EA003195B1 - Способ повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса - Google Patents

Abstract

Описаны способы повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса. В данных способах соответствующие клетки-мишени, инфицируемые с помощью соответствующего ретровируса в присутствии либо смеси из эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, либо эффективного количества функционального материала, обладающего этими связывающими доменами на одной и той же молекуле. Данные функциональные материалы могут использоваться без иммобилизации или с иммобилизацией на шариках. Данные способы пригодны, например, для генной терапии. Кроме того, раскрываются культуральные среды для клеток-мишеней, используемые в указанных способах, способы локализации ретровируса для генного переноса, а также штамм эукариотических клеток, трансдуцированных чужеродным геном, способный быть использованным для клеточной трансплантации.

Description

Настоящее изобретение относится к способам повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени. Эти способы позволяют эффективно трансформировать клетки-мишени в различных областях техники, таких как медицинская наука, клеточная технология, генная инженерия и технология развития, и многими методами с ними связанных.

Предпосылки изобретения

Благодаря постижению механизмов многих болезней человека, а также быстрому прогрессу в технологии рекомбинантных ДНК и в технологии генного переноса, в последнее время разработали условия применения соматической генной терапии для лечения серьезных генетических болезней. Кроме того, в настоящее время активизировались попытки применить генную терапию не только для лечения генетических болезней, но также для лечения вирусных инфекций, таких как ЛГОЗ и рак.

Почти все эксперименты по переносу соответствующего гена у человека, одобренные в прошлом Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США) (ТЭЛ). представляют собой трансдукцию клеток с помощью ретровирусных векторов. Ретровирусные векторы могут эффективно переносить нужный экзогенный ген в клетки для стабильной интеграции данного экзогенного гена в хромосомной ДНК, и, поэтому, в частности, они представляют собой предпочтительные средства генного переноса для генной терапии, в которой необходима долговременная экспрессия гена. Такие векторы создавали разнообразными способами, чтобы избежать неблагоприятного воздействия на трансдуцируемые организмы. Например, исключали репликационные функции векторов, чтобы предотвратить не ограничиваемую повторяемость заражения (трансдукцию), обусловленную ауторепликацией данных векторов, используемых для переноса гена в клетки. Поскольку эти векторы (дефектные по репликации ретровирусные векторы) не обладают способностью к ауторепликации, обычно ретровирусные векторы, упакованные в вирусные частицы, получают путем использования клеток-продуцентов ретровируса (упаковывающие клетки).

С другой стороны, клетки костного мозга представляют собой хорошую мишень для терапии соматического гена, поскольку с клетками костного мозга легко манипулировать в условиях ίη νίΐτο и они содержат гемопоэтические стволовые клетки, способные к ауторепликации. Альтернативно, человеческая пуповинная кровь, как ранее было показано, содержит большое количество незрелых предшественников клеток, в том числе гемопоэтических стволовых клеток. Когда генную терапию осуществляли путем переноса гена в эти клетки-мишени^1> и транс плантировали их в живой организм, перенесенный таким образом ген, экспрессируемый длительное время в кровяных клетках, оказывая пожизненное лечебное действие.

Однако, несмотря на интенсивные исследования в разных группах, гемопоэтические стволовые клетки представляют собой клетки, одни из тех, чье эффективное трансдуцирование является трудным. В прошлом наиболее эффективными условиями переноса гена, относящегося к гемопоэтическим стволовым клеткам мыши и других животных, являлось сокультивирование гемопоэтических стволовых клеток с клетками-продуцентами ретровируса. Однако для клинической генной терапии человека более желательна бесклеточная трансдукция, связанная с биологической безопасностью. К сожалению, эффективный перенос гена в гемопоэтические стволовые клетки, как правило, невозможен без сокультивирования с клеткамипродуцентами ретровируса.

Недавно было сообщено, что эффективность переноса гена с помощью ретровирусов можно повысить с помощью компонента внеклеточного матрикса, фибронектина, или, исключительно, с помощью его фрагментов (1. Οΐίη. Ιηνθδΐ., 93, рр. 1451-1457 (1994); Βίοοά, 88, рр. 855-862 (1996)). Кроме того, обнаружили также, что фрагменты фибронектина, полученные с помощью генной инженерии, обладают такими же свойствами и, при их использовании, может быть осуществлен эффективный перенос экзогенного гена в гемопоэтические стволовые клетки (АО 95/26200). Связывание домена фибронектина, связывающего гепарин с ретровирусом, означает участие фибронектина в таком улучшении эффективности генного переноса. Во всех этих способах, использующих фибронектин и фрагменты фибронектина, клетки инфицировали с помощью ретровирусов на планшетах, на которых иммобилизовали фибронектин или его фрагменты.

Цели изобретения

Обсуждается осуществление вышеописанных способов переноса гена, с использованием фибронектина и фибронектиновых фрагментов с помощью молекул фибронектина или его фрагментов, обладающих доменом, связывающим ретровирус, и доменом на этой же молекуле, связывающим клетку-мишень (№11игс Меб1еше, 2, рр. 876-872 (1996)). Поэтому для эффективного генного переноса в различные клеткимишени с использованием вышеупомянутого способа, необходимо приготовить функциональный материал, обладающий обоими доменами, связывающим вирус и связывающим клетку-мишень, на одной молекуле, в соответствующих отдельных клетках, и еще остается проблема в его использовании в качестве обычного способа переноса гена.

Далее вышеописанный способ генного переноса осуществляют путем иммобилизации фибронектина или фибронектинового фрагмента на поверхности планшета, используемой для культивирования клеток-мишеней после заражения ретровирусами. Однако для иммобилизации на планшете необходимы сложные методики и это не свидетельствует о простоте и удобстве способа переноса гена.

Более того, соответствующий функциональный материал, используемый в вышеописанном способе генного переноса, ограничен в том, что имеющийся домен, связывающий гепарин, получают из фибронектина в качестве домена, связывающего ретровирус. Следовательно, существуют возможности создать улучшенный способ переноса гена при обнаружении любого другого вещества, связывающего ретровирус.

Цель настоящего изобретения заключается в решении этого вопроса и в создании более удобного и эффективного способа переноса гена.

Краткое изложение существа изобретения

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ретровирусное инфицирование с помощью функционального материала, обычно, фибронектина или его фрагмента, можно стимулировать, даже когда область, обладающая доменом, связывающим ретровирус, и область, обладающая доменом, связывающим клетку, не представлены на одной и той же молекуле. Другими словами, авторы настоящего изобретения обнаружили, что эффективность переноса гена с помощью ретровирусов в клетки-мишени можно повысить путем использования эффективного количества функционального материала, содержащего домен, связывающий ретровирус, смешанного с функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клеткумишень.

Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили также, что ретровирусная инфекция, усиливающая активность с помощью функционального материала, может наблюдаться даже когда этот функциональный материал не иммобилизован на поверхности планшета. Авторы настоящего изобретения обнаружили, кроме того, что эффективность переноса гена в клетки-мишени можно повысить путем контактирования ретровирусов с этими клеткамимишенями в присутствии функционального материала, иммобилизованного на шариках.

Вдобавок, авторы настоящего изобретения далее обнаружили вещество, связывающее ретровирус, которое не содержит домена, связывающего гепарин, происходящего из фибронектина, и также обнаружили, что этот материал и его производные пригодны для переноса гена в клетки-мишени с помощью ретровирусов. Более того, авторы настоящего изобретения добились создания функциональных материалов, пригодных для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. В итоге было создано настоящее изобретение.

Итак, первый аспект настоящего изобретения связан со способом повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. Этот способ предназначен для трансдукции клеток-мишеней с помощью ретровируса и характеризуется инфицированием соответствующих клеток-мишеней с помощью соответствующего ретровируса в присутствии смеси из эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, чтобы дать возможность перенести соответствующий ген в эти клеткимишени.

Соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используемый для этой первой цели настоящего изобретения, специфически не ограничен и, например, он представляет собой функциональный материал, выбранный из определенной группы, состоящей из связывающего Гепарин-ΙΙ домена фибронектина, фактора роста фибробластов, коллагена, полилизина и их функциональных эквивалентов. Соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку-мишень, может представлять собой вещество, содержащее лиганд, которое может связываться с клеткамимишенями. В качестве лиганда выступают клеточные адгезионные белки, гормоны, цитокины, антитела, цепочки сахара, углеводы и метаболиты клеток-мишеней и т.п. Примеры адгезионных белков включают полипептиды домена фибронектина, связывающего клетку. Так же как и этот домен фибронектина, связывающий клетку, существуют полипептиды домена, связывающегося с УБА-5 и/или УБА-4. Кроме того, другие примеры лиганда включают эритропоэтин.

Указанный функциональный материал, используемый для первой цели настоящего изобретения, может применяться без иммобилизации или может быть иммобилизован, и, при иммобилизации на шариках, удобен в применении. Кроме того, когда лиганд, специфичный для клеток-мишеней, выбран в качестве функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку, первый аспект настоящего изобретения дает возможность удобно трансдуцировать предполагаемые клетки-мишени.

Как описано выше, в традиционных способах, которые раскрыты в АО 95/26200 и №1иге Меб1С1ие рассматривается основной механизм повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса для совместной локализации ретровируса и клетокмишеней на функциональном материале, обладающем и доменом, связывающим ретровирус и доменом, связывающим клетку-мишень на одной и той же молекуле. Однако в соответствии с настоящим изобретением, эффективность генного переноса в клетки-мишени можно повысить путем осуществления генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса в присутствии смеси эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клеткумишень.

Второй аспект настоящего изобретения относится к культуральной среде для клетокмишеней, используемой для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов, которая включает смесь эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективное количество другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень.

Благодаря использованию культуральной среды из второго аспекта настоящего изобретения, можно удобным образом осуществить указанный первый аспект настоящего изобретения.

Третий аспект настоящего изобретения относится к способу локализации ретровирусов и данный способ отличается инкубированием культуральной среды, содержащей ретровирус, контактируемый со смесью эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень.

Четвертый аспект настоящего изобретения относится к набору, используемому для осуществления ретровирус-опосредованного генного переноса в клетки-мишени и данный набор включает

a) эффективное количество функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и/или эффективное количество другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клеткумишень;

b) синтетический субстрат для инкубирования клеток-мишеней и ретровируса; и

c) ростовой фактор клетки-мишени для предварительной стимуляции соответствующих клеток-мишеней.

Благодаря применению реагентного набора из четвертого аспекта настоящего изобретения, можно удобно осуществить первый и третий аспекты настоящего изобретения.

Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу, повышающему эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов и данный способ отличается тем, что эти клетки-мишени инфицированы соответствующим ретровирусом в присутствии эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, а также доменом, связывающим ретровирус, полученным из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, или его функционального эквивалента, на одной и той же молекуле, чтобы дать возможность трансдуцировать данные клетки-мишени.

В вышеуказанных традиционных способах, которые описаны в XVО 95/26200 и №11игс Мебюше, фибронектиновые фрагменты раскрыты в качестве материала, который может использоваться для наиболее эффективного способа по улучшению генного переноса в клеткимишени с помощью ретровирусов. Однако, что касается функциональных материалов, иных, чем фибронектиновые фрагменты, не существует конкретного описания того, какого рода функциональный материал может применяться для эффективного способа генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. В частности, в традиционном способе описан лишь 12-14 повтор в фибронектине в качестве домена, связывающего данный ретровирус.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что фактор роста фибробластов, коллаген, полилизин и другие, которые не обладают какой-либо структурной связью с этим повтором 12-14 фибронектина, могут эффективно использоваться в способе по улучшению генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. По этой причине любой функциональный эквивалент этих материалов, т. е. любой материал, который обладает доменом, связывающим ретровирус, функционально эквивалентен этим материалам и может повышать эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса, может использоваться для осуществления пятой цели настоящего изобретения.

Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения в качестве домена, связывающего клетку-мишень, может использоваться материал, обладающий лигандом, который может связываться с клетками-мишенями, и этот материал присоединен к домену, связывающему ретровирус.

Примеры соответствующего лиганда включают клеточные адгезионные белки, гормоны, цитокины, антитела, цепочки сахара, углеводы, метаболиты клеток-мишеней и т.п. Примеры клеточных адгезионных белков включают полипептиды связывающего клетку домена фибронектина. Например, полипептиды домена, связывающегося с УЬА-5 и/или УЬА-4, могут использоваться в настоящем изобретении. Кроме того, другие примеры лиганда включают эритропоэтин.

Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения в качестве фактора роста фибробластов, используемого в качестве домена, связывающего ретровирус, существуют фак003195 торы роста фибробластов, выбранные, например, из фактора роста фибробластов, представленного с помощью δΕβ. ΙΌ Νο. 3 в списке последовательностей, функционально эквивалентные фактору и полипептидам, содержащим данный фактор, или его функциональные эквиваленты.

Примеры этих функциональных материалов включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в δΕβ. ΙΌ Νο. 4 и 5 данного списка последовательностей.

Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения коллагены, используемые в качестве домена, связывающего ретровирус, включают, например, коллагены, выбранные из коллагенового фрагмента, содержащего домен, связывающий инсулин, получаемого из коллагена типа V, функциональных эквивалентов соответствующих фрагментов и полипептидов, содержащих соответствующие фрагменты или их функциональный эквивалент. Кроме того, примеры таких фрагментов включают фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в δΕβ. ΙΌ Νο. 6 данного списка последовательностей.

Примеры этих функциональных материалов включают полипептиды, представленные в δΕβ. ΙΌ Νο. 7 и 8 данного списка последовательностей.

Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения полилизин, используемый в качестве домена, связывающего ретровирус, представляет собой полимер Ь-лизина и, например, один из них, обладая подходящим уровнем полимеризации, может быть выбран из коммерчески доступных продуктов и использован.

Если домен, связывающий ретровирус, получен из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, который одновременно обладает доменом, связывающим клетку-мишень, эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровирусов можно повысить путем инфицирования клеток-мишеней с помощью ретровируса в присутствии эффективного количества домена, связывающего данный ретровирус, полученного из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Если клетки-мишени представляют собой адгезионные клетки, ретровирус и клетки-мишени, соответственно, связываются и приклеиваются к данному функциональному материалу, эффективность генного переноса в данные клеткимишени с помощью ретровируса может быть повышена путем инфицирования этих клетокмишеней с помощью ретровируса в присутствии соответствующего эффективного количества домена, связывающего данный ретровирус, полученный из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина.

Было также обнаружено, что если полипептид, представленный в δΕβ. ΙΌ Νο. 1 списка последовательностей (именуемый ниже как Н271), обладает одновременно доменом, связывающим клетку-мишень, т.е., если клеткимишени связываются с полипептидом Н-271, то эффективность генного переноса в эти клеткимишени с помощью ретровируса можно повысить путем инфицирования данных клетокмишеней с помощью соответствующего ретровируса в присутствии эффективного количества данного полипептида.

Другими словами, хотя домен, связывающий соответствующий ретровирус, описанный выше в №Шгс МеЛеше, обладает лишь повтором 12-14 фибронектина, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что Н271 эффективно действует в качестве домена, связывающего клетку-мишень, в соответствии с конкретным видом клеток-мишеней, чтобы улучшить эффективность генного переноса в данные клетки-мишени. Кроме того, в случае когда клетки-мишени представляют собой адгезионные клетки, эти клетки-мишени и ретровирус, соответственно, связываются и слипаются с данным полипептидом, а эффективность генного переноса в эти клетки-мишени с помощью соответствующего ретровируса может быть улучшена путем инфицирования данных клетокмишеней с помощью данного ретровируса в присутствии эффективного количества данного полипептида.

Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения, функциональный материал может использоваться без иммобилизации или может быть иммобилизован, однако иммобилизация является предпочтительной для случая, в котором клетки-мишени представляют собой прилипающие клетки.

Шестой аспект настоящего изобретения связан с культуральной средой для клетокмишеней, используемой для генного переноса в соответствующие клетки-мишени с помощью ретровируса, которая включает эффективное количество функционального материала, который обладает доменом, связывающим клеткумишень, а также доменом, связывающим ретровирус, полученным из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, или их функционального эквивалента, на одной и той же молекуле.

Седьмой аспект настоящего изобретения относится к способу локализации ретровируса, который включает инкубирование культуральной среды, содержащей соответствующий ретровирус, контактируемый с эффективным количеством функционального материала, содержащего домен, связывающий ретровирус, получаемый из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Эти функциональные материалы могут эффективно использоваться для локализации ретровируса для улучшения генно го переноса в клетки-мишени с помощью данного ретровируса.

Сверх того, данный способ локализации ретровируса настоящего изобретения включает инкубацию данного ретровируса, контактируемого с эффективным количеством функционального материала, включающего домен, который связывается с клеткой-мишенью, а также домен, связывающий ретровирус, полученный из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, или их функционального эквивалента, на одной и той же молекуле.

Восьмой аспект настоящего изобретения заключается в использовании набора для осуществления ретровирус-опосредованного генного переноса в клетки-мишени и данный набор включает

a) эффективное количество функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, а также доменом, связывающим клетку-мишень, полученным от фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина или их функционального эквивалента, на одной и той же молекуле;

b) синтетический субстрат для инкубирования клеток-мишеней, контактируемых с ретровирусом; и

c) фактор роста клетки-мишени для предварительной стимуляции соответствующих клеток-мишеней.

На практике могут быть соответственно использованы любой способ первого и пятого аспектов, любая культуральная среда второго и шестого аспектов, любой способ третьего и седьмого аспектов и любой набор четвертого и восьмого аспектов настоящего изобретения, соответствующие функциональные материалы, иммобилизованные на шариках.

Девятый аспект настоящего изобретения относится к способу повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса и отличается тем, что данные клетки-мишени инфицированы с помощью ретровируса в присутствии эффективного количества функционального материала, иммобилизованного на шариках, выбранных из практически чистого фибронектина, практически чистого фибронектинового фрагмента или их смеси, чтобы дать возможность трансдуцировать данные клетки-мишени с помощью данного ретровируса.

Десятый аспект настоящего изобретения также связан со способом повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса и отличается тем, что данные клетки-мишени инфицированы с помощью ретровируса в присутствии эффективного количества функционального материала, выбранного из практически чистого фибронектина, практически чистого фибронектинового фрагмента или их смеси без иммобилизации, чтобы дать возможность трансдуцировать данные клетки-мишени с помощью соответствующего ретровируса.

В вышеуказанных традиционных способах, которые раскрыты в АО 95/26200 и №1Шга1 Мебюше, основной механизм повышения эффективности генного переноса с помощью ретровируса заключается в том, что ретровирус и клетки-мишени должны быть солокализованы на функциональном материале, обладающем доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень на одной и той же молекуле. В этих способах указанная солокализация и ретровируса и клеток-мишеней на функциональном материале, обладающем и доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле, становится возможной, благодаря иммобилизации данного функционального материала, обладающего доменом, связывающим соответствующий ретровирус, и доменом, связывающим соответствующую клетку-мишень, на одной и той же молекуле на культуральном субстрате.

Однако в соответствии с настоящим изобретением, даже при использовании практически чистого фибронектина, практически чистого фибронектинового фрагмента или их смеси, неожиданно (обнаружилось, что) эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса может быть эффективно повышена путем использования соответствующего функционального материала, обладающего и доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень на одной и той же молекуле без иммобилизации на культуральном субстрате.

Как соответствующие клетки-мишени, используемые в указанных первом, пятом, девятом и десятом аспектах настоящего изобретения, могут использоваться, например, клетки, выбранные из: стволовых клеток, гемопоэтических клеток, не адгезирующих при низкой плотности моноядерных клеток, адгезирующих клеток, клеток костного мозга, гемопоэтических стволовых клеток, стволовых клеток периферической крови, клеток пуповинной крови, гемопоэтических стволовых клеток плода, эмбриопластических стволовых клеток, эмбриональных клеток, первичных половых клеток, ооцитов, оогоний, яйцеклеток, сперматоцитов, сперматозоидов, ΟΌ34⁺ клетки, С-кб' клетки, мультипотентных предшественников гемопоэтических клеток, унипотентных предшественников гемопоэтических клеток, эритроцитарных клеток-предшественников, лимфоцитарных клетокпредшественников, зрелых клеток крови, лимфоцитов, В-клеток, Т-клеток, фибробластов, нейробластов, клеток нервов, эндотелиальных клеток, ангиоэндотелиальных клеток, гепатоцитов, миобластов, клеток скелетной мускулатуры, клеток гладкой мускулатуры, раковых клеток, миеломных клеток и лейкозных клеток.

Как соответствующий ретровирус, используемый для первого, третьего, пятого, седьмого, девятого и десятого аспектов настоящего изобретения, можно использовать ретровирус, содержащий экзогенный ген, и этот ретровирус может представлять собой, например, рекомбинантный ретровирусный вектор. Кроме того, этот ретровирус может представлять собой, например, дефектный по репликации рекомбинантный ретровирусный вектор.

Одиннадцатый аспект настоящего изобретения связан с трансдуцируемыми клетками, получаемыми в соответствии с первым, пятым, девятым или десятым аспектом настоящего изобретения.

Двенадцатый аспект настоящего изобретения относится к способу трансплантирования клетки для трансплантирования соответствующих трансдуцированных клеток, в соответствии с одиннадцатым аспектом настоящего изобретения, позвоночному животному.

Тринадцатый аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, представленному 8 Ер. Ш Νο. 13 в списке последовательностей, который может повысить эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, или его функциональным эквивалентам.

Четырнадцатый аспект настоящего изобретения относится к гену, кодирующему указанный полипептид, согласно тринадцатому аспекту настоящего изобретения. Примеры такого гена включают ген, представленный 8 Ер. Ш Νο. 17 в списке последовательностей, или ген, который может гибридизовать с вышеуказанным геном в строгих условиях, и кодирует полипептид, который может повышать эффективность переноса данного гена в клетки-мишени с помощью ретровируса.

В вышеуказанных традиционных способах из \νθ 95/26200 и №1Шгс Мебюше, наиболее эффективный пептид, используемый для переноса гена, представляет собой СН-296. С другой стороны, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что этот же полипептид без домена, связывающего УЪЛ-5 и домена, связывающего УЪЛ-4, может использоваться в настоящем изобретении.

Пятнадцатый аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, представленному 8Ер. Ш Νο. 30 в списке последовательностей, который может повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, или к его функциональному эквиваленту.

Шестнадцатый аспект настоящего изобретения относится к гену, кодирующему указанный полипептид, согласно пятнадцатому аспекту настоящего изобретения. Примеры этого гена включают ген, представленный 8Ер. Ш Νο. 33 в списке последовательностей, или ген, который может гибридизовать с вышеуказанным геном в строгих условиях и кодирует полипептид, кото рый может повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса.

Семнадцатый аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, представленному 8Ер. Ш Νο. 5, который может повышать эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса, или к его функциональным эквивалентам.

Восемнадцатый аспект настоящего изобретения относится к гену, кодирующему полипептид, согласно семнадцатому аспекту настоящего изобретения. Примеры такого гена включают ген, представленный 8Ер. Ш Νο. 26 или ген, который может гибридизовать с вышеуказанным геном и кодирует полипептид, который может повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса.

Подробное описание настоящего изобретения

Для способа генного переноса настоящего изобретения обычно используются рекомбинантные ретровирусные векторы, и, в частности, подходящим является дефектный по репликации ретровирусный вектор. Способность к репликации у данного вектора исключали, чтобы предотвратить ауторепликацию в инфицируемых клетках, так, чтобы данный вектор не являлся патогенным. Эти векторы можно внедрять в хозяйские клетки, такие как клетки позвоночного животного, в частности, клетки млекопитающих, чтобы устойчиво интегрировать экзогенные гены, вставленные в эти векторы, в хромосомную ДНК хозяйских клеток.

В настоящем изобретении экзогенные гены, переносимые в клетки, могут использоваться путем их инсерцирования в ретровирусный вектор под контролем подходящего промотора, например, промотора ЕГК, представленного в ретровирусе, или экзогенного промотора. Кроме того, для того чтобы осуществить транскрипцию экзогенного гена, в векторе могут быть также представлены другие регуляторные элементы, которые взаимодействуют с промотором, и сайт инициации транскрипции, например, энхансер может также присутствовать в векторе. Более того, предпочтительно, инсерцируемый ген может обладать нижележащей терминаторной последовательностью. Этот экзогенный ген, переносимый в клетки, может быть природным или искусственным геном, и может обладать дополнительной молекулой ДНК, полученной из гетерологичных источников, присоединенной к нему путем лигирования или другими способами, известными в данной области.

Экзогенные гены, инсерцированные в ретровирус, могут представлять собой любые гены, представляющие интерес для трансдукции клеток. Например, эти экзогенные гены могут кодировать фермент, который ассоциирован с лечением болезни, белок, антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим или вспомогательный праймер (смотрите, напр., XVО 90/13641), внутриклеточное антитело (смотрите, напр., νΟ 94/02610), ростовой фактор и т.п.

Ретровирусные векторы, используемые в настоящем изобретении, могут обладать маркерным геном, для того чтобы трансдуцируемые клетки можно было легко селектировать. В качестве маркерного гена можно использовать, например, ген лекарственной устойчивости, который обеспечивает трансформированным клеткам устойчивостью к антибиотику, или репортерный ген, который наделяет трансформированные клетки ферментной активностью для их детектирования.

В качестве используемых векторов существуют ретровирусные векторы, такие как известный МРС-вектор (АТСС Νο. 68754), а-8ОС (АТСС N0. 68755) и др. Кроме того, N2/ ΖίρΤΚΝΕΟ-вектор (ΤΚΝΕΟ, Βίοοά, Уо1. 78, рр. 310-317 (1991)) и РМ5пео-вектор (Ехр. Нета1о1., νοί. 23, рр. 630-638 (1995)) оба, используемые в нижеприводимых примерах, содержат гены устойчивости к неомицину (неомицинфосфотрансферазный ген) в качестве своих маркерных генов. Поэтому, клетки, трансформированные с помощью этих векторов, могут распознаваться в качестве клеток, обладающих устойчивостью к антибиотикам (неомицину, С418, и др.), инактивируемых продуктами данных генов. Более того, эти векторы можно получить в виде вирусных частиц, содержащих данные векторы, упакованные в них, путем использования известных упаковывающих клеточных штаммов, например, РО13 (АТСС СРЬ-10686), РО13/Ь№8 (АТСС СКЕ-10685), РА317 (АТСС СРЬ-9078), клеточных штаммов, описанных в патенте США 5278056, ОР + Е-86 (АТСС СРЬ-9642), ОР + ептАт-12 (АТСС СРЬ-9641) и др.

Термин эффективное количество функционального материала, используемого здесь, означает определенное количество, необходимое для трансформации клеток-мишеней геном, переносимом в клетки-мишени с помощью ретровируса. Соответствующее количество можно подобрать в зависимости от конкретного функционального материала, ретровируса и конкретного вида клеток-мишеней, путем использования способа, описанного здесь. Термин эффективность генного переноса, используемый здесь, означает эффективность трансформации.

Способность связывания с ретровирусом функционального материала, т.е. эффективность и пригодность функционального материала настоящего изобретения, может быть установлена с помощью обычных анализов, которые описаны в нижеприводимых примерах.

Эти анализы определяют пределы, в которых ретровирусные частицы связаны с функциональным материалом, иммобилизованном на матриксе, используемом в настоящем изобретении, чтобы противостоять смыву с данного матрикса. Коротко, вируссодержащий супернатант, например, можно инкубировать в лунке, содержащей соответствующий иммобилизованный функциональный материал, обладающий доменом, связывающий ретровирус. Затем эту лунку тщательно промывают физиологическим солевым буфером и после этого клетки-мишени инкубируют в данной лунке, чтобы определить уровень инфекционной активности вируса, остающегося в данной лунке. Оценивают снижение инфекционной активности, или титра, относительно данного начального вирусного супернатанта, и сравнивают с тем, что получено в аналогичном контроле (т.е. используя лунку, покрытую В8А). Существенно более высокий титр, остающийся в функциональном материале, содержащемся в лунке, по сравнению с вышеуказанной контрольной лункой, свидетельствует о том, что данный материал может использоваться в качестве функционального материала в настоящем изобретении.

Для облегчения этой процедуры скринирования, данный вирусный вектор может содержать селективный маркерный ген.

Функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используемый в настоящем изобретении, можно скринировать с помощью этих анализов.

Как таковой, функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, представляет собой здесь функциональный материал, который обладает доменом, связывающим ретровирус, полученный из связывающего Гепарин-ΙΙ домена фибронектина, фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина.

Связывание домена, связывающего клетку, из функционального материала, используемого в настоящем изобретении, с клетками, т.е., связывание материала, содержащего лиганд, связывающий клетку-мишень с клетками, можно таким же образом проанализировать, применяя стандартные методики. Например, такие методики включают те, которые описаны в №11иге 352: 438-441 (1991).

Вкратце, определенный функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку, иммобилизировали на планшете для культивирования и соответствующую анализируемую популяцию клеток загружали в среду, с последующей инкубацией в течение 30 мин-2 ч. После этого периода инкубации, изымали клетки, не адгезированные с данным функциональным материалом, подсчитывали и анализировали на жизнеспособность. Клетки, прилипшие к данному функциональному материалу, также изымали с использованием трипсина или диссоциирующего клетки буфера (например, Οίόοο). подсчитывали и тестировали на жизнеспособность. В некоторых случаях, например для гемопоэтических колониеобразующих клеток, эти клетки культивировали далее в течение дополнительных 12-14 дней для установления колониеобразующих характеристик данных клеток.

Затем вычисляли процентную долю адгезирующих клеток и сравнивали со стандартом или стандартным контролем, таким как бычий сывороточный альбумин (В 8А), иммобилизованном на культуральном планшете. Существенное связывание клеток-мишеней с анализируемым функциональным веществом указывает, что это сочетание функциональный материал/клетка пригодно для настоящего изобретения и данный функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку, может сосуществовать с, или быть присоединенным к, определенному функциональному материалу, обладающему доменом, связывающим ретровирус, с последующим оцениванием ретровирусного инфицирования данных клеток-мишеней, для конструирования функционального материала, используемого в настоящем изобретении.

Поскольку соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, может использоваться в настоящем изобретении, как описано выше, здесь представлен функциональный материал, который обладает доменом, связывающим ретровирус, полученный из связывающего Гепарин-11 домена фибронектина, фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Все вещества, которые обладают доменом, связывающим ретровирус, эквивалентные вышеуказанному, и которые могут повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов путем присоединения к, или сосуществования с, лигандом, обладающим доменом, связывающим клетку-мишень, включены в соответствующие функциональные эквиваленты соответствующего домена, связывающего ретровирус, получаемого от фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина.

Эффективное количество функционального материала(ов), используемого(ых) в настоящем изобретении, можно определить путем использования клеток-мишеней и ретровируса в способе настоящего изобретения по генному переносу в присутствии выбранного функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, присоединенного к, или сосуществующего с соответствующим функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клетку, и оценивания повышения эффективности переноса данного гена, в соответствии с вышеописанным способом.

Настоящее изобретение подробно иллюстрируется ниже.

Первый аспект настоящего изобретения заключается в создании способа, повышающего эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса. Данный способ отличается инфицированием жизнеспособных клеток-мишеней ретровирусом в присутствии смеси функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клетку-мишень, который является эффективным для повышения эффективности генного переноса в соответствующие клетки-мишени с помощью соответствующего ретровируса.

Данный способ может использоваться для получения клеток-трансформантов, трансдуцируемых с помощью соответствующего ретровируса, и для трансплантирования данных клеток индивидуальному организму, осуществляющих генный перенос в индивидуальный организм.

Функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используемый в данном способе, специфически не ограничен, а его примеры включают связывающий Гепарин-ΙΙ домен фибронектина, фактор роста фибробластов, коллаген, полилизин и др. Таким же образом могут использоваться его функциональные эквиваленты, например функциональный материал, обладающий доменом, связывающим гепарин. Кроме того, может использоваться смесь функциональных материалов, полипептид, содержащий функциональный материал, полимер функционального материала, производное функционального материала и тому подобное. Эти функциональные материалы можно получить из естественно встречаемых продуктов, или получить искусственно (напр., получить с помощью генно-инженерных методик или химическим синтезом). Кроме того, они могут быть получены путем сочетания естественно встречаемых продуктов с синтетическими продуктами.

Поскольку домен, связывающий ретровирус, и/или домен, связывающий клетку-мишень, которые могут осуществлять генный перенос с высокой эффективностью, как здесь описывается и утверждается, функциональный материал может быть тем используемым материалом, который обладает мутацией в аминокислотных последовательностях естественно встречаемых полипептидов. В настоящем изобретении, даже если и делеция, замена, инсерция и/или добавка, одна или множество, например, до нескольких аминокислот, представлены в аминокислотных последовательностях естественно встречаемых полипептидов, поскольку требуемый домен, связывающий ретровирус, и/или домен, связывающий клетку-мишень, сохраняются, такие полипептиды именуются как функциональные эквиваленты данных полипептидов, обладающих естественно встречаемыми аминокислотными последовательностями. Эти функциональные эквиваленты могут быть получены путем создания генов, кодирующих соответствующие функциональные эквиваленты, чтобы произвести указанные эквиваленты и установить их биологические активности.

В этом отношении соответствующие области биотехнологии уже достигли уровня, когда можно рутинно осуществить определенную делецию, замену, добавку или другие модификации аминокислот в требуемых функциональных доменах. Затем эти полученные аминокислотные последовательности можно, как положено, проскринировать на нужную активность связывания клетки или активность связывания вируса.

Ген, кодирующий функциональный эквивалент, можно получить путем поиска генов, гибридизующих с геном, кодирующим вышеуказанный функциональный материал.

То есть ген, кодирующий вышеуказанный функциональный материал или часть его нуклеотидной последовательности, можно использовать в качестве гибридизационного зонда или праймеров метода амплификации гена, такого как РСВ, или ему подобного, для отбора гена, кодирующего белок, обладающего активностью, аналогичной данному функциональному материалу. Иногда в этом методе получали фрагмент ДНК, содержащий только часть требуемого гена. В таком случае, после установления того, что полученный фрагмент ДНК представляет собой часть требуемого гена, этот целый требуемый ген получали путем осуществления гибридизации с помощью данного фрагмента ДНК или его частью в качестве зонда или осуществлением РСВ с помощью праймеров, синтезируемых на основе нуклеотидной последовательности данного фрагмента ДНК.

Вышеуказанную гибридизацию можно осуществить, например, в нижеследующих условиях.

А именно, мембрану, на которой иммобилизуют ДНК, инкубируют в 6х88С (1х88С: 0,15 ИаС1, 0,015 натрийцитрата, рН 7,0), содержащем 0,5% 8Ό8, 0,1% В8А, 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% Исо11 400 и 0,01% денатурированной ДНК спермы лосося вместе с зондом при 50°С в течение 12-20 ч. После завершения инкубации эту мембрану промывали вначале 2х88С, содержащего 0,5% 8Ό8, при 37°С, а затем с помощью меняющихся концентраций 88С до 0,1х88С и температурах до 50°С до появления сигнала от данной иммобилизованной ДНК, который можно отличить от фона.

Кроме того, так или иначе, в том, что полученный таким образом ген, представляет собой требуемый ген, можно удостовериться путем проверки активности белка, кодируемого с помощью данного гена, в соответствии с вышеуказанным способом.

Как описано в вышеуказанном АО 95/26200, связывающий Гепарин-ΙΙ домен фибронектина представляет собой полипептид, обладающий доменом, связывающим ретровирус. Хотя фактор роста фибробластов, коллаген и полилизин не имеют какого-либо структурного сходства со связывающим Гепарин-ΙΙ доменом фибронектина (например, сходство в аминокислотных последовательностях), авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти субстан ции обладают доменами, связывающими ретровирус.

Функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку-мишень, используемый в настоящем изобретении, специфически не ограничен, либо представляет собой вещество, обладающее лигандом, которое может связываться с клетками-мишенями. Примеры этого лиганда включают клеточные адгезионные белки, гормоны, цитокины, антитела к антигенам на клеточных поверхностях, полисахариды, цепочки сахара в гликопротеинах или гликолипидах, метаболиты клеток-мишеней и т. д. Кроме того, здесь могут быть использованы полипептиды, содержащие функциональные материалы, полимеры функциональных материалов, производные функциональных материалов, функциональные эквиваленты функциональных материалов и т.п. Эти функциональные материалы могут быть получены из естественно встречаемых продуктов или полученных искусственно (например, полученных с помощью генно-инженерных методик или методами химического синтеза). Далее, они могут быть получены путем сочетания естественно встречаемых продуктов и синтетических продуктов.

Используемые здесь клеточные адгезионные белки представляют собой, например, фибронектин и его фрагменты. Например, связывающий клетку домен человеческого фибронектина, который корреспондирует с Рго¹²³⁹-8ег¹⁵¹⁵, как описано в патенте США № 5198423, как было показано, обладает функцией, эквивалентной описанному здесь полипептиду С-274 связывания с клетками, включая клетки ВНК и В16-Р10 (Ктии/ика с соавт., 1. ВюсНет. Уо1. 110, рр. 285-291 (1991)). Последовательность, составленная из четырех аминокислот ВСЭ8. представленная в этих полипептидах, представляет собой лиганд для рецептора УЬА-5. Экспрессию рецептора УЬА-5 наблюдали у широкого круга клеток, и он экспрессируется в недифференцированных клетках лучше, чем в дифференцированных клетках. Кроме того известно, что область фибронектина С8-1 является лигандом для рецептора УЬА-4 и связывается с клетками, экспрессирующими данный рецептор (Т-клетки, В-клетки, моноциты, ΝΚ-клетки, ацидофилоциты, базофилы, тимоциты, миеломоноцитарные клетки, клетки-предшественники эритробластов, лимфоцитарные клетки-предшественники, клетки меланомы, мышечные клетки и т.п.). Соответствующий полипептид, описанный в 1Р-А 3-284700, и представленный 8ЕО. ΙΌ Νο. 29 (именуемый ниже как С277С81), представляет собой полипептид, обладающий лигандами для обоих вышеупомянутых рецепторов УЬА-5 и УЬА-4, и может использоваться для генного переноса в клетки, обладающими этими рецепторами. Более того, было показано, что Гепарин-П-домен может связываться с фибробластами, эндотелиальными клетками и опухолевыми клетками. Полипептидная последовательность домена, из Гепарин-11-домена, связывающая клетку, пригодна для нацеливания ретровирусной инфекции на мишенируемые клетки в присутствии полипептида из функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус.

Гормоны и цитокины, обладающие клеточными специфичными активностями, подходят в качестве функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку, в настоящем изобретении. Например, эритропоэтин, который представляет собой цитокин в гемопоэтической системе, может использоваться для генного переноса в эритроцитарные клетки. Использовали эритропоэтин, получаемый в соответствии с известным способом. Кроме того, можно использовать также функциональные эквиваленты данного эритропоэтина и полипептиды, содержащие эритропоэтин или его функциональные эквиваленты.

Как описано в нижеприводимых примерах, когда функциональный материал, обладающий ретровирусной связывающей активностью (например, Н-271 и фактором роста фибробластов), использовали в смеси с С-274, который представляет собой полипептид, обладающий активностью, связывать клетку, получаемый из фибронектина или чего-либо подобного, можно получить высокую эффективность генного переноса. ΝΙΗ/ЗТЗ-клетки, которые использовались в этих экспериментах, экспрессируют рецептор УЬА-5, который может связываться с С-274 и их взаимодействие способствует повышению эффективности генного переноса.

Далее наблюдали также один и тот же феномен, когда производное эритропоэтина присутствует при генном переносе в ТР-1-клетки, которые экспрессируют рецептор эритропоэтина (Βίοο6, νοί. 73, рр. 375-380 (1989)). Более того, этот эффект не наблюдался в клетках, которые не имели какого-либо эритропоэтинового рецептора.

Из этих результатов становится ясно, что клеточная специфичность, повышающая эффективность генного переноса, имеет место в присутствии соответствующего функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и соответствующего функционального материала, обладающего доменом, связывающего клетку.

В этом аспекте настоящего изобретения, функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используется в форме смеси с другим функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клетку-мишень. В связи с этим, эффективность генного переноса в клетки-мишени, обладающие сродством к функциональным материалам, отчетливо повышается. Так как эффективность генного переноса повышена, можно исключить сокультивирование с клетками-продуцентами вируса, и это является одним из преимуществ настоящего изобретения.

Способы по избирательному генному переносу в клетки-мишени весьма полезны и разнообразные исследования были осуществлены. Например, существует невирусный вектор (молекулярно-конъюгированный вектор), в котором материал, связывающийся с рецептором, представленным на клеточной поверхности, присоединяется к ДНК-связывающему материалу. Примеры генного переноса с использованием такого вектора включают генный перенос в клетки печени с помощью асиалогликопротеина (1. Βΐοί. СЬет., νοί. 262, рр. 4429-4432 (1987)), генный перенос в лимфобласты с помощью трансферрина (Ргос. ΝαΙΙ. Асаб. 8с1. И8А, νοί. 89, рр. 6099-6103 (1992)), генный перенос в раковые клетки с помощью анти-ЕСРрецепторных антител (РЕВ 8 Ьейегк, νοί. 338, рр. 167-169 (1994) и др. Эти способы генного переноса с использованием невирусных векторов представляются нежелательными с той точки зрения, что генная экспрессия переносимых генов долговременна, из-за чего эти переносимые гены не интегрируются в хромосомную ДНК клеток. Предпринимались настойчивые попытки использовать ретровирусы, которые широко применяются в качестве векторов, способных инсерцировать гены в хромосомы, для специфического заражения клеток. Например, осуществляли генный перенос в гепатоциты путем прямой химической модификации ретровирусов для присоединения к лактозе (1. Βίοί. СЬет., νοί. 266, рр. 14143-14146 (1991)), генный перенос в клетки, экспрессирующие эритропоэтиновый рецептор, путем использования рекомбинантных вирусных частиц, обладающих оболочечным белком, который представляет собой белок, слит с эритропоэтином (8с1епсе, νοί. 266, рр. 1373-1376 (1994)) и др. Однако, для этой цели необходимо получить специальные белковые частицы, согласующиеся с отдельными клетками-мишенями. Кроме того, химическая модификация вирусных частиц требует сложных процедур и вызывает инактивацию вирусов. Более того, что касается вирусной оболочки, модифицируемой с помощью генной инженерии, желаемый продукт, обладающий необходимыми функциями (связывание с клетками-мишенями и конструирование вирусных частиц), получается не всегда.

Вышеупомянутый νθ 95/26200 позволяет предположить, что ретровирусный вектор, без какой-либо специальной модификации, может переноситься в клетки в присутствии фибронектинового фрагмента, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, обладающий активностью, связывающей клетку. Однако этот способ использует функциональную молекулу, обладающую и активностью, связывающей вирус, и активностью, связывающей клетку, и поэтому необходимо получать индивидуальный специальный функциональный материал, согласующийся с отдельными видами клеток. Кроме того, неизвестно, действительно или нет полученный функциональный материал сохраняет обе активности.

Сочетание функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и отличного функционального материала, обладающего доменом, связывающим клеткумишень настоящего изобретения, создает систему доставки гена с использованием ретровируса для самых разных видов клеток. Для этой цели нет нужды ковалентно присоединять функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, к функциональному материалу, обладающему доменом, связывающим клетку. Поэтому нет надобности получать индивидуальный специальный функциональный материал, в котором соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, ковалентно присоединен к соответствующему функциональному материалу, обладающему доменом, связывающим клетку, согласующийся с отдельными видами клеток, а генный перенос в клетки-мишени может быть удобно и эффективно осуществлен.

Примером генного переноса в клеткимишени с использованием данного способа настоящего изобретения является генный перенос в клетки гемопоэтической системы. Было известно, что вышеупомянутая клеточная адгезионная область С8-1 фибронектина пригодна для генного переноса в гемопоэтические стволовые клетки. Кроме того, было также известно, что помимо вышеуказанного эритропоэтина, различные другие клеточные специфичные цитокины участвуют в дифференциации гемопоэтических клеток, и генный перенос можно специфически осуществить в клетки-мишени (клеточные линии) при их использовании. Например, при использовании С-С8Е. в качестве клеток-мишеней трансдукции могут использоваться мегакариобласты и клетки-предшественники гранулоцитов.

Когда использующееся вещество, которое специфически или преимущественно связывается с малигнизированными клетками в качестве функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку, в такие клеткимишени можно осуществить перенос гена.

Например, было известно, что рецепторы, называемые как НЕЯ-2 и НЕЯ-4, экспрессируются в некоторых клетках карциномы молочной железы (Ргос. №11. Асаб. 80. И8А, Уо1. 92, рр. 9747-9751 (1995)). В соответствии с этим представляется возможным контролировать рост клеток карциномы молочной железы путем сочетания герегулина, который представляет собой лиганд для соответствующих рецепторов, с соответствующим функциональным материа лом, обладающим доменом, связывающим ретровирус.

Кроме того, благодаря использованию функционального материала, содержащего иод для клеток (раковых) щитовидной железы, или функционального материала, содержащего липопротеин высокой плотности (НОЬ), асиалогликопротеин или его часть для клеток (раковых) печени, эти клетки могут использоваться в качестве клеток-мишеней для трансдукции.

Далее, благодаря использованию антител к антигенам, представленным на клеточных поверхностях, соответственно, моноклональные антитела в качестве функционального материала, обладающего активностью, связывающей клетку, любые клетки, имеющие антитела, могут использоваться в качестве клеток-мишеней. Таким образом, самые различные клетки могут использоваться в качестве клеток-мишеней благодаря применению способа локализации ретровирусного вектора и клеток-мишеней, описанных в настоящем изобретении.

В наиболее предпочтительном варианте, эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса повышена, благодаря использованию нового функционального материала.

До сих пор был известен только ГепаринΙΙ-домен фибронектина, как представитель функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, эффективного для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов.

Как описано выше, данный домен обладает сам по себе способностью связываться с некоторыми клетками и, в некоторых случаях, эта активность является нежелательно зависящей от определенных клеток-мишеней. В таких случаях желаемые результаты могут быть получены путем замены связывающего домена на другой домен, связывающий клетку. Таким образом, можно использовать многочисленные функциональные материалы, обладающие различными свойствами, и это создает более широкие возможности применения соответствующей генной терапии в соответствии с настоящим изобретением и легко осуществляемой трансдукцией выбранных клеток-мишеней.

Данный новый функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, созданный с помощью настоящего изобретения, включает факторы роста фибробластов, полипептиды, содержащие соответствующие факторы, фрагменты коллагена, смесь соответствующих фрагментов, полипептиды, содержащие соответствующие фрагменты, полимеры функционального материала и т. п. Полилизины также используются для этой цели настоящего изобретения. Эти функциональные материалы могут быть получены из естественно встречаемых продуктов или могут быть произведены синтетически (напр., произведены с помощью методов генной инженерии или химическим синтезом). Далее, они могут быть произведены путем сочетания естественно встречаемых продуктов и химически синтезируемых продуктов. Данный функциональный материал может использоваться для способа переноса гена из первого аспекта настоящего изобретения, но для генного переноса пригодны также химерные молекулы из данного функционального материала и соответствующего другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку.

Все вышеописанные функциональные материалы обладают активностью, связывающей ретровирус. Однако эти материалы не содержат Гепарин-11-домена человеческого фибронектина, описанного в АО 95/26200, или полипептида, обладающего аналогичными аминокислотными последовательностями.

В качестве фактора роста фибробластов, может использоваться практически чистый естественно встречаемый продукт, или может использоваться продукт, полученный методами генной инженерии. В настоящем изобретении, может использоваться фактор роста фибробластов, который представлен ЗЕр. ГО Νο. 3 в списке последовательностей, и могут также использоваться модифицированные его производные, сохраняющие функции данного полипептида. Примеры производных фактора роста фибробластов включают полипептид, представленный ЗЕр. ГО Νο. 4 в списке последовательностей (именуемый ниже как С-РОР»А). Он представляет собой полипептид, в котором адгезирующий клетку домен полипептида фибронектина присоединен к Ν-концу фактора роста фибробластов, представленному ЗЕр. ГО Νο. 3, и может быть получен с помощью методов генной инженерии, как в основном описано в патенте США 5302701. Данный полипептид может быть получен путем использования Е. οοΐί, что было описано в вышеприведенном патенте США, в виде РЕЯМ Р-12637, и в настоящее время депонированного по Будапештскому Договору в Ναΐίοηαΐ ΙηδΐίΐυίΌ ο£ Вю/щенсе аиб Ηитаи-ТесЬиο1οду (ΝΙΒΗ), Аде псу ο£ Ιη6ιΐ5ΐπηΐ Заепсе & ТесНгюЕ οду, ΜίηίδΐΓγ ο£ ΙπίΌΓπαΐίοηαΙ Тгабе & Ιη6ιΐ5ΐΐΎ ο£ 1-1-3, ШдакЫ, ТкикиЬа-кЫ, ФагакЕкеп, 1араи, под инвентарным номером РЕЯМ ВР-5278 (дата первоначального депонирования: 9 декабря

1991г.).

Полипептидное производное вышеприведенного С-РСР«А, обладающее адгезирующим СЗ-1-клетки доменом, произведенным из фибронектина, которое представлено ЗЕр. ΙΌ Νο. 5 (именуемое ниже в качестве Р0Р-СЗ1), получаемое путем использования ЕксйебсЫа ^ΐί, депонировали по Будапештскому Договору в ΝΙΒΗ ο£ 1-1-3, ШдакЫ, ТкикиЬа-кЫ, ФагакЕкеп, Япония, под инвентарным номером РЕЯМ ВР5654 (дата первоначального депонирования: 6 сентября 1996г.), в соответствии со способом, описанным здесь. Это С-РРР-СЗ1 особенно пригодно для генного переноса в клеткимишени, обладающие СЗ-1-связывающим свойством, в частности, гемопоэтические стволовые клетки.

В качестве коллагеновых фрагментов могут использоваться существенно очищенные фрагменты, полученные путем энзиматического или химического расщепления природных коллагенов, или могут использоваться коллагеновые фрагменты, полученные методами генной инженерии. Кроме того, могут использоваться модификации этих фрагментов, сохраняющие их функции. Среди коллагенов человеческий коллаген тип V обладает сильной активностью, связывающей инсулин (ДР-А 2-209899). Примером полипептидов, обладающего доменом, связывающим инсулин является полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в списке последовательностей ЗЕр. ГО Νο. 28 (именуемую ниже как Οοΐν). Οοΐν можно получить в соответствии со способом, описанным здесь в примерах. Полипептид, который содержит Οοΐν и представлен ЗЕр. ГО Νο. 7 (именуемый ниже как С277^ΐν), представляет собой полипептид, в котором адгезирующий клетку домен полипептида фибронектина присоединен к Ν-концу Οοΐν и может быть получен методом генной инженерии в соответствии с ДР-А 5-97698 как описано выше. С277-Сο1V можно получить путем использования Е. ^ΐί, которая описана под инвентарным номером РЕЯМ Р-12560 в ДР-А 5-97698 и депонирована по Будапештскому Договору в ΝΙΒΗ 1-1-3, ШдакЫ, ТкикиЬа-кЫ, ФагакЕкеп, Япония, под инвентарным номером РЕЯМ ΒР5277 (дата первоначального депонирования: 7 октября 1991 г.).

Полипептид (именуемый ниже в качестве С-Сο1V-СЗ1), произведенный от С277-Сο1V, который представлен ЗЕр. ГО Νο. 8, и обладает доменом СЗ-1, адгезирующем клетку, произведенным из фибронектина, может быть получен следующим образом. Фрагмент ДНК, выделенный путем амплификации с помощью РСЯ с использованием вышеуказанной плазмиды, которую получали от Е. ^ΐί, депонированной по Будапештскому Договору в ΝΙΒΗ 1-1-3, ЫдакЫ, ТкикиЬа-кЫ, ФагакЕкеп, Япония, под инвентарным номером РЕЯМ ΒР-2800 (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989 г.) в качестве матрицы и соответствующих праймеров СЗ1-З (соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в ЗЕр. ГО Νο. 9 в приведенном списке последовательностей) и М4, и обработанных затем с помощью ферментов рестрикции ΝΊιοΙ и ЗаИ.

С другой стороны, выделяли фрагмент

ДНК в результате амплификации с помощью

РСЯ с использованием плазмиды рТР7520Сο1V, которая содержит ген, кодирующий С277-Сο1V, и полученную из вышеуказанной РЕЯМ ВР25

5277 Е. οοΐί в качестве матрицы, и праймеров СЕ и СКВ, а затем обрабатывали с помощью ферментов рестрикции ЛссШ и ΝΙιοΙ. Нуклеотидные последовательности СЕ и СИВ представлены в δΕβ. ΙΌ Νοχ 10 и 12 приведенного списка последовательностей. Вышеполученные два фрагмента ДНК смешивали и лигировали с около 4,4 т.п. н. фрагментом ДНК, полученным путем обработки плазмиды ρΤΕ7520ί’οΐν с помощью ферментов рестрикции ЛссШ и δαΙΙ. Полученная плазмида кодирует полипептид С-СсЩ-С81, который обладает Сδ-1-доменом, алгезирующем клетки по С-концу С277-Сο1V, и в котором глутаминовая кислота по С-концу ί'οΐν и Сконцевой треонин заменены, соответственно, аланином и серином. После культивирования Ε. ^1ί, трансформированной этой плазмидой, из этой культуры можно получить требуемый полипептид. Этот С-Сс№-С81 особенно пригоден для генного переноса в клетку-мишень, особенно стволовую клетку, обладающую Сδ1связывающим свойством.

В качестве полилизина, как описано выше, который обладает подходящим уровнем полимеризации, можно выбрать и использовать полилизин из коммерчески доступных полилизинов.

Функциональные материалы, используемые в настоящем изобретении, могут включать производные вышерассмотренных функциональных материалов. Их примеры включают вышерассмотренный С-ЕСЕ-С81 или его функциональные эквиваленты и С-Сс№-С81 или его функциональные эквиваленты. Кроме того, в настоящем изобретении могут также использоваться полимеры, полученные путем полимеризации множества молекул из соответствующих функциональных материалов, и модифицированные материалы, полученные путем модификации соответствующих функциональных материалов, в соответствии с известными способами (добавление цепи сахара и т.п.). Эти полимеры и их функциональные эквиваленты можно получить с помощью методов генной инженерии с использованием генов, кодирующих соответствующие полимеры, и генов, кодирующих их функциональные эквиваленты. Кроме того, функциональный материал с добавленным цистеином, пригодным для получения полимера из соответствующего функционального материала, можно получить путем добавки, инсерции и замены цистеина в аминокислотной последовательности соответствующего функционального материала. Кроме того, молекула, которая представляет собой функциональный материал с добавленным цистеином и обладает доменом, связывающим ретровирус, легко присоединяется к другой молекуле, которая представляет собой функциональный материал с добавленным цистеином, и обладает доменом, связывающим клетку-мишень. К тому же, материал, соединяемый с другим функциональным материалом, можно получить путем использования соответствующего реакционноспособного цистеинового остатка из соответствующего функционального материала с добавленным цистеином.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, генный перенос осуществляют путем использования полимера из связывающего ретровирус домена фибронектина, который повышает эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов.

Соответствующий функциональный материал представляет собой полипептид, обладающий многочисленными Гепарин-П-связывающими доменами из человеческого фибронектина в одной молекуле, как описано в вышеприведенном \νϋ 95/26200, или производные данного полипептида. Поскольку сохраняется одна и та же активность, такая же, как у соответствующего функционального материала, часть функциональных эквивалентов, чьи аминокислотные последовательности отличаются от последовательностей из естественно встречаемых продуктов, могут быть включены.

Примеры полимера функционального материала включают те из них, которые получены путем энзиматической или химической полимеризации вышеуказанного полипептида, произведенного из фибронектина или с помощью методов генной инженерии. Пример полипептида, который обладает в молекуле двумя Гепарин-ΙΙсвязывающими доменами, произведенными из фибронектина, включают полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной в списке последовательностей δΕβ. ΙΌ Νο. 13 (именуемой ниже в качестве Н2547). Н2-547 можно получить в соответствии со способом, описанным здесь, путем использования Ε^οΐί, которую депонировали по Будапештскому Договору в ΝΙΒΗ 1-1-3, Ηίβαδίιί, ТкикиЬаδΐιί, ШагакЕкеи, Япония, под инвентарным номером ΕΕΒΜ ВР-5656 (дата первоначального депонирования: 6 сентября 1996 г.). Полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной δΕβ. ΙΌ Νο. 14 в списке последовательностей, представляет собой полипептидное производное, содержащее адгезирующий клетку полипептид фибронектина, присоединенный по Ν-концу Н2-547 (именуемый ниже в качестве СН 2-826). Этот полипептид можно получить в соответствии со способом, описанным здесь. Далее, полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной δΕβ. ΙΌ Νο. 30 в списке последовательностей, представляет собой полипептидное производное, содержащее, адгезирующую клетку, Сδ-1-область фибронектина, присоединенную по С-концу Н2-547 (именуемое ниже как Η2δ-573). Соответствующий полипептид можно получить в соответствии со способом, описанным здесь, путем использования Ε^οΐί, которую депонировали по Будапешт скому Договору в ΝΙΒΗ 1-1-3, ШдазЫ, ТзикиЬаδΐιί. 1Ьагак1-кеп, Япония, под инвентарным номером РЕЕМ ΒΡ-5655 (дата первоначального депонирования: 6 сентября 1996г.). Η28-573, обладающий областью адгезии клетки С8-1 пригоден для генного переноса в гемопоэтические стволовые клетки.

Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, жизнеспособные клетки-мишени заражали дефектным по репликации ретровирусным вектором в присутствии соответствующего функционального материала, иммобилизованного на шариках, которые являются эффективными для повышения эффективности генного переноса в клетки с помощью ретровирусного вектора.

Удобные способы для повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусного вектора путем использования соответствующих функциональных материалов, описанные выше в АО 95/26200 и №11иге Мебкте, осуществляли путем иммобилизации функциональных материалов в посуде, используемой для инфицирования клеток вирусом (планшет для клеточного культивирования). Эти способы требуют усложненных процедур, таких как отмывку избытка функционального материала, после обработки данного планшета раствором, содержащим указанный функциональный материал.

Поэтому способы переноса гена с использованием планшета, обладающего функциональными материалами, иммобилизованными в нем, трудно считать удобным способом. С другой стороны, способ с использованием функциональных материалов, иммобилизованных на шарике(ах) имеет следующие преимущества.

По сравнению с планшетом, иммобилизацию на шариках можно осуществить в относительно небольшом пространстве, а шарики разместить в герметичной посуде. Так как поверхность планшета, обладающего функциональным материалом, иммобилизованном в нем, выдерживают на воздухе, с ним нужно обращаться осторожно, чтобы предотвратить порчу, или что-либо подобное, связанное с высыханием во время хранения, для случая функционального материала, обладающего сниженной стабильностью. Однако шарики можно хранить путем суспендирования в растворе и избежать таких проблем. Более того, поверхностная площадь функционального материала увеличивается при использовании шариков и, по этой причине, можно получить повышенную эффективность генного переноса по сравнению с планшетом.

Иммобилизацию функциональных материалов можно осуществить с помощью удобного способа, например, посуду для культивирования клетки-мишени покрывают соответствующими функциональными материалами или же данные функциональные материалы можно иммобилизовать, например, на шариках, обра ботанных для культивирования клеток. Соответствующий сырьевой материал и вид шариков можно выбрать в зависимости от соответствующего предполагаемого использования. Например, шарик может обладать круговой или сферической сердцевиной в качестве центральной части и поверхность этой сердцевины можно покрыть гидрофильным полимером. Примеры сырьевого материала и вида этой сердцевины и полимера описаны в 1Ρ-Ά 8-501092. Например, биодеградируемые шарики, на которых иммобилизованы эти функциональные материалы, можно вводить в живой организм. Альтернативно, эффективный способ заключается в использовании смеси шариков, на котором иммобилизована молекула, обладающая доменом, связывающим ретровирус, и шариков, на которых иммобилизована молекула, обладающая доменом, связывающим клетку-мишень.

Когда, например, эти функциональные материалы используются без иммобилизации, посуда для культивирования клетки-мишени может быть предварительно обработана веществом, которое предотвращает прилипание соответствующих функциональных материалов к данной посуде, например, бычьим сывороточным альбумином (Β8Α). Таким образом, данные функциональные материалы могут использоваться без неспецифичной адгезии к данной посуде.

В соответствии с настоящим изобретением, генный перенос можно эффективно осуществить даже в такой системе, в которой функциональный материал настоящего изобретения используется без иммобилизации.

Кроме того, благодаря использованию специфического набора реагентов, предназначенного для осуществления способа настоящего изобретения, как описано ниже, генный перенос в клетки может быть осуществлен очень удобно.

Как описано выше, трансформированные клетки, полученные в соответствии со способом настоящего изобретения, можно трансплантировать живому организму, с тем, чтобы осуществить генную терапию и чтобы экспрессировать экзогенный ген в живом организме.

Например, когда гемопоэтические стволовые клетки используются в качестве клетокмишеней, генную терапию можно осуществлять с помощью следующих процедур. Во-первых, материал, содержащий гемопоэтические клетки, например, ткани костного мозга, периферической крови, крови пуповины плода или др., собирают от донора. Этот собранный материал может использоваться сам по себе. Однако обычно фракцию моноцитов, содержащую гемопоэтические стволовые клетки, получают центрифугированием в градиенте плотности или подобным образом. Альтернативно, гемопоэтические стволовые клетки могут быть выделены очисткой благодаря использованию маркеров на клеточных поверхностях, таких как СБ34 и/или

С-набор. Полученный материал, содержащий гемопоэтические клетки можно факультативно подвергнуть предварительной стимуляции подходящим фактором роста клеток или другим, а затем, эти клетки инфицировать рекомбинантным ретровирусным вектором, в который был инсерцирован предполагаемый ген, в соответствии со способом настоящего изобретения, в частности, в присутствии соответствующего функционального материала, обладающего активностью, связывающей стволовую клетку. Полученные таким образом трансформированные клетки можно трансплантировать реципиенту, например, путем внутривенного введения. Данный реципиент представляет собой, предпочтительно, аутологичного донора, но включает также аллогенные трансплантаты, последнее особенно предпочтительно для трансплантации при использовании клеток из пуповины крови.

Генная терапия с использованием гемопоэтических стволовых клеток компенсирует недостаточность или аномальность гена пациента и его примеры включают ΆΌΆ-недостаточность и болезнь Гоше. Кроме того, иногда, трансдукцию гена лекарственной устойчивости осуществляют для ослабления нарушений гемопоэтических стволовых клеток, связанных с химиотерапией, применяемой при лечении рака, лейкемий и т. п.

Известно, что гемопоэтические стволовые клетки экспрессируют УЪЛ-4-рецептор и по этой причине возможно эффективно осуществить генный перенос благодаря использованию соответствующего функционального материала, обладающего С8-1-областью, адгезирующей клетку, описанной в настоящем изобретении. Далее, как описано выше, молекулы, такие как СЭ34 и С-набор, экспрессируются на соответствующих поверхностях гемопоэтических стволовых клеток, и по этой причине эффективность генного переноса может быть повышена благодаря сочетанию антител против этих молекул или фактора стволовых клеток, который представляет собой лиганд С-набора соответствующего функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус.

Сверх того, для генной терапии рака, изучали терапевтический эффект вакцины на новообразования, при этом цитокиновые гены переносили в раковые клетки и, после лишения способности к росту, эти клетки возвращали в организм пациента, чтобы повысить иммунитет к новообразованию (Нитап Сепе Тйегару, Уо1. 5, рр. 153-164 (1994)). Такую обработку можно эффективно осуществлять благодаря применению способа настоящего изобретения с помощью соответствующего функционального материала, обладающего высоким сродством к раковым клеткам.

Кроме того, предпринимались настойчивые попытки лечить ΆΙΌ8 при помощи генной терапии. В этом случае предлагалось перено сить ген, кодирующий молекулу нуклеиновой кислоты, которая подавляет НГУ-репликацию или генную экспрессию (например, антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим и пр.), в Т-клетки, которые инфицированы НГУ, который вызывает ΆΙΌ8 (1. У1го1., Уо1. 69, рр. 4045-4052 (1995)). Генный перенос в Т-клетки можно осуществить способом настоящего изобретения с использованием соответствующего функционального материала, например, СЭ4-антитела или ему подобного, который может связаться с молекулой, присутствующей на соответствующей поверхности Т-клеток.

Таким образом, в качестве клетокмишеней для генного переноса можно использовать любые клетки, поскольку соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку-мишень, доступен или может быть приготовлен.

Более того, данный способ настоящего изобретения подходит для условий применения клинической генной терапии, потому что сокультивирование клеток-мишеней в присутствии клеток-продуцентов ретровируса не требуется, и данный способ настоящего изобретения можно осуществить в отсутствие гексадиметринбромида, использование которого оказывает неблагоприятное клиническое воздействие на человеческий организм. Далее, применение, например, настоящего изобретения в других областях техники, иных, чем генная терапия, позволяет проще продуцировать трансгенных позвоночных животных для использования в качестве источника клеток-мишеней, эмбриопластических стволовых клеток, первичных половых клеток, ооцитов, оогоний, яйцеклеток, сперматоцитов, сперматозоидов и др.

Иными словами, в настоящем изобретении разработали, в качестве первого варианта, способ клеточного трансплантирования, включающий трансплантирование трансформированных клеток, полученных способом настоящего изобретения, позвоночному животному. Примеры позвоночных животных для трансплантирования трансформированных клеток включают млекопитающих (например, мышь, крыса, кролик, коза, свинья, лошадь, собака, обезьяна, шимпанзе, человек и т.д.), птиц (например, курица, индейка, куропатка, дикая утка и т.д.), пресмыкающихся (например, змея, аллигатор, черепаха, и т.д.), земноводных (например, лягушка, саламандра, тритон и т.д.), рыб (например, бод таскеге1 (макрелещука), скумбрия, окунь, луциан, морской окунь, желтохвост, тунец, лосось, форель, карп, а(й)ю, угорь, камбала, акула, скат, осетр и т.д.).

Таким образом, в соответствии с этим вариантом осуществления настоящего изобретения, подобно практически чистому фибронектину, практически чистым фибронектиновым фрагментам или их смеси, генный перенос с помощью ретровирусов можно осуществить эффективно благодаря соответствующему домену, связывающему ретровирус, и соответствующему домену, связывающему клеткумишень, из функционального материала, используемого в настоящем изобретении. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет метод для перемещения генетического материала в клетки позвоночных животных без какого-либо ограничения традиционных методик.

В очередном варианте осуществления настоящего изобретения эффективное количество материала, который обладает доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле и обладает функциями, эквивалентными функциям практически чистого фибронектина, практически чистых фибронектиновых фрагментов или их смеси, используется в качестве соответствующего функционального материала.

Такой функциональный материал представляет собой материал, который может осуществить генный перенос с той же эффективностью, что и фибронектин, фибронектиновый фрагмент или их смесь. Обычно он представляет собой функциональный материал настоящего изобретения, обладающий вышеуказанным новым доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле. В случае использования этих материалов, предполагается, что ретровирусы, также как и клетки-мишени, связывают, как минимум, один функциональный материал.

Примеры функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим мишень, на одной и той же молекуле, включают полипептиды, представленные в списке последовательностей 8Е0. ГО Νοκ. 21 и 22 (именуемые ниже соответственно, СНУ-181 и СНУ-179).

Эти пептиды включают сходные последовательности типа III (Ш-12, Ш-13 и Ш-14), содержащиеся в Н-271. В СНУ-181, последовательности ΙΙΙ-12 и ΙΙΙ-13, и в СНУ-179, последовательности III-13 и ΙΙΙ-14 присоединены через метионин к С-концу адгезирующего клетку полипептида (Рго¹²³⁹- 8ег¹⁵¹⁵) фибронектина. Плазмиду для экспрессии полипептида СНУ-181 можно сконструировать, например, путем следующих операций.

Вначале плазмиду ρΗΌ101, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий связывающий гепарин полипептид (Н-271) фибронектина, получали в ЕксбепсЫа соб ΗΒ101/ρΗΌ101 (ЕЕВМ ВР-2264). ΗίηάΙΙΙ-сайт интродуцировали в область, кодирующую С-концевую ΙΙΙ-13последовательность в этой плазмиде, путем сайт-направленного мутагенеза, с последующей обработкой с помощью №οΙ и ΗίηάΙΙΙ, для получения фрагмента ДНК, кодирующего последовательность ΙΙΙ-12 и ΙΙΙ-13. С другой стороны, плазмидный вектор ρΙΝΙΙΙ-отрА! обрабатывали с помощью ΗίηάΙΙΙ и 8аП для получения фраг мента ДНК, кодирующего область терминатора липопротеина.

Далее, плазмиду рТЕ7021, содержащую фрагмент ДНК, кодирующую адгезирующий клетку полипептид (С-279) фибронектина, получали из ЕксбепсЫа соб 1М109/рТЕ7021 (ЕЕВМ ВР-1941), а Жобсайт интродуцировали непосредственно перед терминирующим кодоном С-279 в данной плазмиде путем сайтнаправленного мутагенеза для получения плазмиды рТЕ7520. Полученную плазмиду обрабатывали с помощью Ν^Ι и 8аб, с последующим смешиванием с фрагментом ДНК, кодирующим последовательность ΙΙΙ-12 и ΙΙΙ-13, и с фрагментом ДНК, кодирующим область терминатора липопротеина, для их лигирования и получения плазмиды ρСΗУ181 для экспрессии полипептида СΗУ-181. Нуклеотидная последовательность области, кодирующей полипептид СΗУ-181 в плазмиде рСДУШ, показана в списке последовательностей в 8Е0. ГО №. 27.

Плазмиду для экспрессии полипептида СΗУ-179 можно сконструировать, например, с помощью следующих операций.

Вначале, в область, кодирующую Νконцевую последовательность ΙΙΙ-13 в плазмиде рИО101, сайт-направленным мутагенезом интродуцировали Шобсайт. с последующей обработкой с помощью Ν^Ι и ΗίηάΙΙΙ для получения фрагмента ДНК, кодирующего последовательность ΙΙΙ-13 и ΙΙΙ-14. Полученный фрагмент смешивали с фрагментом ДНК, кодирующим вышеуказанную область терминатора липопротеина, и с плазмидой рТЕ7520, обработанной Ν^Ι и 8аП, для их лигирования и получения плазмиды ρСΗУ179 для экспрессирования полипептида №ν-179.

СИУ-Ш и 6Ην-179 могут быть получены путем культивирования Е. соб, трансформированной, соответственно, вышеуказанными плазмидами, с последующим выделением очисткой из результирующей культуры.

Эти функциональные материалы могут использоваться путем иммобилизации, например, на шариках, как описано выше, или без иммобилизации.

В очередном варианте настоящего изобретении создали культуральную среду для клетокмишеней, используемую для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов, которая включает (1) вышеописанную смесь эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, или (2) эффективное количество соответствующего функционального материала, обладающего вышеописанным новым доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клеткумишень, на одной и той же молекуле. Данный функциональный материал может быть иммо33 билизован или может быть использован без иммобилизации.

Другие ингредиенты в культуральной среде настоящего изобретения специфически не ограничены, поскольку они могут использоваться в культуре клеток-мишеней, и могут использоваться в коммерчески доступных культуральных средах. Культуральная среда настоящего изобретения может также содержать сыворотку, фактор роста клеток, необходимый для роста клеток-мишеней, антибиотик для предотвращения загрязнения микроорганизмами и т. д. Например, в случае МН/3Т3-клеток. модифицированная Дюльбекко среда Игла (ИМЕМ, ЖН Вю8С1епсе), содержащая 10% сыворотки плода коровы (Οί^ο), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (оба от Οί^ο) может использоваться в качестве культуральной среды.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения создали способ локализации ретровируса, который включает инкубирование культуральной среды, содержащей ретровирус, контактируемый с (1) вышеописанной смесью из молекулы, содержащей домен, связывающий ретровирус, и другой молекулы, содержащей домен, связывающий клетку-мишень, (2) вышеописанным функциональным материалом настоящего изобретения, обладающим новым доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле, или (3) с вышеописанным функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим ретровирус.

Как описано выше, данный функциональный материал может быть иммобилизован или может использоваться без иммобилизации. Инкубацию можно осуществлять в соответствии с обычным способом, например, при 37°С в условиях 5%-ной концентрации СО₂ и влажности 99,5%. Эти условия можно подобрать в зависимости от специфики используемых клетокмишеней, а период культивирования можно также изменять в соответствии со спецификой клеток и целей.

Благодаря использованию способа настоящего изобретения, вирусные частицы могут быть локализованы в различных конструктах, которые доставляют вирусы в клетки-мишени.

В очередном варианте осуществления настоящего изобретения создали набор для использования ретровирус-опосредованного генного переноса в клетки-мишени. Данный набор включает

а) эффективное количество (1) смеси из молекулы, обладающей вышеописанным доменом, связывающим ретровирус, и другой молекулы, обладающей доменом, связывающим клетку-мишень или (2) функциональный материал, обладающий новым доменом настоящего изобретения, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле;

(Ь) синтетический субстрат для инкубирования ретровируса, контактируемого с клетками-мишенями; и (С) фактор роста клетки-мишени для предварительного стимулирования клеток-мишеней. Функциональный материал (а) может быть иммобилизованным или не иммобилизованным. Данный набор может, кроме того, включать рекомбинантный ретровирусный вектор, необходимые буферы и т.п.

В качестве синтетического субстрата можно использовать планшет для культивирования клеток, чашки Петри, флаконы и т. п. Они могут быть изготовлены из полистирола.

В случае, когда клетки-мишени представляют собой клетки в С.-фазе, заражение ретровирусом не происходит и по этой причине, предпочтительно, клетки предварительно стимулируют для приведения клеток, в определенный клеточный цикл. Для этой цели клеткимишени культивируют в присутствии соответствующего фактора роста клетки перед инфицированием ретровирусом. Например, в случае генного переноса в клетки костного мозга и гемопоэтические стволовые клетки, можно использовать фактор роста клетки-мишени, такой как интерлейкин-6, или фактор стволовой клетки.

Соответствующие представители, составляющие данный набор, могут быть получены в форме лиофилизированных продуктов, гранул, таблеток, кроме водных растворов, рег §е в соответствии с известными способами.

Благодаря использованию набора настоящего изобретения можно получить, например, культуру трансформированной жизнеспособной клетки-мишени и можно проще осуществить ретровирус-опосредованную трансдукцию в клетки-мишени.

Настоящее изобретение включает также способ генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, в котором функциональный материал выбран из группы, состоящей из практически чистого фибронектина, практически чистых фибронектиновых фрагментов и их смеси или их полимера, которые иммобилизуют на шариках или используют не иммобилизованными.

Настоящее изобретение включает вышеописанный СН2-826 и его функциональные элементы. Кроме того, в настоящем изобретении создали ген, кодирующий СН-2-826. Одним из его примеров является ген, представленный 8Ер. Ш Νο. 20 в списке последовательностей. Настоящее изобретение включает также функциональные эквиваленты данного гена.

Далее, в настоящем изобретении создали вышеописанный СНУ-181, включая его функциональные эквиваленты. Кроме того, в настоящем изобретении создали ген, кодирующий

СНУ-181. Одним из примеров данного гена является ген, представленный в списке последова35 тельностей 8ЕЦ. ΙΌ Νο. 27. Настоящее изобретение включает также функциональные эквиваленты данного гена.

В настоящем изобретении создали также полимер, содержащий полимер домена, связывающего соответствующий ретровирус и/или полимер домена, связывающего соответствующую клетку-мишень. Специфические примеры данного полимера представляют собой фактор роста фибробластов и полимер полипептида, обладающий доменом, связывающим инсулин, произведенный из коллагена типа V.

Как обсуждается ниже, хотя настоящее изобретение не ограничивается какой-либо теорией, предполагается, что генный перенос в клетки с помощью ретровируса, т.е. трансформация, усиливается благодаря связыванию ретровируса с клеткой-мишенью по соответствующим функциональным доменам.

Как таковой, функциональный материал, который связывается с ретровирусом, и, таким образом, пригоден для настоящего изобретения, представлен здесь практически чистым фибронектином, практически чистыми фибронектиновыми фрагментами или их смесью. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вышеописанные функциональные материалы настоящего изобретения, обладающие функциями практически теми же, что и практически чистый фибронектин и ему подобные повышают эффективность генного переноса, т. е. эффективность трансформации клеток-мишеней с помощью ретровируса.

Фрагменты фибронектина, описанные здесь, могут иметь природное или искусственное происхождение, и могут быть получены практически чистыми из естественно встречаемых продуктов, например, в качестве ранее описанных у К.иок1айй с соавт. (1981) 1. ΒίοΙ. Сйеш. 256:7277; Ра1е1 и ЬобкЬ (1986) 1. Се11. Βίο1. 102:449; и Вегпаг61 с соавт. (1987) 1. Се11. Βίο1. 105:489. В этом отношении, ссылка, приводимая здесь, на практически чистый фибронектин или фибронектиновый фрагмент, подразумевает средство, которое практически свободно от других белков, естественно встречаемых с фибронектином.

Практически чистый фибронектин или фибронектиновый фрагмент, описанный здесь может быть также получен методами генной инженерии, например, как, в основном, описано в патенте США № 5198423. В частности, рекомбинантные фрагменты, идентифицированные ниже в примерах в качестве Н-271, Н-296, СН271 (8 ЕС) ΙΌ N0 23) и СН-296 (81 /С) ΙΌ ΝΟ 24), и способы их получения подробно описаны в данном патенте. Фрагмент С-274, используемый в нижеследующих примерах, был получен так, как он описан в патенте США № 5102988. Эти фрагменты или фрагменты, из которых они рутинно произведены, доступны благодаря культивированию Е. οο1ί. депонированной в ΝΙΒΗ 1

1-3, ШдакЫ, ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагак1-кеи, Япония, по Будапештскому Договору под инвентарным номером ЕЕРМ Р-10721 (Н-296) (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989г.), ЕЕРМ ВР-2799 (С-277, связанный с Н-271 через метионин) (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989г.), СЕЕМ ΒΡ-2800 (С-277, связанный с Н-296 через метионин) (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989г.), а также как описано в патенте США №5198423.

Кроме того, полезные сведения о фибронектиновых фрагментах, используемых здесь, или об исходных материалах для таких фрагментов, можно найти у Кшихика с соавт., 1. Βίοсйеш. 110, 284-291 (1991), который к тому же сообщает о вышеописанных рекомбинантных фрагментах; в ΕΜΒΟ 1., 4, 1755-1759 (1985), где сообщается о структуре гена человеческого фибронектина; и в Β^οсйет^κΐ^у, 25, 4936-4941 (1986), где сообщается о домене человеческого фибронектина, связывающем Гепарин II. Обнаружено, что фибронектиновые фрагменты, которые содержат и домен, адгезирующий клетки С8-1 и домен, связывающий Гепарин-ΙΙ, значительно усиливают эффективность генного переноса в гемопоэтические клетки и действуют до сих пор.

Таким образом становится очевидным, что фибронектин-связанные полипептиды, описанные здесь, представляют аминокислотную последовательность, обладающую клеточносвязывающей активностью домена фибронектина, адгезирующего клетки С8-1, а также аминокислотной последовательностью домена фибронектина, связывающего Гепарин-ΙΙ, который связывается с вирусом.

Полипептид, связывающий вирус, используемый для усиления трансдукции при помощи ретровирусных векторов, как описано в XVΟ 95/26200, включает (1) первую аминокислотную последовательность, которая корреспондирует с А1а¹⁶⁹⁰-Тйг¹⁹⁶⁰ из связывающего Гепарин-ΙΙ домена человеческого фибронектина, который представлен по формуле (8ЕЦ ΙΌ ΝΟ 1):

А1а

Не

Рго

А1а

Рго

ТЬг

Азр

Ьеи

Ьуз

РЬе

ТЬг

СХп

УаХ

ТЫ

Рго

ТЬг

Зег

Ьеи

Зег

А1а

СХп

Тгр

ТЬг

Рго

Рго

Азп

Уа1

СХп

Ьеи

ТЬг

С1у

Туг

Агд

УаХ

Агд

Уа1

ты

Рго

Ьуз

СХи

Ьуз

ТЬг

СХу

Рго

МеЬ

Ьуз

СХи

Не

Азп

Ьеи

А1а

Рго

Азр

Зег

Зег

Зег

Уа1

УаХ

УаХ

Зег

СХу

Ьеи

МеЬ

УаХ

АХа

ТЫ

Ьуз

Тут

С1и

УаХ

Зег

УаХ

Туг

АХа

Ьеи

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Зег

Агд

Рго

А1а

С1п

СХу

УаХ

УаХ

ТЬг

ТЬг

Ьеи

СХи

Азп

УаХ

Зег

Рго

Рго

Агд

Агд

А1а

Агд

Уа1

ТЬг

Азр

АХа

ТЬг

С1и

ТЬг

ты

Не

ТЫ

Не

Зег

Тгр

Агд

ТЫ

ьуз

ТЫ

СХи

ТЬг

Не ТЫ СХу РЬе СХп УаХ Азр А1а УаХ Рго АХа Азп СХу СХп ТЬг

Рго

11е

СХп

Агд

ТЬг

1Хе

Зуз

Рго

Азр

УаХ

Агд

Зег

Туг

ТЬг

Не

ТЫ

СХу

Ьеи

СХп

Рго

СХу

ТЬг

Азр

Туг

Ьуз

1Хе

Туг

Ьеи

Туг

ТЬг

Ьеи

Азп

Азр

Азп

АХа

Агд

Зег

Зег

Рго

УаХ

УаХ

1Хе

Азр

АХа

Зег

ТЬг

АХа

Не

Азр

АХа

Рго

Зег

Азп

Ьеи

Агд

РЬе

Ьеи

АХа

ТЬг

ТЫ

Рго

Азп

Зег

Ьеи

Ьеи

УаХ

Зег

Тгр

СХп

Рго

Рго

Агд

АХа

Агд

1Хе

ТЫ

СХу

Туг

Не

1Хе

Ьуз

Туг

СХи

Зуз

Рго

СХу

3θν

Рго

Рго

Агд

СХи

УаХ

Уа1

Рго

Агд

Рго

Агд

Рго

СХу

УаХ

ТЬг

СХи

А1а

ТЬг

1Хе

ТЬг С1у Ьеи С1и Рго СХу ТЬг СХи Туг ТЬг 11е Туг УаХ 11е А1а Ьеи Ьуз Азп Азп С1п Ьуз Зег СХи Рго Ьеи Не С1у Агд Ьуз Ьуз ТЬг/ или достаточно сходной аминокислотной последовательностью, которая, к тому же, про37 являет способность связывать соответствующий ретровирус;

и (ίί) вторую аминокислотную последовательность (С8-1), которая корреспондирует с одной частью ШС8-связывающего домена человеческого фибронектина; которая представлена по формуле (8ЕЦ ГО Νο. 2):

Азр 61и Ьеи Рго С.1п Ьеи Уа1 ТЬг Ьеи Рго Н1з Рго Азп Ьеи Низ О1у Рго С1и 11е Ьеи Азр Уа1 Рго 5ег ТЬг;

или достаточно сходной аминокислотной последовательностью, которая к тому же проявляет способность связывать гемопоэтические клетки, такие как первичные половые и/или долговременные репопулирующие (стволовые) клетки.

Ретровирус-связывающая активность полипептида, представленного выше с помощью 8ЕЦ. ГО Νο. 1 (Н-271) показывает концентрационную зависимость и, как указано ниже в примере 8, показывает практически ту же активность, что и СН-271 при высоких концентрациях. То есть ретровирус и клетки-мишени связаны на первое время, как минимум, одной молекулой Н-271 в присутствии высокой концентрации Н-271.

Сильное связывание вируса с доменом, связывающим вирус, функционального материала настоящего изобретения, может использоваться для конструирования систем доставки для вирус-опосредованной терапии посредством широкого круга типов клеток. Для этой цели, полипептид, содержащий ретровирус-связывающий домен функционального материала настоящего изобретения, можно присоединить к любому материалу, содержащему домен, связывающий клетку, который делает этот конструкт специфичным для клеток-мишеней, или может солокализоваться с материалом, содержащим свой домен, связывающий клетку. То есть, полипептид, связывающий определенный вирус, может быть ковалентно присоединен к материалу, связывающему определенную клетку, или они могут быть разными молекулами.

Этот подход обходит прежнюю необходимость конструировать ретровирус-специфичные клеточные линии для каждой клетки-мишени и облегчает выбор функционального материала, обладающего наиболее подходящим доменом, связывающим клетку-мишень, в соответствии с видом отдельных клеток-мишеней. По этой причине, благодаря использованию функционального материала настоящего изобретения, специфическую трансдукциию клеток-мишеней легко осуществить, применяя, в частности, способ настоящего изобретения, в котором смесь функционального материала, обладающего ретровирус-связывающим доменом, и функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, особенно пригоден для переноса требуемого гена в предполагаемую клетку-мишень. Кроме того, новый функциональный материал, созданный в на стоящем изобретении, особенно пригоден для данного способа, повышающего эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов, и родственных методов.

Далее настоящее изобретение подробно иллюстрируют нижеприведенные примеры, но они не рассматриваются как ограничивающие его объем.

Пример 1.

(1) Получение вирусного супернатанта.

Клетки-продуценты ОР+Е-86 (АТСС СРЬ9642), содержащие ретровирусный плазмидный вектор РМ5ηеο, содержащий ген устойчивости к неомицину (Ехр. НетаШк, 23, 630-638 (1995)) культивировали в модифицированной Дюльбекко среде Игла (ΌΜΕΜ, ШН Вюкшепсе), содержащей 10% околоплодной сыворотки теленка (ЕС8, Οίόοο), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (оба от Οίόοο). Все ΌΜΕΜ, использованные ниже, содержали 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Супернатант, содержащий РМ5пео-вирус, собирали путем добавления 4 мл ΌΜΕΜ, содержащей 10% ЕС8, в полусообщающиеся чашки для культивирования в течение ночи. Собранную среду фильтровали через 0,45 микронные фильтры (Μά^οι^) для получения вирусного супернатанта, который хранили перед использованием при -80°С.

Что касается ретровирусной плазмиды, ΤΚΝΕΟ-вектора, (Βίοοά, 78, 310-317. (1991)), ΤΚΝΕΟ-вирусный супернатант получали раздельно, по одним и тем же методикам, что и описанные выше при использовании клеток ОР+ептАт-12 (АТСС СРЬ-9641).

(2) Определение титра вируса в супернатанте.

Титр вируса в супернатанте определяли путем использования клеток МН/3Т3, согласно стандартным методикам (1. νίΓοΙ., 62, 1120-1124 (1998)). А именно, ΌΜΕΜ и 2000 клеток/лунку №Н/3Т3-клеток вносили в 6-луночную планшету для культивирования ткани. После культивирования в течение ночи, в каждую лунку вносили последовательно разбавленный вирусный супернатант вместе с гексадиметринбромидом (ρο1уЬ^еηе. выпущенный фирмой А1бпсй) в конечной концентрации 7,5 мкг/мл. Этот супернатант инкубировали при 37°С в течение 24 ч и затем используемую среду заменяли средой, содержащей О418 (ΟίΗο) в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Данную планшету инкубировали дальше. О418-устойчивые (О418^г) колонии, которые выращивали более 10-12 дней, окрашивали кристаллическим фиолетовым, чтобы произвести подсчет. Количество инфицированных частиц в расчете на 1 мл супернатанта (с&/т1) вычисляли умножением числа колоний на лунку при определенном уровне разведения и использовали его в качестве титра супернатанта для определения количества вирусного супернатан та, добавляемого в последующих экспериментах.

Пример 2.

(1) Получение полипептида, произведенного из фибронектина.

Полипептид, произведенный из человеческого фибронектина, Н-271 (аминокислотная последовательность показана в 8ЕО. ΙΌ Νο. 1 списка последовательностей), получали из Е. со11, содержащей рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую полипептид ρΗΌΙΟΙ, т.е. ЕзсйепсЫа сой ΗΒ101/ρΗΌ101 (ЕЕЕМ ΒΡ-2264), в соответствии со способом, описанным в патенте США № 5198423.

Полипептид, СН-271 (аминокислотная последовательность показана в 8ЕО. ΙΌ Νο. 23 списка последовательностей), получали следующим образом. А именно, ЕзсйепсЫа сой НВ101/рСН101 (ЕЕЕМ ΒΡ-2799) культивировали в соответствии со способом, описанным в вышеуказанном патенте, и СН-271 выделяли из полученной культуры.

А полипептид СН-296 (аминокислотная последовательность показана 8ЕО. ΙΌ Νο. 24) получали следующим образом. А именно, ЕксйепсЫа сой НВ101/рСН102 (ЕЕЕМ ВР-2800) культивировали в соответствии со способом, описанным в вышеуказанном патенте и СР-296 выделяли из полученной культуры.

Полипептид С-274 (аминокислотная последовательность показана в 8ЕО. ΙΌ Νο. 25 списка последовательностей) получали следующим образом. А именно, ЕзсйепсЫа ^1ί 1М109/рТЕ7221 (ЕЕЕМ ВР-1915) культивировали в соответствии со способом, описанным в патенте США № 5102988, и С-274 выделяли из полученной культуры.

Далее полипептид С277-С81 (аминокислотная последовательность показана в 8ЕО ΙΌ. Νο. 29 списка последовательностей) получали следующим образом. А именно, ЕзсйепсЫа ^1ί НВ101/рС825, который был описан в ДР-А 3284700 под ЕЕЕМ Ρ-11339 и был депонирован в вышеуказанном ШВН из 1-1-3 ШдазЫ, Ткикийа8Й1, Шатай-кеп, ηο Будапештскому Договору, под инвентарным номером ЕЕЕМ ВР-5723 (дата первоначального депонирования: 5 марта 1990 г.), культивировали в соответствии со способом, описанным в вышеуказанном патенте, и С277С81 выделяли из полученной культуры.

(2) Получение С-ЕСЕ«А.

Полипептид С-ЕОЕ»А (аминокислотная последовательность показана в 8ЕО ΙΌ. Νο. 4 списка последовательностей) получали следующим образом. А именно, Е. отк содержащую рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую вышеуказанный полипептид рУМН-СЕ»А, т.е. ЕзсйепсЫа той ЧМ 109/рУМНСЕ«А (ЕЕЕМ ВР-5278) культивировали в 5 мл ЕВ-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина при 37°С в течение 8 ч. Этот прокультивированный бульон инокулировали в 500 мл ЬВ бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 1 мМ ΙΡΤΟ (изопропил-в-О-тиогалактопиранозид) и культивировали при 37°С в течение ночи. Бактериальные клетки собирали, суспендировали в 10 мл РВ8 (фосфатно-солевой буфер), содержащего 1 мМ РМ8Е (фенилметансульфонийфторид) и 0,05% ΝοηίώΗ Р-40 и обрабатывали ультразвуком для разрушения полученных клеток. Полученную смесь центрифугировали для получения супернатанта. Для абсорбции 4,000 при 260 нм этого супернатанта добавляли 1 мл 5%-ного полиэтиленимина и эту смесь центрифугировали для получения супернатанта. Полученный супернатант наносили на НИтар-Нерапп-колонку (Рйаттаиа), уравновешенную РВ8. После отмывки с помощью РВ8, не абсорбированной фракции, абсорбированную фракцию элюировали при помощи РВ8, содержащего градиент №1С1 от 0,5 до 2М. Полученный элюат анализировали 8Ό 8-электрофорезом в полиакриламидном геле (8Э8-РАСЕ). который показал наличие двух фракций, содержащих 47 кД полипептид. Одну из фракций, которую элюировали при высокой концентрации №С1, собирали и наносили на колонку 8ирего8е 6 (Рйаттаиа), уравновешенную РВ8, содержащего 1,5 №С1. Полученный элюат анализировали с помощью 8Э8-РАСЕ и, фракцию, содержащую полипептид, около 47 кД, собирали для получения выделенного очисткой С-ЕОЕ»А, который использовали в последующих стадиях.

(3) Получение С-ЕОЕ-С81.

Вначале конструировали плазмиду для экспрессирования требуемого полипептида, СЕСЕ-С81 (аминокислотная последовательность показана в 8ЕО. ΙΌ Νο. 5 списка последовательностей), в ЕзсйепсЫа той в качестве хозяина.

Культивировали ЕзсйепсЫа той

НВ101/рСН102 (РЕЕМ ВР-2800) и из полученных бактериальных клеток получали плазмиду рСН102 щелочно-8И8-методом. РСЕ осуществляли с использованием этой плазмиды в качестве матрицы, а также праймера М4 (Такага 81ιιιζο Οο., Ь16) и праймера С81-8, нуклеотидная последовательность которого показана в 8ЕО. ΙΌ Νο. 9 в списке последовательностей, и амплифицированный фрагмент ДНК в данном реакционном растворе извлекали с помощью этанольного осаждения. Полученный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью NйеI и 8аП (оба фермента от Такага 81ιιιζο СЬ., Ь16.), с последующим электрофорезом в агарозном геле для извлечения из данного геля 970 п.н. фрагмента ДНК.

Затем культивировали ЕзсйепсЫа той ЧМ109/рУМН-СЕ»А (ЕЕЕМ ВР-5278) и из этих полученных бактериальных клеток щелочно8Э8-методом получали плазмиду рУМН-СЕ»А. Реакцию РСЕ осуществляли с использованием этой плазмиды в качестве матрицы, а также праймера СЕ, нуклеотидная последовательность которого показана в 8ЕО. ΙΌ Νο. 10, и праймера

ΡΝΒ, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 11 списка последовательностей, и амплифицированный фрагмент ДНК в этом реакционном растворе извлекали с помощью этанольного осаждения. Этот полученный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью Есо521 (Такага δΐιιιζο Со., Ь1б.) и №ей с последующим электрофорезом в агаровом геле, чтобы извлечь из данного геля 320 п.н. фрагмент ДНК.

Фрагмент ДНК, около 4,1 т.п.н., выделяли путем обработки плазмиды рУМН-СР»А с помощью Есо521 и 8ай и подвергали электрофорезу в агарозном геле, смешивали с вышеуказанным 970 п.н. фрагментом ДНК и, около, 320 п.н. фрагментом ДНК для лигирования их с полученной рекомбинантной плазмидой, которую инсерцировали в Е. сой ГМ109. Плазмиду, полученную из результирующего трансформанта, которая содержала каждую одну молекулу из вышеуказанных трех фрагментов ДНК, отбирали и назвали плазмидой рСР8100. Е. сой ГМ109, трансформированную с помощью плазмиды рСР8100, назвали ЕзсйейсЫа сой ГМ109/ рСР8100. Данная плазмида рСР8100 обладает полученной из фибронектина на С-конце СРСР»А областью, адгезирующей клетку, и кодирует соответствующий полипептид, С-РСР-С81, в котором второй лизин с С-конца РСР заменен на аланин.

Полипептид С-РСР-С81 получали следующим образом. А именно, вышеуказанную Е. сой 1М109/рСЕ8100 культивировали в 5 мл ЬВбульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина, при 37°С в течение 8 ч. Этот прекультивированный бульон инокулировали в 500 мл ЬВбульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 1 мМ ГРТС, и культивировали в течение ночи при 37°С для сбора бактериальных клеток. Полученные в итоге бактериальные клетки суспендировали в 10 мл РВ8 (фосфатно-солевом буфере), содержащем 0,5М №С1, 1 мМ РМ8Р и 0,05% №шбе1 Р-40, и данные бактериальные клетки обрабатывали ультразвуком на разрушение и центрифугировали для получения супернатанта. Этот супернатант наносили на Н1ТгарНерапи-колонку, предварительно уравновешенную с РВ8, содержащем 0,5М №С1, не адсорбированные фракции отмывали с помощью РВ8, содержащего 0,5М №С1, а адсорбированную фракцию элюировали с помощью РВ8, имеющего градиент концентрации №С1 от 0,5 до 2М. Полученный элюат анализировали с помощью δΌδ-полиакриламидного гелевого электрофореза и собирали фракции около 50 кД полипептида, чтобы получить выделенный очисткой СРСР-С81, который использовали в последующих стадиях.

Полученную таким образом аминокислотную последовательность исследовали, от Νконца до пятой аминокислоты выделенного очисткой С-РСР-С81, и обнаружили совмести мость с последовательностью, которая показана в 8 Ер. ГО №. 5 списка последовательностей. Кроме того, измеренный с помощью массспектроскопии молекулярный вес выделенного очисткой С-РСР-С81 совпадал с молекулярным весом, ожидаемым от вышеуказанной аминокислотной последовательности.

(4) Получение С-277-Со1У.

Полипептид С277-Со1У (аминокислотная последовательность показана в 8Ер. ГО №. 6 списка последовательностей) выделяли очисткой следующим образом. А именно, Е. сой, содержащую рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую вышеуказанный полипептид, рТР7520Со1У, т.е. ЕзсйейсЫа сой ГМ109/рТР7520 Со1У (РЕВМ ВР-5277), культивировали в 5 мл ЬВ-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина при 37°С в течение 6,5 ч. Этот прокультивированный бульон инокулировали в 500 мл ЬВ-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина, и культивировали при 37°С. Когда абсорбция при 660 нм достигала 0,6, в этот бульон вносили ГРТС в конечной концентрации доведенной до 1 мМ, и этот бульон культивировали в течение ночи, чтобы собрать бактериальные клетки. Полученные бактериальные клетки суспендировали в 10 мл РВ8, содержащего 1 мМ ЭДТА, 0,05% №шбе1 Р-40 и 2 мМ РМ8Р, и обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин до разрушения клеток. Раствор с разрушенными клетками центрифугировали и полученный в итоге супернатант наносили на Везоигсе р-колонку (Рйагтааа) для получения не адсорбированной фракции, содержащей требуемый полипептид.

Данную фракцию наносили на НГТгарНерапи-колонку, уравновешенную с помощью РВ8. После отмывания не адсорбированной фракции с помощью РВ8 адсорбированную фракцию элюировали с помощью РВ8, имеющего градиент №С1 от 0 до 0,5М. Полученный элюат анализировали в 8Ь8-РАСЕ и собирали соответствующие фракции, содержащие 48 кД полипептид, для получения выделенного очисткой С277-Со1У, который использовали в последующих стадиях.

(5) Получение Со1У.

Вначале конструировали плазмиду для экспрессирования полипептида Со1У (аминокислотная последовательность показана в 8Ер. ГО №. 6 списка последовательностей), в ЕзсйепсЫа сой в качестве хозяина.

Культивировали ЕзсйейсЫа сой НВ 101/ рТР7520Со1У (РЕВМ ВР-5277) и из полученных в итоге бактериальных клеток щелочно-8Ь8методом получали плазмиду рТР7520Со1У. Эту плазмиду обрабатывали с помощью Ν^Ι и ВатШ (оба фермента от Такага 81и^о Со., Ыб.), с последующим электрофорезом в агарозном геле для извлечения из данного геля фрагмента ДНК, около, 0,58 т.п.н. Извлеченный фрагмент смешивали с плазмидным вектором рЕТ8С (№43 уадеп), обработанного с помощью Ысо1 и ВатН1, для лигирования с ним. Итоговую рекомбинантную плазмиду интродуцировали в Е. со11 ВЬ21 для получения трансформанта, из которого получали плазмиды, отобрали плазмиду, содержащую только одну молекулу вышеуказанного фрагмента ДНК, около 0,58 т.п.н., и назвали рЕТСо1У.

Е. со11 ВЬ21, трансформированную вышеуказанной плазмидой рЕТСо1У, то есть ЕксЬег1с1па со11 ВЬ-21/рЕТСоГУ, культивировали в течение ночи в 10 мл ЬВ-бульона, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, при 37°С. 0,2 мл этого прекультивированного раствора инокулировали в 100 мл Ь-бульона, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, с последующим культивированием при 37°С. Когда абсорбция достигала при 600 нм 0,4, в него вносили 1РТС до конечной концентрации 1 мМ, с последующим культивированием в течение ночи, чтобы собрать бактериальные клетки. Итоговые бактериальные клетки суспендировали в 5 мл РВ8 (фосфатно-солевой буфер), содержащем 1 мМ ЭДТА, 0,5% №шбе1 Р-40, 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина и 2 мМ РМ8Е, эти клетки подвергали ультразвуковой обработке на разрушение, с последующим центрифугированием для получения супернатанта. Супернатант наносили на ШТгарНерапп-колонку, уравновешенную с РВ8, не адсорбированные фракции вымывали с помощью РВ8, а адсорбированную фракцию элюировали с помощью РВ8, содержащего 0,5М №С1. Полученный элюат анализировали в 8Ό8полиакриламидном гелевом электрофорезе и подтверждали практическую гомогенность, около, 18 кД полипептида. Полученный таким образом, выделенный очисткой, Со1У использовали в последующих стадиях.

(6) Получение Н2-547.

Плазмиду для экспрессирования полипептида Н2-547 (аминокислотная последовательность показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 13 списка последовательностей) конструировали следующим образом. Культивировали ЕксЬепсЫа со11 НВ101/рСН101 (ГЕЯМ ВР-2800) и, с использованием щелочно-808-метода, из культивированных клеток получали плазмиду рСН102. Осуществляли РСЯ, используя эту плазмиду в качестве матрицы, а также праймер 128, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 15 списка последовательностей, и праймер 14А, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 16 списка последовательностей, с последующим электрофорезом в агаровом геле для извлечения из данного геля фрагмента ДНК, около 0,8 т.п.н., кодирующего связывающий гепарин полипептид фибронектина. Извлеченный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью Шо1 и ВашШ (оба фермента от Такага 81ιιιζο Со., Ыб.) и смешивали с рТУ118N (Такага 81ιιιζο Со., Ыб.), обработанного с помощью ^оТ-ВатНТ, для лигирования с ним, который инсерцировали в Е. со11 ДМ109. Из итогового трансформанта получали плазмиды, отбирали плазмиду, содержащую вышеуказанный фрагмент ДНК и назвали плазмиду рЯН1.

Плазмидный вектор, рЫЖ-отрА, (Т1е ЕМВО 1оигпа1, 3, 3437-2442 (1984)), обрабатывали с помощью ВатШ и НшсП (Такага 81ιιιζο Со., Ыб.) для извлечения фрагмента ДНК, около 0,9 т.п.н., содержащего липопротеиновую терминаторную область. Извлеченный фрагмент смешивали с плазмидой рЯН1, обработанной с помощью ВатШ-НшсП, для их лигирования, чтобы получить плазмиду рЯН1-Т, содержащую 1ас-промотор, фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, связывающий гепарин, и липопротеиновый терминатор, в данном порядке.

Фрагмент ДНК, около 3,1 т.п.н., получали в результате обработки плазмиды рЯН1-Т, с помощью Ν1κΙ и 8са! (оба фермента от Такага 81ιιιζο Со., Ыб.), а фрагмент ДНК, около 2,5 т. п.н., получали в результате обработки плазмиды рЯН1-Т, соответственно, с помощью 8ре Ι (Такага 81ιιιζο Со., Ыб.) и 8саЕ и эти два фрагмента лигировали с получением плазмиды рЯН2-Т, содержащей 1ас-промотор, открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, в котором два полипептида, связывающие гепарин, соединены в тандем, и липопротеиновый терминатор, в данном порядке. Нуклеотидная последовательность вышеуказанной открытой рамки считывания показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 17 списка последовательностей.

Полипептид Н2-547 получали следующим образом. Готовили четыре колбы Эрленмейера по 500 мл, снабженные перегородкой, содержащие 120 мл ЬВ-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина, в который инокулировали Е. со11 НВ 101, трансформированную с помощью вышеуказанной плазмиды рЯН2-Т, то есть Е§сЬепсЫа со11 НВ101/рЯН2-Т, для культивирования в течение ночи при 37°С. Культивированные клетки собирали центрифугированием, суспендировали в 40 мл лизирующего буфера (50 мМ трис-НС, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ №С1, 1 мМ ОТТ, 1 мМ РМ8Е, рН 7,5) и обрабатывали эти бактериальные клетки ультразвуком на разрушение. Супернатант, полученный путем центрифугирования, наносили на колонку ШдЬ 1гар Нерапп (РЬагтааа), уравновешенную буфером для выделения (50 мМ трис-НС1, рН 7,5). Не адсорбированные в колонке фракции вымывали с помощью этого же буфера, с последующим элюированием с помощью буфера для выделения, имеющего градиент концентрации ΝηΟ от 0 до 1 М.

Полученный элюат анализировали с помощью 8О8-полиакриламидного гелевого электрофореза и собирали фракции, содержащие полипептид, обладающий молекулярным весом около 60000, для получения выделенного очисткой препарата Н2-547. Количество белка, со45 держащегося в этом полученном препарате, анализировали с помощью ВСА ΡΚΟΤΕΙΝ А88АУ КЕАСЕЭТ (Р1егсе) с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта, свидетельствующего о получении около 10 мг Н2-547.

Исследовали аминокислотную последовательность от Ν-конца до пятого остатка, выделенного очисткой полученного таким образом Н2-547, и обнаружили совместимость с аминокислотной последовательностью Н2-547, ожидаемой из нуклеотидной последовательности, показанной в 8Ер. ΙΌ Νο. 17 списка последовательностей, минус метионин на Ν-конце (ее последовательность показана в 8Ер. ГО Νο. 13 списка последовательностей). Молекулярный вес выделенного очисткой Н2-547, измеренного с помощью масс-спектрометрии, совместим с ожидаемым молекулярным весом из аминокислотной последовательности, показанной в 8 Ер. ΙΌ Νο. 13 списка последовательностей.

(7) Получение СН2-826.

Плазмиду для экспрессирования полипептида СН2-826 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Ер. ГО Νο. 14 списка последовательностей) конструировали следующим образом. РСК осуществляли с использованием вышеуказанной плазмиды рСН102 в качестве матрицы, а также праймера СЬ8, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. ГО Νο. 18 списка последовательностей, и праймера СЬА, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. ГО Νο. 19 списка последовательностей, с последующим электрофорезом в агаровом геле для извлечения фрагмента ДНК, около 0,8 т.п.н., кодирующего адгезирующий клетку полипептид фибронектина. Этот полученный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью №οΙ и ВдШ (оба фермента от Такага 8Ьиζο Сс., Ыб.) и смешивали с рТУ118^ обработанной с помощью NсοI-ΒатΗI, для их лигирования, который инсерцировали в Е. той ДМ109. Из итогового трансформанта получали плазмиды и плазмиду, содержащую вышеуказанный фрагмент ДНК, отобрали и назвали плазмидой рКС1. Фрагмент ДНК, около 2,5 т.п.н., полученный путем обработки плазмиды рКС1, с помощью 8реί и 8сак и фрагмент ДНК, около 3,9 т.п.н., полученный путем обработки вышеуказанной плазмиды рКН2-Т с помощью ΝΙκί и 8сак смешивали дли их лигирования, чтобы получить плазмиду рКСН2-Т, кодирующую полипептид, в котором два полипептида, связывающие гепарин, тандемно соединены с Сконцевым полипептидом, адгезирующим клетку. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания в этой плазмиде рКСН2-Т, кодирующей этот полипептид, показан в 8Ер. ГО Νο. 20 списка последовательностей.

Полипептид СН2-826 получали в соответствии с тем же способом, который использовали для получения полипептида Н2-547, описанного в примере 2(6). Фракции, содержащие полипептид, обладающий молекулярным весом около 90000, собирали из элюата колонки ШдЬ 1гар Нерапп, для получения выделением очисткой СН2-826.

(8) Получение Η28-537.

Плазмиду для экспрессирования полипептида Н28-537 (аминокислотная последовательность показана в 8Ер. ГО Νο. 30 списка последовательностей) конструировали следующим образом. РСК осуществляли с использованием вышеуказанной плазмиды рСН102 в качестве матрицы, а также праймера С818, нуклеотидная последовательность которого показана в 8 Ер. ГО Νο. 31 списка последовательностей, и праймера С81А, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. ГО Νο. 32 списка последовательностей, с последующим электрофорезом в агаровом геле для извлечения фрагмента ДНК, около 0,1 т.п.н., кодирующей адгезирующий клетку полипептид фибронектина. Извлеченный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью №οΙ и ВатШ (оба фермента от Такага 81ιιιζο Са, Ыб.) и смешивали с рТУ118К, обработанной с помощью NсοI-ΒатΗI, для их лигирования, который инсерцировали в Е. той ДМ109. Из итогового трансформанта получали плазмиды и плазмиду, содержащую вышеуказанный фрагмент ДНК, отбирали и назвали плазмидой рК81.

Плазмидный вектор рINIII-οтрА1 обрабатывали с помощью ВатШ и НшсП для извлечения фрагмента ДНК, около 0,9 т.п.н., содержащего область липопротеинового терминатора. Извлеченный фрагмент смешивали с плазмидой рК81, обработанной с помощью ВатШ -НшсП, для их лигирования с получением плазмиды рК81-Т, содержащей ίас-промотор, фрагмент ДНК, кодирующий С8-1-область полипептида и липопротеиновый терминатор, в данном порядке.

Получали фрагмент ДНК, около 2,4 т.п.н., полученный путем обработки этой плазмиды рК81-Т с помощью ΝΙκΙ и 8сай и фрагмент ДНК, около 3,3 т.п.н., полученный путем обработки вышеуказанной плазмиды рКН2-Т с помощью 8рей 8саI и РзИ (Такага 81ιιιζο Ыб.).

Их лигировали с получением плазмиды рКН28Т, содержащей ίас-промотор, открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, обладающий такой структурой, в которой два полипептида, связывающие гепарин, тандемно соединены, а затем к его С-концу присоединяли С8-1-область, и липопротеиновый С-терминатор, в данном порядке. Нуклеотидная последовательность вышеуказанной открытой рамки считывания показана в 8Ер. ГО Νο. 32 списка последовательностей.

Полипептид Н28-573 получали в соответствии с тем же методом, который использовали для получения полипептида Н2-547, описанного в примере 2 (6). Фракции, содержащие полипеп47 тид, обладающие молекулярным весом около 60000, собирали из элюата колонки Ηί§1ι 1гар Нерапп для получения очищенного Η28-573.

(9) Иммобилизация функционального материала на планшете.

Для использования планшета, на котором иммобилизовали функциональный материал для проведения эксперимента по заражению клеток ретровирусом (6-луночный планшет для культивирования ткани, Ра1соп), иммобилизацию осуществляли в соответствии со следующими операциями. А именно, раствор каждого функционального материала, описанного в вышеуказанных примерах, в ΡΒ8 в подходящей концентрации, наносили на планшет в количестве 2 мл на лунку (донная площадь 9,6 см²) и планшет инкубировали под УФ-светом при комнатной температуре в течение 1 ч, не закрывая его, а затем еще полчаса в закрытом состоянии. Затем раствор полипептида заменяли на 2 мл ΡΒ8, содержащего 2% бычьего сывороточного альбумина (Β8Α, Βоейπηде^ Маппкеип) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Планшет промывали с помощью ΡΒ8, содержащего 25 мМ ΗΕΡΕ8. Сенсибилизированный контрольный планшет, в котором иммобилизовали Β8Α, получали в соответствии с тем же способом, который приведен выше, за исключением того, что инкубацию с полипептидом не осуществляли. Для эксперимента генного переноса (вирусное заражение) в нижеприведенных примерах, если не указано иначе, использовали вышеуказанный 6-луночный планшет для тканевой культуры. Если концентрация функционального материала, используемого для иммобилизации на планшете, указывалась, количество полипептида на единицу площади дна лунки описывали с использованием в качестве единицы пмоль/см² (и мкг/см²). Например, когда иммобилизацию осуществляли путем использования в вышеуказанном планшете 2 мл 48 мкг/мл раствора Н-271 (донная площадь 9,6 см²), то это соответствует описанию иммобилизация была осуществлена с 333 пмоль/см² (10 мкг/см²) Н-271. А планшет, иммобилизованный С-296, используемый для культивирования не прилипших клеток (ТР-1, Η Б-60) после трансдукции, получали путем иммобилизации 48 пмоль/см² (3 мкг/см²) раствора СН-296, в соответствии с вышеприведенными операциями. В последующих примерах вирусное заражение клеток-мишеней всегда осуществляли в среде без ро1уЬгепе. Если количество вируса, клеток, среды и т.п. указано, то и описано соответствующее количество на лунку, если не оговорено особо.

Пример 3.

(1) Генный перенос с использованием смеси функциональных материалов.

Нижеследующие эксперименты осуществляли для изучения эффекта на генный перенос в случае иммобилизации на планшете смеси ма териала, связывающего клетку, и материала, связывающего ретровирус. Вначале каждый полипептид иммобилизовали на планшете путем использования 32 пмоль/см² (1,5 мкг/см²) СЕСЕ«Л, смеси 32 пмоль/см² (1 мкг/см² С-274 и 32 пмоль/см² (0,5 мкг/см²) РОР (Бес!оп Бюкшзоп) в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9). После преинкубации 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 с£и вируса РМ5пео, на соответствующих планшетах, и контрольном планшете, покрытом Β8Α при 37°С в течение 30 мин, эти планшеты тщательно промывали с помощью ΡΒ8. В каждый из этих планшетов вносили 2 мл среды БМЕМ, содержащей 2000 клеток ΝΙΗ/ЗТЗ, и инкубировали при 37°С в течение 2 ч в отсутствие ро1уЬгепе. Η адгезированные клетки собирали декантированием, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для отделения их от планшета. Полученные клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины. Одну половинную порцию культивировали в БМЕМ, а другую порцию культивировали в БМЕМ, содержащей С418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней и подсчитывали появляющиеся колонии. Подбор определенного соотношения числа устойчивых С418 (О418^г) колоний по отношению к колониям, полученным в среде без 0418, в качестве эффективности генного переноса, показан на фиг. 1. На фиг. 1 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 1, в случае 2-х часового ретровирусного заражения, при использовании смеси С-274 и РОР, колонии О418^г получали с той же эффективностью генного переноса, что и С-ΡΟΡ^Α, где эти два полипептида ковалентно соединены, хотя эффективность генного переноса, полученная с использованием одного лишь РОР была ниже, чем с использованием С-ΡΟΡ^Α.

С целью подробного изучения эффект иммобилизации одного лишь С-274 и одного лишь РОР сравнивали с эффектом иммобилизации их смеси. А именно, оценку осуществляли исключая планшеты, полученные с 32 пмоль/см² (1 мкг/см²) С-274, 32 пмоль/см² (0,5 мкг/см²) РОР и смеси, соответственно, из 32 пмоль/см² С-274 и 32 пмоль/см² РОР одним и тем же способом, который описан в примере 2 (9). Полученные результаты показаны на фиг. 2. На фиг. 2 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 2, при использовании планшета, на котором осуществляли иммобилизацию смесью из С-274 и РОР, эффективность генного переноса была выше, чем при использовании планшета, на котором иммобилизовали только РСР. А на планшете, на котором иммобилизацию осуществляли с помощью С-274, который не обладает доменом, связывающим какой-либо ретровирус, колонии С418^г не появлялись. Это показывает, что при объединении РСР, который обладает доменом, связывающим ретровирус, с С-274, который обладает доменом, связывающим клетку, можно повысить эффективность генного переноса, в сравнении с переносом, полученным при использовании только РСР, и что ковалентное соединение полипептидов не обязательно требуется для создания такого эффекта этими объединенными полипептидами.

(2) Генный перенос с использованием смеси функциональных материалов.

В соответствии с тем же способом, который описан в примере 3 (1), оценку осуществляли за исключением того, что полипептид, обладающий доменом, связывающий ретровирус, заменяли на Со1У. В этом эксперименте исследовали эффект смешивания С-274 и Со1У в различных молярных соотношениях. А именно, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), иммобилизацию на планшетах осуществляли путем использования, соответственно, 330 пмоль/см² (6 мкг/см²) Со1У, смеси из 330 пмоль/см² (10 мкг/см²) С-274 и 330 пмоль/см² Со1У (молярное соотношение С-274 : Со1У=10:10), смеси из 100 пмоль/см² (3 мкг/см²) С-274 и 330 пмоль/см² Со1У (3 : 10), смеси из 33 пмоль/см² (1 мкг/см²) С-274 и 330 пмоль/см² Со1У (1:10), 330 пмоль/см² (16 мкг/см²) С277Со1У и 330 пмоль/см² (10 мкг/см²) С-274. При использовании полученных таким образом планшетов, эффект ретровирусного заражения исследовали в соответствии с тем же способом, который описан выше. Полученные результаты показаны на фиг. 3. На фиг. 3, на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 3, в случае 2-х часового заражения, эффективность заражения планшета, иммобилизованного Со1У, была менее 1/2 от планшета, иммобилизованного С277Со1У, тогда как инфекционная эффективность планшета, на котором осуществляли иммобилизацию смесью из Со1У и его 1/10 количеством С-274, была той же, что и у планшета, иммобилизованного С277-Со1У. Следовательно, ретровирусное инфицирование, усиливающее активность С-274, выясняли по наблюдению для случая с РСР. Этот эффект был несколько снижен в случае, в котором количество молекул С-274 относительно молекул Со1У было повышено. При покрытии смесью, содержащей те же количества Со1У и С-274, существенных различий между данной смесью и одним лишь Со1У не имелось.

(3) Генный перенос с использованием смеси функциональных материалов.

С целью исследовать ретровирусное воздействие на эффективность генного переноса при иммобилизации смесью материала, обладающего доменом, связывающим клетку, и материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, осуществили нижеследующий эксперимент. Прежде всего, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), осуществили иммобилизацию планшетов с помощью, соответственно, 32 пмоль/см² (1 мкг/см²) С-274, 333 пмоль/см² (10 мкг/см²) Н271 и смесью из 32 пмоль/см² (1 мкг/см²) С-274 и 333 пмоль/см² (10 мкг/см²) Н-271. После преинкубации 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 сГи вируса РМ5пео, на соответствующих планшетах при 37°С в течение 30 мин, планшеты тщательно промывали с помощью РВ8. В каждый из этих планшетов вносили 2 мл среды ЭМЕМ, содержащей 2000 клеток ΝΙΗ/3Τ3, и инкубировали при 37°С в течение 2

ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для отделения их от планшета. Полученные клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины. Одну половинную порцию культивировали в ЭМЕМ, а другую порцию культивировали в ЭМЕМ, содержащей С418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали. Подбор соотношения числа С418^г-колоний относительно колоний, полученных в среде без С418, в качестве эффективности генного переноса, данные результаты показаны на фиг. 4. На фиг. 4, на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 4, при использовании планшета, на котором иммобилизовали смесь из С-274 и Н-271 (молярное соотношение=1:10), эффективность инфицирования была существенно повышена. На планшете, с иммобилизованным С-274, генный перенос не наблюдали.

(4) Генный перенос с использованием С277-С81.

С целью исследовать ретровирусное действие на инфекционную эффективность, при использовании С277-С81, в качестве материала, обладающего доменом, связывающим клетку, и иммобилизацию его смеси и материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, осуществили нижеследующий эксперимент. В качестве материала, связывающего ретровирус, использовали полилизин [(Ьу§)_п, поли-Ьлизиингидробромид, молекулярный вес: 50000100000, Аако Риге Сйетка1 Со., ЬЙ.] и Н-271. В качестве соответствующих клеток, использовали не адгезирующие клетки, ТР-1-клетки (АТСС СВЬ-2003). Вначале, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), осуществили иммобилизацию на планшетах путем использования нижеследующих растворов: С-277-С81 (33 пмоль/см², 1,1 мкг/см²), полилизина (133 пмоль/см², 10 мкг/см²), смеси из С-277-С81 (33 пмоль/см²) и полилизина (133 пмоль/см²), Н-271 (333 пмоль/см², 10 мкг/см²) и смеси из С-277-С81 (33 пмоль/см²) и Н-271 (333 пмоль/см²) и СН-296 (33 пмоль/см², 2,1 мкг/см²), соответственно. В каждый планшет вносили среду ΒΡΜΙ-1640 [содержащую 5 нг/мл 6М-СР8 (Ре1го Теей), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина], содержащую 1х10⁴ сГи вируса ΤΚΝΕΟ, 1х10⁴ ТР-1-клеток и планшет инкубировали при 37°С в течение 24 ч. После инкубации собирали не адгезированные клетки путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с планшета. Полученные клетки объединяли. Одну из пяти порций итоговой клеточной суспензии переносили в два планшета, покрытые СН-296, и инкубировали в течение 24 ч. Затем в одной из порций меняли среду на вышеуказанную среду, а среду из другой порции меняли на вышеуказанную среду, содержащую 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 8 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали. Частоту 6418^г - (эффективность переноса гена) колоний вычисляли на основе численностей колоний, появившихся в присутствии и отсутствии 6418.

Полученные результаты показаны на фиг.

5. На фиг. 5 на абсциссе указаны соответствующие используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса. На фиг. 5 (а) отражает использование соответствующего полилизина в качестве материала, связывающего ретровирус, и (Ь) отражает использование Н-271. В сравнении с планшетом, на котором иммобилизован только материал, связывающий ретровирус, эффективность генного переноса существенно выше благодаря использованию полилизина или Н-271 вместе с С277-С81, обладающим доменом, связывающим клетку.

(5) Получение полипептида, происходящего из эритропоэтина.

Полипептидное производное, которое представляет собой эритропоэтин, слитый с глутатион-8-трансферазой (68Т-Еро), получали для использования для генного переноса в клетки, обладающие эритропоэтиновым рецептором. Его аминокислотная последовательность показана в 8ЕО. ΙΌ Νο. 34 списка последовательностей. В этой последовательности аминокислотная последовательность от 233-й аминокислоты до 398-й аминокислоты корреспондирует с эритропоэтином.

Вначале с помощью нижеследующих операций сконструировали плазмиду для экспрессии 68Т-Еро. РСК. осуществляли с использованием кДНК-библиотеки, полученной из печени человеческого плода (С1оие1есй) в качестве матрицы, и праймеров ЕРР1 и ЕРК1, показанных в 8ЕО. ΙΌ №. 35 и 36 списка последовательностей). Часть этой реакционной смеси отобрали и, использовали в качестве матрицы в дополнительной РСК в присутствии праймеров ЕРР2 и ЕРК2 (соответствующие нуклеотидные последовательности праймеров ЕРР2 и ЕРК2 показаны в 8ЕО. ΙΌ №. 37 и 38 списка последовательностей). Амплифицированные фрагменты ДНК извлекали из реакционной смеси, обрабатывали с помощью ЕсоК1 и ВатН1 (оба фермента от Такага 8Нихо Со., Ыб.) и затем подвергали агарозному электрофорезу для извлечения фрагмента ДНК, около 520 п.н., который содержит область, кодирующую эритропоэтин. Полученный итоговый фрагмент смешивали с плазмидным вектором ρΓν118Ν (Такага 8Нихо Со., Ыб.), который обрабатывали с помощью ЕсоК1 (Такага 811ихо Со., Ыб.) и ВатН1 для лигирования его с данной плазмидой. Затем, этой плазмидой трансформировали Е. сой 1М109. Трансформант, удерживающий вышеуказанную плазмиду, отбирали из итоговых трансформантов, чтобы получить плазмиду, которую назвали плазмидой рЕРО. Затем полученную плазмиду рЕРО обрабатывали с помощью ЕсоК1 и 8ай (Такага 811ихо Со., Ыб.) и подвергали агарозному электрофорезу для извлечения фрагмента ДНК, около 0,5 т.п.н. Этот фрагмент смешивали с плазмидным вектором р6ЕХ5Х-3 (Рйагтааа), обработанного с помощью ЕсоК1 и 8а11, чтобы лигировать их. Этой полученной плазмидой трансформировали Е.соН 1М109. Трансформант, удерживающий вышеуказанную плазмиду отбирали из полученных трансформантов, чтобы выделить плазмиду. Плазмида была названа р68ТЕРО. Эта плазмида кодирует 68Т-ЕРО, в которой аминокислотная последовательность эритропоэтина присоединена к С-концу глутатион-8-трансферазы, произведенной из данного вектора. Нуклеотидную последовательность, кодирующая 68Т-ЕРО в плазмиде р68ТЕРО, показана в 8ЕО. ΙΌ №. 39 списка последовательностей.

Полипептид 68Т-ЕРО получали с помощью следующих операций. Готовили семь культуральных пробирок, каждая содержала по 5 мл ЬВ-бульона, содержащего по 100 мкг/мл ампициллина, и Е. сой 1М109, трансформированную с помощью вышеуказанной плазмиды р68ТЕРО, ЕксйепсЫа сой ГМ109/р68ТЕРО, инокулировали в каждый бульон, с последующим инкубированием при 37°С в течение ночи. Затем готовили семь 2-х литровых колб Эрленмейера, каждая содержала 500 мл этого же бульона, и в каждую колбу инокулировали порцию в 5 мл вышеуказанной культуры, с последующим инкубированием при 37°С. Через 3,5 ч после начала инкубации, вносили !РТ6 до конечной концентрации 1 мМ и продолжали инкубацию еще 3,5 ч. По завершению культивиро вания клетки извлекали из этого культурального бульона центрифугированием, суспендировали в 100 мл ΡΒδ, содержащем 1 мМ ΡΜδΕ и 1 мМ ЭДТА и разрушали с помощью ультразвуковой обработки. К обработанному раствору добавляли 100 мл ΡΒδ, содержащий 1 мМ ΡΜδΕ, 1 мМ ЭДТА и 2% Тритона Х-100. Полученную смесь ставили на лед на 30 мин и центрифугировали для получения супернатанта. Полученный супернатант фильтровали через 0,45 мкм фильтр (Μίΐΐίροΐΐ) и наносили на колонку глутатионδеρ11а11ο5е 4Β (ТНаопааа, 3 мл), уравновешенную ΡΒδ. После промывания колонки с помощью ΡΒδ колонку элюировали 50 мМ Трис-НС1, содержащем 10 мМ глутатиона (рН 8,0). Полученный элюат анализировали в δΌδполиакриламидном гелевом электрофорезе и собирали фракцию, содержащую полипептид, обладающий молекулярным весом, около, 44000. Эту фракцию диализовали против ΡΒδ. Диализованный образец наносили на колонку Кебюитее β (ТНаопааа), уравновешенную ΡΒδ. После промывания колонки с помощью ΡΒδ, колонку элюировали с помощью ΡΒδ, обладающего градиентом Ναί'Ί от 0 до 0,6М. В соответствии с тем же способом, который описан выше, эту колонку элюировали с помощью 50 мМ Трис-НС1, содержащего глутатион (рН 8,0), чтобы собрать фракцию, содержащую полипептид, обладающий молекулярным весом, около, 44000. Полученную фракцию с этим полипептидом подвергали ультрафильтрации с помощью ί'οηίΓΚοη 10 (ΛιηΚοη) для концентрирования до около 50 мкл. Далее ее фильтровали с помощью иИгайее ί’3ΟνδΤΡΕ· (Μίΐΐίροκ) и полученный фильтрат подвергали гель-фильтрующей хроматографии с использованием колонки δ^Γώιχ 200 (ТНаопааа, уравновешенная с ΡΒδ). Элюированную фракцию, содержащую полипептид, обладающий молекулярным весом, около, 44000, собирали и использовали в качестве ΟδΤ-ΕΡΟ-полипептидного раствора в последующих экспериментах. В этом ΟδΤ-Εροрастворе около 50% общего белка составлял ΟδΤ-Ερο.

(6) Генный перенос в клетки, экспрессирующие эритропоэтиновый рецептор.

Эффект генного переноса с использованием эритропоэтина в качестве материала, обладающего активностью, связывающей клетку, изучали с применением двух видов клеток, ΤΕ1, которые экспрессируют эритропоэтиновый рецептор, и НЬ-60 (АТСС ССЬ-240), которые не экспрессируют этот эритропоэтиновый рецептор. В данном исследовании, вышеуказанное полипептидное производное эритропоэтина (ΟδΤ-Ερο) использовали в качестве эритропоэтина, а полилизин использовали в качестве материала, связывающего ретровирус. Вначале, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), иммобилизацию на планшетах осуществляли путем использования, соот ветственно, 34 пмоль/см² (1,5 мкг/см²) ΟδΤ-Ερο, полилизина (133 пмоль/см², 10 мкг/см²), смеси ΟδΤ-Ερο (34 пмоль/см²) и полилизина (133 пмоль/см²). В каждый планшет вносили среду, содержащую 1х10⁴ с& вируса ΤΚΝΕΟ и 1х10⁴ клеток и этот планшет инкубировали при 37°С в течение 24 ч. В качестве среды использовали среду ΒΡΜΙ1640 (содержащую 5 нг/мл ΟΜ-ί'Έδ, 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина) для ΤΕ-1, а для НЬ-60 использовали среду ΒΡΜΙ (Νίδδΐιί, содержащую 10% ΕСδ, 50 единиц/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина). После инкубации путем декантирования собирали не прилипшие клетки, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с планшета. Собранные клетки объединяли. Порции, соответствующие одной пятой этой полученной клеточной суспензии, переносили в два планшета, иммобилизованные с СН-296, и инкубировали в течение 24 ч. Затем среду в одной из порций заменяли вышеуказанной средой, а среду в другой порции заменяли вышеуказанной средой, содержащей 0418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 8 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали. Частоту Ο418^г-кοлοний (эффективность генного переноса) вычисляли на основе численностей колоний, возникающих в присутствии и отсутствии 0418.

Полученные результаты показаны на фиг.

6. На фиг. 6 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а, соответственно, на ординате указана эффективность генного переноса. В случае использования ΤΕ-1-клеток, как показано на фиг. 6(а), несмотря на то, что генный перенос имел место с некоторым избытком в планшете, в котором иммобилизовали только полилизин, повышенная эффективность генного переноса была получена в присутствии ΟδΤ-Ερο. С другой стороны, в случае использования НЬ-60, как показано на фиг. 6(Ь), в присутствии ΟδΤ-Ερο повышенной эффективности генного переноса не наблюдали. Эти результаты показывают, что генный перенос, специфичный для клетки-мишени, возможен, благодаря использованию эритропоэтина.

Кроме того, эксперимент по генному переносу в ΤΕ-1-клетки осуществляли путем замены материала, связывающего ретровирус, на Н2547. В соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), иммобилизацию на планшетах осуществляли с использованием, соответственно, Н2-547 (333 пмоль/см², 20 мкг/см²), ΟδΤ-Ερο, корреспондирующего с 34 пмоль/см², 1,5 мкг/см²), и смеси из ΟδΤ-Ερο (34 пмоль/см²) и Н2-547 (333 пмоль/см², 20 мкг/см²). Одновременно осуществляли контрольный эксперимент с использованием планшета с иммобилизованным ΒδΑ.

Полученные результаты показаны на фиг.

7. На фиг. 7 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате, соответственно, указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 7, в случае использования Н2-547, эффективность генного переноса в ТЕ-1-клетки была повышенной в присутствии 68Т-Еро.

(7) Генный перенос с использованием шариков, на которых иммобилизована смесь функциональных материалов.

Можно ли повысить эффективность инфицирования ретровирусом путем использования шариков, на которых иммобилизованы оба материала, материал, обладающий доменом, связывающим клетку, и материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, или не иммобилизованы - не исследовали.

Шарики, на которых иммобилизовали полипептиды, были получены в соответствии с нижеследующими операциями. В качестве шариков использовали полистироловые шарики, имеющие диаметр 1,14 мкм (Ро1уЬеаб§ Ро1уз(угепе Мкгокрйеге, производимые Ро1у8с1епсе). К 20 мкл 2,5%-ной суспензии вышеуказанных шариков добавляли 80 мкл этанола и 2 мл разных полипептидных растворов в РВ8, оставляя затем на ночь при 4°С. К этому добавляли В8А и РВ8 с получением 4 мл 1%-ной суспензии В8А/РВ8. Шарики удаляли из полученной суспензии путем центрифугирования и вновь суспендировали в 5 мл 1%-ной В8А/РВ8. Затем полученную суспензию оставляли при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы получить суспензию шариков, с иммобилизованным полипептидом. В качестве полипептидных растворов использовали 100 мкг/мл С-274, 100 мкг/мл Н-271, 100 мкг/мл СН-271, 100 мкг/мл СН-296 и смесь из 100 мкг/мл Н-271 и 10 мкг/мл С-274. В качестве контроля получали шарики, покрытые 2%-ным В8А, в соответствии с тем же указанным способом.

Одну десятую порцию шариков, иммобилизованных полипептидом, полученных таким образом, извлекали из вышеуказанной суспензии и инкубировали при 37°С в течение ночи вместе, соответственно, с 2000 ТЕ-1-клеток и с 1000 сГи супернатанта вируса ΤΚΝΕΟ. Эти клетки извлекали и суспендировали в среде КРМ1 [содержащей 10% ЕС8, 5 нг/мл 6М-СЕ8 (Ре1го1есй), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина], содержащей 0,3% Бакто-агара (ЭгГсо) и высевали в 35 мл чашку на изготовленную вышеуказанную среду, содержащую 0,5% Бакто-агара. Использовали две среды, содержащие 0,75 мг/мл 6418 и без 6418. Чашку инкубировали в 5%-ном СО₂ при 37°С в течение 14 дней. Колонии, которые появлялись в присутствии 6418 и в отсутствие 6418, подсчитывали и вычисляли возникшее соотношение 6418^г-колоний (эффективность генного переноса).

Полученные результаты показаны на фиг.

8. На фиг. 8, на абсциссе указан использованный материал и В 8 А, а на ординате указана эффективность генного переноса. При использовании шариков, на которых иммобилизована смесь Н271 и С-274, получали повышенную эффективность генного переноса, по сравнению с использованием шариков, на которых иммобилизовали лишь один Н-271, и шариков, на которых иммобилизовали СН-271 или СН-296, обладающих, соответственно, доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку, на одной и той же молекуле.

Пример 4.

(1) Генный перенос с использованием Е6Е и С-Е6Е.А.

Эффект Е6Е (Вес1оп Эескиъоп) и полипептида, представленного в 8ЕЦ. ГО №. 4 (СЕ6Е»А), на ретровирусное инфицирование исследовали в опыте, образования колоний клеток ΝΙΗ/ЗТЗ. А именно, оценку осуществляли в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), путем иммобилизации на планшетах, соответственно, Е6Е (132 пмоль/см², 2,25 мкг/см²), и С-Е6Е»А (133 пмоль/см², 6,3 мкг/см²) , и иммобилизации В8А на контрольном планшете. В каждый планшет вносили 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 сГи вируса РМ5пео, и преинкубировали при 37°С в течение 30 мин, с последующей тщательной отмывкой с помощью РВ8. В этот планшет вносили 2 мл среды ΌΜΕΜ, содержащей 2000 клеток ΝΙΗ/3Τ3, и инкубировали при 37°С в течение 24 ч с последующей инкубацией на селективной среде, содержащей 0,75 мг/мл 6418, в течение 10 дней. Колонии окрашивали и подсчитывали. Полученные результаты показаны на фиг. 9. На фиг. 9 на оси абсцисс указан используемый материал, а на оси ординат указано количество появившихся колоний.

Как показано на фиг. 9, в контрольном планшете, в котором иммобилизовали В8А, колонии не возникли. С другой стороны, при использовании планшета, иммобилизованного Е6Е и С-Е6Е»А, колонии 6418^г зарегистрировали в обоих планшетах. Эти результаты показывают, что и Е6Е и С-Е6Е»А, оба, обладают доменом, связывающим ретровирус, и что СЕ6Е»А, в котором был присоединен связывающий клетку домен полипептида из фибронектина, показывает наилучший генный перенос с Е6Е.

(2) Связь между концентрацией С-Е6Е'А и эффективностью генного переноса.

Эффективности генного переноса сравнивали путем использования планшетов, покрытых различными концентрациями С-Е6Е»А. Инфицирование ретровирусом осуществляли в соответствии с теми же операциями, которые описаны в примере 4 (1), за исключением планшета, полученного с использованием 0,521 пмоль/см² (0,0247 мкг/см²) - 5,21 пмоль/см² (0,247 мкг/см²) С-Е6Е»А, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), и планшета, иммобилизованного В8А (контрольный планшет). После вирус-инфицирующей обработки не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с этого планшета. Клетки, собранные таким образом, объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две части, одну половинную порцию культивировали в ЭМЕМ, а другую - культивировали в ЭМЕМ, содержащей С418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней, а количество появившихся колоний подсчитывали. Соотношение численности С418'-колоний и численности колоний, полученных в среде не содержащей С418, рассматривали в качестве эффективности генного переноса.

Полученные результаты показаны на фиг. 10. На фиг. 10 на оси абсцисс указаны используемые концентрации С-ЕСЕ«А, иммобилизованного на планшете, а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Результат контрольного планшета в эксперименте также наносили на график полипептидной концентрации от 0 пмоль/см². Как показано на фиг. 10, эффективность генного переноса повышалась концентрационно-зависимо, как увеличение концентрации иммобилизованного С-РСР»А.

(3) Генный перенос в НЬ-60-клетки.

Что касается инфицирования ретровирусом клетки НЬ-60 (АТСС ССЬ-240), которая не является адгезирующей клеткой, влияние присутствия разных полипептидов исследовали в соответствии с нижеследующими операциями. А именно, в каждый планшет, полученный с использованием 100 пмоль/см² С-Р6Р»А (4,8 мкг/см²) или С-РСР-С81 (5,1 мкг/см²), в соответствии со способом из примера 2 (9), и контрольный планшет, на котором иммобилизовали В8А, вносили 2 мл среды КРМ1 (содержащей 10% ГС8, 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина), содержащей 1х10⁴ с£и вируса ΤΚΝΉΟ и 2000 клеток НЬ-60, с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч. После инкубации не прилипшие клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали пипетированием и эти клетки объединяли. Каждую 1/2 порцию полученной итоговой клеточной суспензии переносили в планшет, покрытый СН-296, инкубировали в течение 24 ч и меняли данную среду на среду КРМ1, содержащую С418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. После инкубации при 37°С в течение 12 дней подсчитывали численность появившихся колоний. Соответствующая численность колоний С418^г, полученных с использованием каждого полипептида, показана на фиг. 11. На фиг. 11, соответственно, на оси абсцисс указан соответствующий функциональный материал, а на оси ординат указана численность колоний С418^г.

Как показано на фиг. 11, численность С418'-колоний отчетливо выше при использовании для иммобилизации С-РСР»А или С-РСРС81 на планшете, что свидетельствует о том, что эти полипептиды способствуют инфицированию НЬ-60-клеток ретровирусом.

(4) Генный перенос в мышиные клетки костного мозга.

Для изучения влияния ГОР, С-РСР»А и СРСР-С81 на ретровирусное инфицирование мышиных миелоидных клеток осуществляли нижеследующий эксперимент.

Мышам (С3Н/Не1), в возрасте 6-8 недель, внутрибрюшинно вводили 150 мг/кг 5фторурацила (5-РИ, ΛιηΚ^ο), через 2 дня после введения выделяли бедренную и большеберцовую кость для сбора костного мозга. Полученный итоговый костный мозг подвергали центрифугированию в градиенте плотности с использованием Ρκο11-Ην]Ρ·κ|ΐκ (плотность 1,0875 г/мл, Рйагтааа) для получения фракции моноядерных клеток низкой плотности, которые использовали в качестве клеток костного мозга мыши.

Полученные клетки костного мозга мыши престимулировали перед инфицированием с помощью ретровируса, в соответствии со способом по Ьиккеу с соавт. (Βίοοά, 80, 396 (1992)). А именно, мышиные клетки костного мозга вносили в α-МЕМ (Οί^ο), содержащую 20% ГС8, 100 единиц/мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-6 (гЫЬ-6, Атдеп), 100 нг/мл рекомбинантного фактора мышиных стволовых клеток (гт8СГ, Атдеп), 50 единиц/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина при плотности клеток 1х10⁶ клеток/мл, с последующей инкубацией при 37°С в течение 48 ч в 5%-ном СО₂. Эти престимулированные клетки, включая и адгезированные к емкости, собирали отсасыванием с помощью пипетки.

Каждые 2 мл среды, использованной для вышеуказанной престимуляции, содержащей 1х10⁶ престимулированных клеток и 1х10⁴ с& вируса РМ5пео, вносили в планшет, содержащий 236 пмоль/см² (4 мкг/см²) ГОР, 169 пмоль/см² (8 мкг/см²) С-Р6Р»А или 159 пмоль/см² (8 мкг/см²) С-Р6Р-С81, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), и в В8А-иммобилизованный планшет (контрольный планшет), с последующей инкубацией при 37°С. Через 2 ч в каждый планшет добавляли свежую среду (2 мл), содержащую то же количество вируса, с последующим продолжением инкубации в течение 22 ч. После завершения инкубации не прилипшие клетки собирали путем декантирования, а клетки, адгезированные к планшету, собирали с использованием диссоциирующего клетки буфера (СОВ, не содержащий ферменты, ОФто), эти клетки объединяли и дважды отмывали с помощью этого же буфера. Подсчитывали численность собранных клеток. Собранные клетки подвергали анализу на НРР

СЕС (Высокопотенциальные пролиферативныеколониеобразующие клетки).

ΗΡΡ-СЕС-анализ осуществляли в соответствии со способом по ВгаШеу с соавт. (Айк!. 1. Ехр. Вю1. Μοά. 8ск, 44, 287-293 (1966)). В качестве среды использовали среду 1%/0,66%-ного наслоенного мягкого агара с 0418, в конечной концентрации 1,5 мг/мл, или без него. К нему добавляли инфицированные клетки в количестве 1х10⁴ клеток/лунку, с последующей инкубацией при 37°С в течение 13 дней в 10%-ном С0₂. После завершения инкубации колонии, которые возникали, наблюдали под инверсионным микроскопом и подсчитывали численность высокоплотных колоний (обладающие диаметром не менее чем 0,5 мм), полученных в ΗΡΡСЕС, для вычисления частоты встречаемости (эффективность генного переноса) 0418^гколоний. Полученные результаты показаны на фиг. 12. На фиг. 12 на оси абсцисс указан используемый функциональный материал и В8А, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 12 на планшетах, покрытых с помощью В8А, в качестве контроля, 0418^г-колонии не возникают, тогда как при использовании планшетов, на которых иммобилизовали вышеуказанные полипептиды, получали 0418^г-колонии. Эффективности генного переноса были повышены на порядок для Е0Е, СΕΟΕ·Α и С-Е0Е-С81, что дает основание полагать, что наличие адгезирующего соответствующую клетку домена, полученного из фибронектина, и полипептида С8-1, который обладает активностью домена, связывающегося с клетками, повышает инфицирование клеток костного мозга с помощью ретровируса.

(5) Связь между концентрацией С277Со1У, используемого для иммобилизации на планшете, и эффективность генного переноса.

Эффективности генного переноса сравнивали путем использования планшетов, покрытых различными концентрациями С277-Со1У, в соответствии с нижеследующими операциями. Соответствующие планшеты готовили в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), применяя 0,1 пмоль/см² (0,1 мкг/см²) - 416 пмоль/см² (20 мкг/см²) С277-Со1У. 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 с Гн вируса РМ5псо, вносили в соответствующие планшеты и осуществляли преинкубирование при 37°С в течение 30 мин с последующим тщательным отмыванием с помощью РВ8. В каждый планшет вносили 2 мл среды 6МЕМ, содержащей 2000 клеток NIΗ/3Т3, и такой планшет инкубировали при 37°С в течение 24 ч.

Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, адгезированные с планшетом, собирали путем трипсиновой обработки для их отделения от планшета и эти клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины и одну половинную порцию культивировали в 6МЕМ, а другую порцию инкубировали в 6МЕМ, содержащей 0418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл при 37°С в течение 10 дней, а численность появляющихся колоний подсчитывали. Соотношение численности 0418^г-колоний и численности колоний, полученных в среде, не содержащей 0418, брали в качестве эффективности генного переноса. Полученные результаты показаны на фиг. 13. На фиг. 13 на абсциссе указан используемый функциональный материал, а на ординате указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 13, при использовании иммобилизованного С277-Со1У планшета, эффективность генного переноса была повышена в зависимости от концентрации С277-Со1У, используемого для иммобилизации.

(6) Генный перенос с использованием полилизина.

Связывание полилизина [(Ьу8)п| исследовали в нижеследующих операциях. В качестве полилизина использовали поли-Ь-лизиингидробромид (молекулярный вес: 50000-100000, \Уако Риге Сбетка1) и в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), его иммобилизовали на планшете путем использования 133 пмоль/см² (10 мкг/см²) раствора полилизина в РВ8. Эффективности генного переноса в этом планшете и в контрольном планшете, в котором иммобилизовали В8А, оценивали в соответствии с тем же способом, который описан в примере 4 (2). Полученные результаты показаны на фиг. 14. На фиг. 14 на оси абсцисс указан функциональный материал, а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 14, в контрольном планшете, покрытом В8А, колония не возникает, тогда как на планшете, иммобилизованном полилизином, появляются 0418^г-колонии, что дает основание полагать, что после промывки ретровирус остается на планшете потому, что этот ретровирус связывается с полилизином, иммобилизованном в данном планшете.

Пример 5.

(1) Генный перенос с использованием полимера полипептида.

Перенос гена с использованием полимера полипептида осуществляли без иммобилизации полипептида в планшете. В планшет, покрытый В8А, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), вносили 2 мл 6МЕМ, содержащей 1000 сГи вируса РМ5пео, 2000 клеток №Щ/3Т3 и соответствующий полипептид (Н271, СН-271, Н2-547 и СН2-826) в конечной концентрации 0,63 нмоль/мл, с последующей инкубацией в течение 24 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с планшета. Затем эти клетки объединяли. В качестве контроля этим же способом осуществляли этот же эксперимент без добавления какого-либо полипептида. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины и одну половинную порцию культивировали в ΌΜΕΜ. Другую порцию культивировали в ΌΜΕΜ, содержащую 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали. Беря соотношение численности 6418^г-колоний относительно численности колоний, появляющихся в данной среде без 6418, в качестве эффективности генного переноса, получали результаты, показанные на фиг. 15. На фиг. 15 на оси абсцисс указан соответствующий используемый функциональный материал, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.

Как видно на фиг. 15, эффективность генного переноса в присутствии Н2-547 существенно выше, чем эффективность переноса в присутствии Н-271, а, в случае СН2-826, эффективность генного переноса равна или выше эффективности, полученной с СН-271.

Далее осуществляли более подробное исследование в соответствии с тем же способом, который описан выше, за исключением того, что в качестве полипептидов использовали СН271, СН-296 и Н2-547 в количествах, 0,126 нмоль (конечная концентрация 0,063 нмоль/мл) и 1,26 нмоль (конечная концентрация 0,63 нмоль/мл) для соответствующих планшетов. Полученные результаты показаны на фиг. 16. На фиг. 16, на оси абсцисс указан используемый функциональный материал и его количества, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.

Как следует из фиг. 16, при использовании Н2-547, эффективность генного переноса была значительно выше, чем при использовании любого количества полипептида СН-271 и СН-296.

(2) Генный перенос в мышиные клетки костного мозга с использованием Н2Б-573.

Для изучения влияния Н2Б-573 на ретровирусное заражение клеток костного мозга, осуществили эксперимент генного переноса в мышиные клетки костного мозга, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 4 (4).

Мышиные клетки костного мозга получали в соответствии с тем же способом, который описан в вышеприведенном примере, и полученные клетки престимулировали.

В качестве планшетов для ретровирусного инфицирования, кроме планшета, иммобилизованного Н2Б-573 (160 пмоль/см², 10 мкг/см²), планшета, иммобилизованного СН-296 (132 пмоль/см², 6,3 мкг/см²), в качестве контроля использовали планшет, иммобилизованный ВБА. Соответствующие результаты, полученные в НРР-СРС-анализе показаны на фиг. 17. На фиг. 17 на оси абсцисс указан используемый функциональный материал, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 17, на планшете, покрытом ВБА, в качестве контроля, высоко плотностные колонии 6418^г не появляются. Хотя на планшете, иммобилизованном СН-296, получали около 50% эффективности генного переноса, высокоплотностные колонии 6418^г были получены с повышенной эффективностью в случае использования планшета, иммобилизованного Н2Б-573.

Пример 6.

(1) Генный перенос с использованием функционального материала без иммобилизации.

Влияние на эффективность ретровирусного инфицирования при наличии полипептида в планшете без иммобилизации исследовали следующим образом. А именно, в каждый планшет, покрытый ВБА, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), вносили 2 мл среды ΌΜΕΜ, содержащей 100 е!и вируса ΡΜ5ποο. 2000 клеток ΝΙ4/3Τ3 и СН-296 в конечной концентрации 10, 40, 250 мкг/мл (каждая, соответствующая 0,158, 0,632 и 3,950 нмоль/мл), с последующей инкубацией в течение 24 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а прилипшие к планшету клетки собирали путем трипсиновой обработки для отделения их от данного планшета. Эти клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию переносили в 10 см чашку для культивирования клеток, с последующей инкубацией в течение 24 ч. Имеющуюся среду меняли на ΌΜΕΜ, содержащую 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл, с последующей инкубацией в течение еще 10 дней. В качестве контроля, отдельно, готовили планшет без СН-296 и планшет, в которой иммобилизовали 32 пмоль/см² (2 мкг/см²) или иммобилизовали 127 пмоль/см² (8 мкг/см²) СН-296, и осуществляли вышеуказанные операции путем добавления вирусного супернатанта и клеток к нему. Подсчитывали численность 6418^г-колоний, полученных таким образом, и результаты суммировали в табл. 1.

Таблица 1

Планшет	СН-296	Численность 6418гколоний
ВБА	-	5
ВБА	10 мкг/мл	41
ВБА	40 мкг/мл	66
ВБА	250 мкг/мл	92
СН-296 (32 пмоль/см2)	-	55
СН-296 (127 пмоль/см2)	-	47

Как показано в табл. 1, при совместном присутствии в растворе клеток, вируса и СН296, численность 6418^г-колоний значительно повышалась по сравнению с отсутствием СН296. Эта численность была равной или выше численности, полученной при использовании соответствующего планшета, покрытого СН296. Кроме того, при добавлении раствора СН

296, с вышеуказанными соответствующими концентрациями, в планшет, покрытый ΒЗА, и после его отстаивания в течение некоторого времени, промывания планшета и использования в эксперименте по вирусному инфицированию, численность полученных 6418^г-кοлοний была аналогичной той, которую получали в случае без добавления СН-296. Из этого следует, что СН-296 не связывается с иммобилизованным ΒЗА. По этой причине предполагается, что вышеуказанное ретровирусное инфицирование, усиливающее эффект СН-296, не связано с адгезией СН-296 в данном растворе с планшетом во время инкубации.

(2) Генный перенос с использованием функционального материала без иммобилизации.

Влияние на эффективность ретровирусного инфицирования, при совместном присутствии полипептида в планшете без иммобилизации, исследовали следующим образом. А именно, в каждый планшет, покрытый ΒЗА, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), вносили 2 мл среды ИМЕМ, содержащей 1000 с£и вируса РМ5иео, 2000 клеток МИ/3Т3 и С-Р6Р»А, ί^οΐν и С277-Сο1V, соответственно, в конечной концентрации 1,67 нмоль/мл, с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а прилипшие к планшету клетки собирали путем трипсиновой обработки для отделения их от планшета. Эти клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины, одну половинную порцию культивировали с ИМЕМ, а другую порцию культивировали с ИМЕМ, содержащей 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней и подсчитывали численность появляющихся колоний. Соотношение численности 6418'кοлοний и численности колоний, полученных в среде, не содержащей 6418, рассматривали в качестве эффективности генного переноса. Полученные результаты показаны на фиг. 18. На фиг. 18 на оси абсцисс указаны соответствующие используемые функциональные материалы, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 18, когда вирусное инфицирование имеет место в присутствии каждого полипептида, получают более высокую эффективность генного переноса. Таким образом понятно, что даже когда эти полипептиды не иммобилизованы на планшетах, инфицирование соответствующим ретровирусом усиливается.

(3) Генный перенос в не адгезированные клетки путем использования функционального материала без иммобилизации.

Влияние на эффективность генного переноса в не адгезированные клетки с помощью полипептида без иммобилизации исследовали следующим образом. А именно, в каждый планшет, приготовленный с помощью 333 пмоль/см² (10 мкг/см²) Н-271 и в соответствии с тем же способом, описанным в примере 2 (9), и в контрольный планшет, в который иммобилизовали ΒЗА, вносили 2 мл среды ЯРΜI (содержащей 5 нг/мл 6М-СРЗ, 50 единиц/мл пенициллина и 50 мг/мл стрептомицина), содержащую 1х10⁴ с£и вируса ТКЫЕО и 1х10⁴ клеток из ТР-1клеток. В соответствующий планшет, иммобилизованный ΒЗА, вносили затем Н-271 в конечной концентрации 50 мкг/мл (1,67 нмоль/мл) Н271. Каждый планшет инкубировали при 37°С в течение 24 ч. После инкубации собирали не адгезированные клетки, а клетки, прилипшие к данному планшету, собирали путем трипсиновой обработки. Эти клетки объединяли. Каждую 1/5 порцию из этой итоговой клеточной суспензии переносили в два планшета, покрытые СН296, инкубировали в течение 24 ч. В одном планшете имеющуюся среду меняли на вышеуказанную среду, а среду из другого планшета меняли на вышеуказанную среду, содержащую 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. После инкубации при 37°С в течение 8 дней, подсчитывали численность появляющихся колоний. Соответствующую частоту встречаемости (эффективности генного переноса) вычисляли на основе численности колоний, появляющихся в присутствии или отсутствии 6418. Полученные результаты показаны на фиг. 19. На фиг. 19 на оси абсцисс указан используемый материал и его форма, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 19, при использовании не иммобилизованного Н-271, получают более высокую эффективность генного переноса, чем ту, которую получают при использовании иммобилизованного Н-271. Следовательно, показано, что при использовании Н-271 для генной трансдукции ТР-1-клеток, не иммобилизованное состояние предпочтительней.

(4) Объяснение механизма ретровирусного заражения, усиленное с помощью полипептида.

Чтобы выяснить каким образом усиливается ретровирусное инфицирование клеток с помощью полипептида без иммобилизации, как показано в вышеприведенном примере, получаемое за счет связывания соответствующих клеток с данным полипептидом и связывания данного полипептида с соответствующим ретровирусом, осуществляли нижеследующий эксперимент. Во-первых, в иммобилизованные ΒЗА планшеты, полученные по способу, описанному в примере 2 (9), вносили 2 мл ИМЕМ, содержащие 1000 клеток из клеток NIΗ/3Т3, с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч. Эту среду удаляли из планшетов, и в каждый вносили 2 мл 1,67 нмоль/мл, соответственно, Н-271, СН-271, С-Р6Р»А и, в качестве контроля, РΒЗ, с последующей инкубацией при 37°С в течение 2,5 ч. Эти планшеты промывали уравновешенным солевым раствором Хэнкса (НВ88, ΟίΗο), содержащем 25 мМ НЕРЕ8. В каждый из планшетов вносили 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 с£и вируса РМ5пео, с последующей инкубацией при 37°С в течение 30 мин. Затем эти планшеты промывали с помощью РВ8. В каждый из этих планшетов вносили 2 мл ΌΜ^Μ, с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки, чтобы отделить их от планшета. Эти клетки объединяли соответственно. Каждую клеточную суспензию, полученную таким образом, делили на две половины, одну половинную порцию культивировали с ΌΜΗΜ, а другую порцию культивировали с ΌΜΗΜ, содержащую О418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней и численность появляющихся колоний подсчитывали. Соотношение численности О418^г-кοлοний и численность колоний, полученный в среде, не содержащей О418, рассматривали в качестве эффективности генного переноса. Полученные результаты показаны на фиг. 20. На фиг. 20, на оси абсцисс указаны используемые функциональные материалы и контроль, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 20, когда вирусное заражение осуществляли после обработки соответствующих клеток данного планшета с помощью соответствующего вышеуказанного полипептидного раствора, наблюдали отчетливое повышение эффективности инфицирования. Это позволяет предполагать, что эффективность инфицирования повышается, благодаря связыванию данного полипептида с клетками и последующему связыванию ретровируса с данным полипептидом в клетках.

Осуществляли подобный эксперимент, за исключением того, что вносимый полипептид заменяли, соответственно, на 0,29 нмоль/мл СЕОЕ»А и 0,79 нмоль/мл СН-296. Полученные результаты показаны на фиг. 21. На фиг. 21 на оси абсцисс указаны используемые функциональные материалы и контроль, а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 21, повышение эффективности генного переноса наблюдали в случае СЕОЕ»А и СН-296. Таким образом, вышеуказанная активность была подтверждена в С-ЕОЕ»А. Вместе с тем было показано, что СН-296 обладает той же активностью, способствующей заражению ретровирусом, по тому же механизму.

Пример 7.

(1) Генный перенос с использованием функционального материала, иммобилизованного на шариках.

Действительно ли эффективность инфицирования ретровирусом могла бы быть повышена при использовании шариков, покрытых соответ ствующим функциональным материалом, или нет, исследовали в соответствии с нижеследующими операциями. В качестве шариков применяли полистироловые шарики, обладающие диаметром 1,14 мкм (Τοίν^αάδ Рο1у8ίу^еηе Μ^Γο^^ι^, выпускаемые Рο1у8с^еηсе). К 20 мкл 2,5%-ной суспензии вышеуказанных шариков добавляли 80 мкл этанола, и сюда же добавляли 2 мл 40 мкг/мл СН-296, и оставляли на ночь при 4°С. К этому добавляли В8А и РВ8 для получения 1%-ной суспензии В8А/РВ8 (4 мл), шарики извлекали центрифугированием и снова получали 5 мл 1%-ной суспензии В8А/РВ8, оставляемой при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы получить суспензию из шариков, иммобилизованных СР-296. В соответствии с этим же способом, готовили шарики в качестве контроля, за исключением того, что иммобилизацию осуществляли с использованием 2% В8А, вместо раствора из СН-296.

Из вышеуказанной суспензии отбирали одну десятую порцию (0,5 мл) и данные шарики извлекали центрифугированием. Сюда же вносили ΌΜΗΜ, содержащую 1000 с£и вируса РМ5пео, с последующей инкубацией при 37°С в течение 30 мин. Эти шарики дважды промывали с помощью 1% В8А/РВ8, суспендировали в 2 мл ΌΜ^Μ, 1 мл из которой переносили на планшет. Сюда же добавляли 1 мл ΌΜ^Μ, содержащей 3х10⁵ клеток, из клеток МН/3Т3, с последующей инкубацией в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 24 ч. Вслед за этим данную среду меняли на ΌΜΗΜ, содержащую О418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл с последующей инкубацией в течение еще 10 дней. Колонии, которые появлялись, окрашивали и подсчитывали. Полученные результаты показаны в табл. 2.

Как показано в табл. 2, если использовали шарики, покрытые СН-296, появлялось 264 О418^г-колонии, тогда как в случае использования шариков, покрытых В8А, в качестве контроля, резистентные колонии не получали. Это дает основание полагать, что даже иммобилизация СН-296 на шариках, влияет как и в случае иммобилизации в планшете, на увеличение эффективности ретровирусного инфицирования.

Таблица 2

Шарики	Число О418^-кοлοний
Иммобилизованные В8А (контроль)	0
Иммобилизованные СН-296	264

(2) Генный перенос в мышиные клетки костного мозга, на которых иммобилизовали функциональный материал.

Способность повышать эффективность ретровирусного инфицирования мышиных клеток костного мозга с помощью шариков, покрытых соответствующим функциональным материалом, исследовали в соответствии с нижеследующими операциями.

Мышиные клетки костного мозга готовили в соответствии с тем же способом, который описан в примере 4 (4) и престимулировали.

В каждый планшет, покрытый В 8 А, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), и в аналогичный планшет, покрытый с помощью В8А, с 1/10 порцией шариков, иммобилизованных СН-296, полученных в примере 7 (1), вносили 2 мл соответствующей среды, используемой для вышеуказанной престимуляции, содержащей 1х10⁶ престимулированных клеток и 1х10⁴ сГи вируса РМ5пео, с последующей инкубацией при 37°С. Через 2 ч в каждый планшет вносили свежее количество среды (2 мл), содержащей то же количество вируса, с последующей инкубацией в течение 22 ч. После завершения инкубации, не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали с использованием буфера, диссоциирующего клетки (СОВ, не содержащего ферментов, С1Ьсо), эти клетки объединяли и дважды промывали этим же буфером. Подсчитывали численность полученных клеток. Собранные клетки подвергали НРР-СРС-анализу, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 4 (4).

Полученные результаты показаны на фиг. 22. На фиг. 22, на оси абсцисс указан используемый функциональный материал и его форма, а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Как показано в данных результатах, понятно, что эффективность инфицирования мышиных клеток костного мозга ретровирусом также можно повысить при использовании шариков, иммобилизованных СН-296.

Пример 8.

(1) Генный перенос с использованием Н271 и СН-271.

Влияние Н-271 на ретровирусное инфицирование оценивали путем преинкубирования вирусного супернатанта в планшетах, покрытых Н-271 и СН-271, которые, соответственно, способствуют ретровирусному инфицированию, затем планшеты тщательно промывали, определяя остающееся количество соответствующего вируса, путем анализа образующих колонию клеток ΝΙΗ/3Τ3, и сравнивали полученные результаты в обоих планшетах. А именно, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), планшеты готовили с различными концентрациями, соответственно, Н-271 [от 67 пмоль/см² (2 мкг/см²) до 333 пмоль/см² (10 мкг/см²) ] и СН-271 [от 67 пмоль/см² (4 мкг/см²) до 333 пмоль/см² (20 мкг/см²)]. В каждый планшет вносили 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 сГи вируса РМ5пео, и преинкубировали при 37°С в течение 30 мин, с последующей тщательной промывкой с помощью РВ8. В этот планшет вносили 2 мл среды ЭМЕМ. содержащей 2000 клеток ΝΙΗ/3Τ3, и инкубировали при 37°С в течение 24 ч, с последующей инкубацией на селективной среде, со держащей 0,75 мг/мл С418, в течение 10 дней. Колонии окрашивали и подсчитывали. Полученные результаты показаны на фиг. 23. Фиг. 23 представляет собой график, иллюстрирующий связь между функциональным материалом и эффективностью переноса гена. На фиг. 23 на оси абсцисс указано количество используемого функционального материала, а на оси ординат указано количество С418^г-колоний.

Как показано на фиг. 23, при использовании иммобилизованного С-271 планшета, количество появляющихся С418^г-колоний было одним и тем же, невзирая на концентрацию соответствующего полипептида. С другой стороны, в случае Н-271, количество возникающих колоний повышалось в зависимости от соответствующей концентрации, как увеличения в концентрации данного полипептида, используемого для иммобилизации и, в случае планшета, приготовленного с 333 пмоль/см² Н-271, количество возникших колоний было почти тем же, что и с СН-271. Это дает основание полагать, что с СН271 может быть получена эквивалентная эффективность вирусного инфицирования, при достаточном количестве Н-271, иммобилизованном на планшете.

(2) Генный перенос с использованием СРСР.А.

Влияния С-ЕСЕ«А на ретровирусное инфицирование исследовали в опыте с ΝΙΗ/ЗТЗклеточной колонией. А именно, оценку осуществляли в соответствии с тем же способом, который описан в примере 8 (1), за исключением того, что использовали планшеты, приготовленные с 127 пмоль/см² (6 мкг/см²) с-ЕСЕ«А, 127 пмоль/см² (7,6 мкг/см²) СН-271 и 127 пмоль/см² (8 мкг/см²) СН-289, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), и контрольный планшет, в которой иммобилизован В8А. Полученные результаты показаны на фиг. 24. Фиг. 24 представляет собой график, иллюстрирующий связь между функциональными материалами и эффективностями генного переноса. На фиг. 24 на оси абсцисс указаны функциональные материалы и В8А, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.

Как показано на фиг. 24, в контрольном планшете, в которой иммобилизован В8А, колония не возникает. С другой стороны, при использовании планшета, в котором иммобилизован С-ЕСЕ«А, подтверждалось появление С418^гколоний, а численность этих колоний была той же, что и на планшетах с использованием СН271 и СН-296. Это предполагает, что домен, связывающий ретровирус, обладающий фактически теми же функциями, что и домены СН271 и СН-296, присутствует в молекуле ЕСЕ.

(3) Генный перенос с использованием СЕСЕ-С81.

Влияния полипептида С-ЕСЕ-С81 на ретровирусное инфицирование исследовали в соответствии с нижеследующими операциями. А именно, анализ МН/3Т3-клеточной колонии осуществляли в соответствии с тем же способом, который описан в примере 8 (1), благодаря использованию планшетов, приготовленных, соответственно, с 133 пмоль/см² С-РСР-С81 (6,7 мкг/см²), С-РСР»А (6,3 мкг/см²), СН-271 (8 мкг/см²) и СН-296 (8,4 мкг/см²), в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9). Полученные результаты показаны на фиг. 25. Фиг. 25 представляет собой график, иллюстрирующий связь между соответствующими функциональными материалами и эффективностями переноса соответствующего гена. На фиг. 25 на оси абсцисс указаны используемые функциональные материалы, а на оси ординат указано число С418^г-кοлοний.

Как показано на фиг. 25, почти та же численность колоний, возникающих на планшетах, в которых эти четыре полипептида были, соответственно, иммобилизованы, свидетельствует, что молекула С-РСР-С81 обладает активностью, связывающей ретровирус, эквивалентной активностям других полипептидов.

(4) Генный перенос с использованием С277-СοίV.

Влияния С277-СеГУ на ретровирусное инфицирование оценивали в соответствии с тем же способом, что и в примере 8 (1), благодаря использованию планшеты, приготовленной со 124 пмоль/см² (6,4 мкг/см²) С277-СοίV и контрольным планшетом, в которой иммобилизован В8А. Полученные результаты показаны на фиг. 26. Фиг. 26 представляет собой график, иллюстрирующий связь между соответствующим функциональным материалом и эффективностью генного переноса. На оси абсцисс указан соответствующий используемый функциональный материал и В8А, а на оси ординат указано число С418^г-колоний.

Как показано на фиг. 26, в контрольном планшете, покрытом с помощью В8А, колония не возникает. С другой стороны, при использовании планшета, иммобилизованного С277ί,'οίν. С418^г-кοлοнии возникают. Это свидетельствует о том, что соответствующий ретровирус, остающийся в планшете после отмывки, содержит домен, связывающий вирус в ^ίνмолекуле.

Как описано выше, в настоящем изобретении создали способ для эффективного генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса. Когда данный способ настоящего изобретения осуществляли путем подбора материала, связывающего клетку, подходящего для клетокмишеней, трансформированные клетки-мишени можно удобно получать с высокой эффективностью генного переноса без какой-либо потребности в специальном ретровирусном векторе. При пересадке этих трансформированных клеток позвоночным, легко получать трансформированных животных, и настоящее изобретение пригодно для различных технических областей, таких как медицинские науки, технология клетки, генная инженерия и технология развития. Кроме того, в настоящем изобретении разработали культуральную среду, содержащую соответствующий функциональный материал или его смесь, и набор реагентов для осуществления опосредованного ретровирусом генного переноса в клетки-мишени. Благодаря использованию этой культуральной среды и набора, можно легко и эффективно осуществлять локализацию ретровируса, трансдукцию экзогенного гена в клетки-мишени и тому подобное.

Краткое пояснение чертежей

Фиг. 1 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью фактора роста фибробластов, функционального материала, содержащего этот фактор роста фибробластов и смеси данного фактора роста фибробластов и, адгезирующего соответствующую клетку, доменного полипептида фибронектина.

Фиг. 2 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью фактора роста фибробластов, смеси фактора роста фибробластов и, полипептида домена адгезии клетки, фибронектина, и, адгезирующего соответствующую клетку, доменного полипептида фибронектина.

Фиг. 3 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью коллагенового фрагмента, смеси из связывающего клетку доменного полипептида фибронектина и коллагенового фрагмента, функционального материала, содержащего этот коллагеновый фрагмент, и смеси из связывающего клетку доменного полипептида фибронектина.

Фиг. 4 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью фибронектинового фрагмента и смеси из этого фибронектинового фрагмента и связывающего клетку доменного полипептида фибронектина.

Фиг. 5 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью связывающего клетку доменного полипептида фибронектина, полилизина, смеси полилизина и связывающего клетку доменного полипептида фибронектина, фибронектинового фрагмента и смеси фибронектинового фрагмента и связывающего клетку доменного полипептида фибронектина.

Фиг. 6 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью эритропоэтинового производного, полилизина и смеси из эритропоэтинового производного и полилизина.

Фиг. 7 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью эритропоэтинового производного, полимерного фрагмента фибронектина и смеси из данного эритропоэтинового производного и данного полимерного фрагмента фибронектина.

Фиг. 8 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в соответствующие клетки-мишени с помощью шариков, на которых иммобилизован фибронектиновый фрагмент, соответствующие шарики, на которых иммобилизован связывающий клетку доменный полипептид фибронектина и шарики, на которых иммобилизована смесь из фибронектинового фрагмента и связывающего клетку доменного полипептида фибронектина.

Фиг. 9 представляет собой график, иллюстрирующий трансформацию клеток-мишеней с помощью фактора роста фибробластов и соответствующего функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов.

Фиг. 10 представляет собой график, иллюстрирующий определенную связь между количеством функционального материала, содержащего используемый фактор роста фибробластов, и эффективностью генного переноса.

Фиг. 11 представляет собой график, иллюстрирующий трансформацию клеток-мишеней с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов.

Фиг. 12 представляет собой еще один график, иллюстрирующий трансформацию клетокмишеней с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов.

Фиг. 13 представляет собой график, иллюстрирующий связь между эффективностью генного переноса в клетки-мишени и количеством функционального материала, содержащего используемый коллагеновый фрагмент.

Фиг. 14 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью полилизина.

Фиг. 15 представляет собой график, иллюстрирующий трансформацию клеток-мишеней с помощью фибронектинового фрагмента и полимерного фрагмента фибронектина.

Фиг. 16 представляет собой еще один график, иллюстрирующий трансформацию клетокмишеней с помощью фибронектинового фрагмента и полимерного фрагмента фибронектина.

Фиг. 17 представляет собой еще один график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью фибронектинового фрагмента и полимерного фрагмента фибронектина.

Фиг. 18 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов, коллагеновый фрагмент и функциональный материал, содержащий этот коллагеновый фрагмент.

Фиг. 19 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью фибронектинового фрагмента.

Фиг. 20 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью функционального материала, содержащего фибронектиновый фрагмент и фактор роста фибробластов.

Фиг. 21 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов и фибронектиновый фрагмент.

Фиг. 22 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса с помощью иммобилизованных на шариках фибронектинового фрагмента.

Фиг. 23 представляет собой график, иллюстрирующий связь между количеством используемого фибронектинового фрагмента и трансдукцией гена в клетки-мишени.

Фиг. 24 представляет собой график, иллюстрирующий трансдукцию гена в клеткимишени с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов и фибронектиновый фрагмент.

Фиг. 25 представляет собой еще один график, иллюстрирующий трансдукцию гена в клетки-мишени с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов и фибронектиновый фрагмент.

Фиг. 26 представляет собой график, иллюстрирующий трансдукцию гена в клеткимишени с помощью функционального материала, содержащего коллагеновый фрагмент.

Список последовательностей

8ЕС. ΙΌ Νο. 1

ДЛИНА: 271

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

А1а Не 1

Рго А1а Рго ТНг Азр 5

Ьеи

Ьуз РНе ТНг С1п Уа1 ТНг Рго

10

15

ТНг

Зег

Ьеи

Зег

А1а

С1п

Тгр

ТНг

Рго

Рго

Азп

Уа1

С1п

Ьеи

ТНг

20

25

30

С1у

Туг

Агд

Уа1

Агд

УаХ

ТНг

Рго

Ьуз

С1и

Ьуз

ТНг

СХу

Рго

Меб

35

40

45

Ьуз

О1и

11е

Азп

Ьеи

АХа

Рго

Азр

Зег

Зег

Зег

Уа1

Уа1

νβΐ

Зег

50

55

60

СХу

Ьеи

Меб

УаХ

АХа

ТНг

ьуз

Туг

СХи

Уа1

Зег

Уа1

Туг

А1а

Ьеи

65

70

75

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

ТНг

Зег

Агд

Рго

А1а

С1п

СХу

Уа1

Уа1

ТНг

ТНг

80

85

90

Ьеи

О1и

Азп

УаХ

Зег

Рго

РГО

Агд

Агд

А1а

Агд

Уа1

ТНг

Азр

А1а

95

100

105

ТНг

О1и

ТНг

ТНг

11е

ТНг

Не

Зег

Тгр

Агд

ТНг

Ьуз

ТНг

С1и

ТНГ

но

115

120

Не

ТНг

С1у

РНе

СХп

Уа1

Азр

А1а

Уа1

Рго

А1а

Азп

СХу

σΐη

ТНг

125 130 135

Рго Не О1п Агд ТНг 11е Ьуз Рго Азр Уа1 Агд Зег Туг тьг 11е

140 145150

ТНг С1у Ьеи С1п Рго С1у ТНг Азр Туг Ьуз 11е Туг Ьеи Туг ТНг

155 160165

Ьеи Азп Азр Азп А1а Агд Зег Зег Рго Уа1 Уа1 11е Азр А1а Зег

170 175180

ТНг А1а 11е Азр А1а Рго Зег Азп Ьеи Агд РНе Ьеи А1а ТНг ТНг

185

190

195

Рго

Азп

Зег

Ьеи

Ьеи

Уа1

Зег

Тгр

СХп

Рго

Рго

Агд

АХа

Агд

11е

200

205

210

ТНг

С1у

Туг

Не

Не

Ьуз

Туг

С1и

Ьуз

Рго

С1у

Зег

Рго

Рго

Агд

215

220

225

С1и

Уа1

Уа1

Рго

Агд

Рго

Агд

Рго

СХу

Уа1

ТНг

СХи

АХа

ТНг

Не

230

235

240

ТНг

С1у

Ьеи

СХи

Рго

С1у

ТНг

С1и

Туг

ТНг

Не

Туг

Уа1

Не

А1а

245

250

255

Ьеи

Ьуз

Азп

Азп

СХп

Ьуз

Зег

01и

Рго

Ьеи

Не

С1у

Агд

Ьуз

Ьуз

260

265

270

ТНг

8ЕС. ΙΌ Νο. 2

ДЛИНА: 25

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Азр О1и Ьеи Рго О1п Ьеи Уа1 ТНг Ьеи Рго Нхз Рго Азп Ьеи Н1з

10 15

С1у Рго С1и 11е Ьеи Азр Уа1 Рго Зег ТНг

25

8ЕС. ΙΌ Νο. 3

ДЛИНА: 155

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Меб 1

А1а

А1а С1у

Зег 11е ТНг ТНг Ьеи Рго АХа Ьеи Рго С1и Азр

5

10

15

О1у

О1у

Зег

С1у

А1а

РНе

Рго

Рго

С1у

Нхз

РНе

Ьуз

Азр

Рго

Ьуз

20

25

30

Агд

Ьеи

Туг

Суз

Ьуз

Азп

С1у

О1у

РНе

РНе

Ьеи

Агд

11е

Нхз

Рго

35

40

45

АЗр

С1у

Агд

Уа1

Азр

С1у

УаХ

Агд

СХи

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Нхз

Не

50

55

60

Ьуз

Ьеи

СХп

Ьеи

О1п

А1а

СХи

С1и

Агд

СХу

Уа1

Уа1

Зег

Не

Ьуз

70 75

С1у

УаХ

Суз

АХа

Азп Агд Тут Ьеи А1а Меб Ьуз

С1и

Азр СХу

Агд 90

80

85

Ьеи

Ьеи

АХа

Зет

Ьуз

Суз

УаХ

ТНг

Азр

С1и

Суз

РЬе

РЬе

РНе

С1и

95

100

105

Агд

Ьеи

С1и

Зег

Азп

Азп

Туг

Азп

ТЫ

Туг

Агд

Зег

Агд

Ьуз

Туг

110

115

120

ТЫ

Зег

Тгр

туг

Уа1

А1а

Ьеи

Ьуз

Агд

ТНГ

СХу

С1п

Туг

ЬуЗ

Ьеи

125

130

135

С1у

Зег

Ьуз

ТНг

С1у

Рго

С1у

СХп

Ьуз

А1а

11е

Ьеи

РНе

Ьеи

Рго

140

145

150

Меб

Зег

А1а

Ьуз

Зег

155

8ЕС. ΙΌ Νο. 4

ДЛИНА: 432

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Рго ТНг Азр Ьеи Агд РЬе ТНг Азп 11е С1у Рго Азр ТНг Меб Агд

10 15

Уа1 ТНг Тгр А1а Рго Рго Рго Зег Не Азр Ьеи ТНг Азп РЬе Ьеи

Уа1

Агд

Туг

Зег

20 Рго

УаХ

Ьуз

Азп

СХи

25 С1и

Азр

νβΐ

АХа

С1и

30 Ьеи

35

40

45

Зег

11е

зег

Рго

Зег

Азр

Азп

АХа

Уа1

Уа1

Ьеи

ТНг

Азп

Ьеи

Ьеи

50

55

60

Рго

СХу

ТНг

С1и

Туг

νβΐ

Уа1

Зег

Уа1

Зег

Зег

УаХ

Туг

СХи

С1п

65

70

75

ΗΪ3

С1и

Зег

ТНг

Рго

Ьеи

Агд

СХу

Агд

С1п

Ьуз

ТНг

С1у

Ьеи

Азр

80

85

90

Зег

Рго

ТНг

СХу

Не

Азр

РНе

Зег

Азр

Не

ТНг

АХа

Азп

Зег

РНе

95

100

105

ТНг

Уа1

Н±г

Тгр

Не

А1а

Рго

Агд

А1а

ТНг

Не

ТНг

СХу

Туг

Агд

но

115

120

Не

Агд

Нхз

Нхз

Рго

С1и

Н13

РЬе

Зег

С1у

Агд

Рго

Агд

С1и

Азр

125

130

135

Агд

Уа1

Рго

Н1з

Зег

Агд

Азп

Зег

Не

ТНг

Ьеи

ТНг

Азп

Ьеи

ТНг

140

145

150

Рго

СХу

ТНг

СХи

Туг

Уа1

Уа1

Зег

11е

Уа1

А1а

Ьеи

Азп

СХу

Агд

155

160

165

СХи

С1и

5ег

Рго

Ьеи

Ьеи

Не

С1у

<31 п

СХп

Зег

ТНг

Уа1

Зег

Азр

170

175

130

νβΐ

Рго

Агд

Азр

Ьеи

СХи

УаХ

νβΐ

А1а

АХа

ТНг

Рго

ТНг

Зег

Ьеи

185

190

195

Ьеи

Не

Зег

Тгр

Азр

А1а

Рго

АХа

УаХ

ТНг

Уа1

Агд

Туг

Туг

Агд

200

205

210

Не

ТНг

Туг

СХу

СХи

ТНг

С1у

СХу

АЗП

Зег

Рго

νβΐ

СХп

С1и

РЬе

215 220 225

ТЬг Уа1 Рго С1у

Зег Ьуз Зег ТЬг А1а ТЬг

11е Зег С1у

Ьеи

Ьуз 240

230

235

Рго

С1у

Уа1

Азр

Туг

ТЫ

Не

ТЬг

Уа1

Туг

А1а

Уа1

тьг

СХу

Агд

245

250

255

С1у

Азр

Зег

Рго

А1а

Зег

Зег

Ьуз

Рго

Не

Зег

Не

Азп

Туг

Агд

260

265

270

ТЬг

С1 и

Не

Азр

Ьуз

Рго

Зег

МеГ

АХа

АХа

С1у

Зег

Не

ты

ТЫ

275

280

285

Ьеи

Рго

А1а

Ьеи

Рго

С1и

Азр

С1у

СХу

Зег

С1у

А1а

РЬе

Рго

Рго

290

295

300

С1у

Нхз

РЬе

Ьуз

Азр

Рго

Ьуз

Агд

Ьеи

Туг

Суз

Ьуз

Азп

СХу

С1у

305

310

315

РЬе

РЬе

Ьеи

Агд

Не

Нхз

Рго

Азр

СХу

Агд

νβΐ

Азр

СХу

7аХ

Агд

320

325

330

С1и

Ьуз

Зег

Азр

Рго

Н±3

Не

Ьуз

Ьеи

С1п

Ьеи

С1п

АХа

СХи

СХи

335

340

345

Агд

<31у

νβΐ

Уа1

Зег

11е

Ьуз

С1у

УаХ

Суз

А1а

Азп

Агд

Туг

Ьеи

350

355

360

А1а

Мег

Ьуз

С1и

Азр

С1у

Агд

Ьеи

Ьеи

А1а

Зег

Ьуз

Суз

УаХ

ТЫ

365

370

375

Азр

С1и

Суз

РЬе

РНе

РЬе

С1и

Агд

Ьеи

С1и

Зег

Азп

Азп

Туг

Азп

380

385

390

ТЬг

Туг

Агд

Зег

Агд

Ьуз

Туг

ТЫ

Зег

Тгр

Туг

Уа1

АХа

Ьеи

Ьуз

395 400405

Агд ТЬг С1у С1п Туг Ьуз Ьеи С1у Зег Ьуз ТЬг С1у Рго СХу С1п

410 415420

Ьуз А1а Не Ьеи РЬе Ьеи Рго МеГ Зег А1а ЬузЗег

425430

8ЕО. ΙΌ № 5

ДЛИНА: 457

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Рго

ТЬг

Азр

Ьеи Агд

РЬе

ТЬг

Азп

Не

СХу

Рго

Азр

ТЬг

МеГ

Агд

1

5

10

15

νβΐ

ТЫ

тгр

А1а

Рго

Рго

рго

Зег

Не

Азр

Ьеи

ТЫ

Азп

РЬе

Ьеи

20

25

30

7а1

Агд

Туг

Зег

Рго

Уа1

Ьуз

Азп

СХи

С1и

Азр

Уа1

А1а

С1и

Ьеи

35

40

45

Зег

Не

Зег

Рго

Зег

Азр

Азп

А1а

УаХ

Уа1

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

Ьеи

50

55

60

Рго

С1у

ТЬг

С1и

Туг

V»!

Уа1

Зег

УаХ

Зег

Зег

νβΐ

Туг

О1и

С1п

65

70

75

Нхз

С1и

Зег

ТЫ

Рго

Ьеи

Агд

СХу

Агд

С1п

Ьуз

ТЬГ

С1у

Ьеи

Азр

80

85

90

Зег

Рго

ТЬг

С1у

Не

Азр

РЬе

Зег

Азр

Не

ТЬг

А1а

Азп

Зег

РЬе

100 105

ТЬг Уа1 НХз Тгр 11е А1а Рго Агд А1а ТЫ 11е ТЫ С1у Туг Агд

110

Не Агд Нхз ΗΪ3 Рго С1и Н1з РЬе

125

Агд Уа1 Рго Нхз Зег Агд Азп Зег

140

Рго С1у ТЬг С1и Туг Уа1 Уа1 Зег * 155

С1и С1и Зег Рго Ьеи Ьеи 11е С1у 170

Уа1 Рго Агд Азр Ьеи С1и νβΐ νβΐ

185

Ьеи Не Зег Тгр Азр А1а Рго А1а

200

Не ТЬг Туг С1у С1и ТЬг С1у С1у

215

ТЬг νβΐ Рго С1у Зег Ьуз Зег ТЬг

230

Рго С1у Уа1 Азр Туг ТЬг Не ТЬг

245

С1у Азр Зег Рго А1а Зег Зег Ьуз

260

ТЬг С1и 11е Азр Ьуз Рго Зег МеГ 275

Ьеи Рго А1а Ьеи Рго С1и Азр С1у

290

С1у Нхз РЬе Ьуз Азр Рго Ьуз Агд

305

РЬе РЬе Ьеи Агд Не Нхз Рго Азр

320

С1и Ьуз Зег Азр Рго Нхз 11е Ьуз

335

Агд С1у Уа1 УаХ Зег 11е Ьуз С1у

350

А1а МеГ Ьуз С1и Азр С1у Агд Ьеи

365

Азр С1и Суз РЬе РЬе РЬе С1и Агд

380

ТЬг Туг Агд Зег Агд Ьуз Туг ТЬг

395

Агд ТЬг С1у С1п Туг Ьуз Ьеи С1у

410

Ьуз А1а Не Ьеи РЬе Ьеи Рго МеГ

425

Рго С1п Ьеи Уа1 ТЬг Ьеи Рго Нхз

440

11е Ьеи Азр Уа1 Рго Зег ТЬг

455

115120

Зег С1у Агд Рго Агд С1и Азр

130135

11е ТЬг Ьеи ТЬг Азп Ьеи ТЬг

145150

Не Уа1 А1а Ьеи Азп С1у Агд

160165

С1п С1п Зег ТЬг νβΐ Зег Азр

175180

А1а А1а ТЬг Рго ТЬг Зег Ьеи

190195 \7а1 ТЬг Уа1 Агд Туг Туг Агд

205210

Азп Зег Рго Уа1 С1п С1и РЬе

220225

А1а ТЬг Не Зег С1у Ьеи Ьуз

235240

Уа1 Туг А1а Уа1 ТЬг С1у Агд

250255

Рго Не Зег Не Азп Туг Агд

265270

А1а А1а С1у Зег Не ТЬг ТЬг

280285

С1у Зег С1у А1а РЬе Рго Рго

295300

Ьеи Туг Суз Ьуз Азп С1у С1у

310315

С1у Агд \7а1 Азр С1у Уа1 Агд

325330

Ьеи С1п Ьеи С1п А1а С1и 01и

340345 \7а1 Суз А1а Азп Агд Туг Ьеи

355360

Ьеи А1а Зег Ьуз Суз Уа1 ТЬг

370375

Ьеи С1и Зег Азп Азп Туг Азп

385390

Зег Тгр Туг \7а1 АХа Ьеи Ьуз

400405

Зег Ьуз ТЬг С1у Рго С1у С1п

415420

Зег А1а А1а Зег Азр С1и Ьеи

430435

Рго Азп Ьеи Нхз С1у Рго С1и

445450

ΊΊ

Ί8

8ЕО. ΙΌ № 6

ДЛИНА: 186

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

С1у Не Агд С1у Ьеи Ьуз С1у ТЬг Ьуз О1у О1и Ьуз С1у О1и Азр

1015

С1у РЬе Рго С1у РЬе Ьуз С1у Азр МеГ С1у 11е Ьуз С1у Азр Агд

2530

О1у О1и 11е С1у Рго Рго С1у Рго Агд С1у С1и Азр С1у Рго С1и

4045

О1у Рго Ьуз С1у Агд 01у С1у Рго Азп С1у Азр Рго С1у Рго Ьеи

5560

С1у Рго Рго <Э1у СХи Ьуз С1у Ьуз Ьеи С1у Уа1 Рго С1у Ьеи Рго

7075

С1у Туг Рго С1у Агд С1п С1у Рго Ьуз С1у Зег 11е ОХу РЬе Рго

8590

01у РЬе Рго С1у АХа Азп О1у СХи Ьуз С1у С1у Агд С1у ТЬг Рго

100105

С1у Ьуз Рго 01у Рго Агд С1у <Э1п Агд 01у Рго ТЬг 01у Рго Агд

110 115120

С1у СЯи Агд С1у Рго Агд СХу 11е ТЬг С1у Ьуз Рго С1у Рго Ьуз

125 130135

СХу Азп Зег С1у С1у Азр С1у Рго А1а С1у Рго Рго С1у СХи Агд

140 145150

С1у Рго Азп С1у Рго С1п С1у Рго ТЬг О1у РЬе Рго С1у Рго Ьуз

155 160165

С1у Рго Рго СХу Рго Рго С1у Ьуз Азр С1у Ьеи Рго С1у 81$ Рго

170 175180

С1у С1п Агд С1у С1и ТЬг

185

65

70

75

Н1з

С1и

Зег

ТЬг

Рго

Ьеи

Агд

СХу

Агд

σΐη

Ьуз

ТЬг

С1у

Ьеи

Азр

80

85

90

Зег

Рго

ТЬГ

С1у

Не

Азр

РЬе

Зег

Азр

Не

ТЬг

А1а

Азп

Зег

РЬе

95

100

105

ТЬг

УаХ

Нхз

Тгр

Не

А1а

Рго

Агд

А1а

ТЬГ

Не

ТЬг

С1у

Туг

Агд

8ЕО. ΙΌ № 7

ДЛИНА: 464

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Рго 1

ТЬг

Азр Ьеи

Агд РЬе ТЬг Азп 11е СХу Рго Азр ТЬг Мег Агд

5

10

15

Уа1

ТЬг

Тгр

А1а

Рго

Рго

Рго

Зег

11е

Азр

Ьеи

тьг

Азп

РЬе

Ьеи

20

25

30

УаХ

Агд

Туг

Зег

Рго

Уа1

Ьуз

Азп

С1и

СХи

Азр

Уа1

А1а

С1и

Ьеи

35

40

45

Зег

Не

Зег

Рго

Зег

Азр

Азп

А1а

Уа1

Уа1

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

Ьеи

50

55

60

Рго

С1у

ТЬг

СХи

Туг

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Зег

Зег

Уа1

Туг

С1и

С1П

110	115	120
Рго	С1и	Нхз	РЬе	Зег	С1у	Агд	Рго	Агд	01 и	Азр
125					130					135
Зег	Агд	Азп	Зег	11е	ТЬг	Ьеи	ТЬг	АЗП	Ьеи	ТЬг
140					145					150
Туг	Уа1	УаХ	Зег	Не	νβΐ	А1а	Ьеи	Азп	С1у	Агд
155					160					165

Азр Ьеи С1и	V»! νβΐ	А1а	А1а 190	ТЬг Рго	ТЬг	Зег	Ьеи 195
	185
Тгр	Азр	А1а	Рго	А1а	νβΐ	ТЬГ	УаХ	Агд	Туг	Туг	Агд
	200					205					210
С1у	С1и	ТЬг	С1у	СХу	АЗП	Зег	Рго	νβΐ	С1п	С1и	РЬе
	215					220					225
С1у	Зег	Ьуз	Зег	ТЬг	АХа	ТЬГ	Не	Зег	С1у	Ьеи	Ьуз
	230					235					240
Азр	Туг	ТЬг	11е	ТЬг	Уа1	Туг	А1а	νβΐ	ТЬг	С1у	Агд

Зег

Рго

АХа 260

Зег

Зег

ьуз Рго Не Зег Не Азп Туг Агд

265

270

Не

Азр

Ьуз

Рго

Зег

мег

СХу

Не

Агд

СХу

Ьеи

Ьуз

СХу

275

280

285

СХу

СХи

Ьуз

01у

СХи

Азр

СХу

РЬе

Рго

СХу

РЬе

Ьуз

СХу

290

295

300

СХу

Не

Ьуз

С1у

Азр

Агд

С1у

С1и

Не

О1у

Рго

Рго

СХу

305

310

315

С1у

СХи

Азр

С1у

Рго

СХи

СХу

Рго

Ьуз

С1у

Агд

СХу

СХу

320

325

330

С1у

Азр

Рго

СХу

Рго

Ьеи

СХу

Рго

Рго

СХу

С1и

Ьуз

СХу

335

340

345

С1у

νβΐ

Рго

О1у

Ьеи

Рго

СХу

Туг

Рго

С1у

Агд

С1п

С1у

С1у Рго	Агд СХу	С1и Агд С1у Рго Агд С1у
400	405
СХу	Рго	Ьуз	СХу	Азп	Зег	<31у	С1у	Азр	СХу
				415					420
С1у	СХи	Агд	С1у	Рго	Азп	СХу	Рго	С1п	СХу
				430					435
С1у	Рго	Ьуз	СХу	Рго	Рго	С1у	Рго	Рго	СХу

БИО. ΙΌ Νο. 8

ДЛИНА: 489

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Рго ТНг Азр Ьеи Агд РЬе ТЬг Азп Не СХу Рго Азр ТНг МеГ Агд

1

5

10

15

УаХ

ТЬг

Тгр

АХа

Рго

Рго

Рго

Зег

11е

Азр

Ьеи

ТЬг

Азп

РЬе

Ьеи

20

25

30

УаХ

Агд

Туг

Зег

Рго

Уа1

Ьуз

Азп

СХи

СХи

Азр

УаХ

АХа

С1и

Ьеи

35

40

45

Зег

Не

Зег

Рго

Зег

Азр

Азп

АХа

УаХ

УаХ

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

Ьеи

50

55

60

Рго

СХу

ТЬг

СХи

Туг

УаХ

УаХ

Зег

ν«χ

Зег

Зег

УаХ

Туг

С1и

СХп

65

70

75

Нхз

СХи

Зег

ТЬг

Рго

Ьеи

Агд

СХу

Агд

СХп

Ьуз

ТЬг

СХу

Ьеи

Азр

80

85

90

Зег

Рго

ТЬг

СХу

Не

Азр

РЬе

Зег

Азр

Не

ТЬг

А1а

Азп

Зег

РЬе

95

100

Х05

ТЬг

Уа1

ΗΪ3

Тгр

11е

АХа

Рго

Агд

А1а

ТЬг

Не

ТЬг

СХу

Туг

Агд

ХЮ

115

120

Не

Агд

Н1з

Н1з

Рго

СХи

Нхз

РЬе

Зег

СХу

Агд

Рго

Агд

СХи

Азр

125

130

135

Агд

УаХ

Рго

ΗΪ3

Зег

Агд

Азп

Зег

Не

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

ТЫ

140

145

150

Рго

С1у

ТЬг

СХи

Туг

УаХ

УаХ

Зег

Не

УаХ

А1а

Ьеи

Азп

СХу

Агд

155

160

165

СХи

С1и

Зег

Рго

Ьеи

Ьеи

Не

СХу

С1п

СХп

Зег

ТНг

УаХ

Зег

Азр

170

175

180

УаХ

Рго

Агд

Азр

Ьеи

СХи

УаХ

УаХ

А1а

АХа

ТЫ

Рго

ТЫ

Зег

Ьеи

185

190

195

Ьеи

Не

Зег

Тгр

Азр

АХа

Рго

АХа

УаХ

ТЬг

УаХ

Агд

туг

Туг

Агд

200

205

210

11е

ТЫ

Тут

СХу

СХи

ТЬг

СХу

СХу

Азп

Зег

Рго

Уа1

С1п

С1и

РЬе

215

220

225

ТЬг

Уа1

Рго

СХу

Зег

Ьуз

Зег

ТЫ

А1а

ТЬг

Не

Зег

С1у

Ьеи

Ьуз

230

235

240

Рго

С1у

Уа1

Азр

Туг

ТЫ

Не

ТЬг

УаХ

Туг

А1а

Уа1

ТНг

СХу

Агд

245

250

255

СХу

Азр

Зег

Рго

АХа

Зег

Зег

Ьуз

Рго

Не

Зег

Не

Азп

Туг

Агд

260

265

270

ТЬг

СХи

11е

Азр

Ьуз

Рго

Зег

Μβΐ

СХу

Не

Агд

СХу

Ьеи

Ьуз

СХу

275

280

285

ТЬг

Ьуз

СХу

СХи

Ьуз

СХу

С1и

Азр

СХу

РЬе

Рго

СХу

РЬе

Ьуз

СХу

290

295

300

Азр

Мег

С1у

Не

Ьуз

С1у

Азр

Агд

С1у

СХи

11е

СХу

Рго

Рго

СХу

305

310

315

Рго

Агд

С1у

С1и

Азр

С1у

Рго

С1и

СХу

Рго

Ьуз

С1у

Агд

СХу

СХу

320

325

330

Рго

Азп

СХу

Азр

Рго

СХу

Рго

Ьеи

СХу

Рго

Рго

С1у

СХи

Ьуз

СХу

335

340

345

Ьуз

Ьеи

С1у

УаХ

Рго

СХу

Ьеи

Рго

СХу

Туг

Рго

СХу

Агд

С1п

СХу

350

355

360

Рго

Ьуз

С1у

Зег

Не

СХу

РЬе

Рго

СХу

РЬе

Рго

СХу

АХа

Азп

СХу

365

370

375

СХи

Ьуз

С1у

С1у

Агд

СХу

ТЬг

Рго

СХу

Ьуз

Рго

СХу

Рго

Агд

С1у

380

385

390

С1п

Агд

СХу

Рго

ТЬг

С1у

Рго

Агд

СХу

СХи

Агд

СХу

Рго

Агд

С1у

395

400

405

Не

ТЫ

СХу

Ьуз

Рго

СХу

Рго

Ьуз

СХу

Азп

Зег

СХу

СХу

Азр

СХу

410

415

420

РГО

А1а

С1у

Рго

Рго

СХу

С1и

Агд

С1у

Рго

Азп

СХу

Рго

СХп

С1у

425

430

435

Рго

ТЫ

СХу

РЬе

Рго

СХу

Рго

Ьуз

СХу

Рго

Рго

СХу

Рго

Рго

С1у

440

445

450

Ьуз

Азр

С1у

Ьеи

Рго

СХу

НХз

Рго

СХу

С1п

Агд

СХу

АХа

Зег

Азр

455

460

465

СХи

Ьеи

Рго

С1п

Ьеи

УаХ

ТЫ

Ьеи

Рго

НХЗ

Рго

Азп

Ьеи

Нхз

СХу

470

475

480

Рго С1и Не Ьеи Азр Уа1 Рго 5ег ТНг

485

БИО. ΙΌ Νο. 9

ДЛИНА: 36

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АААССАТОСС АСТСАССЕАС САССТТСССС ААСТСС 36

БИО. ΙΌ Νο. 10

ДЛИНА: 20

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

ААТТСАСААА ССАТССАТСС 20

БИО. ΙΌ Νο. 11

ДЛИНА: 33

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

ССАТТААААТ САССТА5САЕ САСАСАТТСС ААС 33

БИО. ΙΌ Νο. 12 ДЛИНА: 36

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

ТСТАСАССАТ ССТТАССТАС ССССТСТСТС ТССАСС 36

БИО. ΙΌ Νο. 13

ДЛИНА: 547

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

А1а АХа 5ег А1а 11е Рго А1а Рго ТЬг Азр Ьеи Ьуз РЬе ТНг <Э1п

10 15

Уа1 ТЬг Рго ТЬг Зег Ьеи Зет А1а С1п Тгр ТЬг Рго Рго Азп Уа1

25 30

С1п Ьеи ТНг С1у

Туг Агд Уа1 Агд Уа1 ТНг Рго Ьуз С1и Ьуз ТНг

35

40

45

СХу

Рго

МеГ

Ьуз

С1и

Не

Азп

Ьеи

АХа

Рто

Азр

Зет

Зет

Зег

Уа1

50

55

60

УаХ

Уа1

5ет

С1у

Ьеи

МеГ

Уа1

А1а

ТНг

Ьуз

Туг

СХи

Уа1

Зет

Уа1

65

70

75

Туг

А1а

Ьеи

Ьуз

Азр

ТЫ

Ьеи

ТНг

Зег

Агд

Рто

А1а

С1п

С1у

Уа1

80

85

90

Уа1

ТЫ

ТНг

Ьеи

СХи

Азп

УаХ

Зег

Рто

Рто

Агд

Агд

АХа

Агд

Уа1

95

100

105

ТНг

Азр

А1а

ТНг

С1и

ТНг

ТНг

Не

ТНг

Не

Зег

Тгр

Агд

ТНг

Ьуз

110

115'

120

ТЫ

С1и

ТНг

Не

ТНг

СХу

РНе

СХп

Уа1

Азр

АХа

УаХ

Рто

АХа

Азп

123

130

135

СХу

С1п

ТНг

Рго

Не

С1п

Агд

ТНг

Не

Ьуз

Рго

Азр

Уа1

Агд

Зет

140

145

150

Туг

ТНг

Не

ТНг

С1у

Ьеи

01п

Рго

<31у

ТНг

АЗр

Тут

Ьуз

Не

Тут

155

160

165

Ьеи

Туг

ТНг

Ьеи

Азп

Азр

Азп

А1а

Агд

Зет

Зег

Рто

Уа1

Уа1

Не

170

175

180

Азр

А1а

Зег

ТНг

А1а

Не

Азр

А1а

Рто

Зег

Азп

Ьеи

Агд

РНе

Ьеи

185

190

195

АХа

ТНг

ТНг

Рго

Азп

Зег

Ьеи

Ьеи

Уа1

Зет

Тгр

О1п

Рто

Рго

Агд

200

205

210

А1а

Агд

Не

ТНг

СХу

Туг

Не

Не

Ьуз

Тут

01и

Ьуз

Рто

С1у

Зет

215

220

225

Рто

Рто Агд С1и

УаХ 230

УаХ Рто Агд Рто Агд Рто ОХу Уа1 ТНг С1и

235

240

А1а

ТНг

Не

ТНг

СХу

Ьеи

СХи

Рто

СХу

ТНг

СХи

Туг

ТНг

Не

Тут

245

250

255

Уа1

Не

А1а

Ьеи

Ьуз

Азп

Азп

СХп

Ьуз

Зет

СХи

Рго

Ьеи

Не

СХу

260

265

270

Агд

Ьуз

Ьуз

ТНг

Зет

АХа

Не

Рто

АХа

Рто

ТНг

Азр

Ьеи

Ьуз

РНе

275

280

285

ТНг

С1П

Уа1

ТНг

Рто

ТНг

Зет

Ьеи

Зет

АХа

СХп

Тгр

ТНг

РТО

Рто

290

295

300

Азп

Уа1

С1п

Ьеи

ТНг

СХу

Тут

Агд

Уа1

Агд

Уа1

ТНг

Рто

Ьуз

СХи

305

3X0

3X5

Ьуз

ТНг

С1у

Рто

МеГ

Ьуз

СХи

1Хе

Азп

Ьеи

АХа

Рто

Азр

5ет

Зег

320

325

330

Зет

Уа1

УаХ

УаХ

Зет

СХу

Ьеи

МеС

УаХ

АХа

ТНг

Ьуз

Туг

СХи

Уа1

335

340

345

Зет

Уа1

Тут

А1а

Ьеи

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

ТНг

Зет

Агд

Рго

АХа

СХп

350

355

360

С1у

Уа1

Уа1

ТНг

ТНг

Ьеи

СХи

Азп

Уа1

Зет

Рто

Рто

Агд

Агд

АХа

365

370

375

Агд

Уа1

ТНг

Азр

АХа

ТНг

СХи

ТНг

ТНг

Не

ТНг

1Хе

Зет

Тгр

Агд

380

385

390

ТНг

Ьуз

ТНг

С1и

ТНг

1Хе

ТНг

СХу

РНе

СХп

Уа1

Азр

АХа

Уа1

Рто

395

400

405

АХа Азп СХу СХп ТНг 410

Рто

Не

СХп

Агд ТНг 1Хе Ьуз Рто Азр УаХ

415

420

Агд

Зег

Тут

ТНг

Не

ТНг

СХу

Ьеи

СХп

Рго

СХу

ТНг

Азр

Тут

Ьуз

425

430

435

Не

Тут

Ьеи

Туг

ТНг

Ьеи

Азп

Азр

Азп

АХа

Агд

Зег

Зет

Рто

УаХ

440

445

450

УаХ

Не

Азр

А1а

Зет

ТНг

АХа

11е

Азр

АХа

Рто

Зег

Азп

Ьеи

Агд

455

460

465

РНе

Ьеи

А1а

ТНг

ТНг

Рто

Азп

Зет

Ьеи

Ьеи

УаХ

Зет

Тгр

СХп

Рго

470

475

480

Рго

Агд

А1а

Агд

Не

ТЫ

СХу

Тут

Не

1Хе

Ьуз

Туг

СХи

Ьуз

Рто

485

490

495

С1у

Зет

Рго

Рто

Агд

С1и

Уа1

УаХ

Рто

Агд

Рто

Агд

Рто

СХу

УаХ

500

505

5X0

ТНг

С1и

А1а

ТНг

Не

ТНг

СХу

Ьеи

СХи

Рго

СХу

ТНг

СХи

Тут

ТНг

515

520

525

Не

Тут

Уа1

Не

А1а

Ьеи

Ьуз

Азп

Азп

С1п

Ьуз

Зет

СХи

Рто

Ьеи

8ЕО. ΙΌ Νθ. 14

ДЛИНА: 826

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

А1а

А1а

Бег

Рто

ТНг Азр Ьеи Агд РНе ТНг Азп

11е

СХу Рго Азр 15

5

хо

ТНг

МеГ

Агд

УаХ

ТНг

Тгр

АХа

Рго

Рго

Рго

Бег

Не

Азр

Ьеи

ТНг

20

25

30

Азп

РНе

Ьеи

УаХ

Агд

Туг

Бег

Рго

УаХ

Ьуз

Азп

СХи

СХи

Азр

УаХ

35

40

45

АХа

СХи

Ьеи

Бег

Не

Бег

Рго

Бег

Азр

Азп

АХа

Уа1

УаХ

Ьеи

ТНг

50

55

60

Азп

Ьеи

Ьеи

Рто

СХу

ТНг

СХи

Туг

УаХ

УаХ

Бег

УаХ

Зег

Зег

Уа1

65

70

75

Туг

СХи

СХп

ньз

СХи

Зег

ТНг

Рго

Ьеи

Агд

СХу

Агд

СХп

Ьуз

ТНг

80

85

90

СХу

Ьеи

Азр

Бег

Рго

ТНг

СХу

Не

Азр

РНе

Бег

Азр

Не

ТНг

А1а

95

100

105

Азп

Бег

РНе

ТНг

УаХ

ΗΪ3

Тгр

Не

АХа

Рго

Агд

АХа

ТНг

Не

ТНг

Х10

1X5

120

СХу

Туг

Агд

Не

Агд

ΗΪ3

ΗΪ3

Рго

СХи

Н13

РНе

Зег

СХу

Агд

Рго

Х25

130

135

Агд

СХи

Азр

Агд

УаХ

Рго

ΗΪ5

Бег

Агд

Азп

Зег

11е

ТНг

Ьеи

ТНг

Х40

145

150

Азп

Ьеи

ТНг

Рго

СХу

ТЫ

СХи

Туг

УаХ

УаХ

Зег

Не

УаХ

А1а

Ьеи

Азп

СХу

Агд

С1и

155 СХи

Зег

Рго

Ьеи

Ьеи

ХбО Не СХу

СХп

СХп

Зег

Х65 ТНг

170

175

ΧΘ0

УаХ

Зег

Азр

УаХ

Рго

Агд

Азр

Ьеи

СХи

УаХ

Уа1

АХа

АХа

ТНг

Рго

185

190

195

ТНг

Зег

Ьеи

Ьеи

Не

Зег

Тгр

Азр

АХа

Рго

АХа

УаХ

ТНг

УаХ

Агд

200

205

210

Туг

Туг

Агд

Не

ТНг

Туг

СХу

СХи

ТНг

СХу

СХу

Азп

Зег

Рго

УаХ

215

220

225

01 п

СХи

РНе

ТНг

УаХ

Рто

СХу

Зег

Ьуз

Зег

ТНг

АХа

ТНг

1Хе

Зег

230

235

240

С1у

Ьеи

Ьуз

Рго

СХу

УаХ

Азр

Туг

ТНг

Не

ТНг

УаХ

Туг

АХа

УаХ

245

250

255

ТНг

СХу

Агд

СХу

Азр

Зег

Рго

АХа

Зег

Зег

Ьуз

Рго

Не

Зег

Не

260

265

270

Азп

Туг

Агд

ТНг

СХи

Не

Азр

Ьуз

Рго

Зет

ТНг

Зег

АХа

Не

Рго

275

280

285

А1а

Рго

ТНг

Азр

Ьеи

Ьуз

РНе

ТНг

СХп

УаХ

ТНг

Рго

ТНг

Зег

Ьеи

290

295

300

Зег

АХа

СХп

Тгр

ТНг

Рго

Рго

Азп

Уах

СХп

Ьеи

ТНг

СХу

Туг

Агд

305

310

315

УаХ

Агд

УаХ

ТНг

Рго

Ьуз

СХи

Ьуз

ТНг

СХу

Рго

мег

Ьуз

СХи

Не

320

325

330

Азп

Ьеи

АХа

Рго

Азр

Зег

Зег

Зег

УаХ

УаХ

УаХ

Зег

СХу

Ьеи

Μβΐ

335

340

345

УаХ

АХа

ТНг

Ьуз

Туг

СХи

УаХ

Зег

УаХ

Туг

АХа

Ьеи

Ьуз

Азр

ТНг

530 535 540

Не С1у Агд Ьуз Ьуз ТНг Зег

545

350 355 360

Ьеи

ТЬг

Зег

Агд Рго А1а СХп СХу УаХ Уа1 ТЬг ТЬг Ьеи С1и Азп

365

370

375

Уа1

Зег

РГО

Рго

Агд

Агд

А1а

Агд

УаХ

ТЬг

Азр

АХа

ТЬг

С1и

ТЬг

380

385

390

ТЬг

1Хе

ТЬг

Не

Зег

Тгр

Агд

ТЬг

Ьуз

ТЬг

С1и

ТЬг

Не

ТЫ

С1у

395

400

405

РЬе

СХп

УаХ

Азр

АХа

УаХ

Рго

А1а

Азп

СХу

С1п

ТЬг

РГО

Не

СХп

410

415

420

Агд

ТЬг

Не

Ьуз

Рго

Азр

Уа1

Агд

Зег

Туг

ТЬг

Не

ТЬг

СХу

Ьеи

425

430

435

С1п

Рго

С1у

ТЬг

Азр

Туг

Ьуз

Не

Туг

Ьеи

Туг

ТЬг

Ьеи

Азп

Азр

440

445

450

Азп

А1а

Агд

Зег

Зег

Рго

Уа1

Уа1

Не

Азр

АХа

Зег

ТЫ

А1а

Не

455

460

465

Азр

А1а

Рго

Зег

Азп

Ьеи

Агд

РЬе

Ьеи

А1а

ТЬг

ТЬг

Рго

Азп

Зег

470

475

480

Ьеи

Ьеи

УаХ

Зег

Тгр

С1п

Рго

Рго

Агд

А1а

Агд

Не

ТЬг

С1у

Туг

485

490

495

11е

Не

Ьуз

Туг

С1и

Ьуз

Рго

С1у

Зег

Рго

РГО

Агд

СХи

Уа1

УаХ

500

505

510

Рго

Агд

РГО

Агд

Рго

СХу

Уа1

ТЬг

СХи

А1а

ТЬг

Не

ТЬг

СХу

Ьеи

515

520

525

СХи

Рго

СХу

ТЬг

СХи

Туг

ТЬг

Не

Туг

Уа1

Не

А1а

Ьеи

Ьуз

Азп

Азп

530

535 Агд 550

Ьуз

540 Ьуз ТЬг Зег А1а 555

С1п

Ьуз

Зег С1и 545

Рго Ьеи Не С1у

Не

Рго

А1а

Рго

ТЬг

Азр

Ьеи

Ьуз

РЬе

ТЬг

СХп

УаХ

ТЬг

Рго

ТЬг

560

565

570

Зег

Ьеи

Зег

А1а

С1п

Тгр

ТЬг

РГО

Рго

АЗП

Уа1

СХп

Ьеи

ТЬг

СХу

575

580

585

Туг

Агд

Уа1

Агд

УаХ

ТЬг

Рго

Ьуз

СХи

Ьуз

ты

СХу

Рго

Μβΐ

Ьуз

590

595

600

С1и

Не

АЗП

Ьеи

А1а

Рго

Азр

Зег

Зег

Зег

Уа1

УаХ

Уа1

Зег

СХу

605

610

615

Ьеи

Мей

УаХ

А1а

ТЫ

ьуз

Туг

С1 и

УаХ

Зег

УаХ

Туг

А1а

Ьеи

Ьуз

620

625

630

Азр

ты

Ьеи

ТЬг

Зег

Агд

Рго

А1а

СХп

С1у

Уа1

УаХ

ТЫ

ТЬг

Ьеи

635

640

645

С1и

Азп

УаХ

Зег

Рго

Рго

Агд

Агд

А1а

Агд

Уа1

ты

Азр

А1а

ТЬг

650

655

660

С1и

ТЬг

ТЬг

11е

ТЬг

Не

Зег

Тгр

Агд

ТЫ

Ьуз

ты

СХи

ТЬг

11е

665

670

675

ТЫ

СХу

РЬе

СХп

УаХ

Азр

А1а

Уа1

Рго

АХа

Азп

СХу

СХп

ТЫ

Рго

680

685

690

Не

(31 п

Агд

ТЬг

Не

Ьуз

Рго

Азр

УаХ

Агд

Зег

Туг

ТЫ

Не

ТЬг

695

700

705

С1у

Ьеи

С1п

Рго

С1у

ТЫ

Азр

Туг

Ьуз

Не

Туг

Ьеи

ТуГ

ТЫ

Ьеи

710

715

720

Азп

Азр

Азп

А1а

Агд

Зег

Зег

Рго

УаХ

УаХ

Не

Азр

А1а

Зег

ТЫ

725 730 735

АХа

11е Азр

А1а Рго Зег 740

Азп Ьеи

Агд РЬе 745

Ьеи А1а

ТЬг ТЬг Рго 750

Азп

Зег

Ьеи

Ьеи

Уа1

Зег

Тгр

СХп

Рго

Рго

Агд

АХа

Агд

Не

ТЬг

755

760

765

С1у

Туг

ХХе

Не

Ьуз

Туг

СХи

Ьуз

Рго

СХу

Зег

РГО

Рго

Агд

СХи

770

775

780

Уа1

Уа1

Рго

Агд

Рго

Агд

Рго

С1у

УаХ

ТЬг

С1и

А1а

ТЫ

11е

ТЬг

785

790

795

С1у

Ьеи

С1и

Рго

СХу

ТЫ

С1и

Туг

ТЬг

Не

Туг

УаХ

1Хе

А1а

Ьеи

800

805

810

Ьуз

Азп

Азп

СХп

Ьуз

Зег

СХи

Рго

Ьеи

Не

С1у

Агд

Ьуз

Ьуз

ТЫ

815 820 825

Зег

8Ер. ΙΌ Νο. 15

ДЛИНА: 38

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АААССАТОСС А6СТАСС6СТ АТТССТССАС СААСТСАС 38

8Ер. ΙΌ ΝΟ. 16

ДЛИНА: 36

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АААССАТССС ТААСТАСТСТ ТТТТССТТСС ААТСАС 36

8Ер. ΙΌ Νο. 17

ДЛИНА: 1644

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: двойная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АТОССАОСТА ССОСТАТТСС ТССАССААСТ ОАССТСААСТ ТСАСТСАООТ САСАСССАСА 60

АОССТОАССО СССАСТССАС АССАСССААТ СТТСАССТСА СТОСАТАТСС АСТСССС-СТС 120

АСССССААСС АСААОАСССС АССААТОААА ОАААТСААСС ТТОСТССТСА САССТСАТСС 180

ОТСОТТСТАТ САССАСТТАТ СОТОСССАСС АААТАТСААС ТОАОТОТСТА ТОСТСТТААС 240

ОАСАСТТТСА СААССАОАСС АССТСАСССТ ОТТОТСАССА СТСТССАСАА ТОТСАОСССА 300

ССААСААССС СТССТОТОАС АСАТССТАСТ САСАССАССА ТСАССАТТАС СТССАС-ААСС 360

ААСАСТСАСА СОАТСАСТОС СТТССААСТТ ОАТССССТТС САСССААТОС ССАСАСТССА 420

АТССАОАСАА ССАТСААССС АОАТОТСАОА АССТАСАССА ТСАСАСОТТТ АСААССАССС 480

АСТСАСТАСА АОАТСТАССТ СТАСАССТТС ААТСАСААТС СТСССАССТС СССТСТССТС 540

АТССАССССТ ССАСТСССАТ ТСАТОСАССА ТССААССТСС СТТТССТССС САССАСАССС 600

ААТТССТТСС ТОСТАТСАТС ОСАОССОССА ССТОССАССА ТТАСССССТА САТСАТСААО 660

ТАТСАСААОС СТСССТСТСС ТСССАСАСАА ОТСОТСССТС СССССССССС ТОСТСТСАСА 720

САСССТАСТА ТТАСТСОССТ ССААСССССА АСССААТАТА СААТТТАТОТ САТТССССТС 780

ААСААТААТС АОААСАОСОА СССССТСАТТ ОСААСОАААА АСАСТАСССС ТАТТССТОСА 840

ССААСТСАСС ТСААСТТСАС ТСАССТСАСА СССАСААОСС ТСАССССССА ОТСОАСАССА 900

СССААТСТТС АОС Т САС ТС О АТАТСОАСТС ССССТСАССС ССААССАСАА САС ССС АС С А 960

АТСАААОААА ТСААССТТОС ТССТСАСАОС ТСАТССОТСС ТТОТАТСАСО АСТТАТСОТО 1020

СССАССАААТ АТСААОТОАС ТСТСТАТОСТ СТТААСОАСА СТТТОАСААС САСАССАОСТ 1080

САСССТСТТС ТСАССАСТСТ СОАОААТОТС АССССАССАА СААССССТСС ТОТОАСАОАТ 1140

ССТАСТСАСА ССАССАТСАС САТТАОСТСС АСААССААОА СТСАСАСОАТ САСТОССТТС 1200

СААСТТСАТС СССТТССАСС СААТОСССАС АСТССААТСС АСАСААССАТ СААОССАСАТ 1250

ОТСАСААОСТ АСАССАТСАС АОСТТТАСАА ССАСОСАСТС АСТАСААОАТ СТАССТСТАС 1320

АССТТСААТО АСААТССТСС САССТССССТ ОТОСТСАТСС АСОССТССАС ТОССАТТСАТ 1380

ССАССАТССА АССТСССТТТ ССТОСССАСС АСАСССААТТ ССТТССТОСТ АТСАТООСАС 1440

СССССАССТС ССАССАТТАС ССОСТАСАТС АТСААСТАТС АСААСССТСС СТСТССТССС 1500

АСАСААСТСС ТСССТССССС ССОСССТССТ СТСАСАОАСС СТАСТАТТАС ТООССТОСАА 1560

СССССААССС ААТАТАСААТ ТТАТСТСАТТ ССССТСААСА АТААТСАСАА САСССАСССС 1620

СТСАТТССАА ОСАААААСАС ТАСТ 1644

8Ер. ΙΌ Νο. 18

ДЛИНА: 37

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АААССАТССС АССТА5СССС АСТСАССТВС САТТСАС 37

8ЕС). ΙΌ №. 19

ДЛИНА: 38

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

ААААСАТСТС ТААСТАСТСС АТООТТТОТС ААТТТСТС 38

8ЕС). ΙΌ №. 20

ДЛИНА: 2481

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: двойная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АТСССАССТА СССССАСТСА ССТСССАТТС АССААСАТТС СТССАСАСАС САТСССТСТС 60

АССТССССТС САСССССАТС САТТСАТТТА АССААСТТСС ТССТСССТТА СТСАССТСТС 120

АААААТСАСС ААСАТСТТСС АСАСТТСТСА АТТТСТССТТ САСАСААТСС АСТССТСТТА 180

АСАААТСТСС ТСССТССТАС АСААТАТСТА СТСАСТСТСТ ССАСТСТСТА ССААСААСАТ 240

САСАССАСАС СТСТТАСАСС ААСАСАСААА АСАССТСТТС АТТССССААС ТСССАТТСАС 300

ТТТТСТСАТА ТТАСТСССАА СТСТТТТАСТ СТССАСТССА ТТССТССТСС АСССАССАТС 360

АСТСССТАСА ССАТСССССА ТСАТССССАС САСТТСАСТС ССАСАССТСС АСААСАТССС 420

СТСССССАСТ СТСССААТТС САТСАСССТС АССААССТСА СТССАСССАС АСАСТАТСТС 480

СТСАССАТСС ТТССТСТТАА ТСССАСАСАС САААСТСССТ ТАТТСАТТСС ССААСААТСА 540

АСАСТТТСТС АТСТТСССАС ССАССТССАА СТТСТТССТС ССАСССССАС САСССТАСТС 600

АТСАССТСОС АТССТССТСС ТСТСАСАСТС АСАТАТТАСА ССАТСАСТТА СССАСАААСА 660

ССАССАААТА ССССТСТССА ССАСТТСАСТ СТСССТСССА ССААСТСТАС АССТАССАТС 720

АССССССТТА ААССТССАСТ ТСАТТАТАСС АТСАСТСТСТ АТССТСТСАС ТСССССТССА 780

САСАСССССС СААССАССАА СССААТТТСС АТТААТТАСС СААСАСАААТ ТСАСАААССА 840

ТССАСТАССС СТАТТССТСС АССААСТСАС СТСААСТТСА СТСАССТСАС АСССАСААСС 900

СТСАСССССС АСТССАСАСС АСССААТСТТ САССТСАСТС САТАТССАСТ СССССТСАСС 960

СССААССАСА АСАССССАСС ААТСАААСАА АТСААССТТС СТССТСАСАС СТСАТСССТС 1020

СТТСТАТСАС САСТТАТССТ ССССАССААА ТАТСААСТСА СТСТСТАТСС ТСТТААССАС 1080

АСТТТСАСАА ССАСАССАСС ТСАСССТСТТ СТСАССАСТС ТССАСААТОТ САССССАССА 1140

АСААССССТС СТСТСАСАСА ТССТАСТСАС АССАССАТСА ССАТТАССТО САСААССААС 1200

АСТСАСАССА ТСАСТСССТТ ССААСТТСАТ ССССТТССАС ССААТССССА САСТССААТС 1260

САСАСААССА ТСААСССАСА ТСТСАСААСС ТАСАССАТСА САССТТТАСА АССАСССАСТ 1320

САСТАСААСА ТСТАССТСТА САССТТСААТ САСААТССТС ССАССТСССС ТСТССТСАТС 1380

САССССТССА СТСССАТТСА ТССАССАТСС ААССТСССТТ ТССТССССАС САСАСССААТ 1440

ТССТТССТСС ТАТСАТСССА ССССССАССТ СССАССАТТА СССССТАСАТ САТСААСТАТ 1500

САСААСССТС ССТСТССТСС САСАСААСТС СТСССТСССС СССССССТСС ТСТСАСАСАС 1560

ССТАСТАТТА СТССССТССА АСССССААСС СААТАТАСАА ТТТАТСТСАТ ТССССТСААС 1620

ААТААТСАСА АСАСССАССС ССТСАТТССА АССАААААСА СТАССОСТАТ ТССТССАССА 1680

АСТСАССТСА АСТТСАСТСА ССТСАСАССС АСААСССТСА ССССССАСТС САСАССАССС 1740

ААТСТТСАСС ТСАСТССАТА ТССАСТСССС СТСАСССССА АССАСААСАС СССАССААТС 1800

АААСАААТСА АССТТССТСС ТСАСАССТСА ТСССТССТТС ТАТСАССАСТ ТАТССТСССС 1960

АССАААТАТС ААСТСАСТСТ СТАТССТСТТ ААССАСАСТТ ТСАСААССАС АССАССТСАС 1920

ССТСТТСТСА ССАСТСТССА СААТСТСАСС ССАССААСАА ССССТССТСТ САСАСАТССТ 1980

АСТСАСАССА ССАТСАССАТ ТАССТССАСА АССААСАСТС АСАССАТСАС ТСССТТССАА 2040

СТТСАТСССС ТТССАСССАА ТССССАСАСТ ССААТССАСА СААССАТСАА СССАСАТСТС 2100

АСААССТАСА ССАТСАСАСС ТТТАСААССА СССАСТСАСТ АСААСАТСТА ССТСТАСАСС 2160

ТТСААТСАСА АТССТСССАС СТССССТСТС СТСАТССАСС ССТССАСТСС САТТСАТССА 2220

ССАТССААСС ТСССТТТССТ ССССАССАСА СССААТТССТ ТССТССТАТС АТСССАСССС 2280

ССАССТСССА ССАТТАСССС СТАСАТСАТС ААСТАТСАСА АСССТСССТС ТССТСССАСА 2340

СААСТССТСС СТСССССССС СССТССТСТС АСАСАСССТА СТАТТАСТСС ССТССААССС 2400

ССААСССААТ АТАСААТТТА ТСТСАТТССС СТСААСААТА АТСАСААСАС ССАСССССТС 2460

АТТССААССА ААААСАСТАО Т 2481

8ЕС). ΙΌ №. 21

ДЛИНА: 472

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Рго

ТПг

Азр

Ьеи

Агд

РЬе

Т1тг

Азп

Не

С1у

Рго

Азр

ТЬГ

Мег

Агд

1

5

10

15

йа1

ТНг

Тгр

А1а

Рго

Рго

Рго

Зег

11е

Азр

Ьеи

ТНг

АЗП

РЬе

Ьеи

20

25

30

Уа1

Агд

Туг

Зег

Рго

Уа1

Ьуз

Азп

С1и

С1и

Азр

Уа1

А1а

С1и

Ьеи

8ЕО. ΙΌ Νο. 22

ДЛИНА: 457

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ТЬг 11е Туг УаХ Не А1а Ьеи Ьуз Азп Азп С1п Ьуз Зег С1и Рго

440 445 450

Ьеи 11е СХу Агд Ьуз Ьуз ТЬг

455

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Рго

ТЬг

Азр

Ьеи

Агд

РЬе

ТЬг

Азп

Не

С1у

Рго

Азр

ТЬг

Мег

Агд

1

5

10

15

Уа1

ТЬг

Тгр

А1а

Рго

Рго

Рго

2ег

Не

АЗр

Ьеи

ТЬг

Азп

РЬе

Ьеи

20

25

30

Уа1

Агд

Туг

Зег

Рго

УаХ

Ьуз

Азп

СХи

СХи

Азр

Уа1

А1а

31и

Ьеи

40 45

Зег Не Зег Рго Зег Азр Азп А1а УаХ Уа1 Ьеи ТЬг Азп Ьеи Ьеи

Рго

СХу

ТЬг

СХи

50 Туг

УаХ

УаХ

Зег

УаХ

55 Зег

5ег

УаХ

Туг

О1и

60 СХп

65

70

75

Нхз

СХи

Зег

ТЬг

Рго

Ьеи

Агд

СХу

Агд

СХп

Ьуз

ТЬг

СХу

Ьеи

Азр

80

85

90

5ег

Рго

ТЬг

С1у

1Хе

Азр

РЬе

Зег

Азр

Не

ТЬг

АХа

Азп

Зег

РЬе

95

100

105

ТЬг

УаХ

Нхз

Тгр

Не

А1а

Рго

Агд

АХа

ТЬг

Не

ТЬг

С1у

Туг

Агд

1X0

115

120

Не

Агд

Нхз

Нхз

Рго

С1и

Н1з

РЬе

Зег

СХу

Агд

Рго

Агд

СХи

Азр

125

130

135

Агд

УаХ

Рго

Н13

Зег

Агд

Азп

Зег

Не

ТЬг

Ьеи

ТЬг

АЗП

Ьеи

ТЬг

140

145

150

Рго

СХу

ТЬг

СХи

Туг

Уа1

Уа1

Зег

Не

Уа1

АХа

Ьеи

Азп

СХу

Агд

155

160

165

СХи

С1и

Зег

Рго

Ьеи

Ьеи

Не

СХу

СХп

СХп

Зег

ТЬг

УаХ

Зег

Азр

170

175

180

УаХ

Рго

Агд

Азр

Ьеи

СХи

УаХ

УаХ

А1а

А1а

ТЬг

Рго

ТЬг

Зег

Ьеи

185

190

195

Ьеи

Не

Зег

Тгр

Азр

А1а

Рго

А1а

УаХ

ТЬг

УаХ

Агд

Туг

Туг

Агд

200

205

210

1Хе

ТЬг

Туг

СХу

СХи

ТЬг

СХу

СХу

Азп

Зег

Рго

УаХ

С1п

СХи

РЬе

215

220

225

ТЬг

УаХ

Рго

СХу

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

АХа

ТЬг

Не

Зег

С1у

Ьеи

Ьуз

230

235

240

Рго

СХу

УаХ

АЗр

Туг

ТЬг

Не

ТЬг

УаХ

Туг

А1а

УаХ

ТЬг

СХу

Агд

245

250

255

С1у

Азр

Зег

Рго

АХа

Зег

Зег

Ьуз

Рго

Не

Зег

Не

Азп

Туг

Агд

260

265

270

ТЬг

СХи

11е

Азр

Ьуз

Рго

Зег

МеГ

Азп

УаХ

Зег

Рго

Рго

Агд

Агд

275

280

285

А1а

Агд

УаХ

ТЬг

Азр

А1а

ТЬг

СХи

ТЬг

ТЬг

Не

ТЫ

Не

Зег

Тгр

290

295

300

Агд

ТЬг

Ьуз

ТЬг

С1и

ТЬг

Не

ТЫ

СХу

РЬе

СХп

УаХ

Азр

А1а

УаХ

305

310

3X5

Рго

А1а

АЗП

С1у

С1п

ТЬг

Рго

11е

СХп

Агд

ТЬг

11е

Ьуз

Рго

Азр

320

325

330

УаХ

Агд

Зег

Туг

ТЬг

11е

ТЬг

С1у

Ьеи

СХп

Рго

СХу

ТЬг

Азр

Туг

335

340

345

Ьуз

Не

Туг

Ьеи

Туг

ТЫ

Ьеи

АЗП

Азр

Азп

А1а

Агд

Зег

Зег

Рго

350

355

360

УаХ

Уа1

Не

Азр

А1а

Зег

ТЫ

А1а

Не

Азр

АХа

Рго

Зег

Азп

Ьеи

365

370

375

Агд

РЬе

Ьеи

АХа

ТЫ

ТЬг

Рго

Азп

Зег

Ьеи

Ьеи

УаХ

Зег

Тгр

СХп

380

385

390

Рго

Рго

Агд

А1а

Агд

1Хе

ТЬг

СХу

Туг

Не

Не

Ьуз

Туг

СХи

Ьуз

395

400

405

Рго

СХу

Зег

Рго

Рго

Агд

СХи

УаХ

Уа1

Рго

Агд

РГО

Агд

Рго

СХу

410

415

420

УаХ

ТЬг

С1и

А1а

ТЫ

Не

ТЬг

СХу

Ьеи

СХи

Рго

СХу

ТЫ

СХи

Туг

425

430

435

8ЕО. ΙΌ Νο. 23

ДЛИНА: 549

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Рго ТЬг Азр Ьеи Агд РЬе ТЬг Азп Не С1у Рго Азр ТЬг МеС Агд

1015

Уа1 ТЬг Тгр А1а Рго Рго Рго Зег Не Азр Ьеи ТЬг Азп РЬе Ьеи

2530

Уа1 Агд Туг Зег Рго Уа1 Ьуз Азп С1и О1и Азр Уа1 А1а С1и Ьеи

4045

Зег 11е Зег Рго Зег Азр Азп А1а Уа1 Уа1 Ьеи ТЬг Азп Ьеи Ьеи

5560

Рго С1у ТЬг С1и Туг УаХ Уа1 Зег Уа1 Зег Зег Уа1 Туг С1и С1п

7075

Нхз С1и Зег ТЬг Рго Ьеи Агд С1у Агд С1п Ьуз ТЬг С1у Ьеи Азр

8590

Зег Рго ТЬг С1у 11е Азр РЬе Зег Азр Не ТЬг АХа Азп Зег РЬе

100105

ТЬг Уа1 Н19 Тгр 11е А1а Рго Агд А1а ТЬг Не ТЬг С1у Туг Агд

110 115120

Не Агд Нхз Нхз Рго С1и Нхз РЬе Зег С1у Агд Рго Агд С1и Азр

125 130135

Агд

Уа1

Рго Нхз

Зег 140

Агд Азп Зег

11е ТЬг 145

Ьеи ТЬг Азп Ьеи

ТЬг 150

Рго

С1у

ТЬг

С1и

Туг

Уа1

Уа1

Зег

11е

УаХ

А1а

Ьеи

Азп

С1у

Агд

155

160

165

СХи

С1и

Зег

Рго

Ьеи

Ьеи

Не

С1у

С1п

СХп

Зег

ТЬг

Уа1

Зег

Азр

170

Х75

180

УаХ

Рго

Агд

Азр

Ьеи

С1и

УаХ

Уа1

А1а

АХа

ТЫ

Рго

ТЬг

Зег

Ьеи

185

Х90

195

Ьеи

11е

Зег

Тгр

Азр

А1а

Рго

АХа

Уа1

ТЬг

УаХ

Агд

Туг

Туг

Агд

200

205

210

Не

ТЬг

Туг

С1у

С1и

ТЬг

С1у

СХу

Азп

Зег

Рго

УаХ

С1П

С1и

РЬе

215

220

225

ТЬг

УаХ

Рго

С1у

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

АХа

ТЬг

Не

Зег

СХу

Ьеи

Ьуз

230

235

240

Рго

С1у

Уа1

Азр

Туг

ТЫ

Не

ТЬг

УаХ

Туг

АХа

Уа1

ТЬг

СХу

Агд

245

250

255

<31у

Азр

Зег

Рго

А1а

Зег

Зег

Ьуз

Рго

Не

Зег

11е

Азп

Туг

Агд

260

265

270

ТЬг

С1и

Не

Азр

Ьуз

Рго

Зег

Ме-е

А1а

Не

Рго

АХа

Рго

ТЬг

Азр

275 280285 ьеи ьуз РЬе ТЫ 61η Уа1 ТЫ Рго

290

ТЬг Рго Рго Азп Уа1 С1п Ьеи ТЫ

305

Рго Ьуз <31и Ьуз ТЫ С1у Рго МеГ

320

Азр Зег Зег Зег Уа1 Уа1 Уа1 Зег

335

Туг 01и Уа1 Зег Уа1 Туг А1а Ьеи

350

Рго А1а 01п С1у Уа1 V»! ТЬг ТЬг

365

Агд Агд А1а Агд Уа1 ТЬг Азр А1а

380

Зег Тгр Агд ТЬг Ьуз ТЬг <31и ТЬг 395

А1а Уа1 Рго А1а Азп С1у С1п ТЬг

410

Рго Азр Уа1 Агд 5ег Туг ТЬг Не

425

Азр Туг Ьуз 11е Туг Ьеи Туг ТЬг

440

Зег Рго Уа1 Уа1 11е Азр А1а Зег

455

Азп Ьеи Агд РЬе Ьеи А1а ТЬг ТЬг

470

Тгр С1п Рго Рго Агд А1а Агд 11е

485

С1и Ьуз Рго С1у Зег Рго Рго Агд

500

Рго С1у Уа1 ТЫ 01 и А1а ТЫ 11е

515

С1и Туг ТЫ 11е Туг Уа1 11е А1а

530

01и Рго Ьеи 11е С1у Агд Ьуз Ьуз

545

ТЬг Зег Ьеи Зег Ала С1п Тгр

295300

С1у Туг Агд Уа1 Агд Уа1 ТЬг

310315

Ьуз С1и 11е Азп Ьеи А1а Рго

325330

С1у Ьеи МеГ Уа1 А1а ТЬг Ьуз

340345

Ьуз Азр ТЫ Ьеи ТЬг Зег Агд

355360

Ьеи С1и Азп Уа1 Зег Рго Рго

370375

ТЫ С1и ТЫ ТЬг Не ТЬг 11е

385390

Не ТЫ (31у РЬе С1п Уа1 Азр

400405

Рго Х1е С1п Агд ТЬг 11е Ьуз

415420

ТЬг (31у Ьеи С1п Рго С1у ТЬг

430435

Ьеи Азп Азр Азп А1а Агд Зег

445450

ТЬг А1а 11е Азр А1а Рго Зег

460465

Рго Азп Зег Ьеи Ьеи Уа1 Зег

475480

ТЫ С1у Туг 11е Не Ьуз Туг

490495

01и Уа1 Уа1 Рго Агд Рго Агд

505510

ТЬг С1у Ьеи С1и Рго <31у ТЫ

520525

Ьеи Ьуз Азп Азп 01п Ьуз Зег

535540

ТЬг

Зег

Не Зег

Рго Зег 50

Азр Азп

А1а

Уа1 Уа1 55

Ьеи

ТЬг Азп

Ьеи

Ьеи 60

Рго

С1у

ТЫ

С1и

Туг

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Зег

Зег

Уа1

Туг

СЯи

01п

65

70

75

Н±з

О1и

Зег

ТЫ

Рго

Ьеи

Агд

О1у

Агд

С1п

Ьуз

ТЫ

61у

Ьеи

Азр

80

85

90

Зег

Рго

ТЬг

С1у

11е

Азр

РЬе

Зег

Азр

Не

ТЬг

А1а

Азп

Зег

РЬе

95

100

105

ТЬг

Уа1

Н1з

Тгр

Не

А1а

Рго

Агд

А1а

ТЬг

Не

ТЬг

01у

Туг

Агд

НО

115

120

Не

Агд

Н1з

ΗΪ3

Рго

С1и

Н1з

РЬе

Зег

С1у

Агд

Рго

Агд

С1и

Азр

125

130

135

Агд

Уа1

Рго

Н1з

Зег

Агд

Азп

Зег

Не

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Азп

Ьеи

ТЫ

140

145

150

Рго

О1у

ТЫ

С1и

туг

Уа1

ν<ι

Зег

Не

Уа1

А1а

Ьеи

АЗП

О1у

Агд

155

160

165

С1и

С1и

Зег

Рго

Ьеи

Ьеи

Не

О1у

С1п

σΐη

Зег

ТЬг

Уа1

Зег

Азр

170

175

180

Уа1

Рго

Агд

Азр

Ьеи

С1и

Уа1

Уа1

А1а

А1а

ТЫ

Рго

ТЬг

Зег

Ьеи

185

190

195

Ьеи

Не

Зег

Тгр

Азр

А1а

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Агд

Туг

Туг

Агд

200

205

210

Не

ТЬг

Туг

С1у

С1и

ТЬг

С1у

01у

Азп

2ег

Рго

Уа1

01п

С1и

РЬе

215

220

225

ТЫ

Уа1

Рго

01 у

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

А1а

ТЬг

Не

Зег

С1у

Ьеи

Ьуз

230 235 240

8ЕО. ΙΌ № 24

ДЛИНА: 574

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

РГО

ТЫ

Азр

Ьеи

Агд

РЬе

ТЬг

Азп

Не

С1у

Рго

Азр

ТЫ

МеГ

Агд

1

5

10

15

Уа1

ТЬг

Тгр

А1а

Рго

Рго

Рго

Зег

Не

Азр

Ьеи

ТЬг

Азп

РЬе

Ьеи

20

25

30

Уа1

Агд

Туг

зет

рго

Уа1

Ьуз

Азп

С1и

С1и

Азр

Уа1

А1а

С1и

Ьеи

35

40

45

Рго

О1у

Уа1

Азр Туг 245

ТЬг Не ТЬг Уа1

Туг А1а Уа1 250

ТЬг

С1у Агд 255

01у

Азр

Зег

Рго

А1а

Зег

Зег

Ьуз

Рго

Не

Зег

11е

Азп

Туг

Агд

260

265

270

ТЬг

О1и

Не

Азр

Ьуз

Рго

Зег

Мег

А1а

Не

Рго

А1а

Рго

ТЬг

Азр

275

280

285

Ьеи

Ьуз

РЬе

ТЬг

С1п

Уа1

ТЫ

Рго

ТЫ

Зег

Ьеи

Зег

А1а

С1п

Тгр

290

295

300

ТЫ

Рго

Рго

Азп

Уа1

01п

Ьеи

ТЬг

С1у

Туг

Агд

Уа1

Агд

Уа1

ТЫ

305

310

315

Рго

Ьуз

С1и

Ьуз

ТЬг

С1у

Рго

Мег

Ьуз

С1и

Не

Азп

Ьеи

А1а

Рго

320

325

330

Азр

Зег

Зег

Зег

Уа1

Уа1

Уа1

Зег

О1у

Ьеи

МеГ

Уа1

А1а

ТЬг

Ьуз

335

340

345

Туг

<31и

Уа1

Зег

Уа1

Туг

А1а

Ьеи

Ьуз

Азр

ТЬг

ьеи

ТЬг

Зег

Агд

350

355

360

Рго

А1а

С1п

С1у

Уа1

Уа1

ТЬг

ТЫ

Ьеи

О1и

Азп

Уа1

Зег

Рго

Рго

365

370

375

Агд

Агд

А1а

Агд

Уа1

ТЬг

Азр

АХа

ТЫ

С1и

ТЫ

ТЬг

Не

ТЫ

Не

380

385

390

Зег

Тгр

Агд

ТЬг

Ьуз

ТЬг

С1и

ТЬг

11е

ТЬг

С1у

РЬе

С1п

Уа1

Азр

395

400

405

А1а

Уа1

Рго

А1а

Азп

С1у

01п

ТЬг

Рго

11е

С1п

Агд

ТЬг

Не

Ьуз

410

415

420

Рго Азр Уа1 Агд

Зег 425

Туг ТЬг

Не

ТЫ С1у Беи С1п Рго С1у ТЬг

430

435

Азр

Туг

Буз

Не

Туг

Беи

Туг

ТЬг

Беи

Азп

Азр

Азп

АХа

Агд

Зег

440

445

450

Зег

Рго

Уа1

Уа1

Не

Азр

А1а

Зег

ТЬг

А1а

Не

Азр

АХа

Рго

Зег

455

460

465

АЗП

Ьей

Агд

РЬе

Беи

АХа

ты

ТЬг

Рго

Азп

Зег

Беи

Беи

УаХ

Зег

470

475

480

Тгр

С1п

Рго

Рго

Агд

А1а

Агд

Не

ТЬг

О1у

Туг

Не

Не

Буз

Туг

485

490

495

С1и

Буз

Рго

С1у

Зег

Рго

Рго

Агд

С1и

Уа1

УаХ

Рго

Агд

Рго

Агд

500

505

510

Рго

О1у

Уа1

ТЬг

О1и

А1а

ТЬг

Не

ТЬг

С1у

Беи

СХи

Рго

СХу

ТЬг

515

520

525

О1и

Туг

ТЬг

Не

Туг

УаХ

Не

А1а

Беи

Буз

Азп

АЗП

СХп

Буз

Зег

530

535

540

СХи

РГО

Беи

Не

С1у

Агд

Буз

Буз

ТЬг

Азр

С1и

Беи

Рго

СХп

Беи

545

550

555

Уа1

ТЬг

Беи

Рго

ΗΪ3

Рго

Азп

Беи

ΗΪ3

С1у

Рго

СХи

Не

Беи

Азр

560 565 570

Уа1 Рго Зег ТЬг δΕΟ. ΙΌ Νο. 25

ДЛИНА: 274

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Рго ТЬг Азр Беи Агд

РЬе ты

Азп

1Хе СХу 10

Рго Азр

ТЬг МеГ Агд 15

1

5

УаХ

ТЫ

Тгр

АХа

Рго

Рго

Рго

Зег

Не

Азр

Беи

ТЬг

Азп

РЬе

Беи

20

25

30

УаХ

Агд

Туг

Зег

Рго

УаХ

Буз

Азп

С1и

СХи

Азр

УаХ

А1а

СХи

Беи

35

40

45

Зег

1Хе

Зег

Рго

Зег

Азр

Азп

А1а

Уа1

УаХ

Беи

ТЬг

Азп

Беи

Беи

50

55

60

Рго

СХу

ТЬг

СХи

Туг

УаХ

УаХ

Зег

УаХ

Зег

Зег

УаХ

Туг

СХи

СХп

65

70

75

Н1з

СХи

Зег

ТЬг

Рго

Беи

Агд

СХу

Агд

СХп

Буз

ТЬг

С1у

Беи

АЗр

80

85

90

Зег

Рго

ТЬг

СХу

1Хе

Азр

РЬе

Зег

Азр

11е

ТЬг

А1а

Азп

Зег

РЬе

100 105

ТЬг

Уа1 НХз Тгр 1Хе но

АХа

Рго

Агд

А1а ТЬг 11е ТЬг С1у Туг Агд

115

120

11е

Агд

ΗΪ3

ΗΪ3

Рго

С1и

Ηΐ3

РЬе

Зег

О1у

Агд

Рго

Агд

С1и

Азр

125

130

135

Агд

Уа1

Рго

НХз

Зег

Агд

Азп

Зег

Не

ТЬг

Беи

ТЬг

Азп

Беи

ТЬг

140

145

150

Рго

С1у

ТЬг

С1и

Туг

Уа1

Уа1

Зег

Не

Уа1

А1а

Беи

Азп

С1у

Агд

155

160

165

СХи

СХи

Зег

Рго

Беи

Беи

Не

СХу

С1п

СХп

Зег

ТЬг

Уа1

Зег

Азр

170

175

180

Уа1

Рго

Агд

Азр

Беи

С1и

Уа1

УаХ

А1а

АХа

ТЬг

Рго

ТЫ

Зег

Беи

185

190

195

Беи

Не

Зег

Тгр

Азр

АХа

Рго

АХа

Уа1

ТЬг

Уа1

Агд

Туг

Туг

Агд

200

205

210

Не

ТЫ

Туг

С1у

С1и

ТЬг

СХу

СХу

Азп

Зег

Рго

Уа1

С1п

С1и

РЬе

215

220

225

ТЬг

УаХ

Рго

С1у

Зег

Буз

Зег

ТЫ

А1а

ТЬг

Не

Зег

С1у

Беи

Буз

230

235

240

Рго

С1у

Уа1

Азр

Туг

ТЬг

Не

ТЫ

УаХ

Туг

А1а

Уа1

ТЬг

С1у

Агд

245

250

255

С1у

Азр

Зег

Рго

А1а

Зег

Зег

Буе

Рго

Не

Зег

Не

Аеп

Туг

Агд

260 265 270

ТЬг С1и Не Азр δΕΟ. ΙΌ Νο. 26

ДЛИНА: 1374

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: двойная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АТССССАСТС АССТСССАТТ САССААСАТТ ССТССАОАСА ССАТСССТОТ САССТСОССТ 60

ССАСССССАТ ССАТТСАТТТ ААССААСТТС СТССТСССТТ АСТСАССТСТ ОАААААТСАО 120

СААСАТСТТО САСА6ТТ0ТС ААТТТСТССТ ТСАСАСААТО САСТСОТСТТ ААСАААТСТС 180

СТСССТ6СТА САСААТАТСТ АСТСАСТСТС ТССАСТСТСТ АССААСААСА ТСАСАССАСА 240

ССТСТТАСАО СААОАСАСАА ААСАОСТСТТ ОАТТССССАА СТСССАТТСА СТТТТСТСАТ 300

АТТАСТСССА АСТСТТТТАС ТСТОСАСТСС АТТССТССТС САСССАССАТ САСТСССТАС 360

АСОАТССССС АТСАТССССА ССАСТТСАСТ 5С0А0АССТС САСААСАТСС ССТОССССАС 420

ТСТСССААТТ ССАТСАСССТ САССААССТС АСТССАОССА САСАСТАТСТ ССТСАССАТС 480

СТТССТСТТА АТСССАСАСА ССАААОТССС ТТАТТОАТТО СССААСААТС ААСАСТТТСТ 540

ОАТОТТСССА ССОАССТСОА АСТТСТТССТ ССОАСССССА ССАСССТАСТ ОАТСАССТСС 600

САТОСТССТО СТОТСАСАСТ САСАТАТТАС АООАТСАСТТ АСССАОАААС АОСАССАААТ 660

АССССТСТСС АССА6ТТСАС ТСТСССТОСС АССААСТСТА СА6СТАССАТ САССССССТТ 720

АААССТССАС ТТСАТТАТАС САТСАСТОТС ТАТССТСТСА СТСССССТОС АСАСАССССС 780

ОСААОСАССА АОССААТТТС САТТААТТАС ССААСАСААА ТТСАСАААСС АТССАТЗССА 840

СССОССАССА ТСАССАСССТ СССССССТТС ССССАОСАТО СССССАСССО СОССТТСССО 900

ССССОССАСТ ТСААССАССС СААССООСТС ТАСТЭСАААА АСССССОСТТ СТТССТСССС 960

АТССАССССС АС60СССАСТ ТСАСССССТС ССССАСААОА ССОАСССТСА САТСААССТА 1020

СААСТТСААС САСААСАСАС АССАСТТбТС ТСТАТСАААС САСТСТСТСС ТААСССТТАС 1080

СТОССТАТСА АОСААСАТОС ААбАТТАСТС ССТТСТАААТ СТСТТАСЗСА ТОАСТСТТТС 1140

ТТТТТТСААС САТТССААТС ТААТААСТАС ААТАСТТАСС ССТСААССАА АТАСАССАОТ 1200

ТСОТАТСТСС САСТСАААСЗ ААСТССОСАС ТАТАААСТТС САТССААААС АССАССТССС 1260

САСАААССТА ТАСТТТТТСТ ТССААТОТСТ ССТОСТАССС АССАССТТСС ССААСТСОТА 1320

АСССТТССАС АССССААТСТ ТСАТССАССА ОАСАТСТТСС АТСТТССТТС САСА 1374 δΕΟ. ΙΌ Νο. 27

ДЛИНА: 1416

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: двойная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

СССАСТОАСС ТСССАТТСАС СААСАТТССТ ССАОАСАССА ТСССТСТСАС СТСОССТССА 60

СССССАТССА ТТОАТТТААС СААСТТССТС ОТОСОТТАСТ САССТСТСАА АААТСАООАА 120

ОАТОТТЗСАС А6ТТСТСААТ ТТСТССТТСА САСААТССАО ТССТСТТААС АААТСТССТО 180

ССТСОТАСАб ААТАТСТАСТ САСТСТСТСС АСТОТСТАСС ААСААСАТСА САССАСАССТ 240

СТТАОАОСАА САСАСААААС А06ТСТТСАТ ТССССААСТО ОСАТТСАСТТ ТТСТСАТАТТ 300

АСТСССААСТ СТТТТАСТСТ ССАСТСОАТТ ССТССТССАО ССАССАТСАС ТбОСТАСАСС 360

АТСССССАТС АТСССОАОСА СТТСАСТССС АСАССТССАС ААСАТСОССТ СССССАСТСТ 420

СССААТТССА ТСАСССТСАС СААССТСАСТ ССАОССАСАС АОТАТОТСОТ САССАТССТТ 480

ССТСТТААТб ССАОАСАССА ААСТСССТТА ТТСАТТОССС ААСААТСААС АбТТТСТОАТ 540

СТТССОАССС АССТОСААСТ ТОТТОСТОСО АСССССАССА СССТАСТОАТ САССТСССАТ 600

ССТССТОСТО ТСАСАСТСА6 АТАТТАСА2С АТСАСТТАСО ОАОАААСАОС АОСАААТАСС 660

ССТСТССАСС АОТТСАСТОТ СССТСССАСС ААСТСТАСАС СТАССАТСАО СССССТТААА 720

ССТССАСТТО АТТАТАССАТ САСТСТСТАТ ССТСТСАСТС ССССТССАСА САСССССОСА 780

АССАССААСС СААТТТССАТ ТААТТАСССА АСАСАААТТС АСАААССАТС САТСССТАТТ 840

ССТССАССАА СТСАССТСАА СТТСАСТСАб СТСАСАСССА СААСССТОАО СССССАОТСС 900

АСАССАСССА АТСТТСАССТ САСТССАТАТ СЗАОТССССС ТОАСССССАА ССАСААОАСС 960

ССАССААТ5А ААСАААТСАА ССТТССТССТ САСАОСТСАТ СССТСОТТСТ АТСАССАСТТ 020

АТОСТССССА ССАААТАТОА АСТСАСТСТС ТАТОСТСТТА АСОАСАСТТТ САСААССАСА 1080

ССА0СТСА60 СТСТТСТСАС САСТСТССАС ААТСТСАССС САССААСААС ОССТССТСТС 1140

АСАОАТССТА СТОАСАССАС САТСАССАТТ АЗСТСОАСАА ССААСАСТСА САССАТСАСТ 1200

СОСТТССААО ТТСАТОССОТ ТССАСССААТ ССССАСАСТС СААТССАОАО ААССАТСААС 1260

ССАОАТСТСА СААССТАСАС САТСАСАССТ ТТАСААССАС ССАСТСАСТА СААСАТСТАС 1320

СТСТАСАССТ Т6ААТСАСАА ТССТСССАСС ТССССТСТСС ТСАТССАСЗС СТССАСТОСС 1380

АТТОАТССАС САТССААССТ СССТТТССТС СССАСС 1416

ЗЕр. ΙΌ Νο. 28

ДЛИНА: 35

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

С1у 1	С1у Агд	С1у	ТЬг Рго С1у Ьуз Рго С1у Рго Агд б!у С1п Агд
5	10	15
С1у	Рго	ТЫ	С1у	Рго	Агд	С1у С1и	Агд С1у Рго	Агд	С1у	Не ТЬг
				20			25			30
С1у	Ьуз	РГО	С1у	Рго
				35

ЗЕр. ΙΌ Νο. 29

ДЛИНА: 302

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

Рго 1

ТНг

Азр Ьеи Агд РНе ТНг Азп 11е С1у Рго Азр ТНг Ме1: Агд

5

10

15

Уа1

ТНг

Тгр

А1а

Рго

Рго

Рго

Зег

Не

Азр

Ьеи

ТНг

АЗП

РНе

Ьеи

20

25

30

Уа1

Агд

Туг

Зег

Рго

Уа1

Ьуз

Азп

С1и

С1и

АЗр

Уа1

А1а

С1и

Ьеи

35

40

45

зег

Не

Зег

Рго

Зег

Азр

Азп

А1а

Уа1

Уа1

Ьеи

ТНг

Азп

Ьеи

Ьеи

50

55

60

Рго

О1у

ТНг

С1и

Туг

Уа1

Уа1

Зег

Уа1

Зег

Зег

Уа1

Туг

С1и

С1п

65

70

75

Н1з

СИ и

Бег

ТЬг

Рго

Ьеи

Агд

О1у

Агд

О1п

Ьуз

ТНг

С1у

Ьеи

Азр

80

85

90

Зег

Рго

ТНг

С1у

Не

Азр

РНе

Зег

Азр

Не

ТНг

А1а

Азп

Зег

РНе

95

100

105

ТНг

Уа1

НЬз

Тгр

Не

А1а

Рго

Агд

А1а

ТНг

Не

ТНг

σι у

Туг

Агд

110

115

120

Не

Агд

НЬз

НЬз

Рго

С1и

НЬз

РНе

Зег

С1у

Агд

Рго

Агд

СЬи

Азр

125

130

135

Агд

Уа1

Рго

НЬЗ

Зег

Агд

Азп

Зег

Не

ТНг

Ьеи

ТНг

Азп

Ьеи

ТНг

140

145

150

Рго

С1у

ТНГ

С1и

Туг

Уа1

Уа1

Зег

Не

Уа1

А1а

Ьеи

Азп

С1у

Агд

155

160

165

01 и О1и

Зег

Рго Ьеи Ьеи Не 01у С1п <31п Зег ТЬг Уа1 Зег Азр

170

175

180

Уа1

Рго

Агд

Азр

Ьеи

О1и

Уа1

Уа1

А1а

А1а

ТЬг

Рго

ТЬг

Зег

Ьеи

185

190

195

Ьеи

Не

Зег

Тгр

Азр

А1а

Рго

А1а

Уа1

ТЬг

Уа1

Агд

Туг

Туг

Агд

200

205

210

Не

ТЬг

Туг

01у

01и

ТЬг

О1у

О1у

Азп

Зег

Рго

Уа1

01п

01и

РЬе

215

220

225

ТЬг

Уа1

Рго

О1у

Зег

Ьуз

Зег

ТЬг

А1а

ТЬг

11е

Зег

О1у

Ьеи

Ьуз

230

235

240

Рго

С1у

Уа1

Азр

Туг

ТЬг

Не

ТЬг

Уа1

Туг

А1а

Уа1

ТЬг

С1у

Агд

245

250

255

О1у

Азр

Зег

Рго

А1а

Зег

Зег

Ьуз

Рго

Не

Зег

Не

Азп

Туг

Агд

260

265

270

ТЬг

С1и

Не

Азр

Ьуз

Рго

Зег

Азр

О1и

Ьеи

Рго

О1п

Ьеи

νβΐ

ТЬг

275

280

285

Ьеи

Рго

Η13

Рго

Азп

Ьеи

ΗΪ3

О1у

Рго

С1и

11е

Ьеи

Азр

Уа1

Рго

290 295 300

Зег ТЬг

ЗЕр. ΙΌ Νο. 30

ДЛИНА: 573

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

МеЪ А1а А1а Зег А1а Не Рго А1а Рго ТНг Азр Ьеи Ьуз РНе ТНг

10 15

С1п 7а1 ТНг Рго ТНг Зег Ьеи Зег А1а С1п Тгр ТНг Рго Рго Азп

25 30

Уа1 С1п Ьеи

ТНг С1у Туг 35

Агд Уа1

Агд Уа1 40

ТНг

Рго

Ьуз

С1и

Ьуз 45

ТНг

С1у

Рго

Μβΐ

Ьуз

С1и

Не

Азп

Ьеи

А1а

Рго

Азр

Бег

Бег

Бег

50

55

60

Уа1

Уа1

Уа1

Бег

С1у

Ьеи

МеЪ

Уа1

А1а

ТНг

Ьуз

Туг

С1и

Уа1

Бег

65

70

75

Уа1

Туг

А1а

Ьеи

Ьуз

Азр

ТНг

Ьеи

ТНг

Бег

Агд

Рго

А1а

О1п

С1у

80

85

90

Уа1

Уа1

ТНг

ТНг

Ьеи

С1и

Азп

Уа1

Бег

Рго

Рго

Агд

Агд

А1а

Агд

95

100

105

Уа1

ТНг

Азр

А1а

ТНг

С1и

ТНг

ТНг

Не

ТНг

11е

Зег

Тгр

Агд

ТНг

но

115

120

Ьуз

ТНГ

С1и

ТНг

Не

ТНг

С1у

РНе

С1п

Уа1

Азр

А1а

νβΐ

Рго

А1а

125

130

135

Азп

С1у

С1п

ТНг

Рго

Не

01п

Агд

ТНг

Не

Ьуз

Рго

Азр

Уа1

Агд

140

145

150

Бег

Туг

ТНг

Не

ТНг

С1у

Ьеи

О1п

Рго

С1у

ТНг

Азр

Туг

Ьуз

Не

155

160

165

Туг

Ьеи

Туг

ТНг

Ьеи

Азп

Азр

Азп

А1а

Агд

Бег

Бег

Рго

Уа1

Уа1

170 175 180

Не Азр А1а Зег

ТЬг А1а 11е Азр А1а Рго Зег Азп Ьеи Агд

РЬе 195

185

190

Ьеи

А1а

ТЬг

ТЬг

Рго

Азп

Зег

Ьеи

Ьеи

Уа1

Зег

Тгр

С1п

Рго

Рго

200

205

210

Агд

АХа

Агд

Не

ТЬг

О1у

Туг

Не

Не

Ьуз

Туг

С1и

Ьуз

Рго

СХу

215

220

225

Зег

Рго

Рго

Агд

С1и

Уа1

Уа1

Рго

Агд

Рго

Агд

Рго

С1у

Уа1

ТЬг

230

235

240

С1и

А1а

ТЬг

Не

ТЫ

О1у

Ьеи

С1и

РГО

С1у

ТЬг

С1и

Туг

ТЬг

11е

245

250

255

Туг

Уа1

11е

А1а

Ьеи

Ьуз

Азп

Азп

О1п

Ьуз

Зег

СХи

Рго

Ьеи

Не

260

265

270

С1у

Агд

Ьуз

Ьуз

ТЫ

А1а

Не

Рго

А1а

Рго

ТЬг

Азр

Ьеи

Ьуз

РЬе

275

280

285

ТЬг

С1п

νβΐ

ТЬг

Рго

ТЬг

Зег

Ьеи

Зег

А1а

С1п

Тгр

ТЬг

Рго

Рго

290

295

300

Азп

Уа1

СХп

Ьеи

ТЫ

СХу

Туг

Агд

Уа1

Агд

Уа1

ТЬг

Рго

Ьуз

С1и

305

310

315

Ьуз

ТЬг

С1у

Рго

ме-с

Ьуз

С1и

Не

Азп

Ьеи

А1а

Рго

Азр

Зег

Зег

320

325

330

Зег

νβΐ

Уа1

Уа1

Зег

(Пу

Ьеи

МеГ

Уа1

АХа

ТЬг

Ьуз

Туг

СХи

Уа1

335

340

345

Зег

Уа1

Туг

А1а

Ьеи

Ьуз

Азр

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Зег

Агд

Рго

А1а

СХп

8Ер. ΙΌ Νο. 31

ДЛИНА: 37

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АААССАТССС АССТАССААТ СТСАССССАС СААСААС 37

350

360

355

555

545

550

Ьеи Рго

РГО АЗП

С1у

565

Ьеи

Рго

560

570

8Ер. ΙΌ Νο. 32

ДЛИНА: 37

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АААССАТССС ТЖС№ ААССААСАТС ШС 37

8Ер. ΙΌ Νο. 33 ДЛИНА: 1722

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: двойная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АТСССАССТА ССССТАТТСС ТССАССААСТ САССТСААСТ ТСАСТСАССТ САСАСССАСА 60

АСССТСАССС СССАСТССАС АССАСССААТ СТТСАССТСА СТС С АТ АТСС АСТСССССТС 120

АСССССААСС АСААСАСССС АССААТСААА САААТСААСС ТТССТССТСА САССТСАТСС 180

СТССТТСТАТ САССАСТТАТ ССТОСССАСС АААТАТСААС ТСАСТСТСТА ТССТСТТААС 240

САСАСТТТСА СААССАСАСС АССТСАСССТ СТТСТСАССА СТСТССАСАА ТСТСАССССА 300

ССААСААССЗ СТСЗТСТСАС АС АТССТАСТ САСАССАССА ТСАССАТТАО СТССАСААСС 360

ААСАСТСАСА ССАТСАСТСС СТТССААСТТ ОАТСССОТТС САСССААТСС ССАСАСТССА 420

АТССАСАСАА ССАТСААССС АСАТСТСАСА АССТАСАССА ТСАСАССТТТ АСААССАСОС 480

АСТСАСТАСА АСАТСТАССТ СТАСАССТТС ААТСАСААТС СТСССАССТС СССТСТССТС 540

АТССАССССТ ССАСТСССАТ ТСАТССАССА ТССААССТСС СТТТССТССС САССАСАССС 600

ААТТССТТСС ТССТАТСАТС ССАССССССА ССТОССАССА ТТАСССССТА САТСАТСААС 660

ТАТСАСААСС СТСССТСТСС ТСССА6АСАА СТССТСССТС СССССССССС ТССТСТСАСА 720

САСССТАСТА ТТАСТССССТ ССААСССССА АСССААТАТА СААТТТАТСТ САТТССССТС 780

ААБААТААТС АСААСАСССА СССССТСАТТ ССААССАААА АСАСТАСССС ТАТТССТССА 840

ССААСТСАСС ТСААСТТСАС ТСАССТСАСА СССАСААССС ТСАССССССА СТССАСАССА 900

СССААТСТТС АССТСАСТСС АТАТССАСТС ССССТСАССС ССААССАСАА САССССАССА 960

АТСАААСААА ТСААССТТСС ТССТСАСАСС ТСАТСССТСС ТТ5ТАТСАСС АСТТАТССТС 1020

СССАССАААТ АТСААСТСАС ТСТСТАТССТ СТТААССАСА СТТТСАСААС САСАССАССТ 1080

САСССТСТТС ТСАССАСТСТ ССАСААТСТС АССССАССАА СААССССТСС ТСТ С АС АС АТ ' 1140

ССТАСТСАСА ССАССАТСАС САТТАССТСС АСААССААСА СТСАСАССАТ САСТСССТТС 1200

СААСТТСАТС СССТТССАСС СААТССССАС АСТССААТСС АСАСААССАТ СААСССАСАТ 1260

СТСАСААССТ АСАССАТСАС АССТТТАСАА ССАСССАСТС АСТАСААСАТ СТАССТСТАС 1320

АССТТСААТС АСААТССТСС САССТССССТ СТССТСАТСС АССССТССАС ТСССАТТСАТ 1380

ССАССАТССА АССТСССТТТ ССТССССАСС АСАСССААТТ ССТТССТССТ АТСАТСССАС 1440

СССССАССТС ССАССАТТАС ССССТАСАТС АТСААСТАТС АСААСССТСС СТСТССТССС 1500

АСАСААСТСС ТСССТССССС ССССССТССТ СТСАСАСАСС СТАСТАТТАС ТССССТССАА 1560

СССССААССС ААТАТАСААТ ТТАТСТСАТТ ССССТСААСА АТ ААТ С АС АА САСССАСССС 1620

СТСАТТССАА ССАААААСАС ТАСССАССАС СТТССССААС Т СОТ А АС ССТ ТССАСАСССС 1680

ААТСТТСАТС САССАСАЗАТ СТТССАТСТТ ССТТССАСТА СТ 1722

Зег ТЬг Зег

8ЕО. ΙΌ Νο. 34

ДЛИНА: 412

ВИД: аминокислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

МеГ Зег Рго Не Ьеи С1у Туг Тгр Ьуз Не Ьуз С1у Ьеи УаХ СХп

1015

Рго ТЬг Агд Ьеи Ьеи Ьеи СХи Туг Ьеи С1и С1и Ьуз Туг СЛи СХи

2530

Нхз Ьеи Туг СХи Агд Азр СХи С1у Азр Ьуз Тгр Агд Азп Ьуз Ьуз

4045

РЬе СХи Ьеи ОХу Ьеи С1и РЬе Рго Азп Ьеи Рго Туг Туг Не Азр

5560

СХу Азр УаХ Ьуз Ьеи ТЬг С1п Зег МеГ АХа 11е 1Хе Агд Туг 1Хе

7075

АХа Азр Ьуз НХз Азп Мет: Ьеи СХу СХу Суз Рго Ьуз СХи Агд АХа

8590

СХи 1Хе Зег МеЕ Ьеи СХи С1у АХа Уа1 Ьеи Азр Не Агд Туг СХу

Х00Х05

УаХ Зег Агд 1Хе АХа Туг Зег Ьуз Азр РЬе С1и ТЬг Ьеи Ьуз УаХ

ХХО 115120

Азр РЬе Ьеи Зег Ьуз Ьеи Рго С1и МеЕ Ьеи Ьуз Мег РЬе С1и Азр

125 130135

Агд Ьеи Суз ΗΪ3 Ьуз ТЬг Туг Ьеи Азп С1у Азр Ηί3 Уа1 ТЬг Н1з

140 145150

Рго Азр РЬе МеЪ Ьеи Туг Азр А1а Ьеи Азр Уа1 Уа1 Ьеи Туг Μβΐ

155 160165

Азр Рго Μβΐ Суз Ьеи Азр А1а РЬе Рго Ьуз Ьеи УаХ Суз РЬе Ьуз

170 175Х80

Ьуз Агд Не С1и А1а 11е Рго С1п 11е Азр Ьуз Туг Ьеи Ьуз Зег

185 190Х95

Зег Ьуз Туг Не А1а Тгр Рго Ьеи С1п С1у Тгр С1п А1а ТЬг РЬе

200 205210

С1у С1у С1у Азр НХз Рго Рго Ьуз Зег Азр Ьеи Не С1и С1у Агд

215 220225

СХу 1Хе Рго Агд Азп Зег СХу АХа Рго Рго Агд Ьеи 11е Суз Азр

230 235240

Зег

Агд

Уа1

Ьеи С1п Агд Туг Ьеи Ьеи СХи А1а Ьуз О1и АХа С1и

245

250

255

Азп

Не

ТЬг

ТЬг

СХу

Суз

АХа

СХи

Н1з

Суз

Зег

Ьеи

Азп

СХи

Азп

260

265

270

11е

ТЬг

УаХ

Рго

Азр

ТЬг

Ьуз

Уа1

Азп

РЬе

Туг

АХа

Тгр

Ьуз

Агд

275

280

285

Μβΐ

СХи

Уа1

С1у

С1п

О1п

А1а

Уа1

СХи

УаХ

Тгр

СХп

С1у

Ьеи

А1а

290

295

300

Ьеи

Ьеи

Зег

С1и

АХа

Уа1

Ьеи

Агд

С1у

СХп

АХа

Ьеи

Ьеи

Уа1

Азп

305

3X0

315

Зег

Зег

С1п

Рго

Тгр

С1и

Рго

Ьеи

СХп

Ьеи

ΗΪ3

УаХ

Азр

Ьуз

АХа

320

325

330

УаХ

Зег

ОХу

Ьеи

Агд

Зег

Ьеи

ТЬг

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Агд

АХа

Ьеи

С1у

335

340

345

АХа

СХп

Ьуз

СХи

АХа

1Хе

Зег

Рго

Рго

Азр

АХа

А1а

Зег

АХа

АХа

350

355

360

Рго

Ьеи

Агд

ТЬГ

Не

ТЬг

АХа

Азр

ТЬг

РЬе

Агд

Ьуз

Ьеи

РЬе

Агд

365

370

375

УаХ

ТуГ

Зег

Азп

РЬе

Ьеи

Агд

СХу

Ьуз

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Туг

ТЬг

СХу

380

385

390

СХи

АХа

Суз

Агд

ТЬг

С1у

Азр

Агд

Ьеи

АХа

МеЪ

Азр

Рго

Ьеи

СХи

395

400

405

Зег

ТЬг

Агд

А1а

АХа

АХа

Зег

410

8ЕО. ΙΌ Νο. 35

ДЛИНА: 24

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная

ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

естссстстс сссстсссле тест 24

8ЕО. ΙΌ Νο. 36

ДЛИНА: 24

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

СТТС6ТСАСС САССТССТСС АТАТ 24

8ЕО. ΙΌ Νο. 37

ДЛИНА: 33

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

ССССТССССА АТТССССТСС СССАССАСЗС СТС 33

8ЕО. ΙΌ Νο. 38

ДЛИНА: 33

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

СССАСОТСОА ТССАТСССТА АТСТОТСССС ТОТ 33

8ЕО. ΙΌ Νο. 39

ДЛИНА: 1722

ВИД: нуклеиновая кислота

СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная

ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:

АТСТССССТА ТАСТАССТТА ТТССААААТТ ААСССССТТС ТССААСССАС ТССАСТТСТТ 60

ТТССААТАТС ТТСААСАААА АТАТСААСАС САТТТСТАТС АСССССАТСА АССТСАТААА 120

ТССССАААСА ААААСТТТСА АТТСССТТТС САСТТТСССА АТСТТССТТА ТТАТАТТСАТ 180

ССТСАТСТТА ААТТААСАСА СТСТАТСССС АТСАТАССТТ АТАТАССТСА СААССАСААС 240

АТСТТСССТС ОТТСТССААА АСАСССТССА САСАТТТСАА ТССТТСААСС АССССТТТТО 300

САТАТТАСАТ АСССТСТТТС САСААТТССА ТАТАСТАААС АСТТТСАААС ТСТСАААСТТ 360

САТТТТСТТА ССААССТАСС ТСАААТССТС ААААТСТТСС ААСАТССТТТ АТСТСАТААА 420

АСАТАТТТАА АТССТСАТСА ТСТААСССАТ ССТСАСТТСА ТСТТСТАТСА СССТСТТСАТ 480

СТТСТТТТАТ АСАТССАССС ААТСТСССТС САТСССТТСС СААААТТАСТ ТТСТТТТААА 540

АААССТАТТС ААССТАТССС АСАААТТСАТ ААСТАСТТСА ААТССАССАА СТАТАТАССА 600

ТССССТТТСС АССССТСССА АСССАССТТТ ССТССТСССС АССАТССТСС ААААТСССАТ 660

СТСАТССААС СТССТСССАТ ССССАССААТ ТССССТСССС САССАССССТ САТСТСТСАС 720

АССССАСТСС ТССАСАССТА ССТСТТССАО СССААССАСС СССАСААТАТ САССАССССС 780

ТСТССТСААС АСТССАССТТ СААТСАСААТ АТСАСТСТСС САСАСАССАА АСТТААТТТС 840

ТАТСССТССА АСАССАТССА ССТСССССАС САСССССТАС ААСТСТСССА СССССТСССС 900

СТССТСТССС ААССТСТССТ ССССССССАС ССССТСТТСС ТСААСТСТТС ССАССССТСС 960

САСССССТСС АССТССАТСТ ССАТАААССС СТСАСТСССС ТТСССАСССТ САССАСТСТС 1020

СТТСССССТС ТСССАССССА СААССААССС АТСТССССТС САСАТССССС СТСАССТССТ 1080

ССАСТСССАА СААТСАСТСС ТСАСАСТТТС СССАААСТСТ ТСССАСТСТА СТССААТТТС 1140

СТССССССАА АССТСААССТ СТАСАСАССС САССССТССА ССАСАССССА САСАТТАССС 1200

АТССАТССТС ТАСАСТСОАС ТССАСССССС ССАТССТСА 1239

100

Claims (48)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени ех у1уо с помощью ретровируса, включающий осуществление следующих стадий:

   а) престимулирование клеток-мишеней в присутствии фактора роста;

   б) инкубирование престимулированных клеток-мишеней с ретровирусом в присутствии синтетического субстрата;

   в) осуществление трансдукции клетокмишени путем их инфицирования ретровирусом в присутствии смеси эффективного количества функционального материала, связывающегося с ретровирусом, и эффективного количества другого функционального материала, связывающегося с клеткой-мишенью.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что функциональный материал, связывающийся с ретровирусом, выбран из группы, включающей гепарин-ΙΙ область фибронектина, факторы роста фибробластов, коллагены, полилизины или функциональные эквиваленты этих соединений.
3. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что функциональный материал, связывающийся с клеткой-мишенью, представляет собой лиганд.
4. 4. Способ по п.3, отличающийся тем, что указанный лиганд выбран из группы, включающей адгезивные по отношению к клетке белки, гормоны, цитокины, антитела и углеводы.
5. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что адгезивный по отношению к клетке белок представляет собой связывающий клетку доменный полипептид фибронектина.
6. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанный доменный полипептид фибронектина, представляет собой полипептид, связывающийся с очень поздним антигеном-5 (УЪА-5) и/или с очень поздним антигеном-4 (УЪА-4).
7. 7. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанный лиганд представляет собой эритропоэтин.
8. 8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанные функциональные материалы иммобилизованы.
9. 9. Способ по п.8, отличающийся тем, что функциональные материалы иммобилизованы на шариках.
10. 10. Культуральная среда для клетокмишеней, предназначенная для использования в способе повышения эффективности генного переноса по любому из пп.1-9, которая может быть применена в культуре клеток-мишеней и которая содержит смесь эффективного количества функционального материала, связывающего ретровирус, и эффективного количества иного функционального материала, связывающего клетки-мишени.
11. 11. Способ локализации ретровируса для генного переноса в клетки-мишени, включаю щий инкубацию указанного ретровируса с культуральной средой по п.10.
12. 12. Способ локализации по п.11, отличающийся тем, что функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, представляет собой функциональный материал, выбираемый из группы, содержащей связывающую гепарин-ΙΙ область фибронектина, факторы роста фибробластов, коллагены, полилизины и их функциональные элементы.
13. 13. Способ локализации по п.11, отличающийся тем, функциональный материал, связывающийся с клеткой-мишенью, представляет собой лиганд.
14. 14. Способ локализации по п.13, отличающийся тем, что указанный лиганд выбран из группы, включающей адгезивные по отношению к клетке белки, гормоны, цитокины, антитела и углеводы.
15. 15. Способ локализации по п.14, отличающийся тем, что адгезивный по отношению к клетке белок представляет собой связывающий клетку доменный полипептид фибронектина.
16. 16. Способ локализации по п.15, отличающийся тем, что указанный доменный полипептид фибронектина представляет собой полипептид, связывающийся с УЪА-5 и/или УЪА-4.
17. 17. Способ локализации по п.14, отличающийся тем, что указанный лиганд представляет собой эритропоэтин.
18. 18. Способ локализации по любому из пп.11-17, отличающийся тем, что указанные функциональные материалы иммобилизованы.
19. 19. Способ локализации ретровируса для генного переноса в клетки-мишени, включающий инкубацию указанного ретровируса с культуральной средой по п.10, отличающийся тем, что функциональный материал, связывающий ретровирус, получен из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина.
20. 20. Способ локализации по п.19, отличающийся тем, что указанный функциональный материал иммобилизован.
21. 21. Способ повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени ех у1уо с помощью ретровируса, включающий осуществление следующих стадий:

    а) престимулирование клеток-мишеней в присутствии фактора роста;

    б) инкубирование престимулированных клеток-мишеней с ретровирусом в присутствии синтетического субстрата;

    в) осуществление трансдукции клетокмишеней путем их инфицирования указанным ретровирусом в присутствии эффективного количества функционального материала, полученного из фактора роста фибробластов, коллагены, полилизина, причем каждая молекула указанного материала содержит как домен, связывающий ретровирус, так и домен, связывающий клеткимишени.

    101

    102
22. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанный домен, связывающийся с клеткоймишенью, представляет собой лиганд, который специфически связывается с клеткамимишенями.
23. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что указанный лиганд выбран из группы, содержащей белки, адгезивные по отношению к клетке, гормоны, цитокины, антитела, углеводы.
24. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что адгезивный по отношению к клетке белок представляет собой связывающий клетку доменный полипептид фибронектина.
25. 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что указанный доменный полипептид фибронектина представляет собой полипептид, связывающийся с УЬА-5 и/или УЪА-4.
26. 26. Способ по п.23, отличающийся тем, что указанный лиганд представляет собой эритропоэтин.
27. 27. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанный фактор роста фибробластов выбран из группы, содержащей фактор роста фибробластов, представленный в 8Ер. ГО Νο. 3 списка последовательностей, эквиваленты данного фактора и полипептиды, содержащие данный фактор или функциональный эквивалент данного фактора.
28. 28. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанный функциональный материал представляет собой полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной в 8Ер. ГО Νο. 4 или 5 списка последовательностей.
29. 29. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанный коллаген выбран из группы, содержащей фрагмент, полученный из коллагена типа ν, обладающий доменом, связывающим инсулин, функциональные эквиваленты данного фрагмента, полипептиды, содержащие данный фрагмент или функциональный эквивалент данного фрагмента.
30. 30. Способ по п.29, отличающийся тем, что указанный фрагмент, обладающий доменом, связывающим инсулин и получаемый из коллагена типа ν, представляет собой фрагмент, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной в 8Ер. ГО Νο. 6 списка последовательностей.
31. 31. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанный функциональный материал представляет собой полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной в 8Ер. ГО Νο. 7 или 8 списка последовательностей.
32. 32. Способ по любому из пп.21-31, отличающийся тем, что указанный функциональный материал иммобилизован.
33. 33. Способ по любому из пп.21-31, отличающийся тем, что функциональный материал используют без иммобилизации.
34. 34. Культуральная среда для клетокмишеней, предназначенная для использования в способе повышения эффективности генного переноса по любому из пп.21-33, которая может быть использована в культуре клеток-мишеней и которая содержит эффективное количество функционального материала, полученного из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, причем каждая молекула указанного материала содержит как домен, связывающий ретровирус, так и домен, связывающий клеткимишени.
35. 35. Способ локализации ретровируса, для генного переноса в клетки-мишени, включающий инкубацию ретровируса с культуральной средой по п.34.
36. 36. Способ локализации по п.35, отличающийся тем, что указанный фактор роста фибробластов выбран из группы, содержащей фактор роста фибробластов, представленный в 8Ер. ΙΌ Νο. 3 списка последовательностей, функциональные эквиваленты данного фактора и полипептиы, содержащие данный фактор или функциональные эквиваленты данного фактора.
37. 37. Способ локализации по п.35, отличающийся тем, что указанный функциональный материал представляет собой полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной в 8Е(Д ГО Νο. 4 списка последовательностей.
38. 38. Способ локализации по п.35, отличающийся тем, что указанный коллаген выбран из группы, содержащей фрагмент, полученный из коллагена типа ν, обладающий доменом, связывающим инсулин, функциональные эквиваленты данного фрагмента и полипептиды, содержащие данный фрагмент или функциональный эквивалент данного фрагмента.
39. 39. Способ локализации по п.38, отличающийся тем, что указанный фрагмент, получаемый из коллагена типа ν, обладающий доменом, связывающим инсулин, представляет собой фрагмент, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной в 8Ер. ГО Νο. 6 списка последовательностей.
40. 40. Способ локализации по п.35, отличающийся тем, что указанный функциональный материал представляет собой полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной в 8Ер. ГО Νο. 7 или 8 списка последовательностей.
41. 41. Способ по любому из пп.35-40, отличающийся тем, что указанный функциональный материал иммобилизован.
42. 42. Способ по любому из пп.18, 20, 32 и 41, отличающийся тем, что функциональный материал иммобилизован на шариках.
43. 43. Способ повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени ех νίνο с помощью ретровируса, включающий осуществление следующих стадий:

    103

    104

    а) престимулирование клеток-мишеней в присутствии фактора роста;

    б) инкубирование престимулированных клеток-мишеней с ретровирусом в присутствии синтетического субстрата;

    в) осуществление трансдукции клетокмишеней путем их инфицирования указанным ретровирусом в присутствии эффективного количества функционального материала, выбранного из группы, содержащей, по существу, чистый фибронектин, по существу, чистый фрагмент фибронектина или их смесь, причем каждая молекула указанного материала содержит как домен, связывающий ретровирус, так и домен, связывающий клетки-мишени.
44. 44. Способ по любому из пп.1-9, 21-33 и 43, отличающийся тем, что указанные клетки мишени представляют собой клетки, выбранные из группы, содержащей стволовые клетки, гемопоэтические клетки, не адгезирующие моноядерные клетки низкой плотности, адгезирующие клетки, клетки костного мозга, гемопоэтические стволовые клетки, стволовые клетки периферической крови, клетки крови пуповины, гемопоэтические стволовые клетки плода, эмбриопластические стволовые клетки, эмбриональные клетки, первичные половые клетки, ооциты, яйцеклетки, сперматозоиды, сперматоциты, СЭ34' клетки, С⁺ клетки, мультипатентные предшественники гемопоэтических клеток, унипотентные предшественники гемопоэтических клеток, эритроцитарные клеткипредшественники, лимфоцитарные клеткипредшественники, зрелые клетки крови, лимфоциты, В-клетки, Т-клетки, фибробласты, нейробласты, нервные клетки, эндотелиальные клетки, ангиоэндотелиальные клетки, гепатоциты, миобласты, клетки скелетной мускулатуры, клетки гладкой мускулатуры, раковые клетки, миеломные клетки и лейкозные клетки.
45. 45. Способ по любому из пп.1-9, 11-18, 1933, 35-41 и 42-44, отличающийся тем, что указанный ретровирус включает экзогенный ген.
46. 46. Способ по п.45, отличающийся тем, что указанный ретровирус представляет собой рекомбинантный ретровирусный вектор.
47. 47. Способ по п.45, отличающийся тем, что указанный ретровирус представляет собой дефектный по репликации рекомбинантный ретровирусный вектор.
48. 48. Штамм эукариотических клеток, трансдуцированных чужеродным геном, способный быть использованным для клеточной трансплантации, где указанные клетки получены способом по любому из пп.1-9, 21-33 или 4347.