CN1571844A - 利用vsv-g假型化猴免疫缺陷病毒载体将基因导入灵长类胚胎干细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明利用被VSV-G蛋白假型化的猴免疫缺陷病毒载体(SIV),成功地将基因高效导入灵长类胚胎干细胞,其中所述VSV-G蛋白为水泡性口炎病毒(VSV)的表面糖蛋白。本发明提供用于将基因导入灵长类胚胎干细胞的猴免疫缺陷病毒载体。用上述载体介导的灵长类胚胎干细胞基因导入可以用于灵长类的胚胎学研究、疾病研究、临床应用和实验模型等,另外,可用于从胚胎干细胞获得所需的分化细胞或分化组织,也可以用于分析和筛选使组织或细胞特异性分化的基因或试剂。
Description
技术领域
本发明涉及用于将基因导入灵长类胚胎干细胞的猴免疫缺陷病毒载体。
背景技术
胚胎干细胞(以下称为ES细胞)是具有自主复制能力的多能性未分化细胞。已知在受伤后ES细胞具有组织修复能力,因此,ES细胞可以用于筛选各种疾病的治疗物质和再生医疗领域,目前被广泛研究。与小鼠ES细胞相比,猴ES细胞更接近于人的ES细胞,因此有望适用于人的疾病模型。
ES细胞的遗传工程对其将来应用于各种疾病和损伤的治疗极其重要。为了改变ES细胞的增殖能力或分化能力等特性,或药物敏感性,往往需要对ES细胞的基因组进行稳定的基因导入。为了实现稳定的基因导入,一般采用整合到宿主基因组的逆转录病毒载体,这是因为当以ES细胞等反复进行增殖和分化的细胞为靶时,如果导入基因不整合到基因组中,则载体会随每个细胞的分裂而被稀释。来自Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)的逆转录病毒载体以往被广泛用于基因导入,但是,在对小鼠ES细胞的基因导入中效率低下(约为百分之几),并且基因表达随时间而减弱。最近,用来自小鼠干细胞病毒(MSCV)的逆转录病毒载体对小鼠ES细胞进行基因导入,其导入效率得到改善(50%以上),但基因表达随时间而减弱的问题仍未得到解决(Cherry,S.R.等,Mol.Cell Biol.20:7419,2000)。最近有报告表明,采用整合到基因组中的另一个载体——慢病毒载体可以更高效地(80%以上)将基因导入小鼠ES细胞(Hamaguchi,I.等,J.Virol.74:10778,2000),但在该报告中,对导入基因的表达只进行了数天~约两周的短时间观察,也没有任何有关导入基因长期表达的记载。
上述对ES细胞进行基因导入的报告中,都采用了小鼠ES细胞。至今尚无关于将基因导入灵长类ES细胞的报告文献,只有学术会议上的报告指出灵长类ES细胞的基因导入比小鼠ES细胞的基因导入更困难。例如,用MoMLV载体时灵长类ES细胞的基因导入效率为1%左右,用MSCV载体时为5~10%左右(IMSUT Symposium for Stem Cell Biology,Tokyo,Japan2000;Key Stone Sympoia,Pluripotent Stem Cells:Biology and Applications,Durango,Colorado,USA,2001)。
发明内容
本发明的目的是提供用于灵长类ES细胞基因导入的猴免疫缺陷病毒载体。本发明载体介导的灵长类ES细胞基因导入可以用于人等灵长类的胚胎学研究、疾病研究、临床应用和实验模型等。另外,该方法还可以用于分析或筛选用于进行组织或细胞特异性分化的基因或试剂,所述特异性分化对从ES细胞获得所需的分化细胞或分化组织有用。
本发明人研究开发了一种可以将基因导入灵长类ES细胞的载体。为了建立一种通过该载体高效地将外源基因导入灵长类ES细胞的方法,对猴免疫缺陷病毒(SIV)载体进行了悉心研究。结果发现,用VSV-G蛋白假型化的SIV载体具有明显高效地将基因导入灵长类ES细胞的能力,其中VSV-G蛋白是水泡性口炎病毒(VSV)的表面糖蛋白。VSV-G假型化SIV载体对猴ES细胞的基因导入效率比小鼠ES细胞高数倍~10倍以上(图8)。SIV载体介导的ES细胞转导效率随感染复数(MOI)增加,当MOI很高时,基因被导入到几乎所有的ES细胞(图5)。将一种包含连接在CMV启动子下游的报告基因的SIV载体导入Cynomolgus猴的ES细胞,在较长的一段时间内,所导入的基因稳定表达,即使是两个月后表达水平也基本没有下降(图6)。
因此,本发明人研究开发了可以将基因导入灵长类ES细胞的假型化SIV载体,并且成功建立了一种用该载体将基因导入灵长类ES细胞的方法。本发明涉及用于灵长类ES细胞基因导入的猴免疫缺陷病毒载体,更具体地,本发明涉及:
(1)用于将基因导入灵长类胚胎干细胞的重组猴免疫缺陷病毒载体,该载体被VSV-G假型化;
(2)如(1)所述的载体,其中重组猴免疫缺陷病毒载体来自agm株;
(3)如(1)或(2)所述的载体,其中重组猴免疫缺陷病毒载体为自我失活型;
(4)如(1)~(3)中任意一项所述的载体,其中灵长类为旧世界灵长类猕猴科猕猴属;
(5)如(1)~(4)中任意一项所述的载体,其带有可以表达的外源基因;
(6)如(5)所述的载体,其中外源基因为编码选自绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶和萤光素酶的蛋白质的基因;
(7)将基因导入灵长类胚胎干细胞的方法,其包括使(1)~(6)中任意一项所述的重组猴免疫缺陷病毒载体与灵长类胚胎干细胞接触的步骤;
(8)导入了(1)~(6)中任意一项所述的重组猴免疫缺陷病毒载体的灵长类胚胎干细胞;
(9)由(8)所述的灵长类胚胎干细胞增殖和/或分化生成的细胞;
(10)一种检测基因导入对ES细胞增殖和/或分化的效果的方法,该方法包括:(a)将(1)~(6)中任意一项所述的重组猴免疫缺陷病毒载体导入灵长类胚胎干细胞的步骤;(b)检测该胚胎干细胞的增殖或分化的步骤。
本发明中“病毒载体”是指能够将核酸分子导入宿主的病毒粒子。“猴免疫缺陷病毒(SIV)载体”是指具有SIV骨架的载体。“具有SIV骨架”是指构成该载体的病毒粒子中包含的核酸分子以SIV基因组为基础。例如,当病毒粒子中的核酸分子包含来自SIV基因组的包装信号序列时,这样的载体包括在本发明的SIV病毒载体之内。本发明中,猴免疫缺陷病毒(SIV)包括所有的SIV株及其亚型。SIV分离株包括但不限于SIVagm、SIVcpz、SIVmac、SIVmnd、SIVsm、SIVsnm和SIVsyk。“重组”病毒载体是指利用基因重组技术构建的病毒载体。用编码病毒基因组的DNA和包装细胞构建的病毒载体包括在重组病毒载体之内。
“VSV-G假型化载体”是指包含VSV-G蛋白的载体,VSV-G蛋白是水泡性口炎病毒(VSV)的表面糖蛋白。VSV-G蛋白可以是来自任何VSV株的蛋白,例如可以用来自Indiana血清型株(J.Virology 39:519-528(1981))的VSV-G蛋白,但不限于此。另外,VSV-G蛋白也可以是天然蛋白质通过一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加等得到的修饰物。VSV-G假型化载体可以通过在病毒产生时使VSV-G蛋白与之共存来制备。例如,通过VSV-G表达载体的转染,或通过诱导整合到宿主染色体DNA中的VSV-G基因的表达,使包装细胞内的VSV-G表达,由此使包装细胞产生的病毒粒子用VSV-G假型化。VSV-G蛋白以稳定的糖蛋白同型三聚体的形式存在于膜上,因此,在纯化过程中载体粒子不容易被破坏,可以通过离心浓缩成高浓度(Yang,Y.等,Hum Gene Ther:Sep,6(9),1203-13.1995)。
本发明的假型化逆转录病毒载体还可以包括来自其它病毒的包膜蛋白。例如,来自感染人细胞的病毒的包膜蛋白适于用作这种蛋白。这样的蛋白质包括但不限于兼嗜性逆转录病毒包膜蛋白。作为兼嗜性逆转录病毒包膜蛋白,可以用例如来自小鼠白血病病毒(MuLV)4070A株的包膜蛋白,也可以用来自MuMLV 10A1的包膜蛋白(例如pCL-10A1(Imgenex)(Naviaux,R.K.等,J.Virol.70:5701-5705(1996))。另外,还包括来自疱疹病毒科的蛋白,例如单纯疱疹病毒的gB、gD、gH和gp85蛋白和EB病毒的gp350和gp220蛋白等;嗜肝DNA病毒科的蛋白,包括例如乙型肝炎病毒的S蛋白等。
猴免疫缺陷病毒作为猴的HIV样病毒被发现,与HIV一起构成灵长类慢病毒组(E.Ido和M.Hayamizu,“Gene,Infection and Pathogenicity of SimianImmunodeficiency Virus”,Protein,Nucleic acid and Enzyme,Vol.39,No.8,1994)。该组进一步被大致分为4个亚组:(1)HIV-1组,包括HIV-1和从黑猩猩分离的SIVcpz,其中HIV-1是人获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的原因;(2)HIV-2组,包括:从白领白眉猴(Sooty Mangabeys,Cercocebus atys)分离的SIVsmm和从猕猴(Macaca mulatta)分离的SIVmac,以及对人致病性较低的HIV-2(Jaffar,S.等,J.Acquir.Immune Defic.Syndr.Hum.Retrovirol.,16(5),327-32,1997);(3)SIVagm组,以从非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)分离的SIVagm为代表;和(4)SIVmnd组,以从山魈(Papio sphinx)分离的SIVmnd为代表。
迄今无人报道SIVagm和SIVmnd在自然宿主中的致病性(Ohta,Y.等,Int.J.Cancer,15,41(1),115-22,1988;Miura,T.等,J.Med.Primatol.,18(3-4),255-9,1989;M.Hayamizu,Nippon Rinsho,47,1,1989)。更具体地,有关感染实验的报道提示,SIVagm病毒的TYO-1株(本发明实施例中也用到它)除了对其天然宿主不具有致病性以外,对食蟹猴(Macaca facicularis)和猕猴(Macaca mulatta)也不表现致病性(Ali,M.等,Gene Therapy,1(6),367-84,1994;Honjo,S等J.Med.Primatol.,19(1),9-20,1990)。尚没有任何有关SIVagm对人感染和致病的报告,因此不清楚其致病性,但一般说来,灵长类慢病毒的种特异性高,从自然宿主跨种感染或致病的例子很少,有发病率低、疾病进展慢的倾向(Novembre,F.J.等,J.Virol.,71(5),4086-91,1997)。因此,认为以SIVagm、特别是SIVagm TYO-1株为基础制备的病毒载体比以HIV-1或其它慢病毒为基础制备的载体安全性高,优选用于本发明。
本发明的猴免疫缺陷病毒载体可以包含来自其它慢病毒的部分基因组RNA序列。例如,本发明的猴免疫缺陷病毒载体还包括含有嵌合序列的载体,所述嵌合序列是用人免疫缺陷病毒(HIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)(Poeschla,E.M.等,Nature Medicine,4(3),354-7,1998)或山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)(Mselli-Lakhal,L.等,Arch.Virol.,143(4),681-95,1998)等其它慢病毒的部分基因组序列取代猴免疫缺陷病毒的部分基因组而形成的。
本发明的逆转录病毒载体中,长末端重复序列(LTR)也可以被修饰。LTR是逆转录病毒的特征序列,存在于病毒基因组的两端。5’LTR起启动子的作用,促进原病毒mRNA的转录。因此,如果将基因转移载体中具有5’LTR启动子活性的部分用其它活性更强的启动子取代,则有可能增大基因转移载体的mRNA转录量,提高包装效率和载体滴度,其中所述基因转移载体编码包装在病毒粒子内的病毒RNA基因组。进一步地,例如当为慢病毒时,已知病毒蛋白tat增强5’LTR的转录活性,因此,用不依赖于tat蛋白的启动子取代5’LTR可以从包装载体删除tat。感染细胞或侵入到细胞内的病毒RNA在逆转录后,将两端的LTR连接成环状结构,连接部位与病毒整合酶结合,然后整合到细胞染色体内。被转录的原病毒mRNA是从5’LTR转录起始点到下游的3’LTR polyA序列,5’LTR启动子部分没有包装到病毒内。因此,即使启动子被其它序列取代,整合到靶细胞染色体中的部分不会发生变化。基于以上事实,认为5’LTR启动子的取代与制备安全性高的高滴度载体有关。因此,基因转移载体5’末端启动子的取代可以提高被包装载体的滴度。
另外,通过部分删除3’LTR序列制备自我失活型载体(SIN载体),可以防止全长载体mRNA在靶细胞中转录,从而提高安全性。侵入到靶细胞染色体的慢病毒原病毒将其5’末端结合到3’LTR的U3部分。因此,在逆转录后,基因转移载体的转录产物整合到靶细胞的染色体中,使U3部分处于5’末端。从此点开始RNA的转录,该RNA的结构与基因转移载体的转录产物相似。如果靶细胞内存在慢病毒或相关蛋白,被转录的RNA可能被重新包装并感染其它细胞。另外,还有一种可能就是3’LTR启动子可能表达位于病毒基因组3’末端的宿主基因(Rosenberg,N.,Jolicoeur,P.,RetroviralPathogenesis.Retroviruses.Cold Spring Harbor Laboratory Press,475-585,1997)。这种现象已被视为逆转录病毒载体的一个问题,目前已经开发出SIN载体以避免此类问题(Yu,S.F.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83(10),3194-8,1986)。当基因转移载体上3’LTR的U3部分缺失时,靶细胞内没有5’LTR和3’LTR的启动子,因此全长RNA和宿主基因不进行转录。并且,由于只从内部启动子转录目的基因,有望获得安全性高并且能够高表达的载体。这样的载体在本发明中是优选的。SIN载体可以通过公知的方法或实施例1~4的方法构建。
利用逆转录病毒载体等在基因组中包含LTR序列的病毒载体进行基因治疗的问题之一是导入基因的表达逐渐降低,其中一个原因是这些载体整合到宿主基因组后,宿主机制使LTR发生甲基化,抑制导入基因的表达(Challita,P.M.and Kohn,D.B.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2567,1994)。自我失活型(SIN型)载体在整合到宿主基因组后失去大部分的LTR序列,因此有难于出现因LTR甲基化而导致基因表达减弱的优点。根据实施例可知,将基因转移载体中的3’LTRU3区域用其它启动子序列取代而制备的自我失活型载体在导入灵长类ES细胞后能持续稳定表达两个月以上。因此,通过修饰LTR U3区域而设计成自我失活型的SIN载体特别适用于本发明。具体地,通过取代、缺失和/或添加3’LTR U3区域的一个或多个核苷酸而被修饰的载体包含在本发明的范围内。可以单纯地缺失U3区域,或者在该区域插入其它的启动子。该启动子包括例如CMV启动子、EF1启动子和CAG启动子等。
另外,本发明载体编码的外源基因优选设计成可以通过LTR以外的启动子转录。例如,如上所述,将LTR U3区域用非LTR启动子取代时,优选该修饰的LTR驱动外源基因的表达。或者,如实施例中所述,通过在LTR区域以外的位置设置非LTR启动子,并在该位置的下游连接外源基因,可以不依赖于LTR而诱导外源基因的表达。本发明中,构建成通过非LIR启动子驱动外源基因表达的SIV载体在ES细胞中长时间稳定地表达该外源基因。因此,在外源基因上游连接非LTR启动子、使该外源基因通过该启动子进行转录,这样的载体特别适用于本发明。非LTR启动子包括例如CMV启动子、EF1启动子和CAG启动子,特别优选CMV启动子。这样的载体特别是当以上述自我失活(SIN)型载体为基础构建时其效率很高。
有人指出,HIV载体为代表的慢病毒载体的危险性在于,如果宿主基因组已经带有HIV原病毒,外来载体与内源性原病毒之间会发生重组,从而产生可复制的病毒。这可能是将来在实际中将HIV载体用于HIV患者时的一大问题。本发明使用的SIV载体基本上没有与HIV同源的序列,并且其中80.6%的病毒序列已被去除,因此是不能复制的病毒,上述危险性小,与其它慢病毒载体相比安全性高。本发明的SIV载体为优选去除40%以上、更优选50%以上、进一步优选60%以上、再进一步优选70%以上、最优选80%以上原SIV基因组序列的不能复制的病毒。
逆转录病毒可以如下产生:在宿主细胞中转录具有包装信号的基因转移载体DNA,在gag、pol蛋白和包膜蛋白的存在下形成病毒粒子。基因转移载体DNA编码的包装信号序列优选具有足够的长度以保持由该序列形成的结构。另一方面,为了抑制野生型病毒的出现频率,必须将这些载体之间的重叠序列保持在最小限度,所述野生型表达由该载体DNA上的包装信号与提供gag和pol蛋白的包装载体之间的重组引起。因此,在构建基因转移载体DNA时,为了同时确保包装效率和安全性,优选使用尽可能短而又包含包装所必需的序列的序列。
例如,实施例中所用的来自SIVagm的包装载体,由于HIV载体没有被包装,因此所用信号的来源不限于SIV。但是,当采用来自HIV的包装载体时,来自SIV的基因转移载体也被包装,因此,为了降低重组病毒的出现频率,可以将来自不同慢病毒的基因转移载体和包装载体重组形成载体粒子。这样制备的SIV载体也包括在本发明范围之内。在这种情况下,优选用灵长类慢病毒之间的重组(例如HIV和SIV)。
在基因转移载体DNA中,优选修饰gag蛋白使其不能表达。病毒gag蛋白可能被机体视为异物而表现出抗原性,还可能影响细胞的机能。为了使gag蛋白不表达,可以进行如下修饰:在gag起始密码子的下游添加或缺失碱基,由此导致移码。优选缺失gag蛋白的部分编码区。一般来说,gag蛋白5’端的编码区对病毒包装是必需的。因此,在基因转移载体中优选缺失gag蛋白C末端的编码区。在不给包装效率造成很大影响的范围内,优选缺失尽可能大的gag编码区。另外,还优选将gag蛋白的起始密码子(ATG)用ATG以外的密码子进行取代。取代密码子可以适当选择对包装效率影响小的密码子。将按照上述方法构建的带有包装信号的基因转移载体DNA导入适当的包装细胞中,由此可以产生病毒载体。产生的病毒载体可以从例如包装细胞的培养上清中回收。
对用作包装细胞的细胞没有特殊限制,只要是通常用于产生病毒的细胞株即可。从用于人基因治疗的方面考虑,认为来自人和猴的细胞合适。可以用作包装细胞的人细胞株包括例如293细胞、293T细胞、293EBNA细胞、SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞和TE671细胞等;猴细胞株包括例如COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞和BMT10细胞等。
对插入载体中的外源基因的种类没有特别限制,可以是编码蛋白质的核酸,也可以是反义核酸和核酶等不编码蛋白质的核酸。该基因可以是天然或人工设计的序列。人工蛋白质包括例如与其它蛋白质的融合蛋白、显性阴性蛋白(包括可溶性受体分子和膜结合型显性阴性受体)、缺失型细胞粘附分子和可溶性细胞表面分子等。另外,外源基因也可以是用于评价基因导入效率和表达稳定性等的标记基因。标记基因包括例如编码绿色荧光蛋白(以下称为“GFP”)、β-半乳糖苷酶和萤光素酶等的基因,特别优选编码GFP的基因。
本发明的假型化病毒载体可以被基本上纯化。纯化可以通过过滤器过滤、离心分离和柱提纯等公知的纯化、分离方法进行。例如,将载体溶液用0.45μm的过滤器过滤后,在42500×g、4℃的条件下离心90分钟,由此沉淀、浓缩载体。
本发明的假型化逆转录病毒载体可以根据需要适当与所需的可药用载体或介质组合制成组合物。“可药用载体”是指可以与载体一起施用并且不明显阻碍载体介导的基因转移的材料。具体地,可以适当与例如灭菌水、生理盐水、培养液、血清和磷酸缓冲生理盐水(PBS)等组合,还可以与稳定剂、杀菌剂等组合。含有本发明假型化逆转录病毒载体的组合物可以用作试剂或药物,例如可以将本发明的组合物用作ES基因导入试剂或基因治疗药物。
使本发明的载体与灵长类(包括人)的ES细胞接触,由此可以将包含该载体的核酸导入所述ES细胞中。本发明涉及将基因导入灵长类ES细胞的方法,该方法包括使本发明载体与所述ES细胞接触的步骤。另外,本发明涉及经VSV-G假型化的重组猴免疫缺陷病毒载体在灵长类ES细胞基因转移中的用途。对作为导入对象的灵长类ES细胞没有特别限制,可以采用例如所需的猴ES细胞。已知世界上大约有200种猴,高等灵长类大致分为以下两类:
(1)新世界灵长类(New World primates)
狨猴(Callithrix jacchus)是公知的实验用灵长类之一。新世界灵长类的胚胎和胎盘结构与旧世界灵长类不同,但两者的发育基本上类似。
(2)旧世界灵长类(Old World Primates)
旧世界灵长类是与人极其近缘的灵长类,已知有猕猴(Macaca mulatta)和cynomolgus猴(食蟹猴Macaca fascicularis)。日本猴(Macaca fuscata)与cynomolgus猴同属(猕猴属)。旧世界灵长类的发育与人极其相似。
本发明中的“猴”是指灵长类,具体指新世界灵长类和旧世界灵长类。对用本发明载体进行基因导入的导入对象——猴ES细胞没有特别限制,包括狨猴ES细胞(Thomson,J.A.等,Biol.Reprod.55,254-259,(1996))、猕猴ES细胞(Thomson,J.A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92,7844-7848,(1995))和cynomolgus猴ES细胞(参见实施例)等。旧世界灵长类是与人极其近缘的灵长类,并且其发育与人类似,因此有望用作与人接近的疾病模型或多种疾病治疗剂的筛选系统。因此,作为本发明载体的导入对象,优选来自旧世界灵长类,特别优选来自日本猴、猕猴和cynomolgus猴等猕猴属猴的ES细胞。
灵长类ES细胞的制备可以按照公知的方法或实施例中的方法进行。例如,可以从发育的胚泡获取ES细胞(参照例如WO 96/22362)。具体地,例如可将从胚泡获得的内细胞团(inner cell mass)在饲养细胞上培养或用白血病抑制因子(LIF,也称作分化抑制因子(DIF))进行培养,由此建立ES细胞。
饲养细胞包括来自妊娠12~16天的小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养细胞、将小鼠胚胎成纤维细胞株例如STO细胞等通过丝裂霉素C或X射线处理所得的细胞等。来自小鼠的饲养细胞可以大量地制备,这有利于实验。饲养细胞可以通过例如后述实施例中记载的方法等制备。用MEM培养基(Minimum Essential Medium Eagle)将饲养细胞接种到被明胶覆盖的培养容器上。可以使饲养细胞在培养容器充分长满。将接种了饲养细胞的培养容器中的MEM培养基更换为ES细胞培养用的培养基(参照实施例6表3),并将上述内细胞团接种到该饲养细胞上。
利用本发明的载体将基因导入灵长类ES细胞,可通过包括使该载体与灵长类ES细胞接触的步骤的方法进行。具体例如,将要导入基因的ES细胞接种到被饲养细胞覆盖的培养皿上,然后加入SIV载体。此时,可以通过同时添加例如大约8μg/ml Polybrene提高导入效率。以导入时的MOI(感染复数,感染病毒粒子数/细胞)为例如0.1~100、优选1~100、更优选2~50(例如5~10)进行导入。通常,不用多次添加载体,添加一次就能把基因导入几乎全部的ES细胞。本发明的载体有即使不用RetroNectinTM也能获得高基因导入效率的优点。
另外,本发明还涉及导入了本发明VSV-G假型化病毒载体的灵长类ES细胞,和,由该细胞增殖和/或分化产生的细胞。可以如下诱导ES细胞的分化:例如加入细胞因子等公知的分化/增殖因子或胞外基质等基质、与其它细胞共培养、移植到个体内等(Hitoshi Niwa“ES cell differentiation fatedecision mechanism”Protein,Nucleic acid and Enzyme 45:2047-2055,2000;Rathjen,P.D.等,Reprod.Fertil.Dev.10:31-47,1998)。
例如,诱导来自胚外组织的细胞分化的方法列举如下:
胚外内胚层 胚状体形成
滋养外胚层 抑制Oct-3/4表达
诱导来自未分化细胞的细胞分化的方法可以列举如下:
原始外胚层 胚状体形成
HepG2培养上清
诱导来自外胚层的细胞分化的方法可以列举如下:
神经细胞 胚状体形成+视黄酸处理
胚状体形成+bFGF
胚状体形成+视黄酸处理+Sox2阳性细胞的选择
神经胶质细胞 胚状体形成+视黄酸处理
胚状体形成+bFGF
上皮细胞 胚状体形成
诱导来自神经嵴细胞的细胞分化的方法可以列举如下:
色素细胞 胚状体形成
OP9+ST2+地塞米松+SOL
产生类固醇的细胞 SF1过度表达
诱导来自中胚层的细胞分化的方法可以列举如下:
血细胞(造血干细胞)胚状体形成+IL-3+IL-6+饲养细胞
OP9+饲养细胞
flk1-阳性细胞的选择
血管内皮细胞 flk1-阳性细胞的选择
破骨细胞 胚状体形成+视黄酸处理
心肌细胞 胚状体形成
胚状体形成+αMHC阳性细胞的选择
骨骼肌细胞 胚状体形成
平滑肌细胞 胚状体形成
胚状体形成+DMSO
脂肪细胞 胚状体形成+视黄酸处理+胰岛素+T3
诱导来自内胚层的细胞分化的方法可以列举如下:
产生胰岛素的细胞 胚状体形成
通过本发明的假型化病毒载体导入了基因的ES细胞以及由该ES细胞分化的细胞、组织和器官等可以用于各种药物的分析和筛选。例如,可以通过灵长类ES细胞的基因导入来评价或筛选使组织或细胞,特别优选来自灵长类的组织或细胞进行特异性分化的基因或药物等的效果。本发明提供使组织或细胞进行特异性分化的基因或药物的筛选方法。本发明提供一种检测基因导入对ES细胞增殖或分化的效果的方法,其包括下述步骤:(a)将本发明的载体导入灵长类ES细胞的步骤;和(b)检测该ES细胞的增殖或分化的步骤。可以通过使本发明的重组猴免疫缺陷病毒载体与目的灵长类ES细胞接触,而将载体导入ES细胞。ES细胞的增殖可以通过线粒体活性测定(例如细胞计数和MTT分析)等公知的方法进行检测。ES细胞的分化可以通过检测公知分化基因的表达,或者通过细胞或组织等的形态学或生化学分析进行检测(Satoshi Niwa“ES cell differentiation fate decisionmechanism”Protein,Nucleic acid and Enzyme 45:2047-205 5,2000;Rathien,P.D.等,Reprod.Fertil.Dev.10:31-47,1998)。导入载体可以携带效果待测的所需外源基因。另外,在检测载体本身导入到ES细胞中的效率时,可以用不含外源基因的载体,例如作为阴性对照的情况。可以用上述检测方法评价或筛选能影响灵长类ES细胞增殖或分化的基因。筛选可以通过下述方法进行:该方法继上述检测方法中的步骤(a)和(b)之后,还包括步骤(c)选择具有调节该ES细胞增殖和分化的活性的导入基因。这样的筛选方法也包括在上述本发明的基因导入效果检测方法中。
利用上述方法进行筛选的一个例子是筛选使灵长类ES细胞分化成功能细胞的基因。
例如,使灵长类ES细胞分化成胰腺β细胞时,基因A、B、C、D和E中的哪种是必需的?哪种组合最有效?还有,按照什么顺序导入基因最合适?为了研究这些问题,高效并且简单地将基因导入灵长类ES细胞的技术是有用的。本发明的载体满足这样的要求。例如,构建用于表达基因A、B、C、D和E的本发明载体,然后将这些基因以各种组合或顺序导入灵长类ES细胞或从它们分化得到的细胞中。通过检测导入了这些基因的细胞的分化情况,可以知道基因导入的效果。
另外,本发明的载体也可以用于预测体内施用某种基因进行基因治疗的副作用。
基因X对每种器官和组织的毒性或副作用在某种程度上可以通过对小鼠或猴施用该基因的实验掌握。但是,现有的方法不能检测出基因X对每种组织的干细胞可能造成的所有影响。该基因X可能抑制某些特定组织的干细胞分化成功能细胞。例如,抑制肝脏干细胞的分化时,其抑制作用首先会在患有肝炎或接受肝脏切除手术时表现出来。因此,基因X抑制肝脏干细胞的分化,导致不能进行必要的肝脏再生的严重事故。这样的问题在一般的动物实验中未必能预见到。利用本发明的载体可以高效地将基因X导入灵长类ES细胞中,使这种导入了基因的ES细胞分化成各种组织干细胞或进一步分化成功能细胞,这样可以在各个分化阶段检测基因X的安全性。
利用本发明载体进行的分析或筛选可以用于灵长类,特别是人或猴的胚胎学研究、疾病研究、临床应用和实验模型等,并且能够筛选用于获得所需的分化细胞或分化组织的基因或试剂。
在上述筛选方法中,ES细胞特异性分化为所需组织或细胞的过程可以,例如以所需组织或细胞的特异性标记的表达作为指标进行评价,例如用组织或细胞特异性抗原作为上述特异性标记。例如,神经前体细胞的标记为干蛋白(nestin)等,所述干蛋白是中间纤维。这种特异性标记可以用该标记的抗体通过通常使用的ELISA和免疫染色等检测,也可以用编码该标记的核酸通过常规的RT-PCR和DNA阵列杂交进行检测。所述“核酸”是指基因组DNA、RNA、mRNA或cDNA等。本发明范围内包括通过本筛选法获得的基因或试剂。
另外,本发明范围内也包括导入了本发明假型化逆转录病毒载体的ES细胞以及由该ES细胞分化产生的分化细胞或分化组织。所述分化细胞和分化组织可以通过观察上述组织或细胞的特异性标记的表达和形态学特征来鉴定。
本发明的病毒载体还可以用于灵长类中任何遗传性疾病的基因治疗。对治疗目标的疾病没有特殊限制。例如,目标疾病及其单一致病基因包括Gaucher病中的β-脑苷脂酶(cerebrosidase)(第20染色体)、血友病中的凝血因子VIII(X染色体)和凝血因子IX(X染色体)、腺苷脱氨酶缺乏症中的腺苷脱氨酶、苯丙酮酸尿症中的苯丙氨酸羟化酶(第12染色体)、Duchenne氏肌营养不良中的肌营养不良蛋白(X染色体)、家族性高胆固醇血症中的LDL受体(第19染色体)和囊性纤维症中的CFTR基因的染色体易位等。被认为与上述基因之外的多种基因有关的目标疾病包括阿耳茨海默氏病、帕金森氏病等神经变性疾病、缺血性脑病、痴呆或艾滋病等难治性感染病等。
另外,由导入了基因的ES细胞分化的细胞、组织和器官可以用于疾病治疗。例如,基因缺损或不足导致的疾病可以如下进行治疗:将该基因导入灵长类ES细胞的染色体中,然后移植到体内,由此弥补缺损的基因,弥补(体)循环中酶、生长因子等的不足。另外,与器官移植相结合的基因治疗可以通过将非人动物供体的组织相容性抗原变为人型组织相容性抗原来进行,由此可以提高异种移植的成功率。
当利用本发明载体进行基因导入的ES细胞来自猴时,通过将该ES细胞移植到疾病模型猴的体内,可以提供对人疾病治疗有用的模型。作为人的疾病模型,已知有多种疾病模型猴,例如,可以人工制作人帕金森氏病的模型猴,饲养大量天生患有糖尿病的猴作为人糖尿病的忠实模型,猴SIV感染症公知作为人HIV感染症的忠实模型。对于这样的疾病,在将人ES细胞用于临床前,作为临床前实验,将猴ES细胞移植到疾病模型猴,这样的系统是非常有用的。
附图简述
图1是一种慢病毒载体系统的示意图,该系统采用了猴免疫缺陷病毒克隆SIVagmTYO1。
图2表示SIVagm基因转移载体的结构,其中5’LTR的启动子序列——U3区域被其它的启动子序列取代。
图3表示3’LTR U3区域被其它启动子序列取代的SIVagm基因转移载体的结构,和,预计作为该载体在靶细胞中逆转录的结果而产生的5’LTR U3启动子区域的结构。
图4表示包含EGFP作为报告基因的SIN载体(pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVEGFP/3’LTRΔU3)(也简称为“SIN-GFP/SIV”或“SIN CMVEGFP”)的结构。通过除去3’U3,获得自我失活载体(SIV载体)。
图5表示在用SIV载体导入了EGFP基因的ES细胞(CMK-1株)中,EGFP表达的时间过程。横轴表示基因导入当天(第0天)后的天数,纵轴表示CMK-1中EGFP表达细胞的比率(%)。CMK-1的基因导入效率用实施例中记载的“CMK-1基因导入效率校正式”予以校正,以除去饲养细胞混入部分的影响。结果发现,基因导入2天后,基因导入效率极高并且依赖于MOI,MOI=100时导入效率为90%以上,MOI=10时约为80%,MOI=1时约为60%。这种高基因导入效率持续2个月以上。
图6表示在用SIV载体导入了EGFP基因的ES细胞(CMK-1株)中,EGFP平均荧光强度的时间过程。横轴表示基因导入当天(第0)天后的天数,纵轴表示通过FACS分析得到的EGFP平均荧光强度。在持续约2个月以上的时间内,EGFP表达细胞的平均荧光强度几乎没有下降。
图7是在用SIV载体导入了基因的ES细胞(CMK-1株)中,EGFP表达的荧光显微照片。
上图:基因导入后21天(第21天)的ES细胞的荧光显微镜观察结果。发出EGFP荧光的CMK-1细胞呈岛状突出。
下图:基因导入后62天(第21天)的ES细胞的荧光显微镜观察结果。发出EGFP荧光的CMK-1细胞仍然呈岛状突出。
图8表示SIV载体介导的小鼠和猴ES细胞(CMK-1株)的基因导入效率。纵轴表示除去了饲养细胞混入部分的影响的ES细胞基因导入效率(%)。结果发现,猴ES细胞的基因导入效率比小鼠ES细胞高。一般认为,当采用以SIV为基础的载体时,作为SIV自然宿主的猴等灵长类的细胞比小鼠等异种的细胞的基因导入效率高。
发明的最佳实施方案
下面通过实施例详细说明本发明,但本发明不限于这些实施例。本说明书中引用的文献在此引入作为参考。
[实施例1]SIV载体的构建
用非致病性非洲绿猴(African green monkey)免疫缺陷病毒克隆——SIVagmTYO1构建载体系统。图1表示载体系统的概要。所有核苷酸的序号以下均用病毒RNA的转录起始点+1表示。用插入了SIVagmTYO1的pSA212作为质粒(J.Viol.,vol.64,pp307-312,1990)。并且所有连接反应都按照Ligation High(Toyobo)所附的说明书进行。
a.包装载体的构建
首先,用引物1F(SEQ ID NO:1)和1R(SEQ ID NO:2),以pSA212为模板,通过PCR获得与含有tat/rev第一外显子和vif的区域(5337-5770)对应的DNA片段。在PCR引物上添加EcoRI限制酶位点,由此制备在3’末端带有EcoRI位点的DNA片段。用BglII和EcoRI将PCR片段进行消化后,通过琼脂糖凝胶电泳和Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)纯化。将按照上述方法得到的DNA片段,和,编码gag/pol区域的DNA片段(包括XhoI位点(356)~BglII位点(5338))在pBluescript KS+(Stratagene)的XhoI-EcoRI位点连接。然后,通过PCR扩增与包含tat/rev第2外显子和Rev responsive element(RRE)(6964-7993)的区域对应的DNA片段。用类似于针对上述PCR片段的方式,用引物2F(SEQ ID NO:3)和2R(SEQ ID NO:4),以pSA212为模板进行PCR,由此在3’末端添加NotI位点。用EcoRI和NotI消化后将DNA片段纯化,然后插入pBluescript KS+的EcoRI-NotI位点,所述pBluescript KS+中已插有gag-tat/rev。
然后,合成包含剪接供体(SD)部位的DNA片段(序列3F(SEQ ID NO:5)和3R(SEQ ID NO:6))。合成时在DNA片段的5’和3’末端分别添加XhoI位点和SalI位点,然后插入上述pBluescript KS+的XhoI位点,所述pBluescriptKS+已插有gag-RRE-tat/rev。所得的质粒用XhoI和NotI进行消化,纯化包含SD~tat/rev的片段,然后将该片段插入质粒的XhoI-NotI位点,所述质粒在pCAGGS(Gene,vol.108,pp193-200,1991)的EcoRI位点插有XhoI/NotI接头(序列4F(SEQ ID NO:7)和4R(SEQ ID NO:8))。将按照上述方法得到的质粒作为包装载体(pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev)。
b.基因转移载体的构建
以pSA212为模板,通过PCR,用引物5-1F(SEQ ID NO:9)和5-1R(SEQID NO:10)扩增来自SIVagmTYO1的5’LTR区域(8547-9053+1-982,在5’末端添加KpnI位点,在3’末端添加EcoRI位点),用引物5-2F(SEQ ID NO:11)和5-2R(SEQ ID NO:12)扩增RRE(7380-7993,在5’末端添加EcoRI,在3’末端添加SacII位点),用引物5-3F(SEQ ID NO:13)和5-3R(SEQ ID NO:14)扩增3’LTR(8521-9170,在5’末端添加NotI和BamHI位点,在3’末端添加SacI位点)。以pEGFPC2为模板,通过PCR,用引物6F(SEQ ID NO:15)和6R(SEQ ID NO:16)扩增来自pEGFPC2(Clontech)的CMV启动子区域和编码增强型绿色荧光蛋白(以下称为EGFP)的区域(1-1330,在5’末端添加SacII位点,在3’末端添加NotI位点和BamHI位点以及翻译终止密码子)。将4种PCR片段分别用限制酶KpnI和EcoRI、EcoRI和SacII、BamHI和SacI、SacII和BamHI消化后,纯化,然后以5’LTR->3’LTR->RRE和CMV启动子EGFP的顺序连接并插入到pBluescript KS+的KpnI-SacI位点之间(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR)。为了插入作为报告基因的β-半乳糖苷酶基因,将上述通过PCR制备的包含5’LTR区域和3’LTR区域的DNA片段分别用限制酶KpnI和EcoRI、NotI和SacI消化,纯化,然后分别插入质粒pBluescript KS+的KpnI-EcoRI位点和NotI-SacI位点(pBS/5’LTR.U3G2/WT3’LTR)。在该质粒的NotI位点插入包含编码pCMV-beta β-半乳糖苷酶(Clontech)的区域的NotI片段(820-4294)(pBS/5’LTR.U3G2/β-gal/WT3’LTR)。然后在质粒pBS/5’LTR.U3G2/β-gal/WT3’LTR的EcoRI-NotI位点插入RRE序列(pBS/5’LTR.U3G2/RRE6/tr/β-gal/WT3’LTR),所述RRE序列(6964-8177,在5’末端添加EcoRI位点,在3’末端添加NotI位点)已用引物7-1F(SEQ ID NO:17)和7-1R(SEQ ID NO:18),以pSA212为模板通过PCR进行扩增。然后,用EcoRI和NheI切除RRE序列,插入RRE序列(7380-7993,在5’末端添加EcoRI位点,在3’末端添加NheI位点),该RRE序列已以pSA212为模板,用引物7-2F(SEQ IDNO:19)和7-2R(SEQ ID NO:20)通过PCR进行扩增。将以上方法得到质粒(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/β-gal/WT3’LTR)用NheI和SmaI消化使其平端化,然后插入来自pEGFPN2(Clontech)的CMV启动子区域(8-592,平端化AseI-NheI片段)(pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)。所有平端化反应都用Blunting High(Toyobo)根据所附的说明书进行。将质粒pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3’LTR和pBS/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR分别用KpnI-SacI消化,制备包含5’LTR-3’LTR的DNA片段,然后将该片段插入pGL3 Control(Promega)载体的KpnI-SacI位点,作为基因转移载体(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR和pGL3C/5′LTR.U3G2/RREc/s/CMVFEGFP/WT3′LTR)来使用。
[实施例2]5’LTR的修饰
慢病毒的5’LTR转录活性一般依赖于Tat蛋白的存在,该Tat蛋白是一种来自病毒的因子。因此,为了消除对Tat的依赖性,并通过用转录活性强的启动子序列进行取代来提高载体滴度,制备SIVagm基因转移载体,该载体中5’LTR启动子序列——U3区域被其它的启动子序列取代(图2)。
通过下述方法用嵌合启动子取代5’LTR:用引物9-1F~3F(SEQ ID NO:21-23)和引物9R(SEQ ID NO:24),以pSA212为模板,通过PCR扩增包含5’LTR的TATA盒下游区域直至gag区域(9039-9170+1-982)的片段。然后,将包含CMVL启动子(来自pCI(Promega),1-721)的片段用引物10-1F(SEQID NO:25)和10-1R(SEQ ID NO:26)以pCI为模板通过PCR扩增;将包含CMV启动子(来自pEGFPN2(Clontech),1-568)的片段用引物10-2F(SEQ IDNO:27)和10-2R(SEQ ID NO:28)以pEGFPN2为模板通过PCR扩增;将包含EF1α启动子(pEF-BOS(Nucleic Acids Research,vol.18,p5322,1990)的核苷酸2240-2740)的片段用引物10-3F(SEQ ID NO:29)和10-3R(SEQ ID NO:30)以pEF-BOS为模板通过PCR扩增;将包含CA启动子(pCAGGS的核苷酸5-650)的片段用引物10-4F(SEQ ID NO:31)和10-4R(SEQ ID NO:32)以pCAGGS为模板通过PCR扩增。扩增后,将包含5’LTR的片段和包含上述各启动子的片段混合,添加与各启动子5’末端对应的引物(10-1F(SEQ ID NO:25)、10-2F(SEQ ID NO:27)、10-3F(SEQ ID NO:29)或10-4F(SEQ ID NO:31)以及与5’LTR的3’末端对应的引物(9R),然后进行10个循环的PCR反应,得到含有4种启动子分别与5’LTR组成的嵌合启动子的DNA片段。将所得的DNA片段插入基因转移载体(pGL3C/5’LTR.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)的KpnI-EcoRI位点(pGL3 C/CMVL.U3 G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/CMV.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/EFlα.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/CAGU3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR)。
[实施例3]3’LTR的修饰
切除3’LTR的部分序列,以防止全长载体mRNA在靶细胞中转录,由此构建安全性提高的自我失活型(SIV)载体。在慢病毒载体中,已经证明3’LTR区域包含的启动子序列——U3区域在靶细胞中逆转录时可以整合到5’LTR的U3启动子区域,因此,在靶细胞的基因组内,基因转移载体质粒3’LTR区域中包含的U3区域可以作为与基因表达相关的5’LTR U3启动子区域(图3)。因此,制备将SIVagm基因转移载体的3’LTR U3区域用其它启动子序列取代的载体(图3)。另外,为了研究靶细胞中5’LTR是否可以缺失启动子序列,也制备缺失SIVagm基因转移载体中3’LTR U3区域的载体。
3’LTR U3启动子序列的修饰和缺失通过下述方法进行:用引物11F(SEQ ID NO:33)和11R(SEQ ID NO:34),以pSA212为模板,通过PCR扩增不含3’LTR U3的DNA片段。另外,将U3区域已被其它启动子取代的一种3’LTR用引物12-1F~3F(SEQ ID NOs:35-37)和引物12R(SEQ ID NO:38)通过PCR扩增,其中分别以按照实施例2记载的方法得到的插有嵌合启动子的载体质粒pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR、pGL3C/EF1α.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR和pGL3C/CAGU3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR为模板。将通过PCR所得的DNA片段用SalI和SacI消化,纯化,然后插入pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/WT3’LTR的SalI-SacI位点(pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/3’LTRΔU3、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/CMVL.R、pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/EF1α.R和pGL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/CAGR)。
另外,从经过EcoR1-BamHI处理的pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVFβ-gal/3’LTRΔU3构建包含EGFP作为报告基因的SIN载体(pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVEGFP/3’LTRΔU3)(图4),用PCR产物——EcoRI-BamHI片段取代包含β-gal的片段,所述PCR以pEGFP-C2(Clontech)为模板,用EGFPFG2Eco(ATCGGAATTCGGCCGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT/SEQ ID NO:39)和EGFPRstoNB(CGGGATCCGCGGCCGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC/SEQ ID NO:40)作为引物。然后将以pSA212为模板,用引物5-2F(SEQ ID NO:11)和5-2R(SEQ ID NO:12)扩增的PCR产物——EcoRI-SacII片段插入EcoRI-SacII位点。
[实施例4]大量制备SIV
转染
将来自人胚肾细胞的细胞系293T细胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.90,pp8392-8396,1993)接种到50个15cm的皿中,使达到2.5×106细胞/皿,在包含10%非活性胎牛血清(FCS)的DMEM(GibcoBRL)中培养48小时,每个15cm皿中培养基的量为20ml。培养两天后,将300μg基因转移载体pGCL3C/CMVL.U3G2/RREc/s/CMVEGFP/3′LTRΔU3、150μg包装载体pCAGGS/SIVagm gag-tat/rev和50μg VSV-G表达载体(pVSV-G)溶于75mlOPTI-MEM(Invitrogen),加入2ml PLUS试剂(Invitrogen),搅拌后在室温静置15分钟。另外将3ml LIPOFECTAMINE(Invitrogen)单独与75mlOPTI-MEM混合,然后将其与上述DNA混合物混合,在室温静置15分钟。
将每皿中的3ml溶液滴加到293T细胞,其中培养基已经用10mlOPTI-MEM替换,在37℃、10%CO2中培养3小时。每皿中加入10ml包含20%FCS的DMEM,继续培养21小时。转染24小时后,每皿中的培养基替换成20ml包含10%FCS的DMEM,再继续培养24小时。
载体的回收和浓缩
回收培养上清,用0.45μm的过滤器过滤,然后在42500G和4℃离心90分钟。将所得沉淀溶于10ml TBS中,在37℃反应2小时,然后在42500G和4℃离心2小时,所述TBS包含10mM MgCl2、3mM精胺、0.3mM亚精胺和100μM dNTP。将所得颗粒悬浮于1ml PBS中,然后在-80℃冷冻保存,所述PBS包含5%FCS和2μg/ml Polybrene。
[实施例5]猴胚泡的制备
为了获得适于建立ES细胞的胚泡,进行体外受精和显微受精,然后用体外培养法使受精卵发育成胚泡。
(1)卵巢刺激法
皮下给予雌性cynomolgus猴(4~15周龄)1.8mg促性腺激素释放素(GnRH)(商品名:Leuplin,武田药品工业(株)社;或商品名:Sprecur,HoechstMarion RousseI)。给予GnRH两周后,每天定时(本实施例中为晚上)肌内给予下述激素,每天一次,持续9天,所述激素为:妊娠马血清促性腺激素(PMSG)(商品名:Serotropin,帝国脏器制药(株)社),25IU/kg;人绝经期尿性促性腺激素(hMG)(Pergonal,帝国脏器制药(株)社),10IU/kg;卵泡刺激激素(FSH)(Fertinorm,Serono Laboratories),3IU/kg。给药5天后,用腹腔镜(外径=3mm)观察卵巢,确认卵泡是否发育。
确认施用了PMSG、hMG或FSH的猴的卵泡充分发育后,肌内给予一次人绒毛膜促性腺激素(hCG)(商品名:Puberogen,Sankyo CO.,Ltd.),剂量为400IU/kg。给予hCG的40小时后进行采卵。
采卵通过下述方法进行:用腹腔镜(外径=10mm)观察卵巢,用配备了60mm 19G或20G Cathelin针的2.5ml注射筒穿刺卵泡并吸取卵泡液和卵子,所述注射器中装有约0.5ml包含10%SSS(Serum Substitute Supplement;Irvine Scientific Sales Inc.)的α-MEM(α-Modification of Eagle’s Medium;ICDBiomedical Inc.)溶液。
回收后迅速在立体显微镜下分离卵丘细胞中包含的成熟卵子,然后转移到含有0.3%BSA的TALP(以下简称为BSA/TALP)中,37℃在5%CO2、5%O2和90%N2的CO2培养箱中预培养3~4小时。
(2)精子的采集
(i)从附睾上采集的方法
采取雄性cynomolgus猴(10~15周龄)的附睾,然后迅速将带有23G针的1ml注射筒插入精管内,缓慢注入含有0.3%BSA的BWW(以下简称为BSA/BWW),切断附睾尾部,收集从中留出的精液。
(ii)利用电刺激进行的采集法
(a)直肠法
将雄性cynomolgus猴(10~15周龄)用盐酸氯胺酮和盐酸甲苯噻嗪(分别为5mg/kg和1mg/kg)进行麻醉,并使其处于仰卧位。在与电刺激器相连的棒状直肠电极上涂布角蛋白乳膏,然后将该电极轻轻插入上述猴的直肠中。用灭菌生理盐水洗净阴茎,用纸巾等擦干,然后将阴茎尖端插入试管(50ml)中。随后,给电刺激器通以5V交流电,通电3~5秒后,停止5秒,此操作最多重复3次。观察到射精时停止操作。如果没观察到射精,将电压改为10V后进行同样的操作,如果还未发现射精,则在15V或20V下进行操作。
(b)阴茎法
不进行麻醉,将雄性cynomolgus猴(10~15周龄)的四肢固定在笼子的前面,使其阴茎方便触及。带上手术用橡胶手套,用无菌生理盐水洗涤阴茎,然后用纸巾等擦干。准备电刺激器,用夹子将电极连接到阴茎上。首先以1秒的间隔反复通以5V的直流电压,然后逐渐缩短其间隔。如果未观察到射精,在10V、15V或20V的电压下进行同样的操作。如果还没有出现射精,则在交流电压反复进行同样的操作。
(3)精液采集后的处理和冷冻保存法(Torii,R.,Hosoi,Y.,Iritani,A.,Masuda,Y.and Nigi,H.(1998).Establishment of Routine Cryopreservation ofSpermatozoa in the Japanese Monkey(Macaca fuscata),Jpn.J.Fertil.,43(2),125-131)
将通过直肠法或阴茎法采集的精液在37℃的CO2培养箱中静置约30分钟,收集液体成分,加入包含0.3%BSA的BWW(Biggers,Whitten andWittinghams)(BSA/BWW)培养液1~2ml配制精子溶液,将该溶液轻轻覆盖到2.5ml 80%Percoll(American Pharmacia Biotech Inc.)和2.5ml 60%Percoll的液体上。所得的样品在室温以1,400rpm的速度离心分离20分钟,抽取并弃去上层,剩下试管底部的约0.5ml。然后加入BSA/BWW约10ml,轻轻混合,得到的混合物在室温以1,400rpm的速度离心分离3分钟,抽取并弃去上层,剩下底部的约0.5ml。
往所得的精子中加入适量的BSA/BWW制备精子溶液,使精子数达到约5×107~1.0×108细胞/ml,在4℃静置约60~90分钟。然后,在冰水中往精子溶液中缓慢滴加TTE-G溶液(含有终浓度为12%的甘油的TTE培养基(100ml培养基的组成:Tes 1.2g、Tris-HCl 0.2g、葡萄糖2g、乳糖2g、棉子糖0.2g、蛋黄20ml、青霉素-G 10,000IU、硫酸链霉素5mg)),所述TTE-G溶液的量为精子溶液的1/5,将所得混合物静置5分钟。上述滴加TTE-G溶液和静置的操作重复5次。
将所得的混合物在冰水中放置60~90分钟后,将得到的精子溶液加到0.25或0.5ml麦杆(ストロ-)中。将该麦杆在液氮容器的上部保持约5分钟,进一步在液氮表面保持5分钟,然后将该麦杆保存在液氮中。
(4)用于体外受精的精子的制备
从液氮中取出的麦杆在室温保持30秒,然后在37℃水浴中保持30秒,使保存的精子溶液解冻。接着往上述麦杆中加入包含1mM咖啡因(Sigma)和1mM dbC-AMP(Sigma)的BSA/BWW 10ml,所得混合物在37℃的CO2培养箱(5%CO2)中温育30分钟,进行受精获能。
将上述精子溶液以1,000rpm(200×g)的速度离心分离2分钟,弃去上清液,然后加入约0.5~1ml包含1mM咖啡因和1mM dbC-AMP的BSA/BWW。将所得的精子溶液在37℃的CO2培养箱中(5%CO2)静置60分钟,收集游到顶部的精子,检查精子的运动性和精子数,由此获得体外受精用的精子。
(5)受精方法
(A)体外受精法
往在塑料皿中被矿物油覆盖的50μl BSA/BWW液滴中加入卵丘细胞中包含的卵子1~5个,然后将精子悬浮液转移到液滴中,达到5.0×105~1.0×106个(精子)/ml。用矿物油覆盖该液滴,然后进行授精。
将受精后的卵子在37℃、5%CO2、5%O2和90%N2的CO2培养箱中培养。授精5小时后,用TALP溶液替换BWW溶液,受精效率经测定约为45%,因此以较高受精率得到受精卵。将已确认受精的卵子培养约20小时,然后转移到CMRL-1066溶液中继续培养。
所述CMRL-1066溶液按照下述方法配制:将0.014615g L-谷氨酰胺(1mM)溶于10ml的A溶液中[青霉素G(1000单位)、0.5ml硫酸庆大霉素(10mg/ml)、10ml CMRL-1066(10×)(不含NaHCO3和L-谷氨酰胺)、0.218gNaHCO3、6.7ml乳酸钠(290毫渗量stock),用水调至100ml]。将所得溶液过滤除菌,往除菌后的溶液1ml中添加9ml溶液A,得到10ml溶液B。将0.0055g丙酮酸钠(最终浓度为5mM)溶于溶液B,得到溶液C。将8ml溶液C和2ml BCS(胎牛血清)混合,将所得的混合物过滤除菌,得到CMRL-1066溶液。
(B)显微授精法
(i)卵子的制备
将回收的卵母细胞收集到用矿物油(Sigma)覆盖的50μl包含0.3%BSA的TALP(BSA/TALP)溶液液滴中,在37℃、5%CO2、5%O2和90%N2的条件下预培养2~4小时。
为了确认卵子的成熟,将卵母细胞培养物在包含0.1%透明质酸酶(Sigma)的TALP-HEPES溶液中进一步培养1分钟,用移液管除去卵丘细胞。回收的卵子在倒置显微镜下分成以下4类:
第1类:带有极体的成熟卵子(PB);
第2类:没有观察到PB和生发泡(GV)的成熟中期的卵子;
第3类:没有观察到GV的未成熟卵子;
第4类:明显变形或伴有胞质退化包括退化型变化的卵子。
对于第1类卵子,确认后迅速用于显微授精。对于第2类和第3类卵子,将其收集到用矿物油覆盖的50μl BSA/TALP溶液液滴中,在37℃、5%CO2、5%O2和90%N2的条件下继续培养。培养后24小时检查卵子的成熟状态,成熟卵子用于显微授精,剩下的未成熟的卵子和第4类卵子不用于受精。
(ii)精子的制备
按照体外受精的制备方法进行。
(iii)显微授精法
显微授精在装有微调的倒置显微镜下(Olympus IX70,Narishige)进行。在15cm的皿中,依次放置点1(15μl稀释精子)、点2(10%聚乙烯吡咯烷酮/PBS培养液(PVP,平均分子量约为360,000,Nacalai Tesque)5μl×3个和点3(用于卵子操作的TALP-HEPES溶液(BSA最终浓度为3mg/ml)5μl×3个),用矿物油覆盖其表面以防止干燥,将该皿用于显微授精。另外,本实施例中忽略操作温度变化,因此未使用加热装置,但也可以使用加热装置。
采用人体显微授精所用的倾斜角度为30度的针(外径7~8μm,内径5~7μm,Medi-Con International Co.,Ltd)作为注入用针,将该针连接到高精度的Alcatel注射器上。
采用人显微授精所用的倾斜角度为30度的针,或用磁力拔出器(商品名:PN-30,Narishige)制作的针(外径约为100μm,前端内径约为15μm)作为用于支撑卵子的针。将上述针连接到Narishige注射器上,该注射器带有2000μl的气密注射筒。
在点1按照人显微授精的基准选择具有运动性的精子并吸取,将所得的精子转移到点2释放。在点2中,PVP的粘性导致精子的运动性降低。用注射针摩擦上述精子的尾部,破坏部分精子膜,由此使精子停止运动。吸取该精子以及粘度高的溶液并转移到点3。
将成熟卵子加入到点3中,用支撑针在6点或12点的位置固定,使极体以下的染色体不被注射用针破坏,然后将精子置于注入用针的尖端并插入卵子中。确认针已经通过透明带后,吸取卵细胞膜。确认发生膜断裂后,将注入用针内的内容物(精子和卵子的细胞质)注入卵子中。重复注入精子和卵子细胞质的一系列操作,单次操作中有2~3个卵子进行显微授精。如果精子或卵子细胞质污染了针尖端的内侧,用点2中的溶液洗净。
将显微受精的卵子迅速放回培养箱中,在37℃、5%O2、5%CO2和90%N2的条件下开始培养。显微受精后迅速在6cm的裸露培养皿中制作50ulCMRL-1066溶液的点(spot),并用石蜡油覆盖。点与气体的平衡原则上进行3小时以上。显微授精后24小时,将卵子从TALP溶液转移到上述CMRL-1066溶液的点中,在37℃、5%O2、5%CO2和90%N2的条件下,在CO2培养箱中密封培养8天,结果以高受精率(约为75~85%)得到受精卵。
(6)培养方法
体外受精和显微授精后,将确认已受精的卵子用微小悬滴培养法进行培养,该方法中,为了避免温度和二氧化碳气体浓度的急剧变化,用矿物油覆盖培养基,这种方法在小鼠和兔子等实验动物中广泛使用,但通常不用于人。观察培养过程,为了避免温度或pH变化导致的不必要的压力,在预测到胚泡的出现之前不开启或关闭培养箱的门,进行密闭培养,即,在体外受精中为培养开始后7天,在显微授精中为培养开始后8天。
此次培养中所用的培养基、培养温度和培养气体如下:
培养基:TALP & CMRL-1066
所用培养基为通常用于小鼠的BWW、用于人的Pl(Nakamedical Inc.)、Blast培养基(Nakamedical Inc.)和新开发的HFF(human foilcular fluid,FusoPharmaceutical Industries,Ltd.)。结果表明,受精和分裂顺利进行,但在桑葚体阶段停止发育。确认受精后,组合使用TALP和CMRL-1066培养液,受精胚发育成胚泡,并且发育率极高,为受精胚的40~46%。培养箱外的操作中用HEPES缓冲液系统TALP而不用磷酸缓冲液系统PBS,由此可以减少对卵子的不良影响。
培养温度:38℃
小鼠和人的胚胎通常在37℃进行,但在该温度下发育慢,并且完全没有桑葚体以后的发育。因此,与38.5℃的牛胚胎培养等类似,在38℃或稍高的温度进行培养,体外受精后7天获得胚泡,显微授精后8天获得胚泡。
培养气体:5%CO2、5%O2和90%N2
在通常所用的5%CO2和95%空气的条件下,受精卵的发育停止在桑葚体阶段,但在5%CO2、5%O2和90%N2中培养时,发育到胚泡的发育率很高。
TALP溶液和TALP-HEPES溶液如下配制:
表1
试剂 | 原液 | 终溶液(mM) | 原液(ml) |
(mM) (g/100mol) | TALP TALP-HEPES | ||
HEPESNaClKClCaCl2MgCl2·6H2O乳酸钠水NaH2PO4·H2O葡萄糖NaHCO3 | -157.0 0.92166.0 1.24120.0 1.76120.0 2.44150.0 --20.5 -295.0 5.31167.0 1.40 | 10.0114.03.162.00.510.0-0.355.025.0(TALP)2.0(TALP-HEPES) | - 240mg至100ml 至100ml1.9 1.91. 1.70.41 0.416.7 6.7- 7.11.7 1.715.0 1.2 |
青霉素G(10,000单位/100ml)和酚红(1mg/100ml) |
原液通过高压灭菌法灭菌保存。
配制TALP溶液前,配制下列试剂并用过滤器过滤除菌:
丙酮酸钠 0.5mM 0.0055g(每100ml)
硫酸庆大霉素(10mg/ml) 50μg/ml 50μl
BSA 3mg/ml 0.3g
配制TALP-HEPES溶液前,配制下列试剂并用过滤器过滤除菌:
丙酮酸钠 0.1mM 0.0011g(每100ml)
BSA 3mg/ml 0.3g
另外,配制TALP-HEPES溶液时,首先将50ml NaCl和Na-HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸)、酚红和青霉素G溶解。往所得的溶液中分别加入规定量的原液,最后用NaCl原液调至100ml。然后,用1M NaOH将所得溶液调至pH=7.4。乳酸钠溶液通过将原液(60%的糖浆剂)与水以1∶35的比例混合来制备。往所得混合物中加入1mg/ml的酚红后,用1M NaOH将所得溶液调至pH=7.6,然后过滤除菌。所得的试剂可以在4℃保存一周。将28mg NaHPO4·H2O溶于10ml葡萄糖溶液中,过滤除菌,所得的溶液可以在4℃保存一周。
BWW(Biggers,Whitten and Whittingham)溶液的组成如表2所示。
表2
试剂 | 用量*(mg) |
NaClCaCl2KH2PO4MgSO4NaHCO3丙酮酸钠D(+)-葡萄糖(无水)青霉素G链霉素DL-乳酸钠乳酸钙酚红1mg Merk | 2,770178811471,0531450031251,0372631 |
*:/500ml
[实施例6]建立猴ES细胞的方法
(1)饲养细胞的制备
将从12.5日龄的小鼠胚胎获得的原代胚胎成纤维细胞(以下称为MEF细胞)在包含10%胎牛血清(FBS)的MEM培养基中培养1-3代,直至细胞铺满。然后在含有最终浓度为10μg/ml的丝裂霉素C(MMC)的MEM培养基中培养MEF 2~3小时,使细胞分裂失活。随后,除去包含MMC的培养基,用PBS洗涤细胞3次。通过胰蛋白酶处理(0.05%胰蛋白酶和1mM EDTA)将洗净后的细胞从培养皿剥离,计数细胞数。
在被明胶覆盖的24孔培养皿的各个孔中接种2×104个/孔的经MMC处理过的MEF。
将所得的细胞接种到皿上,在确认细胞数足够以后,培养小鼠ES细胞并检查其性质,结果发现,所得的细胞增殖能力良好,保持未分化的状态,适合用作饲养细胞。另外,3代以下(1-3代)的细胞适合用作饲养细胞。
(2)从猴胚泡分离内细胞团
为了除去透明体,将猴胚泡转移到包含最终浓度为0.5%的链霉蛋白酶或Tyrode的M2培养基(参见例如D.M.Glover等,Eds.,DNA Cloning 4Mammalian Systems A Practical Approach第二版(1995)等)中,在37℃温育10分钟。另外将残留有透明体的胚泡进一步在37℃用链霉蛋白酶处理5分钟。确认除去透明体后,将得到的胚泡用PBS洗涤两次。
然后,将胚泡转移到用M16培养基(参见上述“DNA Cloning 4Mammalian Systems A Practical Approach”等)稀释20倍的兔抗cynomolgus猴淋巴细胞血清溶液中,在37℃温育30分钟,然后将所得的胚泡用PBS洗涤三次。将胚泡转移到用M16培养液稀释50倍的补体溶液中,在37℃温育30分钟,然后将所得的胚泡用PBS洗涤三次。当胚泡的营养外胚层未完全除去时,用剥离针在显微镜下物理性地除去营养外胚层,由此分离内细胞团(ICM)。
(3)猴的内细胞团的培养
从接种了(1)中所得的饲养细胞的24孔培养皿中除去MEM培养基,每孔加入ES细胞培养用培养基(ES细胞培养基,表3)800μl。
用微量移液管将(2)中所得的ICM移到各个孔中,浓度为1个细胞/孔,在37℃、5%CO2的条件下培养7天。为了不妨碍ICM的着床,培养开始后3天不改变培养基,每天用显微镜观察着床状况。
表3
ES细胞培养基的组成
产品名 用量
DMEM/F12(SIGMA) 500ml
FBS(JRH BIOSCIENCES) 75ml
谷氨酰胺(SIGMA;200mM) 5ml
青霉素(SIGMA;10.000IU/ml)和
链霉素(SIGMA;100mg/ml)混合物 5ml
丙酮酸钠(SIGMA;100mM) 5ml
NaHCO3(SIGMA;7.5%) 8ml
2-巯基乙醇
(SIGMA;最终浓度10-4M) 4μl
LIF(ESGRO;最终浓度1000U/ml) 0.5ml(106U/ml)
在培养第7天,将ICM分散,除去孔中的ES细胞培养基,用PBS将孔洗涤一次,往孔中加入300μl 0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA,然后迅速除去。随后,将24孔培养皿在37℃温育1分钟。用显微镜确认细胞分散后,往孔中加入500μl ES细胞培养基,用移液管很好地分散。
将上述细胞全部转移到预先接种了饲养细胞的新鲜24孔培养皿的孔中,加入300μl ES细胞培养基,使培养基总量为800μl,然后充分混合以使细胞接种均匀。每两天更换一次ES细胞培养基。细胞分散后7天内被视为ES细胞的细胞团增殖,以集落出现,每天进行观察。
ES细胞集落出现后,在24孔培养皿中将细胞用胰蛋白酶处理,进一步传代。在此期间,每天或每两天更换一次ES细胞培养基,结果得到由cynomolgus猴胚泡产生的大量ES细胞株。
(4)猴ES细胞的评价
核型:
检查染色体数是否正常(与起源猴的染色体数相同:2n=42),结果表明,所建立的ES细胞保持正常的核型。
多能性:
将1×106个cynomolgus猴ES细胞皮下注射到8周龄的SCID小鼠的腹股沟区域,注射后5~12周发现形成肿瘤。用Bouin液或多聚甲醛溶液将该肿瘤固定后,切成薄片,进行苏木精伊红染色(HE染色)或免疫染色,然后进行组织学检查。在免疫染色中,可以利用的猴组织特异性抗体极少,因此使用人神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、S-100蛋白和结蛋白的抗体。
结果发现,该肿瘤是由来自外胚层(神经元和神经胶质)、中胚层(肌肉、软骨、骨)和内胚层(纤毛上皮和肠道上皮)的细胞群构成的畸胎瘤。在免疫组织学检查中,用NSE抗体检查神经元,用NSE和GFAP的抗体检查神经胶质,用NSE抗体检查末梢神经,用S-100蛋白抗体检查软骨,用结蛋白抗体检查肌肉。以上结果表明,cynomolgus猴的ES细胞具有多能性(三胚层分化能力)。
形态学特征:
1.核/细胞质之比高,核仁显著,形成集落;
2.与小鼠ES细胞相比,集落形态扁平。
细胞表面标记的表达:
为了确认有无阶段特异性胚抗原(SSEA,该抗原是用于赋予ES细胞特征的细胞表面标记),用SSEA-1(阴性对照)、SSEA-3和SSEA-4的细胞表面标记抗体进行免疫染色。这些抗体得自The Developmental Studies HybridomaBank of the National Institute of Child Health and Human Development。通过下述操作评价每一种SSEA细胞表面标记:使用4%多聚甲醛固定的细胞与第一抗体反应,然后,与标记的聚合物(Simple Stain PO,Nichirei)反应,该聚合物包含与过氧化物酶和第二抗体偶联的氨基酸聚合物。加入Simple StainDAB溶液(Nichirei)进行检测,结果未检出SSEA-1,但检出了SSEA-3和SSEA-4。
碱性磷酸酯酶活性:
以Fast-Red TR SaH为底物,用HNPP(Roche)测定碱性磷酸酯酶活性,结果检测出碱性磷酸酯酶。
[实施例7]猴ES细胞的培养
(I)饲养细胞的制备
与实施例6类似,将从12.5日龄的小鼠胚胎获得的MEF在包含10%胎牛血清(FBS)的MEM培养基中培养1-3代,直至细胞铺满。然后在含有最终浓度为10μg/ml的MMC的MEM培养基中培养MEF 2~3小时,使细胞分裂失活。随后,除去包含MMC的培养基,用PBS洗涤细胞3次。通过胰蛋白酶处理(0.05%胰蛋白酶和1mM EDTA)回收细胞,计数细胞数。
在被明胶覆盖的24孔培养皿的各个孔中接种2×104个/孔的经MMC处理过的MEF。
(II)猴ES细胞(CMK-1株)的培养
按照实施例6的方法配制ES细胞培养基。将ES细胞的CMK-1株(以下也称为“CMK-1”)接种到上述(I)中制备的饲养细胞上。此时,ES细胞不分散成单个细胞,而是以5~10个细胞的细胞团进行接种。每天或每两天更换一次培养基,细胞每4~6天传代一次。
在传代中,用PBS将细胞洗涤一次,加入0.25%胰蛋白酶/PBS或0.1%胶原酶/DMEM,在37℃温育2~10分钟。将细胞悬浮于ES细胞培养基中,以1000rpm的速度离心5分钟。将该细胞以1∶2~1∶4的比例接种到新鲜制备的饲养细胞上。用10~20%DMSO/DMEM或市售的细胞冷冻保存液保存细胞。
[实施例8]利用猴ES细胞(CMK-1株)进行的基因导入实验
<将基因导入猴ES细胞(CMK-1株)>
通过上述制备的表达EGFP的VSV-G假型化SIV载体(自我失活型(SIN)载体)(图4)将基因导入猴ES细胞中,使用有效滴度为1.9×109/ml的载体溶液。
在基因导入的前一天,以7.5×104细胞/ml的浓度将CMK-1接种到饲养细胞上(2.5×105细胞/ml)。在基因导入的当天(第0天),以上述制备的细胞为基准,用ES细胞培养基(实施例6)稀释上述SIV载体,使MOI为1、10和100。加入Polybrene 8μg/ml进行一次转导,10小时后更换培养基。次日(第1天)开始,每5~6天细胞以1∶3~1∶4的比例传代到饲养细胞上。
ES细胞(CMK-1株)的基因导入效率用下述方法通过EGFP表达率计算,所述EGFP表达率通过FACScan求出。由于CMK-1细胞是在饲养细胞上培养的,因此用胰蛋白酶回收的样品中混有CMK-1细胞和饲养细胞。另外,除了CMK-1细胞之外,SIV载体还可以将基因导入用丝裂霉素C处理过的饲养细胞中,因此,EGFP表达细胞中包含CMK-1细胞和饲养细胞。用下述“(1)饲养细胞中EGFP表达率的测定”和“(2)CMK-1细胞和饲养细胞的细胞比测定”根据下面的校正式计算CMK-1细胞中的EGFP表达率。
<CMK-1基因导入效率的校正式>
在各FACS样本中,CMK-1的EGFP表达率表示为Ec,饲养细胞的EGFP表达率表示为Ef,CMK-1和饲养细胞的总体EGFP表达率表示为Eb。将CMK-1细胞数表示为c,饲养细胞的细胞数表示为f时:
f×Ef+c×Ec=(f+c)Eb
将上式变形为:
Ec={(f+c)Eb-f×Ef}/c
设c/(f+c)=k,则有
1/k=1+f/c
将其代入上述方程,得:
Ec=Eb/k-(1/k-1)/Ef
=(Eb-Ef)/k+Ef
由此得到校正式:
平均Ec={(Eb-Ef)/n×∑1/ki}+Ef
标准误差SEM(平均值的标准误差)=1/n×(∑(Eci-均值)2)1/2
=(Eb-Ef)×(∑(1/ki-1/n∑1/ki)2)1/2
(1)饲养细胞中EGFP表达率的测定
将SIV载体仅导入饲养细胞中,使MOI=1,10和100,在上述的相同条件下进行FACS分析和传代。
(2)CMK-1细胞和饲养细胞的细胞比测定
用下述方法识别CMK-1细胞和饲养细胞。人的抗HLA-ABC抗体(小鼠抗人HLA-ABC:RPE,Serotec Ltd.)不与来自小鼠的饲养细胞反应,但与来自cynomolgus猴的CMK-1细胞反应。使该抗体与CMK-1细胞和饲养细胞的细胞混悬液反应,用FACS测定CMK-1细胞和饲养细胞的细胞比。
测定SIV载体介导的猴ES细胞的基因导入效率(图5)。CMK-1细胞的基因导入效率中,通过上述“CMK-1基因导入效率的校正式”消除了混入的饲养细胞的影响。基因导入两天后,发现基因导入效率很高并且依赖于MOI,MOI=100时,导入效率为90%以上,MOI=10约为80%,MOI=1时约为60%。这种高基因导入效率持续两个月以上。另外,检查导入了EGFP基因的CMK-1细胞中平均荧光强度的时间过程,结果发现EGFP表达细胞的平均荧光强度持续两个月以上几乎不下降(图6)。通过SIV载体导入了EGFP基因的CMK-1细胞(“绿色”ES细胞)的显微照片如图所示。
[实施例9]SIV载体介导的猴ES细胞和小鼠ES细胞的基因导入效率
为了研究SIV载体介导的基因导入的效率是否随ES细胞的种类而变,按照实施例8的方法将基因导入小鼠ES细胞(D3株)。
具体地,在基因导入的前一天,以7.5×104细胞/ml的浓度将CMK-1细胞接种到饲养细胞上(2.5×105细胞/ml)。在基因导入的当天(第0天),以上述制备的细胞为基准,用ES细胞培养基(实施例6)稀释表达上述EGFP的VSG-G假型化SIV载体(自我失活型(SIN)载体)(图4),使MOI为1、10和100。加入Polybrene 8μg/ml进行一次基因导入,10小时后更换培养基。次日(第1天)开始,每5~6天细胞以1∶3~1∶4的比例传代到饲养细胞上。将小鼠ES细胞(D3株)在基因导入的前一天以1×105细胞/ml的浓度接种到大约相同数量的饲养细胞上,对于CMK-1细胞也使用相同类型的饲养细胞。接种次日往上述SIV载体中添加培养基,使MOI=10,加入Polybrene 8μg/ml进行一次基因导入,次日(第1天)开始,每一天细胞以1∶8~1∶10的比例传代到饲养细胞上。
以MOI=10进行转导的各ES细胞的基因导入效率如图8所示,结果发现猴ES细胞的基因导入效率比小鼠ES细胞高(图8)。当使用以SIV为基础的载体时,作为SIV自然宿主的猴等灵长类的细胞比猴等的异种细胞的基因导入效率更高。
工业实用性
本发明用于来自灵长类的ES细胞基因导入用的VSV-G假型化猴免疫缺陷病毒载体可以用于灵长类(包括人)的胚胎学研究、疾病研究、临床应用和实验模型。本发明的载体可以筛选能控制ES细胞特异性分化为组织或细胞的基因或试剂,该筛选方法在下述基因或试剂等的筛选中发挥优良的效果,所述基因或试剂使组织或细胞进行特异性分化,以获得所需的分化细胞或分化组织。
序列表
<110>花团丰(HANAZONO Yutaka)
上田泰次(UEDA Yasuji)
近藤靖(KONDO Yasushi)
铃木丰(SUZUKI Yutaka)
<120>利用VSG-V假型化猴免疫缺陷病毒载体将基因导入灵长类胚胎干细胞
<130>D3-A0103P
<140>JP 02/05225
<141>2002-05-29
<150>JP 2001-174696
<151>2001-06-08
<160>40
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:人工合成的引物序列
<400>1
gcagatctca accaggaggc gaggctgcat tttggg 36
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:人工合成的引物序列
<400>2
gcgaattcta ct tactggtg ctgtaaagga gccaaa 36
<210>3
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:人工合成的引物序列
<400>3
atcggaattc ttttattgta agatggattg gtttttaaat 40
<210>4
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述:人工合成的引物序列
<400>4
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cgggatccgc ggccgcttac ttgtacagct cgtccatgcc 40
Claims (10)
1.一种重组猴免疫缺陷病毒载体,用于将基因导入灵长类胚胎干细胞,该载体被VSV-G假型化。
2.权利要求1所述的载体,其中重组猴免疫缺陷病毒载体来自agm株。
3.权利要求1或2所述的载体,其中重组猴免疫缺陷病毒载体为自我失活型。
4.权利要求1~3中任意一项所述的载体,其中灵长类属于旧世界灵长类猕猴科猕猴属。
5.权利要求1~4中任意一项所述的载体,其携带可以表达的外源基因。
6.权利要求5所述的载体,其中外源基因为编码选自绿色荧光蛋白、β-半乳糖苷酶和萤光素酶的蛋白质的基因。
7.将基因导入灵长类胚胎干细胞的方法,其包括使权利要求1~6中任意一项所述的重组猴免疫缺陷病毒载体与灵长类胚胎干细胞接触的步骤。
8.灵长类胚胎干细胞,所述细胞中导入了权利要求1~6任一项所述的重组猴免疫缺陷病毒载体。
9.由权利要求8所述的灵长类胚胎干细胞增殖和/或分化生成的细胞。
10.一种检测基因导入对ES细胞增殖或分化的效果的方法,该方法包括以下步骤:
(a)将权利要求1~6中任意一项所述的载体导入灵长类胚胎干细胞;
(b)检测该胚胎干细胞的增殖或分化。
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