CN114736928A - 一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用，该杆状病毒载体包含外源基因表达盒与稳定序列，所述稳定序列位于距离所述外源基因表达盒的5kb以内，所述稳定序列为CNE序列或NAE序列。本发明将CNE(或NAE)序列构建至重组杆状病毒载体上的外源基因表达盒附近，使得携带产生AAV所必需的功能蛋白表达盒或ITR核心表达元件等外源基因表达盒的重组杆状病毒感染昆虫细胞，在连续传代多代后，重组杆状病毒和rAAV的生产水平仍能保持相对稳定。

Description

一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用。
背景技术
重组腺相关病毒(rAAV)是目前基因治疗领域最具应用前景的载体之一。目前，生产rAAV的体系主要有两大类：一种是利用哺乳动物细胞(如293细胞、COS细胞、HeLa细胞、KB细胞等)的常规生产体系；另一种是利用昆虫细胞的生产体系。在哺乳动物细胞生产体系中，单个细胞的rAAV颗粒产量低，并且培养中极可能存在污染的风险，这限制了rAAV在哺乳动物细胞中的大规模生产及应用。
为了克服上述问题，已开发了利用杆状病毒感染昆虫细胞制备rAAV的生产系统，即将提供AAV的rep基因、cap基因和ITR核心表达元件分别通过Tn7转座整合到3种不同的杆状病毒基因组中，利用这3种重组杆状病毒共感染昆虫细胞制备rAAV(Urabe等，2002，Hum.Gene Ther.13:1935-1943；US20030148506；US20040197895)。
然而，由于重组杆状病毒自身的不足，即在连续传代过程中外源基因容易丢失，使得含有AAV基因组的重组杆状病毒经过多次传代会不稳定，导致rAAV的产率下降。现有的重组杆状病毒载体不适合于对稳定性要求很高的大规模批量化的rAAV生产和应用，因此，用于生产基因治疗载体药物仍然有很大的改进需求。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用，旨在解决利用重组杆状病毒制备rAAV存在传代不稳定的问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种杆状病毒载体，包含外源基因表达盒与稳定序列，所述稳定序列位于距离所述外源基因表达盒的5kb以内，所述稳定序列为CNE序列或NAE序列。
优选地，所述外源基因表达盒为AAV的cap基因表达盒、AAV的rep基因表达盒和带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件中的至少一个；所述稳定序列位于距离所述cap基因表达盒的起始端和末端、所述rep基因表达盒起始端和末端以及所述带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件的一端和另一端中的至少一处的5kb以内。
优选地，所述外源基因表达盒为所述cap基因表达盒和所述rep基因表达盒。
优选地，按从5’至3’的顺序包含所述cap基因表达盒、所述稳定序列和所述rep基因表达盒。
优选地，按从5’至3’的顺序包含所述rep基因表达盒、所述稳定序列和所述cap基因表达盒。
优选地，所述稳定序列位于所述cap基因表达盒与所述rep基因表达盒之间，且其两端分别靠近所述cap基因表达盒的起始端和所述rep基因表达盒的起始端。
优选地，所述外源基因表达盒为所述带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件。
优选地，所述外源基因表达盒为所述带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件和所述cap基因表达盒。
优选地，所述外源基因表达盒为AAV的rep78基因表达盒，所述杆状病毒载体还包含AAV的rep52基因表达盒，所述稳定序列位于所述rep78基因表达盒与所述rep52基因表达盒之间。
优选地，所述外源基因表达盒为AAV的rep52基因表达盒，所述杆状病毒载体还包含AAV的rep78基因表达盒，所述稳定序列位于所述rep52基因表达盒与所述rep78基因表达盒之间。
优选地，所述稳定序列的两端分别靠近所述rep78基因表达盒的起始端和所述rep52基因表达盒的起始端。
优选地，启动所述rep78基因表达盒表达的启动子为杆状病毒早期启动子，启动所述rep52基因表达盒表达表达的启动子为杆状病毒极晚期启动子。
优选地，所述杆状病毒早期启动子为△lE1启动子，所述杆状病毒极晚期启动子为p10启动子。
优选地，所述外源基因表达盒用于表达报告蛋白或治疗性基因产物。
优选地，所述杆状病毒载体为重组杆状病毒转移载体，所述外源基因表达盒与所述稳定序列位于所述重组杆状病毒转移载体的Tn7转座子末端元件Tn7L和Tn7R之间。
优选地，所述杆状病毒载体为重组杆状病毒穿梭载体。
优选地，所述重组杆状病毒穿梭载体是通过第一重组杆状病毒转移载体介导的Tn7转座将所述外源基因表达盒与所述稳定序列插入到第一杆状病毒穿梭载体的转座插入位点而得到，所述第一杆状病毒穿梭载体上的杆状病毒基因组中缺失CNE序列或NAE序列。
优选地，所述重组杆状病毒穿梭载体是通过转移载体介导的Red同源重组将所述外源基因表达盒插入到第二杆状病毒穿梭载体自带的CNE序列或NAE序列附近而得到。
按照本发明的另一方面，提供了一种上述任一杆状病毒载体在昆虫细胞中制备重组杆状病毒和/或重组腺相关病毒的应用。
按照本发明的另一方面，提供了一种昆虫细胞，其包含上述任一杆状病毒载体。
优选地，所述杆状病毒载体为上述任一重组杆状病毒穿梭载体。
优选地，所述昆虫细胞还包含第二载体，所述第二载体包含带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件，所述外源基因表达盒为AAV的cap基因表达盒和AAV的rep基因表达盒。
按照本发明的另一方面，提供了一种体外生长或产生重组杆状病毒的方法，包括提供包含上述任一昆虫细胞的昆虫细胞培养物，并培养所述昆虫细胞。
按照本发明的另一方面，提供了一种体外生长或产生重组腺相关病毒的方法，包括提供包含上述任一昆虫细胞的昆虫细胞培养物，并培养所述昆虫细胞。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明将CNE或NAE序列构建到重组杆状病毒载体的外源基因表达盒附近，在连续传代中，重组杆状病毒的生产水平可保持相对稳定。同时将CNE或NAE序列构建到产生重组腺相关病毒所必需的功能蛋白表达盒或者ITR核心表达元件附近，利用该重组杆粒感染昆虫细胞，在连续传代中，重组杆状病毒和重组腺相关病毒的生产水平相对稳定；并且在杆状病毒传代过程中，如果cap和rep基因表达盒丢失，会使得丢失了该表达盒的缺陷杆粒基因组无法复制或包装进衣壳中，从而保证了含有CNE(或NAE)序列的cap与rep基因表达盒的重组杆状病毒的传代稳定性，使得包含该杆状病毒载体的昆虫细胞即使在连续传代后也能够稳定地维持高滴度的rAAV产生。
附图说明
图1为本发明实施例1构建的打靶CNE序列的第一同源重组表达框示意图。
图2为本发明实施例1构建的打靶NAE序列的第二同源重组表达框示意图。
图3为本发明实施例2构建的重组杆状病毒转移载体pFastBac-Rep-Cap9示意图。
图4为本发明实施例2构建的重组杆状病毒转移载体pFastBac-Rep-CNE-Cap9示意图。
图5为本发明实施例2构建的重组杆状病毒转移载体pFastBac-ITR示意图。
图6为本发明实施例2构建的重组杆状病毒转移载体pFastBac-ITR-CNE示意图。
图7为本发明实施例3构建的重组杆状病毒转移载体pFastBac-Rep-NAE-Cap9示意图。
图8为本发明实施例3构建的重组杆状病毒转移载体pFastBac-ITR-NAE示意图。
图9为本发明实施例6中含有Rep-CNE-Cap9序列的重组杆状病毒(rBV)从第3代至第10代的滴度。
图10为本发明实施例6中含有Rep-NAE-Cap9序列的重组杆状病毒(rBV)从第3代至第10代的滴度。
图11为本发明实施例6中含有不带CNE或NAE的Rep-Cap9序列的重组杆状病毒(rBV)从第3代至第10代的滴度。
图12为本发明实施例6中含有ITR-CNE序列的重组杆状病毒(rBV)从第3代至第10代的滴度。
图13为本发明实施例6中含有ITR-NAE序列的重组杆状病毒(rBV)从第3代至第10代的滴度。
图14为本发明实施例6中含有不带CNE或NAE的ITR序列的重组杆状病毒(rBV)从第3代至第10代的滴度。
图15为本发明实施例7中分别用第3代至第10代含有或不含有CNE序列的重组杆状病毒(rBV)生产AAV的产率的对比图。
图16为本发明实施例7中分别用第3代至第10代含有或不含有NAE序列的重组杆状病毒(rBV)生产AAV的产率的对比图。
图17为本发明实施例8中含有CNE序列的重组杆状病毒(rBV)感染宿主细胞后表达AAV衣壳蛋白的Western Blot检测图。
图18为本发明实施例8中含有NAE序列的重组杆状病毒(rBV)感染宿主细胞后表达AAV衣壳蛋白WesternBlot检测图。
图19为本发明实施例8中不含有CNE或NAE序列的重组杆状病毒(rBV)感染宿主细胞后表达AAV衣壳蛋白的Western Blot检测图。
图20为本发明实施例8中含有CNE序列的重组杆状病毒(rBV)感染宿主细胞后表达AAV Rep蛋白的WesternBlot检测图。
图21为本发明实施例8中含有NAE序列的重组杆状病毒(rBV)感染宿主细胞后表达AAV Rep蛋白的WesternBlot检测图。
图22为本发明实施例8中不含有CNE或NAE序列的重组杆状病毒(rBV)感染宿主细胞后表达AAV Rep蛋白的Western Blot检测图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中，“若干”的含义是至少一个，例如一个，两个等，除非另有明确具体的限定。
正如本文所用的，表达盒是指包含引入宿主细胞时可操作连接的编码序列和调控序列的核酸构建体，分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。表达盒应理解为包括允许转录开始的启动子、目的基因开放阅读框和转录终止子。通常，启动子序列置于目的基因上游，与目的基因的距离与表达控制相容。
顺式作用元件是指与结构基因串联的特定DNA序列，是转录因子的结合位点，它们通过与转录因子结合而调控基因转录的精确起始和转录效率。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控，本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点。
AAV是单链DNA病毒，基因组结构简单，全长约4.7kb，其基因组中包含rep基因表达盒、cap基因表达盒和位于基因组两端的AAV反向末端重复序列(inverted terminalrepeats，ITR)。这些是包装AAV病毒所必需的三个元件。Cap基因编码结构性的VP衣壳蛋白，其包含三个重叠开放阅读框，分别编码VP1、VP2、VP3三种类型的亚基。Rep基因编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四个重叠的多功能蛋白，其参与AAV的复制及整合。ITR是基因组两端的125个核苷酸的回文结构，能形成一个自我互补的倒T型发卡结构，是DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的顺式作用元件。AAV作为缺陷型病毒，在没有辅助病毒的存在下不能够独立复制，因此AAV只能定点整合在宿主细胞染色体中，呈潜伏状态。在辅助病毒存在的情况下，rep基因表达量增加可以将整合在宿主细胞染色体中的AAV基因组拯救出来，大量复制得到AAV DNA，单链的rAAV基因组在VP衣壳蛋白的作用下被包装成具有感染性的病毒粒子。
保守的非蛋白编码元件(conserved non-protein-coding element，CNE)被发现存在于所有已测序的甲型杆状病毒属(Alphabaculovirus)的基因组中，高度同源序列有154-157bp。有报道推测，位于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicamultiple nucleopolyhedro-virus,AcMNPV)基因组ac152区域的一段富含at的CNE序列是病毒粒子生产所必需的顺式作用元件。
NAE序列最早被发现是在甲型杆状病毒属中存在的一种核衣壳装配必需元件，其在核衣壳装配过程中起着必不可少的作用。天然的NAE序列在甲型杆状病毒属定位于ac83基因及其同源基因中，且位于其中的近末端(CN106566829A)。ac83是与杆状病毒核衣壳装配相关的核心基因，全长2544bp，编码847个氨基酸，预测分子量为96.2kDa。敲除ac83不影响病毒基因组的复制，但会完全阻断病毒核衣壳的装配，在电子显微镜下可以观察到细胞核中出现大量中空的衣壳前体。
天然的CNE序列和NAE序列在杆状病毒基因组中的位置具有一定的保守性，目前没有文献资料报道这两种序列可用于在杆状病毒系统中以提高生产AAV的稳定性，而本发明对此进行了验证。
本发明提供的一种杆状病毒载体，包含外源基因表达盒与稳定序列，所述稳定序列位于距离所述外源基因表达盒的5kb以内，所述稳定序列为CNE序列或NAE序列。
本发明所涉及的外源基因表达盒既可以是生产rAAV所需的元件，也可以是用来表达外源蛋白的编码序列，外源蛋白例如但不限于报告蛋白或治疗性基因产物。当外源基因表达盒为生产rAAV所需的元件时，具体可以为AAV的cap基因表达盒、AAV的rep基因表达盒和带有异源功能基因的AAVITR核心表达元件中的至少一个，则所述稳定序列位于距离所述cap基因表达盒的起始端和末端、所述rep基因表达盒起始端和末端以及带有异源功能基因的AAVITR核心表达元件的一端和另一端中的至少一处的5kb以内。
其中，带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件即为异源功能基因及位于所述异源功能基因两端的AAV反向末端重复序列(ITR)，所述异源功能基因可以为至少一个编码感兴趣的基因(Gene of Interest，GOI)产物的核苷酸序列，所述感兴趣的基因产物可以是治疗性基因产物，具体可以是多肽、RNA分子(siRNA)或其他基因产物，例如但不限于脂蛋白酯酶、载脂蛋白、细胞因子、白细胞介素或干扰素；也可以是评估载体转化和表达的报告蛋白，例如但不限于荧光蛋白(绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白RFP)、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、海肾荧光素酶、萤火虫荧光素酶或碱性磷酸酶。
为了提高杆状病毒系统在昆虫细胞中生产AAV的稳定性，本发明将稳定序列，即CNE序列或NAE序列，构建至包装AAV病毒所必需的三个元件附近。具体地，稳定序列与三个元件的位置关系可呈现多种形式：(1)该外源基因表达盒为AAV的cap基因表达盒，稳定序列位于距离cap基因表达盒的起始端和/或末端的5kb以内；(2)该外源基因表达盒为AAV的rep基因表达盒，稳定序列位于距离rep基因表达盒的起始端和/或末端的5kb以内；(3)该外源基因表达盒为带有异源功能基因的AAVITR核心表达元件(即ITR-GOI)，稳定序列位于距离ITR-GOI的一端和/或另一端的5kb以内；(4)该外源基因表达盒为AAV的cap基因表达盒和rep基因表达盒，稳定序列位于距离cap基因表达盒的起始端和末端、rep基因表达盒的起始端和末端中的至少一处的5kb以内；(5)该外源基因表达盒为AAV的cap基因表达盒和带有异源功能基因的AAVITR核心表达元件，稳定序列位于距离cap基因表达盒的起始端和末端、ITR-GOI的一端和另一端中的至少一处的5kb以内；(6)该外源基因表达盒为AAV的rep基因表达盒和带有异源功能基因的AAVITR核心表达元件，稳定序列位于距离rep基因表达盒的起始端和末端、ITR-GOI的一端和另一端中的至少一处的5kb以内；(7)该外源基因表达盒为AAV的cap基因表达盒、rep基因表达盒以及带有异源功能基因的AAVITR核心表达元件，稳定序列位于距离cap基因表达盒的起始端和末端、rep基因表达盒的起始端和末端以及ITR-GOI的一端和另一端中的至少一处的5kb以内。
作为一个优选实施例，外源基因表达盒为AAV的cap基因表达盒和rep基因表达盒，稳定序列位于距离cap基因表达盒的起始端和末端、rep基因表达盒的起始端和末端中的至少一处的5kb以内。
需要说明的是，本发明不限定cap基因表达盒与rep基因表达盒的具体位置和方向，cap基因表达盒、rep基因表达盒以及稳定序列三部分排列方式可以有六种：1、从5’端至3’端依次排列为cap基因表达盒、rep基因表达盒和稳定序列；2、从5’端至3’端依次排列为rep基因表达盒、cap基因表达盒和稳定序列；3、从5’端至3’端依次排列为cap基因表达盒、稳定序列和rep基因表达盒；4、从5’端至3’端依次排列为rep基因表达盒、稳定序列和cap基因表达盒；5、从5’端至3’端依次排列为稳定序列、cap基因表达盒和rep基因表达盒；6、从5’端至3’端依次排列为稳定序列、rep基因表达盒和cap基因表达盒。cap基因表达盒与rep基因表达盒可以是同向的，也可以是反向的。cap基因表达盒在杆状病毒载体上的顺序既可以是从5’端至3’端的，也可以是从3’端至5’端的。同理地，rep基因表达盒在杆状病毒载体上的顺序既可以是从5’端至3’端的，也可以是从3’端至5’端的。
另外，稳定序列距离cap基因表达盒和/或rep基因表达盒可以约0.5kb、约1kb、约1.5kb、约2kb、约2.5kb、约3kb、约3.5kb、约4kb、约4.5kb或约5kb。这里稳定序列与cap、rep两个基因表达盒的距离，不限定是与基因起始端的距离还是末端的距离。一些实施例中的CNE序列可以是与野生型AcMNPVCNE序列完全相同的CNE序列，也可以是来自其它杆状病毒中的CNE序列，或者是与野生型AcMNPVCNE序列享有至少50％序列同一性、至少60％序列同一性、至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或更高序列同一性的人工CNE序列。同样地，NAE序列可以是与野生型AcMNPVNAE序列完全相同的NAE序列，也可以是来自其它杆状病毒中的NAE序列，或者是与野生型AcMNPVNAE序列享有至少50％序列同一性、至少60％序列同一性、至少70％序列同一性、至少80％序列同一性、至少85％序列同一性、至少90％序列同一性、至少95％序列同一性或更高序列同一性的人工NAE序列。
作为一个优选实施例，稳定序列位于cap基因表达盒与rep基因表达盒之间，具体地，杆状病毒载体按从5’至3’的顺序包含cap基因表达盒、CNE序列和rep基因表达盒，或者杆状病毒载体按从5’至3’的顺序包含cap基因表达盒、NAE序列和rep基因表达盒，或者杆状病毒载体按从5’至3’的顺序包含rep基因表达盒、CNE序列和cap基因表达盒，或者按从5’至3’的顺序包含rep基因表达盒、NAE序列和cap基因表达盒。进一步优选的，稳定序列的两端分别靠近cap基因表达盒的起始端和rep基因表达盒的起始端，即cap基因表达盒与rep基因表达盒的方向相反，且两者的起始端相向设置并朝向稳定序列。
作为一个优选实施例，cap基因和rep基因可分别置于杆状病毒极晚期基因表达强启动子p10启动子和polh启动子下进行调控；或者cap基因受polh启动子调控，rep基因受p10启动子调控。
本发明涉及的rep基因表达盒至少编码Rep78和Rep52蛋白，或者Rep68和Rep40蛋白，既可以是由同一调控序列连接两个重叠开放阅读框组成，又可以是由两个表达盒组成，两个表达盒分别拥有各自的调控序列，分别表达一种蛋白。一些实施例中，杆状病毒载体可包含rep78和rep52两个独立的基因表达盒，分别由两个启动子各自启动表达，稳定序列例如但不限于位于rep78和rep52两个基因表达盒之间，优选地，该稳定序列的两端分别靠近rep78基因表达盒的起始端和rep52基因表达盒的起始端。启动rep78基因表达盒表达的启动子可采用杆状病毒早期启动子，例如△lE1启动子；启动rep52基因表达盒表达表达的启动子可采用杆状病毒极晚期启动子，例如p10启动子或polh启动子。
本发明提供的杆状病毒载体，可以是杆状病毒、杆状病毒转移载体(baculovirustransfervector)或者杆状病毒穿梭载体(baculovirusshuttlevector，又称杆状病毒质粒baculovirusplasmid，简称杆粒Bacmid)。本发明涉及的杆状病毒转移载体通常含有强启动子和Tn7转座子末端元件Tn7L和Tn7R，例如但不限于pFastBac载体。当包含外源基因表达盒和稳定序列的杆状病毒载体为第一重组杆状病毒转移载体时，该外源基因表达盒和稳定序列位于第一重组杆状病毒转移载体的Tn7转座子末端元件Tn7L和Tn7R之间。接着通过第一重组杆状病毒转移载体介导的Tn7转座将外源基因表达盒和稳定序列一起插入到第一杆状病毒穿梭载体的转座插入位点，即得到含有上述外源基因表达盒和稳定序列的第一重组杆状病毒穿梭载体。值得注意的是，当稳定序列为CNE序列时，相应的第一杆状病毒穿梭载体所携带的杆状病毒基因组中缺失CNE序列；当稳定序列为NAE序列时，相应的第一杆状病毒穿梭载体所携带的杆状病毒基因组中缺失NAE序列。还有另一种获得包含外源基因表达盒和稳定序列的重组杆状病毒穿梭载体的方式，即利用克隆有外源基因表达盒的转移载体与携带完整的杆状病毒基因组(含有正常的CNE序列和NAE序列)的第二杆状病毒载体进行Red同源重组，将外源基因表达盒插入到第二杆状病毒穿梭载体自带的CNE序列或NAE序列附近，也可得到含有上述外源基因表达盒和稳定序列的第二重组杆状病毒穿梭载体。
本发明提供的杆状病毒载体用于在昆虫细胞中制备重组杆状病毒和/或重组腺相关病毒，相比不含CNE或NAE序列的载体，包含本发明杆状病毒载体的昆虫细胞即使在连续传代后也能够稳定地维持高滴度的rAAV产生。
本发明还提供一种包含上述杆状病毒载体的昆虫细胞，例如但不限于包含该载体的来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞、来自粉纹夜蛾的TniPro细胞或来自Estimaacrea的E4a细胞，优选为Sf9细胞。
本发明还提供一种体外生长或产生重组杆状病毒的方法，该方法包括提供包含上述昆虫细胞的昆虫细胞培养物，并培养所述昆虫细胞。该昆虫细胞是由包含上述任意一种外源基因表达盒和稳定序列的重组杆状病毒感染昆虫细胞而得，或者由包含上述任意一种外源基因表达盒和稳定序列的重组杆粒转染昆虫细胞而得。
本发明还提供一种体外生长或产生重组腺相关病毒的方法，其包括提供包含上述昆虫细胞的昆虫细胞培养物，并培养所述昆虫细胞。该昆虫细胞是由包含上述任意一种外源基因表达盒和稳定序列的一种或多种重组杆状病毒感染昆虫细胞而得，或者由包含上述任意一种外源基因表达盒和稳定序列的一种或多种重组杆粒转染昆虫细胞而得，该CNE序列或NAE序列位于距离cap基因表达盒起始端、cap基因表达盒末端、rep基因表达盒起始端和rep基因表达盒末端中至少一处的5kb以内。这样的昆虫细胞可以重复传代多代，几乎没有或很少AAV产生的损失，例如至少3代、至少4代、至少5代、至少6代、至少7代、至少8代、至少9代、至少10代。
需要说明的是，在用于生长或产生重组杆状病毒或重组腺相关病毒的昆虫细胞中，既可以含有分别携带AAV cap基因表达盒的重组杆粒、携带AAVrep基因表达盒的重组杆粒以及携带ITR-GOI的重组杆粒三种杆粒，也可以含有同时携带AAV的cap和rep基因表达盒的重组杆粒以及携带ITR-GOI的重组杆粒两种杆粒，也可以含有只携带AAVrep基因表达盒的重组杆粒以及同时携带AAV cap基因表达盒和ITR-GOI的重组杆粒两种杆粒，还可以只包含通过整合后同时携带AAV的cap和rep基因表达盒以及ITR-GOI的一种重组杆粒。其中，稳定序列(CNE或NAE序列)位于AAV的cap基因表达盒、AAV的rep基因表达盒和带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件中的至少一个附近。
一个实施例中，采用两杆状病毒系统生产rAAV，主要流程是：将AAV的rep基因和cap基因协同附近的CNE序列(或NAE序列)通过转移载体介导的Tn7重组整合在一个杆状病毒基因组中，将携带有异源功能基因的ITR核心表达元件通过转移载体介导的Tn7重组整合到另外一个杆状病毒基因组中，然后将上述两种重组杆状病毒BEV共同感染宿主细胞，产生出rAAV。
以下结合具体实施例，对上述技术方案详细说明。
实施例1构建缺失CNE序列的杆粒△CNE-Bac和缺失NAE序列的杆粒△NAE-Bac Red重组是一种细菌水平的高效重组方法，可以在大肠杆菌(DH10Bac)中用来快速改造重组杆状病毒基因组。Red重组是利用λ噬菌体Red重组酶(由Exo、Beta和Gam这3种蛋白质组成)将导入细胞携带有同源臂的线性DNA片段与基因组的特定靶序列进行同源重组，从而实现目的基因的替换(Doublet等，2008，J Microbiol Methods，75(2)：359-361)。
首先构建打靶CNE序列的第一同源重组表达框(SEQ ID No.1)，如图1所示，该表达框从5’至3’依次包括CNE上游同源序列、氯霉素(Chol)抗性基因表达框和CNE下游同源序列；然后利用Red重组技术，将该表达框与杆粒(bacmid)上的CNE序列进行替换，从而获得了缺失CNE序列的杆粒△CNE-Bac。
同理，首先构建打靶NAE序列的第二同源重组表达框(SEQ ID No.2)，如图2所示，该表达框从5’至3’依次包括NAE上游同源序列、氯霉素(Chol)抗性基因表达框和NAE下游同源序列；然后利用Red重组技术，将该表达框与杆粒上的NAE序列进行替换，从而获得了缺失NAE序列的杆粒△NAE-Bac。
实施例2构建不含有或含有CNE序列的重组转移载体pFastBac-Rep-Cap9、pFastBac-Rep-CNE-Cap9、pFastBac-ITR及pFastBac-ITR-CNE
构建包含AAV Cap表达盒及Rep表达盒的重组转移载体。首先从AAV基因组中PCR扩增得到AAV9的Cap基因序列及AAV2的Rep基因序列，然后通过酶切酶连的方式将Cap基因序列(SEQ ID No.3)及Rep基因序列(SEQ ID No.4)插入到pFastBac载体上获得重组转移载体pFastBac-Rep-Cap9，如图3所示。
构建包含CNE序列、AAV Cap表达盒及Rep表达盒的重组转移载体。首先从杆状病毒基因组PCR扩增得到CNE序列(SEQ ID No.5)，然后通过酶切酶连的方式将CNE序列插入到pFastBac-Rep-Cap9载体上获得重组转移载体pFastBac-Rep-CNE-Cap9，如图4所示。
构建包含ITR核心元件(ITR-GOI)的重组转移载体。ITR-GOI核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。本实施例中ITR核心元件中的GOI采用了红色荧光蛋白mcherry基因表达盒，即由miniEf1a启动子控制mcherry表达，便于检测rAAV的活性，将ITR和红色荧光蛋白表达盒构建到转移载体pFastBac上获得重组转移载体pFastBac-ITR，如图5所示。
构建包含CNE序列及ITR-GOI的转移载体。首先从杆状病毒基因组中PCR扩增得到CNE序列，然后通过酶切酶连的方式将CNE序列插入到pFastBac-ITR载体上获得重组转移载体pFastBac-ITR-CNE，如图6所示。
实施例3构建含有NAE序列的重组转移载体pFastBac-Rep-NAE-Cap9和pFastBac-ITR-NAE
构建包含NAE序列、AAV Cap表达盒及Rep表达盒的重组转移载体。首先从杆状病毒基因组PCR扩增得到NAE序列(SEQ ID No.7)，然后通过酶切酶连的方式将NAE序列插入到实施例2中构建的pFastBac-Rep-Cap9载体上获得重组转移载体pFastBac-Rep-NAE-Cap9，如图7所示。
构建包含NAE序列及ITR-GOI的转移载体。首先从杆状病毒基因组中PCR扩增得到NAE序列，然后通过酶切酶连的方式将NAE序列插入到实施例2中构建的pFastBac-ITR载体上获得重组转移载体pFastBac-ITR-NAE，如图8所示。
实施例4构建含有或不含有CNE序列的重组杆粒
将实施例2中获得的重组转移载体pFastBac-Rep-Cap9和pFastBac-ITR分别转化到包含杆粒bacmid的DH10Bac菌株中，DH10Bac菌株中还含有一个辅助质粒(pMON7124(13.2kb)，四环素抗性，编码转座酶)，一旦转移载体转化到DH10Bac菌中，Tn7就发生转座，Rep-Cap9和ITR序列从转移载体上切下，并插入到杆粒bacmid的Tn7位点中，形成重组杆粒Bac-Tn7-Rep-Cap9和Bac-Tn7-ITR。转座过程需要的转座酶由辅助质粒表达提供。
同理，将实施例2中获得的重组转移载体pFastBac-Rep-CNE-Cap9和pFastBac-ITR-CNE分别转化到包含杆粒△CNE-Bac的DH10Bac菌株中，通过Tn7转座，形成重组杆粒△CNE-Bac-Tn7-Rep-CNE-Cap9和△CNE-Bac-Tn7-ITR-CNE。
实施例5构建含有NAE序列的重组杆粒
参照实施例4，将实施例3中获得的重组转移载体pFastBac-Rep-NAE-Cap9和pFastBac-ITR-NAE分别转化到包含杆粒△NAE-Bac的DH10Bac菌株中，通过Tn7转座，形成重组杆粒△NAE-Bac-Tn7-Rep-NAE-Cap9和△NAE-Bac-Tn7-ITR-NAE。
实施例6利用实施例4和实施例5获得的重组杆粒生产rBV，并验证包含CNE或NAE序列的重组杆状病毒传代稳定性
为了进一步分析含有CNE或NAE序列的重组杆状病毒的传代稳定性，本实施例以及接下来的实施例中均采用Q-PCR的方法检测rBV和rAAV的滴度，方法引用自专利CN108699567A。
重组杆状病毒的制备：抽提上述实施例4和实施例5中构建的重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞，制备重组杆状病毒和重组腺相关病毒。转染后的Sf9昆虫细胞成功产生BEV，大量复制增殖的BEV进一步感染导致Sf9细胞发生明显的细胞病变效应(CPE)。收集发生CPE的Sf9细胞培养上清液，其中含有大量BEV，即为第0代BEV(BEV-P0)，同时收集含有大量rAAV的Sf9细胞。将制备得到的BEV-P0以感染复数(MOI＝1)感染悬浮培养的Sf9细胞，感染72h后，细胞活性下降至50％以下，将细胞培养液1000g离心5min，分别收集培养上清和细胞沉淀，上清液标记为第1代BEV(BEV-P1)，细胞则标记为用BEV-P0包装的rAAV。
将本实施例制备的重组杆状病毒以相同的MOI经过连续传代后感染Sf9细胞，获得P3、P4、P5……P10代次的BEV，测试重组杆状病毒的传代稳定性。采用荧光定量PCR(qPCR)的方法测定所有代次BEV的滴度，滴度单位用VG/mL(VG，virus genomes)表示。使用对应于gp64基因(存在于本发明的所有重组杆状病毒中)的一对qPCR引物(Q-GP64-F：AACTTGGACATTACCCCGCC和Q-GP64-R：CCGTTGTACGCATACGCCTG)来测定总杆状病毒滴度；使用对应于rep基因的一对qPCR引物(Q-Rep-F：GAACAAGGTGGTGGACGAGT和Q-Rep-R：ATTCAAACAGGCGCTTAAAT)来测定包含rep基因表达盒和cap基因表达盒的杆状病毒滴度；使用对应于Tn7序列的一对qPCR引物(Q-Tn7-F：TCGTATTAGCTTACGACGCTACA和Q-Tn7-R：TAGTTGGGAACTGGGAGGGG)测定包含ITR-GOI的杆状病毒滴度。通过Tn7/GP64以及REP/GP64的比值，评估BEV中外源片段(即rep/cap基因表达盒和ITR-GOI元件)的传代稳定性。如果比值稳定不变，代表rep/cap基因表达盒和ITR-GOI元件的传代稳定性较好，如果随着传代次数的增加，比值下降明显，说明插入的外源片段的稳定性较差。整个传代过程以总BEV滴度也就是GP64的Q-PCR滴度计算感染复数(MOI)传代。
含有CNE或NAE序列与不含有CNE或NAE序列的重组杆状病毒(rBV)从第3代至第10代rBV滴度的实验结果示于图9至图14中：图9示出了含有CNE序列的重组杆粒△CNE-Bac-Tn7-Rep-CNE-Cap9转染宿主细胞，并连续传至第10代，用gp64和rep qPCR引物确定的相对rBV滴度；图10示出了含有NAE序列的重组杆粒△NAE-Bac-Tn7-Rep-NAE-Cap9转染宿主细胞，并连续传至第10代，用gp64和rep qPCR引物确定的相对rBV滴度；图11示出了不含有CNE或NAE序列的重组杆粒Bac-Tn7-Rep-Cap9转染宿主细胞，并连续传至第10代，用gp64和repqPCR引物确定的相对rBV滴度；图12示出了含有CNE序列的重组杆粒△CNE-Bac-Tn7-ITR-CNE转染宿主细胞，并连续传至第10代，用gp64和tn7qPCR引物确定的相对rBV滴度；图13示出了含有NAE序列的重组杆粒△NAE-Bac-Tn7-ITR-NAE转染宿主细胞，并连续传至第10代，用gp64和tn7qPCR引物确定的相对rBV滴度；图14示出了不含有CNE或NAE序列的重组杆粒Bac-Tn7-ITR转染宿主细胞，并连续传至第10代，用gp64和tn7qPCR引物确定的相对rBV滴度。
以上实验数据表明，当重组杆状病毒载体不含有CNE或NAE序列时，特异性重组杆状病毒滴度随着传代次数的增加而快速降低；传至p10代时，特异性重组杆状病毒滴度低于总rBV滴度的10％(图11和图14)。而当重组杆状病毒载体含有CNE或NAE序列时，特异性重组杆状病毒滴度随着传代次数的增加无明显降低，且能维持相对稳定；特异性重组杆状病毒滴度不低于总rBV滴度的30％(图9、图10、图12和图13)。
实施例7检测包含AAVrep基因表达盒和cap基因表达盒的重组杆状病毒在不同代次的rAAV生产率
评估重组杆状病毒传代稳定性的另一方面是检测重组腺相关病毒(rAAV)的包装率和上清滴度，利用qPCR的方法测定所有代次rAAV的滴度，滴度单位用VG/L(VG，virusgenomes)表示。rAAV滴度的检测使用靶向ITR序列的一对引物(Q-ITR-F：GGAACCCCTAGTGATGGAGTT和Q-ITR-R：CGGCCTCAGTGAGCGA)或者WPRE序列的一对引物(Q-WPRE-F：CCGTTGTCAGGCAACGTG和Q-WPRE-R：AGCTGACAGGTGGTGGCAAT)。本实施例分别使用第3代至第10代的含有CNE序列的重组杆状病毒(△CNE-Bac-Tn7-Rep-CNE-Cap9)和含有NAE序列的重组杆状病毒(△NAE-Bac-Tn7-Rep-NAE-Cap9)与含有ITR-GOI元件的重组杆状病毒(Bac-Tn7-ITR)共感染Sf9细胞以用来生产AAV病毒载体，以及使用第3代至第10代的不含有CNE或NAE序列的重组杆状病毒(Bac-Tn7-Rep-Cap9)与含有ITR-GOI元件的重组杆状病毒(Bac-Tn7-ITR)共感染Sf9细胞以用来生产AAV病毒载体。在病毒感染三天后，收获细胞沉淀并且测定AAV的生产率。
实验结果如图15和图16所示，当重组杆状病毒载体含有CNE或NAE序列时，宿主细胞中AAV9的产生产率在第3代至第10代稳定维持，相反地，当重组杆状病毒载体不含有CNE或NAE序列时，AAV9的产生产率在第3代至第10代下降较快。本实施例显示了CNE或NAE序列增强了包含AAVrep基因表达盒和cap基因表达盒的重组杆状病毒在连续传代中生产rAAV的稳定性。
实施例8检测包含AAVrep基因表达盒和cap基因表达盒的重组杆状病毒在不同代次的蛋白表达水平
本实施例中，通过蛋白质印迹(Western Blot)来分析Rep蛋白和Cap蛋白的表达水平。图17显示使用第3代至第10代的含有CNE的重组杆状病毒△CNE-Bac-Tn7-Rep-CNE-Cap9感染Sf9细胞后，衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的表达。图18显示使用第3代至第10代的含有NAE的重组杆状病毒△NAE-Bac-Tn7-Rep-NAE-Cap9感染Sf9细胞后，衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的表达。图19显示使用第3代至第10代的不含有CNE或NAE序列的重组杆状病毒Bac-Tn7-Rep-Cap9感染Sf9细胞后，衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的表达。其中，M为蛋白质大小标记；泳道1至8，由用第3代至第10代的rBV感染的Sf9宿主细胞制备的细胞裂解物。
图20显示使用第6代至第10代的含有CNE的重组杆状病毒△CNE-Bac-Tn7-Rep-CNE-Cap9感染Sf9细胞后，Rep78和Rep52蛋白的表达。图21显示使用第6代至第10代的含有NAE的重组杆状病毒△NAE-Bac-Tn7-Rep-NAE-Cap9感染Sf9细胞后，Rep78和Rep52蛋白的表达。图22显示使用第6代至第10代的不含有CNE或NAE序列的重组杆状病毒Bac-Tn7-Rep-Cap9感染Sf9细胞后，Rep78和Rep52蛋白的表达。其中，M为蛋白质大小标记；泳道1至5，由用第6代至第10代的rBV感染的Sf9宿主细胞制备的细胞裂解物。图17至图22中的结果表明，与缺乏CNE或NAE序列的rBV相比，含有CNE或NAE序列的rBV在多次传代中表达更高水平的VP蛋白和Rep蛋白。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 睿征医药科技（武汉）有限公司
<120> 一种杆状病毒载体及其在昆虫细胞中制备rAAV的应用
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1590
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Expression cassette for homologous recombinant
<400> 1
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ggtctacgcc atatgaacgt cctacgcttg aagatctccg cagacagttg caagacaatt 1500
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aagtgcgtag aaggcagcgt caaaaccagc 1590
<210> 2
<211> 1277
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Expression cassette homologous recombinant
<400> 2
cacccgacgt aataggctac gtgtcggata ttatgcaaaa cacttatatt gtaacgtggt 60
tcaacaccgt cgacctttcc acctatcacg aaagcgtgca tgatgaccgg attgaaattt 120
ttgatttctt aaatcaaaaa tttcaacctg ttgatcgaat cgtacacgat cgcgttagag 180
caaatgatga aaatcccaac gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcatttaa 240
atggcgcgcc ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtatt cattaagcat 300
ctgccgacat ggaagccatc acaaacggca tgatgaacct gaatcgccag cggcatcagc 360
accttgtcgc cttgcgtata atatttgccc atggtgaaaa cgggggcgaa gaagttgtcc 420
atattggcca cgtttaaatc aaaactggtg aaactcaccc agggattggc tgagacgaaa 480
aacatattct caataaaccc tttagggaaa taggccaggt tttcaccgta acacgccaca 540
tcttgcgaat atatgtgtag aaactgccgg aaatcgtcgt ggtattcact ccagagcgat 600
gaaaacgttt cagtttgctc atggaaaacg gtgtaacaag ggtgaacact atcccatatc 660
accagctcac cgtctttcat tgccatacgt aattccggat gagcattcat caggcgggca 720
agaatgtgaa taaaggccgg ataaaacttg tgcttatttt tctttacggt ctttaaaaag 780
gccgtaatat ccagctgaac ggtctggtta taggtacatt gagcaactga ctgaaatgcc 840
tcaaaatgtt ctttacgatg ccattgggat atatcaacgg tggtatatcc agtgattttt 900
ttctccattt tagcttcctt agctcctgaa aatctcgaca actcaaaaaa tacgcccggt 960
agtgatctta tttcattatg gtgaaagttg gaacctctta cgtgccgatc aacgtctcat 1020
tttcgccaaa agttggccca gggcttcccg gtatcaacag ggacaccagg atttatttat 1080
tctgcgaagt gatcttccgt cacaggtagg cgcgccgaag ttcctatact ttctagagaa 1140
taggaacttc gcacgtcaaa aacggccaat acatggcgtg tcccgaagaa ttgtacgata 1200
acaacgaatt taaatgtaac atagaatcgg ataaattata ctatttggat aatttacaag 1260
aagattccat tgtataa 1277
<210> 3
<211> 2211
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cap gene
<400> 3
ctggctgccg acggttatct acccgattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60
gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120
aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180
aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240
cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300
caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360
gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420
ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480
aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540
tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600
cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660
gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780
tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840
tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900
ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960
caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020
acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080
gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140
acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200
ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260
cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320
gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380
ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440
ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500
tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560
ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620
ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680
accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740
gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800
atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860
aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920
aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980
gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040
gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100
tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160
tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211
<210> 4
<211> 1866
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rep gene
<400> 4
ctggcggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacgg gcatctgccc 60
ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg agtgggagtt gccgccagat 120
tctgacttgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180
cgcgactttc tgacggagtg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240
caatttgaga agggagagag ctacttccac ttacacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300
aaatccttag ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360
taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaacggc 420
gccggaggcg ggaacaaggt ggtggacgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480
acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatttagaac agtatttaag cgcctgtttg 540
aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600
gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgacgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660
tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720
cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780
tcccaaatca aggctgcctt ggacaatgcg ggaaagatta tgagcctgac taaaaccgcc 840
cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900
attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960
acgaaaaagt tcggcaagag gaacaccatc tggctgtttg ggcctgcaac taccgggaag 1020
accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080
aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140
aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200
gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260
aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320
ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380
gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440
gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500
gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560
gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620
aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680
ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740
tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800
ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860
caataa 1866
<210> 5
<211> 156
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CNE
<400> 5
acttttttgt aatgcaaaaa agttgatagt gtagtagtat attgggagcg tatcgtacag 60
tgtagactat tctaataaaa tagtctacga tttgtagaga ttgtactgta tatggagtgt 120
caggcaaaag tgaacttttt tgcattgcaa aaaaat 156
<210> 6
<211> 2407
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITR-GOI
<400> 6
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgccgccc gtcagtgggc agagcgcaca 180
tcgcccacag tccccgagaa gttgggggga ggggtcggca attgaaccgg tgcctagaga 240
aggtggcgcg gggtaaactg ggaaagtgat gtcgtgtact ggctccgcct ttttcccgag 300
ggtgggggag aaccgtatat aagtgcagta gtcgccgtga acgttctttt tcgcaacggg 360
tttgccgcca gaacacgcgt aagggatccg ccaccatggt gagcaagggc gaggaggata 420
acatggccat catcaaggag ttcatgcgct tcaaggtgca catggagggc tccgtgaacg 480
gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc acccagaccg 540
ccaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccctc 600
agttcatgta cggctccaag gcctacgtga agcaccccgc cgacatcccc gactacttga 660
agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg 720
tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc 780
tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc ccgtaatgca gaagaagacc atgggctggg 840
aggcctcctc cgagcggatg taccccgagg acggcgccct gaagggcgag atcaagcaga 900
ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg acgctgaggt caagaccacc tacaaggcca 960
agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca acgtcaacat caagttggac atcacctccc 1020
acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt acgaacgcgc cgagggccgc cactccaccg 1080
gcggcatgga cgagctgtac aagtaagaat tcgatatcaa gcttatcgat aatcaacctc 1140
tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc 1200
tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca 1260
ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg 1320
tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca 1380
ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg 1440
cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg 1500
acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg 1560
ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg 1620
accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc 1680
ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca tcgataccga gcgctgctcg 1740
agagatctac gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt 1800
tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga 1860
ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt 1920
tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc 1980
acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc 2040
tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg 2100
gtagagacgg ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat 2160
ctacccacct tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc 2220
tgtccttctg attttgtagg taaccacgtg cggaccgagc ggccgcagga acccctagtg 2280
atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 2340
gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 2400
ctgcagg 2407
<210> 7
<211> 200
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NAE
<400> 7
cattttcagc gacgtatatt gacaaatata ctacagtcgg acgtttgtgc cgacctatat 60
actacacttt accaaaaata tactacacta aactctaaat atactacaac tccacttcaa 120
tataaccaca ctctcgtaaa acggcccaaa aatatcgaaa tatatggggc aaatacacgt 180
ttaaaaaacg ctacgattcc 200

Claims (24)

1.一种杆状病毒载体，其特征在于：包含外源基因表达盒与稳定序列，所述稳定序列位于距离所述外源基因表达盒的5kb以内，所述稳定序列为CNE序列或NAE序列。
2.根据权利要求1所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述外源基因表达盒为AAV的cap基因表达盒、AAV的rep基因表达盒和带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件中的至少一个；所述稳定序列位于距离所述cap基因表达盒的起始端和末端、所述rep基因表达盒起始端和末端以及所述带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件的一端和另一端中的至少一处的5kb以内。
3.根据权利要求2所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述外源基因表达盒为所述cap基因表达盒和所述rep基因表达盒。
4.根据权利要求3所述的杆状病毒载体，其特征在于：按从5’至3’的顺序包含所述cap基因表达盒、所述稳定序列和所述rep基因表达盒。
5.根据权利要求3所述的杆状病毒载体，其特征在于：按从5’至3’的顺序包含所述rep基因表达盒、所述稳定序列和所述cap基因表达盒。
6.根据权利要求3所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述稳定序列位于所述cap基因表达盒与所述rep基因表达盒之间，且其两端分别靠近所述cap基因表达盒的起始端和所述rep基因表达盒的起始端。
7.根据权利要求2所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述外源基因表达盒为所述带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件。
8.根据权利要求2所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述外源基因表达盒为所述带有异源功能基因的AAV ITR核心表达元件和所述cap基因表达盒。
9.根据权利要求1所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述外源基因表达盒为AAV的rep78基因表达盒，所述杆状病毒载体还包含AAV的rep52基因表达盒，所述稳定序列位于所述rep78基因表达盒与所述rep52基因表达盒之间。
10.根据权利要求1所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述外源基因表达盒为AAV的rep52基因表达盒，所述杆状病毒载体还包含AAV的rep78基因表达盒，所述稳定序列位于所述rep52基因表达盒与所述rep78基因表达盒之间。
11.根据权利要求9或10所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述稳定序列的两端分别靠近所述rep78基因表达盒的起始端和所述rep52基因表达盒的起始端。
12.根据权利要求9或10所述的杆状病毒载体，其特征在于：启动所述rep78基因表达盒表达的启动子为杆状病毒早期启动子，启动所述rep52基因表达盒表达表达的启动子为杆状病毒极晚期启动子。
13.根据权利要求12所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述杆状病毒早期启动子为△lE1启动子，所述杆状病毒极晚期启动子为p10启动子。
14.根据权利要求1所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述外源基因表达盒用于表达报告蛋白或治疗性基因产物。
15.根据权利要求1所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述杆状病毒载体为重组杆状病毒转移载体，所述外源基因表达盒与所述稳定序列位于所述重组杆状病毒转移载体的Tn7转座子末端元件Tn7L和Tn7R之间。
16.根据权利要求1所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述杆状病毒载体为重组杆状病毒穿梭载体。
17.根据权利要求16所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述重组杆状病毒穿梭载体是通过第一重组杆状病毒转移载体介导的Tn7转座将所述外源基因表达盒与所述稳定序列插入到第一杆状病毒穿梭载体的转座插入位点而得到，所述第一杆状病毒穿梭载体上的杆状病毒基因组中缺失CNE序列或NAE序列。
18.根据权利要求16所述的杆状病毒载体，其特征在于：所述重组杆状病毒穿梭载体是通过转移载体介导的Red同源重组将所述外源基因表达盒插入到第二杆状病毒穿梭载体自带的CNE序列或NAE序列附近而得到。
19.一种权利要求1-18任一所述的杆状病毒载体在昆虫细胞中制备重组杆状病毒和/或重组腺相关病毒的应用。
20.一种昆虫细胞，其特征在于：包含权利要求1-14和16-18中任一所述的杆状病毒载体。
21.根据权利要求20所述的昆虫细胞，其特征在于：所述杆状病毒载体为权利要求16-18任一所述的杆状病毒载体。
22.根据权利要求21所述的昆虫细胞，其特征在于：还包含第二载体，所述第二载体包含带有异源功能基因的AAVITR核心表达元件，所述外源基因表达盒为AAV的cap基因表达盒和AAV的rep基因表达盒。
23.一种体外生长或产生重组杆状病毒的方法，其特征在于：包括提供包含权利要求20-22任一所述的昆虫细胞的昆虫细胞培养物，并培养所述昆虫细胞。
24.一种体外生长或产生重组腺相关病毒的方法，其特征在于：包括提供包含权利要求20-22任一所述的昆虫细胞的昆虫细胞培养物，并培养所述昆虫细胞。
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IRINA KIKHNO: "Identification of a conserved non-protein-coding genomic element that plays an essential role in Alphabaculovirus pathogenesis", 《PLOS ONE》, vol. 9, no. 4, 16 April 2014 (2014-04-16), pages 3 *
ZHIHONG HUANG等: "The Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus ac83 Gene Contains a cis-Acting Element That Is Essential for Nucleocapsid Assembly" *
ZHIHONG HUANG等: "The Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus ac83 Gene Contains a cis-Acting Element That Is Essential for Nucleocapsid Assembly", 《 J VIROL.》, vol. 91, no. 5, pages 02110 - 16 *
ZHIHONG HUANG等: "The Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus ac83 Gene Contains a cis-Acting Element That Is Essential for Nucleocapsid Assembly", 《J VIROL》 *
ZHIHONG HUANG等: "The Autographa californica Multiple Nucleopolyhedrovirus ac83 Gene Contains a cis-Acting Element That Is Essential for Nucleocapsid Assembly", 《J VIROL》, vol. 91, no. 5, 1 March 2017 (2017-03-01), pages 4 *

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