CN101550406B - 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效诱导多潜能干细胞的方法。利用慢病毒载体将Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc,Klf4,UTF1,Rex1(ZFP42)等6个诱导因子及p53基因抑制剂导入到细胞中,能高效诱导产生诱导多潜能干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途。
背景技术
(一)干细胞多能性(pluripotency)的特点:
胚胎干细胞因为具有向三个胚层细胞的分化能力而被称为“多潜能”干细胞,此外,胚胎瘤(EC)细胞和胚胎生殖(EG)细胞均具有和胚胎干细胞类似的多能性。多潜能干细胞共同的特点是:细胞核质比比较大,克隆样生长(人胚胎干细胞较扁平,而小鼠胚胎干细胞较为隆起,细胞界限不明显),具有AP酶活性,特异地表达SSEA4,TRA1-60,TRA1-81等表面标志(小鼠胚胎干细胞还特异性地表达SSEA1,而人胚胎干细胞不表达SSEA1),及Oct4,Nanog,Sox2,rex1(ZFP42),GDF3,lin28,mbd2,TEGF1等标志性基因。此外,还可以在悬浮培养条件下,形成胚胎小体(Embryonidbodies)结构,并发生自发分化,EB形成6-9天后贴壁培养,可检测到向内、中、外三个胚层分化的细胞。
(二)诱导多能性干细胞(IPS细胞)的研究
2006年8月,日本京都大学再生医科学研究所教授山中伸弥(Yamanaka)实验室首先宣布在小鼠的成纤维细胞中导入4个基因(Oct4,Sox2,c-Myc和KLF4)成功地将其诱导成为全能性的干细胞,其性质和胚胎干细胞类似。1从而首次揭示了通过转基因可以在分化的细胞中建立全能性。这是对许多年来的生物学观念的一次巨大的冲击,并且有望使基于干细胞技术的治疗性克隆彻底摆脱卵子来源的困境和破坏胚胎引起的伦理争议。目前使用这种人工干细胞来进行细胞治疗患者尚存在安全隐患,但它不久后可能被应用于疾病模型的制作和新药研发等研究工作。这一成果加快了再生医学的研究步伐,具有划时代的意义。
在该实验中,Yamanaka等人首先选取了和小鼠胚胎干细胞自我更新及维持多能性相关的24个基因,分别将他们克隆到逆转录病毒载体,对胚胎成纤维细胞进行共转染,在进行基于Fbx15报告体系的筛选之后,他们观察到了ES-like的细胞集落的形成。
经过对这24个基因的进一步分析,他们发现,仅转导Oct4,Sox2,c-Myc,KLF4就可以使胚胎成纤维细胞完全转变成为诱导的多潜能干细胞(IPS细胞-InducedPluripotentStemCells,俗称“诱导的多潜能干细胞”)。该IPS细胞拥有正常的核型,表达类似胚胎干细胞的分子标志,可以在体外被诱导分化为内、中、外三个胚层的终末分化的细胞,能够在裸鼠体内形成畸胎瘤,在畸胎瘤中含有内、中、外三个胚层的分化细胞。此外,和胚胎干细胞一样,IPS细胞在Nanog和Oct4promoter上检测到H3的低甲基化和高乙酰化。然而,采用Fbx15基因作为reporter筛选出来的细胞并不具有完整的全能性,如:内源Oct4等干性基因仍然没有能够正常地启动表达,不能通过囊胚注射的方法制成嵌合小鼠等。
此后,2007年5月份,Yamanaka实验室和Jaenisch实验室同时在Nature杂志上发表文章声明2,3,他们采用新的报告基因(基于Oct4或nanog的promoter)进行抗药性筛选可以产生完全重编程的IPS细胞,新的IPS细胞可以使内源基因重新启动,并且可以通过囊胚注射制备成为嵌合小鼠,并整合到生殖系统中,产生完全由该IPS细胞生成的后代小鼠。Jaenisch实验室的实验结果表明,该IPS细胞甚至通过四倍体胚胎嵌合技术制备发育正常的小鼠胚胎。此外,新的IPS细胞的Oct4启动子及Nanog启动子的甲基化修饰也几乎被完全擦除。
同时,Hochedlinger实验室和Plath实验室合作在Cellstemcells上发表文章,用更加丰富的手段验证了IPS细胞完全重编程的效果。4例如,同分化细胞融合使分化细胞去分化的能力,雌性细胞的X染色体失活现象,H3K4和H3K27的甲基化谱等等。由此,4个因子诱导分化细胞成为全能性干细胞的事实被完全确认!
2007年8月,Jaenisch实验室又发表新文章表明:不需要任何筛选体系,只通过形态判断一样可以获得重编程完全的全能性细胞系。5如果靶细胞整合有GFP的报告体系的话,可以看到内源Oct4的启动,但其发生的时间较晚,大约在20-30天左右才可以观察到。也表明靶细胞需要一个较长的时间去逐渐发生重编程向IPS细胞的转变。同年9月,Ramalho-Santos实验室也在Cellstemcell杂志上发表文章称不用任何筛选体系即可完成IPS细胞的诱导。6
此外,也有一些文章对四个因子进行了进一步分析,例如,上述Cellstemcell杂志的文章中,作者采用N-myc代替c-Myc来完成重编程,Yamanaka实验室和Jaenisch实验室也分别在Cellstemcell和NatureBiotechnology上发表文章声称不使用c-Myc,而只用Oct4,Sox2和KLF4一样可以获得IPS细胞,7Yamanaka实验室甚至对于其它各因子都尝试了替换,如成功将Sox2换成Sox1和Sox3,成功将Klf4换成Klf2和Klf5,以及将c-Myc换成了L-myc和N-myc。然而,不采用c-Myc以后,诱导IPS细胞的效率将会大大降低,也并非每次都可以重复,证明c-Myc对于reprogramming仍然起到了非常关键的作用。
尽管诱导IPS细胞的技术研究发展迅速,诱导IPS细胞机制的分析却发展较为缓慢,Yamanaka曾在第一篇IPS细胞的文献中提出模型:由c-Myc打开分化细胞的染色体结构,使之较容易被改造;而KLF4通过P53信号通路同c-Myc相互平衡,抑制由c-Myc带来的细胞凋亡;而Oct4和Sox2成为一对蛋白复合物,启动一系列和全能性相关基因,并抑制许多和分化发育相关基因的表达,从而使细胞转换到全能性的转态。
此后,2008年2月和2008年3月的Cellstemcell杂志上分别发表两篇文章8,9揭示了诱导IPS重编程的变化过程。其中,Jeanisch实验室利用胚胎干细胞的四种标志:AP活性的出现、sseal的表达、Nanog和Oct4等内源干性基因的启动,将IPS的诱导过程分为3个阶段。IPS的诱导时间大约在30天左右,其中AP活性最先出现,随时间增加,AP活性细胞比例逐渐增加至80%以上;sseal在第9天左右开始表达,至iPS出现时,只有15%左右的细胞表达sseal;Nanog和Oct4在第16天左右出现,比例极低。与此同时,Hochedlinger实验室的工作也类似地将iPS的诱导过程分为Thy1的沉默,SSEA-1的表达,外源基因的沉默,内源干性基因的表达四个阶段。这些结果为进一步深入研究分子机制提供了很好的基础。也为IPS重编程技术的研究提供了阶段性指标。
此外,Yamanaka在2008年2月的Science杂志中发表文章,报道了使用新的细胞类型——小鼠的肝细胞和胃细胞成功地实现了诱导IPS细胞重编程的过程。10有趣的是,用肝细胞诱导IPS细胞对于基因整合的数量需求更少,而且对c-Myc基因的需求更小,和小鼠皮肤成纤维细胞相比,有更容易被诱导成为IPS细胞的趋势。另外,Yamanaka实验室的该论文中还使用细胞世系追踪的经典实验体系追踪了原代培养的肝细胞里表达白蛋白的细胞,发现最后诱导出的绝大部分IPS细胞都来源于表达白蛋白的肝细胞。尽管表达白蛋白的细胞是否一定是完全分化的肝实质细胞还有待商榷,但该实验结果已初步对成体细胞的重编程能力进行了更深入的判断和探索,诱导IPS细胞的重编程能力绝非仅仅出现在皮肤的成纤维细胞中。这给IPS细胞技术的应用提供了更可靠的依据。
2007年11月21日,在完全重编程的小鼠IPS细胞建系后仅半年的时间,日本Yamanaka实验室及美国Thomson实验室就分别在Cell和Science杂志上发表文章11,宣布成功地通过转基因的方法,将人体皮肤细胞诱导成为全能性的IPS细胞!有意思的是,Yamanaka实验室仍然使用了诱导小鼠IPS的工作中曾被采用的4个因子Oct4,Sox-2,c-Myc,Klf4,同时,它还转导了逆转录病毒的受体以辅助逆转录病毒载体进入细胞,提高基因转导效率。而Thomson实验室则对胚胎干细胞富集表达的基因进行了新的筛选,并找到了新的诱导IPS的因子组合:Oct4,Sox2,Nanog和Lin-28,并使用慢病毒载体进行基因转导。
仅仅1个月之后,2007年12月,美国GeorgeDaley实验室又在Nature杂志上发表文章,成功地将人的真皮成纤维细胞逆转成为全能性的IPS细胞12。2个月后,2008年2月,美国Plath实验室也报道了成功地用人体成纤维细胞诱导出了人IPS细胞。13有所不同的是,GeorgeDaley实验室的工作中,诱导成人的IPS时必须同时加上TERT和SV40T两个导致细胞转化的基因,而Plath实验室则增加了一个新的基因Nanog来诱导人的IPS细胞。
发明内容
本发明提供了一种制备诱导多潜能干细胞的方法。该方法通过向分化的细胞中提供特定组合的诱导因子,诱导产生IPS细胞-诱导的多潜能干细胞(InducedPluripotentStemCells,俗称“万能细胞”),其中所使用的诱导因子涉及Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc,Klf4,UTF1,Rex1(ZFP42)及p53基因抑制剂。
一方面,本发明涉及诱导因子UTF1,Rex1(ZFP42)和p53基因抑制剂的至少一种用于诱导多潜能干细胞产生的用途,用于促进诱导产生多能性干细胞的因子的效率的用途及促进诱导产生多能性干细胞的效率。
另一个方面,本发明涉及一种制备诱导多潜能干细胞的方法,包括向分化的细胞中提供诱导因子,所述诱导因子包括Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc和Klf4,以及UTF1,Rex1(ZFP42)和p53基因抑制剂的至少一种。优选地,所述诱导因子不包括Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc和Klf4中的一种。更优选地,当诱导因子为UTF1时不包括Oct4;诱导因子为p53si时不包括KLF4。更进一步优选地,所述诱导因子不包括c-Myc。
在另一个优选的实施方案中,所述分化的细胞是成纤维细胞,肝细胞,胃细胞,角质细胞或血液细胞。
在另一个优选的实施方案中,所述分化的细胞来源于哺乳动物。
在另一个优选的实施方案中,所述哺乳动物是人、鼠或灵长类动物。
在另一个优选的实施方案中,所述诱导因子为DNA形式,mRNA形式或蛋白质形式。
p53基因的表达是导致人和小鼠胚胎干细胞自发分化和自发凋亡的主要原因之一14,15。此外,p53基因表达的蛋白还会结合在Nanog和Oct4等胚胎干细胞特异的转录基因启动子上,抑制这些和全能性相关的重要基因的表达。因此,抑制p53基因的转录产物或抑制P53功能的抑制剂,有望促进细胞的全能性,并抑制分化。这可以通过例如合成siRNA(干涉RNA)片段或利用特异抑制P53功能的小分子来抑制p53基因,从而通过结合其它诱导因子实现本发明的目的。本发明示例性地通过实验证明了利用合成的p53干涉片段p53si结合其它诱导因子成功获得了IPS细胞。基于说明书的教导,本领域的普通技术人员完全可以确定其它合成的干涉RNA序列(如正义链为5'GACUCCAGUGGUAAUCUACdtdt3’,SEQIDNO:54,反义链为5'GUAGAUUACCACUGGAGUCdtdt3’,SEQIDNO:55的干涉RNA序列)例如可以通过用LipofectamineRNAMax(Invitrogen)瞬时转染到靶细胞中实现对P53的干涉,同时结合其它诱导因子从而实现本发明的目的。并且,本领域的普通技术人员基于说明书的教导,同样可以确定特异抑制P53功能的小分子抑制剂如抑制P53的转录活性的pifithrin-α(CALBIOCHEM,货号506132)16,抑制P53结合到线粒体并进一步诱导凋亡的pifithrin-miu(CALBIOCHEM,货号506155)17同样可以在靶细胞中抑制P53的作用,同时结合其它诱导因子实现本发明的目的。因此,基于说明书的教导,本领域的普通技术人员可以确定现有技术中已知的其它p53基因抑制剂可以用于本发明,同其它诱导因子结合获得IPS细胞。
在另一个优选的实施方案中,Oct4(POU5f1)的DNA序列如SEQIDNO:5所示,Sox2的DNA序列如SEQIDNO:8所示,c-Myc的DNA序列如SEQIDNO:14所示,Klf4的DNA序列如SEQIDNO:11所示,UTF1的DNA序列如SEQIDNO:17所示,Rex1(ZFP42)的DNA序列如SEQIDNO:20所示,和p53基因抑制剂选自SEQIDNO:1所示的序列,SEQIDNO:54所示的序列,pifithrin-α,或pifithrin-miu。
本领域的普通技术人员可以理解,当上述诱导因子为DNA形式时,将其转染到分化的细胞中的技术在本领域中是公知的,包括但不限于DEAE-葡聚糖法,磷酸钙法,阳离子脂质体法,阳离子聚合物,Biolistic颗粒传递法(基因枪粒子轰击法),显微注射法,电穿孔法和病毒介导法。其中优选病毒载体介导法,所述病毒载体优选为慢病毒载体,逆转录病毒载体,腺病毒载体等。优选地,所述慢病毒是以I型人免疫缺损病毒(HIV-1)为代表的慢病毒(如PLL3.7载体),所述逆转录病毒以PMX载体为例,所述腺病毒载体是以Ad5血清型E1/E3缺陷型腺病毒DNA为骨架的复制缺陷型重组腺病毒系统。
本领域的普通技术人员同样可以理解,可以在体外表达上述诱导因子,获得相应的蛋白质后,导入到分化的细胞中,从而实现本发明的目的。将蛋白质导入到细胞中的技术在本领域中是公知的,包括但不限于Tat-delivery及相关技术,Carbonnanotube,Nano-particle,电转(核转染),基因枪,超声+造影剂,SLO细胞通透,蛋白和细胞配体结合。16
本领域的普通技术人员也可以理解,可以将上述诱导因子的mRNA直接导入到分化的细胞中,使其在细胞中表达产生相应的蛋白,从而实现本发明的目的。将mRNA导入到细胞中的技术与将蛋白质导入到细胞中的技术相类似,并且在本领域中是公知的。
再一个方面,本发明一种制备诱导多潜能干细胞的试剂盒,包括向分化的细胞中提供诱导因子,所述诱导因子包括Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc和Klf4,以及UTF1,Rex1(ZFP42)和p53基因抑制剂的至少一种。优选地,所述诱导因子不包括Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc和Klf4中的一种。更优选地,当诱导因子为UTF1时不包括Oct4;诱导因子为p53si时不包括KLF4。更进一步优选地,所述诱导因子不包括c-Myc。
在另一个优选的实施方案中,所述诱导因子为DNA形式,mRNA形式或蛋白质形式。
在一个优选的实施方案中,当所述诱导因子是DNA形式时,所述试剂盒还包括用于将诱导因子转染到分化细胞中的病毒载体。
在另一个优选的实施方案中,所述病毒载体选自慢病毒载体,逆转录病毒载体或腺病毒载体。
在本发明的另一个方面,涉及用上述方法及试剂盒制备的多潜能干细胞。
通过在已报道的4个重编程基因的基础上补充P53si,UTF1,Rex1三个诱导因子或其中任何一种,均可以明显提高重编程效率,并可以产生正常的IPS细胞。UTF1甚至可以取代已报道的4因子中的Oct4;而P53si可以取代已报道的4因子中的Klf4而实现重编程。
本发明得到的诱导多潜能干细胞,表达胚胎干细胞的标志性基因及表面蛋白,和胚胎干细胞一样具有表面的碱性磷酸酶活性,具有自发分化形成胚胎小体(Embryoidbody)的能力,并可以被进一步分化成为内、中、外三个胚层的细胞类型。同小鼠中的报导一致的是,该诱导过程经历了几个发展阶段:AP+细胞的产生,ES-like的细胞克隆的产生,外源导入基因的沉默和内源干性基因的启动。
使用本文发明方法建立的IPS细胞具有很高的效率,从IPS细胞形成过程必须经过的AP+阶段来看,使用7个诱导因子进行IPS细胞制备可以在本实验室4个因子不足以有效产生IPS细胞的情况下(见表1)大量建立出IPS细胞系,并比已报道的IPS细胞建系效率高出1-2个数量级。通过对7个诱导因子进行进一步分析可以更加明确P53si,UTF1及Rex1具有对于重编程效率的明显贡献。其中,UTF1甚至可以取代已报道的4因子中的Oct4;而P53si可以取代已报道的4因子中的Klf4而实现重编程。
附图说明
图1为本发明所使用慢病毒载体pLL3.7的结构图,a)为慢病毒干涉载体pLL3.7;b)为慢病毒干涉载体pLL-IRES-puro。
图2为慢病毒载体转染EGFP的荧光图,a)为细胞在普通视野下的形态图;b)为细胞显示高比例的绿色荧光。
图3为携带各个诱导因子的慢病毒感染成纤维细胞20天后的AP阳性克隆,a)为:成人包皮成纤维(HFF),靶细胞数为2×105,AP+且类似胚胎干细胞克隆数为181。
图4为IPS细胞表达人胚胎干细胞表面标志及AP染色阳性,其中b)为IPS细胞的AP染色图;c)为细胞核DAPI染色图;d)为和c同视野下的SSEA4免疫荧光图;e)为细胞核DAPI染色图;f)为和e同视野的Nanog免疫荧光染色图。
图6为IPS细胞形成胚胎小体(EmbryoidBodies,EB)。
图7为IPS细胞通过EB自发向三个胚层细胞的分化。其中AFP是内胚层肝脏细胞的标志,T是中胚层细胞特异表达的基因,nestin是神经细胞特异表达的基因。11,13
具体实施方式
以通过实施例进一步举例说明本发明。本领域的普通技术人员可以理解本发明并不限于所述实施例,并且本领域的普通技术人员可以基于说明书的教导对实施例进行修改。这些修改同样包含在本发明由后附的权利要求所定义的本发明的范围内。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1.重组载体pLL-p53si的构建
1).p53干涉片段的获得
按照以下序列合成p53干涉片段的正义链和反义链:
正义链:5′-TGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTTC-3′(SEQIDNO:1)
反义链:5′-TCGAGAAAAAAGACTCCAGTGGTAATCTACTCTCTTGAAGTAGATTACCACTGGAGTCA-3′(SEQIDNO:2)
将正义链和反义链于1.5ml管中如下进行退火,反应体系10ul,分别加入:10×退火缓冲液(100mMTris-HCl,pH7.5,1MNaCl,10mMEDTA)1ul,正义链和反义链各1ul(500ng/ul),适量的无菌水补足至10ul,煮沸后冷却过夜,得到p53干涉片段。
慢病毒干涉载体pLL3.7(RubinsonandDillonetal,NatureGenetics,2003,质粒图谱见图1上,具体信息和全序列可参考http://www.sciencegateway.org/protocols/lentivirus/pllmap.html,SEOIDNO:21)用HpaI和XhoI在37℃下双酶切经测序正确的pLL3.7质粒,使用鼎国公司的DNA快速纯化/回收试剂盒回收7.6kb大小的片段。
使用DNALigationKitVer2.0(TaKaRa),按照插入的DNA/载体摩尔比10∶1的比例分别吸取适量的DNA在1.5ml管中,反应体系10ul,分别加入:10×缓冲液1ul,10mMdNTPs0.2ul,T4DNA连接酶0.2ul,适量的无菌水补足至10ul,16℃条件下反应30min。
取5ul连接产物加入到100ulTop10感受态细胞中,冰浴30分钟;42℃孵育90秒;再冰浴2分钟;将其转移至0.5mlLB培养液中,37℃、100rpm条件下培养45分钟;然后吸取50ul均匀涂布于直径10cm的LB平板上,37℃条件下培养18小时。随机挑取形态正常、分散良好的5个单菌落送测序鉴定,获得重组载体pLL-p53si。
实施例2.PLL-Oct4(POU5f1),PLL-Sox2,PLL-c-Myc,PLL-Klf4,PLL-UTF1,PLL-Rex1(ZFP42)表达载体的构建
1.pLL-IRES-puro质粒的提取
1)用XbaI和NotI双酶切pLL3.7,然后用T4DNApolymerase补平,用T4DNALigase连接,去掉U6启动子和LoxP,得到pLL3.7-U6-。用N-heI单酶切,回收大片段,并用碱性磷酸酶去磷酸化,得到酶切载体;
2)pIRES(Clontech)用EcoRI单酶切,然后用T4DNApolymerase补平,用T4DNALigase连接,去掉EcoRI位点,得到pIRES-E-,用NheI和XbaI双酶切pIRES-E-,回收700bp片段,得到IRES片段。
3)IRES片段与第1)步得到的酶切载体用T4DNALigase连接,得到pLL-IRES-GFP。BamHI和EcoRI双酶切正确的pLL-IRES-GFP,并回收大片段,得到酶切pLL-IRES载体;
4)用引物5'GTAGGATCCATGACCGAGTACAAGCCC3’(SEQIDNO:52)和5'GATGAATTCAGGCACCGGGCTTGCG3’(SEQIDNO:53),PCR扩增pBabePuro(SearchVectorpedia),得到800bp的PuroPCR片段。用BamHI和EcoRI双酶切PuroPCR片段,回收,得到酶切puro,连接到第3)步的酶切pLL-IRES载体,得到pLL-IRES-Puro。
应用Promega公司的WizardPlusSVMiniprepsDNAPurificationSystem试剂盒提取pLL-IRES-puro质粒,图谱见图1b)。
2.Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc,Klf4,UTF1,Rex1(ZFP42)cDNA的获得
将Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc,Klf4,UTF1,Rex1(ZFP42)基因的cDNA克隆入pGEM-T载体中测序正确后,XhoI+EcoRI双酶切下cDNA片段并克隆入pLL-IRES-puro载体的CMV启动子后。具体如下。
Oct4的ORF:见SEQIDNO:5
Sox2的ORF见SEQIDNO:8
Klf4的ORF见SEQIDNO:11
c-Myc的ORF见SEQIDNO:14)
Utf1的ORF见SEQIDNO:17
Rex1(ZFP42)的ORF见SEQIDNO:20
pLL-Oct4(POU5f1),pLL-Sox2,pLL-c-Myc,pLL-Klf4,pLL-UTF1和pLL-Rex1(ZFP42)重组载体的构建和鉴定
1)酶切和回收
①各基因的酶切和回收
用XhoI和EcoRI双酶切通过连接各基因的cDNA至pGEM-T载体中而获得的重组质粒以回收各基因的cDNA,37℃温育。待确定酶切已完全后,中止反应。使用鼎国公司的DNA快速纯化/回收试剂盒回收各基因大小的片段。
②pLL-IRES-puro质粒的酶切和回收使用XhoI和EcoRI(NEB公司)37℃酶切pLL-IRES-puro质粒。待确定酶切已完全后,中止反应。使用鼎国公司的DNA快速纯化/回收试剂盒回收酶切后的DNA(6.5kb)。
2)连接反应
使用DNALigationKitVer2.0,按照插入的DNA/载体摩尔比3∶1的比例分别吸取适量的DNA在1.5ml管中,反应体系10ul,分别加入:10×buffer1ul,10mMdNTPs0.2ul,T4DNA连接酶0.2ul,适量的无菌水补足至10ul,16℃条件下反应30min。
3)转化和鉴定
如上按照常规方法将连接产物转化到Top10感受态细胞中。后经PCR鉴定和测序分别获得了pLL-Oct4(POU5f1),pLL-Sox2,pLL-c-Myc,pLL-Klf4,pLL-UTF1和pLL-Rex1(ZFP42)重组载体。
实施例3.人成纤维细胞(靶细胞)的获得
1)新鲜的成体包皮组织(HFF)75%乙醇消毒并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤;
2)用眼科剪小心分离出皮下组织并剪碎;
3)再用PBS洗几遍,取小组织块接种于培养皿中,放置于在37℃,5%二氧化碳培养箱中;
4)两个小时后加入DMEM高葡萄糖培养基(购自Hyclone公司,产品目录号为SH30022.01B,其中添加15%的胎牛血清(FBS),0.1mMβ-巯基乙醇,1%非必需氨基酸,1mM谷氨酸盐,8单位/ml庆大霉素);
5)培养2-3天,移去不能贴壁的组织块;
6)继续培养7-9天,移去残余的组织块;
7)0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA室温消化细胞5分钟,用上述DMEM高葡萄糖培养基中和,1∶3接种于新培养皿中;
8)以后每2天换液,每4天1∶3传代。
实施例4.人诱导多潜能干细胞的诱导
1)慢病毒的制备
本实验采用的慢病毒是利用实施例1和2制备的携带了上述各个诱导因子的重组载体,利用购自于Addgene公司的包装质粒pMDLg/pRRE(货号12251)pRSV-Rev(货号12253)和pMD2.G(货号12259)按照常规方法制备。
具体操作方法如下:
EndoFreePlasmidKit(Qiagen)大量制备上述质粒。提取的质粒以2-4ug/ul的浓度冻存于TE中。
包装时四个质粒的比例如下:
包装步骤:
①用含10%胎牛血清的DMEM(购自Hyclone公司,产品目录号为SH30022.01B)传代培养HEK293T细胞(ATCC,产品目录号CRLv-11268),8x106细胞/10cm培养皿,第二天观察细胞,细胞要边界分明,不聚团,不堆积,形成一个单层。细胞内的颗粒少,细胞看起来要饱满,有三到四个突起,突起不能很长。之外则边界曲线圆滑,无细小突起,大概占60-80%,即可进行包装;
②转染前给293T细胞更换新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基;
③包装的液体分为2×HBS,水,2.5MCaCl2,先取出一批1.5ml管,先加入400ul水,再加入50μl的2.5MCaCl2,混匀,再依次加入四个质粒,混匀,根据质粒的总体积调整水的总体积,使终体积为500ul。取相等数量的5ml流式细胞管,每管加入500ul的2×HBS。将1.5ml管里的混合溶液以每秒一滴的速度加入到流式管的2×HBS中,每加入一滴,立即晃匀。混合后,可见溶液呈乳白色,盖上盖后漩涡震荡5-6下彻底混匀,以避免形成很大的磷酸钙沉淀。
④混合液逐滴加入相应293T细胞中;(10-20分钟后可在显微镜下见到磷酸钙沉淀的细小粒)
⑤到12-16个小时后更换新鲜的10%胎牛血清的DMEM培养基;
⑥按照常规方法转染(携带上述各个诱导因子的重组载体分别同pMDLg/pRRE、pRSVREV、pVSVg质粒共转染细胞,以分别包装携带上述各个诱导因子的慢病毒)后24小时确认靶细胞的数量和状态,每份转染使用10cm培养皿的靶细胞,每皿约106个细胞;
⑦转染后44-48小时后收毒;
⑧收毒时用注射器先取出转染后的293T上清(如果上清中有不少293T细胞悬浮,也可以先3000rpm离心10min后再使用注射器),过滤(0.45μM滤器)除去293T细胞,由此获得分别携带上述各个诱导因子的慢病毒;
⑨毒液(毒液的组合使用参见表1中的因子组合)和培养基1∶1混合感染靶细胞(每个10cm培养皿收获的毒液感染一个10cm培养皿的靶细胞;
⑩感染8-12小时后更换10%胎牛血清的DMEM新鲜培养基
感染后48小时按照常规方法检测感染效率。如图2所示,被带有绿色荧光蛋白的病毒感染的细胞占细胞总数的90%以上。
2)慢病毒感染细胞的进一步诱导培养
慢病毒感染的靶细胞继续在DMEM+10%胎牛血清中培养5天。感染后第七天以5×104细胞/10cm培养皿的密度接种于饲养层(feeder)细胞上。
饲养层(feeder)细胞的获得:
①取生长状态良好的贴壁小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast,MEF),弃去MEF培养基(DMEM培养基添加10%胎牛血清),加入含10ug/mL丝裂霉素C的丝裂霉素C工作液;
②在37℃下培养3个小时,培养期间用0.1%明胶处理将要接种MEF细胞的培养皿,室温放置2小时以上(或37℃放置30分钟以上),用前吸掉明胶溶液即可;
③取出MEF细胞,弃去含丝裂霉素C工作液,用PBS洗5遍,以便彻底洗掉残存的丝裂霉素;
④加入胰酶-EDTA(美国Gibco公司)进行消化,然后用MEF培养基终止反应;
⑤1000转/分种离心5分钟,弃上清,用MEF培养基重悬细胞沉淀并计数;
⑥按照1.6×105个细胞/3.5cm培养皿的密度将经上述步骤处理的MEF细胞接种至包被有0.1%明胶的培养皿中,置于37℃培养箱中培养12-24小时,得到用于培养人胚胎干细胞的饲养层。
靶细胞传至饲养层细胞后第二天换人胚胎干细胞培养基。配方如下20%血清替代物(Knock-outSemmReplacement,KSR,Gibico),1mM谷氨酰胺,0.1mMβ-巯基乙醇,1%非必需氨基酸(美国Gibco公司),4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),用ddH2O定容至1000mL。
继续培养,每两天换液。感染后20天可用AlkalinePhosphataseDetectionKit(Chemicon)检测被感染细胞的碱性磷酸酶(AP)的表达情况。结果如图3所示为各个携带诱导因子的慢病毒感染成纤维细胞20天后的AP阳性克隆,a)为:成人包皮成纤维(HFF),靶细胞数为2×105,AP+且类似胚胎干细胞克隆数为181。
从剩余的细胞中挑取AP表达阳性(即AP+)且形态类似人胚胎干细胞的克隆传至新的饲养层细胞上。随后按照人胚胎干细胞的常规培养方法继续培养传代:
1)加入或1mg/mL胶原酶IV(Gibco),置于37℃培养箱中孵育10-15分钟,然后取出细胞在相差显微镜下观察,若克隆边缘出现卷边,则可终止消化;否则放回培养箱,延长消化时间,但要随时取出观察,以防止因消化过度导致克隆脱落;
4)消化结束后,吸掉Dispase或胶原酶IV,用PBS和DMEM/F12培养基(Gibco,货号11330-032)分别洗一遍后,加入适量DMEM/F12(2mL/3.5cm培养皿);
5)用无菌直头或弯头玻璃滴管轻柔地将细胞克隆从培养皿底部刮下,并转移至无菌的15mL锥形底离心管中,用滴管温和地吹吸若干次,使细胞克隆变成大小较为均一小的细胞团;
6)1000rpm离心3-4分钟,小心吸掉上清,用玻璃滴管吸新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬沉淀;
7)取出上述获得的MEF饲养层细胞,用PBS洗三遍,将上述细胞的小团块接种于MEF饲养层细胞上,置于37℃细胞培养箱中培养12-24小时,细胞贴壁后可更换新鲜的HESM培养基。每天更换一次培养基,通常5-7天传代一次。若出现以下情况之一时则需及时进行传代:(1)MEF饲养层的放置时间达到两周;(2)细胞克隆过于致密或面积过大;(3)细胞出现明显的自发分化。
实施例5.诱导多潜能干细胞全能性的鉴定
1).碱性磷酸酶(AP)染色及免疫组化染色检测干性基因的表达
碱性磷酸酶的存在是胚胎干细胞保持未分化状态的一个重要指标,通过检测其的存在与否,可进一步判定胚胎干细胞。胚胎干细胞中含有丰富的碱性磷酸酶(AP),而已分化的胚胎干细胞AP呈弱阳性或阴性。
按照制造商的说明,用AlkalinePhosphataseDetectionKit(Chemicon)检测诱导的多潜能干细胞的碱性磷酸酶(AP)的表达。
为进一步检测用本发明诱导方法获得的细胞是否真的像形态上所表现出来的一样保持了细胞的未分化状态,使用细胞免疫荧光染色的方法进一步检测9代的IPS细胞内源性干性基因Nanog和SSEA4基因(SSEA4基因是胚胎干细胞表面的独特标记)的表达情况,具体方法包括以下步骤:
1)取出细胞,弃培养基,用PBS洗两遍;
2)加入4%的多聚甲醛室温固定15分钟,或加入无水甲醇室温固定5-10分钟;
3)用PBS洗三遍,每遍5分钟;
4)用PBST(含0.2%TritonX100(体积百分比)的PBS溶液)溶液进行透化,室温放置10分钟;
5)用PBS洗一遍,5分钟;
6)加入含2-3%山羊血清或马血清的PBST,室温封闭30-60分钟;
7)弃封闭液,加入一抗(兔抗-Oct4、鼠抗-Tra-1-81,美国Chemicon公司)(按1∶50-200用封闭液(含2-3%山羊血清或马血清的PBST)稀释),4℃放置12-24小时(或37℃孵育2小时);
8)用PBS洗三遍,每遍5分钟;
9)加入二抗(罗丹明标记山羊抗-兔IgG、罗丹明标记兔抗-鼠IgG,中国中山生物技术有限公司)(按1∶50-150比例稀释于二抗稀释液(称取0.1g牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA),溶于100mL的PBS中,即为0.1%的BSA溶液))中,37℃避光放置1小时;
10)用PBS洗三遍,每遍5分钟;
11)加入终浓度为1mg/mL的DAPI溶液(美国Roche公司),室温放置5分钟;
12)用PBS洗三遍,每遍5分钟;
13)加入500ulPBS(或PBS∶甘油(1∶1)),在荧光显微镜下观察拍照。
结果如图4c)-f)所示。用我们的方法诱导出来的IPS细胞拥有和胚胎干细胞一样可以检测到表面标志SSEA4的表达,及胚胎干细胞关键内源转录因子nanog的表达。
2).RT-PCR检测干性基因的表达
对诱导的IPS细胞的干性基因的表达情况进行RT-PCR检测,具体方法包括以下步骤:
1)用Trizol法提取培养细胞的RNA;
2)RNA的反转录:使用Promega公司的反转录试剂盒并按说明书进行操作反转录合成其cDNA;
3)多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR):以步骤2)获得的cDNA为模板,在上游引物P3、下游引物P4(见下文)的引导下进行PCR检测。PCR反应条件为:先94℃5min;然后94℃40sec,53-62℃40sec,72℃30-60sec,共35个循环;最后72℃10min。反应结束后,对PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。
检测用引物如下:
内源基因:
Oct4:5′GAACCGAGTGAGAGGCAACC3′(SEQIDNO:22)和5′ATCCCAAAAACCCTGGCACA3′(SEQIDNO:23)
Sox2:5′ATGGGTTCGGTGGTCAAGTC3′(SEQIDNO:24)和5′CCCTCCCATTTCCCTCGTTT3′(SEQIDNO:25)
Nanog:5′TGGAACAGTCCCTTCTATAA3′(SEQIDNO:26)和5′CTGATTAGGCTCCAACCATA3′(SEQIDNO:27)
外源基因:
KlF4:5′ACCACTGTGACTGGGACG3′(SEQIDNO:28)和5′GCAGCGTATCCACATAGCGT3′(SEQIDNO:29)
Myc:5′TACATCCTGTCCGTCCAAGC3′(SEQIDNO:30)和5′GCAGCGTATCCACATAGCGT3′(SEQIDNO:31)
Rex1:5′TCATTCATGGTCCCCGAGA3′(SEQIDNO:32)和5′GCAGCGTATCCACATAGCGT3′(SEQIDNO:33)
Utf1:5’GACCAGCTGCTGACCTTGA(SEQDNO:34)3’和5′GCAGCGTATCCACATAGCGT3′(SEQIDNO:35)
用于扩增胚胎干细胞中特有基因的引物:
p53:5′CAGCCAAGTCTGTGACTTGCACGTAC3′(SEQIDNO:36)和5′CTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATC3′(SEQIDNO:37)
Lin28:5′GGGCATCTGTAAGTGGTT3′(SEQIDNO:38)和5′GTAGGGCTGTGGATTTCT3′(SEQIDNO:39)
Gdf3:5′CCCGAGACTTATGCTACG3′(SEQIDNO:40)和5′TCCAGGAATAACCCGAAA3′(SFQIDNO;41)
Hesx1:5′AAACCCTCAACTTGCTCC3′(SFQIDNO:42)和5′TTGGTCTTCGGCCTCTAT3′(SEQIDNO;43)
Tdgf1:5′TCAGGAATTTGCTCGTCC3′(SEQIDNO;44)和5′CTTGGGCAGCCAGGTGT3′(SFQIDNO:45)
Mbd2:5′ATCTGGGCTAAGTGCTGG3′(SFQIDNO:46)和5′AAGCTGGGTCTTGGATGA3′(SEQIDNO:47)
Fgf4:5′GCGGCTCTACTGCAACGT3′(SEQIDNO:48)和5′CCTTCTTGGTCTTCCCATTC3′(SEQIDNO:49)
Gapdh:5′AATCCCATCACCATCTTCC3′(SEQIDNO:50)和5′CATCACGCCACAGTTTCC3′(SEQIDNO:51)
3)胚胎小体(EB)的形成及分化:
为了进一步评价用本发明的诱导方法获得的IPS细胞的性质,现检测所获得的IPS细胞的全能性。对诱导的IPS细胞进行体外诱导胚胎小体(EB)的形成及分化,具体方法包括以下步骤:
(1)取出要诱导分化的IPS细胞,弃培养基,用PBS洗一遍;
(2)加入Dispase,置于37℃培养箱中消化,消化时间应比传代时有所延长,令胚胎干细胞克隆容易脱落;
(3)取出细胞,用无菌玻璃滴管轻轻吹打,使所有克隆脱离培养皿底;
(4)将细胞团转移至无菌15mL锥底离心管中,1000rpm离心3分钟;
(5)弃上清,用分化培养基(胎牛血清150mL,谷氨酰胺0.146g,β-巯基乙醇50μl,非必需氨基酸10mL,用DMEM/F12定容至1000mL)轻轻重悬;
(6)将细胞团接种于低贴附能力的Petri-dish培养皿中(因为EB在悬浮培养条件下容易形成),放回37℃培养箱中;
(7)每隔一天更换一次培养基,一般在4-5天后就能看到典型的近似圆球样的EB,培养时间根据需要而定,时间越长,EB中的细胞分化程度越高。
胚胎小体的观测结果见图6中(放大倍数:×100),结果诱导的IPS细胞在分化培养基中均可以形成胚胎小体(EB)。EB形成7天以后,再使其贴壁继续分化7天,方法为:收集培养了分化一定天数后的EB,将其接种于经过fibronectin(5ng/μl,Sigma)包被的培养皿中促进EB的贴壁,仍然使用分化培养基,每隔一天更换一次,能够逐渐观察到从EB周围生长出不同形态的分化细胞类型。结果如图6所示。
然后用免疫荧光方法(具体方法同实施例5)检测其三个胚层(外胚层,中胚层和内胚层)的基因Nestin,T和AFP基因,结果见图7。
通过上述实验,我们统计了上述诱导因子Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc,Klf4,UTF1,Rex1(ZFP42)及p53si组合所产生的AP阳性、类似于胚胎干细胞的克隆数,见表1。
能产生人IPS的诱导因子组合的探索
综上所述,我们利用慢病毒载体转导Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc,Klf4,UTF1,Rex1(ZFP42)等6个基因的全长cDNA及p53基因抑制剂的方法,实现了高效制备人诱导全能干细胞。
为了进一步揭示我们发现的3个因子(Klf4,UTF1,Rex1)能否替代原有四个因子(Oct4,Sox2,c-Myc,Klf4)的功能,我们按照表1开展了进一步的实验。发现Utf1能替代Oct4行使功能,同时p53干涉也能替代Klf4的功能。
表1:各诱导因子组合产生AP+且类似胚胎干细胞克隆计数统计表(每105靶细胞)
注:O(Oct4),S(Sox2),M(c-Myc),K(Klf4),P(P53si),U(Utf1),R(Rex1),所产生的IPS细胞克隆形态及鉴定同实施例5,故省略。
由表格统计可看出,在OSMK的基础上加入U,R,P中的任何一个因子均可提高AP阳性且类似胚胎干细胞的集落形成率,揭示U,R,P因子对于IPS细胞形成的促进作用;以OSMKPUR为基础分别减去U,R,P中的任何一个,均可明显降低形成率,提示U,R,P对于IPS细胞形成的促进作用;此外,P可以取代已报导的K,U可以取代已报导的O以行使诱导产生IPS细胞的功能。
同时,我们进行了诱导猴(恒河猴,rhesusmacaque)诱导IPS细胞的探索,即取猴耳部皮肤的成纤维细胞,按照上述实施例的程序诱导产生了IPS细胞。,所产生的IPS细胞克隆形态及鉴定同实施例5,故省略。结果:4因子(OSMK)产生的AP阳性克隆约为10/20000,没有类似胚胎干细胞克隆,而7因子(OSMKPUR)所产生的AP阳性克隆约为200/20000,类似胚胎干细胞克隆约为20个/20000。
虽然在具体的实施过程中采用了人或猴的成纤维细胞,但本领域的普通技术人员可以理解,上述实验完全可以用于哺乳动物,包括鼠,来实现本发明的目的。
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cccccatgccccccgccgtatgagttctgtggggggatggcgtactgtgggccccaggtt240
ggagtggggctagtgccccaaggcggcttggagacctctcagcctgagggcgaagcagga300
gtcggggtggagagcaactccgatggggcctccccggagccctgcaccgtcacccctggt360
gccgtgaagctggagaaggagaagctggagcaaaacccggaggagtcccaggacatcaaa420
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Claims (15)
1.选自诱导因子p53基因抑制剂,UTF1和Rex1(ZFP42)的至少一种联合诱导因子Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc和K1f4用于诱导多潜能干细胞产生的用途,其中所述多潜能干细胞诱导自人成纤维细胞。
2.选自诱导因子p53基因抑制剂,UTF1和Rex1(ZFP42)的至少一种联合诱导因子Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc和K1f4用于促进诱导产生多能性干细胞的效率的用途,其中所述多潜能干细胞诱导自人成纤维细胞。
3.一种制备诱导多潜能干细胞的方法,包括向分化的细胞中提供诱导因子,所述诱导因子包括p53基因抑制剂,UTF1和Rex1(ZFP42)的至少一种,联合Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc和K1f4,其中所述分化的细胞是人成纤维细胞。
4.权利要求3的方法,其中所述诱导因子不包括Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc和K1f4中的一种。
5.权利要求4的方法,其中诱导因子包括UTF1时不包括Oct4;诱导因子包括p53si时不包括KLF4。
6.权利要求5的方法,其中诱导因子不包括c-Myc。
7.权利要求3-6任一项的方法,其中所述诱导因子为DNA形式,mRNA形式或蛋白质形式。
8.一种制备诱导多潜能干细胞的试剂盒,包括向分化的细胞中提供诱导因子,所述诱导因子包括p53基因抑制剂,UTF1和Rex1(ZFP42)的至少一种,联合Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc和K1f4,所述多潜能干细胞诱导自人成纤维细胞。
9.权利要求8的试剂盒,其中诱导因子不包括Oct4(POU5f1),Sox2,c-Myc和K1f4中的一种。
10.权利要求9的试剂盒,其中诱导因子为UTF1时不包括Oct4;诱导因子为p53si时不包括KLF4。
11.权利要求10的试剂盒,其中所述诱导因子不包括c-Myc。
12.权利要求8-11任一项的试剂盒,其中所述诱导因子为DNA形式,mRNA形式或蛋白质形式。
13.权利要求8-11任一项的试剂盒,其中当所述诱导因子是DNA形式时,所述试剂盒还包括用于将诱导因子转染到分化细胞中的病毒载体。
14.权利要求13的试剂盒,其中所述病毒载体选自慢病毒载体,逆转录病毒载体或腺病毒载体。
15.权利要求3-6任一项的方法或权利要求8-14任一项的试剂盒制备的多潜能干细胞。
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