마우스 골수종), BFA-1c1BPT(소 내피 세포), RAJI(인간 림프구), PER.C6®, NS0, CAP, BHK21 및 HEK 293(인간 신장)을 포함하지만, 이로 제한되지는 않는다.
본 개시내용의 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 것은 당업자에게 널리 공지된 다양한 기법에 의해 달성될 수 있다. 이들은 형질감염(전기영동 및 전기천공 포함), 원형질체 융합, 인산칼슘 침전, 외피 DNA와의 세포 융합, 미세주입, 및 온전한 바이러스를 사용한 감염을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 문헌[Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)]을 참고한다.
본 개시내용의 벡터를 포함하는 숙주 세포는 적절한 성장 배지에서 성장한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "적절한 성장 배지"는 세포의 성장에 필요한 영양소를 함유하는 배지를 의미한다. 세포 성장에 필요한 영양소는 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민, 미네랄 및 성장 인자를 포함할 수 있다. 선택적으로, 배지는 하나 이상의 선택 인자를 함유할 수 있다. 선택적으로 배지는 우아혈청 또는 우태혈청(FCS)을 함유할 수 있다. 성장 배지는 일반적으로, 예를 들어 벡터 상의 선택 가능한 마커에 의해 보완되는 필수 영양소의 결핍 또는 약물 선택에 의해 벡터를 함유하는 세포를 선택할 것이다.
V. 사용 방법
본원에 제공된 바큘로바이러스 발현 벡터 시스템은 본원에 기재된 재조합 박미드에 삽입된 외래 서열에 의해 인코딩된 산물의 생산에 사용된다. 산물의 확장 가능한 생산은 당업계에 공지된 몇몇 접근법에 의해 달성될 수 있다.
하나의 접근법은 바큘로바이러스의 성장을 지원하는 적합한 곤충 숙주 세포의 감염을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본원에 기재된 외래 서열을 포함하는 재조합 박미드는 먼저 적합한 박테리아 숙주 세포(예를 들어, 이.콜라이)에서 증식된다. 이어서, 재조합 박미드는 박테리아 숙주 세포로부터 단리되고, 적합한 형질감염 시약(예를 들어, 셀펙틴(CELLFECTIN))을 사용하여 적합한 곤충 숙주 세포 내로 형질감염된다. 곤충 숙주 세포는 재조합 바큘로바이러스 입자를 생성하고 이는 이후 외래 서열의 바이러스 증폭을 위해 숙주 곤충 세포 내로 감염될 수 있다.
소정의 구현예에서, 외래 서열에 의해 인코딩된 산물을 생산하는 방법으로서, 적절한 조건 하에서 본원에 기재된 재조합 박미드를 적합한 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및 적절한 조건 하에서 재조합 바큘로바이러스로 제2 적합한 곤충 세포를 감염시켜, 외래 서열에 의해 인코딩된 산물을 생산하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다. 소정의 구현예에서, 유전자 치료제를 생산하려는 목적으로, 재조합 박미드는 Rep 코딩 서열 및 양쪽 모두에 ITR이 측접하는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함한다.
소정의 구현예에서, 핵산 분자를 생산하는 방법으로서, 적절한 조건 하에서 본원에 기재된 재조합 박미드를 적합한 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및 적절한 조건 하에서 재조합 바큘로바이러스로 제2 적합한 곤충 세포를 감염시켜 핵산 분자를 생산하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다. 소정의 구현예에서, ceDNA를 생산하는 방법으로서, 적절한 조건 하에서 본원에 기재된 재조합 박미드를 적합한 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및 적절한 조건 하에서 재조합 바큘로바이러스로 제2 적합한 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA를 생산하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에 제공된다.
또 다른 접근법에서는, 바큘로바이러스 유전자 프로모터(예를 들어, 바큘로바이러스 항시적 유전자 프로모터)의 제어 하에 단백질 인코딩 서열을 안정적으로 통합함으로써 안정 세포주를 생성할 수 있다. 소정의 구현예에서, 안정 세포주는 안정 곤충 세포주이다. 서열의 안정적 통합은 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 핵산을 다양한 숙주 세포주 내로 안정적으로 통합하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(핵산의 안정적 통합에 의해 생성된 예시적인 생산자 세포주의 더 자세한 설명에 대해서는 아래 실시예를 참고). 예를 들어, 선택 가능한 마커(및 AAV cap 및 rep 유전자 및/또는 rAAV 게놈)를 함유하는 핵산이 통합된 세포를 선택하기 위해 (예를 들어, 선택 가능한 마커의 사용을 통한) 반복 선택이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 핵산은 부위-특이적 방식으로 세포주 내로 통합되어 생산자 세포주를 생성할 수 있다. FLP/FRT(예를 들어, 문헌[O'Gorman, S. et al. (1991) Science 251:1351-1355] 참고), Cre/loxP(예를 들어, 문헌[Sauer, B. and Henderson, N. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5166-5170] 참고), 및 phi C31-att(예를 들어, 문헌[Groth, A. C. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5995-6000] 참고)와 같은 몇몇 부위-특이적 재조합 시스템이 당업계에 공지되어 있다.
안정 세포주 접근법에서, 일 구현예에서는, 단백질 인코딩 서열의 적절한 발현에 필요한 보체 단백질을 인코딩하는 BEV가 안정 세포주 내로 도입된다. 소정의 구현예에서, 유전자 치료제를 생산하려는 목적으로, 안정 세포주는 측접 대칭 또는 비대칭 AAV 또는 비-AAV ITR이 안정적으로 통합된 치료 단백질-코딩 유전자를 포함한다. 이어서 적합한 Rep를 인코딩하는 BEV를 유전자 치료제의 생산에 필요한 조건 하에 안정 세포주 내로 도입한다.
특정 안정 세포주를 생성하는 방법이 본원에 기재되어 있다(실시예 8 참고). ceDNA를 생산하기 위한 특정 안정 세포주의 예에는 안정적으로 통합된 도 8b에 나타난 플라스미드를 갖는 세포주가 포함된다. 이들 안정 세포주는 표 5에 나열되어 있다. 소정의 방법에서, ceDNA를 생산하기 위해, ceDNA의 생산에 필요한 조건 하에서 적합한 Rep를 인코딩하는 BEV가 안정 세포주 내로 도입된다.
또 다른 접근법에서, 외래 서열에 의해 인코딩된 산물의 생산은 무-바큘로바이러스 방식으로 안정 세포주를 사용하여 달성될 수 있다. 소정의 구현예에서, 유전자 치료제를 생산하려는 목적으로, 안정 세포주는 측접 대칭 또는 비대칭 AAV 또는 비-AAV ITR이 안정적으로 통합된 치료 단백질-코딩 유전자를 포함한다. 소정의 구현예에서, 안정 세포주에서의 무-바큘로바이러스 생산은 바큘로바이러스 유전자 프로모터의 제어 하의 안정 세포주에서의 Rep 단백질의 일시적 발현을 포함한다. 적합한 바큘로바이러스 유전자 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 소정의 구현예에서, 바큘로바이러스 유전자 프로모터는 오르기아 슈도츠가타 다중 핵다각체병바이러스(Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus, OpMNPV)의 전초기(ie) 유전자 프로모터이다. 소정의 구현예에서, 바큘로바이러스 유전자 프로모터는 OpMNPV의 OpIE2 프로모터이다. 일시적 유전자 발현을 매개하는 다양한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 소정의 구현예에서, 일시적 유전자 발현은 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 형질감염에 의해 달성될 수 있다.
산물의 다운스트림 정제는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 요법 목적의 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 이온-교환 크로마토그래피에 의해 RNA, 고분자량 DNA, 단백질, 및 기타 불순물로부터 저분자량 DNA를 분리하는 실리카 기반 컬럼을 포함하는 플라스미드 DNA 단리 키트에 의해 정제될 수 있다.
본원에 기재된 모든 다양한 양태, 구현예, 및 옵션은 임의의 및 모든 변형으로 조합될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 포함된 것으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본 개시내용이 일반적으로 기재되어 있지만, 추가의 이해가 본원에 제공된 실시예를 참조하여 얻어질 수 있다. 이들 실시예는 단지 예시의 목적을 위한 것이고 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예
실시예 1: BIVVBac 전구체 박미드
발현 벡터 중에서도, 바큘로바이러스는 그의 큰 유전적 카고(cargo) 용량(최대 수십 kb이며, 100 kb로 보고된 바가 있음)으로 인해 뛰어나다. 이 전이유전자 용량은 재조합 AAV 벡터(최대 38 kb의 발현 카세트)의 생산을 위해 이용되어 왔다. 또한 바큘로바이러스 벡터의 큰 전이유전자 용량은 비-바이러스 유전자 요법을 위한 DNA 치료 약물 물질 생산을 위해 활용할 수 있다고 추론하였다. 따라서, 기존의 박미드 툴을 사용하여 달성할 수 있는 것보다 다수의 전이유전자를 수용하도록 특별히 설계된 새로운 다용도 바큘로바이러스 셔틀 벡터(박미드)를 생성하였다. 이 다용도 박미드("BIVVBac"로 불림)는 생체내 유전자 요법을 위한 rAAV 벡터 생산뿐만 아니라, 임의의 원하는 단백질, 예를 들어 재조합 단백질의 생산에도 사용될 수 있다.
BIVVBac 박미드는 AcMNPV C6 게놈을 인코딩하는 bMON14272(Invitrogen)로부터 유래되었으며(도 1의 A) 다음 두 개의 삽입 부위를 인코딩하도록 조작하였다: 1) 폴리헤드린 유전자좌에서의 mini-attTn7 및 2) EGT 유전자좌에서의 LoxP. mini-attTn7 삽입 서열은 Tn7-매개 전위 후 재조합 박미드의 X-gal-매개 블루/화이트 스크리닝을 위한 Lac-프로모터-구동 이.콜라이 LacZα 단편과 인-프레임 융합되고 LoxP 부위는 Cre-매개 시험관내 또는 생체내 재조합을 위한 것이다. LoxP 재조합 부위는 폴리에흐드린 유전자좌에 mini-attTn7 삽입 서열을 함유하는 bMON14272에 두 단계로 삽입하였다. 먼저, ets 폴리아데닐화 신호가 뒤에 있는 AcMNPV 39K 프로모터 하의 루돌프 적색 형광 단백질(RFP) 유전자, LoxP 재조합 부위, 및 AcMNPV EGT 유전자좌에 측접하는 서열을 포함하는 플라스미드를 젠스크립트(GenScript)®(Piscataway, NJ)를 통해 합성했다(도 1의 B)(SEQ ID NO: 9). 그런 다음, 합성 플라스미드 DNA를, 제조업체의 지침에 따라, 셀펙틴(Cellfectin)(Invitrogen) 형질감염 시약을 사용하여 Sf9 세포(ATCC® CRL-1711)에서 AvrII 선형화된 bMON14272와 공동-형질감염시켰다. RFP 발현 카세트 및 LoxP 서열을 Sf9 세포에서 상동성 재조합에 의해 EGT 유전자좌에서 재조합하였다. 무-세포 상층액 내 생산된 자손 바이러스를 플라크 정제하고 RFP+ 플라크를 Sf9 세포에서 증폭하여 P1(계대 1) 바이러스를 생성했다. 그런 다음 바큘로바이러스 DNA를 P1 바이러스로부터 단리하고 주형으로 사용하여 전달 플라스미드의 내부 및 외부에 있는 프라이머를 사용하고 생성된 앰플리머(amplimer)를 시퀀싱하여 예상되는 재조합 접합에 걸쳐 있는 영역을 PCR 증폭했다. 재조합 바이러스를 추가로 증폭하고, 바이러스 DNA 단리에 사용했으며, 이를 이후 이.콜라이 DH10B 박테리아 내로 형질전환시키고(O'Reilly et al. 1992), 이어서 카나마이신, X-Gal, 및 IPTG를 사용하여 선택했다. 카나마이신 저항성 청색 이.콜라이 클론으로부터 단리된 박미드 DNA를 제한 효소 맵핑으로 분석하고 "BIVVBac"으로 지정하였다(도 1의 C). Tn7 전위효소 유전자 tnsA-E 및 테트라사이클린 저항성을 인코딩하는 헬퍼 플라스미드, pMON7124(Invitrogen)를 BIVVBac를 보유하는 DH10B 이.콜라이 내로 형질전환시킨 후, 카나마이신 및 테트라사이클린을 사용하여 선택하였다. 이중 저항성 클론 중 하나를, 이전에 기재된 바와 같이(Sharma and Schimke, 1996), 전기-수용성(electro-competent) 세포를 만드는 데 사용하였고 생성된 새로운 이.콜라이 균주를 BIVVBacDH10B로 지정하였다(도 1의 D). 그 다음 이 균주를, 하기 기재된 바와 같이, Tn7 전위에 의해 폴리헤드린 유전자좌에 AAV2, B19, 또는 GPV 복제(Rep) 단백질-코딩 유전자를 삽입하는 데 사용하였다.
실시예 2: Cre-LoxP 공여체 벡터
LoxP 재조합 부위, 전사 인핸서 hr5 요소가 앞에 있고 AcMNPV p10 폴리아데닐화 신호가 뒤에 있는 AcMNPV ie1 프로모터 하의 강화된 GFP(eGFP) 마커 유전자, 암피실린 저항성 마커, 조건부 R6Kγ 복제 원점, 및 다중 클로닝 부위를 포함하는 DNA 작제물을 젠스크립트®(Piscataway, NJ)를 통해 합성했다(SEQ ID NO:10)(도 2a). 이 합성 DNA를 pUC57 벡터 내로 클로닝하고 생성된 작제물을 "Cre-LoxP 공여체 벡터"로 지정했다(도 2b). Cre-LoxP 공여체 벡터의 주요 특징은 다음과 같다: (1) 전이유전자 삽입을 위한 다중 클로닝 부위(MCS); (2) Cre-매개 시험관내 또는 생체내 재조합을 위한 LoxP 부위; (3) 다음의 2 개의 복제 원점: (3a) DH5α, NEB 안정, PMC103, 및 DH10B와 같은 이.콜라이 균주 내로 이 벡터를 증식시키기 위한 ColE1 Ori, 및 (3b) pir+ 및 pir116과 같은 π 단백질을 발현하는 이.콜라이 균주 내로 이 벡터를 증식시키기 위한 조건부 R6Kγ Ori; (4) Cre-LoxP 재조합에 의해 'BIVVBac' 내 LoxP 부위에 Cre-LoxP 공여체 벡터를 삽입한 후 카나마이신 및 암피실린을 이용하여 재조합 박미드를 선택하기 위한 암피실린 항생제-저항성 유전자; 및 (5) 연속 계대에 걸쳐 Sf9 세포에서 복제되는 동안 재조합 BEV에서의 전이유전자의 안정성을 결정하기 위한 강화된 GFP 리포터 유전자.
실시예 3: 복제(Rep) 단백질 발현 작제물
B19.Rep:
B19 Rep의 코딩 서열은 B19 균주 HV(젠뱅크(GenBank) 수탁 번호 AF162273)로부터 얻었고 야생형 서열은 젠스크립트®(Piscataway, NJ)를 통해 합성했다(SEQ ID NO:11)(도 3a). 합성 DNA를 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 pFastBac1(Invitrogen) 벡터 내로 클로닝하고 젠타마이신 저항성 클론을 사용하여 pFastBac.Polh.B19.Rep 전달 벡터를 생성했다. 이 벡터를 BIVVBacDH10B 이.콜라이 내로 형질전환시켜 하기 기재된 바와 같이 재조합 BEV, AcBIVVBac.Polh.B19.RepTn7을 생산했다. 그런 다음 적정된 BEV를 대칭 B19 ITR을 갖는 hFVIIIco6XTEN을 인코딩하는 다클론 Sf 세포주에서의 감염에 사용하였으며 ceDNA 벡터는 하기 기재된 바와 같이, 감염된 세포 펠렛으로부터 정제하였다. 예비 결과에서는 폴리헤드린 프로모터-구동 B19.Rep가 ceDNA를 '구제'할 수 없는 것으로 드러났다. 바큘로바이러스 감염 주기의 극후기 단계에서 높은 수준의 비-스플라이싱 B19.Rep 발현은 비효율적이고/이거나 세포에 독성이 있다는 가설을 세웠다. 이 가설에 대해, 폴리헤드린 프로모터를 AcMNPV-항시적 전초기(ie1) 프로모터로 대체하여 pFastBac.IE1.B19.Rep 전달 벡터를 생성했다(도 3b). 이 벡터를 사용하여 재조합 BEV, AcBIVVBac.IE1.B19.RepTn7을 생성한 후 대칭 B19 ITR을 갖는 hFVIIIco6XTEN을 인코딩하는 다클론 Sf 세포주에서 테스트했다. 결과는 AcMNPV-항시적 ie1-구동 B19.Rep가 폴리헤드린-구동 Rep와 비교하여 테스트된 두 세포주 모두로부터 ceDNA 벡터를 구제할 수 있었음을 보여주었다. 이 데이터는 Rep 단백질의 화학량론적 발현이 rAAV 생산에 대해 이전에 관찰된 바와 같이 Sf9 세포에서의 ceDNA 생산에 중요하다는 것을 시사한다.
GPV.Rep:
GPV Rep의 코딩 서열은 GPV 균주 B(젠뱅크 수탁 번호 GPU25749)로부터 얻었다. B19와 달리, GPV.Rep는 단일 mRNA 전사물로부터 스플라이싱된 단백질(Rep78 및 Rep52)을 생산하고, 두 단백질 모두의 화학량론적 발현을 달성하기 위해, 리키 리보솜 스캐닝 메커니즘을 통해 단일 mRNA 종으로부터 Rep78 및 Rep52 폴리펩티드의 발현을 가능하게 할 Rep78 코딩 서열을 유전적으로 변형시켰다. Rep78 오픈 리딩 프레임(orf)의 AUG 개시 코돈, 인접한 프롤린 코돈, 및 Rep52 orf의 시작 코돈 전에 발생하는 12 개의 다운스트림 AUG 트리플렛(triplet)을 유전자 합성을 통해 변경하였다. 코작 공통 서열의 맥락에서 제시되는 CUG 트리플렛으로 구성된 비효율적 번역 개시 신호로 Rep78 개시 코돈 및 근위 측접 뉴클레오티드를 돌연변이시켰다. Rep78 orf의 개시 코돈과 Rep52 orf의 AUG 개시 코돈 사이에 발생하는 AUG 트리플렛은 침묵 돌연변이를 지니거나(아웃-오브-프레임 AUG 코돈의 경우) 보존적 아미노산 치환을 인코딩하도록 (인-프레임 AUG 코돈의 경우) 변경하였다. 마지막으로, 변형된 GPV.Rep 코딩 서열을 젠스크립트®를 통해 합성하였고(SEQ ID NO:12)(도 3c) 합성 DNA를 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 pFastBac1(Invitrogen) 벡터 내로 클로닝하여 pFastBac.Polh.GPV.Rep 전달 벡터를 생성했다(도 3d). 그런 다음 이 벡터를 BIVVBacDH10B 이.콜라이 내로 형질전환시켜 하기 기재된 바와 같이 재조합 BEV, AcBIVVBac.Polh.GPV.RepTn7을 생산했다.
AAV2.Rep:
AAV2 Rep의 코딩 서열은 AAV2 게놈(젠뱅크 수탁 번호 NC_001401)으로부터 얻었다. B19.Rep와 달리, AAV2.Rep 또한 단일 mRNA 전사물로부터 스플라이싱된 단백질(Rep78 및 Rep52)을 생산하고, 두 단백질 모두의 화학량론적 발현을 달성하기 위해, 이전에 기재된 바와 같이(Smith et al., 2009), 리키 리보솜 스캐닝 메커니즘을 통해 단일 mRNA 전사물로부터 Rep78 및 Rep52 폴리펩티드의 발현을 가능하게 할 Rep78 코딩 서열을 유전적으로 변형시켰다(도 3e). 변형된 AAV2.Rep 코딩 서열을 젠스크립트®를 통해 합성하였고(SEQ ID NO:13)(도 3e) 합성 DNA를 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 pFastBac1(Invitrogen) 벡터 내로 클로닝하여 pFastBac.Polh.AAV2.Rep 전달 벡터를 생성했다(도 3f). 그런 다음 이 벡터를 BIVVBacDH10B 이.콜라이 내로 형질전환시켜 하기 기재된 바와 같이 재조합 BEV, AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7을 생산했다.
실시예 4: 인간 FVIIIco6XTEN 발현 작제물
비-AAV 또는 AAV ITR을 갖는 인간 FVIIIco6XTEN 발현 작제물:
간-특이적 TTPp 프로모터 하의 XTEN 144 펩티드를 갖는 코돈-최적화된 인간 FVIII(FVIIIco6XTEN), 우드척 전사후 조절 요소(WPRE), 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(bGHpA) 신호, 및 비-AAV 또는 AAV의 측접 절두된 ITR을 포함하는 유전적 작제물이 PCT 공개 번호 WO2019032898A1에 기재되어 있다. 여기서, 이들 작제물은 5' 또는 3' ITR을 비-AAV 또는 AAV의 야생형 서열로 대체함으로써 만든 새로운 작제물과 동시에 테스트하였다(표 2). 이들 새로운 작제물은, 십자형 DNA 구조를 인식하고 제거하는 엑소뉴클레아제를 인코딩하는, sbcC 유전자 결실을 함유하는 이.콜라이 균주 PMC103에서 성장시키고 유지하였다. PMC103 이.콜라이는 박테리아 배양물의 온도 및 성장 조건을 최적화한 후 비-AAV 또는 AAV의 대칭 또는 비대칭 ITR을 갖는 hFVIIIco6XTEN 작제물의 성장을 지원할 수 있었다. 모든 새로운 작제물은 암피실린 저항성 플레이트에서 선택하였으며 제한 효소 맵핑으로 스크리닝하여 올바른 유전적 구조를 결정했다. 그런 다음 hFVIIIco6XTEN 발현 작제물을 Cre-LoxP 공여체 벡터를 만드는 데 사용했다.
[표 2]
인간 FVIIIco6XTEN 발현 작제물
Figure pct00004
비-AAV 또는 AAV ITR을 갖는 인간 FVIIIco6XTEN Cre-LoxP 공여체 벡터:
작제물-1, -3, 및 -7(표 2)로부터의 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트를 PstI 효소를 사용하여 절제하고 Cre-LoxP 공여체 벡터 내의 동일한 부위에 클로닝했다. 생성된 작제물을 NEB® 안정 수용성 이.콜라이 균주(New England Biolabs) 내로 형질전환시키고 제한 효소 맵핑에 의해 암피실린 저항성 클론을 스크리닝했다. pCLDV-1, -3, 및 -7(표 2)에서 "플라스미드 Cre-LoxP"에 대한 접두사 "pCL"을 사용하여 올바른 클론을 지정했다(도 4b). 유사하게, 다른 공여체 벡터를 생성하기 위해, 작제물 -2, -4, -5, -6, -8, 및 -9로부터의 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트를 PstI 및/또는 PvuII 효소를 사용하여 절제하고 Cre-LoxP 공여체 벡터 내의 동일한 부위에 클로닝했다. 야생형 ITR 서열의 긴 회문 반복부로 인해 이들 작제물을 PMC103 이.콜라이 균주 내로 형질전환시켰고 제한 효소 맵핑에 의해 암피실린 저항성 클론을 스크리닝하였다. 그런 다음 생성된 Cre-LoxP 공여체 벡터, pCLDV-2, -4, -5, -6, -8, 및 -9를 Tn7 부위에서 각각 B19, GPV, 또는 AAV2 Rep를 인코딩하는 "BIVVBac" 박미드 내로 LoxP 재조합 부위에서 삽입하였다(표 3). 표 3의 ITR의 서열은 표 1에 제시되어 있다.
[표 3]
인간 FVIIIco6XTEN Cre-LoxP 공여체 벡터
Figure pct00005
실시예 5: 복제(Rep) 바큘로바이러스 발현 벡터(BEV)
AAV의 복제는 비구조(복제) 단백질; Rep78, Rep68, Rep52, 및 Rep40에 좌우된다. AAV ITR에 대한 결합, 서열- 및 가닥-특이적 엔도뉴클레아제 활성, 및 ATP-의존적 DNA 헬리카제 활성을 포함하여, 바이러스 DNA 복제에 관여하는 특징규명된 AAV Rep78 및 Rep68의 몇몇 활성이 존재한다. Rep68 또는 Rep78은 ITR 내의 특정 영역(Rep 결합 부위)에 결합하고 말단 분해 부위(TRS)로 불리는 고유한 부위에서 이중체(duplex) 복제 중간체의 한 가닥을 끊는다(nick). 엔도뉴클레아제 반응은 새로 생성된 5' 말단에 대한 Rep의 공유결합적 부착을 초래한다. 닉(nick)의 3' 말단은 ITR의 연장을 위한 프라이머로서의 역할을 한다. 공유결합적으로 부착된 Rep 분자의 헬리카제 활성은 ITR의 이차 구조를 풀 수 있다. 말단 분해의 프로세스는 말단의 복원 및 자손 바이러스 게놈의 생성을 위한 수단을 제공한다. 따라서, Rep는 진핵 세포에서의 ITR-매개 벡터 생산에 필수적이며 Sf9 세포로부터 ITR-측접 hFVIIIco6XTEN 벡터 게놈을 '구제'하기 위해, 본 발명자들은 비-AAV 또는 AAV Rep를 인코딩하는 재조합 BEV를 생성했다. 이들 BEV를 생성하기 위해, 먼저, BIVVBacDH10B 이.콜라이(도 1의 D)를 전달 벡터, pFastBac.IE1.B19.Rep(도 3b), pFastBac.Polh.GPV.Rep(도 3d) 및 pFastBac.Polh.AAV2.Rep(도 3f)로 초-형질전환(super-transform)시킨 후, 카나마이신, 젠타마이신, X-Gal, 및 IPTG에 대해 형질전환체를 선택하였다. BIVVBac 내 mini-attTn7 삽입 부위에서의 Rep 발현 카세트 및 젠타마이신 저항성 유전자의 부위-특이적 전위는 LacZα(mini-attTn7과 인-프레임 융합됨)를 파괴하고 X-Gal-매개 이중 항생제 선택에서 백색 이.콜라이 콜로니를 초래했다. 따라서, 재조합 박미드 DNA를 알칼리성 용해 미니프렙에 의해 백색 이.콜라이 콜로니로부터 단리하고 제한 효소로 분해하여 올바른 유전적 구조를 결정했다. 제한 효소 맵핑의 결과는 각각의 재조합 박미드에 대한 예상되는 단편을 보여주었고 이는 BIVVBac의 폴리헤드린 유전자좌에서의 Rep의 부위-특이적 전위를 시사한다(도 5a). 전달 플라스미드의 내부 및 외부에 있는 프라이머를 사용하여 예상되는 삽입 부위에 걸쳐 있는 영역을 PCR 증폭하고 생성된 앰플리머를 시퀀싱하여 추가 확인을 달성했다.
제조업체의 지침에 따라, 셀펙틴®(Invitrogen) 형질감염 시약을 사용하여 B19.Rep, GPV.Rep, 또는 AAV2.Rep를 인코딩하는 올바른 재조합 박미드를 Sf9 세포에 형질감염시켰다. 기재된 바와 같이(Jarvis, 2014), 형질감염-후 4 내지 5 일째에, 자손 바큘로바이러스를 수확하고 Sf9 세포에서 플라크 정제했다. 각각의 재조합 BEV, AcBIVVBac.IE1.B19.RepTn7 (도 5b), AcBIVVBac.Polh.GPV.RepTn7 (도 5c), 및 AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 (도 5d)의 플라크 정제된 RFP+ 클론 6 개를 10% 열-불활성화 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 ESF-921 배지에서 T25 플라스크 중 mL 당 0.5 x 106으로 시딩된 Sf9 세포 내에서 P1(계대 1)로 증폭하였다. 감염-후 4 내지 5일째에, P1 바이러스를 저속 원심분리로 수확하고 감염된 세포 펠렛을 항-B19 NS1(MyBioSource, Inc.), 항-GPV.REP(GenScript®), 및 항-AAV2.REP 303.9(American Research Products Inc.) 단일클론 또는 다클론 항체를 각각 사용하는 면역블롯팅에 의해 B19.REP, GPV.REP 또는 AAV2.REP 검출에 대해 테스트했다. AcBIVVBac.IE1.B19.RepTn7 플라크 정제된 클론의 면역블롯 분석(도 5e)은 74 kDa의 예측 질량에서 단일 종의 B19.REP를 보여주었는데, 이는 Sf9 세포에서 비-스플라이싱된 mRNA 전사물로부터 발현된 B19.REP를 시사한다. 흥미롭게도, 테스트된 모든 바이러스 클론에서 관찰되는 동등한 수준의 B19.REP 발현이 있었으며 이는 Sf9 세포에서 AcMNPV IE1 프로모터 하의 B19.REP 발현의 화학량론적 수준을 시사한다. B19.REP와 달리, AcBIVVBac.Polh.GPV.RepTn7 (도 5f) 또는 AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 (도 5g) 플라크 정제된 클론의 면역블롯 분석은 Rep78 및 Rep52 폴리펩티드에 해당하는 73 kDa 및 49 kDa의 예측 질량에서 2 개의 종의 REP를 보여주었는데, 이는 Sf9 세포에서 스플라이싱된 mRNA 전사물로부터 발현된 GPV.REP 및 AAV2.REP를 시사한다. 테스트된 모든 바이러스 클론에서 관찰되는 동등한 수준의 Rep78 또는 Rep52가 있었으며 이는 Sf9 세포에서 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 안정적인 GPV.REP 및 AAV2.REP 발현을 시사한다. REP78 발현의 수준은 REP52의 거의 절반이었는데, 이는 리키 리보솜 스캐닝 메커니즘에 의해 단일 mRNA 전사물로부터 두 폴리펩티드 모두의 올바른 화학량론적 발현이 달성된다는 것을 추가로 시사한다. 각각의 BEV의 가장 높은 REP 발현 클론을 Sf9 세포에서 추가 증폭을 위해 선택한 다음, ceDNA 벡터 생산을 위해 비-AAV 및 AAV의 대칭 또는 비대칭 ITR이 측접하는 hFVIIIco6XTEN을 인코딩하는 안정 세포주에서의 감염에 사용했다.
실시예 6: 복제(Rep) 및 인간 FVIIIco6XTEN 바큘로바이러스 발현 벡터(BEV)
BIVVBac를 사용하여 다수의 전이유전자를 수용할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 다음의 2 개의 전이유전자 발현 카세트를 인코딩하는 유도체 벡터 패밀리를 생성했다: 1) Rep, 및 2) 비-AAV 및 AAV의 대칭 또는 비대칭 ITR이 측접하는 hFVIIIco6XTEN. 이들 BEV는 두 단계로 생산했다. 먼저, 상기 기재된 바와 같이, Tn7 전위를 통해 폴리헤드린 유전자좌에서의 mini-attTn7 부위에 Rep 발현 카세트를 삽입했다. 그런 다음, Cre 재조합효소(New England Biolabs)를 사용하여 시험관내 Cre-LoxP 재조합을 통한 EGT 유전자좌에서의 LoxP 부위에 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트를 삽입하기 위해, 생성된 재조합 박미드를 사용했다. 프로세스에서, B19 ITR, GPV ITR, 및 AAV ITR을 갖는 hFVIIIco6XTEN을 인코딩하는 Cre-LoxP 공여체 벡터(pCLDV-1 내지 -9)(표 2)를 AcBIVVBac.IE1.B19.Rep(도 5b), AcBIVVBac.Polh.GPV.Rep(도 5c), 또는 AcBIVVBac.Polh.AAV2.Rep(도 5d) 박미드에 각각 삽입하였다. 재조합 반응물을 DH10B 이.콜라이에 형질전환시켰고 형질전환체는 카나마이신, 젠타마이신, 및 암피실린에 대해 선택하였다. 전달 플라스미드의 내부 및 외부에 있는 프라이머를 사용하여 예상되는 삽입 부위에 걸쳐 있는 영역을 증폭하고 생성된 앰플리머를 시퀀싱함으로써 PCR 및/또는 제한 효소 맵핑에 의해 삼중 항생제-저항성 콜로니를 스크리닝했다.
두 전이유전자 카세트 모두를 인코딩하는 올바른 재조합 박미드를 맥시 프렙(maxi prep) 정제하고 셀펙틴®(Invitrogen) 형질감염 시약을 사용하여 Sf9 세포에 형질감염시켰다. 형질감염-후 4 내지 5 일째에, 자손 바큘로바이러스를 수확하고 Sf9 세포에서 플라크 정제했다. 각각의 재조합 BEV(BEV-1 내지 -9)(표 4)(도 6a, 도 6b, 및 도 6c)의 플라크 정제된 RFP+ 및 GFP+ 클론 6 개를 10% 열-불활성화 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 ESF921 배지에서 T25 플라스크 중 mL 당 0.5 x 106으로 시딩된 Sf9 세포 내에서 P1(계대 1)로 증폭하였다. 감염-후 4 내지 5 일째에, 모든 클론은 각각의 재조합 BEV에 대해, GFP+ 및 RFP+ 세포의 수에 의해 결정되는, 감염의 진행을 나타냈으며 이는 바이러스가 정상적으로 복제될 수 있었고 동일한 바큘로바이러스 게놈 내 다수의 전이유전자 삽입이 자손 바이러스 생산에 유해 효과를 미치지 않았음을 시사한다. P1 바이러스를 저속 원심분리로 수확하고 감염된 세포 펠렛을 면역블롯팅에 의한 REP 검출 또는 퓨어링크 맥시 프렙 DNA 단리 키트(PureLink Maxi Prep DNA isolation kit)(Invitrogen)를 사용하는 ceDNA 단리를 위해 가공했다. 상기 기재된 바와 같이, B19.REP, GPV.REP 또는 AAV2.REP를 검출하기 위해 면역블롯팅을 수행했다. 면역블롯팅의 결과는 테스트된 각각의 REP에 대해 6 개 클론 모두 양성임을 나타냈는데, 이는 EGT 유전자좌에서의 hFVIIIco6XTEN 카세트의 삽입이 전초기 또는 폴리헤드린-구동 REP 발현에 유해 효과를 미치지 않았음을 시사한다. 마지막으로, 각각의 BEV의 가장 높은 REP 발현 클론을 추가로 증폭하여 작업 BEV 모액(P2)을 생산한 후 Sf9 세포에서 역가를 측정했다. 하기 기재된 바와 같이, 적정된 BEV를 Sf9 세포에서의 감염에 사용하여 hFVIIIco6XTEN ceDNA 벡터를 생산했다.
[표 4]
Rep 및 인간 FVIIIco6XTEN BEV
Figure pct00006
실시예 7: 바큘로바이러스로부터의 인간 FVIIIco6XTEN ceDNA 벡터 생산
hFVIIIco6XTEN 및 Rep 유전자 둘 모두를 인코딩하는 재조합 BEV(표 4)를 ceDNA 생산에 대해 테스트했다. Sf9 세포를 3 pfu/세포의 감염 다중도(MOI)로 각각의 BEV의 적정된 작업 모액(P2)으로 감염시켰다. 세포를 실온에서 1.5 시간 동안 가볍게 회전시키고, 500xg로 5 분 동안 펠렛화하고, 상층액을 흡입하고, 세포를 10 mL의 신선한 ESF-921 배지로 1 회 세척하였다. 세포를 50 mL의 ESF-921 배지 내로 현탁시킨 다음 진탕 인큐베이터(shaker incubator)에서 28℃에서 72 시간 동안 인큐베이션시켰다. 감염-후 72 시간째에, 감염된 세포를 수확하고, 펠렛을 1x PBS로 1 회 세척하여 잔류 바큘로바이러스 입자 및/또는 배양 배지를 제거하였다. 그런 다음, 제조업체의 지침에 따라, 퓨어링크 맥시 프렙 DNA 단리 키트(Invitrogen)에 의해 ceDNA 벡터를 단리했다. 용출 분획을 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여 각 ceDNA 벡터의 수율 및 순도를 결정했다. 제1 라운드의 분석으로서, BEV-5(표 4, 도 7a)로 감염된 Sf9 세포로부터 단리된 ceDNA 벡터를 테스트하였다. BEV-5의 6 개 클론 모두를 ceDNA 생산에 대해 테스트하였다. 클론 중 하나는 hFVIIIco6XTEN 전이유전자의 크기(약 7.0 kb)에 해당하는 DNA 밴드를 보여주었는데, 이는 폴리헤드린-구동 GPV REP가 비대칭 ITR-측접-hFVIIIco6XTEN 벡터 DNA를 구제할 수 있었음을 보여준다(도 7b). 밴딩 패턴을 시각화하고 ceDNA의 크기를 확인하기 위해 샘플을 상이한 부피로 다시 러닝했다. 고분자량의 다수의 밴드를 관찰하였다(도 7c). 이 데이터는 비-AAV Rep뿐만 아니라 ITR-측접 hFVIIIco6XTEN 전이유전자를 인코딩하는 단일 재조합 BEV로부터의 ceDNA 생산의 개념을 증명한다.
실시예 8: 인간 FVIIIco6XTEN 안정 곤충 세포주
곤충 세포 게놈 또한 변형되어 바큘로바이러스 감염 후 DNA 치료 약물 물질을 생산할 수 있다고 추론하였다. 이 목표를 달성하기 위해, 전사 인핸서 hr5 요소가 앞에 있고 AcMNPV p10 폴리아데닐화 신호가 뒤에 있는 AcMNPV 전초기(ie1) 프로모터 하의 네오마이신 저항성 마커를 인코딩하는 플라스미드를 젠스크립트®(Piscataway, NJ)로부터 합성했다(SEQ ID NO:14)(도 8a). 이 합성 DNA는 셀펙틴®(InvitrogenTM)을 사용하여 Sf9 세포에서 비-AAV 또는 AAV의 대칭 및 비대칭 ITR이 측접하는 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트(표 3)를 인코딩하는 플라스미드와 공동-형질감염시켰다. 형질감염-후 24 시간째에, 세포를 형광 현미경으로 시각화하여 형질감염 효율을 결정하였고, 그 결과 80% 초과의 GFP+ 세포가 나타났으며 이는 더 높은 형질감염 효율을 시사한다. 형질감염-후 72 시간째에, 1.0 mg/mL의 최종 농도에서 완전 TNMFH 배지(10% FBS + 0.1% Pluronic F68이 보충된 Grace 곤충 배지(Grace's Insect Medium))에 현탁된 G418 항생제(Sigma Aldrich)로 세포를 선택하였다. 선택 약 1주일 후, 형질전환된 세포의 약 50%가 회수되었으며, 이는 네오마이신 저항성 마커가 이 세포 집단 내로 안정적으로 통합되었음을 시사한다. 생존 세포(survivor cell)를 선택 배지에서 꺼냈고, 생존 세포에 합류 성장 시까지 신선한 완전 TNMFH 배지를 공급하였다. 합류 세포를 분열이 계속됨에 따라 더 큰 배양 용기로 부착 배양으로서 점진적으로 확장시켰다. 이후, 각 세포주를 완전 TNMFH에서 1회 계대 및 10% FBS가 보충된 ESF-921 배지에서 1회 계대 동안 진탕 플라스크에서 성장시켜 현탁 배양에 적응시켰다. 마지막으로, 각 세포주를 현탁 배양물로서 진탕 플라스크에서 무-혈청 ESF-921에 적응시켰다. 이들 진탕 플라스크 배양물을 4일마다 계대로 무-혈청 ESF-921 배지에서 일상적으로 유지하고 세포 성장을 모니터링하였다. 각각의 세포주는 삽입된 hFVIIIco6XTEN 작제물에 따라 지정되고 "Sf"라는 접두사가 붙는다(도 8b)(표 5).
[표 5]
인간 FVIIIco6XTEN 안정 곤충 세포주
Figure pct00007
실시예 9: 안정 세포주로부터의 인간 FVIIIco6XTEN ceDNA 벡터 생산
안정 세포주 접근법을 테스트하기 위해, 비-AAV 및 AAV의 대칭 또는 비대칭 ITR(표 4)을 갖는 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트를 인코딩하는 각각의 세포주의 다클론 집단을 사용했다. 세포를 3 pfu/세포의 감염 다중도(MOI)로 Rep를 인코딩하는 각각의 재조합 BEV(도 5b 내지 도 5d)의 적정된 작업 모액(P2)으로 감염시켰다. 세포를 실온에서 1.5 시간 동안 가볍게 회전시키고, 500xg로 5 분 동안 펠렛화하고, 상층액을 흡입하고, 세포를 10 mL의 신선한 ESF-921 배지로 1 회 세척하였다. 마지막으로, 세포를 50 mL의 ESF-921 배지 내로 현탁시킨 다음 진탕 인큐베이터(shaker incubator)에서 28℃에서 72 시간 동안 인큐베이션시켰다. 감염-후 72 시간째에, 감염된 세포를 수확하고, 펠렛을 1x PBS로 1 회 세척하여 잔류 바큘로바이러스 입자 및/또는 배양 배지를 제거하였다. 그런 다음, 제조업체의 지침에 따라, 퓨어링크 맥시 프렙 DNA 단리 키트(Invitrogen)에 의해 ceDNA 벡터를 단리했다. 용출 분획을 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여 각 ceDNA 벡터의 수율 및 순도를 결정했다. 결과는, 이전에 관찰된 바와 같이(도 9a 내지 도 9c), DNA 밴드가 다양한 정도의 강도를 갖는 hFVIIIco6XTEN의 크기(약 7.0 kb)뿐만 아니라 고분자량 밴드에 대응함을 보여주었다. 흥미롭게도, 테스트된 모든 세포주는 측접 대칭 및/또는 비대칭 ITR에 관계없이 DNA 밴드가 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트의 크기에 대응함을 보여주었다. GPV 세포주-3, -4, 및 -5는 B19 또는 AAV2 주와 비교하여 다양한 크기의 다수의 밴드를 나타냈다.
실시예 10: ceDNA로부터의 인간 FVIIIco6XTEN 발현
ceDNA가 혈우병 A 환자 치료를 위한 비-바이러스 유전자 요법 벡터로 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 시험관내 검정을 수행하여 간세포-유래 암종 인간 Huh7 세포 내 ceDNA로부터의 인간 FVIII 발현을 테스트했다. 먼저, Huh7 세포를 10% FBS 및 0.1% 항생제 혼합물(InvitrogenTM)이 보충된 변형 IMEM 배지(GibcoTM) 중에 24-웰 플레이트에 5 x 105 세포/mL로 시딩한 후, 48 시간 동안 CO2(5%)와 함께 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션시켜 정적 세포 성장으로 인한 단일층을 달성하였다. 이 성장 조건은 생체내에서 비-침하 간 세포의 핵에서의 hFVIIIco6XTEN 발현을 모방하기 위해 달성하였다. 제조업체의 지침에 따라, 리포펙타민(Lipofectamine) 3000(InvitrogenTM)을 사용하여 hFVIIIco6XTEN 발현 카세트의 크기에 해당하는 약 1 ug의 겔-정제된 ceDNA 로 단일층을 형질감염시켰다. 대칭 절두된 ITR이 측접하는 hFVIIIco6XTEN을 인코딩하는 플라스미드 DNA를 대조군으로 사용했다(pCLDV-1, -3, 및 -7, 표 3). 형질감염-후 18 시간째에, 형질감염 혼합물을 흡입하고, 10% FBS 및 0.1% 항생제 혼합물이 보충된 신선한 IMEM 배지를 세포에 공급했다. 공급-후 48 시간 및 72 시간째에 각각의 처리로부터 무-세포 상층액을 분취하고 분비된 hFVIIIco6XTEN을, 제조업체의 지침에 따라, 크로모제닉스 코테스트® SP 인자 VIII 발색 검정에 의해 측정했다. 표준을 사용하여 FVIII 활성을 정규화하고 도 10에 U/mL로서 도표화하였다. 검정 결과는 hFVIII.B19Δ135.ceDNA를 제외하고 테스트된 모든 샘플에 대해 시간이 지남에 따른 hFVIII 발현 수준의 증가를 보여주었다. 이 데이터는 FVIII가 Huh7 세포의 비-분할 단일층의 핵에 잠재적으로 형질감염된 ceDNA 벡터로부터 발현되었음을 시사한다. GPV 세포주-3, -4, 및 -5로부터 얻은 ceDNA는 AAV 주-6 및 -8과 비교하여 낮은 수준의 FVIII 발현을 나타냈는데, 이는 상기 기재된 바와 같이, GPV ITR이 세포 게놈 내로 통합되는 동안 절두될 가능성이 있음을 시사한다. 놀랍게도, B19 세포주-1 및 -2로부터 얻은 ceDNA는 검출 가능한 hFVIIIco6XTEN 발현을 나타내지 않았던 반면, 대조군으로 사용된 플라스미드 DNA(pCLDV-1, 표 3)에서는 검출 가능했다. 전체적으로, GPV 및 AAV의 ceDNA 벡터는 Huh7 세포에서 생리학적 수준에서 지속적인 hFVIII 발현을 나타냈으며, 이는 ceDNA가 비-바이러스 유전자 요법 벡터로 사용될 수 있음을 시사한다(도 10). 개별 세포주는 표 5에 기재되어 있다.
실시예 11: 일시적 형질감염에 의한 인간 FVIIIco6XTEN ceDNA 벡터 생산
일시적 유전자 발현 시스템은 바큘로바이러스-곤충 세포 시스템에서의 기능 분석을 수행하기 위한 가장 중요한 기술 중 하나이다. 이 시스템은 일시적 발현 플라스미드에서 바큘로바이러스 프로모터의 제어 하에 외래 유전자를 발현하기 위해 개발하였다. 또한, 이 시스템은 벡터 작제 및 단백질 합성에 대해 더 짧은 작업 시간을 제공하고, 바이러스 감염 및 세포 용해와 연관된 난제를 피하며, 단백질의 세포 수송을 관찰할 강력한 수단을 제공한다. 일반적으로 바큘로바이러스 유전자 프로모터는 감염 주기에서 전사의 개시에 따라 전초기, 초기, 후기, 및 극후기 프로모터로 나뉜다. 이들 중에서도, 전초기(ie) 유전자 프로모터들만이 숙주 RNA-중합효소 II에 의해 인식되고 바이러스 전사 인자들과는 독립적이며, 이는 그들을 곤충 세포에서의 무-바큘로바이러스 이종 단백질 발현에 적합하게 만든다. 가장 광범위하고 상업적으로 이용 가능한 일시적 유전자 발현 시스템은 오르기아 슈도츠가타 다중 핵다각체병바이러스(Orgyia pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus, OpMNPV)의 전초기(ie) 유전자 프로모터를 기반으로 개발된다. 다른 전초기(ie) 유전자 프로모터와 비교하여, OpMNPV의 OpIE2 프로모터는 Sf 세포에서의 이종 단백질 발현을 위한 강한 활성을 제공하는 것으로 나타났다(Bleckmann et al., 2016). 보다 최근에는, OpIE2 프로모터의 제어 하의 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 일시적 유전자 발현을 기반으로 하는 무-바큘로바이러스 시스템도 기재되었다(Puente-Massaguer et al., 2020).
따라서, Rep 단백질의 일시적 발현이 안정 세포주로부터 인간 FVIIIco6XTEN ceDNA 벡터를 "구제"할 수 있다는 가설을 세웠다. 이 가설을 테스트하기 위해, 안정 세포주에서의 무-바큘로바이러스 ceDNA 생산을 위한 OpMNPV 전초기(OpIE2) 프로모터 하의 PEI-매개 일시적 Rep 단백질 발현을 활용하였다. OpMNPV 게놈(젠뱅크 수탁 번호 NC_001875.2)으로부터의 OpIE2 프로모터 서열은 젠스크립트®(Piscataway, NJ)를 통해 합성했다(SEQ ID NO:15). 합성 프로모터 서열을 클로닝하여 Rep 단백질 발현 작제물 내 폴리헤드린 또는 전초기 프로모터를 대체하였다(도 11a, 도 11c, 도 11e). 생성된 일시적 발현 플라스미드, pFastBac.OpIE2.B19.Rep(도 11b), pFastBac.OpIE2.GPV.Rep(도 11d), 및 pFastBac.OpIE2.AAV2.Rep(도 11f)를 사용하여 비-AAV 및 AAV의 대칭 또는 비대칭 ITR을 갖는 인간 FVIIIco6XTEN 발현 카세트를 인코딩하는 안정 세포주(표 5)를 형질감염시킬 것이다.
비-AAV 및 AAV의 대칭 또는 비대칭 ITR을 갖는 인간 FVIIIco6XTEN 발현 카세트를 인코딩하는 안정 세포주(표 5)는 OpMNPV 전초기(OpIE2) 프로모터 하의 B19.Rep, GPV.Rep 또는 AAV2.Rep를 인코딩하는 일시적 발현 플라스미드(도 11) 및 전사 인핸서 hr5 요소가 앞에 있고 AcMNPV p10 폴리아데닐화 신호가 뒤에 있는 AcMNPV 전초기(ie1) 프로모터 하의 퓨로마이신 저항성 마커를 인코딩하는 플라스미드로 초-형질전환되어 새로운 세트의 안정 세포주를 생성할 것이다. 실시예 8에 기재된 바와 같이, 형질전환된 세포를 퓨로마이신으로 선택하고 진탕 플라스크 배양까지 증폭할 것이다. 이들 세포주를 무-바큘로바이러스 인간 FVIIIco6XTEN ceDNA 벡터 생산을 위한 생산자 세포주로 사용할 것이다.
실시예 12: 변형된 FVIIIXTEN 발현 카세트
표적화된 숙주에 대해 cDNA를 코돈-최적화함으로써 전이유전자 발현 수준을 증가시킬 수 있다는 가설을 세웠다. V1.0 FVIIIco6XTEN 발현 카세트로부터의 FVIII 발현의 생리학적 수준은 미국 공개 번호 20190185543에 기재된 바와 같은 이전 연구에서 입증되었다. 그러나, 표적 특이성을 추가로 개선하고 면역원성을 감소시키기 위해, FVIIIXTEN cDNA를 코돈-최적화하였고, 이때 파보바이러스 ITR을 갖는 FVIIIXTEN 발현 카세트를 인코딩하는 DNA 벡터에 대해 야기된 선천적 면역 반응을 모면하기 위해 CpG 반복부를 고갈시켰다. 인핸서 요소(A1MB2), 하이브리드 합성 인트론(키메라 인트론), 우드척 전사후 조절 요소(WPRE), 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화(bGHpA) 신호와 함께 간-특이적 변형된 마우스 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터(mTTR482)의 조절 하의 XTEN 144 펩티드와 융합된(FVIIIXTEN) B-도메인 결실(BDD) 코돈-최적화된 인간 인자 VIII(BDDcoFVIII)를 포함하는 변형된 V2.0 FVIIIXTEN 발현 카세트를 생성하였다. V2.0 FVIIIXTEN 발현 카세트는 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
초기 생체내 효능 연구는 V1.0 FVIIIXTEN 발현 카세트와 비교하여 FVIII 활성의 유의미한 개선을 보여주었다(데이터는 나타내지 않음). 따라서, V2.0 FVIIIXTEN 발현 카세트를 사용하여, 상기 기재된 바와 같이, 재조합 BIVVBac 박미드를 생성하였다(실시예 6). 그런 다음, AAV2 WT(도 12a), B19 WT 또는 최소(Minimal)(SEQ ID NO. 16)(도 12b), 및 GPVΔ120(SEQ ID NO. 17) 또는 GPVΔ186(SEQ ID NO. 18)(도 12c)을 포함하는 조작된 파보바이러스 ITR을 V2.0 FVIIIXTEN 발현 카세트(SEQ ID NO: 19) 내로 삽입하고, 하기 기재된 바와 같이, 세 가지 상이한 접근법을 사용하여 바큘로바이러스 시스템에서 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산에 대해 테스트했다.
실시예 13: FVIIIXTEN ceDNA 생산의 접근법
바큘로바이러스-곤충 세포 시스템에서, 재조합 BEV는 강한 프로모터 하에 관심 유전자를 전달하고, 곤충 세포에서 바이러스 복제에 필수적인 전사 복합체를 제공한다. 이 시스템은 안정 세포주의 형태에서 바큘로바이러스 게놈 및/또는 곤충 세포 게놈에 관심 전이유전자를 삽입할 유연성을 제공한다. 확장성의 용이성에 따라 플랫폼 선택의 유연성을 제공하기 위해 ceDNA 생산의 세 가지 상이한 접근법을 설계하는 데 바큘로바이러스 시스템의 이들 장점을 활용하였다.
1 BAC:
전이유전자 발현을 위한 1 Bac 접근법의 사용을 조사하기 위해 BIVVBac 박미드를 사용했다. BIVVBac는 실시예 1에 설명된 바와 같이 바큘로바이러스 게놈 내의 2 개의 상이한 위치에서 2 개의 상이한 메커니즘에 의해 다수의 전이유전자 삽입을 허용하도록 설계되었다. 최적화된 FVIIIXTEN 발현 카세트(SEQ ID NO: 19)는 Tn7 전위를 통해 BIVVBac 내 폴리헤드린 유전자좌에서의 mini-attTn7 부위에 파보바이러스 ITR과 함께 삽입했으며, 동일한 백본에서, ITR-특이적 복제(Rep) 유전자 발현 카세트를, 상기 기재된 바와 같이(실시예 6), Cre-LoxP 재조합을 통해 EGT 유전자좌에서의 LoxP 부위에 삽입했다. 그런 다음, 재조합 BEV를 생성하고, 도 13a에 도시된 바와 같이, Sf9 세포에서의 감염에 사용하여 FVIIIXTEN ceDNA를 생산했다. Rep 발현 수준을 제어하기 위한 상이한 프로모터를 사용하여, 하기 기재된 바와 같이, ceDNA 생산을 위한 1 Bac 접근법의 개념을 증명했다.
2 BAC:
전이유전자 발현을 위한 2 BAC 접근법의 사용을 조사하기 위해, 실시예 5에 상기 기재된 바와 같이, Tn7 전위를 통해 2 개의 상이한 BIVVBac 박미드에서, 최적화된 FVIIIXTEN 발현 카세트를 파보바이러스 ITR과 함께 삽입하고/하거나 ITR-특이적 복제(Rep) 유전자 발현 카세트를 폴리헤드린 유전자좌에서의 mini-attTn7 부위에 삽입했다. 그런 다음, 재조합 BEV를 생성하고, 도 13b에 도시된 바와 같이, Sf9 세포에서의 공동-감염에 사용하여 FVIIIXTEN ceDNA를 생산했다. 다음의 실험에서 기재된 바와 같이, 재현 가능한 ceDNA 생산성을 얻기 위해 2 BAC 접근법과 연관된 난제를 2 개 바큘로바이러스의 감염 다중도(MOI)의 상이한 비를 사용하고 Rep 발현 수준을 미세-조정하여 조사하였다.
안정 세포주:
전이유전자 발현을 위한 안정 세포주 접근법의 사용을 조사하기 위해, 실시예 8에 기재된 바와 같이, 파보바이러스 ITR을 갖는 최적화된 FVIIIXTEN 발현 카세트를 사용하여 안정 세포주를 생성하였다. 실시예 5에 상기 기재된 바와 같이, Tn7 전위를 통해 BIVVBac 박미드 내 폴리헤드린 유전자좌에서의 mini-attTn7 부위에 ITR-특이적 복제(Rep) 유전자 발현 카세트를 삽입함으로써 재조합 박미드도 생성하였다. 그런 다음, 재조합 Rep.BEV를 생성하고, 도 13c에 도시된 바와 같이, FVIIIXTEN 안정 세포주에서의 감염에 사용하여 FVIIIXTEN ceDNA를 생산했다. 다음의 실험에서 기재된 바와 같이, 안정 세포주를 생성하는 프로세스를 가속시키기 위해 안정 세포주 접근법과 연관된 난제는 GFP를 프록시로 사용하는 FACS 세포 분류를 통해 FVIIIXTEN 형질전환유전자(transformer)를 농축함으로써 조사했다.
실시예 14: 1 BAC로부터의 FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN) 벡터 생산
AAV2 WT 또는 B19 WT ITR을 갖는 V2.0 FVIIIXTEN 및 AcMNPV 폴리헤드린 프로모터 하의 각각의 Rep 유전자를 인코딩하는 재조합 BEV를, 상기 기재된 바와 같이, 1 BAC 접근법을 사용하여 Sf9 세포에서 FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN) 생산에 대해 테스트했다. 약 2.0 x 106/mL 세포를 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 또는 3.0 플라크 형성 단위(pfu)/세포의 MOI에서 1 BAC BEV로 감염시켰다(도 14a, 도 15a). 세포를 50 mL의 무-혈청 ESF-921 배지 내로 현탁시킨 후 28℃ 진탕 인큐베이터에서 72 내지 96 시간 동안 또는 생존력이 60 내지 70%에 도달할 때까지 인큐베이션시켰다. 감염-후 약 96 시간째에, 감염된 세포를 수확하고, 제조업체의 지침에 따라, 퓨어링크 맥시 프렙 DNA 단리 키트(Invitrogen)를 사용하여 ceFVIIIXTEN 단리를 위해 펠렛을 가공했다. 최종 용출 분획을 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 전기영동 상에서 분석하여 ceFVIIIXTEN 생산성을 결정했다.
ceFVIIIXTEN AAV2 ITR
AAV2 1 BAC의 아가로스 겔 분석(도 14b)은 테스트된 모든 MOI에서 ceFVIIIXTEN AAV2 ITR의 크기(약 8.5 kb)에 해당하는 DNA 밴드를 보여주었으며, 이때 다른 처리와 비교하여 1.0 pfu/세포의 MOI에서 가장 높은 생산성을 얻었다(도 14c). 이 결과는 HBoV1 ITR 작제물로부터 얻은 ceFVIIIXTEN이 바이러스 로드의 증가에 따라 생산성의 증가를 나타냄을 가리키는 초기 데이터(데이터는 나타내지 않음)와는 반대였다. 이론에 얽매이지 않고, 이는 AAV2 Rep가 HBoV1-NS1 단백질과 비교하여 DNA 복제에 대하여 AAV2 WT ITR의 말단 분해 부위에서의 상이한 결합 메커니즘 및 엔도뉴클레아제 활성을 갖는다는 것을 시사할 수 있으며, 이는 각 ITR의 특유의 헤어핀 구조(T- 대 U-형상)에 기인할 수 있다.
ceFVIIIXTEN B19 ITR
B19 1 BAC의 아가로스 겔 분석(도 15b)은 테스트된 모든 MOI에서 ceFVIIIXTEN B19 ITR의 크기(약 8.5 kb)에 해당하는 DNA 밴드를 보여주었으나, 생산성의 수준은 낮았다(도 15c). AAV2 또는 HBoV1과 달리, B19 1 BAC의 더 높은 바이러스 로드는 ceFVIIIXTEN 생산성을 개선하지 않았는데, 이는 잠재적으로 더 높은 수준의 B19-NS1이 감염의 나중 단계에서 강한(폴리헤드린) 바큘로바이러스 프로모터 하에서 발현되는 것에 기인한다. 이들 결과는 전장(WT) 파보바이러스 ITR과 화학량론적 REP 발현의 조합이 바큘로바이러스 시스템에서 더 높은 ceDNA 생산성을 얻는 데 중요할 수 있음을 시사한다.
결론적으로, 이들 실험은 1 BAC 접근법이 파보바이러스 ITR을 갖는 FVIIIXTEN 및 NS1 전이유전자를 인코딩하는 단일 재조합 BEV로부터의 ceDNA 생산의 개념을 증명한다는 것을 보여주었다. 이는 또한 바큘로바이러스 셔틀 벡터(BIVVBac) 내 상이한 유전자좌에 삽입되는 다수의 전이유전자의 실현 가능성 및 기능성, 그리고 바큘로바이러스 곤충 세포 시스템에서의 재조합 AAV 벡터 생산을 위한 이의 잠재적인 용도를 나타낸다.
실시예 15: 2 BAC로부터의 FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN) 벡터 생산
ceDNA 전이유전자 발현에 대한 2 BAC 접근법을 조사하기 위해, 비를 일정하게 유지하고 Sf9 세포를 상이한 MOI의 2 BAC로 공동-감염시키거나 MOI를 일정하게 유지하고 Sf9 세포를 상이한 비의 2 BAC로 공동-감염시킴으로써 공동-감염의 몇몇 상이한 조건을 테스트했다. 각각의 경우에, 바이러스 접종원은 제거하지 않았으며, 세포는 28℃ 진탕 인큐베이터에서 생존력이 60 내지 70%에 도달할 때까지 인큐베이션시켰다. 감염-후 약 96 시간째에, 감염된 세포를 수확하고, 제조업체의 지침에 따라, 퓨어링크 맥시 프렙 DNA 단리 키트(Invitrogen)를 사용하여 ceFVIIIXTEN 단리를 위해 펠렛을 가공했다. 최종 용출 분획을 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 전기영동 상에서 분석하여 ceFVIIIXTEN 생산성을 결정했다.
ceFVIIIXTEN AAV2 ITR
50 mL의 무-혈청 ESF-921 배지에 시딩된 약 2.0 x 106/mL 세포를 각각 비를 1:10으로 일정하게 유지하기 위해 0.01, 0.1, 0.3, 1.0, 또는 3.0 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT. ITRsTn7 BEV 및 0.001, 0.01, 0.03, 0.1, 또는 0.3 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.Polh.AAV2. RepΔVP80Tn7 BEV(이전에 미국 특허 출원 번호 63/069,115에 기재됨)의 적정된 작업 모액(P2)으로 공동-감염시켰다(도 16a 및 도 16b). AAV2 2 BAC의 아가로스 겔 분석은 상이한 공동-감염 MOI에서 오염 바큘로바이러스 DNA(contaminating baculoviral DNA)(vDNA)와 비교하여 다양한 정도의 ceFVIIIXTEN(ceDNA) 생산성을 보여주었다. 0.1-0.01 및 3.0-0.3 pfu/세포의 MOI는 동등한 수준의 ceFVIIIXTEN(ceDNA) 생산성을 나타내었지만, 나중의 공동-감염 MOI는 더 낮은 수준의 오염 vDNA를 나타냈다(도 16c).
이들 결과는 AAV2 2 BAC 접근법이 1 BAC와 동등한 수준의 ceFVIIIXTEN 생산성을 나타내지만, 이 정제 방법을 사용하여 공동-정제된 다른 불순물의 수준에는 유의미한 차이가 있음을 시사한다. 이론에 얽매이지 않고, 이는 Sf9 세포에서 더 높은 ceFVIIIXTEN 생산성을 달성하기 위해 화학량론적 AAV2 REP78/REP52 발현의 중요성을 추가로 강조할 수 있다.
ceFVIIIXTEN B19 ITR
50 mL의 무-혈청 ESF-921 배지에 시딩된 약 2.0 x 106/mL 세포를 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 또는 5.0 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT. ITRsTn7 BEV 및 각각 비를 1:10으로 유지하기 위해 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.3, 또는 0.5 pfu/세포의 MOI 또는 비를 1:5로 일정하게 유지하기 위해 0.02, 0.06, 0.1, 0.2, 또는 0.6 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.Polh.B19-NS1Tn7 BEV의 적정된 작업 모액(P2)으로 공동-감염시켰다(도 17a 및 도 17b). AAV2 2 BAC와 달리, B19 2 BAC의 아가로스 겔 분석은 상이한 공동-감염 MOI에서 동등한 수준의 ceFVIIIXTEN(ceDNA) 및 오염 바큘로바이러스 DNA(vDNA) 생산성을 보여주었다(도 17c). 흥미롭게도, 테스트한 조건 중 어느 것도 B19 1 BAC로 얻은 결과와 같은 ceFVIIIXTEN B19 ITR 생산성의 개선을 보여주지 않았다.
결론적으로, B19 1 BAC 및 B19 2 BAC 접근법 둘 모두는 바큘로바이러스 시스템에서 비-AAV 파보바이러스 ITR로부터의 ceDNA 생산의 개념을 증명한다.
ceFVIIIXTEN GPV ITR
50 mL의 무-혈청 ESF-921 배지에 시딩된 약 2.0 x 106/mL 세포를 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 또는 5.0 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.GPVΔ120. ITRsTn7 BEV 및 각각 비를 1:10으로 유지하기 위해 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.3, 또는 0.5 pfu/세포의 MOI 또는 비를 1:5로 일정하게 유지하기 위해 0.02, 0.06, 0.1, 0.2 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.Polh.GPV-NS1Tn7 BEV의 적정된 작업 모액(P2)으로 공동-감염시켰다(도 18a 및 도 18b). AAV2 또는 B19 2 BAC와 달리, GPV 2 BAC의 아가로스 겔 분석은 5.0-0.5 pfu/세포의 MOI 공동-감염에서 관찰된 희미한 밴드를 제외하고 테스트된 모든 MOI에서 ceFVIIIXTEN의 크기(약 8.5 kb)에 해당하는 검출 가능한 DNA 밴드를 나타내지 않았다(도 18c). GPV 2 BAC로 얻은 ceFVIIIXTEN 생산성은 GPV 1 BAC와 상관관계가 있고, 여기서 상기 기재된 바와 같이 V1.0 FVIIIco6XTEN은 GPV 비대칭 ITR과 함께 사용된다(도 7b, 실시예 7 참고).
두 연구 모두에서, FVIIIXTEN 전이유전자 카세트의 두 말단 모두에서 전장 WT GPV ITR을 얻는 데 있어서의 클로닝 복잡성으로 인해, 절두된 GPV ITR을 테스트했다. 그럼에도 불구하고, GPV 1 BAC 및 GPV 2 BAC 접근법 둘 모두는 ceDNA 생산의 개념을 증명하고 Sf9 세포에서의 FVIIIXTEN ceDNA의 더 높은 생산성을 달성하기 위해 최적의 MOI 비 및 프로모터 선택의 중요성을 입증한다.
실시예 16: 안정 세포주로부터의 FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN) 벡터 생산
안정 세포주 접근법을 테스트하기 위해, AAV2 WT, B19 최소, 또는 GPVΔ120 ITR이 측접하는 V2.0 FVIIIXTEN으로 만든 각각의 세포주의 다클론 집단을 50 mL의 무-혈청 ESF921 배지에 약 2.0 x 106/mL로 시딩하고, 표시된 바와 같이, 상이한 MOI의 ITR-특이적 REP.BEV의 적정된 작업 모액(P2)으로 감염시켰다. 각각의 경우에, 바이러스 접종원은 제거하지 않았으며, 세포는 28℃ 진탕 인큐베이터에서 72 내지 96 시간 동안 또는 생존력이 60 내지 70%에 도달할 때까지 인큐베이션시켰다. 감염-후 약 96 시간째에, 감염된 세포를 수확하고, 제조업체의 지침에 따라, 퓨어링크 맥시 프렙 DNA 단리 키트(Invitrogen)를 사용하여 ceFVIIIXTEN 단리를 위해 펠렛을 가공했다. 최종 용출 분획을 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 전기영동 상에서 분석하여 ceFVIIIXTEN 생산성을 결정했다.
ceFVIIIXTEN AAV2 ITR
AAV2 WT ITR을 갖는 V2.0 FVIIIXTEN을 인코딩하는 세포주는 이전에 기재된 바와 같이 개발하였다(실시예 8). 그런 다음 다클론 Sf.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITR 세포 집단을 0.001, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 또는 0.5 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepΔVP80Tn7 BEV(미국 특허 출원 번호 63/069,115에 기재됨)의 적정된 작업 모액(P2)으로 감염시켰다(도 19a, 도 19b). AAV2 안정 세포주로부터 단리된 ceFVIIIXTEN의 아가로스 겔 분석은 가장 낮은 0.001 pfu/세포의 MOI를 제외하고 테스트된 모든 MOI에서 동등한 수준의 생산성을 나타냈으며, 이는 ceFVIIIXTEN의 크기(약 8.5 kb)에 해당하는 검출 가능한 DNA 밴드를 나타내지 않았다. 흥미롭게도, 0.01 및 0.03 pfu/세포의 MOI의 REP.BEV로 감염된 세포는 더 높은 MOI와 비교하여 ceFVIIIXTEN의 더 높은 생산성과 동시에 오염 바큘로바이러스 DNA(vDNA)를 나타냈다(도 19c). 이들 결과는 AAV2 1 BAC 또는 AAV2 2 BAC 접근법과 달리, 안정 세포주 접근법이 Sf9 세포 게놈에서 AAV2 WT ITR이 측접하는 안정적으로 통합된 FVIIIXTEN 발현 카세트를 "구제"하기 위해 더 낮은 바이러스 접종원을 필요로 함을 시사한다.
결론적으로, 이 연구는 파보바이러스 ITR이 측접하는 FVIIIXTEN 발현 카세트로 안정적으로 통합된 세포주를 이용한 ceDNA 생산의 개념을 증명한다.
ceFVIIIXTEN B19 ITR
B19 최소 ITR을 갖는 V2.0 FVIIIXTEN을 인코딩하는 세포주는 이전에 기재된 바와 같이 개발하였다(실시예 8). 그런 다음 다클론 Sf.FVIIIXTEN.B19.최소.ITR 세포 집단을 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 또는 5.0 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.Polh.B19-NS1Tn7 BEV의 적정된 작업 모액(P2)으로 감염시켰다(도 20a, 도 20b). B19 안정 세포주로부터 단리된 ceFVIIIXTEN의 아가로스 겔 분석은 REP.BEV의 MOI가 증가함에 따라 DNA 밴드 강도의 수준이 증가하는 것을 보여주었다. 그러나, DNA 밴드는 ceFVIIIXTEN의 예상되는 크기(약 8.5 kb)보다 약간 더 낮았다(도 20c). 흥미롭게도, 상이한 ITR을 이용함에도 불구하고, B19 안정 세포주로부터 얻은 V1.0 ceFVIIIXTEN(실시예 9, 도 9a)에 대해 유사한 밴딩 패턴을 관찰하였다. 대조적으로, B19 WT ITR을 갖는 FVIIIXTEN을 인코딩하는 B19 1 BAC 또는 2 BAC로 감염된 Sf9 세포로부터 얻은 ceFVIIIXTEN은 V2.0 ceFVIIIXTEN에 대해 예상되는 크기(약 8.5 kb)의 DNA 밴드 를 보여주었다(도 15c 및 도 17c).
이들 결과는 말단 분해 부위 및 REP 결합 요소가 B19 ITR의 절두된 또는 최소 변이체에 존재하더라도, 효율적인 복제를 위해 B19-NS1이 DNA에 이를 결합하고 끊기 위해서는 전장(WT) 서열이 필요할 수 있음을 시사한다.
ceFVIIIXTEN GPV ITR
GPVΔ120 ITR을 갖는 V2.0 FVIIIXTEN을 인코딩하는 세포주는 이전에 기재된 바와 같이 개발하였다(실시예 8). 그런 다음 다클론 Sf.FVIIIXTEN.GPVΔ120.ITR 세포 집단을 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 또는 5.0 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.Polh.GPV-NS1Tn7 BEV의 적정된 작업 모액(P2)으로 감염시켰다(도 21a, 도 21b). B19 세포주와 달리, GPV 안정 세포주로부터 단리된 ceFVIIIXTEN의 아가로스 겔 분석은 감염의 MOI가 증가함에 따라 생산성의 수준이 감소하는 것을 보여주었다.
흥미롭게도, ceFVIIIXTEN GPV ITR의 경우, 다른 파보바이러스 ITR과 비교하여 ceFVIIIXTEN 생산성에 있어서 반대 경향을 관찰하였다. GPV 세포주에서 감염에 사용된 가장 낮은 MOI(0.01 pfu/세포)는 테스트된 다른 MOI와 비교하여 ceFVIIIXTEN(ceDNA)에 대해 가장 높은 밴드 강도를 나타냈다(도 21c). 이들 결과는 적어도 안정 세포주의 경우 GPV-ITR-매개 ceDNA 생산을 위해 매우 낮은 수준의 GPV-NS1이 필요함을 시사한다. 추가로, 이 데이터는 GPV 1 BAC 또는 2 BAC에서 관찰된 ceFVIIIXTEN의 더 낮은 생산성(도 7c, 도 18c)이 아마도, 높은 바이러스 로드로 인한 것임을 시사하며, 이는 원래 ceFVIIIXTEN 생산에 요구되는 것보다 많은 더 높은 수준의 GPV-NS1 발현에 간접적으로 해당한다.
그럼에도 불구하고, 안정 세포주 접근법은 비-AAV 파보바이러스 ITR이 측접하는 FVIIIXTEN 발현 카세트로 안정적으로 통합된 세포주로부터의 ceDNA 생산의 개념을 증명한다.
실시예 17: FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN) 벡터 정제
바큘로바이러스-곤충 세포 시스템에서, 재조합 BEV는 강한 프로모터 하에 관심 유전자를 전달하고, 곤충 세포에서 바이러스 복제에 필수적인 전사 복합체를 제공한다. 전형적으로, 바큘로바이러스 DNA 게놈은 핵에서 복제되고, 각각이 전장 DNA 게놈을 함유하는, 수천만 개의 자손 바이러스 입자를 생산한다. 실리카 겔 컬럼과 같은 플라스미드 DNA-기반 정제 방법을 사용하여 곤충 세포로부터 DNA를 단리하면서, 바큘로바이러스 게놈 DNA가 ceDNA와 공동-정제된다는 것이 입증되었다. 상업적 플라스미드 DNA 키트 컬럼은 일반적으로 그의 분자량을 기준으로 DNA를 분리하도록 설계되어 있지 않으므로, 전형적으로, 샘플에 존재하는 모든 형태의 DNA가 이러한 컬럼에 결합할 수 있다. 또한, 큰 분자량 DNA의 결합 능력은 저분자량 DNA와 상이할 수 있으며 음이온-교환 기반 키트 컬럼은 상이한 크기의 DNA의 결합 효율에 기반하여 최적화되어 있지 않다.
ceDNA 프렙에서 관찰된 고분자량 DNA(> 20 kb)는 저분자량 ceFVIIIXTEN(약 8.5 kb)과 함께 공동-정제된 바큘로바이러스 및/또는 Sf9 세포 게놈 DNA일 가능성이 있다는 가설을 세웠다(예를 들어 도 14c 내지 도 21c 참고). 이전에는, 감염성 자손 바이러스 생산에 필요한, VP80과 같은 바큘로바이러스 캡시드 유전자를 녹아웃시킴으로써 바큘로바이러스 DNA를 감소시키는 간접적인 접근법을 이용하였다. 이 접근법은 녹-아웃 BEV로부터 얻은 ceDNA 프렙에서의 바큘로바이러스 DNA의 유의미한 감소를 보여주었다(미국 특허 출원 번호 63/069,115 참고). 이 접근법은 바큘로바이러스 DNA 오염을 줄이는 데 효율적이었지만, 감염된 세포 펠렛으로부터 얻은 전체 DNA 중 유의미한 양(약 60%)으로 존재하는 세포 게놈 DNA를 줄일 수는 없었다.
이 연구에서는, FVIIIXTEN ceDNA를 나머지 원치 않는 DNA로부터 분리하는 직접적인 접근법을 이용하였으며, 감염된 세포 펠렛으로부터의 전체 DNA 프렙으로부터 정제된 FVIIIXTEN(95% 초과의 순도)을 효율적으로 얻는 것을 입증하였다. 이 신규한 접근법은, 크기 및 전하에 따라 상이한 단백질 분자를 분리하는 데 널리 사용되는 분취용 전기영동을 활용한다. 예를 들어, 문헌[Michov, B. (2020) Electrophoresis. Berlin, Boston: De Gruyter, pp. 405-424]을 참고한다. 예를 들어, 바이오-라드 모델 491 프렙 셀 또는 기타 이러한 유닛을 사용하여, 그의 크기에 기반하여 복합체 분자를 분리할 수 있다.
현재 연구에서는, FVIIIXTEN ceDNA를 고분자량 DNA로부터 분리하기 위해 분취용 전기영동 기법을 이용하였고, 하기 기재된 바와 같이, 생체내 연구에 사용할 정제된 ceDNA를 성공적으로 얻었다.
ceDNA 정제의 전체 작업흐름은 도 22에 나타나 있으며, 여기서 프로세스는 무-혈청 곤충 세포 배양 배지에서 Sf9 세포 배양물의 규모를 0.5 L에서 1.5 L 또는 더 높은 부피로 확대하는 것으로 시작한다(도 22의 A). 전형적으로 약 1.3 x 106/mL의 시딩 밀도로 2 일 인큐베이션시킨 후, 약 2.5 x 106/mL의 원하는 세포 밀도에 도달하면, 세포를 최적화된 MOI에서 (ceDNA 생산에 사용되는 접근법에 따라) 1 BAC 또는 2 BAC BEV로 감염시키고, 생존력이 약 60 내지 70%에 도달할 때까지(전형적으로 약 4 일이 소요됨) 세포를 28℃ 진탕 인큐베이터에서 인큐베이션되도록 한다(도 22의 B). 생존력이 약 70%에 도달하면, 세포를 수확하고, 제조업체의 지침에 따라, 퓨어링크 하이퓨어 엑스피 플라스미드 기가프렙(PureLink HiPure Expi Plasmid Gigaprep) 정제 키트(Invitrogen)와 같은, 음이온-교환 크로마토그래피 키트 컬럼에 의해 전체 DNA 정제를 위해 가공한다. 정제된 DNA 물질의 분취량을 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 전기영동 상에서 체크하여 DNA 생산성 및 완전성을 결정한다(도 22의 C). 그런 다음 정제된 물질을, 제조업체의 지침에 따라 조립된, 0.5% 분취용 아가로스 겔 및 0.25% 스태킹 아가로스 겔을 포함하는 분취용 아가로스 겔 전기영동 유닛 상에 로딩한다. 약 50 mL/분의 버퍼 재순환 유량 및 50 μL/분의 용출 버퍼 속도로 6 내지 7 일 동안 4℃에서 저전압(약 40 불변 볼트)으로 샘플을 러닝하여 70 내지 80 분째에 각각의 분획을 분획 수집 챔버에 수집한다. 연속 용출 전기영동 후, 각각의 분획 20 μL를 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 전기영동 상에서 체크하여 FVIIIXTEN ceDNA의 순도를 결정한다(도 22의 D). 원하는 분획을 조합하여 3M NaOAc, pH 5.5 및 100% EtOH와 함께 -20C에서 1 내지 2 시간 동안 침전시킨다. 마지막으로, 침전된 FVIIIXTEN ceDNA를 고속으로 펠렛화하고 70% EtOH로 1 회 세척한 후 TE, pH 8.0 버퍼 내로 재현탁시킨다. 정제된 FVIIIXTEN ceDNA를 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 전기영동 상에서 다시 체크하여, 생체내 효능 연구를 위해 동물에 주사하기 전에 순도 및 완전성을 확인한다(도 22의 E).
실시예 18: FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN) 생체내 효능
HemA 마우스에서의 ceFVIIIXTEN 전신 투여
생체내에서 ceDNA의 기능성을 검증하기 위해, AAV2 또는 HBoV1 WT ITR를 갖는 정제된 ceFVIIIXTEN을 hFVIIIR593C+/+/HemA 마우스에 유체역학적 꼬리-정맥 주사를 통해, 각각 12 μg, 40 μg, 및 80 μg/kg에 상당하는, 0.3 μg, 1.0 μg, 또는 2.0 μg/마우스로 전신 주사했다. 주사받은 마우스로부터 혈장 샘플을 7 일 간격으로 수집하고 FVIII 활성을, 상기 기재된 바와 같이, 발색 검정에 의해 측정했다.
ceFVIIIXTEN 주사된 코호트에 대한 정상의 퍼센트로 정규화된 혈장 FVIII 활성이 도 23에 나타나 있다. 결과는 테스트된 AAV2 또는 HBoV1 ceDNA의 최고 용량에서 관찰된 초생리학적 수준(정상의 500% 초과)의 FVIII 발현을 갖는 HemA 마우스에서 용량-의존적 반응을 보여주었다. 그러나, 주사 후 140 일차까지 FVIII 발현 수준의 점진적인 감소를 관찰하였으며, 그 후 ceFVIIIXTEN AAV2 ITR 주사된 코호트에서 수준이 안정화되었다. 흥미롭게도, ceFVIIIXTEN HBoV1 ITR의 FVIII 발현 수준은 ceFVIIIXTEN AAV2 ITR을 주사받은 마우스와 유사한 발현 경향을 보여주었다(데이터는 나타내지 않음).
결론적으로, 이들 생체내 효능 연구는 ceFVIIIXTEN의 기능성을 검증하고 파보바이러스 ITR이 바큘로바이러스 곤충 세포 시스템에서 관심 전이유전자를 인코딩하는 기능적 ceDNA를 생산하는 데 사용될 수 있음을 입증한다.
실시예 19: 1 BAC로부터의 FVIIIXTEN HBoV1 ITR ceDNA 벡터 생산
FVIIIXTEN HBoV1 ITR 및 HBoV1 NS1 유전자 둘 모두를 인코딩하는 1 BAC BEV를 Sf9 세포에서 FVIIIXTEN ceDNA 생산에 대해 테스트했다. 약 2.5 x 106/mL 세포를 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 또는 3.0 플라크 형성 단위(pfu)/세포의 감염 다중도(MOI)에서 각각의 BEV의 적정된 작업 모액(P2)으로 감염시켰다(도 24a). 세포를 50 mL의 무-혈청 ESF-921 배지 내로 현탁시킨 후 28℃ 진탕 인큐베이터에서 72 내지 96 시간 동안 또는 세포 생존력이 60 내지 70%에 도달할 때까지 인큐베이션시켰다. 감염-후 약 96 시간째에, 감염된 세포를 수확하고, 제조업체의 지침에 따라, 퓨어링크 맥시 프렙 DNA 단리 키트(Invitrogen)에 의해 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 단리를 위해 펠렛을 가공했다. 최종 용출 분획을 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 전기영동 상에서 분석하여 FVIIIXTEN ceDNA 벡터의 생산성을 결정했다.
HBoV1 ITR을 갖는 FVIIIXTEN 및 폴리헤드린-구동 HBoV1-NS1을 인코딩하는 AcBIVVBac (mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1LoxP BEV(도 24b)의 아가로스 겔 분석이 도 24c에 나타나있다. 결과는 테스트된 모든 용량에서 DNA 밴드가 FVIIIXTEN HBoV1 ITR(약 8.5 kb) ceDNA의 크기에 해당하며, MOI가 증가함에 따라 생산성이 증가하는 것을 보여주었다.
이 결과는, 이전에 바이러스 로드가 증가함에 따라 생산성의 감소가 관찰되었던, AAV2 ITR 1 BAC로 얻은 ceDNA 생산성과 상반되었다. 이론에 얽매이지 않고, HBoV1-NS1 단백질은 DNA 복제를 위해 HBoV1 ITR의 말단 분해 부위에서의 고유한 결합 메커니즘 및 엔도뉴클레아제 활성을 가질 수 있으며 이는 REH 및 LEH ITR의 특유의 구조로 인한 것일 수 있다.
결론적으로, 이들 실험은 1 BAC 접근법이 HBoV1 ITR을 갖는 FVIIIXTEN 및 NS1 전이유전자를 인코딩하는 단일 재조합 BEV로부터의 ceDNA 생산의 개념을 증명한다는 것을 보여주었다. 이는 또한 바큘로바이러스 셔틀 벡터(BIVVBac) 내 상이한 유전자좌에 삽입되는 다수의 전이유전자의 실현 가능성 및 기능성, 그리고 바큘로바이러스 곤충 세포 시스템에서의 재조합 AAV 벡터 생산을 위한 이의 잠재적인 용도를 나타낸다.
실시예 20: 2 BAC로부터의 FVIIIXTEN HBoV1 ITR ceDNA 벡터 생산
전이유전자 발현에 대한 2 BAC 접근법을 조사하기 위해, 폴리헤드린-구동 HBoV1-NS1 BEV와 함께 FVIIIXTEN HBoV1 ITR을 인코딩하는 클론성 재조합 BEV를 Sf9 세포에서의 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 생산을 위해 1:10 및 1:5 비의 상이한 MOI 또는 0.3, 1.0, 3.0, 및 5.0 pfu/세포의 MOI의 상이한 비에서 공동-감염에 대해 테스트했다(도 25a). 구체적으로, 약 2.0 x 106/mL 세포를 50 mL의 무-혈청 ESF-921 배지에 시딩하고, 각각 일정한 1:10 비를 유지하기 위해 0.01, 0.03, 0.05, 0.1, 0.3, 0.5 pfu/세포의 MOI 또는 일정한 1:5 비를 유지하기 위해 0.02, 0.06, 0.1, 0.2, 0.6, 1.0 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.Polh.HBoV1-NS1Tn7 BEV와 함께 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 3.0, 5.0 pfu/세포의 MOI의 AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRsTn7 BEV의 적정된 작업 모액(P2)으로 공동-감염시켰다. 유사하게, 세포를 또한 0.3, 1.0, 3.0, 또는 5.0 pfu/세포의 일정한 MOI에서 1:1, 1:2, 1:5, 또는 1:10 비로 공동-감염시켰다(도 25b). 각각의 경우에, 바이러스 접종원은 제거하지 않았으며, 세포는 28℃ 진탕 인큐베이터에서 생존력이 60 내지 70%에 도달할 때까지 인큐베이션시켰다. 감염-후 약 96 시간째에, 감염된 세포를 수확하고, 제조업체의 지침에 따라, 퓨어링크 맥시 프렙 DNA 단리 키트(Invitrogen)에 의해 FVIIIXTEN ceDNA 벡터 단리를 위해 펠렛을 가공했다. 최종 용출 분획을 0.8 내지 1.2% 아가로스 겔 전기영동 상에서 분석하여 ceDNA 생산성을 결정했다.
예상한 대로, 아가로스 겔 분석은 상이한 조건에서 다양한 정도의 FVIIIXTEN ceDNA 생산성을 보여주었다. 그러나, 3.0 pfu/세포의 MOI로 공동-감염된 2 BAC는 바이러스 로드 비의 증가에 따라 FVIIIXTEN ceDNA 생산성의 수준이 증가하는 것을 보여주었고, 테스트된 다른 조건과 비교하여 1:10이 가장 높았다(도 25c). 더 높은 바이러스 로드는 FVIIIXTEN HBoV1 ITR ceDNA의 생산성을 개선하는 것으로 보이며, 이는 1 BAC BEV에서의 관찰과 일치한다(실시예 6 참고). 이는 Sf9 세포에서의 HBoV1-ITR-의존적 FVIIIXTEN ceDNA 복제를 위해 더 높은 수준의 HBoV1-NS1이 필요함을 추가로 시사한다.
1 BAC 또는 2 BAC를 사용한 결과는 HBoV1-NS1 복제의 수준이 바큘로바이러스 시스템에서의 FVIIIXTEN ceDNA 생산성에 유의미한 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
결론적으로, 이들 실험은 2 BAC 접근법이 HBoV1 ITR을 갖는 FVIIIXTEN 및/또는 NS1 전이유전자를 인코딩하는 2 개의 재조합 BEV로부터의 ceDNA 생산의 개념을 증명한다는 것을 보여주었다. 이들 실험은 또한 Sf9 세포에서의 FVIIIXTEN ceDNA의 더 높은 생산성을 달성하기 위한 최적의 MOI 비 및/또는 프로모터의 중요성을 입증한다.
서열
[표 6]
추가 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014

Claims (195)

  1. 박테리아 레플리콘;
    선택 가능한 마커 서열;
    트랜스포존의 삽입을 위한 제1 우선 표적 부위를 포함하는 제1 리포터 유전자;
    바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 리포터 유전자; 및
    부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 제2 우선 표적 부위를 포함하는, 박미드(bacmid).
  2. 제1항에 있어서, 상기 박테리아 레플리콘은 카피수가 적은 레플리콘인, 박미드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 카피수가 적은 레플리콘은 mini-F 레플리콘인, 박미드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커 서열은 항생제 저항성 유전자를 포함하는, 박미드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 항생제 저항성 유전자는 카나마이신 저항성 유전자인, 박미드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리포터 유전자는 발색성 기질을 대사할 수 있는 효소를 인코딩하는, 박미드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 효소는 LacZα 또는 이의 기능적 부분인, 박미드.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 발색성 기질은 블루-gal 또는 X-gal인, 박미드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포존의 삽입을 위한 제1 우선 표적 부위는 상기 제1 리포터 유전자의 리딩 프레임을 파괴하지 않는, 박미드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 우선 표적 부위는 박테리아 트랜스포존에 대한 부착 부위인, 박미드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 우선 표적 부위는 T7 트랜스포존에 대한 부착 부위인, 박미드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 트랜스포존은 T7 트랜스포존인, 박미드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자는 형광 단백질을 인코딩하는, 박미드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 형광 단백질은 적색 형광 단백질인, 박미드.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바큘로바이러스-유도성 프로모터는 39K 프로모터인, 박미드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 우선 표적 부위는 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 박미드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개되는, 박미드.
  18. mini-F 레플리콘;
    항생제 저항성 유전자;
    T7 트랜스포존에 대한 부착 부위를 포함하는 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분;
    바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및
    LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 박미드.
  19. 박테리아 레플리콘;
    제1 선택 가능한 마커 서열;
    제1 리포터 유전자 내로 삽입된 이종 서열로서, 상기 제1 리포터 유전자의 리딩 프레임을 파괴하는 삽입된 이종 서열;
    바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 제2 리포터 유전자; 및
    부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 우선 표적 부위를 포함하는, 재조합 박미드.
  20. 제19항에 있어서, 상기 이종 서열은 이종 유전자를 포함하는, 재조합 박미드.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 이종 유전자는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는, 재조합 박미드.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 이종 서열은 발현 제어 서열을 포함하는, 재조합 박미드.
  23. 제22항에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 상기 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결되는, 재조합 박미드.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 바큘로바이러스 프로모터를 포함하는, 재조합 박미드.
  25. 제24항에 있어서, 상기 바큘로바이러스 프로모터는 전초기, 초기, 후기, 또는 극후기(very late) 유전자 프로모터인, 재조합 박미드.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 바큘로바이러스 프로모터는 폴리헤드린 프로모터, 전초기1 프로모터, 및 전초기2 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 박미드.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 재조합 박미드.
  28. 제21항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 바이러스 파보비리다에(Parvoviridae) 과의 구성원의 게놈으로부터 단리된 Rep 단백질인, 재조합 박미드.
  29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 파보바이러스 Rep 단백질인, 재조합 박미드.
  30. 제29항에 있어서, 상기 파보바이러스 Rep 단백질은 B19 Rep, AAV2 Rep, HBoV1 Rep, 및 GPV Rep로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 박미드.
  31. 제19항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 서열은 제2 선택 가능한 마커 서열을 포함하는, 재조합 박미드.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제2 선택 가능한 마커 서열은 젠타마이신 저항성 유전자를 포함하는, 재조합 박미드.
  33. 제19항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 박테리아 레플리콘은 mini-F 레플리콘인, 재조합 박미드.
  34. 제19항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 선택 가능한 마커 서열은 카나마이신 저항성 유전자를 포함하는, 재조합 박미드.
  35. 제19항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리포터 유전자는 LacZα 또는 이의 기능적 부분을 인코딩하는, 재조합 박미드.
  36. 제19항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 리포터 유전자는 적색 형광 단백질을 인코딩하는, 재조합 박미드.
  37. 제19항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바큘로바이러스-유도성 프로모터는 39K 프로모터인, 재조합 박미드.
  38. 제19항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우선 표적 부위는 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 재조합 박미드.
  39. 제19항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개되는, 재조합 박미드.
  40. mini-attTn7 부위 내로 삽입된 이종 서열로서, 상기 이종 서열은 Rep를 인코딩하고, 삽입된 Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 이종 서열; 및
    LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 재조합 박미드.
  41. 박테리아 레플리콘;
    제1 항생제 저항성 유전자;
    mini-attTn7 부위 내로 삽입된 이종 서열로서, 상기 이종 서열은 Rep를 인코딩하고, 삽입된 Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 이종 서열;
    바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및
    LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 재조합 박미드.
  42. 박테리아 레플리콘;
    제1 항생제 저항성 유전자;
    mini-attTn7 부위 내로 삽입된 이종 서열로서, 상기 이종 서열은 B19 Rep를 인코딩하고, 삽입된 B19 Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 이종 서열;
    바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및
    LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 재조합 박미드.
  43. 박테리아 레플리콘;
    제1 항생제 저항성 유전자;
    mini-attTn7 부위 내로 삽입된 이종 서열로서, 상기 이종 서열은 GPV Rep를 인코딩하고, 삽입된 GPV Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 이종 서열;
    바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및
    LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 재조합 박미드.
  44. 박테리아 레플리콘;
    제1 항생제 저항성 유전자;
    mini-attTn7 부위 내로 삽입된 이종 서열로서, 상기 이종 서열은 AAV2 Rep를 인코딩하고, 삽입된 AAV2 Rep가 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 이종 서열;
    바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및
    LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 재조합 박미드.
  45. 핵산 벡터로서,
    제1 박테리아 균주에서 상기 핵산 벡터를 증식시키기 위한 제1 복제 원점으로서, 조건부 복제 원점인 제1 복제 원점;
    제2 박테리아 균주에서 상기 핵산 벡터를 증식시키기 위한 제2 복제 원점;
    이종 서열의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위;
    선택 가능한 마커 서열;
    리포터 유전자; 및
    부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 우선 표적 부위를 포함하는, 핵산 벡터.
  46. 제45항에 있어서, 상기 제1 복제 원점은 pi 단백질의 존재를 조건으로 하는, 벡터.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 제1 복제 원점은 R6Kγ인, 벡터.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 박테리아 균주는 pi 단백질을 포함하는, 벡터.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 복제 원점은 pUC57인, 벡터.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커 서열은 항생제 저항성 유전자를 포함하는, 벡터.
  51. 제50항에 있어서, 상기 항생제 저항성 유전자는 암피실린 저항성 유전자인, 벡터.
  52. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 인코딩하는, 벡터.
  53. 제52항에 있어서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질인, 벡터.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우선 표적 부위는 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 벡터.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개되는, 벡터.
  56. 핵산 벡터로서,
    제1 박테리아 균주에서 상기 핵산 벡터를 증식시키기 위한 제1 복제 원점으로서, 조건부 복제 원점인 제1 복제 원점;
    제2 박테리아 균주에서 상기 핵산 벡터를 증식시키기 위한 제2 복제 원점;
    이종 서열;
    선택 가능한 마커 서열;
    리포터 유전자; 및
    부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 우선 표적 부위를 포함하는, 핵산 벡터.
  57. 제56항에 있어서, 상기 이종 서열은 이종 유전자를 포함하는, 벡터.
  58. 제57항에 있어서, 상기 이종 유전자는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는, 벡터.
  59. 제57항 또는 제58항에 있어서, 상기 이종 서열은 발현 제어 서열을 포함하는, 벡터.
  60. 제59항에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 상기 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결되는, 벡터.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 조직-특이적 프로모터를 포함하는, 벡터.
  62. 제61항에 있어서, 상기 조직-특이적 프로모터는 트리스테트라프롤린(TTP) 또는 뮤린 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터인, 벡터.
  63. 제59항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 벡터.
  64. 제63항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 벡터.
  65. 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 전사-후 조절 요소를 포함하는, 벡터.
  66. 제65항에 있어서, 상기 전사-후 조절 요소는 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)인, 벡터.
  67. 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 치료 단백질인, 벡터.
  68. 제67항에 있어서, 상기 치료 단백질은 응고 인자인, 벡터.
  69. 제66항에 있어서, 상기 응고 인자는 인자 VIII(FVIII)인, 벡터.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 응고 인자는 FVIII-XTEN인, 벡터.
  71. 제56항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 서열은 5' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하는, 벡터.
  72. 제56항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 서열은 3' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하는, 벡터.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 5' ITR 및 상기 3' ITR은 파보바이러스로부터 유래되는, 벡터.
  74. 제73항에 있어서, 상기 파보바이러스는 B19, GPV, HBoV1, 및 AAV2로 구성된 군으로부터 선택되는, 벡터.
  75. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' ITR은 B19로부터 유래된 야생형 또는 변이체 5' ITR인, 벡터.
  76. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' ITR은 GPV로부터 유래된 야생형 또는 변이체 5' ITR인, 벡터.
  77. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' ITR은 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 변이체 5' ITR인, 벡터.
  78. 제71항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' ITR은 HBoV1로부터 유래된 야생형 5' ITR인, 벡터.
  79. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 5' ITR은 절두된 5' ITR인, 벡터.
  80. 제71항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' ITR은 B19로부터 유래된 야생형 또는 변이체 3' ITR인, 벡터.
  81. 제71항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' ITR은 GPV로부터 유래된 야생형 또는 변이체 3' ITR인, 벡터.
  82. 제71항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' ITR은 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 변이체 3' ITR인, 벡터.
  83. 제71항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' ITR은 HBoV1로부터 유래된 야생형 3' ITR인, 벡터.
  84. 제80항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변이체 3' ITR은 절두된 3' ITR인, 벡터.
  85. 제56항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 복제 원점은 pi 단백질의 존재를 조건으로 하는, 벡터.
  86. 제85항에 있어서, 상기 제1 복제 원점은 R6Kγ인, 벡터.
  87. 제85항 또는 제86항에 있어서, 상기 제1 박테리아 균주는 pi 단백질을 포함하는, 벡터.
  88. 제56항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 복제 원점은 pUC57인, 벡터.
  89. 제56항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택 가능한 마커 서열은 항생제 저항성 유전자를 포함하는, 벡터.
  90. 제89항에 있어서, 상기 항생제 저항성 유전자는 암피실린 저항성 유전자인, 벡터.
  91. 제56항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리포터 유전자는 형광 단백질을 인코딩하는, 벡터.
  92. 제91항에 있어서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질인, 벡터.
  93. 제56항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 우선 표적 부위는 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 벡터.
  94. 제56항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개되는, 벡터.
  95. 제1 리포터 유전자 내로 삽입된 제1 이종 서열로서, 삽입된 이종 서열이 상기 제1 리포터 유전자의 리딩 프레임을 파괴하는, 제1 이종 서열;
    부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 제1 우선 표적 부위;
    제2 이종 서열을 포함하는 다중 클로닝 부위; 및
    부위-특이적 재조합 사건을 매개할 수 있는 제2 우선 표적 부위를 포함하는, 재조합 박미드.
  96. 제95항에 있어서, 상기 제1 이종 서열은 제1 이종 유전자를 포함하는, 재조합 박미드.
  97. 제96항에 있어서, 상기 제1 이종 서열은 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는, 재조합 박미드.
  98. 제97항에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 바큘로바이러스 프로모터를 포함하는, 재조합 박미드.
  99. 제98항에 있어서, 상기 바큘로바이러스 프로모터는 전초기, 초기, 후기, 또는 극후기 프로모터인, 재조합 박미드.
  100. 제99항에 있어서, 상기 바큘로바이러스 프로모터는 폴리헤드린 프로모터, 전초기1 프로모터, 및 전초기2 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 박미드.
  101. 제97항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 게놈으로부터 단리된 Rep 단백질인, 재조합 박미드.
  102. 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 파보바이러스 Rep 단백질인, 재조합 박미드.
  103. 제102항에 있어서, 상기 파보바이러스 Rep 단백질은 B19 Rep, AAV2 Rep, HBoV1 Rep, 및 GPV Rep로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 박미드.
  104. 제95항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 이종 서열은 제2 이종 유전자를 포함하는, 재조합 박미드.
  105. 제104항에 있어서, 상기 제2 이종 서열은 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 발현 제어 서열을 포함하는, 재조합 박미드.
  106. 제105항에 있어서, 상기 발현 제어 서열은 조직-특이적 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사-후 조절 요소를 포함하는, 재조합 박미드.
  107. 제106항에 있어서, 상기 조직-특이적 프로모터는 트리스테트라프롤린(TTP) 또는 뮤린 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터인, 재조합 박미드.
  108. 제107항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 재조합 박미드.
  109. 제107항에 있어서, 상기 전사-후 조절 요소는 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)인, 재조합 박미드.
  110. 제105항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 치료 단백질인, 재조합 박미드.
  111. 제110항에 있어서, 상기 치료 단백질은 응고 인자인, 재조합 박미드.
  112. 제111항에 있어서, 상기 응고 인자는 인자 VIII(FVIII)인, 재조합 박미드.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 상기 응고 인자는 FVIII-XTEN인, 재조합 박미드.
  114. 제95항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 이종 서열은 5' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하는, 재조합 박미드.
  115. 제95항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 이종 서열은 3' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하는, 재조합 박미드.
  116. 제115항에 있어서, 상기 5' ITR은 상기 바이러스 파보비리다에 과의 제1 구성원의 게놈으로부터 유래되고, 상기 3' ITR은 상기 바이러스 파보비리다에 과의 제2 구성원의 게놈으로부터 유래되는, 재조합 박미드.
  117. 제116항에 있어서, 상기 제1 및 제2 구성원은 동일한, 재조합 박미드.
  118. 제116항에 있어서, 상기 제1 및 제2 구성원은 상이한, 재조합 박미드.
  119. 제114항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' ITR 및 상기 3' ITR은 B19, GPV, HBoV1, 및 AAV2로 구성된 군으로부터 선택된 파보바이러스로부터 유래되는, 재조합 박미드.
  120. 제119항에 있어서, 상기 5' ITR은 B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' ITR인, 재조합 박미드.
  121. 제119항에 있어서, 상기 5' ITR은 GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' ITR인, 재조합 박미드.
  122. 제119항에 있어서, 상기 5' ITR은 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' ITR인, 재조합 박미드.
  123. 제119항에 있어서, 상기 5' ITR은 HBoV1로부터 유래된 야생형 5' ITR인, 재조합 박미드.
  124. 제119항에 있어서, 상기 3' ITR은 B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' ITR인, 재조합 박미드.
  125. 제119항에 있어서, 상기 3' ITR은 GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' ITR인, 재조합 박미드.
  126. 제119항에 있어서, 상기 3' ITR은 AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' ITR인, 재조합 박미드.
  127. 제119항에 있어서, 상기 3' ITR은 HBoV1로부터 유래된 야생형 3' ITR인, 재조합 박미드.
  128. 제95항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 박미드는 박테리아 레플리콘을 추가로 포함하는, 재조합 박미드.
  129. 제128항에 있어서, 상기 박테리아 레플리콘은 mini-F 레플리콘인, 재조합 박미드.
  130. 제95항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 박미드는 하나 이상의 선택 가능한 마커 서열을 추가로 포함하는, 재조합 박미드.
  131. 제130항에 있어서, 상기 하나 이상의 선택 가능한 마커 서열은 하나 이상의 항생제 저항성 유전자를 포함하는, 재조합 박미드.
  132. 제131항에 있어서, 상기 하나 이상의 항생제 저항성 유전자는 암피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 및 젠타마이신 저항성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는, 재조합 박미드.
  133. 제95항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 리포터 유전자는 LacZα 또는 이의 기능적 부분을 인코딩하는, 재조합 박미드.
  134. 제95항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 박미드는 적어도 제2 및 제3 리포터 유전자를 추가로 포함하는, 재조합 박미드.
  135. 제134항에 있어서, 상기 제2 및 제3 리포터 유전자는 각각 형광 단백질을 인코딩하는, 재조합 박미드.
  136. 제135항에 있어서, 상기 형광 단백질은 녹색 형광 단백질 또는 적색 형광 단백질인, 재조합 박미드.
  137. 제95항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 우선 표적 부위는 각각 LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 재조합 박미드.
  138. 제95항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합 사건은 Cre 재조합효소에 의해 매개되는, 재조합 박미드.
  139. Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 Rep 서열이 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및
    5'에서 3'으로,
    바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 제1 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부;
    단백질을 인코딩하는 서열;
    상기 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및
    상기 바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 제2 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함하는 이종 서열
    을 포함하는, 재조합 박미드.
  140. 제139항에 있어서, 상기 바이러스 파보비리다에 과의 제1 및 제2 게놈은 동일한, 재조합 박미드.
  141. 제140항에 있어서, 상기 바이러스 파보비리다에 과의 제1 및 제2 게놈은 상이한, 재조합 박미드.
  142. 제139항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Rep는 상기 바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 제1 또는 제2 게놈으로부터 유래되는, 재조합 박미드.
  143. B19 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 B19 Rep 서열이 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및
    5'에서 3'으로,
    B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부;
    단백질을 인코딩하는 서열;
    상기 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및
    B19로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함하는 이종 서열
    을 포함하는, 재조합 박미드.
  144. GPV Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 GPV Rep 서열이 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및
    5'에서 3'으로,
    GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부;
    단백질을 인코딩하는 서열;
    상기 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및
    GPV로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함하는 이종 서열
    을 포함하는, 재조합 박미드.
  145. AAV2 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 AAV2 Rep 서열이 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및
    이종 서열을 포함하는 재조합 박미드로서, 상기 이종 서열은 5'에서 3'으로,
    AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부;
    단백질을 인코딩하는 서열;
    상기 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및
    AAV2로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함하는, 재조합 박미드.
  146. HBoV1 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 HBoV1 Rep 서열이 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및
    5'에서 3'으로,
    HBoV1로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부;
    단백질을 인코딩하는 서열;
    상기 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및
    HBoV1로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부를 포함하는 이종 서열
    을 포함하는, 재조합 박미드.
  147. 제139항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 치료 단백질인, 재조합 박미드.
  148. 제147항에 있어서, 상기 치료 단백질은 응고 인자인, 재조합 박미드.
  149. 제148항에 있어서, 상기 응고 인자는 인자 VIII(FVIII)인, 재조합 박미드.
  150. 제148항 또는 제149항에 있어서, 상기 응고 인자는 FVIII-XTEN인, 재조합 박미드.
  151. Rep 단백질을 인코딩하는 서열로서, Rep가 리포터 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및
    SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 서열을 포함하는, 재조합 박미드.
  152. 제147항에 있어서, 상기 이종 서열은 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 박미드.
  153. Rep 단백질을 인코딩하는 서열로서, Rep가 리포터 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열; 및
    SEQ ID NO: 29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이종 서열을 포함하는, 재조합 박미드.
  154. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 박미드를 포함하는, 숙주 세포.
  155. 제19항 내지 제44항 중 어느 한 항의 재조합 박미드를 포함하는, 숙주 세포.
  156. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  157. 제56항 내지 제94항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  158. 제95항 내지 제153항 중 어느 한 항의 재조합 박미드를 포함하는, 숙주 세포.
  159. 제19항 내지 제44항 중 어느 한 항의 재조합 박미드를 생성하는 방법으로서,
    박테리아 세포 내로
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 박미드; 및
    제19항 내지 제44항 중 어느 한 항의 이종 서열을 포함하는 트랜스포존에 작동 가능하게 연결된 박테리아 레플리콘을 포함하는 공여체 핵산 분자를 도입하는 단계;
    전위가 발생하는 조건 하에서 상기 박테리아 세포를 인큐베이션시키는 단계; 및
    상기 박테리아 세포로부터 상기 재조합 박미드를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  160. 제95항 내지 제153항 중 어느 한 항의 재조합 박미드를 생성하는 방법으로서,
    박테리아 세포 내로
    제19항 내지 제44항 중 어느 한 항의 재조합 박미드;
    제56항 내지 제94항 중 어느 한 항의 벡터; 및
    Cre 재조합효소를 도입하는 단계;
    부위-특이적 재조합이 발생하는 조건 하에서 상기 박테리아 세포를 인큐베이션시키는 단계; 및
    상기 박테리아 세포로부터 상기 재조합 박미드를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  161. 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 방법으로서, 적절한 조건 하에서 제95항 내지 제153항 중 어느 한 항의 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
  162. 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법으로서,
    제1항 내지 제44항 및 제95항 내지 제153항 중 어느 한 항의 박미드를 포함하는 재조합 바큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
  163. 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법으로서,
    적절한 조건 하에서 제139항 내지 제153항 중 어느 한 항의 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및
    적절한 조건 하에서 상기 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  164. 제161항 내지 제163항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 바큘로바이러스는 단일 박미드를 포함하는, 방법.
  165. 야생형 또는 절두된 B19 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법으로서,
    적절한 조건 하에서 제139항의 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및
    적절한 조건 하에서 상기 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  166. (없음)
  167. 야생형 또는 절두된 GPV 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법으로서,
    적절한 조건 하에서 제139항의 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및
    적절한 조건 하에서 상기 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  168. 야생형 또는 절두된 AAV2 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법으로서,
    적절한 조건 하에서 제139항의 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및
    적절한 조건 하에서 상기 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  169. 야생형 HBoV1 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법으로서,
    적절한 조건 하에서 제139항의 재조합 박미드를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및
    적절한 조건 하에서 상기 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  170. 5'에서 3'으로,
    바이러스 파보비리다에 과의 제1 구성원의 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부;
    단백질을 인코딩하는 서열;
    상기 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및
    상기 바이러스 파보비리다에 과의 제2 구성원의 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부
    를 포함하는 핵산 서열을 포함하는, 플라스미드.
  171. 제170항에 있어서, 상기 하나 이상의 발현 제어 서열은 조직-특이적 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사-후 조절 요소를 포함하는, 플라스미드.
  172. 제171항에 있어서, 상기 조직-특이적 프로모터는 트리스테트라프롤린(TTP) 또는 뮤린 트랜스티레틴(mTTR) 프로모터인, 플라스미드.
  173. 제170항 또는 제171항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 플라스미드.
  174. 제170항 내지 제173항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사-후 조절 요소는 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)인, 플라스미드.
  175. 제170항 내지 제174항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 치료 단백질인, 플라스미드.
  176. 제175항에 있어서, 상기 치료 단백질은 응고 인자인, 플라스미드.
  177. 제176항에 있어서, 상기 응고 인자는 인자 VIII(FVIII)인, 플라스미드.
  178. 제176항 또는 제177항에 있어서, 상기 응고 인자는 FVIII-XTEN인, 플라스미드.
  179. 제176항 내지 제178항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 응고 인자는 SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 플라스미드.
  180. 제170항 내지 제179항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 구성원은 B19, GPV, HBoV1, 및 AAV2로 구성된 군으로부터 선택되는, 플라스미드.
    [청구항 180]
    제180항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 구성원은 동일한, 플라스미드.
  181. 제180항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 구성원은 상이한, 플라스미드.
  182. 제170항 내지 제181항 중 어느 한 항의 핵산 서열을 포함하는 안정 세포주로서, 상기 핵산 서열은 상기 안정 세포주의 게놈에 안정적으로 통합되는, 안정 세포주.
  183. 제182항에 있어서, 상기 안정 세포주는 안정 곤충 세포주인, 안정 세포주.
  184. 제183항에 있어서, 상기 안정 곤충 세포주는 Sf9인, 안정 세포주.
  185. 야생형 또는 절두된 역위 말단 반복부를 포함하는 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법으로서, Rep 단백질을 인코딩하는 바큘로바이러스를 제182항 내지 제184항 중 어느 한 항의 안정 세포주 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  186. 제185항에 있어서, 상기 안정 세포주는 곤충 세포주인, 방법.
  187. 제186항에 있어서, 상기 곤충 세포주는 Sf9인, 방법.
  188. 제1 박미드 및 제2 박미드를 포함하는 재조합 박미드 세트로서,
    상기 제1 박미드는 mini-attTn7 부위 내로 삽입된 Rep를 인코딩하는 서열을 포함하고, 상기 삽입된 Rep는 리포터 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하며;
    상기 제2 박미드는 이종 서열을 포함하고, 상기 이종 서열은 5'에서 3'으로,
    바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 제1 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 5' 역위 말단 반복부(ITR);
    단백질을 인코딩하는 서열;
    상기 단백질을 인코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 발현 제어 서열; 및
    상기 바이러스 파보비리다에 과의 구성원의 제2 게놈으로부터 유래된 야생형 또는 절두된 3' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하는, 재조합 박미드 세트.
  189. 제182항에 있어서, 상기 5' ITR 및 상기 3' ITR은 B19, GPV, HBoV1, 및 AAV2로 구성된 군으로부터 선택된 파보바이러스로부터 유래되는, 재조합 박미드 세트.
  190. 제188항 또는 제189항에 있어서, 상기 이종 서열은 SEQ ID NO: 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 박미드 세트.
  191. 제188항 또는 제189항에 있어서, 상기 이종 서열은 SEQ ID NO: 19의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 박미드 세트.
  192. 제188항 또는 제189항에 있어서, 상기 이종 서열은 SEQ ID NO: 29의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 재조합 박미드 세트.
  193. 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법으로서,
    제188항 내지 제192항 중 어느 한 항의 재조합 박미드 세트를 포함하는 재조합 바큘로바이러스로 곤충 세포를 감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
  194. 폐쇄 말단 DNA(ceDNA) 분자를 생성하는 방법으로서,
    적절한 조건 하에서 제188항 내지 제192항 중 어느 한 항의 재조합 박미드 세트를 곤충 세포 내로 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 생성하는 단계; 및
    적절한 조건 하에서 상기 재조합 바큘로바이러스로 제2 곤충 세포를 감염시켜 ceDNA 분자를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  195. 박테리아 레플리콘;
    제1 항생제 저항성 유전자;
    HBoV1 Rep를 인코딩하는 서열로서, 삽입된 HBoV1 Rep 서열이 LacZα 유전자 또는 이의 기능적 부분의 리딩 프레임을 파괴하는, 서열;
    바큘로바이러스-유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 형광 단백질을 인코딩하는 유전자; 및
    LoxP 부위 또는 이의 변이체를 포함하는, 재조합 박미드.
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