CN118103515A - 杆状病毒表达系统 - Google Patents

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CN118103515A CN202280068808.6A CN202280068808A CN118103515A CN 118103515 A CN118103515 A CN 118103515A CN 202280068808 A CN202280068808 A CN 202280068808A CN 118103515 A CN118103515 A CN 118103515A
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recombinant bacmid
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刘童瑶
A·马戈迪亚
P·扎卡斯
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Abstract

本文提供了一种用于产生所需蛋白质的杆状病毒表达载体系统。在一方面，所需蛋白质是封闭端DNA(ceDNA)分子，所述封闭端DNA分子包含衍生自病毒科细小病毒科成员的基因组的野生型和/或截短型反向末端重复序列。

Description

杆状病毒表达系统
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月23日提交的国际申请号PCT/US2021/047218和2022年2月14日提交的美国临时专利申请号63/310,038的优先权，将所述申请的公开内容通过引用以其整体特此并入。
对电子提交的序列表的引用
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背景技术
基因疗法提供了治疗多种疾病的持久手段的可能性。基因疗法治疗的最新发展采用病毒或非病毒载体的使用。目前有若干种技术用于产生基因疗法载体。
例如，杆状病毒表达载体系统(BEVS)是用于产生基因疗法载体的已确立系统。在该系统中，将昆虫宿主细胞用重组杆状病毒感染。昆虫宿主细胞提供了必要的蛋白质加工机制以产生由重组杆状病毒编码的产物。BEVS已被用于产生用于许多不同应用的产品，包括疫苗、治疗性蛋白质、蛋白质结晶学以及用于基础和应用研究的产品。当生产用于基因疗法的病毒载体时，经常使用若干种杆状病毒表达载体并将其感染到昆虫宿主细胞中。每一种杆状病毒表达载体的产生是耗时的，并且抬高了生产成本。
因此，本领域需要改进的杆状病毒表达载体系统，同时避免现有系统的局限性。
发明内容
本文提供了一种杆状病毒表达载体系统，其包含杆状病毒穿梭载体(杆粒)和/或经工程化以产生治疗性药物产品的稳定细胞系。本文提供的杆状病毒表达载体系统包含含有两个或更多个外来序列插入位点的重组杆粒，和一个或多个能够介导外来序列(例如，异源基因)插入所述外来序列插入位点中的供体载体。
在一方面，本文提供了一种杆粒，所述杆粒包含：细菌复制子；选择性标记序列；包含用于插入转座子的第一优先靶位点的第一报告基因；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的第二报告基因；以及能够介导位点特异性重组事件的第二优先靶位点。
在某些示例性实施方案中，所述细菌复制子是低拷贝数复制子。在某些示例性实施方案中，所述低拷贝数复制子是微型F复制子。
在某些示例性实施方案中，所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。在某些示例性实施方案中，所述抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因。
在某些示例性实施方案中，所述第一报告基因编码能够代谢生色底物的酶。在某些示例性实施方案中，所述酶是LacZα或其功能部分。在某些示例性实施方案中，所述生色底物是蓝色-gal或X-gal。
在某些示例性实施方案中，用于插入转座子的所述第一优先靶位点不破坏所述第一报告基因的阅读框。在某些示例性实施方案中，所述第一优先靶位点是细菌转座子的附着位点。在某些示例性实施方案中，所述第一优先靶位点是T7转座子的附着位点。在某些示例性实施方案中，所述转座子是T7转座子。
在某些示例性实施方案中，所述第二报告基因编码荧光蛋白。在某些示例性实施方案中，所述荧光蛋白是红色荧光蛋白。
在某些示例性实施方案中，所述杆状病毒诱导型启动子是39K启动子。
在某些示例性实施方案中，第二优先靶位点包含LoxP位点或其变体。
在某些示例性实施方案中，所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
在另一方面，本文提供了一种杆粒，所述杆粒包含：微型F复制子；抗生素抗性基因；包含T7转座子附着位点的LacZα基因或其功能部分；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及LoxP位点或其变体。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：细菌复制子；第一选择性标记序列；插入第一报告基因中的异源序列，其中所插入的异源序列破坏了所述第一报告基因的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的第二报告基因；以及能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点。
在某些示例性实施方案中，所述异源序列包含异源基因。在某些示例性实施方案中，所述异源基因包含编码蛋白质的序列。
在某些示例性实施方案中，所述异源序列还包含表达控制序列。在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列与所述编码蛋白质的序列可操作地连接。
在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列包含杆状病毒启动子。在某些示例性实施方案中，所述杆状病毒启动子是即早期、早期、晚期或极晚期基因启动子。在某些示例性实施方案中，所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、即早期1启动子和即早期2启动子。
在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列包含多腺苷酸化信号。
在某些示例性实施方案中，所述蛋白质是从病毒科细小病毒科成员的基因组中分离的Rep蛋白。在某些示例性实施方案中，所述蛋白质是细小病毒Rep蛋白。在某些示例性实施方案中，所述细小病毒Rep蛋白选自B19 Rep、AAV2 Rep、HBoV1 Rep和GPV Rep。
在某些示例性实施方案中，所述异源序列包含第二选择性标记序列。在某些示例性实施方案中，所述第二选择性标记序列包含庆大霉素抗性基因。
在某些示例性实施方案中，所述细菌复制子是微型F复制子。在某些示例性实施方案中，所述第一选择性标记序列包含卡那霉素抗性基因。在某些示例性实施方案中，所述第一报告基因编码LacZα或其功能部分。在某些示例性实施方案中，所述第二报告基因编码红色荧光蛋白。在某些示例性实施方案中，其中所述杆状病毒诱导型启动子是39K启动子。在某些示例性实施方案中，所述第二优先靶位点包含LoxP位点或其变体。在某些示例性实施方案中，所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到微型attTn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码Rep，并且其中所插入的Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；以及LoxP位点或其变体。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：细菌复制子；第一抗生素抗性基因；插入到微型attTn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码Rep，并且其中所插入的Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及LoxP位点或其变体。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：细菌复制子；第一抗生素抗性基因；插入到微型attTn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码B19 Rep，并且其中所插入的B19 Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及LoxP位点或其变体。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：细菌复制子；第一抗生素抗性基因；插入到微型attTn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码GPV Rep，并且其中所插入的GPV Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及LoxP位点或其变体。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：细菌复制子；第一抗生素抗性基因；插入到微型attTn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码AAV2Rep，并且其中所插入的AAV2 Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及LoxP位点或其变体。
在另一方面，本文提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含：用于在第一细菌株中繁殖所述核酸载体的第一复制起点，其中所述第一复制起点是条件性复制起点；用于在第二细菌株中繁殖所述核酸载体的第二复制起点；用于插入异源序列的多克隆位点；选择性标记序列；报告基因；以及能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点。
在某些示例性实施方案中，所述第一复制起点是以pi蛋白的存在为条件的。在某些示例性实施方案中，所述第一复制起点是R6Kγ。
在某些示例性实施方案中，所述第一细菌株包含pi蛋白。
在某些示例性实施方案中，所述第二复制起点是pUC57。
在某些示例性实施方案中，所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。在某些示例性实施方案中，所述抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因。
在某些示例性实施方案中，所述报告基因编码荧光蛋白。在某些示例性实施方案中，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
在某些示例性实施方案中，所述优先靶位点包含LoxP位点或其变体。在某些示例性实施方案中，所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
在另一方面，本文提供了一种核酸载体，所述核酸载体包含：用于在第一细菌株中繁殖所述核酸载体的第一复制起点，其中所述第一复制起点是条件性复制起点；用于在第二细菌株中繁殖所述核酸载体的第二复制起点；包含异源序列的多克隆位点；选择性标记序列；报告基因；以及能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点。
在某些示例性实施方案中，所述异源序列包含异源基因。在某些示例性实施方案中，所述异源基因包含编码蛋白质的序列。
在某些示例性实施方案中，所述异源序列还包含表达控制序列。在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列与所述编码蛋白质的序列可操作地连接。在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列包含组织特异性启动子。在某些示例性实施方案中，所述组织特异性启动子是三重四脯氨酸(tristetraprolin)(TTP)或鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列包含多腺苷酸化信号。在某些示例性实施方案中，所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列包含转录后调节元件。在某些示例性实施方案中，所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
在某些示例性实施方案中，所述蛋白质是治疗性蛋白质。在某些示例性实施方案中，所述治疗性蛋白质是凝血因子。在某些示例性实施方案中，所述凝血因子是因子VIII(FVIII)。在某些示例性实施方案中，所述凝血因子是FVIII-XTEN。
在某些示例性实施方案中，所述异源序列包含5’反向末端重复序列(ITR)。在某些示例性实施方案中，所述异源序列包含3’反向末端重复序列(ITR)。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR和所述3’ITR衍生自细小病毒。在某些示例性实施方案中，所述细小病毒选自B19、GPV、HBoV1和AAV2。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR是衍生自B19的野生型或变体5’ITR。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR是衍生自GPV的野生型或变体5’ITR。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR是衍生自AAV2的野生型或变体5’ITR。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR是衍生自HBoV1的野生型或变体5’ITR。在某些示例性实施方案中，所述变体5’ITR是截短型5’ITR。在某些示例性实施方案中，所述3’ITR是衍生自B19的野生型或变体3’ITR。在某些示例性实施方案中，所述3’ITR是衍生自GPV的野生型或变体3’ITR。在某些示例性实施方案中，所述3’ITR是衍生自AAV2的野生型或变体3’ITR。在某些示例性实施方案中，所述变体3’ITR是截短型3’ITR。在某些示例性实施方案中，所述3’ITR是衍生自HBoV1的野生型3’ITR。
在某些示例性实施方案中，所述第一复制起点是以pi蛋白的存在为条件的。在某些示例性实施方案中，所述第一复制起点是R6Kγ。
在某些示例性实施方案中，第一细菌株包含pi蛋白。
在某些示例性实施方案中，所述第二复制起点是pUC57。
在某些示例性实施方案中，所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。在某些示例性实施方案中，所述抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因。
在某些示例性实施方案中，所述报告基因编码荧光蛋白。在某些示例性实施方案中，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
在某些示例性实施方案中，所述优先靶位点包含LoxP位点或其变体。在某些示例性实施方案中，所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到第一报告基因中的第一异源序列，其中所插入的异源序列破坏了所述第一报告基因的阅读框；能够介导位点特异性重组事件的第一优先靶位点；包含第二异源序列的多克隆位点；以及能够介导位点特异性重组事件的第二优先靶位点。
在某些示例性实施方案中，所述第一异源序列包含第一异源基因。在某些示例性实施方案中，所述第一异源序列包含与编码蛋白质的序列可操作地连接的表达控制序列。
在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列包含杆状病毒启动子。在某些示例性实施方案中，所述杆状病毒启动子是即早期、早期、晚期或极晚期启动子。在某些示例性实施方案中，所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、即早期1启动子和即早期2启动子。
在某些示例性实施方案中，所述蛋白质是从病毒科细小病毒科成员的基因组中分离的Rep蛋白。在某些示例性实施方案中，所述蛋白质是细小病毒Rep蛋白。在某些示例性实施方案中，所述细小病毒Rep蛋白选自B19 Rep、AAV2 Rep、HBoV1 Rep和GPV Rep。
在某些示例性实施方案中，所述第二异源序列包含第二异源基因。在某些示例性实施方案中，所述第二异源序列包含与编码蛋白质的序列可操作地连接的表达控制序列。在某些示例性实施方案中，所述表达控制序列包含组织特异性启动子、多腺苷酸化信号和/或转录后调节元件。在某些示例性实施方案中，所述组织特异性启动子是三重四脯氨酸(tristetraprolin)(TTP)或鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。在某些示例性实施方案中，所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。在某些示例性实施方案中，所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
在某些示例性实施方案中，所述蛋白质是治疗性蛋白质。在某些示例性实施方案中，所述治疗性蛋白质是凝血因子。在某些示例性实施方案中，所述凝血因子是因子VIII(FVIII)。在某些示例性实施方案中，所述凝血因子是FVIII-XTEN。
在某些示例性实施方案中，所述第二异源序列包含5’反向末端重复序列(ITR)。在某些示例性实施方案中，所述第二异源序列包含3’反向末端重复序列(ITR)。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR衍生自病毒科细小病毒科的第一成员的基因组，并且所述3’ITR衍生自病毒科细小病毒科的第二成员的基因组。在某些示例性实施方案中，所述第一成员和所述第二成员是相同的。在某些示例性实施方案中，所述第一成员和所述第二成员是不同的。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR和所述3’ITR衍生自细小病毒，所述细小病毒选自B19、GPV和AAV2。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR是衍生自B19的野生型或截短型5’ITR。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR是衍生自GPV的野生型或截短型5’ITR。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR是衍生自AAV2的野生型或截短型5’ITR。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR是衍生自HBoV1的野生型或截短型5’ITR。在某些示例性实施方案中，所述3’ITR是衍生自B19的野生型或截短型3’ITR。在某些示例性实施方案中，所述3’ITR是衍生自GPV的野生型或截短型3’ITR。在某些示例性实施方案中，所述3’ITR是衍生自AAV2的野生型或截短型3’ITR。在某些示例性实施方案中，所述5’ITR是衍生自HBoV1的野生型3’ITR。
在某些示例性实施方案中，所述重组杆粒还包含细菌复制子。在某些示例性实施方案中，所述细菌复制子是微型F复制子。
在某些示例性实施方案中，所述重组杆粒还包含一种或多种选择性标记序列。在某些示例性实施方案中，所述一种或多种选择性标记序列包含一种或多种抗生素抗性基因。在某些示例性实施方案中，所述一种或多种抗生素抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和庆大霉素抗性基因。
在某些示例性实施方案中，所述第一报告基因编码LacZα或其功能部分。
在某些示例性实施方案中，所述重组杆粒还至少包含第二报告基因和第三报告基因。在某些示例性实施方案中，所述第二报告基因和所述第三报告基因各自编码荧光蛋白。在某些示例性实施方案中，所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
在某些示例性实施方案中，所述第一优先靶位点和所述第二优先靶位点各自包含LoxP位点或其变体。在某些示例性实施方案中，所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到微型attTn7位点中的编码Rep的序列，其中所插入的Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自病毒科细小病毒科成员的第一基因组的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；一种或多种表达控制序列，其与所述编码蛋白质的序列可操作地连接；以及衍生自病毒科细小病毒科成员的第二基因组的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
在某些示例性实施方案中，病毒科细小病毒科的所述第一基因组和所述第二基因组是相同的。在某些示例性实施方案中，病毒科细小病毒科的所述第一基因组和所述第二基因组是不同的。
在某些示例性实施方案中，所述Rep衍生自所述病毒科细小病毒科成员的所述第一基因组或所述第二基因组。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到微型attTn7位点中的编码B19 Rep的序列，其中所插入的B19 Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自B19的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自B19的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到微型attTn7位点中的编码GPV Rep的序列，其中所插入的GPV Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自GPV的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自GPV的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到微型attTn7位点中的编码AAV2 Rep的序列，其中所插入的AAV2 Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自AAV2的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自AAV2的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
在另一方面，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到微型attTn7位点中的编码AAV2 HBoV1 Rep的序列，其中所插入的HBoV1 Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自HBoV1的野生型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自HBoV1的野生型3’反向末端重复序列。
在某些示例性实施方案中，所述蛋白质是治疗性蛋白质。在某些示例性实施方案中，所述治疗性蛋白质是凝血因子。在某些示例性实施方案中，所述凝血因子是因子VIII(FVIII)。在某些示例性实施方案中，所述凝血因子是FVIII-XTEN。
在另一方面，提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所述的杆粒。在另一方面，提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所述的重组杆粒。在另一方面，提供了宿主细胞，所述宿主细胞包含如本文所述的载体。
在另一方面，本文提供了一种产生如本文所述的重组杆粒的方法，所述方法包括：将如本文所述的杆粒和供体核酸分子引入细菌细胞中，所述供体核酸分子包含细菌复制子，所述细菌复制子与包含如本文所述的异源序列的转座子可操作地连接；在发生转座的条件下孵育所述细菌细胞；以及从所述细菌细胞中分离所述重组杆粒。
在另一方面，本文提供了一种产生如本文所述的重组杆粒的方法，所述方法包括：将如本文所述的重组杆粒、如本文所述的载体、以及Cre重组酶引入细菌细胞中；将所述细菌细胞在发生位点特异性重组的条件下孵育；以及从所述细菌细胞中分离所述重组杆粒。
在另一方面，本文提供了一种产生重组杆状病毒的方法，所述方法包括在适当条件下将本文所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中。
在另一方面，本文提供了一种产生封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：在适当条件下将如本文所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
在另一方面，本文提供了一种产生包含野生型或截短型B19反向末端重复序列的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：在适当条件下将包含野生型或截短型B19反向末端重复序列的如本文所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
在另一方面，本文提供了一种产生包含野生型或截短型GPV反向末端重复序列的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：在适当条件下将包含野生型或截短型GPV反向末端重复序列的如本文所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
在另一方面，本文提供了一种产生包含野生型或截短型AAV2反向末端重复序列的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：在适当条件下将包含野生型或截短型AAV2反向末端重复序列的如本文所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
在另一方面，本文提供了一种产生包含野生型HBoV1反向末端重复序列的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：在适当条件下将包含野生型HBoV1反向末端重复序列的如本文所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
在另一方面，本文提供了一种质粒，所述质粒包含核酸序列，所述核酸序列从5’至3’包含：衍生自病毒科细小病毒科的第一成员的基因组的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；一种或多种表达控制序列，其与所述编码蛋白质的序列可操作地连接；以及衍生自病毒科细小病毒科的第二成员的基因组的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
在一些实施方案中，本文公开了重组杆粒组，所述重组杆粒组包含第一杆粒和第二杆粒，其中所述第一杆粒包含插入到微型attTn7位点中的编码Rep的序列，其中所插入的Rep破坏了报告基因或其功能部分的阅读框；并且其中所述第二杆粒包含异源序列，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自病毒科细小病毒科成员的第一基因组的野生型或截短型5’反向末端重复序列(ITR)；编码蛋白质的序列；一种或多种表达控制序列，其与所述编码蛋白质的序列可操作地连接；以及衍生自病毒科细小病毒科成员的第二基因组的野生型或截短型3’反向末端重复序列(ITR)。在一些实施方案中，所述5’ITR和所述3’ITR衍生自细小病毒，所述细小病毒选自B19、GPV、HBoV1和AAV2。
在某些示例性实施方案中，所述一种或多种表达控制序列包含组织特异性启动子、多腺苷酸化信号和/或转录后调节元件。在某些示例性实施方案中，所述组织特异性启动子是三重四脯氨酸(tristetraprolin)(TTP)或鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。在某些示例性实施方案中，所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。在某些示例性实施方案中，所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
在某些示例性实施方案中，所述蛋白质是治疗性蛋白质。在某些示例性实施方案中，所述治疗性蛋白质是凝血因子。在某些示例性实施方案中，所述凝血因子是因子VIII(FVIII)。在某些示例性实施方案中，所述凝血因子是FVIII-XTEN。
在某些示例性实施方案中，所述第一成员和/或所述第二成员选自B19、GPV、HBoV1和AAV2。在某些示例性实施方案中，所述第一成员和/或所述第二成员是相同的。在某些示例性实施方案中，所述第一成员和/或所述第二成员是不同的。
在另一方面，本文提供了一种稳定细胞系，所述稳定细胞系包含如本文所述的核酸序列，其中所述核酸序列稳定地整合在所述稳定细胞系的基因组中。
在某些示例性实施方案中，所述稳定细胞系是稳定的昆虫细胞系。在某些示例性实施方案中，所述稳定的昆虫细胞系是Sf9。
在另一方面，本文提供了一种产生包含野生型或截短型反向末端重复序列的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括将如本文所述的重组杆粒引入如本文所述的稳定细胞系中。
在另一方面，本文提供了一种产生包含野生型或截短型反向末端重复的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括将以下引入宿主细胞中：如本文所述的质粒；和如本文所述的重组杆粒。
在某些示例性实施方案中，所述宿主细胞是昆虫细胞。在某些示例性实施方案中，所述昆虫细胞是Sf9。
附图说明
图1A至图1D是根据本发明的一个实施方案的重组杆粒的示意图。图1A示出了bMON14272的示意图，所述bMON14272编码卡那霉素抗性标记(KanR)、与LacZα框内融合的微型attTn7插入位点和微型F复制起点(微型F)。图1B示出了合成转移载体的示意性线性图谱，所述合成转移载体包含编码在AcMNPV 39K启动子(p39K)下的红色荧光蛋白(RFP)的基因、之后是ets多腺苷酸化信号(etsPAS)、LoxP重组位点和EGT侧接基因序列。图1C示出了重组杆粒(BIVVBac)的示意图，所述重组杆粒编码卡那霉素抗性标记(KanR)、与LacZα框内融合的微型attTn7插入位点、微型F复制起点(微型F)、编码在AcMNPV 39K启动子(p39K)下的红色荧光蛋白(RFP)基因的基因、之后是ets多腺苷酸化信号(etsPAS)、以及LoxP重组位点。图1D示出了大肠杆菌株(BIVVBacDH10B)的示意图，所述大肠杆菌株具有BIVVBac杆粒和编码转座酶的Tn7辅助质粒。
图2A至图2B是根据本发明的一个实施方案的Cre-LoxP供体载体的示意图。图2A示出了合成DNA的示意性线性图谱，所述合成DNA包含之前是AcMNPV转录增强子hr5元件且之后是AcMNPV p10多腺苷酸化信号(p10 PAS)的在AcMNPV即早期1(pIE1)启动子下编码增强型GFP的基因、LoxP重组位点(LoxP)、氨苄青霉素抗生素抗性基因、多克隆位点(MCS)、ColE1和R6Kγ复制起点(Ori)。图2B示出了根据本发明的一个实施方案的Cre-LoxP供体载体的示意性图谱，所述供体载体通过将合成DNA(图2A)插入至pUC57载体中而制得。
图3A至图3F是根据本发明的实施方案的复制(Rep)蛋白表达构建体的示意图。图3A示出了合成DNA的示意性线性图谱，所述合成DNA编码在AcMNPV多角体蛋白或即早期1(ie1)启动子下的B19 Rep基因，之后是SV40多腺苷酸化信号(SV40 PAS)。图3B示出了根据本发明的实施方案的Tn7转移载体的示意性图谱，所述Tn7转移载体通过将B19.Rep合成DNA(图3A)插入到pFastBac1载体(Invitrogen)中而制得。图3C示出了合成DNA的示意性线性图谱，所述合成DNA编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的GPV Rep78和Rep52剪接基因，之后是sv40多腺苷酸化信号(SV40 PAS)。经修饰的mRNA转录物(mRNA)示出为波浪线，其具有Rep78的非规范起始密码子(CUG)、Rep52的规范起始密码子(AUG)和终止密码子(UAA)。图3D示出了根据本发明的实施方案的Tn7转移载体的示意性图谱，所述Tn7转移载体通过将GPV.Rep合成DNA(图3C)插入到pFastBac1载体(Invitrogen)中而制得。图3E示出了合成DNA的示意性线性图谱，所述合成DNA编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的AAV2 Rep78和Rep52剪接基因，之后是sv40多腺苷酸化信号(SV40 PAS)。经修饰的mRNA转录物(mRNA)示出为波浪线，其具有Rep78的非规范起始密码子(CUG)、Rep52的规范起始密码子(AUG)和终止密码子(UAA)。图3F示出了根据本发明的实施方案的Tn7转移载体的示意性图谱，所述Tn7转移载体通过将AAV2.Rep合成DNA(图3E)插入到pFastBac1载体(Invitrogen)中而制得。
图4A至图4B是人FVIIIco6XTEN表达构建体的示意图。图4A示出了表达构建体的示意性线性图谱，所述表达构建体在以下的调节下编码包含XTEN 144肽的密码子优化的人因子VIII(FVIIIco6)(FVIIIco6XTEN)：肝脏特异性TTPp启动子、土拨鼠转录后调节元件(WPRE)和牛生长激素多腺苷酸化(bGHpA)信号。hFVIIIco6XTEN表达盒分别侧接有以下的对称截短型(Δ)、对称野生型(WT)和不对称型(Asy)ITR：B19(Δ135、WT)、GPV(Δ162、WT和Asy)或AAV2(WT、Asy1、Asy2、Asy3)。所指示的ITR序列可以在表1中找到。图4B示出了Cre-LoxP供体载体的示意性线性图谱，所述Cre-LoxP供体载体编码克隆到如图2B中所述的Cre-LoxP供体载体中的如图4A中所述的侧接有B19、GPV或AAV2的ITR的hFVIIIco6XTEN表达盒。
图5A至图5G示出了包含编码Rep的序列的重组杆状病毒表达载体(BEV)的示意图，以及对其的确认研究。图5A是编码B19.Rep、GPV.Rep或AAV2.Rep的重组BIVV Bac杆粒(分别为BIVVBac.IE1.B19.RepTn7、BIVVBac.Polh.GPV.RepTn7和BIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7)与亲本BIVVBac和bMON14272杆粒相比的限制性酶作图的琼脂糖凝胶电泳图像。图5B示出了AcBIVVBac.IE1.B19.RepTn7的示意性图谱。图5C示出了AcBIVVBac.Polh.GPV.RepTn7的示意性图谱。图5D示出了AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7的示意性图谱。图5E示出了重组AcBIVVBac.IE1.B19.RepTn7 BEV的噬斑纯化克隆(克隆1-6；Cl#1、Cl#2、Cl#3、Cl#4、Cl#5、Cl#6)中的B19.REP免疫印迹，其中多克隆抗B19 NS1(1:2500)作为一抗，并且IRDye@680RD驴抗兔LI-COR(1:10,000)作为二抗。将Precision Plus ProteinTM双色(Bio-Rad)用作标准品并且示出在左边。图5F示出了重组AcBIVVBac.Polh.GPV.RepTn7 BEV的噬斑纯化克隆(克隆1-6；Cl#1、Cl#2、Cl#3、Cl#4、Cl#5、Cl#6)中的GPV.REP免疫印迹，其中多克隆抗GPV REP肽抗体(1:500)作为一抗，并且IRDye@680RD驴抗兔LI-COR(1:10,000)作为二抗。将PrecisionPlus ProteinTM双色(Bio-Rad)用作标准品并且示出在左边。图5G示出了重组AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV的噬斑纯化克隆中的AAV2.REP免疫印迹，其中单克隆抗AAV2 Rep(1:500)作为一抗并且IRDye@800CW驴抗小鼠LI-COR(1:10,000)作为二抗。将Precision Plus ProteinTM双色(Bio-Rad)用作标准品并且示出在左边。
图6A至图6C是包含编码Rep和hFVIIIco6XTEN的序列的BEV的示意图。图6A示出了重组BEV的示意性图谱，所述重组BEV编码B19.Rep表达盒和hFVIIIco6XTEN表达盒，后者表达盒侧接有如指示的B19 ITR(AcBIVVBac(B19.Rep)FVIII.B19.ITRLoxP)。图6B示出了重组BEV的示意性图谱，所述重组BEV编码GPV.Rep表达盒和hFVIIIco6XTEN表达盒，后者表达盒侧接有如指示的GPV ITR(AcBIVVBac(GPV.Rep)FVIII.GPV.ITRLox P)。图6C示出了重组BEV的示意性图谱，所述重组BEV编码AAV2.Rep表达盒和hFVIIIc o6XTEN表达盒，后者表达盒侧接有AAV2 ITR(AcBIVVBac(AAV2.Rep)FVIII.AAV2.IT RLoxP)。如图6A至图6C中指示的ITR序列可以在表1中找到。
图7A至图7C示出了根据本发明的一个实施方案使用杆状病毒表达载体系统产生人FVIIIco6XTEN ceDNA载体。图7A是重组BEV的示意性图谱，所述重组BEV编码GPV.Rep表达盒和hFVIIIco6XTEN表达盒，后者表达盒侧接有GPV不对称型ITR(AcBIVVBac(GPV.Rep)FVIII.GPV.ITRLoxP)。所指示的ITR序列可以在表1中找到。图7B是从用AcBIVVBac(GPV.Rep)FVIII.GPV.Asy.ITRLoxP BEV的噬斑纯化克隆(克隆1-6；Cl#1、Cl#2、Cl#3、Cl#4、Cl#5、Cl#6)感染的Sf9细胞中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于hFVIIIco6XTEN大小的DNA条带由箭头指示。图7C是从以不同体积加载的重组AcBIVVBac(GPV.Rep)FVIII.GPV.Asy.ITRLoxP BEV克隆#4(如图7B中所示)获得的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于hFVIIIco6XTEN大小的DNA条带由箭头指示。
图8A至图8B示出了用于产生稳定的人FVIIIco6XTEN编码昆虫细胞系的材料。图8A示出了质粒的示意性图谱，所述质粒编码之前是转录增强子hr5元件且之后是AcMNPV p10多腺苷酸化信号的在AcMNPV即早期(ie1)启动子下的新霉素抗性标记。图8B示出了侧接有B19、GPV或AAV2 ITR的hFVIIIco6XTEN表达盒的示意性图谱，所述表达盒稳定地整合到Sf9细胞基因组中以产生稳定细胞系。产生的稳定细胞系列表示出在表5中，并且ITR的序列示出在表1中。
图9A至图9C是琼脂糖凝胶电泳图像，其示出了从稳定细胞系对人FVIIIco6XTENceDNA载体的产生。图9A是从Sf细胞系-1和-2中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像，所述ceDNA载体编码分别侧接有对称型截短型(B19Δ135)或对称型野生型(B19.WT)ITR的hFVIIIco6XTEN。图9B是从Sf细胞系-3、-4和-5中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像，所述ceDNA载体编码分别侧接有对称型截短型(GPVΔ162)、对称型野生型(GPV.WT)或不对称型(GPV.Asy)ITR的hFVIIIco6XTEN。图9C是从Sf细胞系-6、-7、-8和-9中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像，所述ceDNA载体编码分别侧接有对称野生型(AAV2.WT)、不对称型1(AAV2.Asy1)、不对称型2(AAV2.Asy2)或不对称型3(AAV2.Asy3)的hFVIIIco6XTEN。用于图9A至图9C中的稳定细胞系示出在表5中，并且ITR的序列示出在表1中。
图10是示出了通过ChromogenixSP因子VIII生色测定测量的hFVIII活性的绘图。将从稳定细胞系中分离的ceDNA转染在Huh7细胞中，并且在转染后48和72h收获无细胞上清液，并且通过生色测定进行测试以检测hFVIII。实线表示ceDNA样品，并且虚线表示用作对照的质粒DNA样品。
图11A至图11F是根据本发明的实施方案的复制(Rep)蛋白表达构建体的示意图。图11A示出了合成DNA的示意性线性图谱，所述合成DNA编码在OpMNPV即早期(OpIE2)启动子下的B19 Rep基因，之后是sv40多腺苷酸化信号(SV40 PAS)。图11B示出了通过在如图3B中所示的pFastBac.IE1.B19.Rep构建体中用OpIE2替代IE1启动子制得的瞬时表达质粒的示意性图谱。图11C示出了合成DNA的示意性线性图谱，所述合成DNA编码在OpMNPV即早期(OpIE2)启动子下的GPV Rep78和Rep52剪接基因，之后是sv40多腺苷酸化信号(SV40 PAS)。经修饰的mRNA转录物(mRNA)示出为波浪线，其具有Rep78的非规范起始密码子(CUG)、Rep52的规范起始密码子(AUG)和终止密码子(UAA)。图11D示出了通过在如图3D中所示的pFastBac.Polh.GPV.Rep构建体中用OpIE2替代多角体蛋白启动子制得的瞬时表达质粒的示意性图谱。图11E示出了合成DNA的示意性线性图谱，所述合成DNA编码在OpMNPV即早期(OpIE2)启动子下的AAV2Rep78和Rep52剪接基因，之后是sv40多腺苷酸化信号(SV40 PAS)。经修饰的mRNA转录物(mRNA)示出为波浪线，其具有Rep78的非规范起始密码子(CUG)、Rep52的规范起始密码子(AUG)和终止密码子(UAA)。图11F示出了通过在如图3F中所示的pFastBac.Polh.AAV2.Rep构建体中用OpIE2替代多角体蛋白启动子制得的瞬时表达质粒的示意性图谱。
图12A至图12C是修饰的FVIIIXTEN表达盒的示意图，所述表达盒具有根据本发明的实施方案的细小病毒ITR、肝脏特异性修饰的小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子(mTTR482)和(V2.0)密码子优化的BDDco-FVIIIXTEN转基因(V2.0 FVIIIXTEN)(SEQ ID NO:19)。图12A示出了侧接有AAV2 WT ITR(SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6)的经修饰的FVIIIXTEN表达盒的示意性线性图谱。图12B示出了侧接有B19 WT(SEQ ID NO:2)或B19最小型(SEQ IDNO:16)的经修饰的FVIIIXTEN表达盒的示意性线性图谱。图12C示出了侧接有GPVΔ120(SEQID NO:17)或GPVΔ186(SEQ ID NO:18)的经修饰的FVIIIXTEN表达盒的示意性线性图谱。
图13A至图13C是根据本发明的一个实施方案的用于在杆状病毒系统中产生ceDNA的方法的示意图。图13A示出了单BAC方法的示意图，其中将在不同基因座处编码V2.0FVIIIXTEN和Rep基因的单一重组BEV用于在Sf9细胞中进行感染以产生ceDNA。图13B示出了双BAC方法的示意图，其中将Sf9细胞用编码V2.0 FVIIIXTEN和/或Rep基因的重组BEV共感染以产生ceDNA。图13C示出了稳定细胞系方法的示意图，其中FVIIIXTEN表达盒稳定地整合到Sf9细胞基因组中并且通过感染编码Rep基因的重组BEV以产生ceDNA而被挽救。
图14A至图14C示出了根据本发明的一个实施方案从AAV2单BAC产生人FVIIIXTENceDNA载体。图14A是在Sf9细胞中使用重组BEV产生FVIIIXTEN ceDNA载体的单BAC方法的示意图，所述重组BEV编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的AAV2 Rep基因和包含V2.0FVIIIXTEN且侧接有AAV2 WT ITR的人FVIIIXTEN表达盒(AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITR)Polh.AAV2.RepLoxP)。图14B示出了AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITR)Polh.AAV2.RepLoxP BEV的示意性图谱。图14C是从用AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITR)Polh.AAV2.RepLoxP BEV的滴定病毒原液(P2)感染的Sf9细胞中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于FVIIIXTEN ceDNA(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DNA条带由箭头指示。
图15A至图15C示出了根据本发明的一个实施方案从B19单BAC产生人FVIIIX TENceDNA载体。图15A是在Sf9细胞中使用重组BEV产生FVIIIXTEN ceDNA载体的单BAC方法的示意图，所述重组BEV编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的B19 NS1基因和包含V2.0FVIIIXTEN且侧接有B19 WT ITR的人FVIIIXTEN表达盒(AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITR)Polh.B19.NS1LoxP)。图15B示出了AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITR)Polh.B19.NS1LoxP BEV的示意性图谱。图15C是从用AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITR)Polh.B19.NS1LoxP BEV的滴定病毒原液(P2)感染的Sf9细胞中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于FVIIIXTEN ceDNA(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DNA条带由箭头指示。
图16A至图16C示出了根据本发明的一个实施方案从AAV2双BAC产生人FVIII XTENceDNA载体。图16A是FVIIIXTEN ceDNA载体产生的双BAC方法的示意图，其中将Sf9细胞用编码FVIIIXTEN表达盒的重组BEV共感染，所述重组BEV编码包含V2.0 FVI IIXTEN且侧接有AAV2 WT ITR的FVIIIXTEN表达盒(AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITRTn7)和/或编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的AAV2 Rep基因(AcBIVV Bac.Polh.AAV2.RepTn7)。图16B示出了AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITRTn7和AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV的示意图谱。图16C是从以如指示的AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITRTn7和AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV的不同MOI共感染的Sf9细胞中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于FVIIIXTEN ceDNA载体(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DN A条带由箭头指示。
图17A至图17C示出了根据本发明的一个实施方案从B19双BAC产生人FVIIIX TENceDNA载体。图17A是FVIIIXTEN ceDNA载体产生的双BAC方法的示意图，其中将Sf9细胞用编码FVIIIXTEN表达盒的重组BEV共感染，所述重组BEV编码包含V2.0 FVI IIXTEN且侧接有B19 WT ITR的FVIIIXTEN表达盒(AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITRTn7)和/或编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的B19 NS1基因(AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7)。图17B示出了AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITRTn7和AcBIVV Bac.Polh.B19.NS1Tn7 BEV的示意性图谱。图17C是从以如指示的AcBIVVBac.mTTR.FVII IXTEN.B19.WT.ITRTn7和AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7 BEV的不同MOI共感染的Sf9细胞中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于FVIIIXTEN ceDNA载体(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DNA条带由箭头指示。
图18A至图18C示出了根据本发明的一个实施方案从GPV双BAC产生人FVIIIX TENceDNA载体。图18A是FVIIIXTEN ceDNA载体产生的双BAC方法的示意图，其中将Sf9细胞用编码FVIIIXTEN表达盒的重组BEV共感染，所述重组BEV编码包含V2.0 FVI IIXTEN且侧接有GPVΔ120ITR的FVIIIXTEN表达盒(AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.GP VΔ120.ITRTn7)和/或编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的GPV NS1基因(AcBIVVBa c.Polh.GPV.NS1Tn7)。图18B示出了AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.GPVΔ120.ITRTn7和Ac BIVVBac.Polh.GPV.NS1Tn7 BEV的示意性图谱。图18C是从以如指示的AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.GPVΔ120.ITRTn7和AcBIVVBac.Polh.GPV.NS1Tn7 BEV的不同MOI共感染的Sf9细胞中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于FVIIIXTEN ceDNA载体(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DNA条带由箭头指示。
图19A至图19C示出了根据本发明的一个实施方案从AAV2稳定细胞系产生人FVIIIXTEN ceDNA载体。图19A示出了FVIIIXTEN ceDNA载体产生的稳定细胞系方法的示意图，其中将编码包含V2.0 FVIIIXTEN且侧接有AAV2 WT ITR的FVIIIXTEN表达盒的稳定细胞系用编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的AAV2 Rep基因的重组BEV(AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7)感染。图19B示出了AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV的示意性图谱。图19C是从以如指示的AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7 BEV的不同MOI感染的AAV2稳定细胞系中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于FVIIIXTEN ceDNA载体(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DNA条带由箭头指示。
图20A至图20C示出了根据本发明的一个实施方案从B19稳定细胞系产生人FVIIIXTEN ceDNA载体。图20A示出了FVIIIXTEN ceDNA载体产生的稳定细胞系方法的示意图，其中将编码包含V2.0 FVIIIXTEN且侧接有B19最小型ITR的FVIIIXTEN表达盒的稳定细胞系用编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的B19 NS1基因的重组BEV(AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7)感染。图20B示出了AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7 BEV的示意性图谱。图20C是从以如指示的AcBIVVBac.Polh.B19.NS1Tn7 BEV的不同MOI感染的B19稳定细胞系中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于FVIIIXTEN ceDNA载体(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DNA条带由箭头指示。
图21A至图21C示出了根据本发明的一个实施方案从GPV稳定细胞系产生人FVIIIXTEN ceDNA载体。图21A示出了FVIIIXTEN ceDNA载体产生的稳定细胞系方法的示意图，其中将编码包含V2.0 FVIIIXTEN且侧接有GPVΔ120ITR的FVIIIXTEN表达盒的稳定细胞系用编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的GPV NS1基因的重组BEV(AcBIVVBac.Polh.GPV.NS1Tn7)感染。图21B示出了AcBIVVBac.Polh.GPV.NS1Tn7 BEV的示意性图谱。图21C是从以如指示的AcBIVVBac.Polh.GPV.NS1Tn7 BEV的不同MOI感染的GPV稳定细胞系中分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于FVIIIXTEN ceDNA载体(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DNA条带由箭头指示。
图22A至图22E示出了根据本发明的一个实施方案使用双BAC方法产生和纯化FVIIIXTEN ceDNA载体的工作流程。图22A示出了Sf9细胞扩增和持续时间(第0-2天)的示意图，其中将细胞从小规模(0.5L)到大规模培养(1.5L)烧瓶依次放大以在无血清ESF921培养基中实现2.5至3.0x106/mL的细胞密度。图22B示出了Sf9大型培养(1.5L)烧瓶感染和孵育持续时间(第2-6天)的示意图，其中将细胞分别以0.1和0.01噬斑形成单位(pfu)/细胞的MOI用重组BEV共感染，所述重组BEV编码包含V2.0 FVIIIXTEN且侧接有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表达盒(AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRTn7)和/或编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的HBoV1 NS1基因(AcBIVVBac.Polh.HBo V1.NS1Tn7)。图22C示出了质粒GigaPrep纯化试剂盒和琼脂糖凝胶电泳以及处理持续时间(第6-7天)的图像，其中每日测量感染细胞的细胞密度和活力，并且一旦细胞活力达到70％-80％，就通过低速离心沉淀细胞。通过PureLinkTM HiPure Expi质粒Gigaprep试剂盒(Invitrogen)将FVIIIXTEN ceDNA载体从感染细胞沉淀中纯化，并且在琼脂糖凝胶电泳上运行等分试样以确定FVIIIXTEN ceDNA(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和/或Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的生产力。图22D示出了Bio-Rad 491型制备槽(Prep Cell)和琼脂糖凝胶电泳以及处理持续时间(第7-12天)的图像，其中将Giga-prep纯化的DNA加载到制备槽中的制备型琼脂糖凝胶上以将FVIIIXTEN ceDNA(约8.5kb片段)从高分子量DNA中分离。在0.8％至1.2％琼脂糖凝胶上分析以70-80min间隔从制备型琼脂糖凝胶电泳中收集的洗脱级分，以确定FVIIIXTEN ceDNA的纯度。图22E示出了琼脂糖凝胶电泳的图像，其中将从制备槽收集的级分合并，并且用1/10体积的3M NaOAc(pH 5.5)和3体积的100％乙醇沉淀以获得纯化的FVIIIXTEN ceDNA。凝胶图像示出了与起始材料相比FVIIIXTEN ceDNA的纯度，其中箭头指示对应于FVIIIXTEN ceDNA载体(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DNA条带。
图23示出了通过ChromogenixSP因子VIII生色测定测量的血浆FVIII活性水平的图示。图23示出了在以不同间隔从hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠收集的血液样品中测量的血浆FVIII活性水平的图解绘图，经由流体动力学尾静脉注射向所述小鼠全身性地注射80、40或12μg/kg的FVIIIXTEN HBoV1(wtHBoV1)或AAV2(wtAAV2)ITR ceDNA。
图24A-图24C示出了根据本发明的一个实施方案使用单BAC方法产生人FVIIIXTEN ceDNA载体。图24A是使用重组BEV在Sf9细胞中产生FVIIIXTEN ceDNA载体的单BAC方法的示意图，所述重组BEV编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的HBoV1 NS1基因和两侧为HBoV1 ITR的人FVIIIXTEN表达盒(AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1LoxP)。图24B示出了AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1LoxP BEV的示意性图谱。图24C是从用(AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1LoxP)BEV的滴定病毒原液(P2)感染的Sf9细胞分离的ceDN A载体的琼脂糖凝胶电泳图像。对应于FVIIIXTEN ceDNA(ceDNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DNA条带由箭头指示。
图25A-图25C示出了根据本发明的一个实施方案使用双BAC方法产生人FVIIIXTEN ceDNA载体。图25A是产生FVIIIXTEN ceDNA载体的双BAC方法的示意图，其中用重组BEV共感染Sf9细胞，所述重组BEV编码两侧为HBoV1 ITR的FVIIIXTEN表达盒(AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRsTn7)和/或编码在AcMNPV多角体蛋白启动子下的HBoV1 NS1基因(AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1Tn7)。图25B示出了AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRsTn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1Tn7 BEV的示意性图谱。图25C是从Sf9细胞分离的ceDNA载体的琼脂糖凝胶电泳图像，所述Sf9细胞用所指示的AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRsTn7和AcBIVVBac.Polh.HBoV1.NS1Tn7 BEV以恒定比率的不同MOI或恒定MOI的不同比率共感染。对应于FVIIIXTEN ceDNA载体(ce DNA)、杆状病毒DNA(vDNA)和Sf9细胞基因组DNA(gDNA)的大小的DNA条带由箭头指示。
具体实施方式
本文提供了一种适合于表达两种或更多种外来序列的杆状病毒表达载体系统。还提供了使用本文所述的杆状病毒表达载体系统例如产生ceDNA的方法。
I.定义
应注意，术语“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”实体是指一个/一种或多个/多种所述实体：例如，“一个核苷酸序列”应理解为代表一个或多个核苷酸序列。类似地，“一种治疗性蛋白质”和“一种miRNA”应理解为分别代表一种或多种治疗性蛋白质和一种或多种miRNA。因此，术语“一个/一种(a)”(或“一个/一种(an)”)、“一个/一种或多个/多种”和“至少一个/一种”在本文中可互换使用。
术语“约”在本文中用于意指大约、大致、大约地或在……左右。在术语“约”结合数字范围使用时，其通过扩展所述数值上下的边界来修饰所述范围。通常，术语“约”在本文中用于向上或向下(较高或较低)以10％的差异修饰高于和低于所述值的数值。
同样如本文所用，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关列示项目的任何和所有可能组合，以及在替代方案(“或”)中解释时组合的缺少。
“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸”、“一个或多个核苷酸的序列”和“多核苷酸”可互换使用并且是指呈单链形式或双链螺旋的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式或其任何磷酸酯类似物，如硫代磷酸酯和硫代酸酯。单链核酸序列是指单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子、特别是DNA或RNA分子仅仅是指分子的一级和二级结构，并且不将其限制为任何特定三级形式。因此，这个术语包括尤其在线性或环状DNA分子(例如，限制性片段)、质粒、超螺旋化DNA和染色体中发现的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，在本文中可以根据常规习惯描述序列，仅沿DNA的非转录链(即，具有与mRNA同源的序列的链)以5’至3’方向给出序列。“重组DNA分子”是已经经历分子生物学操纵的DNA分子。DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。本公开文本的“核酸组合物”包含如本文所述的一种或多种核酸。
如本文所用，“反向末端重复序列”(或“ITR”)是指位于单链核酸序列的5'端或3'端的核酸子序列，其包含一组核苷酸(初始序列)，之后下游是其反向互补体，即回文序列。初始序列与反向互补体之间的间插核苷酸序列可以具有任何长度，包括零。在一个实施方案中，可用于本公开文本的ITR包含一个或多个“回文序列”。ITR可以具有任何数目的功能。在一些实施方案中，本文所述的ITR形成发夹结构。在一些实施方案中，ITR形成T形发夹结构。在一些实施方案中，ITR形成非T形发夹结构，例如U形发夹结构。在一些实施方案中，ITR促进核酸分子在细胞的细胞核中的长期存活。在一些实施方案中，ITR促进核酸分子在细胞的细胞核中的永久存活(例如，持续细胞的整个寿命)。在一些实施方案中，ITR促进核酸分子在细胞的细胞核中的稳定性。在一些实施方案中，ITR促进核酸分子在细胞的细胞核中的保留。在一些实施方案中，ITR促进核酸分子在细胞的细胞核中的持久性。在一些实施方案中，ITR抑制或防止核酸分子在细胞的细胞核中的降解。
因此，如本文所用的“ITR”可以折叠回于自身并形成双链区段。例如，在折叠形成双螺旋时，序列GATCXXXXGATC包含GATC的初始序列及其互补体(3'CTAG5')。在一些实施方案中，ITR包含初始序列与反向互补体之间的连续回文序列(例如，GATCGATC)。在一些实施方案中，ITR包含初始序列与反向互补体之间的中断的回文序列(例如，GATCXXXXGATC)。在一些实施方案中，连续或中断的回文序列的互补部分彼此相互作用以形成“发夹环”结构。如本文所用，在单链核苷酸分子上的至少两个互补序列碱基配对形成双链部分时，产生“发夹环”结构。在一些实施方案中，仅ITR的一部分形成发夹环。在其他实施方案中，整个ITR形成发夹环。
在本公开文本中，至少一个ITR是非腺病毒相关病毒(非AAV)的ITR。在某些实施方案中，ITR是病毒科细小病毒科的非AAV成员的ITR。在一些实施方案中，ITR是依赖病毒属(Dependovirus)或红病毒属(Erythrovirus)的非AAV成员的ITR。在特定实施方案中，ITR是以下病毒的ITR：鹅细小病毒(GPV)、番鸭细小病毒(MDPV)或红病毒属细小病毒B19(也称为细小病毒B19-本文中也称为“B19”、灵长类红细小病毒1、B19病毒和红病毒)。在某些实施方案中，两个ITR中的一个ITR是AAV的ITR。在其他实施方案中，构建体中两个ITR中的一个ITR是选自以下的AAV血清型的ITR：血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11及其任何组合。在一个特定实施方案中，ITR衍生自AAV血清型2，例如AAV血清型2的ITR。
在本公开文本的某些方面中，核酸分子包含两个ITR 5'ITR和3'ITR，其中5'ITR位于核酸分子的5'末端，并且3'ITR位于核酸分子的3'末端。5'ITR和3'ITR可以衍生自相同病毒或不同病毒。在某些实施方案中，5'ITR衍生自AAV并且3'ITR并非衍生自AAV病毒(例如，非AAV)。在一些实施方案中，3'ITR衍生自AAV并且5'ITR并非衍生自AAV病毒(例如，非AAV)。在其他实施方案中，5'ITR并非衍生自AAV病毒(例如，非AAV)，并且3'ITR衍生自相同或不同的非AAV病毒。
如本文所用的术语“细小病毒”涵盖细小病毒科，包括但不限于自主复制的细小病毒和依赖病毒。自主细小病毒包括例如以下属的成员：博卡病毒属(Bocavirus)、依赖病毒属、红病毒属、阿留申病毒属(Amdovirus)、细小病毒属(Parvovirus)、浓核病毒属(Densovirus)、重复病毒属(Iteravirus)、康特拉病毒属(Contravirus)、禽细小病毒属(Aveparvovirus)、反刍类细小病毒属(Copiparvovirus)、原细小病毒属(Protoparvovirus)、四型细小病毒属(Tetraparvovirus)、双义浓核病毒属(Ambidensovirus)、短浓核病毒属(Brevidensovirus)、肝胰浓核病毒属(Hepandensovirus)和对虾浓核病毒属(Penstyldensovirus)。
示例性自主细小病毒包括但不限于猪细小病毒、小鼠微小病毒、犬细小病毒、水貂肠炎病毒、牛细小病毒、鸡细小病毒、猫瘟病毒、猫细小病毒、鹅细小病毒、H1细小病毒、番鸭细小病毒、蛇细小病毒和B19病毒。其他自主细小病毒是本领域技术人员已知的。参见例如FIELDS等人VIROLOGY,第2卷,第69章(第4版,Lippincott-Raven Publishers)。
如本文所用的术语“非AAV”涵盖来自细小病毒科的核酸、蛋白质和病毒，不包括细小病毒科的任何腺相关病毒(AAV)。“非AAV”包括但不限于以下属的自主复制成员：博卡病毒属、依赖病毒属、红病毒属、阿留申病毒属、细小病毒属、浓核病毒属、重复病毒属、康特拉病毒属、禽细小病毒属、反刍类细小病毒属、原细小病毒属、四型细小病毒属、双义浓核病毒属、短浓核病毒属、肝胰浓核病毒属和对虾浓核病毒属。
如本文所用，术语“腺相关病毒”(AAV)包括但不限于AAV 1型、AAV 2型、AAV 3型(包括3A型和3B型)、AAV 4型、AAV 5型、AAV 6型、AAV 7型、AAV 8型、AAV 9型、AAV 10型、AAV11型、AAV 12型、AAV 13型、蛇AAV、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、绵羊AAV、山羊AAV、虾AAV、Gao等人(J.Virol.78:6381(2004))和Moris等人(Virol.33:375(2004))所披露的那些AAV血清型和进化枝以及目前已知或将来发现的任何其他AAV。参见例如FIELDS等人VIROLOGY,第2卷,第69章(第4版,Lippincott-Raven Publishers)。
如本文所用，术语“衍生自”是指组分从指定分子或生物体分离或使用指定分子或生物体制备，或者信息(例如，氨基酸或核酸序列)来自指定分子或生物体。例如，衍生自第二核酸序列(例如，ITR)的核酸序列(例如，ITR)可以包括与第二核酸序列的核苷酸序列相同或基本上相似的核苷酸序列。在核苷酸或多肽的情况下，衍生的物质可以通过例如天然存在的诱变、人工定向诱变或人工随机诱变来获得。用于衍生核苷酸或多肽的诱变可以是有意定向的或有意随机的，或者是各自的混合。诱变核苷酸或多肽以产生衍生自第一核苷酸或多肽的不同核苷酸或多肽可以是随机事件(例如，由于聚合酶失真而引起)，并且所衍生的核苷酸或多肽的鉴定可以通过适当的筛选方法(例如，如本文所讨论)来进行。多肽的诱变通常需要操纵编码多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，衍生自第二核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列分别与第二核苷酸或氨基酸序列具有至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中第一核苷酸或氨基酸序列保留第二核苷酸或氨基酸序列的生物学活性。在其他实施方案中，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR与非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)至少90％相同，其中非AAV(或AAV)ITR保留非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的功能特性。在一些实施方案中，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR与非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)至少80％相同，其中非AAV(或AAV)ITR保留非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的功能特性。在一些实施方案中，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR与非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)至少70％相同，其中非AAV(或AAV)ITR保留非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的功能特性。在一些实施方案中，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR与非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)至少60％相同，其中非AAV(或AAV)ITR保留非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的功能特性。在一些实施方案中，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR与非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)至少50％相同，其中非AAV(或AAV)ITR保留非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的功能特性。
在某些实施方案中，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR包含非AAV(或AAV)的ITR的片段或由所述片段组成。在一些实施方案中，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR包含非AAV(或AAV)的ITR的片段或由所述片段组成，其中所述片段包含至少约5个核苷酸、至少约10个核苷酸、至少约15个核苷酸、至少约20个核苷酸、至少约25个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约35个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约45个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约55个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约65个核苷酸、至少约70个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约80个核苷酸、至少约85个核苷酸、至少约90个核苷酸、至少约95个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约125个核苷酸、至少约150个核苷酸、至少约175个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约225个核苷酸、至少约250个核苷酸、至少约275个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约325个核苷酸、至少约350个核苷酸、至少约375个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约425个核苷酸、至少约450个核苷酸、至少约475个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约525个核苷酸、至少约550个核苷酸、至少约575个核苷酸或至少约600个核苷酸；其中衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR保留非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的功能特性。在某些实施方案中，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR包含非AAV(或AAV)的ITR的片段或由所述片段组成，其中所述片段包含至少约129个核苷酸，并且其中衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR保留非AAVITR(或分别地，AAV ITR)的功能特性。在某些实施方案中，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR包含非AAV(或AAV)的ITR的片段或由所述片段组成，其中所述片段包含至少约102个核苷酸，并且其中衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR保留非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的功能特性。
在一些实施方案中，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR包含非AAV(或AAV)的ITR的片段或由所述片段组成，其中所述片段包含非AAV(或AAV)的ITR的长度的至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％。
在某些实施方案中，在正确比对时，衍生自第二核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列分别与第二核苷酸或氨基酸序列的同源部分具有至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，其中第一核苷酸或氨基酸序列保留第二核苷酸或氨基酸序列的生物学活性。在其他实施方案中，在正确比对时，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR与非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的同源部分至少90％相同，其中第一核苷酸或氨基酸序列保留第二核苷酸或氨基酸序列的生物学活性。在一些实施方案中，在正确比对时，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR与非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的同源部分至少80％相同，其中第一核苷酸或氨基酸序列保留第二核苷酸或氨基酸序列的生物学活性。在一些实施方案中，在正确比对时，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR与非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的同源部分至少70％相同，其中第一核苷酸或氨基酸序列保留第二核苷酸或氨基酸序列的生物学活性。在一些实施方案中，在正确比对时，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR与非AAV ITR(或分别地，AAV ITR)的同源部分至少60％相同，其中第一核苷酸或氨基酸序列保留第二核苷酸或氨基酸序列的生物学活性。在一些实施方案中，在正确比对时，衍生自非AAV(或AAV)的ITR的ITR与非AAV ITR(或分别地，AAVITR)的同源部分至少50％相同，其中第一核苷酸或氨基酸序列保留第二核苷酸或氨基酸序列的生物学活性。
“无衣壳(capsid-free)”或“无衣壳(capsid-less)”载体或核酸分子是指不具有衣壳的载体构建体。在一些实施方案中，无衣壳载体或核酸分子不含编码例如AAV Rep蛋白的序列。在一些实施方案中，无衣壳(capsid-free)或无衣壳(capsid-less)载体可以包含共价封闭端，在本文中称为“封闭端DNA(ceDNA)”。通常，本文所述的ceDNA可以使用本发明的杆状病毒表达系统产生，并且ceDNA通常包含至少一种编码异源基因产物的核酸，所述核酸在任一侧侧接有ITR(例如，AAV或非AAV ITR)。
如本文所用，“编码区”或“编码序列”是多核苷酸中由可翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)通常不翻译成氨基酸，但是可以认为其是编码区的一部分，但是任何侧接序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等)不是编码区的一部分。编码区的边界通常由5’末端的起始密码子(编码所得多肽的氨基末端)和3’末端的翻译终止密码子(编码所得多肽的羧基末端)来决定。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中(例如，在单一载体上)，或者存在于单独的多核苷酸构建体中(例如，在单独的(不同的)载体上)。然后，结果就是单一载体可以仅含有单个编码区，或者包含两个或更多个编码区。
哺乳动物细胞分泌的某些蛋白质与分泌信号肽相关，一旦生长中的蛋白质链跨越糙面内质网的输出已经起始所述分泌信号肽便从成熟蛋白质被切割下来。本领域普通技术人员知道，信号肽通常融合至多肽的N末端，并且从完整或“全长”多肽被切割下来以产生多肽的分泌或“成熟”形式。在某些实施方案中，天然信号肽或该序列的保留指导多肽分泌的能力的功能衍生物与所述多肽可操作地缔合。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽(例如，人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶信号肽)或其功能衍生物。
术语“下游”是指核苷酸序列位于参考核苷酸序列的3’。在某些实施方案中，下游核苷酸序列是指转录起点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。
术语“上游”是指核苷酸序列位于参考核苷酸序列的5’。在某些实施方案中，上游核苷酸序列是指位于编码区或转录起点的5’侧的序列。例如，大多数启动子位于转录起始位点的上游。
如本文所用，术语“基因盒”或“表达盒”意指能够指导特定多核苷酸序列在适当的宿主细胞中表达的DNA序列，其包含与感兴趣多核苷酸序列可操作地连接的启动子。基因盒可以涵盖位于编码区上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，且影响相关编码区的转录、RNA加工、稳定性或翻译的核苷酸序列。如果意图在真核细胞中表达编码区，则多腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3’。在一些实施方案中，基因盒包含编码基因产物的多核苷酸。在一些实施方案中，基因盒包含编码miRNA的多核苷酸。在一些实施方案中，基因盒包含异源多核苷酸序列。
编码产物(例如，miRNA或基因产物(例如，多肽，如治疗性蛋白质))的多核苷酸可以包括与一个或多个编码区可操作地缔合的启动子和/或其他表达(例如，转录或翻译)控制序列。在可操作缔合中，以将基因产物的表达置于一个或多个调节区的影响或控制下的方式将基因产物(例如，多肽)的编码区与所述一个或多个调节区缔合。例如，如果启动子功能的诱导导致编码基因产物(由编码区编码)的mRNA的转录，并且如果启动子与编码区之间的连接的性质确实不会干扰启动子指导基因产物表达的能力或干扰DNA模板转录的能力，则编码区和启动子是“可操作地缔合”。除了启动子以外的其他表达控制序列(例如，增强子、操纵子、阻遏物和转录终止信号)也可以与编码区可操作地缔合以指导基因产物表达。
“表达控制序列”是指提供编码序列在宿主细胞中的表达的调节核苷酸序列，如启动子、增强子、终止子等。表达控制序列通常涵盖有助于与其可操作地连接的编码核酸的有效转录和翻译的任何调节核苷酸序列。表达控制序列的非限制性实例包括启动子、增强子、翻译前导序列、内含子、多腺苷酸化识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点或茎环结构。多种表达控制序列是本领域技术人员已知的。这些包括而不限于在脊椎动物细胞中起作用的表达控制序列，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子片段(即早期启动子，与内含子A结合)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳斯肉瘤病毒)。其他表达控制序列包括衍生自脊椎动物基因的那些，如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β珠蛋白，以及能够控制真核细胞中基因表达的其他序列。另外的合适的表达控制序列包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如可由干扰素或白介素诱导的启动子)。其他表达控制序列包括内含子序列、转录后调节元件和多腺苷酸化信号。在本公开文本的其他地方讨论了另外的示例性表达控制序列。
类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。
如本文所用的术语“表达”是指多核苷酸产生基因产物(例如RNA或多肽)的过程。它包括而不限于将多核苷酸转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物以及将mRNA翻译为多肽。表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸，例如通过基因转录产生的信使RNA，或者是从转录物翻译的多肽。本文描述的基因产物还包括经过转录后修饰(例如多腺苷酸化或剪接)的核酸，或经过翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、脂质的添加、与其他蛋白质亚基缔合或蛋白水解切割)的多肽。如本文所用，术语“产量”是指通过基因表达产生的多肽的量。
“载体”是指用于将核酸克隆和/或转移到宿主细胞中的任何媒介物。载体可以是复制子，另一核酸区段可以与其连接以实现所连接区段的复制。“复制子”是指在体内起自主复制单元的作用(即，能够在其自身控制下复制)的任何基因元件(例如，质粒、噬菌体、粘粒、染色体、病毒)。术语“载体”包括在体外、离体或在体内将核酸引入细胞中的媒介物。很多载体是本领域已知和使用的，包括例如质粒、经修饰的真核病毒或经修饰的细菌病毒。通过将适当的多核苷酸片段连接到具有互补粘性末端的选择载体中，可以实现将多核苷酸插入合适的载体中。
可以对载体进行工程化以编码选择性标记或报告物，其提供对已经并入载体的细胞的选择或鉴定。选择性标记或报告物的表达允许鉴定和/或选择并入并表达含于载体上的其他编码区的宿主细胞。本领域中已知并使用的选择性标记基因的例子包括：提供针对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨磷除草剂、磺酰胺等的抗性的基因；和用作表型标记的基因，即花色苷调节基因、异戊烷基转移酶基因等。本领域中已知并使用的报告物的例子包括：萤光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。还可以将选择性标记视为报告物。
如本文所用的术语“宿主细胞”是指例如可以或已经用作ssDNA或载体的接受者的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。所述术语包括已经转导的初始细胞的后代。因此，如本文所用的“宿主细胞”通常是指已经用外源DNA序列转导的细胞。应理解，由于天然、偶然或刻意突变，单个亲代细胞的后代的形态或基因组或总DNA互补体可能不一定与初始亲代完全相同。在一些实施方案中，宿主细胞可以是体外宿主细胞。
术语“选择性标记”是指能够基于标记基因的效应(即，对抗生素的抗性、对除草剂的抗性、比色标记、酶、荧光标记等)加以选择的鉴定因子(通常是抗生素或化学抗性基因)，其中所述效应用于跟踪感兴趣核酸的遗传和/或鉴定已经遗传感兴趣核酸的细胞或生物体。本领域中已知并使用的选择性标记基因的例子包括：提供针对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨磷除草剂、磺酰胺等的抗性的基因；和用作表型标记的基因，即花色苷调节基因、异戊烷基转移酶基因等。
术语“报告基因”是指编码能够基于报告基因的效应加以鉴定的鉴定因子的核酸，其中所述效应用于跟踪感兴趣核酸的遗传性、鉴定已经遗传感兴趣核酸的细胞或生物体和/或测量基因表达诱导或转录。本领域中已知并使用的报告基因的例子包括：萤光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。也可以将选择性标记基因视为报告基因。
“启动子”与“启动子序列”可互换使用并且是指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以整体衍生自天然基因，或者由衍生自在自然界中发现的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成DNA区段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应不同环境或生理条件而表达。使基因在大多数细胞类型中在大多数时间表达的启动子一般被称为“组成型启动子”。使基因在特定细胞类型中表达的启动子一般被称为“细胞特异性启动子”或“组织特异性启动子”。使基因在发育或细胞分化的特定阶段表达的启动子一般被称为“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。在用诱导启动子的试剂、生物分子、化学品、配体、光等暴露或处理细胞后被诱导并且使基因表达的启动子一般被称为“诱导型启动子”或“可调型启动子”。还认识到，由于在大多数情况下，尚未完全界定调节序列的确切边界，所以不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。
启动子序列通常在其3’末端以转录起始位点为界，并向上游(5’方向)延伸以包括以高于背景的可检测水平起始转录所必需的最小数目的碱基或元件。在启动子序列内将发现转录起始位点(例如通过用核酸酶S1标示(mapping)方便地界定)以及负责RNA聚合酶的结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。
在一些实施方案中，核酸分子包含组织特异性启动子。在某些实施方案中，组织特异性启动子驱动治疗性蛋白质(例如，凝血因子)在肝脏中(例如，在肝细胞和/或内皮细胞中)的表达。在特定实施方案中，启动子选自小鼠甲状腺素转运蛋白启动子(mTTR)、天然人因子VIII启动子、人α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、人白蛋白最小启动子、小鼠白蛋白启动子、三重四脯氨酸(tristetraprolin，TTP)启动子、CASI启动子、CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子及其任何组合。在一些实施方案中，启动子选自肝脏特异性启动子(例如，α1-抗胰蛋白酶(AAT))、肌肉特异性启动子(例如，肌肉肌酸激酶(MCK)、肌球蛋白重链α(αMHC)、肌红蛋白(MB)和结蛋白(DES))、合成启动子(例如，SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK和tMCK)及其任何组合。在一个特定实施方案中，启动子包含TTP启动子。
术语“限制性内切核酸酶”与“限制性酶”可互换使用并且是指在双链DNA内的特定核苷酸序列内结合并切割的酶。
术语“质粒”是指染色体外元件，其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是衍生自任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性、环状或超螺旋化的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中多个核苷酸序列已经接合或重组至独特构建体中，所述构建体能够将用于所选基因产物的启动子片段和DNA序列以及适当的3'非翻译序列引入细胞中。
可以使用的真核病毒载体包括但不限于腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒(例如，痘苗病毒载体)、杆状病毒载体或疱疹病毒载体。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物和生物聚合物。
“克隆载体”是指“复制子”，其是单位长度的连续复制的核酸并且其包含复制起点，如质粒、噬菌体或粘粒，另一核酸区段可以与所述复制子连接以实现所连接区段的复制。某些克隆载体能够在一种细胞类型(例如，细菌)中复制，并在另一细胞类型(例如，真核细胞)中表达。克隆载体通常包含一个或多个可以用于选择包含载体的细胞的序列和/或一个或多个用于插入感兴趣核酸序列的多克隆位点。
术语“表达载体”是指设计为使得所插入核酸序列在插入宿主细胞中之后能够表达的媒介物。将所插入核酸序列以如上所述的与调节区可操作地缔合地放置。
通过本领域熟知的方法将载体引入宿主细胞中，所述方法是例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体转染(溶酶体融合)、使用基因枪或DNA载体转运蛋白。如本文所用，“培养”(“culture”，“to culture”和“culturing”)意指在体外条件下孵育细胞，所述条件允许细胞生长或分裂或使细胞维持存活状态。如本文所用，“培养的细胞”是指体外繁殖的细胞。
如本领域中已知的术语“同一性百分比”是两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较序列所确定。在本领域中，根据具体情况，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列关联性程度，如通过此类序列的串之间的匹配所确定。“同一性”可以通过已知方法容易地计算，所述已知方法包括但不限于：Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.编)Oxford University Press,New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.编)AcademicPress,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I(Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编)Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology(von Heinje,G.编)Academic Press(1987)；以及Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.和Devereux,J.编)Stockton Press,New York(1991)。确定同一性的优选方法设计为给出所测试序列之间的最佳匹配。确定同一性的方法被编纂于可公开获得的电脑程序中。序列比对和同一性百分比计算可以使用序列分析软件来进行，所述序列分析软件是例如LASERGENE生物信息学计算套件的Megalign程序(DNASTAR Inc.，威斯康星州麦迪逊市)、GCG程序套件(Wisconsin Package 9.0版，Genetics Computer Group(GCG)，威斯康星州麦迪逊市)、BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403(1990))和DNASTAR(DNASTAR,Inc.1228S.Park St.威斯康星州麦迪逊市53715美国)。在本申请的上下文中将理解，如果使用序列分析软件进行分析，除非另外指定，否则分析结果将基于所参考程序的“缺省值”。如本文所用的“缺省值”将意指在首次初始化时最初用软件加载的任一组值或参数。
如本文所用，对应于本公开文本的特定序列中的核苷酸的核苷酸是通过比对本公开文本的序列以最大化与参考序列的同一性来鉴定。用于鉴定参考序列中的等效氨基酸的编号是基于用于鉴定本公开文本的序列中的相应氨基酸的编号。
如本文所用，术语“异源的”或“外源的”是指此类分子通常在给定背景下(例如，在细胞中或在多肽中)未发现。例如，可以将外源或异源分子引入细胞中并且仅在例如通过转染或其他形式的遗传工程化操纵细胞之后存在，或者异源氨基酸序列可以存在于其天然不存在的蛋白质中。
如本文所用，术语“异源核苷酸序列”是指不与给定多核苷酸序列一起天然存在的核苷酸序列。在一个实施方案中，异源核苷酸序列编码能够延长治疗性蛋白质(例如，凝血因子，例如FVIII)的半衰期的多肽。在另一个实施方案中，异源核苷酸序列编码增加治疗性蛋白质(例如，凝血因子，例如FVIII)的流体力学半径的多肽。在其他实施方案中，异源核苷酸序列编码改善治疗性蛋白质的一种或多种药物代谢动力学特性但不显著影响其生物学活性或功能(例如，促凝血活性)的多肽。在一些实施方案中，治疗性蛋白质通过接头与异源核苷酸序列编码的多肽连接或相连。异源核苷酸序列编码的多肽部分的非限制性例子尤其包括免疫球蛋白恒定区或其部分、白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、转铁蛋白、美国专利申请号20100292130的PAS多肽、HAP序列、转铁蛋白或其片段、人绒毛膜促性腺激素的β亚基的C末端肽(CTP)、白蛋白结合小分子、XTEN序列、FcRn结合部分(例如，完整Fc区或其结合至FcRn的部分)、单链Fc区(ScFc区，例如如US2008/0260738、WO 2008/012543或WO 2008/1439545中所述)、聚甘氨酸接头、聚丝氨酸接头、选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的两种类型氨基酸的6-40个氨基酸的肽和短多肽(具有从小于50％至大于50％变化的二级结构程度)、或其两个或更多个组合。在一些实施方案中，异源核苷酸序列编码的多肽连接至非多肽部分。非多肽部分的非限制性例子包括聚乙二醇(PEG)、白蛋白结合小分子、聚唾液酸、羟乙基淀粉(HES)、其衍生物或其任何组合。
如本文所用，关于核苷酸序列的术语“优化”是指编码多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列已经突变以增强所述多核苷酸序列的特性。在一些实施方案中，进行优化以增加转录水平、增加翻译水平、增加稳态mRNA水平、增加或减少调节蛋白(如通用转录因子)的结合、增加或减少剪接或增加多核苷酸序列产生的多肽的产量。可以对多核苷酸序列进行以使其优化的变化的例子包括密码子优化、G/C含量优化、去除重复序列、去除富含AT的元件、去除隐蔽剪接位点、去除阻遏转录或翻译的顺式作用元件、添加或去除多T或多A序列、在转录起始位点周围添加增强转录的序列(如Kozak共有序列)、去除可以形成茎环结构的序列、去除去稳定序列及其两个或更多个组合。
如本文所用，术语“杆粒”是指可以在大肠杆菌和昆虫细胞两者中繁殖的穿梭载体。重组杆粒是指包含异源序列(例如，编码异源基因的异源序列)的杆粒。
II.杆状病毒表达载体系统
本文提供了一种杆状病毒表达载体系统，其包含杆状病毒穿梭载体(杆粒)和/或经工程化以产生治疗性药物产品的稳定细胞系。本文提供的杆状病毒表达载体系统包含含有两个或更多个外来序列插入位点的重组杆粒，和一个或多个能够介导外来序列(例如，异源基因)插入所述外来序列插入位点中的供体载体。
在一些实施方案中，治疗性药物产品是蛋白质。在一些实施方案中，治疗性药物产品是核酸。在一些实施方案中，治疗性药物产品是重组蛋白，其可用于例如各种应用，包括疫苗、蛋白质替代疗法(例如，酶替代疗法)以及用于基础和应用研究的重组蛋白。在某些实施方案中，治疗性药物产品是DNA治疗性药物物质，其是编码靶序列的质粒样、无衣壳的核酸分子。DNA治疗性药物物质可以是共价封闭端DNA(ceDNA)的形式。通常，ceDNA包含位于第一反向末端重复序列(5’ITR)与第二ITR(3’ITR)之间的治疗性蛋白质编码基因。
在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR是腺相关病毒(AAV)ITR或非AAV ITR。在某些实施方案中，非AAV ITR是从病毒科细小病毒科的成员获得的ITR。合适的ITR序列包括本领域技术人员已知的AAV血清型的AAV ITR。合适的AAV和非AAV ITR序列描述于PCT公开号WO2019032898A1、WO 2020033863A1和WO 2017152149A1中，将所述专利的公开内容通过引用以其整体并入本文。例如，非AAV ITR序列可以衍生自鹅细小病毒(GPV)或细小病毒B19(本文中也称为“B19”)。
A.杆状病毒穿梭载体(杆粒)
杆状病毒是最突出的感染昆虫的病毒。已鉴定出超过500种杆状病毒分离株，其中大部分源自鳞翅目(Lepidoptera)的昆虫。两种最常见的分离株是苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核多角体病毒(AcMNPV)和家蚕(Bombyx mori)核多角体病毒(BmNPV)。在生产用于基因疗法的病毒或非病毒载体时，通常需要将几种杆状病毒表达载体感染到昆虫宿主细胞中。每一种杆状病毒表达载体的产生是耗时的，并且抬高了生产成本，这代表了本发明之前的杆状病毒表达载体系统的显著缺点。
在某些实施方案中，本文提供的杆状病毒表达载体系统包含重组杆粒，本文中称为“BIVVBac”。BIVVBac的代表性示意图示于图1C中。在某些实施方案中，BIVVBac是经基因修饰的AcMNPV，其包含至少两个外来序列插入位点。包含含有至少两个外来序列插入位点的杆粒的杆状病毒表达载体系统允许减少需要产生的杆状病毒表达载体的总数。在一些实施方案中，需要本发明的单一杆状病毒表达载体来产生基因疗法载体。
在某些实施方案中，BIVVBac包含第一外来序列插入位点和第二外来序列插入位点。第一外来序列插入位点和第二外来序列插入位点可以是不同的，从而利用不同的机制来驱动外来序列(例如，异源序列、异源基因)的插入。外来序列的插入可以由本领域已知的任何方法驱动。例如，可以通过转座或位点特异性重组来插入外来序列。可以将外来序列插入位点设计为包含在报告基因内，使得在插入外来序列后，报告基因被破坏。报吿基因的破坏可有助于鉴定其中插入了外来序列的杆粒克隆。在此类实施方案中，将外来序列插入位点与报告基因框内融合，或者将报告基因与外来序列插入位点框内融合。
在某些实施方案中，第一外来序列插入位点和第二外来序列插入位点位于AcMNPV内的不同基因座中。在某些实施方案中，第一外来序列插入位点和第二外来序列插入位点位于AcMNPV内的不同非必需基因座中。AcMNPV的各种非必需基因座是本领域技术人员已知的。例如，多角体蛋白基因和EGT基因是昆虫细胞中病毒复制的非必需AcMNPV基因。因此，在某些实施方案中，第一外来序列插入位点位于AcMNPV的多角体蛋白基因座中，并且第二外来序列插入位点位于AcMNPV的EGT基因座中。
在某些实施方案中，第一外来序列插入位点允许经由转座插入外来序列。在某些实施方案中，第一外来序列插入位点包含用于插入转座子的优先靶位点。在某些实施方案中，第一外来序列插入位点是用于插入转座子的优先靶位点。在某些实施方案中，第一外来序列插入位点是作为细菌转座子的附着位点的优先靶位点。合适的细菌转座子及其相应的附着位点是本领域技术人员已知的。例如，转座子Tn7以其高频率转座到细菌染色体的特定位点(attTn7)的能力而闻名。因此，在某些实施方案中，第一外来序列插入位点是作为Tn7转座子的附着位点的优先靶位点(例如，attTn7)。在一些实施方案中，第一外来序列插入位点是作为微型Tn7转座子的附着位点的优先靶位点(例如，微型attTn7，即Tn7转座因子识别和插入Tn7转座子所需的最小DNA序列)。
在某些实施方案中，将第一外来序列插入位点与报告基因框内融合。报吿基因可以是本领域已知的任何报吿基因，包括例如萤光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、特定颜色的荧光蛋白、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。在某些实施方案中，将第一外来序列插入位点与编码能够代谢生色底物的酶的报告基因框内融合。能够代谢生色底物的酶可以是本领域已知的具有相同特性的任何酶，例如LacZ或其功能部分。编码能够代谢生色底物的酶的报告基因可用于对阳性插入事件的基于颜色的筛选。例如，LacZ可用于蓝-白筛选，其中功能性LacZ基因产物切割生色底物X-gal或蓝色-gal，从而产生蓝色色素。在蓝-白筛选中，通过α互补测得的功能性LacZ的存在意味着插入事件失败，并且蓝色菌落代表未插入外来序列的克隆。另一方面，白色菌落代表外来序列成功插入从而破坏了功能性LacZ基因产物的产生并阻止了生色底物(例如X-gal)的切割的克隆。
因此，在某些实施方案中，第一外来序列插入位点是与编码LacZα或其功能部分的序列框内融合、用于细菌转座子的优先靶位点。在某些实施方案中，第一外来序列插入位点是与编码LacZα或其功能部分的序列框内融合、作为Tn7转座子的附着位点的优先靶位点(例如，attTn7)。成功转座后，转座子破坏编码LacZα的序列，从而破坏功能性LacZ基因产物的产生。
在某些实施方案中，第二外来序列插入位点允许经由位点特异性重组插入外来序列。在某些实施方案中，第二外来序列插入位点包含能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点。各种位点特异性重组酶技术是本领域技术人员已知的。例如，Cre-loxP系统经由Cre重组酶介导位点特异性重组，所述Cre重组酶能够识别称为loxP位点的34个碱基对的DNA序列。因此，第二外来序列插入位点是用于Cre介导的重组的优先靶位点。在某些实施方案中，第二外来序列插入位点是包含能够被Cre重组酶识别的loxP位点或其变体的优先靶位点。
本发明的重组杆粒包含为其在细菌(例如，大肠杆菌)和昆虫细胞两者中繁殖的能力所需的其他元件。例如，本发明的重组杆粒包含细菌复制子。在某些实施方案中，杆粒包含细菌复制子。各种细菌复制子是本领域技术人员已知的，并且包括例如F质粒来源的复制子。在某些实施方案中，合适的细菌复制子是微型F复制子，其是由为复制和调节所需的DNA区域oriS和incC构成的F质粒衍生物。在某些实施方案中，细菌复制子是低拷贝数复制子。在某些实施方案中，低拷贝数复制子是微型F复制子。
本发明的重组杆粒的其他元件包括一种或多种选择性标记序列、和其他报告基因。本领域中已知并使用的选择性标记基因的例子包括：提供针对氨苄青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、潮霉素、双丙氨磷除草剂、磺酰胺等的抗性的基因；和用作表型标记的基因，即花色苷调节基因、异戊烷基转移酶基因等。在某些实施方案中，重组杆粒包含选择性标记序列，所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。在某些实施方案中，抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因并且赋予对卡那霉素的抗性。本领域中已知并使用的报告物的例子包括：萤光素酶(Luc)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)等。在一些情况下，还可以将选择性标记视为报告物。在某些实施方案中，重组杆粒包含编码荧光蛋白的报告基因。在某些实施方案中，荧光蛋白是红色荧光蛋白。
本领域技术人员将认识到，本文所述的重组杆粒的各种元件彼此可操作地连接。杆粒中各种编码序列中的每一种都可以与包含例如启动子序列的调节区可操作地连接。本领域已知的任何启动子序列都可以是合适的。
因此，本发明的重组杆粒包含微型F复制子、抗生素抗性基因、包含Tn7转座子的附着位点的LacZα或其功能部分、与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因以及LoxP位点或其变体。
在某些示例性实施方案中，本发明的重组杆粒是如图1C中所示的BIVVBac。在某些实施方案中，BIVVBac编码AcMNPV C6基因组并且已经工程化为编码两个外来序列插入位点：1)在多角体蛋白基因座中的微型attTn7和2)在EGT基因座中的LoxP。将微型attTn7插入序列与用于在Tn7介导的转座后对重组杆粒进行X-gal介导的蓝/白筛选的Lac启动子驱动的大肠杆菌LacZα片段和用于Cre介导的体外或体内重组的LoxP位点框内融合。BIVVBac还包含在AcMNPV 39K启动子控制下的红色荧光蛋白基因，并且之后ets多腺苷酸化信号。
在某些示例性实施方案中，将BIVVBac引入能够允许Tn7介导的转座的细菌株中。在某些实施方案中，细菌株是大肠杆菌株。在某些实施方案中，细菌株是大肠杆菌DH10B细菌。在某些实施方案中，将编码Tn7转座酶基因tnsA-E和四环素抗性的辅助质粒引入具有BIVVBac的DH10B大肠杆菌中。具有BIVVBac和辅助质粒的DH10B大肠杆菌在本文中称为BIVVBacDH10B。
任何外来序列(例如，异源序列)都可以经由Tn7介导的转座引入BIVVBac中。在某些实施方案中，通过以下方式经由Tn7介导的转座将外来序列引入BIVVBac中：将包含外来序列的Tn7转移载体引入BIVVBacDH10B中，从而产生包含外来序列的BIVVBac。在某些实施方案中，包含外来序列的BIVVBac包含细菌复制子；第一选择性标记序列；插入第一报告基因中的外来序列(例如，异源序列)，其中所插入的外来序列破坏了所述第一报告基因的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的第二报告基因；以及能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点。
在某些示例性实施方案中，出于产生基因疗法载体的目的，经由Tn7介导的转座将AAV或非AAV Rep基因引入BIVVBac中。在某些实施方案中，将包含AAV或非AAV Rep基因的Tn7转移载体引入BIVVBacDH10B中，从而产生包含Rep基因的BIVVBac。在某些实施方案中，重组杆粒包含：微型F复制子；第一抗生素抗性基因；插入到LacZα或其功能部分中的编码B19Rep的序列，其中所插入的B19 Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及LoxP位点或其变体。在某些实施方案中，重组杆粒包含：微型F复制子；第一抗生素抗性基因；插入到LacZα或其功能部分中的编码GPV Rep的序列，其中所插入的GPV Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及LoxP位点或其变体。在某些实施方案中，重组杆粒包含：微型F复制子；第一抗生素抗性基因；插入到LacZα或其功能部分中的编码AAV2 Rep的序列，其中所插入的AAV2Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及LoxP位点或其变体。
任何外来序列(例如，异源序列)都可以经由Cre介导的重组引入BIVVBac中。在某些实施方案中，经由CRE介导的重组将外来序列引入BIVVBac中，其中外来序列位于本文所述的Cre-LoxP转移载体上。CRE介导的重组的方法是本领域技术人员熟知的。
在某些示例性实施方案中，出于产生基因疗法载体的目的，经由CRE介导的重组将侧接有对称或不对称型AAV或非AAV反向末端重复序列(ITR)的治疗性蛋白质编码基因引入BIVVBac中。在某些实施方案中，重组杆粒包含：微型F复制子；抗生素抗性基因；包含T7转座子的附着位点的LacZα或其功能部分；能够介导位点特异性重组事件的第一优先靶位点(例如，第一LoxP位点)；侧接有对称或不对称型AAV或非AAV ITR的治疗性蛋白质编码基因；以及能够介导位点特异性重组事件的第二优先靶位点(例如，第二LoxP位点)。
因此，出于产生基因疗法载体的目的，重组杆粒包含：插入到LacZα或其功能部分中的编码B19 Rep的序列，其中所插入的B19 Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自细小病毒B19的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自细小病毒B19的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
因此，出于产生基因疗法载体的目的，重组杆粒包含：插入到LacZα或其功能部分中的编码GPV Rep的序列，其中所插入的GPV Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自GPV的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自GPV的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
因此，出于产生基因疗法载体的目的，重组杆粒包含：插入到LacZα或其功能部分中的编码AAV2 Rep的序列，其中所插入的AAV2 Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自AAV2的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自AAV2的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
因此，出于产生基因疗法载体的目的，重组杆粒包含：插入到微型attTn7位点、LacZα或其功能部分中的编码人博卡病毒(HBoV1)Rep的序列，其中所插入的HBoV1 Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自HBoV1的野生型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自HBoV1的野生型3’反向末端重复序列。
在某些实施方案中，使用BIVVBac杆粒来产生封闭端DNA(ceDNA)。在一些实施方案中，使用单一杆状病毒表达载体产生ceDNA。在这种“单BAC”方法中，单一杆状病毒表达载体(例如，BIVVBac)编码在杆状病毒系统中产生ceDNA所需的所有必需元件，并且有可能在任何杆状病毒允许细胞系中用于产生ceDNA。这种方法描绘于图13A中。
在某些实施方案中，使用多种杆状病毒表达载体产生ceDNA。在这种“双BAC”方法中，将ceDNA产生所需的必需元件插入到两种不同的杆状病毒(例如，两种BIVVBac杆粒)中，并且有可能用于在容许杆状病毒感染的任何细胞系中进行共感染。这种方法描绘于图13B中。
在某些实施方案中，通过稳定细胞系产生ceDNA。在这种方法中，将产生ceDNA所需的必需元件插入在杆状病毒系统的两个组分中。这种方法描绘于图13C中。稳定细胞系可以通过以下方式来产生：在杆状病毒基因启动子(例如，杆状病毒组成型基因启动子)的控制下稳定地整合蛋白质编码序列。在某些实施方案中，稳定细胞系是稳定的昆虫细胞系。
B.转移载体
本文所述的重组杆粒包含至少两个外来序列插入位点。在某些实施方案中，所述至少两个外来序列插入位点是1)用于Tn7介导的转座的微型attTn7，和2)用于Cre介导的位点特异性重组的LoxP。因此，本发明的杆状病毒表达载体系统进一步包含两个或更多个转移载体，所述两个或更多个转移载体包含待插入到重组杆粒的外来序列插入位点中的外来序列。
Tn7转移载体
在某些实施方案中，转移载体包含待插入到重组杆粒的微型attTn7中的外来序列。在某些实施方案中，转移载体是Tn7转移载体。在某些实施方案中，转移载体是微型Tn7转移载体。在某些实施方案中，Tn7转移载体包含能够介导外来序列转座到重组杆粒的微型attTn7中的Tn7的左端和右端(Tn7L和Tn7R)。
在某些示例性实施方案中，出于产生基因疗法载体的目的，Tn7转移载体包含AAV或非AAV Rep的编码序列。在一些实施方案中，提供了Rep表达构建体，其中Rep基因是非AAV或AAV的，在pFastBac1转移载体(Invitrogen)中在杆状病毒基因启动子的调节下克隆。在某些实施方案中，杆状病毒基因启动子是即早期(ie1)的启动子。在某些实施方案中，杆状病毒基因启动子是多角体蛋白基因的启动子。合适的杆状病毒基因启动子是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，合适的杆状病毒基因启动子是即早期、早期、晚期或极晚期基因启动子
在某些实施方案中，Rep编码序列被修饰为使得Rep78的规范起始密码子被修饰为非规范起始密码子。在某些实施方案中，使在Rep52的起始密码子之前的其他AUG密码子突变为携带沉默突变(在框外的情况下)或编码保守氨基酸取代(在框内的情况下)以允许通过核糖体遗漏扫描机制从单一mRNA转录物表达Rep78和Rep52多肽。
在某些实施方案中，Tn7转移载体包含侧接与Rep基因可操作地连接的杆状病毒基因启动子的Tn7的左端和右端(Tn7L和Tn7R)。在某些实施方案中，Rep基因选自B19 Rep、GPVRep、HBoV1和AAV2 Rep。在某些实施方案中，Tn7转移载体包含侧接与B19 Rep可操作地连接的多角体蛋白启动子的Tn7的左端和右端，如图3A和图3B中所示。在某些实施方案中，Tn7转移载体包含侧接与B19 Rep可操作地连接的ie1启动子的Tn7的左端和右端，如图3A和图3B中所示。在某些实施方案中，Tn7转移载体包含侧接与GPV Rep可操作地连接的多角体蛋白启动子的Tn7的左端和右端，如图3C和图3D中所示。在某些实施方案中，Tn7转移载体包含侧接与AAV2 Rep可操作地连接的多角体蛋白启动子的Tn7的左端和右端，如图3E和图3F中所示。在某些实施方案中，Tn7转移载体包含侧接与HBoV1 Rep可操作地连接的多角体蛋白启动子的Tn7的左端和右端(未提供数据)。
Cre-LoxP转移载体
在某些实施方案中，转移载体是Cre-LoxP转移载体。在某些实施方案中，Cre-LoxP转移载体是核酸载体，所述核酸载体包含：用于在第一细菌株中繁殖所述核酸载体的第一复制起点，其中所述第一复制起点是条件性复制起点；用于在第二细菌株中繁殖所述核酸载体的第二复制起点；用于插入外来序列(例如，异源序列)的多克隆位点；选择性标记序列；报告基因；和/或能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点。在某些实施方案中，第一复制起点以pi蛋白的存在为条件的，如R6Kγ复制起点。在某些实施方案中，第一复制起点是R6Kγ复制起点。因此，在某些实施方案中，第一细菌株包含pi蛋白。在某些实施方案中，第二复制起点是pUC57复制起点。在某些实施方案中，能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点包含LoxP位点或其变体，并且位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。本文所述的Cre-LoxP转移载体可以具有适合于正确鉴定包含所述载体的宿主细胞的任何其他元件。例如，可以将本领域技术人员已知的任何选择性标记序列和/或报告基因掺入本文所述的Cre-LoxP转移载体中。
在某些实施方案中，Cre-LoxP转移载体是pUC57载体，所述pUC57载体包含：LoxP重组位点、之前是转录增强子hr5元件且之后是AcMNPV p10多腺苷酸化信号的在AcMNPV ie1启动子下的增强型GFP(eGFP)标记基因、氨苄青霉素抗性标记、条件性R6Kγ复制起点和多克隆位点。Cre-LoxP转移载体的特征包括：1)用于插入转基因的多克隆位点(MCS)；2)用于Cre介导的体外或体内重组的LoxP位点；3)两个复制起点，所述两个复制起点包括：i)用于将该载体繁殖到大肠杆菌株(如DH5α、NEB Stable、PMC103和DH10B)中的ColE1 Ori，和ii)用于将该载体繁殖到表达π(pi)蛋白的大肠杆菌株(如pir+和pir116)中的条件性R6KγOri；4)用于在通过Cre介导的重组将Cre-LoxP供体载体插入在BIVVBac中的LoxP位点中之后用卡那霉素和氨苄青霉素筛选重组杆粒的氨苄青霉素抗性基因；以及5)用于确定转基因在重组BEV中的稳定性同时在昆虫细胞中经过连续传代进行复制的增强型GFP报告基因。本领域技术人员将理解，多克隆位点是否保持在包含外来序列(例如，转基因)的Cre-LoxP转移载体中取决于外来序列插入其中的方式(例如，通过使用末端限制性位点或使用非末端限制性位点，或用于将外来序列克隆进来的限制性酶的性质)。
在某些示例性实施方案中，出于产生基因疗法载体的目的，Cre-LoxP转移载体包含外来序列(例如，异源序列)。例如，在某些实施方案中，Cre-LoxP转移载体包括侧接有对称或不对称型AAV或非AAV反向末端重复序列(ITR)的治疗性蛋白质编码基因。在某些实施方案中，侧接有对称或不对称型AAV或非AAV ITR的治疗性蛋白质编码基因位于Cre-LoxP转移载体的多克隆位点的位置中。
本领域技术人员将认识到，Tn7转移载体和Cre-LoxP转移载体是可用于插入外来序列以产生本发明的重组杆粒的转移载体的例子。在某些实施方案中，待使用本文所述的转移载体插入的外来序列是在转移载体之间可互换的。例如，出于产生基因疗法载体的目的，可以通过Tn7转移载体将Rep基因引入重组杆粒中，并且可以通过Cre-LoxP转移载体引入治疗性蛋白质编码基因。在另一个例子中，出于产生基因疗法载体的目的，可以通过Cre-LoxP转移载体将Rep基因引入重组杆粒中，并且可以通过Tn7转移载体引入治疗性蛋白质编码基因。
在某些实施方案中，本发明的Cre-LoxP转移载体包含LoxP序列和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)编码基因，并且用于克隆治疗性蛋白质编码基因(例如，具有侧接的对称或不对称型ITR的hFVIIIco6XTEN；其中ITR是非AAV或AAV的)。
在某些实施方案中，提供了一种重组杆粒，其中经由转座在多角体蛋白基因座中的微型attTn7位点处插入Rep编码基因，并且经由Cre介导的重组在EGT基因座中的LoxP位点处插入具有对称或不对称型ITR的治疗性蛋白质编码基因。在某些实施方案中，Rep基因和ITR是非AAV或AAV的。
因此，在某些实施方案中，提供了重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到LacZα或其功能部分中(例如，插入到LacZα内的微型attTn7位点中)的编码AAV rep(例如，AAV2 rep)的序列，其中所插入的Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：野生型或截短型AAV 5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及野生型或截短型AAV 3’反向末端重复序列。
在某些实施方案中，提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到LacZα或其功能部分(例如，插入到LacZα内的微型attTn7位点中)的编码非AAV Rep的序列，其中所插入的Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自第一细小病毒非AAV基因组的野生型或截短型非AAV 5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自第二细小病毒非AAV基因组的野生型或截短型非AAV 3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，所述第一细小病毒非AAV基因组和所述第二细小病毒非AAV基因组是不同的。
在某些实施方案中，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到LacZα或其功能部分(例如，插入到LacZα内的微型attTn7位点)中的编码B19 Rep的序列，其中所插入的B19 Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自细小病毒B19的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自细小病毒B19的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
在某些实施方案中，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到LacZα或其功能部分(例如，插入到LacZα内的微型attTn7位点)中的编码GPV Rep的序列，其中所插入的GPV Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自GPV的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自GPV的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
在某些实施方案中，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到LacZα或其功能部分(例如，插入到LacZα内的微型attTn7位点)中的编码AAV2 Rep的序列，其中所插入的AAV2 Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自AAV2的野生型或截短型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自AAV2的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
在某些实施方案中，本文提供了一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到LacZα或其功能部分(例如，插入到LacZα内的微型attTn7位点)中的编码HBoV1 Rep的序列，其中所插入的HBoV1 Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：衍生自HBoV1的野生型5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及衍生自HBoV1的野生型3’反向末端重复序列。
在某些实施方案中，提供了重组杆粒，所述重组杆粒包含：插入到LacZα或其功能部分中(例如，插入到LacZα内的微型attTn7位点中)的编码非AAV Rep的序列，其中所插入的Rep破坏了LacZα或其功能部分的阅读框；和包含异源序列的多克隆位点，其中所述异源序列从5’至3’包含：野生型或截短型非AAV 5’反向末端重复序列；编码蛋白质的序列；与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及野生型或截短型非AAV 3’反向末端重复序列。在某些实施方案中，非AAV Rep和非AAV反向末端重复序列选自病毒科细小病毒科的非AAV基因组的ITR。在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR是相同的细小病毒非AAV基因组的。在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR是不同的细小病毒非AAV基因组的。在这种实施方案中，非AAV Rep是至少一种细小病毒非AAV基因组的Rep。在此类实施方案中，本领域技术人员将能够确定最适合用于如下实施方案中的Rep：其中5’ITR和3’ITR是不同细小病毒非AAV基因组的。
在某些实施方案中，所述重组杆粒包含野生型或截短型AAV 5’ITR和野生型或截短型细小病毒非AAV 3’ITR。在某些实施方案中，所述重组杆粒包含野生型或截短型细小病毒非AAV 5’ITR和野生型或截短型AAV 3’ITR。在此类实施方案中，本领域技术人员将能够确定最适合用于如下实施方案中的Rep：其中5’ITR和3’ITR是不同细小病毒基因组的。
III.外来序列
本领域技术人员将理解，本文所述的杆状病毒表达载体系统可用于产生任何所需的产品。例如，本文所述的杆状病毒表达载体系统可用于产生重组蛋白，或用于基因治疗剂的病毒或非病毒载体。因此，以下对核酸分子产生的描述不应以任何方式进行限制。
核酸分子
在某些实施方案中，本文所述的杆状病毒表达载体系统可用于产生核酸分子。例如，产生用于基因疗法的核酸分子。因此，本文所述的某些实施方案涉及编码靶序列的质粒样、无衣壳的核酸分子的产生。衣壳是病毒的蛋白质外壳，包封病毒的遗传物质。已知衣壳通过保护病毒基因组、将基因组递送至宿主和与宿主相互作用来辅助病毒粒子的功能。然而，尤其在用于基因疗法中时，病毒衣壳可以是限制载体的包装能力和/或诱导免疫应答方面的因素。
AAV载体已经作为一种更常见类型的基因疗法载体出现。然而，衣壳的存在限制了AAV载体在基因疗法中的效用。具体地，衣壳自身可能将载体中包括的转基因的大小限制到低至小于4.5kb。即使在添加表达控制元件之前，可用于基因疗法中的多种治疗性蛋白质也可以轻易超过这个大小。
此外，构成衣壳的蛋白质可能起到受试者的免疫系统可靶向的抗原的作用。AAV在一般群体中非常常见，大多数人在其一生中已经暴露于AAV。因此，大多数潜在的基因疗法接受者可能已经产生过针对AAV的免疫应答，并且因此更有可能排斥所述疗法。
在某些实施方案中，本发明涉及核酸分子的产生，所述核酸分子包含第一ITR、第二ITR和基因盒(例如，编码治疗性蛋白质和/或miRNA)。在一些实施方案中，第一ITR和第二ITR侧接包含异源多核苷酸序列的基因盒。在一些实施方案中，核酸分子不包含编码衣壳蛋白、复制蛋白和/或组装蛋白的基因。在一些实施方案中，基因盒编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质包含凝血因子。在一些实施方案中，基因盒编码miRNA。在某些实施方案中，基因盒定位于第一ITR与第二ITR之间。在一些实施方案中，核酸分子还包含一个或多个非编码区。在某些实施方案中，所述一个或多个非编码区包含启动子序列、内含子、转录后调节元件、3'UTR多(A)序列或其任何组合。
在一个实施方案中，基因盒是单链核酸。在另一个实施方案中，基因盒是双链核酸。
本公开文本的一些方面涉及一种核酸分子，所述核酸分子包含基因盒(例如，编码治疗性蛋白质和/或miRNA)。在一些实施方案中，基因盒编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质包含凝血因子。在一些实施方案中，基因盒编码miRNA。在一些实施方案中，核酸分子还包含至少一个非编码区。在某些实施方案中，所述至少一个非编码区包含启动子序列、内含子、转录后调节元件、3'UTR多(A)序列或其任何组合。
在一些实施方案中，本文公开的核酸分子包含内含子或内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列是天然存在的内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列是合成序列。在一些实施方案中，内含子序列衍生自天然存在的内含子序列。在一些实施方案中，内含子序列是杂合的合成内含子或嵌合内含子。在一些实施方案中，内含子序列是嵌合内含子，所述嵌合内含子由鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白内含子组成并且已经修饰以消除现有五个ATG序列，从而减少假翻译起始。在某些实施方案中，内含子序列包含SV40小T内含子。在一些实施方案中，内含子序列定位于编码FVIII多肽的核酸序列的5'。在一些实施方案中，嵌合内含子定位于启动子序列如mTTR启动子的5’。在一些实施方案中，嵌合内含子包含SEQID NO:23的核酸序列。
在一个实施方案中，基因盒是单链核酸。在另一个实施方案中，基因盒是双链核酸。在另一个实施方案中，基因盒是封闭端双链核酸(ceDNA)。
在一些实施方案中，基因盒包含编码FVIII多肽的核苷酸序列，其中核苷酸序列经密码子优化。在一些实施方案中，基因盒包含由mTTR启动子驱动、编码密码子优化的FVIII的核苷酸序列和合成内含子。在一些实施方案中，基因盒包含国际申请号PCT/US 2017/015879中披露的核苷酸序列，将所述申请通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，基因盒是如PCT/US2017/015879中所述的“hFVIIIco6XTEN”基因盒。在一些实施方案中，基因盒包含密码子优化的cDNA，其编码与XTEN 144肽融合的B结构域缺失(BDD)的密码子优化的人因子VIII(BDDcoFVIII)。
在一些实施方案中，基因盒包含由mTTR启动子驱动、编码密码子优化的FVIII的核苷酸序列。在一些实施方案中，mTTR启动子包含SEQ ID NO:22的核酸序列。在一些实施方案中，基因盒还包含A1MB2增强子元件。在一些实施方案中，A1MB2增强子元件包含SEQ ID NO:21的核酸序列。在一些实施方案中，基因盒还包含嵌合或合成内含子。在一些实施方案中，嵌合内含子由鸡β-肌动蛋白/兔β-珠蛋白内含子组成并且已经修饰以消除现有五个ATG序列，从而减少假翻译起始。在一些实施方案中，内含子序列定位于编码FVIII多肽的核酸序列的5'。在一些实施方案中，嵌合内含子定位于启动子序列如mTTR启动子的5’。在一些实施方案中，嵌合内含子包含SEQ ID NO:23的核酸序列。在一些实施方案中，基因盒还包含土拨鼠转录后调节元件(WPRE)。在一些实施方案中，WPRE包含SEQ ID NO:24的核酸序列。在一些实施方案中，基因盒还包含牛生长激素多腺苷酸化(bGHpA)信号。在一些实施方案中，bGHpA信号包含SEQ ID NO:25的核酸序列。在一些实施方案中，基因盒包含与SEQ ID NO:19具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因盒包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
在一些实施方案中，基因盒包含由肝脏特异性修饰的小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子(mTTR482)驱动、编码密码子优化的FVIII和XTEN肽的核苷酸序列，所述基因盒包括A1MB2增强子元件、杂合的合成内含子(嵌合内含子)、土拨鼠转录后调节元件(WPRE)和牛生长激素多腺苷酸化(bGHpA)信号。在一些实施方案中，基因盒包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。在一些实施方案中，基因盒包含与SEQ ID NO:19具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的核苷酸序列。
反向末端重复序列
在某些实施方案中，5’ITR和3’ITR是腺相关病毒(AAV)ITR或非AAV ITR。在某些实施方案中，非AAV ITR是从病毒科细小病毒科的成员获得的ITR。合适的ITR序列包括本领域技术人员已知的AAV血清型的AAV ITR。合适的AAV和非AAV ITR序列描述于PCT公开号WO2019032898A1、WO 2020033863A1和WO 2017152149A1中，将所述专利的公开内容通过引用以其整体并入本文。例如，非AAV ITR序列可以衍生自鹅细小病毒(GPV)或细小病毒B19(本文中也称为“B19”)。在一些实施方案中，ITR并非衍生自AAV基因组。在一些实施方案中，ITR是非AAV的ITR。在一些实施方案中，ITR是来自选自但不限于以下的病毒科细小病毒科的非AAV基因组的ITR：博卡病毒属、依赖病毒属、红病毒属、阿留申病毒属、细小病毒属、浓核病毒属、重复病毒属、康特拉病毒属、禽细小病毒属、反刍类细小病毒属、原细小病毒属、四型细小病毒属、双义浓核病毒属、短浓核病毒属、肝胰浓核病毒属、对虾浓核病毒属及其任何组合。在某些实施方案中，ITR衍生自红病毒属细小病毒B19(人病毒；本文中也称为“B19”))。在另一个实施方案中，ITR衍生自番鸭细小病毒(MDPV)株。在某些实施方案中，MDPV株被减弱，例如MDPV株FZ91-30。在其他实施方案中，MDPV株是病原性的，例如MDPV株YY。在一些实施方案中，ITR衍生自猪细小病毒，例如猪细小病毒U44978。在一些实施方案中，ITR衍生自小鼠微小病毒，例如小鼠微小病毒U34256。在一些实施方案中，ITR衍生自犬细小病毒，例如犬细小病毒M19296。在一些实施方案中，ITR衍生自水貂肠炎病毒，例如水貂肠炎病毒D00765。在一些实施方案中，ITR衍生自依赖细小病毒(Dependoparvovirus)。在一个实施方案中，依赖细小病毒是依赖病毒属鹅细小病毒(GPV)株。在具体实施方案中，GPV株被减弱，例如GPV株82-0321V。在另一个具体实施方案中，GPV株是病原性的，例如GPV株B。合适的细小病毒ITR序列的例子示出在表1中。
表1：细小病毒ITR序列
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治疗性蛋白质
在一些方面，本文提供了核酸分子的产生，所述核酸分子包含第一ITR、第二ITR和编码靶序列的基因盒，其中靶序列编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，基因盒编码一种治疗性蛋白质。在一些实施方案中，基因盒编码多于一种治疗性蛋白质。在一些实施方案中，基因盒编码相同治疗性蛋白质的两个或更多个拷贝。在一些实施方案中，基因盒编码相同治疗性蛋白质的两种或更多种变体。在一些实施方案中，基因盒编码两种或更多种不同的治疗性蛋白质。
本公开文本的某些实施方案涉及一种核酸分子，所述核酸分子包含第一ITR、第二ITR和编码治疗性蛋白质的基因盒。任何治疗性蛋白质均可以通过本公开文本的杆状病毒表达载体系统产生，包括但不限于产生凝血因子。在一些实施方案中，凝血因子选自FI、FII、FIII、FIV、FV、FVI、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI、FXII、FXIII、VWF、前激肽释放酶、高分子量激肽原、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白质C、蛋白质S、蛋白质Z、蛋白质Z相关蛋白酶抑制剂(ZPI)、纤溶酶原、α2-纤溶酶抑制剂、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)、纤溶酶原激活物抑制物-2(PAI2)、其任何酶原、其任何活性形式及其任何组合。在一个实施方案中，凝血因子包含FVIII或其变体或片段。在另一个实施方案中，凝血因子包含FIX或其变体或片段。在另一个实施方案中，凝血因子包含FVII或其变体或片段。在另一个实施方案中，凝血因子包含VWF或其变体或片段。
生长因子
在一些方面，本文提供了核酸分子的产生，所述核酸分子包含第一ITR、第二ITR和编码靶序列的基因盒，其中靶序列编码治疗性蛋白质，并且其中治疗性蛋白质包含生长因子。生长因子可以选自本领域中已知的任何生长因子。在一些实施方案中，生长因子是激素。在其他实施方案中，生长因子是细胞因子。在一些实施方案中，生长因子是趋化因子。
在一些实施方案中，生长因子是肾上腺髓质素(AM)。在一些实施方案中，生长因子是血管生成素(Ang)。在一些实施方案中，生长因子是自分泌运动因子。在一些实施方案中，生长因子是骨形态发生蛋白(BMP)。在一些实施方案中，BMP选自BMP2、BMP4、BMP5和BMP7。在一些实施方案中，生长因子是睫状神经营养因子家族成员。在一些实施方案中，睫状神经营养因子家族成员选自睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、白介素-6(IL-6)。在一些实施方案中，生长因子是集落刺激因子。在一些实施方案中，集落刺激因子选自巨噬细胞集落刺激因子(m-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，生长因子是表皮生长因子(EGF)。在一些实施方案中，生长因子是肝配蛋白。在一些实施方案中，肝配蛋白选自肝配蛋白A1、肝配蛋白A2、肝配蛋白A3、肝配蛋白A4、肝配蛋白A5、肝配蛋白B1、肝配蛋白B2和肝配蛋白B3。在一些实施方案中，生长因子是促红细胞生成素(EPO)。在一些实施方案中，生长因子是成纤维细胞生长因子(FGF)。在一些实施方案中，FGF选自FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF15、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF20、FGF21、FGF22和FGF23。在一些实施方案中，生长因子是胎牛促体素(FBS)。在一些实施方案中，生长因子是GDNF家族成员。在一些实施方案中，GDNF家族成员选自神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、神经秩蛋白、普塞芬蛋白和阿特敏蛋白。在一些实施方案中，生长因子是生长分化因子-9(GDF9)。在一些实施方案中，生长因子是肝细胞生长因子(HGF)。在一些实施方案中，生长因子是肝细胞瘤衍生的生长因子(HDGF)。在一些实施方案中，生长因子是胰岛素。在一些实施方案中，生长因子是胰岛素样生长因子。在一些实施方案中，胰岛素样生长因子是胰岛素样生长因子-1(IGF-1)或IGF-2。在一些实施方案中，生长因子是白介素(IL)。在一些实施方案中，IL选自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6和IL-7。在一些实施方案中，生长因子是角质形成细胞生长因子(KGF)。在一些实施方案中，生长因子是迁移刺激因子(MSF)。在一些实施方案中，生长因子是巨噬细胞刺激蛋白(MSP或肝细胞生长因子样蛋白(HGFLP)。在一些实施方案中，生长因子是肌生成抑制蛋白(GDF-8)。在一些实施方案中，生长因子是神经调节蛋白。在一些实施方案中，神经调节蛋白选自神经调节蛋白1(NRG1)、NRG2、NRG3和NRG4。在一些实施方案中，生长因子是神经营养蛋白。在一些实施方案中，生长因子是脑源性神经营养因子(BDNF)。在一些实施方案中，生长因子是神经生长因子(NGF)。在一些实施方案中，NGF是神经营养蛋白-3(NT-3)或NT-4。在一些实施方案中，生长因子是胎盘生长因子(PGF)。在一些实施方案中，生长因子是血小板源性生长因子(PDGF)。在一些实施方案中，生长因子是肾胺酶(RNLS)。在一些实施方案中，生长因子是T细胞生长因子(TCGF)。在一些实施方案中，生长因子是血小板生成素(TPO)。在一些实施方案中，生长因子是转化生长因子。在一些实施方案中，转化生长因子是转化生长因子α(TGF-α)或TGF-β。在一些实施方案中，生长因子是肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。在一些实施方案中，生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)。
微小RNA(miRNA)
微小RNA(miRNA)是通过抑制翻译或诱导信使RNA(mRNA)降解来负调节基因表达的小非编码RNA分子(约18-22个核苷酸)。从其发现以来，miRNA已经参与多种细胞过程，包括细胞凋亡、分化和细胞增殖，并且其已显示在致癌中具有关键作用。miRNA调节基因表达的能力使得体内miRNA表达成为基因疗法中有价值的工具。
在一些方面，本文提供了核酸分子的产生，所述核酸分子包含第一ITR、第二ITR和编码靶序列的基因盒，其中靶序列编码miRNA，并且其中第一ITR和/或第二ITR是非腺相关病毒的ITR(例如，第一ITR和/或第二ITR来自非AAV)。miRNA可以是本领域中已知的任何miRNA。在一些实施方案中，miRNA下调靶基因的表达。在某些实施方案中，靶基因选自SOD1、HTT、RHO或其任何组合。
在一些实施方案中，基因盒编码一种miRNA。在一些实施方案中，基因盒编码多于一种miRNA。在一些实施方案中，基因盒编码两种或更多种不同的miRNA。在一些实施方案中，基因盒编码相同miRNA的两个或更多个拷贝。在一些实施方案中，基因盒编码相同治疗性蛋白质的两种或更多种变体。在某些实施方案中，基因盒编码一种或多种miRNA以及一种或多种治疗性蛋白质。
在一些实施方案中，miRNA是天然存在的miRNA。在一些实施方案中，miRNA是工程化miRNA。在一些实施方案中，miRNA是人工miRNA。在某些实施方案中，miRNA包含Evers等人,Molecular Therapy 26(9):1-15(印刷版之前的电子版，2018年6月)披露的miHTT工程化的miRNA。在某些实施方案中，miRNA包含Dirren等人,Annals of Clinical andTranslational Neurology 2(2):167-84(2015年2月)披露的miR SOD1人工miRNA。在某些实施方案中，miRNA包含miR-708，其靶向RHO(参见Behrman等人,JCB 192(6):919-27(2011))。
在一些实施方案中，miRNA通过下调基因抑制剂的表达来上调所述基因的表达。在一些实施方案中，抑制剂是天然(例如，野生型)抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂得自突变的、异源性和/或错误表达的基因。
表达控制元件
在一些实施方案中，由本文所述的杆状病毒表达载体系统产生的核酸分子或载体还包含至少一种表达控制序列。如本文所用的表达控制序列是有助于与其可操作地连接的编码核酸的有效转录和翻译的任何调节核苷酸序列，如启动子序列或启动子-增强子组合。例如，通过本公开文本的方法产生的分离核酸分子可以与至少一种转录控制序列可操作地连接。
基因表达控制序列可以是例如哺乳动物或病毒启动子，如组成型或诱导型启动子。组成型哺乳动物启动子包括但不限于以下基因的启动子：次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、腺苷脱氨酶、丙酮酸激酶、β-肌动蛋白启动子和其他组成型启动子。在真核细胞中组成性地发挥作用的示例性病毒启动子包括例如来自以下病毒的启动子：巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒(例如，SV40)、乳头瘤病毒、腺病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、劳斯肉瘤病毒、巨细胞病毒、莫洛尼氏白血病病毒的长末端重复(LTR)和其他逆转录病毒、以及单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子。
其他组成型启动子是本领域普通技术人员已知的。可用作本公开文本的基因表达序列的启动子还包括诱导型启动子。诱导型启动子是在诱导剂的存在下表达。例如，在某些金属离子的存在下诱导金属硫蛋白启动子以促进转录和翻译。其他诱导型启动子是本领域普通技术人员已知的。
在一个实施方案中，本公开文本包括转基因在组织特异性启动子和/或增强子控制下的表达。在另一个实施方案中，启动子或其他表达控制序列选择性地增强转基因在肝细胞中的表达。肝脏特异性启动子的例子包括但不限于小鼠甲状腺素转运蛋白启动子(mTTR)、天然人因子VIII启动子、天然人因子IX启动子、人α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、人白蛋白最小启动子和小鼠白蛋白启动子。在特定实施方案中，启动子包含mTTR启动子。mTTR启动子描述于R.H.Costa等人,1986,Mol.Cell.Biol.6:4697中。F8启动子描述于Figueiredo和Brownlee,1995,J.Biol.Chem.270:11828-11838中。在某些实施方案中，启动子包括mTTR启动子(例如，mTTR202启动子、mTTR202opt启动子、mTTR482启动子)中的任一种，如美国专利公开号US2019/0048362中所披露，将所述文献通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，核酸分子包含组织特异性启动子。在某些实施方案中，组织特异性启动子驱动治疗性蛋白质(例如，凝血因子)在肝脏中(例如，在肝细胞和/或内皮细胞中)的表达。在特定实施方案中，启动子选自小鼠甲状腺素转运蛋白启动子(mTTR)、天然人因子VIII启动子、人α-1-抗胰蛋白酶启动子(hAAT)、人白蛋白最小启动子、小鼠白蛋白启动子、三重四脯氨酸(tristetraprolin，TTP)启动子、CASI启动子、CAG启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子及其任何组合。在一些实施方案中，启动子选自肝脏特异性启动子(例如，α1-抗胰蛋白酶(AAT))、肌肉特异性启动子(例如，肌肉肌酸激酶(MCK)、肌球蛋白重链α(αMHC)、肌红蛋白(MB)和结蛋白(DES))、合成启动子(例如，SPc5-12、2R5Sc5-12、dMCK和tMCK)及其任何组合。
可以使用一种或多种增强子进一步增强表达水平以实现治疗功效。一种或多种增强子可以单独提供，或与一种或多种启动子元件一起提供。通常，表达控制序列包含多个增强子元件和组织特异性启动子。在一个实施方案中，增强子包括一个或多个拷贝的α-1-微球蛋白/双库尼茨抑制剂(bikunin)增强子(Rouet等人,1992,J.Biol.Chem.267:20765-20773；Rouet等人,1995,Nucleic Acids Res.23:395-404；Rouet等人,1998,Biochem.J.334:577-584；Ill等人,1997,Blood Coagulation Fibrinolysis 8:S23-S30)。在另一个实施方案中，增强子衍生自肝脏特异性转录因子结合位点，如EBP、DBP、HNF1、HNF3、HNF4、HNF6和Enh1，包含HNF1、(有义)-HNF3、(有义)-HNF4、(反义)-HNF1、(反义)-HNF6、(有义)-EBP、(反义)-HNF4(反义)。
在特定例子中，可用于本公开文本的启动子是ET启动子，其还作为GenBank号AY661265而已知。还参见Vigna等人,Molecular Therapy 11(5):763(2005)。其他合适载体和表达控制序列的例子描述于以下文献中：WO 02/092134、EP1395293或美国专利号6,808,905、7,745,179或7,179,903，将所述文献通过引用以其整体并入本文。
通常，表达控制序列应视需要包括分别涉及转录和翻译的起始的5'非转录序列和5'非翻译序列，如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。特别地，此类5'非转录序列将包括启动子区，所述启动子区包括用于可操作地连接的编码核酸的转录控制的启动子序列。基因表达序列任选地根据需要包括增强子序列或上游激活子序列。
在某些实施方案中，通过本文所述的杆状病毒表达载体系统产生的核酸分子包含例如与转基因可操作地连接的一种或多种miRNA靶序列。
在一些实施方案中，靶序列是miR-223靶标，已经报道其可在骨髓定向祖细胞中以及至少部分地在更原始的HSPC中最有效地阻断表达。miR-223靶标可以在分化的髓样细胞(包括粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、髓样树突细胞)中阻断表达。miR-223靶标还可以适合于依赖于淋巴样或红系细胞谱系中的稳健转基因表达的基因疗法应用。miR-223靶标还可以在人HSC中非常有效地阻断表达。
在一些实施方案中，靶序列是miR-142靶标。在一些实施方案中，将造血特异性微小RNA(如miR-142(142T))的互补序列并入包含转基因的核酸分子中，使得编码转基因的转录物易发生miRNA介导的下调。通过这种方法，可以在造血谱系抗原呈递细胞(APC)中防止转基因表达，同时在非造血细胞中维持所述转基因表达(Brown等人,Nat Med 2006)。这种策略可以对转基因表达施加严格的转录后控制，并且由此使得能够稳定递送和长期表达转基因。在一些实施方案中，miR-142调节防止经转导细胞的免疫介导的清除和/或诱导抗原特异性调节性T细胞(T reg)，并且介导对转基因编码抗原的稳健的免疫耐受。
在一些实施方案中，靶序列是miR181靶标。Chen C-Z和Lodish H,Seminars inImmunology(2005)17(2):155-165披露了miR-181，它是在小鼠骨髓内的B细胞中特异性表达的miRNA(Chen和Lodish,2005)。所述文献还披露，一些人miRNA与白血病相关。
靶序列可以与miRNA完全或部分互补。术语“完全互补”意指，靶序列的核酸序列与识别所述靶序列的miRNA的序列100％互补。术语“部分互补”意指，靶序列与识别所述靶序列的miRNA的序列仅部分互补，借此部分互补的序列仍然被miRNA识别。换句话说，在本公开文本的上下文中，部分互补的靶序列有效识别相应miRNA，并且实现在表达所述miRNA的细胞中防止或减少转基因表达。miRNA靶序列的例子描述于以下文献中：WO 2007/000668、WO2004/094642、WO 2010/055413或WO 2010/125471，将所述文献通过引用以其整体并入本文。
异源部分
在一些实施方案中，转基因编码异源氨基酸序列。异源氨基酸序列可以连接至转基因产物。在一些实施方案中，异源氨基酸序列可以连接至转基因产物的N末端或C末端。例如，对于编码FVIII的转基因，异源氨基酸序列可以连接至FVIII氨基酸序列的N末端或C末端或插入在FVIII氨基酸序列中的两个氨基酸之间。在一些实施方案中，异源氨基酸序列可以在以下文献中披露的任何位点处插入在FVIII多肽内：国际公开号WO 2013/123457A1和WO 2015/106052 A1或美国公开号2015/0158929A1，将所述文献通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，将异源氨基酸序列插入在FVIII的B结构域或其片段内。
在一些实施方案中，异源部分包含一个或多个XTEN序列、其片段、变体或衍生物。如本文所用，“XTEN序列”是指延伸长度的多肽，其具有非天然存在的基本上不重复的序列，所述序列主要由小亲水氨基酸构成，并且所述序列在生理条件下具有较低程度的或不具有二级或三级结构。作为异源部分，XTEN可以用作半衰期延长部分。另外，XTEN可以提供所需特性，包括但不限于增强的药物代谢动力学参数和溶解度特征。
在一些实施方案中，可用于本公开文本的XTEN序列是具有大于约20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1200、1400、1600、1800或2000个氨基酸残基的肽或多肽。在某些实施方案中，XTEN是具有大于约20至约3000个氨基酸残基、大于30至约2500个残基、大于40至约2000个残基、大于50至约1500个残基、大于60至约1000个残基、大于70至约900个残基、大于80至约800个残基、大于90至约700个残基、大于100至约600个残基、大于110至约500个残基或大于120至约400个残基的肽或多肽。在一个特定实施方案中，XTEN包含长度长于42个氨基酸并且短于144个氨基酸的氨基酸序列。
本公开文本的XTEN序列可以包含一个或多个5至14(例如，9至14)个氨基酸残基的序列基序或与所述序列基序至少80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列，其中所述基序包含4至6种类型的选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)的氨基酸(例如，5种氨基酸)，基本上由所述氨基酸组成或由所述氨基酸组成。可以用作本公开文本的嵌合蛋白中的异源部分的XTEN序列的例子披露于例如以下文献中：美国专利公开号2010/0239554A1、2010/0323956A1、2011/0046060A1、2011/0046061A1、2011/0077199A1或2011/0172146A1，或者国际专利公开号WO2010/091122 A1、WO 2010/144502 A2、WO 2010/144508A1、WO 2011/028228A1、WO 2011/028229A1或WO 2011/028344A2，将每篇所述文献通过引用以其整体并入本文。
IV.宿主细胞
合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。“宿主细胞”是指具有或能够具有任何感兴趣物质的任何细胞。
在一些实施方案中，适用于本发明的宿主细胞是昆虫来源的。在一些实施方案中，合适的昆虫宿主细胞包括例如从草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(Sf)分离的细胞系或从粉纹夜蛾(richoplusia ni)(Tni)分离的细胞系。本领域技术人员将能够容易地确定任何Sf或Tni细胞系的适用性。示例性昆虫宿主细胞包括而不限于Sf9细胞、Sf21细胞、HighFiveTM细胞。示例性昆虫宿主细胞还包括而不限于不受外来病毒污染的任何Sf或Tni细胞系，例如Sf-弹状病毒(rhadovirus)阴性(Sf-RVN)和Tn-野田村病毒(nodavirus)阴性(Tn-NVN)细胞。其他适合的宿主昆虫细胞是本领域技术人员已知的。在一个特定实施方案中，昆虫宿主细胞是Sf9细胞。
在一些实施方案中，适用于本发明的宿主细胞是细菌来源的。在一些实施方案中，合适的细菌宿主细胞可以是本领域技术人员已知的任何细菌宿主细胞。在某些实施方案中，合适的细菌宿主细胞不能拆分十字形DNA结构。在某些实施方案中，合适的细菌宿主菌株包含SbcCD复合物中的破坏。在一些实施方案中，SbcCD复合物中的破坏包含SbcC基因和/或SbcD基因中的基因破坏。在某些实施方案中，SbcCD复合物中的破坏包含SbcC基因中的基因破坏。包含SbcC基因中的基因破坏的各种细菌宿主菌株是本领域中已知的。例如而不限于，细菌宿主菌株PMC103包含基因型sbcC、recD、mcrA、ΔmcrBCF；细菌宿主菌株PMC107包含基因型recBC、recJ、sbcBC、mcrA、ΔmcrBCF；并且细菌宿主菌株SURE包含基因型recB、recJ、sbcC、mcrA、ΔmcrBCF、umuC、uvrC。
在一些实施方案中，适用于本发明的宿主细胞是哺乳动物来源的，例如人来源的。相信本领域技术人员有能力优先地确定最适合于其目的的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于CHO、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40 T抗原的CVI的衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)、NS0、CAP、BHK21和HEK 293(人肾)。
将本公开文本的载体引入宿主细胞中可以通过本领域技术人员熟知的多种技术来完成。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包膜DNA的细胞融合、显微注射和完整病毒感染。参见Ridgway,A.A.G."MammalianExpression Vectors"第24.2章,第470-472页Vectors,Rodriguez和Denhardt编辑(Butterworths,Boston,Mass.1988)。
使包含本公开文本的载体的宿主细胞在适当生长培养基中生长。如本文所用，术语“适当生长培养基”是指含有细胞生长所需的营养物的培养基。细胞生长所需的营养素可以包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素、矿物质和生长因子。任选地，培养基可以含有一种或多种选择因子。任选地，培养基可以含有小牛血清或胎牛血清(FCS)。生长培养基通常将例如通过药物选择或必需营养素的缺乏来选择含有所述载体的细胞，所述必需营养素通过载体上的选择性标记来补充。
V.使用方法
本文提供的杆状病毒表达载体系统可用于产生由插入在本文所述的重组杆粒中的外来序列编码的产物。可以通过本领域已知的若干种方法实现产物的可扩展生产。
一种方法包括感染支持杆状病毒生长的合适昆虫宿主细胞。在某些实施方案中，首先将如本文所述的包含外来序列的重组杆粒在合适的细菌宿主细胞(例如，大肠杆菌)中繁殖。然后从细菌宿主细胞中分离重组杆粒，并且使用合适的转染试剂(例如，CELLFECTIN)转染到合适的昆虫宿主细胞中。昆虫宿主细胞产生重组杆状病毒颗粒，然后可以将所述病毒颗粒感染到用于外来序列的病毒扩增的宿主昆虫细胞中。
在某些实施方案中，本文提供了一种产生由外来序列编码的产物的方法，所述方法包括在适当条件下将本文所述的重组杆粒转染到合适的昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；并且在适当条件下用重组杆状病毒感染第二合适的昆虫细胞以产生由外来序列编码的产物。在某些实施方案中，出于产生基因治疗剂的目的，重组杆粒包含Rep编码序列和在两侧侧接有ITR的编码蛋白质的序列。
在某些实施方案中，本文提供了一种产生核酸分子的方法，所述方法包括在适当条件下将本文所述的重组杆粒转染到合适的昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；并且在适当条件下用重组杆状病毒感染第二合适的昆虫细胞以产生所述核酸分子。在某些实施方案中，本文提供了一种产生ceDNA的方法，所述方法包括在适当条件下将本文所述的重组杆粒转染到合适的昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；并且在适当条件下用重组杆状病毒感染第二合适的昆虫细胞以产生所述ceDNA。
在另一种方法中，稳定细胞系可以通过以下方式来产生：在杆状病毒基因启动子(例如，杆状病毒组成型基因启动子)的控制下稳定地整合蛋白质编码序列。在某些实施方案中，稳定细胞系是稳定的昆虫细胞系。序列的稳定整合可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。用于将核酸稳定整合到多种宿主细胞系中的方法是本领域已知的(对于通过稳定整合核酸产生的示例性生产细胞系的更详细描述，参见下文的实施例)。例如，重复选择(例如，通过使用选择性标记)可以用于选择已整合含有选择性标记(和AAV cap和rep基因和/或rAAV基因组)的核酸的细胞。在其他实施方案中，核酸能以位点特异性方式整合到细胞系中以产生生产细胞系。若干种位点特异性重组系统是本领域已知的，如FLP/FRT(参见例如O'Gorman,S.等人(1991)Science 251:1351-1355)、Cre/loxP(参见例如Sauer,B.和Henderson,N.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:5166-5170)以及phi C31-att(参见例如Groth,A.C.等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.97:5995-6000)。
在稳定细胞系方法中，在一个实施方案中，将编码正确表达蛋白质编码序列所需的互补蛋白质的BEV引入稳定细胞系中。在某些实施方案中，出于产生基因治疗剂的目的，稳定细胞系包含稳定地整合于其中的具有侧接的对称或不对称型AAV或非AAV ITR的治疗性蛋白质编码基因。然后在产生基因治疗剂所需的条件下将编码合适的Rep的BEV引入稳定细胞系中。
本文描述了产生具体稳定细胞系的方法(参见实施例8)。用于产生ceDNA的具体稳定细胞系的例子包括具有稳定地整合于其中的图8B中所示质粒的细胞系。这些稳定细胞系列于表5中。在某些方法中，为了产生ceDNA，在产生ceDNA所需的条件下将编码合适的Rep的BEV引入稳定细胞系中。
在又另一种方法中，可以使用稳定细胞系以无杆状病毒的方式实现由外来序列编码的产物的产生。在某些实施方案中，出于产生基因治疗剂的目的，稳定细胞系包含稳定地整合于其中的具有侧接的对称或不对称型AAV或非AAV ITR的治疗性蛋白质编码基因。在某些实施方案中，稳定细胞系中的无杆状病毒产生包括在杆状病毒基因启动子的控制下在稳定细胞系中瞬时表达Rep蛋白。合适的杆状病毒基因启动子是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，杆状病毒基因启动子是黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)多核多角体病毒(OpMNPV)的即早期(ie)基因启动子。在某些实施方案中，杆状病毒基因启动子是OpMNPV的OpIE2启动子。介导瞬时基因表达的各种方法是本领域技术人员已知的。在某些实施方案中，瞬时基因表达可以通过聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染来实现。
产物的下游纯化可以涉及本领域技术人员已知的任何方法。例如，对于用于基因疗法目的的病毒或非病毒载体，可以通过含有基于二氧化硅的柱的质粒DNA分离试剂盒进行纯化，所述分离试剂盒通过离子交换色谱将低分子量DNA与RNA、高分子量DNA、蛋白质和其他杂质分离。
本文所述的所有各个方面、实施方案和选择都能以任何和所有变化组合。
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同指示每个单独出版物、专利或专利申请明确且单独地通过引用并入一般。
已经一般性地描述了本公开文本，通过参考本文所提供的实施例可以获得进一步的理解。这些实施例仅用于说明的目的，而不旨在是限制性的。
实施例
实施例1：BIVVBac前体杆粒
在表达载体中，杆状病毒因其超大的遗传货物容量(高达几十kb，有报道为100kb)而脱颖而出。这种转基因容量已被利用用于产生重组AAV载体(高达38kb表达盒)。推测杆状病毒载体的大转基因容量也可用于非病毒基因疗法的DNA治疗性药物物质产生。因此，产生了一种新的多功能杆状病毒穿梭载体(杆粒)，其被专门设计用于容纳多个转基因，而这不是使用现有杆粒工具可以实现的。这种多功能杆粒(称为“BIVVBac”)还可用于体内基因疗法的rAAV载体产生，以及任何所需蛋白质(例如重组蛋白质)的产生。
BIVVBac杆粒衍生自编码AcMNPV C6基因组(图1A)的bMON14272(Invitrogen)，并且经工程化以编码两个插入位点：1)在多角体蛋白基因座中的微型attTn7，和2)在EGT基因座中的LoxP。将微型attTn7插入序列与用于在Tn7介导的转座后对重组杆粒进行X-gal介导的蓝/白筛选的Lac启动子驱动的大肠杆菌LacZα片段和用于Cre介导的体外或体内重组的LoxP位点框内融合。分两步将LoxP重组位点插入bMON14272中，所述bMON14272在多角体蛋白基因座中包含微型attTn7插入序列。首先，通过(皮斯卡塔韦，新泽西州)合成质粒，所述质粒由以下构成：在AcMNPV 39K启动子下的Rudolph红色荧光蛋白(RFP)基因、之后是ets多腺苷酸化信号、LoxP重组位点以及侧接AcMNPV EGT基因座的序列(图1B)(SEQ IDNO:9)。然后，根据制造商的说明，使用Cellfectin(Invitrogen)转染试剂中将合成质粒DNA与AvrII线性化bMON14272共转染在Sf9细胞(/>CRL-1711)中。RFP表达盒和LoxP序列在Sf9细胞中通过同源重组而重组在EGT基因座处。对在无细胞上清液中产生的子代病毒进行噬斑纯化，并且将RFP+噬斑在Sf9细胞中扩增以产生P1(第1代)病毒。然后将杆状病毒DNA从P1病毒中分离，并且用作模板以使用转移质粒内部和外部的引物对跨越预期重组连接点的区域进行PCR扩增，并对所得扩增子进行测序。将重组病毒进一步扩增，并且用于病毒DNA分离，然后将所述病毒DNA转化到大肠杆菌DH10B细菌中(O’Reilly等人1992)，之后用卡那霉素、X-Gal和IPTG进行选择。将从卡那霉素抗性蓝色大肠杆菌克隆中分离的杆粒DNA通过限制性酶作图分析并指定为“BIVVBac”(图1C)。将编码Tn7转座酶基因tnsA-E和四环素抗性的辅助质粒pMON7124(Invitrogen)转化到具有BIVVBac的DH10B大肠杆菌中，之后用卡那霉素和四环素进行选择。如先前所述(Sharma和Schimke,1996)，将双重抗性克隆之一用于制备电感受态细胞，并且将所得的新大肠杆菌株指定为BIVVBacDH10B(图1D)。然后将该株用于通过Tn7转座在多角体蛋白基因座处插入AAV2、B19或GPV复制(Rep)蛋白编码基因，如下所述。
实施例2：Cre-LoxP供体载体
通过(皮斯卡塔韦，新泽西州)合成DNA构建体，所述DNA构建体由以下构成：LoxP重组位点、之前是转录增强子hr5元件且之后是AcMNPV p10多腺苷酸化信号的在AcMNPV ie1启动子下的增强型GFP(eGFP)标记基因、氨苄青霉素抗性标记、条件性R6Kγ复制起点和多克隆位点(SEQ ID NO:10)(图2A)。将该合成DNA克隆到pUC57载体中，并且将所得构建体指定为“Cre-LoxP供体载体”(图2B)。Cre-LoxP供体载体的关键特征包括：(1)用于插入转基因的多克隆位点(MCS)；(2)用于Cre介导的体外或体内重组的LoxP位点；(3)两个复制起点：(3a)用于将该载体繁殖到大肠杆菌株(如DH5α、NEB Stable、PMC103和DH10B)中的ColE1 Ori，和(3b)用于将该载体繁殖到表达π(pi)蛋白的大肠杆菌株(如pir+和pir116)中的条件性R6KγOri；(4)用于在通过Cre-LoxP重组将Cre-LoxP供体载体插入在“BIVVBac”中的LoxP位点中之后用卡那霉素和氨苄青霉素筛选重组杆粒的氨苄青霉素抗性基因；以及(5)用于确定转基因在重组BEV中的稳定性同时在Sf9细胞中经过连续传代进行复制的增强型GFP报告基因。
实施例3：复制(Rep)蛋白表达构建体
B19.Rep：
从B19株HV(GenBank登录号AF162273)获得B19 Rep的编码序列，并且通过(皮斯卡塔韦，新泽西州)合成野生型序列(SEQ ID NO:11)(图3A)。在AcMNPV多角体蛋白启动子下将合成DNA克隆到pFastBac1(Invitrogen)载体中，并且使用庆大霉素抗性克隆产生pFastBac.Polh.B19.Rep转移载体。将该载体转化到BIVVBacDH10B大肠杆菌中以产生重组BEV，AcBIVVBac.Polh.B19.RepTn7，如下所述。然后将滴定的BEV用于在编码具有对称型B19 ITR的hFVIIIco6XTEN的多克隆Sf细胞系中感染，并且从感染的细胞沉淀中纯化ceDNA载体，如下所述。初步结果揭示，多角体蛋白启动子驱动的B19.Rep无法“挽救”ceDNA。假设在杆状病毒感染周期的极晚期高水平的非剪接B19.Rep表达是低效的和/或对细胞有毒的。对于该假设，将多角体蛋白启动子用AcMNPV组成型即早期(ie1)启动子替代以产生pFastBac.IE1.B19.Rep转移载体(图3B)。将该载体用于产生重组BEV，AcBIVVBac.IE1.B19.RepTn7，并且然后在编码具有对称型B19 ITR的hFVIIIco6XTEN的多克隆Sf细胞系中进行测试。结果显示，与多角体蛋白驱动的Rep相比，AcMNPV组成型ie1驱动的B19.Rep能够从测试的两种细胞系中挽救ceDNA载体。该数据表明，Rep蛋白的化学计量表达对于Sf9细胞中的ceDNA产生至关重要，如对于rAAV产生较早观察到的。
GPV.Rep：
从GPV B株(GenBank登录号GPU25749)获得GPV Rep的编码序列。与B19不同，GPV.Rep从单一mRNA转录物产生剪接蛋白(Rep78和Rep52)，并且为了实现两种蛋白质的化学计量表达，将Rep78编码序列经基因修饰，从而允许经由核糖体遗漏扫描机制从单一mRNA物质表达Rep78和Rep52多肽。将Rep78开放阅读框(orf)的AUG起始密码子、相邻的脯氨酸密码子和出现在Rep52 orf的起始密码子之前的十二个下游AUG三联体经由基因合成进行改变。使Rep78起始密码子和近侧侧接苷酸突变为低效的翻译起始信号，所述翻译起始信号由在Kozak共有序列背景下呈现的CUG三联体构成。将在Rep78 orf的起始密码子与Rep52 orf的AUG起始密码子之间出现的AUG三联体改变为携带沉默突变(在框外AUG密码子的情况下)，或编码保守氨基酸取代(在框内AUG密码子的情况下)。最后，通过合成经修饰的GPV.Rep编码序列(SEQ ID NO:12)(图3C)，并且将合成DNA在AcMNPV多角体蛋白启动子下克隆到pFastBac1(Invitrogen)载体中以产生pFastBac.Polh.GPV.Rep转移载体(图3D)。然后将该载体转化到BIVVBacDH10B大肠杆菌中以产生重组BEV，AcBIVVBac.Polh.GPV.RepTn7，如下所述。
AAV2.Rep：
从AAV2基因组(GenBank登录号NC_001401)获得AAV2 Rep的编码序列。与B19.Rep不同，AAV2.Rep也从单一mRNA转录物产生剪接蛋白(Rep78和Rep52)，并且为了实现两种蛋白质的化学计量表达，将Rep78编码序列经基因修饰，从而允许经由核糖体遗漏扫描机制从单一mRNA转录物表达Rep78和Rep52多肽，如早先所述(Smith等人,2009)(图3E)。通过合成经修饰的AAV2.Rep编码序列(SEQ ID NO:13)(图3E)，并且将合成DNA在AcMNPV多角体蛋白启动子下克隆到pFastBac1(Invitrogen)载体中以产生pFastBac.Polh.AAV2.Rep转移载体(图3F)。然后将该载体转化到BIVVBacDH10B大肠杆菌中以产生重组BEV，AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7，如下所述。
实施例4：人FVIIIco6XTEN表达构建体
具有非AAV或AAV ITR的人FVIIIco6XTEN表达构建体：
在PCT公开号WO 2019032898A1中描述了包含以下的基因构建体：在肝脏特异性TTPp启动子下的具有XTEN 144肽的密码子优化的人FVIII(FVIIIco6XTEN)、土拨鼠转录后调节元件(WPRE)、牛生长激素多腺苷酸化(bGHpA)信号和非AAV或AAV的侧接截短型ITR。在此，将这些构建体与通过用非AAV或AAV的野生型序列替代5'或3'ITR制得的新构建体平行测试(表2)。将这些新构建体在含有缺失的sbcC基因的大肠杆菌PMC103株中生长和维持，所述sbcC基因编码识别和消除十字形DNA结构的核酸外切酶。在优化细菌培养物的温度和生长条件之后，PMC103大肠杆菌能够支持具有非AAV或AAV对称或不对称型ITR的hFVIIIco6XTEN构建体的生长。将所有新构建体在氨苄青霉素抗性板上进行选择并且通过限制性酶作图筛选以确定正确的遗传结构。然后将hFVIIIco6XTEN表达构建体用于制备Cre-LoxP供体载体。
表2：人FVIIIco6XTEN表达构建体
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具有非AAV或AAV ITR的人FVIIIco6XTEN Cre-LoxP供体载体：
将来自构建体-1、-3和-7(表2)的hFVIIIco6XTEN表达盒用PstI酶切除并且克隆在Cre-LoxP供体载体中的相同位点处。将所得构建体转化到稳定感受态大肠杆菌株(New England Biolabs)中，并且通过限制性酶作图筛选氨苄青霉素抗性克隆。对于pCLDV-1、-3和-7中的“质粒Cre-LoxP”，将正确的克隆指定为带有前缀“pCL”(表2)(图4B)。类似地，为了产生其他供体载体，将来自构建体-2、-4、-5、-6、-8和-9的hFVIIIco6XTEN表达盒用PstI和/或PvuII酶切除并且克隆在Cre-LoxP供体载体中的相同位点处。由于野生型ITR序列的长回文重复序列，这些构建体被转化到PMC103大肠杆菌株中，并且通过限制性酶作图筛选氨苄青霉素抗性克隆。然后将所得的Cre-LoxP供体载体pCLDV-2、-4、-5、-6、-8和-9在LoxP重组位点处插入到分别在Tn7位点处编码B19、GPV或AAV2 Rep的“BIVVBac”杆粒中(表3)。表3中ITR的序列示于表1中。
表3：人FVIIIco6XTEN Cre-LoxP供体载体
Cre-LoxP供体载体 5’ITR 3’ITR
pCLDV-1 pCL.hFVIIIco6XTEN.B19Δ135 B19Δ135 B19Δ135
pCLDV-2 pCL.hFVIIIco6XTEN.B19.WT B19.WT B19.WT
pCLDV-3 pCL.hFVIIIco6XTEN.GPVΔ135 GPVΔ162 GPVΔ162
pCLDV-4 pCL.hFVIIIco6XTEN.GPV.WT GPV.WT GPV.WT
pCLDV-5 pCL.hFVIIIco6XTEN.GPV.Asy GPVΔ162 GPV.WT
pCLDV-6 pCL.hFVIIIco6XTEN.AAV2.WT AAV2.WT AAV2.WT
pCLDV-7 pCL.hFVIIIco6XTEN.AAV2.Asy1 AAV2Δ15Δ11 AAV2Δ15
pCLDV-8 pCL.hFVIIIco6XTEN.AAV2.Asy2 AAV2.WT AAV2Δ15
pCLDV-9 pCL.hFVIIIco6XTEN.AAV2.Asy3 AAV2Δ15Δ11 AAV2.WT
实施例5：复制(Rep)杆状病毒表达载体(BEV)
AAV的复制依赖于非结构(复制)蛋白；Rep78、Rep68、Rep52和Rep40。已经表征出AAV Rep78和Rep68的参与病毒DNA复制的若干种活性，包括与AAV ITR的结合、序列和链特异性核酸内切酶活性以及ATP依赖性DNA解旋酶活性。Rep68或Rep78与ITR内的特定区域(Rep结合位点)结合，并且在称为末端解离位点(TRS)的独特位点处使双链复制中间体的一条链产生切口。核酸内切酶反应导致Rep共价附接到新产生的5’端。切口的3’端充当用于ITR延伸的引物。共价附接的Rep分子的解旋酶活性可以解开ITR的二级结构。末端解离过程为末端恢复和子代病毒基因组的产生提供了手段。因此，Rep对于真核细胞中ITR介导的载体产生和从Sf9细胞“挽救”ITR侧接的hFVIIIco6XTEN载体基因组至关重要，我们产生了编码非AAV或AAV Rep的重组BEV。为了产生这些BEV，首先用转移载体pFastBac.IE1.B19.Rep(图3B)、pFastBac.Polh.GPV.Rep(图3D)和pFastBac.Polh.AAV2.Rep(图3F)超转化BIVVBacDH10B大肠杆菌(图1D)，并且然后在卡那霉素、庆大霉素、X-Gal和IPTG上选择转化体。BIVVBac中在微型attTn7插入位点处的Rep表达盒和庆大霉素抗性基因的位点特异性转座破坏了LacZα(与微型attTn7框内融合)并且在X-Gal介导的双重抗生素选择上产生白色大肠杆菌菌落。因此，通过碱裂解小量制备从白色大肠杆菌菌落中分离重组杆粒DNA，并且用限制性酶消化以确定正确的遗传结构。限制性酶作图的结果显示了每种重组杆粒的预期片段，这表明Rep在BIVVBac的多角体蛋白基因座中的位点特异性转座(图5A)。通过使用转移质粒内部和外部的引物对跨越预期插入位点的区域进行PCR扩增并对所得扩增子进行测序，获得了进一步的确认。
根据制造商的说明，使用(Invitrogen)转染试剂在Sf9细胞中转染编码B19.Rep、GPV.Rep或AAV2.Rep的正确重组杆粒。在转染后4-5天，收获子代杆状病毒并在Sf9细胞中进行噬斑纯化，如所述的(Jarvis,2014)。将每种重组BEV，AcBIVVBac.IE1.B19.RepTn7(图5B)、AcBIVVBac.Polh.GPV.RepTn7(图5C)和AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn(图5D)的六个噬斑纯化的RFP+克隆在Sf9细胞中扩增至P1(第1代)，所述Sf9细胞以0.5x106/mL接种在T25烧瓶中的补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)的ESF-921培养基中。在感染后4-5天，通过低速离心收获P1病毒，并且分别使用抗B19 NS1(MyBioSource,Inc.)、抗GPV.REP/>和抗AAV2.REP 303.9(American Resea rchProducts Inc.)单克隆或多克隆抗体通过免疫印迹测试感染细胞沉淀以检测B19.REP、GPV.REP或AAV2.REP。AcBIVVBac.IE1.B19.RepTn7噬斑纯化克隆的免疫印迹分析(图5E)显示出单一种类的预测质量为74kDa的B19.REP，这表明B19.REP在Sf9细胞中从非剪接mRNA转录物表达。有趣的是，在所有测试的病毒克隆中观察到等同水平的B19.REP表达，这表明在Sf9细胞中在AcMNPV IE1启动子下化学计量水平的B19.REP表达。与B19.REP不同，AcBIVVBac.Polh.GPV.RepTn(图5F)或AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepTn7(图5G)噬斑纯化克隆的免疫印迹分析显示两个种类的预测质量为73kDa和49kDa的REP对应于Rep78和Rep52多肽，这表明GPV.REP和AAV2.REP在Sf9细胞中从剪接mRNA转录物表达。在所有测试的病毒克隆中观察到等同水平的Rep78或Rep52，这表明在Sf9细胞中在AcMNPV多角体蛋白启动子下的稳定GPV.REP和AAV2.REP表达。REP78表达水平几乎是REP52的一半，这进一步表明两种多肽的正确化学计量表达是通过核糖体遗漏扫描机制从单一mRNA转录物实现的。选择每种BEV的最高REP表达克隆用于在Sf9细胞中进一步扩增，并且然后用于在编码侧接有非AAV和AAV的对称或不对称型ITR的hFVIIIco6XTE N的稳定细胞系中感染以用于ceDNA载体产生。
实施例6：复制(Rep)和人FVIIIco6XTEN杆状病毒表达载体(BEV)
为了测试BIVVBac是否可用于容纳多个转基因，产生了一族衍生载体，其编码两个转基因表达盒：1)Rep和2)侧接有非AAV和AAV的对称或不对称型ITR的hFVIIIco6XTEN。这些BEV分两步产生。首先，如上所述，经由Tn7转座将Rep表达盒插入在多角体蛋白基因座中的微型attTn7位点。然后，将所得重组杆粒用于使用Cre重组酶(New England Biolabs)经由体外Cre-LoxP重组在EGT基因座中的LoxP位点处插入hFVIIIco6XTE N表达盒。在该过程中，将编码具有B19 ITR、GPV ITR和AAV ITR的hFVIIIco6XTEN的Cre-LoxP供体载体(pCLDV-1至-9)(表2)分别插入AcBIVVBac.IE1.B19.Rep(图5B)、AcBIVVBac.Polh.GPV.Rep(图5C)或AcBIVVBac.Polh.AAV2.Rep(图5D)杆粒中。将重组反应物在DH10B大肠杆菌中转化，并且在卡那霉素、庆大霉素和氨苄青霉素上选择转化体。通过以下方式来筛选三重抗生素抗性菌落：通过限制性酶作图和/或使用转移质粒内部和外部的引物对跨越预期插入位点的区域进行PCR扩增，并对所得扩增子进行测序。
最大量制备法纯化编码两个转基因盒的正确重组杆粒，并且使用(Invitrogen)转染试剂在Sf9细胞中转染。在转染后4-5天，收获子代杆状病毒并在Sf9细胞中进行噬斑纯化。将每种重组BEV(BEV-1至-9)(表4)(图6A、6B和6C)的六个噬斑纯化的RFP+和GFP+克隆在Sf9细胞中扩增至P1(第1代)，所述Sf9细胞以0.5x106/mL接种在T25烧瓶中的补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)的ESF921培养基中。在感染后4-5天，所有克隆对于每种重组BEV均显示出感染进展(通过GFP+和RFP+细胞的数量确定)，这表明病毒能够正常复制并且在同一杆状病毒基因组中插入多个转基因对子代病毒产生没有不利影响。通过低速离心收获P1病毒，并且处理感染细胞沉淀，以用于通过免疫印迹进行REP检测或用于使用PureLink最大制备型DNA分离试剂盒(Invitrogen)进行ceDNA分离。如上所述，进行免疫印迹以检测B19.REP、GPV.REP或AAV2.REP。免疫印迹的结果显示所有六个克隆对于测试的每种REP均呈阳性，这表明在EGT基因座处插入hFVIIIco6XTEN盒对即早期或多角体蛋白驱动的REP表达没有不利影响。最后，将每种BEV的最高REP表达克隆进一步扩增以产生工作BEV原液(P2)，之后在Sf9细胞中滴定。将滴定的BEV用于在Sf9细胞中感染以产生hFVIIIco6XTEN ceDNA载体，如下所述。
表4：Rep和人FVIIIco6XTEN BEV
实施例7：从杆状病毒产生人FVIIIco6XTEN ceDNA载体
测试编码hFVIIIco6XTEN和Rep基因二者的重组BEV(表4)的ceDNA产生。将Sf9细胞用每种BEV的滴定工作原液(P2)感染，感染复数(MOI)为3pfu/细胞。将细胞在室温下轻轻翻滚1.5h，以500xg沉淀5min，吸出上清液，并且将细胞用10mL新鲜ESF-921培养基洗涤一次。将细胞悬浮于50mL ESF-921培养基中，并且然后在摇床培养箱中在28℃下孵育72h。在感染后72h，收获感染细胞，并且将沉淀用1x PBS洗涤一次以去除残留的杆状病毒颗粒和/或培养基。然后，根据制造商的说明，通过PureLink Maxi Prep DNA分离试剂盒(Invitrogen)分离ceDNA载体。通过0.8％至1.2％琼脂糖凝胶电泳分析洗脱级分，以确定每种ceDNA载体的产量和纯度。作为第一轮分析，测试了从用BEV-5感染的Sf9细胞中分离的ceDNA载体(表4，图7A)。测试BEV-5的所有六个克隆的ceDNA产生。克隆之一显示出对应于hFVIIIco6XTEN转基因(约7.0kb)大小的DNA条带，这显示出多角体蛋白驱动的GPV REP能够挽救不对称型ITR侧接的hFVIIIco6XTEN载体DNA(图7B)。将样品以不同的体积再次运行以可视化显带图案并确认ceDNA的大小。观察到多条高分子量条带(图7C)。该数据证明了从编码非AAV Rep以及ITR侧接的hFVIIIco6XTEN转基因的单一重组BEV产生ceDNA的概念。
实施例8：人FVIIIco6XTEN稳定昆虫细胞系
推测昆虫细胞基因组也可以经修饰以在杆状病毒感染后产生DNA治疗性药物物质。为了实现这一目标，从(皮斯卡塔韦，新泽西州)合成编码之前是转录增强子hr5元件且之后为AcMNPV p10多腺苷酸化信号的在AcMNPV即早期(ie1)启动子下的新霉素抗性标记的质粒(SEQ ID NO:14)(图8A)。使用/>(InvitrogenTM)将该合成DNA与编码侧接有非AAV或AAV的对称和不对称型ITR的hFVIIIco6XTEN表达盒的质粒(表3)一起在Sf9细胞中共转染。在转染后24h，在荧光显微镜下可视化细胞以确定转染效率，并且结果显示>80％ GFP+细胞，这表明更高的转染效率。在转染后72h，用G418抗生素(Sigma Aldrich)以1.0mg/mL终浓度选择细胞，所述G418抗生素悬浮于完全TNMFH培养基(补充有10％ FBS+0.1％ Pluronic F68的Grace昆虫培养基)中。在约一周的选择之后，回收了约50％的转化细胞，这表明新霉素抗性标记稳定地整合到该细胞群中。将存活细胞从选择培养基中取出并且用新鲜的完全TNMFH培养基培养直到汇合生长。随着汇合细胞继续分裂，将它们作为贴壁培养物逐渐扩增到更大的培养器皿中。随后，通过以下方式使每个细胞系适应悬浮培养：在摇瓶中在完全TNMFH中培养1代并且在补充有10％ FBS的ESF-921培养基中生长1代。最后，每个细胞系均作为悬浮培养物适应摇瓶中的无血清ESF-921。通常将这些摇瓶培养物维持在无血清ESF-921培养基中，每四天传代一次，并且监测细胞生长。每个细胞系根据插入的hFVIIIco6XTEN构建体指定并以“Sf”为前缀(图8B)(表5)。
表5：人FVIIIco6XTEN稳定昆虫细胞系
人FVIIIco6XTEN细胞系 5’ITR 3’ITR
细胞系-1 Sf.hFVIIIco6XTEN.B19Δ135 B19Δ135 B19Δ135
细胞系-2 Sf.hFVIIIco6XTEN.B19.WT B19.WT B19.WT
细胞系-3 Sf.hFVIIIco6XTEN.GPVΔ135 GPVΔ162 GPVΔ162
细胞系-4 Sf.hFVIIIco6XTEN.GPV.WT GPV.WT GPV.WT
细胞系-5 Sf.hFVIIIco6XTEN.GPV.Asy GPVΔ162 GPV.WT
细胞系-6 Sf.hFVIIIco6XTEN.AAV2.WT AAV2.WT AAV2.WT
细胞系-7 Sf.hFVIIIco6XTEN.AAV2.Asy1 AAV2Δ15Δ11 AAV2Δ15
细胞系-8 Sf.hFVIIIco6XTEN.AAV2.Asy2 AAV2.WT AAV2Δ15
细胞系-9 Sf.hFVIIIco6XTEN.AAV2.Asy3 AAV2Δ15Δ11 AAV2.WT
实施例9：从稳定细胞系产生人FVIIIco6XTEN ceDNA载体
为了测试稳定细胞系方法，使用编码具有非AAV和AAV的对称或不对称型ITR的hFVIIIco6XTEN表达盒(表4)的每个细胞系的多克隆群体。将细胞用编码Rep的每种重组BEV(图5B-D)的滴定工作原液(P2)感染，感染复数(MOI)为3pfu/细胞。将细胞在室温下轻轻翻滚1.5h，以500xg沉淀5min，吸出上清液，并且将细胞用10mL新鲜ESF-921培养基洗涤一次。最后，将细胞悬浮于50mL ESF-921培养基中，并且然后在摇床培养箱中在28℃下孵育72h。在感染后72h，收获感染细胞，并且将沉淀用1x PBS洗涤一次以去除残留的杆状病毒颗粒和/或培养基。然后，根据制造商的说明，通过PureLink Maxi Prep DNA分离试剂盒(Invitrogen)分离ceDNA载体。通过0.8％至1.2％琼脂糖凝胶电泳分析洗脱级分，以确定每种ceDNA载体的产量和纯度。结果显示出对应于具有不同强度的hFVIIIco6XTEN的大小(约7.0kb)的DNA条带以及高分子量条带，如前面观察到的(图9A-C)。有趣的是，所有测试的细胞系均显示出对应于hFVIIIco6XTEN表达盒的大小的DNA条带，而与侧接的对称和/或不对称型ITR无关。与B19或AAV2细胞系相比，GPV细胞系-3、-4和-5显示出不同大小的多个条带。
实施例10：来自ceDNA的人FVIIIco6XTEN表达
为了确定ceDNA是否可以用作用于治疗血友病A患者的非病毒基因疗法载体，进行体外测定以在肝细胞来源的癌性人Huh7细胞中测试来自ceDNA的人FVIII表达。首先，将Huh7细胞以5x105个细胞/mL接种在24孔板中的补充有10％ FBS和0.1％抗生素混合物(InvitrogenTM)的改良IMEM培养基(GibcoTM)中，并且然后在具有CO2(5％)的37℃培养箱中孵育48h以实现由于静态细胞生长而形成的单层。实现这种生长条件以模拟体内非分裂肝细胞的细胞核中的hFVIIIco6XTEN表达。根据制造商的说明，使用Lipofectamine3000(InvitrogenTM)用对应于hFVIIIco6XTEN表达盒大小的约1ug凝胶纯化的ceDNA转染单层。将编码侧接有对称型截短型ITR的hFVIIIco6XTEN的质粒DNA用作对照(pCLDV-1、-3和-7，表3)。在转染后18h，吸出转染混合物，并且用补充有10％ FBS和0.1％抗生素混合物的新鲜IMEM培养基培养细胞。在培养后48h和72h，从每种处理中等分出无细胞上清液，并且根据制造商的说明，通过ChromogenixSP因子VIII生色测定测量分泌的hFVIIIco6XTEN。将FVIII活性用标准品归一化并作为U/mL绘制在图10中。测定结果显示除hFVIII.B19Δ135.ceDNA外，所有测试样品的hFVIII表达水平随时间增加。该数据表明，FVIII是从可能在Huh7细胞的非分裂单层的细胞核中转染的ceDNA载体表达的。与AAV系6和8相比，从GPV细胞系-3、-4和-5获得的ceDNA显示出低水平的FVIII表达，这表明GPV ITR在整合到细胞基因组中时最有可能被截短，如上所述。出人意料的是，从B19细胞系-1和-2获得的ceDNA未显示出可检测的hFVIIIco6XTEN表达，而其在用作对照的质粒DNA(pCLDV-1，表3)中是可检测的。总的来说，GPV和AAV的ceDNA载体在Huh7细胞中显示出生理水平下的持续hFVIII表达，这表明ceDNA可以用作非病毒基因疗法载体(图10)。单独的细胞系描述于表5中。
实施例11：通过瞬时转染进行的人FVIIIco6XTEN ceDNA载体产生
瞬时基因表达系统是在杆状病毒-昆虫细胞系统中进行功能分析的最重要技术之一。该系统被开发用于在瞬时表达质粒中在杆状病毒启动子的控制下表达外来基因。此外，该系统为载体构建和蛋白质合成提供了更短的周转时间，避免了与病毒感染和细胞裂解相关的挑战，并且提供了用于观察蛋白质的细胞运输的稳健手段。杆状病毒基因启动子通常根据其在感染周期中的转录开始分为即早期、早期、晚期和极晚期启动子。其中，只有即早期(ie)基因启动子被宿主RNA聚合酶II识别，并且不依赖于病毒转录因子，从而使其适合于昆虫细胞中的无杆状病毒的异源蛋白表达。最广泛且可商购的瞬时基因表达系统是基于黄杉毒蛾多核多角体病毒(OpMNPV)的即早期(ie)基因启动子开发的。与其他即早期(ie)基因启动子相比，OpMNPV的OpIE2启动子已显示出为Sf细胞中的异源蛋白表达提供强大活性(Bleckmann等人,2016)。最近，还描述了基于聚乙烯亚胺(PEI)介导的在OpIE2启动子控制下的瞬时基因表达的无杆状病毒系统(Puente-Massaguer等人,2020)。
因此，假设Rep蛋白的瞬时表达可以从稳定细胞系中“挽救”人FVIIIco6XTENceDNA载体。为了测试该假设，利用了PEI介导的在OpMNPV即早期(OpIE2)启动子下的瞬时Rep蛋白表达以用于在稳定细胞系中产生无杆状病毒ceDNA。通过(皮斯卡塔韦，新泽西州)合成来自OpMNPV基因组(GenBank登录号NC_001875.2)的OpIE2启动子序列(SEQID NO:15)。将合成的启动子序列克隆以替代Rep蛋白表达构建体中的多角体蛋白或即早期启动子(图11A、11C、11E)。将所得瞬时表达质粒pFastBac.OpIE2.B19.Rep(图11B)、pFastBac.OpIE2.GPV.Rep(图11D)和pFastBac.OpIE2.AAV2.Rep(图11F)用于转染编码具有非AAV和AAV的对称或不对称型ITR的人FVIIIco6XTEN表达盒的稳定细胞系(表5)。
将编码具有非AAV和AAV的对称或不对称型ITR的人FVIIIco6XTEN表达盒的稳定细胞系(表5)用编码在OpMNPV即早期(OpIE2)启动子下的B19.Rep、GPV.Rep或AAV2.Rep的瞬时表达质粒(图11)和编码之前是转录增强子hr5元件且之后是AcMNPV p10多腺苷酸化信号的在AcMNPV即早期(ie1)启动子下的嘌呤霉素抗性标记的质粒进行超级转化，以产生新的稳定细胞系组。如实施例8中所述，用嘌呤霉素选择转化的细胞并扩增至摇瓶培养。将这些细胞系用作用于产生无杆状病毒的人FVIIIco6XTEN ceDNA载体的生产细胞系。
实施例12：经修饰的FVIIIXTEN表达盒
假设可以通过针对靶向宿主对cDNA进行密码子优化来提高转基因表达水平。来自V1.0 FVIIIco6XTEN表达盒的生理水平的FVIII表达已在如美国公开号20190185543中所述的先前研究中得到证明。然而，为了进一步改善靶标特异性并降低免疫原性，对FVIIIXTENcDNA进行密码子优化并缺失CpG重复序列，以逃避针对编码具有细小病毒ITR的FVIIIXTEN表达盒的DNA载体产生的固有免疫应答。产生了经修饰的V2.0FVIIIXTEN表达盒，其包含在肝脏特异性修饰小鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子(mTTR482)以及增强子元件(A1MB2)调节下的与XTEN 144肽(FVIIIXTEN)融合的B结构域缺失(BDD)的经密码子优化的人因子VIII(BDDcoFVIII)、杂合的合成内含子(嵌合内含子)、土拨鼠转录后调节元件(WPRE)和牛生长激素多腺苷酸化(bGHpA)信号。V2.0 FVIIIXTEN表达盒包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
初始的体内功效研究显示，与V1.0 FVIIIXTEN表达盒相比FVIII活性的显著改善(数据未示出)。因此，将V2.0 FVIIIXTEN表达盒用于产生重组BIVVBac杆粒，如上所述(实施例6)。然后，将工程化的细小病毒ITR(包括AAV2 WT(图12A)、B19 WT或最小型(SEQ IDNO.16)(图12B)和GPVΔ120(SEQ ID NO.17)或GPVΔ186(SEQ ID NO.18)(图12C)插入到V2.0 FVIIIXTEN表达盒(SEQ ID NO:19)中，并且使用如下所述的三种不同方法测试杆状病毒系统中的FVIIIXTEN ceDNA载体产生。
实施例13：FVIIIXTEN ceDNA产生的方法
在杆状病毒-昆虫细胞系统中，重组BEV递送在强启动子下的感兴趣基因，并且提供病毒在昆虫细胞中复制所必需的转录复合物。该系统提供了将感兴趣转基因以稳定细胞系的形式插入在杆状病毒基因组和/或昆虫细胞基因组中的灵活性。杆状病毒系统的这些优势在ceDNA产生的三种不同方法的设计中得到了利用，从而根据可扩展性的难易度提供平台选择的灵活性。
单BAC：
为了研究单Bac方法用于转基因表达的用途，使用了BIVVBac杆粒。BIVVBac被设计为在杆状病毒基因组内的两个不同位点处通过两种不同的机制接受多个转基因插入，如实施例1中所述。通过Tn7转座将优化的FVIIIXTEN表达盒(SEQ ID NO:19)与细小病毒ITR一起插入在BIVVBac中多角体蛋白基因座中的微型attTn7位点处，并且在同一骨架中，通过Cre-LoxP重组将ITR特异性复制(Rep)基因表达盒插入在EGT基因座中的LoxP位点处，如上所述(实施例6)。然后产生重组BEV并将其用于在Sf9细胞中感染以产生FVIIIXTEN ceDNA，如图13A中所描绘。使用用于控制Rep表达水平的不同启动子来证明单Bac方法用于ceDNA产生的概念，如下所述。
双BAC：
为了研究双Bac方法用于转基因表达的用途，通过Tn7转座将优化的FVIIIXTEN表达盒与细小病毒ITR一起插入在和/或将ITR特异性复制(Rep)基因表达盒插入在两种不同的BIVVBac杆粒中的多角体蛋白基因座中的微型attTn7位点处，如上文在实施例5中所述。然后产生重组BEV并将其用于在Sf9细胞中共感染以产生FVIIIXTEN ceDNA，如图13B中所描绘。使用两种杆状病毒的不同感染复数(MOI)比率和对Rep表达水平的微调以获得可重复的ceDNA生产力来研究与双BAC方法相关的挑战，如以下实验中所述。
稳定细胞系：
为了研究稳定细胞系方法用于转基因表达的用途，用优化的具有细小病毒ITR的FVIIIXTEN表达盒产生稳定细胞系，如实施例8中所述。重组杆粒还通过以下方式产生：通过Tn7转座将ITR特异性复制(Rep)基因表达盒插入在BIVVBac杆粒中多角体蛋白基因座中的微型attTn7位点处，如上文在实施例5中所述。然后产生重组Rep.BEV并将其用于在FVIIIXTEN稳定细胞系中感染以产生FVIIIXTEN ceDNA，如图13C中所描绘。通过使用GFP作为代表的FACS细胞分选富集FVIIIXTEN转化体以加快产生稳定细胞系的过程来研究与稳定细胞系方法相关的挑战，如以下实验中所述。
实施例14：从单BAC产生FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN)载体
如上所述，使用单BAC方法测试重组BEV在Sf9细胞中的FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN)产生，所述重组BEV编码具有AAV2 WT或B19 WT ITR的V2.0FVIIIXTEN及其在AcMNPV多角体蛋白启动子下的相应Rep基因。将约2.0x106/mL细胞以0.1、0.5、1.0、2.0或3.0噬斑形成单位(pfu)/细胞的MOI用单BAC BEV感染(图14A、图15A)。将细胞悬浮到50mL无血清ESF-921培养基中，并且然后在28℃摇床培养箱中孵育72-96h或直到活力达到60％-70％。在感染后约96h，收获感染细胞，并且处理沉淀，以用于根据制造商的说明使用PureLink最大制备型DNA分离试剂盒(Invitrogen)进行ceFVIIIXTEN分离。在0.8％至1.2％琼脂糖凝胶电泳上分析最终洗脱级分以确定ceFVIIIXTEN生产力。
ceFVIIIXTEN AAV2 ITR
AAV2单BAC的琼脂糖凝胶分析(图14B)在所有测试的MOI中显示出对应于ceFVIIIXTEN AAV2 ITR的大小(约8.5kb)的DNA条带，其中与其他处理相比，在1.0pfu/细胞的MOI下获得最高生产力(图14C)。该结果与早期数据形成对比，所述早期数据表明从HBoV1ITR构建体获得的ceFVIIIXTEN显示出随着病毒载量的增加生产力的增加(数据未示出)。不受理论的束缚，这可表明与HBoV1-NS1蛋白相比，AAV2 Rep在AAV2WT ITR的末端解离位点处对于DNA复制具有不同的结合机制和核酸内切酶活性，这可能是由于相应ITR的不同发夹结构(T形与U形)所致。
ceFVIIIXTEN B19 ITR
B19单BAC的琼脂糖凝胶分析(图15B)在所有测试的MOI中显示出对应ceFVIIIXTENB19 ITR的大小(约8.5kb)的DNA条带，但生产力水平较低(图15C)。与AAV2或HBoV1不同，B19单BAC的更高病毒载量未改善ceFVIIIXTEN生产力，这可能是由于在感染后期在强(多角体蛋白)杆状病毒启动子下表达的B19-NS1水平更高。这些结果表明全长(WT)细小病毒ITR和化学计量REP表达的组合可能对于在杆状病毒系统中获得更高的ceDNA生产力至关重要。
总之，这些实验显示，单BAC方法确实证明了从编码具有细小病毒ITR的FVIIIXTEN和NS1转基因的单一重组BEV产生ceDNA的概念。它还显示了在杆状病毒穿梭载体(BIVVBac)中不同基因座处插入多个转基因的可行性和功能性，以及其用于在杆状病毒昆虫细胞系统中产生重组AAV载体的潜在用途。
实施例15：从双BAC产生FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN)载体
为了研究用于ceDNA转基因表达的双BAC方法，通过以下方式来测试若干种不同的共感染条件：保持比率恒定并且以不同MOI用双BAC共感染Sf9细胞，或者通过保持MOI不变并且用不同比率的双BAC共感染Sf9细胞。在每种情况下，不去除病毒接种物，并且将细胞在28℃摇床培养箱中孵育直到活力达到60％-70％。在感染后约96h，收获感染细胞，并且处理沉淀，以用于根据制造商的说明使用PureLink最大制备型DNA分离试剂盒(Invitrogen)进行ceFVIIIXTEN分离。在0.8％至1.2％琼脂糖凝胶电泳上分析最终洗脱级分以确定ceFVIIIXTEN生产力。
ceFVIIIXTEN AAV2 ITR
将接种在50mL无血清ESF-921培养基中的约2.0x106/mL的细胞用AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITRTn7 BEV的滴定工作原液(P2)(MOI为0.01、0.1、0.3、1.0或3.0pfu/细胞)和AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepΔVP80Tn7 BEV(先前在美国专利申请号63/069,115中描述)的滴定工作原液(P2)(MOI为0.001、0.01、0.03、0.1或0.3pfu/细胞以分别保持1:10比率恒定)共转染(图16A至图16B)。AAV2双BAC的琼脂糖凝胶分析显示出在不同的共感染MOI下，与污染杆状病毒DNA(vDNA)相比的不同程度的ceFVIIIXTEN(ceDNA)生产力。尽管0.1-0.01和3.0-0.3pfu/细胞的MOI显示出等同水平的ceFVIIIXTEN(ceDNA)生产力，但后面的共感染MOI显示出较低水平的污染vDNA(图16C)。
这些结果表明，尽管AAV2双BAC方法显示出与单BAC等同水平的ceFVIIIXTEN生产力，但是用该纯化方法共同纯化的其他杂质的水平存在显著差异。不受理论束缚，这可以进一步强调化学计量的AAV2 REP78/REP52表达对于在Sf9细胞中实现更高的ceFVIIIXTEN生产力的重要性。
ceFVIIIXTEN B19 ITR
将接种在50mL无血清ESF-921培养基中的约2.0x106/mL的细胞用AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.B19.WT.ITRTn7 BEV的滴定工作原液(P2)(MOI为0.1、0.3、0.5、1.0、3.0或5.0pfu/细胞)和AcBIVVBac.Polh.B19-NS1Tn7 BEV的滴定工作原液(P2)(MOI为0.01、0.03、0.05、0.1、0.3或0.5pfu/细胞以分别保持1:10比率或MOI为0.02、0.06、0.1、0.2或0.6pfu/细胞以分别保持1:5比率)共转染(图17A至图17B)。与AAV2双BAC不同，B19双BAC的琼脂糖凝胶分析显示出在不同的共感染MOI下，ceFVIIIXTEN(ceDNA)和污染杆状病毒DNA(vDNA)生产力的等同水平(图17C)。有趣的是，测试的条件中没有一个显示出像用B19单BAC获得的结果那样的ceFVIIIXTEN B19 ITR生产力的改善。
总之，B19单BAC和B19双BAC方法两者均证明了在杆状病毒系统中从非AAV细小病毒ITR产生ceDNA的概念。
ceFVIIIXTEN GPV ITR
将接种在50mL无血清ESF-921培养基中的约2.0x106/mL个细胞用AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.GPVΔ120.ITRTn7 BEV的滴定工作原液(P2)(以MOI为0.1、0.3、0.5、1.0、30或5.0pfu/细胞)和AcBIVVBac.Polh.GPV-NS1Tn7 BEV的滴定工作原液(P2)(MOI为0.01、0.03、0.05、0.1、0.3或0.5pfu/细胞以分别保持1:10比率或MOI为0.02、0.06、0.1、0.2pfu/细胞以分别保持1:5比率)共转染(图18A至图18B)。与AAV2或B19双BAC不同，GPV双BAC的琼脂糖凝胶分析在所有测试的MOI中未显示出可检测的对应于ceFVIIIXTEN的大小(约8.5kb)的DNA条带，除了在5.0-0.5pfu/细胞的MOI共感染下观察到的微弱条带(图18C)。用GPV双BAC获得的ceFVIIIXTEN生产力与GPV单BAC相关，其中V1.0 FVIIIco6XTEN与GPV不对称型ITR一起使用，如上所述(图7B，参见实施例7)。
在两项研究中，由于在FVIIIXTEN转基因盒的两端获得全长WT GPV ITR的克隆复杂性，对截短型GPV ITR进行测试。尽管如此，GPV单BAC和GPV双BAC方法两者均证明了ceDNA产生的概念，并且证明了最佳MOI比率和启动子选择对于在Sf9细胞中实现更高的FVIIIXTEN ceDNA生产力的重要性。
实施例16： 从稳定细胞系产生FVIIIXTEN ceDNA (ceFVIIIXTEN)载体
为了测试稳定细胞系方法，将用侧接有AAV2 WT、B19最小型或GPVΔ120ITR的V2.0FVIIIXTEN制得的每个细胞系的多克隆群体以约2.0x106/mL接种在50mL无血清ESF921培养基中，并且用ITR特异性REP.BEV的滴定工作原液(P2)以如指示的不同MOI感染。在每种情况下，不去除病毒接种物，并且将细胞在28℃摇床培养箱中孵育72-96h或直到活力达到60％-70％。在感染后约96h，收获感染细胞，并且处理沉淀，以用于根据制造商的说明使用PureLink最大制备型DNA分离试剂盒(Invitrogen)进行ceFVIIIXTEN分离。在0.8％至1.2％琼脂糖凝胶电泳上分析最终洗脱级分以确定ceFVIIIXTEN生产力。
ceFVIIIXTEN AAV2 ITR
如前面所述(实施例8)开发编码具有AAV2 WT ITR的V2.0 FVIIIXTEN的细胞系。然后将多克隆Sf.FVIIIXTEN.AAV2.WT.ITR细胞群用AcBIVVBac.Polh.AAV2.RepΔVP80Tn7 BEV(在美国专利申请号63/069,115中描述)的滴度工作原液(P2)以0.001、0.01、0.03、0.1、0.3或0.5pfu/细胞的MOI感染(图19A、19B)。从AAV2稳定细胞系中分离的ceFVIIIXTEN的琼脂糖凝胶分析在所有测试的MOI下显示出等同水平的生产力，除了未显示出对应于ceFVIIIXTEN的大小(约8.5kb)的可检测的DNA条带的0.001pfu/细胞的最低MOI。有趣的是，与较高MOI相比，以0.01和0.03pfu/细胞的MOI用REP.BEV感染的细胞显示出与污染杆状病毒DNA(vDNA)平行的更高ceFVIIIXTEN生产力(图19C)。这些结果表明，与AAV2单BAC或AAV2双BAC方法不同，稳定细胞系方法需要较低的病毒接种物来在Sf9细胞基因组中“挽救”稳定整合的侧接有AAV2 WT ITR的FVIIIXTEN表达盒。
总之，该项研究证明了用稳定整合了侧接有细小病毒ITR的FVIIIXTEN表达盒的细胞系产生ceDNA的概念。
ceFVIIIXTEN B19 ITR
如前面所述(实施例8)开发编码具有B19最小型ITR的V2.0 FVIIIXTEN的细胞系。然后将多克隆Sf.FVIIIXTEN.B19.最小型.ITR细胞群用AcBIVVBac.Polh.B19-NS1Tn7BEV的滴定工作原液(P2)以0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、3.0或5.0pfu/细胞的MOI感染(图20A、20B)。从B19稳定细胞系中分离的ceFVIIIXTEN的琼脂糖凝胶分析显示随着REP.BEV的MOI增加，DNA条带强度的水平渐增。然而，DNA条带略低于ceFVIIIXTEN的预期大小(约8.5kb)(图20C)。有趣的是，对于从B19稳定细胞系(实施例9，图9A)获得但具有不同ITR的V1.0 ceFVIIIXTEN观察到类似的显带图案。相比之下，从用编码具有B19 WT ITR的FVIIIXTEN的B19单BAC或双BAC感染的Sf9细胞获得的ceFVIIIXTEN显示出V2.0ceFVIIIXTEN的预期大小DNA条带(约8.5kb)(图15C和图17C)。
这些结果表明，虽然末端解离位点和REP结合元件存在于B19 ITR的截短型或最小型变体中，但对于B19-NS1可能需要全长(WT)序列来结合DNA并对DNA产生切口以进行有效复制。
ceFVIIIXTEN GPV ITR
如前面所述(实施例8)开发编码具有GPVΔ120ITR的V2.0 FVIIIXTEN的细胞系。然后将多克隆Sf.FVIIIXTEN.GPVΔ120.ITR细胞群用AcBIVVBac.Polh.GPV-NS1Tn7BEV的滴定工作原液(P2)以0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5、1.0、3.0或5.0pfu/细胞的MOI感染(图21A、21B)。与B19细胞系不同，从GPV稳定细胞系中分离的ceFVIIIXTEN的琼脂糖凝胶分析显示，随着感染MOI增加，生产力水平渐减。
有趣的是，对于ceFVIIIXTEN GPV ITR，与其他细小病毒ITR相比，在ceFVIIIXTEN生产力方面观察到相反的趋势。与测试的其他MOI相比，用于在GPV细胞系中感染的最低MOI(0.01pfu/细胞)显示出ceFVIIIXTEN(ceDNA)的最高条带强度(图21C)。这些结果表明，至少在稳定细胞系的情况下，GPV-ITR介导的ceDNA产生需要非常低水平的GPV-NS1。此外，该数据表明，在GPV单BAC或双BAC中观察到的ceFVIIIXTEN的较低生产力(图7C、图18C)可能是由于高病毒载量所致，这间接对应于与ceFVIIIXTEN产生最初需要的相比更多的更高水平GPV-NS1表达。
尽管如此，稳定细胞系方法确实证明了从稳定整合了侧接有非AAV细小病毒ITR的FVIIIXTEN表达盒的细胞系产生ceDNA的概念。
实施例17：FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN)载体纯化
在杆状病毒-昆虫细胞系统中，重组BEV递送在强启动子下的感兴趣基因，并且提供病毒在昆虫细胞中复制所必需的转录复合物。通常，杆状病毒DNA基因组在细胞核中复制并产生数以千万个子代病毒颗粒，每个子代病毒颗粒含有全长DNA基因组。已经证明杆状病毒基因组DNA与ceDNA共纯化，同时使用基于质粒DNA的纯化方法(如硅胶柱)从昆虫细胞中分离DNA。商业质粒DNA试剂盒柱通常不被设计用于基于分子量分离DNA，并且因此，通常样品中存在的所有形式的DNA均可以与这些柱结合。此外，大分子量DNA的结合能力可能与低分子量DNA不同，并且基于阴离子交换的试剂盒柱未基于不同大小的DNA的结合效率进行优化。
假设在ceDNA制备物中观察到的高分子量DNA(>20kb)最可能是与低分子量ceFVIIIXTEN(约8.5kb)共同纯化的杆状病毒和/或Sf9细胞基因组DNA(参见例如图14C至图21C)。先前，采用间接方法以通过敲除杆状病毒衣壳基因(如VP80)来减少杆状病毒DNA，所述杆状病毒衣壳基因是产生感染性子代病毒产生所需的。这种方法显示出从敲除BEV获得的ceDNA制备物中杆状病毒DNA的显著减少(参见美国专利申请号63/069,115)。虽然这种方法在减少杆状病毒DNA污染方面是有效的，但它无法减少细胞基因组DNA，其在从感染细胞沉淀中获得的总DNA中以显著量(约60％)存在。
在该研究中，采用了将FVIIIXTEN ceDNA与其余不需要的DNA分离的直接方法，并且证明所述直接方法从来自感染细胞沉淀的总DNA制备物中高效获得纯化的FVIIIXTEN(>95％纯度)。这种新颖的方法利用了制备型电泳，其广泛用于根据大小和电荷分离不同的蛋白质分子。参见例如Michov,B.(2020)Electrophoresis.Berlin,Boston:De Gruyter,第405-424页。例如，Bio-Rad 491型号prep cell或其他此类单元可用于基于大小分离复杂分子。
在目前的研究中，采用制备型电泳技术将FVIIIXTEN ceDNA与高分子量DNA分离，并且成功获得了待用于体内研究的纯化ceDNA，如下所述。
ceDNA纯化的整个工作流程如图22中所示，其中过程开始于将无血清昆虫细胞培养基中的Sf9细胞培养物从0.5L放大至1.5L或更高体积(图22A)。在达到约2.5x106/mL的所需细胞密度后，通常在接种密度为约1.3x106/mL的情况下孵育2天后，将细胞用单BAC或双BAC BEV(取决于用于产生ceDNA的方法)以优化的MOI感染，并且将细胞在28℃摇床培养箱中孵育，直到活力达到约60％-70％，这通常需要约4天(图22B)。一旦活力达到约70％，就收获细胞并且对其进行处理，以根据制造商的说明通过阴离子交换色谱试剂盒柱(如PureLink HiPure Expi质粒Gigaprep纯化试剂盒(Invitrogen))进行总DNA纯化。在0.8％至1.2％琼脂糖凝胶电泳上检查纯化DNA材料的等分试样以确定DNA生产力和完整性(图22C)。然后将纯化的材料加载到制备型琼脂糖凝胶电泳单元上，所述单元含有0.5％制备型琼脂糖凝胶和0.25％堆积琼脂糖凝胶，根据制造商的说明进行组装。在缓冲液再循环流速为约50mL/min且洗脱缓冲液速率为50μL/min的情况下，将样品在4℃下以低电压(约40恒定伏特)运行6-7天，以在70-80min将每个级分收集在级分收集室中。在连续洗脱电泳之后，在0.8％至1.2％琼脂糖凝胶电泳上检查20μL的每个级分以确定FVIIIXTEN ceDNA的纯度(图22D)。将所需级分合并以在-20C下用3M NaOAc(pH 5.5)和100％ EtOH沉淀1-2h。最后，将沉淀的FVIIIXTEN ceDNA以高速沉淀并且用70％ EtOH洗涤一次，然后再悬浮到TE(pH 8.0)缓冲液中。将纯化的FVIIIXTEN ceDNA再次在0.8％至1.2％琼脂糖凝胶电泳上检查以确认纯度和完整性，然后注射到动物中以进行体内功效研究(图22E)。
实施例18：FVIIIXTEN ceDNA(ceFVIIIXTEN)体内功效
HemA小鼠中的ceFVIIIXTEN全身性施用
为了在体内验证ceDNA的功能，将纯化的具有AAV2或HBoV1 WT ITR的ceFVIIIXTEN以0.3μg、1.0μg或2.0μg/小鼠(分别等同于12μg、40μg和80μg/kg)经由流体动力学尾静脉注射来全身性注射在hFVIIIR593C+/+/HemA小鼠中。以7天间隔收集来自注射小鼠的血浆样品，并且通过生色测定测量FVIII活性，如上所述。
对于ceFVIIIXTEN注射的群组，归一化为占正常值百分比的血浆FVIII活性示于图23中。结果显示出HemA小鼠中的剂量依赖性反应，其中在测试的最高剂量的AAV2或HBoV1ceDNA中观察到FVIII表达的超生理水平(>正常值的500％)。然而，在ceFVIIIXTEN AAV2ITR注射群组中，观察到FVIII表达水平的逐渐下降直到注射后第140天，此后水平稳定。有趣的是，ceFVIIIXTEN HBoV1 ITR的FVIII表达水平显示出与用ceFVIIIXTEN AAV2 ITR注射的小鼠相似的表达趋势(数据未示出)。
总之，这些体内功效研究验证了ceFVIIIXTEN的功能性，并且证明细小病毒ITR可用于在杆状病毒昆虫细胞系统中产生编码感兴趣转基因的功能性ceDNA。
实施例19：从单BAC产生FVIIIXTEN HBoV1 ITRs ceDNA载体
在Sf9细胞中测试编码FVIIIXTEN HBoV1 ITR和HBoV1 NS1基因的单BAC BEV的FVIIIXTEN ceDNA产生。用每种BEV的滴定工作原液(P2)以0.1、0.5、1.0、2.0或3.0噬斑形成单位(pfu)/细胞的感染复数(MOI)感染约2.5×106/mL细胞(图24A)。将细胞悬浮于50mL无血清ESF-921培养基中，然后在28℃振荡培养箱中孵育72-96h或直至细胞活力达到60％-70％。在感染后约96h，收获感染细胞，并且处理沉淀，以用于根据制造商的说明书通过PureLink Maxi Prep DNA分离试剂盒(Invitrogen)进行FVIIIXTEN ceDNA载体分离。在0.8％至1.2％琼脂糖凝胶电泳上分析最终洗脱级分，以确定FVIIIXTEN ceDNA载体的生产力。
编码具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN和多角体蛋白驱动的HBoV1-NS1的AcBIVVBac(mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRs)Polh.HBoV1.NS1LoxP BEV(图24B)的琼脂糖凝胶分析示于图24C中。结果显示在所有测试剂量中，DNA条带对应于FVIIIXTEN HBoV1 ITRs(约8.5kb)ceDNA的大小，随着MOI增加生产力增加。
该结果与用AAV2 ITRs单BAC获得的ceDNA生产力(其中先前观察到生产力随着病毒载量的增加而降低)相反。不受理论的约束，HBoV1-NS1蛋白可以由于REH和LEH ITR的独特结构而在HBoV1 ITR的末端解离位点具有独特的结合机制和核酸内切酶活性以用于DNA复制。
总之，这些实验显示，单BAC方法确实证明了从编码具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN和NS1转基因的单一重组BEV产生ceDNA的概念。它还显示了在杆状病毒穿梭载体(BIVVBac)中不同基因座处插入多个转基因的可行性和功能性，以及其用于在杆状病毒昆虫细胞系统中产生重组AAV载体的潜在用途。
实施例20：从双BAC产生FVIIIXTEN HBoV1 ITRs ceDNA载体
为了研究用于转基因表达的双BAC方法，测试编码FVIIIXTEN HBoV1 ITRs的克隆重组BEV与多角体蛋白驱动的HBoV1-NS1 BEV，以用于以1:10和1:5比率的不同MOI或以0.3、1.0、3.0和5.0pfu/细胞的MOI的不同比率共感染以在Sf9细胞中产生FVIIIXT EN ceDNA载体(图25A)。具体地，将约2.0×106/mL细胞接种在50mL无血清ESF-921培养基中，并且分别用MOI为0.1、0.3、0.5、1.0、3.0、5.0pfu/细胞的AcBIVVBac.mTTR.FVIIIXTEN.HBoV1.ITRsTn7 BEV与MOI为0.01、0.03、0.05、0.1、0.3、0.5pfu/细胞来保持恒定1:10比率或MOI为0.02、0.06、0.1、0.2、0.6、1.0pfu/细胞来保持恒定1:5比率的AcBIVVBac.Polh.HBoV1-NS1Tn7 BEV的滴定工作原液(P2)共感染。类似地，对细胞还以1:1、1:2、1:5或1:10比率以0.3、1.0、3.0或5.0pfu/细胞的恒定MOI共感染(图25B)。在每种情况下，不去除病毒接种物，并且将细胞在28℃摇床培养箱中孵育直到活力达到60％-70％。在感染后约96h，收获感染细胞，并且处理沉淀，以用于根据制造商的说明书通过PureLinkMaxi Prep DNA分离试剂盒(Invitrogen)进行FVIIIXTEN ceDNA载体分离。在0.8％至1.2％琼脂糖凝胶电泳上分析最终洗脱级分，以确定ceDNA生产力。
如所预期的，琼脂糖凝胶分析显示出不同条件下FVIIIXTEN ceDNA生产力的不同程度。然而，以3.0pfu/细胞的MOI共感染的双BAC显示FVIIIXTEN ceDNA生产力水平随病毒载量比率增加而增加，与测试的其他条件相比，1:10比率下的生产力水平是最高的(图25C)。较高的病毒载量显现提高了FVIIIXTEN HBoV1 ITRs ceDNA的生产力，这与在单BACBEV中的观察结果一致(参见实施例6)。这进一步表明在Sf9细胞中HBoV1-ITR依赖性FVIIIXTEN ceDNA复制需要更高水平的HBoV1-NS1。
单BAC或双BAC的结果表明，HBoV1-NS1复制水平对杆状病毒系统中FVIIIXTENceDNA生产力具有显著影响。
总之，这些实验已经表明，双BAC方法确实证明了从编码具有HBoV1 ITR的FVIIIXTEN和/或NS1转基因的两种重组BEV产生ceDNA的概念。这些实验也证明了最佳MOI比率和/或启动子对于在Sf9细胞中实现FVIIIXTEN ceDNA的较高生产力的重要性。
序列
表6.另外的核苷酸或氨基酸序列。
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Claims (195)

1.一种杆粒，所述杆粒包含：
细菌复制子；
选择性标记序列；
包含用于插入转座子的第一优先靶位点的第一报告基因；
与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的第二报告基因；以及
能够介导位点特异性重组事件的第二优先靶位点。
2.根据权利要求1所述的杆粒，其中所述细菌复制子是低拷贝数复制子。
3.根据权利要求2所述的杆粒，其中所述低拷贝数复制子是微型F复制子。
4.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。
5.根据权利要求4所述的杆粒，其中所述抗生素抗性基因是卡那霉素抗性基因。
6.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第一报告基因编码能够代谢生色底物的酶。
7.根据权利要求6所述的杆粒，其中所述酶是LacZα或其功能部分。
8.根据权利要求6或7所述的杆粒，其中所述生色底物是蓝色-gal或X-gal。
9.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中用于插入转座子的所述第一优先靶位点不破坏所述第一报告基因的阅读框。
10.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第一优先靶位点是细菌转座子的附着位点。
11.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第一优先靶位点是T7转座子的附着位点。
12.根据权利要求11所述的杆粒，其中所述转座子是T7转座子。
13.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第二报告基因编码荧光蛋白。
14.根据权利要求13所述的杆粒，其中所述荧光蛋白是红色荧光蛋白。
15.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述杆状病毒诱导型启动子是39K启动子。
16.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述第二优先靶位点包含LoxP位点或其变体。
17.根据任一前述权利要求所述的杆粒，其中所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
18.一种杆粒，所述杆粒包含：
微型F复制子；
抗生素抗性基因；
包含T7转座子的附着位点的LacZα基因或其功能部分；
与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及
LoxP位点或其变体。
19.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
细菌复制子；
第一选择性标记序列；
插入到第一报告基因中的异源序列，其中所插入的异源序列破坏了所述第一报告基因的阅读框；
与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的第二报告基因；以及
能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点。
20.根据权利要求19所述的重组杆粒，其中所述异源序列包含异源基因。
21.根据权利要求19或20所述的重组杆粒，其中所述异源基因包含编码蛋白质的序列。
22.根据权利要求20或21所述的重组杆粒，其中所述异源序列包含表达控制序列。
23.根据权利要求22所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列与所述编码蛋白质的序列可操作地连接。
24.根据权利要求22或23所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列包含杆状病毒启动子。
25.根据权利要求24所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒启动子是即早期、早期、晚期或极晚期基因启动子。
26.根据权利要求24或25所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、即早期1启动子和即早期2启动子。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列包含多腺苷酸化信号。
28.根据权利要求21-27中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是从病毒科细小病毒科成员的基因组中分离的Rep蛋白。
29.根据权利要求21-28中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是细小病毒Rep蛋白。
30.根据权利要求29所述的重组杆粒，其中所述细小病毒Rep蛋白选自B19 Rep、AAV2Rep、HBoV1 Rep和GPV Rep。
31.根据权利要求19-30中任一项所述的重组杆粒，其中所述异源序列包含第二选择性标记序列。
32.根据权利要求31所述的重组杆粒，其中所述第二选择性标记序列包含庆大霉素抗性基因。
33.根据权利要求19-32中任一项所述的重组杆粒，其中所述细菌复制子是微型F复制子。
34.根据权利要求19-33中任一项所述的重组杆粒，其中所述第一选择性标记序列包含卡那霉素抗性基因。
35.根据权利要求19-34中任一项所述的重组杆粒，其中所述第一报告基因编码LacZα或其功能部分。
36.根据权利要求19-35中任一项所述的重组杆粒，其中所述第二报告基因编码红色荧光蛋白。
37.根据权利要求19-36中任一项所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒诱导型启动子是39K启动子。
38.根据权利要求19-37中任一项所述的重组杆粒，其中所述优先靶位点包含LoxP位点或其变体。
39.根据权利要求19-38中任一项所述的重组杆粒，其中所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
40.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
插入到微型attTn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码Rep，并且其中所插入的Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；以及
LoxP位点或其变体。
41.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
细菌复制子；
第一抗生素抗性基因；
插入到微型attTn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码Rep，并且其中所插入的Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；
与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及
LoxP位点或其变体。
42.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
细菌复制子；
第一抗生素抗性基因；
插入到微型attTn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码B19 Rep，并且其中所插入的B19 Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；
与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及
LoxP位点或其变体。
43.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
细菌复制子；
第一抗生素抗性基因；
插入到微型attTn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码GPV Rep，并且其中所插入的GPV Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；
与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及
LoxP位点或其变体。
44.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
细菌复制子；
第一抗生素抗性基因；
插入到微型attTn7位点中的异源序列，其中所述异源序列编码AAV2 Rep，并且其中所插入的AAV2 Rep破坏了LacZα基因或其功能部分的阅读框；
与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及
LoxP位点或其变体。
45.一种核酸载体，所述核酸载体包含：
用于在第一细菌株中繁殖所述核酸载体的第一复制起点，其中所述第一复制起点是条件性复制起点；
用于在第二细菌株中繁殖所述核酸载体的第二复制起点；
用于插入异源序列的多克隆位点；
选择性标记序列；
报告基因；以及
能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点。
46.根据权利要求45所述的载体，其中所述第一复制起点是以pi蛋白的存在为条件的。
47.根据权利要求45或46所述的载体，其中所述第一复制起点是R6Kγ。
48.根据权利要求45-47中任一项所述的载体，其中所述第一细菌株包含pi蛋白。
49.根据权利要求45-48中任一项所述的载体，其中所述第二复制起点是pUC57。
50.根据权利要求45-49中任一项所述的载体，其中所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。
51.根据权利要求50所述的载体，其中所述抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因。
52.根据权利要求45-51中任一项所述的载体，其中所述报告基因编码荧光蛋白。
53.根据权利要求52所述的载体，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
54.根据权利要求45-53中任一项所述的载体，其中所述优先靶位点包含LoxP位点或其变体。
55.根据权利要求45-54中任一项所述的载体，其中所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
56.一种核酸载体，所述核酸载体包含：
用于在第一细菌株中繁殖所述核酸载体的第一复制起点，其中所述第一复制起点是条件性复制起点；
用于在第二细菌株中繁殖所述核酸载体的第二复制起点；
异源序列；
选择性标记序列；
报告基因；以及
能够介导位点特异性重组事件的优先靶位点。
57.根据权利要求56所述的载体，其中所述异源序列包含异源基因。
58.根据权利要求57所述的载体，其中所述异源基因包含编码蛋白质的序列。
59.根据权利要求57或58所述的载体，其中所述异源序列包含表达控制序列。
60.根据权利要求59所述的载体，其中所述表达控制序列与所述编码蛋白质的序列可操作地连接。
61.根据权利要求59或60所述的载体，其中所述表达控制序列包含组织特异性启动子。
62.根据权利要求61所述的载体，其中所述组织特异性启动子是三重四脯氨酸(TTP)或鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。
63.根据权利要求59-62中任一项所述的载体，其中所述表达控制序列包含多腺苷酸化信号。
64.根据权利要求63所述的载体，其中所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。
65.根据权利要求59-64中任一项所述的载体，其中所述表达控制序列包含转录后调节元件。
66.根据权利要求65所述的载体，其中所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
67.根据权利要求58-66中任一项所述的载体，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
68.根据权利要求67所述的载体，其中所述治疗性蛋白质是凝血因子。
69.根据权利要求66所述的载体，其中所述凝血因子是因子VIII(FVIII)。
70.根据权利要求68或69所述的载体，其中所述凝血因子是FVIII-XTEN。
71.根据权利要求56-70中任一项所述的载体，其中所述异源序列包含5'反向末端重复序列(ITR)。
72.根据权利要求56-71中任一项所述的载体，其中所述异源序列包含3'反向末端重复序列(ITR)。
73.根据权利要求71或72所述的载体，其中所述5’ITR和所述3’ITR衍生自细小病毒。
74.根据权利要求73所述的载体，其中所述细小病毒选自B19、GPV、HBoV1和AAV2。
75.根据权利要求71-74中任一项所述的载体，其中所述5’ITR是衍生自B19的野生型或变体5’ITR。
76.根据权利要求71-74中任一项所述的载体，其中所述5’ITR是衍生自GPV的野生型或变体5’ITR。
77.根据权利要求71-74中任一项所述的载体，其中所述5’ITR是衍生自AAV2的野生型或变体5’ITR。
78.根据权利要求71-74中任一项所述的载体，其中所述5’ITR是衍生自HBoV1的野生型5’ITR。
79.根据权利要求75-77中任一项所述的载体，其中所述变体5’ITR是截短型5’ITR。
80.根据权利要求71-79中任一项所述的载体，其中所述3’ITR是衍生自B19的野生型或变体3’ITR。
81.根据权利要求71-78中任一项所述的载体，其中所述3’ITR是衍生自GPV的野生型或变体3’ITR。
82.根据权利要求71-78中任一项所述的载体，其中所述3’ITR是衍生自AAV2的野生型或变体3’ITR。
83.根据权利要求71-78中任一项所述的载体，其中所述3’ITR是衍生自HBoV1的野生型3’ITR。
84.根据权利要求80-82中任一项所述的载体，其中所述变体3’ITR是截短型3’ITR。
85.根据权利要求56-76中任一项所述的载体，其中所述第一复制起点是以pi蛋白的存在为条件的。
86.根据权利要求85所述的载体，其中所述第一复制起点是R6Kγ。
87.根据权利要求85或86所述的载体，其中所述第一细菌株包含pi蛋白。
88.根据权利要求56-87中任一项所述的载体，其中所述第二复制起点是pUC57。
89.根据权利要求56-88中任一项所述的载体，其中所述选择性标记序列包含抗生素抗性基因。
90.根据权利要求89所述的载体，其中所述抗生素抗性基因是氨苄青霉素抗性基因。
91.根据权利要求56-90中任一项所述的载体，其中所述报告基因编码荧光蛋白。
92.根据权利要求91所述的载体，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白。
93.根据权利要求56-92中任一项所述的载体，其中所述优先靶位点包含LoxP位点或其变体。
94.根据权利要求56-93中任一项所述的载体，其中所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
95.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
插入到第一报告基因中的第一异源序列，其中所插入的异源序列破坏了所述第一报告基因的阅读框；
能够介导位点特异性重组事件的第一优先靶位点；
包含第二异源序列的多克隆位点；以及
能够介导位点特异性重组事件的第二优先靶位点。
96.根据权利要求95所述的重组杆粒，其中所述第一异源序列包含第一异源基因。
97.根据权利要求96所述的重组杆粒，其中所述第一异源序列包含与编码蛋白质的序列可操作地连接的表达控制序列。
98.根据权利要求97所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列包含杆状病毒启动子。
99.根据权利要求98所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒启动子是即早期、早期、晚期或极晚期启动子。
100.根据权利要求99所述的重组杆粒，其中所述杆状病毒启动子选自多角体蛋白启动子、即早期1启动子和即早期2启动子。
101.根据权利要求97-100中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是从病毒科细小病毒科成员的基因组中分离的Rep蛋白。
102.根据权利要求97-101中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是细小病毒Rep蛋白。
103.根据权利要求102所述的重组杆粒，其中所述细小病毒Rep蛋白选自B19 Rep、AAV2Rep、HBoV1 Rep和GPV Rep。
104.根据权利要求95-103中任一项所述的重组杆粒，其中所述第二异源序列包含第二异源基因。
105.根据权利要求104所述的重组杆粒，其中所述第二异源序列包含与编码蛋白质的序列可操作地连接的表达控制序列。
106.根据权利要求105所述的重组杆粒，其中所述表达控制序列包含组织特异性启动子、多腺苷酸化信号和/或转录后调节元件。
107.根据权利要求106所述的重组杆粒，其中所述组织特异性启动子是三重四脯氨酸(TTP)或鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。
108.根据权利要求107所述的重组杆粒，其中所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。
109.根据权利要求107所述的重组杆粒，其中所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
110.根据权利要求105-109中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
111.根据权利要求110所述的重组杆粒，其中所述治疗性蛋白质是凝血因子。
112.根据权利要求111所述的重组杆粒，其中所述凝血因子是因子VIII(FVIII)。
113.根据权利要求111或112所述的重组杆粒，其中所述凝血因子是FVIII-XTEN。
114.根据权利要求95-113中任一项所述的重组杆粒，其中所述第二异源序列包含5’反向末端重复序列(ITR)。
115.根据权利要求95-114中任一项所述的重组杆粒，其中所述第二异源序列包含3’反向末端重复序列(ITR)。
116.根据权利要求115所述的重组杆粒，其中所述5’ITR衍生自病毒科细小病毒科的第一成员的基因组，并且所述3’ITR衍生自病毒科细小病毒科的第二成员的基因组。
117.根据权利要求116所述的重组杆粒，其中所述第一成员和所述第二成员是相同的。
118.根据权利要求116所述的重组杆粒，其中所述第一成员和所述第二成员是不同的。
119.根据权利要求114-118中任一项所述的重组杆粒，其中所述5’ITR和所述3’ITR衍生自细小病毒，所述细小病毒选自B19、GPV、HBoV1和AAV2。
120.根据权利要求119所述的重组杆粒，其中所述5’ITR是衍生自B19的野生型或截短型5’ITR。
121.根据权利要求119所述的重组杆粒，其中所述5’ITR是衍生自GPV的野生型或截短型5’ITR。
122.根据权利要求119所述的重组杆粒，其中所述5’ITR是衍生自AAV2的野生型或截短型5’ITR。
123.根据权利要求119所述的重组杆粒，其中所述5’ITR是衍生自HBoV1的野生型5’ITR。
124.根据权利要求119所述的重组杆粒，其中所述3’ITR是衍生自B19的野生型或截短型3’ITR。
125.根据权利要求119所述的重组杆粒，其中所述3’ITR是衍生自GPV的野生型或截短型3’ITR。
126.根据权利要求119所述的重组杆粒，其中所述3’ITR是衍生自AAV2的野生型或截短型3’ITR。
127.根据权利要求119所述的重组杆粒，其中所述3’ITR是衍生自HBoV1的野生型3’ITR。
128.根据权利要求95-126中任一项所述的重组杆粒，其中所述重组杆粒还包含细菌复制子。
129.根据权利要求128所述的重组杆粒，其中所述细菌复制子是微型F复制子。
130.根据权利要求95-129中任一项所述的重组杆粒，其中所述重组杆粒还包含一种或多种选择性标记序列。
131.根据权利要求130所述的重组杆粒，其中所述一种或多种选择性标记序列包含一种或多种抗生素抗性基因。
132.根据权利要求131所述的重组杆粒，其中所述一种或多种抗生素抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和庆大霉素抗性基因。
133.根据权利要求95-132中任一项所述的重组杆粒，其中所述第一报告基因编码LacZα或其功能部分。
134.根据权利要求95-133中任一项所述的重组杆粒，其中所述重组杆粒还至少包含第二报告基因和第三报告基因。
135.根据权利要求134所述的重组杆粒，其中所述第二报告基因和所述第三报告基因各自编码荧光蛋白。
136.根据权利要求135所述的重组杆粒，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
137.根据权利要求95-136中任一项所述的重组杆粒，其中所述第一优先靶位点和所述第二优先靶位点各自包含LoxP位点或其变体。
138.根据权利要求95-137中任一项所述的重组杆粒，其中所述位点特异性重组事件由Cre重组酶介导。
139.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
编码Rep的序列，其中所插入的Rep序列破坏了所述LacZα基因或其功能部分的阅读框；以及
异源序列，所述异源序列从5’至3’包含：
衍生自病毒科细小病毒科成员的第一基因组的野生型或截短型5’反向末端重复序列；
编码蛋白质的序列；
与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及
衍生自病毒科细小病毒科成员的第二基因组的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
140.根据权利要求139所述的重组杆粒，其中病毒科细小病毒科的所述第一基因组和所述第二基因组是相同的。
141.根据权利要求140所述的重组杆粒，其中病毒科细小病毒科的所述第一基因组和所述第二基因组是不同的。
142.根据权利要求139-141中任一项所述的重组杆粒，其中所述Rep衍生自所述病毒科细小病毒科成员的所述第一基因组或所述第二基因组。
143.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
编码B19 Rep的序列，其中所插入的B19 Rep序列破坏了所述LacZα基因或其功能部分的阅读框；以及
异源序列，所述异源序列从5’至3’包含：
衍生自B19的野生型或截短型5’反向末端重复序列；
编码蛋白质的序列；
与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及
衍生自B19的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
144.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
编码GPV Rep的序列，其中所插入的GPV Rep序列破坏了所述LacZα基因或其功能部分的阅读框；以及
异源序列，所述异源序列从5’至3’包含：
衍生自GPV的野生型或截短型5’反向末端重复序列；
编码蛋白质的序列；
与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及
衍生自GPV的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
145.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
编码AAV2 Rep的序列，其中所插入的AAV2 Rep序列破坏了所述LacZα基因或其功能部分的阅读框；以及
异源序列，其中所述异源序列从5’至3’包含：
衍生自AAV2的野生型或截短型5’反向末端重复序列；
编码蛋白质的序列；
与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及
衍生自AAV2的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
146.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
编码HBoV1 Rep的序列，其中所插入的HBoV1 Rep序列破坏了所述LacZα基因或其功能部分的阅读框；以及
异源序列，所述异源序列从5’至3’包含：
衍生自HBoV1的野生型或截短型5’反向末端重复序列；
编码蛋白质的序列；
与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及
衍生自HBoV1的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
147.根据权利要求139-146中任一项所述的重组杆粒，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
148.根据权利要求147所述的重组杆粒，其中所述治疗性蛋白质是凝血因子。
149.根据权利要求148所述的重组杆粒，其中所述凝血因子是因子VIII(FVIII)。
150.根据权利要求148或149所述的重组杆粒，其中所述凝血因子是FVIII-XTEN。
151.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
编码Rep蛋白的序列，其中所述Rep破坏报告基因或其功能部分的阅读框；以及
包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列的异源序列。
152.根据权利要求147所述的重组杆粒，其中所述异源序列包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
153.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
编码Rep蛋白的序列，其中所述Rep破坏报告基因或其功能部分的阅读框；以及
包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列的异源序列。
154.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1-18中任一项所述的杆粒。
155.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求19-44中任一项所述的重组杆粒。
156.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求45-55中任一项所述的载体。
157.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求56-94中任一项所述的载体。
158.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求95-153中任一项所述的重组杆粒。
159.一种产生根据权利要求19-44中任一项所述的重组杆粒的方法，所述方法包括：
将以下引入细菌细胞中：
根据权利要求1-18中任一项所述的杆粒；以及
供体核酸分子，所述供体核酸分子包含细菌复制子，所述细胞复制子与包含权利要求19-44中任一项的异源序列的转座子可操作地连接；
在发生转座的条件下孵育所述细菌细胞；以及
从所述细菌细胞中分离所述重组杆粒。
160.一种产生根据权利要求95-153中任一项所述的重组杆粒的方法，所述方法包括：
将以下引入细菌细胞中：
根据权利要求19-44中任一项所述的重组杆粒；
根据权利要求56-94中任一项所述的载体；以及
Cre重组酶；
将所述细菌细胞在发生位点特异性重组的条件下孵育；以及
从所述细菌细胞中分离所述重组杆粒。
161.一种产生重组杆状病毒的方法，所述方法包括在适当条件下将根据权利要求95-153中任一项所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中。
162.一种产生封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：
用包含根据权利要求1-44和95-153中任一项所述的杆粒的重组杆状病毒感染昆虫细胞。
163.一种产生封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：
在适当条件下将根据权利要求139-153中任一项所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及
在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
164.根据权利要求161-163中任一项所述的方法，其中所述重组杆状病毒包含单个杆粒。
165.一种产生包含野生型或截短型B19反向末端重复序列的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：
在适当条件下将根据权利要求139所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及
在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
166.一种产生包含野生型或截短型GPV反向末端重复序列的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：
在适当条件下将根据权利要求139所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及
在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
167.一种产生包含野生型或截短型AAV2反向末端重复序列的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：
在适当条件下将根据权利要求139所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及
在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
168.一种产生包含野生型HBoV1反向末端重复序列的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：
在适当条件下将根据权利要求139所述的重组杆粒转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及
在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
169.一种质粒，所述质粒包含核酸序列，所述核酸序列从5’至3’包含：
衍生自病毒科细小病毒科的第一成员的基因组的野生型或截短型5’反向末端重复序列；
编码蛋白质的序列；
与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及
衍生自病毒科细小病毒科的第二成员的基因组的野生型或截短型3’反向末端重复序列。
170.根据权利要求170所述的质粒，其中所述一种或多种表达控制序列包含组织特异性启动子、多腺苷酸化信号和/或转录后调节元件。
171.根据权利要求171所述的质粒，其中所述组织特异性启动子是三重四脯氨酸(TTP)或鼠甲状腺素转运蛋白(mTTR)启动子。
172.根据权利要求170或171所述的质粒，其中所述多腺苷酸化信号是牛生长激素多腺苷酸化信号。
173.根据权利要求170-173中任一项所述的质粒，其中所述转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
174.根据权利要求170-174中任一项所述的质粒，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。
175.根据权利要求175所述的质粒，其中所述治疗性蛋白质是凝血因子。
176.根据权利要求176所述的质粒，其中所述凝血因子是因子VIII(FVIII)。
177.根据权利要求176或177所述的质粒，其中所述凝血因子是FVIII-XTEN。
178.根据权利要求176-178中任一项所述的质粒，其中所述凝血因子包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列。
179.根据权利要求170-179中任一项所述的质粒，其中所述第一成员和/或所述第二成员选自B19、GPV、HBoV1和AAV2。
180.根据权利要求180所述的质粒，其中所述第一成员和/或所述第二成员是相同的。
181.根据权利要求180所述的质粒，其中所述第一成员和/或所述第二成员是不同的。
182.一种稳定细胞系，所述稳定细胞系包含权利要求170-181中任一项的核酸序列，其中所述核酸序列稳定地整合到所述稳定细胞系的基因组中。
183.根据权利要求182所述的稳定细胞系，其中所述稳定细胞系是稳定的昆虫细胞系。
184.根据权利要求183所述的稳定细胞系，其中所述稳定的昆虫细胞系是Sf9。
185.一种产生包含野生型或截短型反向末端重复序列的封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括将编码Rep蛋白的杆状病毒引入根据权利要求182-184中任一项所述的稳定细胞系中。
186.根据权利要求185所述的方法，其中所述稳定细胞系是昆虫细胞系。
187.根据权利要求186所述的方法，其中所述昆虫细胞系是Sf9。
188.重组杆粒组，所述重组杆粒组包含第一杆粒和第二杆粒，
其中所述第一杆粒包含插入到微型attTn7位点中的编码Rep的序列，其中所插入的Rep破坏了报告基因或其功能部分的阅读框；并且
其中所述第二杆粒包含异源序列，其中所述异源序列从5’至3’包含：
衍生自病毒科细小病毒科成员的第一基因组的野生型或截短型5’反向末端重复序列(ITR)；
编码蛋白质的序列；
与所述编码蛋白质的序列可操作地连接的一种或多种表达控制序列；以及
衍生自病毒科细小病毒科成员的第二基因组的野生型或截短型3’反向末端重复序列(ITR)。
189.根据权利要求182所述的重组杆粒组，其中所述5’ITR和所述3’ITR衍生自细小病毒，所述细小病毒选自B19、GPV、HBoV1和AAV2。
190.根据权利要求188或189所述的重组杆粒组，其中所述异源序列包含SEQ ID NO:20的核苷酸序列。
191.根据权利要求188或189所述的重组杆粒组，其中所述异源序列包含SEQ ID NO:19的核苷酸序列。
192.根据权利要求188或189所述的重组杆粒组，其中所述异源序列包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列。
193.一种产生封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：
用包含根据权利要求188-192中任一项所述的重组杆粒组的重组杆状病毒感染昆虫细胞。
194.一种产生封闭端DNA(ceDNA)分子的方法，所述方法包括：
在适当条件下将根据权利要求188-192中任一项所述的重组杆粒组转染到昆虫细胞中以产生重组杆状病毒；以及
在适当条件下用所述重组杆状病毒感染第二昆虫细胞以产生ceDNA分子。
195.一种重组杆粒，所述重组杆粒包含：
细菌复制子；
第一抗生素抗性基因；
编码HBoV1 Rep的序列，其中所插入的HBoV1 Rep序列破坏了所述LacZα基因或其功能部分的阅读框；
与杆状病毒诱导型启动子可操作地连接的编码荧光蛋白的基因；以及
LoxP位点或其变体。
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