CN108611326B - 一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法 - Google Patents

一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108611326B
CN108611326B CN201810371657.7A CN201810371657A CN108611326B CN 108611326 B CN108611326 B CN 108611326B CN 201810371657 A CN201810371657 A CN 201810371657A CN 108611326 B CN108611326 B CN 108611326B
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
vsvg
gene
vector plasmid
plp2
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810371657.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108611326A (zh
Inventor
高山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yingkaisaiwei (Beijing) Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201810371657.7A priority Critical patent/CN108611326B/zh
Publication of CN108611326A publication Critical patent/CN108611326A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108611326B publication Critical patent/CN108611326B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法，该慢病毒生产体系为由携带外源基因的载体质粒和3个包装质粒pLP1、pLP2‑rev、pLP‑VSVG构成的四质粒表达系统，包装质粒pLP1表达慢病毒的基本结构基因gag/pol，包装质粒pLP2表达慢病毒的调节基因rev，包装质粒pLP‑VSVG表达慢病毒的胞膜蛋白基因VSVG，其中，这四种质粒的比例为pLP1：pLP2：pLP‑VSVG：载体质粒＝9:6:9:8。利用本发明慢病毒生产体系及其生产方法，能够获得高达109pfu/ml数量级的高滴度的病毒。

Description

一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法
技术领域
本发明属于病毒制备领域，具体涉及一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法。
背景技术
慢病毒属于反转录病毒科，慢病毒载体是基于HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)发展起来的基因治疗载体，可以将外源DNA或RNA有效地整合到分裂细胞和非分裂细胞的宿主染色体上，并形成稳定持久表达。与一般逆转录病毒载体相比，慢病毒载体具如下优点：有可感染分裂细胞及非分裂细胞的特点，包括较难转染的原代细胞、干细胞等；转移基因片段容量较大，目的基因表达时间长；安全性高，不易诱发宿主免疫反应。因此在基因治疗层面，慢病毒载体正获得越来越广泛的应用。
HIV-1型慢病毒核心为单股正链RNA二倍体，由9个基因组成，包括3个编码病毒颗粒的基本结构基因—gag、pol、env，2个调节基因—tat、rev以及4个辅助基因vif、vpr、vpu、nef。其中gag基因编码病毒核心蛋白，pol基因编码病毒复制需要的酶，env基因编码病毒胞膜糖蛋白。
HIV-1型慢病毒载体是由HIV-1型慢病毒改造而成的，经历了30年的改进更迭，目前应用广泛的是4质粒表达系统，系统由携带外源基因的载体质粒和3个包装质粒构成，特点如下：首先，为了确保载体的生物安全性，防止产生具有复制能力的病毒，将包装质粒部分基因进行了替换，并所需要的基因分散到3个质粒中，一个表达gag/pol，一个表达胞膜蛋白，一个表达rev；第二，将载体3’端长末端重复序列中U3区的增强子和启动子序列去除，确保了载体一旦转入细胞将不能产生完整长度的RNA，丧失了转录能力，从另一个维度减少产生具有复制能力的病毒的可能性；第三，删除了vif、vpr、vpu、nef 4个致病基因，去除了对细胞潜在的毒害作用，提高转染后细胞活性；第四，使用VSV-G基因替代env表达胞膜结构，从而扩大了载体的感染谱，使载体的具有高度稳定性。
这4个质粒分别具有不同基因区段，尤其是包装质粒为需要配合使用共同转染到目的细胞中，但使用比例和用量众说纷纭，相差很大，并没有定论。而商业化包装质粒多以混合物形式出售，也没有明确的比例。而且研究表明，在实际应用过程中，随着插入片段的延长，病毒滴度呈半对数形式下降，目的质粒越长则包装活力毒粒的能力越下降。因此出于应用需要，优化确定一套稳定而高滴度的慢病毒生产体系十分重要。
在非专利文献1中，通过对比包装病毒的感染效率，优化了慢病毒包装的混合质粒条件，并成功地应用于感染白血病细胞系，首次发现提高Rev质粒量可以更有效地提高慢病毒的包装效率。发现相对低剂量的pLP-VSVG和相对高剂量的pLP2-Rev是优化第三代慢病毒包装体系的重点。
然而本发明的发明人通过研究发现，慢病毒包装时载体质粒和包装质粒以与现有技术不同的其他比例使用时也能够获得非常优异的效果。
现有技术文献
非专利文献1：阮峥等，“第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探”，生物技术通讯Vol25，No.6，Nov.,2014，第770-774页
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供一种高滴度的慢病毒生产体系及其生产方法，
用于解决课题的方法
基于以上诉求，本发明提供了一套高滴度的慢病毒生产体系。在本发明中，使用的是安全性高的四质粒表达系统，该高效的慢病毒生产体系，其为由携带外源基因的载体质粒和3个包装质粒pLP1、pLP2-rev、pLP-VSVG构成的四质粒表达系统，包装质粒pLP1表达慢病毒的基本结构基因gag/pol，包装质粒pLP2表达慢病毒的调节基因rev，包装质粒pLP-VSVG表达慢病毒的胞膜蛋白基因VSVG，其中，这四种质粒的比例为pLP1：pLP2：pLP-VSVG：载体质粒＝9:6:9:8。
上述载体质粒可以为用于哺乳动物表达系统的载体质粒，载体质粒上的目的基因可以为任何基因，优选为携带GFP基因的载体质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP。
转染时上述四种质粒的总量优选为13.2μg/ml。
转染细胞为哺乳动物细胞，优选为Lenti-X细胞系。
上述高效的慢病毒生产体系可以为试剂盒。
本发明还提供上述高效的慢病毒生产体系的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
接种步骤，将转染细胞接种至细胞培养皿，细胞生长至覆盖70-80％底面积；
转染步骤，将pLP1、pLP2、pLP-VSVG和载体质粒这四种质粒共同瞬时转染至上述转染细胞的步骤，其中pLP1：pLP2：pLP-VSVG：载体质粒＝9:6:9:8；
培养步骤，培养48-72小时，收集病毒上清；和
浓缩步骤，将上述病毒上清离心去除碎片后，将病毒浓缩100倍以上，得到病毒浓缩溶液。
在上述浓缩步骤中，对病毒浓缩溶液进行置换，置换的目的是为了去除其中的血清和双抗。上述置换优选为浓缩后在补液容器加入6倍以上所述浓缩溶液体积细胞培养基，继续浓缩至初始体积。上述细胞培养基优选为DMEM培养基。
发明的效果
本发明的慢病毒的生产体系和生产方法可以大规模、稳定的生产慢病毒，使病毒滴度达到109pfu/ml数量级。并且在浓缩过程中对原病毒浓缩液溶液进行有效置换，能够减少原培养基中动物血清及不良成分对后续病毒应用体系影响。
具体实施方式
本发明通过具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但是本领域普通技术人员可以理解的是：以下具体实施方式以及实施例旨在阐述本发明，而不应理解为以任何方式限制本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明作出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特殊说明，均为本领域常规的实验方法，所使用的实验材料如无特别说明，均属于可以容易地从商业公司获取的实验材料。
本发明中使用的包装质粒pLP1、pLP2-rev、pLP-VSVG购自invitrogen公司，其具体基因结构可以参考invitrogen公司的“ViraPowerTM慢病毒表达系统”的用户手册。
本发明中使用的载体质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP购自SBI公司，其具体基因结构可以参考SBI公司的“pCDH cDNA克隆和表达慢病毒载体”的用户手册。
实施例1、病毒生产：
提前20-24小时将Lenti-X细胞(六合通)批量铺入15cm细胞培养皿，每皿9.0X 106个细胞，使用的培养基为25ml含有10％FBS的DMEM培养基(Gibco，C11995500BT)。将细胞放入37℃、5％CO2和100％湿度条件下培养。
当细胞量覆盖住70-80％培养皿时进行转染。将终浓度36ug/ml的PEI和12ug/ml的DNA溶解到DMEM中，混合均匀后室温孵育15min，所用质粒比例为PLP1:PLP2:VSVG:pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP＝9:6:9:8。pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP购自SBI。吸取2.5ml DNA/PEI混合物缓慢加入培养皿边缘，轻晃混匀。
6小时后，小心吸出培养液，加入25ml含有2％FBS和0.12％丁酸钠的DMEM。64小时后收集含有病毒的上清液，等待浓缩。
实施例2、病毒浓缩：
浓缩使用的是Spectrumlabs公司的KrosFLO TFF系统浓缩机。按图组装系统后，监测管路是否漏液，检查中空纤维是否破损。先使整个液流系统充满液体，再排空液体，关闭蠕动泵，调低泵速，用夹子关闭回流及测流。打开泵，使柱压达到15PSI，用夹子关闭进压液流，关闭蠕动泵，打开侧液流夹子，如果一分钟内柱压降低小于0.1PSI则说明中空纤维柱没有破损。
用1L水清洗柱子，背压4PSI，完成后用500ml PBS平衡柱子，接样品开始浓缩，注意整个过程中不要产生气泡。
收集的上清液用3500g离心1小时，去除细胞碎片。将离心后液体加入截留500KD的S型中空纤维系统进行浓缩，管路选择#17，流速300ml/min，背压5PSI。当样品浓缩至15ml时，关闭背压，向补液容器内加入90ml DMEM，继续浓缩至35-40ml，4℃，10000g离心5min。将离心后的液体管分装，并存入-80℃。
实施例3、病毒滴度检测
1.病毒液稀释：将浓缩后的病毒138000g离心2min，取上清。取50μl病毒上清加入到450μl DMEM培养基中，混匀，标记为10-1。从10-1混合液开始再用DMEM连续倍比稀释6个稀释度，标记为5X10-2，2.5X10-2，1.25X10-2，6.25X10-3，3.125X10-3，1.5625X10-3。
2.293T细胞(上海细胞库)的准备：用Trypsin将293T消化成单个细胞，洗2遍后用完全培养基(DMEM，Gibco，C11995500BT；FBS，Gibco，10270-106；Penstrept，Gibco，15140122)重悬，取适量细胞悬液于细胞计数板计数。计数后，将细胞悬液用完全培养基稀释成4X105个细胞/ml，根据体积，每毫升中加入0.6μl Polybrene(上海翊圣生物，40804ES76)。
3.病毒感染：24孔板的每个孔中加入500μl上述细胞悬液，加入100μl稀释后的病毒混合液,混匀，设无病毒感染孔做对照，置于37℃、5％CO2和100％湿度条件下培养。24小时后，换成完全培养基继续培养。
4.FACS检测：病毒感染72小时后，收集细胞。用PBS洗2次后，500μl PBS重悬于流式管中，用FACS(流式仪，Beckman,CytoFLEX)检测GFP表达量
5.病毒滴度计算
取FACS阳性率在3％-30％的点进行计算，病毒滴度计算公式如下：
病毒滴度(pfu/ml)＝(阳性比率GFP％*200000)*1000/病毒原液体积(ul)
注：公式中的20000，是指24孔板中，每孔的293T细胞数。
实施例4、质粒比例及用量优化
该实施例中，如下表改变质粒总量及比例，其余按照实施例1-3实施。
表1质粒比例和质粒总量的初步筛选
质粒总量(μg) 比例 病毒滴度
120μg 20:13:5:20 1.59E+06
100μg 20:13:5:20 1.52E+06
80μg 20:13:5:20 1.67E+06
60μg 20:13:5:20 2.14E+06
40μg 20:13:5:20 2.59E+06
20μg 20:13:5:20 NA
33μg 20:13:5:20 1.74E+06
33μg 9:6:9:8 4.67E+06
表2质粒比例和质粒总量的二次筛选
质粒总量(μg) 比例 病毒滴度
60 20:13:5:20 8.86E+06
60 9:6:9:8 7.11E+06
40 20:13:5:20 2.07E+07
40 9:6:9:8 2.24E+07
33 9:6:9:8 3.59E+07
20 9:6:9:8 3.63E+07
表3质粒比例的筛选
质粒总量(μg) 比例 病毒滴度
33 9:6:9:8 6.67E+06
33 9:6:9:12 5.97E+06
33 12:6:3:7 2.97E+06
33 8:4:2:7 4.62E+06
33 10.5:27:10.5:9.5 4.34E+06
33 0.9:0.3:0.5:1.3 5.10E+06
33 9:9:6:8 6.08E+06
33 9:9:6:12 5.78E+06
33 6:9:9:8 4.51E+06
33 6:9:9:12 4.90E+06
33 1:1:1:1 5.84E+06
33 2:2:2:3 6.62E+06
注1：比例为PLP1:PLP2:VSVG:载体质粒
注2：表1中，20μg转染没有滴度，因为测量的点没有在线性范围内
由上述表1～3可知，质粒总量为33μg(即浓度为13.2μg/ml)，质粒比例为pLP1：pLP2：pLP-VSVG：载体质粒＝9:6:9:8时，病毒滴度最高。

Claims (9)

1.一种高效的慢病毒生产试剂盒，其特征在于：
其为由携带外源基因的载体质粒和3个包装质粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG构成的四质粒表达系统，包装质粒pLP1表达慢病毒的基本结构基因gag/pol，包装质粒pLP2表达慢病毒的调节基因rev，包装质粒pLP-VSVG表达慢病毒的胞膜蛋白基因VSVG，
其中，这四种质粒的比例为pLP1：pLP2：pLP-VSVG：载体质粒＝9:6:9:8。
2.如权利要求1所述的高效的慢病毒生产试剂盒，其特征在于：
所述载体质粒为用于哺乳动物表达系统的载体质粒。
3.如权利要求2所述的高效的慢病毒生产试剂盒，其特征在于：
所述载体质粒为携带GFP基因的质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP。
4.使用权利要求1～3中任一项所述的高效的慢病毒生产试剂盒的慢病毒的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
接种步骤，将转染细胞接种至细胞培养皿，细胞生长至覆盖70-80％底面积；
转染步骤，将pLP1、pLP2、pLP-VSVG和载体质粒这四种质粒共同瞬时转染至所述转染细胞的步骤，其中pLP1：pLP2：pLP-VSVG：载体质粒＝9:6:9:8；
培养步骤，培养48-72小时，收集病毒上清；和
浓缩步骤，将所述病毒上清离心去除碎片后，将病毒浓缩100倍以上，得到病毒浓缩溶液。
5.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于：
转染时所述四种质粒的总量为13.2μg/ml。
6.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于：
所述载体质粒为用于哺乳动物表达系统的载体质粒。
7.如权利要求6所述的生产方法，其特征在于：
所述载体质粒为携带GFP基因的质粒pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP。
8.如权利要求4所述的生产方法，其特征在于：
转染细胞为哺乳动物细胞。
9.如权利要求8所述的生产方法，其特征在于：
所述哺乳动物细胞为Lenti-X细胞系。
CN201810371657.7A 2018-04-24 2018-04-24 一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法 Active CN108611326B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810371657.7A CN108611326B (zh) 2018-04-24 2018-04-24 一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810371657.7A CN108611326B (zh) 2018-04-24 2018-04-24 一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108611326A CN108611326A (zh) 2018-10-02
CN108611326B true CN108611326B (zh) 2019-07-19

Family

ID=63660677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810371657.7A Active CN108611326B (zh) 2018-04-24 2018-04-24 一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108611326B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113584083A (zh) * 2020-04-30 2021-11-02 深圳市深研生物科技有限公司 用于逆转录病毒载体的生产细胞和包装细胞及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004024905A1 (fr) * 2002-09-10 2004-03-25 Agtc Gene Technology Company Ltd. Virus de l'herpes simplex humain recombine pour la production de vecteurs lentivirus
CN102140442A (zh) * 2010-02-01 2011-08-03 北京大学深圳医院 重组慢病毒及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004024905A1 (fr) * 2002-09-10 2004-03-25 Agtc Gene Technology Company Ltd. Virus de l'herpes simplex humain recombine pour la production de vecteurs lentivirus
CN102140442A (zh) * 2010-02-01 2011-08-03 北京大学深圳医院 重组慢病毒及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development and Optimization of a High Titer Recombinant Lentivirus System;Storck, A等;《BIOTECHNIQUES》;20170930;第63卷(第3期);第136-138页
第三代慢病毒包装系统优化及Rev表达质粒对慢病毒包装效率作用初探;阮峥等;《生物技术通讯》;20141103;第25卷(第6期);第770-773页

Also Published As

Publication number Publication date
CN108611326A (zh) 2018-10-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Naldini et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector
Olsen Gene transfer vectors derived from equine infectious anemia virus
Kawai et al. New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide
Felber et al. A quantitative bioassay for HIV-1 based on trans-activation
US7226780B2 (en) Lentivirus vector system
Trobridge et al. Cell cycle requirements for transduction by foamy virus vectors compared to those of oncovirus and lentivirus vectors
RU2729385C2 (ru) Биопроизводство лентивирусных векторов
US11845962B2 (en) Method for large-scale production of lentivirus by using GMP-level serum-free suspension cells
CN102260667A (zh) 细胞微粒子-siRNA复合物的制备及其在艾滋病治疗中的应用
CN103842500A (zh) 可用于转导真核细胞的基于病毒的载体组合物
Chen et al. Cytoplasmic tail truncation of SARS-CoV-2 spike protein enhances titer of pseudotyped vectors but masks the effect of the D614G mutation
CN107384872B (zh) 高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用
CN108611326B (zh) 一种高效的慢病毒生产体系及其生产方法
CN101353666B (zh) 一种hiv药物筛选细胞模型及其专用假型慢病毒
WO2000040741A2 (en) Lentivirus vector system
Borok et al. Vesicular stomatitis virus G-pseudotyped lentivirus vectors mediate efficient apical transduction of polarized quiescent primary alveolar epithelial cells
Toscano et al. Efficient lentiviral transduction of Herpesvirus saimiri immortalized T cells as a model for gene therapy in primary immunodeficiencies
EP2578236B1 (en) PREPARATION OF MICROVESICLE-siRNA COMPLEXES AND USE THEREOF IN AIDS TREATMENT
CN105039411A (zh) 附着型慢病毒载体、制备方法及应用
WO2023072178A1 (en) Methods for developing a cell line for producing virus in suspension cell culture
Leath et al. Developing novel lentiviral vectors into clinical products
Stevenson et al. Molecular basis of cell cycle dependent HIV-1 replication: implications for control of virus burden
Gu et al. The enhancement of RNAi against HIV in vitro and in vivo using H-2Kk protein as a sorting method
Zufferey et al. Production of high‐titer lentiviral vectors
Kasper et al. Efficient manipulation of Hedgehog/GLI signaling using retroviral expression systems

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20200831

Address after: No.1 Workshop, No.45, Dongjiu Road, Tianjin pilot free trade zone (Airport Economic Zone), Jinghai District, Tianjin

Patentee after: Yingwei fosai Biotechnology (Tianjin) Co.,Ltd.

Address before: 100032 No. 9, North Third Ring Road, Xicheng District, Beijing

Patentee before: Gao Shan

TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220531

Address after: 100176 306a, floor 3, building 4, Yongchang Middle Road, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Patentee after: Beijing Zhongke Weiyuan Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 300000 plant 1, No. 45, East 9th Road, Tianjin pilot free trade zone (Airport Economic Zone), Jinghai District, Tianjin

Patentee before: Yingwei fosai Biotechnology (Tianjin) Co.,Ltd.

CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: Room 306A, 3rd Floor, Building 4, Yard 4, Yongchang Middle Road, Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing 100176

Patentee after: Yingkaisaiwei (Beijing) Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 100176 306a, floor 3, building 4, Yongchang Middle Road, Beijing Economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Patentee before: Beijing Zhongke Weiyuan Biotechnology Co.,Ltd.