JP2012210218A - レトロウイルスの保存方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】固相に固定化されたレトロウイルス結合活性を有する物質の存在下にレトロウイルスを維持することを特徴とするレトロウイルスの保存方法。レトロウイルス結合活性を有する物質が固定化された固相を保持する容器内に、前記レトロウイルス結合活性を有する物質と結合した状態で封入されていることを特徴とするレトロウイルス組成物。
【選択図】なし
Description
このように、レトロウイルスベクターについては即時使用可能な状態で安定に保存できる方法が望まれていた。
本発明は、固相に固定化されたレトロウイルス結合活性を有する物質の存在下に、非凍結状態でレトロウイルスを維持することを特徴とするレトロウイルスの保存方法を提供する。
(1)レトロウイルス結合活性を有する物質が固定化された固相とレトロウイルスを含有するレトロウイルス産生細胞培養液上清を接触させる工程;
(2)工程(1)の固相を洗浄する工程;及び
(3)工程(2)で得られた固相を緩衝液と接触させた状態で維持する工程。
あらかじめ精製されたレトロウイルスをレトロウイルス産生細胞の上清にかえて使用する場合には、上記(2)の工程を省略してもよい。
この態様では、レトロウイルス産生細胞の上清に含有される成分に起因するレトロウイルスの不活化が抑制されるため、レトロウイルスの感染能力がより高く維持される。
本発明は、保存に適した形態の、レトロウイルスを含有する組成物を提供する。
前記組成物においてレトロウイルスは、容器内に、固相に固定化されたレトロウイルス結合活性を有する物質と結合した状態で封入されていることを特徴とする。当該組成物は前記のレトロウイルスの保存方法の記載に準じて調製することができる。また、上記のレトロウイルス結合活性を有する物質としては、前記のレトロウイルスの保存方法において使用可能なものが例示される。
1. CH−296コートプレートの作製
表面未処理24ウェルプレート(ファルコン社製)に1ウェルあたり500μlの20μg/mlのフィブロネクチンフラグメントであるCH−296(商品名レトロネクチン;タカラバイオ社製)を添加して4℃で一晩放置した後、2%BSA/PBSで室温にて30分間ブロッキングし、さらにPBSで洗浄した。このプレートをCH−296コートプレートとし、必要に応じて作製した。
レトロウイルスベクタープラスミドpDOG−polIIは、以下の手順で作製した。まず、rsGFP発現ベクターpQBI25(Qbiogene社製)を制限酵素NheI及びNotIで切断し、775bpのGFP遺伝子断片を得た。次にpQBI polII(Qbiogene社製)を制限酵素NheI及びNotIで切断してrsGFP−NeoR融合遺伝子を除去し、先に得た775bpのrsGFP遺伝子断片を挿入し、polIIプロモーター制御下でrsGFP遺伝子が発現するベクターpQBI polII(neo−)を得た。pQBI polII(neo−)を制限酵素XhoIで消化し、polIIプロモーター制御下、GFP発現ユニットを含むDNA断片を得、その末端をDNA Blunting Kit(タカラバイオ社製)を用いて平滑化した。レトロウイルスベクタープラスミドpDON−AI(タカラバイオ社製)を制限酵素XhoIとSphIで消化して得られたベクター断片4.58kbpの末端をDNA Blunting Kit(タカラバイオ社製)を用いて平滑化したのち、アルカリフォスファターゼ(タカラバイオ社製)を用いて脱リン酸化した。この平滑化したベクターに先の平滑化したpolIIプロモーター制御下rsGFP発現ユニットを含むDNA断片をDNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いて挿入し、rsGFP発現組換えレトロウイルスベクターpDOG−polIIを得た。
ウイルス上清液の力価の測定はHT−1080細胞(ATCC CCL−121)を使用して標準的な方法[Markowitz D.ら、ジャーナル オブ ヴィロロジー(J. Virol.)、第62巻、第4号、第1120〜1124頁(1988年)]に従って測定した。すなわち、6ウェルの組織培養用プレートに1ウェルあたり5×104個のHT−1080細胞を含む10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM 2mlを添加し、37℃、5%CO2にて一晩培養した後、培地を吸引除去し、各ウェルに系列希釈したウイルス上清液 1mlを加え、更にヘキサジメトリン・ブロミド(ポリブレン:アルドリッチ社製)を終濃度8μg/mlとなるように加えた。これを37℃、5%CO2で4〜6時間培養し、更に10%ウシ胎仔血清を含有するDMEMを1ml添加して72時間培養した。このプレートより回収した細胞をフローサイトメーター FACS Vantage(ベクトン・ディッキンソン社製)による解析に供し、rsGFP発現HT−1080細胞の割合を測定した。ウェルあたりの仕込み細胞数にrsGFP発現細胞の割合とウイルス上清液の希釈倍率を乗じた値より、上清1mlあたりの感染性粒子数(I.V.P./ml)を算出し、ウイルス力価とした。実施例1−2で調製されたウイルス液の力価は1.9×105I.V.P./mlから4.5×105I.V.P./mlの範囲であった。
CH−296コートプレートを用いたレトロウイルスの保存(1)
GaLV/DOG−polIIウイルス液の活性評価にはK−562細胞(ATCC CCL−243)を用いた。K−562細胞は10%ウシ胎仔血清(Thermo Trace社製)を含むRPMI−1640培地(シグマ社製)で培養した。
CH−296コートプレートを用いたレトロウイルスの保存(2)
実施例2において、レトロウイルス結合容器の洗浄による保存安定性の向上が示された。次に、より保存安定性の向上に寄与できる溶媒の探索を行うため、無機塩溶媒として、リン酸ナトリウム、塩化カルシウムと硫酸マグネシウムの混合物、リン酸ナトリウムと塩化カルシウムと硫酸マグネシウムの混合物、糖類としてブドウ糖、D−ソルビトール、精製白糖、マルトース、果糖、乳糖、D−マンニトール、高分子化合物としてカルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール400、タンパク質として精製ゼラチン、ヒト血清アルブミン(HSA)についてレトロウイルスの保存に関する影響を調べた。前記物質の各物質を、無機塩は注射用水、それ以外はPBSに溶解し、レトロウイルス保存安定効果について試験した。探索の手順は実施例2に準じるが、レトロウイルス結合容器の保存培養は37℃、3時間で実施した。その結果、40mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7、0.5mM塩化カルシウムおよび1mM硫酸マグネシウム含有20mMリン酸緩衝液pH7、1.5〜20%ヒト血清アルブミン含有PBS溶液、0.5〜2.5%精製ゼラチン含有PBS溶液、5%乳糖含有PBS溶液において、PBS単独よりもレトロウイルスベクターの保存安定性の向上が確認された。
各種の機能性物質の存在下でのレトロウイルスの保存
本実施例ではレトロウイルス結合活性と細胞接着活性を示す機能性物質を用いて保存安定性の評価を行った。レトロウイルス結合活性と細胞接着活性を示す機能性物質として前記のCH−296のほかに、CH−271およびH−296[Kimizuka F.ら、ジャーナル オブ バイオケミストリー(J. Biochem.)、第110巻、第2号、第284〜291頁(1991年)]、DEAE−デキストラン(シグマ社)、ポリ−L−リジン(平均分子量3万〜7万、ICN社)、DEAE−デキストランとフィブロネクチンフラグメントC−CS1[Kimizuka F.ら、ジャーナル オブ バイオケミストリー(J. Biochem.)、第110巻、第2号、第284〜291頁(1991年)]の混合物、ポリ−L−リジンとC−CS1の混合物を用いて実施した。
ガス透過性培養バッグを用いたレトロウイルスの保存
前記のCH−296を、表面未処理24ウェルプレート(ファルコン社製)およびガス透過性培養バッグ(X−FOLDTM、85cm2、Nexell社製)を用いて以下の実験を実施した。
まず、20μg/mlのCH−296をバッグあたり9ml添加して4℃で一晩放置した。次にバッグあたり30mlのPBSで3回洗浄し、CH−296コートバッグとした。一方、24ウェルプレートは実施例1の手順に従ってCH−296でコートした。
レトロウイルスの長期保存
GaLV/DOG‐polIIウイルス液(3.3×105I.V.P./ml)を10%ウシ胎仔血清含有RPMI−1640培地で2倍希釈したものを実施例1記載の24ウェルCH−296コートプレートに1ウェルあたり500μl加え、5%CO2インキュベーター内、37℃で4時間インキュベーションし、レトロウイルスベクターを結合させた。次に、各ウェルあたり500μlの40mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、あるいは1.5%ヒト血清アルブミン含有40mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0を用いてプレートを2回洗浄し、同じ緩衝液500μlでウェルを満たして4℃でインキュベーションした。一方、前記プレートのウェルにウイルス2倍希釈液を加えたものを洗浄せずに4℃でインキュベーションした(ウイルス上清そのままのインキュベーション)。インキュベーション開始から1、2、3、4週間目に各ウェルの溶液を除き、4×104個/mlになるように調製したK−562細胞懸濁液を500μl加え、37℃、5%CO2存在下で培養し遺伝子導入を実施した。ウイルス上清そのままでインキュベーションしたウェルについては、500μlの40mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0で1回洗浄し、4×104個/mlになるように調製したK−562細胞懸濁液を500μl加え、37℃、5%CO2存在下で培養し遺伝子導入を実施した。対照として同ロットのウイルス液で同様の手順でウイルス結合プレートを調製し、4℃でインキュベーションすることなく直ちにK−562細胞を加えて遺伝子導入を実施した。遺伝子導入された細胞での遺伝子導入効率を測定して算出された、対照での導入効率に対する各試験群のウイルスでの遺伝子導入効率の相対値、すなわち残存力価を表2に示す。
希釈したレトロウイルスの保存
GaLV/DOG‐polIIウイルス液(3.3×105I.V.P./ml)を10%ウシ胎仔血清含有RPMI−1640培地で2、4、8、16倍にそれぞれ希釈して作製した希釈液を実施例1記載の24ウェルCH−296コートプレートの1ウェルあたり500μl加え、5%CO2インキュベーター内、37℃で4時間インキュベーションし、レトロウイルスベクターを結合させた。次に、各ウェルあたり500μlの40mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0、あるいは1.5%ヒト血清アルブミン含有40mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0を用いてプレートを2回洗浄し、同じ緩衝液500μlでウェルを満たして4℃でインキュベーションした。一方、前記プレートのウェルにウイルス希釈液を加えたものを洗浄せずに4℃でインキュベーションした(ウイルス上清そのままのインキュベーション)。インキュベーション開始から1、2、3、4週間目に各ウェルの溶液を除き、4×104個/mlになるように調製したK−562細胞懸濁液を500μl加え、37℃、5%CO2存在下で培養し遺伝子導入を実施した。ウイルス上清そのままでインキュベーションしたウェルについては、500μlの40mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.0で1回洗浄し、4×104個/mlになるように調製したK−562細胞懸濁液を500μl加え、37℃、5%CO2存在下で培養し遺伝子導入を実施した。対照として同ロットのウイルス液で同様の手順でウイルス結合プレートを調製し、4℃でインキュベーションすることなく直ちにK−562細胞を加えて遺伝子導入を実施した。遺伝子導入された細胞での遺伝子導入効率を測定して算出された、対照での導入効率に対する保存後のウイルスでの遺伝子導入効率の相対値、すなわち残存力価を表3に示す。
Claims (7)
- 下記工程を含むレトロウイルスの保存方法:
(1)レトロウイルス結合活性を有する物質が固定化された固相とレトロウイルスを含有するレトロウイルス産生細胞培養液上清を接触させる工程;
(2)工程(1)によりレトロウイルス結合活性を有する物質を介してレトロウイルスが固定化された固相から上清を除く工程;及び
(3)工程(2)で得られた固相にレトロウイルス結合活性を有する物質を介して固定化されたレトロウイルスを、15℃以下で24時間以上維持する工程。 - レトロウイルスを維持する工程が、非凍結状態で実施される、請求項1記載の方法。
- レトロウイルスを維持する工程が、レトロウイルスが溶液と接触した状態で実施される、請求項1記載の方法。
- 溶液が空気と接触しない状態の溶液である、請求項3記載の方法。
- 溶液が、リン酸塩を緩衝成分として含有する緩衝液である、請求項3記載の方法。
- 溶液が、タンパク質および糖類から選択される物質を含有する、請求項3記載の方法。
- レトロウイルス結合活性を有する物質が、フィブロネクチンのヘパリン−IIドメインを有するポリペプチド、線維芽細胞増殖因子、V型コラーゲンのインシュリン結合ドメインを有するポリペプチド、DEAEデキストラン、ポリリジンから選択される物質である請求項1記載の方法。
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