JP4921083B2 - レトロウィルス産生用無血清培地 - Google Patents
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Description
本発明を概説すれば、本発明は
[1]ウイルス産生細胞の培養に使用される無血清培地であって、血清アルブミンが添加されてなることを特徴とする培地、
[2]血清アルブミンがヒト血清アルブミンである[1]の培地、
[3]血清アルブミンを0.05〜1%(重量比)の濃度で含有する[1]または[2]の培地、
[4]インターロイキン−2を含有する[1]〜[3]の培地、
[5]インターロイキン−2が10〜1000JRU/mLの濃度で含有する[4]の培地、
[6]カルシウムを150〜700mg/Lの濃度で含む[1]〜[5]の培地、
[7]上皮細胞成長因子を含有する[1]〜[6]の培地、
[8]ウイルス産生細胞が遺伝子組換えレトロウイルスベクター産生細胞である[1]〜[7]の培地、
[9]目的物質の製造方法であって、所望の目的物質を産生する能力を有する細胞を[1]〜[8]の培地で培養する工程を含有することを特徴とする目的物質の製造方法、
[10][1]〜[8]の培地に目的物質産生細胞の保存物を接種して培養を開始することを特徴とする[9]の目的物質の製造方法、
[11]目的物質が遺伝子組換えレトロウイルスベクターである[9]又は[10]の製造方法、に関する
本培地は、ウイルス産生細胞の培養に必要な成分を混合して作製された血清を含有しない基本培地に血清アルブミンが添加されてなるものである。
市販のGT−T503培地(タカラバイオ社製)1Lに、25%ヒト血清アルブミン(ブミネート25%;バクスター社製)を8mL(ヒト血清アルブミン2g、N−アセチルトリプトファンナトリウム42.92mg、カプリル酸ナトリウム26.6mgを含有)添加して、培地Aを作製した。さらに、培地Aにインターロイキン2(Proleukin;Chiron社製)を最終濃度175JRU/mLになるように添加して、培地Bを作製した。
1.レトロウイルス プロデューサー細胞の培養
細胞内領域欠損ヒト低親和性神経成長因子受容体(ΔLNGFR)遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞(GP+envAm−12をパッケージング細胞とした)のワーキングセルバンク(WCB)を37℃のウォーターバスにて融解した。細胞融解液を15mL遠心チューブに移し、さらに完全培地(10%ウシ胎児血清(ジェイアールエッチ(JRH)社製)を含むDMEM培地(キャンブレックス(Cambrex)社製))を10mL加え遠心処理(500×g、5分間、20℃)を行った。遠心後、上清を除去し完全培地(10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地)に懸濁しセルカウントを行った。セルカウント後、15mL遠心チューブに1×106の細胞数となるように分注し再び遠心処理(500×g、5分間、20℃)を行った。遠心して上清を除去後、培地Aに懸濁し、細胞培養用のT25フラスコ(CELLBIND、コーニング社製)を用いてCO2インキュベーター(37℃、湿度95%、CO2濃度5%)にて培養を行った。このとき比較対照として完全培地を用いた培養を行った。細胞の継代に関しては、完全培地及び培地A共に継代間隔を3日とし、播種細胞密度は2×104/cm2とした。この条件で3継代行った。
3回目の継代後3日間培養した細胞を、これまでと同様にレトロウイルス回収用に植え継ぎを行った。播種細胞密度は4×104/cm2とし、培養0日目から培養1日目はCO2インキュベーター(37℃、湿度95%、CO2濃度5%)にて培養を行った。培養1日目に、完全培地及び培地Aを取り除き、新しい培地にそれぞれ交換した。液量はウイルス回収用に0.1mL/cm2にあわせ、CO2インキュベーターの温度を33℃に下げて培養を行った。培養2日目に、各培養フラスコより上清液を回収し再び完全培地及び培地Aをそれぞれ補充し培養を行った。上記の回収を3日間連続で行った。回収した培養上清液(1日目、2日目、3日目)は、0.22μmのポアサイズのフィルター(ミリポア社製)でろ過し、レトロウイルス上清液として小分け分注後−80℃保存した。
上記のように完全培地及び培地Aを用いて培養及び回収したレトロウイルス上清液について遺伝子導入効率の測定を行った。完全培地及び培地Aを用いて回収したレトロウイルス上清液それぞれについて原液、4倍及び8倍希釈液を調製し、さらにそれぞれ最終濃度4μg/mLとなるようにプロタミン(持田製薬社製)を添加した。このとき希釈にはそれぞれ完全培地及び培地Aを用いた。希釈液500μLにヒト白血病細胞CEM(0.5×106細胞)を加え懸濁し、24穴細胞培養用プレート(旭テクノグラス社製)に移した。その24穴細胞培養用プレートを遠心処理(32℃、1000×g、2時間)した。遠心後、各穴より上清を取り除きCEM用の培地(10%血清を含むRPMI1640培地「キャンブレックス社(Cambrex)」)をそれぞれ加えた。懸濁後、CO2インキュベーター(37℃、湿度95%、CO2濃度5%)にて3日間培養を行った。
培養後、レトロウイルスによる遺伝子導入効率を調べるために、レトロウイルスベクターのマーカー遺伝子であるヒト低親和性神経成長因子受容体(ΔLNGFR)の発現を蛍光ラベルされたLNGFR認識抗体を用いて調べた。感染培養後の細胞0.5×106をエッペンチューブに移し、遠心処理(4℃、500×g、5分間)にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞に1次抗体としてΔLNGFRを認識するモノクローナル抗体(ケミコン社製)を0.5μg含む100μLのPBS溶液を添加して懸濁後、氷上にて20分間放置した。この時、非特異的結合(バックグラウンド)を調べるために、アイソタイプコントロールとしてマウスIgG(ベクトン・ディッキンソン(Becton−Dickinson)社製)を用いたサンプル調製も行った。放置後、予め冷やしておいたリン酸バッファー溶液(PBS:ギブコ社製)を900μL加え、遠心処理(4℃、500×g、5分間)にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞に、1次抗体を認識する2次抗体としてフィコエリトリン(PE:Phycoerythrin)標識された抗マウスIgG溶液(ダコ社製)を100μL添加して懸濁後、氷上にて20分間放置した。放置後、予め冷やしておいたリン酸バッファー液(PBS:ギブコ社製)を900μL加え、遠心処理(4℃、500×g、5分間)にて細胞を沈殿させた。上清を取り除いた後、沈殿した細胞に、3%ホルムアルデヒド液を添加し固定化処理した。固定化後、フローサイトメトリー解析(FCM)を行った。
図1に示されるように、培地Aを用いて培養及び回収したレトロウイルス上清液の導入効率は、すべての回収日において完全培地と同等以上の遺伝子導入効率を示した。すなわち、完全培地よりも高タイターのウイルスが得られることが分かった。これらの結果よりワーキングセルバンクから馴化を経ないで培養を行っても、十分に継代及びウイルス回収出来ることが示された。
1.レトロウイルスベクターの調製
レトロウイルスベクタープラスミドpDOG−polIIは以下の手順で作製した。まずrsGFP発現ベクターpQBI25(Qbiogene Inc.社製)を制限酵素NheI及びNotIで切断し、775bpのGFP遺伝子断片を得た。次にpQBI polII(Qbiogene Inc.社製)を制限酵素NheI及びNotIで切断してrsGFP−NeoR融合遺伝子を除去し、先に得た775bpのrsGFP遺伝子断片を挿入しpolIIプロモーター制御下でrsGFP遺伝子が発現するベクターpQBI polII(neo−)を得た。pQBI polII(neo−)を制限酵素XhoIで消化し、polIIプロモーター制御下GFP発現ユニットを含むDNA断片を得、その末端をDNA blunting kit(タカラバイオ社製)を用いて平滑化した。レトロウイルスベクタープラスミドpDON−AI(タカラバイオ社製)を制限酵素XhoIとSphIで消化して得られたベクター断片4.58kbpの末端をDNA blunting kit(タカラバイオ社製)を用いて平滑化したのち、アルカリフォスファターゼ(タカラバイオ社製)を用いて脱リン酸化した。この平滑化したベクターに先の平滑化したpolIIプロモーター制御下rsGFP発現ユニットを含むDNA断片をDNA Ligation Kit(タカラバイオ社製)を用いて挿入し、rsGFP発現組換えレトロウイルスベクターpDOG−polIIを得た。
PG13/DOG−polII細胞を培地A又は完全培地を用いて実施例2と同様の方法で培養し、レトロウイルス上清液を調製した。得られたレトロウイルス上清液を用いてヒト繊維芽肉種細胞HT1080に遺伝子導入を行った。
図2よりテナガザル(Gibbon ape)レトロウイルス産生細胞においても、培地Aを用いた培養物より回収したレトロウイルス上清液の導入効率は、完全培地と匹敵する導入効率を示した。このことよりワーキングセルバンクから馴化を経ないで直接無血清培地での培養を行っても、十分に継代及びウイルス回収出来ることが示された。
実施例2と同様に、ΔLNGFR遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。このとき、前記の培地A及び培地AにIL−2を600JRU/mL添加した培地Bを用いて行った。培養については継代数が5回である以外、実施例2−1と同様に行った。ウイルス回収では、播種細胞密度を6×104/cm2とした以外は実施例2−2と同様に行った。遺伝子導入効率の評価では、CEM細胞に加えて、ヒト末梢血単核球(Human Peripheral Blood Mononuclear Cell:PBMC)についてもCEM細胞と同様に遺伝子導入を行い、FACS測定した。
実施例2と同様に、ΔLNGFR遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いて本発明の培地Aと市販の各種無血清培地との比較を行った。培養については、下記に示す直接馴化、間接馴化の2通りで行った。
(1)直接馴化:ワーキングセルバンクを完全培地で2継代培養した後、直接、培地A及び市販の無血清培地にそれぞれ切り替えて培養を行った。継代は4回行った。
(2)間接馴化:ワーキングセルバンクを完全培地で2継代培養した後、ウシ胎児血清濃度を段階的(ウシ胎児血清濃度6.6%→3.3%→1.5%→0%)に下げて馴化培養を行った。
用いた培地4種類を以下に示す。
1 培地A
2 AIM−V(インビトロジェン社製:Invitrogen)
3 HyQ SFM4MegaVir(ハイクローン社製:Hyclone)
4 Opti−ProSFM(インビトロジェン社製:Invitrogen)
なお、培地3,4についてはグルタミンを推奨量添加して使用した。
ウイルス回収は実施例2−2と同様に行った。遺伝子導入はCEM細胞を用いて行った。遺伝子導入効率の評価は実施例2−3と同様に行った。
これらの結果より、本発明のA培地は、市販の無血清培地に比べて、レトロウイルス産生細胞の培養において優れており、レトロウイルス産生を明らかに効率よく行えることが確認された。
実施例2と同様に、ΔLNGFR遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いて細胞培養を行った。培地Aにて細胞培養を開始した後、継代1回目より培地Aに加えて市販のGT−T503培地(タカラバイオ社製)を用いて細胞培養を開始した。さらにもう1代それぞれの培地で継代し細胞増殖率を比較した。
実施例2と同様に、ΔLNGFR遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、市販無血清培地Opti−ProSFM(インビトロジェン社製:Invitrogen)及びOpti−ProSFMに最終濃度0.2%(重量比)となるように25%ヒト血清アルブミン(ブミネート25%(HSA);バクスター社製)を添加した培地を用いて行った。なお、Opti−ProSFMにはグルタミンを推奨量添加して使用した。
培養については継代数が5回である以外、実施例2−1と同様に行った。ウイルス回収操作は、実施例2−2と同様に行った。また、4日目の回収も実施例2−2と同様に行った。
遺伝子導入はCEM細胞を用いて行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例2−3と同様に行った。
図5に示されるように、ヒト血清アルブミン(HSA)を添加することでウイルス力価が上がった。
実施例2と同様に、ΔLNGFR遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、前記の培地Aよりトランスフェリンを除いた培地I及び培地Iのカルシウム濃度、ここでは当初から含まれている塩化カルシウム濃度を165mg/Lから、日局塩化カルシウムを加えて330mg/Lに調整した培地II及び495mg/Lに調整した培地IIIを用いた。培養については継代数が5回である以外、実施例2−1と同様に行った。ウイルス回収操作は、実施例2−2と同様に行った。遺伝子導入はCEM細胞を用いて行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例2−3と同様に行った。
実施例2と同様に、ΔLNGFR遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、前記の培地Aよりトランスフェリンを除いた培地I及び培地Iに上皮細胞成長因子(epidermal growth factor:和光純薬工業社製)を最終濃度10mg/Lとなるように添加した培地IVを用いた。培養については継代数が5回である以外、実施例2−1と同様に行った。ウイルス回収操作は、実施例2−2と同様に行った。遺伝子導入はCEM細胞を用いて行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例2−3と同様に行った。
図8に示されるように、上皮細胞成長因子を添加することによってウイルス力価が上がった。
実施例2と同様に、ΔLNGFR遺伝子発現マウスレトロウイルス産生細胞を用いてウイルス上清液の調製を行った。本実施例では、前記の培地A及び培地Aのカルシウム濃度、ここでは当初から含まれている塩化カルシウム濃度を165mg/L から、日局塩化カルシウムを加えて330mg/Lに調整し、さらに上皮細胞成長因子を最終濃度10mg/Lとなるように添加した培地Vを用いた。培養については継代数が5回である以外、実施例2−1と同様に行った。ウイルス回収操作は、実施例2−2と同様に行った。遺伝子導入はCEM細胞を用いて行い、遺伝子導入効率の評価は、実施例2−3と同様に行った。
本発明により、ウイルス産生細胞の培養に適した無血清培地が提供される。本発明の培地によれば、無血清条件でのウイルス産生細胞の培養を効率よく実施することができ、従来に比べ簡便な操作で血清を含有しないウイルスベクターを製造することができる。
Claims (8)
- ウイルス産生細胞の培養に使用される無血清培地であって、下記(a)及び(b)を含有することを特徴とする培地:
(a)0.05〜1%(重量比)の濃度のヒト血清アルブミン、及び
(b)塩化カルシウム相当として150〜700mg/Lの濃度のカルシウム。 - 更に、インターロイキン−2を含有する請求項1に記載の培地。
- インターロイキン−2を10〜1000JRU/mLの濃度で含有する請求項2記載の培地。
- 上皮細胞成長因子を含有する請求項1〜3いずれか1項に記載の培地。
- ウイルス産生細胞が遺伝子組換えレトロウイルスベクター産生細胞である請求項1〜4いずれか1項に記載の培地。
- 目的物質の製造方法であって、所望の目的物質を産生する能力を有する細胞を請求項1〜5いずれか1項に記載の培地で培養する工程を含有することを特徴とする目的物質の製造方法。
- 請求項1〜5いずれか1項に記載の培地に目的物質産生細胞の保存物を接種して培養を開始することを特徴とする請求項6記載の目的物質の製造方法。
- 目的物質が遺伝子組換えレトロウイルスベクターである請求項6または7に記載の製造方法。
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