CN105392362B - 用于在宿主昆虫中表达重组蛋白的杆状病毒dna元件 - Google Patents

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Abstract

提供了能够改进重组蛋白在昆虫中的表达的试剂和方法。更具体而言，将重组DNA元件引入昆虫幼虫，能够提高重组蛋白的表达，促进所述蛋白的正确折叠，以及提高昆虫感染后的存活率。所述重组DNA元件可以通过例如包含所述元件的重组杆状病毒来引入昆虫幼虫。该重组DNA元件包括编码转录调节因子(例如IE‑0和IE‑1)的核酸、转录增强子元件(例如同源区域(hr))和启动子。

Description

用于在宿主昆虫中表达重组蛋白的杆状病毒DNA元件
技术领域
本发明可以被列入生物技术领域；其涵盖了包含例如启动子、作为增强子的同源区(hr)、转录调节因子的编码序列(例如杆状病毒Ac-ie-01cDNA)或其任意组合且能够提高重组蛋白表达效率(例如在昆虫幼虫中)的核酸序列。此外，本发明还指向：包含上述本发明核酸序列的载体本身；以所述序列或载体所感染、转化、转导或转染的昆虫；以及，使用上述序列、载体或昆虫来生成蛋白的方法。
背景技术
杆状病毒表达载体体系(BEVS)是一种已建立完善的方法，用于生成用作疫苗、治疗分子或诊断试剂的重组蛋白。BEVS因其过度表达潜力及快速发展速度，而成为用于生成任何用途的重组蛋白的最诱人选择之一。工业中最常用于重组蛋白表达的杆状病毒载体基于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核多角体病毒(AcMNPV)，以草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)9(Sf9)或21(Sf21)昆虫细胞为合适表达宿主(1)，并以粉纹夜蛾(Trichoplusia ni，或T.ni)昆虫幼虫为活生物工厂(2)。BEVS开发于80年代(3)，自此以来，已在杆状病毒感染的昆虫细胞中成功生成了从胞质酶到膜结合蛋白的数百种重组蛋白。
全世界每年约生产70000吨蚕丝，其生产过程中，将低价值的原料桑树叶转化为基于蛋白质的高价值产物蚕丝。昆虫是高效的蛋白质生产者，因为其新陈代谢快。鳞翅目，例如家蚕(Bombyx mori)或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)，是生物技术中最常用的两种昆虫。它们在不到2周内即可将体积成长约5000倍，并生产出每只昆虫超过1千米的蚕丝。丝腺细胞可以产生约80μg蛋白质/细胞/天，而最好的哺乳类细胞培养体系仅能产生约50pg蛋白质/细胞/天。从培养哺乳类细胞中得到的重组蛋白可能受外源因子(例如病毒或朊病毒)感染的担忧，在人用或动物用的昆虫源产品中即使并非绝不存在，亦显著较低。虽然已经产生了转基因桑蚕来生成人医疗蛋白(4)，但该技术尚未用于生产疫苗抗原。但是，转基因杆状病毒(苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒和家蚕核型多角体病毒)已经用于生产昆虫源疫苗(insectigen)。从根本上来说，用于在昆虫细胞培养物中进行抗原表达的相同杆状病毒可以用于感染昆虫幼虫。感染后，重组抗原在昆虫组织中积累，在感染后3-4天，即可处理该幼虫以获得该重组抗原，其获取数量可以在每条受感染幼虫数百微克(μg)至数毫克之间。针对动物感染性疾病的实验性疫苗也得到了极好的测试结果，哪怕使用的是从幼虫获得的未纯化可溶抗原，且在对动物进行重复免疫程序后没有任何副作用(5,6,7,8)。其他一些不同用途的蛋白质也是以昆虫作为活生物工厂来生产的，例如酶(9,10)、抗体(11,12)、荷尔蒙(13,14)、细胞因子(15,16)和诊断性蛋白(17,18,19,20)。上述蛋白中大多数在合成后经过正确处理，且其功能活性在可溶性幼虫蛋白提取物中保持完整。用昆虫作为活生物工厂，因其生产多功能性、可扩展性、效率性和发展速度，是有希望取代常规发酵技术和植物源蛋白的一种替代方式，
加速重组蛋白表达，从而能够在昆虫幼虫的细胞机器被杆状病毒感染严重损坏之前进行蛋白表达，将会是BEVS的一项重要改进。由常规强病毒启动子多角体蛋白(polyhedrin，即polh)或p10基因所驱动的晚期表达，在外源蛋白翻译后修饰中具有严重不利条件。杆状病毒启动子能够比常规使用的polh或p10启动子更早地启动表达，因此其特性在于可用作异源蛋白生产，但其生产力降低(21)。
改进BEVS的另一种可能是，通过减少病毒诱导的细胞死亡，在感染后晚期更好地保存细胞完整性。降低感染后晚期因BEVS导致的昆虫细胞机器严重损坏，将不仅增加可用于生产和积累重组蛋白(分泌或未分泌)的时间，还为复合蛋白的折叠或生成蛋白的所有翻译后修饰提供更多时间。杆状病毒感染的昆虫幼虫在感染过程中以病毒剂量依赖性的方式生产和积累重组蛋白。延长受感染幼虫的存活，连同针对高感染剂量进行某种保护，可以极大地提高充当活生物工厂的昆虫的生产力。
已经测定出一些杆状病毒DNA元件参与启动了病毒传播所必需的后期表达因子的基因。其中之一为AcMNPV(苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核多角体病毒)的立即早期(ie)蛋白(immediate early protein)IE-1及其剪接变体IE-0。因其内部翻译起始，翻译由Ac-ie-01 cDNA编码的AcMNPV mRNAs会既产生IE-0又产生IE1。两者均由于具有作为转录调节因子的能力(22)而被认为是杆状病毒基因表达的关键调节因子。AcMNPV IE-1合成于感染极早期，是67-kDa的二聚DNA结合性蛋白，在质粒转染试验中，它通过其N端酸性结构域的活性来刺激转录(23,24)。IE-1在细胞核中累积，且保留于此度过晚期(25)。IE-1作为同源二聚体与杆状病毒同源区域(hr)序列的结合，能增强IE-1的反式激活，所述同源区域充当转录增强子以及病毒DNA复制起点。AcMNPV立即早期蛋白IE-0(74kDa)与IE-1相同，只是其N端上另有54个氨基酸残基。AcMNPV IE-0是含636个氨基酸的72.6-kDa的蛋白，它由orf141(exon0)所编码的38个氨基酸、ie1上游未翻译前导所编码的16个氨基酸以及IE-1蛋白的全部582个氨基酸所组成。因此，除了融合在N端的额外54个氨基酸外，最终产物与IE-1一模一样。推测因为其共有序列，IE-0和IE-1具有相同的生物化学活性，包括结合hr增强子和转录调控。
由于缺乏强于商用启动子(polh和p10)的新型替代启动子，以及缺乏任何能通过降低病毒导致的细胞损伤从而在杆状病毒体系中实现长期表达的替代形式，因此，本发明聚焦于通过在杆状病毒表达组件中并入重组DNA元件的方法，解决所述问题。令人吃惊地，本发明展示了：包含杆状病毒转录调节因子、增强子同源区域(hr)序列、启动子或启动子组合的所述表达组件，能够将昆虫幼虫中的重组蛋白生产提高到前所未有的水平。此外，本发明的表达组件还提高了高感染剂量杆状病毒感染的昆虫幼虫在感染后晚期的存活率，由此令杆状病毒感染对昆虫的致病作用最小化。另一方面，提高了杆状病毒感染期间的细胞功能完整性，也有助于在昆虫幼虫中进行正确的重组蛋白翻译后加工。
发明内容
本发明提供了用于改进杆状病毒感染的昆虫幼虫中的重组蛋白表达的方法及其产物。
以下各项为能够实现该改进表达的优选实施例：
1.含有能够高于内源水平地表达充当转录调控因子的蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的核酸序列的昆虫，其中所述核酸选自：
(a)含有如SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的核酸；
(b)与SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％，并编码能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码含有如SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码了与SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％并能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的氨基酸序列的核酸序列。
2.根据第1项所述的昆虫，进一步包括至少一个充当增强子区域并可操作地连接任何适用于驱动重组蛋白表达的启动子的重组同源区域(hr)。
3.根据第2项所述的昆虫，其中所述重组同源区域(hr)是如SEQ ID NO:27(hr1)所示的序列。
4.根据第2或3项所述的昆虫，其中，所述可操作地连接在所述重组同源区域(hr)上的启动子选自如下核酸：
(a)含有如SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的核酸；和
(b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％的核酸序列。
5.根据1-4中任一项所述的昆虫，包含了含有重组启动子、编码转录调控因子的序列、选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合的核酸序列。
6.根据1-5中任一项所述的昆虫，进一步包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接在选自第1-5项中的核酸序列。
7.根据1-6中任一项所述的昆虫，其中所述昆虫来自鳞翅目(Lepidoptera)。
8.根据1-7中任一项所述的昆虫，其中所述昆虫选自：Trichoplusia ni(粉纹夜蛾)、Spodoptera frugiperda(草地贪夜蛾)、Spodoptera exigua(甜菜夜蛾)、Ascalaphaodorata、Bombyx mori(家蚕)、Rachiplusia ni和Stigmene acrea。
9.根据1-8中任一项所述的昆虫，其中所述核酸序列是通过重组杆状病毒(优选为AcMNPV或BmNPV)引入该昆虫的。
10.用于产生重组蛋白的方法，包括：使用1-9中任一项所述的昆虫，并通过常规方法对重组蛋白进行提取和纯化。
11.根据第10项所述的用于生产重组蛋白的方法，其中所述重组蛋白选自：亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、病毒样颗粒、治疗蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝剂、受体、荷尔蒙或诊断性蛋白试剂。
12.用于含有如1-6中任一项所述核酸序列的昆虫的饲育、喂养或注射培养基。
附图说明
图1：本发明的杆状病毒重组DNA元件的示意图，包括4种主要元件：编码转录调控因子的序列(A，例如IE0和IE1)，其表达受到启动子(B，例如polh或pB29)的驱动；增强子同源区域(hr)序列(C，例如hr1)，位于驱动编码重组蛋白的外源基因表达的启动子(D；e.g.p10、pB29p10或p6.9p10)的上游。该示意图展示了本发明的重组DNA元件之间相互作用，从而获得前所未有的重组蛋白过度表达的理论机制。
图2：使用“”克隆体系(invitrogenTM)生成重组杆状病毒的不同策略。
图3：生成与其他用于制备重组杆状病毒的商用技术相兼容的克隆、供体和转移载体的基本方案。
图4：A)用在polh启动子控制下表达GFP蛋白的常规杆状病毒或含有本发明的杆状病毒组件polh Ac-ie-01/hr1p6.9p10GFP的杆状病毒，以500或50000PFU接种粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫(五龄)，在感染96小时后所生成的重组GFP。B)以图4A中的相同杆状病毒以两种不同感染剂量，即500和50000PFUs，感染96小时后的幼虫存活率。
图5：A)包含本发明的表达组件polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP的杆状病毒以不同剂量感染幼虫96小时后，相对于常规杆状病毒(polhGFP)的幼虫存活百分比。B)以常规杆状病毒(polhGFP)或含有本发明的表达组件(polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP)的杆状病毒进行感染时的昆虫生物量和感染96小时后回收的生物量。感染剂量为5x 104PFUs。
图6：A)使用感染剂量为5x 104PFUs的在polh启动子(polhAc-ie-01)控制下过度表达Ac-ie-01 cDNA的杆状病毒，或使用在polh启动子(polhGFP)控制下表达GFP的常规杆状病毒，感染幼虫96小时后的幼虫存活百分比。B)以图6A中的相同杆状病毒进行感染时的昆虫生物量和感染96小时后回收的生物量。感染剂量为5x 104PFUs。
图7：用在polh启动子控制下的常规杆状病毒(2)或用含有本发明表达组件polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP的杆状病毒(1)所表达的重组GFP蛋白的对比。感染后96小时，取得每种杆状病毒以5x 105PFUs所感染的幼虫的提取物。A)重组GFP蛋白的考马斯蓝染色。B)以特异性抗血清检测微管蛋白来测定杆状病毒感染后的细胞完整性。C)使用特异性抗GFP血清对重组GFP蛋白进行免疫印迹检测。
图8：本发明的杆状病毒表达组件中所含的优选元件的示意图示，包括转录调控因子的编码序列、对编码重组蛋白的外源基因的启动子引发的转录进行增强的同源区域(hr)。
具体实施方式
本发明通过向昆虫引入重组DNA元件的方式，改进重组蛋白的表达。
本发明的重组DNA元件是能够使得杆状病毒转录调控因子进行高于内源水平的表达的序列，以及可选地，增强子同源区域(hr)和可操作地连接在上述元件上的启动子。
此外，重组DNA元件可以构成表达组件的一部分。
“表达组件”指的是包含重组DNA元件的核酸序列，其控制基因表达(例如，启动子)和/或是基因表达所必需的(例如，基因本身)。该表达组件可以用重组载体或杆状病毒载体来引入。
重组DNA组件可以被包含在单一核酸序列、克隆载体、转移载体、重组杆状病毒或细胞中。但是，他们也可以存在于不同的核酸序列、克隆载体、转移载体、重组杆状病毒中并被引入同一细胞。
本发明令人吃惊地展示了，向昆虫幼虫引入序列能引发杆状病毒转录调控因子进行高于内源水平的表达，以及，可选地，增强子同源区域(hr)序列、启动子或启动子组合的引入能够将重组蛋白的生成提高到前所未有的水平。这表明，该体系可用于重组蛋白的体内表达。
此外，与常规杆状病毒感染的幼虫相比，用杆状病毒向昆虫幼虫引入所述重组DNA元件，提高了幼虫在感染后的存活率，尤其是在使用高病毒剂量进行感染之后的存活率(令生物量回收量，即该体系的生产力，得到最大化)。生产流程末尾所回收的昆虫生物量亦显著增加。而且，与常规杆状病毒感染的幼虫相比，所述杆状病毒感染的幼虫的分子细胞机器完整性和细胞形态得到了改善。杆状病毒感染期间的细胞功能完整性改善，还有助于重组蛋白进行正确的翻译后加工。
因此，本发明的一个方面涉及一种含有允许进行高于内源水平的转录调控因子表达的核酸序列的昆虫。在一个优选实施例中，所述转录调控因子为IE-1、IE-0和/或其片段。在又一个优选实施例中，所述昆虫为转基因昆虫。
“转录调控因子”指的是能够通过例如与增强子或抑制子区域结合和/或招募更多参与转录的蛋白来调节特定基因转录的调节蛋白。
IE-1及其剪接变体IE-0是在杆状病毒感染期间内源表达的转录调控因子。在本发明中，IE-1、IE-0和/或其片段重组后进行表达，以将所述蛋白的总水平提高到高于内源水平。这可以通过例如引入更多的内源基因拷贝或控制所述内源基因的启动子表达来达成。更多的内源基因拷贝可以在适当启动子(例如polh或pB29)的控制下作为转基因的形式引入。
IE-1、IE-0和/或其片段的表达水平可以在mRNA和蛋白质水平上根据本领域技术人员所知的常规方法进行测定，例如定量PCR和免疫印迹分析法。
在本发明中，IE-1、IE-0和/或其片段由SEQ ID NO:1(亦称为Ac-ie-01)至SEQ IDNO:5所示的核酸编码。SEQ ID NO:1是编码IE-1和IE-0的Ac-ie-01 cDNA，SEQ ID NO:2是编码IE-1的编码序列(CDS)，SEQ ID NO:3是IE-0的CDS。SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5分别是IE-1和IE-0用于保持催化转录调控因子活性的N端区域的CDSs。SEQ ID NO:2-5所编码的蛋白分别如SEQ ID NO:6-9所示。
本发明进一步公开了SEQ ID NO:1-9的变体，所述变体具有转录调控因子功能，或编码具有转录调控因子功能的氨基酸。所述变体是与原核酸或氨基酸存在一个或多个位点差异的核苷酸或氨基酸序列，其中所述差异可以是核苷酸或氨基酸残基的添加、删除和/或取代。
本发明的核酸和氨基酸序列与其他核酸和氨基酸序列可以分别通过用EMBOSSNeedle软件在默认参数下测定序列一致性或相似性来加以区分(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)。用于产生所述变体的方法包括随机诱变或定向诱变、定点饱和诱变、基于PCR的片段拼接、DNA改组、体外或体内同源重组以及基因合成法。
SEQ ID NO:1-5序列的变体序列与SEQ ID NO:1-5序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％。SEQ ID NO:6-9序列的变体序列与SEQ ID NO:6-9序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％。所述昆虫优选为鳞翅目，更优选为选自Trichoplusia ni(粉纹夜蛾)、Spodopterafrugiperda(草地贪夜蛾)、Spodoptera exigua(甜菜夜蛾)、Ascalapha odorata、Bombyxmori(家蚕)、Rachiplusia ni和Stigmene acrea的昆虫。在一个优选实施例中，所述昆虫为幼虫。
在一个优选实施例中，除允许蛋白IE-1、IE-0和/或其片段高于内源水平表达的核酸序列外，本发明的昆虫还含有能够通过可操作地连接其相应启动子来增强重组蛋白表达的重组同源区域(hr)。
重组同源区域(hr)由长约70bp且在靠近中间处有30-bp不完整回文的重复单位组成。AcMNPV基因组中，同源区域在8个位置重复，每侧含2-8个重复序列。同源区域包括转录增强子和杆状病毒DNA复制起点。
“增强子区域”指的是控制序列，其与转录调控因子的结合能提高相关基因的转录水平。
“重组蛋白”指的是源自重组DNA的蛋白。所述蛋白可用于造福人类和动物，且可应用于工业、商业或医疗应用。
“可操作地连接”指的是两个核酸序列相互连接，且其中一个核酸序列可以在例如转录调控方面影响另一个核酸序列。
“启动子”指的是可与RNA聚合酶结合从而引发转录的DNA序列。所述序列还可以包含与各种转录调控蛋白(例如转录因子)的结合位点。所述启动子序列可以由DNA序列中位置接近的不同启动子片段(不同或相同片段)组成，且可以由连接子或间隔子分隔开。所述启动子称为嵌合启动子。
位于所述启动子/启动子组合上游的所述增强子同源区域序列hr优选为hr1(SEQID NO:27)。驱动重组蛋白表达的所述启动子优选为：选自SEQ ID NO:10-16，或能够充当启动子且与SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％的序列。
在一个优选实施例中，所述核酸序列包括重组启动子、编码转录调控因子的序列、选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合。
如上所述，本发明中的重组启动子、编码转录调控因子的序列和增强子区域无需是单个分子的一部分，相反，这些序列可以是不同分子的部分，只要它们可操作地相连，即包含在相同细胞内，即可。
本发明的昆虫优选为包括编码重组蛋白的核酸序列。该核酸序列可操作地连接在能够允许IE-1、IE-0和/或其片段进行高于内源水平的表达的核酸序列上，且可选地连接同源区域(hr)。上述重组DNA元件优选为通过重组杆状病毒引入昆虫。优选地，所述杆状病毒为AcMNPV或BmNPV，且所述昆虫为昆虫幼虫。该杆状病毒通过口服(经口，per os)，或更优选地通过注射施用给幼虫。在又一个实施例中，以本发明的重组杆状病毒、转移载体、克隆载体或核酸序列来感染、转染、转导或转化所述昆虫。优选地，所述昆虫幼虫在如专利申请ES2232308中所述的饲育模块中进行饲育。
在本发明的另一方面中，公开了使用本发明的昆虫生产重组蛋白的方法。为此，可以用本发明的重组杆状病毒、转移载体、克隆载体或核酸序列来感染、转染、转导或转化所述昆虫。表达所述重组蛋白后，采用常规方法来对该重组蛋白进行提取和纯化。
在一个优选的蛋白生产实施例中，以注射高病毒剂量(高于104空斑形成单位(Plaque Forming Units))的本发明重组杆状病毒来感染所述幼虫。感染后3-4天，处理所述受感染幼虫并通过使用合适的提取缓冲液来获得全可溶性蛋白提取物。对提取物离心，除去脂类部分，然后，以常规方法纯化重组蛋白。
以本发明的方法来生产的重组蛋白，优选为选自以下各项蛋白：亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、病毒样颗粒、治疗蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝剂、受体、荷尔蒙或诊断性蛋白试剂。
本发明的一个方面涉及在昆虫的饲育、喂养或注射培养基中使用本发明的重组杆状病毒、转移载体、克隆载体或核酸序列。
本发明公开了一种可用于生产本发明的昆虫且包含所述用于高于内源水平地表达IE-1、IE-0和/或其片段的序列的杆状病毒。
“杆状病毒(Baculovirus)”指的是一个感染无脊椎动物(主要感染昆虫和节肢动物)的病毒科。“重组杆状病毒”进一步通过例如同源重组或转座引入重组DNA。重组杆状病毒优选为源自AcMNPV(苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒)或BmNPV(家蚕核型多角体病毒)。
“重组DNA”指的是一种人造DNA，其通过组合或插入一条或多条DNA链，从而将在正常情况下非共同存在的DNA组合在一起。
“重组DNA元件”指的是重组DNA中的功能性元件，例如启动子、增强子或基因。如上所述，本发明的重组DNA元件是能够使得杆状病毒转录调控因子高于内源水平地进行表达的序列、增强子同源区域(hr)和可操作地连接在上述元件上的启动子。优选地，杆状病毒转录调控因子IE-1、IE-0或其片段高于内源水平地进行表达。
重组杆状病毒优选为，除了(i)高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列外，还包括相连的(ii)重组同源区域(hr)和(iii)用于驱动重组蛋白表达的适当启动子。用于昆虫的重组DNA元件优选组合如上所述。此外，重组杆状病毒优选为包括编码重组蛋白的核酸序列。
除了适用于以杆状病毒进行整合或转座的序列外，本发明还公开了可用于产生本发明的昆虫和/或重组杆状病毒且包含所述使得蛋白IE-1、IE-0和/或其片段高于内源水平地表达的序列的转移载体。
转移载体一般能够向杆状病毒中插入基因信息。
转移载体优选为，除了(i)高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列外，还包括相连的(ii)重组同源区域(hr)和(iii)用于驱动重组蛋白表达的适当启动子。用于昆虫的重组DNA元件优选组合如上所述。
在一个优选实施例中，所述转移载体包含编码所述重组蛋白的核酸序列，而在另一个优选实施例中，所述转移载体不含所述序列。
在一个优选实施例中，所述转移载体为杆粒。
“杆粒(bacmid)”指的是一种质粒结构，其包含在转染入细胞后足以产生杆状病毒的DNA序列。
在又一个优选实施例中，所述转移载体源自以下市售杆状病毒表达体系中的任一种：“”(invitrogenTM)、“BacPAKTM”(ClontechTM)、“FlashBACTM”(OxfordExpression TechnologiesTM)、“BacuVanceTM”(GenScriptTM)、“Bac-N-Blue DNATM”(invitrogenTM)、“BaculoDirectTM”(invitrogenTM)、“”1000、2000、3000()、“DiamondBacTM”(或“BaculoGoldTM”(BD biosciencesTM)。
本发明公开了一种可用于产生本发明中的昆虫、重组杆状病毒和/或转移载体，包含所述能够高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列，且适用于细菌复制的克隆载体。
“克隆载体”指的是任何适用于克隆的载体，一般包括限制性位点、细菌繁殖的复制起点以及选择标记。
该克隆载体优选为：除了(i)高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列外，还包括相连的(ii)重组同源区域(hr)和(iii)用于驱动重组蛋白表达的适当启动子。用于昆虫的重组DNA元件优选组合如上所述。
在一个优选的方面中，所述克隆载体包括编码所述重组蛋白的核酸序列(亦称为“供体载体”)，而在另一个优选实施例中，所述克隆载体不含所述序列。
本发明公开了一种可用于产生本发明中的昆虫、重组杆状病毒和/或克隆载体且包含所述能够高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列的核酸序列。
该核酸序列优选为，除了(i)高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列外，还包括相连的(ii)重组同源区域(hr)和(iii)用于驱动重组蛋白表达的适当启动子。用于昆虫的重组DNA元件优选组合如上所述。
在一个优选实施例中，所述核酸序列包含编码所述重组蛋白的核酸序列，而在另一个优选实施例中，所述核酸序列不含所述序列。
序列说明
序列号(SEQ ID NO) 名称
1 完整的Ac-ie-01 cDNA
2 IE-1的蛋白编码序列(CDS)
3 IE-0的CDS
4 IE-1N端区域的CDS
5 IE-0N端区域的CDS
6 IE-1蛋白
7 IE-0蛋白
8 IE-1N端区域蛋白
9 IE-0N端区域蛋白
10 polh(启动子)
11 p10(启动子)
12 pB29p10(启动子)
13 p6.9p10(启动子)
14 pB29(启动子)
15 pB2p10(启动子)
16 polhp10(启动子)
17 polhAc-ie-01/hr1p10
18 polhAc-ie-01/hr1pB29p10
19 polhAc-ie-01/hr1p6.9p10
20 pB29Ac-ie-01/hr1p10
21 pB29Ac-ie-01/hr1pB29p10
22 pB29Ac-ie-01/hr1p6.9p10
23 polhAc-ie-01/hr1polh
24 pB29Ac-ie-01/hr1polh
25 polhAc-ie-01/hr1polhp10
26 pB29Ac-ie-01/hr1polhp10
27 同源区域增强子hr1
28 polhAc-ie-01
29 polhGFP
根据布达佩斯条约的微生物保藏
质粒保藏于西班牙模式菌种保藏中心(CECT)(www.cect.org)(地址：Universityof Valencia(Parc Científic Universitat de València)；Catedrático AgustínEscardino,9；46980Paterna(Valencia),Spain)，检索号CECT8031，保藏日期2011年10月4日。
实施例
实施例1：杆状病毒载体表达体系(BEVS)中，杆状病毒转录调控因子的过度表达，使得与启动子功能性相连的同源区域(hr)的增强子功能加强，提高重组蛋白表达。
由AcMNPV中的Ac-ie-01cDNA所编码的立即早期病毒蛋白IE-1和IE-0是强力的杆状病毒转录调控因子。所述蛋白以同源二聚体形式与充当转录增强子的杆状病毒同源区域(hr)序列结合，能够增强这些蛋白对反式激活的调节。AcMNPV IE-1/IE-0是67-72kDa的二聚体DNA结合性蛋白，在质粒转染实验中，能够通过其N端酸性区域的活性来刺激转录(7,8)。IE-1和IE-0合成于感染极早期，在细胞核中累积，且保留于此度过晚期。使用双质粒pFastBacTM(invitrogenTM)，在polh启动子的控制下克隆Ac-ie-01 cDNA。在同一质粒的不同位点上，GFP编码基因被克隆于早前合成的hr1p6.9p10嵌合启动子的下游，所述嵌合启动子包含融合的同源区域hr1和启动子p6.9和p10。所得到的本发明杆状病毒表达组件以及重组DNA元件的假定功能如图1所示。所得质粒用于以“”体系(invitrogenTM)生成重组杆状病毒。同时，以同样的体系制备在polh启动子控制下表达GFP蛋白的常规杆状病毒。
以低感染剂量或高感染剂量(5x 102或5x 104)感染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫96小时后，以荧光光度法研究不同杆状病毒调节的GFP蛋白表达。含有上述本发明表达组件的杆状病毒使得幼虫提取物中的GFP表达水平提高了约13％至超过40％，取决于所用的病毒剂量(图4A)。使用在昆虫源pB29启动子控制下表达Ac-ie-01 cDNA的杆状病毒，或在hr1pB29p10启动子控制下表达GFP的杆状病毒，观察到相似结果(数据未显示)。
实施例2：大感染剂量的本发明杆状病毒表达组件通过Ac-ie-01 cDNA编码的转录调控因子提高了受杆状病毒感染的昆虫幼虫的存活率和昆虫生物量回收量
在上一实施例中，展示了本发明杆状病毒组件中表达重组蛋白的杆状病毒在蛋白生产能力方面的优势。但是，观察到的最主要差异还是高感染剂量下的幼虫存活百分比(最大生产力)。在所述感染条件下，含有本发明表达组件的杆状病毒令幼虫存活率提高了约70％(图4B)。这意味着，使用常规的杆状病毒时，最优感染条件为使用5x 102PFUs的感染剂量(最大幼虫成活率)。但是，通过使用含有本发明表达组件的杆状病毒，可以使用5x 104的剂量，而在生产过程末尾回收到相同数目的幼虫(图4B)。在所述最优生产条件下(5x104PFUs感染量)，含有本发明表达组件的杆状病毒产生的重组蛋白量超过常规杆状病毒(5x102PFUs)最优剂量感染昆虫幼虫的两倍(图4A和4B)。
使用不同剂量的常规杆状病毒(polhGFP)或含有本发明的表达组件polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP的杆状病毒(两者均表达GFP蛋白)，进行幼虫感染研究，发现当使用含本发明表达组件时，受感染幼虫的存活率提高(图5A)。在最高感染剂量(5x 104)下，与用常规杆状病毒感染的幼虫相比，用含本发明表达组件进行感染的幼虫的存活率提高了超过70％。该受感染幼虫的存活率对生产过程末尾所回收的昆虫生物量回收量具有直接显著的效果，当使用最大剂量(最大生产力)的含本发明表达组件的杆状病毒时，所述昆虫生物量回收量提高了80％(图5B)。
为了测定本发明杆状病毒高剂量感染后存活率提高的相关有趣性质的遗传因素原因，生制备在polh启动子控制下表达Ac-ie-01 cDNA编码的转录调控因子的重组杆状病毒。然后，用该杆状病毒以高剂量感染粉纹夜蛾幼虫(T.ni)。作为对照，我们使用了在相同启动子控制下表达GFP蛋白的杆状病毒。与以本发明的表达组件polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP所感染的幼虫相似，受过度表达Ac-ie-01 cDNA(polhAc-ie-01)的杆状病毒感染的幼虫，与受相同启动子(polhGFP)控制表达GFP的常规杆状病毒感染的幼虫相比，也显示出提高的存活率(图6A)。这强烈地暗示着，本发明中的杆状病毒表达组件中所用的转录调控因子的过度表达，保护昆虫幼虫不受杆状病毒导致的死亡率影响，允许长期表达(更多重组蛋白产量)并使用高感染剂量(最大生产力)来提高昆虫生物量回收量(图6B)。
实施例3：Ac-ie-01 cDNA编码的转录调控因子在杆状病毒表达体系中的过度表达促进用作生物工厂的受感染昆虫幼虫中的重组蛋白翻译后加工
杆状病毒感染期间的细胞完整性，对保证该体系中表达的外源蛋白的正确折叠或任意翻译后加工而言，非常重要。常用于研究和生产的杆状病毒强启动子，例如polh和p10，仅在感染后晚期表达外源基因，而此时受感染细胞已经表现出严重的细胞病变效应，且细胞活力降低。如上所述，本发明的杆状病毒表达组件中所用的转录调控因子的过度表达，保护细胞不受杆状病毒感染的病原作用影响，允许保持完全活力的细胞具有用于重组蛋白生产的较宽时间窗口。
对本发明的表达组件中所含重组DNA元件与作为活生物工厂的昆虫幼虫中的重组蛋白翻译后修饰的相关性进行了研究。为此，使用polhGFP启动子控制下表达报告蛋白GFP的常规杆状病毒、含本发明杆状病毒组件且亦表达GFP蛋白的杆状病毒(polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP)，以5x 104PFUs的剂量来感染昆虫幼虫。
感染后96小时，用SDS-PAGE凝胶和考马斯亮蓝染色来分析受感染幼虫提取物(图7A)。有趣的是，常规杆状病毒表达的GFP蛋白条带的分子量降低(低于预期)，暗示着重组蛋白的降解或错折叠。相反地，当使用本发明的杆状病毒表达组件来介导GFP蛋白表达时，所得GFP条带显示出该蛋白的预期分子量，即约27kDa。
还使用抗GFP单克隆抗体以免疫印迹法来分析受感染幼虫的提取物(mab2515；MilliporeTM)(图7C)。在两种杆状病毒感染幼虫的提取物中均检测出了GFP蛋白，但用考马斯亮蓝染色，却观察到重组蛋白的电泳淌度差异。
同时，在感染后的不同时间点，使用特异抗血清对细胞微管蛋白进行免疫印迹分析，以测量细胞机器的完整性(图7B)。常规杆状病毒感染在感染后96小时严重损坏了细胞完整性，因此在该时间点后检测到的微管蛋白条带急剧减少(因细胞完整性的完全丧失而降解)。而以本发明表达组件所改造的重组杆状病毒所感染的细胞中，细胞微管蛋白并未受到同样影响，这符合本发明的杆状病毒表达组件中所含重组DNA元件所带来的细胞保护。
实施例4：细胞培养物和病毒
27℃下，在6孔组织培养板中以含有10％热灭活牛胎血清(Pan BiotechTM,Germany)的TNM-FH昆虫培养基(Pan BiotechTM,Germany)培养Spodoptera frugiperdaSf21或Sf9细胞系(1x106细胞/孔)。使用“”杆状病毒表达体系(invitrogenTM,USA)获得AcMNPV重组杆状病毒。使用pFastBacTM-DUAL质粒(invitrogenTM)制备含有本发明重组DNA元件的不同转移载体。pFastBacTM-DUAL中所包含的启动子和调控因子是合成(GenScriptTM,USA)所得，其中以足量的侧翼限制序列来促进克隆。使用这些转移载体来用(invitrogenTM,USA)转染Sf21细胞。感染Sf21所得的重组杆状病毒随后在细胞中传代两次，并用空斑测定方法来滴定。所得的杆状病毒表达组件的基因结构如图8所示，图中展示了驱动Ac-ie-01 cDNA或外源基因(例如，GFP)表达的启动子的潜在不同组合。使用了不同表达组件来生成如图4至图7所示的实施例中的重组杆状病毒。
实施例5：制备克隆载体
该克隆载体是含有本发明杆状病毒表达组件的小段DNA，可以向其中插入外源DNA片段：用限制酶处理载体和外源DNA来制造相同突出末端，然后将片段相连。该克隆载体的必要特征必须包括：合成多克隆位点(MCS)，用于促进外源基因以选定方向插入；选择性标记，例如抗生素耐药性，以允许对阳性转化细胞进行选择；以及，功能性复制起点(ORI)，用于细菌繁殖。
实施例6：制备含有本发明杆状病毒表达组件的供体载体
供体载体由含有杆状病毒表达组件并以适当限制酶克隆插入了外源基因的克隆载体(例如pUC57质粒)组成。本发明杆状病毒表达组件是通过连接以下DNA序列来合成的：(i)杆状病毒转录调控因子编码序列Ac-ie-01，位于启动子序列(例如polh或pB29启动子)下游和HSV TK多腺苷酸化信号上游；(ii)另一位点上的增强子序列(例如同源区域hr1)，位于(iii)启动子序列(例如pB29p10、p10、p6.9p10或polh)的上游；随后是用于克隆所需基因的多克隆位点(MCS)和位于MCS下游的SV40多腺苷酸化信号(图1)。杆状病毒表达组件侧翼为特异性限制位点(例如，5’端为BglII和BstZ17l，3’端为BglII和SgfI)，以促进亚克隆进入商用杆状病毒发生体系(基于转座，例如“”体系(invitrogenTM)的转移载体中，或基于同源重组，例如“flashBACTM”(Oxford Expression TechnologiesTM)、“BaculogoldTM”(BD BiosciencesTM)、“BacPAK6TM”(ClontechTM)、“Bac-N-Blue DNATM”(invitrogenTM)))的转移载体中(图2和图3)。
使用NcoI和SpeI限制位点将绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因克隆入克隆载体的MCS，生成供体质粒载体(图2)。
实施例7：制备含本发明杆状病毒表达组件的转移载体
通过以BstZ17l对供体载体的5’-侧翼位点进行酶切，及以XbaI进行酶切，并将其克隆入已用相同酶进行酶切的转移载体pFastBacTM1，从而生成所述转移载体。在此情况下，作为亚克隆的结果，杆状病毒表达组件的SV40多腺苷酸化信号被转移载体的SV40多腺苷酸化信号所替换。除此之外，表达组件的所有元件均包含在该pFastBac转移载体中，取代了原本商用转移载体的polh启动子和MCS(图2)。
实施例8：使用“”体系生成含有本发明杆状病毒表达组件的杆状病毒表达载体使用修饰后的转移载体pFastBacTM1和该个体杆状病毒表达组件，通过“”杆状病毒表达体系来生成重组杆状病毒。更具体而言，使用修饰后的转移载体来转化含有杆状病毒穿梭载体(杆粒)和辅助质粒的E.coli宿主菌DH10BacTM，并允许该表达组件转座后生成重组杆粒。然后，使用以含有本发明杆状病毒表达组件和GFP编码基因的重组杆粒的DNA来转染昆虫细胞，例如，Sf21细胞。转染后72小时，收获细胞并获得第一代重组杆状病毒(图2)。该重组杆状病毒随后可以用常规试验方法进一步扩增和/或滴定。可以使用类似步骤来以商用BEVSs提供的其他转移载体生成重组杆状病毒(图3)。
实施例9：昆虫幼虫的饲育和感染
粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)在二级生物安全条件下进行饲育。将卵置于专门设计的含有人造虫食的幼虫发育笼中，并保持在22℃、控制湿度(50％)和光照周期(8h/天)的生长室中。
使用五龄幼虫(蛹化前的末龄幼虫)进行所有的感染实验。每条幼虫的标准重量为约120-130mg，在腹足(体腔前侧)附近注射5μl稀释到指定空斑形成单位(PFU)数量/剂的重组杆状病毒。以96hpi处理幼虫。收集幼虫后立即冷冻在-20℃下储藏，直至用于重组蛋白定量处理。使用Bag(InterscienceTM,法国)搅拌器进行2分钟均质化，获得受杆状病毒感染的冷冻粉纹夜蛾幼虫的总可溶性非变性蛋白(TSNDPs)。提取缓冲液由PBS 1x、0.01％Triton X-100、全蛋白酶抑制剂混合物(RocheTM,德国)和25nM DTT组成。
实施例10：荧光分析
用TecanTM GENiosTM(CA,USA)荧光分析仪(激发[Ex],485/发射[Em],535)来对约20μg来自受感染细胞的含不同量重组GFP蛋白的总可溶性蛋白进行分析和定量。
实施例11：免疫印迹分析
以15％SDS-PAGE凝胶来解析来自受重组杆状病毒感染的幼虫的总可溶性蛋白部分(10μg)。用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色，或将凝胶转移到硝酸纤维膜。以1：1000的抗GFP单克隆抗体mab2515(MilliporeTM,USA)或微管蛋白抗血清(T5168；Sigma-AldrichTM)探测免疫印迹，并以1:2000稀释的抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)标记缀合物(KPLTM,UK)作为二级抗体来显示免疫复合物。使用ECL免疫印迹检测系统来检测蛋白条带，并用ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(ChemiDocTM XRS Gel Imaging System)(Bio-RadTM,USA)进行分析。
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Claims (10)

1.一种重组DNA元件，其含有包含Ac-ie-01基因的额外一个拷贝的核酸序列，所述核酸序列允许充当转录调控因子的蛋白IE-1、IE-0或其片段的表达水平高于所述蛋白在常规杆状病毒感染期间获得的水平，其中所述核酸选自：
(a)含有SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的核酸；
(b)与SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％并编码能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码含有SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码了与SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的序列一致性为至少70％且能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的氨基酸序列的核酸序列，
其中，所述重组DNA元件还含有编码可操作地连接在上述核酸序列上的重组蛋白以及驱动所述重组蛋白表达的启动子的核酸序列，所述启动子选自以下核酸：
(a)含有SEQ ID NO:10-16任一项所示的核苷酸序列；以及
(b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与SEQ ID NO:10-16中任一项所述的核苷酸序列的序列一致性为至少70％；
其中，所述重组DNA元件还包括至少一个充当增强子区域并可操作地连接至驱动所述重组蛋白表达的启动子的重组同源区域(hr)。
2.根据权利要求1所述的重组DNA元件，其特征在于，所述核酸序列通过重组杆状病毒引入昆虫。
3.根据权利要求2所述的重组DNA元件，其特征在于，所述昆虫来自鳞翅目。
4.根据权利要求1所述的重组DNA元件，其特征在于，所述重组同源区域是SEQ ID NO:27所示的序列。
5.根据权利要求1所述的重组DNA元件，其特征在于，包含了含有重组启动子、编码转录调控因子的序列、选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合的核酸序列。
6.根据权利要求1所述的重组DNA元件，其特征在于，进一步包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接选自权利要求1～5中任一项所述的核酸序列。
7.根据权利要求3所述的重组DNA元件，其特征在于，其中所述昆虫选自：Trichoplusiani、Spodoptera frugiperda、Spodoptera exigua、Ascalapha odorata、Bombyx mori、Rachiplusia ni和Stigmene acrea。
8.根据权利要求2所述的重组DNA元件，其特征在于，其中所述核酸序列通过选自AcMNPV或BmNPV的重组杆状病毒引入该昆虫。
9.用于生产重组蛋白的方法，其特征在于，包括使用引入了权利要求1‐8中任一项所述的重组DNA元件的昆虫并通过常规方法对重组蛋白进行提取和纯化。
10.根据权利要求9所述的用于生产重组蛋白的方法，其特征在于，其中所述重组蛋白选自：亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、病毒样颗粒、治疗蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝剂、受体、荷尔蒙或诊断性蛋白试剂。
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