JPWO2020138430A1 - 網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬 - Google Patents

Abstract

本発明は、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬であって、他家由来、かつ、立体構造を有する網膜組織を含み、治療薬が投与される対象患者が、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患した患者であり、かつ、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤を、治療薬の投与後１か月以上にわたり全身的に投与されない患者である、治療薬に関する。

Description

本発明は、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬に関する。本発明はまた、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患を治療するための方法、網膜組織及びキットにも関する。

眼内は、視覚維持のため過剰な免疫応答が起きにくい免疫特権部位（immune-privileged site）とされ、免疫拒絶反応が生じにくい臓器であると認識されている。免疫特権部位としての機能は、網膜毛細血管内皮細胞を実体とする内側血液網膜関門（inner BRB）と、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を実体とする外側血液網膜関門（outer BRB）とからなる血液網膜関門（blood-retinal barrier；BRB）が、網膜と循環血液を隔絶すること、及びＲＰＥ細胞により分泌されるＴＧＦβ等のサイトカインにより達成されると考えられている。一方で、網膜の疾患及び移植手技等により血液網膜関門が障害を受けた場合には、免疫特権部位としての機能は減弱し、免疫拒絶反応が惹起されやすくなると考えられているが、その詳細は分かっていない（非特許文献１）。

網膜色素上皮細胞の移植については、近年、ドナーとレシピエントの主要組織適合遺伝子複合体抗原（ＭＨＣ抗原、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともいう）が適合している場合には、免疫抑制剤を用いなくても網膜色素上皮細胞の移植片に対する免疫応答は防止できることが証明された一方で、ドナーとレシピエントのＭＨＣ抗原（ＨＬＡ）が適合しない場合、免疫特権部位に移植したのにも関わらず、網膜色素上皮細胞の移植片によって免疫応答が惹起され移植片が排除されることも報告された（非特許文献２、３）。

また、ヒトへのＨＬＡが適合しない他家由来の網膜色素上皮細胞の移植において、タクロリムス（非特許文献４）又はプレドニゾロン（非特許文献５）等の免疫抑制剤が経口投与により全身的に投与されている（非特許文献４、５）。

J. Wayne Streilein et al., Vision Research, Vol.42(2002)，pp.487-495 Sunao Sugita et al., Stem Cell Reports, Vol.7, pp.635-648, October 11, 2016 Sunao Sugita et al., Stem Cell Reports, Vol.7, pp.619-634, October 11, 2016 Steven D Schwartz et al., LANCET Vol.385,Issue.9967, 7-13 February 2015, pp.509-516 Lyndon da Cruz et al., Nature biotechnology, Vol.36, pp.328-337 (2018)

以上のとおり、ヒトに他家（ドナー）由来の網膜組織を移植する場合にも、免疫抑制剤の投与が必要であると考えられている。しかし、特に免疫抑制剤の全身的な投与は、癌化のリスクを高める、重篤な感染症を引き起こす等の重篤な副作用の可能性があり、免疫力が落ちている高齢者及び癌患者等に対する投与は特に問題視されている。また、長期にわたる免疫抑制剤の使用は、上記の副作用等のリスクを上昇させ、患者のＱＯＬ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｏｆ Ｌｉｆｅ）を著しく低下させる。

したがって、本発明は、拒絶反応を引き起こしにくい他家由来の網膜組織を含む、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬の提供を目的とする。

発明者らは、ドナーとＭＨＣ（ＨＬＡ）型が不一致のレシピエントにおいて、凝集体を形成していない分散状態の網膜系細胞は免疫応答を誘導するのに対して、細胞凝集体を形成する立体構造を有する網膜組織はレシピエントの免疫応答を誘導せず、むしろその免疫活性化を抑制することを見出した。本発明は、この新規な知見に基づくものである。

すなわち、本発明は以下の各発明に関する。
［１］網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬であって、他家由来、かつ、立体構造を有する網膜組織を含み、上記治療薬が投与される対象患者が、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患した患者であり、かつ、上記治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤を全身的に投与されない患者であることを特徴とする、治療薬。
［２］上記対象患者が、上記治療薬の投与１か月後以降に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤を全身的に投与されない患者である、［１］に記載の治療薬。
［３］網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬であって、他家由来、かつ、立体構造を有する網膜組織を含み、上記治療薬が投与される対象患者が、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患した患者であり、かつ、上記治療薬の投与前、投与時、及び／又は投与後、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤を、長期間にわたり（例：上記治療薬の投与後１か月以上にわたり）全身的に投与されない患者である、治療薬。
［４］上記対象患者が、上記治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤を全身的に投与されない患者である、［１］〜［３］のいずれかに記載の治療薬。
［５］上記対象患者が、上記治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤（好ましくは、ステロイド系抗炎症剤）を局所的に投与されない患者である、［１］〜［４］のいずれかに記載の治療薬。
［６］上記対象患者が、上記治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、トリアムシノロン、フルオシノロン及びカルシニューリン阻害剤からなる群より選択される１種以上の免疫抑制剤を局所的に投与される患者である、［１］〜［５］のいずれかに記載の治療薬。
［７］上記対象患者が、上記治療薬の投与１か月後以降に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤を局所的に投与されない患者である、［５］に記載の治療薬。
［８］上記対象患者が、上記治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤を投与されない患者である、［１］〜［３］のいずれかに記載の治療薬。
［９］上記治療薬が、実質的に網膜色素上皮細胞を含まない、［１］〜［８］のいずれかに記載の治療薬。
［１０］少なくとも上記網膜組織の表面においてＴＧＦβが存在している、［１］〜［９］のいずれかに記載の治療薬。
［１１］上記網膜組織の長軸方向の直径が０．２ｍｍ以上である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の治療薬。
［１２］上記網膜組織１個当たりに含まれる総細胞数が１×１０^４細胞以上である、［１］〜［１１］のいずれかに記載の治療薬。
［１３］上記網膜組織の表面が面積比で５０％以上の連続上皮構造を有する、［１］〜［１２］のいずれかに記載の治療薬。
［１４］上記網膜組織１個当たりに含まれる総細胞数の５０％以上が、ＰＡＸ６、Ｃｈｘ１０及びＣｒｘの少なくとも一つを発現する細胞である、［１］〜［１３］のいずれかに記載の治療薬。
［１５］上記網膜組織が、多能性幹細胞由来である、［１］〜［１４］のいずれかに記載の治療薬。

本発明によれば、他家由来であるが免疫抑制作用を示すことにより拒絶反応を引き起こしにくい網膜組織を含む、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬の提供が可能となる。それにより、移植時の免疫抑制剤の併用について患者にとってより負担の少ない方法、例えば、免疫抑制剤の全身的な投与をしない等の方法が選択可能となる。

実施例１における、ヒトＥＳ細胞株（ｋｈＥＳ−１）及びヒトｉＰＳ細胞株（ＴＬＨＤ２）それぞれから分化誘導された神経網膜の顕微鏡写真を示す図である。 実施例２における、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された神経網膜のＨＬＡ発現解析結果を示すグラフである。 実施例２における、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜のＨＬＡ発現解析結果を示すグラフである。 実施例３における、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された神経網膜のＨＬＡ ｃｌａｓｓＩの発現の観察結果を示す写真である。 実施例３における、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜のＨＬＡ ｃｌａｓｓＩＩの発現の観察結果を示す写真である。 実施例４における、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された神経網膜の移植後のＨＬＡ ｃｌａｓｓＩ及びＨＬＡ ｃｌａｓｓＩＩの発現の観察結果を示す写真である。 実施例４における、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された神経網膜の移植後のｈＧＦＡＰによる染色結果を示す写真である。 実施例５における、免疫細胞の活性化に対する抑制能を評価するためのサンプルを示す写真である。（１）は、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された神経網膜そのもの（Ｗｈｏｌｅ ３Ｄ ｒｅｔｉｎａ）、（２）は、（１）の神経網膜の一部を解離したもの（ｓｅｍｉ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）、（３）は、（１）の神経網膜を単一細胞へ分散させたもの（ｓｉｎｇｌｅ）を示す。 実施例５における、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された神経網膜を用いた免疫細胞に対する免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例５における、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された神経網膜を用いた免疫細胞に対する免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例５における、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された神経網膜を用いた免疫細胞に対する免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例５における、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜を用いた免疫細胞に対する免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例５における、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜を用いた免疫細胞に対する免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例５における、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜を用いた免疫細胞に対する免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例６〜７における、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜による活性化された免疫細胞の抑制能の評価結果を示す。 実施例６〜７における、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜による活性化された免疫細胞の抑制能の評価結果を示す。 実施例６〜７における、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜による活性化された免疫細胞の抑制能の評価結果を示す。 実施例６〜７における、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された神経網膜による活性化された免疫細胞の抑制能の評価結果を示す。 実施例６〜７における、ヒトＥＳ細胞から分化誘導された神経網膜による活性化された免疫細胞の抑制能の評価結果を示す。 実施例８における、ＴＧＦβの発現解析結果を示す図である。 実施例９における、神経網膜におけるＴＧＦβの発現を示す写真である。 実施例１０における、ＥＬＩＳＡによるＴＧＦβ２の分泌量の測定結果を示す図である。 実施例１１における、ＴＧＦβ２の分泌量測定の結果を示す図である。 実施例１１における、ＴＧＦβ２の局在を示す写真である。 実施例１２における、浮遊培養開始後５０日、１００日、１６０日及び２００日における各神経網膜を用いたＭＬＲ試験の結果を示す図である。 実施例１２における、浮遊培養開始後５０日、１００日、１６０日及び２００日における各神経網膜を用いたＭＬＲ試験の結果を示す図である。 実施例１２における、浮遊培養開始後５０日、１００日、１６０日及び２００日における各神経網膜を用いたＭＬＲ試験の結果を示す図である。 実施例１３における、免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例１３における、免疫原性試験の結果を示す図である。 実施例１４における、サルヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜の顕微鏡観察結果を示す図である。 実施例１５における、サルｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜の免疫原性の評価結果を示す図である。 実施例１６における、サルｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜を移植した切片に対して免疫染色を行った結果を示す共焦点顕微鏡写真である。 実施例１６における、サルｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜を移植した切片に対して免疫染色を行った結果を示す共焦点顕微鏡写真である。 実施例１７における、サルｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜の活性化免疫細胞の抑制能の評価結果を示す図である。 分化日数８０日でのヒトＥＳから分化誘導した神経網膜ｈＥＳＣ−ＮＲ（Ａ〜Ｃ）、及びヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した神経網膜ｈｉＰＳＣ−ＮＲ（Ｄ〜Ｆ）の免疫染色結果を示す顕微鏡写真である。Ａ及びＤは、ＣＲＸ、Ｃｈｘ１０及びＰａｘ６の発現について、Ｂ及びＥはＣＲＸ、Ｒｘｒ−γ及びＢｒｎ３の発現について、Ｃ及びＦはＩｓｌｅｔ−１、Ｐｒｏｘ１及びＢｒｎ３の発現について確認した結果を示す。 ＩＦＮ−γ存在下又は非存在下で２日間培養したｈＥＳ−ＮＲ、ｈｉＰＳＣ−ＮＲ及びｈｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞におけるＨＬＡクラスＩ、β２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｏｒｉｎ、ＨＬＡクラスＩＩのフローサイトメトリー分析結果を示す図である。 ＩＦＮ−γ存在下又は非存在下で２日間培養したｈＥＳＣ−ＮＲ及びｈＥＳＣ−ＮＲのＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ陽性の画分におけるＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡクラスＩＩのフローサイトメトリー分析結果を示す図である。 ＩＦＮ−γ存在下又は非存在下で２日間培養したｈＥＳＣ−ＮＲ及びｈｉＰＳＣ−ＮＲにおけるβ２−Ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｏｒｉｎ、ＨＬＡ−Ｅ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。 ＩＦＮ−γ存在下又は非存在下で２日間培養したｈＥＳＣ−ＮＲ及びｈｉＰＳＣ−ＮＲにおけるＣＤ４７のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。 ＩＮＦ−γ刺激なしのｈＥＳＣ−ＮＲにおけるＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ及びＨＬＡクラスＩの免疫染色結果を示す顕微鏡写真である。 ＩＮＦ−γ刺激ありのｈＥＳＣ−ＮＲにおけるＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ及びＨＬＡクラスＩの免疫染色結果を示す顕微鏡写真である。 同時間のＩＮＦ‐γ刺激あり又はＩＮＦ−γ刺激なしのｈＥＳＣ−ＮＲにおけるＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ及びＨＬＡクラスＩの免疫染色結果を示す図である。 ＩＦＮ−γ存在下又は非存在下での神経網膜（ＮＲ）又は単一細胞（ｈＥＳＣ）におけるＨＬＡクラスＩ発現レベルを示すグラフである。 ＣＤ３／２８抗体で活性化させた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖を指標に、ｈＥＳＣ−ＮＲの免疫抑制能を検査した結果を示すグラフである。 ＣＤ３／２８抗体で活性化させた末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の増殖及び凝集を指標に、ｈＥＳＣ−ＮＲの免疫抑制能を観察した結果を示す顕微鏡写真である。 ｈＥＳ−ＮＲ（上段）／ｈｉＰＳＣ−ＮＲ（下段）によるＣＤ４陽性Ｔ細胞及びＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化を抑制する効果の用量依存性を調べた結果を示す図である。 Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）を用いて分離共培養したときのｈＥＳＣ−ＮＲの免疫抑制パターンの結果を示す図である。 ｈｉＰＳＣ−ＮＲ、ｉＰＳ細胞及びｉＰＳ−ＲＰＥ細胞におけるＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２及びＴＧＦ−β３の発現結果を示すグラフである。 ｈｉＰＳＣ−ＮＲによるＴＧＦ−β２発現の用量依存性を示すグラフである。 分化日数とＴＧＦ−β２の発現量の関係を示すグラフである。 実施例１９における移植後のＨＬＡ発現パターンを示す顕微鏡写真である。 実施例１９における移植後のＨＬＡ発現パターンを示す顕微鏡写真である。 末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対する、ＩＮＦ−γ処理しＨＬＡ−Ｃｌａｓｓ Ｉを発現上昇させた状態のｈＥＳＣ−ＮＲの免疫原性を検査した結果を示すグラフである。

〔治療薬〕
本明細書の治療薬は、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬であって、他家由来、かつ、立体構造を有する網膜組織を含む。網膜組織は、他家幹細胞から分化誘導され、かつ、立体構造を有する網膜組織であってよい。治療薬が投与される対象患者は、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患した患者であり、かつ、治療薬の投与前、投与時、及び／又は投与後、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤を、長期間にわたって（例：上記治療薬の投与後１か月以上にわたり）全身的に投与されない患者であってよい。治療薬が投与される対象患者は、治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びシクロスポリン以外の免疫抑制剤を全身的に投与されない患者であってよい。

網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患としては、例えば、眼科疾患である黄斑変性症、加齢黄斑変性症、網膜色素変性症、緑内障、角膜疾患、網膜剥離、中心性漿液性網脈絡膜症、錐体ジストロフィー、錐体桿体ジストロフィー、黄斑円孔等が挙げられる。網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患には、網膜組織の損傷を伴う疾患も含まれる。網膜組織の損傷状態としては、例えば、視細胞が変性死している状態等が挙げられる。

（他家幹細胞）
本明細書における「他家」とは、治療対象となる患者（レシピエント）以外のヒト、すなわち他人（ドナー）を意味する。「他家幹細胞」とは、患者（レシピエント）以外のヒトに由来する幹細胞、すなわち他人（ドナー）由来の幹細胞である。

「幹細胞」とは、多分化能（複数種類の細胞へ分化し得る能力）と自己複製能の両方を有し、増殖可能な細胞である。幹細胞としては、例えば、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）、及び、骨髄、血液、皮膚（表皮、真皮、皮下組織）由来の細胞から初期化遺伝子の導入等により人工的に作製された人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞、並びに、骨髄、脂肪、毛包、脳、神経、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉及びその他の組織に存在し、特定された複数種類の細胞に分化する体性幹細胞が挙げられる。本実施形態において分化誘導される他家幹細胞は、多能性幹細胞であることが好ましい。

「多能性幹細胞」は、生体に存在する複数の細胞に分化可能である、好ましくは胎盤などの胚体外組織以外のすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であれば、特に限定されない。多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）等を挙げることができる。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）から得られるＭｕｓｅ細胞（Ｍｕｌｔｉ−ｌｉｎｅａｇｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｓｔｒｅｓｓ ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌ）及び生殖細胞（例えば精巣）から作製される精子幹細胞（ＧＳ細胞）も多能性幹細胞に包含される。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。胚性幹細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はＬＩＦ（白血病抑制因子）を含む培地中で培養することによって製造することができる。胚性幹細胞の製造方法は、例えば、ＷＯ９６／２２３６２、ＷＯ０２／１０１０５７、ＵＳ５，８４３，７８０、ＵＳ６，２００，８０６、ＵＳ６，２８０，７１８等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関から入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所から入手可能である。マウス胚性幹細胞であるＥＢ５細胞株及びＤ３細胞株は、それぞれ国立研究開発法人理化学研究所及びＡＴＣＣから入手可能である。

胚性幹細胞の一つである核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）は、核を取り除いた卵子に体細胞の核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。

ＥＧ細胞は、始原生殖細胞をｍＳＣＦ、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを含む培地中で培養することによって製造することができる（Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７，１９９２）。

「人工多能性幹細胞」とは、体細胞を、公知の方法等によって初期化（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）することで、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞、又は末梢血単核球等の分化した体細胞を、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ）、Ｇｌｉｓ１、Ｎａｎｏｇ、Ｓａｌｌ４、ｌｉｎ２８、Ｅｓｒｒｂ等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現によって初期化して、多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ｃ−Ｍｙｃ若しくはＬ−Ｍｙｃ）、又は（２）Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌｉｎ２８及びＬ−Ｍｙｃ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１３；３１：４５８−４６６）を挙げることが出来る。

人工多能性幹細胞は、２００６年、山中らによってマウス細胞で樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４），ｐｐ．６６３−６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５），ｐｐ．８６１−８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８），ｐｐ．１９１７−１９２０；Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１），ｐｐ．１０１−１０６）。

人工多能性幹細胞は、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加等によって体細胞から人工多能性幹細胞を誘導する方法によっても製造することができる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，ｐｐ．６５１−６５４）。

人工多能性幹細胞は、株化された人工多能性幹細胞として入手可能である。例えば、京都大学で樹立された２０１Ｂ７細胞、２０１Ｂ７−Ｆｆ細胞、２５３Ｇ１細胞、２５３Ｇ４細胞、１２０１Ｃ１細胞、１２０５Ｄ１細胞、１２１０Ｂ２細胞、１２３１Ａ３細胞等のヒト人工多能性幹細胞株が、京都大学から入手可能である。株化された人工多能性幹細胞として、例えば、京都大学で樹立されたＦｆ−Ｉ０１細胞、Ｆｆ−Ｉ０１ｓ０４細胞、ＱＨＪ−Ｉ０１及びＦｆ−Ｉ１４細胞が、京都大学から入手可能である。また、例えば、理化学研究所で樹立されたＴＬＨＤ２株が、理化学研究所から入手可能である。

人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、臍帯血単核球、Ｔ細胞など）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。

人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子の発現によって初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。上記手段としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、又はエピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、又はエレクトロポレーション法）、ＲＮＡベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法（例えば、針を用いた方法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法）等が挙げられる。

人工多能性幹細胞は、フィーダー細胞存在下又はフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で製造できる。フィーダー細胞非存在下で人工多能性幹細胞を製造する際には、公知の方法で、未分化維持因子存在下で人工多能性幹細胞を製造できる。フィーダー細胞非存在下で人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる培地としては、特に限定は無いが、公知の胚性幹細胞及び／又は人工多能性幹細胞の維持培地、又はフィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための培地を用いることができる。フィーダーフリーで人工多能性幹細胞を樹立するための培地としては、例えばＥｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地（Ｅ８培地）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ６培地、ＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ培地、ｍＴｅＳＲ−Ｅ８培地、Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８培地、ＳｔｅｍＦｉｔ培地等のフィーダーフリー培地を挙げることができる。人工多能性幹細胞を製造する際、例えば、フィーダーフリーで体細胞に、センダイウイルスベクターを用いて、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃの４因子を遺伝子導入することで、人工多能性幹細胞を作製することができる。

多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞であってよく、好ましくはヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である。

他家幹細胞は、レシピエントとＨＬＡの遺伝子型が同じであってもよく、異なっていてよい。第６染色体の短腕に存在する主要組織適合遺伝子複合体抗原（ＭＨＣ）領域に数多くのＨＬＡ遺伝子座（ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＲ等）が存在しており、それぞれに複数（数十種類）のＨＬＡ型（アリル）が存在する。ＨＬＡは膜結合型の糖たんぱく質であり、Ｔ細胞等の免疫細胞に対して抗原提示することで、自己と非自己の認識に関与している。自己と非自己の認識には、主にＨＬＡｃｌａｓｓ １とＨＬＡｃｌａｓｓ ２が関与している。ＨＬＡ ｃｌａｓｓ１（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ１）は主にキラーＴ細胞が認識し、ＨＬＡ ｃｌａｓｓ２（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ２）は主にヘルパーＴ細胞が認識する。ＨＬＡ ｃｌａｓｓ１（ＭＨＣ ｃｌａｓｓ１）が提示する抗原は、細胞内で合成されたタンパク質をプロテアソームによって小さく分解されたペプチド断片である。一方で、ＭＨＣ ｃｌａｓｓ２が提示する抗原は、エンドサイトーシスによって取り込まれた外来性のタンパク質をリソソームによって小さく断片化されたペプチド断片である。

（網膜組織）
「網膜組織（Ｒｅｔｉｎａｌ ｔｉｓｓｕｅ）」とは、生体網膜において各網膜層を構成する網膜系細胞が、一種類又は複数種類、一定の秩序に従い存在する組織を意味し、「神経網膜（Ｎｅｕｒａｌ Ｒｅｔｉｎａ）」は、網膜組織であって、後述する網膜層のうち網膜色素上皮層を含まない内側の神経網膜層を含む組織を意味する。

「網膜系細胞」とは、生体網膜において各網膜層を構成する細胞又はその前駆細胞を意味する。網膜系細胞には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、毛様体周縁部細胞、これらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞等）、網膜前駆細胞等の細胞が含まれるがこれらに限定されない。網膜系細胞のうち、神経網膜層を構成する細胞として、具体的には、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、水平細胞、アマクリン細胞、介在神経細胞、網膜神経節細胞（神経節細胞）、双極細胞（桿体双極細胞、錐体双極細胞）、ミュラーグリア細胞、及びこれらの前駆細胞（例：視細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞等）等の細胞が挙げられる。

上述の網膜系細胞は、それぞれの細胞に発現するマーカーを指標として検出もしくは同定することができる。
細胞に発現するマーカーとしては、例えば、網膜前駆細胞で発現するＲｘ（Ｒａｘとも言う）及びＰＡＸ６、神経網膜前駆細胞で発現するＲｘ、ＰＡＸ６及びＣｈｘ１０、並びに、視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１等が挙げられる。
その他のマーカーとしては、双極細胞で強発現するＣｈｘ１０、双極細胞で発現するＰＫＣα、Ｇｏα、ＶＳＸ１及びＬ７、網膜神経節細胞で発現するＴｕＪ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ及びＨＰＣ−１、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、視細胞及び視細胞前駆細胞で発現するＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、桿体細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ、桿体視細胞及び桿体視細胞前駆細胞で発現するＮｒｌ、錐体視細胞で発現するＳ−ｏｐｓｉｎ及びＬＭ−ｏｐｓｉｎ、錐体細胞、錐体視細胞前駆細胞及び神経節細胞で発現するＲＸＲ−γ、錐体視細胞のうち、分化初期に出現する錐体視細胞又はその前駆細胞で発現するＴＲβ２、ＯＴＸ２及びＯＣ２、水平細胞、アマクリン細胞及び神経節細胞で共通して発現するＰａｘ６、網膜色素上皮細胞で発現するＲＰＥ６５及びＭｉｔｆ、ミューラー細胞で発現するＣＲＡＬＢＰ、並びに、ミュラーグリア細胞で発現するＧＳが挙げられる。

「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。

「神経網膜層」とは、神経網膜を構成する各層を意味し、具体的には、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層及び内境界膜を挙げることができる。「視細胞層」とは、網膜層（神経網膜層）の１種であり、神経網膜の最も外側に形成され、視細胞（桿体視細胞、錐体視細胞）、視細胞前駆細胞及び網膜前駆細胞を多く含む網膜層を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現の有無又は発現の程度等によって確認できる。

本実施形態の治療薬における網膜組織は、立体構造を有しているため、他家由来（例えば、ヒトｉＰＳ細胞、ヒトＥＳ細胞、又は他家幹細胞から分化誘導されたもの）でありながら、治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤の全身的な投与が不要になる。

本実施形態の治療薬における網膜組織は、立体構造を有する。「立体構造を有する」とは、一定数以上の網膜系細胞が凝集体を形成し、当該凝集体中において網膜系細胞が網膜層を構成し、当該網膜層中において網膜系細胞が層状で存在し、かつ、少なくとも組織の一定の範囲において頂端面（Ａｐｉｃａｌ面）と基底膜（Ｂａｓａｌ面）の極性（Ｐｏｌａｒｉｔｙ）が維持されている上皮構造を有していることを意味する。すなわち、「網膜組織が立体構造を有する」とは、網膜組織が、網膜系細胞を含む細胞凝集体（Ｃｅｌｌ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ；Ｏｒｇａｎｏｉｄともいう）であることを意味する。Ａｐｉｃａｌ面にはＺｏ−１、β−ｃａｔｅｎｉｎ、及びＡｔｙｐｉｃａｌ ＰＫＣ等が発現している。基底膜ではＣｏｌｌａｇｅｎ、及びＬａｍｉｎｉｎ等が発現している。

一態様において、網膜組織はスフェア（ｓｐｈｅｒｅ）状細胞凝集体である。「スフェア（ｓｐｈｅｒｅ）状細胞凝集体」とは、球状に近い立体的な形を有する細胞凝集体を意味する。球状に近い立体的な形とは、三次元構造を有する形であって、二次元面に投影したときに、例えば、円形又は楕円形を示す球状形、及び球状形が複数融合して形成される形状（例えば二次元に投影した場合に２〜４個の円形若しくは楕円形が重なりあって形成される形状（例：クローバー型））が挙げられる。一態様において、スフェア状細胞凝集体は、小胞性構造を有し、明視野顕微鏡の下では、中央部が暗く外縁部分が明るく観察されるという特徴を有する。

本明細書における網膜組織は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞を実質的に含まなくてもよい。「網膜色素上皮細胞」とは、生体網膜において神経網膜の外側に存在する上皮細胞を意味する。細胞が網膜色素上皮細胞であるか否かは、当業者であれば、例えば、細胞マーカー（ＲＰＥ６５、Ｍｉｔｆ、ＣＲＡＬＢＰ、ＭＥＲＴＫ、ＢＥＳＴ１等）の発現、メラニン顆粒の存在（黒褐色）、細胞間のタイトジャンクション、及び／又は多角形・敷石状の特徴的な細胞形態等により容易に確認できる。細胞が網膜色素上皮細胞の機能を有するか否かは、ＶＥＧＦ及びＰＥＤＦ等のサイトカインの分泌能等により容易に確認できる。一態様において、網膜色素上皮細胞はＲＰＥ６５陽性細胞、Ｍｉｔｆ陽性細胞、又は、ＲＰＥ６５陽性かつＭｉｔｆ陽性細胞である。すなわち、網膜組織は、ＲＰＥ６５陽性細胞、Ｍｉｔｆ陽性細胞、又は、ＲＰＥ６５陽性かつＭｉｔｆ陽性細胞を実質的に含んでいなくてもよい。

本明細書において、「網膜色素上皮細胞を実質的に含まない」とは、上述した網膜色素上皮細胞のマーカー（例：ＲＰＥ６５及び／又はＭｉｔｆ）によって染色されない、若しくは当該マーカーにより染色される細胞が全細胞中の５％以下（好ましくは、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下）であることを意味する。

上記「スフェア状細胞凝集体」の別の態様として、当該凝集体の一部の領域には、網膜色素上皮細胞及び／又は毛様体周縁部用構造体を含んでいてもよい。一態様として、当該細胞凝集体の外環境に対して形成している連続的な境界面（神経網膜により構成される）の一部が網膜色素上皮細胞により構成され、さらに神経網膜と網膜色素上皮細胞の境界領域に毛様体周縁部用構造体が存在する。すなわち、網膜色素上皮と神経網膜とは、毛様体周縁部様構造体に対して、同一の細胞凝集体内でその外周に沿って隣接して存在している。一例として、ＷＯ２０１３／１８３７７４に開示される細胞凝集体が挙げられる（例えば、ＷＯ２０１３／１８３７７４における図１２Ａ）。網膜色素上皮細胞及び毛様体周縁部用構造体を含む網膜組織の場合、後述する方法により、網膜色素上皮細胞及び毛様体周縁部用構造体を含まない領域を切り出した細胞凝集体（網膜組織）を治療薬として用いることができる。

毛様体周縁部様構造体とは、毛様体周縁部と類似した構造体のことである。「毛様体周縁部（ｃｉｌｉａｒｙ ｍａｒｇｉｎａｌ ｚｏｎｅ；ＣＭＺ）」としては、例えば、生体網膜において神経網膜と網膜色素上皮との境界領域に存在する組織であり、且つ、網膜の組織幹細胞（網膜幹細胞）を含む領域を挙げることができる。毛様体周縁部は、毛様体縁（ｃｉｌｉａｒｙ ｍａｒｇｉｎ）又は網膜縁（ｒｅｔｉｎａｌ ｍａｒｇｉｎ）とも呼ばれ、毛様体周縁部、毛様体縁及び網膜縁は同等の組織である。毛様体周縁部は、網膜組織への網膜前駆細胞、分化細胞の供給、網膜組織構造の維持等に重要な役割を果たしていることが知られている。毛様体周縁部のマーカー遺伝子としては、例えば、Ｒｄｈ１０遺伝子（陽性）、Ｏｔｘ１遺伝子（陽性）及びＺｉｃ１（陽性）を挙げることができる。

網膜組織の長軸方向の直径は、０．１ｍｍ以上、又は０．２ｍｍ以上（好ましくは０．３ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上、０．８ｍｍ以上、１．０ｍｍ以上、１．２ｍｍ以上、１．４ｍｍ以上、１．６ｍｍ以上、１．８ｍｍ以上、又は２．０ｍｍ以上）であってよい。網膜組織の長軸方向の直径の上限は特にないが、例えば、５．０ｍｍ以下又は１０ｍｍ以下であってよい。網膜組織の長軸方向の直径は、０．１ｍｍ以上１０ｍｍ以下、０．２ｍｍ以上１０ｍｍ以下、０．３ｍｍ以上１０ｍｍ以下、０．５ｍｍ以上１０ｍｍ以下、０．８ｍｍ以上１０ｍｍ以下、１．０ｍｍ以上１０ｍｍ以下、１．２ｍｍ以上５．０ｍｍ以下、１．４ｍｍ以上５．０ｍｍ以下、１．６ｍｍ以上５．０ｍｍ以下、１．８ｍｍ以上５．０ｍｍ以下、又は２．０ｍｍ以上５．０ｍｍ以下であってよい。本発明の一態様において、網膜組織の長軸方向の直径は、短軸方向の直径の約１．２倍、１．５倍又は２倍であってよい。別の態様において、網膜組織の長軸方向の直径と短軸方向の直径はほぼ同等であってよい。

網膜組織の短軸方向の直径は、０．０５ｍｍ以上（好ましくは０．１ｍｍ以上、０．２ｍｍ以上、０．４ｍｍ以上、０．６ｍｍ以上、０．８ｍｍ以上、又は１．０ｍｍ以上）であってよい。網膜組織の短軸方向の直径の上限は特にないが、例えば、２．５ｍｍ以下又は５ｍｍ以下であってよい。網膜組織の短軸方向の直径は、０．０５ｍｍ以上５ｍｍ以下、０．１ｍｍ以上５ｍｍ以下、０．２ｍｍ以上５ｍｍ以下、０．４ｍｍ以上５ｍｍ以下、０．６ｍｍ以上２．５ｍｍ以下、０．８ｍｍ以上２．５ｍｍ以下、又は１．０ｍｍ以上２．５ｍｍ以下であってよい。

ここで、網膜組織の長軸方向又は短軸方向の直径とは、例えば、実体顕微鏡を用いて撮影された画像に基づいて測定する場合、網膜組織のアピカル面側の外周（輪郭、表面）中の任意の２点を結んだ直線の中で最も長い直線の長さ（長軸方向の直径）又は最も短い直線の長さ（短軸方向の直径）を意味する。なお、網膜組織を含む凝集体の中には、複数の網膜組織が重なりあって存在する場合がある（例：クローバー型）。この場合、網膜組織の長軸方向の直径又は短軸方向の直径とは、凝集体中のそれぞれの網膜組織における長軸方向又は短軸方向の直径を意味し、少なくとも１つの網膜組織の長軸方向又は短軸方向の直径が上述の範囲内であればよい。クローバー型の網膜組織の場合、具体的には、網膜組織の外周（輪郭、表面、アピカル面）を円又は楕円とみなしたうえで、形状的に見て２つの円又は楕円が重なった点（より具体的には、網膜組織を含む凝集体の外周の連続的な位置情報を仮定的に定めた場合に、当該位置情報を横軸、当該位置における接線の傾きを縦軸にプロットしたときに得られる曲線において、当該曲線の連続性が失われる点）で区切られた外周中の任意の２点を結んだ直線の中で最も長い直線又は最も短い直線の長さを測定する。なお、複数の網膜組織を含むかどうかは顕微鏡下での観察等により、当業者であれば容易に判断可能である。

網膜組織の上皮構造の厚み（ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）は、０．０５ｍｍ以上（好ましくは０．１ｍｍ以上、０．１２ｍｍ以上、０．１５ｍｍ以上、０．２ｍｍ以上、０．２５ｍｍ以上、又は０．３ｍｍ以上）であってよい。網膜組織の上皮構造の厚みの上限は特にないが、例えば、１ｍｍ以下（例えば、０．９ｍｍ以下、０．８ｍｍ以下、０．７ｍｍ以下、０．６ｍｍ以下、又は０．５ｍｍ以下）であってよい。網膜組織の上皮構造の厚みは、例えば、０．０５ｍｍ以上１ｍｍ以下、０．１ｍｍ以上０．９ｍｍ以下、０．１２ｍｍ以上０．８ｍｍ以下、０．１５ｍｍ以上０．７ｍｍ以下、０．２ｍｍ以上０．６ｍｍ以下、０．２５ｍｍ以上０．５ｍｍ以下、又は０．３ｍｍ以上０．５ｍｍ以下であってよい。ここで、網膜組織の上皮構造の厚みとは、網膜組織の頂端面から基底膜までの厚みを意味する。

網膜組織１個当たりに含まれる総細胞数は、当該網膜組織の大きさに依存する。網膜組織１個当たりに含まれる総細胞数は、１×１０^４細胞以上、１×１０⁵細胞以上、５×１０⁵細胞以上又は１×１０^６細胞以上であってよい。例えば、長軸方向の直径が０．５ｍｍである網膜組織において、網膜組織の総細胞数は、１×１０^４細胞以上であってよく、好ましくは１×１０⁵細胞以上、５×１０⁵細胞以上又は１×１０^６細胞以上である。また、視細胞層の頂端面において最も外側に存在する細胞（視細胞前駆細胞、視細胞など）は、０．１ｍｍあたり１０細胞以上、１５細胞以上、２０細胞以上が連続して並んでいる。

一実施形態における網膜組織の、長軸方向の直径は０．５ｍｍ以上、上皮構造の厚みは０．２ｍｍ以上、細胞数は１×１０⁵以上であってよい。一実施形態における網膜組織は、１×１０^５細胞／ｍｍ^３以上、好ましくは、５×１０^５細胞／ｍｍ^３以上、又は１×１０^６細胞／ｍｍ^３以上の密度で細胞を含む。

網膜組織は、連続上皮構造を有する網膜組織であってよい。連続上皮構造を有する網膜組織は、例えば、網膜組織の表面、すなわち頂端面において最も外側の層の、面積比で少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、又は９０％以上）において視細胞又はその前駆細胞が連続して存在する網膜組織であってよい。連続上皮構造を有する網膜組織として、例えば、網膜組織の表面に存在する頂端面の面積が、網膜組織の表面の面積に対し、少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、又は９０％以上）である網膜組織を含んでいてよい。

本明細書において、網膜組織における「連続上皮構造」とは、網膜組織が上皮組織に特有の頂端面を持ち、頂端面が神経網膜層を形成する各層のうち、少なくとも視細胞層（外顆粒層）又はニューロブラスティックレイヤー（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｉｃ ｌａｙｅｒ）と概ね平行に、かつ連続的に網膜組織の表面に形成される構造を指す。すなわち、連続上皮構造は、頂端面と基底膜の方向性が維持され、ロゼット様構造でみとめられるような頂端面が分断される構造を持たない。例えば、多能性幹細胞より作製した網膜組織を含む細胞凝集体の場合、凝集体の表面に頂端面が形成され、表面に対して接線方向に１０細胞以上、好ましくは３０細胞以上、より好ましくは１００細胞以上、更に好ましくは４００細胞以上の視細胞又は視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する。連続して配列する視細胞又は視細胞前駆細胞の数は、細胞凝集体に含まれる神経網膜組織の大きさと相関する。本明細書において、上皮組織に対する接線方向とは、上皮組織において例えば頂端面を形成する一つ一つの細胞が一定方向に並んでいる場合の細胞が並んでいる方向のことをいい、上皮組織（又は上皮シート）に対して平行方向又は横方向のことをいう。

一態様において、神経網膜組織の表面には頂端面が形成され、その頂端面に沿って視細胞又は視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する。
視細胞又は視細胞前駆細胞の出現割合が少ない段階の網膜組織（例：発生初期段階の網膜組織）の場合、増殖する神経網膜前駆細胞を含む層は「ニューロブラスティックレイヤー」と呼ばれることが当業者に知られている。また、このような段階の網膜組織の表面には視細胞又は視細胞前駆細胞以外に、極性を持ち、頂端面を形成可能な神経網膜前駆細胞若しくは神経網膜前駆細胞から分裂、増殖する細胞、及び／又は、神経網膜前駆細胞から神経網膜を構成する細胞へと分化する段階の細胞が存在することがある。例えば、このような状態の網膜組織を、「連続上皮構造」を維持する条件で培養を継続することにより、神経網膜組織の表面に形成される頂端面に沿って、視細胞又は視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する網膜組織が得られる。

一態様において、網膜組織の表面に存在する頂端面の面積は網膜組織の表面の面積に対し、平均で３０％以上であってよく、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上である。網膜組織の表面に存在する頂端面の面積の割合は、後述する通り、頂端面のマーカーを染色することで測定可能である。

本明細書において、網膜組織における「ロゼット様構造」とは、中心部の管腔を囲むように放射状又はらせん状に細胞が配列した構造を指す。ロゼット様構造を形成した網膜組織においては、その中心部（管腔）に沿って頂端面及び視細胞、又は視細胞前駆細胞が存在する状態となり、頂端面はロゼット様構造毎に分断されている。

本明細書において、「頂端面（ａｐｉｃａｌ ｓｕｒｆａｃｅ）」とは、上皮組織において、ムコ多糖に富み（ＰＡＳ染色陽性）、ラミニン及びＩＶ型コラーゲンを多く含む５０−１００ｎｍの、上皮細胞が産生した層（基底膜（ｂａｓａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ））が存在する基底膜側とは反対側に形成される表面（表層面）のことをいう。一態様において、視細胞又は視細胞前駆細胞が認められる程度に発生段階が進行した網膜組織においては、外境界膜が形成され、視細胞、視細胞前駆細胞が存在する視細胞層（外顆粒層）に接する面のことをいう。また、このような頂端面は、頂端面のマーカー（例：ａｔｙｐｉｃａｌ−ＰＫＣ（以下ａＰＫＣと略す）、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｚｏ−１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｅｚｒｉｎ）に対する抗体を用いて、当業者に周知の免疫染色法等で同定することができる。発生初期段階で、視細胞又は視細胞前駆細胞が出現していない場合や、視細胞又は視細胞前駆細胞が網膜組織の表面を十分に覆うほど出現していない場合でも、上皮組織は極性を持ち、頂端面では上記頂端面のマーカーを発現する。

網膜組織が連続上皮構造を有するかどうかは、網膜組織が有する頂端面の連続性（すなわち、分断されていない形態）により確認することができる。頂端面の連続性は、例えば、頂端面のマーカー（例：ａＰＫＣ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｚｏ−１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｅｚｒｉｎ）、頂端面側に位置する視細胞又は視細胞前駆細胞のマーカー（例：Ｃｒｘ又はリカバリン）を免疫染色し、取得した画像等について頂端面と視細胞層、及び各網膜層の位置関係を解析することにより判定できる。頂端面及び視細胞層（外顆粒層）以外の網膜層については、細胞核を染色するＤＡＰＩ染色、ＰＩ染色、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、又は細胞核に局在するマーカータンパク（Ｒｘ、Ｃｈｘ１０、Ｋｉ６７、Ｃｒｘ等）等による免疫染色等により同定できる。

ロゼット様構造が生じたか否かについては、細胞凝集体を４％パラホルムアルデヒドで固定する等した後凍結切片を作製し、頂端面マーカーであるａＰＫＣ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎに対する抗体、又は核を特異的に染色するＤＡＰＩ等を用いて通常実施される免疫染色等によりロゼット様構造の異形成（例：分断された頂端面又は頂端面の細胞凝集体内への侵入）を観察することで決定できる。

一態様において、網膜組織における網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞及び視細胞前駆細胞の割合、すなわち、ＰＡＸ６、Ｃｈｘ１０及び／又はＣｒｘを発現する細胞の割合は、総細胞数の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上であってよい。網膜組織１個当たりに含まれる総細胞数の５０％以上が、ＰＡＸ６、Ｃｈｘ１０及びＣｒｘの少なくとも一つを発現する細胞であってよい。

一態様において、本明細書の網膜組織における頂端面側の最も外側の層（視細胞層又はニューロブラスティックレイヤー）に存在する、ＰＡＸ６、Ｃｈｘ１０及び／又はＣｒｘを発現する細胞の割合は、頂端面側の最も外側の層に存在する総細胞数の８０％以上であってよく、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上である。別の態様において、本明細書の網膜組織における頂端面側の最も外側の層（視細胞層又はニューロブラスティックレイヤー）に存在する、視細胞前駆細胞（Ｃｒｘ陽性、かつロドプシン、Ｓ−Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ−Ｏｐｓｉｎ陰性の細胞）及び視細胞（Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ陽性細胞、又は、ロドプシン、Ｓ−Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ−Ｏｐｓｉｎのいずれかが陽性の細胞）の割合は、頂端面側の最も外側の層に存在する総細胞数の８０％以上であってよく、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上である。

一態様において、網膜組織は、視細胞を含んでいてよい。「視細胞（ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｅｌｌ）」とは、網膜の視細胞層に存在し、光刺激を吸収し電気信号へと変換する役割を持つ。視細胞には、明所で機能する錐体（ｃｏｎｅ）と暗所で機能する杆体（又は桿体、ｒｏｄ）の２種類がある。視細胞は視細胞前駆細胞から分化し、成熟する。細胞が視細胞若しくは視細胞前駆細胞であるか否かは、当業者であれば、例えば後述する細胞マーカー（視細胞前駆細胞で発現するＣｒｘ及びＢｌｉｍｐ１、視細胞で発現するリカバリン（Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ）、成熟視細胞で発現するロドプシン、Ｓ−Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ−Ｏｐｓｉｎ等）の発現、外節構造の形成等により容易に確認できる。

一態様において、本明細書の網膜組織は、視細胞前駆細胞（Ｃｒｘ陽性、かつロドプシン、Ｓ−Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ−Ｏｐｓｉｎ陰性の細胞）及び視細胞（Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ陽性細胞、又は、ロドプシン、Ｓ−Ｏｐｓｉｎ及びＭ／Ｌ−Ｏｐｓｉｎのいずれかが陽性の細胞）を含んでいてよい。

一態様において、本明細書の網膜組織におけるＲｅｃｏｖｅｒｉｎを発現する細胞の割合は、総細胞数の５％以上であってよく、好ましくは１０％以上、２０％以上、４０％以上、又は５０％以上であってよい。一態様において、本明細書の網膜組織におけるＲｅｃｏｖｅｒｉｎを発現する細胞の割合は、視細胞層に存在する総細胞数の８０％以上であってよく、好ましくは８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、又は９９％以上である。

網膜組織は、ＴＧＦ（トランスフォーミング増殖因子）βを発現することを特徴とするものであってよい。ＴＧＦβは、細胞の増殖及び分化を制御し、生体の恒常性を維持するサイトカインの一つである。ＴＧＦβには、５種類のサブタイプ（β１〜β５）の存在が知られており、哺乳類では３種類のサブタイプ（β１〜３）が知られている。これらの発現により、免疫抑制効果が期待される。これらのうち、好ましくは、網膜組織は、ＴＧＦβ２を発現するものであってよい。ＴＧＦβ２は、精巣等の免疫特権がある部位で発現している。ＴＧＦβ２の発現により、免疫抑制効果が期待される。

ＴＧＦβは、網膜組織の表面、すなわち、頂端面及び／又は頂端面側の最も外側の層に存在する細胞において存在する方が好ましい。ＴＧＦβが網膜組織の表面に存在するとは、頂端面側の最も外側の層に存在する細胞においてＴＧＦβを発現及び分泌し、及び／又はＴＧＦβが頂端面に存在する、すなわち、頂端面に存在するマトリクス（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎなど）などと上記細胞から分泌されたＴＧＦβが結合している状態をいう。より具体的には、連続上皮構造を有することで頂端面と基底膜の方向性が維持された網膜組織において、頂端面側に存在する最も外側の細胞（好ましくは外側から１、２又は３個程度内側に存在する細胞）においてＴＧＦβが発現および分泌し、頂端面においてＴＧＦβが存在することが好ましい。好ましくは、頂端面におけるＴＧＦβの存在割合は、面積比において、頂端面全体の面積の５０％以上であってよく、さらに好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上である。また、好ましくは、頂端面側に存在する最も外側の細胞の５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上において、ＴＧＦβを発現する。

ＴＧＦβの発現量は、当業者であれば周知技術を用いて測定可能である。具体的には、培養後の培地中のＴＧＦβの発現量をＥＬＩＳＡなどで測定すればよい。一態様として、ＴＧＦβの発現量は、原材料とした多能性幹細胞に対して１０倍以上であってよく、好ましくは５０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、又は５００倍以上である。別態様として、１つの網膜組織におけるＴＧＦβの発現量は、１つの網膜組織を１ｍＬの培地で２日間培養した場合において、１ｐｇ／ｍＬ以上であってよく、好ましくは２ｐｇ／ｍＬ以上、５ｐｇ／ｍＬ以上、又は１０ｐｇ／ｍＬ以上程度である。また、ＴＧＦβの発現部位は、当業者であれば周知技術を用いて測定可能である。具体的には、抗ＴＧＦβ抗体を用いて網膜組織の免疫染色を行えばよい。必要に応じて、上述した頂端面のマーカーとともに共染色すれば、頂端面におけるＴＧＦβの存在の有無及び割合を確認することができる。

本明細書における治療薬の有効成分である網膜組織には、幹細胞から分化誘導された網膜組織を一部解離（ｓｅｍｉ−ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅｄ）又は一部切り出して得られる細胞凝集体も含まれる。一部解離又は一部切り出して得られる細胞凝集体は、例えば、幹細胞から分化誘導された網膜組織の１／４、１／８、１／１６、１／３２、１/６４、又は１／１２８程度の大きさ（細胞数基準）であってよい。解離方法は酵素を使用しても、ハサミ又はナイフ等を用いて物理的に切り出してもよい。

すなわち、一態様として、本明細書における治療薬の有効成分である立体構造を有する網膜組織は、以下の特徴を有する。
（１）細胞凝集体中において網膜系細胞が網膜層を構成し、当該網膜層中において網膜系細胞が層状で存在しており、
（２）当該網膜組織の長軸方向の直径が０．２ｍｍ以上（好ましくは０．５ｍｍ以上）、当該網膜組織の上皮構造の厚みが０．２ｍｍ以上、及び、当該網膜組織に含まれる総細胞数が１×１０^５細胞以上であり（又は、当該網膜組織が１×１０^５細胞／ｍｍ^３以上の密度で細胞を含み）、
（３）当該網膜組織１個あたりに含まれる総細胞数の５０％以上（好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上）が、ＰＡＸ６、Ｃｈｘ１０及びＣｒｘの少なくとも一つを発現する細胞であり、及び／又は、視細胞層又はニューロブラスティックレイヤーに存在する総細胞数の８０％以上（好ましくは８５％以上、９０％以上、又は９５％以上）が、ＰＡＸ６、Ｃｈｘ１０及びＣｒｘの少なくとも一つを発現する細胞であり、
（４）当該網膜組織は、網膜組織の表面の面積比で、少なくとも５０％以上（好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、又は９０％以上）の連続上皮構造を有し、
（５）当該網膜組織はＴＧＦβ（好ましくはＴＧＦβ２）を発現する、好ましくは、ＴＧＦβは網膜組織の表面に存在する。
上記網膜組織は、下記の特徴の１又は２以上を更に有してもよい。
（Ａ）当該網膜組織はスフェア状細胞凝集体であり、好ましくは、小胞性構造を有している。
（Ｂ）網膜色素上皮細胞を実質的に含まない。
（Ｃ）当該網膜組織の頂端面において最も外側に存在する細胞が、０．１ｍｍあたり１０細胞以上（好ましくは、１５細胞以上、又は２０細胞以上）が連続して並んでいる。
（Ｄ）当該網膜組織は視細胞を含んでいてよい、好ましくは、視細胞層に存在する総細胞数の８０％以上、又は、網膜組織中の総細胞数の５％以上である。
（Ｅ）当該網膜組織が多能性幹細胞由来である。

網膜組織は、一態様として、他家幹細胞（例えば、他家多能性幹細胞）から分化誘導されたものである。分化誘導を行う方法としては、ＷＯ２０１１／０５５８５５、ＷＯ２０１３／０７７４２５、ＷＯ２０１５／０２５９６７、ＷＯ２０１６／０６３９８５、ＷＯ２０１６／０６３９８６、ＷＯ２０１７／１８３７３２、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１０ Ｊａｎ ２０；５（１）：ｅ８７６３．、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ． ２０１１ Ａｕｇ；２９（８）：１２０６−１８．、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ２０１４ Ｊｕｎ １０；１１１（２３）：８５１８−２３、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ． ２０１４ Ｊｕｎ １０；５：４０４７等に開示されている方法が挙げられるが、特に限定されない。別の態様として、他家の生体由来の網膜組織を用いることもできる。生体から網膜組織を調製する方法は、当業者にとって周知である。具体的には、麻酔下で網膜組織を切り出すことができる。切り出した網膜組織から、ＲＰＥ細胞を切除することも可能である。

神経網膜を分化誘導により製造する方法の具体的な一態様として、下記工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含む方法が挙げられる。
（Ａ）：多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、１）ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質、並びに２）未分化維持因子を含む培地で培養する工程、
（Ｂ）：無血清培地中で浮遊培養することによって細胞凝集体を形成させる工程、
（Ｃ）：工程（Ｂ）で得られた細胞凝集体を、ＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナル伝達経路作用物質を含む培地中でさらに浮遊培養する工程。

本方法は、例えばＷＯ２０１６／０６３９８５又はＷＯ２０１７／１８３７３２にも開示されており、より詳細にはＷＯ２０１６／０６３９８５又はＷＯ２０１７／１８３７３２を参照することが可能である。

ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路、すなわちＳｍａｄファミリーによって伝達される、シグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質（例：ＳＢ４３１５４２：４−［４−（１，３−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−５−（２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ］−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ、ＬＹ−３６４９４７：４−［３−（２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌ−４−ｙｌ］−ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、ＳＢ−５０５１２４：２−［４−（１，３−ｂｅｎｚｏｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−２−（１，１−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−５−ｙｌ］−６−ｍｅｔｈｙｌ−ｐｙｒｉｄｉｎｅ、Ａ−８３−０１：３−（６−Ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−Ｎ−ｐｈｅｎｙｌ−４−（４−ｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌ）−１Ｈ−ｐｙｒａｚｏｌｅ−１−ｃａｒｂｏｔｈｉｏａｍｉｄｅ等）、Ｎｏｄａｌ／Ａｃｔｉｖｉｎシグナル伝達経路阻害物質（例：ＳＢ４３１５４２、Ａ−８３−０１等）及びＢＭＰシグナル伝達経路阻害物質（例：ＬＤＮ１９３１８９：４−［６−［４−（１−Ｐｉｐｅｒａｚｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ：６−［４−［２−（１−Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌ）ｅｔｈｏｘｙ］ｐｈｅｎｙｌ］−３−（４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）−ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ等）を挙げることができる。これらの物質は市販されており入手可能である。

ソニック・ヘッジホッグ（以下、「Ｓｈｈ」と記すことがある。）シグナル伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈによって媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＳＨＨ、ＰＭＡ（Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ：９−Ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ−Ｎ−［４−（４−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］−２−（１−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌｏｘｙ）−９Ｈ−ｐｕｒｉｎ−６−ａｍｉｎｅ）、ＳＡＧ（Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ Ａｇｏｎｉｓｔ：３−Ｃｈｌｏｒｏ−Ｎ−［ｔｒａｎｓ−４−（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ］−Ｎ−［［３−（４−ｐｙｒｉｄｉｎｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］ｍｅｔｈｙｌ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎｅ−２−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）等が挙げられる。

ＴＧＦβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えば、ＳＢ４３１５４２は、通常０．１〜２００μＭ、好ましくは２〜５０μＭの濃度で使用される。Ａ−８３−０１は、通常０．０５〜５０μＭ、好ましくは０．５〜５μＭの濃度で使用される。ＬＤＮ１９３１８９は、通常１〜２０００ｎＭ、好ましくは１０〜３００ｎＭの濃度で使用される。ＳＡＧは、通常、１〜２０００ｎＭ、好ましくは１０〜７００ｎＭの濃度で使用される。ＰＭＡは、通常０．００２〜２０μＭ、好ましくは０．０２〜２μＭの濃度で使用される。

工程（Ａ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、培地として未分化維持因子を含む上記フィーダーフリー培地を用いるとよい。

工程（Ａ）におけるフィーダーフリー条件での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２８，６１１−６１５，（２０１０））、ラミニン断片（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３，１２３６，（２０１２））、基底膜標品（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９，９７１−９７４，（２００１）、例：マトリゲル）、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、ビトロネクチン（Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ）等が挙げられる。

工程（Ａ）における多能性幹細胞の培養時間は、工程（Ｂ）において形成される細胞凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲であってよく、特に限定されないが、通常０．５〜１４４時間である。一態様において、工程（Ａ）における多能性幹細胞の培養時間は、好ましくは２〜９６時間、より好ましくは６〜４８時間、さらに好ましくは１２〜４８時間、よりさらに好ましくは１８〜２８時間（例、２４時間）である。

無血清培地の準備及び細胞凝集体の形成は当業者にとって周知の方法で行うことができる。無血清培地の準備及び細胞凝集体の形成を行う方法としては、例えば、ＳＦＥＢ法：Serum-free Floating culture of Embryoid Bodies-like aggregates（Watanabe et al. Nature Neuroscience, volume 8, pages 288−296 (2005)）、及びＳＦＥＢ法の改良法であるＳＦＥＢｑ法（Eiraku etal.Cell Stem Cell, Volume 3, ISSUE 5, P519-532, November 06, 2008）が挙げられる。ＳＦＥＢｑ法とは、具体的には、１ウェルの直径が１ｃｍ弱程度の非細胞接着性培養皿（例：９６ウェルプレートの１ウェル：約７ｍｍ）に多能性幹細胞を約１２０００個ずつ入れ、２〜３時間以内に素早く凝集塊を作成する方法を意味する。

一態様において、工程（Ｂ）において用いられる培地は、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含んでいてよい。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質としては、上述したものを上述の濃度で用いることができる。ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは、浮遊培養開始時から培地に含まれる。培地には、ＲＯＣＫ阻害剤（例、Ｙ−２７６３２）を添加してもよい。培養時間は例えば、１２時間〜６日間であってよい。

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰによって媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４若しくはＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチド等が挙げられる。ＢＭＰ２タンパク質、ＢＭＰ４タンパク質及びＢＭＰ７タンパク質は例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から、ＧＤＦ７タンパク質は例えば富士フイルム和光純薬株式会社から入手可能である。

用いられる培地は、例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地（好ましくは、無血清培地）が挙げられる。無血清培地、及び血清培地は上述の通り準備することができる。

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜系細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばヒトＢＭＰ４タンパク質の場合は、約０．０１ｎＭ〜約１μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭ、より好ましくは約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、さらに好ましくは約１．５ｎＭ（５５ｎｇ／ｍＬ）の濃度となるように培地に添加する。

ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（Ａ）の浮遊培養開始から約２４時間後以降に添加されていればよく、浮遊培養開始後数日以内（例えば、１５日以内）に培地に添加されてもよい。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは浮遊培養開始後１日目〜１５日目までの間、より好ましくは１日目〜９日目までの間、最も好ましくは３日目に培地に添加されてよい。

具体的な態様として、例えば、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後１〜９日目に、好ましくは工程（Ｂ）の浮遊培養開始後１〜３日目に、培地の一部又は全部をＢＭＰ４を含む培地に交換し、ＢＭＰ４の終濃度を約１〜１０ｎＭに調整し、ＢＭＰ４の存在下で例えば１〜１２日間、好ましくは２〜９日間、さらに好ましくは２〜５日間培養することができる。ここにおいて、ＢＭＰ４の濃度を、同一濃度を維持すべく、１若しくは２回程度培地の一部又は全部をＢＭＰ４を含む培地に交換することができる。又はＢＭＰ４の濃度を段階的に減じることもできる。

上記工程（Ａ）〜工程（Ｃ）における培養温度、ＣＯ_２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃〜約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ_２濃度は、例えば約１％〜約１０％、好ましくは約５％である。

上記工程（Ｃ）における培養期間を変動させることによって、様々な分化段階の網膜系細胞を含む網膜組織を製造することができる。すなわち、未成熟な網膜系細胞（例：網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞）と成熟した網膜系細胞（例：視細胞）とを様々な割合で含む網膜組織を製造することができる。工程（Ｃ）の培養期間を延ばすことによって、成熟した網膜系細胞の割合を増やすことができる。なお、「未成熟な網膜系細胞」とは、成熟した網膜系細胞への分化が決定づけられている前駆細胞を意味する。

上記工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）は、ＷＯ２０１７／１８３７３２に開示された方法を使用することもできる。すなわち、工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）において、工程（Ａ）により得られた細胞を、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質をさらに含む培地で浮遊培養し、神経網膜を形成することができる。

工程（Ｂ）及び／又は工程（Ｃ）に用いる、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、タンパク質、核酸、低分子化合物等のいずれであってもよい。Ｗｎｔにより媒介されるシグナルは、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ（Ｆｚ）及びＬＲＰ５／６（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ５／６）のヘテロ二量体として存在するＷｎｔ受容体を介して伝達される。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、Ｗｎｔ又はＷｎｔ受容体に直接作用する物質（抗Ｗｎｔ中和抗体、抗Ｗｎｔ受容体中和抗体等）、Ｗｎｔ又はＷｎｔ受容体をコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ等）、Ｗｎｔ受容体とＷｎｔの結合を阻害する物質（可溶型Ｗｎｔ受容体、ドミナントネガティブＷｎｔ受容体等、Ｗｎｔアンタゴニスト、Ｄｋｋ１、Ｃｅｒｂｅｒｕｓタンパク質等）、Ｗｎｔ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質［ＣＫＩ−７（Ｎ−（２−アミノエチル）−５−クロロイソキノリン−８−スルホンアミド）、Ｄ４４７６（４−［４−（２，３−ジヒドロ−１，４−ベンゾジオキシン−６−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］ベンズアミド）、ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏ （ＩＷＲ１ｅ） （４−［（３ａＲ，４Ｓ，７Ｒ，７ａＳ）−１，３，３ａ，４，７，７ａ−ヘキサヒドロ−１，３−ジオキソ−４，７−メタノ−２Ｈ−イソインドール−２−イル］−Ｎ−８−キノリニル−ベンズアミド）、並びに、ＩＷＰ−２（Ｎ−（６−メチル−２−ベンゾチアゾリル）−２−［（３，４，６，７−テトラヒドロ−４−オキソ−３−フェニルチエノ［３，２−ｄ］ピリミジン−２−イル）チオ］アセタミド）等の低分子化合物等］等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として、これらを一種又は二種以上含んでいてもよい。ＣＫＩ−７、Ｄ４４７６、ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏ （ＩＷＲ１ｅ）、ＩＷＰ−２等は公知のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質であり、市販品等を適宜入手可能である。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質として好ましくはＩＷＲ１ｅが用いられる。

工程（Ｂ）におけるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、良好な細胞凝集体の形成を誘導可能な濃度であればよい。例えばＩＷＲ−１−ｅｎｄｏの場合は、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約０．３μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１μＭから約１０μＭ、更に好ましくは約３μＭの濃度となるように培地に添加する。ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏ以外のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏの濃度と同等のＷｎｔシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。

工程（Ｂ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を培地に添加するタイミングは、早い方が好ましい。Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質は、工程（Ｂ）における浮遊培養開始から、通常６日以内、好ましくは３日以内、より好ましくは１日以内、より好ましくは１２時間以内、更に好ましくは工程（Ｂ）における浮遊培養開始時に、培地に添加される。具体的には、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を添加した基礎培地の添加や、該基礎培地への一部若しくは全部の培地交換を行う事ができる。工程（Ａ）で得られた細胞を、工程（Ｂ）においてＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は特に限定されないが、好ましくは、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時に培地へ添加した後、工程（Ｂ）終了時（ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質添加直前）まで作用させる。更に好ましくは、後述する通り、工程（Ｂ）終了後（すなわち工程（Ｃ）の期間中）も、継続してＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に曝露させる。一態様としては、後述する通り、工程（Ｂ）終了後（すなわち工程（Ｃ）の期間中）も、継続してＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させ、網膜組織が形成されるまで作用させてもよい。

工程（Ｃ）において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質としては、前述のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質のいずれかを用いる事ができるが、好ましくは、工程（Ｂ）で用いたＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質と同一の種類のものを工程（Ｃ）において使用する。

工程（Ｃ）におけるＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、網膜前駆細胞及び網膜組織を誘導可能な濃度であればよい。例えばＩＷＲ−１−ｅｎｄｏの場合は、約０．１μＭから約１００μＭの濃度となるように培地に添加してよく、好ましくは約０．３μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１μＭから約１０μＭ、更に好ましくは約３μＭの濃度となるように培地に添加してよい。ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏ以外のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記ＩＷＲ−１−ｅｎｄｏの濃度と同等のＷｎｔシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。工程（Ｃ）の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、工程（Ｂ）の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度を１００としたとき、好ましくは５０〜１５０、より好ましくは８０〜１２０、更に好ましくは９０〜１１０であり、第二工程の培地中のＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質の濃度と同等であることが、より好ましい。

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質の培地への添加時期は、網膜系細胞若しくは網膜組織を含む凝集体形成を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が好ましい。好ましくは、工程（Ｃ）開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が培地に添加される。より好ましくは、工程（Ｂ）においてＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、工程（Ｃ）においても継続して（即ち、工程（Ｂ）の開始時から）培地中に含まれる。更に好ましくは、工程（Ｂ）の浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加された後、工程（Ｃ）においても継続して培地中に含まれる。例えば、工程（Ｂ）で得られた培養物（Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質を含む培地中の凝集体の懸濁液）にＢＭＰシグナル伝達作用物質（例、ＢＭＰ４）を添加してもよい。

Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、特に限定されないが、好ましくは、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時を起算点として、２日間から３０日間、より好ましくは６日間から２０日間、８日間から１８日間、１０日間から１８日間、又は１０日間から１７日間（例えば、１０日間）である。別の態様において、Ｗｎｔシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時にＷｎｔシグナル伝達経路阻害物質が添加される場合において、工程（Ｂ）における浮遊培養開始時を起算点として、好ましくは３日間から１５日間（例えば、５日間、６日間、又は７日間）であり、より好ましくは６日間から１０日間（例えば、６日間）である。

上述した方法で得た網膜系細胞の細胞凝集体を、更に下記工程に付すことにより、毛様体周縁部様構造体を含む神経網膜を製造することもできる。毛様体周縁部様構造体を含む神経網膜を製造することにより、視細胞前駆細胞等を豊富に含み、連続上皮構造が高い頻度で含まれる神経網膜を製造する事が可能である。
工程Ｄ：Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質、及び／又は、ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で３日間から６日間程度の期間培養する工程。
工程Ｅ：工程Ｄにより得られた細胞凝集体を、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない無血清培地又は血清培地中で３０日間〜１５０日間（好ましくは、３０日間〜１２０日間、又は３０日間〜１００日間）程度培養する工程。

一態様として、工程（Ａ）〜（Ｃ）で得られた神経網膜を含む細胞凝集体であって、工程（Ｂ）の浮遊培養開始後６〜３０日目、１０〜２０日目（１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目又は２０日目）の神経網膜を含む細胞凝集体から、上記工程（Ｄ）及び工程（Ｅ）により、毛様体周縁部様構造体を製造できる。

Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、Ｗｎｔによって媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。具体的なＷｎｔシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）を挙げることができる。工程Ｄにおける無血清培地又は血清培地中のＷｎｔシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばＣＨＩＲ９９０２１の場合には、約０．１μＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１μＭ〜約３０μＭの範囲を挙げることができる。

ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としては、ＦＧＦによって媒介されるシグナル伝達を阻害できるものである限り特に限定されない。ＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、ＳＵ−５４０２、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８等が挙げられる。工程Ｄにおける無血清培地又は血清培地中のＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、例えばＳＵ−５４０２の場合、約０．１μＭ〜約１００μＭ、好ましくは約１μＭ〜約３０μＭ、より好ましくは約５μＭの濃度で添加する。

上述の方法によって、網膜組織（神経網膜）を製造することができるが、これらに限定されない。

「移植による拒絶反応」とは、移植を受けた患者（レシピエント）の免疫応答により、移植された組織又は臓器を拒絶しようとする個体の防御反応を意味する。

移植による拒絶反応は、発症する時期に応じて、例えば、急性期及び慢性期に分類される。急性期の拒絶反応は移植日又は移植後数日（例えば、移植１日後、２日後、又は３日後等）から約２か月以内に生じ、慢性期の拒絶反応は移植後約２か月以降に発症する。急性拒絶は、さらに急性初期（移植後約１０日以内）と急性後期（移植後約１１日から約２か月以内）の拒絶反応に分類されることもある。

具体的な症状としては、リンパ球の浸潤及び免疫細胞の活性化等が挙げられる。また、眼底検査や、蛍光眼底造影検査及び／又はリンパ球混合アッセイを指標として、移植による拒絶反応の程度を判定することができる。
急性拒絶（特に急性初期）は、手術侵襲による炎症反応も影響する複雑かつ強い免疫応答が誘導される可能性が高いため、腎臓移植などにおいて、一般的には、タクロリムス等の免疫抑制剤が全身的に投与される。拒絶反応の所見が認められなければ、その後、免疫抑制剤の投与量は減量されるが、通常当該免疫抑制剤の使用は継続される。

免疫抑制剤とは、免疫系の活動を抑制ないし阻害するために用いる薬剤である。免疫抑制剤は、移植された臓器又は組織に対する拒絶反応の予防及び抑制、自己免疫疾患及びアレルギー等の炎症性疾患に対する炎症制御の目的で使用される。

免疫抑制剤は、その作用機序又は構造等の類似性により、いくつかの分類が可能である。一例として、作用機序による分類として、ステロイド系抗炎症剤（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ／ＳＡＩＤｓ）、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、細胞毒性剤、代謝拮抗剤、細胞障害性抗生物質、アルキル化剤、微小管合成阻害剤等が挙げられる。免疫抑制剤として用いられる物質には限定はなく、低分子化合物、タンパク質（抗体を含む）、核酸等のいずれであってもよい。これらの免疫抑制剤の中には、別の疾患の治療剤として用いられるが、免疫抑制作用を有するために移植による拒絶反応を抑制するための免疫抑制剤としても使用される薬剤が含まれる。移植による拒絶反応を抑制するために臓器移植患者に対し服用させる免疫抑制剤としては、例えば、カルシニューリン阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、代謝拮抗剤及びステロイド系抗炎症剤等が挙げられる。

ステロイド系抗炎症剤とは、有効成分として糖質コルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）あるいはその誘導体を含む抗炎症剤である。ステロイド系抗炎症剤は、核内受容体であるｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＲ／ＮＲ３Ｃ１）に結合することで、炎症性遺伝子ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１の発現を抑制し、リンパ球（獲得免疫系の細胞に加え、特に自然免疫系の細胞：好中球、マクロファージなど）の増殖シグナルを抑制させる。例えば、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメサゾン、ベタメタゾン、フルオロメトロン等が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書において、ステロイド系抗炎症剤について、作用の強さに基づく分類を行うことができる。具体的には、強作用型（Ｓｔｒｏｎｇ）ステロイド系抗炎症剤及び中作用型（Ｍｉｌｄ）ステロイド系抗炎症剤に分類される。強作用型ステロイド系抗炎症薬として、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プレドニゾロン及びメチルプレドニゾロン等が挙げられる。中作用型ステロイド系抗炎症剤として、フルオロメトロン、ベタメタゾンジプロピオン酸エステル（ベタメタゾン吉草酸エステル）、トリアムシノロン、コルチゾン及びヒドロコルチゾン等が挙げられる。

眼科領域で使用されるステロイド系抗炎症剤としては、点眼剤として用いられるベタメタゾン吉草酸エステル又はフルオロメトロン等、硝子体内注射剤及び／又はテノン注射剤として用いられるトリアムシノロンアセトニド等が挙げられる。また、経口剤としては、作用時間が短いコルチゾン又はヒドロコルチゾン、作用時間が中程度のプレドニゾロン又はメチルプレドニゾロンコハク酸エステルナトリウム、作用時間が長いデキサメタゾン又はベタメタゾンが用いられる。ステロイドパルス療法には、一般的にメチルプレドニゾロンの点滴用液剤が用いられる。
ステロイド系抗炎症剤も、移植による拒絶反応の予防のために有効であることが知られており、例えばプレドニゾロンなどが用いられる。また、ＲＰＥ細胞等の移植による免疫拒絶反応の予防の目的には、ステロイド系抗炎症剤の経口剤もしくはステロイド系抗炎症剤のパルス療法が用いられることが報告されているが、点眼剤もしくは硝子体内注射又はテノン注射単独でステロイド系抗炎症剤を用いることは報告されていない。

カルシニューリン阻害剤とは、カルシニューリン阻害作用を有する薬剤であり、特にＴ細胞の活性化制御を主作用とする薬剤である。具体的には、カルシニューリン阻害剤は、イムノフィリンと呼ばれる細胞内の受容体と結合した後、脱リン酸化酵素カルシニューリンＰＰ２Ｂの活性を抑制し、インターロイキン２（ＩＬ−２）及びインターフェロンγの産生を抑制し、Ｔ細胞の増殖抑制を示す。カルシニューリン阻害剤としては、例えば、シクロスポリン、タクロリムス等が挙げられる。

眼科領域において、シクロスポリンは点眼剤として非感染性ぶどう膜炎などに適用がある一方、タクロリムスは眼科領域における適用症はない。
また、カルシニューリン阻害作用を有する薬剤が、移植による拒絶反応の予防のために有効であることは知られているが、ＲＰＥ細胞等の移植による免疫拒絶反応の予防の目的には、カルシニューリン阻害の経口剤が用いられていることが報告されている。一方で、カルシニューリン阻害剤の点眼剤を用いることは報告されていない。

ｍＴＯＲ阻害剤とは、ｍＴＯＲ（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）阻害作用を有する薬剤である。具体的には、ｍＴＯＲ阻害剤は、イムノフィリンに結合した後にｍＴＯＲ活性を阻害し、免疫担当細胞の細胞周期の停止及びタンパク質翻訳の抑制といった効果を示す。インターロイキン２（ＩＬ−２）の産生を低下させることによってＴ細胞及びＢ細胞の活性化を阻害することが知られている。ｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、シロリムス（ラパマイシン）、シロリムス誘導体であるテムシロリムス、エベロリムス等が挙げられる。

細胞毒性剤とは、抗がん剤としても使用される細胞分裂阻害作用を有する薬剤である。細胞毒性剤は、がん治療に比べて少量を用いることで免疫抑制剤としても使用される。細胞毒性剤は、さらに、核酸合成に干渉する代謝拮抗剤、細胞障害性抗生物質、アルキル化剤、微小管合成阻害剤等に分類可能である。

代謝拮抗剤としては、例えば、プリンアナログ及びその前駆物質であるメルカプトプリン及びアザチオプリン、葉酸類似体であるメトロレキサートグアノシン産生阻害剤であるミコフェノール酸、ピリミジン合成阻害剤であるレフルノミド等が挙げられる。アザチオプリン、及び活性代謝物である６−メルカプトプリンは、６−ＭＰリボ核酸となって、ミコフェノール酸及びミゾリビンはリンパ球の増殖の主要経路を担うイノシン―１−リン酸脱水素酵素ＩＭＰＤＨの活性を抑制して、ｄｅ ｎｏｖｏ拡散合成の阻害によるリンパ球の増殖抑制を示す。また、ＲＰＥ細胞等の移植による免疫拒絶反応の予防の目的には、ミコフェノール酸の経口剤が用いられることが報告されている。

細胞障害性抗生物質とは、細胞障害活性を有する抗生物質である。細胞障害性抗生物質としては、例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン等が挙げられる。

アルキル化剤とは、細胞傷害性抗がん剤の一種である。アルキル化剤としては、例えば、シクロフォスファミドが挙げられる。

微小管合成阻害剤とは、微小管合成を阻害し、細胞の遊走等を阻害する薬剤である。微小管合成阻害剤としては、例えば、コルヒチンやビンブラスチン等が挙げられる。

タンパク質及び抗体としては、サイトカイン（ＩＬ−２、ＴＮＦα等）、及びその受容体、Ｔ細胞等の免疫細胞の表面マーカー（ＣＤ３やＣＤ２５等）に作用するタンパク質及び抗体が挙げられる。抗体はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体とに分類できる。例えば、抗ＣＤ２５抗体としてバシリキシマブ、抗ＣＤ２０抗体としてリツキシマブが挙げられる。これらは、標的とする免疫細胞の機能を抑制する。

免疫抑制剤は、その剤形により経口剤、注射剤及び外用剤等に分類できる。経口剤とは、経口により投与される医薬品の製剤（薬剤）である。経口剤としては、錠剤、カプセル剤、顆粒等様々な剤形が含まれるが、これらに限定されない。注射剤とは、注射針を用いて皮内又は皮下の組織、血管内若しくは眼内（テノン嚢下、硝子体内）等に直接投与する液状又は用時溶解して液状にして用いる薬剤である。外用剤とは、経口剤及び注射剤を除いた、人体へ直接用いる全ての薬剤の総称である。外用剤としては、点眼剤、点眼軟膏、液剤・エアゾル剤・ドライパウダー等の吸入剤、軟膏・クリーム・湿布剤・テープ剤等の経皮剤等が含まれるがこれらに限定されない。
眼領域の移植に用いられる免疫抑制剤の剤形としては、経口剤、注射剤（静脈内注射、テノン嚢下注射、硝子体内注射等）及び外用剤として特に点眼剤が用いられる。

「免疫抑制剤を全身的に投与する」とは、免疫抑制剤を全身に分布させる態様、すなわち免疫抑制剤の有効成分が血流に存在する態様で投与すること、具体的には、経口投与又は静脈内投与等により免疫抑制剤を投与すること等を意味する。

「免疫抑制剤を局所的に投与する」とは、免疫抑制剤を眼内、皮膚等局所に分布させ、免疫抑制剤の有効成分が実質的に血流に存在しない態様で投与することを意味する。本実施形態において、「免疫抑制剤を局所的に投与する」とは、具体的には、眼内への注射（テノン嚢下注射、硝子体内注射等）、又は点眼により免疫抑制剤を投与すること等を意味する。副作用など患者負担の軽減という観点では、免疫抑制剤の局所的な投与が好ましく、特に点眼剤による投与が好ましい。しかしながら、現在の移植治療においては、免疫抑制剤は全身的に投与されることが通常であり、移植による拒絶反応の予防を目的として局所的に投与され得ることは報告されていない。

テノン嚢下注射とは、結膜を小さく切開し眼球の後ろのテノン嚢に薬剤を注入する投与方法である。点眼剤に比べてはるかに強力で後眼部への効果が期待できる処置であり、一回の注入で長期間効果が持続すると考えられている。
硝子体内注射は眼内に直接薬剤を投与する方法であり、全身的な副作用のリスクを軽減し、眼内の病変に対してより強く治療効果を発揮する。

移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤の投与とは、移植による拒絶反応が認められる前から予防的に投与することを意味する。すなわち、他疾患の予防及び／又は治療を目的とした免疫抑制剤の投与、及び、すでに生じた移植による拒絶反応をコントロールすることを目的とした免疫抑制剤の投与は含まない。

通常、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤の投与は、移植の直前又は直後から開始され、永久的に継続される。移植後の免疫抑制剤の継続期間中に、免疫抑制剤の種類、剤形、又は用法・用量が変更になる場合もある。具体的には、移植初期には高容量の免疫抑制剤が高頻度に投与されるが、その後の症状に応じて適宜増減される。安定した状態が得られた後は、徐々に減量し、有効最小量で維持することが考えられる。しかし、眼科領域の移植も含め、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤は全身的な投与が継続される。

本実施形態の治療薬の特徴は、移植に伴う拒絶反応につながる免疫応答を惹起しない、又は免疫応答を抑制することにある。すなわち、本実施形態の治療薬を移植に用いることにより、拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤投与による患者負担の軽減が可能な点にある。従って、本実施形態の治療薬は、当該治療薬の投与の前後において、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤の投与を行わない、若しくは、副作用が少ないなど患者の負担がより少ない免疫抑制剤を、局所的な投与及び／又はより短期間の投与を行うことが可能となる点に特徴がある。

免疫抑制剤の使用期間は短い方が好ましい。外科手術による侵襲が免疫誘導する点を考慮すると、本実施形態の治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後１週間（２週間、１か月、２か月）程度（又は、急性期の拒絶反応が生じる可能性のある期間）、免疫抑制剤を投与することは許容される。この場合、後述の通り、免疫抑制剤の局所的な投与が好ましく、ステロイド系抗炎症剤の使用が好ましい。

全身性の作用を抑制するために、免疫抑制剤の局所的な投与の方が好ましく、本発明の治療薬を用いる場合、眼への局所投与が好ましい。

免疫抑制作用の強さ、副作用の有無若しくは副作用の懸念の程度、その発生頻度、及び／又は重篤度等を考慮すると、「副作用が少ない免疫抑制剤」としては、ステロイド系抗炎症剤が挙げられる。すなわち、本実施形態の治療薬により移植が行われる際に、ステロイド系抗炎症剤の全身的又は局所的な投与は許容される。外科手術による侵襲が誘導する免疫誘導を抑制する事が可能である点でも、ステロイド系抗炎症剤を一定期間使用することは許容される。
一方、本実施形態の治療薬が、Ｔ細胞の活性化、及び活性化したＴ細胞を強く抑制可能な点を考慮すると、Ｔ細胞を主な標的とするカルシニューリン阻害剤及びｍＴＯＲ阻害剤の使用を抑制する事が可能である。現在の移植治療において最もよく使用されており副作用の懸念も高いカルシニューリン阻害剤及びｍＴＯＲ阻害剤の使用を行わない、長期間の投与を行わない、全身的な投与を行わない、もしくは使用量を抑制する事が可能な点は、臨床上大きな意義がある。

本実施形態の治療薬の一態様においては、対象患者は、上述の治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤を全身的に投与されない。対象患者は、好ましくは、ステロイド系抗炎症剤以外の免疫抑制剤を全身的に投与されない。
本実施形態の治療薬の一態様において好ましくは、免疫抑制剤は全身的に投与されず、さらに好ましくは、免疫抑制剤は全身的に投与されず、かつステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤は局所的にも投与されず（すなわち免疫抑制剤として、ステロイド系抗炎症剤もしくはカルシニューリン阻害剤のみが局所的に投与され）、さらに好ましくは、免疫抑制剤を一切投与されない。

治療薬の投与時に投与されないこととは、本実施形態の治療薬の投与と同時に投与しない、又は、治療薬の投与の直前若しくは直後であって同時投与とみなされるタイミング、例えば、治療薬の投与の前後２４時間以内若しくは１２時間以内に投与されないことを意味する。治療薬の投与前に投与されないこととは、本実施形態の治療薬の投与の前に、同時投与とみなされるタイミング以前、少なくとも１週間前から投与されないことを意味する。治療薬の投与後に投与されないこととは、本発明の治療薬の投与の後に、同時投与とみなされるタイミング以降、少なくとも６か月以内若しくは１年以内に投与されないことを意味する。

本実施形態の治療薬は、上述の治療薬の投与前、投与時又は投与後に、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤を全身的又は局所的（好ましくは局所的）に投与することは許容される。また、本実施形態の治療薬は、上述の治療薬の投与前、投与時又は投与後に、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤を局所的に投与されてよい。上述の治療薬の投与後１年以内、好ましくは６か月以内、より好ましくは３か月以内、より好ましくは２か月以内、より好ましくは１か月以内、より好ましくは２週間以内、より好ましくは１週間以内に、免疫抑制剤の投与を終了することができる。

本実施形態の治療薬は、網膜組織の有効量を含んでいてよい。網膜組織の有効量は、投与の目的、投与方法、投与対象の状況（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、例えば、細胞数として、例えば、１．０×１０^４個以上（例えば、１×１０^５個、１×１０^６個又は１×１０^７個）としてもよい。

本実施形態の治療薬は、医薬として許容される担体を含んでいてよい。医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることができる。必要に応じて、移植医療において、移植する組織又は細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤、ｐＨ調整剤等を配合させてもよい。

本実施形態の治療薬は、網膜組織を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することによって、細胞懸濁液として製造することができる。本実施形態の治療薬は、必要であれば、凍結保存剤を添加して、凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いてもよい。

本実施形態の治療薬に含まれる網膜組織は、例えば、ピンセット、ナイフ、ハサミ等を用いて適切な大きさに細切し、凝集体の一部を移植するために切り出して利用できる。切り出し後の形状は特に限定はないが、例えば、細胞シートが挙げられる。

本実施形態の治療薬は、移植によって患者に投与される。患者への投与は、例えば、注射針を用いて網膜下に移植する方法、又は、眼球の一部を切開し、切開部位から損傷部位若しくは病変部位に移植する方法で実施される。本実施形態の治療薬の投与に際して、投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤を全身的に投与されない。本実施形態の治療薬の投与に際して、投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤を全身的に投与されてもよく、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤を局所的に投与されてもよい。

（患者）
本実施形態の治療薬の対象患者は、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患した患者であり、該治療薬は上記対象患者に移植するための治療薬である。治療薬が投与される対象患者は、上述の治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤を全身的に投与されない。ただし、対象患者は、上述の治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤を全身的に投与されてもよく、また、移植による拒絶反応の予防を目的とした、免疫抑制剤を局所的に投与されてもよい。

対象患者は、好ましくは治療薬の投与２か月後（又は、１か月後）以降には、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤も全身的に投与されない。すなわち、対象患者は、治療薬の投与前、投与時及び／又は投与２か月後（又は、１か月後）までに、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤を全身的に又は局所的に投与されてもよいが、治療薬の投与２か月後（又は、１か月後）以降に、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤を全身的に投与されず、局所的に投与されてもよい。

対象患者は、好ましくは治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、免疫抑制剤を全身的に投与されない。すなわち、対象患者は、治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤を含めた免疫抑制剤は全身的に投与されないが、局所的に投与されてもよい。

対象患者は、好ましくは治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外（好ましくは、ステロイド系抗炎症剤以外）の免疫抑制剤を局所的に投与されない。すなわち、対象患者は、治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外（好ましくは、ステロイド系抗炎症剤以外）の免疫抑制剤は全身的にも局所的にも投与されないが、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤を全身的に又は局所的（好ましくは局所的）に投与されてもよい。ここで好ましい局所投与としては、テノン注射又は硝子体注射が挙げられる。

対象患者は、治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、トリアムシノロン、フルオシノロン、及び、カルシニューリン阻害剤（シクロスポリン、タクロリムスなど）からなる群から選択される１以上の免疫抑制剤を局所的に投与されてよい。ここで好ましい局所投与としては、テノン注射又は硝子体注射が挙げられる。

対象患者は、好ましくは治療薬の投与２か月後以降（又は、１か月後）には、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤を局所的にも投与されない。

対象患者は、好ましくは治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、免疫抑制剤を投与されない。

網膜組織又は網膜系細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、眼科疾患である黄斑変性症、加齢黄斑変性、網膜色素変性、白内障、緑内障、角膜疾患、網膜症、黄斑円孔等が挙げられるが、これらに限られない。

本発明の一態様として、移植用網膜組織（治療薬）とＨＬＡ型が適合しない、網膜組織又は網膜系細胞の障害に基づく疾患に罹患した患者に対する治療薬が提供される。移植用網膜組織とＨＬＡ型が適合しない患者とは、例えば、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤＲからなる群から選択される１、２、３又は全てのＨＬＡが適合しない患者である。ＨＬＡ型の適合度は、当業者であれば血清学的検査及びＤＮＡ型検査などの周知技術により判別可能である。

本発明の一態様として、血液網膜関門が障害を受けた患者に対する治療薬が提供される。血液網膜関門が障害を受けると免疫応答が起こりやすくなり、移植による拒絶反応が起こりやすくなると考えられる。本実施形態の治療薬は、免疫応答を誘導せず、むしろ免疫応答抑制することが可能である。従って、血液網膜関門が障害を受けた患者に対しても、本実施形態の治療薬を、免疫抑制剤の使用を軽減した上で使用することができる。なお、血液網膜関門の障害は、外科手術に基づく障害も含まれる。血液網膜関門が障害を受けているか否かは、眼底検査や蛍光眼底造影検査、光干渉断層計（ＯＣＴ）検査により判断することができる。血液網膜関門が障害を受けている疾患とは、例えば、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、Ｂｅｈｃｅｔ病、サルコイドーシスである。

臓器移植においては、移植を行うことができない、若しくは、移植が可能であったとしても、長期の入院若しくは通院、及び十分な経過観察のために様々な検査を強いられる患者が存在する。これらの患者では特にＱＯＬが大きく低下する。その一因として、併用を必須とする免疫抑制剤の使用禁忌、併用禁忌、及び、慎重投与の対象となる患者が挙げられる。具体的には、高齢者、妊婦、妊娠している可能性のある婦人、授乳婦、小児（低出生体重児、新生児、乳児を含む）、感染症のある患者、Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルス等のウイルスキャリア、悪性腫瘍又はその既往歴のある患者、腎機能障害のある患者、肝機能障害のある患者、膵機能障害のある患者等が挙げられる。本実施形態の治療薬は、免疫抑制剤を使用せず、又は、免疫抑制剤の使用量を軽減可能である。従って、一実施態様において、高齢者、妊婦、妊娠している可能性のある婦人、授乳婦、小児（低出生体重児、新生児、乳児を含む）、感染症のある患者、Ｂ型又はＣ型肝炎ウイルス等のウイルスキャリア、悪性腫瘍又はその既往歴のある患者、腎機能障害のある患者、肝機能障害のある患者、及び、膵機能障害のある患者からなる群から選択される１以上の患者に対し、治療薬を提供する。

本実施形態の網膜組織の一態様として、他家由来、かつ、立体構造を有する網膜組織であって、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患し、かつ、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤を全身的に投与されない患者における網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療に使用するための、網膜組織が提供される。

また、本発明の網膜組織の他の一態様として、他家由来、かつ、立体構造を有する網膜組織であって、網膜組織を投与する際、投与前、投与時及び／又は投与後に移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤を全身的に投与されない、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療に使用するための、網膜組織が提供される。

〔治療方法〕
本実施形態の治療方法の一態様として、他家由来、かつ、立体構造を有する網膜組織の有効量を、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患した患者に投与（移植）することを含み、対象患者が、網膜組織の投与前（移植前）、投与時（移植時）及び／又は投与後（移植後）に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤を全身的に投与されないことを特徴とする、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療方法が提供される。網膜組織は、製剤、具体的には移植用製剤として、患者に移植される。

本実施形態の治療方法の他の一態様として、他家由来、かつ、立体構造を有する網膜組織の有効量を、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患した患者に投与することを含み、網膜組織を投与する際、投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤を全身的に投与されないことを特徴とする、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療方法が提供される。本発明の一態様として、前述の事前検査において当該治療薬による免疫応答の抑制効果が認められる患者に対し、本発明の治療薬を投与する方法が挙げられる。

すなわち、本実施形態の治療方法は、一態様として、他家幹細胞から立体構造を有する網膜組織を分化誘導するステップと、該網膜組織の有効量を網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患した患者に投与（移植）するステップとを含む。対象患者及び投与方法は上述のとおりであってよい。

網膜組織は、治療（移植）に際して、網膜組織を該網膜組織の生存能力を維持するために必要な媒体において保存してもよい。「生存能力を維持するために必要な媒体」としては、培地、生理学的緩衝溶液等が挙げられるが、網膜前駆細胞等の網膜系細胞を含む細胞集団が生存する限りにおいて特に限定されず、当業者であれば適宜選択することができる。一例として、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製した培地が挙げられる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ （ＧＭＥＭ）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＭＥＭ Ｚｉｎｃ Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地又はこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。

移植は、例えば、注射針を用いて網膜下に移植する方法、又は眼球の一部を切開し、切開部位から損傷部位又は病変部位に移植することで実施される。

〔キット〕
一実施態様として、他家幹細胞から分化誘導され、かつ、立体構造を有する網膜組織と、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患した患者に対して、治療薬の投与時又は投与後に、（１）免疫抑制剤を投与しない旨、（２）免疫抑制剤を全身的に投与しない旨（治療薬の投与1か月以上にわたり免疫抑制剤を全身的に投与しない、との期間を限定する場合も含む）、（３）免疫抑制剤を局所的にのみ投与する旨、（４）免疫抑制剤として、ステロイド系抗炎症剤若しくはカルシニューリン阻害剤のみ（好ましくは、ステロイド系抗炎症剤のみ）を全身的又は局所的に投与する旨、又は、（５）上述の（１）〜（４）のいずれかを実質的に記載しているに等しい記載を示した指示書、説明書、添付文書、又は製品ラベルと、を含む、キットが提供される。（１）〜（４）のいずれかを実質的に記載しているに等しい記載とは、例えば、一般的な医師が（１）〜（４）の投与が可能であると理解できる程度の非臨床又は臨床のデータを開示すること等が含まれる。上記データには、動物種を問わず、また、in vivoデータに限られず、in vitroにおける免疫寛容又は免疫抑制効果を示すデータも含まれる。さらに、当該キットには、移植用器具（例：眼内投与用の注射針や注射筒など）や移植用媒体、網膜組織の生存能力を維持するために必要な媒体などが含まれていてもよい。

網膜組織と、指示書、説明書、添付文書、又は製品ラベルとは同梱されることが好ましい。指示書、説明書、添付文書、又は製品ラベルは、印刷されたものであってもよく、インターネット等の掲示される電子情報であってもよい。電子情報の場合は、その情報の入手方法が同梱されることが好ましい。

以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。

以下の実施例で使用したすべての動物は、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って処置した。動物実験は理化学研究所・ＢＤＲ倫理委員会の承認を受け、理化学研究所・生体力学研究センターの動物実験指針に基づいて行った。

＜実施例１：ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞からＳＦＥＢｑ法による神経網膜（ＮＲ）の作製＞
Ｃｒｘ：：Ｖｅｎｕｓレポーター遺伝子を持つように遺伝子改変したヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１株、（非特許文献３））及び理化学研究所にて樹立されたヒトｉＰＳ細胞（ＴＬＨＤ２株）を、「Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，４，３５９４ （２０１４）」に記載の方法に準じてフィーダーフリー条件下で培養した。フィーダーフリー培地としてはＳｔｅｍＦｉｔ培地（商品名：ＡＫ０３Ｎ、味の素社製）、フィーダー細胞に代わる足場としてＬａｍｉｎｉｎ５１１−Ｅ８（商品名、ニッピ社製）を用いた。

ＫｈＥＳ−１株及びＴＬＨＤ２株は、フィーダーフリー培地において、多能性マーカーである、Ｏｃｔ３／４，Ｎａｎｏｇ，ＳＳＥＡ−４）を発現していた。

具体的なヒトＥＳ及びヒトｉＰＳ細胞（ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞）の維持培養操作は、以下の様に行った。まず、サブコンフレント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になったヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞（ＫｈＥＳ−１株及びＴＬＨＤ２株）を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて単一細胞へ分散した。その後、単一細胞へ分散されたヒトＥＳ細胞を、Ｌａｍｉｎｉｎ５１１−Ｅ８にてコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Ｙ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、１０μＭ）存在下、ＳｔｅｍＦｉｔ培地にてフィーダーフリー条件下で培養した。上記プラスチック培養ディッシュとして、６ウェルプレート（イワキ社製、細胞培養用、培養面積９．４ｃｍ^２）を用いた場合、上記単一細胞へ分散されたヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の播種細胞数は１ウェルあたり０．４〜１．２×１０^４細胞とした。播種した１日後に、Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地に交換した。以降、１〜２日ごとに一回Ｙ２７６３２を含まないＳｔｅｍＦｉｔ培地にて培地交換した。その後、サブコンフレント１日前になるまでフィーダーフリー条件下で培養した。当該サブコンフレント１日前のヒトＥＳ細胞を、ＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβシグナル伝達経路阻害物質、５μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ）の存在下（Ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ処理）で、１日間フィーダーフリー条件下で培養した。

ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを用いて細胞分散液処理し、更にピペッティング操作によって単一細胞に分散した後、単一細胞に分散されたヒトＥＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６ウェルＶ底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり１．２×１０^４細胞になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、２７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。その際の無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）には、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地との１：１混合液に１０％ ＫＳＲ、４５０μＭ １−モノチオグリセロール、１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地を用いた。

浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、終濃度２０μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ又は３０ｎＭ、０ｎＭ）を添加した。浮遊培養開始後３日目に、Ｙ２７６３２及びＳＡＧを含まず、ヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＢＭＰ−４、Ｒ＆Ｄ社製）を含む培地を用いて、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４を終濃度１．５ｎＭで含む培地を５０μＬ添加した。浮遊培養開始後６日目以降、３日に一回Ｙ２７６３２及びＳＡＧ及びヒト組み換えＢＭＰ４を含まない培地で半量交換した。

当該浮遊培養開始後１５日から１８日目の凝集体を、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質（ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質（ＳＵ５４０２、５μＭ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ/Ｆ１２培地に１％ Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地）で３７℃、５％ＣＯ_２で、３〜４日間培養した。その後、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）にて、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まず血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（以下、ＮｕｃＴ０培地ということもある）で培養した。浮遊培養開始後（分化誘導）４０日目以降、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（ＮｕｃＴ０培地とＮｕｃＴ２培地の混合培地、以下、ＮｕｃＴ１培地ということもある）で培養した。浮遊培養開始後（分化誘導）６０日目以降、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路作用物質Ｔ３を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（以下、ＮｕｃＴ２培地ということもある）で浮遊培養開始後（分化誘導）８０〜９５日目まで培養した。

顕微鏡を用いて、観察した結果、ヒトＥＳ細胞株（ｋｈＥＳ−１）及びヒトｉＰＳ細胞株（ＴＬＨＤ２）において、分化誘導８０〜９５日目に層構造を有する神経網膜（ＮＲ）が形成されることが分かった（図１）。

図２９は、上記の方法で作製した浮遊培養開始後８０日目のヒトＥＳ細胞から及びヒトｉＰＳ細胞からそれぞれ分化誘導した神経網膜ｈＥＳ−ＮＲ（Ａ〜Ｃ）及びｈｉＰＳＣ−ＮＲ（Ｄ〜Ｆ）におけるＣＲＸ、Ｃｈｘ１０、Ｐａｘ６、ＲＸｙ−γ、Ｂｒｎ３、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐｒｏｘ１の発現結果を示す顕微鏡写真である。核染色には、ＤＡＰＩを用いた。図２９中のスケールバーは、３０μｍを示す。

ｈＥＳ−ＮＲ及びｈｉＰＳＣ−ＮＲの細胞層の中間には、神経網膜前駆細胞のマーカーである、Ｃｈｘ１０及びＰａｘ６が発現していた（図２９のＡ、Ｄ）。神経網膜の基底膜側には、Ｐａｘ６及び網膜神経節細胞のマーカーである、Ｂｒｎ３が発現していた（図２９のＡ〜Ｂ、Ｄ〜Ｅ）。浮遊培養開始後８０日目の段階では、視細胞前駆体のマーカーであるＣｒｘと、錐体細胞、錐体視細胞前駆細胞及び神経節細胞のマーカーであるＲｘｒ−γとは、頂端面側の層に発現していた（図２９のＢ、Ｅ）。Ｉｓｌｅｔ−１及びＰｒｏｘ１は、頂端面側及び基底膜側のいずれにも発現していた（図２９のＣ、Ｆ）。Ｉｓｌｅｔ−１及びＰｒｏｘ１は、初期分化期の内部網膜細胞（ｉｎｎｅｒ ｒｅｔｉｎａｌ ｃｅｌｌ）のマーカーである。

大部分のＣｒｘは、Ｂｒｎ３ではなく、Ｒｘｒ−γとともに頂端面側の層に位置していた（図２９のＢ、Ｅ）。

ｈＥＳ−ＮＲ及びｈｉＰＳＣ−ＮＲは、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐｒｏｘ１及びＢｒｎ３を発現していた（図２９のＣ、Ｆ）。この結果は、網膜神経節細胞（ｒｅｔｉｎａｌ ｇａｎｇｌｉｏｎ ｃｅｌｌｓ）、アマクリン細胞（ａｍａｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌｓ）及び水平細胞（ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｃｅｌｌｓ）の存在を示す。

＜実施例２：神経網膜のＨＬＡの発現解析１＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後８０日から１００日のヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜の培養液中に、組換えＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、２日間培養した。一方で、組換えＩＦＮ−γを添加しないグループも用意した。

２日後、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。これらの細胞に対し、抗ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ抗体（ＦＩＴＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｆ５６６２）、抗ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体（ＦＩＴＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰ、−ＤＱ；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，＃Ｆ０８１７又はＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、＃５５５５５８）、抗ＨＬＡ Ｅ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃３４２６０４）、抗ＣＤ８６（Ｂ７−２）抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１２−０８６２）、対照としてアイソタイプ抗体（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＦＩＴＣ；ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、＃５５５５７３又はｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＦＩＴＣ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１−４７３２）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＢＤ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。その結果、組換えインターフェロンγを添加しない条件（−）では、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜はＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩの発現はほとんどなく、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩＩ、ＨＬＡ−Ｅ及びＣＤ８６の発現はないことが分かった。一方で、組換えインターフェロンγを添加した条件（＋ＩＦＮ−γ）では、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩの発現はあるが低く、ＨＬＡ−Ｅの発現はほとんどなく、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩＩ及びＣＤ８６の発現はないことが分かった（図２Ａ及び図２Ｂ）。

これらの結果から、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜は免疫原性が非常に低いことが分かった。

＜実施例３：神経網膜のＨＬＡの発現解析２＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後２７日、９１日、１４９日、２３９日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜の培養液中に、組換えＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、２日間培養した。一方で、組換えＩＦＮ−γを添加しないグループも用意した。なお、浮遊培養開始後２７日、９１日、１４９日、又は２３９日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜は、それぞれ典型的には下記の特徴を有する。
浮遊培養開始後２７日：Ｃｈｘ１０＋神経網膜前駆細胞が優位に存在しＢｒｎ３＋／Ｐａｘ６＋ガングリオン細胞も存在する。
浮遊培養開始後９１日：Ｒｘｒｇ＋／リカバリン＋錐体視細胞が出現し始める。
浮遊培養開始後１４９日：アピカル面における各種Ｃｒｘ＋視細胞数が増加する。
浮遊培養開始後２３９日：ＰＫＣα＋杆体双極細胞、ＧＳ＋／ＧＦＡＰ−ミュラーグリア細胞が出現し始める。

２日後、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜をＰＢＳにて洗浄し、４％ＰＦＡを用いて１５分間４℃で固定した。ＰＢＳにて洗浄後、３０％Ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に浸した。その後、クリオモルドにＯＣＴコンパウンドを用いて包埋後、クリオスタットで１２μｍの切片を作製した。これらの切片に対し、抗ＨＬＡ ｃｌａｓｓＩ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１４−９９８３）、ＨＬＡ ｃｌａｓｓＩＩ抗体（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５５５５７）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞に対して蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス）で観察を行った。その結果、どの分化段階の神経網膜も、組換えインターフェロンγを添加しない条件では、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜はＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩの発現はほとんどなく、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩＩの発現はないことが分かった。一方で、組換えインターフェロンγを添加した条件では、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩの発現はあるが低く、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩＩの発現はないことが分かった（図３及び図４）。

＜実施例４：神経網膜のＨＬＡの発現解析３＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後８０日から１００日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜を免疫不全網膜変性ラットの網膜下に移植した。

移植後５カ月以上経過後、眼摘し、ＰＢＳにて洗浄し、４％ＰＦＡを用いて６０分間室温で固定した。ＰＢＳにて洗浄後、３０％スクロース溶液に浸した。その後、クリオモルドにＯＣＴコンパウンドを用いて包埋後、クリオスタットで１２μｍの切片を作製した。これらの切片に対し、抗ＨＬＡ ｃｌａｓｓＩ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１４−９９８３）、ＨＬＡ ｃｌａｓｓＩＩ抗体（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、＃５５５５５７）、Ｓｔｅｍ１２１抗体（ＴａＫａＲａ）、Ｓｔｅｍ１２３（ｈｕｍａｎ ＧＦＡＰ）（ＴａＫａＲａ）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された切片に対して蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス）で観察を行った。

その結果、移植後のヒトＥＳ細胞由来神経網膜は一部の細胞ではＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩの発現はあるが、大多数の視細胞は発現しておらず、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩＩの発現はないことが分かった（図５Ａ）。また、ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩが発現している細胞はｈＧＦＡＰも染色されることから、移植後にＨＬＡ ｃｌａｓｓＩを発現している細胞はグラフト由来のＭｕｌｌｅｒ細胞の可能性が高いことがわかった（図５Ｂ）。

＜実施例５：神経網膜の免疫細胞に対する免疫原性試験による評価１＞
免疫細胞に対する神経網膜の免疫原性を評価するためのサンプルとして、（１）実施例１で作製した浮遊培養開始後８０日から１００日のヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜（単一細胞へ分散されていない神経網膜（Ｗｈｏｌｅ ｒｅｔｉｎａ）のサンプル）、（２）（１）の神経網膜をＰＢＳにて洗浄後、これに神経細胞分散液（住友ベークライト社製）を添加し、３７℃でインキュベート後、軽くピペッティングをして、一部解離（Ｓｅｍｉ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）状態としたサンプル、及び（３）（１）の神経網膜を完全に単一細胞へ分散したサンプルを用意した。インフォームドコンセントを得た健常人より採血し、回収したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）に対して、上記（１）、（２）、及び（３）それぞれに対して低接着性の２４ウェルプレート（住友ベークライト社製）を用いて２日間混合培養させた。ヒトＥＳ由来神経網膜に関する（１）、（２）、及び（３）の顕微鏡観察結果を図６に示す。

２日後、ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳにて洗浄後、抗ＡＰＣ−ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３１７４１６）、抗ＡＰＣ−ＣＤ８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、＃１７−００８８−４２）、抗ＡＰＣ−ＣＤ１１ｂ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、＃１３０−０９１−２４１）、抗ＡＰＣ−ＮＫＧ２Ａ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製＃１３０−０９８−８０９）、及び、抗ＰＥ−Ｋｉ−６７抗体 （ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３５０５０４）を用いて免疫染色を行った。また、コントロール抗体として、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＡＰＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、＃１３０−１１３−１９６）、及びｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１）κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ （ＰＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１１２）を用いた。これらの免疫染色された細胞に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＢＤ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。図７Ａ、図７Ｂ及び図８はヒトＥＳ細胞から分化誘導した神経網膜を用いた場合の解析結果を示し、図９Ａ、図９Ｂ及び図１０はヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した神経網膜を用いた場合の解析結果を示す。

その結果、（３）の単一細胞へ分散されたサンプルと混合させた条件では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及び、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ陽性の単球、マイクログリアの非常に弱い拒絶反応が確認された。一方で（１）と（２）の単一細胞へ分散されていない神経網膜及び、Ｓｅｍｉ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅの状態のサンプルは、（３）とは逆にＣＤ４陽性Ｔ細胞及び、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ陽性の単球、マイクログリア、ＮＫＧ２Ａ陽性のＮＫ細胞において、免疫拒絶反応を引き起こさないことが分かった。

また、ヒトＥＳ細胞由来神経網膜におけるＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉの発現に関しては、（１）のサンプル（Ｗｈｏｌｅ ｒｅｔｉｎａ）と、（３）のサンプルとの間で大きな違いは認められなかった（図３７）。一方、図７Ｂ及び図９Ｂに示すとおり、ＥＬＩＳＡ法によりＩＦＮ−γを測定した結果、ヒトＥＳ細胞由来神経網膜及びヒトｉＰＳ細胞由来神経網膜とも、（１）のサンプル（Ｗｈｏｌｅ ｒｅｔｉｎａ）がＰＢＭＣによるＩＮＦ−γの発現を強く抑制することが示された（（１）のサンプル（Ｗｈｏｌｅ ｒｅｔｉｎａ）と、（２）のサンプル（ｓｅｍｉ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）、（３）のサンプル（ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ）及びコントロールとの対比）。

これらの結果から、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜及び、Ｓｅｍｉ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅの状態では免疫拒絶をうけず、逆に免疫細胞に対して抑制的に作用することが分かった。

＜実施例６：免疫細胞活性化の抑制能の評価（活性化状態の免疫細胞）＞
ＣＤ３、ＣＤ２８抗体を添加して刺激することによって、活性化させた免疫細胞に対する抑制能を評価するためのサンプルとして、実施例１で作製した浮遊培養開始後８０日から１００日のヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜（単一細胞へ分散されていない神経網膜のサンプル）を用意した。インフォームドコンセントを得た健常人より採血し、回収したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）に対して、２４ウェルプレート（住友ベークライト社製）を用いて２日間混合培養させた。

２日後、ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳにて洗浄後、抗ＡＰＣ−ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３１７４１６）、抗ＡＰＣ−ＣＤ８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、＃１７−００８８）、抗ＡＰＣ−ＣＤ１１ｂ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、＃１３０−０９１−２４１）、抗ＡＰＣ−ＣＤ１９抗体、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗ＰＥ−Ｋｉ−６７抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３５０５０４）を用いて免疫染色を行った。また、ｉｓｏｔｙｐｅ抗体として、ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ２ａ（ＩｇＧ２ａ）κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００２０８）、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＡＰＣ、ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１２２）κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ （ＰＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１１２）を用いた。これらの免疫染色された細胞に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＢＤ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。図１１〜１４はヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した神経網膜を用いた場合の解析結果を示す。

その結果、活性化されているＣＤ４陽性Ｔ細胞及び、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ陽性の単球、ＣＤ１９陽性のＢ細胞、ＮＫＧ２Ａ陽性のＮＫ細胞において、活性化を抑制することが分かった（図１１Ａ、図１１Ｂ、図１２、図３８）。この効果は、ヒトｉＰＳ細胞由来ＲＰＥ細胞と同程度の効果であった（図１１Ａ、図１１Ｂ）。

コントロールのＰＢＭＣ（ヒトＥＳ細胞由来神経網膜と共培養していないＰＢＭＣ）は増殖し、大きな凝集体を形成したが、ヒトＥＳ細胞由来神経網膜と共培養したＰＢＭＣは凝集体が小さく、ヒトＥＳ細胞由来神経網膜に近いほど凝集の程度は小さかった（図３９）。ｈＥＳＣ−ＮＲの抑制効果は、共培養ディッシュ中のヒトＥＳ細胞から分化誘導した神経網膜（ｈＥＳ−ＮＲ）付近において明らかであった。また、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜の活性化状態の免疫細胞の抑制効果には、用量依存性があった（図４０）。

これらの結果から、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜は活性化状態の免疫細胞に対しても免疫細胞の活性化状態を抑制させることが分かった。すなわち、ヒトｉＰＳ細胞由来神経網膜には免疫抑制能があると言える。

Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）を用いた培養アッセイのため、０．３ｍｍ孔サイズ膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を有するトランスウェルチャンバーと、上述したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）と、培地として、リコンビナントＩＬ２を含むＲＰＭＩ １６４０（Ｓｕｇｉｔａ ｅｔ ａｌ ２０１５）とを準備した。

培地存在下で、ＰＢＭＣをトランスウェルプレートの下部ウェルに加え、ヒトＥＳ細胞由来神経網膜を上部ウェルに加えた。上部ウェル上で、ヒトＥＳ細胞由来神経網膜を４〜５日間培養した。５日間の培養終了後、ＰＢＭＣを回収した。回収したＰＢＭＣをＰＥ結合Ｋｉ６７抗体及びＡＰＣ結合ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１９、ＮＫＧ２Ａ抗体を用いて染色し、フローサイトメトリーにより増殖を評価した。

ヒトＥＳ細胞由来神経網膜（ｈＥＳＣ−ＮＲ）の免疫抑制パターンは、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）を用いた分離共培養でも同様であった。これにより、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜による免疫抑制には、分泌型の体液性分子が寄与していることが示された（図４１）。

ｈｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）と比較して、実施例１で製造したヒトｉＰＳ細胞由来神経網膜（ｈｉＰＳＣ−ＮＲ）は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３を高度に発現した（図４２）。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３は、ヒトｉＰＳ細胞由来網膜色素上皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞）によっても発現される。ＥＬＩＳＡ法によって、培地上清中のＴＧＦ−β２がｈｉＰＳＣ−ＮＲの用量依存的に増加することが示された（図４３）。分化日数（ＤＤ）５０〜分化日数（ＤＤ）２４０日におけるｈＥＳＣ−ＮＲの異なる分化段階において、ＴＧＦ−β２は、常に分泌されていた。ＴＧＦβ２の分泌は、ＤＤ１００とＤＤ１６０で最も高い値を示した。ＤＤ１００とＤＤ１６０におけるＴＧＦβ２の分泌レベルは、ｈｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞によって分泌されるレベルと類似していた（図４４）。

ヒトｉＰＳ細胞由来網膜色素上皮細胞（ｈｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞）は、次の方法により調製した。１０ｕＭのＹ−２７６３２（Ｗａｋｏ）及び５μＭのＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ）、３ｕＭのＣＫＩ−７（Ｓｉｇｍａ）を含むＧＭＥＭ培地でｈｉＰＳＣを培養してＲＰＥ細胞を誘導した。ＲＰＥ細胞様コロニーが出現してきたら、ＲＰＥ細胞様コロニーを削り取り、ＣＥＬＬ ｓｔａｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ）でコーティングしたディッシュに移して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ）にＢ２７（Ｔｈｅｒｍｏ）とｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ）とＳＢ４３１５４２（ＳＩＧＭＡ）を含む培地でＲＰＥ細胞を培養した。

＜実施例７：免疫細胞活性化の抑制能の評価（ＴＧＦβ抗体、受容体阻害剤）＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後８０日から１００日のヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜を用意した。インフォームドコンセントを得た健常人より採血し、回収したＰＢＭＣと神経網膜について、２４ウェルプレート（住友ベークライト社製）を用いて、（１）ＰＢＭＣのみ、（２）ＰＢＭＣと神経網膜を混合、（３）ＰＢＭＣと神経網膜に加えてｍｏｕｓｅ ＩｇＧ抗体（アイソタイプ対照）を培養液中に添加、（４）ＰＢＭＣと神経網膜に加えて抗ＴＧＦβ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｍｔｅｍｓ社製）を培養液中に添加、（５）ＰＢＭＣと神経網膜に加えてＴＧＦβ受容体阻害剤ＳＢ４３１５４２を培養液中に添加の４つの条件で２日間混合培養させた。

２日後、ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳにて洗浄後、抗ヒトＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、ｃａｔａｌｏｇ ＃３１７４１６）、抗ヒトＣＤ８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、＃１７−００８８）を用いて免疫染色を行った。また、ｉｓｏｔｙｐｅ抗体として、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１ （ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１２２）、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１１２）を用いた。これらの免疫染色された細胞に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＢＤ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。その結果、（４）及び（５）のＴＧＦβ抗体又はＴＧＦβ受容体阻害剤を培養液中に添加した条件では、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及び、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の活性化の抑制がキャンセルされていることが、対照と比較して分かった（図１３〜１４）。

これらの結果から、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜は主にＴＧＦβシグナルを介して、免疫細胞の活性化を抑制させていることが分かった。

＜実施例８：ＴＧＦβの発現１＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後８０〜１００日のヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜（ｉＰＳ−３Ｄ ｒｅｔｉｎａ）をＰＢＳにて洗浄後、神経細胞分散液（住友ベークライト社製）を添加し、３７℃でインキュベート後、単一細胞へ分散した。これらの細胞に対し、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＲＮＡサンプルを回収した。その後、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ：０４ ８９７ ０３０ ００１）を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ でｃＤＮＡを合成した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ：０４ ７０７ ４９４ ００１）キットを用いてＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３のｑＰＣＲを実施した。測定はＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒを使用した。

その結果、ＴＧＦβ１はｉＰＳ細胞と比較して、２〜４倍程度、ＴＧＦβ２は１００倍程度、ＴＧＦβ３は５〜８倍程度発現上昇していることが分かった（図１５）。

＜実施例９：ＴＧＦβの発現２＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後８０〜１００日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜をＰＢＳにて洗浄後、４％ＰＦＡを用いて１５分間４℃で固定した。ＰＢＳにて洗浄後、３０％Ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に浸した。その後、クリオモルドにＯＣＴコンパウンドを用いて包埋後、クリオスタットで１２μｍの切片を作製した。これらの切片に対し、抗Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（ＢＤ）、抗Ｅｚｒｉｎ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＴＧＦβ１抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＧＦβ２抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＴＧＦβ３抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞に対して共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＰ８）で観察を行った。その結果、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３すべて、頂端面マーカーのＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎ及びＥｚｒｉｎ陽性側に局在していることが分かった。

よって、神経網膜で発現されたＴＧＦβは、頂端面側に局在し、分泌していることが示唆された（図１６）。

＜実施例１０：ＥＬＩＳＡによるＴＧＦβ２分泌量の測定＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後５０日、１００日、１６０日、２４０日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜をＰＢＳで洗浄後、神経網膜を１５個２４ウェルプレート（住友ベークライト）に入れ、１ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で１、２日間培養した。

１、２日後、培養上清を回収し、ＴＧＦβ２のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＴＧＦβ２の分泌量を測定した。その結果、どの分化段階においてもＴＧＦβ２を分泌していること、そして、１００日では二日間培養すると非常に多くのＴＧＦβ２を分泌していることが明らかとなった。（図１７）。

＜実施例１１：酵素処理有り無しによるＴＧＦβ２の発現とＥＬＩＳＡの関係性＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後８０−１００日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜を（１）：無処置、（２）：ＰＢＳで洗浄後、神経細胞分散液（住友ベークライト）を処理し、ピペッティングせずに回収、（３）：（１）の神経網膜をＰＢＳにて洗浄後、これに神経細胞分散液（住友ベークライト社製）を添加し、３７℃でインキュベート後、軽くピペッティングをして、一部解離（Ｓｅｍｉ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｅ）状態としたサンプル（４）：（１）の神経網膜を完全に単一細胞へ分散したサンプルを用意した。２４ウェルプレート（住友ベークライト社製）を用いて、１ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で２日間培養した。

２日後、培養上清を回収し、ＴＧＦβ２のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＴＧＦβ２の分泌量を測定した。この測定結果を図１８（ａ）に示す。

また、（１）、（２）、（３）及び（４）の細胞に対し、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、ＲＮＡサンプルを回収した。その後、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ：０４ ８９７ ０３０ ００１）を用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ でｃＤＮＡを合成した。Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ：０４ ７０７ ４９４ ００１）キットを用いてＴＧＦβ２のｑＰＣＲを実施した。測定はＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒを使用した。この測定結果を図１８（ｂ）に示す。

さらに（１）と（２）の酵素処理直後のヒトＥＳ細胞由来神経網膜をＰＢＳにて洗浄後、４％ＰＦＡを用いて１５分間４℃で固定した。ＰＢＳにて洗浄後、３０％Ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に浸した。その後、クリオモルドにＯＣＴコンパウンドを用いて包埋後、クリオスタットで１２μｍの切片を作製した。これらの切片に対し、抗Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（ＢＤ）、ＴＧＦβ２抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞に対して共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＰ８）で観察を行った。

その結果、酵素処理していない（１）のサンプルではＥＬＩＳＡでＴＧＦβ２の分泌を検出したが、（２）、（３）、及び（４）ではどれも検出限界以下であった。一方で、ｑＰＣＲの発現では（１）が最も発現量が高いが、（２）、（３）、及び（４）でも発現していることがわかった。また、共焦点顕微鏡での観察の結果、酵素処理無ではＴＧＦβ２、及び頂端面マーカーのＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎが表面に整列して局在しているが、（２）の酵素処理をしたサンプルでは表面が乱れており、ＴＧＦβ２の局在もまばらになっていることが分かった（図１９）。

よって、神経網膜がＴＧＦβ２を分泌するためには、膜表面であるＡｐｉｃａｌ面の構造（例えば、アピカル面が整列して並んでいることなど）が重要であることが示唆された。一方で、酵素処理等の膜表面のマトリックス等の構造が乱れることで、分泌量が下がることがわかった。

＜実施例１２：分化日数とＭＬＲ＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後５０日、８０日、１５０日、２００日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜を用意した。インフォームドコンセントを得た健常人より採血し、回収したＰＢＭＣと神経網膜について、２４ウェルプレート（住友ベークライト社製）を用いて、ＰＢＭＣと神経網膜を混合培養させた。

２日後、ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳにて洗浄後、抗ヒトＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３１７４１６）、抗ヒトＣＤ８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、＃１７−００８８）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いて免疫染色を行った。また、アイソタイプ抗体として、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１２２）、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１１２）を用いた。これらの免疫染色された細胞に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＢＤ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。その結果、どの分化段階においても免疫細胞の活性化を抑制することが分かった（図２０Ａ、図２０Ｂ、図２１）。

＜実施例１３＞
上記ＭＬＲ ａｓｓａｙに関して自家と他家の差を見るために、ｉＰＳ細胞（ＴＬＨＤ２）のドナーとインフォームドコンセントを得た健常人より採血し、回収したＰＢＭＣと神経細胞分散液（住友ベークライト社製）によりシングルセル化した神経網膜について、低接着性の２４ウェルプレート（住友ベークライト社製）を用いて２日間混合培養させた。

２日後、ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳにて洗浄後、抗ＡＰＣ−ヒトＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３１７４１６）、抗ヒトＡＰＣ−ＣＤ８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、＃１７−００８８）、抗ＡＰＣ−ヒトＣＤ１１ｂ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、＃１３０−０９１−２４１）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＡＰＣ−ＮＫＧ２Ａ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製＃１３０−０９８−８０９）、抗ヒトＰＥ−Ｋｉ−６７抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３５０５０４）を用いて免疫染色を行った。また、アイソタイプ抗体として、ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ２ａ（ＩｇＧ２ａ）、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００２０８）、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１２２）、及びｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１２２）、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１１２）を用いた。これらの免疫染色された細胞に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＢＤ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。図２２及び図２３はヒトｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜を用いた場合の解析結果を示す。

その結果、自家のＰＢＭＣと神経網膜を混合させた条件では、免疫活性化は確認されなかった。また、他家のＡｌｌｏに関しても、ＣＤ４陽性Ｔ細胞及び、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ陽性の単球、マイクログリアの非常に弱い拒絶反応が確認されたが、大きな差は確認されなかった。

これらの結果から、ヒトｉＰＳ細胞由来神経網膜は自家であれば、より免疫拒絶をうけにくいが、他家でも大きく拒絶反応を引き起こさないことが分かった。

＜実施例１４：サルｉＰＳ細胞からＳＦＥＢｑ法による神経網膜（ＮＲ）の作製＞
京都大学にて樹立されたサルｉＰＳ細胞（１１２１Ａ１株）を、ＭＥＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社 ＰＭＥＦ−ＣＦＸ−Ｃ）を用いてＯｎフィーダー条件下で培養した。未分化培地としてはＰｒｉｍａｔｅ ＥＳ培地（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社）とｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ社）培地を３：１で混合し、１０ｍｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ社製）と１０^６ｕｎｉｔ／ｍｌのＬＩＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）をそれぞれ１０００倍希釈で添加して用いた。

具体的なサルｉＰＳ細胞の維持培養操作は、以下の様に行った。まず、サブコンフレント（培養面積の６割が細胞に覆われる程度）になったサルｉＰＳ細胞を、１ｍｌ用のチップを用いて物理的に剥離させ、コロニーの状態で回収されたサルｉＰＳ細胞を、ＭＥＦを播種したプラスチック培養ディッシュに播種し、ｂＦＧＦとＬＩＦ存在下、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳとｍＴｅＳＲ１混合培地にてオン・フィーダー条件下で培養した。上記プラスチック培養ディッシュとして、６０ｍｍ ｄｉｓｈ又は１００ｍｍ ｄｉｓｈ（イワキ社製、細胞培養用）を用いた。播種後毎日、培地交換をした。その後、サブコンフレントになるまで培養した。

サルｉＰＳ細胞を、ＰＢＳにて洗浄後、ＣＴＫ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ社）を用いて細胞剥離処理し、コロニーの状態で１５ｍｌチューブに回収した。静置し、コロニーが底に落ちたことを確認後、アスピレーターで上清を除去した。その後、ＰＢＳで洗浄後、Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔを添加し、３７℃で５分ほどインキュベートした。ピペッティング操作によって単一細胞に分散した後、単一細胞に分散されたサルｉＰＳ細胞を非細胞接着性の９６ウェル培養プレート（商品名：ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ ９６ウェルＶ底プレート，住友ベークライト社製）の１ウェルあたり１．２×１０^４細胞になるように１００μＬの無血清培地に浮遊させ、２７℃、５％ＣＯ_２で浮遊培養した。その際の無血清培地（ｇｆＣＤＭ＋ＫＳＲ）には、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地との１：１混合液に１０％ ＫＳＲ、４５０μＭ １−モノチオグリセロール、１×Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加した無血清培地を用いた。

浮遊培養開始時（浮遊培養開始後０日目）に、上記無血清培地にＹ２７６３２（ＲＯＣＫ阻害物質、終濃度１０〜２０μＭ）及びＳＡＧ（Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質、３００ｎＭ又は３０ｎＭ）を添加した。浮遊培養開始後３日目に、Ｙ２７６３２及びＳＡＧを含まず、ヒト組み換えＢＭＰ４（商品名：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ ＢＭＰ−４、Ｒ＆Ｄ社製）を含む培地を用いて、外来性のヒト組み換えＢＭＰ４を終濃度１．５ｎＭで含む培地を５０μＬ添加した。浮遊培養開始後６日目以降、３日に一回Ｙ２７６３２及びＳＡＧ及びヒト組み換えＢＭＰ４を含まない培地で半量交換した。

当該浮遊培養開始後１５日目の凝集体を、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）に移し、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質（ＣＨＩＲ９９０２１、３μＭ）及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質（ＳＵ５４０２、５μＭ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ/Ｆ１２培地に１％ Ｎ２ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔが添加された培地）で３７℃、５％ＣＯ_２で、３〜４日間培養した。その後、９０ｍｍの低接着培養皿（住友ベークライト社製）にて、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（ＮｕｃＴ０培地）で培養した。浮遊培養開始後（分化誘導）４０日目以降、Ｗｎｔシグナル伝達経路作用物質及びＦＧＦシグナル伝達経路阻害物質を含まない血清培地（ＮｕｃＴ１培地）で培養した。浮遊培養開始後（分化誘導）６０日目以降、ＮｕｃＴ２培地で長期培養した。

顕微鏡を用いて、観察した結果、サルｉＰＳ細胞株において、層構造を有する神経網膜（ＮＲ）が形成されることが分かった（図２４）。

サルｉＰＳ細胞由来神経網膜をＰＢＳにて洗浄後、４％ＰＦＡを用いて１５分間４℃で固定した。ＰＢＳにて洗浄後、３０％Ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に浸した。その後、クリオモルドにＯＣＴコンパウンドを用いて包埋後、クリオスタットで１２μｍの切片を作製した。これらの切片に対し、抗Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、Ｐａｘ６抗体（ＢＤ ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＲＸ抗体（ＴａＫａＲａ社）、Ｉｓｌｅｔ−１（ＤＳＨＢ社）、ＢＲＮ３（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ社）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞に対して蛍光顕微鏡（株式会社キーエンス）で観察を行った。その結果、サルｉＰＳ細胞由来神経網膜はヒトと同様の網膜分化をしていることが確認された（図２４）。

＜実施例１５＞
実施例１４で作製した浮遊培養開始後４５日から５５日のサルｉＰＳ細胞由来神経網膜の培養液中に、組換えＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、２日間培養した。一方で、組換えＩＦＮ−γを添加しないグループも用意した。

２日後、サルｉＰＳ細胞由来神経網膜をＰＢＳにて洗浄後、神経細胞分散液（住友ベークライト社製）を添加し、３７℃でインキュベート後、単一細胞へ分散した。これらの細胞に対し、抗ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ抗体（ＦＩＴＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｆ ５６６２）、抗ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体（ＦＩＴＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰ、−ＤＱ；ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，＃Ｆ０８１７又はＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、＃５５５５５８）、対照としてアイソタイプ抗体（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＦＩＴＣ；ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、＃５５５５７３又はｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＦＩＴＣ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃１１−４７３２）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＢＤ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。その結果、組換えインターフェロンγを添加しない条件では、サルｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜は、ＭＨＣ−ｃｌａｓｓＩ（ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩ）の発現はほとんどなく、ＭＨＣ−ｃｌａｓｓＩＩ（ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩＩ）の発現はないことが分かった。一方で、組換えインターフェロンγを添加した条件では、ＭＨＣ−ｃｌａｓｓＩ（ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩ）の発現はあるが低く、ＭＨＣ−ｃｌａｓｓＩＩ（ＨＬＡ−ｃｌａｓｓＩＩ）の発現はないことが分かった（図２５）。

これらの結果から、サルｉＰＳ細胞から分化誘導された神経網膜はヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞と同様に、免疫原性が非常に低いことが分かった。

＜実施例１６：ＭＨＣマッチ、非マッチのサル―サル移植＞
実施例１４で作製した浮遊培養開始後４５日から５５日のサルｉＰＳ細胞由来神経網膜をレーザーにより視細胞変性モデルを作製したサルｉＰＳ細胞とＭＨＣ型がマッチしたカニクイザル及びＭＨＣ型がマッチしていないカニクイザルそれぞれに移植をした。移植後、免疫抑制剤は投与しなかった。

６か月後、サルｉＰＳ細胞由来神経網膜を移植した眼をＰＢＳにて洗浄後、４％ＰＦＡを用いて６０分間４℃で固定した。ＰＢＳにて洗浄後、３０％Ｓｕｃｒｏｓｅ溶液に浸した。その後、クリオモルドにＯＣＴコンパウンドを用いて包埋後、クリオスタットで１２μｍの切片を作製した。これらの切片に対し、抗Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ抗体（Ｓｉｇｍａ）、抗Ｒｅｃｏｖｅｒｉｎ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、抗ＰＫＣα抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｃｏｎｅ ａｒｒｅｓｔｉｎ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された組織に対して共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＰ８）で観察を行った。その結果、ＭＨＣがマッチしているサル及びマッチしていないサルの両方において、杆体視細胞及び錐体視細胞が生着していること、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ陽性の杆体視細胞が成熟していることが確認された。

よって、ＭＨＣがマッチしているサル及び非マッチのサルの両方において、免疫抑制剤を投与しなくても視細胞は生着し、部分的に成熟することが明らかとなった（図２６、図２７）。

＜実施例１７：生体のサルの神経網膜の活性化免疫細胞の抑制能の評価＞
抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を添加して刺激することによって、活性化させたサル由来の免疫細胞に対する抑制能を評価するためのサンプルとして、生後８歳６か月のサル生体由来の神経網膜（単一細胞へ分散されていない神経網膜のサンプル）を用意した。他家のサル由来より採血し、回収したＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）に対して、２４ウェルプレート（住友ベークライト社製）を用いて２日間混合培養させた。

２日後、ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳにて洗浄後、抗ＡＰＣ−ＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３１７４１６）、抗ＡＰＣ−ＣＤ８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、＃１７−００８８）、抗ＡＰＣ−ＣＤ１１ｂ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社製、＃１３０−０９１−２４１）、抗ＡＰＣ−ＣＤ１９抗体、抗ＮＫＧ２Ａ抗体、抗ＰＥ−Ｋｉ−６７抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃３５０５０４）を用いて免疫染色を行った。また、ｉｓｏｔｙｐｅ抗体として、ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ２ａ（ＩｇＧ２ａ）κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（ＦＩＴＣ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００２０８）、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ＡＰＣ、ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１２２）κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ （ＰＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１１２）を用いた。これらの免疫染色された細胞に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＢＤ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。図２８は生体のサル由来神経網膜を用いた場合の解析結果を示す。

その結果、サル由来神経網膜が、活性化されているＣＤ４陽性Ｔ細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞、ＣＤ１１ｂ陽性の単球及びマイクログリア、並びにＮＫＧ２Ａ陽性のＮＫ細胞の活性化状態を抑制することが分かった（図２８）。

これらの結果から、生体のサル由来神経網膜は活性化状態の免疫細胞に対しても、免疫細胞の活性化状態を抑制させることが分かった。すなわち、生体のサル由来神経網膜には免疫抑制能があると言える。

＜実施例１８：ＩＦＮ−γ刺激によるヒトＥＳ／ｉＰＳＣ由来神経網膜におけるＨＬＡクラスＩ，ＩＩの発現について＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後８０日から１００日のヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜の培養液中に、組換えＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、２日間培養した。一方で、組換えＩＦＮ−γを添加しないグループも用意した。

２日後、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜をＰＢＳにて洗浄し、神経細胞分散液（ＷＡＫＯ社製）を添加した。３７℃でインキュベート後、ピペッティングにより単一細胞へ分散した。これらの細胞に対し、抗ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ抗体（ＡＰＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ；Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ、＃３１１４１０）、抗ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ抗体（ＡＰＣ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＰ、−ＤＱ；Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ ＃３６１７１４）、抗β２―ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ抗体（ＡＰＣ Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ、＃３１６３１２）、対照としてアイソタイプ抗体（ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＡＰＣ；Ｂｉｏ Ｌｅｇｅｎｄ、＃４００２２０）を用いて免疫染色を行った。これらの免疫染色された細胞に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＢＤ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。

ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜（ｈＥＳ−ＮＲ／ｈｉＰＳＣ−ＮＲ）による抗原提示能力を評価するために、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びＩＩなどの免疫原性に関連する分子の発現をフローサイトメトリーにより調べた（図３０、図３１）。

ｈＥＳ−ＮＲ／ｈｉＰＳＣ−ＮＲは、ＲＰＥ細胞と比較して、低いレベルでＨＬＡクラスＩ及びβ２―ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（β２−ＭＧａｔ）を発現していたが、ＨＬＡクラスＩＩは発現していなかった。炎症性サイトカインインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）刺激は、ＨＬＡクラスＩの発現を増加させた。

ｈｉＰＳＣ−ＮＲにおけるＨＬＡクラスＩの発現レベルは、ｈｉＰＳＣ−ＲＰＥの場合よりも低かった（図３０、図３１）。よってｈＥＳＣ−ＮＲはＲＰＥ細胞に比べて、免疫原性が低いことがわかった。

ＩＮＦ−γはまた、ｈＥＳＣ−ＮＲ及びｈｉＰＳＣ−ＮＲの両方でＭＨＣクラスＩ分子を構成するタンパク質であるβ２−ミクログロブリン（β２−ＭＧ）、ＨＬＡ−ＥとＰＤ−Ｌ１の発現を増加させた。一方で、副刺激因子であるＣＤ４０や８０、８６においてはＩＮＦ−γのある無しに関わらず、発現は確認されなかった。さらに、免疫抑制性の表面抗原として知られているＣＤ４７はＩＮＦ−γ有り無しに関係なく発現していた。ＨＬＡクラスＩ発現レベルは、Ｃｒｘ：：ｖｅｎｕｓ＋視細胞前駆体では他の集団よりも低かった（図３２、図３３）。

免疫組織化学分析により、ＩＮＦ−γ刺激後のｈＥＳＣ−ＮＲにおけるＨＬＡクラスＩのアップレギュレーションが確認された。一方、ＩＮＦ−γ刺激条件のないＣｒｘ：：Ｖｅｎｕｓ＋視細胞前駆体ではほとんど検出できなかった（図３４〜３６）。

＜実施例１９：移植後のｈＥＳＣ−ＮＲのＨＬＡ発現レベル及び分布＞
Ｒｈｏ変異ヌードラットの網膜変性モデル（リンパ球枯渇ヌードラット）を用いて、移植後のヒトＥＳ細胞由来神経網膜（ｈＥＳ−ＮＲ）によるＨＬＡ発現を調べた。

Ｒｈｏ変異ヌードラット（ＳＤ−Ｆｏｘｎ１ Ｔｇ （Ｓ３３４ｔｅｒ） ３ＬａｖＲｒｒｃヌードラット、日本エスエルシー株式会社）を準備した。移植片作製用の神経網膜として、実施例１で作製した浮遊培養開始後８０日から１００日のヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞由来神経網膜を準備した。

移植片作製用の神経網膜の連続上皮部分を切断し、移植片とした。ラットをケタミン塩酸塩（４０〜８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５〜１０ｍｇ／ｋｇ，又は３〜５％イソフルランの吸入により麻酔した（Ｈｕｎｇ−ｙａら、２０１８ＥｂｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ）。瞳孔はＭｙｄｒｉｎＰ（０．５％フェニレフリン＋０．５％トロピカミド；株式会社参天製薬（大阪市））で散瞳させた。移植片を，ガラスピペットを用いてＳＤ‐Ｆｏｘｎ１Ｔｇ（Ｓ３３４より）３ＬａｖＲｒｃヌードラットの網膜下腔に挿入した。

ＨＬＡクラスＩ発現は、移植片挿入後１日目では明らかでなかった。しかし、移植片挿入５か月後、ＨＬＡクラスＩは視細胞ロゼットと宿主ＲＰＥとの間で発現している細胞が局在していた。さらに、これらのＨＬＡクラスＩを発現している細胞は、ヒト特異的グリア線維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）と共局在しており、グラフト由来の活性化ミュラーグリアがＨＬＡ−Ｃｌａｓｓ Ｉを示す（図４６）。よって、移植後、活性化ミュラーグリア限定的にＨＬＡ−Ｃｌａｓｓ Ｉが発現しており、その他視細胞等は発現していなかった。

ＨＬＡクラスＩＩは、観察されたどの時点、どの部分でも発現は確認されなかった（図４５Ｃ）。

＜実施例２０：ＩＮＦ−ｇ処理によってＨＬＡ−Ｃｌａｓｓ Ｉが発現上昇したＮＲの免疫細胞の活性化について＞
実施例１で作製した浮遊培養開始後８０日から１００日のヒトＥＳ細胞由来神経網膜の培養液中に、組換えＩＦＮ−γ（１００ｎｇ／ｍＬ）（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を添加し、２日間培養した。一方で、組換えＩＦＮ−γを添加しないグループも用意した。インフォームドコンセントを得た健常人より採血し、回収したＰＢＭＣと神経網膜について、２４ウェルプレート（住友ベークライト社製）を用いて、ＰＢＭＣと神経網膜を混合培養させた。

５日後、ＰＢＭＣを回収し、ＰＢＳにて洗浄後、抗ヒトＣＤ４抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３１７４１６）、抗ヒトＣＤ８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、＃１７−００８８）、抗ＣＤ１９抗体、抗ＮＫＧ２Ａ抗体を用いて免疫染色を行った。また、アイソタイプ抗体として、ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１２２）、κ ｉｓｏｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４００１１２）を用いた。これらの免疫染色された細胞に対してフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ ＢＤ社製）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。その結果、ＩＮＦ−ｇ処理してＨＬＡ−Ｃｌａｓｓ Ｉが発現上昇したｈＥＳＣ−ＮＲにおいても免疫細胞を活性化させないことがわかった（図４７）。

Claims (13)

1. 網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患の治療薬であって、
   他家由来、かつ、立体構造を有する網膜組織を含み、
   前記治療薬が投与される対象患者が、網膜系細胞又は網膜組織の障害を伴う疾患に罹患した患者であり、かつ、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤を、前記治療薬の投与後１か月以上にわたり全身的に投与されない患者である、治療薬。
2. 前記対象患者が、前記治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした免疫抑制剤を、全身的に投与されない患者である、請求項１に記載の治療薬。
3. 前記対象患者が、前記治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及びカルシニューリン阻害剤以外の免疫抑制剤を局所的に投与されない患者である、請求項１又は２に記載の治療薬。
4. 前記対象患者が、前記治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、トリアムシノロン、フルオシノロン及びカルシニューリン阻害剤からなる群より選択される１種以上の免疫抑制剤を局所的に投与される患者である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療薬。
5. 前記対象患者が、前記治療薬の投与１か月後以降に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、ステロイド系抗炎症剤及び／又はカルシニューリン阻害剤を局所的に投与されない患者である、請求項３に記載の治療薬。
6. 前記対象患者が、前記治療薬の投与前、投与時及び／又は投与後に、移植による拒絶反応の予防を目的とした、免疫抑制剤を投与されない患者である、請求項１に記載の治療薬。
7. 前記治療薬が、実質的に網膜色素上皮細胞を含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療薬。
8. 少なくとも前記網膜組織の表面においてＴＧＦβが存在している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の治療薬。
9. 前記網膜組織の長軸方向の直径が０．２ｍｍ以上である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の治療薬。
10. 前記網膜組織１個当たりに含まれる総細胞数が１×１０^４細胞以上である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の治療薬。
11. 前記網膜組織の表面が面積比で５０％以上の連続上皮構造を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の治療薬。
12. 前記網膜組織１個当たりに含まれる総細胞数の５０％以上が、ＰＡＸ６、Ｃｈｘ１０及びＣｒｘの少なくとも一つを発現する細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の治療薬。
13. 前記網膜組織が、多能性幹細胞由来である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の治療薬。

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