CN107384872B - 高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用 - Google Patents

高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用，包装质粒和膜囊质粒，所述包装质粒为pMDLg/pRRE、pRSV‑Rev，囊膜质粒为VSV‑G，用于细胞转染的Buffer A:1M CaCl2，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的Buffer B：1M NaHCO3，重悬病毒时减少病毒黏附损失的Buffer C：302无血清培养基。利用4质粒表达系统共转染HEK 293T细胞，收集病毒上清，超速离心后获得滴度高达1010 TU/mL的病毒浓缩液，用其感染小鼠腹腔巨噬细胞两次，可达90%以上的感染效率。

Description

高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及高滴度慢病毒的制备及其在高效感染小鼠腹腔巨噬细胞方面的应用。
背景技术
现有的转基因方法包括物理方法、化学方法和生物学方法。物理方法主要包括DNA显微注射法、电穿孔法和金属颗粒轰击法等；化学方法主要包括脂质体或受体介导的转染等；生物学方法主要指病毒感染。电转、脂质体介导的转染等方法安全性高，但效率较低，且难以实现外源基因的稳定永久表达。腺病毒载体系统感染效率高, 但目的基因不整合至靶细胞基因组, 表达时间短，而且能够激起宿主细胞的免疫反应，本身对细胞的毒性较大，使其应用逐渐减少。随着近年来慢病毒等新兴病毒载体的发展，以其可以感染分裂及非分裂细胞、容纳外源性基因片段更大等优点，逐渐受到科学界的青睐。
慢病毒(lentivirus)为RNA病毒，属逆转录病毒科，以HIV-1为基础构建的新型慢病毒载体(1entivirus vector, LV)系统是由慢病毒为骨架改造而来，且比逆转录病毒载体有更广的宿主范围。LV介导的基因转染有两大优点：一，可以将目的基因高效整合到宿主细胞的染色体上并随细胞增殖长期稳定表达；二，可以感染多种细胞类型，包括分裂细胞和非分裂细胞，且可以在体实现基因转导。在感染能力方面，可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。由此可见慢病毒已经成为现代细胞生物学研究中一种广泛应用的基因传递工具。从其安全性考虑，慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒，但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，因此操作时建议使用生物安全柜，穿实验服，戴口罩和手套，不要产生气雾或飞溅。
慢病毒滴度对基因导入效率至关重要，然而不同方法包装的慢病毒其滴度差异很大，能否制备高滴度的慢病毒是提高效感染效率的前提。影响慢病毒包装滴度的因素有很多，包括包装质粒、膜囊质粒的选择及其纯度，HEK 293T细胞状态、培养基条件，转染试剂等。虽然选用VSV-G膜蛋白包装的高滴度慢病毒提高了细胞的感染种类及感染效率，但是对不同细胞和组织的亲嗜性存在较大差别。目前，市场上出售的慢病毒滴度在108-109TU/mL，尚可满足部分实验需要，但对于小鼠巨噬细胞而言，其感染效率低，无法使目的基因在巨噬细胞上有效过表达。目前已有文献报道对于慢病毒感染人白血病单核细胞系THP-1效率达90%以上时，multiplicity of infection (MOI)须达到60，即意味着需消耗大量病毒，如何制备高滴度慢病毒已成其瓶颈，而如何高效感染啮齿动物原代巨噬细胞尚未见相关文献报道。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供一种高滴度慢病毒的制备试剂盒及其应用，滴度可达到1012copies/mL，功能活性滴度达到1010 TU/mL，且可高效感染小鼠腹腔巨噬细胞，效率可达到90%以上。
技术方案：高滴度慢病毒的制备试剂盒，包括：包装质粒和膜囊质粒，所述质粒混合物为包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev，与囊膜质粒VSV-G，用于细胞转染的Buffer A :1MCaCl2，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的Buffer B：1M NaHCO3，重悬病毒时减少病毒黏附损失的Buffer C：302无血清培养基。
上述试剂盒的应用，步骤为：（1）转染：细胞转染前24小时，用0.25%Trypsin-EDTA将长满15cm细胞培养皿的转染细胞进行消化，按1:10细胞数量传代至直径10cm细胞培养皿，每份培养皿加入10mL DMEM+10%FBS+1%PS培养基，第二天细胞汇合度达到80%以上；（2）转染前1小时，弃掉原培养基，每份直径10cm细胞培养皿更换新鲜的37℃预热的6mL DMEM+10% FBS培养基；（3）病毒包装液的准备：将试剂盒中的质粒混合物60μL与转移质粒 60μg分别加入到6mL无酚红DMEM培养基中并混匀，所述质粒混合物为包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev与囊膜质粒VSV-G按质量比1:1:1的混合物，加入试剂Buffer A 360μL，混匀，室温静置20~30分钟，每份培养皿中均匀滴入1mL病毒包装液，十字晃匀，置于37℃孵箱；（4）18小时后，吸出全部的病毒包装液至预先准备的84消毒液中，每份细胞培养皿更换新鲜的37℃预热的12mL DMEM+10% FBS+1%Buffer B培养基；（5）48~72小时后，收集上清，初步离心，3000rpm，5分钟；（6）准备0.45μm孔径滤器，用PBS+1% Buffer C 润湿；（7）将离心后的病毒上清通过湿润的0.45μm孔径滤器过滤，以去除细胞碎片；（8）将过滤后的病毒液体进行超速离心，18000rpm，2小时，4℃；（9）离心后弃上清，用200μLPBS+1% Buffer C重悬，分装后于-80℃冰箱保存备用。
上述转染细胞为HEK293T细胞及小鼠腹腔巨噬细胞。
有益效果：利用4质粒表达系统共转染HEK 293T细胞，收集病毒上清，超速离心后获得滴度达到1010 TU/mL的病毒浓缩液，用其感染小鼠腹腔巨噬细胞两次，可达90%以上的感染效率。
附图说明
图1为高滴度慢病毒制备试剂盒流程图；
图2为mCherry慢病毒功能活性滴度测定图；5×1010 TU/mL慢病毒（mCherry）活性滴度检测（HEK293T细胞，感染96小时）
图3为慢病毒（mCherry）感染小鼠腹腔巨噬细胞的病毒用量及效率统计图。
具体实施方式
下面的实例可使本专业技术人员全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
一、慢病毒制备试剂盒组成及实验流程
本试剂盒采用4质粒慢病毒包装系统，由包装质粒(pMDLg/pRRE、pRSV-Rev)、膜囊质粒 (VSV-G）、转移质粒组成。本试剂盒所提供用于细胞转染的Buffer A ，配合最适宜病毒包装环境的Buffer B，重悬病毒时减少病毒损失的Buffer C，可最终得到较高滴度的病毒液，实验重复性好，可信度高。
1. 产品组成
（1）本试剂盒提供产品如下：
质粒混合物：包装质粒和膜囊质粒中pMDLg/pRRE、pRSV-Rev与VSV-G（购自Addgene）按质量比1:1:1的混合物，4℃储存；
转移质粒：4℃储存，需使用者根据实验需要插入目的基因片段；
试剂：Buffer A（1M CaCl2，2×BES）（4℃储存）
Buffer B（1M NaHCO3）（4℃储存）
Buffer C（302无血清培养基）（4℃储存）
（2）自备试剂及相关仪器设备：
细胞：HEK 293T
试剂：DMEM（Invitrogen，11995073）
FBS（Invitrogen，16140）
Glutamine（Invitrogen，25030）
Penicillin/Streptomycin（Invitrogen，15140-122）
0.05%Trypsin-EDTA（Invitrogen，25200056）
DMEM(no phenol red)（Life，31053-028）
耗材：0.45μm过滤器（Millipore，SLHV033RB）
仪器：超速离心机（Beckman）
离心机转头（Beckman SW32Ti rotor）
2. 试剂盒使用流程
以包装6份10cm 培养皿的病毒为例，详细实验步骤如下：
（1）HEK 293T细胞生长增殖状态较好转染前24小时，用0.05%Trypsin-EDTA将长满15cm细胞培养皿的HEK 293T细胞进行消化，按1:4传代至10cm细胞培养皿，每份培养皿加入10mL DMEM+10% FBS+1%PS培养基，第二天细胞汇合度达到80%以上。
（2）转染前1小时，弃掉原培养基，每份10cm细胞培养皿更换新鲜预热的6mL DMEM+10% FBS培养基。
（3）病毒包装液的准备：将试剂盒中的质粒混合物60μL与转移质粒 60μg分别加入到6mL DMEM(no phenol red)培养基中并混匀，上述质粒混合物为pMDLg/pRRE、pRSV-Rev与VSV-G（购自Addgene）按质量比1：1：1的混合物，加入试剂Buffer A 360μL，混匀，室温静置20~30分钟，每份培养皿中均匀滴入1mL病毒包装液，十字晃匀，置于37℃孵箱。
（4）18小时后，吸出全部的病毒包装液至预先准备的84消毒液中，每份细胞培养皿更换新鲜的37℃预热的12mL DMEM+10% FBS+1%Buffer B培养基。
（5）48~72小时后，收集上清，初步离心，3000rpm，5分钟。
（6）准备0.45μm孔径滤器，用PBS+1%Buffer C 润湿。
（7）将离心后的病毒上清通过湿润的0.45μm孔径滤器过滤，以去除细胞碎片。
（8）将过滤后的病毒液体进行超速离心，18000rpm，2小时，4℃。
（9）离心后弃上清，用200μLPBS+1% Buffer C重悬，分装后于-80℃冰箱保存备用。
病毒包装流程如图表所示。（图1）
二、慢病毒滴度测定
通过上述实验方法包装带有mCherry荧光报告基因的慢病毒，对其滴度进行测定，一种方法为qRT-PCR检测慢病毒滴度，使用试剂盒（Lenti-X qRT-PCR Titration Kit,Clontech, 631235），流程详见其说明书。qRT-PCR结果为：1.2×1012 copies/mL。
另一种方法为慢病毒活性功能性滴度检测。将HEK 293T细胞以浓度3×105cells/mL种于24孔板中，每孔加500μL DMEM+10% FBS+1%PS培养基，培养过夜。第二天弃掉配液，加入300μL DMEM+10% FBS含mCherry病毒的新鲜培养基，第一孔所加病毒量为2μL，此后每孔病毒量依次10倍梯度稀释至10-7，18~20小时后弃掉病毒液，换新鲜培养基DMEM+10% FBS+1%PS，48小时后观察荧光表达情况。统计结果为5×1010 TU/mL。（图2）
三、高效感染小鼠腹腔巨噬细胞
1. C57BJ/6背景雄性小鼠，腹腔注射硫胶质，1mL/只，5天后提取腹腔巨噬细胞，以5×105cells/mL密度种于24孔板中。
2. 两小时后弃掉培液，PBS洗1遍以纯化巨噬细胞。
3. 加入300μLDMEM+10% FBS+1.8μgPolybrene含上述实验方法包装的mCherry病毒的新鲜培养基。
4. 间隔18-20小时后弃掉病毒液，重复感染一次。
5. 72小时后观察荧光表达。
所加病毒量及感染效率如图所示（图3），用4μL病毒感染每孔细胞，感染两次后，感染效率可达到90%以上。

Claims (1)

1.高滴度慢病毒的制备试剂盒的应用，其特征在于包装质粒和膜囊质粒，所述包装质粒为pMDLg/pRRE、pRSV-Rev，囊膜质粒为VSV-G，用于细胞转染的Buffer A :1M CaCl2，2×BES，配合最适宜病毒包装环境的Buffer B：1M NaHCO3，重悬病毒时减少病毒黏附损失的Buffer C：302无血清培养基；具体应用步骤为：（1）转染：细胞转染前24小时，用0.25%Trypsin-EDTA将长满15cm细胞培养皿的转染细胞进行消化，按1:10细胞数量传代至直径10cm细胞培养皿，每份培养皿加入10mL DMEM+10%FBS+1%PS培养基，第二天细胞汇合度达到80%以上；所述转染细胞为HEK 293T细胞；（2）转染前1小时，弃掉原培养基，每份直径10cm细胞培养皿更换新鲜的37℃预热的6mL DMEM+10% FBS培养基；（3）病毒包装液的准备：将试剂盒中的质粒混合物60μL与转移质粒 60μg分别加入到6mL无酚红DMEM培养基中并混匀，所述质粒混合物为包装质粒pMDLg/pRRE、pRSV-Rev与囊膜质粒VSV-G按质量比1:1:1的混合物，加入试剂Buffer A 360μL，混匀，室温静置20~30分钟，每份培养皿中均匀滴入1mL病毒包装液，十字晃匀，置于37℃孵箱；（4）18小时后，吸出全部的病毒包装液至预先准备的84消毒液中，每份细胞培养皿更换新鲜的37℃预热的12mL DMEM+10% FBS+1%Buffer B培养基；（5）48~72小时后，收集上清，初步离心，3000rpm，5分钟；（6）准备0.45μm孔径滤器，用PBS+1%Buffer C 润湿；（7）将离心后的病毒上清通过湿润的0.45μm孔径滤器过滤，以去除细胞碎片；（8）将过滤后的病毒液体进行超速离心，18000rpm，2小时，4℃；（9）离心后弃上清，用200μL PBS+1% Buffer C重悬，分装后于-80℃冰箱保存备用。
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