EA004928B1 - Полипептиды, повышающие эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, и гены, их кодирующие - Google Patents
Полипептиды, повышающие эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, и гены, их кодирующие Download PDFInfo
- Publication number
- EA004928B1 EA004928B1 EA200200837A EA200200837A EA004928B1 EA 004928 B1 EA004928 B1 EA 004928B1 EA 200200837 A EA200200837 A EA 200200837A EA 200200837 A EA200200837 A EA 200200837A EA 004928 B1 EA004928 B1 EA 004928B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- cells
- retrovirus
- gene transfer
- polypeptide
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 348
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 237
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 216
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 215
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 title claims abstract description 210
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title abstract description 30
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims abstract description 240
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 4
- 101100271190 Plasmodium falciparum (isolate 3D7) ATAT gene Proteins 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 517
- 239000000463 material Substances 0.000 description 231
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 191
- 238000000034 method Methods 0.000 description 142
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 127
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 114
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 114
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 86
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 77
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 65
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 61
- 239000008204 material by function Substances 0.000 description 52
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 49
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 42
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 42
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 41
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 41
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 41
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 41
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 40
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 40
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 40
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 40
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 38
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 36
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 34
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 30
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 30
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 30
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 28
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 28
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 26
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 24
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 24
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 24
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 22
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 21
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 20
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 20
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 19
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 18
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 18
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 17
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 17
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 15
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 15
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 14
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 13
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 12
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 12
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 12
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 12
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 12
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 11
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 10
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 10
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 10
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 10
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 9
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 9
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 8
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 8
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 7
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 108010075944 Erythropoietin Receptors Proteins 0.000 description 7
- 102100036509 Erythropoietin receptor Human genes 0.000 description 7
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 7
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 208000005074 Retroviridae Infections Diseases 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 101150033518 uba-5 gene Proteins 0.000 description 5
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 4
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 101100291853 Caenorhabditis briggsae uba-4 gene Proteins 0.000 description 3
- 101100291854 Caenorhabditis elegans moc-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000012432 Collagen Type V Human genes 0.000 description 3
- 108010022514 Collagen Type V Proteins 0.000 description 3
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 3
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108010002913 Asialoglycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 2
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 2
- 235000002256 Diospyros oleifera Nutrition 0.000 description 2
- 244000153389 Diospyros oleifera Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000015779 HDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010010234 HDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 101001026885 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase D3 Proteins 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102100037311 Serine/threonine-protein kinase D3 Human genes 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000270728 Alligator Species 0.000 description 1
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000225069 Calyptocephallela gayi Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000269333 Caudata Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 208000027219 Deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 241000723298 Dicentrarchus labrax Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M Fluoride anion Chemical compound [F-] KRHYYFGTRYWZRS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001670157 Gymnura Species 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001417534 Lutjanidae Species 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102100027754 Mast/stem cell growth factor receptor Kit Human genes 0.000 description 1
- 101000716728 Mus musculus Kit ligand Proteins 0.000 description 1
- 101100049053 Mus musculus Vash1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102400000058 Neuregulin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000556 Neuregulin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241000269799 Perca fluviatilis Species 0.000 description 1
- 241000288049 Perdix perdix Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 241000360071 Pituophis catenifer Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000269908 Platichthys flesus Species 0.000 description 1
- 241001600434 Plectroglyphidodon lacrymatus Species 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- WHSQPVUDHQAQLA-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSSSS WHSQPVUDHQAQLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100455666 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) LUC7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 1
- 240000005499 Sasa Species 0.000 description 1
- 101100073174 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) jhd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000269821 Scombridae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000270708 Testudinidae Species 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007012 clinical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000001819 effect on gene Effects 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940116886 human interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 235000020640 mackerel Nutrition 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005074 megakaryoblast Anatomy 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000003887 myelocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000003757 neuroblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000003924 normoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002380 oogonia Anatomy 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 201000005484 prostate carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002629 repopulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102220261568 rs773559423 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002363 skeletal muscle cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/13045—Special targeting system for viral vectors
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Описаны пептиды, повышающие эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, гены, кодирующие эти полипептиды, а также способ повышения эффективности генного переноса. В данном способе соответствующие клетки-мишени, инфицируемые с помощью ретровируса в присутствии либо смеси из эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающим доментом, связывающим клетку-мишени, либо эффективного количества функционального материала, обладающего этими связывающими доменами на одной и той же молекуле. Этим функциональным материалом являются указанные пептиды, которые могут использоваться без иммобилизации или с иммобилизацией на шариках. Способ пригоден, например, для генной терапии.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к полипептидам и генам, кодирующим эти полипептиды, используемые в способе, повышающем эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса. Данное изобретение может быть использовано в различных областях техники, таких как медицина, клеточная техно логия, генная инженерия и технология развития и многих методах с ними связанных.
Препросылки изобретения
Благодаря постижению механизмов многих болезней человека, а также быстрому прогрессу в технологии рекомбинантных ДНК и в технологии генного переноса, в последнее время разработали условия применения соматической генной терапии для лечения серьезных генетических болезней. Кроме того, в настоящее время активизировались попытки применить генную терапию не только для лечения генетических болезней, но также для лечения вирусных инфекций, таких как ΑΙΌ8 и рак.
Почти все эксперименты по переносу соответствующего гена у человека, одобренные в прошлом Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (США) (ΕΌΛ). представляют собой трансдукцию клеток с помощью ретровирусных векторов. Ретровирусные векторы могут эффективно переносить нужный экзогенный ген в клетки для стабильной интеграции данного экзогенного гена в хромосомной ДНК, и, поэтому, в частности, они представляют собой предпочтительные средства генного переноса для генной терапии, в которой необходима долговременная экспрессия гена. Такие векторы создавали разнообразными способами, чтобы избежать неблагоприятного воздействия на трансдуцируемые организмы. Например, исключали репликационные функции векторов, чтобы предотвратить не ограничиваемую повторяемость заражения (трансдукцию), обусловленную ауторепликацией данных векторов, используемых для переноса гена в клетки. Поскольку эти векторы (дефектные по репликации ретровирусные векторы) не обладают способностью к ауторепликации, обычно, ретровирусные векторы, упакованные в вирусные частицы, получают путем использования клеток-продуцентов ретровируса (упаковывающие клетки).
С другой стороны, клетки костного мозга представляют собой хорошую мишень для терапии соматического гена, поскольку с клетками костного мозга легко манипулировать в условиях ίη νίίτο, и они содержат гемопоэтические стволовые клетки, способные к ауторепликации. Альтернативно, человеческая пуповинная кровь, как ранее было показано, содержит большое количество незрелых предшественников клеток, в том числе гемопоэтических стволовых клеток. Когда генную терапию осуществляли путем переноса гена в эти клетки-мишени и трансплантировали их в живой организм, перенесенный таким образом ген, экспрессируемый длительное время в кровяных клетках, оказывал пожизненное лечебное действие.
Однако несмотря на интенсивные исследования в разных группах, гемопоэтические стволовые клетки представляют собой клетки, одни из тех, чье эффективное трансдуцирование является трудным. В прошлом наиболее эффективными условиями переноса гена, относящегося к гемопоэтическим стволовым клеткам мыши и других животных, являлось сокультивирование гемопоэтических стволовых клеток с клетками-продуцентами ретровируса. Однако для клинической генной терапии человека более желательна бесклеточная трансдукция, связанная с биологической безопасностью. К сожалению, эффективный перенос гена в гемопоэтические стволовые клетки, как правило, невозможен без сокультивирования с клеткамипродуцентами ретровируса.
Недавно было сообщено, что эффективность переноса гена с помощью ретровирусов можно повысить с помощью компонента внеклеточного матрикса, фибронектина или исключительно с помощью его фрагментов (I. С1ш. Ιηνθδί., 93, рр. 1451-1457 (1994); Β1οοά, 88, рр. 855-862 (1996)). Кроме того, обнаружили также, что фрагменты фибронектина, полученные с помощью генной инженерии, обладают такими же свойствами, и при их использовании может быть осуществлен эффективный перенос экзогенного гена в гемопоэтические стволовые клетки (\УО 95/26200). Связывание домена фибронектина, связывающего гепарин, с ретровирусом означает участие фибронектина в таком улучшении эффективности генного переноса. Во всех этих способах, использующих фибронектин и фрагменты фибронектина, клетки инфицировали с помощью ретровирусов на планшетах, на которых иммобилизовали фибронектин или его фрагменты.
Цели изобретения
Обсуждается осуществление вышеописанных способов переноса гена, с использованием фибронектина и фибронектиновых фрагментов с помощью молекул фибронектина или его фрагментов, обладающих доменом, связывающим ретровирус, и доменом на этой же молекуле, связывающим клетку-мишень (Ыа1иге Меб1еше, 2, рр. 876-872 (1996)). Поэтому, для эффективного генного переноса в различные клеткимишени с использованием вышеупомянутого способа, необходимо приготовить функциональный материал, обладающий обоими доменами, связывающим вирус и связывающим клетку-мишень, на одной молекуле, в соответствующих отдельных клетках, и еще остается проблема в его использовании в качестве обычного способа переноса гена.
Далее вышеописанный способ генного переноса осуществляют путем иммобилизации фибронектина или фибронектинового фрагмента на поверхности планшета, используемой для культивирования клеток-мишеней после заражения ретровирусами. Однако для иммобилизации на планшете необходимы сложные методики и это не свидетельствует о простоте и удобстве способа переноса гена.
Более того, соответствующий функциональный материал, используемый в вышеописанном способе генного переноса, ограничен в том, что имеющийся домен, связывающий гепарин, получают из фибронектина в качестве домена, связывающего ретровирус. Следовательно, существуют возможности создать улучшенный способ переноса гена при обнаружении любого другого вещества, связывающего ретровирус.
Цель настоящего изобретения заключается в решении этого вопроса и в создании более удобного и эффективного способа переноса гена.
Краткое изложение существа изобретения
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ретровирусное инфицирование с помощью функционального материала, обычно, фибронектина или его фрагмента, можно стимулировать, даже когда область, обладающая доменом, связывающим ретровирус, и область, обладающая доменом, связывающим клетку, не представлены на одной и той же молекуле. Другими словами, авторы настоящего изобретения обнаружили, что эффективность переноса гена с помощью ретровирусов в клетки-мишени можно повысить путем использования эффективного количества функционального материала, содержащего домен, связывающий ретровирус, смешанного с функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клеткумишень.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили также, что ретровирусная инфекция, усиливающая активность с помощью функционального материала, может наблюдаться даже когда этот функциональный материал не иммобилизован на поверхности планшета. Авторы настоящего изобретения обнаружили, кроме того, что эффективность переноса гена в клетки-мишени можно повысить путем контактирования ретровирусов с этими клеткамимишенями в присутствии функционального материала, иммобилизованного на шариках.
Вдобавок, авторы настоящего изобретения далее обнаружили вещество, связывающее ретровирус, которое не содержит домена, связывающего гепарин, происходящего из фибронектина, и также обнаружили, что этот материал и его производные пригодны для переноса гена в клетки-мишени с помощью ретровирусов. Более того, авторы настоящего изобретения добились создания функциональных материалов, пригодных для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. В итоге было создано настоящее изобретение.
Итак, первый аспект настоящего изобретения связан со способом повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. Этот способ предназначен для трансдукции клеток-мишеней с помощью ретровируса и характеризуется инфицированием соответствующих клеток-мишеней с помощью соответствующего ретровируса в присутствии смеси из эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, чтобы дать возможность перенести соответствующий ген в эти клеткимишени.
Соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используемый для этой первой цели настоящего изобретения, специфически не ограничен и, например, он представляет собой функциональный материал, выбранный из определенной группы, состоящей из связывающего гепарин II домена фибронектина, фактора роста фибробластов, коллагена, полилизина и их функциональных эквивалентов. Соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку-мишень, может представлять собой вещество, содержащее лиганд, которое может связываться с клеткамимишенями. В качестве лиганда выступают клеточные адгезионные белки, гормоны, цитокины, антитела, цепочки сахара, углеводы и метаболиты клеток-мишеней и т.п. Примеры адгезионных белков включают полипептиды домена фибронектина, связывающего клетку. Также как и этот домен фибронектина, связывающий клетку, существуют полипептиды домена, связывающегося с УЪА-5 и/или УЪА-4. Кроме того, другие примеры лиганда включают эритропоэтин.
Указанный функциональный материал, используемый для первой цели настоящего изобретения, может применяться без иммобилизации или может быть иммобилизован и при иммобилизации на шариках удобен в применении. Кроме того, когда лиганд, специфичный для клеток-мишеней, выбран в качестве функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку, первый аспект настоящего изобретения дает возможность удобно трансдуцировать предполагаемые клетки-мишени.
Как описано выше, в традиционных способах, которые раскрыты в АО 95/26200 и Иа1иге
МеФсше рассматривается основной механизм повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса для совместной локализации ретровируса и клетокмишеней на функциональном материале, обла5 дающем и доменом, связывающим ретровирус и доменом, связывающим клетку-мишень на одной и той же молекуле. Однако в соответствии с настоящим изобретением эффективность генного переноса в клетки-мишени можно повысить путем осуществления генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса в присутствии смеси эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клеткумишень.
Второй аспект настоящего изобретения относится к культуральной среде для клетокмишеней, используемой для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов, которая включает смесь эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективное количество другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень.
Благодаря использованию культуральной среды из второго аспекта настоящего изобретения можно удобным образом осуществить указанный первый аспект настоящего изобретения.
Третий аспект настоящего изобретения относится к способу локализации ретровирусов и данный способ отличается инкубированием культуральной среды, содержащей ретровирус, контактируемый со смесью эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к набору, используемому для осуществления ретровирус-опосредованного генного переноса в клетки-мишени и данный набор включает
a) эффективное количество функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и/или эффективное количество другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клеткумишень;
b) синтетический субстрат для инкубирования клеток-мишеней и ретровируса; и
c) ростовой фактор клетки-мишени для предварительной стимуляции соответствующих клеток-мишеней.
Благодаря применению реагентного набора из четвертого аспекта настоящего изобретения, можно удобно осуществить первый и третий аспекты настоящего изобретения.
Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу, повышающему эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов и данный способ отличается тем, что эти клетки-мишени инфицированы соответствующим ретровирусом в присутствии эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, а также доменом, связывающим ретровирус, полученным из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, или его функционального эквивалента, на одной и той же молекуле, чтобы дать возможность трансдуцировать данные клетки-мишени.
В вышеуказанных традиционных способах, которые описаны в XVО 95/26200 и ЫаШге Мебкше, фибронектиновые фрагменты раскрыты в качестве материала, который может использоваться для наиболее эффективного способа по улучшению генного переноса в клеткимишени с помощью ретровирусов. Однако что касается функциональных материалов иных, чем фибронектиновые фрагменты, не существует конкретного описания того, какого рода функциональный материал может применяться для эффективного способа генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. В частности, в традиционном способе описан лишь 12-14 повтор в фибронектине в качестве домена, связывающего данный ретровирус.
Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что фактор роста фибробластов, коллаген, полилизин и другие, которые не обладают какой-либо структурной связью с этим повтором 12-14 фибронектина, могут эффективно использоваться в способе по улучшению генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов. По этой причине любой функциональный эквивалент этих материалов, т. е. любой материал, который обладает доменом, связывающим ретровирус, функционально эквивалентен этим материалам и может повышать эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса, может использоваться для осуществления пятой цели настоящего изобретения.
Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения, в качестве домена, связывающего клетку-мишень, может использоваться материал, обладающий лигандом, который может связываться с клетками-мишенями, и этот материал присоединен к домену, связывающему ретровирус.
Примеры соответствующего лиганда включают клеточные адгезионные белки, гормоны, цитокины, антитела, цепочки сахара, углеводы, метаболиты клеток-мишеней и т.п. Примеры клеточных адгезионных белков включают полипептиды связывающего клетку домена фибронектина. Например, полипептиды домена, связывающегося с УБА-5 и/или УБА-4, могут использоваться в настоящем изобретении. Кроме того, другие примеры лиганда включают эритропоэтин.
Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения в качестве фактора роста фибробластов, используемого в качестве домеΊ на, связывающего ретровирус, существуют факторы роста фибробластов, выбранные, например, из фактора роста фибробластов, представленного с помощью 8ЕО. ΙΌ Νο. 3 в списке последовательностей, функционально эквивалентные фактору и полипептидам, содержащим данный фактор, или его функциональные эквиваленты.
Примеры этих функциональных материалов включают полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в 8ЕЦ. ΙΌ Νοδ. 4 и 5 данного списка последовательностей.
Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения коллагены, используемые в качестве домена, связывающего ретровирус, включают, например, коллагены, выбранные из коллагенового фрагмента, содержащего домен, связывающий инсулин, получаемого из коллагена типа V, функциональных эквивалентов соответствующих фрагментов и полипептидов, содержащих соответствующие фрагменты или их функциональный эквивалент. Кроме того, примеры таких фрагментов включают фрагмент, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в 8>Ер. ΙΌ Νο. 6 данного списка последовательностей.
Примеры этих функциональных материалов включают полипептиды, представленные в 8Ер. ΙΌ Νοδ. 7 и 8 данного списка последовательностей.
Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения полилизин, используемый в качестве домена, связывающего ретровирус, представляет собой полимер Ь-лизина и, например, один из них, обладая подходящим уровнем полимеризации, может быть выбран из коммерчески доступных продуктов и использован.
Если домен, связывающий ретровирус, получен из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, который, одновременно, обладает доменом, связывающим клеткумишень, эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов можно повысить путем инфицирования клетокмишеней с помощью ретровируса в присутствии эффективного количества домена, связывающего данный ретровирус, полученного из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Если клетки-мишени представляют собой адгезионные клетки, ретровирус и клетки-мишени, соответственно, связываются и приклеиваются к данному функциональному материалу, эффективность генного переноса в данные клеткимишени с помощью ретровируса может быть повышена путем инфицирования этих клетокмишеней с помощью ретровируса в присутствии соответствующего эффективного количества домена, связывающего данный ретровирус, полученный из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина.
Было также обнаружено, что если полипептид, представленный в 8>Ер. ΙΌ Νο. 1 списка последовательностей (именуемый ниже как Н271), обладает одновременно доменом, связывающим клетку-мишень, т.е. если клеткимишени связываются с полипептидом Н-271, то эффективность генного переноса в эти клеткимишени с помощью ретровируса можно повысить путем инфицирования данных клетокмишеней с помощью соответствующего ретровируса в присутствии эффективного количества данного полипептида.
Другими словами, хотя домен, связывающий соответствующий ретровирус, описанный выше в №1игс МеЛеше, обладает лишь повтором 12-14 фибронектина, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что Н271 эффективно действует в качестве домена, связывающего клетку-мишень, в соответствии с конкретным видом клеток-мишеней, чтобы улучшить эффективность генного переноса в данные клетки-мишени. Кроме того, в случае, когда клетки-мишени представляют собой адгезионные клетки, эти клетки-мишени и ретровирус соответственно связываются и слипаются с данным полипептидом, а эффективность генного переноса в эти клетки-мишени с помощью соответствующего ретровируса может быть улучшена путем инфицирования данных клетокмишеней с помощью данного ретровируса в присутствии эффективного количества данного полипептида.
Для осуществления пятого аспекта настоящего изобретения функциональный материал может использоваться без иммобилизации или может быть иммобилизован, однако, иммобилизация является предпочтительной для случая, в котором клетки-мишени представляют собой прилипающие клетки.
Шестой аспект настоящего изобретения связан с культуральной средой для клетокмишеней, используемой для генного переноса в соответствующие клетки-мишени с помощью ретровируса, которая включает эффективное количество функционального материала, который обладает доменом, связывающим клеткумишень, а также доменом, связывающим ретровирус, полученным из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, или их функционального эквивалента, на одной и той же молекуле.
Седьмой аспект настоящего изобретения относится к способу локализации ретровируса, который включает инкубирование культуральной среды, содержащей соответствующий ретровирус, контактируемый с эффективным количеством функционального материала, содержащего домен, связывающий ретровирус, получаемый из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Эти функциональные материалы могут эффективно использоваться для локализации ретровируса для улучшения генно го переноса в клетки-мишени с помощью данного ретровируса.
Сверх того, данный способ локализации ретровируса настоящего изобретения включает инкубацию данного ретровируса, контактируемого с эффективным количеством функционального материала, включающего домен, который связывается с клеткой-мишенью, а также домен, связывающий ретровирус, полученный из фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина, или их функционального эквивалента, на одной и той же молекуле.
Восьмой аспект настоящего изобретения заключается в использовании набора для осуществления ретровирус-опосредованного генного переноса в клетки-мишени и данный набор включает
a) эффективное количество функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, а также доменом, связывающим клетку-мишень, полученным от фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина или их функционального эквивалента, на одной и той же молекуле;
b) синтетический субстрат для инкубирования клеток-мишеней, контактируемых с ретровирусом; и
c) фактор роста клетки-мишени для предварительной стимуляции соответствующих клеток-мишеней.
На практике могут быть соответственно использованы любой способ первого и пятого аспектов, любая культуральная среда второго и шестого аспектов, любой способ третьего и седьмого аспектов и любой набор четвертого и восьмого аспектов настоящего изобретения, соответствующие функциональные материалы, иммобилизованные на шариках.
Девятый аспект настоящего изобретения относится к способу повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса и отличается тем, что данные клетки-мишени инфицированы с помощью ретровируса в присутствии эффективного количества функционального материала, иммобилизованного на шариках, выбранных из практически чистого фибронектина, практически чистого фибронектинового фрагмента или их смеси, чтобы дать возможность трансдуцировать данные клетки-мишени с помощью данного ретровируса.
Десятый аспект настоящего изобретения также связан со способом повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса и отличается тем, что данные клетки-мишени инфицированы с помощью ретровируса в присутствии эффективного количества функционального материала, выбранного из практически чистого фибронектина, практически чистого фибронектинового фрагмента или их смеси без иммобилизации, чтобы дать возможность трансдуцировать данные клетки-мишени с помощью соответствующего ретровируса.
В вышеуказанных традиционных способах, которые раскрыты в \УО 95/26200 и Ыа1ига1 МеЛеше, основной механизм повышения эффективности генного переноса с помощью ретровируса заключается в том, что ретровирус и клетки-мишени должны быть солокализованы на функциональном материале, обладающем доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень на одной и той же молекуле. В этих способах указанная солокализация и ретровируса и клеток-мишеней на функциональном материале, обладающем и доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле, становится возможной, благодаря иммобилизации данного функционального материала, обладающего доменом, связывающим соответствующий ретровирус, и доменом, связывающим соответствующую клетку-мишень, на одной и той же молекуле на культуральном субстрате.
Однако в соответствии с настоящим изобретением даже при использовании практически чистого фибронектина, практически чистого фибронектинового фрагмента или их смеси, неожиданно обнаружилось, что эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса может быть эффективно повышена путем использования соответствующего функционального материала, обладающего и доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень на одной и той же молекуле без иммобилизации на культуральном субстрате.
Как соответствующие клетки-мишени, используемые в указанных первом, пятом, девятом и десятом аспектах настоящего изобретения, могут использоваться, например, клетки, выбранные из стволовых клеток, гемопоэтических клеток, не адгезирующих при низкой плотности моноядерных клеток, адгезирующих клеток, клеток костного мозга, гемопоэтических стволовых клеток, стволовых клеток периферической крови, клеток пуповинной крови, гемопоэтических стволовых клеток плода, эмбриопластических стволовых клеток, эмбриональных клеток, первичных половых клеток, ооцитов, оогоний, яйцеклеток, сперматоцитов, сперматозоидов, СИ 34 + клетки, 0-кй + клетки, мультипотентных предшественников гемопоэтических клеток, унипотентных предшественников гемопоэтических клеток, эритроцитарных клеток-предшественников, лимфоцитарных клеток-предшественников, зрелых клеток крови, лимфоцитов, В-клеток, Т-клеток, фибробластов, нейробластов, клеток нервов, эндотелиальных клеток, ангиоэндотелиальных клеток, гепатоцитов, миобластов, клеток скелетной мускулатуры, клеток гладкой мускулатуры, раковых клеток, миеломных клеток и лейкозных клеток.
Как соответствующий ретровирус, используемый для первого, третьего, пятого, седьмого, девятого и десятого аспектов настоящего изобретения, можно использовать ретровирус, содержащий экзогенный ген, и этот ретровирус может представлять собой, например, рекомбинантный ретровирусный вектор. Кроме того, этот ретровирус может представлять собой, например, дефектный по репликации рекомбинантный ретровирусный вектор.
Одиннадцатый аспект настоящего изобретения связан с трансдуцируемыми клетками, получаемыми в соответствии с первым, пятым, девятым или десятым аспектом настоящего изобретения.
Двенадцатый аспект настоящего изобретения относится к способу трансплантирования клетки для трансплантирования соответствующих трансдуцированных клеток, в соответствии с одиннадцатым аспектом настоящего изобретения, позвоночному животному.
Тринадцатый аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, представленному 8 Ер. ГО Νο. 13 в списке последовательностей, которыми может повысить эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, или его функциональным эквивалентам.
Четырнадцатый аспект настоящего изобретения относится к гену, кодирующему указанный полипептид, согласно тринадцатому аспекту настоящего изобретения. Примеры такого гена включают ген, представленный 8 Ер. ГО Νο. 17 в списке последовательностей, или ген, который может гибридизовать с вышеуказанным геном в строгих условиях, и кодирует полипептид, который может повышать эффективность переноса данного гена в клетки-мишени с помощью ретровируса.
В вышеуказанных традиционных способах из АО 95/26200 и №1Шгс Мебюше наиболее эффективный пептид, используемый для переноса гена, представляет собой СН-296. С другой стороны, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что этот же полипептид без домена, связывающего УЬЛ-5 и домена, связывающего УЬЛ-4, может использоваться в настоящем изобретении.
Пятнадцатый аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, представленному 8Ер. ГО Νο. 30 в списке последовательностей, который может повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, или к его функциональному эквиваленту.
Шестнадцатый аспект настоящего изобретения относится к гену, кодирующему указанный полипептид, согласно пятнадцатому аспекту настоящего изобретения. Примеры этого гена включают ген, представленный 8Ер. ГО Νο. 33 в списке последовательностей, или ген, который может гибридизовать с вышеуказанным геном в строгих условиях и кодирует полипептид, который может повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса.
Семнадцатый аспект настоящего изобретения относится к полипептиду, представленному 8Ер. ГО Νο. 5, который может повышать эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса, или к его функциональным эквивалентам.
Восемнадцатый аспект настоящего изобретения относится к гену, кодирующему полипептид, согласно семнадцатому аспекту настоящего изобретения. Примеры такого гена включают ген, представленный 8Ер. ГО Νο. 26 или ген, который может гибридизовать с вышеуказанным геном и кодирует полипептид, который может повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса. Подробное описание настоящего изобретения
Для способа генного переноса настоящего изобретения обычно используются рекомбинантные ретровирусные векторы, и, в частности, подходящим является дефектный по репликации ретровирусный вектор. Способность к репликации у данного вектора исключали, чтобы предотвратить ауторепликацию в инфицируемых клетках, так, чтобы данный вектор не являлся патогенным. Эти векторы можно внедрять в хозяйские клетки, такие как клетки позвоночного животного, в частности, клетки млекопитающих, чтобы устойчиво интегрировать экзогенные гены, вставленные в эти векторы, в хромосомную ДНК хозяйских клеток.
В настоящем изобретении экзогенные гены, переносимые в клетки, могут использоваться путем их инсерцирования в ретровирусный вектор под контролем подходящего промотора, например, промотора БТВ. представленного в ретровирусе, или экзогенного промотора. Кроме того, для того чтобы осуществить транскрипцию экзогенного гена, в векторе могут быть также представлены другие регуляторные элементы, которые взаимодействуют с промотором, и сайт инициации транскрипции, например, энхансер может также присутствовать в векторе. Более того, предпочтительно, инсерцируемый ген может обладать нижележащей терминаторной последовательностью. Этот экзогенный ген, переносимый в клетки, может быть природным или искусственным геном и может обладать дополнительной молекулой ДНК, полученной из гетерологичных источников, присоединенной к нему путем лигирования или другими способами, известными в данной области.
Экзогенные гены, инсерцированные в ретровирус, могут представлять собой любые гены, представляющие интерес для трансдукции клеток. Например, эти экзогенные гены могут кодировать фермент, который ассоциирован с лечением болезни, белок, антисмысловую нуклеи13 новую кислоту, рибозим или вспомогательный праймер (см., например, АО 90/13641), внутриклеточное антитело (см., например, АО 94/02610), ростовой фактор и т.п.
Ретровирусные векторы, используемые в настоящем изобретении, могут обладать маркерным геном, для того чтобы трансдуцируемые клетки можно было легко селектировать. В качестве маркерного гена можно использовать, например, ген лекарственной устойчивости, который обеспечивает трансформированным клеткам устойчивостью к антибиотику, или репортерный ген, который наделяет трансформированные клетки ферментной активностью для их детектирования.
В качестве используемых векторов существуют ретровирусные векторы, такие как известный МРО-вектор (АТСС Νο. 68754), а-8ОС (АТСС N0. 68755) и др. Кроме того,
Ν2/ΖίρΤΚΝΕΟ^κτορ (ΤΚΝΕΟ, Βίοοά, νοί. 78, рр. 310-317 (1991)) и РМ5пео-вектор (Ехр. НешаФБ, νοί. 23, рр. 630-638 (1995)) оба, используемые в нижеприводимых примерах, содержат гены устойчивости к неомицину (неомицинфосфотрансферазный ген) в качестве своих маркерных генов. Поэтому клетки, трансформированные с помощью этих векторов, могут распознаваться в качестве клеток, обладающих устойчивостью к антибиотикам (неомицину, С418, и др.), инактивируемых продуктами данных генов. Более того, эти векторы можно получить в виде вирусных частиц, содержащих данные векторы, упакованные в них, путем использования известных упаковывающих клеточных штаммов, например, РО13 (АТСС СРБ10686), РО13/Ь№8 (АТСС СРЬ-10685), РА317 (АТСС СРЬ-9078), клеточных штаммов, описанных в патенте США 5278056, ОР + Е-86 (АТСС СРЬ-9642), ОР + еп\Ат-12 (АТСС СВЬ9641) и др.
Термин эффективное количество функционального материала, используемого здесь, означает определенное количество, необходимое для трансформации клеток-мишеней геном, переносимом в клетки-мишени с помощью ретровируса. Соответствующее количество можно подобрать в зависимости от конкретного функционального материала, ретровируса и конкретного вида клеток-мишеней, путем использования способа, описанного здесь. Термин эффективность генного переноса, используемый здесь, означает эффективность трансформации.
Способность связывания с ретровирусом функционального материала, т.е. эффективность и пригодность функционального материала настоящего изобретения, может быть установлена с помощью обычных анализов, которые описаны в нижеприводимых примерах.
Эти анализы определяют пределы, в которых ретровирусные частицы связаны с функциональным материалом, иммобилизованном на матриксе, используемом в настоящем изобрете нии, чтобы противостоять смыву с данного матрикса. Коротко, вируссодержащий супернатант, например, можно инкубировать в лунке, содержащей соответствующий иммобилизованный функциональный материал, обладающий доменом, связывающий ретровирус. Затем эту лунку тщательно промывают физиологическим солевым буфером и после этого клетки-мишени инкубируют в данной лунке, чтобы определить уровень инфекционной активности вируса, остающегося в данной лунке. Оценивают снижение инфекционной активности, или титра, относительно данного начального вирусного супернатанта, и сравнивают с тем, что получено в аналогичном контроле (т.е. используя лунку, покрытую В8А). Существенно более высокий титр, остающийся в функциональном материале, содержащемся в лунке, по сравнению с вышеуказанной контрольной лункой, свидетельствует о том, что данный материал может использоваться в качестве функционального материала в настоящем изобретении.
Для облегчения этой процедуры скринирования, данный вирусный вектор может содержать селективный маркерный ген.
Функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используемый в настоящем изобретении, можно скринировать с помощью этих анализов.
Как таковой, функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, представляет собой здесь функциональный материал, который обладает доменом, связывающим ретровирус, полученный из связывающего гепарин-ΙΙ домена фибронектина, фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина.
Связывание домена, связывающего клетку, из функционального материала, используемого в настоящем изобретении, с клетками, т.е. связывание материала, содержащего лиганд, связывающий клетку-мишень с клетками, можно таким же образом проанализировать, применяя стандартные методики. Например, такие методики включают те, которые описаны в №11иге 352: 438-441 (1991).
Вкратце, определенный функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку, иммобилизировали на планшете для культивирования и соответствующую анализируемую популяцию клеток загружали в среду, с последующей инкубацией в течение 30 мин-2 ч. После этого периода инкубации изымали клетки, не адгезированные с данным функциональным материалом, подсчитывали и анализировали на жизнеспособность. Клетки, прилипшие к данному функциональному материалу также изымали, с использованием трипсина или диссоциирующего клетки буфера (например, Οίόοο). подсчитывали и тестировали на жизнеспособность. В некоторых случаях, например для гемопоэтических колониеобразующих клеток, эти клетки культивировали далее в течение дополнительных 12-14 дней для установления колониеобразующих характеристик данных клеток. Затем вычисляли процентную долю адгезирующих клеток и сравнивали со стандартом или стандартным контролем, таким как бычий сывороточный альбумин (В 8А), иммобилизованном на культуральном планшете. Существенное связывание клеток-мишеней с анализируемым функциональным веществом указывает, что это сочетание функциональный материал/клетка пригодно для настоящего изобретения и данный функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку, может сосуществовать с или быть присоединенным к определенному функциональному материалу, обладающему доменом, связывающим ретровирус, с последующим оцениванием ретровирусного инфицирования данных клеток-мишеней для конструирования функционального материала, используемого в настоящем изобретении.
Поскольку соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, может использоваться в настоящем изобретении, как описано выше, здесь представлен функциональный материал, который обладает доменом, связывающим ретровирус, полученный из связывающего гепаринII домена фибронектина, фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина. Все вещества, которые обладают доменом, связывающим ретровирус, эквивалентные вышеуказанному, и которые могут повышать эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов путем присоединения к или сосуществования с лигандом, обладающим доменом, связывающим клетку-мишень, включены в соответствующие функциональные эквиваленты соответствующего домена, связывающего ретровирус, получаемого от фактора роста фибробластов, коллагена или полилизина.
Эффективное количество функционального материала(ов), используемого(ых) в настоящем изобретении, можно определить путем использования клеток-мишеней и ретровируса в способе настоящего изобретения по генному переносу в присутствии выбранного функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, присоединенного к или сосуществующего с соответствующим функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клетку, и оценивания повышения эффективности переноса данного гена, в соответствии с вышеописанным способом.
Настоящее изобретение подробно иллюстрируется ниже.
Первый аспект настоящего изобретения заключается в создании способа, повышающего эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса. Данный способ отличается инфицированием жизнеспособных клеток-мишеней ретровирусом в присутст вии смеси функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клетку-мишень, который является эффективным для повышения эффективности генного переноса в соответствующие клетки-мишени с помощью соответствующего ретровируса.
Данный способ может использоваться для получения клеток-трансформантов, трансдуцируемых с помощью соответствующего ретровируса, и для трансплантирования данных клеток индивидуальному организму, осуществляющих генный перенос в индивидуальный организм.
Функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используемый в данном способе, специфически не ограничен, а его примеры включают связывающий гепарин-ΙΙ домен фибронектина, фактор роста фибробластов, коллаген, полилизин и др. Таким же образом могут использоваться его функциональные эквиваленты, например функциональный материал, обладающий доменом, связывающим гепарин. Кроме того, может использоваться смесь функциональных материалов, полипептид, содержащий функциональный материал, полимер функционального материала, производное функционального материала и тому подобное. Эти функциональные материалы можно получить из естественно встречаемых продуктов, или получить искусственно (например, получить с помощью генноинженерных методик или химическим синтезом). Кроме того, они могут быть получены путем сочетания естественно встречаемых продуктов с синтетическими продуктами.
Поскольку домен, связывающий ретровирус, и/или домен, связывающий клетку-мишень, которые могут осуществлять генный перенос с высокой эффективностью, как здесь описывается и утверждается, функциональный материал может быть тем используемым материалом, который обладает мутацией в аминокислотных последовательностях естественно встречаемых полипептидов. В настоящем изобретении, даже если и делеция, замена, инсерция и/или добавка, одна или множество, например, до нескольких аминокислот, представлены в аминокислотных последовательностях естественно встречаемых полипептидов, поскольку требуемый домен, связывающий ретровирус, и/или домен, связывающий клетку-мишень, сохраняются, такие полипептиды именуются как функциональные эквиваленты данных полипептидов, обладающих естественно встречаемыми аминокислотными последовательностями. Эти функциональные эквиваленты могут быть получены путем создания генов, кодирующих соответствующие функциональные эквиваленты, чтобы произвести указанные эквиваленты и установить их биологические активности.
В этом отношении соответствующие области биотехнологии уже достигли уровня, когда можно рутинно осуществить определенную делецию, замену, добавку или другие модификации аминокислот в требуемых функциональных доменах. Затем эти полученные аминокислотные последовательности можно, как положено, проскринировать на нужную активность связывания клетки или активность связывания вируса.
Ген, кодирующий функциональный эквивалент, можно получить путем поиска генов, гибридизующих с геном, кодирующим вышеуказанный функциональный материал.
То есть ген, кодирующий вышеуказанный функциональный материал или часть его нуклеотидной последовательности, можно использовать в качестве гибридизационного зонда или праймеров метода амплификации гена, такого как РСК, или ему подобного, для отбора гена, кодирующего белок, обладающего активностью, аналогичной данному функциональному материалу. Иногда в этом методе получали фрагмент ДНК, содержащий только часть требуемого гена. В таком случае, после установления того, что полученный фрагмент ДНК представляет собой часть требуемого гена, этот целый требуемый ген получали путем осуществления гибридизации с помощью данного фрагмента ДНК или его частью в качестве зонда или осуществлением РСК с помощью праймеров, синтезируемых на основе нуклеотидной последовательности данного фрагмента ДНК.
Вышеуказанную гибридизацию можно осуществить, например, в нижеследующих условиях.
А именно мембрану, на которой иммобилизуют ДНК, инкубируют в 6 х 88С (1 х 88С: 0,15 №С1, 0,015 натрийцитрата, рН 7,0), содержащем 0,5% 8Ό8, 0,1% В8А, 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% Р1со11 400 и 0,01% денатурированной ДНК спермы лосося вместе с зондом при 50°С в течение 12-20 ч. После завершения инкубации эту мембрану промывали вначале 2 х 88С, содержащего 0,5% 8Ό8, при 37°С, а затем с помощью меняющихся концентраций 88С до 0,1 х 88С и температурах до 50°С до появления сигнала от данной иммобилизованной ДНК, который можно отличить от фона.
Кроме того, так или иначе, в том, что полученный таким образом ген, представляет собой требуемый ген, можно удостовериться путем проверки активности белка, кодируемого с помощью данного гена, в соответствии с вышеуказанным способом.
Как описано в вышеуказанном АО 95/26200, связывающий гепарин-ΙΙ домен фибронектина, представляет собой полипептид, обладающий доменом, связывающим ретровирус. Хотя фактор роста фибробластов, коллаген и полилизин не имеют какого-либо структурного сходства со связывающим гепарин-ΙΙ доменом фибронектина (например, сходство в аминокислотных последовательностях), авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти субстанции обладают доменами, связывающими ретровирус.
Функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку-мишень, используемый в настоящем изобретении, специфически не ограничен, либо представляет собой вещество, обладающее лигандом, которое может связываться с клетками-мишенями. Примеры этого лиганда включают клеточные адгезионные белки, гормоны, цитокины, антитела к антигенам на клеточных поверхностях, полисахариды, цепочки сахара в гликопротеинах или гликолипидах, метаболиты клеток-мишеней и т. д. Кроме того, здесь могут быть использованы полипептиды, содержащие функциональные материалы, полимеры функциональных материалов, производные функциональных материалов, функциональные эквиваленты функциональных материалов и т.п. Эти функциональные материалы могут быть получены из естественно встречаемых продуктов или полученных искусственно (например, полученных с помощью генноинженерных методик или методами химического синтеза). Далее они могут быть получены путем сочетания естественно встречаемых продуктов и синтетических продуктов.
Используемые здесь клеточные адгезионные белки представляют собой, например, фибронектин и его фрагменты. Например, связывающий клетку домен человеческого фибронектина, который корреспондирует с Рго1239-8ег1515, как описано в патенте США № 5198423, как было показано, обладает функцией, эквивалентной описанному здесь полипептиду С-274 связывания с клетками, включая клетки ВНК и В16-Р10 (Кти/ика с соавт., 1. ВюсНет. Уо1. 110, рр. 285-291 (1991)). Последовательность, составленная из четырех аминокислот Β6Ό8, представленная в этих полипептидах, представляет собой лиганд для рецептора УЪА-5. Экспрессию рецептора УЪА-5 наблюдали у широкого круга клеток, и он экспрессируется в недифференцированных клетках лучше, чем в дифференцированных клетках. Кроме того, известно, что область фибронектина С8-1 является лигандом для рецептора УЪА-4 и связывается с клетками, экспрессирующими данный рецептор (Т-клетки, В-клетки, моноциты, ΝΚ-клетки, ацидофилоциты, базофилы, тимоциты, миеломоноцитарные клетки, клетки-предшественники эритробластов, лимфоцитарные клетки-предшественники, клетки меланомы, мышечные клетки и т.п.). Соответствующий полипептид, описанный в 1Р-А 3-284700, и представленный 8ЕО. ΙΌ Νο. 29 (именуемый ниже как С277С81), представляет собой полипептид, обладающий лигандами для обоих вышеупомянутых рецепторов УЪА-5 и УЪА-4, и может использоваться для генного переноса в клетки, обладаю щими этими рецепторами. Более того, было показано, что гепарин-ΙΙ -домен может связываться с фибробластами, эндотелиальными клетками и опухолевыми клетками. Полипептидная последовательность домена, из гепарин-11-домена, связывающая клетку, пригодна для нацеливания ретровирусной инфекции на мишенируемые клетки в присутствии полипептида из функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус.
Гормоны и цитокины, обладающие клеточными специфичными активностями, подходят в качестве функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку, в настоящем изобретении. Например, эритропоэтин, который представляет собой цитокин в гемопоэтической системе, может использоваться для генного переноса в эритроцитарные клетки. Использовали эритропоэтин, получаемый в соответствии с известным способом. Кроме того, можно использовать также функциональные эквиваленты данного эритропоэтина и полипептиды, содержащие эритропоэтин или его функциональные эквиваленты.
Как описано в нижеприводимых примерах, когда функциональный материал, обладающий ретровирусной связывающей активностью (например, Н-271 и фактором роста фибробластов), использовали в смеси с С-274, который представляет собой полипептид, обладающий активностью связывать клетку, получаемый из фибронектина или чего-либо подобного, можно получить высокую эффективность генного переноса. ΝΙΗ/ЗТЗ-клетки, которые использовались в этих экспериментах, экспрессируют рецептор УЪА-5, который может связываться с С-274 и их взаимодействие способствует повышению эффективности генного переноса.
Далее наблюдали также один и тот же феномен, когда производное эритропоэтина присутствует при генном переносе в ТР-1-клетки, которые экспрессируют рецептор эритропоэтина (В1ооб, Уо1. 73, рр. 375-380 (1989)). Более того, этот эффект не наблюдался в клетках, которые не имели какого-либо эритропоэтинового рецептора.
Из этих результатов становится ясно, что клеточная специфичность, повышающая эффективность генного переноса, имеет место в присутствии соответствующего функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и соответствующего функционального материала, обладающего доменом, связывающего клетку.
В этом аспекте настоящего изобретения, функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, используется в форме смеси с другим функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим клетку-мишень. В связи с этим, эффективность генного переноса в клетки-мишени, обладающие сродством к функциональным материалам, отчетливо повышается. Так как эффективность генного переноса повышена, можно исключить сокультивирование с клетками-продуцентами вируса, и это является одним из преимуществ настоящего изобретения.
Способы по избирательному генному переносу в клетки-мишени весьма полезны и разнообразные исследования были осуществлены. Например, существует невирусный вектор (молекулярно-конъюгированный вектор), в котором материал, связывающийся с рецептором, представленным на клеточной поверхности, присоединяется к ДНК-связывающему материалу. Примеры генного переноса с использованием такого вектора включают генный перенос в клетки печени с помощью асиалогликопротеина (1. Вю1. СЬет., Уо1. 262, рр. 4429-4432 (1987)), генный перенос в лимфобласты с помощью трансферрина (Ргос. №11. Асаб. 8ст И8А, Уо1. 89, рр. 6099-6103 (1992)), генный перенос в раковые клетки с помощью анти-ЕСРрецепторных антител (РЕВ 8 Ьейетк, Уо1. 338, рр. 167-169 (1994) и др. Эти способы генного переноса с использованием невирусных векторов представляются нежелательными с той точки зрения, что генная экспрессия переносимых генов долговременна, из-за чего эти переносимые гены не интегрируются в хромосомную ДНК клеток. Предпринимались настойчивые попытки использовать ретровирусы, которые широко применяются в качестве векторов, способных инсерцировать гены в хромосомы, для специфического заражения клеток. Например, осуществляли генный перенос в гепатоциты путем прямой химической модификации ретровирусов для присоединения к лактозе (1. Вю1. СЬет., Уо1. 266, рр. 14143-14146 (1991)), генный перенос в клетки, экспрессирующие эритропоэтиновый рецептор, путем использования рекомбинантных вирусных частиц, обладающих оболочечным белком, который представляет собой белок, слит с эритропоэтином (8с1епсе, Уо1. 266, рр. 1373-1376 (1994)) и др. Однако для этой цели необходимо получить специальные белковые частицы, согласующиеся с отдельными клетками-мишенями. Кроме того, химическая модификация вирусных частиц требует сложных процедур и вызывает инактивацию вирусов. Более того, что касается вирусной оболочки, модифицируемой с помощью генной инженерии, желаемый продукт, обладающий необходимыми функциями (связывание с клетками-мишенями и конструирование вирусных частиц) получается не всегда.
Вышеупомянутый XVО 95/26200 позволяет предположить, что ретровирусный вектор, без какой-либо специальной модификации, может переноситься в клетки в присутствии фибронектинового фрагмента к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, обладающий активностью, связывающей клетку. Однако этот способ использует функциональную молекулу, обладающую и активностью, связывающей вирус, и активностью, связывающей клетку, и поэтому необходимо получать индивидуальный специальный функциональный материал, согласующийся с отдельными видами клеток. Кроме того, неизвестно, действительно или нет полученный функциональный материал сохраняет обе активности.
Сочетание функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и отличного функционального материала, обладающего доменом, связывающим клеткумишень настоящего изобретения, создает систему доставки гена с использованием ретровируса для самых разных видов клеток. Для этой цели нет нужды ковалентно присоединять функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, к функциональному материалу, обладающему доменом, связывающим клетку. Поэтому нет надобности получать инивидуальный специальный функциональный материал, в котором соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, ковалентно присоединен к соответствующему функциональному материалу, обладающему доменом, связывающим клетку, согласующийся с отдельными видами клеток, а генный перенос в клетки-мишени может быть удобно и эффективно осуществлен.
Примером генного переноса в клеткимишени с использованием данного способа настоящего изобретения является генный перенос в клетки гемопоэтической системы. Было известно, что вышеупомянутая клеточная адгезионная область С8-1 фибронектина пригодна для генного переноса в гемопоэтические стволовые клетки. Кроме того, было также известно, что помимо вышеуказанного эритропоэтина, различные другие клеточные специфичные цитокины участвуют в дифференциации гемопоэтических клеток, и генный перенос можно специфически осуществить в клетки-мишени (клеточные линии) при их использовании. Например, при использовании С-С8Е в качестве клеток-мишеней трансдукции могут использоваться мегакариобласты и клетки-предшественники гранулоцитов.
Когда использующееся вещество, которое специфически или преимущественно связывается с малигнизированными клетками в качестве функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку, в такие клеткимишени можно осуществить перенос гена.
Например, было известно, что рецепторы, называемые как НЕК-2 и НЕК-4, экспрессируются в некоторых клетках карциномы молочной железы (Ргос. Ναι. Асаб. 8ст И8А, Уо1. 92. рр. 9747-9751 (1995)). В соответствии с этим представляется возможным контролировать рост клеток карциномы молочной железы путем сочетания герегулина, который представляет собой лиганд для соответствующих рецепторов, с соответствующим функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим ретровирус.
Кроме того, благодаря использованию функционального материала, содержащего иод для клеток (раковых) щитовидной железы, или функционального материала, содержащего липопротеин высокой плотности (НЭЬ), асиалогликопротеин или его часть для клеток (раковых) печени, эти клетки могут использоваться в качестве клеток-мишеней для трансдукции.
Далее благодаря использованию антител к антигенам, представленным на клеточных поверхностях, соответственно, моноклональные антитела в качестве функционального материала, обладающего активностью, связывающей клетку, любые клетки, имеющие антитела, могут использоваться в качестве клеток-мишеней. Таким образом, самые различные клетки могут использоваться в качестве клеток-мишеней благодаря применению способа локализации ретровирусного вектора и клеток-мишеней, описанных в настоящем изобретении.
В наиболее предпочтительном варианте, эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса повышена, благодаря использованию нового функционального материала.
До сих пор был известен только гепаринΙΙ-домен фибронектина, как представитель функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, эффективного для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов.
Как описано выше, данный домен обладает сам по себе способностью связываться с некоторыми клетками и в некоторых случаях эта активность является нежелательно зависящей от определенных клеток-мишеней. В таких случаях желаемые результаты могут быть получены путем замены связывающего домена на другой домен, связывающий клетку. Таким образом, можно использовать многочисленные функциональные материалы, обладающие различными свойствами, и это создает более широкие возможности применения соответствующей генной терапии в соответствии с настоящим изобретением и легко осуществляемой трансдукцией выбранных клеток-мишеней.
Данный новый функциональный материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, созданный с помощью настоящего изобретения, включает факторы роста фибробластов, полипептиды, содержащие соответствующие факторы, фрагменты коллагена, смесь соответствующих фрагментов, полипептиды, содержащие соответствующие фрагменты, полимеры функционального материала и т.п.
Полилизины также используются для этой цели настоящего изобретения. Эти функциональные материалы могут быть получены из естественно встречаемых продуктов или могут быть произведены синтетически (например, произведены с помощью методов генной инженерии или химическим синтезом). Далее они могут быть произведены путем сочетания естественно встречаемых продуктов и химически синтезируемых продуктов. Данный функциональный материал может использоваться для способа переноса гена из первого аспекта настоящего изобретения, но для генного переноса пригодны также химерные молекулы из данного функционального материала и соответствующего другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку.
Все вышеописанные функциональные материалы обладают активностью, связывающей ретровирус. Однако эти материалы не содержат гепарин-11-домена человеческого фибронектина, описанного в XVО 95/26200, или полипептида, обладающего аналогичными аминокислотными последовательностями.
В качестве фактора роста фибробластов, может использоваться практически чистый естественно встречаемый продукт или может использоваться продукт, полученный методами генной инженерии. В настоящем изобретении может использоваться фактор роста фибробластов, который представлен 8Ер. ΙΌ Νο. 3 в списке последовательностей и могут также использоваться модифицированные его производные, сохраняющие функции данного полипептида. Примеры производных фактора роста фибробластов включают полипептид, представленный 8 Ер. ΙΌ Νο. 4 в списке последовательностей (именуемый ниже как С-ЕСЕ-А). Он представляет собой полипептид, в котором адгезирующий клетку домен полипептида фибронектина присоединен к Ν-концу фактора роста фибробластов, представленному 8Ер. ΙΌ Νο. 3, и может быть получен с помощью методов генной инженерии, как в основном описано в патенте США 5302701. Данный полипептид может быть получен путем использования Е. οοΐί, что было описано в вышеприведенном патенте США, в виде ЕЕКМ Р-12637, и в настоящее время депонированного по Будапештскому Договору в Ναΐίοηαΐ ΙικΜα οί Вю5С1епее апб Ηитаη-Тесйηο1οду (ΝΙΒΗ), Аде псу οί кбиНкй 8с1ег1ее & ТеекюЕ οду, Μίηίδΐιγ οί ^ογ^Ι^^ Тгабе & кбиНгу οί 1-1-3, ШдакЫ, ТкикиЬа-кЫ, Шагак-кеи, кран, под инвентарным номером ЕЕКМ ΒΡ-5278 (дата первоначального депонирования; 9 декабря 1991 г.).
Полипептидное производное вышеприведенного С-ЕСЕ-А, обладающее адгезирующим С8-1-клетки доменом, произведенным из фибронектина, которое представлено 8Ер. ΙΌ Νο. 5 (именуемое ниже в качестве ЕСЕ-С81), получаемое путем использования Е^еНепеЫа тоН, депонировали по Будапештскому Договору в ΝΙΒΗ οί 1-1-3, ШдакЫ, ТкикиЬа-кЫ, Шагак-кеи, Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ ΒΡ
5654 (дата первоначального депонирования: 6 сентября 1996 г.), в соответствии со способом, описанным здесь. Это С-ЕСЕ-С81 особенно пригодно для генного переноса в клеткимишени, обладающие С8-1-связывающим свойством, в частности, гемопоэтические стволовые клетки.
В качестве коллагеновых фрагментов, могут использоваться существенно очищенные фрагменты, полученные путем энзиматического или химического расщепления природных коллагенов, или могут использоваться коллагеновые фрагменты, полученные методами генной инженерии. Кроме того, могут использоваться модификации этих фрагментов, сохраняющие их функции. Среди коллагенов, человеческий коллаген тип V обладает сильной активностью, связывающей инсулин (ΙΡ-А 2-209899). Примером полипептидов, обладающего доменом, связывающим инсулин является полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в списке последовательностей 8Ер. ΙΌ Νο. 28 (именуемую ниже как ί,'οΐν). ί,'οΐν можно получить в соответствии со способом, описанным здесь в примерах. Полипептид, который содержит ί,'οΐν и представлен 8Ер. ΙΌ Νο. 7 (именуемый ниже как С277ΟΑΐν), представляет собой полипептид, в котором адгезирующий клетку домен полипептида фибронектина присоединен к Ν-концу САШ и может быть получен методом генной инженерии в соответствии с ΙΡ-А 5-97698 как описано выше. С277-СЪЩ можно получить путем использования Е. тоН, которая описана под инвентарным номером ЕЕКМ Р-12560 в ΙΡ-А 5-97698 и депонирована по Будапештскому Договору в ΝΙΒΗ 1-1-3, ШдакЫ, ТкикиЬа-кЫ, IЬа^ак^-кеη, Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ ΒΡ5277 (дата первоначального депонирования: 7 октября 1991 г.).
Полипептид (именуемый ниже в качестве С-СсЩ-С81), произведенный от С277-Сο1V, который представлен 8Ер. ΙΌ Νο. 8, и обладает доменом С8-1, адгезирующем клетку, произведенным из фибронектина, может быть получен следующим образом. Фрагмент ДНК, выделенный путем амплификации с помощью ΡΟΚ с использованием вышеуказанной плазмиды, которую получали от Е. тоН, депонированной по Будапештскому Договору в ΝΙΒΗ 1-1-3, ШдакЫ, ТкикиЬа-кЫ, Шагак-кеи, Япония, под инвентарным номером ЕЕКМ ΒΡ-2800 (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989 г.) в качестве матрицы и соответствующих праймеров С81-8 (соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в 8Ер. ΙΌ Νο. 9 в приведенном списке последовательностей) и М4, и обработанных затем с помощью ферментов рестрикции ΜιοΙ и 8аП.
С другой стороны, выделяли фрагмент
ДНК в результате амплификации с помощью
ГСК с использованием плазмиды рТЕ7520^Ш, которая содержит ген, кодирующий С277-Со1У, и полученную из вышеуказанной РЕЕМ ВР5277 Е. сой в качестве матрицы, и праймеров СР и СИЕ, а затем обрабатывали с помощью ферментов рестрикции АссШ и Ийек Нуклеотидные последовательности СР и СИЕ представлены в 8ЕЦ. ΙΌ Νοδ. 10 и 12 приведенного списка последовательностей.
Вышеполученные два фрагмента ДНК смешивали и лигировали с около 4,4 т.п.н. фрагментом ДНК, полученным путем обработки плазмиды рТР7520Со1У с помощью ферментов рестрикции АссШ и 8ай. Полученная плазмида кодирует полипептид С-Со1У-С81, который обладает С8-1-доменом, алгезирующем клетки по С-концу С277-Со1У, и в котором глутаминовая кислота по С-концу Со1У и С-концевой треонин заменены, соответственно, аланином и серином. После культивирования Е.сой, трансформированной этой плазмидой, из этой культуры можно получить требуемый полипептид. Этот ССо1У-С81 особенно пригоден для генного переноса в клетку-мишень, особенно стволовую клетку, обладающую С81-связывающим свойством.
В качестве полилизина, как описано выше, который обладает подходящим уровнем полимеризации, можно выбрать и использовать полилизин из коммерчески доступных полилизинов.
Функциональные материалы, используемые в настоящем изобретении, могут включать производные вышерассмотренных функциональных материалов. Их примеры включают вышерассмотренный С-РСР-С81 или его функциональные эквиваленты и С-Со1У-С81 или его функциональные эквиваленты. Кроме того, в настоящем изобретении могут также использоваться полимеры, полученные путем полимеризации множества молекул из соответствующих функциональных материалов, и модифицированные материалы, полученные путем модификации соответствующих функциональных материалов, в соответствии с известными способами (добавление цепи сахара и т.п.). Эти полимеры и их функциональные эквиваленты можно получить с помощью методов генной инженерии с использованием генов, кодирующих соответствующие полимеры, и генов, колирующих их функциональные эквиваленты. Кроме того, функциональный материал с добавленным цистеином, пригодным для получения полимера из соответствующего функционального материала, можно получить путем добавки, инсерции и замены цистеина в аминокислотной последовательности соответствующего функционального материала. Кроме того, молекула которая представляет собой функциональный материал с добавленным цистеином и обладает доменом, связывающим ретровирус, легко присоединяется к другой молекуле, которая представляет собой функциональный материал с добавленным цистеином, и обладает доменом, связывающим клетку-мишень. К тому же материал, соединяемый с другим функциональным материалом, можно получить путем использования соответствующего реакционноспособного цистеинового остатка из соответствующего функционального материала с добавленным цистеином.
В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения генный перенос осуществляют путем использования полимера из связывающего ретровирус домена фибронектина, который повышает эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов.
Соответствующий функциональный материал представляет собой полипептид, обладающий многочисленными гепарин-11-связывающими доменами из человеческого фибронектина в одной молекуле, как описано в вышеприведенном νθ 95/26200, или производные данного полипептида. Поскольку сохраняется одна и та же активность, такая же как у соответствующего функционального материала, часть функциональных эквивалентов, чьи аминокислотные последовательности отличаются от последовательностей из естественно встречаемых продуктов, могут быть включены.
Примеры полимера функционального материала включают те из них, которые получены путем энзиматической или химической полимеризации вышеуказанного полипептида, произведенного из фибронектина или с помощью методов генной инженерии. Пример полипептида, который обладает в молекуле двумя гепарин-ΙΙсвязывающими доменами, произведенными из фибронектина, включают полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной в списке последовательностей 8ЕЦ. ΙΌ Ио. 13 (именуемой ниже в качестве Н2547). Н2-547 можно получить в соответствии со способом, описанным здесь, путем использования Е.сой, которую депонировали по Будапештскому Договору в ΝΙΒΗ 1-1-3, НщакЫ, Ткикийаδΐιί. Шатай-кеп, Япония, под инвентарным номером РЕЕМ ВР-5656 (дата первоначального депонирования: 6 сентября 1996 г.). Полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной 8Е(). ΙΌ Ио. 14 в списке последовательностей, представляет собой полипептидное производное, содержащее адгезирующий клетку полипептид фибронектина, присоединенный по Ν-концу Н2-547 (именуемый ниже в качестве СН 2-826). Этот полипептид можно получить в соответствии со способом, описанным здесь. Далее полипептид, обладающий аминокислотной последовательностью, представленной 8ЕЦ. ΙΌ Ио. 30 в списке последовательностей, представляет собой полипептидное производное, содержащее адгезирующую клетку, С8-1-область фибронектина, присоединенную по С-концу Н2-547 (именуемое ниже как Η28-573). Соответствующий по липептид можно получить в соответствии со способом, описанным здесь, путем использования Е.еой, которую депонировали по Будапештскому Договору в ΝΙΒΗ 1-1-3, НщаЧн, ТкикиЬаδΐιί. 1Ьагак1-кеп, Япония, под инвентарным номером ЕЕРМ ΒΡ-5655 (дата первоначального депонирования: 6 сентября 1996 г.). Η28-573, обладающий областью адгезии клетки С8-1 пригоден для генного переноса в гемопоэтические стволовые клетки.
Еще в одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, жизнеспособные клетки-мишени заражали дефектным по репликации ретровирусным вектором в присутствии соответствующего функционального материала, иммобилизованного на шариках, которые являются эффективными для повышения эффективности генного переноса в клетки с помощью ретровирусного вектора.
Удобные способы для повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусного вектора путем использования соответствующих функциональных материалов, описанные выше в АО 95/26200 и №1иге МеШеше, осуществляли путем иммобилизации функциональных материалов в посуде, используемой для инфицирования клеток вирусом (планшет для клеточного культивирования). Эти способы требуют усложненных процедур, таких как отмывку избытка функционального материала, после обработки данного планшета раствором, содержащим указанный функциональный материал.
Поэтому способы переноса гена с использованием планшета, обладающего функциональными материалами, иммобилизованными в нем, трудно считать удобным способом. С другой стороны, способ с использованием функциональных материалов, иммобилизованных на шарике(ах) имеет следующие преимущества.
По сравнению с планшетом, иммобилизацию на шариках можно осуществить в относительно небольшом пространстве, а шарики разместить в герметичной посуде. Так как поверхность планшета, обладающего функциональным материалом, иммобилизованном в нем, выдерживают на воздухе, с ним нужно обращаться осторожно, чтобы предотвратить порчу или чтолибо подобное, связанное с высыханием во время хранения, для случая функционального материала, обладающего сниженной стабильностью. Однако шарики можно хранить путем суспендирования в растворе и избежать таких проблем. Более того, поверхностная площадь функционального материала увеличивается при использовании шариков, и по этой причине можно получить повышенную эффективность генного переноса по сравнению с планшетом.
Иммобилизацию функциональных материалов можно осуществить с помощью удобного способа, например, посуду для культивирования клетки-мишени покрывают соответствующими функциональными материалами или же данные функциональные материалы можно иммобилизовать, например, на шариках, обработанных для культивирования клеток.
Соответствующий сырьевой материал и вид шариков можно выбрать в зависимости от соответствующего предполагаемого использования. Например, шарик может обладать круговой или сферической сердцевиной в качестве центральной части, и поверхность этой сердцевины можно покрыть гидрофильным полимером. Примеры сырьевого материала и вида этой сердцевины и полимера описаны в 1Ρ-Ά 8501092. Например, биодеградируемые шарики, на которых иммобилизованы эти функциональные материалы, можно вводить в живой организм. Альтернативно, эффективный способ заключается в использовании смеси шариков, на котором иммобилизована молекула, обладающая доменом, связывающим ретровирус, и шариков, на которых иммобилизована молекула, обладающая доменом, связывающим клеткумишень.
Когда, например, эти функциональные материалы используются без иммобилизации, посуда для культивирования клетки-мишени может быть предварительно обработана веществом, которое предотвращает прилипание соответствующих функциональных материалов к данной посуде, например, бычьим сывороточным альбумином (Β8Α). Таким образом, данные функциональные материалы могут использоваться без неспецифичной адгезии к данной посуде.
В соответствии с настоящим изобретением, генный перенос можно эффективно осуществить даже в такой системе, в которой функциональный материал настоящего изобретения используется без иммобилизации.
Кроме того, благодаря использованию специфического набора реагентов, предназначенного для осуществления способа настоящего изобретения, как описано ниже, генный перенос в клетки может быть осуществлен очень удобно.
Как описано выше, трансформированные клетки, полученные в соответствии со способом настоящего изобретения, можно трансплантировать живому организму с тем, чтобы осуществить генную терапию и чтобы экспрессировать экзогенный ген в живом организме.
Например, когда гемопоэтические стволовые клетки используются в качестве клетокмишеней, генную терапию можно осуществлять с помощью следующих процедур. Во-первых, материал, содержащий гемопоэтические клетки, например, ткани костного мозга, периферической крови, крови пуповины плода или др., собирают от донора. Этот собранный материал может использоваться сам по себе. Однако обычно фракцию моноцитов, содержащую гемопоэтические стволовые клетки, получают центрифугированием в градиенте плотности или подобным образом. Альтернативно, гемопоэтические стволовые клетки могут быть выделены очисткой благодаря использованию маркеров на клеточных поверхностях, таких как СЭ34 и/или С-набор. Полученный материал, содержащий гемопоэтические клетки, можно факультативно подвергнуть предварительной стимуляции подходящим фактором роста клеток или другим, а затем эти клетки инфицировать рекомбинантным ретровирусным вектором, в который был инсерцирован предполагаемый ген, в соответствии со способом настоящего изобретения, в частности, в присутствии соответствующего функционального материала, обладающего активностью, связывающей стволовую клетку. Полученные таким образом трансформированные клетки можно трансплантировать реципиенту, например, путем внутривенного введения. Данный реципиент представляет собой, предпочтительно, аутологичного донора, но включает также аллогенные трансплантаты, последнее особенно предпочтительно для трансплантации при использовании клеток из пуповины крови.
Генная терапия с использованием гемопоэтических стволовых клеток компенсирует недостаточность или аномальность гена пациента и его примеры включают АЭА-недостаточность и болезнь Гоше. Кроме того, иногда трансдукцию гена лекарственной устойчивости осуществляют для ослабления нарушений гемопоэтических стволовых клеток, связанных с химиотерапией, применяемой при лечении рака, лейкемий и т. п.
Известно, что гемопоэтические стволовые клетки экспрессируют νΓΑ-4-рецептор, и по этой причине возможно эффективно осуществить генный перенос благодаря использованию соответствующего функционального материала, обладающего С8-1-областью, адгезирующей клетку, описанной в настоящем изобретении. Далее, как описано выше, молекулы, такие как СИ34 и С-набор, экспрессируются на соответствующих поверхностях гемопоэтических стволовых клеток, и по этой причине эффективность генного переноса может быть повышена благодаря сочетанию антител против этих молекул или фактора стволовых клеток, который представляет собой лиганд С-набора соответствующего функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус.
Сверх того, для генной терапии рака изучали терапевтический эффект вакцины на новообразования, при этом цитокиновые гены переносили в раковые клетки, и после лишения способности к росту эти клетки возвращали в организм пациента, чтобы повысить иммунитет к новообразованию (Нитап Сепе Тйегару. νοί. 5, рр. 153-164 (1994)). Такую обработку можно эффективно осуществлять благодаря применению способа настоящего изобретения с помощью соответствующего функционального материала, обладающего высоким сродством к раковым клеткам.
Кроме того, предпринимались настойчивые попытки лечить ΑΙΌ8 при помощи генной терапии. В этом случае предлагалось переносить ген, кодирующий молекулу нуклеиновой кислоты, которая подавляет ΗΙν-репликацию или генную экспрессию (например, антисмысловую нуклеиновую кислоту, рибозим и пр.), в Т-клетки, которые инфицированы ΗΙν, который вызывает ΑΙΌ8 (1. νίτοί., νοί. 69, рр. 4045-4052 (1995)). Генный перенос в Т-клетки можно осуществить способом настоящего изобретения с использованием соответствующего функционального материала, например, СИ4-антитела или ему подобного, который может связаться с молекулой, присутствующей на соответствующей поверхности Т-клеток.
Таким образом, в качестве клетокмишеней для генного переноса, можно использовать любые клетки, поскольку соответствующий функциональный материал, обладающий доменом, связывающим клетку-мишень, доступен или может быть приготовлен.
Более того, данный способ настоящего изобретения подходит для условий применения клинической генной терапии, потому что сокультивирование клеток-мишеней в присутствии клеток-продуцентов ретровируса не требуется, и данный способ настоящего изобретения можно осуществить в отсутствие гексадиметринбромида, использование которого оказывает неблагоприятное клиническое воздействие на человеческий организм.
Далее применение, например, настоящего изобретения в других областях техники, иных, чем генная терапия, позволяет проще продуцировать трансгенных позвоночных животных для использования в качестве источника клетокмишеней, эмбриопластических стволовых клеток, первичных половых клеток, ооцитов, оогоний, яйцеклеток, сперматоцитов, сперматозоидов и др.
Иными словами, в настоящем изобретении разработали, в качестве первого варианта, способ клеточного трансплантирования, включающий трансплантирование трансформированных клеток, полученных способом настоящего изобретения, позвоночному животному. Примеры позвоночных животных для трансплантирования трансформированных клеток включают млекопитающих (например, мышь, крыса, кролик, коза, свинья, лошадь, собака, обезьяна, шимпанзе, человек и т.д.), птиц (например, курица, индейка, куропатка, дикая утка и т.д.), пресмыкающихся (например, змея, аллигатор, черепаха и т.д.), земноводных (например, лягушка, саламандра, тритон и т.д.), рыб (например, άο§ таскеге1 (макрелещука), скумбрия, окунь, луциан, морской окунь, желтохвост, тунец, лосось, форель, карп, а(й)ю, угорь, камбала, акула, скат, осетр и т.д.).
Таким образом, в соответствии с этим вариантом осуществления настоящего изобретения, подобно практически чистому фибронектину, практически чистым фибронектиновым фрагментам или их смеси, генный перенос с помощью ретровирусов можно осуществить эффективно благодаря соответствующему домену, связывающему ретровирус, и соответствующему домену, связывающему клеткумишень, из функционального материала, используемого в настоящем изобретении. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет метод для перемещения генетического материала в клетки позвоночных животных без какого-либо ограничения традиционных методик.
В очередном варианте осуществления настоящего изобретения эффективное количество материала, который обладает доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле и обладает функциями, эквивалентными функциям практически чистого фибронектина, практически чистых фибронектиновых фрагментов или их смеси, используется в качестве соответствующего функционального материала.
Такой функциональный материал представляет собой материал, который может осуществить генный перенос с той же эффективностью, что и фибронектин, фибронектиновый фрагмент или их смесь. Обычно он представляет собой функциональный материал настоящего изобретения, обладающий вышеуказанным новым доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле. В случае использования этих материалов предполагается, что ретровирусы, также как и клетки-мишени, связывают, как минимум, один функциональный материал.
Примеры функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим мишень, на одной и той же молекуле, включают полипептиды, представленные в списке последовательностей 8ЕО. ГО N08. 21 и 22 (именуемые ниже соответственно, СНУ-181 и СНУ-179).
Эти пептиды включают сходные последовательности типа III (ΙΙΙ-12, ΙΙΙ-13 и ΙΙΙ-14), содержащиеся в Н-271. В СНУ-181, последовательности ΙΙΙ-12 и ΙΙΙ-13, и в СНУ-179, последовательности ΙΙΙ-13 и ΙΙΙ-14 присоединены через метионин к С-концу адгезирующего клетку полипептида (Рто1239- 8ет1515) фибронектина. Плазмиду для экспрессии полипептида СНУ-181 можно сконструировать, например, путем следующих операций.
Вначале плазмиду рНЭ101, содержащую фрагмент ДНК, кодирующий связывающий гепарин полипептид (Н-271) фибронектина, получали в ЕхсйепсЫа сой НВ101/рНЭ101 (ЕЕКМ ВР-2264). НшИШ-сайт интродуцировали в область, кодирующую С-концевую ΙΙΙ-13последовательность в этой плазмиде, путем сайт-направленного мутагенеза, с последующей обработкой с помощью №οΙ и НшИШ, для получения фрагмента ДНК, кодирующего последовательность ΙΙΙ-12 и ΙΙΙ-13. С другой стороны, плазмидный вектор ρΙΝΙΙΙ-отрА! обрабатывали с помощью НтИШ и 8ай для получения фрагмента ДНК, кодирующего область терминатора липопротеина.
Далее, плазмиду рТР7021, содержащую фрагмент ДНК, кодирующую адгезирующий клетку полипептид (С-279) фибронектина, получали из Е8скег1сЫа сой 1М109/рТР7021 (ЕЕКМ ВР-1941), а ШоЕсайт интродуцировали непосредственно перед терминирующим кодоном С-279 в данной плазмиде путем сайтнаправленного мутагенеза, для получения плазмиды рТЕ7520. Полученную плазмиду обрабатывали с помощью Ν^Ι и 8ай, с последующим смешиванием с фрагментом ДНК, кодирующим последовательность ΙΙΙ-12 и ΙΙΙ-13, и с фрагментом ДНК, кодирующим область терминатора липопротеина, для их лигирования и получения плазмиды рСНУ181 для экспрессии полипептида СНУ-181. Нуклеотидная последовательность области, кодирующей полипептид СНУ-181 в плазмиде рСНУ181, показана в списке последовательностей в 8Е0. ГО №. 27.
Плазмиду для экспрессии полипептида СНУ-179 можно сконструировать, например, с помощью следующих операций.
Вначале в область, кодирующую Νконцевую последовательность ΙΙΙ-13 в плазмиде рНЭ101, сайт-направленным мутагенезом интродуцировали ШоЕсайт. с последующей обработкой с помощью Ν^Ι и НшйШ для получения фрагмента ДНК, кодирующего последовательность ΙΙΙ-13 и ΙΙΙ-14. Полученный фрагмент смешивали с фрагментом ДНК, кодирующим вышеуказанную область терминатора липопротеина, и с плазмидой рТР7520, обработанной Ν^Ι и 8аИ, для их лигирования и получения плазмиды рСНУ179 для экспрессирования полипептида СНУ-179.
СНУ-181 и СНУ-179 могут быть получены путем культивирования Е. сой, трансформированной, соответственно, вышеуказанными плазмидами, с последующим выделением очисткой из результирующей культуры.
Эти функциональные материалы могут использоваться путем иммобилизации, например, на шариках, как описано выше, или без иммобилизации.
В очередном варианте настоящего изобретении создали культуральную среду для клетокмишеней, используемую для генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов, которая включает (1) вышеописанную смесь эффективного количества функционального материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, и эффективного количества другого функционального материала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, или (2) эффективное количество соответствующего функционального материала, обладающего вышеописанным новым доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клеткумишень, на одной и той же молекуле. Данный функциональный материал может быть иммобилизован или может быть использован без иммобилизации.
Другие ингредиенты в культуральной среде настоящего изобретения специфически не ограничены, поскольку они могут использоваться в культуре клеток-мишеней, и могут использоваться в коммерчески доступных культуральных средах. Культуральная среда настоящего изобретения может также содержать сыворотку, фактор роста клеток, необходимый для роста клеток-мишеней, антибиотик для предотвращения загрязнения микроорганизмами и т. д. Например, в случае ΝΙΗ/ЗТЗ-клеток, модифицированная Дюльбекко среда Игла (ΌΜΕΜ, ЖН Вю8С1епее), содержащая 10% сыворотки плода коровы (С1Ьсо), 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (оба от С1Ьсо) может использоваться в качестве культуральной среды.
В следующем варианте осуществления настоящего изобретения создали способ локализации ретровируса, который включает инкубирование культуральной среды, содержащей ретровирус, контактируемый с (1) вышеописанной смесью из молекулы, содержащей домен, связывающий ретровирус, и другой молекулы, содержащей домен, связывающий клетку-мишень, (2) вышеописанным функциональным материалом настоящего изобретения, обладающим новым доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле, или (3) с вышеописанным функциональным материалом, обладающим доменом, связывающим ретровирус.
Как описано выше, данный функциональный материал может быть иммобилизован или может использоваться без иммобилизации. Инкубацию можно осуществлять в соответствии с обычным способом, например, при 37°С в условиях 5%-ной концентрации СО2 и влажности 99,5%. Эти условия можно подобрать в зависимости от специфики используемых клетокмишеней, а период культивирования можно также изменять в соответствии со спецификой клеток и целей.
Благодаря использованию способа настоящего изобретения, вирусные частицы могут быть локализованы в различных конструктах, которые доставляют вирусы в клетки-мишени.
В очередном варианте осуществления настоящего изобретения создали набор для использования ретровирус-опосредованного генного переноса в клетки-мишени. Данный набор включает
а) эффективное количество (1) смеси из молекулы, обладающей вышеописанным доменом, связывающим ретровирус, и другой моле кулы, обладающей доменом, связывающим клетку-мишень, или (2) функциональный материал, обладающий новым доменом настоящего изобретения, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку-мишень, на одной и той же молекуле;
(Ь) синтетический субстрат для инкубирования ретровируса, контактируемого с клетками-мишенями; и (С) фактор роста клетки-мишени для предварительного стимулирования клеток-мишеней. Функциональный материал (а) может быть иммобилизованным или не иммобилизованным. Данный набор может, кроме того, включать рекомбинантный ретровирусный вектор, необходимые буферы и т.п.
В качестве синтетического субстрата можно использовать планшет для культивирования клеток, чашки Петри, флаконы и т.п. Они могут быть изготовлены из полистирола.
В случае, когда клетки-мишени представляют собой клетки в С0-фазе, заражение ретровирусом не происходит и по этой причине предпочтительно клетки предварительно стимулируют для приведения клеток в определенный клеточный цикл. Для этой цели клетки-мишени культивируют в присутствии соответствующего фактора роста клетки перед инфицированием ретровирусом. Например, в случае генного переноса в клетки костного мозга и гемопоэтические стволовые клетки, можно использовать фактор роста клетки-мишени, такой как интерлейкин-6, или фактор стволовой клетки.
Соответствующие представители, составляющие данный набор, могут быть получены в форме лиофилизированных продуктов, гранул, таблеток, кроме водных растворов, рег §е в соответствии с известными способами.
Благодаря использованию набора настоящего изобретения можно получить, например, культуру трансформированной жизнеспособной клетки-мишени и можно проще осуществить ретровирус-опосредованную трансдукцию в клетки-мишени.
Настоящее изобретение включает также способ генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, в котором функциональный материал выбран из группы, состоящей из практически чистого фибронектина, практически чистых фибронектиновых фрагментов и их смеси или их полимера, которые иммобилизуют на шариках или используют не иммобилизованными.
Настоящее изобретение включает вышеописанный СН2-826 и его функциональные элементы. Кроме того, в настоящем изобретении создали ген, кодирующий СН-2-826. Одним из его примеров является ген, представленный 8ЕЦ. ΙΌ Νο. 20 в списке последовательностей. Настоящее изобретение включает также функциональные эквиваленты данного гена.
Далее в настоящем изобретении создали вышеописанный СНУ-181, включая его функциональные эквиваленты. Кроме того, в настоящем изобретении создали ген, кодирующий СНУ-181. Одним из примеров данного гена является ген, представленный в списке последовательностей 8Ер.ГО Νο. 27. Настоящее изобретение включает также функциональные эквиваленты данного гена.
В настоящем изобретении создали также полимер, содержащий полимер домена, связывающего соответствующий ретровирус и/или полимер домена, связывающего соответствующую клетку-мишень. Специфические примеры данного полимера представляют собой фактор роста фибробластов и полимер полипептида, обладающий доменом, связывающим инсулин, произведенный из коллагена типа V.
Как обсуждается ниже, хотя настоящее изобретение не ограничивается какой-либо теорией, предполагается, что генный перенос в клетки с помощью ретровируса, т.е. трансформация, усиливается благодаря связыванию ретровируса с клеткой-мишенью по соответствующим функциональным доменам.
Как таковой, функциональный материал, который связывается с ретровирусом, и, таким образом, пригоден для настоящего изобретения, представлен здесь практически чистым фибронектином, практически чистыми фибронектиновыми фрагментами или их смесью. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что вышеописанные функциональные материалы настоящего изобретения, обладающие функциями практически теми же, что и практически чистый фибронектин и ему подобные повышают эффективность генного переноса, т. е. эффективность трансформации клеток-мишеней с помощью ретровируса.
Фрагменты фибронектина, описанные здесь, могут иметь природное или искусственное происхождение и могут быть получены практически чистыми из естественно встречаемых продуктов, например, в качестве ранее описанных у ЯиоНайИ с соавт. (1981) 1. Βίο1. Сйет. 256:7277; Ра1е1 и ЬобЫй (1986) 1. Се11. Βΐο1. 102:449; и ВегпагФ с соавт. (1987) 1. Се11. Βίο1. 105:489. В этом отношении ссылка, приводимая здесь, на практически чистый фибронектин или фибронектиновый фрагмент подразумевает средство, которое практически свободно от других белков, естественно встречаемых с фибронектином.
Практически чистый фибронектин или фибронектиновый фрагмент, описанный здесь, может быть также получен методами генной инженерии, например, как в основном описано в патенте США № 5198423. В частности, рекомбинантные фрагменты, идентифицированные ниже в примерах в качестве Н-271, Н-296, СН271 (8 ЕС) ΙΌ Νο. 23) и СН-296 (8Ер ГО Νο. 24), и способы их получения подробно описаны в данном патенте. Фрагмент С-274, используемый в нижеследующих примерах, был получен так, как он описан в патенте США № 5102988. Эти фрагменты или фрагменты, из которых они рутинно произведены, доступны благодаря культивированию Е. οοΐί, депонированной в ΝΙΒΗ 11-3, Н1да8Й1, ТкикиЬа-кЫ, 1Ьагак1-кеп, Япония, по Будапештскому Договору под инвентарным номером ЕЕКМ Р-10721 (Н-296) (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989 г.), ЕЕКМ ВР-2799 (С-277, связанный с Н-271 через метионин) (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989 г.), ЕЕЯМ ΒΡ-2800 (С-277, связанный с Н-296 через метионин) (дата первоначального депонирования: 12 мая 1989 г.), а также как описано в патенте США № 5198423.
Кроме того, полезные сведения о фибронектиновых фрагментах, используемых здесь, или об исходных материалах для таких фрагментов, можно найти у ΚίιηίζιιΕη с соавт., 1. Βίοсйет. 110, 284-291 (1991), который к тому же сообщает о вышеописанных рекомбинантных фрагментах; в ЕМΒО 1., 4, 1755-1759 (1985), где сообщается о структуре гена человеческого фибронектина; и в Β^οсйет^8ί^у, 25, 4936-4941 (1986), где сообщается о домене человеческого фибронектина, связывающем гепарин ΙΙ. Обнаружено, что фибронектиновые фрагменты, которые содержат и домен, адгезирующий клетки С8-1 и домен, связывающий гепарин II, значительно усиливают эффективность генного переноса в гемопоэтические клетки и действуют до сих пор.
Таким образом становится очевидным, что фибронектинсвязанные полипептиды, описанные здесь, представляют аминокислотную последовательность, обладающую клеточносвязывающей активностью домена фибронектина, адгезирующего клетки С8-1, а также аминокислотной последовательностью домена фибронектина, связывающего гепарин-ΙΙ, который связывается с вирусом.
Полипептид, связывающий вирус, используемый для усиления трансдукции при помощи ретровирусных векторов, как описано в XVО 95/26200, включает (ί) первую аминокислотную последовательность, которая корреспондирует с А1а1690-Тйг1960 из связывающего гепарин-ΙΙ домена человеческого фибронектина, который представлен по формуле (8ЕО ΙΌ Νο. 1)
| АЬа | ЬЬе | Рго | АЬа | Рго | ТЬг | Азр | Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | СЬп | УаЬ | ТЬг | Рго |
| Тлг | Зег | Ьеи | Зег | АЬа | СЬп | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | Азп | УаЬ | СЬп | Ьеи | ТЬг |
| СЬу | Туг | Агд | УаЬ | Агд | УаЬ | ТЬг | Рго | Ьуз | СЬи | Ьуз | ТЬг | СЬу | Рго | Мек |
| Ьуз | СЬи | ТЬе | Азп | Ьеи | АЬа | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | УаЬ | УаЬ | УаЬ | Зег |
| СЬу | Ьеи | МеЬ | УаЬ | АЬа | ТЬг | Ьуз | Туг | СЬи | УаЬ | Зег | УаЬ | Туг | АЬа | Ьеи |
| Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | АЬа | СЬп | СЬу | УаЬ | УаЬ | ТЬг | ТЬг |
| Ьеи | СЬи | Азп | УаЬ | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | АЬа | Агд | УаЬ | ТЬг | Азр | АЬа |
| ТЬг | СЬи | ТЬг | ТЬг | ЬЬе | ТЬг | 11е | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | СЬи | ТЬг |
| Не | ТЬг | СЬу | РЬе | СЬп | УаЬ | Азр | АЬа | УаЬ | Рго | АЬа | Азп | СЬу | СЬп | ТЬг |
| Рго | ЬЬе | СЬп | Агд | ТЬг | Не | Зуз | Рго | Азр | УаЬ | Агд | Зег | Туг | ТЬг | ЬЬе |
| ТЬг | СЬу | Ьеи | СЬп | Рго | СЬу | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | ЬЬе | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг |
| Ьеи | Азп | Азр | Азп | АЬа | Агд | Зег | Зег | Рго | УаЬ | УаЬ | ЬЬе | Азр | АЬа | Зег |
| ТЫ | АЬа | ЬЬе | Азр | АЬа | Рго | Зег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | АЬа | ТЬг | ТЬг |
| Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | УаЬ | Зег | Тгр | СЬп | Рго | Рго | Агд | АЬа | Агд | ЬЬе |
| ТЬг | СЬу | Туг | 1Ье | 11е | Ьуз | Туг | СЬи | Зуз | Рго | СЬу | Зеу | Рго | Рго | Агд |
| С1 и | УаЬ | УаЬ | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | СЬу | УаЬ | ТЬг | СЬи | АЬа | ТЬг | Не |
ТЬг С1у Ьеи С1и Рго С1у ТЬг С1и Туг ТЬг Не Туг Уа1 Не А1а Ьеи Ьуз Азп Азп С1п Ьуз Зег С1и Рго Ьеи Не С1у Агд Ьуз Ьуз ТЬг;
или достаточно сходной аминокислотной последовательностью, которая, к тому же, проявляет способность связывать соответствующий ретровирус; и (ίί) вторую аминокислотную последовательность (С8-1), которая корреспондирует с одной частью 111С8-связывающего домена человеческого фибронектина; которая представлена по формуле (8ЕО ΙΌ N0. 2):
Акр С1и Ьеи Рго С1и Ьеи Уа1 ТЬг Ьеи Рго Ηίκ Рго Аки Ьеи Ηίκ С1у Рго С1и 11е Ьеи Акр Уа1 Рго 8ег ТЬг;
или достаточно сходной аминокислотной последовательностью, которая к тому же проявляет способность связывать гемопоэтические клетки, такие как первичные половые и/или долговременные репопулирующие (стволовые) клетки.
Ретровирус-связывающая активность полипептида, представленного выше с помощью 8ЕЦ. ΙΌ №. 1 (Η-271), показывает концентрационную зависимость и, как указано ниже в примере 8, показывает практически ту же активность, что и СН-271 при высоких концентрациях. То есть ретровирус и клетки-мишени связаны на первое время, как минимум, одной молекулой Н-271 в присутствии высокой концентрации Н-271.
Сильное связывание вируса с доменом, связывающим вирус, функционального материала настоящего изобретения, может использоваться для конструирования систем доставки для вирус-опосредованной терапии посредством широкого круга типов клеток. Для этой цели полипептид, содержащий ретровируссвязывающий домен функционального материала настоящего изобретения, можно присоединить к любому материалу, содержащему домен, связывающий клетку, который делает этот конструкт специфичным для клеток-мишеней, или может солокализоваться с материалом, содержащем свой домен, связывающий клетку. То есть полипептид, связывающий определенный вирус, может быть ковалентно присоединен к материалу, связывающему определенную клетку, или они могут быть разными молекулами.
Этот подход обходит прежнюю необходимость конструировать ретровирус-специфичные клеточные линии для каждой клетки-мишени и облегчает выбор функционального материала, обладающего наиболее подходящим доменом, связывающим клетку-мишень, в соответствии с видом отдельных клеток-мишеней. По этой причине, благодаря использованию функционального материала настоящего изобретения, специфическую трансдукцию клеток-мишеней легко осуществить, применяя, в частности, способ настоящего изобретения, в котором смесь функционального материала, обладающего рет ровирус-связывающим доменом, и функционального метериала, обладающего доменом, связывающим клетку-мишень, особенно пригоден для переноса требуемого гена в предполагаемую клетку-мишень. Кроме того, новый функциональный материал, созданный в настоящем изобретении, особенно пригоден для данного способа, повышающего эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровирусов, и родственных методов.
Далее настоящее изобретение подробно иллюстрируют нижеприведенные примеры, но они не рассматриваются как ограничивающие его объем.
Пример 1.
(1) Получение вирусного супернатанта.
Клетки-продуценты СР + Е-86 (АТСС СИЬ-%42). содержащие ретровирусный плазмидный вектор РМ5пео, содержащий ген устойчивости к неомицину (Ехр. Нета1о1., 23, 630-638 (1995)) культивировали в модифицированной Дюльбекко среде Игла (ΌΜΕΜ, ΙΚΗ Вюкаепсе), содержащей 10% околоплодной сыворотки теленка (ЕС8, С1Ьсо), 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (оба от С1Ьсо). Все ΌΜΕΜ, использованные ниже, содержали 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина. Супернатант, содержащий РМ5пео-вирус, собирали путем добавления 4 мл ΌΜΕΜ, содержащей 10% ЕС8, в полусообщающиеся чашки для культивирования в течение ночи. Собранную среду фильтровали через 0,45 микронные фильтры (Μ^11^ро^е) для получения вирусного супернатанта, который хранили перед использованием при -80°С.
Что касается ретровирусной плазмиды, ΤΚΝΕΟ-вектора, (В1ооб, 78, 310-317 (1991)), ΤΚΝΕΟ-вирусный супернатант получали раздельно по одним и тем же методикам, что и описанные выше при использовании клеток СР+епуАт-12 (АТСС СРЬ-9641).
(2) Определение титра вируса в супернатанте.
Титр вируса в супернатанте определяли путем использования клеток ΝΙΗ/3Τ3, согласно стандартным методикам (1. У1го1., 62, 1120-1124 (1998)). А именно, ΌΜΕΜ и 2000 клеток/лунку МИ/3Т3-клеток вносили в 6-луночную планшету для культивирования ткани. После культивирования в течение ночи в каждую лунку вносили последовательно разбавленный вирусный супернатант вместе с гексадиметринбромидом (ро1уЬгепе, выпущенный фирмой А1бпс11) в конечной концентрации 7,5 мкг/мл. Этот супернатант инкубировали при 37°С в течение 24 ч и затем используемую среду заменяли средой, содержащей С418 (С1Ьсо) в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Данную планшету инкубировали дальше. С418-устойчивые (С418г) колонии, которые выращивали более 10-12 дней, окрашивали кристаллическим фиолетовым, чтобы произвести подсчет. Количество инфицированных частиц в расчете на 1 мл супернатанта (сГи/т1) вычисляли умножением числа колоний на лунку при определенном уровне разведения и использовали его в качестве титра супернатанта для определения количества вирусного супернатанта, добавляемого в последующих экспериментах.
Пример 2.
(1) Получение полипептида, произведенного из фибронектина.
Полипептид, произведенный из человеческого фибронектина, Н-271 (аминокислотная последовательность показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 1 списка последовательностей), получали из Е. той, содержащей рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую полипептид ρΗΌ101, т.е. ЕзсйепсЫа ^1ί ΗΒ101/ρΗΌ101 (РЕЕМ ΒΡ-2264), в соответствии со способом, описанным в патенте США №5198423.
Полипептид, СН-271 (аминокислотная последовательность показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 23 списка последовательностей), получали следующим образом. А именно, ЕзсйепсЫа той НВ101/рСН101 (РЕЕМ ΒΡ-2799) культивировали в соответствии со способом, описанным в вышеуказанном патенте, и СН-271 выделяли из полученной культуры.
А полипептид СН-296 (аминокислотная последовательность показана 8Ер. ΙΌ Νο. 24) получали следующим образом. А именно, ЕзсйепсЫа οοΐΐ НВ101/рСН102 (РЕЕМ ΒΡ-2800) культивировали в соответствии со способом, описанным в вышеуказанном патенте и СР-296 выделяли из полученной культуры.
Полипептид С-274 (аминокислотная последовательность показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 25 списка последовательностей) получали следующим образом. А именно, ЕзсйепсЫа сοI^ !М109/рТР7221 (РЕЕМ ΒΡ-1915) культивировали в соответствии со способом, описанным в патенте США №5102988, и С-274 выделяли из полученной культуры.
Далее полипептид С277-С81 (аминокислотная последовательность показана в 8 Ер ΙΌ. Νο. 29 списка последовательностей) получали следующим образом. А именно, ЕзсйепсЫа сοI^ ΗΒ101/ρС825, который был описан в ΙΡ-Α 3284700 под РЕЕМ Ρ-11339 и был депонирован в вышеуказанном ΝΙΒΗ из 1-1-3 ШдазЫ, ТзикиЬазЫ, ФагаК-кеп, по Будапештскому Договору, под инвентарным номером РЕЕМ ΒΡ-5723 (дата первоначального депонирования: 5 марта 1990 г.), культивировали в соответствии со способом, описанным в вышеуказанном патенте, и С277С81 выделяли из полученной культуры.
(2) Получение С-ЕСЕ-Л.
Полипептид С-РСР-А (аминокислотная последовательность показана в 8Ер ΙΌ. Νο. 4 списка последовательностей) получали следующим образом. А именно, Е. той, содержащую рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую вышеуказанный полипептид рУМИ
СР-А, т.е. ЕзсйепсЫа той ^М109/ρΥМΗ-СР-А (РЕЕМ ΒΡ-5278) культивировали в 5 мл ΕΒбульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина при 37°С в течение 8 ч. Этот прекультивированный бульон инокулировали в 500 мл ΕΒбульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 1 мМ ТТС (изопропил-в-Э-тиогалактопиранозид) и культивировали при 37°С в течение ночи. Бактериальные клетки собирали, суспендировали в 10 мл ΡΒ8 (фосфатно-солевой буфер), содержащего 1 мМ ΡМ8Р (фенилметансульфонийфторид) и 0,05% ΝοηίώΑ Ρ-40 и обрабатывали ультразвуком для разрушения полученных клеток. Полученную смесь центрифугировали для получения супернатанта. Для абсорбции 4,000 при 260 нм этого супернатанта добавляли 1 мл 5%-ного полиэтиленимина и эту смесь центрифугировали для получения супернатанта. Полученный супернатант наносили на Η^Т^аρ-Ηеρа^^η-колонку (Ρйа^тас^а), уравновешенную ΡΒ8. После отмывки, с помощью ΡΒ8, не абсорбированной фракции, абсорбированную фракцию элюировали при помощи ΡΒ8, содержащего градиент №101 от 0,5 до 2М. Полученный элюат анализировали 808-электрофорезом в полиакриламидном геле (8^8-ΡАСЕ), который показал наличие двух фракций, содержащих 47 кД полипептид. Одну из фракций, которую элюировали при высокой концентрации №С1, собирали и наносили на колонку 8ирегозе 6 (Ρ^^ιΟι), уравновешенную ΡΒ8, содержащего 1,5 №С1. Полученный элюат анализировали с помощью 8О8ТАСЕ, и фракцию, содержащую полипептид, около, 4 7 кД, собирали для получения выделенного очисткой С-РСР-А, который использовали в последующих стадиях.
(3) Получение С-РСР-С81.
Вначале конструировали плазмиду для экспрессирования требуемого полипептида, СРСР-С81 (аминокислотная последовательность показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 5 списка последовательностей), в ЕзсйепсЫа той в качестве хозяина.
Культивировали ЕзскепсЫа той
ΗΒ101/ρΡΗ102 (РЕЕМ ВР-2800) и из полученных бактериальных клеток получали плазмиду рСН102 щелочно-808-методом. ΡίΤ осуществляли с использованием этой плазмиды в качестве матрицы, а также праймера М4 (Такага 81ιι.ιζο Сс., Ь!б.) и праймера С81-8, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 9 в списке последовательностей, и амплифицированный фрагмент ДНК в данном реакционном растворе извлекали с помощью этанольного осаждения. Полученный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью ΝΜ и 8аП (оба фермента от Такага 81ιιιζο Са, Ь!б.), с последующим электрофорезом в агарозном геле для извлечения из данного геля 970 п.н. фрагмента ДНК.
Затем культивировали ЕзсйепсНа той
ЗМ^/рУМЫ-СР-А (РЕЕМ ΒΡ-5278) и из этих полученных бактериальных клеток щелочно41
БРБ-методом получали плазмиду рУМН-СЕ-А. Реакцию РСК осуществляли с использованием этой плазмиды в качестве матрицы, а также праймера СЕ, нуклеотидная последовательность которого показана в БЕр. ΙΌ Νο. 10, и праймера ΕΝΚ, нуклеотидная последовательность которого показана в БЕр. ΙΌ Νο. 11 списка последовательностей, и амплифицированный фрагмент ДНК в этом реакционном растворе извлекали с помощью этанольного осаждения. Этот полученный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью Есо521 (Такага Б1шхо Со., Ыб.) и №еЕ с последующим электрофорезом в агаровом геле, чтобы извлечь из данного геля 320 п.н. фрагмент ДНК.
Фрагмент ДНК, около 4,1 т.п.н., выделяли путем обработки плазмиды рУМН-СЕ-А с помощью Есо521 и Бай и подвергали электрофорезу в агарозном геле, смешивали с вышеуказанным 970 п.н. фрагментом ДНК и около 320 п.н. фрагментом ДНК для лигирования их с полученной рекомбинантной плазмидой, которую инсерцировали в Е. сой ДМ109. Плазмиду, полученную из результирующего трансформанта, которая содержала каждую одну молекулу из вышеуказанных трех фрагментов ДНК, отбирали и назвали плазмидой рСЕБ100. Е. сой 1М109, трансформированную с помощью плазмиды рСЕБ100, назвали ЕксйепсЫа сой !М109/рСЕБ100. Данная плазмида рСЕБ100 обладает, полученной из фибронектина на С-конце С-ЕСЕ-А, областью, адгезирующей клетку, и кодирует соответствующий полипептид, С-ЕСЕСБ1, в котором второй лизин с С-конца ЕОЕ заменен на аланин.
Полипептид С-ЕОЕ-СБ1 получали следующим образом. А именно, вышеуказанную Е. сой !М109/рСЕБ 100 культивировали в 5 мл ЬВбульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина, при 37°С в течение 8 ч. Этот прекультивированный бульон инокулировали в 500 мл ЬВбульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина и 1 мМ 1РТО, и культивировали в течение ночи при 37°С для сбора бактериальных клеток. Полученные в итоге бактериальные клетки суспендировали в 10 мл РВБ (фосфатно-солевом буфере), содержащем 0,5М №С1, 1 мМ РМБЕ и 0,05% №шбе1 Р-40, и данные бактериальные клетки обрабатывали ультразвуком на разрушение и центрифугировали для получения супернатанта. Этот супернатант наносили на Н1ТгарНерапи-колонку, предварительно уравновешенную с РВБ, содержащем 0,5М №С1, не адсорбированные фракции отмывали с помощью РВБ, содержащего 0,5М №С1, а адсорбированную фракцию элюировали с помощью РВБ, имеющего градиент концентрации №С1 от 0,5 до 2М. Полученный элюат анализировали с помощью БРБ-полиакриламидного гелевого электрофореза и собирали фракции, около, 50 кД полипептида, чтобы получить выделенный очисткой СЕОЕ-СБ1, который использовали в последующих стадиях.
Полученную таким образом аминокислотную последовательность, исследовали, от Νконца до пятой аминокислоты выделенного очисткой С-ЕОЕ-СБ1, и обнаружили совместимость с последовательностью, которая показана в БЕр. ΙΌ №. 5 списка последовательностей. Кроме того, измеренный с помощью массспектроскопии молекулярный вес выделенного очисткой С-ЕОЕ-СБ1 совпадал с молекулярным весом, ожидаемым от вышеуказанной аминокислотной последовательности.
(4) Получение С-277-Со1У.
Полипептид С277-Со1У (аминокислотная последовательность показана в БЕр. ΙΌ №. 6 списка последовательностей) выделяли очисткой следующим образом. А именно, Е. сой, содержащую рекомбинантную плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую вышеуказанный полипептид, рТЕ7520Со1У, т.е. ЕксйепсЫа сой ДМ109/рТЕ7520 Со1У (ЕЕКМ ВР-5277), культивировали в 5 мл ЬВ-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина при 37°С в течение 6,5 ч. Этот прекультивированный бульон инокулировали в 500 мл ЬВ-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина, и культивировали при 37°С. Когда абсорбция при 660 нм достигала 0,6, в этот бульон вносили ГРТО в конечной концентрации доведенной до 1 мМ, и этот бульон культивировали в течение ночи, чтобы собрать бактериальные клетки. Полученные бактериальные клетки суспендировали в 10 мл РВБ, содержащего 1 мМ ЭДТА, 0,05% №шбе1 Р-40 и 2 мМ РМБЕ, и обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин до разрушения клеток. Раствор с разрушенными клетками центрифугировали и полученный в итоге супернатант наносили на Кекоигсе Р-колонку (Рйагтааа) для получения не адсорбированной фракции, содержащей требуемый полипептид. Данную фракцию наносили на НГТгар-Нерагт-колонку, уравновешенную с помощью РВБ. После отмывания не адсорбированной фракции с помощью РВБ, адсорбированную фракцию элюировали с помощью РВБ, имеющего градиент №С1 от 0 до 0,5М. Полученный элюат анализировали в БЭБ-РАСЕ и собирали соответствующие фракции, содержащие 48 кД полипептид, для получения выделенного очисткой С277-Со1У, который использовали в последующих стадиях.
(5) Получение Со1У.
Вначале конструировали плазмиду для экспрессирования полипептида Со1У (аминокислотная последовательность показана в БЕр. ΙΌ №. 6 списка последовательностей), в ЕксйепсЫа сой в качестве хозяина.
Культивировали ЕксйепсЫа сой
НВ101/рТЕ7520Со1У (ЕЕКМ ВР-5277) и из полученных в итоге бактериальных клеток щелочно-БРБ-методом получали плазмиду рТЕ7520Со1У. Эту плазмиду обрабатывали с помощью ΝοοΙ и ВатН1 (оба фермента от Такага 8Ιιιιζο ЬЙ.), с последующим электрофорезом в агарозном геле для извлечения из данного геля фрагмента ДНК, около, 0,58 т.п.н. Извлеченный фрагмент смешивали с плазмидным вектором рЕТ8С (Nονадеη), преобработанного с помощью ΝοοΙ и ВатН1, для лигирования с ним. Итоговую рекомбинантную плазмиду интродуцировали в Е. οοίί ВЬ21 для получения трансформанта, из которого получали плазмиды, отобрали плазмиду, содержащую только одну молекулу вышеуказанного фрагмента ДНК, около 0,58 т.п.н., и назвали ρΕΤί,’οίν.
Е. οοίί ВЬ21, трансформированную вышеуказанной плазмидой рЕТС'й V, то есть Екскегίοΐιίη тоН ВЬ-21/ρΕΤί.’οίν, культивировали в течение ночи в 10 мл ЬВ-бульона, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, при 37°С. 0,2 мл этого прекультивированного раствора инокулировали в 100 мл Ь-бульона, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, с последующим культивированием при 37°С. Когда абсорбция достигала при 600 нм 0,4, в него вносили 1РТО до конечной концентрации 1 мМ, с последующим культивированием в течение ночи, чтобы собрать бактериальные клетки. Итоговые бактериальные клетки суспендировали в 5 мл РВ8 (фосфатно-солевой буфер), содержащем 1 мМ ЭДТА, 0,5% №пйе1 Р-40, 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина и 2 мМ РМ8Г, эти клетки подвергали ультразвуковой обработке на разрушение, с последующим центрифугированием для получения супернатанта. Супернатант наносили на Н1ТгарНерапп-колонку, уравновешенную с РВ8, не адсорбированные фракции вымывали с помощью РВ8, а адсорбированную фракцию элюировали с помощью РВ8, содержащего 0,5М №1С1. Полученный элюат анализировали в 8И8полиакриламидном гелевом электрофорезе и подтверждали практическую гомогенность около 18 кД полипептида. Полученный таким образом выделенный очисткой ί,'οί V использовали в последующих стадиях.
(6) Получение Н2-547.
Плазмиду для экспрессирования полипептида Н2-547 (аминокислотная последовательность показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 13 списка последовательностей) конструировали следующим образом. Культивировали ЕксйепсЫа ^1ί НВ101/рСН101 (ГЕРМ ВР-2800) и, с использованием щелочно-8И8-метода, из культивированных клеток получали плазмиду рСН102. Осуществляли РСК, используя эту плазмиду в качестве матрицы, а также праймер 128, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 15 списка последовательностей, и праймер 14А, нуклеотидная последовательность которого показана в 8 Ер. ΙΌ Νο. 16 списка последовательностей, с последующим электрофорезом в агаровом геле для извлечения из данного геля фрагмента ДНК, около 0,8 т.п.н., кодирующего связывающий гепарин по липептид фибронектина. Извлеченный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью №οΙ и ВашШ (оба фермента от Такага 81ιιιζο СЪ., ЬЙ.) и смешивали с ρΤν118Ν (Такага 81ιιιζο ЬЙ.), обработанного с помощью NсοI-ΒатНI, для лигирования с ним, который инсерцировали в Е. тоН ДМ109. Из итогового трансформанта получали плазмиды, отбирали плазмиду, содержащую вышеуказанный фрагмент ДНК и назвали плазмиду рКН1.
Плазмидный вектор, рINIII-οтрА1 (Тке ЕМВО йита1, 3, 3437-2442 (1984)), обрабатывали с помощью ВатШ и НшсП (Такага 81ιιιζο ЬЙ.) для извлечения фрагмента ДНК, около 0,9 т.п.н., содержащего липопротеиновую терминаторную область. Извлеченный фрагмент смешивали с плазмидой рКН1, обработанной с помощью ВатШ-НшсП, для их лигирования, чтобы получить плазмиду рКН1-Т, содержащую 1ас-промотор, фрагмент ДНК, кодирующий полипептид, связывающий гепарин, и липопротеиновый терминатор, в данном порядке.
Фрагмент ДНК около 3,1 т.п.н. получали в результате обработки плазмиды рКН1-Т, с помощью ΝΙκΙ и 8саI (оба фермента от Такага 8Ιιιιζο ЬЙ.), а фрагмент ДНК около 2,5
т. п.н. получали в результате обработки плазмиды рКН1-Т, соответственно, с помощью 8реI (Такага 8Ιιιιζο ЬЙ.) и 8са!, и эти два фрагмента лигировали с получением плазмиды рКН2-Т, содержащей 1ас-промотор, открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, в котором два полипептида, связывающие гепарин, соединены в тандем, и липопротеиновый терминатор, в данном порядке. Нуклеотидная последовательность вышеуказанной открытой рамки считывания показана в 8Ер. ΙΌ Νο. 17 списка последовательностей.
Полипептид Н2-547 получали следующим образом. Готовили четыре колбы Эрленмейера по 500 мл, снабженные перегородкой, содержащие 120 мл ЬВ-бульона, содержащего 100 мкг/мл ампициллина, в который инокулировали Е. отН НВ 101, трансформированную с помощью вышеуказанной плазмиды рКН2-Т, то есть Е§скепсЫа ^1ί НВ101/рКН2-Т, для культивирования в течение ночи при 37°С. Культивированные клетки собирали центрифугированием, суспендировали в 40 мл лизирующего буфера (50 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, 150 мМ №С1, 1 мМ ИТТ, 1 мМ РМ8Г, рН 7,5) и обрабатывали эти бактериальные клетки ультразвуком на разрушение. Супернатант, полученный путем центрифугирования, наносили на колонку НщН 1гар Нерапп (Ркагтааа), уравновешенную буфером для выделения (50 мМ трис-НС1, рН 7,5). Не адсорбированные в колонке фракции вымывали с помощью этого же буфера, с последующим элюированием с помощью буфера для выделения, имеющего градиент концентрации №1С1 от 0 до 1М. Полученный элюат анализировали с помощью 8И8-полиакриламидного гелевого электрофореза и собирали фракции, содержащие полипептид, обладающий молекулярным весом около 60000, для получения выделенного очисткой препарата Н2-547. Количество белка, содержащегося в этом полученном препарате, анализировали с помощью ВСА ΡΚΟΤΕΙΝ Α88ΑΥ КЕАСЕЭТ (Р1егсе) с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта, свидетельствующего о получении около 10 мг Н2-547.
Исследовали аминокислотную последовательность от Ν-конца до пятого остатка, выделенного очисткой полученного таким образом Н2-547, и обнаружили совместимость с аминокислотной последовательностью Н2-547, ожидаемой из нуклеотидной последовательности, показанной в 8Ер. ΙΌ №. 17 списка последовательностей, минус метионин на Ν-конце (ее последовательность показана в 8Ер. ΙΌ №. 13 списка последовательностей). Молекулярный вес выделенного очисткой Н2-547, измеренного с помощью масс-спектрометрии, совместим с ожидаемым молекулярным весом из аминокислотной последовательности, показанной в 8Ер. ΙΌ №. 13 списка последовательностей.
7) Получение СН2-826.
Плазмиду для экспрессирования полипептида СН2-826 (аминокислотная последовательность, показанная в 8Ер. ΙΌ №. 14 списка последовательностей) конструировали следующим образом. РСК. осуществляли с использованием вышеуказанной плазмиды рСН102 в качестве матрицы, а также праймера СЬ8, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. Ш №. 18 списка последовательностей, и праймера СЬА, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. ΙΌ №. 19 списка последовательностей, с последующим электрофорезом в агаровом геле для извлечения фрагмента ДНК, около 0,8 т.п.н., кодирующего адгезирующий клетку полипептид фибронектина. Этот полученный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью №о! и ВдШ (оба фермента от Такага 8Ьихо Со., Иб.) и смешивали с рТУ118Н обработанной с помощью ^оЕВатШ, для их лигирования, который инсерцировали в Е. со11 1М109. Из итогового трансформанта получали плазмиды и плазмиду, содержащую вышеуказанный фрагмент ДНК, отобрали и назвали плазмидой рКС1. Фрагмент ДНК около 2,5 т.п.н., полученный путем обработки плазмиды рКС1, с помощью 8реI и 8сак и фрагмент ДНК около 3,9 т.п.н., полученный путем обработки вышеуказанной плазмиды рКН2-Т с помощью ΝΙκΙ и 8сак смешивали дли их лигирования, чтобы получить плазмиду рКСН2-Т, кодирующую полипептид, в котором два полипептида, связывающие гепарин, тандемно соединены с Сконцевым полипептидом, адгезирующим клетку. Нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания в этой плазмиде рКСН2-Т, кодирующей этот полипептид, показан в 8 Ер.
ΙΌ №. 20 списка последовательностей.
Полипептид СН2-826 получали в соответствии с тем же способом, который использовали для получения полипептида Н2-547, описанного в примере 2(6). Фракции, содержащие полипептид, обладающий молекулярным весом около 90000, собирали из элюата колонки Н1дЬ !гар Нерапп, для получения выделением очисткой СН2-826.
(8) Получение Н28-537.
Плазмиду для экспрессирования полипептида Н28-537 (аминокислотная последовательность показана в 8Ер. ΙΌ №. 30 списка последовательностей) конструировали следующим образом. РСК осуществляли с использованием вышеуказанной плазмиды рСН102 в качестве матрицы, а также праймера С818, нуклеотидная последовательность которого показана в 8 Ер. ΙΌ №. 31 списка последовательностей, и праймера С81А, нуклеотидная последовательность которого показана в 8Ер. ΙΌ №. 32 списка последовательностей, с последующим электрофорезом в агаровом геле для извлечения фрагмента ДНК около 0,1 т.п.н., кодирующей адгезирующий клетку полипептид фибронектина. Извлеченный фрагмент ДНК обрабатывали с помощью Ν^Ι и ВатШ (оба фермента от Такага 8Ьихо Со., Ь!б.) и смешивали с рТУ118Н обработанной с помощью ^оЕВатШ, для их лигирования, который инсерцировали в Е. сой 1М109. Из итогового трансформанта получали плазмиды и плазмиду, содержащую вышеуказанный фрагмент ДНК, отбирали и назвали плазмидой рК81.
Плазмидный вектор рГЫШ-отрА! обрабатывали с помощью ВатШ и НшсП для извлечения фрагмента ДНК около 0,9 т.п.н., содержащего область липопротеинового терминатора. Извлеченный фрагмент смешивали с плазмидой рК81, обработанной с помощью ВатШ-НшсП, для их лигирования с получением плазмиды рК81-Т, содержащей 1ас-промотор, фрагмент ДНК, кодирующий С8-1-область полипептида и липопротеиновый терминатор, в данном порядке.
Получали фрагмент ДНК около 2,4 т.п.н., полученный путем обработки этой плазмиды рК81-Т с помощью ΝΙκΙ и 8сак и фрагмент ДНК около 3,3 т.п.н., полученный путем обработки вышеуказанной плазмиды рКН2-Т с помощью 8рек 8са! и РШ (Такага 8Ьихо Со., Иб.). Их лигировали с получением плазмиды рКН28-Т, содержащей 1ас-промотор, открытую рамку считывания, кодирующую полипептид, обладающий такой структурой, в которой два полипептида, связывающие гепарин, тандемно соединены, а затем к его С-концу присоединяли С8-1область, и липопротеиновый С-терминатор, в данном порядке. Нуклеотидная последовательность вышеуказанной открытой рамки считыва ния показана в 8Ε(β. ΙΌ Νο. 32 списка последовательностей.
Полипептид Н28-573 получали в соответствии с тем же методом, который использовали для получения полипептида Н2-547, описанного в примере 2 (6). Фракции, содержащие полипептид, обладающие молекулярным весом около 60000, собирали из элюата колонки Нщ11 1гар Нерали для получения очищенного Н28-573.
(9) Иммобилизация функционального материала на планшете.
Для использования планшета, на котором иммобилизовали функциональный материал для проведения эксперимента по заражению клеток ретровирусом (6-луночный планшет для культивирования ткани, Ра1сои), иммобилизацию осуществляли в соответствии со следующими операциями. А именно, раствор каждого функционального материала, описанного в вышеуказанных примерах, в РВ8 в подходящей концентрации, наносили на планшет в количестве 2 мл на лунку (донная площадь 9,6 см2) и планшет инкубировали под УФ-светом при комнатной температуре в течение одного часа, не закрывая его, а затем еще полчаса в закрытом состоянии. Затем раствор полипептида заменяли на 2 мл РВ8, содержащего 2% бычьего сывороточного альбумина (В 8А, ВоеЬпидег МаплЬем) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Планшет промывали с помощью РВ8, содержащего 25 мМ НЕРЕ8. Сенсибилизированный контрольный планшет, в котором иммобилизовали В8А, получали в соответствии с тем же способом, который приведен выше, за исключением того, что инкубацию с полипептидом не осуществляли. Для эксперимента генного переноса (вирусное заражение) в нижеприведенных примерах, если не указано иначе, использовали вышеуказанный 6-луночный планшет для тканевой культуры. Если концентрация функционального материала, используемого для иммобилизации на планшете, указывалась, количество полипептида на единицу площади дна лунки описывали с использованием в качестве единицы пмоль/см2 (и мкг/см2). Например, когда иммобилизацию осуществляли путем использования в вышеуказанном планшете 2 мл 48 мкг/мл раствора Н-271 (донная площадь 9,6 см2), то это соответствует описанию иммобилизация была осуществлена с 333 пмоль/см2 (10 мкг/см2) Н-271. А планшет, иммобилизованный С-296, используемый для культивирования не прилипших клеток (ТР-1, НЬ-60) после трансдукции, получали путем иммобилизации 48 пмоль/см2 (3 мкг/см2) раствора СН-296 в соответствии с вышеприведенными операциями. В последующих примерах вирусное заражение клеток-мишеней всегда осуществляли в среде без ро1уЬгеие. Если количество вируса, клеток, среды и т.п. указано, то и описано соответствующее количество на лунку, если не оговорено особо.
Пример 3.
(1) Генный перенос с использованием смеси функциональных материалов.
Нижеследующие эксперименты осуществляли для изучения эффекта на генный перенос в случае иммобилизации на планшете смеси материала, связывающего клетку, и материала, связывающего ретровирус. Вначале каждый полипептид иммобилизовали на планшете путем использования 32 пмоль/см2 (1,5 мкг/см2) СР6Р-А, смеси 32 пмоль/см2 (1 мкг/см2 С-274 и 32 пмоль/см2 (0,5 мкг/см2) Р6Р (Вес1оп Όχΐίηзои) в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9). После преинкубации 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 с£и вируса РМ5иео, на соответствующих планшетах, и контрольном планшете, покрытом В8А при 37°С в течение 30 мин, эти планшеты тщательно промывали с помощью РВ8. В каждый из этих планшетов вносили 2 мл среды ΌΜΕΜ, содержащей 2000 клеток МН/3Т3, и инкубировали при 37°С в течение 2 ч в отсутствие ро1уЬгеие. Не адгезированные клетки собирали декантированием, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для отделения их от планшета. Полученные клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины. Одну половинную порцию культивировали в ΌΜΕΜ, а другую порцию культивировали в ΌΜΕΜ, содержащей 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней и подсчитывали появляющиеся колонии. Подбор определенного соотношения числа устойчивых 6418 (6418г) колоний по отношению к колониям, полученным в среде без 6418, в качестве эффективности генного переноса, показан на фиг. 1. На фиг. 1 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 1, в случае 2часового ретровирусного заражения, при использовании смеси С-274 и Р6Р, колонии 6418г получали с той же эффективностью генного переноса, что и С-Р6Р-А, где эти два полипептида ковалентно соединены, хотя эффективность генного переноса, полученная с использованием одного лишь Р6Р была ниже, чем с использованием С-Р6Р-А.
С целью подробного изучения эффект иммобилизации одного лишь С-274 и одного лишь Р6Р сравнивали с эффектом иммобилизации их смеси. А именно, оценку осуществляли исключая планшеты, полученные с 32 пмоль/см2 (1 мкг/см2) С-274, 32 пмоль/см2 (0,5 мкг/см2) Р6Р и смеси, соответственно, из 32 пмоль/см2 С-274 и 32 пмоль/см2 Р6Р одним и тем же способом, который описан в примере 2 (9). Полученные результаты показаны на фиг. 2. На фиг. 2 на абсциссе указаны используемые функциональ ные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 2, при использовании планшета, на котором осуществляли иммобилизацию смесью из С-274 и Р6Р, эффективность генного переноса была выше, чем при использовании планшета, на котором иммобилизовали только Р6Р. А на планшете, на котором иммобилизацию осуществляли с помощью С-274, который не обладает доменом, связывающим какой-либо ретровирус, колонии С4181' не появлялись. Это показывает, что при объединении Р6Р, который обладает доменом, связывающим ретровирус, с С-274, который обладает доменом, связывающим клетку, можно повысить эффективность генного переноса, в сравнении с переносом, полученным при использовании только Р6Р, и что ковалентное соединение полипептидов не обязательно требуется для создания такого эффекта этими объединенными полипептидами.
(2) Генный перенос с использованием смеси функциональных материалов.
В соответствии с тем же способом, который описан в примере 3 (1), оценку осуществляли за исключением того, что полипептид, обладающий доменом, связывающий ретровирус, заменяли на Со1У. В этом эксперименте исследовали эффект смешивания С-274 и Со1У в различных молярных соотношениях. А именно, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), иммобилизацию на планшетах осуществляли путем использования, соответственно, 330 пмоль/см2 (6 мкг/см2) Со1У, смеси из 330 пмоль/см2 (10 мкг/см2) С-274 и 330 пмоль/см2 Со1У (молярное соотношение С274:Со1У = 10:10), смеси из 100 пмоль/см2 (3 мкг/см2) С-274 и 330 пмоль/см2 Со1У (3:10), смеси из 33 пмоль/см2 (1 мкг/см2) С-274 и 330 пмоль/см2 Со1У (1:10), 330 пмоль/см2 (16 мкг/см2) С277-Со1У и 330 пмоль/см2 (10 мкг/см2) С-274. При использовании полученных таким образом планшетов, эффект ретровирусного заражения исследовали в соответствии с тем же способом, который описан выше. Полученные результаты показаны на фиг. 3. На фиг. 3 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 3, в случае 2часового заражения, эффективность заражения планшета, иммобилизованного Со1У, была менее 1/2 от планшета, иммобилизованного С277Со1У, тогда как инфекционная эффективность планшета, на котором осуществляли иммобилизацию смесью из Со1У и его 1/10 количеством С-274, была той же, что и у планшета, иммобилизованного С277-Со1У. Следовательно, ретровирусное инфицирование, усиливающее активность С-274, выясняли по наблюдению для случая с Р6Р. Этот эффект был несколько снижен в случае, в котором количество молекул С-274 относительно молекул Со1У было повышено. При покрытии смесью, содержащей те же количества Со1У и С-274, существенных различий между данной смесью и одним лишь Со1У не имелось.
(3) Генный перенос с использованием смеси функциональных материалов.
С целью исследовать ретровирусное воздействие на эффективность генного переноса при иммобилизации смесью материала, обладающего доменом, связывающим клетку, и материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, осуществили нижеследующий эксперимент. Прежде всего, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), осуществили иммобилизацию планшетов с помощью, соответственно, 32 пмоль/см2 (1 мкг/см2) С-274, 333 пмоль/см2 (10 мкг/см2) Н271 и смесью из 32 пмоль/см2 (1 мкг/см2) С-274 и 333 пмоль/см2 (10 мкг/см2) Н-271. После преинкубации 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 сГи вируса РМ5пео, на соответствующих планшетах при 37°С в течение 30 мин, планшеты тщательно промывали с помощью ΡΒ8. В каждый из этих планшетов вносили 2 мл среды ΌΜΕΜ, содержащей 2000 клеток ΝΙΗ/3Τ3, и инкубировали при 37°С в течение 2
ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для отделения их от планшета. Полученные клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины. Одну половинную порцию культивировали в ΌΜΕΜ, а другую порцию культивировали в ΌΜΕΜ, содержащей 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали. Подбор соотношения числа 6418г-колоний относительно колоний, полученных в среде без 6418, в качестве эффективности генного переноса, данные результаты показаны на фиг. 4. На фиг. 4 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 4, при использовании планшета, на котором иммобилизовали смесь из С-274 и Н-271 (молярное соотношение = 1:10), эффективность инфицирования была существенно повышена. На планшете, с иммобилизованным С-274, генный перенос не наблюдали.
(4) Генный перенос с использованием С277-С81.
С целью исследовать ретровирусное действие на инфекционную эффективность, при использовании С277-С81 в качестве материала, обладающего доменом, связывающим клетку, и иммобилизацию его смеси и материала, обладающего доменом, связывающим ретровирус, осуществили нижеследующий эксперимент. В качестве материала, связывающего ретровирус, использовали полилизин [(Ьу§)п, поли-Ьлизингидробромид, молекулярный вес: 50000100000, \ν;·ι1<ο Риге С11ет1са1 Сб., Ыб.] и Н-271. В качестве соответствующих клеток использовали не адгезирующие клетки, ТЕ-1-клетки (АТСС СКЬ-2003). Вначале в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), осуществили иммобилизацию на планшетах путем использования нижеследующих растворов: С-277-С81 (33 пмоль/см2, 1,1 мкг/см2), полилизина (133 пмоль/см2, 10 мкг/см2), смеси из С-277-С81 (33 пмоль/см2) и полилизина (133 пмоль/см2), Н-271 (333 пмоль/см2, 10 мкг/см2) и смеси из С-277-С81 (33 пмоль/см2) и Н-271 (333 пмоль/см2) и СН-296 (33 пмоль/см2, 2,1 мкг/см2) соответственно. В каждый планшет вносили среду ΚΡΜΙ-1640 [содержащую 5 нг/мл СМ-СЕ8 (Ре!го Тес11). 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина], содержащую 1 х 104 сГи вируса ΤΚΝΕΟ, 1 х 104 ТЕ-1-клеток и планшет инкубировали при 37°С в течение 24 ч. После инкубации собирали не адгезированные клетки путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с планшета. Полученные клетки объединяли. Одну из пяти порций итоговой клеточной суспензии переносили в два планшета, покрытые СН-296, и инкубировали в течение 24
4. Затем в одной из порций меняли среду на вышеуказанную среду, а среду из другой порции меняли на вышеуказанную среду, содержащую С418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 8 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали.
Частоту С418г - (эффективность переноса гена) колоний вычисляли на основе численностей колоний, появившихся в присутствии и отсутствии С418.
Полученные результаты показаны на фиг.
5. На фиг. 5 на абсциссе указаны соответствующие используемые функциональные материалы, а на ординате указана эффективность генного переноса. На фиг. 5 (а) отражает использование соответствующего полилизина в качестве материала, связывающего ретровирус, и (Ь) отражает использование Н-271. В сравнении с планшетом, на котором иммобилизован только материал, связывающий ретровирус, эффективность генного переноса существенно выше благодаря использованию полилизина или Н-271 вместе с С277-С81, обладающим доменом, связывающим клетку.
(5) Получение полипептида, происходящего из эритропоэтина.
Полипептидное производное, которое представляет собой эритропоэтин, слитый с глутатион-3-трансферазой (68Τ-Εрο), получали для использования для генного переноса в клетки, обладающие эритропоэтиновым рецептором. Его аминокислотная последовательность показана в 8ЕО. ΙΌ Νο. 34 списка последовательностей. В этой последовательности аминокислотная последовательность от 233-й аминокислоты до 398-й аминокислоты корреспондирует с эритропоэтином.
Вначале с помощью нижеследующих операций сконструировали плазмиду для экспрессии ^Т^рю. РСК осуществляли с использованием кДНК-библиотеки, полученной из печени человеческого плода (Οοικ^ΐι) в качестве матрицы, и праймеров ЕРЕ1 и ЕРК1, показанных в 8ЕО. ΙΌ Νοδ. 35 и 36 списка последовательностей). Часть этой реакционной смеси отобрали и использовали в качестве матрицы в дополнительной РСК в присутствии праймеров ЕРЕ2 и ЕРК2 (соответствующие нуклеотидные последовательности праймеров ЕРЕ2 и ЕРК2 показаны в 8ЕО. ΙΌ Νοδ. 37 и 38 списка последовательностей). Амплифицированные фрагменты ДНК извлекали из реакционной смеси, обрабатывали с помощью Ε^ΚΙ и ВатН (оба фермента от Такага 81ιιιζο Οο., Ыб.) и затем подвергали агарозному электрофорезу для извлечения фрагмента ДНК около 520 п.н., который содержит область, кодирующую эритропоэтин. Полученный итоговый фрагмент смешивали с плазмидным вектором рΤV118N (Такага 81ιιιζο Сс., Ыб.), который обрабатывали с помощью Ε^ΚΙ (Такага 81ιιιζο Ρο., Ыб.) и ВатШ для лигирования его с данной плазмидой. Затем, этой плазмидой трансформировали Е. той 1М109. Трансформант, удерживающий вышеуказанную плазмиду, отбирали из итоговых трансформантов, чтобы получить плазмиду, которую назвали плазмидой рЕРО. Затем полученную плазмиду рЕРО обрабатывали с помощью Ε^ΚΙ и 8аЛ (Такага 81ιιιζο Γο., Ыб.) и подвергали агарозному электрофорезу для извлечения фрагмента ДНК, около, 0,5 т.п.н. Этот фрагмент смешивали с плазмидным вектором рСЕХ5Х-3 (Рйагтас1а), обработанного с помощью Ε^ΚΙ и 8аП, чтобы лигировать их. Этой полученной плазмидой трансформировали Е. ^ίί 1М109. Трансформант, удерживающий вышеуказанную плазмиду, отбирали из полученных трансформантов, чтобы выделить плазмиду. Плазмида была названа р68ТБРО. Эта плазмида кодирует С8ТΕΡΟ, в которой аминокислотная последовательность эритропоэтина присоединена к С-концу глутатион-8-трансферазы, произведенной из данного вектора. Нуклеотидную последовательность, кодирующая 68ТШРО в плазмиде р68ΤΕΡΟ, показана в 8ΕΟ. ΙΌ Νο. 39 списка последовательностей.
Полипептид 68ТШРО получали с помощью следующих операций. Готовили семь культуральных пробирок, каждая содержала по 5 мл ЬВ-бульона, содержащего по 100 мкг/мл ампициллина, и Е. той 1М109, трансформированную с помощью вышеуказанной плазмиды р68ΤΕΡΟ, ΕδΟκι+Ιιιη той ^Μ109/р68ΤΕΡΟ, инокулировали в каждый бульон с последующим инкубированием при 37°С в течение ночи. Затем готовили семь 2-литровых колб Эрлен мейера, каждая содержала 500 мл этого же бульона, и в каждую колбу инокулировали порцию в 5 мл вышеуказанной культуры с последующим инкубированием при 37°С. Через 3,5 ч после начала инкубации, вносили ГРТС до конечной концентрации 1 мМ и продолжали инкубацию еще 3,5 ч. По завершению культивирования клетки извлекали из этого культурального бульона центрифугированием, суспендировали в 100 мл РВ8, содержащем 1 мМ РМ8Р и 1 мМ ЭДТА и разрушали с помощью ультразвуковой обработки. К обработанному раствору добавляли 100 мл РВ8, содержащий 1 мМ РМ8Р, 1 мМ ЭДТА и 2% Тритона Х-100. Полученную смесь ставили на лед на 30 мин и центрифугировали для получения супернатанта. Полученный супернатант фильтровали через 0,45 мкм фильтр (М1Шроге) и наносили на колонку глутатион8срНа11о5С 4В (РНагтааа, 3 мл), уравновешенную РВ8. После промывания колонки с помощью РВ8, колонку элюировали 50 мМ ТрисНС1, содержащем 10 мМ глутатиона (рН 8,0). Полученный элюат анализировали в 8Ό8полиакриламидном гелевом электрофорезе и собирали фракцию, содержащую полипептид, обладающий молекулярным весом около 44000. Эту фракцию диализовали против РВ8. Диализованный образец наносили на колонку Еекоигке О (Рйагтааа), уравновешенную РВ8. После промывания колонки с помощью РВ8, колонку элюировали с помощью РВ8, обладающего градиентом ИаС1 от 0 до 0,6М. В соответствии с тем же способом, который описан выше, эту колонку элюировали с помощью 50 мМ ТрисНС1, содержащего глутатион (рН 8,0), чтобы собрать фракцию, содержащую полипептид, обладающий молекулярным весом около 44000. Полученную фракцию с этим полипептидом подвергали ультрафильтрации с помощью Сеп1псоп 10 (Аписон) для концентрирования до около 50 мкл. Далее ее фильтровали с помощью ийгаГгее С3ОУ8ТЕЬ (М1Шроге) и полученный фильтрат подвергали гель-фильтрующей хроматографии с использованием колонки 8ирегбех 200 (РНагтааа, уравновешенная с РВ8). Элюированную фракцию, содержащую полипептид, обладающий молекулярным весом около 44 000, собирали и использовали в качестве С8Т-ЕРОполипептидного раствора в последующих экспериментах. В этом С8Т-Еро-растворе около 50% общего белка составлял С8Т-Еро.
(6) Генный перенос в клетки, экспрессирующие эритропоэтиновый рецептор.
Эффект генного переноса с использованием эритропоэтина в качестве материала, обладающего активностью, связывающей клетку, изучали с применением двух видов клеток, ТР1, которые экспрессируют эритропоэтиновый рецептор, и НЬ-60 (АТСС ССЬ-240), которые не экспрессируют этот эритропоэтиновый рецептор. В данном исследовании вышеуказанное полипептидное производное эритропоэтина (С8Т-Еро) использовали в качестве эритропоэтина, а полилизин использовали в качестве материала, связывающего ретровирус. Вначале в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), иммобилизацию на планшетах осуществляли путем использования, соответственно, 34 пмоль/см2 (1,5 мкг/см2) С8Т-Еро, полилизина (133 пмоль/см2, 10 мкг/см2), смеси С8Т-Еро (34 пмоль/см2) и полилизина (133 пмоль/см2). В каждый планшет вносили среду, содержащую 1 х 104 сГи вируса ТКИЕО и 1 х 104 клеток и этот планшет инкубировали при 37°С в течение 24 ч. В качестве среды использовали среду ЕРМП640 (содержащую 5 нг/мл СМ-СР8, 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина) для ТР-1, а для НЬ-60 использовали среду ΕΓΜΙ (И188ш, содержащую 10% РС8, 50 ед./мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина). После инкубации путем декантирования собирали не прилипшие клетки, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с планшета. Собранные клетки объединяли. Порции, соответствующие одной пятой этой полученной клеточной суспензии, переносили в два планшета, иммобилизованные с СН-296, и инкубировали в течение 24 ч. Затем среду в одной из порций заменяли вышеуказанной средой, а среду в другой порции заменяли вышеуказанной средой, содержащей С418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 8 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали. Частоту О418г-колоний (эффективность генного переноса) вычисляли на основе численностей колоний, возникающих в присутствии и отсутствии 0418.
Полученные результаты показаны на фиг.
6. На фиг. 6 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а, соответственно, на ординате указана эффективность генного переноса. В случае использования ТР-1-клеток, как показано на фиг. 6 (а), несмотря на то, что генный перенос имел место с некоторым избытком в планшете, в котором иммобилизовали только полилизин, повышенная эффективность генного переноса была получена в присутствии О8Т-Еро. С другой стороны, в случае использования НЬ-60, как показано на фиг. 6 (Ь), в присутствии О8Т-Еро повышенной эффективности генного переноса не наблюдали. Эти результаты показывают, что генный перенос, специфичный для клетки-мишени, возможен благодаря использованию эритропоэтина.
Кроме того, эксперимент по генному переносу в ТР-1-клетки осуществляли путем замены материала, связывающего ретровирус, на Н2547. В соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), иммобилизацию на планшетах осуществляли с использованием, соответственно, Н2-547 (333 пмоль/см2, 20 мкг/см2), О8Т-Еро, корреспондирующего с 34 пмоль/см2, 1,5 мкг/см2), и смеси из О8Т-Еро (34 пмоль/см2) и Н2-547 (333 пмоль/см2, 20 мкг/см2). Одновременно осуществляли контрольный эксперимент с использованием планшета с иммобилизованным В8А.
Полученные результаты показаны на фиг.
7. На фиг. 7 на абсциссе указаны используемые функциональные материалы, а на ординате, соответственно, указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 7, в случае использования Н2-547, эффективность генного переноса в ТГ-1-клетки была повышенной в присутствии 68Т-Еро.
(7) Генный перенос с использованием шариков, на которых иммобилизована смесь функциональных материалов.
Можно ли повысить эффективность инфицирования ретровирусом путем использования шариков, на которых иммобилизованы оба материала, материал, обладающий доменом, связывающим клетку, и материал, обладающий доменом, связывающим ретровирус, или не иммобилизованы - не исследовали.
Шарики, на которых иммобилизовали полипептиды, были получены в соответствии с нижеследующими операциями. В качестве шариков использовали полистироловые шарики, имеющие диаметр 1,14 мкм (Ро1уЬеа6§ Ροϊνδίνгепе М|сго5р11еге. производимые Ро1у8с1епсе). К 20 мкл 2,5%-ной суспензии вышеуказанных шариков добавляли 80 мкл этанола и 2 мл разных полипептидных растворов в РВ8, оставляя затем на ночь при 4°С. К этому добавляли В8Л и РВ8 с получением 4 мл 1%-ной суспензии В8Л/РВ8. Шарики удаляли из полученной суспензии путем центрифугирования и вновь суспендировали в 5 мл 1%-ной В8Л/РВ8. Затем полученную суспензию оставляли при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы получить суспензию шариков с иммобилизованным полипептидом. В качестве полипептидных растворов использовали 100 мкг/мл С-274, 100 мкг/мл Н-271, 100 мкг/мл СН-271, 100 мкг/мл СН-296 и смесь из 100 мкг/мл Н-271 и 10 мкг/мл С-274. В качестве контроля получали шарики, покрытые 2%-ным В8Л, в соответствии с тем же указанным способом.
Одну десятую порцию шариков, иммобилизованных полипептидом, полученных таким образом, извлекали из вышеуказанной суспензии и инкубировали при 37°С в течение ночи вместе, соответственно, с 2000 ТГ-1-клеток и с 1000 с£и супернатанта вируса ΤΚΝΕΟ. Эти клетки извлекали и суспендировали в среде КРМ1 [содержащей 10% ГС8, 5 нг/мл СМ-СГ8 (Ре1го1ес11), 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина], содержащей 0,3% Бакто-агара (Όίίοο) и высевали в 35 мл чашку на изготовленную вышеуказанную среду, содержащую 0,5% Бакто-агара. Использовали две среды, содержащие 0,75 мг/мл 6418 и без 6418. Чашку инкубировали в 5%-ном СО2 при 37°С в течение 14 дней. Колонии, которые появлялись в при сутствии 6418 и в отсутствие 6418, подсчитывали и вычисляли возникшее соотношение 6418г-колоний (эффективность генного переноса).
Полученные результаты показаны на фиг.
8. На фиг. 8 на абсциссе указан использованный материал и В 8 А, а на ординате указана эффективность генного переноса. При использовании шариков, на которых иммобилизована смесь Н271 и С-274, получали повышенную эффективность генного переноса, по сравнению с использованием шариков, на которых иммобилизовали лишь один Н-271, и шариков, на которых иммобилизовали СН-271 или СН-296, обладающих, соответственно, доменом, связывающим ретровирус, и доменом, связывающим клетку, на одной и той же молекуле.
Пример 4.
(1) Генный перенос с использованием Г6Г и С-Г6Г-А.
Эффект Г6Г (Вес1оп Оескнъоп) и полипептида, представленного в 8ЕЦ. ΙΌ Νο. 4 (СГ6Г-А), на ретровирусное инфицирование исследовали в опыте образования колоний клеток ΝΙΗ/3Τ3. А именно, оценку осуществляли в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), путем иммобилизации на планшетах, соответственно, Г6Г (132 пмоль/см2, 2,25 мкг/см2), и С-Г6Г-А (133 пмоль/см2, 6,3 мкг/см2), и иммобилизации В8А на контрольном планшете. В каждый планшет вносили 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 с£и вируса РМ5пео, и преинкубировали при 37°С в течение 30 мин с последующей тщательной отмывкой с помощью РВ8. В этот планшет вносили 2 мл среды ΌΜΕΜ, содержащей 2000 клеток ΝΙΗ/3Τ3, и инкубировали при 37°С в течение 24 ч с последующей инкубацией на селективной среде, содержащей 0,75 мг/мл 6418, в течение 10 дней. Колонии окрашивали и подсчитывали. Полученные результаты показаны на фиг. 9. На фиг. 9 на оси абсцисс указан используемый материал, а на оси ординат указано количество появившихся колоний.
Как показано на фиг. 9, в контрольном планшете, в котором иммобилизовали В 8 А, колонии не возникли. С другой стороны, при использовании планшета, иммобилизованного Г6Г и С-Г6Г-А, колонии 6418г зарегистрировали в обоих планшетах. Эти результаты показывают, что и Г6Г и С-Г6Г-А, оба, обладают доменом, связывающим ретровирус, и что СГ6Г-А, в котором был присоединен связывающий клетку домен полипептида из фибронектина, показывает наилучший генный перенос с Г6Г.
(2) Связь между концентрацией С-Г6Г-А и эффективностью генного переноса.
Эффективности генного переноса сравнивали путем использования планшетов, покрытых различными концентрациями С-Г6Г-А.
Инфицирование ретровирусом осуществляли в соответствии с теми же операциями, которые описаны в примере 4 (1), за исключением планшета, полученного с использованием 0,521 пмоль/см2 (0,0247 мкг/см2) - 5,21 пмоль/см2 (0,247 мкг/см2) С-Р6Р-А, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), и планшета, иммобилизованного В8А (контрольный планшет). После вирус-инфицирующей обработки, не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с этого планшета. Клетки, собранные таким образом, объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две части, одну половинную порцию культивировали в ΌΜΕΜ, а другую - культивировали в ΌΜΕΜ, содержащей 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней, а количество появившихся колоний подсчитывали. Соотношение численности 6418г-колоний и численности колоний, полученных в среде, не содержащей 6418, рассматривали в качестве эффективности генного переноса.
Полученные результаты показаны на фиг. 10. На фиг. 10 на оси абсцисс указаны используемые концентрации С-Р6Р-А, иммобилизованного на планшете, а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Результат контрольного планшета в эксперименте также наносили на график полипептидной концентрации от 0 пмоль/см2. Как показано на фиг. 10, эффективность генного переноса повышалась концентрационно зависимо, как увеличение концентрации иммобилизованного С-Р6Р-А.
(3) Генный перенос в НЬ-60-клетки.
Что касается инфицирования ретровирусом клетки НЬ-60 (АТСС ССЬ-240), которая не является адгезирующей клеткой, влияние присутствия разных полипептидов исследовали в соответствии с нижеследующими операциями. А именно, в каждый планшет, полученный с использованием 100 пмоль/см2 С-Р6Р-А (4,8 мкг/см2) или С-Г6Г-С81 (5,1 мкг/см2), в соответствии со способом из примера 2 (9), и контрольный планшет, на котором иммобилизовали В8А, вносили 2 мл среды ΚΡΜΙ (содержащей 10% ГС8, 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина), содержащей 1х104 с£и вируса ΤΚΝΕΟ и 2000 клеток НЬ-60, с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч. После инкубации, не прилипшие клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали пипетированием и эти клетки объединяли. Каждую 1/2 порцию полученной итоговой клеточной суспензии переносили в планшет, покрытый СН-296, инкубировали в течение 24 ч и меняли данную среду на среду ΚΡΜΙ, содержащую 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. После инкубации при 37°С в течение 12 дней подсчитывали численность появившихся колоний. Соответствующая чис ленность колоний 6418г, полученных с использованием каждого полипептида, показана на фиг. 11. На фиг. 11, соответственно, на оси абсцисс указан соответствующий функциональный материал, а на оси ординат указана численность колоний 6418г.
Как показано на фиг. 11, численность 6418г-колоний отчетливо выше при использовании для иммобилизации С-Р6Р-А или С-Р6РС81 на планшете, что свидетельствует о том, что эти полипептиды способствуют инфицированию НЬ-60-клеток ретровирусом.
(4) Генный перенос в мышиные клетки костного мозга.
Для изучения влияния Р6Р, С-Р6Р-А и СР6Р-С81 на ретровирусное инфицирование мышиных миелоидных клеток осуществляли нижеследующий эксперимент.
Мышам (С3Н/Не1) в возрасте 6-8 недель внутрибрюшинно вводили 150 мг/кг 5фторурацила (5-РИ, Аш1езсо), через 2 дня после введения выделяли бедренную и большеберцовую кость для сбора костного мозга. Полученный итоговый костный мозг подвергали центрифугированию в градиенте плотности с использованием Ысо11-Ну рас.|ие (плотность 1,0875 г/мл, Рйатшааа) для получения фракции моноядерных клеток низкой плотности, которые использовали в качестве клеток костного мозга мыши.
Полученные клетки костного мозга мыши престимулировали перед инфицированием с помощью ретровируса, в соответствии со способом по Ьизкеу с соавт. (В1оой, 80, 396 (1992)). А именно, мышиные клетки костного мозга вносили в α-МЕМ (61Ьсо), содержащую 20% РС8, 100 ед./мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-6 (тЫЬ-6, Ашдеи), 100 нг/мл рекомбинантного фактора мышиных стволовых клеток (тш8СР, Ашдеи), 50 ед./мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина при плотности клеток 1 х 106 клеток/мл, с последующей инкубацией при 37°С в течение 48 ч в 5%-ном СО2. Эти престимулированные клетки, включая и адгезированные к емкости, собирали отсасыванием с помощью пипетки.
Каждые 2 мл среды, использованной для вышеуказанной престимуляции, содержащей 1 х 106 престимулированных клеток и 1 х 104 с£и вируса РМ5пео, вносили в планшет, содержащий 236 пмоль/см2 (4 мкг/см2) Р6Р, 169 пмоль/см2 (8 мкг/см2) С-Р6Р-А или 159 пмоль/см2 (8 мкг/см2) С-Р6Р-С81, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), и в В8А-иммобилизованный планшет (контрольный планшет), с последующей инкубацией при 37°С. Через 2 ч в каждый планшет добавляли свежую среду (2 мл), содержащую то же количество вируса, с последующим продолжением инкубации в течение 22 ч. После завершения инкубации не прилипшие клетки собирали путем де59 кантирования, а клетки, адгезированные к планшету, собирали с использованием диссоциирующего клетки буфера (СОВ, не содержащий ферменты, 01Ьсо), эти клетки объединяли и дважды отмывали с помощью этого же буфера. Подсчитывали численность собранных клеток. Собранные клетки подвергали анализу на НРРСЕС (Высокопотенциальные пролиферативныеколониеобразующие клетки).
НРР-СЕС-анализ осуществляли в соответствии со способом по ВгаИ1еу с соавт. (Аи81. 1. Ехр. Вю1. МеИ 8сЦ 44, 287-293 (1966)). В качестве среды использовали среду 1%/0, 66%-ного наслоенного мягкого агара с 0418, в конечной концентрации 1,5 мг/мл или без него. К нему добавляли инфицированные клетки в количестве 1 х 104 клеток/лунку, с последующей инкубацией при 37°С в течение 13 дней в 10%-ном С02. После завершения инкубации колонии, которые возникали, наблюдали под инверсионным микроскопом и подсчитывали численность высокоплотных колоний (обладающие диаметром не менее чем 0,5 мм), полученных в НРРСЕС, для вычисления частоты встречаемости (эффективность генного переноса) О418гколоний. Полученные результаты показаны на фиг. 12. На фиг. 12 на оси абсцисс указан используемый функциональный материал и В 8 А, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 12, на планшетах, покрытых с помощью В8А в качестве контроля, С418г-колонии не возникают, тогда как при использовании планшетов, на которых иммобилизовали вышеуказанные полипептиды, получали О418г-колонии. Эффективности генного переноса были повышены на порядок для ЕОЕ, СЕ0Е-А и С-Е0Е-С81, что дает основание полагать, что наличие адгезирующего соответствующую клетку домена, полученного из фибронектина, и полипептида С8-1, который обладает активностью домена, связывающегося с клетками, повышает инфицирование клеток костного мозга с помощью ретровируса.
(5) Связь между концентрацией С277Со1У, используемого для иммобилизации на планшете, и эффективность генного переноса.
Эффективность генного переноса сравнивали путем использования планшетов, покрытых различными концентрациями С277-Со1У, в соответствии с нижеследующими операциями. Соответствующие планшеты готовили в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), применяя 0,1 пмоль/см2 (0,1 мкг/см2) - 416 пмоль/см2 (20 мкг/см2) С277-Со1У. 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 с£и вируса РМ5пео, вносили в соответствующие планшеты и осуществляли преинкубирование при 37°С в течение 30 мин с последующим тщательным отмыванием с помощью РВ8. В каждый планшет вносили 2 мл среды ЭМЕМ, содержащей 2000 клеток МН/3Т3, и такой планшет инкубировали при 37°С в течение 24 ч.
Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, адгезированные с планшетом, собирали путем трипсиновой обработки для их отделения от планшета и эти клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины и одну половинную порцию культивировали в ЭМЕМ, а другую порцию инкубировали в ЭМЕМ, содержащей 0418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл при 37°С в течение 10 дней, а численность появляющихся колоний подсчитывали. Соотношение численности О418г-колоний и численности колоний, полученных в среде, не содержащей 0418, брали в качестве эффективности генного переноса. Полученные результаты показаны на фиг. 13. На фиг. 13 на абсциссе указан используемый функциональный материал, а на ординате указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 13, при использовании иммобилизованного С277-Со1У планшета, эффективность генного переноса была повышена в зависимости от концентрации С277-Со1У, используемого для иммобилизации.
(6) Генный перенос с использованием полилизина.
Связывание полилизина |(Бу8)п| исследовали в нижеследующих операциях. В качестве полилизина использовали поли-Ь-лизиингидробромид (молекулярный вес: 50000-100000, \Уако Риге Скет1са1) и в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), его иммобилизовали на планшете путем использования 133 пмоль/см2 (10 мкг/см2) раствора полилизина в РВ8. Эффективности генного переноса в этом планшете и в контрольном планшете, в котором иммобилизовали В8А, оценивали в соответствии с тем же способом, который описан в примере 4 (2). Полученные результаты показаны на фиг. 14. На фиг. 14 на оси абсцисс указан функциональный материал, а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 14, в контрольном планшете, покрытым В8А, колония не возникает, тогда как на планшете, иммобилизованном полилизином, появляются 0418г-колонии, что дает основание полагать, что после промывки ретровирус остается на планшете, потому что этот ретровирус связывается с полилизином, иммобилизованном в данном планшете.
Пример 5.
(1) Генный перенос с использованием полимера полипептида.
Перенос гена с использованием полимера полипептида осуществляли без иммобилизации полипептида в планшете. В планшет, покрытый
В8А, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), вносили 2 мл ЭМЕМ, содержащей 1000 с£и вируса РМ5пео, 2000 клеток
МН/3Т3 и соответствующий полипептид (Н61
271, СН-271, Н2-547 и СН2-826) в конечной концентрации 0,63 нмоль/мл, с последующей инкубацией в течение 24 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки для снятия их с планшета. Затем эти клетки объединяли. В качестве контроля этим же способом осуществляли этот же эксперимент без добавления какого-либо полипептида. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины и одну половинную порцию культивировали в ΌΜΕΜ. Другую порцию культивировали в ΌΜΕΜ, содержащую С418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней, а появляющиеся колонии подсчитывали. Беря соотношение численности С418г-колоний относительно численности колоний, появляющихся в данной среде без С418 в качестве эффективности генного переноса, получали результаты, показанные на фиг. 15. На фиг. 15 на оси абсцисс указан соответствующий используемый функциональный материал, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.
Как видно на фиг. 15, эффективность генного переноса в присутствии Н2-547 существенно выше, чем эффективность переноса в присутствии Н-271, а, в случае СН2-826 эффективность генного переноса равна или выше эффективности, полученной с СН-271.
Далее осуществляли более подробное исследование в соответствии с тем же способом, который описан выше, за исключением того, что в качестве полипептидов использовали СН271, СН-296 и Н2-547 в количествах 0,126 нмоль (конечная концентрация 0,063 нмоль/мл) и 1,26 нмоль (конечная концентрация 0,63 нмоль/мл) для соответствующих планшетов. Полученные результаты показаны на фиг. 16. На фиг. 16 на оси абсцисс указан используемый функциональный материал и его количества, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.
Как следует из фиг. 16, при использовании Н2-547 эффективность генного переноса была значительно выше, чем при использовании любого количества полипептида СН-271 и СН-296.
(2) Генный перенос в мышиные клетки костного мозга с использованием Η28-573.
Для изучения влияния Η28-573 на ретровирусное заражение клеток костного мозга осуществили эксперимент генного переноса в мышиные клетки костного мозга в соответствии с тем же способом, который описан в примере 4 (4).
Мышиные клетки костного мозга получали в соответствии с тем же способом, который описан в вышеприведенном примере, и полученные клетки престимулировали.
В качестве планшетов для ретровирусного инфицирования кроме планшета, иммобилизо ванного Η28-573 (160 пмоль/см2, 10 мкг/см2), планшета, иммобилизованного СН-296 (132 пмоль/см2, 6,3 мкг/см2), в качестве контроля использовали планшет, иммобилизованный В8А. Соответствующие результаты, полученные в №Р-СРС-анализе показаны на фиг. 17. На фиг. 17 на оси абсцисс указан используемый функциональный материал, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 17, на планшете, покрытом В8А в качестве контроля, высокоплотностные колонии С418г не появляются. Хотя на планшете, иммобилизованном СН-296, получали около 50% эффективности генного переноса, высокоплотностные колонии С418г были получены с повышенной эффективностью в случае использования планшета, иммобилизованного Η28-573.
Пример 6.
(1) Генный перенос с использованием функционального материала без иммобилизации.
Влияние на эффективность ретровирусного инфицирования при наличии полипептида в планшете без иммобилизации исследовали следующим образом. А именно, в каждый планшет, покрытый В8А, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), вносили 2 мл среды ΌΜΕΜ, содержащей 100 с£и вируса РМ5пео, 2000 клеток ΝΙΗ/3Τ3 и СН-296 в конечной концентрации 10, 40, 250 мкг/мл (каждая, соответствующая 0,158, 0,632 и 3,950 нмоль/мл), с последующей инкубацией в течение 24 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а прилипшие к планшету клетки собирали путем трипсиновой обработки для отделения их от данного планшета. Эти клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию переносили в 10 см чашку для культивирования клеток с последующей инкубацией в течение 24 ч. Имеющуюся среду меняли на ΌΜΕΜ, содержащую С418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл, с последующей инкубацией в течение еще 10 дней. В качестве контроля отдельно готовили планшет без СН-296 и планшет, в которой иммобилизовали 32 пмоль/см2 (2 мкг/см2) или иммобилизовали 127 пмоль/см2 (8 мкг/см2) СН-296, и осуществляли вышеуказанные операции путем добавления вирусного супернатанта и клеток к нему. Подсчитывали численность С418г-колоний, полученных таким образом, и результаты суммировали в табл. 1.
Таблица 1
| Планшет | СН-296 | Численность С418г-колоний |
| В8А | - | 5 |
| В8А | 10 мкг/мл | 41 |
| В8А | 40 мкг/мл | 66 |
| В8А | 250 мкг/мл | 92 |
| СН-296 (32 пмоль/см2) | - | 55 |
| СН-296 (127 пмоль/см2) | - | 47 |
Как показано в табл. 1, при совместном присутствии в растворе клеток, вируса и СН296, численность С418'-колоний значительно повышалась по сравнению с отсутствием СН296. Эта численность была равной или выше численности, полученной при использовании соответствующего планшета, покрытого СН296. Кроме того, при добавлении раствора СН296 с вышеуказанными соответствующими концентрациями в планшет, покрытый Β8А, и после его отстаивания в течение некоторого времени, промывания планшета и использования в эксперименте по вирусному инфицированию, численность полученных С418'-колоний была аналогичной той, которую получали в случае без добавления СН-296. Из этого следует, что СН-296 не связывается с иммобилизованным Β8А. По этой причине предполагается, что вышеуказанное ретровирусное инфицирование, усиливающие эффект СН-296 не связано с адгезией СН-296 в данном растворе с планшетом во время инкубации.
(2) Генный перенос с использованием функционального материала без иммобилизации.
Влияние на эффективность ретровирусного инфицирования при совместном присутствии полипептида в планшете без иммобилизации исследовали следующим образом. А именно, в каждый планшет, покрытый Β8А, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), вносили 2 мл среды ЭМ ЕМ, содержащей 1000 сЕи вируса РМ5пео, 2000 клеток МШ3Т3 и СЕСЕ-А, αΐν и С277-Сο1ν, соответственно, в конечной концентрации 1,67 нмоль/мл, с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а прилипшие к планшету клетки собирали путем трипсиновой обработки для отделения их от планшета. Эти клетки объединяли. Полученную итоговую клеточную суспензию делили на две половины, одну половинную порцию культивировали с ИМЕМ, а другую порцию культивировали с ИМЕМ, содержащей С418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней и подсчитывали численность появляющихся колоний. Соотношение численности С4181колоний и численности колоний, полученных в среде, не содержащей С418, рассматривали в качестве эффективности генного переноса. Полученные результаты показаны на фиг. 18. На фиг. 18 на оси абсцисс указаны соответствующие используемые функциональные материалы, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 18, когда вирусное инфицирование имеет место в присутствии каждого полипептида, получают более высокую эффективность генного переноса. Таким образом понятно, что даже когда эти полипептиды не иммобилизованы на планшетах, инфицирование соответствующим ретровирусом усиливается.
(3) Генный перенос в не адгезированные клетки путем использования функционального материала без иммобилизации.
Влияние на эффективность генного переноса в не адгезированные клетки с помощью полипептида без иммобилизации исследовали следующим образом. А именно, в каждый планшет, приготовленный с помощью 333 пмоль/см2 (10 мкг/см2) Н-271 и в соответствии с тем же способом, описанным в примере 2 (9), и в контрольный планшет, в который иммобилизовали Β8А, вносили 2 мл среды КΡΜI (содержащей 5 нг/мл СМ-СЕ8, 50 единиц/мл пенициллина и 50 мг/мл стрептомицина), содержащую 1 х 104 сЕи вируса ТКИЕО и 1 х 104 клеток из ТЕ1-клеток. В соответствующий планшет, иммобилизованный Β8А, вносили затем Н-271 в конечной концентрации 50 мкг/мл (1,67 нмоль/мл) Н-271. Каждый планшет инкубировали при 37°С в течение 24 ч. После инкубации собирали не адгезированные клетки, а клетки, прилипшие к данному планшету, собирали путем трипсиновой обработки. Эти клетки объединяли. Каждую 1/5 порцию из этой итоговой клеточной суспензии переносили в два планшета, покрытые СН296, инкубировали в течение 24 ч. В одном планшете имеющуюся среду меняли на вышеуказанную среду, а среду из другого планшета меняли на вышеуказанную среду, содержащую С418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. После инкубации при 37°С в течение 8 дней, подсчитывали численность появляющихся колоний. Соответствующую частоту встречаемости (эффективности генного переноса) вычисляли на основе численности колоний, появляющихся в присутствии или отсутствии С418. Полученные результаты показаны на фиг. 19. На фиг. 19 на оси абсцисс указан используемый материал и его форма, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 19, при использовании не иммобилизованного Н-271, получают более высокую эффективность генного переноса, чем ту, которую получают при использовании иммобилизованного Н-271. Следовательно, показано, что при использовании Н-271 для генной трансдукции ТЕ-1-клеток, не иммобилизованное состояние предпочтительней.
(4) Объяснение механизма ретровирусного заражения, усиленное с помощью полипептида.
Чтобы выяснить каким образом усиливается ретровирусное инфицирование клеток с помощью полипептида без иммобилизации, как показано в вышеприведенном примере, получаемое за счет связывания соответствующих клеток с данным полипептидом и связывания данного полипептида с соответствующим ретровирусом, осуществляли нижеследующий эксперимент. Во-первых, в иммобилизованные Β8А планшеты, полученные по способу, опи санному в примере 2 (9), вносили 2 мл ΌΜΕΜ, содержащие 1000 клеток из клеток ΝΙΗ/3Τ3, с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч. Эту среду удаляли из планшетов, и в каждый вносили 2 мл 1,67 нмоль/мл, соответственно, Н-271, СН-271, С-Р6Р-А и в качестве контроля ΡΒ8, с последующей инкубацией при 37°С в течение 2,5 ч. Эти планшеты промывали уравновешенным солевым раствором Хэнкса (ΗΒ88, 61Ьсо), содержащем 25 мМ ΗΕΡΕ8. В каждый из планшетов вносили 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 сГи вируса РМ5пео, с последующей инкубацией при 37°С в течение 30 мин. Затем эти планшеты промывали с помощью ΡΒ8. В каждый из этих планшетов вносили 2 мл ΌΜΕΜ, с последующей инкубацией при 37°С в течение 24 ч. Не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали путем трипсиновой обработки, чтобы отделить их от планшета. Эти клетки объединяли соответственно. Каждую клеточную суспензию, полученную таким образом, делили на две половины, одну половинную порцию культивировали с ΌΜΕΜ, а другую порцию культивировали с ΌΜΕΜ, содержащую 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл. Обе порции инкубировали при 37°С в течение 10 дней и численность появляющихся колоний подсчитывали. Соотношение численности 6418г-колоний и численности колоний, полученной в среде, не содержащей 6418, рассматривали в качестве эффективности генного переноса. Полученные результаты показаны на фиг. 20. На фиг. 20 на оси абсцисс указаны используемые функциональные материалы и контроль, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 20, когда вирусное заражение осуществляли после обработки соответствующих клеток данного планшета с помощью соответствующего вышеуказанного полипептидного раствора, наблюдали отчетливое повышение эффективности инфицирования. Это позволяет предполагать, что эффективность инфицирования повышается, благодаря связыванию данного полипептида с клетками и последующему связыванию ретровируса с данным полипептидом в клетках.
Осуществляли подобный эксперимент, за исключением того, что вносимый полипептид заменяли, соответственно, на 0,29 нмоль/мл СР6Р-А и 0,79 нмоль/мл СН-296. Полученные результаты показаны на фиг. 21. На фиг. 21 на оси абсцисс указаны используемые функциональные материалы и контроль, а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Как показано на фиг. 21, повышение эффективности генного переноса наблюдали в случае СР6Р-А и СН-296. Таким образом, вышеуказанная активность была подтверждена в С-Р6Р-А. Вместе с тем, было показано, что СН-296 обладает той же активностью, способствующей заражению ретровирусом, по тому же механизму.
Пример 7.
(1) Генный перенос с использованием функционального материала, иммобилизованного на шариках.
Действительно ли эффективность инфицирования ретровирусом могла бы быть повышена при использовании шариков, покрытых соответствующим функциональным материалом, или нет, исследовали в соответствии с нижеследующими операциями. В качестве шариков применяли полистироловые шарики, обладающие диаметром 1,14 мкм (ГоЕЪеаШ Ρо1у8ΐу^еηе ΜκΐΌ8ρ^Γ€, выпускаемые Ρо1у8с^еηсе). К 20 мкл 2,5%-ной суспензии вышеуказанных шариков добавляли 80 мкл этанола и сюда же добавляли 2 мл 40 мкг/мл СН-296 и оставляли на ночь при 4°С. К этому добавляли Β8Α и ΡΒ8 для получения 1%-ной суспензии Β8Α/ΡΒ8 (4 мл), шарики извлекали центрифугированием и снова получали 5 мл 1%-ной суспензии Β8Α/ΡΒ8, оставляемой при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы получить суспензию из шариков, иммобилизованных СР-296. В соответствии с этим же способом готовили шарики в качестве контроля за исключением того, что иммобилизацию осуществляли с использованием 2% Β8Α, вместо раствора из СН-296.
Из вышеуказанной суспензии отбирали одну десятую порцию (0,5 мл) и данные шарики извлекали центрифугированием. Сюда же вносили ΌΜΕΜ, содержащую 1000 сГи вируса РМ5пео, с последующей инкубацией при 37°С в течение 30 мин. Эти шарики дважды промывали с помощью 1% Β8Α/ΡΒ8, суспендировали в 2 мл ΌΜΕΜ, 1 мл из которой переносили на планшет. Сюда же добавляли 1 мл ΌΜΕΜ, содержащей 3 х 105 клеток, из клеток ΝΙΗ/3Τ3 с последующей инкубацией в СО2-инкубаторе при 37°С в течение 24 ч. Вслед за этим данную среду меняли на ΌΜΕΜ, содержащую 6418 в конечной концентрации 0,75 мг/мл с последующей инкубацией в течение еще 10 дней. Колонии, которые появлялись, окрашивали и подсчитывали. Полученные результаты показаны в табл. 2. Как показано в табл. 2, если использовали шарики, покрытые СН-296, появлялось 264 6418г-колонии, тогда как в случае использования шариков, покрытых Β8Α в качестве контроля, резистентные колонии не получали. Это дает основание полагать, что даже иммобилизация СН-296 на шариках влияет, как и в случае иммобилизации в планшете, на увеличение эффективности ретровирусного инфицирования.
Таблица 2
| Шарики | Число 6418г-колоний |
| Иммобилизованные Β8Α (контроль) | 0 |
| Иммобилизованные СН-296 | 264 |
(2) Генный перенос в мышиные клетки костного мозга, на которых иммобилизовали функциональный материал.
Способность повышать эффективность ретровирусного инфицирования мышиных клеток костного мозга с помощью шариков, покрытых соответствующим функциональным материалом, исследовали в соответствии с нижеследующими операциями.
Мышиные клетки костного мозга готовили в соответствии с тем же способом, который описан в примере 4 (4) и престимулировали.
В каждый планшет, покрытый В8А, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), и в аналогичный планшет, покрытый с помощью В8А, с 1/10 порцией шариков, иммобилизованных СН-296, полученных в примере 7 (1), вносили 2 мл соответствующей среды, используемой для вышеуказанной престимуляции, содержащей 1 х 106 престимулированных клеток и 1 х 104 с£и вируса РМ5иео, с последующей инкубацией при 37°С. Через 2 ч в каждый планшет вносили свежее количество среды (2 мл), содержащей то же количество вируса, с последующей инкубацией в течение 22 ч. После завершения инкубации не адгезированные клетки собирали путем декантирования, а клетки, прилипшие к планшету, собирали с использованием буфера, диссоциирующего клетки (СОВ, не содержащего ферментов, 61Ьсо), эти клетки объединяли и дважды промывали этим же буфером.
Подсчитывали численность полученных клеток. Собранные клетки подвергали НРРСРС-анализу, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 4 (4).
Полученные результаты показаны на фиг. 22. На фиг. 22 на оси абсцисс указан используемый функциональный материал и его форма, а на оси ординат указана эффективность генного переноса. Как показано в данных результатах, понятно, что эффективность инфицирования мышиных клеток костного мозга ретровирусом также можно повысить при использовании шариков, иммобилизованных СН-296.
Пример 8.
(1) Генный перенос с использованием Н271 и СН-271.
Влияние Н-271 на ретровирусное инфицирование оценивали путем преинкубирования вирусного супернатанта в планшетах, покрытых Н-271 и СН-271, которые, соответственно, способствуют ретровирусному инфицированию, затем планшеты тщательно промывали, определяя остающееся количество соответствующего вируса путем анализа образующих колонию клеток МН/3Т3, и сравнивали полученные результаты в обоих планшетах. А именно, в соответствии с тем же способом, который описан в примере 2 (9), планшеты готовили с различными концентрациями, соответственно, Н-271 [от 67 пмоль/см2 (2 мкг/см2) до 333 пмоль/см2 (10 мкг/см2) ] и СН-271 [от 67 пмоль/см2 (4 мкг/см2) до 333 пмоль/см2 (20 мкг/см2)]. В каждый планшет вносили 2 мл вирусного супернатанта, содержащего 1000 с£и вируса РМ5иео, и преинкубировали при 37°С в течение 30 мин, с последующей тщательной промывкой с помощью РВ8. В этот планшет вносили 2 мл среды ΌΜΕΜ, содержащей 2000 клеток МН/3Т3, и инкубировали при 37°С в течение 24 ч, с последующей инкубацией на селективной среде, содержащей 0,75 мг/мл 6418, в течение 10 дней. Колонии окрашивали и подсчитывали. Полученные результаты показаны на фиг. 23. Фиг. 23 представляет собой график, иллюстрирующий связь между функциональным материалом и эффективностью переноса гена. На фиг. 23, на оси абсцисс указано количество используемого функционального материала, а на оси ординат указано количество 6418г-колоний.
Как показано на фиг. 23, при использовании иммобилизованного С-271 планшета, количество появляющихся 6418г-колоний было одним и тем же, невзирая на концентрацию соответствующего полипептида. С другой стороны, в случае Н-271, количество возникающих колоний повышалось в зависимости от соответствующей концентрации, как увеличения в концентрации данного полипептида, используемого для иммобилизации и в случае планшета приготовленного с 333 пмоль/см2 Н-271, количество возникших колоний было почти тем же, что и с СН-271. Это дает основание полагать, что с СН271 может быть получена эквивалентная эффективность вирусного инфицирования при достаточном количестве Н-271, иммобилизованном на планшете.
(2) Генный перенос с использованием СР6Р-А.
Влияния С-Р6Р-А на ретровирусное инфицирование исследовали в опыте с МН/3Т3клеточной колонией. А именно, оценку осуществляли в соответствии с тем же способом, который описан в примере 8 (1), за исключением того, что использовали планшеты, приготовленные с 127 пмоль/см2 (6 мкг/см2) с-Р6Р-А, 127 пмоль/см2 (7,6 мкг/см2) СН-271 и 127 пмоль/см2 (8 мкг/см2) СН-289, в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9), и контрольный планшет, в которой иммобилизован В8А. Полученные результаты показаны на фиг. 24. Фиг. 24 представляет собой график, иллюстрирующий связь между функциональными материалами и эффективностями генного переноса. На фиг. 24 на оси абсцисс указаны функциональные материалы и В8А, а на оси ординат указана эффективность генного переноса.
Как показано на фиг. 24, в контрольном планшете, в которой иммобилизован В8А, колония не возникает. С другой стороны, при использовании планшета, в котором иммобилизован С-Р6Р-А, подтверждалось появление 6418гколоний, а численность этих колоний была той же, что и на планшетах с использованием СН271 и СН-296. Это предполагает, что домен, связывающий ретровирус, обладающий фактически теми же функциями, что и домены СН271 и СН-296, присутствует в молекуле ЕСЕ.
(3) Генный перенос с использованием СЕСЕ-СБ1.
Влияния полипептида С-ЕСЕ-СБ1 на ретровирусное инфицирование исследовали в соответствии с нижеследующими операциями. А именно, анализ МН/3Т3-клеточной колонии осуществляли в соответствии с тем же способом, который описан в примере 8 (1), благодаря использованию планшетов, приготовленных, соответственно, с 133 пмоль/см2 С-ЕСЕ-СБ1 (6,7 мкг/см2), С-ЕСЕ-А (6,3 мкг/см2), СН-271 (8 мкг/см2) и СН-296 (8,4 мкг/см2), в соответствии со способом, описанным в примере 2 (9). Полученные результаты показаны на фиг. 25. Фиг. 25 представляет собой график, иллюстрирующий связь между соответствующими функциональными материалами и эффективностями переноса соответствующего гена. На фиг. 25 на оси абсцисс указаны используемые функциональные материалы, а на оси ординат указано число С418г-колоний.
Как показано на фиг. 25, почти та же численность колоний, возникающих на планшетах, в которых эти четыре полипептида были, соответственно, иммобилизованы, свидетельствует, что молекула С-ЕСЕ-СБ1 обладает активностью, связывающей ретровирус, эквивалентной активностям других полипептидов.
(4) Генный перенос с использованием С277-Со1У.
Влияния С277-Со1У на ретровирусное инфицирование оценивали в соответствии с тем же способом, что и в примере 8 (1), благодаря использованию планшеты, приготовленной со 124 пмоль/см2 (6,4 мкг/см2) С277-Со1У и контрольным планшетом, в которой иммобилизован ВБА. Полученные результаты показаны на фиг. 26. Фиг. 26 представляет собой график, иллюстрирующий связь между соответствующим функциональным материалом и эффективностью генного переноса. На оси абсцисс указан соответствующий используемый функциональный материал и ВБА, а на оси ординат указано число С418г-колоний.
Как показано на фиг. 26, в контрольном планшете, покрытом с помощью ВБА, колония не возникает. С другой стороны, при использовании планшета, иммобилизованного С277Со1У, С418г-колонии возникают. Это свидетельствует о том, что соответствующий ретровирус, остающийся в планшете после отмывки, содержит домен, связывающий вирус в Со1Умолекуле.
Как описано выше, в настоящем изобретении создали способ для эффективного генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса. Когда данный способ настоящего изобре тения осуществляли путем подбора материала, связывающего клетку, подходящего для клетокмишеней, трансформированные клетки-мишени можно удобно получать с высокой эффективностью генного переноса без какой-либо потребности в специальном ретровирусном векторе. При пересадке этих трансформированных клеток позвоночным, легко получать трансформированных животных, и настоящее изобретение пригодно для различных технических областей, таких как медицинские науки, технология клетки, генная инженерия и технология развития. Кроме того, в настоящем изобретении разработали культуральную среду, содержащую соответствующий функциональный материал или его смесь, и набор реагентов для осуществления опосредованного ретровирусом генного переноса в клетки-мишени. Благодаря использованию этой культуральной среды и набора, можно легко и эффективно осуществлять локализацию ретровируса, трансдукцию экзогенного гена в клетки-мишени и тому подобное.
Краткое пояснение чертежей
Фиг. 1 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью фактора роста фибробластов, функционального материала, содержащего этот фактор роста фибробластов и смеси данного фактора роста фибробластов и адгезирующего соответствующую клетку доменного полипептида фибронектина.
Фиг. 2 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью фактора роста фибробластов, смеси фактора роста фибробластов и полипептида домена адгезии клетки фибронектина и адгезирующего соответствующую клетку доменного полипептида фибронектина.
Фиг. 3 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью коллагенового фрагмента, смеси из связывающего клетку доменного полипептида фибронектина и коллагенового фрагмента, функционального материала, содержащего этот коллагеновый фрагмент, и смеси из связывающего клетку доменного полипептида фибронектина.
Фиг. 4 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью фибронектинового фрагмента и смеси из этого фибронектинового фрагмента и связывающего клетку доменного полипептида фибронектина.
Фиг. 5 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью связывающего клетку доменного полипептида фибронектина, полилизина, смеси полилизина и связывающего клетку доменного полипептида фибронектина, фибронектинового фрагмента и смеси фибронектинового фрагмента и связывающего клетку доменного полипептида фибронектина.
Фиг. 6 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью эритропоэтинового производного, полилизина и смеси из эритропоэтинового производного и полилизина.
Фиг. 7 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью эритропоэтинового производного, полимерного фрагмента фибронектина и смеси из данного эритропоэтинового производного и данного полимерного фрагмента фибронектина.
Фиг. 8 представляет собой график, иллюстрирующий эффективности генного переноса в соответствующие клетки-мишени с помощью шариков, на которых иммобилизован фибронектиновый фрагмент, соответствующие шарики, на которых иммобилизован связывающий клетку доменный полипептид фибронектина, и шарики, на которых иммобилизована смесь из фибронектинового фрагмента и связывающего клетку доменного полипептида фибронектина.
Фиг. 9 представляет собой график, иллюстрирующий трансформацию клеток-мишеней с помощью фактора роста фибробластов и соответствующего функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов.
Фиг. 10 представляет собой график, иллюстрирующий определенную связь между количеством функционального материала, содержащего используемый фактор роста фибробластов, и эффективностью генного переноса.
Фиг. 11 представляет собой график, иллюстрирующий трансформацию клеток-мишеней с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов.
Фиг. 12 представляет собой еще один график, иллюстрирующий трансформацию клетокмишеней с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов.
Фиг. 13 представляет собой график, иллюстрирующий связь между эффективностью генного переноса в клетки-мишени и количеством функционального материала, содержащего используемый коллагеновый фрагмент.
Фиг. 14 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью полилизина.
Фиг. 15 представляет собой график, иллюстрирующий трансформацию клеток-мишеней с помощью фибронектинового фрагмента и полимерного фрагмента фибронектина.
Фиг . 16 представляет собой еще один график, иллюстрирующий трансформацию клетокмишеней с помощью фибронектинового фрагмента и полимерного фрагмента фибронектина.
Фиг. 17 представляет собой еще один график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью фибронектинового фрагмента и полимерного фрагмента фибронектина.
Фиг. 18 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов, коллагеновый фрагмент и функциональный материал, содержащий этот коллагеновый фрагмент.
Фиг. 19 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью фибронектинового фрагмента.
Фиг. 20 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью функционального материала, содержащего фибронектиновый фрагмент и фактор роста фибробластов.
Фиг. 21 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов и фибронектиновый фрагмент.
Фиг. 22 представляет собой график, иллюстрирующий эффективность генного переноса с помощью иммобилизованных на шариках фибронектинового фрагмента.
Фиг. 23 представляет собой график, иллюстрирующий связь между количеством используемого фибронектинового фрагмента и трансдукцией гена в клетки-мишени.
Фиг. 24 представляет собой график, иллюстрирующий трансдукцию гена в клеткимишени с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов и фибронектиновый фрагмент.
Фиг. 25 представляет собой еще один график, иллюстрирующий трансдукцию гена в клетки-мишени с помощью функционального материала, содержащего фактор роста фибробластов и фибронектиновый фрагмент.
Фиг. 26 представляет собой график, иллюстрирующий трансдукцию гена в клеткимишени с помощью функционального материала, содержащего коллагеновый фрагмент.
Список последовательностей
5ЕО. ГО Νο. 1
ДЛИНА: 271
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
Не
ТНг
С1п 7а1
РНе
А1а Уа1 Рго А1а Азп
С1п ТНг
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
| Азр | С1и | Ьеи | Рго | О1п | Ьеи | Уа1 | ТНг | Ьеи | РГО ΗΪ3 Рго | Азп Ьеи Нхз |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||
| С1у | Рго | 01и | Не | Ьеи | Азр | Уа1 | Рго | Зег | ТНг | |
| 20 | 25 | |||||||||
| 5Е<2- | Ю | Νο. | 3 |
ДЛИНА: 155
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
125
130
135
Рго
Не <51п
ТНг Не
РГО
Уа1
Зег
ТНг Не
140
150
ТЫ
С1у
Ьеи
Рго
ТНг
145
160
Не
Ьеи
ТНг
155
165
Ьеи
Азп
Агп
А1а
Зег Зег Рго Уа1 Уа1 Не
А1а Зег
170
175
180
185
190
195
| МеГ 1 | А1а | А1а С1у | Зег Не ТНг ТНг Ьеи Рго А1а Ьеи Рго СНи Азр | |||||||||||
| 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| □1у | (51у | Зег | 01у | А1а | РНе | Рго | Рго | С1у | н±з | РНе | Ьуз | Азр | Рго | Ьуз |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Агд | Ьеи | Туг | Суз | Ьуз | Азп | С1у | О1у | РНе | РНе | Ьеи | Агд | Не | Н1з | Рго |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Азр | С1у | Агд | Уа1 | Азр | С1у | νβΐ | Агд | С1и | Ьуз | Зег | Азр | Рго | Нхз | Не |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Ьуз | Ьеи | С1п | Ьеи | <31п | А1а | С1и | С1и | Агд | С1у | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Ьуз |
Рго
Азп
200
С1п Рго Рго
210
205
215
220
225
С1и
Уа1
Уа1 рго
Агд Рго Агд Рго С1у Уа1 ТНг С1и А1а ТНг Не
230
235
240
245
250
255
Ьеи Ьуз
Аэп
АЗП
С1п Ьуз Зег 01и Рго Ьеи Не 01у Агд Ьуз Ьуз
260
265
270
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| <31у | Уа1 | Суз | А1а | Азп | Агд | Туг | Ьеи | А1а | мег | Ьуз | С1и | Азр | С1у | Агд |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьеи | А1а | Зег | Ьуз | Суз | Уа1 | ТНг | Азр | О1и | Суз | РНе | РНе | РНе | С1и |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| Агд | Ьеи | С1и | Зег | Азп | Азп | Туг | Азп | ТНг | Туг | Агд | Зег | Агд | Ьуз | Туг |
| но | 115 | 120 | ||||||||||||
| ТНг | Зег | Тгр | Туг | Уа1 | А1а | Ьеи | Ьуз | Агд | ТНг | С1у | О1п | туг | Ьуз | Ьеи |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| 01у | Зег | Ьуз | ТНг | О1у | Рго | С1у | С1п | Ьуз | А1а | Не | Ьеи | РНе | Ьеи | Рго |
ТНг
ЗЕЗ. Ю Νο. 2
ДЛИНА: 25
ВИД: аминокислота
140 145 150
МеГ Зег А1а Ьуз Зег
155
5Е0. Ю Νο. 4
ДЛИНА: 432
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
Рго ТНг Азр Ьеи Агд РЬе ТНг Азп 11е С1у Рго Азр ТНг МеГ Агд
10 15
Уа1 ТНг Тгр А1а Рго Рго Рго Зег 11е Азр Ьеи ТНг Азп РНе Ьеи
25 30
3Ε0. ΙΟ Νο. 5
ДЛИНА: 457
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕЛИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
Рго
Уа1
Уа1
ТЬг Азр Ьеи Агд
ТЬг Тгр А1а Рго
Агд Туг 5ег Рго
РЬе ТЬг
Рго
Рго
Азп
Вег
Не
Не
Уа1
Ьуз
АЗП
О1и
О1у
Азр
С1и
Рго
Ьеи
Азр
Азр ТЬг
ТЬг Азп
Уа1
А1а
Μβΐ Агд
РЬе Ьеи
С1и
Ьеи
Зег Не Зег Рго Зег Азр
Азп А1а νβΐ νβΐ
Ьеи
ТЬг
Азп
Ьеи
Ьеи
Рго О1у ТЬг 01и Туг Уа1
Уа1 Зег
Уа1 Зег
Зег
Уа1
Туг
С1и
О1п
ΗΪ3 01и Зег ТЬг Рго Ьеи Агд С1у
Агд О1п
Ьуз
ТЬг С1у
Ьеи
Азр
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Рго | 01у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | 11е | Зег | С1у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | νβΐ | АЗр | Туг | ТЫ | Не | ТЫ | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| С1у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | С1и | 11е | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Μβΐ | А1а | А1а | С1у | Зег | Не | ТЫ | ТЫ |
| 275 | 280 | 285 |
ТЬг
А1а Азп
Зег
РЬе
Зег Рго ТЬг С1у 11е Азр РЬе Зег
Азр Не
ΊΊ
Ί8
| Ьеи | Рго А1а | Ьеи | Рго 290 | С1и Азр С1у О1у | Зег С1у А1а РЬе 295 | Рго | Рго 300 | |||||||
| <31у | Нхз | РЬе | Ьуз | Азр | Рго | Ьуз | Агд | Ьеи | Туг | Суз | Ьуз | Азп | С1у | С1у |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| РЬе | РЬе | Ьеи | Агд | Не | Ηί3 | Рго | Азр | С1у | Агд | νβΐ | Азр | С1у | Уа1 | Агд |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| О1и | Ьуз | Зег | Азр | РГО | Ηί5 | Не | Ьуз | Ьеи | С1п | Ьеи | С1п | А1а | С1и | С1и |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Агд | С1у | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Ьуз | С1у | νβΐ | Суз | А1а | Азп | Агд | Туг | Ьеи |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| А1а | Меб | Ьуз | С1и | Азр | О1у | Агд | Ьеи | Ьеи | А1а | Зег | Ьуз | Суз | Уа1 | ТЬг |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| Азр | С1и | Суз | РЬе | РЬе | РЬе | С1и | Агд | Ьеи | О1и | Зег | Азп | Азп | Туг | Азп |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| ТЬг | Туг | Агд | Зег | Агд | Ьуз | Туг | ТЬг | Зег | Тгр | Туг | νβΐ | А1а | Ьеи | Ьуз |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||
| Агд | ТЬг | С1у | σΐη | Туг | Ьуз | Ьеи | С1у | Зег | Ьуз | ТЬг | С1у | Рго | С1у | С1п |
| 410 | 415 | 420 | ||||||||||||
| Ьуз | А1а | Не | Ьеи | РЬе | Ьеи | Рго | Меб | Зег | А1а | А1а | Зег | Азр | О1и | Ьеи |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| Рго | О1п | Ьеи | Уа1 | ТЬг | Ьеи | Рго | Нхз | Рго | Азп | Ьеи | Нхз | 01у | Рго | С1и |
| 440 | 445 | 450 |
3Εζ). Ю Νο. 7
ДЛИНА: 464
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
| Рго | ТЬг | Азр | Ьеи | Агд | РЬе | ТЬг | Азп | Не | С1у | Рго | Азр | ТЬг | Меб | Агд |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| ν31 | Агд | Туг | Зег | Рго | νβΐ | Ьуз | Азп | С1и | О1и | Азр | Уа1 | А1а | <Э1и | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | (Пу | ТЫ | 01и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | 7а1 | Туг | С1и | С1п |
| 65 | 70 | 75 |
| Нхз | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | О1у | Агд | С1п | Ьуз | ТЬг | С1у | Ьеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | С1у | Не | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЫ | Уа1 | Нхз | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЫ | Не | ТЫ | С1у | Туг | Агд |
Не Ьеи Азр Уа1 Рго Зег ТЬг
455
5Е2- 10 Νο. 6
ДЛИНА: 186
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
| О1у 1 | Х1е Агд О1у | Ьеи Ьуз С1у ТЬг Ьуз С1у | С1и | Ьуз С1у <31и | Азр 15 | |||||||||
| 5 | 10 | |||||||||||||
| С1у | РЬе | Рго | С1у | РЬе | Ьуз | О1у | Азр | Меб | С1у | Не | Ьуз | С1у | Азр | Агд |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| О1у | 01и | 11е | С1у | Рго | Рго | 61у | Рго | Агд | О1у | С1и | Азр | С1у | Рго | С1и |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| <31у | Рго | Ьуз | <31у | Агд | С1у | С1у | Рго | Азп | С1у | Азр | Рго | 01у | Рго | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| С1у | Рго | Рго | С1у | С1и | Ьуз | С1у | Ьуз | Ьеи | С1у | νβΐ | Рго | О1у | Ьеи | Рго |
7075
О1у Туг Рго С1у Агд С1п С1у Рго Ьуз С1у Зег Не С1у РЬе Рго
8590
01у РЬе Рго С1у А1а Азп О1у С1и Ьуз С1у С1у Агд С1у ТЬг Рго
100105
С1у Ьуз Рго О1у Рго Агд С1у О1п Агд С1у Рго ТЬг С1у Рго Агд
110 115120
С1у С1и Агд С1у Рго Агд О1у 11е ТЬг С1у Ьуз Рго С1у Рго Ьуз
125 130135
С1у Азп Зег <31у 01у Азр <31у Рго А1а С1у Рго Рго 61у С1и Агд
140 145150
О1у Рго Азп О1у Рго С1п С1у Рго ТЫ С1у РЬе Рго С1у Рго Ьуз
155 160165
С1у Рго Рго О1у Рго Рго С1у Ьуз Азр С1у Ьеи Рго С1у Нхз Рго
170 175180
С1у «31п Агд С1у <31и ТЬг
185
110 115120
II® Агд ΗΪ3 Нхз Рго О1и Нхз РЬе Зег С1у Агд Рго Агд С1и Азр
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | νβΐ | Рго | Нхз | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТЫ | Ьеи | ТЫ | Азп | Ьеи | ТЫ |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | <31у | ТЬг | б1и | Туг | ν»ι | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | С1у | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| С1и | С1и | 2ег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | 31у | 01п | 01п | Зег | ТЬг | νβΐ | 5ег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| νβΐ | Рго | Агд | Азр | Ьеи | <31и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЫ | Рго | ТЫ | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | 11е | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | νβΐ | ТЬг | νβΐ | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Не | ТЬг | Туг | 01у | С1и | ТЬг | С1у | 01у | Азп | 5ег | Рго | νβΐ | С1п | С1и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Рго | С1у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | С1у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | νβΐ | Азр | Тут | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | νηΐ | ТЬг | С1у | Агд |
245 250 255
| С1у | Азр 5ег | РГО | А1а 260 | Зег Зег Ьуз | Рго Не Бег 11е Азп Туг Агд | |||||||||
| 265 | 270 | |||||||||||||
| ТЫ | С1и | Не | Азр | Ьуз | РГО | Бег | Мег | СХу | 1Хе | Агд | СХу | Ьеи | Ьуз | СХу |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| ТЬг | ьуз | С1у | СХи | Ьуз | С1у | С1и | Азр | СХу | РЬе | Рго | СХу | РЬе | Ьуз | СХу |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| Азр | Ме-е | СХу | 11е | Ьуз | СХу | Азр | Агд | СХу | СХи | Х1е | СХу | РГО | Рго | СХу |
| 305 | 3X0 | 315 | ||||||||||||
| Рго | Агд | СХу | С1и | Азр | СХу | Рго | С1и | СХу | Рго | Ьуз | С1у | Агд | СХу | СХу |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| Рго | Азп | С1у | Азр | Рго | СХу | Рго | Ьеи | С1у | Рго | Рго | С1у | С1и | ьуз | СХу |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Ьуз | ьеи | С1у | Уа1 | Рго | СХу | Ьеи | Рто | С1у | Туг | Рго | СХу | Агд | СХп | СХу |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| Рго | Ьуз | С1у | Бег | Не | СХу | РЬе | Рго | СХу | РЬе | Рго | СХу | АХа | Азп | С1у |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| СХи | Ьуз | С1у | СХу | Агд | СХу | ТНг | Рго | СХу | Ьуз | Рго | СХу | Рго | Агд | СХу |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| С1п | Агд | С1у | Рго | ТНг | С1у | Рго | Агд | СХу | СХи | Агд | С1у | Рго | Агд | С1у |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||
| Не | ТНг | С1у | Ьуз | Рго | СХу | Рго | Ьуз | С1у | Азп | Бег | СХу | С1у | Азр | СХу |
| 410 | 4X5 | 420 | ||||||||||||
| Рго | А1а | О1у | Рго | Рго | СХу | СХи | Агд | С1у | Рго | Азп | СХу | Рго | СХп | СХу |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| Рго | ТЬг | СХу | РЬе | Рго | С1у | Рго | Ьуз | СХу | Рго | Рго | СХу | Рго | Рго | СХу |
440
445
450
Ьув Азр СХу Ьеи Рго С1у Нхз Рго С1у С1п Агд 01 у С1и ТНг
455 460
БЕО. 10 Νο. 8
ДЛИНА: 4Э9
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
| Рго | ТЫ | Азр | Ьеи | Агд | РЬе | ТЬт | Азп | 11е | С1у | Рго | Азр | ТЫ | МеС | Агд |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| УаХ | ТЬг | Тгр | АХа | Рго | Рго | РГО | Зег | ХХе | Азр | Ьеи | ТЬт | Азп | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Туг | Бег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | С1и | С1и | Азр | Уа1 | АХа | СХи | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | ТХе | Зег | Рго | Бег | Азр | Азп | АХа | Уа1 | УаХ | Ьеи | ТЬт | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | СХу | ТНг | С1и | Туг | Уа1 | УаХ | Бег | УаХ | Бег | Бег | УаХ | Туг | СХи | С1п |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Ηί£ | СХи | Зег | ТЫ | Рго | Ьеи | Агд | СХу | Агд | СХп | Ьуз | ТЬг | СХу | Ьеи | Азр |
| во | 85 | 90 | ||||||||||||
| Бег | Рго | ТНг | С1у | Не | Азр | РЬе | Бег | Азр | Не | ТЬт | АХа | Адп | Бег | РЬе |
100 105
| ТЬг | Уа1 Н1з | Тгр | Не 110 | А1а Рго Агд А1а ТНг 115 | Не | ТНг | С1у | Туг | Агд 120 | |||||
| Не | Агд | НХз | Н1з | Рго | СХи | Н±з | РЬе | Бег | С1у | Агд | Рго | Агд | С1и | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | Уа1 | РГО | Н1е | Зег | Агд | Азп | Бег | 11е | ты | Ьеи | ТЫ | Азп | Ьеи | ТЫ |
| 140 | Х45 | 150 | ||||||||||||
| РГО | СХу | ТЫ | СХи | Туг | УаХ | УаХ | Бег | 11е | УаХ | А1а | Ьеи | Азп | С1у | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| СХи | СХи | Бег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | С1у | СХп | СХп | Зег | ТЫ | νβΐ | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | СХи | УаХ | УаХ | АХа | А1а | ТЬг | Рго | ТЫ | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | Не | Бег | Тгр | Азр | АХа | Рга | АХа | Уа1 | ТЬг | νβΐ | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Не | ТЫ | Туг | СХу | 01 и | ТЫ | С1у | СХу | Азп | Зег | Рго | Уа1 | С1п | С1и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | УаХ | Рго | СХу | Зег | Ьуз | Бег | ТЫ | А1а | ТЫ | Не | Зег | С1у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | УаХ | Авр | Туг | ТЬг | Не | ТЫ | УаХ | Туг | АХа | Уа1 | ТНг | С1у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| СХу | Азр | Бег | РГО | А1а | Бег | Бег | Ьуз | Рго | Не | 5ег | Не | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЫ | СХи | Не | Азр | Ьуз | Рго | Бег | МеС | С1у | Не | Агд | С1у | Ьеи | Ьуз | С1у |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| ТЫ | Ьуз | СХу | СХи | Ьуз | С1у | СХи | Азр | С1у | РЬе | Рго | С1у | РЬе | Ьуз | С1у |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| Азр | МеС | С1у | 11е | Ьуз | С1у | Азр | Агд | <31у | С1и | Не | С1у | Рго | Рго | С1у |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| Рго | Агд | СХу | С1и | Азр | СХу | РГО | 01и | С1у | Рго | Ьуз | С1у | Агд | С1у | С1у |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| РГО | АЗП | С1у | Азр | Рго | СХу | РГО | Ьеи | (Ну | Рго | Рго | 01у | С1и | Ьуз | С1у |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Ьуз | Ьеи | С1у | νβΐ | Рго | С1у | Ьеи | Рго | С1у | Туг | РГО | С1у | Агд | С1п | О1у |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| РГО | Ьуз | С1у | Зег | Не | СХу | РЬе | Рго | 61у | РЬе | РГО | С1у | АХа | Азп | <31у |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| С1и | Ьуз | С1у С1у | Агд | С1у | ТНг | РГО | 01у | ьуз | Рго | С1у | Рго | Агд | С1у | |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| С1п | Агд | С1у | РГО | ТЫ | С1у | Рго | Агд | С1у | С1и | Агд | С1у | РГО | Агд | С1у |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||
| 11е | ТЬг | С1у | Ьуз | Рго | С1у | Рго | Ьуз | О1у | Азп | Бег | С1у | СХу | Азр | О1у |
| 410 | 415 | 420 | ||||||||||||
| Рго | А1а | СХу | РГО | Рго | С1у | СХи | Агд | С1у | Рго | Азп | С1у | Рго | С1п | С1у |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| Рго | ТЬг | С1у | РЬе | Рго | С1у | Рго | Ьуз | С1у | Рго | Рго | СХу | Рго | Рго | С1у |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||
| Ьуз | Азр | С1у | Ьеи | Рго | С1у | Н±з | Рго | <31у | О1п | Агд | С1у | А1а | Зег | Азр |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||
| СХи | Ьеи | Рго | С1п | Ьеи | Уа1 | ТНг | Ьеи | Рго | Нхз | Рго | Абп | Ьеи | Η1Ξ | С1у |
470 475 490
Рго С1и Не Ьеи Азр Уа1 Рго 5ег ТЬг
485
ЗЕО- Ю Νο. 9
ДЛИНА; 36
ВИД; нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: Аная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АААССАТОСС АСТСАОССАС ОАОСТТСССС ААСТСС 36
3Εβ. Ю Νο. 10
ДЛИНА: 20
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
ААТΤΘАСААА ССАТССАТСС 20
5Е0. Ю Νο. 11
ДЛИНА: 33
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ :
ССАТТААААТ САССТАССАС САСАСАТТСС ААС 33
ЗЕО. Ю Νο. 12
ДЛИНА: 36
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПРГ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
215 220 225
| Рго | Рго Агд СЬи | Уа1 230 | Уа1 Рго Агд Рго Агд Рго С1у Уа1 ТЪг СЬи | |||||||||||
| 235 | 240 | |||||||||||||
| АЬа | ТЪг | Ые | ТЬг | СЬу | Ьеи | СЬи | Рго | СЬу | ТЪг | СЬи | Туг | ТЪг | Ые | Туг |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| Уа1 | Ые | АЬа | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | СЬп | Ьуз | Зег | СЬи | Рго | Ьеи | Ые | СЬу |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| Агд | Ьуз | Ьуз | ТЪг | Бег | АЬа | Ые | РГО | АЬа | РГО | тъг | Азр | Ьеи | Ьуз | ръе |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| ТЪг | СЬп | УаЬ | ТЬг | Рго | ТЪг | Зег | Ьеи | Бег | АЬа | СЬп | Тгр | ТЪг | Рго | Рго |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| Азп | УаЬ | СЬп | Ьеи | ТЬг | СЬу | Туг | Агд | УаЬ | Агд | УаЬ | ТЫ | Рго | Ьуз | СЬи |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| Ьуз | ТЬг | СЬу | РГО | Меб | Ьуз | СЬи | Ые | Азп | Ьеи | АЬа | Рго | Азр | Зег | Зег |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| Зег | УаЬ | УаЬ | УаЬ | Бег | СЬу | Ьеи | мет: | УаЬ | АЬа | ТЬг | Ьуз | Туг | СЬи | УаЬ |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Зег | УаЬ | Туг | АЬа | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЪг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд | Рго | АЬа | СЬп |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| СЬу | УаЬ | Уа1 | ТЬг | ТЪг | Ьеи | СЬи | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | АЬа |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| Агд | УаЬ | ТЪг | Азр | АЬа | ТЪг | СЬи | ТЪг | ТЪг | Ые | ТНг | Ые | Бег | Тгр | Агд |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| ТЪг | Ьуз | ТЪг | СЬи | ТЪг | ЬЬе | ТЪг | СЬу | РЬе | СЬп | Уа1 | Азр | А1а | УаЬ | Рго |
| 395 | 400 | 405 |
ТСТАСАССАТ ССТТАССТАЕ ССССТСТСТО ТССАСС
ЙЕО. Ю Νο. 13
ДЛИНА: 547
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АЬа АЬа Бег А1а Не Рго А1а Рго ТЪг Азр Ьеи Ьуз РЬе ТЬг СЬп
10 15
Уа1 ТЬг Рго ТЪг Бег Ьеи Бег А1а С1п Тгр ТНг Рго Рго Азп УаЬ
25 30
| С1П | Ьеи ТНг | СЬу | Туг 35 | Агд 7а1 Агд 17а1 ТНг 40 | Рго | Ьуз | СЬи | Ьуз | ТЪг 45 | |||||
| СЬу | Рго | Меб | Ьуз | СЬи | Ые | Азп | Ьеи | АЬа | Рго | Азр | Бег | Бег | Зег | УаЬ |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| УаЬ | УаЬ | Зег | СЬу | Ьеи | Мег | УаЬ | АЬа | тнг | Ьуз | Туг | СЬи | УаЬ | Зег | УаЬ |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Туг | АЬа | Ьеи | Ьуз | Азр | ТНг | Ьеи | ТЫ | Бег | Агд | РГО | АЬа | СЬп | С1у | УаЬ |
| ВО | 85 | 90 | ||||||||||||
| УаЬ | ТНг | ТЬг | Ьеи | СЬи | Азп | УаЬ | Бег | Рго | Рго | Агд | Агд | АЬа | Агд | Уа1 |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЫ | Азр | АЬа | ТЪг | СЬи | ТЪг | ТНг | Ые | ТЬг | Ые | Бег | Тгр | Агд | ТЪг | Ьуз |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| ТНг | СЬи | ТЫ | Не | ТЫ | СЬу | РНе | СЬп | уаь | АЗр | АЬа | УаЬ | Рго | АЬа | АЗП |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| С1у | СЬп | ТНг | Рго | Ые | СЬп | Агд | ТЬг | Ые | Ьуз | Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Туг | ТЬг | Ые | ТЪг | СЬу | Ьеи | СЬп | Рго | СЬу | ТЫ | Азр | Туг | Ьуз | Ые | Туг |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | АЬа | Агд | Зег | Бег | Рго | Уа1 | Уа1 | Ые |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Азр | А1а | Зег | ТНг | АЬа | Ые | Азр | АЬа | Рго | Бег | Азп | Ьеи | Агд | РНе | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| АЬа | ТНг | ТЬг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | УаЬ | Бег | Тгр | СЬп | Рго | Рго | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| АЬа | Агд | ЬЬе | ТНг | СЬу | Туг | Ые | Ые | Ьуз | Туг | СЬи | Ьуз | Рго | СЬу | Зег |
| АЬа Азп С1у С1п ТЪг 410 | Рго | Ые | СЬп | Агд ТНг Ые Ьуз Рго Азр УаЬ | ||||||||||
| 415 | 420 | |||||||||||||
| Агд | Бег | Туг | ТЪг | Ые | ТНг | СЬу | Ьеи | СЬп | Рго | СЬу | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| Ые | Туг | Ьеи | Туг | ТНг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | АЬа | Агд | Зег | Зег | Рго | 7а1 |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||
| УаЬ | Ые | Азр | АЬа | Бег | ТНг | АЬа | Ые | Азр | АЬа | Рго | Зег | А$П | Ьеи | Агд |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||
| РЬе | Ьеи | АЬа | ТЪг | ТНг | Рго | Азп | Бег | Ьеи | Ьеи | УаЬ | Зег | Тгр | СЬп | Рго |
| 470 | 475 | 4Θ0 | ||||||||||||
| Рго | Агд | АЬа | Агд | Ые | ТНг | СЬу | Туг | Ые | Ые | Ьуз | Туг | С1и | Ьуз | Рго |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||
| СЬу | Бег | Рго | Рго | Агд | СЬи | УаЬ | УаЬ | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | СЬу | УаЬ |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||
| ТЪг | СЬи | АЬа | ТНг | Ые | ТНг | СЬу | Ьеи | СЬи | РГО | СЬу | ТЫ | 01и | Туг | ТНг |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||
| 11е | Туг | УаЬ | 11е | АЬа | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | СЬп | Ьуз | Зег | О1и | Рго | Ьеи |
530 535 540
11е СЬу Агд Ьуз Ьуз ТНг Зег
545
ЗЕ<2. Ю Νο. 14
ДЛИНА: 826
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АХа
А1а
Зег
Рго
ТЫ
Азр
Ьеи
Агд
РЬе
ТЬг
Азп
Не
С1у
Рго
Азр
ТЬг
МеГ
Агд
Уа1
ТЬг
Тгр
А1а
Рго
Рго
Рго
5ег
Не
Азр
Ьеи
ТЬг
Азп
РЬе
Ьеи
Уа1
Агд
Туг
5ег
Рго
Уа1
Ьуз
Азп
СХи
СХи
Азр
УаХ
АХа
С1и
Ьеи
Зег 11е
Зег
Рго
Зег
Азр
Азп
А1а
УаХ
УаХ
Ьеи
ТЬг
Азп
Ьеи
Ьеи
Рго СХу
ТЬг
СХи
Туг
УаХ
УаХ
Зег
Уа1
Зег
Зег
УаХ
Туг
СХи
С1п
Нгз С1и
Зег ты Рго
Ьеи
Агд
СХу
Агд σΐη
Ьуз
ТЬг
СХу
Ьеи
Азр
Зег Рго
ТЬг
СХу Не
Азр
РЬе
Зег
Азр
ГХе
ТЬг
А1а
100
105
Азп
Зег
РЬе
ТЬг УаХ
Ηίβ
Тгр 1Хе
АХа
Рго
Агд
А1а
ТЬг
Не
ТЬг
НО
115
120
С1у
Туг
Агд
11е Агд
Ηί3
ΗΪ3 Рго
С1и
Ηίβ
РЬе
Зег
С1у
Агд
Рго
125
130
135
Агд
СХи
Азр
Агд Уа1
Рго
Н1з Зег
Агд Азп
Зег
Не
ТЬг
Ьеи
ТЬг
140
145
150
Азп
Ьеи
ТЬг
Рго С1у
ТЬг
С1и Туг УаХ Уа1
Зег
Не
Уа1
АХа
Ьеи
350 355 360
| Ьеи | ТЬг Зег Агд | Рго 365 | А1а С1п С1у УаХ | УаХ ТЬг ТЬг Ьеи С1и Азп | ||||||||||
| 370 | 375 | |||||||||||||
| Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | УаХ | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | СХи | ТЬг |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| ТЬг | Не | ТЬг | Не | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | СХи | ТЬг | Не | ТЬг | СХу |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||
| РЬе | СХп | УаХ | Азр | АХа | УаХ | Рго | АХа | Азп | СХу | СХп | ТЬг | Рго | 11е | СХп |
| 410 | 415 | 420 | ||||||||||||
| Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр | УаХ | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | СХу | Ьеи |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| С1п | Рго | СХу | ТЬг | Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||
| Азп | АХа | Агд | Зег | Зег | Рго | УаХ | УаХ | Не | Азр | АХа | Зег | ТЫ | А1а | Не |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||
| Азр | А1а | Рго | Зег | Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЬг | РГО | Азп | Зег |
| 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьеи | УаХ | Зег | Тгр | СХп | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТЬг | СХу | Туг |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||
| Не | Не | Ьуз | Туг | С1и | Ьуз | Рго | СХу | Зег | Рго | Рго | Агд | СХи | УаХ | УаХ |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||
| Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | СХу | УаХ | ТЬг | СХи | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | СХу | Ьеи |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||
| С1и | Рго | С1у | ТЬг | СХи | Туг | ТЬг | Не | Туг | Уа1 | Не | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп |
| 530 | 535 | 540 |
155
160
165
| Азп | С1п Ьуз Зег | СХи 545 | Рго | Ьеи 11е С1у | Агд 550 | Ьуз | Ьуз | ТЫ | Зег АХа 555 | |||||
| Не | Рго | А1а | Рго | ТЬг | Азр | Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | С1п | УаХ | ТЬг | Рго | ТЬг |
| 560 | 565 | 570 | ||||||||||||
| Зег | Ьеи | Зег | АХа | С1п | Тгр | ТЬг | Рго | Рго | АЗП | УаХ | СХп | Ьеи | ТЬг | СХу |
| 575 | 580 | 585 | ||||||||||||
| Туг | Агд | УаХ | Агд | УаХ | ТЬг | Рго | Ьуз | СХи | Ьуз | ТЫ | С1у | Рго | МеГ | Ьуз |
| 590 | 595 | 600 | ||||||||||||
| СХи | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго | Азр | Зег | Зег | Зег | УаХ | УаХ | УаХ | Зег | СХу |
| 605 | 610 | 615 | ||||||||||||
| Ьеи | Мег | УаХ | А1а | ТЫ | Ьуз | Туг | С1и | УаХ | Зег | УаХ | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз |
| 620 | 625 | 630 | ||||||||||||
| Азр | ТЬг | Ьеи | ТЫ | Зег | Агд | Рго | АХа | С1п | С1у | УаХ | УаХ | ТЬг | ТЬг | Ьеи |
| 635 | 640 | 645 | ||||||||||||
| СХи | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго | Агд | Агд | А1а | Агд | Уа1 | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг |
| 650 | 655 | 660 | ||||||||||||
| СХи | ТЬг | ТЫ | Не | ТЬг | Не | Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | СХи | ТЬг | Не |
| 665 | 670 | 675 | ||||||||||||
| ТЬг | СХу | РЬе | СХп | УаХ | Азр | АХа | УаХ | Рго | АХа | Азп | С1у | С1п | ТЫ | Рго |
| 680 | 685 | 690 | ||||||||||||
| Не | СХп | Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр | УаХ | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не | ТЬг |
| 695 | 700 | 705 | ||||||||||||
| СХу | Ьеи | СХп | Рго | СХу | ТЫ | Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи |
| 710 | 715 | 720 | ||||||||||||
| Азп | Азр | Азп | АХа | Агд | Зег | Зег | Рго | УаХ | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТЬг |
725 730 735
| А1а | Не | Азр А1а Рго Зег Азп Ьеи Агд РЬе | Ьеи | А1а ТЬг ТЬг | Рго 750 | |||||||||
| 740 | 745 | |||||||||||||
| Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | УаХ | Зег | Тгр | СХп | Рго | Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТЬг |
| 755 | 760 | 765 | ||||||||||||
| СХу | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг | С1и | Ьуз | Рго | С1у | Зег | Рго | Рго | Агд | СХи |
| 770 | 775 | 780 | ||||||||||||
| УаХ | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | СХу | УаХ | ТЬг | СХи | А1а | ТЬг | Не | ТЬг |
| 785 | 790 | 795 | ||||||||||||
| С1у | Ьеи | СХи | Рго | СХу | ТЬг | СХи | Туг | ТЬг | Не | Туг | УаХ | Не | А1а | Ьеи |
| 800 | 305 | 810 | ||||||||||||
| Ьуз | Азп | Азп | СХп | Ьуз | Зег | СХи | Рго | Ьеи | Не | СХу | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг |
| 815 | 820 | 825 |
Зег
ΞΕ<2. Ιϋ Νο. 15
ДЛИНА: 39
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АААССАТССС АССТАССССТ АТТССТССАС СААСТСАС 38
3Εζ). Ю Νο. 16
ДЛИНА;
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АААССАТССС ТААСТАСТСТ ТТТТССТТСС ААТСАС
ЗЕО. 10 Νο. 17
ДЛИНА: 1644
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: двойная
ТОПОЛОГИЯ: линейна.
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АТСССАССТА ССССТАТТСС ТССАССААСТ САССТСААСТ ТСАСТСАССТ САСАСССАСА
АСССТСАССС СССАОТССАС АССАСССААТ ОТТСАССТСА СТ6САТАТСС АСТСССССТС
120
АСССССААСС АСААСАССОС АССААТСААА САААТСААСС ТТССТССТСА САОСТСАТСС
130
СТССТТСТАТ САОСАСТТАТ ССТ5СССАСС АААТАТСААО ТСАСТСТСТА ТССТСТТААС
240
САСАСТТТСА СААССАСАСС АССТСАСССТ СТТСТСАССА СТСТССАСАА ТСТСАССССА
300
ССААСААООО СТССТСТСАС АСАТОСТАСТ ОАСАССАССА ТСАССАТТАО СТССАСААСС
360 аасастсаса ссатсастсс сттссааотт сатссссттс сасссаатсс ссасастсса
420 атссасасаа ссатсаассс асатстсаса асстасасса тсасассттт асаассасос
430 астсастаса асатстасст стасассттс аатсасаатс стсссасстс ссстстостс
540
АТССАССССТ ССАСТСССАТ ТСАТССАССА ТССААССТСС СТТТССТССС САССАСАССС
600
ААТТССТТСС ТОСТАТСАТС ССАССССССА ССТСССАССА ТТАСССССТА САТСАТСААС
660
ТАТСАСААЗС СТСССТСТСС ТСССАСАСАА ОТСОТСССТС ССССССОССС ТССТСТСАСА
720
САООСТАСТА ТТАСТСОССТ ССААСССССА АСССААТАТА СААТТТАТСТ САТТССССТС
7Θ0
ААСААТААТС АСААСАСССА СССССТСАТТ ССААССАААА АСАСТАСССС ТАТТССТССА
840
ССААСТСАСС ТОААОТТСАС ТСАССТСАСА СССАСААССС ТСАССССССА СТССАСАССА
900
СССААТСТТС АОСТСАСТСС АТАТССАСТС ССССТСАССС ССААССАСАА САССССАССА
960
АТСАААСААА ТСААССТТСС ТССТСАСАСС ТСАТССОТСС ТТСТАТСАСС АСТТАТССТС
1020
СССАССАААТ АТСААСТСАС ТСТСТАТССТ СТТААОСАСА СТТТСАСААС САСАССАССТ
1080
САОССТСТТС ТСАССАСТСТ ССАСААТСТС АССССАССАА СААССССТСС ТСТСАСАСАТ
1140
ССТАСТСАСА ССАССАТСАС САТТАССТСО АСААССААСА СТСАСАСОАТ САСТСССТТС
1200
СААСТТОАТО ССОТТССАЙС СААТОСССАС АСТССААТСС АСАСААССАТ СААОССАСАТ
1260
СТСАСААССТ АСАССАТСАС АССТТТАСАА ССАСССАСТО АСТАСААСАТ СТАССТСТАС
1320
АССТТСААТС АСААТССТСС САССТССССТ СТССТСАТСС АССССТССАС ТОССАТТОАТ
1380
ССАССАТССА АССТСССТТТ ССТССССАСС АСАСССААТТ ССТТССТССТ АТСАТСССАС
1440
СССССАССТС ССАССАТТАС ССССТАСАТС АТСААСТАТС АСААСССТЗС СТСТССТССС
1500
АСАСААСТСС ТСССТСОССС ССССССТССТ ОТСАСАСАСБ СТАСТАТТАС ТССССТССАА
1560
СССССААССС ААТАТАСААТ ТТАТСТСАТТ ССССТОААСА АТААТСАСАА САСССАСССС
1620
СТСАТТССАА ССАААААОАС ТАСТ
1644
ЗЕО. ΙΟ Νο. 20
ДЛИНА: 2481
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: двойная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АТСССАССТА 0ССССАСТСА ССТСССАТТС АССААСАТТС СТССАСАСАС САТСССТСТС 60
АССТОСССТС САСССССАТС САТТСАТТТА АССААСТТСС ТССТСССТТА СТСАССТСТО 120
АААААТСАСС ААСАТСТТСС АСДСТТСТСА АТТТСТССТТ САОАСААТСС АСТССТСТТА 180
АСАААТСТСС ТСССТССТАС АСААТАТСТА СТСАСТСТСТ ССАСТСТСТА ССААСААСАТ 240
ОАОАССАСАС СТСТТАОАСС ААСАСАОААА АСАССТСТТС АТТССССААС ТС0САТТСАС 300
ТТТТСТСАТА ТТАСТСССАА СТСТТТТАСТ 6Т6САСТОСА ТТОСТССТСО АОССАССАТС 360
АСТСССТАСА ООДТССОССА ТСАТССССАС САСТТСАСТС ССАСАССТСС АСААСАТССС 420
СТСССССАСТ СТСОСААТТС САТСАСССТС АССААССТСА СТССАСССАС АСАСТАТСТС 480
СТСАССАТСС ТТССТСТТАА ТСССАСАСАС САААОТСССТ ТАТТСАТТСС ССААСААТСА 540
АСАСТТТСТС АТОТТСССАС ССАССТССАА ОТТСТТССТС ССАСССССАС САСССТАСТС 500
АТСАССТССС АТССТССТСС ТСТСАСАСТС АСАТАТТАСА ССАТСАСТТА СССАСАААСА 660
ССАССАААТА ССССТСТССА ЙСАСТТСАСТ СТСССТСССА ССААСТСТАС АССТАССАТС 720
АССССССТТА ААССТССАОТ ТСАТТДТАСС АТСАСТСТСТ АТССТОТСАС ТСССССТССА 780
САСАСССССО СААОСАССАА СССААТТТСС АТТААТТАСС СААСАСАААТ ТСАСАААССА 840
ТССАСТАССС СТАТТССТСС АССААСТОАС СТСААСТТСА СТСАССТСАС АСССАСААСС 900
СТСАСССССС АСТОСАСАСС АСССААТСТТ САССТСАСТС САТАТССАСТ СССССТСАСС 960
СССААССАСА АСАССССАСС ААТСАДАСАА АТСААССТТС СТССТСАСАС СТСАТССОТС 1020
ОТТСТАТСАС САСТТАТОСТ ССССАССААА ТАТСААСТСА СТСТСТАТСС ТСТТААССАС 1080
АСТТТСАСАА ССАСАССАСС ТСАСССТСТТ ОТСАССАСТС ТССАСААТСТ САССССАССА 1140
АОДАССССТС СТСТСАСАСА ТССТАСТСАС АССАССАТСА ССАТТАССТС САСААССААС 1200
АСТСАСАССА ТСАСТООСТТ ССААОТТСАТ ОСССТТССАС ССААТССССА САСТССААТС 1260
САСАСААССА ТСААСССАОА ТСТСАСАДСС ТАСАССАТСА САООТТТДСА АССАСССАСТ 1320
ОАСТАСААСА ТСТАССТОТА САССТТОААТ ОАСААТОСТС ССАССТСССС ТСТССТСАТС 1380
САССССТССА СТСССАТТСА ТССАССАТСС ААССТСС6ТТ ТССТССССАС САСАСССААТ 1440
ТССТТССТСС ТДТСАТСССА ОСССССАССТ СССАССАТТА СССССТАСАТ САТСААСТАТ 1500
САОААОССТС СОТСТССТСС САСАСААОТС СТСССТСССС СССССССТСС ТСТСАСАОАО 1560
ССТАСТАТТА СТССССТССА АСССССААСС ОААТАТАСАА ТТТАТСТСАТ ТССССТСААС 1620
ААТААТСАСА АСАОССАССС ССТСАТТСОА АООАААААСА СТАССССТАТ ТССТССАССА 1680
АСТСАССТСА АСТТСАСТСА СОТСАСАССС АСААСССТСА ССССССАСТО САСАССАССС 1740
ААТСТТСАСС ТСАСТОСАТА ТСОАОТСССС ОТСАСССССД АССАЙААСАС СССАССААТО 1800
ДААСАААТСА АССТТОСТСС ТСАСАССТСА ТСС6ТССТТС ТАТСАССАСТ ТАТССТСССС 1960
АССАААТАТС ААСТСАСТСТ СТАТССТСТТ ААООАСАСТТ ТСАСААССАС АССАССТСАС 1920
ССТСТТСТСА ССАСТСТССА СААТ6ТСАСС ССАССААСАА ССССТССТСТ ΟΑΟΑαΑΤΌΟΤ 1980
АСТОАСАССА ССАТСАССАТ ТАССТССАСА АССААСАСТС АСАССАТСАС ТСССТТССАА 2040
СТТСАТСССС ТТССАСССАА ТССССАСАСТ ССААТССАСА САДССАТСАА СССАСАТСТС 2100
АСААССТАСА ССАТСАСАСС ТТТАСААССА СССАСТЕАСТ АСААСАТСТА ССТСТАСАСС 2160
ТТСААТСАСА АТССТСССАС СТССССТСТС СТСАТССАСС ССТССАСТСС САТТСАТССА 2220
ССАТССААСС ТСССТТТССТ ССССАССАСА СССААТТССТ ТССТССТАТС АТСССАСССС 2280
ССАССТСССА ССАТТАСССС СТАСАТСАТС ААСТАТСАСА АСССТСССТС ТССТСССАСА 2340
СААСТСОТСС СТСССССССС СССТССТСТС АСАСАСССТА СТАТТАСТСС ССТССААССС 2400
СОААСССААТ АТАСААТТТА ТСТСАТТССС СТСААСААТА АТСАСААСАС ССАСССССТС 2460
АТТССААССА ААААСАСТАС Т 2481
8ЕС. ΙΌ Ко. 21
ДЛИНА: 472
БИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
ЗЕО.
Мо.
ДЛИНА; 3?
ВИЦ; нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночна;
ТОПОЛОГИЯ: линейная
| Рго | ТПг | Азр | Деи | Агд | РЬе | ТЬг | Азп | Не | С1у | РГО | Азр | ТЬг | мег | Агд |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Уа1 | ТНг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | 11е | Азр | Деи | ТЬг | Азп | РЬе | Деи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Туг | 5ег | Рго | ν&1 | Дуз | Азп | С1и | С1и | Азр | Уа1 | А1а | С1и | Ьеи |
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АААССАТССС АССТАССССС АСТСАССТСС САТТСАС
ЗЕО. 10 N0. 19
ДЛИНА: 39
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
ААААСАТСТС ТААСТАСТСС АТССТТТСТС ААТТТСТС
Рго
Уа1
3Ε<2. ΙΟ Νο. 22
ДЛИНА: 457
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
ТЬг Азр Ьеи Агд РПе
ТЬг
Уа1 Агд
Зег 11е
Тгр А1а Рго
Рго
Туг Зег Рго
Уа1
Зег Рго Зег
Азр
ТЬг
Рго
Ьуз
Азп
Азп
Не
О1у
Рго
Азр
ТЬг ме-с
Агд
Зег
Азп
А1а
Не
Азр
Ьеи
ТЬг
Азп
РНе
Ьеи
О1и
С1и
Азр
Уа1
А1а
О1и
Ьеи
Уа1
Уа1
Ьеи
ТЬг
Азп
Ьеи
Ьеи
ТЬг Не Туг Уа1 11е А1а Ьеи Ьуз Азп Азп 61п Ьуз Зег С1и Рго
| 440 | 445 | 450 | |||
| Ьеи 11е | 61у | Агд | Ьуз Ьуз ТЬг | ||
| 455 | |||||
| ЗЕО. | Ю | ΝΟ. | 23 |
ДЛИНА: 549
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
| Рго 1 | ТЬг | Азр | Ьеи Агд РЬе ТЬг Азп 11е С1у Рго Азр ТЬг Мег Агд | |||||||||||
| 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| νβΐ | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТЬг . | Азп РЬе Ьеи | ||
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| νβΐ | Агд | Туг | Зег | Рго | νβΐ | Ьуз | Азп | 61и | 61 и | Азр | Уа1 | А1а С1и Ьеи | ||
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | 11е | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп Ьеи Ьеи | ||
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТЬг | ОХи | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг С1и С1п | ||
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| ΗΪ5 | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | 61у | Агд | 61п | Ьуз | ТЬг | С1у : | Ьеи Азр | |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | С1у | Не | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЬг | А1а | Азп | Зег 1 | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | ΗΪ5 | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | Туг | Агд |
| НО | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | Агд | Ηί3 | ΗΪ3 | Рго | С1и | ΗΪΞ | РЬе | Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | С1и | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | Уа1 | Рго | нгз | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТЬг | 61и | Туг | \7а1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | 61у | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| С1и | 61и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | С1у | С1п | С1п | 5ег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬГ | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| 11е | ТЬг | Туг | (Пу | С1и | ТЬг | С1у | С1у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | С1п | С1и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЬг | Уа1 | Рго | С1у | Зег | Ьуз | Зег | ТЬг | А1а | ТЬг | Не | Зег | С1у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Туг | А1а | Уа1 | ТЬг | 61у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| С1у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | СГи | Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Мег | А1а | Не | Рго | А1а | . Рго | ТЬг | Азр |
275 280 285
| Ьеи | Ьуз | РЬе | ТЬг | 61п | Уа1 | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | С1п | Тгр |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| ТЬг | Рго | Рго | Азп | ν»1 | 61п | Ьеи | ТЬг | С1у | Туг | Агд | νβΐ | Агд | Уа1 | ТЬг |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| Рго | Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг | С1у | Рго | мег | Ьуз | С1и | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| Азр | Зег | 5ег | Зег | Уа1 | ν»1 | Уа1 | Зег | С1у | Ьеи | Мег | Уа1 | А1а | ТЫ | Ьуз |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Туг | 61и | νβΐ | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЬг | Ьеи | ТЬг | Зег | Агд |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| Рго | А1а | С1п | С1у | Уа1 | ν*1 | ТЬг | ТЬг | Ьеи | С1и | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| Агд | Агд | А1а | Агд | νβΐ | ТЬг | Азр | А1а | ТЬг | 61и | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЬг | 61и | ТЬг | Не | ТЬг | С1у | РЬе | 61п | νβΐ | Азр |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||
| А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | (51у | С1п | ТЬг | Рго | Не | С1п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз |
| 410 | 415 | 420 | ||||||||||||
| Рго | Азр | Уа1 | Агд | Зег | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | Ьеи | С1п | Рго | С1у | ТЬг |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| Азр | Туг | Ьуз | Не | Туг | Ьеи | Туг | ТЬг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||
| Зег | Рго | Уа1 | Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТЬг | А1а | Не | Азр | А1а | Рго | Зег |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||
| Азп | Ьеи | Агд | РЬе | Ьеи | А1а | ТЬг | ТЫ | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | νβΐ | Зег |
| 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Тгр | С1п | РГО | Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТЬг | С1у | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||
| 61и | Ьуз | Рго | С1у | Зег | Рго | Рго | Агд | 61 и | νβΐ | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||
| Рго | 61у | νβΐ | ТЬГ | 6Хи | А1а | ТЬг | Не | ТЬг | 61у | Ьеи | С1и | Рго | 61у | ТЬг |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||
| С1и | туг | ТЬг | Не | Туг | νβΐ | Не | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | С1П | Ьуз | Зег |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||
| 61и | Рго | Ьеи | Не | 61у | Агд | Ьуз | Ьуз | ТЬг |
545
5ΕΏ. 10 Ко. 24
ДЛИНА: 574
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
| Рго 1 | ТЬг Азр | Ьеи Агд РЬе 5 | ТЬг | Азп | Не С1у Рго Азр 10 | ТЬг Мег | Агд 15 | |||||||
| Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | Уа1 | Ьуз | Азп | 61и | 61и | Азр | уа1 | А1а | 61и | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 |
| Зег | Не 5ег Рго Зег Азр Азп А1а Уа1 Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп Ьеи Ьеи 60 | ||||||||||
| 50 | 55 | |||||||||||||
| Рго | <31у | ТЦг | <31и | Туг | νβΐ | Уа1 | Зег | Уа1 | Зег | Зег | Уа1 | Туг | О1и | С1п |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| ΗΪ3 | С1и | Зег | ТЦг | Рго | Ьеи | Агд | С1у | Агд | С1п | Ьуз | ТЬг | О1у | Ьеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | С1у | Не | Азр | РЦе | Зег | Азр | Не | ТЦг | А1а | Азп | Зег | рЦе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЦг | Уа1 | Нхз | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЦг | Не | ТЦг | С1у | Туг | Агд |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| 11е | Агд | Н13 | Нхз | Рго | С1и | Ηί3 | РЦе | Зег | С1у | Агд | Рго | Агд | 61и | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | Уа1 | Рго | Н±з | Зег | Агд | АЗП | Зег | Не | ТЦг | Ьеи | ТЦг | Азп | Ьеи | ТЬг |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | О1у | ТЦг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | 01у | Агд |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| С1и | С1и | зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | С1у | С1п | 01п | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||
| Уа1 | Рго | Агд | Азр | Ьеи | С1и | Уа1 | Уа1 | А1а | А1а | ТЦг | Рго | ТЦг | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | 11е | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Не | ТЦг | Туг | С1у | С1и | ТЦг | С1у | С1у | Азп | Зег | Рго | Уа1 | О1п | С1и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЦг | Уа1 | Рго | О1у | Зег | Ьуз | Зег | ТПг | А1а | ТЬг | Не | Зег | 01у | Ьеи | Ьуз |
230 235 240
| 470 | 475 | 480 | ||||||||
| Агд | А1а | Агд | Не | ТЦг | С1у | Туг | Не | Не | Ьуз | Туг |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||
| Зег | Рго | Рго | Агд | С1и | νβΐ | Уа1 | Рго | Агд | Рго | Агд |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||
| С1и | А1а | ТЦг | Не | ТЦг | <31у | Ьеи | С1и | Рго | С1у | ТЦг |
ЗЕ(2. Ю Νο.
ДЛИНА: 274
ВИД: аминокислота
| Рго С1у Уа1 Азр | Туг ТЦг Не ТЦг Уа1 Туг А1а νβΐ ТЬг 01у Агд | |||||||||||||
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| С1у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | Азп | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЦг | С1и | Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | МеГ | А1а | Не | Рго | А1а | Рго | ТЦг | Азр |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Ьеи | Ьуз | РЦе | ТЦг | С1п | νβΐ | ТЦг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи | Зег | А1а | (31п | Тгр |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||
| ТЬг | Рго | Рго | Азп | νβΐ | 31п | Ьеи | ТЦг | С1у | Туг | Агд | Уа1 | Агд | νβΐ | ТЦг |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||
| Рго | Ьуз | С1и | Ьуз | ТЬг | С1у | Рго | МеГ | Ьуз | С1и | Не | Азп | Ьеи | А1а | Рго |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||
| Азр | Зег | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Уа1 | Зег | 01у | Ьеи | МеГ | Уа1 | А1а | ТЦг | Ьуз |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||
| Туг | С1и | Уа1 | Зег | Уа1 | Туг | А1а | Ьеи | Ьуз | Азр | ТЦг | Ьеи | ТЦг | Зег | Агд |
| 350 | 355 | 360 | ||||||||||||
| Рго | А1а | С1п | С1у | Уа1 | νβΐ | ТЦг | ТЦг | Ьеи | С1и | Азп | Уа1 | Зег | Рго | Рго |
| 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| Агд | Агд | А1а | Агд | νβΐ | ТЦг | Азр | А1а | ТЦг | С1и | ТЦг | ТЬг | Не | ТЬг | Не |
| 380 | 385 | 390 | ||||||||||||
| Зег | Тгр | Агд | ТЬг | Ьуз | ТЦг | С1и | ТЦг | Не | ТЦг | С1у | РЦе | 01п | Уа1 | Азр |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||
| А1а | Уа1 | Рго | А1а | Азп | С1у | 01п | ТЦг | Рго | Не | С1п | Агд | ТЦг | Не | Ьуз |
410 415 420
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
Рго
Уа1
Уа1
Зег
Рго
Нхз
Зег
ТЦг
Не
ТЦг Азр
ТЦг Тгр
Агд Туг
11е Зег
С1у ТЦг
О1и Зег
Рго ТЦг
Уа1 Нхз
Ьеи Агд рЦе
ТЦг
Азп Не
О1у
Рго
Азр
ТЬг
МеГ
Агд
А1а Рго
Агд Нхз
Зег Рго
Рго
Рго
Зег Не
Азр
Ьеи
ТЦг
Азп
РЦе
Ьеи
Уа1
Ьуз
Азп С1и
С1и
Азр
Уа1
А1а
С1и
Ьеи
Рго Зег Азр
Азп А1а Уа1
Уа1
Ьеи
ТЦг
Азп
Ьеи
Ьеи
Агд
Уа1 Рго
С1и Туг V»!
Уа1 Зег Уа1 Зег Зег
Уа1
Туг
С1и <31п
ТЦг Рго Ьеи
С1у 11е Азр
Тгр 11е А1а
110
Нхз Рго С1и
125
Нхз Зег Агд
140
Агд С1у Агд О1п Ьуз ТЦг 01у Ьеи
Азр
РЦе Зег Азр 11е ТЦг А1а Аэп Зег РЬе
100
105
Рго Агд А1а ТЬг 11е ТЦг С1у Туг Агд
115
120
Нхз РЦе Зег С1у Агд Рго Агд С1и Азр
130
135
Азп Зег Не ТЦг Ьеи ТЦг Азп Ьеи ТЦг
145
150
Рго
С1у ТЦг <31и Туг Уа1
Уа1 Зег Не Уа1 А1а Ьеи Азп 01у Агд
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| С1и | О1и | Зег | Рго | Ьеи | Ьеи | Не | С1у | С1п | 01П | Зег | ТЬг | Уа1 | Зег | Азр |
| 170 | 175 | 160 | ||||||||||||
| Уа1 | РГО | Агд | Азр | Ьеи | С1и | Уа1 | 7а1 | А1а | А1а | ТНг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
| 105 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | νβΐ | ТНг | Уа1 | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Не | ТЫ | Туг | О1у | С1и | ТНг | С1у | С1у | Азп | Зег | Рго | νβΐ | С1п | С1и | РЬе |
| 216 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЫ | νβΐ | Рго | 01у | Зег | Ьуз | Зег | ТНг | А1а | ТНг | Не | зег | О1у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | С1у | Уа1 | Азр | Туг | ТЬг | Не | ТЬг | Уа1 | Тут | А1а | Уа1 | ТЬг | С1у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| 01у | Аэр | Зег | РГО | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | АЗП | Туг | Агд |
| 250 | 265 | 270 |
ТНг С1и Т1е Азр
ΞΕ0. ΙΟ По. 26
ДЛИНА: 1374
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: двойная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АТЙСССАСТС АССТЙСЗАТТ САССААСАТТ ЙЙТССАСАСА ССАТЙСЙТЙТ САССТЙЙЙСТ 50
ССАСССССАТ ССАТТСАТТТ ААССААСТТС СТЙЙТЙСЙТТ АСТСАССТОТ ЙАДАААТСАЙ 120
ЙААЙАТЙТТЙ САОАЙТТСТС ААТТТСТССТ ТСАСАСААТС САЙТЙЙТСТТ ААСАААТСТС 180
СТЙССТЕСТА САСААТАТЙТ ДОТЙАЙТЙТС ТССАОТЙТСТ АСЙААСААСА ТЙАЙАЙСАСА 240
ССТСТТАЙАЙ ЙААОАСАСАА ААСАЙЙТСТТ ЙАТТССССАА СТЙЙСАТТЙА СТТТТСТЙАТ 300
АТТАСТСССА АСТСТТТТАС ТЙТЙСАСТЙС АТТйСТССТС САЙССАССАТ САСТСССТАС 360
АЙЙАТССЙСС АТСАТССССА ЙСАСТТСАЙТ ЙСЙАЙАССТС САСААСАТСО ЙЙТЙССССАС 420
ТСТСООААТТ ССАТСАСССТ САССААССТС АСТССАСЙСА САЙАЙТАТСТ ЙОТСАЙСАТС 430
ЙТТЙСТСТТА АТЙЙСАЙАЙА ЙЙАААЙТССС ТТАТТЙАТТЙ СССААСААТЙ ААСАЙТТТСТ 540
ЙАТЙТТССЙА ЙЙЙАССТЙСА АОТТСТТССТ СССАСССССА ССАСССТАСТ ЙАТСАЙСТЙЙ 600
ЙАТЙСТССТЙ СТСТСАСАЙТ ЙАЙАТАТТАС АЙЙАТСАСТТ АСЙЙАЙАААС АЙСАЙСАААТ 660
АЙСССТЙТСС АЙЙАЙТТСАС ТЙТЙССТОЙЙ АССААСТСТА САССТАССАТ САЙСЙЙССТТ 720
АААССТЙЙАЙ ТТЙАТТАТАС САТСАСТСТС ТАТЙЙТСТСА СТЙЙССЙТЙЙ АОАСАЙСССС 780
ЙСААЙСАЙСА АЙССААТТТС САТТААТТАС ССААСАОААА ТТСАСАААСС АТССАТЙССА 840
ЙССЙЙСАЙСА ТСАССАСйСТ ССССЙССТТС СССЙАСЙАТЙ ЙСЙЙСАЙССЙ ССССТТСССС 900
СССЙЙССАСТ ТСААЙЙАССС СААЙСЙОСТС ТАСТЙСАААА АСОООСССТТ СТТССТЙССС 960
АТССАССССЙ АСЙЙССЙАСТ ТЙАСЙЙЙЙТС СССОАЙААСА ССЙАСССТСА САТЙААЙСТА 1020
СААСТТСААС САЙААЙАЙАЙ АЙЙАСТТЙТЙ ТСТАТСАААС САСТСТСТСС ТААСССТТАС 1080
СТЙЙСТАТСА АЙЙААЙАТЙЙ ААЙАТТАСТЙ ЙЙТТСТАААТ ЙТСТТАССЙА ТЙАЙТЙТТТС 1140
ТТТТТТЙААС ЙАТТЙЙААТС ТААТААСТАС АДТАСТТАСС ЙСТСААЙСАА АТАСАССАЙТ 1200
ТЙЙТАТЙТЙЙ САСТЙАААСЙ ААСТССЙСАС ТАТАААСТТЙ САТССААААС АССАССТСЙС 1260
САЙАААЙСТА ТАСТТТТТСТ ТСЙААТСТСТ ССТЙСТДЙСЙ АСЙАЙСТТСС ССАДСТЙЙТА 1320
АСССТТССАС АССССААТСТ ТСАТЙЙАССА САЙДТСТТСО АТЙТТССТТС САСА 1374
ДЛИНА: 1416
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: двойная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
СССДСТОАСС ТЙСЙАТТСАС СААСАТТСОТ ССДЙАСАССА ТЙСЙТЙТСАС СТЙЙЙСТССД 60
СССССАТССА ТТСАТТТААС СААСТТССТО ЙТЙСОТТАСТ САССТЙТЙАА ДААТЙАЙЙДА 120
ЙАТЙТТССАЙ АЙТТЙТСААТ ТТСТССТТСА ЙАСААТЙСАЙ ТЙЙТСТТААС АААТСТССТО 180 ССТОСТАСАС ААТАТСТАСТ ЙАЙТЙТСТСС АЙТЙТСТАСЙ ААСААСАТЙА ЙАССАСАССТ 240 СТТАЙАЙЙАА ЙАСАСААААС АОЙТСТТЙАТ ГССССААСТС ССАТТСАСТТ ТТСТСАТАТТ 300
АСТСССААСТ СТТТТАСТСТ ЙСАСТЙЙАТТ ССТССТСЗАС ССАССАТСАС ТСССТАСАЙЙ 360
АТСССССАТС АТСССЙАССА СТТСАЙТЙЙС АСАССТСЙДС ААЙАТСЙЙЙТ ЙССССАСТСТ 420
СЙЙААТТССА ТСАСССТСАС СААССТСАСТ ССАЙССАЙАЙ АЙТАТЙТЙЙТ САССАТССТТ 480
ЙСТСТТААТЙ 6СА6АСА0СА ААЙТСССТТА ТТСАТТСССС ААСААТСААС АЙТТТСТЙАТ 540
ЙТТССЙАЙЙЙ АССТЙЙААОТ ТСТТССТЙСЙ АСССССАССА ЙССТАСТЙАТ САЙСТЙЙЙАТ 600
ЙСТССТЙСТЕ ТСАСАСТЙАЙ АТДТТАСАСС АТСАСТТАСС САЙАААСАЙЙ АЙЙАААТАЙС 6б0
ССТСТССАСС АСТТСАСТСТ СССТСССАОС ААСТСТАСАО СТАССАТСАС СССССТТААА 720
ССТЙСАЙТТЙ АТТАТАССАТ САСТЙТЙТАТ ССТОТСАСТС ЙССЙТЙОАЙА САЙССССЙСА 730
АЙСАЙСААСС СААТТТССАТ ТААТТАСССА АСАЙАААТТЙ АСАААССАТС САТЙЙСТАТТ 340
ССТЙСАССАА СТЙАССТЙАА СТТСАСТСАС СТСАОАСССА СААСССТЙАЙ СЙСССАЙТЙЙ 900
АСАССАСССА АТЙТТСАЙСТ САСТЙСАТАТ ССАЙТОСЙЙО ТЙАСССССАА ЙЙАЙААЙАСС 9бО
ЙЙАССААТЙА ААСАААТСАА ССТТССТССТ САСАЙСТСАТ ССЙТЙЙТТЙТ АТСАЙЙАСТТ 020
АТСЙТОСССА ССАААТАТСА АЙТСАЙТОТС ТАТССТСТТА АЙЙАСАСТТТ САСААССАЙА 1080
ССАЙСТСАСС ЙТЙТТЙТСАС СДСТСТССАЙ ААТЙТСАЙСС САССАДЙДАЙ ЙССТССТСТС 1140
АСАЙАТЙСТА СТОАЙАССАС САТСАССАТТ АССТССАЙАА ССААСАСТЙА ЙАССАТСАСТ 1200
ЙЙСТТССААЙ ТТЙАТЙССЙТ ТССАСССААТ ЙОССАЙАСТС СААТССАЙАЙ ААССАТСААЙ 1260
ССАСАТСТСА ЙАА5СТАСАС САТСАСАЙЙТ ТТАСААССАЙ ЙСАСТЙАСТА СААЙАТЙТАС 1320 СТЙТАСАССТ ТЙААТЙАСАА ТЙСТССЙАЙС ТССССТОТЙС ТСАТСЙАЙЙС СТССАСТЙСС 1380 АТТЙАТЙСАС САТССААССТ ЙСОТТТССТС ЙССАСС 1416
3ΕΩ. ΙΌ Νο, 28
ДЛИНА: 35 2
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
С1у С1у Агд О1у ТЬг Рго С1у Ьуз Рго С2у Рго Агд С1у С1п Агд
10 15
С1у Рго ТНг С1у Рго Агд С1у С1и Агд О1у Рго Агд 61у Не ТНг
25 30
С1у Вуз Рго С1у Рго
ЗЕ<2. Ю Νο. 29
ДЛИНА: 302
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
МеХ
ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
А1а
А1а
Зег
А1а
Не
Рго
А1а
Рго
ТЬг
Азр
Ьеи
Дуз
РЬе тьг
| Рго 1 | ТЫ | Азр | Ьеи Агд РЬе ТЬг Азп 11е О1у Рго Азр ТЬг МеХ Агд | |||||||||||
| 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Уа1 | ТЬг | Тгр | А1а | Рго | Рго | Рго | Зег | Не | Азр | Ьеи | ТЬг | Азп | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Уа1 | Агд | Туг | Зег | Рго | νβΐ | Ьуз | Азп | С1и | С1и | Азр | νβΐ | А1а | О1и | Ьеи |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Зег | Не | Зег | Рго | Зег | Азр | Азп | А1а | Уа1 | Уа1 | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | Ьеи |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг | νβΐ | Уа1 | Зег | νβΐ | Зег | Зег | νβΐ | Туг | С1и | С1п |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||
| Нхз | С1и | Зег | ТЬг | Рго | Ьеи | Агд | С1у | Агд | 01 п | Ьуз | ТЬг | С1у | Ьеи | Азр |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||
| Зег | Рго | ТЬг | С1у | Не | Азр | РЬе | Зег | Азр | Не | ТЫ | А1а | Азп | Зег | РЬе |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||
| ТЬг | νβΐ | ΗΪ3 | Тгр | Не | А1а | Рго | Агд | А1а | ТЫ | Не | ТЫ | О1у | Туг | Агд |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||
| Не | Агд | НЬз | Нхз | Рго | О1и | Нхз | РЬе | Зег | 01у | Агд | Рго | Агд | О1и | Азр |
| 125 | 130 | 135 | ||||||||||||
| Агд | νβΐ | Рго | Нхз | Зег | Агд | Азп | Зег | Не | ТЫ | Ьеи | ТЬг | Азп | Ьеи | ТЬг |
| 140 | 145 | 150 | ||||||||||||
| Рго | С1у | ТЬг | С1и | Туг | Уа1 | Уа1 | Зег | Не | Уа1 | А1а | Ьеи | Азп | <31у | Агд |
155 160 165
С1п
Уа1
ТЬг
Рго
ТЬг
Зег
Ьеи
Зег
А1а <31п
Тгр
ТЬг
Рго
Рго
Азп
Уа1
ТЬг
Уа1
Уа1
Уа1
Уа1
Ьуз
Азп
Зег
С1п
О1у
Уа1
Туг
Ьеи
Рго
Уа1
А1а
Уа1 ТЬг
ТЬг Азр
ТЬг С1и
ТЬг
С1у
Туг
Агд
Уа1
Агд
Уа1
ТЬг
Рго
Ьуз
С1и
Ьуз
Мех Ьуз
С1у С1п
Туг ТЬг
Зег (31у
Ьеи
ТЫ
А1а
ТЫ
ТЬг
Не
Ьуз
Θ0
Ьеи
С1и
Ьеи
Азр
11е
Мех
ТЬг
О1и Азп
ТЫ (Ни ТЬг
110
Азп νβΐ
Ьеи
Уа1
ТЬг
Ьеи
А1а
ТЫ
Зег
Не
А1а
Рго
Азр
Зег
Зег
Зег
ТЫ
Ьуз
Туг
61и
Уа1
Зег
Зег
Агд
Рго
А1а
С1П
С1у
Рго
Рго
Агд
Агд
А1а
Агд
100
105
ТЬг
Не
Зег
Тгр
Агд
ТЬг
115
120
Не ТЬг С1у
РЬе
С1п
Уа1
Азр
А1а
Уа1
Рго
А1а
125
130
135
Рго
140
ТЬг
155
Не С1п
С1у Ьеи
Агд
ТЬг
Не
Ьуз
Рго
Азр
Уа1
Агд
145
150
С1п Рго
01у
ТЬг
Азр Туг
Ьуз
11е
160
165
| 01и | О1и | Зег | Рго Ьеи 170 | Ьеи Не 01у С1п | С1п Зег ТЬг 175 | νβΐ | Зег | Азр 180 | ||||||
| νβΐ | Рго | Агд | Азр | Ьеи | 01и | νβΐ | Уа1 | А1а | А1а | ТЬг | Рго | ТЬг | Зег | Ьеи |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||
| Ьеи | Не | Зег | Тгр | Азр | А1а | Рго | А1а | ν»1 | ТЬг | νβΐ | Агд | Туг | Туг | Агд |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||
| Не | ТЬг | Туг | 01у | С1и | ТЫ | 01у | 01у | Азп | Зег | Рго | νβΐ | 01п | О1и | РЬе |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||
| ТЫ | Уа1 | Рго | 01у | Зег | Ьуз | Зег | ТЫ | А1а | ТЫ | Не | Зег | 01у | Ьеи | Ьуз |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Рго | О1у | Уа1 | Азр | Туг | ТЫ | Не | ТЬг | νβΐ | Туг | А1а | νβΐ | ТЫ | С1у | Агд |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||
| <31у | Азр | Зег | Рго | А1а | Зег | Зег | Ьуз | Рго | Не | Зег | Не | АЗП | Туг | Агд |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||
| ТЬг | С1и | Не | Азр | Ьуз | Рго | Зег | Азр | С1и | Ьеи | Рго | С1п | Ьеи | Уа1 | ТЬг |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||
| Ьеи | Рго | Нхз | Рго | Азп | Ьеи | Нхз | С1у | Рго | О1и | Не | Ьеи | Азр | Уа1 | Рго |
| 290 | 295 | 300 |
Зег ТЬг
5ΕΏ· 10 Νο. 30
ДЛИНА: 573
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
Ьеи Туг
ТЬг
Туг
Ьеи
Азп Азр
Азп А1а
Уа1
Уа1
Зег Рго
Агд
Зег
| СХу Уа1 Уа1 ТНг | ТНг 365 | Ьеи | СХи Азп УаХ Зег Рго Рго Агд Агд А1а | |||||||||||
| 370 | 375 | |||||||||||||
| Агд | νβΐ | ТНг | Азр | АХа | ТНг | СХи | ТНг | ТНг | Не | ТНг | Не | Зег | Тгр | Агд |
| 3Θ0 | 3Θ5 | 390 | ||||||||||||
| ТНг | Ьуз | ТНг | СХи | ТНг | Не | ТНг | СХу | РНе | СХп | νβΐ | Азр | АХа | УаХ | Рго |
| 395 | 400 | 405 | ||||||||||||
| АХа | Азп | СХу | СХп | ТНг | Рго | 11е | С1п | Агд | ТЬг | Не | Ьуз | Рго | Азр | νβΐ |
| 410 | 415 | 420 | ||||||||||||
| Агд | Зег | Туг | ТНг | Не | ТНг | СХу | Ьеи | С1п | Рго | СХу | ТНг | Азр | Туг | Ьуз |
| 425 | 430 | 435 | ||||||||||||
| Не | Туг | Ьеи | Туг | ТНг | Ьеи | Азп | Азр | Азп | А1а | Агд | Зег | Зег | Рго | 1/аХ |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||
| Уа1 | Не | Азр | А1а | Зег | ТНг | А1а | Не | Азр | АХа | Рго | Зег | Азп | Ьеи | Агд |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||
| РНе | Ьеи | АХа | ТНг | ТНг | Рго | Азп | Зег | Ьеи | Ьеи | УаХ | Зег | Тгр | СХп | Рго |
| 470 | 475 | 4ΘΟ | ||||||||||||
| Рго | Агд | А1а | Агд | Не | ТНг | С1у | Туг | Не | 11е | Ьуз | Туг | С1и | Ьуз | Рго |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||
| С1у | Зег | Рго | Рго | Агд | СХи | νβΐ | УаХ | Рго | Агд | Рго | Агд | Рго | СХу | Уа1 |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||
| ТНг | СХи | АХа | ТНг | Не | ТНг | СХу | Ьеи | СХи | Рго | С1у | ТНг | СХи | Туг | ТНг |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||
| Не | Туг | УаХ | Не | А1а | Ьеи | Ьуз | Азп | Азп | СХп | Ьуз | Зег | СХи | Рго | Ьеи |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||
| Не | СХу | Агд | Ьуз | Ьуз | ТНг | Зег | Азр | СХи | Ьеи | Рго | СХп | Ьеи | УаХ | ТНг |
| 545 | 550 | 555 |
Ьеи Рго Ηίβ Рго Азп Ьеи ΗΪ3 СХу Рго С1и Не Ьеи Азр Уа1 Рго
560 565 570
Зег ТНг Зег
5Е<2. 10 Νο. 31
ДЛИНА: 37
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АААССАТССС АССТАССААТ СТСАССССАС СААСААО 37
ЗЕО. Ю Νο. 32
ДЛИНА: 37
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
8ИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АААССАТССС ТААСТАСТСС ААССААСАТС СААСАТС 37
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: двойная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полиг.ег.тил)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АТСССАССТА ССССТАТТСС ТССАССААСТ САССТСААСТ ТСАСТСАССТ САСАСССАСА 60
АСССТСАССС СССАСТССАС АССАСССААТ ОТТСАОСТСА СТССАТАТСС АСТСССССТС 120 АСССССААСС АСААСАСССС АССААТСААА САААТСААСС ТТССТССТСА САССТСАТСС 180 СТССТТСТАТ САССАСТТАТ ССТССССАСС АААТАТ0ААС ТСАСТОТСТА ТССТСТТААС 240 САСАСТТТСА СААССАСАСС АССТСАСССТ СТТСТСАССА СТСТССАСАА ТСТСАССССА 300 ССААСААССС СТССТСТСАС АСАТССТАСТ САСАССАССА ТСАССАТТАС СТССАСААСС 360 ААСАСТСАСА ССАТСАСТСС СТТССААОТТ ОАТССССТТС САСССААТСС ССАСАСТССА 420
АТССАОАСАА ССАТСААССС АСАТСТСАСА АССТАСАССА ТСАСАССТТТ АСААССАСОС 480 АСТСАСТАСА АСАТСТАССТ СТАСАССТТС ААТСАСААТС СТСССАССТС СССТСТСОТС 540 АТССАССССТ ССАСТСССАТ ТСАТССАССА ТССААССТСС СТТТССТССС САССАСАССС 600 ААТТССТТСС ТССТАТСАТС ССАССССССА СОТСССАССА ТТАСССОСТА САТСАТСААО 660 ТАТСАСААСС СТСССТСТСС ТСССАСАОАА СТССТСССТС СССССССССС ТССТСТСАСА 720 САСССТАСТА ТТАСТССССТ ССААСССССА АСССААТАТА СААТТТАТСТ САТТОСССТО 780
ААСААТААТС АСААСАСССА СССССТСАТТ ССААССАААА А6АСТАСССС ТАТТССТОСА 840 ССААСТСАСС ТСААСТТСАС ТСАООТСАСА СССАСААССС ТСАССССССА СТССАСАССА 900 СССААТСТТС АССТСАСТСС АТАТССАСТС ССССТСАССС ССААССАСАА САССССАССА 960 АТСАААСААА ТСААССТТСС ТССТСАСАСС ТСАТСССТСС ТТОТАТСАСО АСТТАТССТО 1020 СССАССАААТ АТСААОТОАС ТСТСТАТССТ СТТААССАСА СТТТСАСААС САСАССАССТ 1080 САСССТСТТС ТСАССАСТСТ ССАСААТСТС АССССАССАА СААССССТСЗ ТСТСАСАСАТ 1140
ССТАСТСАСА ССАССАТСАС САТТАССТСС АСААССААСА СТСАСАССАТ САСТСССТТС 1200
СААСТТСАТС СССТТССАСС СААТССССАС АСТССААТСС АСАСААССАТ СААСССАСАТ 1260
СТСАСААССТ АСАССАТСАС АССТТТАСАА ССАСССАСТО АСТАСААОАТ СТАССТСТАС 1320
АССТТСААТС АСААТССТСС САССТССССТ СТССТСАТСС АССССТССАС ТСССАТТСАТ 1380
ССАССАТССА АССТСССТТТ ССТССССАСС АСАСССААТТ ССТТССТССТ АТСАТСССАС 1440 СССССАССТС ССАССАТТАС ССССТАСАТС АТСААСТАТС АСААСССТСС СТСТССТССС 1500 АСАСААСТСС ТСССТССССС ССССССТССТ СТСАСАСАСС СТАСТАТТАС ТССССТССАА 1560 СССССААССС ААТАТАСААТ ТТАТСТСАТТ ССССТСААСА АТААТСАСАА САСССАСССС 1620 СТСАТТССАА ССАААААСАС ТАСССАССАС СТТССССААС ТССТААСССТ ТССАСАСССС 1680 ААТСТТСАТС САССАСАСАТ СТТООАТСТТ ССТТССАСТА СТ 1722
5ΕΏ. ±0 Νο. 34
ДЛИНА: 412
ВИД: аминокислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная ТОПОЛОГИЯ: линейная ВИД МОЛЕКУЛЫ: пептид ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
| МеР | Зег | Рго | 1Хе | Ьеи | СХу | Туг | Тгр | Ьуз | Не | Ьуз | С1у | Ьеи | νβΐ | СХп |
| 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Рго | ТНг | Агд | Ьеи | Ьеи | Ьеи | СХи | Туг | Ьеи | С1и | СХи | Ьуз | Туг | СХи | СХи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| НДз | Ьеи | Туг | СХи | Агд | Азр | С1и | С1у | Азр | Ьуз | Тгр | Агд | Азп | Ьуз | Ьуз |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| РНе | С1и | Ьеи | СХу | Ьеи | С1и | РНе | Рго | Азп | Ьеи | Рго | Туг | Туг | Не | Азр |
5Е<2. Ιϋ Νο. 33
ДЛИНА: 1722
100
Νο. 35
5ες.
ДЛИНА: 24
ВИД: нуклеинова;
кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
ССТСССТСТС ССССТСССАС тест
5Е<2. Ю ΝΟ. 36
ДЛИНА: 24
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
ЗЕ<2. 10 Νο. 37
ДЛИНА: 33
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
ССССТССССА АТТССССТСС СССАССАССС СТС 33
5Е0. Ю Νο. 38
ДЛИНА: 33
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеиновая кислота (синтетическая ДНК) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
СССАССТССА ТССАТСССТА АТСТСТСССС ТСТ 33
ЗЕО. 10 Νο. 39
ДЛИНА: 1722
ВИД: нуклеиновая кислота
СТРУКТУРА ЦЕПИ: одиночная
ТОПОЛОГИЯ: линейная
ВИД МОЛЕКУЛЫ: иная нуклеинозая кислота (ДНК, кодирующая синтетический полипептид)
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ:
АТСТССССТА ТАСТАССТТА ТТССААААТТ ААСССССТТС ТССААСССАС ТССАСТТСТТ 60 ТТСЗААТАТС ТТСААСАААА АТАТСААСАС САТТТСТАТС АСССССАТСА АССТСАТААА 120 ТССССАААСА ААААСТТТСА АТТСССТТТС САСТТТСССА АТСТТССТТА ТТАТАТТСАТ 180 ССТСАТСТТА ААТТААСАСА СТСТАТСССС АТСАТАССТТ АТАТАССТСА СААССАСААС 240 АТСТТООСТС СТТСТССААА АСАСССТССА ОАОАТТТСАА ТССТТСААСС АССССТТТГС 300 САТАТТАСАТ АСССТСТТТС САСААТТОСА ТАТАСТАААО АСТТТСАААС ТСТСАААСТТ 360
САТТТТСТТА ССААССТАСС ТСАААТССТС ААААТСТТСС ААСАТССТТТ АТСТСАТААА 420
АСАТАТТТАА АТССТСАТСА ТСТААСССАТ ССТСАСТТСА ТСТТСТАТСА СССТСТТСАТ 480
СТТОТТТТАТ АСАТССАССС ААТОТСССТС САТССОТТСС СААААТТАОТ ТТСТТТТААА 540
АААССТАТТС ААССТАТССС АСАААТТСАТ ААСТАСТТСА ААТССАССАА СТАТАТАССА 600
ТССССТТТСС АССССТСССА АСССАССТТТ ССТССТСССС АССАТССТСС ААААТССОАТ 660
СТСАТССААС СТССТСССАТ ССССАССААТ ТССССТСССС САССАССССТ САТСТСТСАС 720
АЗСССАСТСС ТССАСАСОТА ССТСТТССАС СССААОСАСС СССАСААТАТ САССАССССС 780
ТОТССТСААС АСТССАЗСТТ СААТОАСААТ АТСАСТСТСС САСАСАССАА АСТТААТТТС 840
ТАТСССТССА АСАССАТССА СОТСССССАС САСССССТАС ААОТСТСССА СССССТСССС 900
СТССТОТССС ААССТСТССТ ССССССССАО ССССТСТТСС ТСААСТСТТС ССАССССТСС 960
ЗАСССССТСС АССТССАТСТ ССАТАААССС СТСАСТСССС ТТСССАСССТ САССАСТСТС 1020
СТТССОССТС ТСССАССССА СААЗОААССС АТСТССССТС САСАТОСССС СТСАССТССТ 1080
ССАСТСССАА СААТСАСТСС ТСАСАСТТТС СОСАААСТСТ ТСССАСТСТА СТССААТТТС 1140
СТСССООСАА АССТСААССТ СТАСАСАССС САССССТССА ССАСАССССА САСАТТАССС 1200
АТССАТССТС ТАСАСТССАС ТСОАСССССС ССАТССТСА 1239
Claims (9)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Полипептид, повышающий эффективность генного переноса в клетки-мишени при помощи ретровируса, представленный в 8Ε0 ΙΌ N0: 13 списка последовательностей, или его функциональный эквивалент, полученный путем делеций, замен, инсерций и/или добавок аминокислотных остатков.
- 2. Полипептид, повышающий эффективность генного переноса в клетки-мишени при помощи ретровируса, представленный в 8Ε0 ΙΌ N0: 30 списка последовательностей, или его функциональный эквивалент, полученный путем делеций, замен, инсерций и/или добавок аминокислотных остатков.
- 3. Полипептид, повышающий эффективность генного переноса в клетки-мишени при помощи ретровируса, представленный в 8Ε0 ΙΌ N0: 5 списка последовательностей, или его функциональный эквивалент, полученный пуСТТССТСАСС САССТССТСС АТАТ101102 тем делеций, замен, инсерций и/или добавок аминокислотных остатков.
- 4. Ген, кодирующий полипептид по п.1.
- 5. Ген, кодирующий полипептид по п.2.
- 6. Ген, кодирующий полипептид по п.3.
- 7. Ген по п.4, представленный в 8ЕО ΙΌ N0: 17 списка последовательностей или ген, гибридизующийся с ним в строгих условиях и кодирующий полипептид, который повышает эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса.
- 8. Ген по п.5, представленный в 8Е0 ΙΌ N0: 33 списка последовательностей или ген, гибридизующийся с ним в строгих условиях и кодирующий полипептид, который повышает эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса.
- 9. Ген по п.6, представленный в 8Е0 ΙΌ N0: 26 списка последовательностей или ген, гибридизующийся с ним в строгих условиях и кодирующий полипептид, который повышает эффективность генного переноса в клеткимишени с помощью ретровируса.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29438295 | 1995-11-13 | ||
| JP5184796 | 1996-03-08 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200200837A1 EA200200837A1 (ru) | 2002-12-26 |
| EA004928B1 true EA004928B1 (ru) | 2004-10-28 |
Family
ID=26392431
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA199800369A EA003195B1 (ru) | 1995-11-13 | 1996-11-07 | Способ повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса |
| EA200001110A EA003204B1 (ru) | 1995-11-13 | 1996-11-07 | Набор для переноса гена в клетки-мишени с помощью ретровируса (варианты) |
| EA200200837A EA004928B1 (ru) | 1995-11-13 | 1996-11-07 | Полипептиды, повышающие эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, и гены, их кодирующие |
Family Applications Before (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA199800369A EA003195B1 (ru) | 1995-11-13 | 1996-11-07 | Способ повышения эффективности генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса |
| EA200001110A EA003204B1 (ru) | 1995-11-13 | 1996-11-07 | Набор для переноса гена в клетки-мишени с помощью ретровируса (варианты) |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6472204B1 (ru) |
| EP (1) | EP0870839B1 (ru) |
| JP (1) | JP3343357B2 (ru) |
| KR (2) | KR100395420B1 (ru) |
| CN (1) | CN100390290C (ru) |
| AT (1) | ATE325884T1 (ru) |
| AU (1) | AU709831B2 (ru) |
| CA (1) | CA2235629A1 (ru) |
| DE (1) | DE69636122T2 (ru) |
| EA (3) | EA003195B1 (ru) |
| ES (1) | ES2259182T3 (ru) |
| MX (1) | MX9803706A (ru) |
| WO (1) | WO1997018318A1 (ru) |
Families Citing this family (71)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7083979B1 (en) * | 1994-03-25 | 2006-08-01 | Indiana University Foundation | Methods for enhanced retroviral-mediated gene transfer |
| DK0833934T4 (da) | 1995-06-15 | 2012-11-19 | Crucell Holland Bv | Pakningssystemer til human rekombinant adenovirus til anvendelse ved genterapi |
| ATE325533T1 (de) * | 1995-09-29 | 2006-06-15 | Univ Indiana Res & Tech Corp | Verfahren zum verbesserten virusvermittelten dns- transfer unter verwendung von molekülen mit virus-und zellbindenden domänen |
| TWI239352B (en) * | 1997-07-23 | 2005-09-11 | Takara Bio Inc | Gene transfer method with the use of serum-free medium |
| US6316692B1 (en) * | 1997-11-14 | 2001-11-13 | Cedars Sinai Medical Center | Transfection, storage and transfer of male germ cells for generation of transgenic species and genetic therapies |
| ES2316675T3 (es) * | 1998-07-01 | 2009-04-16 | Takara Bio Inc. | Metodos de transferencia genica con retrovirus. |
| US7198909B1 (en) * | 1998-10-31 | 2007-04-03 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | Myeloid precursor cell useful for gene therapy and for modulation of immune responses |
| ATE376840T1 (de) * | 1999-03-23 | 2007-11-15 | Takara Bio Inc | Gentherapeutika |
| US7345019B1 (en) | 1999-04-13 | 2008-03-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Modulation of excitable tissue function by peripherally administered erythropoietin |
| US7309687B1 (en) | 1999-04-13 | 2007-12-18 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Methods for treatment and prevention of neuromuscular and muscular conditions by peripherally administered erythropoietin |
| US20050164386A1 (en) * | 1999-04-15 | 2005-07-28 | Uytdehaag Alphonsus G. | Overexpression of enzymes involved in post-translational protein modifications in human cells |
| US6855544B1 (en) * | 1999-04-15 | 2005-02-15 | Crucell Holland B.V. | Recombinant protein production in a human cell |
| US8236561B2 (en) * | 1999-04-15 | 2012-08-07 | Crucell Holland B.V. | Efficient production of IgA in recombinant mammalian cells |
| US7297680B2 (en) | 1999-04-15 | 2007-11-20 | Crucell Holland B.V. | Compositions of erythropoietin isoforms comprising Lewis-X structures and high sialic acid content |
| US7604960B2 (en) * | 1999-04-15 | 2009-10-20 | Crucell Holland B.V. | Transient protein expression methods |
| US20050170463A1 (en) * | 1999-04-15 | 2005-08-04 | Abraham Bout | Recombinant protein production in permanent amniocytic cells that comprise nucleic acid encoding adenovirus E1A and E1B proteins |
| WO2003048348A2 (en) * | 2001-12-07 | 2003-06-12 | Crucell Holland B.V. | Production of viruses, viral isolates and vaccines |
| GB9912965D0 (en) * | 1999-06-03 | 1999-08-04 | Oxford Biomedica Ltd | In vivo selection method |
| WO2001004332A1 (en) * | 1999-07-08 | 2001-01-18 | Burkhard Hennemann | Method to improve viral infection |
| US7521220B2 (en) * | 1999-11-26 | 2009-04-21 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| US7192759B1 (en) | 1999-11-26 | 2007-03-20 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| US7527961B2 (en) * | 1999-11-26 | 2009-05-05 | Crucell Holland B.V. | Production of vaccines |
| US6884613B2 (en) | 2000-08-25 | 2005-04-26 | The General Hospital Corporation | Selective precipitation of viruses |
| PA8536201A1 (es) | 2000-12-29 | 2002-08-29 | Kenneth S Warren Inst Inc | Protección y mejoramiento de células, tejidos y órganos que responden a la eritropoyetina |
| US6531121B2 (en) | 2000-12-29 | 2003-03-11 | The Kenneth S. Warren Institute, Inc. | Protection and enhancement of erythropoietin-responsive cells, tissues and organs |
| CN1313158C (zh) * | 2001-06-20 | 2007-05-02 | 大日本住友制药株式会社 | 促进核酸转移的方法 |
| JP2005052001A (ja) * | 2001-07-05 | 2005-03-03 | Takara Bio Inc | 遺伝子治療剤 |
| WO2003016511A1 (en) | 2001-08-15 | 2003-02-27 | Takara Bio Inc. | Method of extended culture for antigen-specific cytotoxic t lumphocytes |
| KR100895231B1 (ko) | 2002-03-25 | 2009-05-04 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 세포상해성 림프구의 제조방법 |
| US20100143442A1 (en) | 2003-02-05 | 2010-06-10 | Queensland University Of Technology | Growth factor complexes and modulation of cell migration and growth |
| US20040219099A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-04 | Jasbir Sandhu | Method for the treatment of tumors |
| US20040220085A1 (en) * | 2003-05-02 | 2004-11-04 | Jasbir Sandhu | Compositions for nucleic acid delivery |
| EA008670B1 (ru) | 2003-05-09 | 2007-06-29 | Круселл Холланд Б.В. | Культуры e1-иммортализованных клеток и способы их культивирования с целью повышения выхода их продукции |
| DK1626992T3 (da) * | 2003-05-23 | 2010-09-20 | Crucell Holland Bv | Produktion af rekombinant IgM i PER.C6-celler |
| FR2857598A1 (fr) * | 2003-07-18 | 2005-01-21 | Inst Nat Sante Rech Med | Composes anti-angiogeniques, composition pharmaceutique les comprenant, et leur utilisation |
| EP1666589B1 (en) | 2003-08-22 | 2010-02-17 | Takara Bio Inc. | Process for producing cytotoxic lymphocytes |
| GB0410130D0 (en) * | 2004-05-06 | 2004-06-09 | Molmed Spa | Cell preparation |
| CN101031651B (zh) * | 2004-09-29 | 2010-06-16 | 宝生物工程株式会社 | 用于产生反转录病毒载体的细胞 |
| JPWO2006082958A1 (ja) * | 2005-02-07 | 2008-06-26 | タカラバイオ株式会社 | レトロウイルスの保存方法 |
| JP4860612B2 (ja) | 2005-06-15 | 2012-01-25 | タカラバイオ株式会社 | 脂肪細胞あるいは前駆脂肪細胞への遺伝子導入方法 |
| AU2006274438A1 (en) * | 2005-07-29 | 2007-02-01 | Australian Stem Cell Centre Limited | Compositions and methods for growth of pluripotent cells |
| CN101243184B (zh) | 2005-08-16 | 2011-12-14 | 宝生物工程株式会社 | 用于治疗或预防免疫缺陷病毒感染的核酸 |
| CN101243187B (zh) | 2005-08-17 | 2012-07-11 | 宝生物工程株式会社 | 淋巴细胞的制备方法 |
| JP4741906B2 (ja) * | 2005-08-31 | 2011-08-10 | タカラバイオ株式会社 | リンパ球の製造方法 |
| WO2007040105A1 (ja) | 2005-09-30 | 2007-04-12 | Takara Bio Inc. | Ｔ細胞集団の製造方法 |
| WO2007142300A1 (ja) | 2006-06-09 | 2007-12-13 | Takara Bio Inc. | リンパ球の製造方法 |
| WO2008133137A1 (ja) | 2007-04-20 | 2008-11-06 | Takara Bio Inc. | 遺伝子治療のためのベクター |
| EP2267118A4 (en) | 2008-03-27 | 2013-08-28 | Takara Bio Inc | METHOD FOR PRODUCING A TRANSFICED CELL |
| US9238797B2 (en) * | 2008-07-07 | 2016-01-19 | Takara Bio Inc. | Method for production of pluripotent stem cell |
| WO2010080032A2 (en) * | 2009-01-09 | 2010-07-15 | Stichting Het Nederlands Kanker Instituut | Bead-assisted viral transduction |
| CN102656263A (zh) | 2009-08-25 | 2012-09-05 | 宝生物工程株式会社 | 用于在视黄酸存在下制备t细胞群的方法 |
| EP2476752A4 (en) | 2009-09-11 | 2013-04-03 | Takara Bio Inc | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF NATURAL KILLER CELLS |
| RU2012127364A (ru) * | 2009-11-30 | 2014-01-10 | Квинсленд Юниверсити Оф Текнолоджи | Химеры фибронектин: фактор роста |
| US9228206B2 (en) | 2010-06-30 | 2016-01-05 | Takara Bio Inc. | Method for gene transfer |
| US8841126B2 (en) | 2010-06-30 | 2014-09-23 | Takara Bio Inc. | Method for gene transfer |
| US9861681B2 (en) | 2013-04-18 | 2018-01-09 | The United States of America as represented by the Secretary of the Army, on behalf of the United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases | Therapeutic compositions for neutralizing type I interferons, and methods of use |
| KR20190033568A (ko) | 2016-07-29 | 2019-03-29 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 줄기세포의 제조에 사용되는 피브로넥틴 프래그먼트 |
| US11524988B2 (en) | 2016-09-19 | 2022-12-13 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Artificial antigen presenting cells for genetic engineering of immune cells |
| CN108103045B (zh) * | 2016-11-25 | 2022-10-04 | 丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 | 脂肪酶及其应用 |
| WO2018156735A1 (en) * | 2017-02-22 | 2018-08-30 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Bispecific antibody for cancer immunotherapy |
| KR102692944B1 (ko) | 2017-02-22 | 2024-08-07 | 루머스 리미티드 | 광 가이드 광학 어셈블리 |
| KR20200112868A (ko) | 2018-01-25 | 2020-10-05 | 다카라 바이오 가부시키가이샤 | 림프구의 제조방법 |
| CN116300087A (zh) | 2019-01-24 | 2023-06-23 | 鲁姆斯有限公司 | 包括具有三阶段扩展的loe的光学系统 |
| CN114901793A (zh) * | 2019-12-30 | 2022-08-12 | 美国圣戈班性能塑料公司 | 用于细胞转导的容器和方法 |
| CN113444167B (zh) * | 2021-07-15 | 2022-09-30 | 陕西巨子生物技术有限公司 | 重组人胶原蛋白多肽及其应用 |
| CN114634984A (zh) * | 2022-02-02 | 2022-06-17 | 复旦大学 | 一种脑胶质瘤生物标记物mlkl基因及其应用 |
| WO2023213969A1 (en) * | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Juno Therapeutics Gmbh | Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use |
| CN114965839A (zh) * | 2022-05-11 | 2022-08-30 | 朗肽生物制药股份有限公司 | 人碱性成纤维细胞生长因子的肽图分析方法 |
| US20240167019A1 (en) * | 2022-11-18 | 2024-05-23 | Saint-Gobain Performance Plastics Corporation | Aptamers, containers and methods for cell transduction |
| CN117603343B (zh) * | 2024-01-19 | 2024-04-26 | 四川大学 | 阻断bFGF的胶原来源天然短肽及应用 |
| CN117645664A (zh) * | 2024-01-29 | 2024-03-05 | 英特菲尔(成都)生物制品有限责任公司 | 重组人纤连蛋白标准品及其制备方法、鉴定方法与应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8516421D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Biotechnology Interface Ltd | Fibronectins |
| JP2770926B2 (ja) * | 1985-12-17 | 1998-07-02 | サイナーゲン インコーポレーテッド | 毛管内皮細胞プロテアーゼ合成、ｄｎａ合成および遊走を促進することの出来るヒト胎盤血管形成誘導因子 |
| US5026839A (en) | 1985-12-17 | 1991-06-25 | Synergen, Inc | DNA encoding a basic fibroblast growth factor |
| US4994559A (en) | 1985-12-17 | 1991-02-19 | Synergen, Inc. | Human basic fibroblast growth factor |
| US5399346A (en) | 1989-06-14 | 1995-03-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Gene therapy |
| US5492890A (en) * | 1990-12-03 | 1996-02-20 | The Scripps Research Institute | Polypeptides for promoting cell attachment |
| DE4110409C2 (de) * | 1991-03-29 | 1999-05-27 | Boehringer Ingelheim Int | Neue Protein-Polykation-Konjugate |
| JP2829405B2 (ja) * | 1991-10-14 | 1998-11-25 | 寳酒造株式会社 | 機能性ポリペプチド |
| SE503225C2 (sv) * | 1991-10-30 | 1996-04-22 | Leif Lindholm Konsult Ab | Virus-antikroppskomplex för införing av virus i mammalieceller |
| CH685803A5 (fr) * | 1992-06-09 | 1995-10-13 | Francis Verdan | Bâton d'alun fixé dans un étui. |
| GB9223084D0 (en) * | 1992-11-04 | 1992-12-16 | Imp Cancer Res Tech | Compounds to target cells |
| US5686278A (en) * | 1994-03-25 | 1997-11-11 | Indiana University Foundation | Methods for enhanced retrovirus-mediated gene transfer |
| JPH1029952A (ja) | 1996-07-16 | 1998-02-03 | Takara Shuzo Co Ltd | ヒト免疫不全ウイルス感染の制御用組成物および制御方法 |
-
1996
- 1996-11-07 EP EP96937515A patent/EP0870839B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-07 AT AT96937515T patent/ATE325884T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-11-07 US US08/809,156 patent/US6472204B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-07 EA EA199800369A patent/EA003195B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-11-07 CA CA002235629A patent/CA2235629A1/en not_active Abandoned
- 1996-11-07 AU AU75058/96A patent/AU709831B2/en not_active Ceased
- 1996-11-07 KR KR10-2001-7008355A patent/KR100395420B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-11-07 EA EA200001110A patent/EA003204B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-11-07 KR KR10-1998-0703457A patent/KR100353115B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-11-07 CN CNB961996137A patent/CN100390290C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-07 EA EA200200837A patent/EA004928B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-11-07 JP JP51873197A patent/JP3343357B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-07 DE DE69636122T patent/DE69636122T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-07 ES ES96937515T patent/ES2259182T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-07 WO PCT/JP1996/003254 patent/WO1997018318A1/ja active IP Right Grant
-
1998
- 1998-05-11 MX MX9803706A patent/MX9803706A/es unknown
-
1999
- 1999-08-02 US US09/366,009 patent/US6426042B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-02-02 US US09/775,964 patent/US6949623B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2005
- 2005-07-14 US US11/181,091 patent/US7446170B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-09-30 US US12/241,581 patent/US7790849B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2259182T3 (es) | 2006-09-16 |
| ATE325884T1 (de) | 2006-06-15 |
| DE69636122D1 (de) | 2006-06-14 |
| US7790849B2 (en) | 2010-09-07 |
| CN1207774A (zh) | 1999-02-10 |
| KR100353115B1 (ko) | 2003-01-06 |
| US20090209730A1 (en) | 2009-08-20 |
| EP0870839B1 (en) | 2006-05-10 |
| DE69636122T2 (de) | 2006-12-07 |
| JP3343357B2 (ja) | 2002-11-11 |
| KR100395420B1 (ko) | 2003-08-21 |
| US20030087437A1 (en) | 2003-05-08 |
| KR19990067446A (ko) | 1999-08-16 |
| US6426042B1 (en) | 2002-07-30 |
| EA200200837A1 (ru) | 2002-12-26 |
| EA199800369A1 (ru) | 1998-12-24 |
| MX9803706A (es) | 1998-09-30 |
| US20060030046A1 (en) | 2006-02-09 |
| WO1997018318A1 (en) | 1997-05-22 |
| US7446170B2 (en) | 2008-11-04 |
| EA003204B1 (ru) | 2003-02-27 |
| US6949623B2 (en) | 2005-09-27 |
| US6472204B1 (en) | 2002-10-29 |
| EA003195B1 (ru) | 2003-02-27 |
| AU709831B2 (en) | 1999-09-09 |
| AU7505896A (en) | 1997-06-05 |
| CN100390290C (zh) | 2008-05-28 |
| EA200001110A1 (ru) | 2001-06-25 |
| EP0870839A1 (en) | 1998-10-14 |
| EP0870839A4 (en) | 2000-01-19 |
| CA2235629A1 (en) | 1997-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA004928B1 (ru) | Полипептиды, повышающие эффективность генного переноса в клетки-мишени с помощью ретровируса, и гены, их кодирующие | |
| KR101279172B1 (ko) | 림프구의 제조 방법 | |
| JP2003135086A (ja) | ウイルス仲介ｄｎａ導入の増強 | |
| KR100786054B1 (ko) | 세포상해성 림프구의 제조방법 | |
| CN103124784A (zh) | 用于扩增干细胞的方法和这些细胞的用途 | |
| WO1999005301A1 (fr) | Procede de transfert de genes a l'aide d'un milieu exempt de serum | |
| CN110157675B (zh) | 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用 | |
| CN113527434A (zh) | Wtn多肽及其在检测前列腺癌中的用途 | |
| US10781423B2 (en) | Method for producing B cell population | |
| CN110129272A (zh) | 稳定表达map3k8蛋白的pk-15细胞株及其构建和应用 | |
| CN113388586A (zh) | 一种溶瘤病毒ndv-nrp1及其构建方法与应用 | |
| CN112080510A (zh) | 靶向人源化gd2的嵌合抗原受体及其用途 | |
| JP4256271B2 (ja) | レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法 | |
| CN110526985A (zh) | 一种靶向egfr的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用 | |
| JP7523012B1 (ja) | ペプチドフラグメント及びその利用 | |
| WO2000056368A1 (fr) | Therapeutique genique | |
| CN117925535A (zh) | 一种car-t细胞的培养方法 | |
| CN118754994A (zh) | 表达Lamp2b-CXCR4融合蛋白的骨髓间充质干细胞来源外泌体及其应用 | |
| CN117247466A (zh) | 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合抗原受体及其用途 | |
| CN112430577A (zh) | 靶向EGFRvⅢ并干扰IL-6表达的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用 | |
| JP2002325595A (ja) | レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC4A | Registration of transfer of a eurasian patent by assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |