CN110577592A

CN110577592A - 一种重组人纤连蛋白肽

Info

Publication number: CN110577592A
Application number: CN201910949562.3A
Authority: CN
Inventors: 项琪; 黄亚东; 程雅婷; 曹苗苗
Original assignee: Medical And Biological Technology Research And Development Center Jinan Univ G
Current assignee: Guangzhou Jinan University Medical Biotechnology Research and Development Center Co.,Ltd.
Priority date: 2019-10-08
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2019-12-17
Anticipated expiration: 2039-10-08
Also published as: CN110577592B

Abstract

本发明属于基因工程领域，更具体地公开了一种重组人纤连蛋白肽。本发明公开的是密码子优化的重组人纤连蛋白肽基因，通过基因工程的方法在体外进行表达纯化。本发明提供的利用大肠杆菌作为表达宿主细胞，提供一种分子量小，且保留了纤连蛋白原本特性，可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平的重组人纤连蛋白肽。

Description

一种重组人纤连蛋白肽

技术领域

本发明涉及到基因工程领域，具体地说，涉及一种重组人纤连蛋白肽的制备方法。

背景技术

纤维连接蛋白（简称纤连蛋白）又称纤维结合蛋白、粘连蛋白、纤粘蛋白，英文名fibronectin，英文缩写Fn。纤维结合蛋白主要由肝脏及血管内皮细胞生成，广泛存在于动物组织和组织液中，是一种大分子糖蛋白，二聚体分子量约为450KD，具有多种生物活性。Fn分子在进化过程中保守性很强，各种动物体液中的Fn具有非常相近的结构、性质和生物学功能，因而不同来源的Fn可以相互替代使用。纤连蛋白可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平，缩短细胞生长时间，提高杂交瘤技术中细胞融合率等。

然而现有的纤连蛋白由于分子量过大加工性较差，并且大多从动物组织中提取，是一种异源蛋白，具有一定的排斥反应，同时具有潜在的携带病原体危害人体的风险。通过基因重组及生物工程技术直接生产出结构、特性、生物学功能与人类纤连蛋白极为相似的重组人纤连蛋白肽，不仅解决现有的纤连蛋白分子量过大，加工性较差的缺点，而且能够减少排异反应，规避感染疾病的风险，同时保留了人纤连蛋白的优良生物学性能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种分子量小，且保留了纤连蛋白原本特性，可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平的重组人纤连蛋白肽。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种重组人纤连蛋白肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在上述的重组人纤连蛋白肽中，其还包括用于蛋白纯化的His标签。

编码上述重组人纤连蛋白肽的核酸，并进行大肠偏好密码子优化，优化序列有SEQID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4；优选为SEQ ID NO.2。其还包括用于蛋白纯化的His标签。

一种用于表达上述重组人纤连蛋白肽的载体，为pET-28a、pET-20b或pQE-30。

一种宿主细胞，其包括上述的表达载体，为M15或BL21(DE3)。

一种上述重组纤连蛋白的制备方法，包括如下步骤：（1）在宿主细胞中表达根据权利要求3或4或5所述的核酸；（2）收集和/或纯化所述重组人纤连蛋白肽。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明截取纤连蛋白氨基酸序列第12~14区域，得到了分子量小，且保留了纤连蛋白原本特性的重组纤连蛋白，可促进细胞生长，提高细胞贴壁率，增强细胞代谢水平。本发明获得的重组纤连蛋白兼具纤连蛋白的特性，能使创伤面修复再生，复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。该重组纤连蛋白具有人源化，免疫原性低，不易发生过敏反应的突出优点。同时也可以作为组织工程、药学或美容护肤领域的活性添加剂。

附图说明

图1为大肠杆菌重组表达质粒pET20b-Fnp的构建图谱。

图2 为重组蛋白Fnp基因片段扩增。泳道1为DL2000DNAmarker；泳道2表示扩增的重组蛋白Fnp基因，约840bp；泳道3为阴性对照。

图3为含重组蛋白Fnp的SDS-PAGE分析。a.M:蛋白分子量标准，泳道1、3、5分别对应未诱导的BL21(DE3) /pET20b-Fnp-1、BL21(DE3) /pET20b-Fnp-2、BL21(DE3) /pET20b-Fnp-3表达系统；泳道2、4、6分别对应已诱导的BL21(DE3) /pET20b-Fnp-1、BL21(DE3) /pET20b-Fnp-2、BL21(DE3) /pET20b-Fnp-3表达系统（将使用序列SEQ ID NO: 2的表达菌命名为BL21(DE3) /pET20b-Fnp-1，使用序列SEQ ID NO:3的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2，使用序列SEQ ID NO:4的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3）。结果显示，BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1表达量均高于BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2和BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3的表达量。后面实验使用的序列默认为SEQ ID NO: 2。

图4为含重组蛋白Fnp纯化后样品的SDS-PAGE与Western blot分析。a. M:蛋白分子量标准，泳道1：Fnp纯化后样品；b： M：蛋白分子量标准，泳道1：Western blot鉴定Fnp。结果显示，纯化后的Fnp蛋白可见少部分二聚体。

图5为Fnp蛋白对HaCat细胞的促粘附作用。结果显示，市售牛纤连蛋白可提高HaCat（ATCC No:CM-1252）细胞粘附率，本专利的Fnp在0.0781nmol/mL~1.250 nmol/mL之间的粘附作用优于市售牛纤连蛋白。

图6为Fnp蛋白对HaCat细胞的划痕愈合作用。结果显示给药24h后，与空白组相比，蛋白浓度为10nmol/mL的Fnp促细胞划痕愈合效果明显优于空白对照组和10nmol/mL的市售牛纤连蛋白。

图7 为CS-Glu/PEG-BA水凝胶中HUVEC细胞的形态和分布图。

培养时间：A) 6h；B) 72h ；C) 168h； D-F为A-C对应的图像。结果显示细胞培养72h和168h 后，本发明的Fnp（200ug/mL）促进HUVEC细胞粘附CS-Glu/PEG-BA水凝胶的效果明显优于空白对照组。

具体实施方式

下面结合附图对本发明进一步说明，但是本领域技术人员应该理解本发明并不限于这些具体的实施例。

除非另外指明，下述实施例中所用的空质粒均为可商购获得的质粒。重组质粒采用常规分子克隆方法构建。

实施例1：重组人纤连蛋白肽在大肠杆菌中表达

1 构建重组表达人纤连蛋白肽的表达载体：

将编码重组人纤连蛋白肽的DNA片段(SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3 、SEQ ID NO.4，将使用序列SEQ ID NO: 2的表达菌命名为BL21(DE3) /pET20b-Fnp-1，使用序列SEQ ID NO:3的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2，使用序列SEQ ID NO:4的表达菌命名为BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3。BL21(DE3) /pET20b-Fnp-1、BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2、BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3的诱导结果如图3所示，结果显示，BL21(DE3)/pET20b-Fnp-1表达量均高于BL21(DE3)/pET20b-Fnp-2和BL21(DE3)/pET20b-Fnp-3的表达量。后面实验使用的序列默认为SEQ ID NO: 2。)送到金唯智生物科技有限公司进行全基因合成，在所述Fnp核苷酸序列的5’端和3’端分别加入Nde1和Hind111(TAKARA Co.Ltd)酶切位点，利用Nde1和Hind111双酶切表达载体pET20b（Tiandz，货号60908-2782）并进行回收，将回收的片段与合成产物用T4 DNA连接酶连接以构建重组质粒pET-20b-Fnp。

2 重组人纤连蛋白肽的表达：

将表达空菌株BL21(DE3) (Invitrogen Co.Ltd)在LB固体培养平板上划线培养过夜。从平板培养基上挑取单菌落接种至LB液体培养基中，37℃摇床内200rpm培养过夜。次日以1％转接量接种到新鲜LB液体培养基中37℃摇床内200rpm培养2-3小时至OD600＝0.3-0.5。4℃，4000rpm 离心10min，弃上清。然后用冰预冷的0.1M CaCl₂重悬菌体沉淀，冰浴30min。4000rpm/min离心10min，弃上清，用冰预冷的0.1M CaCl2重悬菌体沉淀，同时加入终体积15％-20％的灭菌甘油，混匀后置于冰上。取出 0.1μg重组表达质粒pET20b-Fnp，加入到上述准备好的感受态细胞中，42℃热激法转化后培养过夜。利用PCR技术鉴定阳性重组子pET20b-Fnp。挑取阳性重组子接种到LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃、200rpm培养至OD600＝0.6-0.8，1mM IPTG诱导4 小时，收集菌体，加入20mM的磷酸盐缓冲液(pH7.0)重悬菌体。利用超声波破碎仪破碎细胞。18000rpm离心30分钟，收集上清。SDS-PAGE检测和分析Fnp蛋白的表达，重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达，其分子量约为30kDa。

实施例2

将实施例1所得人工合成重组人纤连蛋白肽的基因序列（SEQ ID NO.2 、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4），在5’端和3’端分别引入Nde I和Hind 111酶切位点，通过Nde I/ Hind111双酶切将其连入pET20b载体，由此得到pET20b-Fnp重组质粒。将此重组质粒导入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中培养，以IPTG诱导表达Fnp蛋白，通过镍亲和层析得到纯化的蛋白，通过 SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白的分子量大小和免疫学验证，并检验其生物活性。具体步骤如下：

(1)pET20b-Fnp重组质粒构建与鉴定：本发明采用人工方法合成纤连蛋白基因肽序列，在5’端和3’端分别引入Nde I和Hind 111酶切位点。为方便后续纯化，在5’端起始密码之后加上组氨酸标签，通过Nde I/ Hind 111双酶切将其连入pET20b载体，得到pET20b-FN重组质粒并转化TOP10感受态细胞，在LB(Amp)培养基中挑选阳性克隆。以LB(Amp)平板的单克隆为模板，加入两端引物FnpF(SEQ ID NO.5)和FnpR(SEQ ID NO.6)，再加入Premix Taq™预混酶，按照 PCR反应条件（95℃ 变性10min后进入循环，循环参数第一步为95℃变性60秒，60℃退火30秒， 72℃延伸60秒，30个循环）进行目的片段的扩增。核酸电泳检测目的片段大小。结果如图2所示，获得了目标片段。

(2)Fnp蛋白的表达：将基因表达载体转化如感受态细胞BL21(DE3)，并在LB(Amp)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，接种于LB(Amp)培养中，37℃培养3-5h至OD600为0.5时，加入 IPTG至终浓度为1mM，37℃诱导培养约4h，离心收集菌体

(3)Fnp蛋白的纯化：将发酵所得菌体加入pH7.0PBS缓冲液，采用均质机400bar进行破碎后18000rpm离心20min，将收集得到的上清经镍柱纯化，上样流速0.6mL/min。用pH7.0PBS缓冲液平衡后，采用咪唑梯度洗脱，在300mM时收集流出峰，洗脱样品经G25脱盐，即得到高纯度的蛋白。通过SDS-PAGE蛋白胶以及Western blotting对重组蛋白的分子量大小和免疫学验证(抗体为6X-His tag多克隆抗体，购自赛默飞生物世尔科技，如图4所示)。

实施例3

(1)Fnp蛋白细胞粘附性测定：将HaCat细胞用含10％FBS的DMEM培养，37℃，CO₂浓度5％；首先用 PBS清洗一次，然后添加0.25％的胰酶液进行消化，离心收集细胞；用 DMEM进行重悬，细胞密度控制在6.2×10⁴个/mL，将细胞悬液接种到底层铺有Fnp蛋白膜的培养皿中，细胞密度控制在1.5×10⁴个/mL。37℃培养5h，维持CO₂浓度为 5％；用PBS冲洗掉没有贴壁的细胞；在相差显微镜下计数以及用MTT法比较各组细胞数。阳性对照一组：铺有市售牛纤连蛋白。结果见图5，结果显示：市售牛纤连蛋白可提高HaCat（ATCC No:CM-1252）细胞粘附率，本专利的Fnp在0.0781nmol/mL~1.250 nmol/mL之间的粘附作用优于市售牛纤连蛋白。

(2)Fnp蛋白划痕实验：将处于对数生长期的Balb/c-3T3 细胞用含10％FBS的1640培养基(购自美国Gibco公司)常规培养至 80％～90％汇合，用0.25％胰酶消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜细胞长满板底后，用100ul枪头垂直于孔板，沿板背面划线的相同位置制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入含Fnp蛋白（浓度10nmol/mL）的含1%血清的培养基，拍照记录。将培养板放入培养箱培养24h取出拍照。结果如图6所示，结果显示给药24h后，与空白组相比，蛋白浓度为10nmol/mL的Fnp促细胞划痕愈合效果明显优于空白对照组和10nmol/mL的市售牛纤连蛋白。

(3)细胞在凝胶上的生长状态

取1mL2%CS-Glu（壳聚糖-谷氨酸）溶液，加入200ug/mL的Fnp蛋白溶液，混匀，加入50μl ，200 μg/mL的PEG-BA(四臂聚乙二醇苯甲醛)溶液，涡旋混匀，加如24孔板中，每孔500ul预凝胶溶液，静置5min，待其形成凝胶后，每孔加入1ml培养基，37℃静置过夜，24h后，消化重悬HUVEC细胞，每孔加入5×10⁴个/mL，分别在6h、72h、168h在荧光显微镜下观察。结果如图7所示，结果显示细胞培养72h和168h 后，本发明的Fnp（200μg/mL）促进HUVEC细胞粘附CS-Glu/PEG-BA水凝胶的效果明显优于空白对照组。

序列表

<110> 广州暨南大学医药生物技术研究开发中心

<120> 一种重组人纤连蛋白肽

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

His Met His His His His His His Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe

1 5 10 15

Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn

20 25 30

Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr

35 40 45

Gly Pro Met Phe Val Ala Gln Cys His Pro Phe Ser Cys Ala Arg Lys

50 55 60

Phe His Gly Leu Met Val Asp Cys Thr Cys Leu Val Ser Val Tyr Ala

65 70 75 80

Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr

85 90 95

Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr

100 105 110

Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr

115 120 125

Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln

130 135 140

Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln

145 150 155 160

Pro Gly Thr Asp Tyr Thr Val Gly Met Gln Trp Leu Asn Asp Asn Ala

165 170 175

Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro

180 185 190

Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Arg Tyr

195 200 205

His Gln Arg Thr Asn Thr Asn Val Met Pro Trp Phe Val Pro Val Thr

210 215 220

Glu Gly Ala Glu Ala Leu Thr Ala Arg Val Asn Leu Asn Leu Pro Gly

225 230 235 240

Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr

245 250 255

Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile

260 265 270

Gly Arg Lys Lys Thr Lys Leu

275

<210> 2

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

catatgcatc atcatcatca tcatccggcg ccgaccgatc tgaaatttac ccaggtgacc 60

ccgaccagcc tgagcgcgca gtggaccccg ccgaatgtgc agctgaccgg ctatcgcgtg 120

cgcgtgaccc cgaaagaaaa aaccggcccg atgtttgttg ctcagtgtca tccatttagc 180

tgtgcaagaa aattccatgg cctgatggtg gattgtactt gtctggtgag cgtgtatgcg 240

ctgaaagata ccctgaccag ccgcccggcg cagggcgtgg tgaccaccct ggaaaatgtg 300

agcccgccgc gccgcgcgcg cgtgaccgat gcgaccgaaa ccaccattac cattagctgg 360

cgcaccaaaa ccgaaaccat taccggcttt caggtggatg cggtgccggc gaatggccag 420

accccgattc agcgcaccat taaaccggat gtgcgcagct ataccattac cggcctgcag 480

ccgggcaccg attatactgt ggggatgcag tggctgaatg ataatgcgcg cagcagcccg 540

gtggtgattg atgcgagcac cgcgattgat gcgccgagca atctgcgctt tctggcgacc 600

accccgaata gcctgctgag ataccatcag agaacaaaca ctaatgtcat gccttggttt 660

gtacctgtta cggagggagc cgaggcttta actgcgagag taaacctgaa cctgccgggc 720

gtgaccgaag cgaccattac cggcctggaa ccgggcaccg aatataccat ttatgtgatt 780

gcgctgaaaa ataatcagaa aagcgaaccg ctgattggcc gcaaaaaaac ctaaaagctt 840

<210> 3

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

catatgcatc atcatcatca tcatccggcg ccgaccgatc tgaaatttac tcaagtgact 60

ccgactagcc tgagcgcgca atggactccg ccgaatgttc agctgaccgg ctatcgtgtg 120

cgtgttactc cgaaggaaaa aactggcccg atgtttgttg ctcaatgtca tccattcagc 180

tgtgcaagaa agtttcatgg cctgatggtt gattgtactt gtctggtgag cgtttatgcg 240

ctgaaagata ctctgactag ccgtccggcg cagggcgttg ttactactct ggaaaatgtt 300

agcccgccgc gccgtgcgcg tgttaccgat gcgaccgaaa ccactattac tattagctgg 360

cgcactaaga ccgaaactat tactggcttt caggttgatg cggttccggc gaatggccag 420

actccgattc agcgtactat taaaccggat gttcgcagct atactattac tggcctgcag 480

ccgggcactg attatactgt tgggatgcag tggctgaatg ataatgcgcg tagcagcccg 540

gttgttattg atgcgagcac tgcgattgat gcgccgagca atctgcgttt cctggcgact 600

acaccgaaca gcctcctccg ctaccatcaa agaacaaaca ctaatgttat gccttggttc 660

gttcctgtta cggagggagc cgaggcttta actgcgagag ttaacctgaa cctgccgggc 720

gttactgaag cgaccattac cggcctggaa ccgggcaccg aatataccat ttatgtgatt 780

gcgctgaaaa ataatcagaa aagcgaaccg ctgattggcc gcaaaaaaac ctaaaagctt 840

<210> 4

<211> 840

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

catatgcatc atcatcatca tcatccggcg ccgaccgatc tgaaatttac ccaagtgacc 60

cctacatcac tgagcgcgca gtggacgccg ccgaacgtgc aactgaccgg ctatcgcgtg 120

cgcgttacac cgaaggaaaa gactggcccg atgtttgttg ctcaatgtca tccattcagc 180

tgtgcaagaa aatttcatgg cctgatggtt gattgtactt gtctggtgag cgtttatgcg 240

ctcaaagata ccttaaccag ccgccctgcg cagggcgttg ttaccaccct ggaaaatgtt 300

agccctccgc gtcgcgcgcg cgttaccgat gcgaccgaaa ccaccattac cattagctgg 360

cggacaaaga cagaaacaat cacaggattc caagtggatg cggttccggc gaatggccag 420

acccctattc agcgcaccat taagcctgat gttcgcagct ataccattac cggcctgcag 480

ccgggcaccg attatactgt tgggatgcag tggctgaatg ataatgcgcg cagcagcccg 540

gtggtgatag atgctagtac agctatagat gcgcctagca atttacgctt cctggcgacc 600

acccctaata gcctgctgag ataccatcaa agaacaaaca ctaatgttat gccttggttt 660

gttcctgtta cggagggagc cgaggcttta actgcgagag ttaacctgaa cctgcctgga 720

gttaccgaag cgaccattac cggcctggaa cctggcaccg aatataccat ttatgtgatc 780

gcgctgaaaa ataatcagaa aagcgaaccg ctgattggcc gcaaaaaaac ctaaaagctt 840

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

cggcgccgac cgatctgaaa ttta 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

ttaggttttt ttgcggccaa tcagc 25

Claims

1.一种重组人纤连蛋白肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的重组人纤连蛋白肽，其还包括用于蛋白纯化的His标签。

3.编码根据权利要求1或2所述的重组人纤连蛋白肽的核酸，并进行大肠偏好密码子优化，优化序列有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4。

4.根据权利要求1所述的核酸，其序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求3所述的核酸，其还包括用于蛋白纯化的His标签。

6.一种用于表达上述重组人纤连蛋白肽的载体，其特征在于为pET-28a、pET-20b或pQE-30。

7.一种宿主细胞，其包括权利要求6所述的表达载体，其特征在于为M15或BL21。

8.一种权利要求1或2所述的重组纤连蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：（1）在宿主细胞中表达根据权利要求3或4或5所述的核酸；（2）收集和/或纯化所述重组人纤连蛋白肽。