CN104735977B - 用于在宿主细胞中表达重组蛋白的杆状病毒dna元件 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了用于改进重组蛋白表达的试剂和方法。更具体而言，向宿主细胞中引入重组DNA元件，从而提高重组蛋白的表达，提高所述蛋白的正确折叠以及提高宿主细胞的细胞活力和增殖。所述重组DNA元件可以通过例如含有所述元件的重组杆状病毒引入宿主细胞。所述重组DNA元件包括编码转录调控因子的核酸(例如IE‑0和IE‑1)、转录增强子元件(例如同源区域(hr))和启动子。

Description

用于在宿主细胞中表达重组蛋白的杆状病毒DNA元件
技术领域
本发明可以被列入生物技术领域；其涵盖了包含例如启动子、作为增强子的同源区(hr)、转录调节因子的编码序列(例如杆状病毒Ac-ie-01cDNA)或其任意组合，且能够提高重组蛋白生成质量和效率的核酸序列。此外，本发明还指向：包含上述本发明核酸序列的载体本身；以所述序列或载体所感染、转化或转染的细胞；以及，使用上述序列、载体或细胞来生成蛋白的方法。
杆状病毒表达载体体系(BEVS)是一种已建立完善的方法，用于生成用作疫苗、治疗分子或诊断试剂的重组蛋白。BEVS因其过度表达潜力及快速发展速度，而成为用于生成任何用途的重组蛋白的最诱人选择之一。工业中最常用于重组蛋白表达的杆状病毒基于苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核多角体病毒(AcMNPV)，以草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)9(Sf9)或21(Sf21)昆虫细胞为合适表达宿主(1)，并以粉纹夜蛾(Trichoplusia ni，或T.ni)昆虫幼虫为活生物工厂(2)。BEVS开发于80年代(3)，自此以来，已在杆状病毒感染的昆虫细胞中成功生成了从胞质酶到膜结合蛋白的数百种重组蛋白。
人们努力提高BEVS的生产力(4)。有各种转移载体可用于构建编码驻留融合蛋白的重组杆状病毒，这些蛋白据报告能够提高蛋白表达(包括麦芽糖结合性蛋白、谷胱甘肽S转移酶、SUMO和KDEL驻留信号)。提高表达蛋白稳定性的其他相关研究集中在杆状病毒基因组的两个基因上，其对细胞培养物中的病毒生长并非必需，称为chiA(几丁质酶)和cath(组织蛋白酶)。ChiA的删除似乎可以通过在内质网上积累蛋白和通过细胞分泌途径加工蛋白，来提高分泌性蛋白的生成。此外，防止组织蛋白酶的形成，也可以有助于提高chiA-病毒的产物的稳定性。新型昆虫细胞系，例如来自T.ni的High-FiveTM(Hi-5)或BTI-TnAo38细胞系近期被开发出来，以提高杆状病毒生产力，使得异源蛋白最终回收量得到显著提高(5、6)。
加速重组蛋白表达，从而能够在昆虫的细胞机器被杆状病毒感染严重损坏之前进行蛋白表达，将会是BEVS的一项重要改进。由常规强病毒启动子多角体蛋白(polyhedrin，即polh)或p10基因所驱动的晚期表达，在外源蛋白翻译后修饰中具有严重不利条件。杆状病毒启动子能够比常规使用的polh或p10启动子更早地启动表达，因此其特性在于可用作异源蛋白生产，但其生产力降低(7)。
改进BEVS的另一种可能是，通过减少病毒诱导的细胞死亡，在感染后晚期更好地保存细胞完整性。降低感染后晚期因BEVS导致的昆虫细胞机器严重损坏，将不仅增加可用于生产和积累重组蛋白(分泌或未分泌)的时间，还为复合蛋白的折叠或生成蛋白的所有翻译后修饰提供更多时间。
已经测定出一些杆状病毒DNA元件参与启动了病毒传播所必需的后期表达因子的基因。其中之一为AcMNPV(苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核多角体病毒)的立即早期(ie)蛋白(immediate early protein)IE-1及其剪接变体IE-0。因其内部翻译起始，翻译由Ac-ie-01基因编码的AcMNPV mRNAs会得到IE-0和IE1。两者均由于具有作为转录调节因子的能力(8)而被认为是杆状病毒基因表达的关键调节因子。AcMNPV IE-1合成于感染极早期，是67-kDa的二聚DNA结合性蛋白，在质粒转染试验中，它通过其N端酸性结构域的活性来刺激转录(9，10)。IE-1在细胞核中累积，且在晚期中被保持于此(11)。IE-1作为同源二聚体与杆状病毒同源区域(hr)序列的结合，能增强IE-1的反式激活，所述同源区域充当转录增强子以及病毒DNA复制起点。AcMNPV IE-0是72.6-kDa、含636个氨基酸的蛋白，它由orf141(exon0)所编码的38个氨基酸、ie1上游未翻译前导所编码的16个氨基酸以及IE-1蛋白的全部582个氨基酸所组成。因此，除了融合在N端的额外54个氨基酸外，最终产物与IE-1一模一样。大概是因为其共有序列，IE-0和IE-1具有相同的生物化学活性，包括结合hr增强子和转录调控。
需要新型的替代型BEVSs，允许a)比使用polh或p10启动子的商用BEVS更强的表达，和b)降低病毒导致的细胞损伤，允许在杆状病毒体系中进行长期表达。
发明内容
本发明提供了用于使用BEVS改进重组蛋白表达的方法及其产物。
以下各项为能够实现该改进表达的优选实施例：
1.含有能够高于内源水平地表达充当转录调控因子的蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的核酸序列的重组杆状病毒，其中所述核酸选自：
(a)含有如SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的核酸；
(b)与SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％，并编码能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码含有如SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码了与SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％并能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的氨基酸序列的核酸序列。
2.根据第1项所述的重组杆状病毒，进一步包括至少一个充当增强子区域、并可操作地连接在任何适用于驱动重组蛋白表达的启动子上的重组同源区域(hr)。
3.根据第2项所述的重组杆状病毒，其中所述重组同源区域(hr)是如SEQ ID NO:27(hr1)所示的序列。
4.根据第2或3项所述的重组杆状病毒，其中所述可操作地连接在所述重组同源区域(hr)上的启动子选自如下核酸：
(a)含有如SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的核酸；和
(b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％的核酸序列。
5.根据1-4中任一项所述的重组杆状病毒，包含一核酸序列，该核酸序列含有重组启动子、编码转录调控因子的序列以及选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合。
6.根据1-5中任一项所述的重组杆状病毒，进一步包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接在选自第1-5项中的核酸序列。
7.适用于制备根据1-6中任一项所述的重组杆状病毒的转移载体，包括用于高于内源水平地表达作为转录调控因子的蛋白IE-0、IE-1和/或其片段的序列，还包括适用于在杆状病毒中整合或转位的核酸序列。
8.根据第7项所述的转移载体，还包括作为增强子区域的至少1个重组同源区域(hr)，可操作地连接在适用于驱动重组蛋白表达的任何启动子上。
9.根据第8项所述的转移载体，其中所述重组同源区域(hr)是如SEQ ID NO:27(hr1)所示的序列。
10.根据第8或9项所述的转移载体，其中启动子可操作地连接在选自如下各核酸的重组同源区域(hr)：
(a)含有如SEQ ID NO:10-16任一项所示的核苷酸序列的核酸；
(b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与如SEQ ID NO:10-16任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％的核酸序列。
11.根据第7-10项中任一项所述的转移载体，包含一核酸序列，该核酸序列含有重组启动子、编码转录调控因子的序列以及选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合。
12.根据第7-11项中任一项所述的转移载体，还包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接在选自第7-11项的核酸序列上。
13.根据第7-11项中任一项所述的转移载体，不含编码重组蛋白的核酸序列。
14.根据第7-13项中任一项所述的转移载体，其特征在于所述转移载体为杆粒。
15.根据第7-14项中任一项所述的转移载体，其特征在于所述转移载体源自以下杆状病毒表达体系的任一种：(invitrogenTM)、“BacPAKTM”(ClontechTM)、“FlashBACTM”(Oxford Expression TechnologiesTM)、“BacuVanceTM”(GenScriptTM)、“Bac-N-Blue DNATM”(invitrogenTM)、“BaculoDirectTM”(invitrogenTM)、1000、2000、3000“DiamondBacTM”或“BaculoGoldTM”(BDbiosciencesTM)。
16.适用于生成根据第1-15项中任一项所述的重组杆状病毒或转移载体的克隆载体，包括用于高于内源水平地表达作为转录调控因子的蛋白IE-0、IE-1和/或其片段的序列，其进一步适用于细菌复制。
17.根据第16项所述的克隆载体，还包括至少一个重组同源区域(hr)，该至少一个重组同源区域(hr)作为增强子区域、可操作地连接至任何适于驱动重组蛋白表达的启动子。
18.根据第17项所述的克隆载体，其中所述重组同源区域(hr)是如SEQ ID NO:27(hr1)所示的序列。
19.根据第17或18项所述的克隆载体，其中所述可操作地连接在所述重组同源区域(hr)上的启动子选自如下核酸：
(a)含有如SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的核酸；和
(b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％的核酸序列。
20.根据16-19中任一项所述的克隆载体，包含一核酸序列，该核酸序列含有重组启动子、编码转录调控因子的序列以及选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合。
21.根据16-20中任一项所述的克隆载体，进一步包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接选自第16-20项中的核酸序列。
22.根据16-20中任一项所述的克隆载体，不含编码重组蛋白的核酸序列。
23.适用于生成根据第1-22项中任一项所述的重组杆状病毒、转移载体或克隆载体的核酸序列，包括用于高于内源水平地表达作为转录调控因子的蛋白IE-0、IE-1和/或其片段的序列。
24.根据第23项所述的核酸序列，还包括至少一个重组同源区域(hr)，该至少一个重组同源区域(hr)作为增强子区域、可操作地连接至任何适于驱动重组蛋白表达的启动子。
25.根据第24项所述的核酸序列，其中所述重组同源区域(hr)是如SEQ ID NO:27(hr1)所示的序列。
26.根据第24或25项所述的克隆载体，其中所述可操作地连接在所述重组同源区域(hr)上的启动子选自如下核酸：
(a)含有如SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的核酸；和
(b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％的核酸序列。
27.根据23-26中任一项所述的核酸序列，包含一核酸序列，该核酸序列含有重组启动子、编码转录调控因子的序列以及选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合。
28.根据23-27中任一项所述的核酸序列，进一步包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接在选自第23-27项中的核酸序列。
29.根据23-27中任一项所述的核酸序列，不含编码重组蛋白的核酸序列。
30.以第1-29项中任一项的重组杆状病毒、转移载体、克隆载体或核酸序列来感染、转染、转导或转化的宿主细胞。
31.根据第30项所述的感染、转染、转导或转化后的宿主细胞，其特征在于该细胞为昆虫细胞系。
32.根据第30或31项所述的感染、转染、转导或转化后的宿主细胞，其特征在于该细胞为来自鳞翅目或双翅目的昆虫。
33.根据第30-32项中任一项所述的感染、转染、转导或转化后的宿主细胞，其特征在于该细胞来自Trichoplusia ni、Spodoptera frugiperda、Ascalapha odorata、Bombyx mori、Drosophila melanogaster或Aedes aegypti。
34.根据第30-33项中任一项所述的感染、转染、转导或转化后的宿主细胞，其特征在于该细胞系选自Hi-5TM、Sf9、Sf21、BTI-Tn5B-1、Tn368、BTI-TnAo38、ATC-10和Schneider′s Drosophila Line 2。
35.含有如第1-29项中任一项所述重组杆状病毒、转移载体、克隆载体或核酸序列的培养基。
36.用于制备含有根据第30-34项中任一项所述的感染、转染、转导或转化后的宿主细胞，以及使用常规方法来提取和纯化所述重组蛋白的方法。
37.根据第36项所述的用于生产重组蛋白的方法，其中所述重组蛋白选自：亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、病毒样颗粒、治疗蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝剂、受体、荷尔蒙和诊断性蛋白试剂。
38.根据第7-15中任一项所述的转移载体在制备根据第1-6中任一项所述的重组杆状病毒中的用途。
39.根据第16-22中任一项所述的克隆载体在制备根据第1-15中任一项所述的重组杆状病毒或转移载体中的用途。
40.根据第23-29中任一项所述的核酸序列在制备根据第1-22中任一项所述的重组杆状病毒或转移载体或克隆载体中的用途。
41.含有转基因的转基因细胞系，所述转基因选自下列核酸：
(a)含有如SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的核酸；
(b)与SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％，并编码能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码含有如SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码了与SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％并能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的氨基酸序列的核酸序列。
42.根据第41项所述的转基因细胞系，其为昆虫源、鸟类源或哺乳动物源细胞系。
43.用于生产重组蛋白的方法，包括根据第41或42项所述转基因细胞的生长，和以常规方法对重组蛋白进行提取和纯化。
44.含有在重组杆状病毒中作为启动子的核酸序列的核酸序列，其中所述核酸序列选自：
(a)含有如SEQ ID NO:12、14或15所示的核苷酸序列的核酸；和
(b)与SEQ ID NO:12、14或15所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％的核酸序列。
附图说明
图1：本发明的杆状病毒重组DNA元件的示意图，其中包括4种主要元件：编码转录调控因子的序列(A，例如IE0和IE1)，其表达受到启动子(B，例如polh或pB29)的驱动；增强子同源区域(hr)序列(C，例如hr1)，位于驱动编码重组蛋白的外源基因表达的启动子(D；e.g.p10、polh、pB29p10或p6.9p10)的上游。该示意图展示了本发明的重组DNA元件之间相互作用并获得前所未有的重组蛋白过度表达的理论机制。
图2：通过克隆体系(invitrogenTM)生成重组杆状病毒的不同策略。
图3：生成与其他用于生成重组杆状病毒的商用技术相兼容的克隆、供体和转移载体的总体方案。
图4：A)荧光试验测定含有hr1p10、hr1pB29p10或hr1p6.9p10和Ac-ie-01cDNA的本发明杆状病毒表达组件，在启动子pB29或polh控制下，于感染后不同时间点在受感染Sf21细胞中所表达的GFP蛋白的增量。所有GFP表达水平均与含polh启动子的常规杆状病毒载体进行比较。图中所示为每种杆状病毒的3次独立表达实验的平均值，各情况下标准偏差均低于5％。图中还显示了代表性的荧光显微图，其中所示为以野生型杆状病毒(对照)、在polh启动子下表达GFP的常规杆状病毒，或通过本发明的表达组件polhAc-ie-01/hr1pB29p10GFP表达GFP的杆状病毒感染的Sf21细胞在感染后不同时间点上的代表性荧光显微图。图4的A部分和图4的B部分中的细胞感染复数(MOI)为5，图4的C部分中的细胞MOI为0.1。
图5：A)在polh启动子控制下表达GFP的常规杆状病毒载体(浅灰色)，或以由polhAc-ie-01/hr1pB29p10GFP元件组成的本发明表达组件改造的杆状病毒载体(深灰色)，在感染后不同时间点，在单层生长的Sf21昆虫细胞中的重组GFP蛋白量的对比，通过微流体蛋白分析(ExperionTM；BioRadTM,USA)来测定。两种病毒感染细胞的MOI均为5。B)在polh启动子控制下表达GFP的常规杆状病毒载体(浅灰色)，或以由polhAc-ie-01/hr1p6.p10GFP元件组成的本发明表达组件改造的杆状病毒载体(深灰色)，在感染后不同时间点，在悬浮生长的Sf21昆虫细胞中的重组GFP蛋白量的对比，通过微流体蛋白分析(ExperionTM；BioRadTM,USA)来测定。两种病毒感染细胞的MOI均为0.1。虚线表示含有本发明表达组件的杆状病毒所表达的重组GFP的增量百分比，与在polh启动子下表达GFP的常规杆状病毒所得数值相比；C)SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色解析图5的A部分所述实验中的感染后细胞提取物。D)SDS-PAGE凝胶考马斯亮蓝染色解析图5的B部分所述实验中的感染后细胞提取物。
图6：悬浮培养Sf9昆虫细胞，并以在polh启动子下过度表达Ac-ie-01cDNA的常规杆状病毒，或在本发明的杆状病毒表达组件polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP，的杆状病毒，表达报告基因GFP，以评估所述细胞的(A)细胞密度和(B)活力。作为对照，使用了在polh启动子下表达GFP的常规杆状病毒。悬浮细胞感染复数MOI为0.1。(A)感染后不同时间点(0、24和48小时)对细胞计数，以计算细胞密度。Ac-ie-01cDNA过度表达产生细胞增殖的精确时刻的更详细分析见插入图，图中为以polhGFP或polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP感染的细胞。(B)通过台盼蓝染色法(悬浮细胞和含0.4％染色剂的PBS缓冲液1:1稀释)评估细胞活力。该染色允许区分活细胞和死细胞。细胞活力计算为感染后不同时间点上(从0至120小时)，活细胞占细胞总数的百分比。用(C)在polh启动子下过度表达报告基因GFP的对照常规杆状病毒，或(D)在polh启动子下过度表达Ac-ie-01cDNA的杆状病毒，以MOI＝5感染的单层Hi-5TM昆虫细胞的显微图。显微图是以倒置显微镜LeicaTM DMILTM在感染后96小时获得的。
图7：A)用(1)在polh启动子控制下表达GFP的常规杆状病毒载体，或(2)以含polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP元件的本发明表达组件改造的杆状病毒载体)感染Sf9昆虫细胞，过度表达由Ac-ie-01cDNA编码的转录调控因子。感染后不同时间点上(从0至120小时)对细胞进行采样，并用抗GFP或抗细胞肌动蛋白的抗血清，以SDS-PAGE和免疫印迹法分析细胞提取物。B)取图7的A部分中所分析的Sf9昆虫细胞中所表达GFP蛋白，通过荧光法测定其功能性。感染后不同小时上，获取常规重组杆状病毒(灰色柱)与含本发明杆状病毒组件的重组杆状病毒(黑色柱)的GFP蛋白的荧光数值，并进行比较。
图8：本发明的杆状病毒表达组件中所含的优选元件的示意图示，包括转录调控因子的编码序列、对编码重组蛋白的外源基因的启动子引发的转录进行增强的同源区域(hr)。
图9：分离自T.ni的pB2启动子的序列分析和转录调控元件pB2序列的确定。A)分离自T.ni的pB2启动子的BJHSP2(Genbank登记号：U41640)区域核苷酸序列。前述转录起点如三角形所示，pB2序列中的下划线为TATA框，可能的顺式作用元件则包含在框中。阴影表示的核苷酸残基，表示该序列并入了pB29启动子。图中的透明框表示预测的Br-C和EcR假定结合位点。B)pB2DNA片段及其衍生型启动子pB29的示意图。使用GFP蛋白作为报告基因，用荧光分析法来分析它们的启动子活性。所有实验中，均是在感染后72小时量化GFP表达，表示为3次独立实验的算术平均值及其标准偏差。
图10：使用不同启动子或启动子组合介导的GFP表达。A)以在不同单个或嵌合启动子控制下表达GFP的不同重组杆状病毒，感染Sf21细胞后24小时的荧光分析。B)以与图10的A部分中相同的重组杆状病毒感染的Sf21细胞中的GFP表达的时间进程研究，以荧光试验测量。所有实验均在MOI为5下进行，附图展示了3次独立实验的算术平均值以及相应的标准偏差。
具体实施方式
本发明通过向杆状病毒引入重组DNA元件的方式，改进BEVS中的重组蛋白的表达。
本发明的重组DNA元件是能够使得杆状病毒转录调控因子进行高于内源水平的表达的序列，以及，可选地，增强子同源区域(hr)和可操作地连接在上述元件上的启动子。
此外，重组DNA元件可以构成表达组件的一部分。
“表达组件”指的是包含重组DNA元件的核酸序列，其控制基因表达(例如，启动子)和/或是基因表达所必需的(例如，基因本身)。该表达组件可以用重组载体或杆状病毒载体来引入。
重组DNA组件可以被包含在单一核酸序列、克隆载体、转移载体、重组杆状病毒或细胞中。但是，他们也可以存在于不同的核酸序列、克隆载体、转移载体、重组杆状病毒中并被引入同一细胞。
本发明令人吃惊地展示了，引入序列能引发杆状病毒转录调控因子进行高于内源水平的表达，以及，可选地，增强子同源区域(hr)序列、启动子或启动子组合的引入，能够在感染后早期(感染后6至8小时)至晚期(感染后48至96-120小时)令重组蛋白的生成提高到前所未有的水平。
此外，引入所述重组DNA元件，还提高了受杆状病毒感染细胞的繁殖(尤其是在感染后早期)、感染后晚期的活力以及所述受杆状病毒感染细胞感染的分子细胞机器完整性和细胞形态。杆状病毒感染期间的细胞功能完整性改善，还有助于重组蛋白进行正确的翻译后加工。
与常规polh或p10启动子相比，引入所述重组DNA元件还提高了宿主细胞中的重组蛋白生产。
因此，本发明的一个方面涉及一种含有允许进行高于内源水平的转录调控因子表达的核酸序列的重组杆状病毒。在一个优选实施例中，所述转录调控因子为IE-1、IE-0和/或其片段。
“杆状病毒(Baculovirus)”指的是一个感染无脊椎动物(主要感染昆虫和节肢动物)的病毒科。“重组杆状病毒”进一步通过例如同源重组或转位引入了重组DNA。重组杆状病毒优选为源自AcMNPV。
“重组DNA”指的是一种人造DNA，其通过组合或插入一条或多条DNA链，从而将在正常情况下不共同存在的DNA组合在一起。
“重组DNA元件”指的是重组DNA中的功能性元件，例如启动子、增强子或基因。如上所述，本发明的重组DNA元件是能够使得杆状病毒转录调控因子高于内源水平地进行表达的序列、增强子同源区域(hr)和可操作地连接在上述元件上的启动子。
“转录调控因子”指的是能够通过例如与增强子或抑制子区域结合和/或招募更多参与转录的蛋白来调节特定基因转录的调节蛋白。
IE-1及其剪接变体IE-0是在杆状病毒感染期间内源表达的转录调控因子。在本发明中，IE-1、IE-0和/或其片段重组后进行表达，以将所述蛋白的总水平提高到高于内源水平。这可以通过例如引入更多的内源基因拷贝或控制所述内源基因的启动子表达来达成。更多的内源基因拷贝可以在适当启动子(例如polh或pB29)的控制下作为转基因的形式引入。
IE-1、IE-0和/或其片段的表达水平在mRNA和蛋白质水平上均可以根据本领域技术人员所知的常规方法进行测定，例如定量PCR和免疫印迹分析法。
在本发明中，IE-1、IE-0和/或其片段由SEQ ID NO:1(亦称为Ac-ie-01)至SEQ ID NO:5所示的核酸编码。SEQ ID NO:1是编码IE-1和IE-0的Ac-ie-01cDNA，SEQ ID NO:2是编码IE-1的编码序列(CDS)，SEQ ID NO:3是IE-0的CDS。SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5分别是IE-1和IE-0用于保持催化转录调控因子活性的N端区域的CDSs。SEQ ID NO:2-5所编码的蛋白分别如SEQ ID NO:6-9所示。
本发明进一步公开了SEQ ID NO:1-9的变体，所述变体具有转录调控因子功能，或编码具有转录调控因子功能的氨基酸。所述变体是与原核酸或氨基酸存在一个或多个位点差异的核苷酸或氨基酸序列，其中所述差异可以是核苷酸或氨基酸残基的添加、删除和/或取代。
本发明的核酸和氨基酸序列与其他核酸和氨基酸序列可以分别通过用EMBOSS Needle软件在默认参数下测定序列一致性或相似性来加以区分(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)。用于产生所述变体的方法包括随机诱变或定向诱变、定点饱和诱变、基于PCR的片段拼接、DNA改组、体外或体内同源重组以及基因合成法。
SEQ ID NO:1-5序列的变体序列与SEQ ID NO:1-5序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％。
SEQ ID NO:6-9序列的变体序列与SEQ ID NO:6-9序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％。
在一个优选实施例中，除允许蛋白IE-1、IE-0和/或其片段进行高于内源水平的表达的核酸序列外，本发明的重组杆状病毒还含有能够通过可操作地连接其相应启动子来增强重组蛋白表达的重组同源区域(hr)。
重组同源区域(hr)由长约70bp且靠近中间处有30-bp不完整回文的重复单位组成。AcMNPV基因组中，同源区域在8个位置重复，每侧含2-8个重复序列。同源区域包括转录增强子和杆状病毒DNA复制起点。
“增强子区域”指的是控制序列，其与转录调控因子的结合能提高相关基因的转录水平。
“重组蛋白”指的是源自重组DNA的蛋白。所述蛋白可用于造福人类和动物，且可应用于工业、商业或医疗应用。
“可操作地连接”指的是两个核酸序列相互连接，且其中一个核酸序列可以在例如转录调控方面影响另一个核酸序列。
“启动子”指的是可与RNA聚合酶结合从而引发转录的DNA序列。所述序列还可以包含与各种转录调控蛋白(例如转录因子)的结合位点。所述启动子序列可以由DNA序列中位置接近的不同启动子片段(不同或相同片段)组成，且可以由连接子或间隔子分隔开。所述启动子成为嵌合启动子。
位于所述启动子/启动子组合上游的所述增强子同源区域序列hr优选为hr1(SEQ ID NO:27)。驱动重组蛋白表达的所述启动子优选为：选自SEQ ID NO:10-16，或能够充当启动子且与SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％的序列。
在一个优选实施例中，所述核酸序列包括重组启动子、编码转录调控因子的序列、选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合。
如上所述，本发明中的重组启动子、编码转录调控因子的序列和增强子区域无需是单个分子的一部分，相反，这些序列可以是不同分子的部分，只要它们可操作地相连，即包含在相同细胞内，即可。
本发明的重组杆状病毒优选为包括编码重组蛋白的核酸序列。该核酸序列可操作地连接在能够使得IE-1、IE-0和/或其片段进行高于内源水平的表达的核酸序列上，且可选地连接同源区域(hr)。
在一个实施例中，本发明公开了以本发明的重组杆状病毒、转移载体、克隆载体或核酸序列来感染、转染、转导或转化的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞保存在细胞培养物中。所述宿主细胞优选为昆虫细胞系，更优选为选自鳞翅目(Lepidoptera)或双翅目(Diptera)的昆虫源的细胞系，更优选为选自Trichoplusia ni、Spodoptera frugiperda、Ascalapha odorata、Bombyx mori、Drosophila melanogaster和Aedes aegypti的宿主细胞，最优选为选自Hi-5TM、Sf9、Sf21、BTI-Tn5B-1、Tn368、BTI-TnAo38、ATC-10和Schneider′sDrosophila Line 2的昆虫细胞系。所述宿主细胞可以单层培养或悬浮培养。
在本发明的另一方面中，公开了使用本发明的宿主细胞生产重组蛋白的方法。表达所述重组蛋白后，采用常规方法来对该重组蛋白进行提取和纯化。
在一个优选的蛋白生产实施例中，所述宿主细胞悬浮培养(生物反应器)，其密度在2x106至8x106细胞/ml之间，取决于所用的细胞系和发酵工艺。此外，感染细胞的MOI为0.1-1。
以本发明的方法来生产的重组蛋白，优选为选自以下各项蛋白：亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、病毒样颗粒、治疗蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝剂、受体、荷尔蒙和诊断性蛋白试剂。
本发明的一个方面涉及在培养基中使用本发明的重组杆状病毒、转移载体、克隆载体或核酸序列。在一个优选实施例中，所述培养基包含本发明的杆状病毒。
除了适用于以杆状病毒进行整合或转位的序列外，本发明还公开了可用于产生本发明的重组杆状病毒且包含所述使得蛋白IE-1、IE-0和/或其片段高于内源水平地表达的序列的转移载体。
转移载体一般能够向杆状病毒中插入基因信息。
转移载体优选为，除了(i)高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列外，还包括相连的(ii)重组同源区域(hr)和(iii)用于驱动重组蛋白表达的适当启动子。用于重组杆状病毒的重组DNA元件优选组合如上所述。
在一个优选实施例中，所述转移载体包含编码所述重组蛋白的核酸序列，而在另一个优选实施例中，所述转移载体不含所述序列。
在一个优选实施例中，所述转移载体为杆粒。
“杆粒(bacmid)”指的是一种质粒结构，其包含在转染入细胞后足以产生杆状病毒的DNA序列。
在又一个优选实施例中，所述转移载体源于以下市售杆状病毒表达体系中的任一种：(invitrogenTM)、“BacPAKTM”(ClontechTM)、“FlashBACTM”(OxfordExpression TechnologiesTM)、“BacuVanceTM”(GenScriptTM)、“Bac-N-Blue DNATM”(invitrogenTM)、“BaculoDirectTM”(invitrogenTM)、1000、2000、3000“DiamondBacTM”或“BaculoGoldTM”(BD biosciencesTM)。
本发明公开了一种可用于产生本发明中的重组杆状病毒和/或转移载体，包含所述能够高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列，且适用于细菌复制的克隆载体。
“克隆载体”指的是任何适用于克隆的载体，一般包括限制性位点、细菌繁殖的复制起点以及选择标记。
该克隆载体优选为：除了(i)高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列外，还包括相连的(ii)重组同源区域(hr)和(iii)用于驱动重组蛋白表达的适当启动子。用于重组杆状病毒的重组DNA元件优选组合如上所述。
在一个优选的方面中，所述克隆载体包括编码所述重组蛋白的核酸序列(亦称为“供体载体”)，而在另一个优选实施例中，所述克隆载体不含所述序列。
本发明公开了一种可用于产生本发明中的重组杆状病毒和/或克隆载体且包含所述能够高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列的核酸序列。
该核酸序列优选为，除了(i)高于内源水平地表达蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的序列外，还包括相连的(ii)重组同源区域(hr)和(iii)用于驱动重组蛋白表达的适当启动子。用于重组杆状病毒的重组DNA元件优选组合如上所述。
在一个优选实施例中，所述核酸序列包含编码所述重组蛋白的核酸序列，而在另一个优选实施例中，所述核酸序列不含所述序列。
令人吃惊地，Ac-ie-01cDNA在杆状病毒体系中的瞬态表达为细胞赋予了独特的抗病毒特性和细胞繁殖特性。这暗示，所述基因编码的转录调控因子的过度表达，激活了其他病毒或细胞基因，这些基因可能是所述生产力提高和对不同细胞应激抗性的相关生物科技应用的成因。该研究的可能应用之一，是用于制备高生产力的昆虫、鸟类或哺乳动物转基因细胞系，用于生产重组蛋白或繁殖潜在应用为制备基于弱化或灭活病毒的常规疫苗的病毒。
因此，本发明的一个方面涉及携带作为转基因的SEQ ID NO:1-5或其变体或SEQ ID NO:6-9或其变体的转基因细胞系，如上所述。所述转基因细胞系优选为哺乳动物、鸟类或昆虫源。在又一个实施例中，本发明的转基因细胞系可用于制备重组蛋白，并以常规方法提取和纯化。
“转基因细胞系”指的是含有转到该细胞中的基因的细胞系。
基于这一令人吃惊的发现，即重组杆状启动子pB29(SEQ ID NO:14)和嵌合重组杆状病毒启动子pB29p10(SEQ ID NO:12)和pB2p10(SEQ ID NO:15)与常规启动子例如pB2相比能够提高表达，本发明的另一方面涉及包含SEQ ID NO:12、14或15的所述序列或其与SEQ IDNO:12、14或15序列变体的序列一致性为至少70％、优选为至少75％、更优选为至少80％、更优选为至少85％、更优选为至少90％、最优选为至少95％的核酸序列。
序列说明
根据布达佩斯条约的微生物保藏
Plasmids were deposited in the Spanish Type Culture Collection(CECT)(www.cect.org)；University of Valencia,Parc Científic Universitat de València；Catedrático Agustín Escardino,9；46980Paterna(Valencia),Spain,with the accession number CECT 8031,on the date October 4,2011.
质粒保藏于西班牙模式菌种保藏中心(CECT)(www.cect.org)(地址：University of Valencia(Parc Científic Universitat de València)；Catedrático Agustín Escardino,9；46980Paterna(Valencia),Spain)，检索号CECT8031，保藏日期2011年10月4日。
实施例
实施例1：杆状病毒载体表达体系(BEVS)中，杆状病毒转录调控因子的过度表达，使得与启动子功能性相连的同源区域(hr)的增强子功能加强，提高重组蛋白表达。
由AcMNPV中的Ac-ie-01cDNA所编码的立即早期病毒蛋白，即IE-1和IE-0，是强力的杆状病毒转录调控因子。所述蛋白作为同源二聚体与充当转录增强子的杆状病毒同源区域(hr)序列结合，能够增强这些蛋白对反式激活的调节。AcMNPV IE-1/IE-0是67-72kDa的二聚体DNA结合性蛋白，在质粒转染实验中，能够通过其N端酸性区域的活性来刺激转录(7,8)。IE-1和IE-0合成于感染极早期，在细胞核中累积，且被保持于此直至晚期后。使用双质粒pFastBacTM(invitrogenTM)，在polh启动子的控制下克隆Ac-ie-01cDNA。在同一质粒的不同位点上，GFP编码基因被克隆于早前合成的hr1pB29p10嵌合启动子的下游，所述嵌合启动子包含融合的同源区域hr1和启动子pB29和p10.。启动子pB29是源自驱动鳞翅目昆虫T.ni中的碱性保幼激素-抑制蛋白2(BJHSP-2)启动子pB2的DNA片段。pB29片段含有由源自pB2启动子的436个核苷酸组成的序列，当并入杆状病毒表达载体时，该片段表现出高于全长昆虫源启动子的表达水平。所得的本发明杆状病毒表达组件及该重组DNA元件的推定功能的示意图如图1所示。所得质粒用于以体系(invitrogenTM)制备重组杆状病毒。同时，以相同系统制备在polh启动子控制下表达GFP蛋白的常规杆状病毒。
在单层培养的Sf21细胞中，以荧光分析法测定在感染后不同时间点上不同杆状病毒调控下的GFP蛋白表达。以含有转录调控因子和增强子序列的所述杆状病毒表达组件来表达的GFP，当感染MOI为5时，该表达水平比在polh启动子控制下表达GFP蛋白的常规杆状病毒高约2倍(图4)，当感染MOI为0.1时则高约4倍(数据未显示)。在Hi-5TM细胞中也观察到了所述蛋白积累差异(数据未显示)，这暗示着本发明的杆状病毒表达组件可用于在研究和工业中所用的不同昆虫细胞系中制备重组蛋白。
重要的是，在昆虫细胞中，根据荧光显微镜观察，由本发明的杆状病毒表达组件所调控的GFP表达早于使用常规启动子polh驱动的GFP表达被观测到，此外，感染细胞的荧光强度显著更高(图4的B部分)。用含有本发明表达组件的重组杆状病毒以MOI为5进行感染后仅16小时，即观测到荧光细胞，且所述GFP表达随着感染时间增加(图4的B部分)。在低MOI 0.1时也观察到新型和对照重组杆状病毒之间的显著区别(图4的C部分)。
为了分析用于过度表达转录调控因子的启动子的影响，还在上述以pB29启动子代替了polh启动子进行控制的表达组件中克隆了Ac-ie-01cDNA。与用于驱动Ac-ie-01cDNA表达的启动子无关地，GFP积累高于使用在polh启动子控制下表达报告蛋白且表达组件中不含Ac-ie-01和hr1的常规杆状病毒时所观察到的积累(图4的A部分)。类似地，在含有连接pB29p10嵌合启动子的hr1增强子的表达组件中缺少Ac-ie-01cDNA，使得GFP表达水平低于含有Ac-ie-01cDNA的表达组件(数据未显示)。
实施例2：Ac-ie-01cDNA编码的转录调控因子增强与hr1顺式连接的其他杆状病毒启动子
为了分析由Ac-ie-01编码的转录调控因子和增强子序列的组合能否增强由其他嵌合或非嵌合(即p6.9p10或p10)且与转录增强子同源区域1(hr1)顺式连接的杆状病毒启动子所调控的表达，我们制备了一组新的杆状病毒表达组件及其相应的AcMNPV重组杆状病毒。所述表达组件含有在polh启动子控制下克隆的Ac-ie-01cDNA以及位于hr1p10或hr1p6.9p10启动子下游的GFP编码基因。受不同杆状病毒感染的昆虫细胞的提取物以荧光分析测定表达水平。作为对照，使用了在polh启动子控制下表达GFP蛋白的常规重组杆状病毒。观察结果显示，由Ac-ie-01cDNA编码的转录调控因子与同原序列hr1的组合也能够令在其他杆状病毒启动子或启动子组合(嵌合)控制下表达的报告蛋白GFP提高的前所未有的表达水平(图4的A部分)。在使用由p6.9和p10组成的嵌合启动子的表达组件中，重组蛋白生成量在受检测的不同重组杆状病毒中是最高的(感染后72小时高于对照约2.5倍)。
使用微流体蛋白分析法(ExperionTM；BioRadTM,USA)，进一步量化单层Sf21昆虫细胞和悬浮Sf9昆虫细胞中由常规杆状病毒或包含了含polhAc-ie-01/hr1pB29p10GFP元件的本发明表达组件的杆状病毒所调控的GFP产量。单层昆虫细胞的高感染MOI为5；悬浮昆虫细胞的低感染MOI为0.1。图5的A部分展示了感染后不同时间点上(24至72小时)，重组GFP产量相对于全溶解细胞蛋白的百分比以及相对于常规杆状病毒的产量相对增量。在最晚的分析时间点上，含有本发明表达组件的杆状病毒达到的重组GFP水平超过了40％全细胞蛋白。以SDS-PAGE凝胶解析受感染细胞的细胞提取物，以考马斯亮蓝染色，接受检验的杆状病毒之间的GFP条带强度显著差异明显可见(图5的C部分)。当昆虫细胞悬浮培养并以各杆状病毒感染时，重组蛋白产量的差异甚至高于单层培养并以高MOI 5感染的昆虫细胞的检测结果。图5的B部分展示了感染后24至120小时的所述GPF产量差异。有趣的是，当使用了含有本发明表达组件的杆状病毒时，重组蛋白生产力随时间增加，在感染后120小时达到最大水平。与之相比，以常规杆状病毒生产的重组蛋白在感染后72小时达到最大水平，而在感染后晚期下降(图5的B部分)。在感染后极晚期时，本发明杆状病毒表达组件的处理中观察到超过20倍的产量增量。Hi-5TM细胞中也观察到类似结果(数据未显示)，表明本发明的表达组件可用于在研究和工业中所用的不同昆虫细胞系中生产重组蛋白。悬浮培养细胞中，以SDS-PAGE凝胶解析受感染细胞的细胞提取物，以考马斯亮蓝染色，接受检验的杆状病毒之间的GFP条带强度显著差异亦明显可见(图5的D部分)。
实施例3：本发明的杆状病毒表达组件通过Ac-ie-01cDNA编码的转录调控因子诱导细胞增殖和细胞活力提高
我们通过显微镜观察到，含有本发明杆状病毒表达组件的重组杆状病毒，具有令病毒导致的细胞病变效应降低和零培养物中的细胞密度提高的有趣性质。为了量化所述现象，并测定形成所述有趣性质的DNA元件成因，我们制备了在polh启动子控制下表达由Ac-ie-01cDNA编码的转录调控因子的重组杆状病毒。使用该杆状病毒，以及实施例2中所用的含有本发明表达组件(polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP)的元件的杆状病毒，以及表达GFP蛋白的常规杆状病毒，来以低MOI 0.1感染Sf9细胞。研究了感染后24至120小时内的细胞数量和细胞活力的提高。感染后24小时内，受过量表达上述转录调控因子的任一杆状病毒感染的昆虫细胞，表现出的细胞数目增加比以对照重组杆状病毒感染的培养物高10％(图6的A部分)。用流式细胞仪对所述因素诱导所观察到的细胞增殖差异所需的时间进行更详细的分析，发现感染后3小时，处于S期的昆虫细胞增加，以及感染后6小时，处于G1期的昆虫细胞增加。这些数据暗示，受过度表达Ac-ie-01cDNA编码蛋白的杆状病毒感染的培养物中，有丝分裂的极早增加(数据未显示)。
使用FACSCaliburTM(BD BiosciencesTM)流式细胞仪进行荧光测量。以70％乙醇固定细胞，重悬浮在染色溶液中并培养(50μg/ml碘化丙啶PBS溶液,5ug/ml RNAse)。对数据进行门控以消除与细胞尺寸显著不同的颗粒，并将细胞数目对来自碘化丙啶的红色荧光作图来进行分析。每次分析计数50000细胞。以Modfit软件对每个细胞周期阶段(G1、S和G2)的细胞总数目的数据进行分析。
还以台盼蓝染色对受感染的细胞培养物进行分析，以确定感染后不同时间点的细胞活力。有趣的是，在感染后极晚期(96至120小时)，受过度表达转录调控因子的病毒所感染的昆虫细胞，展示出细胞活力和完整性的增加(50-60％的增加)(图6的B部分)。这暗示本发明的转录调控因子的过度表达，保护了细胞不受杆状病毒导致的细胞病变效应的影响，允许长期表达。感染后的细胞增殖和细胞活力提高都对BEVS的重组蛋白生产力具有重要影响。当转录调控因子的过量表达是在pB29或polh启动子驱动下时，观察到类似结果(数据未显示)。受感染的悬浮Sf9昆虫细胞中所观察到的结果，也在单层培养的Sf21细胞(数据未显示)以及单层培养的Hi-5TM细胞(图6的C部分和6的D部分)中得到了验证。图中展示了过量表达的转录调控因子如何在感染后晚期(96小时)提高细胞完整性。
实施例4：Ac-ie-01cDNA编码的转录调控因子在杆状病毒表达体系中的过度表达促进重组蛋白翻译后加工
杆状病毒感染期间的细胞完整性，对保证该体系中表达的外源蛋白的正确折叠或任意翻译后加工而言，非常重要。常用于研究和生产的杆状病毒强启动子，例如polh和p10，仅在感染后晚期表达外源基因，而此时受感染细胞已经表现出严重的细胞病变效应，且细胞活力降低。如上所述，本发明的杆状病毒表达组件中所用的转录调控因子的过度表达，通过尚属未知的原理保护细胞不受杆状病毒感染的病原作用影响，允许保持完全活力的细胞具有用于重组蛋白生产的较宽时间窗口。我们对本发明的表达组件中所含元件与重组蛋白翻译后修饰的相关性进行了研究。为此，使用polhGFP启动子控制下表达报告蛋白GFP的常规杆状病毒、含本发明杆状病毒组件且亦表达GFP蛋白的杆状病毒(polhAc-ie-01/hr1p6.9p10GFP)来感染Sf9昆虫细胞悬浮液，其MOI为0.1。在感染后的不同时间点上，用抗GFP单克隆抗体(mab2515；MilliporeTM)进行免疫印迹法，分析受感染的细胞，如图7所示。有趣的是，常规杆状病毒表达的GFP蛋白在感染后48小时和72小时表现出数条反应性条带(暗示该蛋白的不适当表达和/或折叠)，且在其后时期表现出分子量降低的条带(低于预期值，暗示着降解)(图7的A部分)。相反地，当使用本发明的杆状病毒表达组件来调控GFP蛋白表达时，感染后所有的检验时间中都仅观察到一条GFP条带，且该GFP条带显示出该蛋白的预期分子量(图7的A部分)。该载体的GFP表达在感染后极后期(120小时)并未出现显著降低，证实了本发明杆状病毒表达组件为杆状病毒载体赋予了持久表达的有趣优势。
同时，在感染后的不同时间点，使用特异抗血清对细胞肌动蛋白进行免疫印迹分析，以测量细胞机器的完整性(图7的A部分)。常规杆状病毒感染在感染后72小时严重损坏了细胞完整性，因为在该时间点后检测到的肌动蛋白条带急剧减少(因细胞完整性的完全丧失而降解)。而以本发明表达组件所改造的重组杆状病毒所感染的细胞中，细胞肌动蛋白并未受到同样影响，这符合本发明的杆状病毒表达组件中所含重组DNA元件所带来的细胞保护。
不同杆状病毒表达的重组GFP的荧光活性反映了其正确构型。如图7的B部分所示，本发明杆状病毒表达组件所表达的GFP在感染时期中保持了功能增长趋势。相反，常规杆状病毒表达的GFP的荧光在感染后72小时达到峰值，随后则下降(图7的B部分)，同时肌动蛋白降解(图7的A部分)并观察到细胞活性降低(图6的B部分)。
实施例5：细胞培养物和病毒
在27℃下，在6孔组织培养板中以含有10％热灭活牛胎血清(Pan BiotechTM,Germany)的TNM-FH昆虫培养基(Pan BiotechTM,Germany)培养Spodoptera frugiperda Sf21或Sf9细胞系(1x106细胞/孔)。使用杆状病毒表达体系(invitrogenTM,USA)获得AcMNPV重组杆状病毒。使用pFastBacTM-DUAL质粒(invitrogenTM)生成含有本发明的重组DNA元件的不同转移载体。pFastBacTM-DUAL中所包含的启动子和调控因子是合成(GenScriptTM,USA)所得，其中以足量的侧翼限制序列来促进克隆。使用了这些转移载体来用(invitrogenTM,USA)转染Sf21细胞。从感染Sf21所得的重组杆状病毒随后在细胞中传代两次，并用空斑测定方法来滴定。所得的本发明杆状病毒表达组件的基因结构如图8所示，图中展示了驱动Ac-ie-01cDNA或外源基因(例如，GFP)表达的启动子的潜在不同组合。使用了不同表达组件来生成如图4-7所示的实施例中的重组杆状病毒。
实施例6：生成克隆载体
该克隆载体是含有本发明杆状病毒表达组件的小段DNA，可以向其中插入外源DNA片段：用限制酶处理载体和外源DNA来制造相同突出末端，然后将片段相连。该克隆载体的必要特征必须包括：合成多克隆位点(MCS)，以促进外源基因以选定方向插入；选择性标记，例如抗生素耐药性，以允许对阳性转化细胞进行选择；以及，功能性复制起点(ORI)，用于细菌繁殖。
实施例7：生成含有本发明杆状病毒表达组件的供体载体
供体载体由含有杆状病毒表达组件并以适当限制酶克隆插入了外源基因的克隆载体(例如pUC57质粒)组成。本发明杆状病毒表达组件是通过连接以下DNA序列来合成的：(i)杆状病毒转录调控因子编码序列Ac-ie-01，位于启动子序列(例如polh或pB29启动子)下游和HSV TK多腺苷酸化信号上游；(ii)增强子序列(例如同源区域hr1)，位于(iii)启动子序列(例如pB29p10、p10、p6.9p10或polh)的上游；随后是用于克隆所需基因的多克隆位点(MCS)和位于MCS下游的SV40多腺苷酸化信号(图1)。杆状病毒表达组件两侧为特异性限制位点(例如，5’端为BglII和BstZ17l，3’端为BglII和SgfI)，以促进亚克隆进入商用杆状病毒发生体系(基于转位，例如体系(invitrogenTM)，或基于同源重组，例如“flashBACTM”(Oxford Expression TechnologiesTM)、“BaculogoldTM”(BD BiosciencesTM)、“BacPAK6TM”(ClontechTM)、“Bac-N-Blue DNATM”(invitrogenTM)))的转移载体中(图2和图3)。
使用NcoI和SpeI限制位点将绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因克隆入克隆载体的MCS，生成供体质粒载体(图2)。
实施例8：生成含本发明杆状病毒表达组件的转移载体
通过以BstZ17l对供体载体的5’-侧翼位点进行酶切，及以XbaI进行酶切，并将其克隆入已用相同酶进行酶切的转移载体pFastBacTM1，从而生成所述转移载体。在此情况下，作为亚克隆的结果，杆状病毒表达组件的SV40多腺苷酸化信号被转移载体的SV40多腺苷酸化信号所替换。除此之外，表达组件的所有元件均包含在该pFastBac转移载体中，取代了原本商用转移载体的polh启动子和MCS(图2)。
实施例9：使用体系生成含有本发明杆状病毒表达组件的杆状病毒表达载体
使用修饰后的转移载体pFastBacTM1和该个体杆状病毒表达组件，通过杆状病毒表达体系来生成重组杆状病毒。更具体而言，使用修饰后的转移载体来转化含有杆状病毒穿梭载体(杆粒)和辅助质粒的E.coli宿主菌DH10BacTM，并允许该表达组件转位后生成重组杆粒。然后，使用以含有本发明杆状病毒表达组件和GFP编码基因的重组杆粒的DNA来转染昆虫细胞，例如，Sf21细胞。转染后72小时，收获细胞并获得第一代重组杆状病毒(图2)。该重组杆状病毒随后可以用常规试验方法进一步扩增和/或滴定。可以使用类似步骤来以商用BEVSs提供的其他转移载体生成重组杆状病毒(图3)。
实施例10：制备蛋白样品
在每个时间点上收获并离心受感染细胞(1x106)。除去上清液，并将细胞团重悬浮在PBS中，经过3个冷冻(-196℃)和解冻(37℃)循环。离心除去细胞碎片。
实施例11：蛋白表达的时间进程分析
使用在调控、增强和启动元件的不同组合控制下表达GFP的不同重组杆状病毒，以MOI 5或0.1感染Sf9、Sf21或Hi-5TM细胞。在各时间点(感染后24、48、72、96和120小时)收获细胞培养物，并用荧光显微镜、荧光分析、SDS-PAGE及后续的考马斯亮蓝染色或免疫印迹法以及用微流体分离和定量(ExperionTM自动化电泳系统；Bio-RadTM,USA)来分析GFP表达。
为了量化重组GFP，按照厂商说明，将样品载入Pro260芯片(Bio-RadTM)并使用ExperionTM系统(Bio-RadTM)进行毛细管电泳分析。通过控制外加电压和电功率，使样品电泳通过微通道。微流体芯片可以无需用户介入地进行数个连续步骤，包括分离、染色、脱色、检测和基本数据分析。ExperionTM系统解析并量化10至260kDa大小的蛋白样品，其高敏感性与胶体考马斯亮蓝SDS-PAGE凝胶染色相仿。为了进行量化，ExperionTM系统使用Pro260阶梯以及针对该系统中的使用而优化的改进版本的Precision Plus ProteinTM标样。
实施例12：荧光显微镜分析
使用LeicaTM DMILTM倒置荧光显微镜的GFP滤镜，使得受感染细胞直接在6孔细胞培养板上可视化。
实施例13：荧光分析
取约20μg含有不同重组GFP蛋白量的源自受感染细胞的全溶解蛋白，使用TecanTMGENiosTM(CA,USA)荧光分析仪(激发[Ex],485/发射[Em],535)进行分析和量化。
实施例14：免疫印迹分析
以15％SDS-PAGE凝胶来解析来自受重组杆状病毒感染的细胞的总可溶性蛋白部分(10μg)。用考马斯亮蓝染色法对凝胶进行染色，或将凝胶转移到硝酸纤维膜。以1：1000的抗GFP单克隆抗体mab2515(MilliporeTM,USA)或肌动蛋白抗血清(20-33；Sigma-AldrichTM)探测免疫印迹，并以1:2000稀释的抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)标记缀合物(KPLTM,UK)或以1:2000稀释的抗兔IgG-辣根过氧化物酶(HRP)标记缀合物(KPLTM,UK)作为二级抗体来显示免疫复合物。使用ECL免疫印迹检测系统来检测蛋白条带，并用ChemiDocTM XRS凝胶成像系统(ChemiDocTM XRS Gel Imaging System)(Bio-RadTM,USA)进行分析。
实施例15：pB2DNA片段中的启动子序列的定界
BJHSP-2基因(pB2)上游的DNA区域是基于此前发表的BJHSP2序列(GenBank登记号：U41640)从T.ni昆虫DNA经PCR扩增所得。扩增的NDA区域与所述序列有数方面的不同，包括2处插入、8处删除和17处突变(SEQ ID NO:34)。使用各种生物信息学分析法，沿pB2序列发现了6个激素应答元件相关的假定结合位点，其中4个对应于假定蜕皮素应答元件(EcR)，且其中3个对应于假定Broad-Complex位点(Br-C)(图9的A部分和9的B部分)，
为了测定转录活动的必要调控区域和潜在激素调控元件的相关性，分析了pB2截短序列(pB29片段，图9的B部分)。pB2和pB29片段序列均克隆在杆状病毒载体中，并使用GFP报告蛋白测试其启动子活性。图9的B部分展示了以每个片段获得的GFP表达水平的荧光分析量化结果。令人吃惊地，pB29片段展示出比原来的全长pB29更强的启动子活性，哪怕其缺少了2个假定Br-C结合位点(图9的B部分)。
实施例16：pB2或pB29和常规杆状病毒启动子之间的协同合作
构建了包含pB2或pB29序列和常规杆状病毒启动子polh或p10的不同嵌合启动子，得到以下组合：pB2polh、polhpB2、pB2p10、p10pB2和pB29p10。将其全部用于制备重组杆状病毒并测试它们的启动子特性。感染后24小时，由polhpB2和pB29p10杂合启动子驱动的GFP蛋白表达高于使用常规启动子polh或p10所得结果(图10)。有趣的是，由嵌合启动子polhpB2控制的GFP表达在感染后48小时下降，而由嵌合启动子pB29p10控制的GFP表达随着时间增加，甚至高于使用polh启动子所得结果(图10的B部分)。嵌合启动子pB2p10在感染后48小时展示出最大GFP表达水平，但后期表达增量并非线性(图10的B部分)。总之，杂合启动子pB29p10比单独使用polh或p10启动子更早且更强。
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Claims (44)

1.含有核酸序列的重组杆状病毒，所述核酸序列允许充当转录调控因子的蛋白IE-1、IE-0和/或其片段的高于内源水平的表达，其中所述核酸选自：
(a)含有如SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的核酸；
(b)与SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％的核酸序列，该核酸序列编码能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的蛋白；
(c)编码含有如SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码与SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的序列一致性为至少70％的氨基酸序列的核酸序列，所述氨基酸序列能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子。
2.根据权利要求1所述的重组杆状病毒，进一步包括至少一个重组同源区域(hr)，该至少一个重组同源区域(hr)充当增强子区域、并可操作地连接至任何适于驱动重组蛋白表达的启动子。
3.根据权利要求2所述的重组杆状病毒，其中所述重组同源区域(hr)是如SEQ ID NO:27(hr1)所示的序列。
4.根据权利要求2或3所述的重组杆状病毒，其中可操作地连接至所述重组同源区域(hr)的所述启动子选自如下核酸：
(a)含有如SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的核酸；和
(b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的重组杆状病毒，包含一核酸序列，该核酸序列含有重组启动子、编码转录调控因子的序列以及选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合。
6.根据权利要求1所述的重组杆状病毒，进一步包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所述编码重组蛋白的核酸序列可操作地连接至选自权利要求1-5所述的核酸序列。
7.适合制备根据权利要求1-6中任一项所述的重组杆状病毒的转移载体，包括用于作为转录调控因子的蛋白IE-0、IE-1和/或其片段的高于内源水平的表达的序列，还包括适用于在杆状病毒中整合或转位的核酸序列。
8.根据权利要求7所述的转移载体，还包括至少1个重组同源区域(hr)，该至少1个重组同源区域(hr)作为增强子区域可操作地连接至适用于驱动重组蛋白表达的任何启动子。
9.根据权利要求8所述的转移载体，其中所述重组同源区域(hr)是如SEQ ID NO:27(hr1)所示的序列。
10.根据权利要求8或9所述的转移载体，其中启动子可操作地连接至选自如下各核酸的重组同源区域(hr)：
(a)含有如SEQ ID NO:10-16任一项所示的核苷酸序列的核酸；
(b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与如SEQ ID NO:10-16任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％的核酸序列。
11.根据权利要求7所述的转移载体，包含一核酸序列，该核酸序列含有重组启动子、编码转录调控因子的序列以及选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合。
12.根据权利要求7所述的转移载体，还包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至选自权利要求7-11所述的核酸序列中的核酸序列。
13.根据权利要求7所述的转移载体，不含编码重组蛋白的核酸序列。
14.根据权利要求7所述的转移载体，其特征在于所述转移载体为杆粒。
15.根据权利要求7所述的转移载体，其特征在于所述转移载体源自以下杆状病毒表达体系的任一种：(invitrogenTM)、“BacPAKTM”(ClontechTM)、“FlashBACTM”(Oxford Expression TechnologiesTM)、“BacuVanceTM”(GenScriptTM)、“Bac-N-Blue DNATM”(invitrogenTM)、“BaculoDirectTM”(invitrogenTM)、1000、2000、3000“DiamondBacTM”或“BaculoGoldTM”(BD biosciencesTM)。
16.适用于生成根据权利要求1-15中任一项所述的重组杆状病毒或转移载体的克隆载体，包括用于高于内源水平地表达作为转录调控因子的蛋白IE-0、IE-1和/或其片段的序列，其进一步适用于细菌复制。
17.根据权利要求16所述的克隆载体，还包括至少一个重组同源区域(hr)，该至少一个重组同源区域(hr)作为增强子区域、可操作地连接至任何适于驱动重组蛋白表达的启动子。
18.根据权利要求17所述的克隆载体，其中所述重组同源区域(hr)是如SEQ ID NO:27(hr1)所示的序列。
19.根据权利要求17或18所述的克隆载体，其中所述可操作地连接在所述重组同源区域(hr)上的启动子选自如下核酸：
(a)含有如SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的核酸；和
(b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％的核酸序列。
20.根据权利要求16所述的克隆载体，包含一核酸序列，该核酸序列含有重组启动子、编码转录调控因子的序列以及选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合。
21.根据权利要求16所述的克隆载体，进一步包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至选自权利要求16-20所述的核酸序列中的核酸序列。
22.根据权利要求16所述的克隆载体，不含编码重组蛋白的核酸序列。
23.适用于生成根据权利要求1-22中任一项所述的重组杆状病毒、转移载体或克隆载体的核酸序列，包括用于高于内源水平地表达作为转录调控因子的蛋白IE-0、IE-1和/或其片段的序列。
24.根据权利要求23所述的核酸序列，还包括至少一个重组同源区域(hr)，该至少一个重组同源区域(hr)作为增强子区域、可操作地连接至任何适于驱动重组蛋白表达的启动子。
25.根据权利要求24所述的核酸序列，其中所述重组同源区域(hr)是如SEQ ID NO:27(hr1)所示的序列。
26.根据权利要求24或25所述的克隆载体，其中可操作地连接至所述重组同源区域(hr)的所述启动子选自如下核酸：
(a)含有如SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的核酸；和
(b)能够在重组杆状病毒中充当启动子且与SEQ ID NO:10-16中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％的核酸序列。
27.根据权利要求23所述的核酸序列，包含一核酸序列，该核酸序列含有重组启动子、编码转录调控因子的序列以及选自SEQ ID NO:17-26的增强子区域的组合。
28.根据权利要求23所述的核酸序列，进一步包括编码重组蛋白的核酸序列，其中所述核酸序列可操作地连接至选自权利要求23-27所述的核酸序列中的核酸序列。
29.根据权利要求23所述的核酸序列，不含编码重组蛋白的核酸序列。
30.以权利要求1-29中任一项的重组杆状病毒、转移载体、克隆载体或核酸序列来感染、转染、转导或转化的宿主细胞。
31.根据权利要求30所述的感染、转染、转导或转化后的宿主细胞，其特征在于该细胞为昆虫细胞系。
32.根据权利要求30或31所述的感染、转染、转导或转化后的宿主细胞，其特征在于该细胞为来自鳞翅目或双翅目的昆虫。
33.根据权利要求30所述的感染、转染、转导或转化后的宿主细胞，其特征在于该细胞来自Trichoplusia ni、Spodoptera frugiperda、Ascalapha odorata、Bombyx mori、Drosophila melanogaster或Aedes aegypti。
34.根据权利要求30所述的感染、转染、转导或转化后的宿主细胞，其特征在于该细胞系选自Hi-5TM、Sf9、Sf21、BTI-Tn5B-1、Tn368、BTI-TnAo38、ATC-10和Schneider′s Drosophila Line 2。
35.含有如权利要求1-29中任一项所述重组杆状病毒、转移载体、克隆载体或核酸序列的培养基。
36.用于制备重组蛋白的方法，包括：培养根据权利要求30-34中任一项所述的感染、转染、转导或转化后的宿主细胞，以及使用常规方法来提取和纯化所述重组蛋白。
37.根据权利要求36所述的用于制备重组蛋白的方法，其中所述重组蛋白选自：亚单位单体疫苗、亚单位多聚体疫苗、病毒样颗粒、治疗蛋白、抗体、酶、细胞因子、凝血因子、抗凝剂、受体、荷尔蒙和诊断性蛋白试剂。
38.根据权利要求7-15中任一项所述的转移载体在制备根据第1-6中任一项所述的重组杆状病毒中的用途。
39.根据权利要求16-22中任一项所述的克隆载体在制备根据第1-15中任一项所述的重组杆状病毒或转移载体中的用途。
40.根据权利要求23-29中任一项所述的核酸序列在制备根据第1-22中任一项所述的重组杆状病毒或转移载体或克隆载体中的用途。
41.含有转基因的转基因细胞系，所述转基因选自下列核酸：
(a)含有如SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的核酸；
(b)与SEQ ID NO:1-5中任一项所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％，并编码能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的蛋白的核酸序列；
(c)编码含有如SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的氨基酸的核酸序列；以及
(d)编码了与SEQ ID NO:6-9中任一项所示的氨基酸序列的序列一致性为至少70％并能够在重组杆状病毒中充当转录调控因子的氨基酸序列的核酸序列。
42.根据权利要求41所述的转基因细胞系，其为昆虫源、鸟类源或哺乳动物源细胞系。
43.用于生产重组蛋白的方法，包括根据权利要求41或42所述转基因细胞的生长，和以常规方法对重组蛋白进行提取和纯化。
44.含有在重组杆状病毒中作为启动子的核酸序列的核酸序列，所述核酸序列选自：
(a)含有如SEQ ID NO:12、14或15所示的核苷酸序列的核酸；和
(b)与SEQ ID NO:12、14或15所示的核苷酸序列的序列一致性为至少70％的核酸序列。
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