JP2002325595A - レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 簡便かつ効率のよい遺伝子導入法を提供する
こと。 【解決手段】 レトロウイルスによる標的細胞への遺伝
子導入効率を向上させる方法において、標的細胞結合部
位と線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン
由来のレトロウイルス結合部位またはそれらと機能的な
同等物とを同一分子上に有する有効量の機能性物質の存
在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることを
特徴とするレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導
入を向上させる方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医学、細胞工学、
遺伝子工学、発生工学などの分野において標的細胞への
遺伝子導入効率を向上させ、標的細胞の形質転換を効率
良く行うことを可能にする方法およびそれに関連する一
連の技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】多数のヒト疾病についてその機構が解明
され、また、組換えＤＮＡ技術、および細胞への遺伝子
導入技術が急速に進歩したことより、近年、重篤な遺伝
病を治療するための体細胞遺伝子治療法のプロトコール
の開発が進められている。また、最近では遺伝病のみな
らずＡＩＤＳのようなウイルス感染症やガンの治療にも
遺伝子治療を適用しようという試みがなされている。

【０００３】これまでに米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が
承認したヒトでの遺伝子導入試験の大部分は組換えレト
ロウイルスベクターを用いて細胞への遺伝子導入を行う
ものである。レトロウイルスベクターは目的の外来遺伝
子を細胞内に効率的に導入し、その染色体ＤＮＡ中に安
定に組み込むので、特に長期にわたる遺伝子発現が望ま
れる遺伝子治療にとって好ましい遺伝子導入手段であ
る。該ベクターは遺伝子導入された生物に悪影響を与え
ないように様々な工夫が施されている。例えば、遺伝子
導入に用いられたベクター自体が細胞内で複製を行い、
無制限な感染（遺伝子導入）を繰り返さないよう、ベク
ター中の複製機能は欠損させてある。これらのベクター
（複製能欠損レトロウイルスベクター）は自己複製でき
ないため、一般的にはレトロウイルス産生細胞（パッケ
ージング細胞）を使用してウイルス粒子に包まれたレト
ロウイルスベクターを調製する。

【０００４】一方、骨髄細胞はイン−ビトロ（in vitr
o）での取り扱いが可能なこと、および自己複製能を有
する造血幹細胞を含有していることから、体細胞遺伝子
治療法の良好な標的細胞である。また、臍帯血液も造血
幹細胞を含む多数の原始前駆細胞を含有していることが
これまでに証明されている。これらの標的細胞に遺伝子
を導入して生体に移植する遺伝子治療を行うことによ
り、導入された遺伝子が血液細胞中で長期にわたり発現
され、疾病を生涯治癒することができる。

【０００５】しかし、多数のグループによって研究が進
められているにもかかわらず、造血幹細胞は高効率の遺
伝子導入の難しい細胞の一つである。これまで、マウス
やその他の動物の造血幹細胞に関して最も効率の良い遺
伝子導入のプロトコールは、造血幹細胞をレトロウイル
ス産生細胞とともに共培養するという方法であったが、
安全性についての懸念から、ヒトにおける臨床的な遺伝
子治療法には、レトロウイルス産生細胞の混入の危険性
の低い無細胞系での遺伝子導入が望まれている。残念な
がら、レトロウイルス産生細胞との共培養を行わずに造
血幹細胞に効率的に遺伝子を導入することは容易ではな
い。

【０００６】最近、細胞外マトリックスの成分であるフ
ィブロネクチンや、そのフラグメントが、単独でレトロ
ウイルスによる細胞への遺伝子導入効率を向上させるこ
とが報告されている（J. Clin. Invest.、第93巻、第14
51〜1457頁、1994年、Blood、第88巻、第855〜862頁、1
996年）。また、遺伝子工学的に生産されたフィブロネ
クチンフラグメントも同様の性質を有しており、これを
利用して造血幹細胞に効率よく外来遺伝子を導入させる
ことが可能であることも示された（ＷＯ９５／２６２０
０号）。こうしたフィブロネクチンによる遺伝子導入効
率の向上には、フィブロネクチン中のヘパリン結合領域
と、レトロウイルスとの結合が関与していることが示唆
されている。これらのフィブロネクチンや、フィブロネ
クチンフラグメントを利用した方法は、全てフィブロネ
クチンや、そのフラグメントを固定化したプレート中で
細胞にレトロウイルスベクターを感染させるものであ
る。

【０００７】上記のフィブロネクチンや、フィブロネク
チンフラグメントを利用した遺伝子導入法は、レトロウ
イルス結合部位と標的細胞部位を同一の分子上に有する
フィブロネクチンあるいはそのフラグメント分子によっ
て達成されると考えられている(Nature Medicine、第2
巻、第876〜872頁、1996年)。したがって、上記の方法
を応用して種々の標的細胞に効率良く遺伝子を導入する
ためには、細胞に応じて一つの分子上にウイルスと細胞
の結合部位を有する機能性物質を作製する必要があり、
普遍的な遺伝子導入法として利用するためには、なお問
題を有している。

【０００８】また、上記の方法は、レトロウイルス感染
時に標的細胞の培養に使用するプレートの表面にフィブ
ロネクチンあるいはフィブロネクチンフラグメントを固
定化することによって達成されているが、プレートへの
固定化は煩雑な操作を要し、簡便な遺伝子導入法とは言
えない。

【０００９】さらに、上記の方法に使用される機能性物
質は、レトロウイルス結合部位としてフィブロネクチン
由来のヘパリン結合領域を含むものに限られている。こ
のため、これ以外のレトロウイルス結合物質を見いだす
ことにより、さらに優れた遺伝子導入方法を開発する可
能性がある。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
問題を解決し、より簡便かつ効率のよい遺伝子導入法を
提供すべくなされたものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、フィブロ
ネクチンあるいはそのフラグメントに代表される機能性
物質によるレトロウイルス感染促進作用が、レトロウイ
ルス結合部位を有する領域と、細胞結合部位を有する領
域とが同一分子上に存在しない場合においても認められ
ることを見いだした。すなわち、レトロウイルス結合部
位を有する有効量の機能性物質と、遺伝子導入の標的細
胞への結合部位を有する機能性物質とを混合して使用す
ることにより、標的細胞へのレトロウイルスによる遺伝
子導入効率を向上させることができることを見いだし
た。

【００１２】また、本発明者らは、機能性物質によるレ
トロウイルス感染促進作用が、機能性物質をプレートの
表面に固定化しない状態であっても認められることも見
いだした。また、機能性物質を固定化したビーズの存在
下にレトロウイルスを標的細胞に接触させた場合にも、
標的細胞への遺伝子導入効率が向上されることを見いだ
した。

【００１３】本発明者らは、また、フィブロネクチン由
来のヘパリン結合領域を含まないレトロウイルス結合性
物質を見いだし、該物質およびそれらの誘導体がレトロ
ウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に有用であるこ
とも見いだした。さらに、本発明者らは、レトロウイル
スによる標的細胞への遺伝子導入に有用な機能性物質を
創成することに成功し、本発明を完成させるに至った。

【００１４】かくして、本発明の第１の発明はレトロウ
イルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる
方法に関し、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子
導入において、レトロウイルス結合部位を有する有効量
の機能性物質と、標的細胞結合部位を有する他の有効量
の機能性物質との混合物の存在下で、標的細胞をレトロ
ウイルスで感染させることを特徴とする。

【００１５】本発明の第１の発明のレトロウイルス結合
部位を有する機能性物質は特に限定するものではなく、
例えば、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域、
線維芽細胞増殖因子、コラーゲン、ポリリジンまたはそ
れらと機能的な同等物から選択される機能性物質であ
る。また、標的細胞結合部位を有する機能性物質とは、
標的細胞に結合するリガンドを含有する物質であればよ
い。当該リガンドとしては、細胞接着性のタンパク質、
ホルモン、サイトカイン、抗体、糖鎖、炭水化物または
標的細胞の代謝物等があり、細胞接着性のタンパク質と
しては、例えば、フィブロネクチンの細胞結合領域ポリ
ペプチドがある。当該フィブロネクチンの細胞結合領域
としては、ＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結
合領域ポリペプチドがある。また、他のリガンドとして
はエリスロポエチンが挙げられる。

【００１６】第１の発明に使用する機能性物質は非固定
化でも、固定化されていてもよく、特にビーズに固定化
することにより、簡便に使用できる。また、標的細胞に
結合部位を有する機能性物質として、標的細胞に特異的
なリガンドを選択することにより、第１の発明により、
簡便に標的細胞への遺伝子導入のターゲッテングが可能
になる。

【００１７】上記のごとく、従来のＷＯ９５／２６２０
０号や、Nature Medicineに開示される方法において
は、レトロウイルスと標的細胞が、レトロウイルス結合
部位と標的細胞結合部位とを同一分子上に有する機能性
物質上で共配置することが、レトロウイルスによる標的
細胞への遺伝子導入効率を向上させる機構において必須
とされている。しかしながら、本発明により、レトロウ
イルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、標的細
胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質との混合物
の存在下でレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導
入を行うと、遺伝子導入効率が向上する。

【００１８】本発明の第２の発明は、レトロウイルス結
合部位を有する有効量の機能性物質と、標的細胞結合部
位を有する他の有効量の機能性物質との混合物を含有す
るレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用
する標的細胞の培養培地に関する。

【００１９】第２の発明の培地を使用することにより、
第１の発明が簡便に実施することができる。

【００２０】本発明の第３の発明はレトロウイルスの配
置方法に関し、レトロウイルス結合部位を有する有効量
の機能性物質と、標的細胞結合部位を有する他の有効量
の機能性物質との混合物と接触したレトロウイルスを含
有する培地を、インキュベートすることを特徴とする。

【００２１】本発明の第４の発明は、標的細胞内へのレ
トロウイルス介在遺伝子導入の実施に使用するためのキ
ットであって、（ａ）レトロウイルス結合部位を有する
有効量の機能性物質および／または標的細胞結合部位を
有する他の有効量の機能性物質、（ｂ）レトロウイルス
と接触した標的細胞をインキュベートするための人工基
質、および（ｃ）上記標的細胞を予備刺激するための標
的細胞増殖因子、を含んでなることを特徴とするキット
に関する。

【００２２】第４の発明のキットを使用することによ
り、第１および第３の態様をそれぞれ簡便に行うことが
できる。

【００２３】本発明の第５の発明は、レトロウイルスに
よる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法に関
し、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に際
し、標的細胞結合部位と、線維芽細胞増殖因子、コラー
ゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位ま
たはそれらと機能的な同等物とを同一分子上に有する有
効量の機能性物質の存在下で、標的細胞をレトロウイル
スで感染させることを特徴とするレトロウイルスによる
標的細胞への遺伝子導入を向上させる方法である。

【００２４】上記のＷＯ９５／２６２００号公報および
Nature Medicineに記載される従来の方法においては、
最も効率よく、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝
子導入を向上させる方法に使用できる物質として、フィ
ブロネクチンのフラグメントが開示されている。しかし
ながら、フィブロネクチンフラグメント以外の機能性物
質でどのような機能性物質が効率よくレトロウイルスに
よる標的細胞への遺伝子導入を向上させる方法に使用で
きるかについては、具体的な開示はない。特に、この従
来の方法において、レトロウイルス結合部位とは、フィ
ブロネクチンのリピート１２−１４が開示されているの
みである。

【００２５】本発明者らは、このフィブロネクチンのリ
ピート１２−１４とは、構造的相関の全くない、線維芽
細胞増殖因子、コラーゲン、ポリリジン等が、意外に
も、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入を向
上させる方法において有効に使用できることを見いだし
た。したがって、これらの物質と機能的な同等物、すな
わち、これらの物質と機能的に同等のレトロウイルス結
合部位を有し、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝
子導入効率を向上させる能力を有する物質は、いずれも
第５の発明において使用することができる。

【００２６】第５の発明において、標的細胞結合部位に
は、標的細胞に結合するリガンドを含有する物質が使用
でき、これはレトロウイルス結合部位と結合している。

【００２７】当該リガンドとしては、例えば、細胞接着
性のタンパク質、ホルモン、サイトカイン、抗体、糖
鎖、炭水化物または標的細胞の代謝物等が挙げられる。
細胞接着性のタンパク質の一例としては、フィブロネク
チンの細胞結合領域ポリペプチドが挙げられ、例えば、
ＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結合領域ポリ
ペプチドが使用できる。他のリガンドとしては、エリス
ロポエチンが挙げられる。

【００２８】第５の発明において、レトロウイルス結合
部位として供される線維芽細胞増殖因子としては、例え
ば、配列表の配列番号３で表される線維芽細胞増殖因
子、該因子の機能的同等物や、該因子または該因子の機
能的同等物を含有するポリペプチドから選択される線維
芽細胞増殖因子がある。

【００２９】これらの機能性物質としては、例えば、配
列表の配列番号４または５で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドが挙げられる。

【００３０】第５の発明において、レトロウイルス結合
部位として供されるコラーゲンとしては、例えば、Ｖ型
コラーゲン由来のインスリン結合部位を含有するフラグ
メント、該フラグメントの機能的同等物や、該フラグメ
ントまたは該フラグメントの機能的同等物を含有するポ
リペプチドから選択されるコラーゲンがある。また、当
該フラグメントとしては、例えば、配列表の配列番号６
で表されるアミノ酸配列を含有するフラグメントが挙げ
られる。

【００３１】これらの機能性物質としては、配列表の配
列番号７または８で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドが挙げられる。

【００３２】第５の発明において、レトロウイルス結合
部位として供されるポリリジン（polylysine）とはＬ−
リジン（lysine）の重合体であって、例えば、市販のポ
リリジンより適当な重合度のポリリジンを選択し使用す
ることができる。

【００３３】線維芽細胞増殖因子、コラーゲン、または
ポリリジン由来のレトロウイルス結合部位が同時に標的
細胞結合部位を有する場合においては、この線維芽細胞
増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウ
イルス結合部位を有する有効量の機能性物質の存在下
で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることによっ
て、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率
を向上させることができる。また、標的細胞が接着性細
胞の場合には、該機能性物質にレトロウイルスと標的細
胞とがそれぞれ結合、接着し、この線維芽細胞増殖因
子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス
結合部位を有する有効量の機能性物質の存在下で、標的
細胞をレトロウイルスで感染させることによって、レト
ロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上さ
せることができる。

【００３４】なお、配列表の配列番号１で表されるポリ
ペプチド（以下、Ｈ−２７１と称す）が同時に標的細胞
結合部位を有する場合、すなわち、標的細胞が該ポリペ
プチド、Ｈ−２７１、に結合性を有する場合において
も、有効量のこのポリペプチドの存在下で、標的細胞を
レトロウイルスで感染させることによって、レトロウイ
ルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるこ
とができることも見いだした。

【００３５】すなわち、上記Nature Medicineによれ
ば、フィブロネクチンのリピート１２−１４がレトロウ
イルス結合部位と開示されているが、本発明者らは、意
外にも、このＨ−２７１が標的細胞の種類によっては、
標的細胞結合部位として、レトロウイルスによる標的細
胞への遺伝子導入効率の向上に有効に機能することを見
いだした。また、標的細胞が接着性細胞の場合にも、こ
のポリペプチドにレトロウイルス、標的細胞がそれぞれ
結合、接着し、有効量のこのポリペプチドの存在下で、
標的細胞をレトロウイルスで感染させることによって、
レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向
上させることができることも見いだした。

【００３６】第５の発明において当該機能性物質は固定
化されていてもよく、固定化されていなくてもよいが、
標的細胞が接着性細胞の場合は、固定化して用いるのが
効率の良い方法である。

【００３７】本発明の第６の発明は、標的細胞結合部位
と、線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン
由来のレトロウイルス結合部位またはそれらと機能的な
同等物とを同一分子上に有する有効量の機能性物を含有
するレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に使
用する標的細胞の培養培地に関する。

【００３８】本発明の第７の発明は、上記した線維芽細
胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロ
ウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と接触し
たレトロウイルスを含有する培地をインキュベートする
レトロウイルスの配置方法に関する。これらの機能性物
質は、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入を
向上させる方法において、レトロウイルスの配置に有効
に使用できる。

【００３９】また、本発明のレトロウイルスの配置方法
では、標的細胞結合部位と線維芽細胞増殖因子、コラー
ゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位ま
たはそれらと機能的な同等物とを同一分子上に有する有
効量の機能性物質と接触したレトロウイルスを含有する
培地をインキュベートすることも包含する。

【００４０】本発明の第８の発明は、標的細胞内へのレ
トロウイルス介在遺伝子導入の実施に使用するためのキ
ットであって、（ａ）標的細胞結合部位と、線維芽細胞
増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウ
イルス結合部位またはそれらと機能的な同等物とを同一
分子上に有する有効量の機能性物質、（ｂ）レトロウイ
ルスと接触した標的細胞をインキュベートするための人
工基質、および（ｃ）上記標的細胞を予備刺激するため
の標的細胞増殖因子、を含んでなることを特徴とするキ
ットに関する。

【００４１】これらの第１および第５の方法の発明、第
２および第６の培地の発明、第３および第７の方法の発
明ならびに第４および第８のキットの発明、いずれにお
いても、機能性物質のビーズ固定化物が好適に使用でき
る。

【００４２】本発明の第９の発明は、レトロウイルスに
よる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法に関
し、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入にお
いて、実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋
なフィブロネクチンフラグメントおよびそれらの混合物
より選択される有効量のビーズに固定化された機能性物
質の存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させる
ことを特徴とする。

【００４３】本発明の第１０の発明もレトロウイルスに
よる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法に関
し、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入にお
いて、実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋
なフィブロネクチンフラグメントおよびそれらの混合物
より選択される有効量の固定化されていない機能性物質
の存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させるこ
とを特徴とする。

【００４４】上記のＷＯ９５／２６２００号およびNatu
re Medicineの方法においては、レトロウイルスと標的
細胞が、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位を
同一分子上に有する機能性物質上で共配置することが、
レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向
上させる機構において必須である。この方法において、
レトロウイルスと標的細胞を、レトロウイルス結合部位
と標的細胞結合部位を同一分子上に有する機能性物質上
に共配置させるには、レトロウイルス結合部位と標的細
胞結合部位を同一分子上に有する機能性物質を培養基に
固定化させることによりはじめて可能になる。

【００４５】しかしながら、本発明によれば、これらの
実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィ
ブロネクチンフラグメントおよびそれらの混合物を用い
る場合においても、意外にも、上記レトロウイルス結合
部位と標的細胞結合部位を同一分子上に有する機能性物
質上が培養基に固定化された状態でなくても、効率よ
く、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率
が向上する。

【００４６】第１、第５、第９および第１０の発明にお
いて、標的細胞としては、例えば、幹細胞（stem cell
s）、造血細胞、非接着性低密度単核細胞、接着性細
胞、骨髄細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞、臍帯血液細
胞、胎児性造血幹細胞、胚形成幹細胞、胚細胞、プライ
モディアル・ジャーム・セル（primordial germ cel
l）、卵母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子、Ｃ
Ｄ３４＋細胞、Ｃ−ｋｉｔ＋細胞、多能性造血前駆細
胞、単能性造血前駆細胞、赤血球系前駆細胞、リンパ球
母細胞、成熟血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、線維芽
細胞、神経芽細胞、神経細胞、内皮細胞、血管内皮細
胞、肝細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ガン
細胞、骨髄腫細胞および白血病細胞から選択される細胞
が使用できる。

【００４７】第１、第３、第５、第７、第９および第１
０の発明において、レトロウイルスとしては、外来遺伝
子を含有するレトロウイルスを使用することができ、ま
た、レトロウイルスとしては、例えば、組換え体レトロ
ウイルスベクターが使用できる。さらに、レトロウイル
スとしては、例えば、複製能を欠損した組換え体レトロ
ウイルスベクターを使用することができる。

【００４８】本発明の第１１の発明は、上記の第１、第
５、第９および第１０の発明で得られる遺伝子導入細胞
に関する。

【００４９】本発明の第１２の発明は、第１１の発明の
遺伝子導入細胞を脊椎動物に移植する細胞移植方法に関
する。

【００５０】本発明の第１３の発明は、配列表の配列番
号１３で表されるレトロウイルスによる標的細胞への遺
伝子導入効率を向上させるポリペプチドまたはその機能
的同等物に関する。

【００５１】本発明の第１４の発明は、第１３の発明の
ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。かかる遺伝
子の例としては、配列表の配列番号１７で表される遺伝
子または厳密な条件下で該遺伝子にハイブリダイズし、
レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向
上させるポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられ
る。

【００５２】上記ＷＯ９５／２６２００号およびNature
Medicineの方法において、最も効率よく遺伝子導入に
使用できるのはＣＨ−２９６である。一方、本発明者ら
は、ＶＬＡ−５結合部位、ＶＬＡ−４結合部位を有さな
い、上記ポリペプチドが意外にも、本発明に使用できる
ことを見いだした。

【００５３】本発明の第１５の発明は、配列表の配列番
号３０で表されるレトロウイルスによる標的細胞への遺
伝子導入効率を向上させるポリペプチドまたはその機能
的同等物に関する。

【００５４】本発明の第１６の発明は、第１５の発明の
ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。かかる遺伝
子の例としては、配列表の配列番号３３で表される遺伝
子または厳密な条件下で該遺伝子にハイブリダイズし、
レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向
上させるポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられ
る。

【００５５】本発明の第１７の発明は配列表の配列番号
５で表されるレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子
導入効率を向上させるポリペプチドまたはその機能的同
等物に関する。

【００５６】本発明の第１８の発明は、第１７の発明の
ポリペプチドをコードする遺伝子に関する。かかる遺伝
子の例としては、配列表の配列番号２６で表される遺伝
子または厳密な条件下で該遺伝子にハイブリダイズし、
レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向
上させるポリペプチドをコードする遺伝子がある。

【００５７】

【発明の実施の形態】本発明の遺伝子導入方法には、通
常、組換えレトロウイルスベクターが使用され、特に、
複製能欠損組換えレトロウイルスベクターが好適であ
る。該ベクターは感染した細胞中で自己複製できないよ
うに複製能を欠損させてあり、非病原性である。これら
のベクターは脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のよう
な宿主細胞に侵入し、その染色体ＤＮＡ中にベクターに
挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。

【００５８】本発明では、細胞に導入しようとする外来
遺伝子は適当なプロモーター、例えば、レトロウイルス
ベクター中に存在するＬＴＲのプロモーターや外来プロ
モーターの制御下に、組換えレトロウイルスベクター内
に挿入して使用することができる。また、外来遺伝子の
転写を達成するためにはプロモーターおよび転写開始部
位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列
がベクター内に存在していてもよい。さらに、好ましく
は、導入された遺伝子はその下流にターミネーター配列
を含有することができる。導入される外来遺伝子は天然
のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、
あるいは起源を異にするＤＮＡ分子が、ライゲーション
や当該技術分野で公知の他の手段によって結合されたも
のであってもよい。

【００５９】レトロウイルスベクターに挿入される外来
遺伝子は、細胞中に導入することが望まれる任意の遺伝
子を選ぶことができる。例えば、外来遺伝子は、治療の
対象となる疾患に関連している酵素や、タンパク質、ア
ンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはフォルスプラ
イマー（例えば、ＷＯ９０／１３６４１号参照）、細胞
内抗体(例えば、ＷＯ９４／０２６１０号参照)、増殖因
子等をコードするものを使用することができる。

【００６０】本発明で用いるレトロウイルスベクター
は、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマ
ーカー遺伝子を有していてもよい。マーカー遺伝子とし
ては、例えば、細胞に抗生物質に対する耐性を付与する
薬剤耐性遺伝子や、酵素活性の検出によって遺伝子導入
された細胞を見分けることができるレポーター遺伝子が
利用できる。

【００６１】使用できるベクターには、例えば、公知の
ＭＦＧベクター（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６８７５４）やα−
ＳＧＣ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．６８７５５）等のレトロウイ
ルスベクターがある。また、本願明細書の下記の実施例
において使用したＮ2／ＺipＴＫＮＥＯベクター（ＴＫ
ＮＥＯ、Blood、第78巻、第310〜317頁、1991年）およ
びＰＭ５ｎｅｏベクター（Exp. Hematol.、第23巻、第6
30〜638頁、1995年）は、いずれもマーカー遺伝子とし
てネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子）を含有している。したがって、こ
れらのベクターによって遺伝子導入された細胞は該遺伝
子産物により不活化される抗生物質（ネオマイシン、Ｇ
４１８等）に対する耐性を有する細胞として確認するこ
とができる。また、これらのベクターは公知のパッケー
ジング細胞株、例えば、公知のＰＧ１３（ＡＴＣＣ Ｃ
ＲＬ−１０６８６）、ＰＧ１３／ＬＮｃ８（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−１０６８５）、ＰＭ３１７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ
−９０７８）や米国特許５,２７８,０５６号に記載の細
胞株、ＧＰ＋Ｅ−８６（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９６４２）や
ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（ＡＴＣＣ ＣＲＬ９６４１）
等の細胞株を使用することにより、該ベクターがパッケ
ージングされたウイルス粒子として調製することができ
る。

【００６２】本明細書において、機能性物質の有効量と
は、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入によ
り、標的細胞の形質転換が生じるのに有効な量であり、
用いる機能性物質、レトロウイルスおよび標的細胞の種
類により、本明細書記載の方法により、選定することが
できる。また、遺伝子導入効率とは、形質転換効率を意
味する。

【００６３】レトロウイルスと結合し、その結果、本発
明で有効に役立つ機能性物質の能力は、下記実施例に記
載したような、定型的な方法を使用して確認することが
できる。

【００６４】これらのアッセイは、レトロウイルス粒子
がマトリックス上に固定された本発明に使用できる機能
性物質と結合して、その結果、レトロウイルスがマトリ
ックスからの洗い流しに抵抗する程度を測定する。簡単
に言えば、例えば、ウイルス含有上清液を、レトロウイ
ルス結合部位を有する機能性物質の固定物を含有するウ
エル中でインキュベートする。ついで、このウエルを生
理的食塩緩衝液で徹底的に洗浄し、その後、標的細胞を
ウエル内でインキュベートしてウエル内に残存している
ウイルスの感染活性値を測定する。最初にウエルに添加
されたウイルス上清液と比較して、感染活性または力価
の減少を評価し、類似する対照実施（例えば、ＢＳＡ固
定化ウエルを使用して）と比較する。対照ウエルと比較
して、本発明の機能性物質を固定化したウエル内の残存
力価が顕著に高いことは、当該物質が本発明のレトロウ
イルス結合部位を有する機能性物質として用いることが
できることを意味する。

【００６５】このスクリーニング方法を促進するため
に、ウイルスベクターは選択可能なマーカー遺伝子を含
有することができる。

【００６６】この方法により、本発明で使用するレトロ
ウイルス結合部位を有する機能性物質のスクリーニング
を行うことができる。

【００６７】このようなレトロウイルス結合部位を有す
る機能性物質としては、フィブロネクチンのヘパリン−
ＩＩ結合領域、線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたは
ポリリジン由来のレトロウイルス結合部位を有する機能
性物質が挙げられる。

【００６８】本発明で使用される機能性物質の細胞結合
部位、すなわち、標的細胞結合性のリガンドを含有する
物質と、細胞との結合は慣用の方法を使用して同様にア
ッセイすることができる。例えば、このような方法に
は、Nature ３５２：４３８〜４４１（１９９１年）に
記載された方法が含まれる。

【００６９】簡単に言えば、細胞結合部位を有する機能
性物質を培養プレート上に固定化し、アッセイすべき細
胞集団は培地に重層して３０分から２時間置く。このイ
ンキュベーション期間後に、機能性物質に接着していな
い細胞を回収し、計数し、生存性についてアッセイす
る。機能性物質と接着した細胞もトリプシンまたは細胞
解離緩衝液（例えば、Gibco）を使用して回収し、計数
し、そして生存性を試験する。場合によっては、例え
ば、造血コロニー形成細胞では、細胞をさらに１２〜１
４日間培養して細胞のコロニー形成特性を確認する。つ
いで、接着細胞の割合を計算し、ウシ血清アルブミン
（ＢＳＡ）を固定化した培養プレートのような標準ない
し標準対照と比較する。標的細胞とアッセイした機能性
物質の実質的な結合によって、機能性物質／細胞の組合
せが本発明に適しており、この標的細胞結合部位を有す
る機能性物質を、レトロウイルス結合部位を有する機能
性物質と結合または共存させて、ウイルスベクターによ
る標的細胞の感染を測定することによって、本発明に使
用する機能性物質を構築することができる。

【００７０】本発明に使用できるレトロウイルス結合部
位を有する機能性物質としては、上記のように、線維芽
細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレト
ロウイルス結合部位が選択できるが、これらの物質と同
等のレトロウイルス結合活性を有し、標的細胞結合部位
を有するリガンドとの結合または共存において、レトロ
ウイルスによる標的細胞の遺伝子導入効率を向上させる
物質は全て、線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポ
リリジン由来のレトロウイルス結合部位と機能的な同等
物に包含される。

【００７１】上記方法により、選定されたレトロウイル
ス結合部位を有する機能性物質と、標的細胞結合部位を
有する機能性物質との結合または共存下において、本発
明の遺伝子導入方法に使用する標的細胞、レトロウイル
スを使用し、その遺伝子導入効率の向上性を測定するこ
とにより本発明に使用する機能性物質の有効量が決定で
きる。

【００７２】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
１つの態様は、レトロウイルスベクターによる標的細胞
への遺伝子導入効率を高める方法である。この方法は、
レトロウイルスベクターによる細胞への遺伝子導入効率
を高めるのに有効な、レトロウイルス結合部位を有する
機能性物質と、標的細胞結合部位を有する他の機能性物
質との混合物の共存下にレトロウイルスベクターを生存
可能な標的細胞に感染させることを特徴とする。

【００７３】この方法は、レトロウイルスベクターによ
って遺伝子導入された遺伝子導入細胞を得る方法として
使用でき、該細胞を生物個体に移植することによる生物
個体への遺伝子導入を可能にする。

【００７４】用いるレトロウイルス結合部位を有する機
能性物質としては、特に限定はなく、例えば、フィブロ
ネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域、線維芽細胞増殖因
子、コラーゲン、ポリリジン等があり、またこれらの機
能性物質と機能的に同等な物質、例えば、ヘパリン結合
性部位を有する機能性物質も使用することができる。ま
た、該機能性物質の混合物、該機能性物質を含有するポ
リペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘
導体等を使用することができる。これらの機能性物質
は、天然起源の物質から得ることができ、また、人為的
に作製する（例えば、遺伝子組換え技術や化学合成技術
によって作製する）ことができ、さらに、天然起源の物
質と人為的に作製された物質との組合せにより作製する
こともできる。

【００７５】なお、用いる機能性物質は、本明細書中に
示される高効率での遺伝子導入の達成が可能なレトロウ
イルス結合部位および／または標的細胞結合部位を有し
ている範囲においては、天然起源のポリペプチドのアミ
ノ酸配列に変異が生じたものであってもよい。本明細書
においては天然起源のポリペプチドのアミノ酸配列中の
１あるいは、例えば、数個までの複数のアミノ酸が欠
失、置換、挿入および／または付加されていても、所望
のレトロウイルス結合部位および／または標的細胞結合
部位を有する限り、そのポリペプチドを天然アミノ酸配
列を有するポリペプチドの機能的同等物と呼ぶ。これら
の機能的同等物は、該機能的同等物をコードする遺伝子
を作製、使用して当該機能的同等物を作製したうえ、そ
の生物活性を確認することにより得ることができる。

【００７６】この点に関して、関連バイオテクノロジー
技術は、対象の機能的領域中のアミノ酸の欠失、置換、
付加または他の修飾を定型的に実施することができる状
態にまで進歩している。つぎに、得られたアミノ酸配列
は、所望の細胞結合活性またはウイルス結合活性につい
て定型的に上記のスクリーニングに付すことができる。

【００７７】また、該機能性同等物をコードする遺伝子
は、上記の機能性物質をコードする遺伝子にハイブリダ
イズする遺伝子を検索することにより、得ることができ
る。

【００７８】すなわち、上記の機能性物質をコードする
遺伝子またはその塩基配列の一部をハイブリダイゼーシ
ョンのプローブまたはＰＣＲ等の遺伝子増幅法のプライ
マーに用いることにより、本酵素類似の活性を有するタ
ンパクをコードする遺伝子をスクリーニングすることが
できる。なお、該方法では目的の遺伝子の一部のみを含
むＤＮＡ断片が得られることがあるが、その際には、得
られたＤＮＡ断片の塩基配列を調べてそれが目的の遺伝
子の一部であることを確かめた上、該ＤＮＡ断片または
その一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行
うか、または該ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて合成さ
れたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的
の遺伝子全体を取得することができる。

【００７９】上記のハイブリダイゼーションは、例え
ば、以下の条件で行うことができる。すなわち、ＤＮＡ
を固定したメンブレンを０．５％ ＳＤＳ、０．１％ ウ
シ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ ポリビニルピ
ロリドン、０．１％ フィコール４００、０．０１％ 変
性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、
ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、
プローブとともにインキュベートする。インキュベーシ
ョン終了後、０．５％ ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３
７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１×までの
範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固
定されたＤＮＡ由来のシグナルがバックグラウンドと区
別できるようになるまでメンブレンを洗浄する。

【００８０】また、こうして得られた新たな遺伝子につ
いて、そこにコードされているタンパクの有する活性
を、上記と同様の方法によって調べることにより、得ら
れた遺伝子が目的とするものであるかどうかを確認する
ことができる。

【００８１】上記ＷＯ９５／２６２００号に記載のよう
に、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域はレト
ロウイルス結合部位を有するポリペプチドである。繊維
芽細胞増殖因子、コラーゲン、ポリリジンはフィブロネ
クチンのヘパリン−ＩＩ結合領域との間に構造的な類似
（例えば、アミノ酸配列上の類似性）が見られる物質で
はないが、本発明者らは、これらの物質がレトロウイル
ス結合部位を有していることを見いだした。

【００８２】本発明に使用される標的細胞結合部位を有
する機能性物質も、特に限定はないが、標的細胞に結合
するリガンドを有する物質であり、該リガンドとしては
細胞接着性のタンパク質、ホルモンやサイトカイン、細
胞表面の抗原に対する抗体、多糖類や糖タンパク、糖脂
質中の糖鎖、あるいは標的細胞の代謝物などが挙げられ
る。また、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機
能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体、該機能性物
質の機能的同等物等を使用することもできる。これらの
機能性物質は天然起源の物質から得ることができ、ま
た、人為的に作製する（例えば、遺伝子組換え技術や化
学合成技術によって作製する）ことができ、さらに、天
然起源の物質と人為的に作製された物質との組合せによ
り作製することもできる。

【００８３】使用される細胞接着タンパク質としては、
フィブロネクチンやそのフラグメントがある。例えば、
米国特許第５,１９８,４２３号に記載の、Ｐｒｏ1239−
Ｓｅｒ1515に対応するヒトフィブロネクチンの細胞結合
ドメインは、本明細書に記載のポリペプチドＣ−２７４
と同等の機能を有しており、ＢＨＫおよびＢ１６−Ｆ１
０細胞等と結合することが示されている（J.Biochem.、
第110巻、第285〜291頁、1991年）。これらのポリペプ
チド中に存在するＲＧＤＳの４アミノ酸からなる配列は
ＶＬＡ−５レセプターのリガンドである。ＶＬＡ−５レ
セプターの発現は広範な細胞において見られるが、分化
した細胞よりも未分化なものによく発現している。ま
た、フィブロネクチン中のＣＳ−１領域はＶＬＡ−４レ
セプターのリガンドとして知られており、該レセプター
を発現している細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細
胞、好酸球、好塩基球、胸腺細胞、骨髄単球系細胞、赤
芽球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、メラノーマ、筋
細胞等）に結合する。特開平３−２８４７００号に記載
のポリペプチドで、配列表の配列番号２９で表されるポ
リペプチド（以下Ｃ２７７−ＣＳ１と称す）は上記のＶ
ＬＡ−５、およびＶＬＡ−４レセプターのリガンドの両
方を含有するポリペプチドであり、本発明の方法におい
て、これらのレセプターを有する細胞への遺伝子導入に
使用することができる。さらに、ヘパリン−ＩＩ領域は
繊維芽細胞、内皮細胞および腫瘍細胞と結合することが
示されている。ヘパリン−ＩＩ領域の細胞結合部位ポリ
ペプチド配列はレトロウイルス結合部位を有する機能性
物質のポリペプチドの存在下で、レトロウイルスベクタ
ーの感染を予め定められた細胞に向けるうえで有用であ
る。

【００８４】細胞特異的な作用を有するホルモンやサイ
トカイン類は本発明の方法に使用される細胞結合部位を
有する機能性物質として適している。例えば、造血系の
サイトカインであるエリスロポエチンを使用することに
より、赤血球系の細胞への遺伝子導入を行うことができ
る。エリスロポエチンは公知の方法にて作製し、使用す
ることができる。また、該エリスロポエチンの機能的同
等物およびエリスロポエチンまたは該エリスロポエチン
の機能的同等物を含有するポリペプチドも使用すること
ができる。

【００８５】下記実施例に示されるように、レトロウイ
ルス結合活性を有する機能性物質（例えば、Ｈ−２７１
や繊維芽細胞増殖因子）をフィブロネクチン由来の細胞
結合活性を有するポリペプチドＣ−２７４等との混合物
で使用した場合には高い遺伝子導入効率を得ることがで
きる。これらの実験に用いたＮＩＨ／３Ｔ３細胞はＣ−
２７４と結合可能なＶＬＡ−５レセプターを発現してお
り、この両者の相互作用が遺伝子導入効率の向上に寄与
している。

【００８６】さらに、同様な現象はエリスロポエチンレ
セプターを発現するＴＦ−Ｉ細胞（Blood、第７３巻、
第３７５〜３８０頁、１９８９年）への遺伝子導入にエ
リスロポエチン誘導体を共存させた場合にも観察され
る。しかも、この効果はエリスロポエチンレセプターを
有していない細胞では認められない。

【００８７】これらの結果より、レトロウイルス結合部
位を有する機能性物質と細胞結合部位を有する他の機能
性物質との共存による細胞特異的な遺伝子導入効率の上
昇が起こることが明らかにされた。

【００８８】本発明のこの態様においては、レトロウイ
ルス結合部位を有する機能性物質を、他の標的細胞との
結合部位を有する機能性物質との混合物として使用す
る。これによって、当該機能性物質に親和性を有する標
的細胞へのレトロウイルスベクターによる遺伝子導入の
効率を顕著に高めることができる。こうして、遺伝子導
入効率が向上することにより、ウイルス産生細胞との共
培養の回避が可能となることは、本発明の１つの利点で
ある。

【００８９】目的とする細胞に選択的に遺伝子を導入す
る手段は利用価値が高く、これまでにも様々な方法が研
究されており、例えば、目的細胞の表面に存在するレセ
プターに結合する物質とＤＮＡ結合性物質とを結合させ
た非ウイルスベクター（molecular conjugation vecto
r）がある。該ベクターを利用した遺伝子導入の例とし
ては、アシアロ糖タンパクを用いた肝ガン細胞への導入
（J. Biol. Chem.、第262巻、第4429〜4432頁、1987
年）、トランスフェリンを用いたリンパ芽球細胞への導
入（Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻、第6099〜61
03頁、1992年）、抗ＥＧＦレセプター抗体を用いたガン
細胞への導入（FEBS Letters、第338巻、第167〜169
頁、1994年）等が知られている。このような非ウイルス
ベクターを用いた遺伝子導入法は、導入された遺伝子が
細胞の染色体ＤＮＡ上に組み込まれないため、導入され
た遺伝子の長期にわたる発現が望まれる場合には好まし
い方法ではない。染色体上への遺伝子組み込みが可能な
ベクターとして繁用されるレトロウイルスベクターを用
い、これを特定の細胞に感染させようとする試みも行わ
れており、例えば、レトロウイルス粒子を直接化学修飾
してラクトースを結合させることによる肝細胞への遺伝
子導入（J. Biol. Chem.、第266巻、第14143〜14146
頁、1991年）、エリスロポエチンとの融合タンパクとし
たエンベロープタンパクを有する組換えウイルス粒子を
利用したエリスロポエチンレセプター発現細胞への遺伝
子導入（Science、第266巻、第1373〜1376頁、1994年）
等が開発されている。しかし、この目的のためには標的
細胞に応じて特別なウイルス粒子の調製を要する。さら
に、ウイルス粒子の化学修飾は煩雑な操作を必要とする
上に、ウイルスの不活化を招くおそれがあり、また、遺
伝子工学的に改変したウイルスエンベロープについて
は、必ずしも必要な機能（標的細胞への結合、およびウ
イルス粒子の構築）を有するものが得られるとは限らな
い。

【００９０】上記ＷＯ９５／２６２００号には、細胞結
合活性を有する適当なリガンドを共有結合させたフィブ
ロネクチンのフラグメント共存下においては、特別な修
飾をしていないレトロウイルスベクターを目的とする細
胞に導入することが可能であることが示唆されている。
しかし、該方法ではウイルス結合活性と細胞への結合活
性の両方を有する機能性分子を用いるため、標的細胞ご
とに個別の機能性物質を作製しなければならない。ま
た、作製された機能性物質に両活性が保持されているか
どうかは明らかでない。

【００９１】本発明によるレトロウイルス結合部位を有
する機能性物質と、標的細胞との結合部位を有する他の
機能性物質との組み合わせは、広範囲の細胞種に対して
レトロウイルスベクターを用いた遺伝子の送達系が提供
できる。この目的のためには、レトロウイルス結合部位
を有する機能性物質と、標的細胞との結合部位を有する
機能性物質とが共有結合によって結合されている必要は
ない。したがって、標的となる細胞ごとに、レトロウイ
ルス結合部位を有する機能性物質と、標的細胞との結合
部位を有する機能性物質とが共有結合によって結合され
た、特定の機能性物質を作製する必要がなく、目的の細
胞への遺伝子導入を簡便、かつ効率よく行うことができ
る。

【００９２】本発明の方法を用いた標的細胞への遺伝子
導入の例としては、造血系の細胞への遺伝子導入が挙げ
られる。上記のフィブロネクチンのＣＳ−１細胞接着領
域は造血幹細胞への遺伝子導入に有用なことが知られて
いる。また、造血系の細胞の分化には上記のエリスロポ
エチンの他にも多数の細胞特異的なサイトカインが関与
していることが知られており、これらを利用することに
よって目的とする細胞（細胞系）に特異的に遺伝子を導
入できる。例えば、Ｇ−ＣＳＦを用いた場合には巨芽
球、および顆粒球前駆細胞を標的とすることが可能であ
る。

【００９３】細胞結合活部位を有する機能性物質とし
て、悪性細胞と、特異的または優先的に結合する物質を
用いることにより、これらの細胞を標的として遺伝子導
入を行うこともできる。

【００９４】例えば、ある種の肺癌細胞においてはＨＥ
Ｒ−２、ＨＥＲ−４というレセプターが過剰発現してい
ることが知られている（Proc. Nat. Acad. Sci. USA、
第92巻、第9747〜9751頁、1995年）。したがって、該レ
セプターに対するリガンドのヘリグリン（heregulin）
をレトロウイルス結合部位を含有する機能性物質と組み
合わせることにより、肺癌細胞の増殖を制御することが
可能となる。

【００９５】また、例えば、甲状腺（癌）細胞に対して
はヨウ素を有する機能性物質を、また、肝臓（癌）細胞
は高密度リポタンパク質（High-density lipoprotein、
ＨＤＬ）やアシアロ糖タンパク質またはこれらの一部を
含有する機能性物質を使用することによって遺伝子導入
の標的とすることができる。

【００９６】さらに、標的細胞の表面に存在する抗原に
対する抗体、好適にはモノクローナル抗体を、細胞結合
活性を有する機能性物質として使用することにより、抗
体が入手できる任意の細胞を標的とすることが可能とな
る。こうして、本発明により開示されるレトロウイルス
ベクターと標的細胞との配置方法を使用することによ
り、広範囲の種類の細胞を標的とすることができる。

【００９７】特に、好ましい態様は、レトロウイルスベ
クターによる標的細胞への遺伝子導入効率を高める方法
において、新規な機能性物質を用いて遺伝子導入を行
う。

【００９８】これまでレトロウイルスによる細胞への遺
伝子導入に有効とされたレトロウイルス結合部位を有す
る機能性物質はフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ領域
のみである。

【００９９】上記のように該領域は、それ自体特定の細
胞に対して結合部位を有しており、標的細胞によっては
この活性が望ましくない場合がある。このような場合に
は、この結合部位を他の標的細胞結合部位に置き換える
ことにより、目的を達成することが可能となる。このよ
うに、性質の異なる複数の機能性物質が使用可能なこと
は、本発明による遺伝子治療の適用範囲を広げることに
つながり、目的の標的細胞へのターゲッテングも容易に
行うことができる。

【０１００】本発明により提供される、新規なレトロウ
イルス結合部位を有する機能性物質としては、線維芽細
胞増殖因子、該因子を含有するポリペプチド、コラーゲ
ンのフラグメント、該フラグメントの混合物、該フラグ
メントを含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体
等が挙げられる。また、ポリリジンも本発明の目的に使
用することができる。これらの機能性物質は、天然起源
の物質から得ることができ、また、人為的に作製する
（例えば、遺伝子組換え技術または化学合成技術によっ
て作製する）ことができ、さらに、天然起源の物質と化
学的に合成された物質との組合せにより作製することも
できる。該機能性物質は、本発明の第１の発明の遺伝子
導入方法にも使用でき、また、該機能性物質と細胞結合
活性を有する機能性物質とのキメラ分子も細胞への遺伝
子導入に有用である。

【０１０１】上記の新規な機能性物質はいずれもレトロ
ウイルス結合活性を有している。しかしながら、これら
の物質は上記ＷＯ９５／２６２００号に記載の、ヒトフ
ィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域またはそれに
類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有する
ものではない。

【０１０２】本発明に使用される線維芽細胞増殖因子と
しては、実質的に純化された天然物を使用しても良く、
また、遺伝子工学的に作製されたものを使用しても良
い。本発明には、配列表の配列番号３で表される線維芽
細胞増殖因子を使用することができ、さらに、これらの
ポリペプチドの機能を損なうことなく改変された誘導体
も使用することができる。線維芽細胞増殖因子誘導体の
例としては、配列表の配列番号４で表されるポリペプチ
ド（以下、Ｃ−ＦＧＦ・Ａと称する）がある。これは配
列番号３で表される線維芽細胞増殖因子のＮ末端にフィ
ブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドが結合したポ
リペプチドであり、米国特許第５,３０２,７０１号に記
載の方法により遺伝子工学的に製造することができる。
該ポリペプチドは該米国特許にＦＥＲＭ Ｐ−１２６３
７として記載され、現在はブタペスト条約の下、ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５２７８の受託番号で茨城県つくば市東１丁
目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所
（ＮＩＢＨ）に寄託されている大腸菌（原寄託日：平成
３年１２月９日）を使用することによって得ることがで
きる。

【０１０３】また、配列番号５で表される、フィブロネ
クチン由来のＣＳ−１細胞接着領域を有する上記のＣ−
ＦＧＦ・Ａの誘導体ポリペプチド（以下、Ｃ−ＦＧＦ−
ＣＳ１と称する）は、上記の茨城県つくば市東１丁目１
番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、
ブタペスト条約の下、ＦＥＲＭ ＢＰ−５６５４の受託
番号で寄託されている大腸菌（原寄託日：平成８年９月
６日）を使用し、本願明細書に記載の方法で得ることが
できる。このＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１はＣＳ−１結合性を有
する標的細胞、特に造血幹細胞への遺伝子導入において
特に有用である。

【０１０４】コラーゲンのフラグメントとしては、天然
型のコラーゲンを酵素学的、化学的に分解し、実質的に
純化したフラグメントを使用しても良く、また、遺伝子
工学的に作製されたものを使用しても良い。さらに、こ
れらのフラグメントの機能を損なうことなく改変された
ものも使用することができる。コラーゲンの中で、ヒト
Ｖ型コラーゲンは強いインスリン結合活性を有し（特開
平２−２０９８９９号）、インスリン結合部位を含有す
るポリペプチドとしては配列表の配列番号２８で表され
るアミノ酸配列を含有するポリペプチドがあり（特開平
５−９７６９８号）、その例としては、配列表の配列番
号６で表されるポリペプチド（以下、ＣｏｌＶと称す
る）が挙げられる。ＣｏｌＶは本願明細書実施例に開示
の方法で作製することができる。ＣｏｌＶを含有するポ
リペプチドであって、配列番号７で表されるポリペプチ
ド（以下、Ｃ２７７−ＣｏｌＶと称する）は、ＣｏｌＶ
のＮ末端にフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチ
ドが結合したポリペプチドであり、上記特開平５−９７
６９８号に記載されているように遺伝子工学的に製造す
ることができる。Ｃ２７７−ＣｏｌＶは該公開公報にＦ
ＥＲＭ Ｐ−１２５６０として記載され、現在はブタペ
スト条約の下、ＦＥＲＭ ＢＰ−５２７７の受託番号で
茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生
命工学工業技術研究所に寄託されている大腸菌（原寄託
日：平成３年１０月７日）を使用することによって得る
ことができる。

【０１０５】配列番号８で表される、フィブロネクチン
由来のＣＳ−１細胞接着領域を有する上記のＣ２７７−
ＣｏｌＶの誘導体ポリペプチド（以下、Ｃ−ＣｏｌＶ−
ＣＳ１と称する）は以下に示す方法によって作製するこ
とができる。ブタペスト条約の下、ＦＥＲＭ ＢＰ−２
８００の受託番号で茨城県つくば市東１丁目１番３号の
通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる大腸菌（原寄託日：平成１年５月１２日）より調製
されるプラスミドｐＣＨ１０２を鋳型とし、プライマー
ＣＳ１−Ｓ（配列表の配列番号９にその塩基配列を示
す）およびＭ４を用いたＰＣＲ反応により増幅されるＤ
ＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩ、ＳａｌＩで消化した後に
単離する。

【０１０６】一方、上記Ｃ２７７−ＣｏｌＶをコードす
る遺伝子を含み、上記大腸菌ＦＥＲＭ ＢＰ−５２７７
より調製されるプラスミドｐＴＦ７５２０ＣｏｌＶを鋳
型とし、プライマーＣＦ、およびＣＮＲを用いたＰＣＲ
反応により増幅されるＤＮＡ断片を制限酵素ＡｃｃII
I、ＮｈｅＩで消化した後に単離する。配列表の配列番
号１０および１２にＣＦおよびＣＮＲのそれぞれの塩基
配列を示す。上記の２つのＤＮＡ断片を、プラスミドｐ
ＴＦ７５２０ＣｏｌＶを制限酵素ＡｃｃIII、ＳａｌＩ
で消化して得られる約４.４ｋｂのＤＮＡ断片と混合
し、ライゲーションを行って得られる組換えプラスミド
はＣ２７７−ＣｏｌＶのＣ末端側にＣＳ−１細胞接着領
域を有し、ＣｏｌＶのＣ末端より２番目のグルタミン酸
がアラニンに、Ｃ末端のスレオニンがセリンにそれぞれ
置換されたポリペプチド、Ｃ−ＣｏｌＶ−ＣＳ１をコー
ドしている。このプラスミドで形質転換された大腸菌を
培養した後、培養物より目的のポリペプチドを取得する
ことができる。このＣ−ＣｏｌＶ−ＣＳ１はＣＳ−１結
合性を有する標的細胞、特に幹細胞への遺伝子導入にお
いて特に有用である。

【０１０７】ポリリジンとしては、上記のごとく、市販
のポリリジンより適当な重合度のポリリジンを選択し、
使用することができる。

【０１０８】本発明で使用する機能性物質としては、上
記の機能性物質の誘導体も使用することができる。上記
のＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１またはその機能的同等物、Ｃ−Ｃ
ｏｌＶ−ＣＳ１またはその機能的同等物はその例であ
る。また、これらの機能性物質を複数の分子結合させた
重合体や、機能性物質を公知方法により修飾したもの
（糖鎖の付加等）も本発明に使用することができる。こ
れら誘導体および該誘導体の機能的同等物は、該誘導体
をコードする遺伝子および該誘導体の機能的同等物をコ
ードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造することも
できる。さらに、これらの機能性物質のアミノ酸配列中
にシステインを付加、挿入、置換することにより、機能
性物質の誘導体の作製に有用なシステイン化機能性物質
を作製することができる。また、システイン化機能性物
質であって、レトロウイルス結合部位を有する分子と、
システイン化機能性物質であって標的細胞結合部位を有
する他の分子とを結合させることも容易である。さら
に、システイン化機能性物質のシステイン残基の反応性
を利用して他の機能性物質との結合体を作製することが
できる。

【０１０９】別の好ましい態様では、レトロウイルスベ
クターによる標的細胞への遺伝子導入効率を高めるフィ
ブロネクチンのレトロウイルス結合部位ポリペプチドの
重合体を用いて遺伝子導入を行う。

【０１１０】該機能性物質は上記ＷＯ９５／２６２００
号に記載の、ヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結
合領域を一分子内に複数個有するポリペプチド、および
該ポリペプチドの誘導体である。なお、本発明に使用す
る機能性物質としては、該機能性物質と同等の活性を有
する範囲内で、天然起源のポリペプチドとはそのアミノ
酸配列が一部異なっている機能的同等物を含むことがで
きる。

【０１１１】用いる機能性物質の重合体としては上記の
フィブロネクチン由来のポリペプチドを酵素学的または
化学的に重合させたものや、遺伝子工学的に作製された
ものがある。フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領
域を一分子内に２個有するポリペプチドとしては配列表
の配列番号１３にアミノ酸配列を示すポリペプチド（以
下、Ｈ２−５４７と称す）が挙げられる。Ｈ２−５４７
はブタペスト条約の下、ＦＥＲＭ ＢＰ−５６５６の受
託番号で茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている大腸菌
（原寄託日：平成８年９月６日）を使用し、本明細書に
記載の方法によって取得することができる。また、配列
表の配列番号１４にアミノ酸配列を示すポリペプチド
は、Ｈ２−５４７のＮ末端にフィブロネクチンの細胞接
着部位ポリペプチドが結合した誘導体ポリペプチド（以
下、ＣＨ２−８２６と称す）である。該ポリペプチドは
本明細書に記載の方法にしたがって取得することができ
る。さらに、配列表の配列番号３０にアミノ酸配列を示
すポリペプチドは、Ｈ２−５４７のＣ末端にフィブロネ
クチンのＣＳ−１細胞接着領域を結合した誘導体ポリペ
プチド（以下、Ｈ２Ｓ−５７３と称す）である。該ポリ
ペプチドはブタペスト条約の下、ＦＥＲＭ ＢＰ−５６
５５の受託番号で茨城県つくば市東１丁目１番３号の通
産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されてい
る大腸菌（原寄託日：平成８年９月６日）を使用し、本
明細書に記載の方法によって取得することができる。Ｃ
Ｓ−１細胞接着領域を有するＨ２Ｓ−５７３は造血幹細
胞への遺伝子導入に有用である。

【０１１２】また、別の好ましい態様においては、、レ
トロウイルスベクターによる標的細胞への遺伝子導入に
おいて、レトロウイルスベクターによる細胞への遺伝子
導入効率を向上させるのに有効な、ビーズ上に固定され
た機能性物質との共存下に複製能欠損組換えレトロウイ
ルスベクターを生存可能な標的細胞に感染させる。

【０１１３】従来の、上記のＷＯ９５／２６２００号お
よびNature Medicineに記載の機能性物質を用いてレト
ロウイルスベクターによる標的細胞への遺伝子導入効率
を向上させる方法は、これまではウイルスを細胞に感染
させる際に使用する容器（細胞培養用のプレート）の表
面に該機能性物質を固定化することにより実施されてき
た。この方法では、プレートを機能性物質を含有する溶
液で処理した後、さらに余分の機能性物質を洗い流すな
ど、煩雑な操作を要する。

【０１１４】このように、機能性物質が固定化されたプ
レートを使用する遺伝子導入方法は簡便な方法とは言い
難い。これに対して、機能性物質をビーズ上に固定して
使用する方法はつぎのような利点を有している。

【０１１５】機能性物質をビーズに固定する操作はプレ
ートの場合に比べて小さなスペースで行うことができ、
また、ビーズを密閉可能な容器中で取り扱える。機能性
物質が固定化されたプレートはその表面が空気にさらさ
れるため、安定性の低い機能性物質の場合には保存中の
乾燥による機能性物質の変質等に気を配る必要がある
が、ビーズは溶液中に懸濁して保存することができるた
め、乾燥の危険はない。さらにビーズの使用は機能性物
質の存在する表面積を大きくすることから、プレート使
用に比べて高い遺伝子導入効率を得ることも可能とな
る。

【０１１６】機能性物質の固定化は常法により行えばよ
く、例えば、標的細胞培養容器に固定化しても良く、例
えば、細胞培養用のビーズに固定化しても良い。ビーズ
の素材、材質等は使用する目的によって選択することが
できる。ビーズとしては、例えば、中心の丸い、または
球状の核を持ち、核の表面は親水性のポリマーで被覆さ
れているものでもよい。この核やポリマーの素材として
は、例えば、特表平８−５０１０９２号に記載のものが
例示される。例えば、生分解性ビーズを使用し、これら
の機能性物質が固定化されたビーズを生体内に投与する
こともできる。また、レトロウイルス結合部位を有する
分子が固定化されたビーズと、標的細胞結合部位を有す
る他の分子が固定化されたビーズとを混合して使用する
のも効率の良い方法である。

【０１１７】これらの機能性物質を固定化せずに使用す
る場合は、例えば、標的細胞培養容器を、予め、該機能
性物質の吸着を防止する物質、例えば、牛血清アルブミ
ン（ＢＳＡ）で前処理し、これらの機能性物質の非特異
的吸着を防止して使用すればよい。

【０１１８】本発明によれば、このような非固定の系に
おいても、本発明に使用する機能性物質により、遺伝子
導入が効率良く達成される。

【０１１９】また、後に説明する、本発明の方法の実施
用に設計されたキットは、細胞への遺伝子導入を極めて
簡便に実施することを可能にする。

【０１２０】上記のごとく、本発明の方法によって遺伝
子を導入された細胞は生体に移植することが可能であ
り、これによって生体内で外来遺伝子を発現させる遺伝
子治療を行うことができる。

【０１２１】例えば、造血幹細胞を標的細胞とした遺伝
子治療は以下のような操作によって実施することができ
る。まず、ドナーより造血幹細胞を含有する材料、例え
ば、骨髄組織、末梢血液、臍帯血液等を採取する。これ
らの材料はそのまま遺伝子導入操作に用いることも可能
であるが、通常は、密度勾配遠心分離等の方法により造
血幹細胞が含まれる単核細胞画分を調製するか、さら
に、ＣＤ３４および／またはＣ−ｋｉｔといった細胞表
面のマーカー分子を利用した造血幹細胞の精製を行う。
これらの造血幹細胞を含有する材料について、必要に応
じて適当な細胞増殖因子等を用いた予備刺激を行った
後、本発明の方法、とりわけ、造血幹細胞への結合活性
を有する機能性物質の存在下に、目的とする遺伝子を挿
入された組換えレトロウイルスベクターを感染させる。
こうして得られた遺伝子導入された細胞は、例えば、静
脈内投与によってレシピエントに移植することができ
る。レシピエントは、好ましくはドナー自身であるが、
同種異系移植を行うことも可能であり、例えば、臍帯血
液を材料とした場合には同種異系移植が行われる。

【０１２２】造血幹細胞を標的とした遺伝子治療として
は、患者において欠損しているか、異常が見られる遺伝
子を補完するものがあり、例えば、ＡＤＡ欠損症やゴー
シェ病の遺伝子治療がこれにあたる。この他、例えば、
ガンや白血病の治療に使用される化学療法剤による造血
細胞の障害を緩和するために、造血幹細胞への薬剤耐性
遺伝子の導入が行われることがある。

【０１２３】造血幹細胞はＶＬＡ−４レセプターを発現
していることが知られており、本発明により開示された
ＣＳ−１細胞接着領域を有する機能性物質を利用して効
率よく遺伝子導入を行うことが可能である。また、造血
幹細胞表面には上記のようにＣＤ３４、Ｃ−ｋｉｔとい
った分子も発現されており、これらの分子に対する抗体
やＣ−ｋｉｔのリガンドである幹細胞因子（stem cell
factor）をレトロウイルス結合部位を有する機能性物質
と組み合わせることによっても、遺伝子導入効率を向上
させることができる。

【０１２４】また、癌の遺伝子治療法としては、癌細胞
にサイトカイン類の遺伝子を導入した後にその増殖能力
を奪って患者の体内に戻し、腫瘍免疫を増強させる腫瘍
ワクチン療法が研究されている（Human Gene Therapy、
第5巻、第153〜164頁、1994年）。癌細胞に高い親和性
を有する機能性物質を用いて本発明の方法を適用するこ
とにより、このような遺伝子治療も、より効果の高いも
のとなる。

【０１２５】また、ＡＩＤＳを遺伝子治療法によって治
療しようという試みも行われている。この場合には、Ａ
ＩＤＳの原因であるＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の
感染するＴ細胞に、ＨＩＶの複製や遺伝子発現を妨げる
ような核酸分子（アンチセンス核酸やリボザイム等）を
コードする遺伝子を導入することが考えられている（例
えば、J. Virol.、第69巻、第4045〜4052頁、1995
年）。Ｔ細胞への遺伝子導入は、Ｔ細胞表面に存在する
分子に結合する機能性物質、例えば抗ＣＤ４抗体等を利
用し、本発明の方法により達成することができる。

【０１２６】このように、遺伝子導入される標的細胞と
しては、上記した本発明の態様に従って、該標的細胞結
合部位を有する機能性物質が入手、あるいは作製可能な
範囲の任意の細胞を使用することができる。

【０１２７】また、本発明の方法は標的細胞をレトロウ
イルス産生細胞の存在下で共培養する必要のないこと、
およびヒトにおいては臨床での使用に問題のあるヘキサ
ジメトリン・ブロミドを使用しないこと等の点から、臨
床における遺伝子治療のプロトコールとしても適したも
のといえる。

【０１２８】さらに、遺伝子治療以外の分野への本発明
の適用として、例えば、標的細胞として胚形成幹細胞、
プライモディアル・ジャーム・セル、卵母細胞、卵原細
胞、卵子、精母細胞、精子等を使用した、トランスジェ
ニック脊椎動物の簡便な作成を挙げることができる。

【０１２９】すなわち、本発明は、その１つの態様とし
て、本発明の方法で得られる形質転換細胞を脊椎動物に
移植する細胞移植方法も提供する。形質転換細胞が移植
される脊椎動物としては、哺乳類（例、マウス、ラッ
ト、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル、チ
ンパンジー、ヒト等）、鳥類（例、ニワトリ、七面鳥、
ウズラ、アヒル、カモ等）、爬虫類（例、ヘビ、ワニ、
カメ等）、両生類（例、カエル、サンショウウオ、イモ
リ等）、魚類（例、アジ、サバ、スズキ、タイ、ハタ、
ブリ、マグロ、サケ、マス、コイ、アユ、ウナギ、ヒラ
メ、サメ、エイ、チョウザメ等）が挙げられる。

【０１３０】かくして、本発明のこの態様によれば、実
質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブ
ロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物と同様
に、本発明に使用する機能性物質のレトロウイルス結合
部位と標的細胞結合部位により、レトロウイルスによる
遺伝子導入が効率良く行われる。それにより、従来の方
法の限界を有していない、遺伝子材料の脊椎動物細胞内
への効率的な導入可能な技術が提供できる。

【０１３１】本発明のさらなる別の態様においては、レ
トロウイルス結合部位と、標的細胞結合部位とを同一分
子中に有する、実質的に純粋なフィブロネクチン、実質
的に純粋なフィブロネクチンフラグメントまたはそれら
の混合物と同等の機能を有する物質の有効量を機能性物
質として使用する。

【０１３２】かかる機能性物質としては、フィブロネク
チン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混
合物と同等の効率で遺伝子導入を行う物質であり、典型
的には、上記した本発明による新規なレトロウイルス結
合部位と標的細胞結合部位とを同一分子中に有する機能
性物質が挙げられる。これらの機能性物質を使用する場
合は、少なくとも１以上の機能性物質にレトロウイルス
と標的細胞とが結合すると考えられる。

【０１３３】上記したレトロウイルス結合部位と、標的
細胞結合部位とを同一分子中に有する機能性物質は、例
えば、配列表の配列番号２１および２２で表されるポリ
ペプチド（以下、各々、ＣＨＶ−１８１およびＣＨＶ−
１７９と称する）が包含される。

【０１３４】これらのペプチドはＨ−２７１中に含まれ
るIII型類似配列（III−１２、III−１３ 、III−１
４）を含むものであり、ＣＨＶ−１８１はIII−１２、I
II−１３配列が、また、ＣＨＶ−１７９はIII−１３ 、
III−１４配列がそれぞれフィブロネクチンの細胞接着
ポリペプチド（Ｐｒｏ1239−Ｓｅｒ1515）のＣ末端にメ
チオニンを介して付加されたものである。

【０１３５】ポリペプチドＣＨＶ−１８１を発現するた
めのプラスミドは、例えば、以下に示す方法によって構
築することができる。

【０１３６】まず、フィブロネクチンのヘパリン結合ポ
リペプチド（Ｈ−２７１）をコードするＤＮＡ断片を含
有するプラスミドｐＨＤ１０１を エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０１（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−２２６４）より調製する。このプラスミド
上のIII−１３配列のＣ末端をコードする領域に部位特
異的変異導入方法によってＨｉｎｄIIIサイトを導入し
た後、これをＮｃｏＩ、ＨｉｎｄIIIで消化し、III−１
２、III−１３配列をコードするＤＮＡ断片を得る。一
方、プラスミドベクターｐＩＮIII−ｏｍｐＡ1をＨｉｎ
ｄIII、ＳａｌＩで消化し、リポプロテインターミネー
ター領域をコードするＤＮＡ断片を得る。

【０１３７】つぎに、フィブロネクチンの細胞接着ポリ
ペプチド（Ｃ−２７９）をコードするＤＮＡ断片を含有
するプラスミドｐＴＦ７０２１を エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）ＪＭ１０９／ｐＴＦ７０２１（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１９４１）より調製し、このプラスミド
上のＣ−２７９の停止コドンの直前に部位特異的変異導
入方法によってＮｃｏＩサイトを導入したプラスミドｐ
ＴＦ７５２０を作製する。このプラスミドをＮｃｏＩ、
ＳａｌＩで消化した後、上記のIII−１２、III−１３配
列をコードするＤＮＡ断片、およびリポプロテインター
ミネーター領域をコードするＤＮＡ断片と混合してライ
ゲーションを行うことにより、ポリペプチドＣＨＶ−１
８１を発現するためのプラスミドｐＣＨＶ１８１を得る
ことができる。配列表の配列番号２７にプラスミドｐＣ
ＨＶ１８１上のポリペプチドＣＨＶ−１８１をコードす
る領域の塩基配列を示す。

【０１３８】また、ポリペプチドＣＨＶ−１７９を発現
するためのプラスミドは、例えば、以下に示す方法によ
って構築することができる。

【０１３９】まず、上記のプラスミドｐＨＤ１０１上の
III−１３配列のＮ末端をコードする領域に部位特異的
変異導入方法によってＮｃｏＩサイトを導入した後、こ
れをＮｃｏＩ、ＨｉｎｄIIIで消化し、III−１３、III
−１４配列をコードするＤＮＡ断片を得る。これと、上
記のリポプロテインターミネーター領域をコードするＤ
ＮＡ断片と、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化したプラス
ミドｐＴＦ７５２０とを混合してライゲーションを行う
ことにより、ポリペプチドＣＨＶ−１７９を発現するた
めのプラスミドｐＣＨＶ１７９を得ることができる。

【０１４０】ＣＨＶ−１８１およびＣＨＶ−１７９はそ
れぞれ上記のプラスミドで形質転換された大腸菌を培養
した後、得られた培養物より精製を行って取得すること
ができる。

【０１４１】これらの機能性物質も、非固定でも、上記
と同様に、例えば、ビーズに固定しても使用できる。

【０１４２】さらに別の態様では、本発明は、（１）上
記のレトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物
質と、標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物
質の混合物または（２）上記の本発明の新規なレトロウ
イルス結合部位および標的細胞結合部位の有効量を同一
分子中に有する機能性物質を含有するレトロウイルスに
よる標的細胞への遺伝子導入に使用する標的細胞の培養
培地を提供するもので、機能性物質は非固定でも、固定
化されていてもよい。

【０１４３】本発明の培養培地の他の成分は、標的細胞
の培養に使用できるものであれば特に制限はなく、市販
の細胞培養用培地を使用してもよい。また、本発明の培
地は、血清や標的細胞の生育に必要な細胞増殖因子、微
生物などによる汚染を防ぐための抗生物質等を含むこと
ができる。例えば、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の場合には、１
０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）と、５０単位／ｍｌの
ペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（共
にギブコ社製）とを含有するダルベッコ改変イーグル培
地（ＤＭＥＭ、ＪＲＨバイオサイエンス社製）を培養培
地に用いることができる。

【０１４４】さらに別の態様では、本発明は、（１）上
記したレトロウイルス結合部位を有する分子と、標的細
胞結合部位を有する他の分子との混合物、（２）上記し
た本発明による新規なレトロウイルス結合部位と、標的
細胞結合部位とを同一分子中に有する機能性物質、また
は（３）上記したレトロウイルス結合部位を有する機能
性物質と接触したレトロウイルスを含有する培地をイン
キュベートすることを特徴とするレトロウイルスの配置
方法を提供する。

【０１４５】該機能性物質は、非固定でも、上記のごと
く、固定化されていてもよい。インキュベーションは、
常法に従って行うことができ、例えば、３７℃、ＣＯ_２
濃度５％、湿度９９．５％の条件で行うことができる。
この条件は、使用する標的細胞に応じて適宜調整し、ま
た、培養時間も細胞や目的に応じて変更することができ
る。

【０１４６】本発明の方法を使用すれば、例えば、標的
細胞にウイルスを送達する広範囲の構築物中にウイルス
粒子を配置させることができる。

【０１４７】本発明の別の態様では、標的細胞内へのレ
トロウイルス介在遺伝子導入の実施に使用するためのキ
ットを提供する。

【０１４８】該キットは、（ａ）有効量の、（１）上記
したレトロウイルス結合部位を有する分子と、標的細胞
結合部位を有する他の分子との混合物または（２）上記
した本発明による新規なレトロウイルス結合部位と、標
的細胞結合部位とを同一分子中に有する機能性物質、
（ｂ）標的細胞と接触したレトロウイルスをインキュベ
ートするための人工基質、および（ｃ）上記標的細胞を
予備刺激するための標的細胞増殖因子、を含んでなるキ
ットを提供するもので、（ａ）の機能性物質は、非固定
でも、固定化されていてもよく、このキットは、さら
に、遺伝子導入に使用する組換えレトロウイルスベクタ
ーや、必要な緩衝剤等を含有していてもよい。

【０１４９】人工基質としては、細胞培養用のプレー
ト、ペトリ皿、フラスコ等を用いることができ、例え
ば、ポリスチレン製のものを使用できる。

【０１５０】標的細胞がＧ0期の細胞である場合には、
レトロウイルスが感染しないため、予備刺激によって細
胞周期に誘導することが好ましく、この目的で、レトロ
ウイルスの感染に先立って、標的細胞を適当な標的細胞
増殖因子の存在下で培養する。例えば、骨髄細胞や造血
幹細胞に遺伝子導入を行う場合の予備刺激には、インタ
ーロイキン−６および幹細胞因子のような標的細胞増殖
因子が使用される。

【０１５１】キットの各構成成分は、各々、自体公知の
方法により、水溶液の他、凍結乾燥物、顆粒、錠剤等の
剤形とすることができ、

【０１５２】本発明のキットを使用することにより、例
えば、形質転換された生存可能な標的細胞培養物を得る
ことができ、標的細胞内へのレトロウイルス介在の遺伝
子導入を簡便に実施することができる。

【０１５３】本発明はまた、実質的に純粋なフィブロネ
クチン、実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメント
およびそれらの混合物より選択される機能性物質または
その重合体の有効量の非固定化物またはビーズ固定化物
を使用する、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子
導入も包含する。

【０１５４】本発明は、上記のＣＨ２−８２６およびそ
の機能的同等物を包含する。また、本発明は、ＣＨ２−
８２６をコードする遺伝子を提供し、配列表の配列番号
２０で表される遺伝子がその１例である。本発明はこれ
らの遺伝子の機能的同等物も包含する。

【０１５５】さらに、本発明は、上記のＣＨＶ−１８１
を提供し、本発明はその機能的同等物を包含する。ま
た、ＣＨＶ−１８１をコードする遺伝子を提供し、配列
表の配列番号２７で表される遺伝子がその１例である。
本発明はこの遺伝子の機能的同等物を包含する。

【０１５６】本発明はまた、レトロウイルス結合部位の
重合体および／または標的細胞結合部位の重合体を含有
する重合体を提供することができる。重合体の具体例と
しては線維芽細胞増殖因子の重合体、Ｖ型コラーゲン由
来のインスリン結合部位を有するポリペプチドの重合体
が例示される。これらの重合体をコードする遺伝子も提
供する。

【０１５７】以下に考察するように、本発明は特定の理
論によって限定されるものではないが、レトロウイルス
と細胞とをそれぞれの機能領域部位に結合させることに
よって、レトロウイルスによる細胞への遺伝子導入、す
なわち形質転換が促進される。

【０１５８】レトロウイルスと結合し、その結果、本発
明で有効に役立つ機能性物質としては、実質的に純粋な
フィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチンフ
ラグメントまたはそれらの混合物があるが、本発明者ら
は、上記したような、これらと実質的に同等な機能を有
する本発明の機能性物質が標的細胞のレトロウイルスに
よる遺伝子導入効率、すなわち形質転換効率を向上させ
ることを見出したのである。

【０１５９】本明細書中に記載のフィブロネクチンのフ
ラグメントは天然または合成起源のものであることがで
き、例えば、ルオスラチ（Ruoslahti）ら（１９８１
年)、J.Biol. Chem. ２５６：７２７７；パテル（Pate
l）およびロディッシュ（Lodish）（１９８６年)、J. C
ell. Biol. １０２：４４９；およびベルナルディ（Ber
nardi）等（１９８７年)、J. Cell. Biol. １０５：４
８９ によって既に記載されたようにして、天然起源の
物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。
この点に関して、本明細書で実質的に純粋なフィブロネ
クチンまたはフィブロネクチンフラグメントと称してい
るのは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒
に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないこ
とを意味する。

【０１６０】本明細書中に記載の実質的に純粋なフィブ
ロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントは、例
えば、米国特許第５,１９８,４２３号に一般的に記載さ
れているようにして、遺伝子組換え体より製造すること
もできる。特に、下記実施例でＨ−２７１、Ｈ−２９
６、ＣＨ−２７１（配列番号２３）およびＣＨ−２９６
（配列番号２４）として同定された組換え体フラグメン
トならびにこれらを取得する方法はこの特許に詳細に記
載されている。下記実施例で使用したＣ−２７４フラグ
メントは米国特許第５,１０２,９８８号に記載されてい
るようにして得た。これらフラグメントまたはこれらフ
ラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは、米
国特許第５,１９８,４２３号にも記載されているよう
に、ブタペスト条約の下、茨城県つくば市東１丁目１番
３号の工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１０７２１（Ｈ−２９６)(原寄託日：平成１年５月
１２日)、ＦＥＲＭ ＢＰ−２７９９（メチオニンを介
してＨ−２７１と結合したＣ−２７７、すなわち、ＣＨ
−２７１)（原寄託日：平成１年５月１２日）、ＦＥＲ
ＭＢＰ−２８００（メチオニンを介してＨ−２９６と結
合したＣ−２７７、すなわち、ＣＨ−２９６）（原寄託
日：平成１年５月１２日）およびＦＥＲＭ ＢＰ−２２
６４（Ｈ−２７１）（原寄託日：平成１年１月３０日）
の受託番号のもとで寄託された大腸菌を培養することに
よって入手することができる。

【０１６１】さらに、本明細書で使用できるフィブロネ
クチンフラグメントまたはこのようなフラグメントの出
発物質に関する有用な情報は、キミヅカ（Kimizuka）
ら、J.Biochem. １１０、２８４〜２９１（１９９１
年）（これは上記した組換体フラグメントに関してさら
に報告している）；EMBO J.、４、１７５５〜１７５９
（１９８５年）（これはヒトフィブロネクチン遺伝子の
構造を報告している）；およびBiochemistry、２５、４
９３６〜４９４１（１９８６年）（これはヒトフィブロ
ネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域について報告してい
る）中に見ることができる。例えば、下記実施例に報告
されているような種々の組換え体フラグメント中に含ま
れるようなＣＳ−１細胞接着領域とヘパリン−ＩＩ結合
領域との両方を有するフィブロネクチンフラグメント
は、これまでの研究で造血細胞内への遺伝子導入効率を
顕著に高めることが分かっている。

【０１６２】かくして、本明細書中に記載のフィブロネ
クチン関連ポリペプチドは、フィブロネクチンのＣＳ−
１細胞接着領域の細胞結合活性を提供するアミノ酸配列
ならびにウイルスと結合するフィブロネクチンのヘパリ
ン−ＩＩ結合領域のアミノ酸配列を提供する。

【０１６３】なお、上記ＷＯ９５／２６２００号に記載
の、レトロウイルスベクターによる形質転換を高めるた
めに使用されるウイルス結合ポリペプチドは (ｉ)ヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域のＡla1690−Ｔhr1960に相 当する、下記の式（配列番号１）で表される第１のアミノ酸配列： Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val VAl Ser Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser val Tyr Ala Leu Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr Pro Ile Gln Arg Thr Ile Cys Pro Asp VAl Arg Ser Tyr Thr Ile Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Cys Pro Gly Ser Pro Pro Arg Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys Thr; またはレトロウイルスと結合する能力を有し、上記の配
列に十分類似したアミノ酸配列および（ii）ヒトフィブ
ロネクチンのＩＩＩＣＳ結合ドメインの１部分に相当す
る、下記の式（配列番号２）で表される第２のアミノ酸
配列（ＣＳ−１）： Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr; または原始前駆細胞および／または長期再定住（幹）細
胞のような造血細胞と結合する能力を有し、上記の配列
に十分類似したアミノ酸配列を含む。

【０１６４】なお、上記の配列表の配列番号１で表され
るポリペプチド（Ｈ−２７１）のレトロウイルス結合活
性は濃度依存性を示し、実施例８に示すように高濃度下
においては、ＣＨ−２７１と実質的に同等の活性を示
す。すなわち、高濃度の有効量のＨ−２７１の存在下で
はじめてレトロウイルスと標的細胞とは、少なくとも１
分子以上のＨ−２７１に結合することが本発明により見
い出された。

【０１６５】本発明で使用する機能性物質中のレトロウ
イルス結合部位とレトロウイルスとの強力な結合は、広
範囲の細胞種においてウイルスを用いた治療法のための
送達系を構築するために使用することができる。この目
的のために、本発明で使用する機能性物質のレトロウイ
ルス結合部位を含むポリペプチドは、構築物として標的
細胞特異性を与える任意の細胞結合部位を含む物質と結
合させる場合もあり、またはその細胞接着部位を含む物
質と共存させる場合もある。すなわち、レトロウイルス
結合部位を有する機能性物質性と、細胞結合部位を有す
る機能性物質性物質は結合していても良く、また異なる
分子として共存していても良い。

【０１６６】この方法は、各標的細胞用に特別のレトロ
ウイルス細胞株を構築するこれまでの必要性を回避する
ことができ、目的の標的細胞の種類により、最適の標的
細胞結合部位を有する機能性物質の選択が容易になる。
したがって、本発明の機能性物質を使用することによ
り、使用する標的細胞に特異的なターゲティングが容易
に実施され、特にレトロウイルス結合部位を有する機能
性物質性と、細胞結合部位を有する機能性物質性物質の
混合物を使用する本発明の方法は、目的の標的細胞への
目的の遺伝子導入効率の向上に、極めて有用である。ま
た本発明が提供する新規機能性物質はレトロウイルスに
よる標的細胞への遺伝子導入効率の向上させる方法およ
び関連の技術において、極めて有用である。

【０１６７】

【実施例】以下に実施例を挙げて、さらに詳しく本発明
を説明するが、本発明は下記実施例の範囲のみに限定さ
れるものではない。

【０１６８】実施例１ （１）ウイルス上清液の調製 レトロウイルスプラスミド、ＰＭ５ｎｅｏベクター（Ex
p. Hematol.、第23巻、第630〜638頁、1995年）を含有
するＧＰ＋Ｅ−８６細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−９６４
２）は１０％ ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ギブコ社製）な
らびに５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg／mlの
ストレプトマイシン（共にギブコ社製）を含有するダル
ベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＪＲＨバイオサイ
エンス社製）中で培養した。なお、以降の操作に使用し
たＤＭＥＭはすべて５０単位／mlのペニシリンおよび５
０μg／mlのストレプトマイシンを含んだものである。
ＰＭ５ｎｅｏウイルス含有上清液は上記産生細胞をセミ
コンフルエントに生育させたプレート（１０cm径のゼラ
チンコート細胞培養用ディシュ、岩城硝子社製）に１０
％ ＦＣＳを含有する４mlのＤＭＥＭを添加し、一夜培
養した後に採集して調製した。採集した培地上清を０．
４５ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過して
ウイルス上清液ストックとし、使用するまでは−８０℃
で保存した。

【０１６９】また、レトロウイルスプラスミド、ＴＫＮ
ＥＯベクター（Blood、第78巻、第310〜317頁、1991
年）についてはＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞（ＡＴＣＣ
ＣＲＬ−９６４１）を使用し、上記同様の操作を行っ
てＴＫＮＥＯウイルス上清液を調製した。

【０１７０】（２）上清液のウイルス力価の測定 上清液のウイルス力価はＮＩＨ／３Ｔ３ 細胞を使用し
て標準的な方法（J. Virol.、第62巻、第1120〜1124
頁、1988年）に従って測定した。すなわち、６ウエルの
組織培養プレートの１ウエルあたりに２０００個のＮＩ
Ｈ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）を含む
ＤＭＥＭを添加し、一夜培養した後、系列希釈したウイ
ルス上清液と終濃度７．５μg／mlのヘキサジメトリン
・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）とを各ウ
エルに加えた。これを３７℃で２４時間インキュベート
した後、培地を終濃度０．７５mg／mlのＧ４１８（ギブ
コ社製）を含有するものと交換してさらにインキュベー
トを続けた。１０〜１２日後に生育したＧ４１８耐性
（Ｇ４１８r）コロニーをクリスタルバイオレットで染
色しその数を記録した。ウエルあたりのコロニー数にウ
イルス上清液の希釈倍率を乗じた値より、上清１ml当た
りに含まれる感染性粒子数（cfu／ml）を算出し、これ
を上清液の力価として以降の実験におけるウイルス上清
液の添加量を決定した。

【０１７１】実施例２ （１）フィブロネクチン由来ポリペプチドの調製 ヒトフィブロネクチン由来のポリペプチド、Ｈ−２７１
（配列表の配列番号１にそのアミノ酸配列を示す）は該
ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミ
ド、ｐＨＤ１０１を含有する大腸菌、Escherichia col
i ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−２２
６４）より、米国特許第５,１９８,４２３号公報に記載
の方法により調製した。

【０１７２】また、ポリペプチドＣＨ−２７１（配列表
の配列番号２３にそのアミノ酸配列を示す）は以下に示
す方法により調製した。すなわち、大腸菌、Escherichi
a coli ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ
−２７９９）を用い、これを上記の公報に記載の方法で
培養し、該培養物よりＣＨ−２７１を得た。

【０１７３】また、ポリペプチドＣＨ−２９６（配列表
の配列番号２４にそのアミノ酸配列を示す）は以下に示
す方法により調製した。すなわち、大腸菌、Escherichi
a coli ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ
−２８００）を用い、これを上記の公報に記載の方法で
培養し、該培養物よりＣＨ−２９６を得た。

【０１７４】ポリペプチドＣ−２７４（配列表の配列番
号２５にそのアミノ酸配列を示す）は以下に示す方法に
より調製した。すなわち、大腸菌、Escherichia coli
ＪＭ１０９／ｐＴＦ７２２１（ＦＥＲＭ ＢＰ−１９
１５）を用い、これを米国特許第５,１０２,９８８号公
報に記載の方法で培養し、該培養物よりＣ−２７４を得
た。

【０１７５】さらに、ポリペプチドＣ２７７−ＣＳ１
（配列表の配列番号２９にそのアミノ酸配列を示す）は
以下に示す方法により調製した。すなわち、特開平３−
２８４７００号公報にＦＥＲＭ Ｐ−１１３３９として
記載され、現在はブタペスト条約の下、上記の茨城県つ
くば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工
業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５７２３とし
て寄託されている大腸菌、Escherichia coli ＨＢ１
０１／ｐＣＳ２５（原寄託日；平成２年３月５日）を用
い、これを上記公報に記載の方法で培養し、該培養物よ
りＣ２７７−ＣＳ１を得た。

【０１７６】（２）Ｃ−ＦＧＦ・Ａの調製 ポリペプチドＣ−ＦＧＦ・Ａ（配列表の配列番号４にそ
のアミノ酸配列を示す）は以下に示す方法に従って調製
した。すなわち、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含有する組み換えプラスミド、ｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａを
含む大腸菌、Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＹＭ
Ｈ−ＣＦ・Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２７８）を１００μ
g／mlのアンピシリンを含む５mlのＬＢ培地中、３７℃
で８時間培養した。この前培養液を１００μg／mlのア
ンピシリン、１mＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ
−チオガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地５００mlに
接種し、３７℃で一夜培養した後集菌した。得られた菌
体を１mＭ ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニウムフ
ルオリド）、０．０５％ ノニデットＰ−４０を含む１
０mlのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、超音
波処理を行って菌体を破砕した後、遠心分離を行って上
清を得た。この上清の２６０nmにおける吸光度を測定し
て、これに上清の液量（ml）を乗じた値を算出し、この
値４０００に対して１mlの割合で５％ポリエチレンイミ
ンを加えた後、遠心分離して上清を得た。この上清をあ
らかじめＰＢＳで平衡化したハイトラップ−ヘパリンカ
ラム（ファルマシア社製）にかけ、ＰＢＳで非吸着の画
分を洗浄した後、０．５Ｍから２ＭのＮａＣｌ濃度勾配
を持つＰＢＳで吸着画分の溶出を行った。溶出液をＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）により分析すると約４７kdのポリペプチドを含む２
つの画分が存在していたが、このうちの高ＮａＣｌ濃度
で溶出された方の画分を集めて１．５Ｍ ＮａＣｌを含
むＰＢＳで平衡化したスーパーロース６カラム（ファル
マシア社製）にかけた。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分析し、約４７kdのポリペプチドを含む画分を集めて
精製Ｃ−ＦＧＦ・Ａを調製し、以下の操作に使用した。

【０１７７】（３）Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１の調製 まず、ポリペプチドＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１（配列表の配列
番号５にそのアミノ酸配列を示す）を大腸菌を宿主とし
て発現させるためのプラスミドを構築した。

【０１７８】Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＣＨ１
０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８００）を培養し、得られた
菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドｐＣＨ
１０２を調製した。このプラスミドを鋳型とし、プライ
マーＭ４（宝酒造社製）及び配列表の配列番号９に塩基
配列を示すプライマーＣＳ１−Ｓを用いたＰＣＲ反応を
行った後、エタノール沈殿によって反応液中の増幅ＤＮ
Ａ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片をＮｈｅＩ、Ｓ
ａｌＩ（ともに宝酒造社製）で消化した後、アガロース
ゲル電気泳動を行い約９７０bpのＤＮＡ断片をゲルより
回収した。

【０１７９】次にEscherichia coli ＪＭ１０９／ｐ
ＹＭＨ−ＣＦ・Ａ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２７８）を培養
し、得られた菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法によってプラ
スミドｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａを調製した。このプラスミド
を鋳型とし、配列番号１０に塩基配列を示すプライマー
ＣＦ及び配列表の配列番号１１に塩基配列を示すプライ
マーＦＮＲを用いたＰＣＲ反応を行った後、エタノール
沈殿によって反応液中の増幅ＤＮＡ断片を回収した。得
られたＤＮＡ断片をＥｃｏ５２Ｉ（宝酒造社製）、Ｎｈ
ｅＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い約３
２０bpのＤＮＡ断片をゲルより回収した。

【０１８０】上記のプラスミドｐＹＭＨ−ＣＦ・ＡをＥ
ｃｏ５２Ｉ、ＳａｌＩで消化した後にアガロースゲル電
気泳動を行って単離される約４．１ｋｂのＤＮＡ断片を
上記の約９７０bpのＤＮＡ断片及び約３２０bpのＤＮＡ
断片と混合し、ライゲーションを行って得られる組換え
プラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形
質転換体よりプラスミドを調製し、上記の３つのＤＮＡ
断片が１分子ずつ含まれたものを選んでプラスミドｐＣ
ＦＳ１００と命名した。また、プラスミドｐＣＦＳ１０
０で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を Escherichia
coli ＪＭ１０９／ｐＣＦＳ１００と命名した。プラス
ミドｐＣＦＳ１００はＣ−ＦＧＦ・ＡのＣ末端側にフィ
ブロネクチン由来のＣＳ−１細胞接着領域を有し、ＦＧ
ＦのＣ末端より２番目のリジンがアラニンに置換された
ポリペプチド、Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１をコードしている。

【０１８１】ポリペプチドＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１は以下に
示す方法に従って調製した。すなわち、上記の大腸菌、
Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＣＦＳ１００を１
００μg／mlのアンピシリンを含む５mlのＬＢ培地中、
３７℃で８時間培養した。この前培養液を１００μg／m
lのアンピシリン、１mＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地５０
０mlに接種し、３７℃で一夜培養した後集菌した。得ら
れた菌体を０．５ＭＮａＣｌ、１mＭ ＰＭＳＦ、０．
０５％ ノニデットＰ−４０を含む１０mlのＰＢＳ（リ
ン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、超音波処理を行って菌
体を破砕した後、遠心分離を行って上清を得た。この上
清をあらかじめ０．５Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳで平衡
化したハイトラップ−ヘパリンカラムにかけ、０．５Ｍ
ＮａＣｌを含むＰＢＳで非吸着の画分を洗浄した後、
０．５Ｍから２ＭのＮａＣｌ濃度勾配を持つＰＢＳで吸
着画分の溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により分析し、約５０ｋｄのポリペ
プチドを含む画分を集めて精製Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１を調
製し、以下の操作に使用した。

【０１８２】こうして得られた精製Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１
のＮ末端から５番目までのアミノ酸配列を調べたとこ
ろ、配列表の配列番号５に示されたアミノ酸配列のもの
と一致した。また、質量分析法によって測定された精製
Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１の分子量も上記のアミノ酸配列から
予想されるものと一致した。

【０１８３】（４）Ｃ２７７−ＣｏｌＶの調製 ポリペプチドＣ２７７−ＣｏｌＶ（配列表の配列番号６
にそのアミノ酸配列を示す）は以下に示す操作によって
精製した。すなわち、上記ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを含有する組み換えプラスミド、ｐＴＦ７５２０Ｃ
ｏｌＶを含む大腸菌、Escherichia coli ＪＭ１０９
／ｐＴＦ７５２０ＣｏｌＶ（ＦＥＲＭＢＰ−５２７７）
を１００μg／mlのアンピシリンを含む５mlのＬＢ培地
中、３７℃で６．５時間培養した。この前培養液を１０
０μg／mlのアンピシリンを含むＬＢ培地５００mlに接
種し、３７℃で培養した。６６０nmにおける吸光度が
０．６に達した時点でＩＰＴＧを終濃度１mＭになるよ
うに添加して一夜培養した後に集菌した。得られた菌体
を１mＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ノニデットＰ−４
０、２mＭ ＰＭＳＦを含む１０mlのＰＢＳに懸濁し、
超音波処理を１０分間行って菌体を破砕した。この菌体
破砕液を遠心分離して得た上清をＰＢＳで平衡化したリ
ソースＱカラム（ファルマシア社製）にかけ、目的のポ
リペプチドを含む非吸着画分を得た。この画分をＰＢＳ
で平衡化したハイトラップ−ヘパリンカラムにかけ、Ｐ
ＢＳで非吸着の画分を洗浄した後、０Ｍから０．５Ｍの
ＮａＣｌ濃度勾配を持つＰＢＳで吸着画分の溶出を行っ
た。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、４８kdの
ポリペプチドを含む画分を集めて精製Ｃ２７７−Ｃｏｌ
Ｖを調製し、以下の操作に使用した。

【０１８４】（５）ＣｏｌＶの調製 まず、ポリペプチドＣｏｌＶ（配列表の配列番号６にそ
のアミノ酸配列を示す）を大腸菌を宿主として発現させ
るためのプラスミドを構築した。

【０１８５】Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＴＦ
７５２０ＣｏｌＶ（ＦＥＲＭ ＢＰ−５２７７）を培養
し、得られた菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法によってプラ
スミドｐＴＦ７５２０ＣｏｌＶを調製した。このプラス
ミドをＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消
化後、アガロースゲル電気泳動を行い、約０．５８kbの
ＤＮＡ断片をゲルより回収した。これをあらかじめＮｃ
ｏＩとＢａｍＨＩで消化しておいたプラスミドベクター
ｐＥＴ８Ｃ（ノバジェン社製）と混合してライゲーショ
ンを行った。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２
１に導入して得られた形質転換体よりプラスミドを調製
し、上記の約０．５８kbＤＮＡ断片１分子のみが含まれ
たものを選び、これをプラスミドｐＥＴＣｏｌＶと命名
した。

【０１８６】上記のプラスミドｐＥＴＣｏｌＶで形質転
換された大腸菌ＢＬ２１、Escherichia coli ＢＬ−
２１／ｐＥＴＣｏｌＶを５０μg／mlのアンピシリンを
含む１０mlのＬＢ培地中、３７℃で一夜培養した。この
前培養液０．２mlを５０μg／mlのアンピシリン、を含
むＬＢ培地１００mlに接種し、３７℃で培養した。６０
０nmの吸光度が０．４に達した時点でＩＰＴＧを終濃度
１mＭとなるように添加し、一夜培養した後に集菌し
た。得られた菌体を１mＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ノニ
デットＰ−４０、１０μg／ml アプロチニン（aprotin
in）、１０μg／ml ロイペプチン（leupeptin）、２m
Ｍ ＰＭＳＦを含む５mlのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩
水）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した後、
遠心分離を行って上清を得た。この上清をＰＢＳで平衡
化したハイトラップ−ヘパリンカラムにかけ、ＰＢＳで
非吸着の画分を洗浄した後、０．５ＭのＮａＣｌを含む
ＰＢＳで吸着画分の溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分析した結果、ほ
ぼ単一な約１８kdのポリペプチドが確認された。こうし
て得られた精製ＣｏｌＶを以下の操作に使用した。

【０１８７】（６）Ｈ２−５４７の調製 ポリペプチドＨ２−５４７（配列表の配列番号１３にそ
のアミノ酸配列を示す）を発現させるためのプラスミド
は以下に示す操作に従って構築した。Escherichia coli
ＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８０
０）を培養し、得られた菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法に
よってプラスミドｐＣＨ１０２を調製した。このプラス
ミドを鋳型とし、配列表の配列番号１５に塩基配列を示
すプライマー１２Ｓと配列表の配列番号１６に塩基配列
を示すプライマー１４Ａとを用いたＰＣＲ反応の後、ア
ガロースゲル電気泳動を行い、フィブロネクチンのヘパ
リン結合ポリペプチドをコードする約０．８kbのＤＮＡ
断片をゲルより回収した。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏ
Ｉ、ＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化した後、Ｎ
ｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造
社製）と混合してライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１
０９に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを
調製し、上記のＤＮＡ断片を含むプラスミドを選んでこ
れをプラスミドｐＲＨ１とした。

【０１８８】プラスミドベクターｐＩＮIII−ｏｍｐＡ1
（The EMBO Journal、第3巻、第2437〜2442頁、1984
年）をＢａｍＨＩとＨｉｎｃII（宝酒造社製）とで消化
し、リポプロテインターミネーター領域を含む約０．９
kbのＤＮＡ断片を回収した。これをＢａｍＨＩとＨｉｎ
ｃIIで消化した上記のプラスミドｐＲＨ１と混合してラ
イゲーションを行い、ｌａｃプロモーター、ヘパリン結
合ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片およびリポプロ
テインターミネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＨ
１−Ｔを得た。

【０１８９】プラスミドｐＲＨ１−ＴをＮｈｅＩとＳｃ
ａＩ（ともに宝酒造社製）で消化して得られる約３．１
kbのＤＮＡ断片と、ＳｐｅＩ（宝酒造社製）とＳｃａＩ
で消化して得られる約２．５kbのＤＮＡ断片をそれぞれ
調製し、この２つをライゲーションさせることによって
ｌａｃプロモーター、ヘパリン結合ポリペプチドが２個
タンデムに連結されたポリペプチドをコードするオープ
ンリーディングフレーム、およびリポプロテインターミ
ネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＨ２−Ｔを得
た。上記のオープンリーディングフレームの塩基配列を
配列表の配列番号１７に示す。

【０１９０】ポリペプチドＨ２−５４７は以下の方法に
より調製した。１００μg／mlのアンピシリンを含む１
２０mlのＬＢ培地を入れた５００mlバッフル付き三角フ
ラスコを４本用意し、これに上記のプラスミドｐＲＨ２
−Ｔで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１、Escherichia
coli ＨＢ１０１／ｐＲＨ２−Ｔを接種して３７℃で１
晩培養した。培養液より遠心分離によって菌体を集め、
４０mlの破砕用緩衝液（５０mＭ トリス−ＨＣｌ、１m
Ｍ ＥＤＴＡ、１５０mＭ ＮａＣｌ、１mＭ ＤＴＴ、１m
Ｍ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波処理を行
って菌体を破砕した。遠心分離を行って得られた上清を
精製用緩衝液（５０mＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）
で平衡化されたハイトラップ−ヘパリンカラム（ファル
マシア社製）にかけた。同緩衝液でカラム内の非吸着画
分を洗浄した後、０〜１Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配を持つ精
製用緩衝液で溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で分析し、分子量約６万のポリ
ペプチドを含む画分を集めて精製Ｈ２−５４７標品を得
た。得られた標品の蛋白量をＢＣＡプロテインアッセイ
リエージェント（ピアス社製）により、ウシ血清アルブ
ミンをスタンダードとして測定したところ、約１０mgの
Ｈ２−５４７が得られていた。

【０１９１】こうして得られた精製Ｈ２−５４７のＮ末
端から５残基までののアミノ酸配列を調べたところ、配
列表の配列番号１７に示される塩基配列から予想される
Ｈ２−５４７のアミノ酸配列よりＮ末端のメチオニンが
除去されたもの（配列表の配列番号１３にその配列を示
す）と一致した。また、質量分析法によって測定された
精製Ｈ２−５４７の分子量は配列表の配列番号１３に示
されるアミノ酸配列から予想されるものと一致した。

【０１９２】（７）ＣＨ２−８２６の調製 ポリペプチドＣＨ２−８２６（配列表の配列番号１４に
そのアミノ酸配列を示す）を発現させるためのプラスミ
ドは以下に示す操作に従って構築した。上記のプラスミ
ドｐＣＨ１０２を鋳型とし、配列表の配列番号１８に塩
基配列を示すプライマーＣＬＳと配列表の配列番号１９
に塩基配列を示すプライマーＣＬＡとを用いたＰＣＲ反
応の後、アガロースゲル電気泳動を行い、フィブロネク
チンの細胞接着ポリペプチドをコードする約０．８kbの
ＤＮＡ断片をゲルより回収した。得られたＤＮＡ断片を
ＮｃｏＩ、ＢｇｌII（宝酒造社製）で消化した後、Ｎｃ
ｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したｐＴＶ１１８Ｎと混合して
ライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。
得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記のＤ
ＮＡ断片を含むプラスミドを選んでこれをプラスミドｐ
ＲＣ１とした。このプラスミドｐＲＣ１をＳｐｅＩとＳ
ｃａＩで消化して得られる約２．５kbのＤＮＡ断片と、
上記のプラスミドｐＲＨ２−ＴをＮｈｅＩとＳｃａＩで
消化して得られる約３．９kbのＤＮＡ断片とを混合して
ライゲーションを行い、細胞接着ポリペプチドのＣ末端
にヘパリン結合ポリペプチドが２個タンデムに連結され
たポリペプチドをコードするプラスミドｐＲＣＨ２−Ｔ
を得た。このポリペプチドをコードするプラスミドｐＲ
ＣＨ２−Ｔ上のオープンリーディングフレームの塩基配
列を配列表の配列番号２０に示す。

【０１９３】ポリペプチドＣＨ２−８２６は実施例２−
（６）に記載のポリペプチドＨ２−５４７について用い
られたものと同様の方法により調製した。ハイトラップ
ヘパリンカラムの溶出液のうち分子量約９万のポリペプ
チドを含む画分を集めて精製ＣＨ２−８２６標品を得
た。

【０１９４】（８）Ｈ２Ｓ−５３７の調製 ポリペプチドＨ２Ｓ−５３７（配列表の配列番号３０に
そのアミノ酸配列を示す）を発現させるためのプラスミ
ドは以下に示す操作に従って構築した。上記のプラスミ
ドｐＣＨ１０２を鋳型とし、配列表の配列番号３１に塩
基配列を示すプライマーＣＳ１Ｓと、配列表の配列番号
３２に塩基配列を示すプライマーＣＳ１Ａとを用いたＰ
ＣＲ反応の後、アガロースゲル電気泳動を行ってフィブ
ロネクチンのＣＳ−１細胞接着領域をコードする約０．
１kbのＤＮＡ断片をゲルより回収した。得られたＤＮＡ
断片をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化した後、ＮｃｏＩ、
ＢａｍＨＩで消化したプラスミドベクターｐＴＶ１１８
Ｎと混合してライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９
に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製
し、上記のＤＮＡ断片を含むプラスミドを選んでこれを
プラスミドｐＲＳ１とした。

【０１９５】プラスミドベクターｐＩＮIII−ｏｍｐＡ1
をＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩとで消化し、リポプロテイ
ンターミネーター領域を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片
を回収した。これをＢａｍＨＩとＨｉｎｃIIとで消化し
た上記のプラスミドｐＲＳ１と混合してライゲーション
を行い、ｌａｃプロモーター、ＣＳ−１領域ポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ断片及びリポプロテインターミネ
ーターをこの順に含むプラスミドｐＲＳ１−Ｔを得た。

【０１９６】プラスミドｐＲＳ１−ＴをＮｈｅＩとＳｃ
ａＩで消化して得られる約２．４ｋｂのＤＮＡ断片と、
プラスミドｐＲＨ２−ＴをＳｐｅＩ、ＳｃａＩ、Ｐｓｔ
Ｉ（宝酒造社製）で消化して得られる約３．３ｋｂのＤ
ＮＡ断片をそれぞれ調製し、この２つをライゲーション
させることによってｌａｃプロモーター、タンデムに並
んだ２個のヘパリン結合ポリペプチドのＣ末端側にさら
にＣＳ−１領域が連結された構造のポリペプチドをコー
ドするオープンリーディングフレーム、及びリポプロテ
インターミネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＨ２
Ｓ−Ｔを得た。上記のオープンリーディングフレームの
塩基配列を配列表の配列番号３２に示す。

【０１９７】ポリペプチドＨ２Ｓ−５７３は実施例２−
（６）に記載のポリペプチドＨ２−５４７について用い
られたものと同様の方法により調製した。ハイトラップ
ヘパリンカラムの溶出液のうち分子量約６万のポリペプ
チドを含む画分を集めて精製Ｈ２Ｓ−５７３標品を得
た。

【０１９８】（９）機能性物質のプレートへの固定化 機能性物質を固定化されたプレート（６ウエルの組織培
養プレート、ファルコン社製）をレトロウイルスの細胞
への感染実験に使用する場合には、以下に示す操作にし
たがって固定化操作を行った。すなわち、上記の実施例
に記載の各種機能性物質を適当な濃度となるようにＰＢ
Ｓに溶解した溶液を１ウエル（底面積９．６cm²）あた
り２ml添加し、紫外線の照射下においてプレートのふた
を開けて１時間、さらにふたを閉めて１時間、室温でイ
ンキュベートした。次に機能性物質溶液を２％のウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ、ベーリンガー・マンハイム社
製）を含むＰＢＳ ２mlに交換してさらに３０分間、室
温でインキュベートした後、２５mＭ ヘペス（ＨＥＰＥ
Ｓ）を含むＰＢＳでプレートを洗浄した。ＢＳＡを固定
化した対照プレートは、上記の操作のうちポリペプチド
溶液とのインキュベーションを省略して作製した。

【０１９９】なお、以降に示す実施例での遺伝子導入
（ウイルス感染）実験においては、特に断らない限り上
記の６ウエルの組織培養プレートを使用し、プレートへ
の固定化に使用した機能性物質の濃度を示す場合には、
ウエルの単位底面積あたりの機能性物質量をpmol／cm²
（およびμg／cm²）を単位として記載する。たとえば上
記のプレート（底面積９．６cm²）について４８μg／ml
のＨ−２７１溶液２mlを用いて固定化を行った場合に
は、「３３３pmol／cm²（１０μg／cm²）のＨ−２７１
を用いて固定化した」と記載する。また、遺伝子導入後
の浮遊細胞（ＴＦ−１、ＨＬ−６０）を培養する際に用
いるＣＨ−２９６を固定化したプレートは、４８pmol／
cm²（３μg／cm²）のＣＨ−２９６溶液を用い、上記の
操作によって固定化を行ったものである。以降の実施例
において、標的細胞へのウイルス感染はすべてポリブレ
ンを含有しない培地中で行った。また、使用するウイル
ス、細胞、培地等の量を示す場合には特に断らない限り
１ウエルあたりの量を記載する。

【０２００】実施例３ （１）機能性物質の混合物を用いた遺伝子導入 細胞に結合する物質と、レトロウイルスに結合する物質
とを混合してプレートに固定化した場合の遺伝子導入効
率への影響を調べるために以下に示す実験を行った。ま
ず、実施例２−（９）に記載の方法に従って３２pmol／
cm²（１．５μg／cm²）のＣ−ＦＧＦ・Ａ、３２pmol／c
m²（１μg／cm²）のＣ−２７４と３２pmol／cm²（０．
５μg／cm²）のＦＧＦとの混合物、および３２pmol／cm
²（０．５μg／cm²）のＦＧＦ（ベクトン・ディッキン
ソン社製）のそれぞれを用い、各ポリペプチドをプレー
トに固定化した。これらのプレート、およびＢＳＡを固
定化した対照プレートのそれぞれに１０００cfuのＰＭ
５ｎｅｏウイルスを含む２mlのウイルス上清液を加えて
３７℃、３０分間プレインキュベーションした後、ＰＢ
Ｓを用いてプレートを徹底的に洗浄した。このプレート
に２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む２mlのＤＭＥ
Ｍ培地を加え、ポリブレンの非存在下に３７℃、２時間
インキュベーションした後、非付着細胞はデカンテーシ
ョンによって、またプレートに付着した細胞はトリプシ
ン処理の後にプレートから剥がすことによってそれぞれ
採取し、これらを合わせた。得られた細胞懸濁液を二分
して一方をＤＭＥＭ、もう一方を終濃度０．７５mg／ml
のＧ４１８を含むＤＭＥＭとともに３７℃で１０日間培
養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含まな
い培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロ
ニー数の割合を遺伝子導入効率とし、その結果を図１に
示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子
導入効率をそれぞれ示す。

【０２０１】図１に示されるように、レトロウイルスの
感染時間を２時間とした場合にはＦＧＦ単独ではＣ−Ｆ
ＧＦ・Ａに比べて低い遺伝子導入効率しか得られない
が、Ｃ−２７４とＦＧＦの混合物を固定化したプレート
を用いた場合には、この２つのポリペプチドが共有結合
したＣ−ＦＧＦ・Ａを用いた場合と同様の効率でＧ４１
８耐性コロニーが得られた。

【０２０２】詳細な検討を行うために、Ｃ−２７４の
み、およびＦＧＦのみを固定化した場合とこれらの混合
物を固定化した場合との比較を行った。すなわち３２pm
ol／cm ²（１μg／cm²）のＣ−２７４、３２pmol／cm
²（０．５μg／cm²）のＦＧＦ、および３２pmol／cm²の
Ｃ−２７４と３２pmol／cm²のＦＧＦとの混合物のそれ
ぞれを用いて実施例２−（９）に記載の方法によってプ
レートへの固定化を行い、これらのプレートを用いて上
記同様の操作でレトロウイルス感染への効果を調べた。
得られた結果を図２に示す。図中、横軸は使用した機能
性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。

【０２０３】図２に示されるようにＣ−２７４とＦＧＦ
との混合物を固定化したプレートを用いた場合にはＦＧ
Ｆのみを固定化したものに比べて高い遺伝子導入効率を
示した。またレトロウイルス結合部位を有しないＣ−２
７４のみを固定化したプレートではＧ４１８耐性コロニ
ーは得られなかった。以上の実験結果より、レトロウイ
ルス結合部位を有するＦＧＦに細胞結合部位を有するＣ
−２７４を組み合わせることによってＦＧＦ単独で使用
した場合に比べて高い感染効率が得られること、および
このようなポリペプチドの組み合わせによる効果の発現
には必ずしもポリペプチド鎖が共有結合で結ばれている
必要がないことが示された。

【０２０４】（２）機能性物質の混合物を用いた遺伝子
導入 レトロウイルス結合部位を有するポリペプチドをＣｏｌ
Ｖに置き換えて、実施例３−（１）同様の実験を行っ
た。本実験においてはＣ−２７４とＣｏｌＶとを種々の
モル比で混合した場合を比較した。すなわち、３３０pm
ol／cm²（６μg／cm²）のＣｏｌＶ、３３０pmol／cm
²（１０μg／cm²）のＣ−２７４と３３０pmol／cm²のＣ
ｏｌＶとの混合物（Ｃ−２７４とＣｏｌＶのモル比は１
０：１０）、１００pmol／cm²（３μg／cm²）のＣ−２
７４と３３０pmol／cm²のＣｏｌＶとの混合物（３：１
０）、３３pmol／cm²（１μg／cm²）のＣ−２７４と３
３０pmol／cm²のＣｏｌＶとの混合物（１：１０）、３
３０pmol／cm²（１６μg／cm²）のＣ２７７−Ｃｏｌ
Ｖ、および３３０pmol／cm²（１０μg／cm²）のＣ−２
７４のそれぞれを用いて実施例２−（９）に記載の方法
によってプレートへの固定化を行い、作製されたプレー
トを用いて上記同様の操作でレトロウイルス感染への効
果を調べた。得られた結果を図３に示す。図中、横軸は
使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ
示す。

【０２０５】図３に示されるように感染時間を２時間と
した場合にはＣｏｌＶを固定化したプレート上での感染
効率はＣ２７７−ＣｏｌＶ固定化プレートの１／２以下
であるが、ＣｏｌＶとその１／１０量（分子数として）
のＣ２７４の混合物を固定化したプレートを用いた場合
にはＣ２７７−ＣｏｌＶと同等の感染効率が得られてお
り、ＦＧＦの場合同様にＣ−２７４分子のレトロウイル
ス感染の促進効果が確かめられた。なお、ＣｏｌＶ分子
に対するＣ−２７４分子の割合が上昇した場合にはこの
効果はむしろ低下し、等量のＣｏｌＶ、Ｃ−２７４を含
む混合物を固定化した場合にはＣｏｌＶのみを固定化し
た場合とほとんど差はみられない。

【０２０６】（３）機能性物質の混合物を用いた遺伝子
導入 細胞結合部位を有する物質と、レトロウイルス結合部位
を有する物質とを混合してプレートへの固定化を行った
場合の遺伝子導入効率への影響を調べるために以下に示
す実験を行った。まず、実施例２−（９）に記載の方法
に従い、３２pmol／cm²（１μg／cm²）のＣ−２７４、
３３３pmol／cm²（１０μg／cm²）のＨ−２７１、およ
び３２pmol／cm²（１μg／cm²）のＣ−２７４と３３３p
mol／cm²（１０μg／cm²）のＨ−２７１との混合物のそ
れぞれを用いてプレートへの固定化を行った。これらの
プレートそれぞれに１０００cfuのＰＭ５ｎｅｏウイル
スを含む２mlのウイルス上清液を加え、３７℃、３０分
間プレインキュベーションした後、ＰＢＳを用いてプレ
ートを徹底的に洗浄した。このプレートに２０００個の
ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む２mlのＤＭＥＭ培地を加えて
３７℃、２時間インキュベーションした後、非付着細胞
はデカンテーションによって、またプレートに付着した
細胞はトリプシン処理の後にプレートから剥がすことに
よってそれぞれ採取し、これらを合わせた。得られた細
胞懸濁液を二分して一方をＤＭＥＭ、もう一方を終濃度
０．７５mg／mlのＧ４１８を含むＤＭＥＭとともに３７
℃で１０日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ
４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対するＧ
４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、そ
の結果を図４に示す。図中、横軸は使用した機能性物
質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。

【０２０７】図４に示されるように、Ｃ−２７４とＨ−
２７１の混合物（モル比１：１０）を固定化したプレー
トを用いた場合にはＨ−２７１のみを固定化したものに
比べて感染効率が大きく上昇した。なお、Ｃ−２７４の
みを固定化したプレートでは遺伝子導入は見られなかっ
た。

【０２０８】（４）Ｃ277−ＣＳ１を用いた遺伝子導入 細胞結合部位を有する物質としてＣ277−ＣＳ１を用
い、これとレトロウイルスに結合部位を有する物質とを
混合してプレートへの固定化を行った場合の感染効率へ
の影響を調べるために以下に示す実験を行った。レトロ
ウイルスに結合する物質としてはポリリジン［（Ｌｙ
ｓ）n、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩、分子量５万〜
１０万、和光純薬社製］、およびＨ−２７１の２種を用
い、また細胞には浮遊細胞であるＴＦ−１細胞（ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ−２００３）を用いた。まず、実施例２−
（９）に記載の方法に従い、以下に示す溶液でプレート
への固定化を行った。３３pmol／cm²（１．１μg／c
m²）のＣ277−ＣＳ１、１３３pmol／cm²（１０μg／c
m²）のポリリジン、３３pmol／cm²のＣ277−ＣＳ１と１
３３pmol／cm²のポリリジンとの混合物、３３３pmol／c
m²（１０μg／cm²）のＨ−２７１、３３pmol／cm²のＣ2
77−ＣＳ１と３３３pmol／cm²のＨ−２７１との混合
物、および３３pmol／cm²（２．１μg／cm²）のＣＨ−
２９６。これらのプレートそれぞれに１×１０4cfu／の
ＴＫＮＥＯウイルス、１×１０4個のＴＦ−１細胞を含
むＲＰＭＩ１６４０培地［５ng／ml ＧＭ−ＣＦＳ（ペ
トロ テック社製）、５０単位／ml ペニシリン、５０
μg／mlストレプトマイシンを含むもの］を加えて３７
℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーシ
ョン終了後、非付着細胞はデカンテーションによって、
またプレートに付着した細胞はトリプシン処理を行って
それぞれ採取し、これらを合わせた。得られた細胞懸濁
液のうちの１／５づつをＣＨ−２９６を固定化したプレ
ート２枚に移して２４時間インキュベートした後、培地
を一方は上記の培地、またもう一方は終濃度０．７５mg
／mlのＧ４１８を含む上記の培地に交換して３７℃で８
日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８の
存在下、非存在下に出現したコロニー数よりＧ４１８耐
性コロニーの出現率（遺伝子導入効率）を算出した。

【０２０９】図５に得られた結果を示す。図中、横軸は
使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ
示す。なお図５の（ａ）はレトロウイルス結合性物質と
してポリリジンを用いた場合、（ｂ）はＨ−２７１を用
いた場合である。細胞へ結合部位を有するＣ277−ＣＳ
１をポリリジン、あるいはＨ−２７１と併用することに
より、遺伝子導入効率はこれらのレトロウイルス結合性
物質のみを固定化したプレートに比べて著しく上昇する
ことが示された。

【０２１０】（５）エリスロポエチン誘導体ポリペプチ
ドの調製 エリスロポエチンに対するレセプターを有する細胞への
遺伝子導入に使用するために、エリスロポエチンをグル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合ポリペプチ
ドとした誘導体ポリペプチド、ＧＳＴ−Ｅｐｏを調製し
た。配列表の配列番号３４にＧＳＴ−Ｅｐｏのアミノ酸
配列を示す。該配列中２３３番目〜３９８番目のアミノ
酸配列がエリスロポエチンに相当する。

【０２１１】まず、ＧＳＴ−Ｅｐｏを発現させるための
プラスミドを以下に示す操作に従って構築した。ヒト胎
児肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社
製）を鋳型とし、プライマーＥＰＦ１、ＥＰＲ１（配列
表の配列番号３５、３６にそれぞれプライマーＥＰＦ
１、ＥＰＲ１の塩基配列を示す）を用いたＰＣＲを行っ
た。この反応液の一部をとってこれを鋳型とし、プライ
マーＥＰＦ２、ＥＰＲ２（配列表の配列番号３７、３８
にそれぞれプライマーＥＰＦ２、ＥＰＲ２の塩基配列を
示す）を用いて再度ＰＣＲを行った。この反応液より増
幅ＤＮＡ断片を回収し、これをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ
（ともに宝酒造社製）で消化した後、アガロースゲル電
気泳動を行ってエリスロポエチンをコードする領域を含
む約５２０bpのＤＮＡ断片を回収した。得られた断片を
ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）、ＢａｍＨＩで消化したプラ
スミドベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）と混合し
てライゲーションを行った後、大腸菌ＪＭ１０９に導入
した。得られた形質転換体より上記のＤＮＡ断片を含む
プラスミドを保持するものを選択し、プラスミドを調製
してこれをプラスミドｐＥＰＯと命名した。次に、こう
して得られたプラスミドｐＥＰＯをＥｃｏＲＩ、Ｓａｌ
Ｉ（宝酒造社製）で消化した後、アガロースゲル電気泳
動を行って約０．５kpのＤＮＡ断片を回収した。この断
片をＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで消化したプラスミドベクタ
ーｐＧＥＸ５Ｘ−３（ファルマシア社製）と混合してラ
イゲーションを行った後、大腸菌ＪＭ１０９に導入し
た。得られた形質転換体より上記のＤＮＡ断片を含むプ
ラスミドを保持するものを選択し、このプラスミドを調
製してこれをプラスミドｐＧＳＴＥＰＯと命名した。該
プラスミドにはベクター由来のグルタチオン−Ｓ−トラ
ンスフェラーゼのＣ末端部分にエリスロポエチンのアミ
ノ酸配列が挿入された融合ポリペプチド、ＧＳＴ−Ｅｐ
ｏがコードされている。プラスミドｐＧＳＴＥＰＯ上の
ＧＳＴ−ＥＰＯをコードする塩基配列を配列表の配列番
号３９に示す。

【０２１２】ポリペプチドＧＳＴ−Ｅｐｏは以下に示す
操作によって調製した。１００μg／mlのアンピシリン
を含む５mlのＬＢ培地を７本準備し、それぞれに上記の
プラスミドｐＧＳＴＥＰＯで形質転換された大腸菌ＪＭ
１０９、Escherichia coliＪＭ１０９／ｐＧＳＴＥＰＯ
を接種して３７℃で１晩培養した。次に、同様の培地５
００mlずつを入れた２リットル容三角フラスコを７本用
意し、これに上記の培養液５mlずつを接種して３７℃で
培養した。培養開始より３．５時間後に終濃度１mＭと
なるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３．５時間培養し
た。培養終了後、遠心分離を行って培養液より菌体を回
収し、これを１mＭ ＰＭＳＦおよび１mＭ ＥＤＴＡを含
む１００mlのＰＢＳに懸濁し、超音波処理を行って菌体
を破砕した。得られた破砕液に１mＭ ＰＭＳＦ、１mＭ
ＥＤＴＡおよび２％のＴritonＸ−１００を含む１００m
lのＰＢＳを加え、氷上に３０分間静置した後に遠心分
離を行って上清を集めた。得られた上清を０．４５μm
のフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、ＰＢＳで
平衡化したグルタチオン−セファロース４Ｂカラム（フ
ァルマシア社製、３ml）にアプライした。カラムをＰＢ
Ｓで洗浄後、１０mＭ グルタチオンを含む５０mＭ トリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いて溶出を行った。溶出液
をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、
分子量約４．４万のポリペプチドを含む画分を集めてこ
れをＰＢＳに対して透析した。透析後の試料をＰＢＳで
平衡化したリソースＱカラム（ファルマシア社製、６m
l）にアプライし、カラムをＰＢＳで洗浄後、０〜０．
６Ｍ ＮａＣｌ濃度勾配を持つＰＢＳにより溶出を行っ
た。上記同様にグルタチオンを含む５０mＭ トリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８．０を用いて溶出を行った。分子量約４．
４万のポリペプチドを含む画分を集め、これをセントリ
コン１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過によって約
５０μlまで濃縮し、さらにウルトラフリーＣ３ＧＶＳ
ＴＲＬ（ミリポア社製）を用いてろ過した後、ろ液をス
ーパーデックス２００カラム（ファルマシア社製、ＰＢ
Ｓにて平衡化）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーに
供した。分子量約４．４万のポリペプチドを含む溶出画
分を集め、これをＧＳＴ−Ｅｐｏポリペプチド溶液とし
て以降の実験に使用した。このＧＳＴ−Ｅｐｏ溶液中に
は総タンパクの約５０％のＧＳＴ−Ｅｐｏが含まれてい
た。

【０２１３】（６）エリスロポエチンレセプター発現細
胞への遺伝子導入 細胞結合活性を有する機能性物質としてエリスロポエチ
ンを使用した場合の遺伝子導入への効果を、エリスロポ
エチンのレセプターを発現するＴＦ−１、およびエリス
ロポエチンのレセプターを発現しないＨＬ−６０（ＡＴ
ＣＣ ＣＣＬ−２４０）の２種の細胞を用いて調べた。
なお、エリスロポエチンとしては上記のエリスロポエチ
ン誘導体ポリペプチド（ＧＳＴ−Ｅｐｏ）を、また、レ
トロウイルスに結合する物質としてポリリジンをそれぞ
れ使用した。まず、実施例２−（９）に記載の方法に従
って３４pmol／cm²（１．５μg／cm²）相当のＧＳＴ−
Ｅｐｏ、１３３pmol／cm²（１０μg／cm²）のポリリジ
ンおよび３４pmol／cm²のＧＳＴ−Ｅｐｏと１３３pmol
／cm²のポリリジンとの混合物のそれぞれを用いてプレ
ートへの固定化を行った。これらのプレートそれぞれに
１×１０4cfu／のＴＫＮＥＯウイルス、および１×１０
4個の細胞を含む培地を加えて３７℃で２４時間インキ
ュベーションした。なお培地としては、ＴＦ−１につい
てはＲＰＭＩ１６４０培地（５ng／ml ＧＭ−ＣＦＳ、
５０単位／ml ペニシリン、５０μg／mlストレプトマイ
シンを添加したもの）、ＨＬ−６０にはＲＰＭＩ培地
（ニッスイ社製、１０％ ＦＣＳ、５０単位／ml ペニシ
リン、５０μg／ml ストレプトマイシンを添加したも
の）をそれぞれ使用した。インキュベーション終了後、
非付着細胞はデカンテーションによって、またプレート
に付着した細胞はトリプシン処理を行ってそれぞれ採取
し、これらを合わせた。各プレートより得られた細胞懸
濁液のうちの１／５づつをＣＨ−２９６を固定化したプ
レート２枚に移して２４時間インキュベートした後、培
地を一方は上記の培地、またもう一方は終濃度０．７５
mg／mlのＧ４１８を含む上記の培地に交換して３７℃で
８日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８
の存在下、非存在下に出現したコロニー数よりＧ４１８
耐性コロニーの出現率（遺伝子導入効率）を算出した。

【０２１４】図６に結果を示す。図中、横軸は使用した
機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。図
６（ａ）に示したＴＦ−１細胞の場合、ポリリジンのみ
を固定化したプレートにおいてもある程度の遺伝子導入
が起こっているが、ＧＳＴ−Ｅｐｏが共存する場合には
これよりも高い遺伝子導入効率が得られた。一方、図６
（ｂ）に示したＨＬ−６０細胞では、ＧＳＴ−Ｅｐｏの
共存による遺伝子導入効率の上昇は見られなかった。以
上の結果より、エリスロポエチンを利用することによ
り、標的とする細胞に特異的な遺伝子導入が可能なこと
が示された。

【０２１５】さらに、レトロウイルス結合部位を有する
物質をＨ２−５４７にかえてＴＦ−１細胞への遺伝子導
入実験を行った。実施例２−（９）に記載の方法に従っ
て３３３pmol／cm²（２０μg／cm²）のＨ２−５４７、
３４pmol／cm²（１．５μg／cm²）相当のＧＳＴ−Ｅｐ
ｏ、および３４pmol／cm²のＧＳＴ−Ｅｐｏと３３３pmo
l／cm²（２０μg／cm²）のＨ２−５４７との混合物のそ
れぞれを用いてプレートへの固定化を行った。同時にＢ
ＳＡを固定化したプレートを使用した対照実験も行っ
た。図７に得られた結果を示す。図中、横軸はプレート
に固定化された機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそ
れぞれ示す。図に示されるようにＨ２−５４７を使用し
た場合にもＧＳＴ−Ｅｐｏの共存によってＴＦ−１細胞
への遺伝子導入効率が向上することが示された。

【０２１６】（７）機能性物質の混合物を固定化したビ
ーズを用いた遺伝子導入 細胞結合部位を有する物質とレトロウイルス結合部位を
有する物質の両者を固定化したビーズを用いて、レトロ
ウイルス感染効率を上げることが可能かどうかを調べ
た。

【０２１７】ポリペプチドを固定化したビーズは以下に
示す方法により調製した。ビーズには粒子径１．１４μ
mのポリスチレンビーズ（ポリビーズ ポリスチレン
ミクロスフェア、ポリサイエンス社製）を用いた。上記
ビーズの２．５％懸濁液２０μlにエタノール８０μl、
および各種ポリペプチドのＰＢＳ溶液 ２mlを加えて４
℃で一夜静置した後、ＢＳＡおよびＰＢＳを加えて４ml
の１％ＢＳＡ／ＰＢＳ懸濁液とした。この懸濁液より遠
心分離によって回収したビーズを再度５mlの１％ＢＳＡ
／ＰＢＳに懸濁し、室温で１時間静置してポリペプチド
固定化ビーズの懸濁液を得た。ポリペプチド溶液として
は１００μg／ml Ｃ−２７４、１００μg／ml Ｈ−２７
１、１００μg／ml ＣＨ−２７１、１００μg／ml ＣＨ
−２９６、および１００μg／ml Ｈ−２７１と１０μg
／ml Ｃ−２７４の混合物を用い、また対照として２％
ＢＳＡ溶液を使用して固定化を行ったビーズも同様に調
製した。

【０２１８】調製されたポリペプチド固定化ビーズのう
ち１／１０量を上記の懸濁液より回収し、それぞれを２
０００個のＴＦ−１細胞、１０００cfuのＴＫＮＥＯウ
イルス上清液とともに３７℃で一晩培養した。細胞を回
収し、０．３％ Bacto Agar（ディフコ社製）を含むＲ
ＰＭＩ培地［１０％ＦＣＳ、５ng／ml ＧＭ−ＣＦＳ
（ペトロ テック社製）、５０単位／ml ペニシリン、
５０μg／mlストレプトマイシンを含むもの］に懸濁
し、これを予め０．５％ Bacto Agarを含む上記のＲＰ
ＭＩ培地で作製した３５mm プレート上にまいた。な
お、培地は０．７５mg/mlＧ４１８を含むもの、含まな
いものの２通りを使用した。プレートを５％ ＣＯ
_２中、３７℃で１４日間インキュベーションした後、Ｇ
４１８の存在下、非存在下に出現したコロニーを計数
し、Ｇ４１８耐性コロニーの出現率（遺伝子導入効率）
を算出した。

【０２１９】図８に結果を示す。図中、横軸はビーズに
固定化された機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれ
ぞれ示す。Ｈ−２７１とＣ−２７４の混合物を固定化し
たビーズを使用した場合には、Ｈ−２７１のみを固定化
されたビーズ、同一分子中にレトロウイルス結合部位と
細胞結合部位の両方を有するＣＨ−２７１やＣＨ−２９
６がそれぞれ固定化されたビーズを用いた場合に比べて
も高い遺伝子導入効率が得られた。

【０２２０】実施例４ （１）ＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ・Ａを用いた遺伝子導入 ＦＧＦ（ベクトン・ディッキンソン社製）、および配列
表の配列番号４で表されるポリペプチド（Ｃ−ＦＧＦ・
Ａ）のレトロウイルス感染に対する影響をＮＩＨ／３Ｔ
３細胞コロニー形成アッセイによって調べた。すなわ
ち、実施例２−（９）に記載の方法により１３２ｐｍｏ
ｌ／ｃｍ²（２．２５μｇ／ｃｍ²）のＦＧＦ、および１
３３ｐｍｏｌ／ｃｍ²（６．３μｇ／ｃｍ²）のＣ−ＦＧ
Ｆ・Ａのそれぞれを用いて固定化を行ったプレート、お
よびＢＳＡを固定化した対照プレートのそれぞれに１０
００cfuのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含む２mlのウイルス
上清液を加えて３７℃、３０分間プレインキュベーショ
ンした後、ＰＢＳを用いてプレートを徹底的に洗浄し
た。このプレートに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を
含む２mlのＤＭＥＭ培地を加えて３７℃、２４時間イン
キュベーションし、その後０．７５mg／mlのＧ４１８を
含む選択培地中で１０日間増殖させ、それに続いてコロ
ニーを染色し、計数した。図９に得られた結果を示す。
図中、横軸はプレートに固定化された機能性物質、縦軸
は出現したＧ４１８耐性コロニー数をそれぞれ示す。

【０２２１】図９に示されるように、対照として使用し
たＢＳＡ固定化プレートではコロニーが出現しなかった
のに対し、ＦＧＦ、およびＣ−ＦＧＦ・Ａを固定化した
プレートを用いた場合にはＧ４１８耐性コロニーの出現
が確認された。この結果よりＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ・Ａが
レトロウイルス結合部位を有していること、および、フ
ィブロネクチンの細胞結合部位ポリペプチドが付加され
たＣ−ＦＧＦ・Ａは遺伝子導入においてＦＧＦより優れ
た効果を有することが示された。

【０２２２】（２）プレートへの固定化に使用したＣ−
ＦＧＦ・Ａ濃度と遺伝子導入効率との関係 種々の濃度のＣ−ＦＧＦ・Ａで固定化を行ったプレート
での遺伝子導入効率の比較を行った。すなわち実施例２
−（９）に記載の方法に従い、０．５２１pmol／cm
²（０．０２４７μg／cm²）〜５．２１pmol／cm²（０．
２４７μg／cm²）のＣ−ＦＧＦ・Ａを用いて固定化を行
ったプレート、およびＢＳＡ固定化プレート（対照プレ
ート）を用い、実施例４−（１）と同様の操作でレトロ
ウイルスの感染を行った。ウイルス感染処理後、非付着
細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着
した細胞はトリプシン処理によってプレートから剥がす
ことによってそれぞれ採取し、両者を合わせた。得られ
た細胞懸濁液を２等分して一方をＤＭＥＭ、他方を終濃
度０．７５mg／mlのＧ４１８を含むＤＭＥＭとともに３
７℃で１０日間培養した後、出現したコロニー数を数
え、Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対
するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率と
した。

【０２２３】得られた結果を図１０に示す。図中、横軸
はプレートの固定化操作に使用されたＣ−ＦＧＦ・Ａの
濃度、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。なお、対
照プレートでの実験結果はポリペプチド濃度０μmol／c
m²としてプロットした。図１０に示されるように、固定
化に使用したＣ−ＦＧＦ・Ａの濃度依存的に遺伝子導入
効率の上昇が見られた。

【０２２４】（３）ＨＬ−６０細胞への遺伝子導入 浮遊細胞であるＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２
４０）へのレトロウイルスの感染に関して、各種のポリ
ペプチドの存在の効果を以下に示す操作によって調べ
た。すなわち、１００pmol／cm²のＣ−ＦＧＦ・Ａ
（４．８μg／cm²）、およびＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１（５．
１μg／cm²）を用いて実施例２−（９）に記載の方法で
固定化を行ったプレート、およびＢＳＡを固定化した対
照プレートのそれぞれに１×１０4cfu／のＴＫＮＥＯウ
イルス、２０００個のＨＬ−６０細胞を含む２mlのＲＰ
ＭＩ培地（１０％ ＦＣＳ、５０単位／mlのペニシリン
および５０μg／mlのストレプトマイシンを添加して使
用）を加えて３７℃で２４時間インキュベーションし
た。インキュベーション終了後、非付着細胞はデカンテ
ーションによって、またプレートに付着した細胞はピペ
ッティングによってそれぞれ採取し、これらを合わせ
た。得られた細胞懸濁液のうちの１／２づつをＣＨ−２
９６固定化プレートに移して２４時間インキュベートし
た後、培地を終濃度０．７５mg／mlのＧ４１８を含む上
記のＲＰＭＩ培地に交換し、３７℃で１２日間培養し、
出現したコロニー数を数えた。各ポリペプチドを使用し
て得られたＧ４１８耐性コロニー数を図１１に示す。図
中、横軸はプレートに固定化された機能性物質、縦軸は
出現したＧ４１８耐性コロニー数をそれぞれ示す。

【０２２５】図１１に示されるように、ＢＳＡ固定化プ
レートに比較してＣ−ＦＧＦ・ＡおよびＣ−ＦＧＦ−Ｃ
Ｓ１を固定化したプレートではＧ４１８耐性コロニー数
が著しく上昇しており、これらのポリペプチドがＨＬ−
６０細胞へのレトロウイルスの感染を促進していること
が示された。

【０２２６】（４）マウス骨髄細胞への遺伝子導入 骨髄細胞へのレトロウイルス感染に対するＦＧＦ、Ｃ−
ＦＧＦ・ＡおよびＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１の効果を調べるた
め、以下に示す実験を行った。

【０２２７】６〜８週齢のマウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）に
１５０mg/Kgの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、アム
レスコ社製）を腹腔内投与し、その２日後に大腿骨およ
び脛骨を摘出して骨髄を採取した。得られた骨髄をフィ
コール−ハイパク（密度 1.0875ｇ／ml、ファルマシア
社製）を用いた密度勾配遠心分離に供し、低密度単核細
胞画分を調製してこれをマウス骨髄細胞とした。

【０２２８】マウス骨髄細胞はルスキー（Luskey）等の
方法（Blood、第80巻、第396〜402頁、1992年）に従
い、レトロウイルス感染前に予備刺激を行った。すなわ
ち、２０％ ＦＣＳ、１００単位／ml 組換えヒトインタ
ーロイキン−６（rhＩＬ−６、アムジェン社製）、１０
０ng／ml 組換えマウス幹細胞因子（rmＳＣＦ、アムジ
ェン社製）、５０単位／mlのペニシリンおよび５０μg
／mlのストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ（ギブ
コ社製）中に１×１０6cells／mlの細胞密度で上記のマ
ウス骨髄細胞を添加し、５％ ＣＯ_２中、３７℃で４８
時間インキュベートした。予備刺激した細胞は容器に付
着したものを含め、ピペットを用いて吸引、採集した。

【０２２９】実施例２−（９）に記載の方法に従って２
３６μmol／cm²（４μg／cm²）のＦＧＦ、１６９pmol／
cm²（８μg／cm²）のＣ−ＦＧＦ・Ａ、あるいは１５９
μmol／cm²（８μg／cm²）のＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１を用い
て固定化を行ったプレート、およびＢＳＡ固定化プレー
ト（対照プレート）に１×１０6個の予備刺激した細胞
と１×１０4cfuのＰＭ５ｎｅｏウイルスとを含む上記の
予備刺激に用いられた培地 ２mlを添加して３７℃でイ
ンキュベートした。２時間後に同量のウイルスを含む同
様の培地（２ml）を新たにプレートに追加し、さらに２
２時間インキュベートを続けた。インキュベート終了
後、非接着細胞はデカンテーションによって、またプレ
ートに接着した細胞は細胞解離緩衝液（ＣＤＢ、酵素を
含まないもの、ギブコ社製）を使用してそれぞれ採集
し、これらを合わせて同緩衝液で２回洗浄した後、細胞
数を計数した。採集した細胞はＨＰＰ−ＣＦＣ（High P
roliferative Potential-Colony Forming Cells、高増
殖能コロニー形成細胞）アッセイに供した。

【０２３０】ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイはブラッドレー
（Bradley）等の方法（Aust. J. Exp.Biol. Med. Sc
i.、第44巻、第287〜293頁、1966年）に従って行った。
培地には１％／０．６６％重層軟寒天培地を使用し、終
濃度１．５mg／mlのＧ４１８を含むもの、および含まな
いものの２通りを用いた。１ウエルあたりに１×１０4
個の感染細胞を添加し、１０％ ＣＯ_２中、３７℃で１
３日間インキュベートした。インキュベーション終了
後、出現したコロニーを倒立顕微鏡で観察し、ＨＰＰ−
ＣＦＣ由来の高密度コロニー（径０．５mm以上）を計数
してＧ４１８耐性コロニーの出現率（遺伝子導入効率）
を算出した。得られた結果を図１２に示す。図中、横軸
は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。

【０２３１】図１２に示されるように、対照として使用
したＢＳＡ固定化プレートではＧ４１８耐性コロニーは
出現していないのに対し、上記の各ポリペプチドを固定
化したプレートを使用した場合にはＧ４１８耐性コロニ
ーが得られている。また、遺伝子導入効率はＦＧＦ、Ｃ
−ＦＧＦ・Ａ、Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１の順に高くなってお
り、細胞への結合活性を持つフィブロネクチン由来の細
胞結合部位ポリペプチド、およびＣＳ−１ポリペプチド
部分の存在が骨髄細胞へのレトロウイルスの感染効率を
高めた。

【０２３２】（５）プレートの固定化に使用したＣ２７
７−ＣｏｌＶ濃度と遺伝子導入効率との関係 種々の濃度のＣ２７７−ＣｏｌＶを用いて固定化を行っ
たプレートでの遺伝子導入効率の比較を以下に示す操作
により行った。０．１pmol／cm²（０．１μg／cm²）〜
４１６pmol／cm²（２０μg／cm²）のＣ２７７−Ｃｏｌ
Ｖを用い、実施例２−（９）に記載の方法によってプレ
ートへの固定化を行った。これらのプレートのそれぞれ
に１０００cfuのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含む２mlのウ
イルス上清液を加えて３７℃、３０分間プレインキュベ
ーションした後、ＰＢＳを用いてプレートを徹底的に洗
浄した。このプレートに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細
胞を含む２mlのＤＭＥＭ培地を加えて３７℃、２４時間
インキュベーションした後、非付着細胞はデカンテーシ
ョンによって、またプレートに付着した細胞はトリプシ
ン処理の後にプレートから剥がすことによってそれぞれ
採取し、これらを合わせた。得られた細胞懸濁液を二分
し、一方にはＤＭＥＭ、もう一方には終濃度０．７５mg
／mlのＧ４１８を含むＤＭＥＭを加えて３７℃で１０日
間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含
まない培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性
コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、その結果を図
１３に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は
遺伝子導入効率を示す。

【０２３３】図１３に示されるようにＣ２７７−Ｃｏｌ
Ｖを固定化したプレートを用いた場合、固定化に使用し
たＣ２７７−ＣｏｌＶの濃度依存的に遺伝子導入効率が
上昇した。

【０２３４】（６）ポリリジンを用いた遺伝子導入 ポリリジン［（Ｌｙｓ）n ］とレトロウイルスとの結合
を以下に示す操作により調べた。ポリリジンとしてはポ
リ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩（分子量５万〜１０万、和
光純薬社製）を使用した。まず、１３３pmol／cm²（１
０μg／cm²）のＰＢＳ溶液としたポリリジンを用い、実
施例２−（９）に記載の方法によってプレートへの固定
化を行った。このプレート、およびＢＳＡを固定化した
対照プレートのそれぞれについて実施例４−（２）に記
載の方法で遺伝子導入効率を評価した。その結果を図１
４に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺
伝子導入効率を示す。

【０２３５】図１４に示されるようにＢＳＡを用いた対
照プレートではコロニーが見られなかったのに対し、ポ
リリジンを固定化したプレートではＧ４１８耐性コロニ
ーの出現が確認された。このことはレトロウイルスがプ
レートに固定化されたポリリジンに結合するために、洗
浄後のプレート上にレトロウイルスが残存していること
を示している。

【０２３６】実施例５ （１）ポリペプチドの重合体を用いた遺伝子導入 ポリペプチドの重合体を用いた遺伝子導入は、各ポリペ
プチドをプレート上に固定しない状態で使用し、実施し
た。実施例２−（９）に記載の方法であらかじめＢＳＡ
を固定化しておいたプレートに１０００pfuのＰＭ５ｎ
ｅｏウイルス、２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞、およ
び終濃度０．６３nmol／mlの各ポリペプチド（Ｈ−２７
１、ＣＨ−２７１、Ｈ２−５４７、ＣＨ２−８２６）を
含む２mlのＤＭＥＭ培地を加えて３７℃、２４時間イン
キュベートした後、非付着細胞はデカンテーションによ
って、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理に
よってプレートから剥がすことによってそれぞれ採取
し、両者を合わせた。また、対照としてポリペプチドを
添加しないものについても同様の操作で導入実験を行っ
た。得られた細胞懸濁液を２等分して一方をＤＭＥＭ、
他方を終濃度０．７５mg／mlのＧ４１８を含むＤＭＥＭ
とともに３７℃で１０日間培養し、出現したコロニー数
を数えた。Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー
数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入
効率とし、その結果を図１５に示す。図中、横軸は使用
した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。

【０２３７】図１５に示されるように、Ｈ２−５４７存
在下での遺伝子導入効率はＣＨ−２７１存在下に比べて
著しく高く、またＣＨ２−８２６でもＣＨ−２７１と同
等あるいはそれ以上の遺伝子導入効率が得られた。

【０２３８】さらに詳細な検討を行った。ポリペプチド
としてＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、Ｈ２−５４７を使
用し、それぞれプレートあたり０．１２６nmol（終濃度
０．０６３nmol／ml）、１．２６nmol（終濃度０．６３
nmol／ml）の２通りの量で用いた他は上記と同様に操作
した。図１６に得られた結果を示す。図中、横軸は使用
した機能性物質とその量、縦軸は遺伝子導入効率を示
す。

【０２３９】図１６に示されるようにＨ２−５４７を用
いた場合には、用いた２通りのポリペプチド量のどちら
でもＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６に比べて有意に高い遺
伝子導入効率が得られた。

【０２４０】（２）Ｈ２Ｓ−５７３を用いたマウス骨髄
細胞への遺伝子導入 骨髄細胞へのレトロウイルス感染に対するＨ２Ｓ−５７
３の効果を調べるため、実施例４−（４）に記載の方法
でマウス骨髄細胞への遺伝子導入を実験を行った。

【０２４１】マウス骨髄細胞は上記実施例に記載の方法
に従って調製し、予備刺激を行った。なお、レトロウイ
ルス感染時のプレートにはＨ２Ｓ−５７３［１６０pmol
／cm ²（１０μg／cm²）］を固定化したものの他、ＣＨ
−２９６［１３２pmol／cm²（８．３μg／cm²）］を固
定化したもの、および対照としてＢＳＡを固定化したも
のを用いた。ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイにより得られた結
果を図１７に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、
縦軸は遺伝子導入効率を示す。

【０２４２】図１７に示されるように、対照として使用
したＢＳＡ固定化プレートではＧ４１８耐性の高密度コ
ロニーの出現は見られない。ＣＨ−２９６固定化プレー
トでは約５０％の遺伝子導入効率が得られているが、Ｈ
２Ｓ−５７３固定化プレートを用いた場合にはこれより
も高い効率でＧ４１８耐性の高密度コロニーが得られ
た。

【０２４３】実施例６ （１）非固定の機能性物質を用いた遺伝子導入 ポリペプチドがプレート上に固定されない状態で共存す
る場合にレトロウイルスの感染効率に与える影響につい
て以下のようにして調べた。すなわち、実施例２−
（９）に記載の方法によりあらかじめＢＳＡを固定化し
ておいたプレートに１００cfuのＰＭ５ｎｅｏウイル
ス、２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞、および終濃度１
０、４０、２５０μg／ml（それぞれ０．１５８、０．
６３２、３．９５０nmol／mlに相当）のＣＨ−２９６を
含む２mlのＤＭＥＭ培地を加えて２４時間インキュベー
ションした後、非付着細胞はデカンテーションによっ
て、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理の後
にプレートから剥がすことによってそれぞれ採取し、両
者を合わせた。得られた細胞懸濁液を１０cm細胞培養用
プレートに移して２４時間インキュベートした後、培地
を終濃度０．７５mg／mlのＧ４１８を含むＤＭＥＭに交
換してさらに１０日間培養した。また、対照としてＣＨ
−２９６を添加しないもの、および３２pmol／cm²（２
μg／cm²）、１２７pmol／cm²（８μg／cm²）のＣＨ−
２９６を固定化したプレートを用いてこれにウイルス上
清液と細胞を加えたものについて上記同様に操作した。
こうして得られたＧ４１８耐性コロニーの数を数え、結
果を表１にまとめた。

【０２４４】

【表１】

【０２４５】表１に示されるように溶液中に細胞、ウイ
ルス、ＣＨ−２９６が共存する場合にはＣＨ−２９６非
存在下に比べてＧ４１８耐性コロニー数が大幅に増加し
た。また、その数はＣＨ−２９６を固定化したプレート
を用いた場合と同等か、もしくはそれよりも多かった。
なお、ＢＳＡ固定化プレートに上記の各濃度のＣＨ−２
９６溶液を添加してしばらく放置した後にプレートを洗
浄してウイルス感染実験に用いた場合には、上記のＣＨ
−２９６を添加しない場合と同程度のＧ４１８耐性コロ
ニーしか得られないことから、ＢＳＡ固定化プレートに
はＣＨ−２９６が結合しないことがわかる。従って上記
のＣＨ−２９６によるレトロウイルス感染促進効果はイ
ンキュベート中に溶液中のＣＨ−２９６がプレートに結
合してもたらされたものではないと考えられる。

【０２４６】（２）非固定の機能性物質を用いた遺伝子
導入 ポリペプチドがプレート上に固定されない状態で共存す
る場合にレトロウイルスの感染効率に与える影響につい
て以下のようにして調べた。すなわち、実施例２−
（９）に記載の方法によりあらかじめＢＳＡを固定化し
ておいたプレートに１０００cfuのＰＭ５ｎｅｏウイル
ス、２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞、および終濃度
１．６７nmol／mlのＣ−ＦＧＦ・Ａ、ＣｏｌＶ、Ｃ２７
７−ＣｏｌＶをそれぞれ含む２mlのＤＭＥＭ培地を加え
て３７℃、２４時間インキュベーションした後、非付着
細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着
した細胞はトリプシン処理の後にプレートから剥がすこ
とによってそれぞれ採取し、両者を合わせた。得られた
細胞懸濁液を二分して一方をＤＭＥＭ、もう一方を終濃
度０．７５mg／mlのＧ４１８を含むＤＭＥＭとともに３
７℃で１０日間培養し、出現したコロニー数を数えた。
Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対する
Ｇ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、
その結果を図１８に示す。図中、横軸は使用した機能性
物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。

【０２４７】図１８に示されるように、各ポリペプチド
がウイルス感染時に共存する場合には高い遺伝子導入効
率が得られており、これらのポリペプチドがプレート上
に固定されない状態でもレトロウイルス感染の促進効果
を有することが明らかとなった。

【０２４８】（３）非固定の機能性物質を用いた浮遊細
胞への遺伝子導入 非固定のポリペプチドが浮遊細胞への遺伝子導入効率に
与える影響について以下のようにして調べた。すなわ
ち、実施例２−（９）に記載の方法により３３３pmol／
cm²（１０μg／cm²）のＨ−２７１を固定化したプレー
ト、およびＢＳＡを固定化したプレートのそれぞれに１
×１０4cfu／のＴＫＮＥＯウイルス、１×１０4個のＴ
Ｆ−１細胞を含む２mlのＲＰＭＩ１６４０培地［５ng／
ml ＧＭ−ＣＦＳ、５０単位／ml ペニシリン、５０μg
／mlストレプトマイシンを含むもの］を加え、さらにＢ
ＳＡを固定化したプレートには終濃度５０μg／ml
（１．６７nmol／ml）のＨ−２７１を加えて３７℃で２
４時間インキュベーションした。インキュベーション終
了後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプ
レートに付着した細胞はトリプシン処理を行ってそれぞ
れ採取し、これらを合わせた。得られた細胞懸濁液のう
ちの１／５づつをＣＨ−２９６を固定化したプレート２
枚に移して２４時間インキュベートした後、培地を一方
は上記の培地、またもう一方は終濃度０．７５mg／mlの
Ｇ４１８を含む上記の培地に交換して３７℃で８日間培
養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８の存在
下、非存在下に出現したコロニー数よりＧ４１８耐性コ
ロニーの出現率（遺伝子導入効率）を算出した。得られ
た結果を図１９に示す。図中、横軸は使用した機能性物
質とその使用形態、縦軸は遺伝子導入効率を示す。

【０２４９】図１９に示されるように、非固定のＨ−２
７１を使用した場合にはＨ−２７１を固定化したプレー
トよりも高い遺伝子導入効率が得られており、ＴＦ−１
細胞への遺伝子導入にＨ−２７１を使用する際には、非
固定の状態の方が好ましいことが示された。

【０２５０】（４）ポリペプチドによるレトロウイルス
感染促進の機構の解明 上記実施例に示された、非固定のポリペプチドによる細
胞へのレトロウイルス感染の促進が細胞とポリペプチド
との結合、およびポリペプチドとレトロウイルスとの結
合を介して起こっていることを確かめるために以下に示
すような実験を行った。まず実施例２−（９）に記載の
方法で調製したＢＳＡ固定化プレートに１０００個のＮ
ＩＨ／３Ｔ３細胞を含む２mlのＤＭＥＭを加え、３７℃
で２４時間生育させた。このプレートより培地を除き、
それぞれ２mlの１．６７nmol／mlのＨ−２７１、ＣＨ−
２７１、Ｃ−ＦＧＦ・Ａおよび対照としてＰＢＳを加え
て３７℃、２．５時間インキュベートした後、２５mＭ
ヘペス（ＨＥＰＥＳ）を含むハンクス平衡塩類溶液（Ｈ
ＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ社製）でプレートを洗浄した。次に
１０００cfuのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含む２mlのウイ
ルス上清液をプレートに加えて３７℃、３０分間インキ
ュベートした後、ＰＢＳでプレートを洗浄した。このプ
レートに２mlのＤＭＥＭを加えて３７℃、２４時間イン
キュベートした後に非付着細胞はデカンテーションによ
って、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理の
後にプレートから剥がすことによってそれぞれ採取し、
両者を合わせた。得られた細胞懸濁液を二分して一方を
ＤＭＥＭ、もう一方を終濃度０．７５mg／mlのＧ４１８
を含むＤＭＥＭとともに３７℃で１０日間培養し、出現
したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含まない培地で得
られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割
合を遺伝子導入効率とし、その結果を図２０に示す。図
中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率
を示す。

【０２５１】図２０に示されるようにプレート上の細胞
を上記のポリペプチド溶液で処理した後にウイルス感染
を行った場合には著しい感染効率の上昇が見られた。こ
のことは細胞にポリペプチドが結合し、さらに細胞上の
ポリペプチドにレトロウイルスが結合することによって
レトロウイルスの感染効率の上昇が起こることを示唆し
ている。

【０２５２】さらに、添加するポリペプチドを、０．２
９nmol／mlのＣ−ＦＧＦ・Ａ、および０．７９nmol／ml
のＣＨ−２９６に変更し、上記同様の実験を行った。図
２１にその結果を示す。図中、横軸は使用した機能性物
質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。図２１に示されるよ
うにＣ−ＦＧＦ・Ａ、およびＣＨ−２９６を添加した場
合には遺伝子導入効率の上昇が見られており、Ｃ−ＦＧ
Ｆ・Ａについて上記の活性が確認されるとともに、ＣＨ
−２９６も同じ機構でレトロウイルスの感染を促進する
活性を有することが示された。

【０２５３】実施例７ （１）機能性物質を固定化したビーズを用いた遺伝子導
入 機能性物質を固定化したビーズを用いてレトロウイルス
感染効率を上げることが可能かどうかを以下に示す操作
によって調べた。ビーズには粒子径１．１４μmのポリ
スチレンビーズ（ポリビーズ ポリスチレン ミクロス
フェア、ポリサイエンス社製）を用いた。上記ビーズの
２．５％懸濁液２０μlにエタノール８０μl、および４
０μg／mlのＣＨ−２９６溶液 ２mlを加えて４℃で一夜
静置した後、ＢＳＡおよびＰＢＳを加えて４mlの１％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳ懸濁液とした。この懸濁液より遠心分離に
よって回収したビーズを再度５mlの１％ＢＳＡ／ＰＢＳ
に懸濁し、室温で１時間静置してＣＨ−２９６固定化ビ
ーズの懸濁液を得た。なお対照としてＣＨ−２９６溶液
のかわりに２％ＢＳＡを使用して固定化操作を行ったビ
ーズも同様に調製した。

【０２５４】上記のビーズ懸濁液のうち１／１０量
（０．５ml）をとり、これより遠心分離によってビーズ
を回収した後、これに１０００cfuのＰＭ５ｎｅｏウイ
ルスを含むＤＭＥＭを加えて３７℃、３０分間インキュ
ベートした。ビーズを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄
後、２mlのＤＭＥＭに懸濁して１mlをプレートに移し、
３×１０5個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む１mlのＤＭＥ
Ｍを加え、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で２４時
間インキュベートした。その後、培地を終濃度０．７５
mg／mlのＧ４１８を含むＤＭＥＭに交換し、さらに１０
日間培養し、出現したコロニーを染色、計数した。表２
にその結果を示す。

【０２５５】表２に示されるようにＣＨ−２９６を固定
化したビーズを使用した場合には２６４個のＧ４１８耐
性コロニーが出現したのに対し、対照として用いたＢＳ
Ａ固定化ビーズではまったく耐性コロニーは得られなか
った。このことはＣＨ−２９６をビーズ上に固定化した
場合でもプレートの場合同様にレトロウイルスの感染効
率を上げる効果を持つことを示している。

【０２５６】

【表２】

【０２５７】（２）機能性物質を固定化したビーズを用
いたマウス骨髄細胞への遺伝子導入 機能性物質を固定化したビーズを用いてマウス骨髄細胞
へのレトロウイルス感染効率を上げることが可能かどう
かを以下に示す操作によって調べた。

【０２５８】マウス骨髄細胞は実施例４−（４）に記載
の方法に従って調製し、予備刺激を行った。

【０２５９】実施例２−（９）に記載の方法に従ってＢ
ＳＡを固定化したプレート、これに実施例７−（１）に
記載の方法で調製したＣＨ−２９６固定化ビーズのうち
１／１０量を添加したもののそれぞれに１×１０6個の
予備刺激した骨髄細胞と１×１０4cfuのＰＭ５ｎｅｏウ
イルスとを含む上記の予備刺激に用いられた培地 ２ml
を添加して３７℃でインキュベートした。２時間後に同
量のウイルスを含む同様の培地（２ml）を新たにプレー
トに追加し、さらに２２時間インキュベートを続けた。
インキュベート終了後、非接着細胞はデカンテーション
によって、またプレートに接着した細胞は細胞解離緩衝
液（ＣＤＢ、酵素を含まない、ギブコ社製）を使用して
それぞれ採集し、これらを合わせて同緩衝液で２回洗浄
した後、細胞数を計数した。採集した細胞は実施例４−
（４）に記載の方法に従いＨＰＰ−ＣＦＣアッセイに供
した。

【０２６０】結果を図２２に示す。図中、横軸は使用さ
れた機能性物質とその使用形態、縦軸は遺伝子導入効率
を示す。この結果より、ＣＨ−２９６固定化ビーズを用
いた場合でもマウス骨髄細胞へのレトロウイルス感染効
率を上げることが可能であることがわかった。

【０２６１】実施例８ （１）Ｈ−２７１、およびＣＨ−２７１を用いた遺伝子
導入 Ｈ−２７１のレトロウイルス感染に対する影響を、Ｈ−
２７１、およびレトロウイルス感染の促進を示すことが
知られているＣＨ−２７１を固定化したプレート中でウ
イルス上清液をプレインキュベーションした後、プレー
トを徹底的に洗浄し、そこに残存するウイルスの量をＮ
ＩＨ／３Ｔ３細胞コロニー形成アッセイで測定し、両者
の結果を比較することにより評価した。すなわち、実施
例２−（９）記載の方法により種々の濃度のＨ−２７１
［６７pmol／cm²（２μg／cm²）〜３３３pmol／cm²（１
０μg／cm²）］、およびＣＨ−２７１［６７pmol／cm²
（４μg／cm²）〜３３３pmol／cm²（２０μg／cm²）］
を用いて固定化操作を行ったプレートのそれぞれに１０
００cfuのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含む２mlのウイルス
上清液を加えて３７℃、３０分間プレインキュベーショ
ンした後、ＰＢＳを用いてプレートを徹底的に洗浄し
た。このプレートに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を
含む２mlのＤＭＥＭ培地を加えて３７℃、２４時間イン
キュベーションし、その後０．７５mg／mlのＧ４１８を
含む選択培地中で１０日間増殖させ、それに続いてコロ
ニーを染色し、計数した。その結果を図２３に示す。図
２３は機能性物質と遺伝子導入効率の関係を示す図であ
り、横軸はポリペプチドの使用量、縦軸はＧ４１８耐性
コロニー数を示す。

【０２６２】図２３に示されるように、ＣＨ−２７１を
用いた場合には固定化操作に用いたポリペプチド濃度に
かかわらずほぼ同程度のＧ４１８耐性コロニーが出現し
た。これに対し、Ｈ−２７１では固定化の際のポリペプ
チド濃度を上げることにより濃度依存的に出現コロニー
数が増加しており、３３３pmol／cm²で固定化を行った
ものではＣＨ−２７１と同程度のＧ４１８耐性コロニー
が得られた。このことは十分量のＨ−２７１を用いてプ
レートの固定化を行うことにより、ＣＨ−２７１と実質
上同等のウイルス感染効率が得られることを示してい
る。

【０２６３】（２）Ｃ−ＦＧＦ・Ａを用いた遺伝子導入 Ｃ−ＦＧＦ・Ａポリペプチドのレトロウイルス感染に対
する影響をＮＩＨ／３Ｔ３細胞コロニー形成アッセイに
よって調べた。すなわち、実施例２−（９）に記載の方
法により１２７pmol／cm²（６μg／cm²）のＣ−ＦＧＦ
・Ａで固定化を行ったプレート、１２７pmol／cm
²（７．６μg／cm²）のＣＨ−２７１で固定化を行った
プレート、１２７pmol／cm²（８μg／cm²）のＣＨ−２
９６で固定化を行ったプレート、およびＢＳＡを固定化
した対照プレートを使用した他は実施例８−（１）と全
く同じ方法で評価した。その結果を図２４に示す。図２
４は機能性物質と遺伝子導入効率の関係を示す図であ
り、横軸に使用した機能性物質およびＢＳＡを、縦軸に
Ｇ４１８耐性コロニー数を示す。

【０２６４】図２４に示されるように、対照として使用
したＢＳＡを固定化したプレートではコロニーが出現し
なかった。一方、Ｃ−ＦＧＦ・Ａを固定化したプレート
を用いた場合にはＧ４１８耐性コロニーの出現が確認さ
れ、その数はＣＨ−２７１、およびＣＨ−２９６を用い
たものと同程度であった。このことはＦＧＦ分子上にＣ
Ｈ−２７１、およびＣＨ−２９６と実質的に同等の機能
を有するレトロウイルス結合部位が存在していることを
示している。

【０２６５】（３）Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１を用いた遺伝子
導入 Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１ポリペプチドのレトロウイルス感染
に対する影響を以下に示す操作によって調べた。すなわ
ち、それぞれ１３３pmol／cm²のＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１
（６．７μg／cm²）、Ｃ−ＦＧＦ・Ａ（６．３μg／c
m²）、ＣＨ−２７１（８μg／cm²）、ＣＨ−２９６
（８．４μg／cm²）を用いて実施例２−（９）に記載の
方法でプレートの固定化を行い、これを用いて実施例８
−（１）同様のＮＩＨ／３Ｔ３細胞コロニー形成アッセ
イを行った。その結果を図２５に示す。図２５は機能性
物質と遺伝子導入効率の関係を示す図であり、横軸に使
用した機能性物質を、縦軸にＧ４１８耐性コロニー数を
示す。

【０２６６】図２５に示されるように、これら４種のポ
リペプチドを固定化したプレートではほぼ同数のＧ４１
８耐性コロニーが出現しており、Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１分
子も他のポリペプチドと実質的に同等のレトロウイルス
結合活性を有していることを示している。

【０２６７】（４）Ｃ２７７−ＣｏｌＶを用いた遺伝子
導入 Ｃ２７７−ＣｏｌＶポリペプチドのレトロウイルス感染
に対する影響を、１２４pmol／cm²（６．４μg／cm²）
のＣ２７７−ＣｏｌＶで固定化を行ったプレート、およ
びＢＳＡを固定化した対照プレートを用いて実施例８−
（１）と同様の方法で評価した。その結果を図２６に示
す。図２６は機能性物質と遺伝子導入効率の関係を示す
図であり、横軸に使用した機能性物質およびＢＳＡを、
縦軸にＧ４１８耐性コロニー数を示す。

【０２６８】図２６に示されるようにＢＳＡを用いた対
照プレートではコロニーが見られなかったのに対し、Ｃ
２７７−ＣｏｌＶを固定化したプレートではＧ４１８耐
性コロニーの出現が確認された。このことはＣｏｌＶ分
子上にレトロウイルス結合部位が存在しているために洗
浄後のプレート上にレトロウイルスが残存していること
を示している。

【０２６９】

【発明の効果】以上記載したごとく、本発明により、レ
トロウイルスを用いて標的細胞に効率よく遺伝子導入す
る方法が提供される。目的とする標的細胞に適した細胞
結合性の物質を選択して本発明の方法を実施することに
より、特殊なレトロウイルスベクターを必要とせず、簡
便かつ高効率で遺伝子導入された標的細胞を取得するこ
とができる。遺伝子導入された細胞の脊椎動物への移植
により、形質転換動物が簡便に作製され、本発明の方法
は医療的分野、細胞工学的分野、遺伝子工学的分野、発
生工学的分野等において有用である。また本発明の機能
性物質、およびその混合物を含有する培地、標的細胞へ
のレトロウイルス介在遺伝子導入を行うためのキットも
提供され、これらの培地、キットを用いることにより、
レトロウイルスの配置、標的細胞への外来遺伝子の導入
などを簡便に効率よく行うことができる。

【０２７０】

【配列表フリーテキスト】

SEQ ID NO: 1: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 2: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 3: Fibroblast growth factor SEQ ID NO: 4: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 5: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 6: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 7: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 8: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 9: Synthetic DNA SEQ ID NO: 10: Synthetic DNA SEQ ID NO: 11: Synthetic DNA SEQ ID NO: 12: Synthetic DNA SEQ ID NO: 13: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 14: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 15: Synthetic DNA SEQ ID NO: 16: Synthetic DNA SEQ ID NO: 17: DNA encoding artificial polypeptide SEQ ID NO: 18: Synthetic DNA SEQ ID NO: 19: Synthetic DNA SEQ ID NO: 20: DNA encoding artificial polypeptide SEQ ID NO: 21: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 22: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 23: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 24: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 25: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 26: DNA encoding artificial polypeptide SEQ ID NO: 27: DNA encoding artificial polypeptide SEQ ID NO: 28: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 29: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 30: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 31: Synthetic DNA SEQ ID NO: 32: Synthetic DNA SEQ ID NO: 33: DNA encoding artificial polypeptide SEQ ID NO: 34: Artificial polypeptide SEQ ID NO: 35: Synthetic DNA SEQ ID NO: 36: Synthetic DNA SEQ ID NO: 37: Synthetic DNA SEQ ID NO: 38: Synthetic DNA SEQ ID NO: 39: DNA encoding artificial polypeptide

【０２７１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Takara Shuzo Co., Ltd. <120> Method for gene introduction into target cells by retrovirus <130> 183112 <150> JP 07-294382 <151> 1995-11-13 <150> JP 08-051847 <151> 1996-03-08 <150> JP 09-518731 <151> 1996-11-07 <160> 39 <210> 1 <211> 271 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <400> 1 Ala Ile Pro Ala Pro Thr Asp Leu Lys Phe Thr Gln Val Thr Pro 1 5 10 15 Thr Ser Leu Ser Ala Gln Trp Thr Pro Pro Asn Val Gln Leu Thr 20 25 30 Gly Tyr Arg Val Arg Val Thr Pro Lys Glu Lys Thr Gly Pro Met 35 40 45 Lys Glu Ile Asn Leu Ala Pro Asp Ser Ser Ser Val Val Val Ser 50 55 60 Gly Leu Met Val Ala Thr Lys Tyr Glu Val Ser Val Tyr Ala Leu 65 70 75 Lys Asp Thr Leu Thr Ser Arg Pro Ala Gln Gly Val Val Thr Thr 80 85 90 Leu Glu Asn Val Ser Pro Pro Arg Arg Ala Arg Val Thr Asp Ala 95 100 105 Thr Glu Thr Thr Ile Thr Ile Ser Trp Arg Thr Lys Thr Glu Thr 110 115 120 Ile Thr Gly Phe Gln Val Asp Ala Val Pro Ala Asn Gly Gln Thr 125 130 135 Pro Ile Gln Arg Thr Ile Lys Pro Asp Val Arg Ser Tyr Thr Ile 140 145 150 Thr Gly Leu Gln Pro Gly Thr Asp Tyr Lys Ile Tyr Leu Tyr Thr 155 160 165 Leu Asn Asp Asn Ala Arg Ser Ser Pro Val Val Ile Asp Ala Ser 170 175 180 Thr Ala Ile Asp Ala Pro Ser Asn Leu Arg Phe Leu Ala Thr Thr 185 190 195 Pro Asn Ser Leu Leu Val Ser Trp Gln Pro Pro Arg Ala Arg Ile 200 205 210 Thr Gly Tyr Ile Ile Lys Tyr Glu Lys Pro Gly Ser Pro Pro Arg 215 220 225 Glu Val Val Pro Arg Pro Arg Pro Gly Val Thr Glu Ala Thr Ile 230 235 240 Thr Gly Leu Glu Pro Gly Thr Glu Tyr Thr Ile Tyr Val Ile Ala 245 250 255 Leu Lys Asn Asn Gln Lys Ser Glu Pro Leu Ile Gly Arg Lys Lys 260 265 270 Thr <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <400> 2 Asp Glu Leu Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His 1 5 10 15 Gly Pro Glu Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr 20 25 <210> 3 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fibroblast growth factor <400> 3 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp 1 5 10 15 Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys 20 25 30 Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro 35 40 45 Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile 50 55 60 Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys 65 70 75 Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg 80 85 90 Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 95 100 105 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr 110 115 120 Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu 125 130 135 Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro 140 145 150 Met Ser Ala Lys Ser 155 <210> 4 <211> 432 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <400> 4 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr 275 280 285 Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro 290 295 300 Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly 305 310 315 Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg 320 325 330 Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu 335 340 345 Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu 350 355 360 Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr 365 370 375 Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 380 385 390 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 395 400 405 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln 410 415 420 Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 425 430 <210> 5 <211> 457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <400> 5 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp 170 175 180 Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr Ser Leu 185 190 195 Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr Arg 200 205 210 Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe 215 220 225 Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys 230 235 240 Pro Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg 245 250 255 Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg 260 265 270 Thr Glu Ile Asp Lys Pro Ser Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr 275 280 285 Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro 290 295 300 Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly 305 310 315 Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg 320 325 330 Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu 335 340 345 Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu 350 355 360 Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr 365 370 375 Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn 380 385 390 Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 395 400 405 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln 410 415 420 Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Ala Ser Asp Glu Leu 425 430 435 Pro Gln Leu Val Thr Leu Pro His Pro Asn Leu His Gly Pro Glu 440 445 450 Ile Leu Asp Val Pro Ser Thr 455 <210> 6 <211> 186 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <400> 6 Gly Ile Arg Gly Leu Lys Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Asp 1 5 10 15 Gly Phe Pro Gly Phe Lys Gly Asp Met Gly Ile Lys Gly Asp Arg 20 25 30 Gly Glu Ile Gly Pro Pro Gly Pro Arg Gly Glu Asp Gly Pro Glu 35 40 45 Gly Pro Lys Gly Arg Gly Gly Pro Asn Gly Asp Pro Gly Pro Leu 50 55 60 Gly Pro Pro Gly Glu Lys Gly Lys Leu Gly Val Pro Gly Leu Pro 65 70 75 Gly Tyr Pro Gly Arg Gln Gly Pro Lys Gly Ser Ile Gly Phe Pro 80 85 90 Gly Phe Pro Gly Ala Asn Gly Glu Lys Gly Gly Arg Gly Thr Pro 95 100 105 Gly Lys Pro Gly Pro Arg Gly Gln Arg Gly Pro Thr Gly Pro Arg 110 115 120 Gly Glu Arg Gly Pro Arg Gly Ile Thr Gly Lys Pro Gly Pro Lys 125 130 135 Gly Asn Ser Gly Gly Asp Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Glu Arg 140 145 150 Gly Pro Asn Gly Pro Gln Gly Pro Thr Gly Phe Pro Gly Pro Lys 155 160 165 Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Lys Asp Gly Leu Pro Gly His Pro 170 175 180 Gly Gln Arg Gly Glu Thr 185 <210> 7 <211> 464 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <400> 7 Pro Thr Asp Leu Arg Phe Thr Asn Ile Gly Pro Asp Thr Met Arg 1 5 10 15 Val Thr Trp Ala Pro Pro Pro Ser Ile Asp Leu Thr Asn Phe Leu 20 25 30 Val Arg Tyr Ser Pro Val Lys Asn Glu Glu Asp Val Ala Glu Leu 35 40 45 Ser Ile Ser Pro Ser Asp Asn Ala Val Val Leu Thr Asn Leu Leu 50 55 60 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Val Ser Ser Val Tyr Glu Gln 65 70 75 His Glu Ser Thr Pro Leu Arg Gly Arg Gln Lys Thr Gly Leu Asp 80 85 90 Ser Pro Thr Gly Ile Asp Phe Ser Asp Ile Thr Ala Asn Ser Phe 95 100 105 Thr Val His Trp Ile Ala Pro Arg Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg 110 115 120 Ile Arg His His Pro Glu His Phe Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp 125 130 135 Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn Leu Thr 140 145 150 Pro Gly Thr Glu Tyr Val Val Ser Ile Val Ala Leu Asn Gly Arg 155 160 165 Glu Glu Ser Pro Leu Leu Ile Gly Gln Gln Ser Thr Val Ser Asp 170 175 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CAGACCAGCT 1080 CAGGGTGTTG TCACCACTCT GGAGAATGTC AGCCCACCAA GAAGGGCTCG TGTGACAGAT 1140 GCTACTGAGA CCACCATCAC CATTAGCTGG AGAACCAAGA CTGAGACGAT CACTGGCTTC 1200 CAAGTTGATG CCGTTCCAGC CAATGGCCAG ACTCCAATCC AGAGAACCAT CAAGCCAGAT 1260 GTCAGAAGCT ACACCATCAC AGGTTTACAA CCAGGCACTG ACTACAAGAT CTACCTGTAC 1320 ACCTTGAATG ACAATGCTCG GAGCTCCCCT GTGGTCATCG ACGCCTCCAC TGCCATTGAT 1380 GCACCATCCA ACCTGCGTTT CCTGGCCACC ACACCCAATT CCTTGCTGGT ATCATGGCAG 1440 CCGCCACGTG CCAGGATTAC CGGCTACATC ATCAAGTATG AGAAGCCTGG GTCTCCTCCC 1500 AGAGAAGTGG TCCCTCGGCC CCGCCCTGGT GTCACAGAGG CTACTATTAC TGGCCTGGAA 1560 CCGGGAACCG AATATACAAT TTATGTCATT GCCCTGAAGA ATAATCAGAA GAGCGAGCCC 1620 CTGATTGGAA GGAAAAAGAC TAGCGACGAG CTTCCCCAAC TGGTAACCCT TCCACACCCC 1680 AATCTTCATG GACCAGAGAT CTTGGATGTT CCTTCCACTA GT 1722 <210> 34 <211> 412 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial polypeptide <400> 34 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln 5 10 15 Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu 20 25 30 His Leu Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys 35 40 45 Phe Glu Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp 50 55 60 Gly Asp Val Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile 65 70 75 Ala Asp Lys His Asn Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala 80 85 90 Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly 95 100 105 Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val 110 115 120 Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu Met Leu Lys Met Phe Glu Asp 125 130 135 Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asp His Val Thr His 140 145 150 Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met 155 160 165 Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu Val Cys Phe Lys 170 175 180 Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr Leu Lys Ser 185 190 195 Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala Thr Phe 200 205 210 Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly Arg 215 220 225 Gly Ile Pro Arg Asn Ser Gly Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp 230 235 240 Ser Arg Val Leu Gln Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu 245 250 255 Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn 260 265 270 Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 275 280 285 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala 290 295 300 Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn 305 310 315 Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala 320 325 330 Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly 335 340 345 Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 350 355 360 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg 365 370 375 Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly 380 385 390 Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Leu Ala Met Asp Pro Leu Glu 395 400 405 Ser Thr Arg Ala Ala Ala Ser 410 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 35 GCTCCCTCTG GGCCTCCCAG TCCT 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 36 GTTGGTGAGG GAGGTGGTGG ATAT 24 <210> 37 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 37 GGCCTCCCGA ATTCCGGTGC CCCACCACGC CTC 33 <210> 38 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 38 CCCACGTGGA TCCATGGCTA ATCTGTCCCC TGT 33 <210> 39 <211> 1239 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA encoding artificial polypeptide <400> 39 ATGTCCCCTA TACTAGGTTA TTGGAAAATT AAGGGCCTTG TGCAACCCAC TCGACTTCTT 60 TTGGAATATC TTGAAGAAAA ATATGAAGAG CATTTGTATG AGCGCGATGA AGGTGATAAA 120 TGGCGAAACA AAAAGTTTGA ATTGGGTTTG GAGTTTCCCA ATCTTCCTTA TTATATTGAT 180 GGTGATGTTA AATTAACACA GTCTATGGCC ATCATACGTT ATATAGCTGA CAAGCACAAC 240 ATGTTGGGTG GTTGTCCAAA AGAGCGTGCA GAGATTTCAA TGCTTGAAGG AGCGGTTTTG 300 GATATTAGAT ACGGTGTTTC GAGAATTGCA TATAGTAAAG ACTTTGAAAC TCTCAAAGTT 360 GATTTTCTTA GCAAGCTACC TGAAATGCTG AAAATGTTCG AAGATCGTTT ATGTCATAAA 420 ACATATTTAA ATGGTGATCA TGTAACCCAT CCTGACTTCA TGTTGTATGA CGCTCTTGAT 480 GTTGTTTTAT ACATGGACCC AATGTGCCTG GATGCGTTCC CAAAATTAGT TTGTTTTAAA 540 AAACGTATTG AAGCTATCCC ACAAATTGAT AAGTACTTGA AATCCAGCAA GTATATAGCA 600 TGGCCTTTGC AGGGCTGGCA AGCCACGTTT GGTGGTGGCG ACCATCCTCC AAAATCGGAT 660 CTGATCGAAG GTCGTGGGAT CCCCAGGAAT TCCGGTGCCC CACCACGCCT CATCTGTGAC 720 AGCCGAGTCC TGCAGAGGTA CCTCTTGGAG GCCAAGGAGG CCGAGAATAT CACGACGGGC 780 TGTGCTGAAC ACTGCAGCTT GAATGAGAAT ATCACTGTCC CAGACACCAA AGTTAATTTC 840 TATGCCTGGA AGAGGATGGA GGTCGGGCAG CAGGCCGTAG AAGTCTGGCA GGGCCTGGCC 900 CTGCTGTCGG AAGCTGTCCT GCGGGGCCAG GCCCTGTTGG TCAACTCTTC CCAGCCGTGG 960 GAGCCCCTGC AGCTGCATGT GGATAAAGCC GTCAGTGGCC TTCGCAGCCT CACCACTCTG 1020 CTTCGGGCTC TGGGAGCCCA GAAGGAAGCC ATCTCCCCTC CAGATGCGGC CTCAGCTGCT 1080 CCACTCCGAA CAATCACTGC TGACACTTTC CGCAAACTCT TCCGAGTCTA CTCCAATTTC 1140 CTCCGGGGAA AGCTGAAGCT GTACACAGGG GAGGCCTGCA GGACAGGGGA CAGATTAGCC 1200 ATGGATCCTC TAGAGTCGAC TCGAGCGGCC GCATCGTGA 1239

【図面の簡単な説明】

【図１】 線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子を
含有する機能性物質、および線維芽細胞増殖因子とフィ
ブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドの混合物によ
る標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。

【図２】 線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子と
フィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドの混合
物、およびフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチ
ドによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフであ
る。

【図３】 コラーゲンフラグメント、フィブロネクチン
の細胞接着部位ポリペプチドとコラーゲンフラグメント
の混合物、コラーゲンフラグメントを含有する機能性物
質、およびフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチ
ドによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフであ
る。

【図４】 フィブロネクチンフラグメント、およびフィ
ブロネクチンフラグメントとフィブロネクチンの細胞接
着部位ポリペプチドの混合物による標的細胞への遺伝子
導入効率を示すグラフである。

【図５】 フィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチ
ド、ポリリジン、ポリリジンとフィブロネクチンの細胞
接着部位ポリペプチドの混合物、フィブロネクチンフラ
グメント、およびフィブロネクチンフラグメントとフィ
ブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドの混合物によ
る標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。

【図６】 エリスロポエチン誘導体、ポリリジン、およ
びエリスロポエチン誘導体とポリリジンの混合物による
標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。

【図７】 エリスロポエチン誘導体、フィブロネクチン
フラグメント重合体、およびエリスロポエチン誘導体と
フィブロネクチンフラグメント重合体の混合物による標
的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。

【図８】 フィブロネクチンフラグメント固定化ビー
ズ、フィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチド固定
化ビーズ、およびフィブロネクチンフラグメントとフィ
ブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドの混合物を固
定化したビーズによる標的細胞への遺伝子導入効率を示
すグラフである。

【図９】 線維芽細胞増殖因子、および線維芽細胞増殖
因子を含有する機能性物質による標的細胞への遺伝子導
入を示すグラフである。

【図１０】 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質
の使用量と、標的細胞への遺伝子導入の関係を示すグラ
フである。

【図１１】 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質
による標的細胞への遺伝子導入を示すグラフである。

【図１２】 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質
による標的細胞への遺伝子導入効率を示すもう一つのグ
ラフである。

【図１３】 コラーゲンフラグメントを含有する機能性
物質の使用量と、標的細胞への遺伝子導入の関係を示す
グラフである。

【図１４】 ポリリジンによる標的細胞への遺伝子導入
効率を示すグラフである。

【図１５】 フィブロネクチンフラグメントおよびフィ
ブロネクチンフラグメント重合体による標的細胞への遺
伝子導入効率を示すグラフである。

【図１６】 フィブロネクチンフラグメントおよびフィ
ブロネクチンフラグメント重合体による標的細胞への遺
伝子導入効率を示すもうひとつのグラフである。

【図１７】 フィブロネクチンフラグメントおよびフィ
ブロネクチンフラグメント重合体による標的細胞への遺
伝子導入効率を示すさらにもうひとつのグラフである。

【図１８】 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物
質、コラーゲンフラグメント、およびコラーゲンフラグ
メントを含有する機能性物質による標的細胞への遺伝子
導入効率を示すグラフである。

【図１９】 フィブロネクチンフラグメントによる標的
細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。

【図２０】 フィブロネクチンフラグメントおよび線維
芽細胞増殖因子を含有する機能性物質による標的細胞へ
の遺伝子導入効率を示すグラフである。

【図２１】 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質
およびフィブロネクチンフラグメントによる標的細胞へ
の遺伝子導入効率を示すグラフである。

【図２２】 フィブロネクチンフラグメント固定化ビー
ズによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフであ
る。

【図２３】 フィブロネクチンフラグメント使用量と、
標的細胞への遺伝子導入の関係を示すグラフである。

【図２４】 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質
およびフィブロネクチンフラグメントによる標的細胞へ
の遺伝子導入を示すグラフである。

【図２５】 線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質
およびフィブロネクチンフラグメントによる標的細胞へ
の遺伝子導入を示すもう１つのグラフである。

【図２６】 コラーゲンフラグメントを含有する機能性
物質による標的細胞への遺伝子導入を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 橋野 仁一 大阪府高槻市明野町27−３ (72)発明者 加藤 郁之進 京都府宇治市南陵町１−１−150 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 DA02 EA02 GA11 GA18 HA01 HA17 4B065 AA90X AA92X AA94X AA97Y AB01 BA02 BB19 BB23 CA44 4C084 AA02 AA06 AA13 BA44 CA53 CA56 DA27 MA02 NA05 NA14 ZB261 ZB262 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 MA02 NA05 NA13 NA14 ZB26 4H045 AA10 BA10 CA40 DA01 EA20

Claims (53)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 レトロウイルスによる標的細胞への遺伝
   子導入効率を向上させる方法において、標的細胞結合部
   位と線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン
   由来のレトロウイルス結合部位またはそれらと機能的な
   同等物とを同一分子上に有する有効量の機能性物質の存
   在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることを
   特徴とするレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導
   入を向上させる方法。
2. 【請求項２】 標的細胞結合部位が、標的細胞と特異的
   に結合するリガンドである請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 リガンドが、細胞接着性のタンパク質、
   ホルモン、サイトカイン、抗体、糖鎖、炭水化物または
   代謝物である請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 細胞接着性のタンパク質が、フィブロネ
   クチンの細胞結合領域ポリペプチドである請求項３記載
   の方法。
5. 【請求項５】 フィブロネクチンの細胞結合領域ポリペ
   プチドが、ＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結
   合領域ポリペプチドである請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 リガンドが、エリスロポエチンである請
   求項３記載の方法。
7. 【請求項７】 線維芽細胞増殖因子が、配列表の配列番
   号３で表される線維芽細胞増殖因子、該因子の機能的同
   等物、および該因子または該因子の機能的同等物を含有
   するポリペプチドから選択される線維芽細胞増殖因子で
   ある請求項１記載の方法。
8. 【請求項８】 機能性物質が配列表の配列番号４または
   ５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである
   請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 コラーゲンがＶ型コラーゲン由来のイン
   スリン結合部位を含有するフラグメント、該フラグメン
   トの機能的同等物、および該フラグメントまたは該フラ
   グメントの機能的同等物を含有するポリペプチドから選
   択されるコラーゲンである請求項１記載の方法。
10. 【請求項１０】 Ｖ型コラーゲン由来のインスリン結合
    部位を含有するフラグメントが、配列表の配列番号６で
    表されるアミノ酸配列を含有するフラグメントである請
    求項９記載の方法。
11. 【請求項１１】 機能性物質が配列表の配列番号７また
    は８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
    る請求項１記載の方法。
12. 【請求項１２】 機能性物質が固定化されている請求項
    １〜１１いずれか１項記載の方法。
13. 【請求項１３】 機能性物質が固定化されていない請求
    項１〜１１いずれか１項記載の方法。
14. 【請求項１４】 標的細胞結合部位と線維芽細胞増殖因
    子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス
    結合部位またはそれらと機能的な同等物とを同一分子上
    に有する有効量の機能性物を含有するレトロウイルスに
    よる標的細胞への遺伝子導入に使用する標的細胞の培養
    培地。
15. 【請求項１５】 線維芽細胞増殖因子が、配列表の配列
    番号３で表される線維芽細胞増殖因子、該因子の機能的
    同等物および該因子または該因子の機能的同等物を含有
    するポリペプチドから選択される線維芽細胞増殖因子で
    ある請求項１４記載の培養培地。
16. 【請求項１６】 機能性物質が、配列表の配列番号４ま
    たは５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで
    ある請求項１４記載の培養培地。
17. 【請求項１７】 コラーゲンが、Ｖ型コラーゲン由来の
    インスリン結合部位を含有するフラグメント、該フラグ
    メントの機能的同等物、および該フラグメントまたは該
    フラグメントの機能的同等物を含有するポリペプチドか
    ら選択されるコラーゲンである請求項１４記載の培養培
    地。
18. 【請求項１８】 Ｖ型コラーゲン由来のインスリン結合
    部位を含有するフラグメントが、配列表の配列番号６で
    表されるアミノ酸配列を有するフラグメントである請求
    項１４記載の培養培地。
19. 【請求項１９】 機能性物質が、配列表の配列番号７ま
    たは８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで
    ある請求項１４記載の培養培地。
20. 【請求項２０】 機能性物質が固定化されている請求項
    １４〜１９いずれか１項記載の培養培地。
21. 【請求項２１】 標的細胞結合部位と線維芽細胞増殖因
    子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス
    結合部位またはそれらと機能的な同等物とを同一分子上
    に有する有効量の機能性物質と接触したレトロウイルス
    を含有する培地をインキュベートすることを特徴とする
    レトロウイルスの配置方法。
22. 【請求項２２】 線維芽細胞増殖因子が、配列表の配列
    番号３で表される線維芽細胞増殖因子、該因子の機能的
    同等物、および該因子または該因子の機能的同等物を含
    有するポリペプチドから選択される線維芽細胞増殖因子
    である請求項２１記載の配置方法。
23. 【請求項２３】 機能性物質が、配列表の配列番号４ま
    たは５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで
    ある請求項２１記載の配置方法。
24. 【請求項２４】 コラーゲンが、Ｖ型コラーゲン由来の
    インスリン結合部位を含有するフラグメント、該フラグ
    メントの機能的同等物、および該フラグメントまたは該
    フラグメントの機能的同等物を含有するポリペプチドか
    ら選択されるコラーゲンである請求項２１記載の配置方
    法。
25. 【請求項２５】 Ｖ型コラーゲン由来のインスリン結合
    部位を含有するフラグメントが、配列表の配列番号６で
    表されるアミノ酸配列を含有するフラグメントである請
    求項２４記載の配置方法。
26. 【請求項２６】 機能性物質が、配列表の配列番号７ま
    たは８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで
    ある請求項２１記載の配置方法。
27. 【請求項２７】 機能性物質が固定化されている請求項
    ２１〜２６いずれか１項記載の配置方法。
28. 【請求項２８】 標的細胞内へのレトロウイルス介在遺
    伝子導入の実施に使用するためのキットであって、 （ａ）標的細胞結合部位と線維芽細胞増殖因子、コラー
    ゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位ま
    たはそれらと機能的な同等物とを同一分子上に有する有
    する有効量の機能性物質、 （ｂ）レトロウイルスと標的細胞をインキュベートする
    ための人工基質、および （ｃ）上記標的細胞を予備刺激するための標的細胞増殖
    因子、を含んでなることを特徴とするキット。
29. 【請求項２９】 線維芽細胞増殖因子が、配列表の配列
    番号３で表される線維芽細胞増殖因子、該因子の機能的
    同等物、および該因子または該因子の機能的同等物を含
    有するポリペプチドから選択される線維芽細胞増殖因子
    である請求項２８記載のキット。
30. 【請求項３０】 機能性物質が、配列表の配列番号４ま
    たは５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドで
    ある請求項２８記載のキット。
31. 【請求項３１】 コラーゲンが、Ｖ型コラーゲン由来の
    インスリン結合部位を含有するフラグメント、該フラグ
    メントの機能的同等物、および該フラグメントまたは該
    フラグメントの機能的同等物を含有するポリペプチドか
    ら選択されるコラーゲンである請求項２８記載のキッ
    ト。
32. 【請求項３２】 Ｖ型コラーゲン由来のインスリン結合
    部位を含有するフラグメントが、配列表の配列番号６で
    表されるアミノ酸配列を有するフラグメントである請求
    項３１記載のキット。
33. 【請求項３３】 機能性物質が配列表の配列番号７また
    は８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
    る請求項２８記載のキット。
34. 【請求項３４】 機能性物質が固定化されている請求項
    ２８〜３３いずれか１項記載のキット。
35. 【請求項３５】 機能性物質がビーズに固定化されてい
    る請求項１２記載の方法。
36. 【請求項３６】 機能性物質がビーズに固定化されてい
    る請求項２０記載の培養培地。
37. 【請求項３７】 機能性物質がビーズに固定化されてい
    る請求項２７記載の配置方法。
38. 【請求項３８】 機能性物質がビーズに固定化されてい
    る請求項３４記載のキット。
39. 【請求項３９】 レトロウイルスによる標的細胞への遺
    伝子導入効率を向上させる方法において、実質的に純粋
    なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチン
    フラグメントおよびそれらの混合物より選択される有効
    量のビーズに固定化された機能性物質の存在下で、標的
    細胞をレトロウイルスで感染させることを特徴とするレ
    トロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上
    させる方法。
40. 【請求項４０】 レトロウイルスによる標的細胞への遺
    伝子導入効率を向上させる方法において、実質的に純粋
    なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチン
    フラグメントおよびはそれらの混合物より選択される有
    効量の固定化されていない機能性物質の存在下で、標的
    細胞をレトロウイルスで感染させることを特徴とするレ
    トロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上
    させる方法。
41. 【請求項４１】 標的細胞が、幹細胞（stem cells）、
    造血細胞、非接着性低密度単核細胞、接着性細胞、骨髄
    細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞、臍帯血液細胞、胎児
    性造血幹細胞、胚形成幹細胞、胚細胞、プライモディア
    ル ジャームセル（primordial germ cell）、卵母細
    胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子、ＣＤ３４＋細
    胞、Ｃ−ｋｉｔ＋細胞、多能性造血前駆細胞、単能性造
    血前駆細胞、赤血球系前駆細胞、リンパ球母細胞、成熟
    血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、神経芽
    細胞、神経細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、筋
    芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ガン細胞、骨髄腫細
    胞及び白血病細胞から選択される細胞である請求項１〜
    １３、３５、３９および４０いずれか１項記載の方法。
42. 【請求項４２】 レトロウイルスが、外来遺伝子を含有
    するレトロウイルスである請求項１〜１３、２１〜２
    ７、３５、３７および３９〜４１いずれか１項記載の方
    法。
43. 【請求項４３】 レトロウイルスが、組換体レトロウイ
    ルスベクターである請求項４２記載の方法。
44. 【請求項４４】 レトロウイルスが、複製能を欠損した
    組換え体レトロウイルスベクターである請求項４２記載
    の方法。
45. 【請求項４５】 配列表の配列番号１３で表されるポリ
    ペプチド、または該配列に１または数個のアミノ酸の欠
    失、置換、挿入および／または付加がなされたアミノ酸
    配列を有し、かつレトロウイルス結合活性を有するポリ
    ペプチド。
46. 【請求項４６】 請求項４５記載のポリペプチドをコー
    ドする遺伝子。
47. 【請求項４７】 配列表の配列番号１７で表される請求
    項４６記載の遺伝子または厳密な条件下で該遺伝子にハ
    イブリダイズし、レトロウイルスによる標的細胞への遺
    伝子導入効率を向上させるポリペプチドをコードする遺
    伝子。
48. 【請求項４８】 配列表の配列番号３０で表されるポリ
    ペプチド、または該配列に１または数個のアミノ酸の欠
    失、置換、挿入および／または付加がなされたアミノ酸
    配列を有し、かつレトロウイルス結合活性を有するポリ
    ペプチド。
49. 【請求項４９】 請求項４８記載のポリペプチドをコー
    ドする遺伝子。
50. 【請求項５０】 配列表の配列番号３３で表される請求
    項４９記載の遺伝子または厳密な条件下で該遺伝子にハ
    イブリダイズし、レトロウイルスによる標的細胞への遺
    伝子導入効率を向上させるポリペプチドをコードする遺
    伝子。
51. 【請求項５１】 配列表の配列番号５で表されるポリペ
    プチド、または該配列に１または数個のアミノ酸の欠
    失、置換、挿入および／または付加がなされたアミノ酸
    配列を有し、かつレトロウイルス結合活性を有するポリ
    ペプチド。
52. 【請求項５２】 請求項５１記載のポリペプチドをコー
    ドする遺伝子。
53. 【請求項５３】 配列表の配列番号２６で表される請求
    項５２記載の遺伝子または厳密な条件下で該遺伝子にハ
    イブリダイズし、レトロウイルスによる標的細胞への遺
    伝子導入効率を向上させるポリペプチドをコードする遺
    伝子。