CN101285055A - 重组人源干扰素诱导蛋白4杆状病毒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组的干扰素诱导蛋白4杆状病毒，所述的杆状病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重组表达盒含有干扰素诱导蛋白4的编码序列；并且，所述的杆状病毒可感染昆虫细胞，从而表达干扰素诱导蛋白4。所述杆状病毒可稳定传代且干扰素诱导蛋白4的表达量高。本发明还公开了一种制备干扰素诱导蛋白4的方法，采用所述方法可获得具有良好糖基化修饰和空间构型的干扰素诱导蛋白4。

Description

重组人源干扰素诱导蛋白4杆状病毒

技术领域

本发明属于生物技术领域，更特别的，本发明涉及一种用于表达IFIT4蛋白的重组病毒，以及采用所述重组病毒表达IFIT4蛋白的方法。

背景技术

系统性红斑狼疮(SLE)是一种涉及许多系统和脏器的全身结缔组织炎症性疾病，可累及皮肤、浆膜、关节、肾及中枢神经系统等，并以自身免疫为特征，患者体内存在多种自身抗体，不仅影响体液免疫，亦影响细胞免疫，补体系统亦有变化。近年来，由于实验室检测技术的发展，临床诊断水平的提高，本病的发病数增多，仅次于儿童类风湿关节炎，居小儿全身性结缔组织疾病中的第2位。

近来多家实验室利用基因芯片对SLE和健康志愿者外周血白细胞基因表达谱进行对比研究，最重要的发现就是一组IFN诱导基因在SLE中高表达。干扰素诱导蛋白4(IFIT4蛋白)是IFN的下游调控蛋白，有实验证明IFIT4在SLE病人及在活动期SLE患者中高表达，其水平明显高于健康人，表明IFIT4可能是SLE非常重要的新的易感基因。初步试验表明，在SLE病人中，IFIT4的mRNA水平与ANA、Anti-dsDNA、Anti-Sm抗体滴度呈正相关，ANA、Anti-dsDNA、Anti-Sm抗体滴度是目前临床诊断的指标，但是由于SLE的复杂性，以上的诊断指标不能够同时适用于一个个体，通常只能为临床医生对病人发病情况以辅助判断。IFIT4与以上提到的诊断指标有一定的相关度，可能成为一个新的指标，从而用于更有效地诊断SLE。

为了对IFIT4进行研究以及研制出可检测体内IFIT4含量的抗体，需要大量地制备接近于天然IFIT4的蛋白。然而目前本领域还没有任何利用基因工程手段表达该蛋白的报道。通常制备抗原所采用的系统是原核表达系统，原核蛋白表达系统具备外源基因的高通量表达、易于扩大再生产、低成本、菌体繁殖迅速、无转录后修饰和表达蛋白可被标记等优点，然而原核系统表达出的蛋白往往缺乏较好的空间构象和基本的糖基化修饰，与天然蛋白相差甚远，这导致在某些情况下用原核系统表达的蛋白免疫动物所制备的单抗识别天然表位能力低，而不能用来开发诊断试剂盒。并且还发现，采用大肠杆菌(如BL21)原核系统表达IFIT4无法实现，IFIT4在表达过程中会被降解。

因此，本领域迫切需要开发一种可方便快捷地表达接近于天然IFIT4的重组IFIT4的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组的IFIT4杆状病毒，其感染昆虫细胞后可表达出重组的IFIT4蛋白。

本发明的另一目的在于提供可方便快捷地表达接近于天然干扰素诱导蛋白4的重组干扰素诱导蛋白4(IFIT4蛋白)的方法。

在本发明的第一方面，提供一种重组的干扰素诱导蛋白4杆状病毒，所述的杆状病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重组表达盒含有干扰素诱导蛋白4的编码序列；并且，所述的杆状病毒可感染昆虫细胞，从而表达干扰素诱导蛋白4。

在本发明的另一优选例中，所述的重组表达盒从5’至3’依次含有以下元件：

多角蛋白启动子，

干扰素诱导蛋白4的编码序列，和

SV40 PolyA转录终止序列。

在本发明的另一优选例中，在多角蛋白启动子与干扰素诱导蛋白4的编码序列之间还含有蛋白纯化标记。更优选的，所述的纯化标记为6×HisTag。

在本发明的另一优选例中，所述的杆状病毒的基因组含有Bacmid DNA，所述Bacmid DNA中含有所述重组表达盒，所述的重组表达盒从5’至3’依次具有以下元件：

多角蛋白启动子，

干扰素诱导蛋白4的编码序列，和

SV40 PolyA转录终止序列。

更优选的，在多角蛋白启动子与干扰素诱导蛋白4的编码序列之间还含有蛋白纯化标记。更优选的，所述的纯化标记为6×His Tag。

在本发明的另一优选例中，所述杆状病毒通过以下步骤制备：

(A)将干扰素诱导蛋白4的编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；

(B)将(A)获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞；和

(C)收获重组的干扰素诱导蛋白4杆状病毒。

在本发明的第二方面，提供一种制备所述的杆状病毒的方法，所述方法包括以下步骤：

(A)将干扰素诱导蛋白4的编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；

(B)将(A)获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞；和

(C)收获重组的干扰素诱导蛋白4杆状病毒。

在本发明的另一优选例中，所述的杆粒为Bacmid杆粒。更优选的，所述的Bacmid来源于大肠杆菌DH10Bac。

在本发明的另一优选例中，在步骤(A)中，干扰素诱导蛋白4的编码序列及其两端重组序列，在转座酶的作用下重组入Bacmid杆粒中mini-attTn7位点。更优选的，所述的转座酶由大肠杆菌DH10Bac中携带的辅助质粒(helper)所表达。

在本发明的另一优选例中，在步骤(A)中，所述重组的杆粒通过以下步骤获得：

(a)将干扰素诱导蛋白4的编码序列插入穿梭载体(优选的为pFASTBac-HTb载体)的多克隆位点中，获得插入了干扰素诱导蛋白4编码序列的重组载体；

(b)将(a)获得的重组载体转入宿主细胞DH10Bac，获得转化的宿主细胞，所述转化的宿主细胞中含有重组杆粒，所述重组杆粒携带干扰素诱导蛋白4编码序列；和

(c)从所述转化的宿主细胞中提取重组杆粒。

在本发明的另一优选例中，所述的干扰素诱导蛋白4具有SEQ ID NO：2中第29-516位所示的氨基酸序列。

在本发明的另一优选例中，所述的干扰素诱导蛋白4的编码序列如SEQ IDNO：1第85-1548位所示。

在本发明的另一优选例中，所述的干扰素诱导蛋白4的编码序列的两端还含有多克隆位点的编码序列和/或蛋白纯化标记位点(如6×His tag)的编码序列。

在本发明的第三方面，提供所述的干扰素诱导蛋白4杆状病毒的用途，用于制备干扰素诱导蛋白4。

在本发明的第四方面，提供一种制备干扰素诱导蛋白4(IFIT4蛋白)的方法，包括以下步骤：

(1)将所述的干扰素诱导蛋白4杆状病毒感染昆虫细胞，培养感染后的昆虫细胞，使之表达干扰素诱导蛋白4；和

(2)分离获得干扰素诱导蛋白4。

在本发明的另一优选例中，所述的干扰素诱导蛋白4是人源的干扰素诱导蛋白4。

在本发明的另一优选例中，在步骤(1)中，进行感染时，干扰素诱导蛋白4杆状病毒数量与昆虫细胞数量的比例为(1-5)pfu：1cell(也即：感染复数(MOI)＝1-5)。

在本发明的另一优选例中，干扰素诱导蛋白4杆状病毒数量与昆虫细胞数量的比例为(3-4)pfu：1cell(也即：感染复数(MOI)＝3-4)。

在本发明的另一优选例中，在步骤(1)中，培养感染后的昆虫细胞4±2天；优选的，培养感染后的昆虫细胞4±1天；更优选的，培养感染后的昆虫细胞4±0.5天；最优选的，培养4天。

在本发明的另一优选例中，在步骤(1)中，感染后的昆虫细胞的培养温度为25-30℃；优选的，所述的培养温度为26-28℃。最优选的，所述的培养温度为27℃。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了人源IFIT4的核酸序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上BLAST同源性最高序列比较结果。其中，

Query表示：pFASTBac-HTB-IFIT4编码人源IFIT4基因的核酸序列；

Sbjct表示：人源IFIT4基因的核酸序列，ref|NM_001031683.1|。

图2显示了人源IFIT4的氨基酸序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上BLAST同源性最高序列比较结果。

Query表示：pFASTBac-HTB-IFIT4编码人源IFIT4基因的蛋白序列；

Sbjct表示：人源IFIT4基因的全蛋白序列，AAX43715。

图3显示了获得BAC-IFIT4杆状病毒及IFIT4蛋白表达的流程示意图。

图4显示了目的基因IFIT4的PCR扩增验证。

其中，泳道1：DL2000marker；泳道2：阴性对照；泳道3：目的基因的扩增条带(其条带大小1.5KB)。

图5显示了目的基因IFIT4的双酶切验证。

其中，泳道1：DL2000marker；泳道2：质粒的酶切后验证(其中上面的条带为pFASTBac-HTB，下面的条带为目的基因IFIT4)。

图6显示了各阳性克隆中获得的病毒杆粒的验证。

其中，泳道1：克隆1；泳道2：克隆2；泳道3：克隆3；泳道4：克隆4。

图7显示了各阳性克隆中获得的病毒杆粒的PCR验证。

其中，泳道1：MD104marker；泳道2：阴性对照；泳道3：克隆1；泳道4：克隆2；泳道5：克隆3；泳道6：克隆4；泳道7：空白对照。

图8显示了在MOI＝4时，分别在培养细胞后2、3、4、5天收取细胞，检测IFIT4蛋白表达情况的结果。

其中，泳道1：未感染昆虫细胞，泳道2：感染24小时，泳道3：感染48小时，泳道4：感染72小时，泳道5：感染96小时，泳道6：感染120小时，泳道7：阳性对照。

图9显示了当MOI＝4且表达时间为4天时，纯化后的蛋白的SDS-PAGE结果(A)和Western印迹结果(B)。

其中，泳道1：未感染细胞；泳道2：感染细胞；泳道3：蛋白低分子量marker；泳道4：纯化后样品1，泳道5：纯化后样品2。

图10显示了显微镜观察MOI＝4(A)和MOI＝9(B)时，昆虫细胞的状态图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现采用杆状病毒感染昆虫细胞来表达干扰素诱导蛋白4(IFIT4蛋白)，可获得具有比较好的糖基化修饰和空间构型的蛋白(也即接近于天然的IFIT4蛋白)，且其能够被IFIT4单克隆抗体很好的识别。本发明人的新发现解决了现有技术中难以表达IFIT4蛋白的技术难题。在此基础上完成了本发明。

本发明人在研究中发现，采用大肠杆菌(如BL2 1)原核系统表达IFIT4蛋白是无法实现的，IFIT4蛋白在表达过程中会被降解；采用真核表达系统成本高且表达困难；采用酵母表达系统可形成过多的糖基化位点，从而使得蛋白的构象发生改变。而采用杆状病毒表达系统来表达IFIT4蛋白表达量高，表达稳定，并且蛋白结构接近天然蛋白。

本发明还提供一种人源IFIT4杆状病毒，所述的病毒可以稳定传代，零下70℃可以长期保存并具有高的滴度。利用该病毒感染昆虫细胞后4-5天可以得到高于4mg/L的IFIT4蛋白，可见IFIT4蛋白的表达量很高。

干扰素诱导蛋白4

干扰素诱导蛋白4(IFIT4蛋白)是一种IFN的下游调控蛋白。最新发现IFIT4在系统性红斑狼疮(SLE)患者及在活动期SLE患者中高表达，其水平明显高于健康人，因此其是与系统性红斑狼疮相关的蛋白。

作为本发明的优选方式，所述的IFIT4蛋白是人源的IFIT4蛋白。

作为本发明的优选方式，所述的IFIT4蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号为AAX43715提供的序列或SEQ ID NO：2中第29-516位所示的序列基本上相同。所述的IFIT4基因的核苷酸序列可以与GenBank登录号为NM 001031683提供的序列或SEQ ID NO：1中第85-1548位所示的序列基本上相同。

干扰素诱导蛋白4杆状病毒

本发明提供了一种重组的IFIT4杆状病毒(BAC-IFIT4)，其可用于感染昆虫细胞而获得重组IFIT4蛋白。所述的杆状病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重组表达盒含有IFIT4蛋白的编码序列。

作为本发明的优选方式，所述的重组表达盒从5’至3’依次具有以下元件：多角蛋白启动子、IFIT4蛋白的编码序列、SV40 PolyA转录终止序列。更优选的，在多角蛋白启动子与干扰素诱导蛋白4的编码序列之间还含有蛋白纯化标记。更优选的，所述的纯化标记为6×His Tag。所述的多角蛋白启动子可以启动IFIT4蛋白的高效表达。

优选的，所述的IFIT4杆状病毒是重组人源IFIT4蛋白杆状病毒。

作为本发明的优选方式，所述杆状病毒通过以下步骤制备：

(A)将IFIT4蛋白的编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；

(B)将(A)获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞；和

(C)收获重组的IFIT4杆状病毒。

作为本发明的优选方式，所述的杆粒是Bacmid杆粒。更优选的，所述的Bacmid来源于大肠杆菌DH10Bac。

作为本发明的优选方式，所述的昆虫细胞选自sf9昆虫细胞，HighFive昆虫细胞；最优选的，所述昆虫细胞是HighFive昆虫细胞。

作为本发明的优选方式，将IFIT4蛋白的编码序列及其两端重组序列，在转座酶的作用下重组入Bacmid杆粒的mini-attTn7位点。更优选的，所述的转座酶由大肠杆菌DH10Bac中携带的辅助质粒(helper)所表达。

作为本发明的优选方式，在步骤(A)中，所述重组的杆粒通过以下步骤获得：

(a)将干扰素诱导蛋白4的编码序列插入穿梭载体(优选pFASTBac-HTb载体)的多克隆位点中，获得插入了IFIT4编码序列的重组载体；

(b)将(a)获得的重组载体转入宿主细胞DH10Bac，获得转化的宿主细胞，所述转化的宿主细胞中含有重组杆粒，所述的重组杆粒携带IFIT4编码序列；和

(c)从所述转化的宿主细胞中提取重组杆粒。

作为本发明的优选方式，所述的IFIT4蛋白具有SEQ ID NO：2中第29-516位所示的氨基酸序列。优选的，所述的IFIT4蛋白的编码序列如SEQ ID NO：1第85-1548位所示。

作为本发明的优选方式，所述的IFIT4蛋白的编码序列的两端还含有多克隆位点的编码序列和/或纯化标记位点(如His tag)的编码序列。

作为本发明的优选方式，所述的人源IFIT4蛋白杆状病毒是通过将目的基因人源IFIT4克隆进入pFASTBac的多克隆位点内，然后将pFASTBAC转化DH10Bac基因工程菌，在转座酶的作用下发生重组，获得杆粒后转染昆虫细胞获得的。将这种病毒感染昆虫细胞后数小时，病毒即可进入昆虫细胞，开始复制病毒，并且转录病毒重组区域中蛋白翻译区的核酸序列，在该段序列中含有人源IFIT4的核酸序列。感染约2-4天后表达具有病毒重组区域中蛋白翻译区所对应的氨基酸序列的蛋白，该段序列中含有人源IFIT4的氨基酸序列。

作为本发明的优选方式，所述的蛋白翻译区的核酸序列是指：编码人源IFIT4融合蛋白的核酸序列，如SEQ ID NO：1第85-1548位所示。

更优选的，所述的蛋白翻译区核酸序列的末端还包含编码纯化标签(如Histag)以及酶切克隆位点的序列，从而便于后续的克隆以及纯化，本领域人源均了解如何在待表达的外源基因的两端设置纯化标记以及克隆位点。

进一步优选的，所述的蛋白翻译区核酸序列的N端还包含如SEQ ID NO：1第1-84位所示的核苷酸序列。即，所述重组人源IFIT4蛋白杆状病毒中的蛋白翻译区核酸序列如SEQID NO：1所示，共含有1548核苷酸(作为开放式阅读框)。上述核苷酸序列可编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白，该蛋白的分子量约在59.6KD左右，其中SEQID NO：2所示第29-516位为人源IFIT4基因的氨基酸序列，分子量约55.77KD。

本发明的IFIT4杆状病毒可以稳定传代，零下70℃可以长期保存并保持高的滴度。

此外，在所述的IFIT4杆状病毒感染昆虫细胞并表达IFIT4蛋白后，还可以通过例如密度梯度离心等方法从培养物中回收IFIT4重组杆状病毒，用于下次感染。

表达IFIT4蛋白的方法

本发明人提供了一种制备IFIT4蛋白的方法，该方法包括步骤：

(1)将所述的干扰素诱导蛋白4杆状病毒感染昆虫细胞，培养感染后的昆虫细胞，使之表达干扰素诱导蛋白4；和

(2)分离获得干扰素诱导蛋白4。

作为本发明的优选方式，所述的昆虫细胞选自：sf9昆虫细胞，HighFive昆虫细胞；最优选的，所述昆虫细胞是HighFive昆虫细胞。

作为本发明的优选方式，所述的IFIT4蛋白是人源IFIT4蛋白。更优选的，所述的IFIT4蛋白具有SEQ ID NO：2中第29-516位所示的氨基酸序列。所述的IFIT4蛋白的编码序列如SEQ ID NO：1第85-1548位所示。

本发明人在实践中发现，在利用重组病毒感染昆虫细胞的过程中，采用的重组病毒数量与昆虫细胞数量与感染后昆虫细胞的生长情况以及最终IFIT4蛋白的表达是密切相关的。当重组病毒数量与昆虫细胞数量之比大于6时，昆虫细胞的生长状态不佳，感染昆虫细胞后适当时间表达出的IFIT4蛋白显著低于重组病毒数量与昆虫细胞数量之比小于等于5时的情况，甚至在无法表达出IFIT4蛋白。因此，作为本发明的优选方式，在前述步骤(3)中，进行感染时，重组病毒数量与昆虫细胞数量的比例为(1-5)pfu：1cell(也即：感染复数(MOI)＝1-5)。更优选的，重组病毒数量与昆虫细胞数量的比例为(3-4)pfu：1cell(也即：感染复数(MOI)＝3-4)。

本发明人在实践中还发现，在利用重组病毒感染昆虫细胞的过程中，感染后的时间控制也是与最终蛋白的表达密切相关的。为了选择合适的病毒感染时间，本发明人在MOI＝4时，分别在培养细胞后2、3、4、5天收取细胞，检测IFIT4蛋白的表达情况。结果发现在培养细胞后2-4天，蛋白的表达量逐渐增加，到第4天达到最大，第5天蛋白表达量又开始降低。因此，作为本发明的优选方式，在前述步骤(3)中，培养感染后的昆虫细胞2-6天后收获IFIT4蛋白是合适的；优选的，培养感染后的昆虫细胞3-5天后收获IFIT4蛋白；更优选的，培养感染后的昆虫细胞3.5-4.5天后收获IFIT4蛋白；最优选的，培养感染后的昆虫细胞4天后收获IFIT4蛋白。

作为本发明的优选方式，在步骤(3)中，感染后的昆虫细胞的培养温度为25-30℃。更优选的，所述的培养温度为26-28℃。最优选的，所述的培养温度为27℃。

作为本发明的优选方式，制备IFIT4蛋白的流程如图3所示。

作为本发明的实施方式，通过PCR将具有如SEQ ID NO：1所示序列的IFIT4基因扩增，用BamHI和XhoI分别酶切PCR产物和pFASTBac-HTB，然后用T4 DNA连接酶连接两种酶切产物。鉴定阳性重组质粒，测序后获得重组质粒pFASTBac-HTB-IFIT4。将pFASTBac-HTB-IFIT4转化大肠杆菌DH10BAC，通过蓝白斑筛选和PCR验证筛选到阳性克隆通过扩增于Cellfectin混合后感染昆虫细胞，出现明显感染后收集上清，并按照以上方法进行病毒的传代，从而得到感染效力较高的病毒。

将前述获得的病毒感染昆虫细胞，27℃培养，4天后即可表达出人源IFIT4蛋白，此蛋白经过SDS-PAGE和Western-Blot进一部鉴定是正确的人源IFIT4蛋白。

IFIT4蛋白的纯化

作为本发明的一种优选方式，所述的重组IFIT4蛋白的氨基端(或羧基端)还可含有一个多肽片段，作为蛋白纯化标记(标签)。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，6-His，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1(见表1)。这些标签可用于对重组IFIT4蛋白进行纯化。

表1可使用的标签系统

表位	肽	相应抗体
			FLAG	DYKDDDK	4E11
HA	YPYDVPDYA	12Ca5
			HA1	CQDLPGNDNST	mouse MAb
c-Myc	EQKLISEEDL	9E10
			6-His	HHHHHH	BAbCO
AU1	DTYRYI	BAbCO
			EE	EYMPME	anti-EE
T7	ASMTGGQQMGR	Invitrogen
			4A6	SFPQFKPQEI	4A6
B	QYPALT	D11，F10
			gE	QRQYGDVFKGD	3B3
Ty1	EVHTNQDPLD	BB2，TYG5

对上述可用的标签的描述可参见如下文献：Prickett等，BioTechniques，7(6)：580-584(1989)；Xie等，Endocrinology，139(11)：4563-4567(1998)；Nagelkerke等，Electrophoresis，18：2694-2698(1997)；Tolbert和Lameh，J.Neurochem.，70：113-119(1998)；Chen和Katz，BioTechniques，25(1)：22-24(1998)；Tseng和Verma，Gene，169：287-288(1996)；Rudiger等，BioTechniques，23(1)：96-97(1997)；O1ah等，Biochem.，221：94-102(1994)；Wang等，Gene，169(1)：53-58(1996)；Grose，U.S.Patent No.5,710,248；Bastin等，Mol.Biochem.Parasitology，77：235-239(1996)Invitrogen，Sigma，Santa Cruz Biotech。

在本发明的优选方式中，在IFIT4蛋白的氨基端设置有组氨酸标签(6×His tag)，以便于蛋白的纯化。例如，可以用HIStrap HP 5ml进行纯化，1小时内即可完成。

本发明的主要优点在于：

(1)首次发现采用杆状病毒感染昆虫细胞来表达IFIT4蛋白，可获得具有比较好的糖基化修饰和空间构型的蛋白，其接近于天然的IFIT4蛋白，且其能够被IFIT4单克隆抗体很好的识别。

(2)对于利用杆状病毒感染昆虫细胞来表达IFIT4蛋白的工艺进行了优化，找到了适合于表达IFIT4蛋白的重组杆状病毒与昆虫细胞的较佳比例和较佳时间，从而可稳定且大量地表达IFIT4蛋白。

(3)本发明人的新发现解决了现有技术中难以表达IFIT4蛋白的技术难题，为研究IFIT4作为SLE诊断标记的可行性奠定基础。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

pFASTBac-HTB-IFIT4质粒的构建

1.目的基因的PCR扩增

根据GenBank登录号为NM_001031683的人源IFIT4基因设计以下引物：

正向：cgcggatccgcgatgagtgaggtcaccaag(SEQ ID NO：3)，下划线部分为BamHI酶切位点；

反向：ccgctcgagcggttattgctctgag(SEQ ID NO：4)，下划线部分为XhoI酶切位点。

采用前述引物，通过常规PCR方法从人基因组cDNA文库扩增人源的IFIT4基因，获得包含BamHI和XhoI酶切位点的PCR产物。

2.BamHI和XhoI酶切PCR产物和pFASTBac-HTB载体

用限制性内切酶BamHI和XhoI分别酶切前述获得的PCR产物和pFASTBac-HTB载体(购自Invitrogen公司)。37℃作用2小时后，酶切产物用DNA Fragment Purification Kit(购自申能博采公司)回收。

3.T4 DNA连接酶连接

将PCR回收产物和pFASTBac-HTB载体回收产物按约1∶8的比例混合，采用T4 DNA连接酶(Takara公司)16℃连接过夜。将连接产物转化进入大肠杆菌DH5α，37℃过夜培养，提取质粒，用BamHI和XhoI酶切鉴定。对阳性质粒测序。

测序结果到http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行BLAST搜索，搜索结果发现，该序列与人源IFIT4同源性非常高，核酸序列的比对结果见图1(99％，仅在接近尾部的部分有一个碱基的差异)，蛋白序列的比对结果见图2。故可以判断该核酸序列为人源IFIT4蛋白的编码序列。也即获得pFASTBac-HTB-IFIT4质粒。

挑取阳性克隆菌扩增后抽提质粒，以前述SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物进行PCR扩增，获得的扩增产物进行电泳鉴定，结果见图4，其中泳道3的1.5kb处的条带即为IFIT4条带。

用BamHI和XhoI酶切pFASTBac-HTB-IFIT4质粒，酶切产物进行电泳鉴定，结果见图5，其中箭头所指处即为IFIT4条带(pFASTBac-HTB-IFIT4质粒在BamHI和XhoI的酶切作用下变为两条带，分子量为1.5KD左右的为目的基因IFIT4，另外一条较大的带为切下目的基因的空载体)。

实施例2

BAC-IFIT4杆状病毒的获得

1.杆粒的获得

将前述制备的pFASTBac-HTB-IFIT4质粒转化进入DH10Bac基因工程菌(购自Invitrogen公司)中，通过蓝白斑筛选(选择白斑)到阳性克隆，37℃过夜培养，PCR验证，得到阳性杆粒菌克隆。

从阳性杆粒菌中抽提获得重组的Bacmid杆粒，电泳验证，结果见图6，其中箭头所指处即为Bacmid条带。

以前述抽提的Bacmid杆粒为模板，以Bacmid特异性引物GTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID NO：5)；和CAGGAAACAGCTATGAC(SEQ IDNO：6)为引物进行PCR扩增，获得扩增产物进行电泳验证，结果见图7，其中箭头所指处即为含有IFIT4的重组条带。

2.昆虫细胞的培养

将HighFive昆虫细胞(购自Invitrogen公司)冻存管从液氮中取出，置于27℃无菌蒸馏水中，溶化后加入SFM昆虫细胞培养基(购自Invitrogen公司)，1000rpm，1min将冻存保护液DMSO洗除，27℃培养。

3.杆状病毒BAC-IFIT4的获得

将Bacmid杆粒、Cellfectin(购自Invitrogen公司)同SFM培养基混和，后采用常规方法转染昆虫细胞。3天后收集上清，并进行病毒3次传代，得到高滴度病毒。

实施例3

人源IFIT4蛋白的优化表达和纯化

1.昆虫细胞的培养

将昆虫细胞冻存管从液氮中取出，置于27℃无菌蒸馏水中，溶化后加入SFM昆虫细胞培养基，1000rpm，1min将DMSO洗除，27℃培养。

2.病毒的感染

按照MOI＝1-5进行病毒感染，27℃培养3-5天。

3.人源IFIT4蛋白的纯化

收集细胞，用裂解缓冲液(0.745KCl，0.605Tris，10ulPMSF，100mlH₂O)进行裂解，适当超声后进行高速离心以除去细胞碎片，在上清中加入PMSF(购自Invitrogen公司)防止降解。

在室温下将上述裂解液过HiTrap His Column 5ml(购自Amersham公司)纯化。

4.人源IFIT4蛋白的鉴定

A.SDS-PAGE电泳

配制12％分离胶和5％的浓缩胶。细胞用上样缓冲液沸水煮4分钟。浓缩胶100V，分离胶200V。电泳1h 40min。

卡马斯亮蓝染色4小时。

脱色液脱色，观察结果。

B.Western印迹检测

SDS-PAGE电泳结束时，电转缓冲液淋洗电转板。

剪切4张滤纸和一张硝酸纤维素膜，并将他们浸泡在电转液中，按照纸膜胶纸的顺序从阳极到阴极摆放正确，200mA，1h30min横流转膜。加入IFIT4抗体(抗天然IFIT4抗原的抗体，购自R&D)和封闭液25℃孵育2h。再用TTBS洗膜，后用羊抗鼠二抗(购自Sigma)与封闭液孵育1h。

加入底物显色1min，观察结果。

5.感染条件的优化

A.MOI的选择

为了找到合适的MOI值，本发明人分别按照MOI＝4、MOI＝2、MOI＝9、MOI＝7进行病毒感染，27℃培养。观察病毒感染的情况。

结果发现，当MOI＝4或MOI＝2时，HighFive昆虫细胞的状态良好，在感染后2-4天内，IFIT4蛋白表达量逐渐增加(SDS-PAGE电泳检测，蛋白条带的显示在2-4天内逐渐增强)，且在第4天表达量达到最高。而当MOI＝9或MOI＝7时，感染4天后昆虫细胞的状态不好，台盼蓝染色细胞死亡率达到80％，蛋白表达量比较低。

当MOI＝4以及MOI＝9时，昆虫细胞感染4天后，在显微镜(400倍)下的情况分别见图10A和图10B，图中可见当MOI＝4时昆虫细胞的状态明显好于MOI＝9时。

B.感染时间的选择

为了选择合适的病毒感染时间，本发明人在MOI＝4时，分别在培养细胞后2、3、4、5天收取细胞，检测IFIT4蛋白的表达情况。

结果如图8所示，可见在培养细胞后2-4天，蛋白的表达量逐渐增加，到第4天达到最大(达到约4.1mg/L)，第5天蛋白表达量又开始降低。

当MOI＝4且表达时间为4天时，纯化后的蛋白的SDS-PAGE结果如图9A所示(在60KD处有一个条带，即为人源IFIT4蛋白)，Western印迹结果如图9B所示(在60KD处有一个条带，即为人源IFIT4蛋白)。

综上可见，当MOI＝1-5，并且病毒感染时间在3-5天(优选4天)时，蛋白的表达最优化。

实施例4

IFIT4蛋白的原核表达

本发明人在具有如SEQ ID NO：1第85-1548位所示序列的多核苷酸的两端添加多克隆位点，克隆入pET28a载体(购自Novagen公司)的多克隆位点内。将形成的重组表达载体转化BL21表达型大肠杆菌，在0.5-5mM IPTG条件下诱导培养。

结果发现，不管如何改进培养条件，最终均无法获得有活性的IFIT4蛋白。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>重组人源干扰素诱导蛋白4杆状病毒

<130>071837

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1548

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

atgtcgtact accatcacca tcaccatcac gattacgata tcccaacgac cgaaaacctg  60

tattttcagg gcgccatgga tccgatgagt gaggtcacca agaattccct ggagaaaatc  120

cttccacagc tgaaatgcca tttcacctgg aacttattca aggaagacag tgtctcaagg  180

gatctagaag atagagtgtg taaccagatt gaatttttaa acactgagtt caaagctaca  240

atgtacaact tgttggccta cataaaacac ctagatggta acaacgaggc agccctggaa  300

tgcttacggc aagctgaaga gttaatccag caagaacatg ctgaccaagc agaaatcaga  360

agtctagtca cttggggaaa ctacgcctgg gtctactatc acttgggcag actctcagat  420

gctcagattt atgtagataa ggtgaaacaa acctgcaaga aattttcaaa tccatacagt  480

attgagtatt ctgaacttga ctgtgaggaa gggtggacac aactgaagtg tggaagaaat  540

gaaagggcga aggtgtgttt tgagaaggct ctggaagaaa agcccaacaa cccagaattc  600

tcctctggac tggcaattgc gatgtaccat ctggataatc acccagagaa acagttctct  660

actgatgttt tgaagcaggc cattgagctg agtcctgata accaatacgt caaggttctc  720

ttgggcctga aactgcagaa gatgaataaa gaagctgaag gagagcagtt tgttgaagaa  780

gccttggaaa agtctccttg ccaaacagat gtcctccgca gtgcagccaa attttacaga  840

agaaaaggtg acctagacaa agctattgaa ctgtttcaac gggtgttgga atccacacca  900

aacaatggct acctctatca ccagattggg tgctgctaca aggcaaaagt aagacaaatg  960

cagaatacag gagaatctga agctagtgga aataaagaga tgattgaagc actaaagcaa  1020

tatgctatgg actattcgaa taaagctctt gagaagggac tgaatcctct gaatgcatac  1080

tccgatctcg ctgagttcct ggagacggaa tgttatcaga caccattcaa taaggaagtc  1140

cctgatgctg aaaagcaaca atcccatcag cgctactgca accttcagaa atataatggg  1200

aagtctgaag acactgctgt gcaacatggt ttagagggtt tgtccataag caaaaaatca  1260

actgacaagg aagagatcaa agaccaacca cagaatgtat ctgaaaatct gcttccacaa  1320

aatgcaccaa attattggta tcttcaagga ttaattcata agcagaatgg agatctgctg  1380

caagcagcca aatgttatga gaaggaactg ggccgcctgc taagggatgc cccttcaggc  1440

ataggcagta ttttcctgtc agcatctgag cttgaggatg gtagtgagga aatgggccag  1500

ggcgcagtca gctccagtcc cagagagctc ctctctaact cagagcaa               1548

<210>2

<211>520

<212>PRT

<2i3>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Ser Tyr Tyr His His His His His His Asp Tyr Asp Ile Pro Thr

1               5                   10                  15

Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala Met Asp Pro Met Ser Glu Val

            20                  25                  30

Thr Lys Asn Ser Leu Glu Lys Ile Leu Pro Gln Leu Lys Cys His Phe

        35                  40                  45

Thr Trp Asn Leu Phe Lys Glu Asp Ser Val Ser Arg Asp Leu Glu Asp

    50                  55                  60

Arg Val Cys Asn Gln Ile Glu Phe Leu Asn Thr Glu Phe Lys Ala Thr

65                  70                  75                  80

Met Tyr Asn Leu Leu Ala Tyr Ile Lys His Leu Asp Gly Asn Asn Glu

                85                  90                  95

Ala Ala Leu Glu Cys Leu Arg Gln Ala Glu Glu Leu Ile Gln Gln Glu

            100                 105                 110

His Ala Asp Gln Ala Glu Ile Arg Ser Leu Val Thr Trp Gly Asn Tyr

        115                 120                 125

Ala Trp Val Tyr Tyr His Leu Gly Arg Leu Ser Asp Ala Gln Ile Tyr

    130                 135                 140

Val Asp Lys Val Lys Gln Thr Cys Lys Lys Phe Ser Asn Pro Tyr Ser

145                 150                 155                 160

Ile Glu Tyr Ser Glu Leu Asp Cys Glu Glu Gly Trp Thr Gln Leu Lys

                165                 170                 175

Cys Gly Arg Asn Glu Arg Ala Lys Val Cys Phe Glu Lys Ala Leu Glu

            180                 185                 190

Glu Lys Pro Asn Asn Pro Glu Phe Ser Ser Gly Leu Ala Ile Ala Met

        195                 200                 205

Tyr His Leu Asp Asn His Pro Glu Lys Gln Phe Ser Thr Asp Val Leu

    210                 215                 220

Lys Gln Ala Ile Glu Leu Ser Pro Asp Asn Gln Tyr Val Lys Val Leu

225                 230                 235                 240

Leu Gly Leu Lys Leu Gln Lys Met Asn Lys Glu Ala Glu Gly Glu Gln

                245                 250                 255

Phe Val Glu Glu Ala Leu Glu Lys Ser Pro Cys Gln Thr Asp Val Leu

            260                 265                 270

Arg Ser Ala Ala Lys Phe Tyr Arg Arg Lys Gly Asp Leu Asp Lys Ala

        275                 280                 285

Ile Glu Leu Phe Gln Arg Val Leu Glu Ser Thr Pro Asn Asn Gly Tyr

    290                 295                 300

Leu Tyr His Gln Ile Gly Cys Cys Tyr Lys Ala Lys Val Arg Gln Met

305                 310                 315                 320

Gln Asn Thr Gly Glu Ser Glu Ala Ser Gly Asn Lys Glu Met Ile Glu

                325                 330                 335

Ala Leu Lys Gln Tyr Ala Met Asp Tyr Ser Asn Lys Ala Leu Glu Lys

            340                 345                 350

Gly Leu Asn Pro Leu Asn Ala Tyr Ser Asp Leu Ala Glu Phe Leu Glu

        355                 360                 365

Thr Glu Cys Tyr Gln Thr Pro Phe Asn Lys Glu Val Pro Asp Ala Glu

    370                 375                 380

Lys Gln Gln Ser His Gln Arg Tyr Cys Asn Leu Gln Lys Tyr Asn Gly

385                 390                 395                 400

Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Gln His Gly Leu Glu Gly Leu Ser Ile

                405                 410                 415

Ser Lys Lys Ser Thr Asp Lys Glu Glu Ile Lys Asp Gln Pro Gln Asn

            420                 425                 430

Val Ser Glu Asn Leu Leu Pro Gln Asn Ala Pro Asn Tyr Trp Tyr Leu

        435                 440                 445

Gln Gly Leu Ile His Lys Gln Asn Gly Asp Leu Leu Gln Ala Ala Lys

    450                 455                 460

Cys Tyr Glu Lys Glu Leu Gly Arg Leu Leu Arg Asp Ala Pro Ser Gly

465                 470                 475                 480

Ile Gly Ser Ile Phe Leu Ser Ala Ser Glu Leu Glu Asp Gly Ser Glu

                485                 490                 495

Glu Met Gly Gln Gly Ala Val Ser Ser Ser Pro Arg Glu Leu Leu Ser

            500                 505                 510

Asn Ser Glu Gln Leu Thr Asn Gly

        515                 520

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

cgcggatccg cgatgagtga ggtcaccaag    30

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

ccgctcgagc ggttattgct ctgag         25

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

gttttcccag tcacgac    17

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

caggaaacag ctatgac    17

Claims (10)

1.一种重组的干扰素诱导蛋白4杆状病毒，其特征在于，所述的杆状病毒的基因组中含有一重组表达盒，所述的重组表达盒含有干扰素诱导蛋白4的编码序列；

并且，所述的杆状病毒可感染昆虫细胞，从而表达干扰素诱导蛋白4。

2.如权利要求1所述的杆状病毒，其特征在于，所述的重组表达盒从5’至3’依次含有以下元件：

多角蛋白启动子，

干扰素诱导蛋白4的编码序列，和

SV40 PolyA转录终止序列。

3.一种制备权利要求1所述的杆状病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(A)将干扰素诱导蛋白4的编码序列克隆入杆粒中，获得重组的杆粒；

(B)将(A)获得的重组的杆粒转染昆虫细胞，培养转染后的昆虫细胞；和

(C)收获重组的干扰素诱导蛋白4杆状病毒。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的干扰素诱导蛋白4具有SEQ ID NO：2中第29-516位所示的氨基酸序列。

5.权利要求1所述的干扰素诱导蛋白4杆状病毒的用途，其特征在于，用于制备干扰素诱导蛋白4。

6.一种制备干扰素诱导蛋白4的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将权利要求1所述的干扰素诱导蛋白4杆状病毒感染昆虫细胞，培养感染后的昆虫细胞，使之表达干扰素诱导蛋白4；和

(2)分离获得干扰素诱导蛋白4。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，进行感染时，干扰素诱导蛋白4杆状病毒数量与昆虫细胞数量的比例为(1-5)pfu：1 cell。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，干扰素诱导蛋白4杆状病毒数量与昆虫细胞数量的比例为(3-4)pfu：1 cell。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，培养感染后的昆虫细胞4±2天。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，感染后的昆虫细胞的培养温度为25-30℃。

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