CN113549653B - 用于慢病毒载体长期存贮的组合试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于慢病毒载体长期存贮的组合试剂，包含组分A和组分B，其中，组分A包含：蔗糖、磷酸二氢钾、七水合磷酸氢二钠和氯化钠；组分B包含：蔗糖、人血白蛋白、辛酸钠、N‑乙酰色氨酸钠、磷酸二氢钾、七水合磷酸氢二钠和氯化钠。本发明的临床级、低内毒病毒载体保存组合试剂，适用于GMP级的慢病毒载体的生产工艺，延长慢病毒保存的有效期，利于高纯度高品质的重组慢病毒载体制备工艺过程稳定，可进行线性放大，并可稳定、持续地改进生产工艺，有效控制成本，完善的生产工艺，并利于CAR‑T细胞产品的制备和临床使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种用于慢病毒载体长期存贮的组合试剂。
背景技术
病毒载体是目前最常用的基因导入方式之一。通过对病毒基因组的改造，使之携带外源目的基因和相关的病毒元件，并被包装成病毒颗粒。进而用病毒转染宿主，使携带的外源基因在宿主体内表达。
慢病毒(Lentivirus，简称LV)属于逆转录病毒科(Retrovidae)，为RNA病毒，由于这类病毒的一个重要特点是毒粒中含有依赖RNA的多聚酶即逆转录酶，故现名为逆转录病毒。慢病毒原发感染的细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主。由于其感染发病的潜伏期长，因此被称为慢病毒。例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)等。
慢病毒载体中研究最深入、应用最广泛的即是以人类免疫缺陷1型病毒(HIV-1)为基础发展起来的载体系统，能高效的将目的基因导入动物细胞。慢病毒基因组为正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，并可进入细胞核，将DNA整合到细胞基因组中进行转录和表达。
慢病毒载体与其他常用的病毒载体相比(如不能整合到染色体上的腺病毒载体，又如只能感染分裂期细胞且容量有限的逆转录病毒载体)，具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。
在制备嵌合抗原受体修饰T细胞(Chimeric Antigen Receptor T-Cell，简称CAR-T细胞)的工艺中，可通过慢病毒转导，将嵌合抗原受体基因整合到病人自体T细胞中，并经体外扩增最终得到临床使用的嵌合抗原受体T细胞注射液。
因此慢病毒载体的长期存贮的稳定性直接影响到临床免疫治疗的期限和经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种临床级、低内毒病毒载体保存组合试剂，用于慢病毒载体长期存贮。
本发明的第一方面，提供一种组合试剂，所述组合试剂包含组分A和组分B，
其中，组分A包含：蔗糖、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)、氯化钠和水；
组分B包含：蔗糖、人血白蛋白、辛酸钠、N-乙酰色氨酸钠、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)、氯化钠和水。
在另一优选例中，组分A中，蔗糖浓度为10-25g/100mL，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为120-150mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为700-850mg/L，氯化钠浓度为8500-10000mg/L。
在另一优选例中，组分A的pH为6.95-7.45，较佳为7-7.45或7.05-7.35。
在另一优选例中，组分B中，蔗糖浓度为10-25g/100mL，人血白蛋白浓度为4-30g/100mL，辛酸钠浓度为4-20mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为4-20mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为20-150mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为150-800mg/L，氯化钠浓度为1500-10000mg/L。
在另一优选例中，组分B的pH为6.95-7.45，较佳为7-7.45或7.05-7.35。
在另一优选例中，组分A：组分B使用时的体积比配比范围在4：1-1：1之间。
本发明的第二方面，提供第一方面所述的组合试剂的用途，用于保存慢病毒载体。
本发明的第三方面，提供第一方面所述的组合试剂的用途，用于制备保存慢病毒载体的试剂。
本发明的第四方面，提供一种保存慢病毒载体的方法，所述方法采用第一方面所述的组合试剂保存慢病毒载体。
在另一优选例中，所述方法包括以下步骤：
(i)在慢病毒载体的生产纯化过程中添加组分A；
(ii)在分装前添加组分B，形成最终慢病毒载体的保存液。
在另一优选例中，组分A：组分B的体积比配比范围在4：1-1：1。
在另一优选例中，组分A中，蔗糖浓度为10-25g/100mL，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为120-150mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为700-850mg/L，氯化钠浓度为8500-10000mg/L。
在另一优选例中，组分B中，蔗糖浓度为10-25g/100mL，人血白蛋白浓度为4-30g/100mL，辛酸钠浓度为4-20mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为4-20mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为20-150mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO-4-7H2O)浓度为150-800mg/L，氯化钠浓度为1500-10000mg/L。
在另一优选例中，组分A的pH为6.95-7.45，较佳为7-7.45或7.05-7.35。
在另一优选例中，组分B的pH为6.95-7.45，较佳为7-7.45或7.05-7.35。
在另一优选例中，所述保存液的渗透压为900-1400mOsmol/Kg。
在另一优选例中，所述保存液的pH为6.95-7.45，较佳为7-7.45或7.05-7.35。
在另一优选例中，所述保存液中蔗糖浓度为10-25g/100mL，人血白蛋白浓度为2-15g/100mL，辛酸钠浓度为1.6-10mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为1.6-10mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为70-130mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为450-800mg/L，氯化钠浓度为5500-10000mg/L。
本发明的第五方面，提供一种慢病毒载体的保存液，包含蔗糖、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)、氯化钠、人血白蛋白、辛酸钠、N-乙酰色氨酸钠和水；
其中，蔗糖浓度为10-25g/100mL，人血白蛋白浓度为2-15g/100mL，辛酸钠浓度为1.6-10mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为1.6-10mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为70-130mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为450-800mg/L，氯化钠浓度为5500-1000mg/L。
在另一优选例中，所述保存液的渗透压为900-1400mOsmol/Kg。
在另一优选例中，所述保存液的pH为6.95-7.45，较佳为7-7.45或7.05-7.35。
本发明的临床级、低内毒病毒载体保存组合试剂，适用于GMP级的慢病毒载体的生产工艺，延长慢病毒保存的有效期，利于高纯度高品质的重组慢病毒载体制备工艺过程稳定，可进行线性放大，并可稳定、持续地改进生产工艺，有效控制成本，完善的生产工艺，并利于CAR-T细胞产品的制备和临床使用。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究，研发出一种低内毒病毒载体保存组合试剂，适用于GMP级的慢病毒载体的生产工艺，延长慢病毒保存的有效期，利于高纯度高品质的重组慢病毒载体制备工艺过程稳定，可进行线性放大，并可稳定、持续地改进生产工艺，有效控制成本，完善的生产工艺，并利于CAR-T细胞产品的制备和临床使用。在此基础上，完成了本发明。
组合试剂
本申请的组合试剂包含组合A和组分B。
组分A包含：水、蔗糖、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为10-25g/100mL，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为120-150mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为700-850mg/L，氯化钠浓度为8500-10000mg/L。组分A的pH为6.95-7.45。
组分B包含：水、蔗糖、人血白蛋白、辛酸钠、N-乙酰色氨酸钠、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为10-25g/100mL，人血白蛋白浓度为4-30g/100mL，辛酸钠浓度为4-20mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为4-20mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为20-150mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为150-800mg/L，氯化钠浓度为1500-10000mg/L。组分B的pH为6.95-7.45。
在高纯度高品质的慢病毒载体的生产纯化过程中使用组分A，在分装前按照一定比例添加组分B，形成最终慢病毒载体的保存液。通常，组分A：组分B使用时的配比范围在体积比4：1-1：1之间。
添加组分B后，得到的保存液的渗透压为900-1400mOsmol/Kg，pH6.95-7.45，其中蔗糖浓度为10-25g/100mL，人血白蛋白浓度为2-15g/100mL，辛酸钠浓度为1.6-10mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为1.6-10mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为70-130mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为450-800mg/L，氯化钠浓度为5500-10000mg/L。
获得的上述液体对慢病毒载体能够进行长期保持，未见滴度的明显下降。
本发明的组合试剂对慢病毒载体的保存效果好于市售同类型产品，同时适用于二代及三代慢病毒载体的长期稳定保存。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
组合试剂包含组合A和组分B。
组分A包含：水、蔗糖、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为10g/100mL，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为144mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为795mg/L，氯化钠浓度为9000mg/L。pH为7.15-7.25。
组分B包含：水、蔗糖、人血白蛋白、辛酸钠、N-乙酰色氨酸钠、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为10g/100mL，人血白蛋白浓度为12g/100mL，辛酸钠浓度为9.6mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为9.6mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为28.8mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为167mg/L，氯化钠浓度为1800mg/L。pH为7.15-7.25。
实施例2
组合试剂包含组合A和组分B。
组分A包含：水、蔗糖、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为10g/100mL，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为144mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为795mg/L，氯化钠浓度为9000mg/L。pH为7.35-7.45。
组分B包含：水、蔗糖、人血白蛋白、辛酸钠、N-乙酰色氨酸钠、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为10g/100mL，人血白蛋白浓度为24g/100mL，辛酸钠浓度为19.2mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为19.2mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为144mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为795mg/L，氯化钠浓度为9000mg/L。pH为7.35-7.45。
实施例3
组合试剂包含组合A和组分B。
组分A包含：水、蔗糖、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为15g/100mL，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为144mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为795mg/L，氯化钠浓度为9000mg/L。pH为7.15-7.25。
组分B包含：水、蔗糖、人血白蛋白、辛酸钠、N-乙酰色氨酸钠、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为15g/100mL，人血白蛋白浓度为6g/100mL，辛酸钠浓度为4.8mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为4.8mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为144mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为795mg/L，氯化钠浓度为1800mg/L。pH为7.15-7.25。
实施例4
组合试剂包含组合A和组分B。
组分A包含：水、蔗糖、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为15g/100mL，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为144mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为795mg/L，氯化钠浓度为9500mg/L。pH为7.35-7.45。
组分B包含：水、蔗糖、人血白蛋白、辛酸钠、N-乙酰色氨酸钠、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为15g/100mL，人血白蛋白浓度为12g/100mL，辛酸钠浓度为9.58mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为9.58mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为28.8mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为167.0mg/L，氯化钠浓度为1800mg/L。pH为7.35-7.45。
实施例5
组合试剂包含组合A和组分B。
组分A包含：水、蔗糖、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为15g/100mL，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为144mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为795mg/L，氯化钠浓度为9500mg/L。pH为7.05-7.15。
组分B包含：水、蔗糖、人血白蛋白、辛酸钠、N-乙酰色氨酸钠、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为15g/100mL，人血白蛋白浓度为24g/100mL，辛酸钠浓度为19.2mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为19.2mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为144mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为795mg/L，氯化钠浓度为9000mMol/L。pH为7.05-7.15。
实施例6
组合试剂包含组合A和组分B。
组分A包含：水、蔗糖、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为20g/100mL，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为144mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为795mg/L，氯化钠浓度为9000mg/L。pH为7.35-7.45。
组分B包含：水、蔗糖、人血白蛋白、辛酸钠、N-乙酰色氨酸钠、磷酸二氢钾(KH2PO4)、七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)和氯化钠，其中，蔗糖浓度为20g/100mL，人血白蛋白浓度为6g/100mL，辛酸钠浓度为4.8mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为4.8mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为28.8mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为167.0mg/L，氯化钠浓度为9000mg/L。pH为7.35-7.45。
按照上述实施例1-6的配方配制的组分A和组分B分开使用，在高纯度高品质的慢病毒载体的生产纯化过程中使用组分A，在分装前添加组分B，形成最终慢病毒载体的保存液。其中，组分A：组分B使用时的体积配比范围在4：1-1：1之间。混合后得到的保存液的的渗透压为900-1400mOsmol/Kg，pH 6.95-7.45，其中蔗糖浓度为10-25g/100mL，人血白蛋白浓度为2-15g/100mL，辛酸钠浓度为1.6-10mmol/L，N-乙酰色氨酸钠浓度为1.6-10mmol/L，磷酸二氢钾(KH2PO4)浓度为70-130mg/L，七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4-7H2O)浓度为450-800mg/L，氯化钠浓度为5500-10000mg/L。
实施例7慢病毒载体保存效果试验
加速降解对比试验
同一慢病毒CBMG-LRA2于实施例1-6制备的不同保存液中以37℃加速失活后，检测慢病毒生物滴度下降速率。
复苏并接种293T细胞于培养皿，培养两天后传代，传代的细胞培养20-24小时后，采用多质粒共转染的方法进行转染。转染6小时后更新培养基并继续培养至72小时，收获慢病毒载体上清。将收集的上清离心并用0.45μm的过滤器过滤以去除细胞碎片。将已过滤慢病毒分装至超离心管中，超速离心20000g,90min 4度。用1ml表1中的保存液分别重悬慢病毒沉淀，4度过夜溶解。第二天分装150μl/管。迅速置于干冰冷冻并放置于-80度冰箱保存。将冻存24小时后的处于不同保存液中的慢病毒置于37度水浴融解。根据QC-SOP-090慢病毒载体生物学滴度测定(ProteinL法)标准操作规程SOP进行操作，进行0hr滴度检测。将水浴融解的病毒继续置于37度中，44-48小时后再次检查。
本发明组合试剂在此试验中与市场在售同类型产品进行了对比(表1)，其表现结果远好于市售同类型产品。
表1、慢病毒滴度保存率
长期稳定性试验
采用组合试剂针对GMP级慢病毒载体的长期存贮效果进行了追踪试验。慢病毒载体冻存在-80℃，保存一定时间后融解并检测生物滴度，对于二代或三代表达系统制备的慢病毒载体目前均未见滴度明显下降(表2)。
表2慢病毒载体稳定性试验结果
上述实验结果表明，本发明的组合试剂对慢病毒载体效果好于市售同类型产品，同时适用于二代及三代慢病毒载体的长期稳定保存。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种用于保存慢病毒载体的保存组合物，其特征在于，所述保存组合物由第一保存试剂和第二保存试剂组成，
其中所述第一保存试剂由以下组分组成：浓度为100g/L至250g/L的蔗糖、浓度为120mg/L至150mg/L的磷酸二氢钾、浓度为700-850mg/L的七水合磷酸氢二钠、和浓度为8.5-10g/L的氯化钠，在高纯度高品质的慢病毒载体的生产纯化过程中使用所述第一保存试剂；所述第二保存试剂由以下组分组成：浓度为100g/L至250g/L的蔗糖、浓度为40g/L至300g/L的人血白蛋白、浓度为4mmol/L至20mmol/L的辛酸钠、浓度为4mmol/L至20mmol/L的N-乙酰色氨酸钠、浓度为20-150mg/L的磷酸二氢钾、浓度为150-800mg/L的七水合磷酸氢二钠、浓度为1.5-10g/L的氯化钠和水，在分装前添加所述第二保存试剂，
其中所述第一保存试剂和所述第二保存试剂具有从1:1至4:1范围的体积比。
2.如权利要求1所述的保存组合物，其特征在于，所述第一保存试剂和所述第二保存试剂在保存慢病毒载体的分装前是分开的。
3.如权利要求1所述的保存组合物，其中在添加所述第二保存试剂后，得到的保存液的渗透压范围为900mOsmol/kg至1400mOsmol/kg。
4.如权利要求1所述的保存组合物，其pH范围为6.95至7.45。
5.如权利要求1－4中任一项所述的保存组合物的用途，用于保存慢病毒载体。
6.一种使用权利要求1－4中任一项所述的保存组合物保存慢病毒载体的方法，所述方法包括：
(a)在高纯度高品质的慢病毒载体的生产纯化过程中，将第一保存试剂与慢病毒载体组合，以形成混合物；和
(b)在保存慢病毒载体的分装前添加所述第二保存试剂，由此将第二保存试剂与步骤(a)的混合物组合，所述第一保存试剂和所述第二保存试剂具有从1:1至4:1范围的体积比。
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