CN103998599A

CN103998599A - 制备视网膜组织和视网膜相关细胞的方法

Info

Publication number: CN103998599A
Application number: CN201280060865.6A
Authority: CN
Inventors: 中野德重; 安藤觉; 笹井芳树; 永乐元次
Original assignee: Independent Administrative Institution Physical Chemistry Institute; Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Independent Administrative Institution Physical Chemistry Institute; Sumitomo Chemical Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2011-11-25
Filing date: 2012-11-22
Publication date: 2014-08-20
Also published as: CA2856867A1; EP2784152A1; WO2013077425A1; CA3114895A1; KR102111936B1; CN113817679A; AU2012341417B2; US20210228645A1; IN2014CN04599A; US20140341864A1; EP2784152A4; KR20140097442A; CA2856867C; AU2012341417A1; US10973854B2; ES2733956T3; EP2784152B1

Abstract

本发明提供[1]制备视网膜组织的方法，所述方法包括以下步骤(1)至(3)：(1)第一步，在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中将多能干细胞进行漂浮培养以形成多能干细胞的聚集体，(2)第二步，在含有基膜制备物的无血清培养基中将在第一步中形成的聚集体进行漂浮培养，和(3)第三步，在含血清的培养基中将在第二步中培养的聚集体进行漂浮培养；[2]制备视杯样结构的方法，所述方法包括以下步骤：在各自含有作用于Sonic hedgehog信号途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中，对在以上步骤(3)中培养的含有视网膜组织的聚集体进行漂浮培养；[3]制备视网膜色素上皮的方法，所述方法包括以下步骤：在各自含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中(其中所述无血清培养基和含血清的培养基不含作用于Sonic hedgehog信号途径的物质)，将在以上步骤(3)中培养的含有视网膜组织的聚集体进行漂浮培养；以及[4]制备视网膜层特异性神经细胞的方法，所述方法包括使包含在来源于灵长类多能干细胞的视网膜组织中的视网膜先祖细胞接触抑制Notch信号途径的物质。

Description

制备视网膜组织和视网膜相关细胞的方法

技术领域

本发明涉及制备视网膜组织以及视网膜相关细胞如视网膜层特异性神经细胞、视网膜色素上皮等的方法。

背景技术

中枢神经系统组织如脑和视网膜具有低的再生能力并且损伤的组织几乎不会自然地恢复。因此，预期移植治疗用的分化自多能干细胞的细胞的再生医学是战胜难治性疾病的最后一张牌。此外，通过自多能干细胞的分化获得的人源细胞被认为能够精确地评估化学物质对人的作用，并且朝向应用于化合物的毒性评估和药物发现的研究和开发正在进行中。

视网膜是重要的感觉组织，其接收光，将其转化为电信号并且，在信息处理后，经由轴突将所述信息传递至大脑的视觉中枢。视网膜主要由在彼此之上叠加的两种内部和外部上皮组织构成。内部是神经视网膜，其接收光并处理信息，并且包含超过一种类型的细胞如光感受器。外部是视网膜色素上皮，其是支持光感受器的存活和功能的单层细胞片。

已有已知的从多能干细胞制备构成神经视网膜的视网膜层特异性神经细胞(光感受器，水平细胞，无长突细胞，神经节细胞等)的报道(专利文献1)。此外，作为由多能干细胞制备三维视网膜组织的方法，描述的是，视网膜先祖组织、视杯样结构和多层神经视网膜组织可以在体外通过以下方式制备：在无血清培养基中形成均质的多能干细胞聚集体并且在基膜制备物存在下将其进行漂浮培养(非专利文献1和专利文献2)。

另一方面，关于通过使用多能干细胞制备视网膜色素上皮的报道也是已知的(非专利文献2)。然而，没有关于高效地制备视网膜色素上皮的报道。

[文献列表]

[专利文献]

专利文献1：WO2008/087917

专利文献2：WO2011/055855

[非专利文献]

非专利文献1：Mototsugu Eiraku,Nozomu Takata,Hiroki Ishibashi,Masako Kawada,Eriko Sakakura,Satoru Okuda,Kiyotoshi Sekiguchi,TaijiAdachi & Yoshiki Sasai(2011)Self-organizing optic-cup morphogenesis inthree-dimensional culture(三维培养中的自组织视杯形态发生).Nature，卷:472,页码:51-56

非专利文献2：Maria Idelson,Ruslana Alper,Alexey Obolensky,EttiBen-Shushan,Itzhak Hemo,Nurit Yachimovich-Cohen,Hanita Khaner,YoavSmith,Ofer Wiser,Michal Gropp,Malkiel A.Cohen,Sharona Even-Ram,YaelBerman-Zaken,Limor Matzrafi,Gideon Rechavi,Eyal Banin和BenjaminReubinoff(2009)Directed Differentiation of HumanEmbryonic Stem Cellsinto Functional Retinal Pigment Epithelium Cells(人胚胎干细胞直接分化为功能性视网膜色素上皮细胞).Cell Stem Cell5,396-408

发明概述

本发明要解决的问题

需要高效地制备视网膜组织、视杯样结构和视网膜层特异性神经细胞以及视网膜色素上皮的的方法。

解决问题的手段

在此种情况下本发明的发明人进行了大量研究并且获得了本发明。

因此，本发明如下。

[1]制备视网膜组织的方法，包括以下步骤(1)至(3)：

(1)第一步，在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中将多能干细胞进行漂浮培养以形成多能干细胞的聚集体，

(2)第二步，在含有基膜制备物(basement membrane preparation)的无血清培养基中将第一步中形成的聚集体进行漂浮培养，和

(3)第三步，在含血清的培养基中将第二步中培养的聚集体进行漂浮培养。

[2]制备视杯样结构的方法，所述方法包括以下步骤：在各自含有作用于Sonic hedgehog(下文中，有时也称作“Shh”)信号途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中，将通过前述[1]的方法获得的视网膜组织进行漂浮培养。

[3]制备视网膜色素上皮的方法，所述方法包括以下步骤：在各自含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中(其中前述无血清培养基和含血清的培养基不含作用于Sonic hedgehog(下文中，有时也称作“Shh”)信号途径的物质)，将通过前述[1]的方法获得的视网膜组织进行漂浮培养。

[4]前述[3]的方法，其中前述含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基还包含作用于激活蛋白(Activin)信号途径的物质。

[5]前述[1]至[4]中任一项的方法，其中前述多能干细胞是灵长类多能干细胞。

[6]前述[1]至[4]中任一项的方法，其中前述多能干细胞是人多能干细胞。

[7]前述[1]至[6]中任一项的方法，其中前述基膜制备物是至少一种选自由以下组成的组的细胞外基质分子：层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。

[8]前述[1]至[7]中任一项的方法，其中前述第一步至第三步在敲除血清置换物(Knockout serum replacement)(下文中，有时也称作“KSR”)存在下进行。

[9]制备视网膜层特异性神经细胞的方法，所述方法包括使包含在来源于灵长类多能干细胞的视网膜组织中的视网膜先祖细胞接触抑制Notch信号途径的物质。

[10]前述[9]的方法，其中前述抑制Notch信号途径的物质是γ分泌酶活性抑制物质。

[11]前述[9]或[10]的方法，其中前述抑制Notch信号途径的物质是N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(下文中，有时也称作“DAPT”)。

[12]前述[9]至[11]中任一项的方法，其中前述灵长类是人。

[13]前述[9]至[12]中任一项的方法，其中所述视网膜层特异性神经细胞是光感受器。

[14]前述[9]至[12]中任一项的方法，其中所述视网膜层特异性神经细胞是神经节细胞。

[15]前述[9]至[14]中任一项的方法，其中所述包含在来源于灵长类多能干细胞的视网膜组织中的视网膜先祖细胞是包含在通过以下步骤制备的视网膜组织中的视网膜先祖细胞：

(1)第一步，在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中将灵长类多能干细胞进行漂浮培养以形成灵长类多能干细胞的聚集体，

(2)第二步，在含有基膜制备物的无血清培养基中将第一步中形成的聚集体进行漂浮培养，

(3)第三步，在含血清的培养基中将第二步中培养的聚集体进行漂浮培养，

(4)第四步，在各自含有作用于Sonic hedgehog(下文中，有时也称作“Shh”)信号途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中将第三步中培养的聚集体进行漂浮培养，以形成视杯样结构，和

(5)将第四步中形成的视杯样结构进行漂浮培养的步骤。

[16]用于评估毒性或药物效力的试剂，所述试剂包含通过前述[1]至[15]中任一项的方法制备的视网膜组织、视杯样结构、视网膜色素上皮或视网膜层特异性神经细胞。

[17]用于评估测试物质的毒性或药物效力的方法，所述方法包括使通过前述[1]至[15]中任一项的方法制备的视网膜组织、视杯样结构、视网膜色素上皮或视网膜层特异性神经细胞接触所述测试物质，并且检查所述物质对所述组织、结构或细胞的影响。

[18]用于由视网膜组织的紊乱所致的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含通过前述[1]至[15]中任一项的方法制备的视网膜组织、视杯样结构、视网膜色素上皮或视网膜层特异性神经细胞。

[19]用于治疗由视网膜组织的紊乱所致的疾病的方法，所述方法包括移植有效量的通过前述[1]至[15]中任一项的方法制备的视网膜组织、视杯样结构、视网膜色素上皮或视网膜层特异性神经细胞至需要所述移植的靶标。

[20]通过前述[1]至[15]中任一项的方法制备的视网膜组织、视杯样结构、视网膜色素上皮或视网膜层特异性神经细胞，其用于治疗由视网膜组织的紊乱所致的疾病。

发明效果

根据本发明，可以高效地制备视网膜组织、视杯样结构、视网膜层特异性神经细胞或视网膜色素上皮。因此，考虑到有效提供视网膜组织、视杯样结构、视网膜层特异性神经细胞或视网膜色素上皮以用于化学物质等的毒性或药物效力评估、移植治疗等，本发明是高度有用的。

附图简述

图1是这样的视图，其显示在自开始漂浮培养起第25天，通过仅添加Matrigel(下文中，有时也称作Matrigel)和不添加抑制Wnt信号途径的物质制备的人多能干细胞来源的聚集体的明视场图像(A)和荧光图像(B)，在自开始漂浮培养起第25天，通过添加抑制Nodal信号途径的物质和Matrigel制备的人多能干细胞来源的聚集体的明视场图像(C)和荧光图像(D)，以及在自开始漂浮培养起第25天，通过添加抑制Wnt信号途径的物质和Matrigel制备的人多能干细胞来源的聚集体的明视场图像(E)和荧光图像(F)。

图2是这样的视图，其显示在自开始漂浮培养起第18天通过添加抑制Wnt信号途径的物质漂浮培养人多能干细胞、在Matrigel存在下漂浮培养人多能干细胞以及在不存在胎牛血清的情况下另外漂浮培养人多能干细胞制备的聚集体的明视场图像(A)和荧光图像(B)，在自开始漂浮培养起第18天通过添加抑制Wnt信号途径的物质漂浮培养人多能干细胞、在Matrigel存在下漂浮培养人多能干细胞以及在胎牛血清存在下漂浮培养人多能干细胞制备的聚集体的明视场图像(C)和荧光图像(D)，以及在自开始漂浮培养起第18天通过添加抑制Wnt信号途径的物质漂浮培养人多能干细胞、在Matrigel存在下漂浮培养人多能干细胞以及另外在胎牛血清和作用于Sonic hedgehog(下文中，有时也称作“Shh”)信号途径的物质存在下漂浮培养人多能干细胞制备的聚集体的明视场图像(E)和荧光图像(F)。

图3显示在自开始漂浮培养起第18天构成聚集体的表达GFP的细胞的FACS直方图(A)，所述聚集体是通过添加抑制Wnt信号途径的物质漂浮培养人多能干细胞、在Matrigel存在下漂浮培养人多能干细胞以及另外在不存在胎牛血清的情况下漂浮培养人多能干细胞制备的；在自开始漂浮培养起第18天构成聚集体的表达GFP的细胞的FACS直方图(B)，所述聚集体是通过添加抑制Wnt信号途径的物质漂浮培养人多能干细胞、在Matrigel存在下漂浮培养人多能干细胞以及另外在胎牛血清存在下漂浮培养人多能干细胞制备的；在自开始漂浮培养起第18天构成聚集体的表达GFP的细胞的FACS直方图(C)，所述聚集体是通过添加抑制Wnt信号途径的物质漂浮培养人多能干细胞、在Matrigel存在下漂浮培养人多能干细胞以及在胎牛血清和抑制Shh信号途径的物质存在下漂浮培养人多能干细胞制备的；并且图(D)显示GFP强阳性细胞的比例，所述GFP强阳性细胞是视网膜先祖细胞。

图4是这样的视图，其显示在自开始漂浮培养起第60天免疫染色视网膜组织(A，B，C)和在自开始漂浮培养起第126天免疫染色视网膜组织(D，E，F，G，H，I)的结果，所述视网膜组织是通过本发明的视网膜组织的制备方法制备的。

图5是这样的视图，其显示在自开始漂浮培养起第14天(A)，第15天(B)，第16天(C)，第17天(D)通过本发明的视杯样结构的制备方法获得的聚集体的同一部分的明视场和荧光图像的重叠的图像。

图6是这样的视图，其显示在自开始漂浮培养起第24至26天通过本发明的视杯样结构的制备方法获得的漂浮培养的聚集体的通过显微镜观察的明视场图像(A)和荧光图像(B)，和双光子显微镜观察图像(C)和获得自双光子显微镜观察图像的3D重构图像(D)。

图7是这样的视图，其显示利用抗-Mitf抗体和抗-Chx10抗体，通过本发明的视杯样结构的制备方法的漂浮培养制备的视杯样结构的冷冻切片的免疫染色的结果。

图8是这样的视图，其显示在不添加10μM DAPT的条件下开始漂浮培养，漂浮培养直至自开始漂浮培养起第41天的情况中的荧光显微镜(A)，在添加DAPT的条件下漂浮培养直至自开始漂浮培养起第41天的情况中的荧光显微镜(B)，在不添加10μM DAPT的条件下漂浮培养直至自开始漂浮培养起第43天的情况中的利用抗-恢复蛋白抗体(C)或抗-Brn3抗体(E)免疫染色的冷冻切片的照片，以及在添加DAPT的条件下漂浮培养直至分化诱导的第43天的情况中的利用抗-恢复蛋白抗体(D)或抗-Brn3抗体(F)免疫染色的冷冻切片的照片，其各自使用在自开始漂浮培养起第29天的Crx::GFP敲入人ES细胞来源的视网膜组织。

图9是这样的视图，其显示在不添加10μM DAPT的条件下漂浮培养直至自开始漂浮培养起第49天的情况中的荧光显微镜(A)，在添加DAPT的条件下漂浮培养直至自开始漂浮培养起第49天的情况中的荧光显微镜(B)，在不添加10μM DAPT的条件下漂浮培养直至自开始漂浮培养起第49天的情况中的利用抗-恢复蛋白抗体(C)或抗-Brn3抗体(E)免疫染色的冷冻切片的照片，以及在添加DAPT的条件下漂浮培养在自开始漂浮培养起第33天冻融视网膜组织后在自开始漂浮培养起第38天的Crx::GFP敲入人ES细胞来源的视网膜组织直至自开始漂浮培养起第49天的情况中的利用抗-恢复蛋白抗体(D)或抗-Brn3抗体(F)免疫染色的冷冻切片的照片。

图10是这样的视图，其显示通过以下方式制备的聚集体的明视场：在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中进行漂浮培养以形成聚集体，在基膜制备物存在下在无血清培养基中漂浮培养形成的聚集体，在含有血清的培养基中培养培养的聚集体，并且在含有作用于Wnt信号途径的物质的培养基中培养培养的聚集体。

图11是这样的视图，其显示通过以下方式制备的聚集体的明视场：在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中进行漂浮培养以形成聚集体，在基膜制备物存在下在无血清培养基中漂浮培养形成的聚集体，在含有血清的培养基中培养培养的聚集体，并且在含有作用于Wnt信号途径的物质和作用于激活蛋白A通路的物质的培养基中培养培养的聚集体。

具体实施方式

以下详细说明实施本发明的方式。

在本发明中，“转化体”是指通过转化产生的有生命的物质如细胞的全部或部分。转化体的实例包括原核细胞，酵母，动物细胞，植物细胞，昆虫细胞等。根据靶标，转化体有时也被称为转化细胞，转化组织，转化宿主等。用于本发明的细胞也可以是转化体。

用于本发明中的遗传改造技术的原核细胞的实例包括属于埃希氏菌属(genus Escherichia)，沙雷氏菌属(genus Serratia)，芽孢杆菌属(genusBacillus)，短杆菌属(genus Brevibacterium)，棒杆菌属(genusCorynebacterium)，微杆菌属(genus Microbacterium)，假单胞菌属(genusPseudomonas)等，如埃希氏菌XL1-Blue，埃希氏菌XL2-Blue，和埃希氏菌DH1。这些细胞具体描述于，例如，Sambrook,J和Russell,D.W.的“Molecular Cloning(分子克隆)(第3版)”，附录3(卷3)，Vector and Bacterialstrains(载体和菌株).A3.2(Cold Spring Harbor USA2001)。

本发明中的“载体”是指能够将所需的多核苷酸序列转移到目标细胞中的载体。这样的载体的实例包括能够在宿主细胞如原核细胞，酵母，动物细胞，植物细胞，昆虫细胞，动物个体和植物个体等中自主复制的那些，或能够整合到染色体中并且在适于多核苷酸转录的位置处含有启动子的那些。

在所述载体中，适于克隆的载体有时被称为“克隆载体”。这样的克隆载体通常具有含有多个限制酶位点的多个克隆位点。目前，有很多载体可用于相关领域中的基因克隆，并且它们被经销商以不同的名称销售，因为它们稍有不同(例如，多克隆位点处的限制酶的种类和序列)。例如，代表的克隆载体描述于(经销商也被描述)Sambrook,J和Russell,D.W.的“Molecular Cloning(分子克隆)(第3版)”，附录3(卷3)，Vector and Bacterialstrains(载体和菌株).A3.2(Cold Spring Harbor USA2001)，并且本领域普通技术人员可以根据目标适当地使用它们。

本发明中的“载体”还包括“表达载体”，“报告载体”，和“重组载体”。“表达载体”是指这样的核酸序列，其中除了结构基因和启动子以外的调节其表达的各种调节元件以这样的方式连接以致它们在宿主中是可操作的。“调节元件”的实例包括终止子，选择标记如药物抗性基因，以及含有增强子的调节元件。本领域技术人员公知，使用的有生命的物质(例如，动物)的表达载体的类型和调节元件的类型可以根据宿主细胞而改变。

本发明中的“重组载体”的实例包括(a)用于基因组文库筛选的λ FIX载体(噬菌体载体)，(b)用于cDNA筛选的λZAP载体(噬菌体载体)，和(c)用于克隆基因组DNA的pBluescript II SK+/-，pGEM，和pCR2.1载体(质粒载体)。“表达载体”的实例包括pSV2/neo载体，pcDNA载体，pUC18载体，pUC19载体，pRc/RSV载体，pLenti6/V5-Dest载体，pAd/CMV/V5-DEST载体，pDON-AI-2/neo载体，和pMEI-5/neo载体(质粒载体)等。“报告载体”的实例包括pGL2载体，pGL3载体，pGL4.10载体，pGL4.11载体，pGL4.12载体，pGL4.70载体，pGL4.71载体，pGL4.72载体，pSLG载体，pSLO载体，pSLR载体，pEGFP载体，pAcGFP载体，pDsRed载体等。根据前述Molecular Cloning(分子克隆)文献可以适当地使用这些载体。

在本发明中，作为用于将核酸分子引入细胞中的技术，例如，可以提及转化，转导，转染等。作为此种引入技术，可以具体提及例如，描述于Ausubel F.A.等编辑(1988),Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,New York,NY；Sambrook J.等(1987),Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第2版和第3版；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,NY；特刊,Experimental Medicine“transgene&expression analysisexperiment method”YODOSHA CO.,LTD.,1997等中的方法。作为用于确认基因的胞内引入的技术，可以提及RNA印迹分析，蛋白质印迹分析或其他公知的常规技术等。

在本发明中，“干细胞”是指甚至在细胞分化后仍保持相同分化能力的细胞，并且其组织可以在组织损伤时再生。此处，干细胞可以是胚胎干细胞(ES细胞)或组织干细胞(也被称为组织的干细胞，组织特异性干细胞或体干细胞)，或人造的多能干细胞(iPS细胞：诱导的多能干细胞)，但不限于此。如从上述来源于干细胞的组织细胞可以再生组织的事实理解的，已知干细胞可以分化为与活体中的细胞接近的正常细胞。

干细胞可以获得自给定的组织，或者也可以购买市售产品。例如，人胚胎干细胞，KhES-1，KhES-2和KhES-3可获得自Kyoto University的前沿医学研究所(Institute for Frontier Medical Sciences)。小鼠胚胎干细胞EB5细胞可获得自RIKEN，而D3细胞系可获得自ATCC。

干细胞可以通过根据本身已知的方法培养来维持。例如，干细胞可以通过补充以胎牛血清(FCS)、敲除血清置换物(Knockout Serum Replacement,KSR)和LIF的无饲养细胞培养来维持。

在本发明中，“多能干细胞”是指这样的干细胞，其可以在体外培养并且有能力分化成构成除胎盘以外的活体的任何细胞(来源于三胚层(外胚层、中胚层、内胚层)的组织)(分化多能性)，其包括胚胎干细胞(ES细胞)。“多能干细胞”获得自受精卵，克隆胚胎，再生干细胞，和组织中的干细胞。其还包括，在向体细胞中引入若干种基因后具有类似于胚胎干细胞的分化多能性的人工多能性的细胞(也被称为人造多能干细胞)。多能干细胞可以通过本身已知的方法制备。制备方法的实例包括描述于Cell 131(5)pp.861-872，Cell 126(4)pp.663-676等中的方法。

在本发明中，“胚胎干细胞(ES细胞)”是指具有自身复制能力和多能性(即，“多能性”)的干细胞，其是源自早期胚胎的多能干细胞。胚胎干细胞首先建立于1981年，并且自1989年起已被应用于产生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干细胞，其也被用于再生医学。

在本发明中，“人造多能干细胞”是指通过直接重编程分化的细胞如成纤维细胞等，通过表达若干种基因如Oct3/4、Sox2、Klf4和Myc被诱导而具有多能性的细胞，其在2006年由Yamanaka等在小鼠细胞中建立(Takahashi K，Yamanaka S.Cell.2006，126(4)，p663-676)。在2007年，其也在人成纤维细胞中被建立，并且具有类似于胚胎干细胞的多能性(Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,Narita M,Ichisaka T,Tomoda K,Yamanaka S.Cell.2007,131(5),p861-872.；Yu J,Vodyanik MA,Smuga-OttoK,Antosiewicz-Bourget J,Frane JL,Tian S,Nie J,Jonsdottir GA,Ruotti V,Stewart R,Slukvin II,Thomson JA.,Science.2007,318(5858),p1917-1920.；Nakagawa M,Koyanagi M,Tanabe K,Takahashi K,Ichisaka T,Aoi T,Okita K,Mochiduki Y,Takizawa N,Yamanaka S.Nat Biotechnol.,2008,26(1),p101-106)。

遗传修饰的多能干细胞可以例如使用同源重组技术制备。要被修饰以用于制备修饰的多能干细胞的染色体上的基因的实例包括组织相容性抗原基因，与由神经系统细胞的紊乱所致的疾病相关的基因等。染色体上的目标基因可以通过描述于Manipulating the Mouse Embryo,A LaboratoryManual(操纵小鼠胚胎，实验室手册),第二版,Cold Spring HarborLaboratory Press(1994)；Gene Targeting,A Practical Approach(基因寻靶，实用方法),IRL Press，Oxford University Press(1993)；Bio Manual系列8,genetargeting,Production of mutant mouse by using ES cells(基因寻靶，通过使用ES细胞制备突变体小鼠),YODOSHA CO.,LTD.(1995)等中的方法修饰。

具体地，例如，分离要修饰的靶基因的基因组基因(例如，组织相容性抗原基因、疾病相关基因等)，并且使用分离的基因组基因制备用于靶基因的同源重组的靶载体。将制备的靶载体引入干细胞中，并且选择显示靶基因和靶载体间的同源重组的细胞，由此可以制备在染色体上具有修饰的基因的干细胞。

作为用于分离靶基因的基因组基因的方法，可以提及描述于MolecularCloning,A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册),第二版,Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989),Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学中的当前实验方案),John Wiley & Sons(1987-1997)等中的已知方法。此外，可以使用基因组DNA文库筛选系统(由Genome Systems生产)，Universal GenomeWalker Kits(由CLONTECH生产)等分离靶基因的基因组基因。

根据描述于Gene Targeting,A Practical Approach(基因寻靶，实用方法),IRL Press，Oxford University Press(1993)；Bio Manual系列8,gene targeting,Production of mutant mouse by using ES cells(基因寻靶，通过使用ES细胞制备突变体小鼠),YODOSHA CO.,LTD.(1995)等中的方法，可以制备用于靶基因的同源重组的靶载体，并且可以有效地选择同源重组体。靶载体可以是任何置换类型和插入类型的，并且选择方法可以是阳性选择，启动子选择，阴性选择，polyA选择等。

作为用于从选择的细胞系中选择目的同源重组体的方法，可以提及用于基因组DNA的Southern杂交法、PCR法等。

在本发明中，“组织”是指细胞群体的结构，其具有一定的构造，其中形状和性质不同的超过一种类型的细胞在空间上被布置成特定的模式。

在本发明中，“视网膜组织”是指这样的视网膜组织，其中构成活体视网膜中的相应的视网膜层的至少两种以上类型的细胞如光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞，其前体细胞或其视网膜先祖细胞在空间上被布置成层。关于各细胞，哪种细胞构成哪个视网膜层可以通过已知方法确认，例如，细胞标记物的表达。

视网膜细胞标记物的实例包括，但不限于，Rax(视网膜的先祖细胞)，PAX6(先祖细胞)，巢蛋白(nestin)(其表达在下丘脑神经元的先祖细胞中而不表达在视网膜先祖细胞中)，Sox1(其表达在下丘脑神经上皮中但是不表达在视网膜中)，Crx(光感受器的前体细胞)等。特别地，上述视网膜层特异性神经元的标记物的实例包括，但不限于，Chx10(双极细胞)，L7(双极细胞)，Tuj1(神经节细胞)，Brn3(神经节细胞)，钙视网膜蛋白(Calretinin)(无长突细胞)，钙结合蛋白(Calbindin)(水平细胞)，视紫红质(Rhodopsin)(光感受器)，恢复蛋白(光感受器)，RPE65(色素上皮)，Mitf(色素上皮)Nrl(视杆细胞)，Rxr-γ(视锥细胞)等。

在本发明中，“视杯样结构”是指具有与胚胎发育过程中的视杯类似的形状的结构。在胚胎发育过程中，视网膜的原基发育自间脑的侧面，并且形成类似从间脑突出的囊。所述囊样上皮结构被称为视泡。视泡的最外部(未来将成为神经视网膜)逐渐向视泡内部凹入，并且形成视杯，视杯是由上皮的内外两层构成的杯状组织。视杯之后长大并且形成具有视网膜组织的视网膜。其是否是视杯样结构可以由本领域普通技术人员通过利用显微镜、放大镜等进行观察来确认。

要在本发明中制备的视杯样结构不仅显示形态学上的视杯样突起而且还显示在构成视杯样结构的细胞中的Rax的高频表达，Rax是视网膜先祖细胞标记物。此外，视杯样结构的外层还显示表达Mitf的视网膜色素上皮的层，并且内层显示构成视网膜组织的细胞，如表达Chx10的视网膜先祖细胞。此种视杯样结构非常类似活体发育中的视杯组织的结构。

本发明中的“视网膜层”是指构成视网膜的各层。其具体实例包括视网膜色素上皮层，光感受器层，外部限制膜，外部核层，外部丛状层，内部核层，内部丛状层，神经节细胞层，神经纤维层和内部限制膜。

本发明中的“视网膜层特异性神经细胞”是指构成视网膜层并且特异于视网膜层的神经细胞。

本发明中的“视网膜先祖细胞”是指可以分化为光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，和视网膜神经节细胞中的任何成熟视网膜细胞的先祖细胞。

另一方面，光感受器前体，水平前体细胞，双极前体细胞，无长突前体细胞和视网膜神经节前体细胞是被确定分别分化为光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞和视网膜神经节细胞的前体细胞。

本发明中的“视网膜色素上皮”是指存在于活体的视网膜中的神经视网膜组织的外侧上的上皮细胞。是否是视网膜色素上皮可以由本领域普通技术人员通过例如细胞标记物(RPE65(色素上皮)，Mitf(色素上皮)等)的表达、黑素颗粒的存在、特征多角细胞形状等容易地确认。

本发明中使用的培养基可以制备自作为基础培养基的用于培养动物细胞的培养基。基础培养基的实例包括BME培养基，BGJb培养基，CMRL1066培养基，Glasgow MEM培养基，改进的MEM Zinc Option培养基，IMDM培养基，Medium199培养基，Eagle MEM培养基，αMEM培养基，DMEM培养基，火腿培养基，RPMI1640培养基，Fischer氏培养基，及它们的混合培养基，并且培养基不受特别的限制，只要其可以用于培养动物细胞。

本发明中的“无血清培养基”是指不含未调整的或未纯化的血清的培养基。含有纯化的来源于血液的组分和来源于动物组织的组分(例如，生长因子)的培养基被认为是无血清培养基，除非其中含有未调整的或未纯化的血清。

培养基不受特别的限制，只要其如上所限定。然而，为了避免复杂的制备，添加有适当量(例如，1-20％)的市售KSR的无血清培养基(GMEM或DMEM，0.1mM2-巯基乙醇，0.1mM非必需氨基酸混合物，1mM丙酮酸钠)可以用作无血清培养基。

此外，无血清培养基可以含有血清置换物。血清置换物可以合适地含有，例如，清蛋白，转铁蛋白，脂肪酸，胶原蛋白前体，痕量元素，2-巯基乙醇或3’硫醇甘油(3’thiolglycerol)，其等效物等。此种血清置换物可以通过例如WO98/30679中所述的方法制备。此外，为了更方便地进行本发明的方法，血清置换物可以是市售产品。此种市售血清置换物的实例包括Chemically-defined Lipid concentrated(化学上限定的脂质浓缩物)(由Gibco生产)和Glutamax(由Gibco生产)。

用于漂浮培养的无血清培养基可以含有脂肪酸或脂质，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化剂，2-巯基乙醇，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。

本发明中的“含血清的培养基”是指含有未调整的或未纯化的血清的培养基。所述培养基不受特别限制，只要其如上所限定。此外，含血清的培养基可以含有脂肪酸或脂质，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化剂，2-巯基乙醇，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。

本发明中的“漂浮培养”是指在防止细胞或细胞质粘附到细胞培养容器材料等的条件下培养。

用于漂浮培养的细胞培养容器不受特别限制，只要其使“漂浮培养”成为可能，并且本领域普通技术人员可以适当地对其进行确定。此种细胞培养容器的实例包括烧瓶，组织培养烧瓶，盘，培养皿，组织培养皿，多盘(multidish)，微板，微孔板，微孔，多板(multiplate)，多孔板，室载玻片(chamber slide)，盘碟(schale)，试管，碟，培养袋和滚瓶(roller bottle)。因为这些细胞培养容器用于漂浮培养，所以它们优选是细胞非粘附性的。作为细胞非粘附性容器，可以使用其表面未被人工处理(例如，利用胞外基质的包被处理等)以提高细胞粘附性的容器等。

本发明中的“灵长类”是指属于灵长类的哺乳动物。灵长类的实例包括卷鼻猴亚目(Strepsirrhini)如狐猴、懒猴和Tsubai，以及类人猿亚目(Haplorhini)如猴、类人猿和人。

<视网膜组织的制备方法>

本发明的第一方面是制备视网膜组织的方法，其包括以下步骤(1)至(3)：

(2)第二步，在含有基膜制备物的无血清培养基中将第一步中形成的聚集体进行漂浮培养，和

(1)第一步

解释第一步，在含有抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中将多能干细胞进行漂浮培养以形成多能干细胞的聚集体。

抑制Wnt信号途径的物质不受特别限制，只要其可以抑制由Wnt介导的信号转导。抑制Wnt信号途径的物质的实例包括Dkk1，Cerberus蛋白，Wnt受体抑制剂，可溶型Wnt受体，Wnt抗体，酪蛋白激酶抑制剂，显性阴性Wnt蛋白，CKI-7(N-(2-氨基乙基)-5-氯-异喹啉-8-磺酰胺)，D4476(4-{4-(2,3-二氢苯并[1,4]二烯-6-基)-5-吡啶-2-基-1H-咪唑-2-基}苯酰胺)，IWR-1-内(IWR-1-endo)(IWR1e)，IWP-2等。

用于本发明的抑制Wnt信号途径的物质的浓度仅需要是形成多能干细胞的聚集体的浓度。例如，常见的抑制Wnt信号途径的物质如IWR1e以约0.1μM至100μM，优选地约1μM至10μM，更优选地约3μM的浓度添加。

抑制Wnt信号途径的物质可以在开始漂浮培养前被添加至无血清培养基，或在自开始漂浮培养起的数天内(例如，5天内)添加到无血清培养基。优选地，抑制Wnt信号途径的物质在自开始漂浮培养起的5天内、更优选地3天内、最优选地与开始漂浮培养同时被添加至无血清培养基。此外，在添加抑制Wnt信号途径的物质的情况下，漂浮培养进行至自开始漂浮培养起的第18天、更优选地第12天。

培养条件如第一步中的培养温度和CO₂浓度可以被适当地确定。而培养温度不受特别限制，其为，例如，约30至40℃，优选地约37℃。CO₂浓度为，例如，约1至10％，优选地约5％。

本发明中的“聚集体”是指分散在培养基中但聚集以形成聚集体的大量细胞。本发明中的“聚集体”包括由在漂浮培养开始时分散的细胞形成的聚集体和在漂浮培养开始时已经形成的聚集体。

当细胞聚集从而形成细胞聚集体并且对聚集体进行漂浮培养时，“形成聚集体”是指“快速地聚集给定数目的分散的干细胞”以形成在质量上均匀的细胞聚集体。

形成聚集体的实验操作的实例包括涉及通过使用具有小孔的平板(96孔板)、微孔等将细胞保持在小空间中的方法，涉及通过使用小离心管短时间离心来聚集细胞的方法等。

第一步中多能干细胞的浓度可以由本领域普通技术人员适当地确定，以更均匀和有效地形成多能干细胞的聚集体。形成聚集体时多能干细胞的浓度不受特别限制，只要其允许形成干细胞的均匀聚集体。例如，当使用96孔微孔板对人ES细胞进行漂浮培养时，加入制备成每孔约1×10³至约5×10⁴个细胞、优选地约3×10³至约3×10⁴个细胞、更优选地约5×10³至约2×10⁴个细胞、最优选地约9×10³个细胞的液体，并且静置平板以形成聚集体。

形成聚集体所需的漂浮培养的时间可以根据所用的多能干细胞适当地确定，只要细胞可以快速聚集。为了形成均匀的聚集体，其理想地是尽可能的短。例如，在人ES细胞的情况中，聚集体理想地优选地在24小时内、更优选地在12小时内形成。聚集体形成所需的时间可以由本领域普通技术人员通过控制用于聚集细胞的工具、离心条件等适当地调整。

本领域普通技术人员可以基于聚集体的尺寸和细胞数目，宏观形态，微观形态，通过组织染色分析及其均匀性，分化和未分化标记物的表达及其均匀性，控制分化标记物的表达及其同步，聚集体间分化效率的再现性等来确定是否已经形成多能干细胞的聚集体。

(2)第二步

解释第二步，在含有基膜制备物的无血清培养基中对第一步中形成的聚集体进行漂浮培养。

“基膜制备物”是指含有基膜构成组分的制备物，当能够形成基膜的目的细胞被铺板于其上并培养时，其具有与上皮细胞类似的控制细胞形成，分化，生长，活动性，功能表达等的功能。此处，“基膜构成组分”是指存在于动物组织中的上皮细胞层和间隙细胞层等之间的薄膜形式的细胞外基质分子。基膜制备物可以通过例如以下方式制备：利用能够溶解细胞脂质的溶液、碱溶液等移除经由基膜粘附在载体上的能够形成基膜的细胞。优选的基膜制备物的实例包括可作为基膜组分商购的产品(例如，Matrigel(下文中，有时也称作Matrigel))和已知作为基膜组分的细胞外基质分子(例如，层粘连蛋白，IV型胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，巢蛋白等)。

Matrigel是制备自来源于Engelbreth Holm Swarn(EHS)小鼠肉瘤的基膜的产品。Matrigel的主要成分是IV型胶原蛋白，层粘连蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。除了这些以外，还含有由EHS肿瘤天然产生的TGF-β，成纤维细胞生长因子(FGF)，组织纤溶酶原激活物和生长因子。Matrigel的“生长因子减少的产品”具有比通常Matrigel低的生长因子浓度，并且其标准浓度为<0.5ng/ml(对于EGF)，<0.2ng/ml(对于NGF)，<5pg/ml(对于PDGF)，5ng/ml(对于IGF-1)，以及1.7ng/ml(对于TGF-β)。在本发明的方法中，优选使用“生长因子减少的产品”。

虽然在第二步中添加到用于漂浮培养的无血清培养基的基膜制备物的浓度不受特别限制，只要神经组织的上皮结构(例如，视网膜组织)被稳定地保持，但是例如，当使用Martigel时，其优选为培养基的1/20至1/200体积，更优选为约1/100体积。虽然当开始培养干细胞时基膜制备物可以已经被添加到培养基，但是优选地，其在自开始漂浮培养起5天内、更优选地在2天内被添加至无血清培养基。

作为第二步中使用的无血清培养基，可以直接使用第一步中使用的无血清培养基，或者可以用新鲜无血清培养基替换。

当将第一步中使用的无血清培养基直接用于该步时，“基膜制备物”可以被添加到培养基。

用于第一步和第二步中的漂浮培养的无血清培养基不受特别限制，只要其如上所限定。然而，为了避免复杂的制备，优选地使用添加有适当量的市售KSR(敲除血清置换物)的无血清培养基(GMEM或DMEM，0.1mM2-巯基乙醇，0.1mM非必需氨基酸混合物，1mM丙酮酸钠)作为无血清培养基。添加到无血清培养基的KSR的量不受特别限制并且，例如，在人ES细胞的情况中，其通常为1至20％、优选为2至20％。

第二步中的培养条件如培养温度和CO₂浓度可以被适当地确定。虽然培养温度不受特别限制，但是其为，例如约30至40℃，优选为约37℃。CO₂浓度为例如约1至10％、优选为约5％。

(3)第三步

解释第三步，在含血清的培养基中对第二步中培养的聚集体进行漂浮培养。

作为用于第三步的含血清的培养基，可以使用直接添加血清的用于第二步的培养的无血清培养基，或者用新鲜的含血清的培养基替换用于第二步的培养的无血清培养基。

作为添加到第三步中的培养基的血清，例如，可以使用哺乳动物血清如牛血清，小牛血清，胎牛血清，马血清，小马血清，胎马血清，兔血清，小兔血清，胎兔血清和人血清等。

自开始漂浮培养起，在第7天或之后，更优选地在第9天或之后，最优选地在第12天或之后添加血清。添加的血清的浓度为约1至30％，优选为约3至20％，更优选为约10％。

第三步中使用的含血清的培养基不受特别限制，只要其如上所限定。优选使用上述添加血清的无血清培养基(GMEM或DMEM，0.1mM2-巯基乙醇，0.1mM非必需氨基酸混合物，1mM丙酮酸钠)。

作为此种含血清的培养基，也可以使用添加有适当量的市售KSR(敲除血清置换物)的培养基。

在第三步中，视网膜组织的制备效率可以通过除了血清外添加作用于Shh信号途径的物质来提高。

作用于Shh信号途径的物质不受特别限制，只要其可以增强由Shh介导的信号转导。作用于Shh信号途径的物质的实例包括属于Hedgehog家族的蛋白(例如，Shh)，Shh受体，Shh受体激动剂，Purmorphamine，SAG等。

该步中使用的作用于Shh信号途径的物质的浓度为，例如，在常见的作用于Shh信号途径的物质如SAG的情况中，约0.1nM至10μM，优选地约10nM至1μM，更优选地约100nM。

因此制备的视网膜组织存在以覆盖聚集体的表面。通过本发明的制备方法制备的是否是视网膜组织可以通过如以下(4)中所述的免疫染色方法来确认。

还可能的是，用镊子等物理切除存在于聚集体表面上的视网膜组织。在这种情况中，因为除视网膜组织以外的神经组织可以形成在各聚集体的表面上，从聚集体切除的部分神经组织被切断并通过如(4)中所述的免疫染色方法确认，由此组织被确认为视网膜组织。

(4)视网膜组织的确认方法

视网膜组织可以通过上述第一步至第三步制备。此外，提供第一步至第三步制备的视网膜组织可以通过以下方法确认。

在含血清的培养基中对第三步中培养的聚集体进行漂浮培养。用于漂浮培养的细胞培养容器的实例包括上述那些。漂浮培养的培养条件如培养温度、CO₂浓度和O₂浓度可以被适当地确认。虽然培养温度不受特别限制，但其为，例如，约30至40℃，优选为约37℃。CO₂浓度为，例如，约1至10％，优选为约5％。O₂浓度为，例如，20至70％，优选为20至60％，更优选为30至50％。

虽然该步中的培养时间不受特别限制，但其通常不少于48小时，优选地不少于7天。

视网膜组织可以通过以下方式确认：在完成漂浮培养后，用固定剂如多聚甲醛溶液固定聚集体，制备冷冻切片，并且通过免疫染色方法等确认层结构的形成。因为视网膜组织的各层由不同的视网膜先祖细胞(光感受器，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞)组成，所以层结构的形成可以通过免疫染色方法使用针对前述在这些细胞中表达的标记物的抗体来确认。

<视杯样结构的制备方法>

本发明的第二方面是视杯样结构的制备方法，所述方法包括以下步骤：在各自含有作用于Shh信号途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中对通过上述<视网膜组织的制备方法>获得的视网膜组织进行漂浮培养。作为在上述<视网膜组织的制备方法>中获得的视网膜组织，可以使用包含在上述<视网膜组织的制备方法>的第三步中培养的视网膜组织的聚集体。作为第二个发明的实施方案，可以提及包括以下步骤(1)至(4)的制备视杯样结构的方法：

(2)第二步，在含有基膜制备物的无血清培养基中对第一步中形成的聚集体进行漂浮培养，

(3)第三步，在含血清的培养基中对第二步中培养的聚集体进行漂浮培养，和

(4)第四步，在各自含有作用于Shh信号途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中对第三步中培养的聚集体进行漂浮培养。

此处，作用于Shh信号途径的物质不受特别限制，只要其可以增强由Shh介导的信号转导。作用于Shh信号途径的物质的实例包括属于Hedgehog家族的蛋白(例如，Shh)，Shh受体，Shh受体激动剂，Purmorphamine，SAG等。

用于本发明的第二方面的作用于Shh信号途径的物质的浓度为，例如，在常见的作用于Shh信号途径的物质如SAG的情况中，约0.1nM至10μM，优选为约10nM至1μM，更优选为约100nM。

作用于Wnt信号途径的物质的实例包括属于Wnt家族的蛋白，Wnt受体，Wnt受体激动剂，GSK3β抑制剂(例如，6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)，CHIR99021，Kenpaullone)等。

用于本发明的第二方面的作用于Wnt信号途径的物质的浓度为，例如，在常见的作用于Wnt信号途径的物质如CHIR99021的情况中，约0.1μM至100μM，优选为约1μM至30μM，更优选为约3μM。

自开始漂浮培养起，在第12天或之后并且在第25天或之前，优选地在第15或之后并且在第18天或之前添加作用于Shh信号途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质。在此情况中，优选使用不含在聚集体形成步骤中添加的抑制Wnt信号途径的物质的培养基。

自开始漂浮培养起，在第18天或之后，产生视杯样结构，其形式为自聚集体的突起。其是否是视杯样结构可以由本领域普通技术人员通过利用显微镜、放大镜等观察来确认。

因此制备的视杯样结构形成外层和内层的两层结构。因为视网膜色素上皮存在于外层中而视网膜先祖细胞存在于内层中，所以视网膜先祖细胞和视网膜色素上皮可以通过例如制备视杯样结构的冷冻切片并进行免疫染色来观察。

此外，因为通过本发明的方法制备的视杯样结构形成为自聚集体的突起的形式，还可能的是，通过以下方式获得高纯度的视网膜先祖细胞：物理和形态学上切去自聚集体的突起，之后对所得的视杯样结构进行分散处理(例如，胰蛋白酶/EDTA处理)和FACS分选。用于切去视杯样结构的方法不受特别限制，并且可以使用精细的镊子等容易地将其从干细胞的聚集体切去。

<视网膜层特异性神经细胞的制备方法>

本发明的第三方面是制备视网膜层特异性神经细胞的方法，所述方法包括使包含在来源于灵长类多能干细胞的视网膜组织中的视网膜先祖细胞接触抑制Notch信号途径的物质。根据本发明的方法，视网膜层特异性神经细胞可以制备自视网膜先祖细胞。

(灵长类多能干细胞来源的视网膜组织的制备方法)

说明用于视网膜层特异性神经细胞的制备方法中的“灵长类多能干细胞来源的视网膜组织”。

作为灵长类多能干细胞来源的视网膜组织，例如可以使用通过上述<视网膜组织的制备方法>获得的视网膜组织，或制备自通过上述<视杯样结构的制备方法>获得的视杯样结构的视网膜组织。

在后一种情况中，视网膜组织可以通过以下方式制备：对上述<视杯样结构的制备方法>的第四步中形成的视杯样结构进行进一步漂浮培养。

因为如上所述，视杯样结构形成为自聚集体的突起的形式，所以可以通过以下方式获得高纯度的视网膜组织：物理和形态学上切去自聚集体的突起，之后进行分离和培养。用于切去视杯样结构的方法不受特别限制，并且可以使用精细镊子等将其容易地自干细胞的聚集体切去。

如上所述制备的视网膜组织和视杯样结构含有视网膜先祖细胞，并且视网膜层特异性神经细胞可以通过使前述视网膜先祖细胞接触抑制Notch信号途径的物质而制备自视网膜先祖细胞。

<抑制Notch信号途径的物质>

接下来，说明用于视网膜层特异性神经细胞的制备方法中的抑制Notch信号途径的物质。

抑制Notch信号途径的物质不受特别限制，只要其可以抑制由Notch介导的信号转导。抑制Notch信号途径的物质的实例包括Notch抗体，Notch受体拮抗剂，ADAM抑制剂，γ分泌酶抑制剂等。

γ分泌酶抑制剂的实例包括N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯(DAPT)。

γ分泌酶抑制剂的浓度不受特别限制，只要其可以增强视网膜先祖细胞向光感受器前体细胞或光感受器的分化。所述浓度为，例如，在常见的γ分泌酶抑制剂的情况中，约0.1至1000μM，优选为约1至100μM，更优选为约10μM。

对于制备自灵长类多能干细胞的视网膜组织，自开始漂浮培养灵长类多能干细胞起，在第15天或之后并且在第200天或之前，添加γ分泌酶抑制剂。优选地，在第20天或之后并且在第150天或之前，更优选地在第25天或之后并且在第100天或之前，向分化诱导的培养基添加γ分泌酶抑制剂。

在γ分泌酶抑制剂存在下粘附培养的时间可以是这样的长度，其允许更有效地制备光感受器前体细胞或光感受器。这样的时间的长度可以为，例如，约3天以上，优选为约5至100天，更优选为约7至30天。

(视网膜层特异性神经细胞的确认方法)

通过参照视网膜层特异性神经细胞是光感受器、光感受器前体或神经节细胞的情况来说明确认如上所述制备的视网膜层特异性神经细胞的方法。

制备的视网膜层特异性神经细胞是否是光感受器前体细胞可以通过已知方法确认，例如，通过光感受器前体细胞标记物的表达。光感受器前体细胞标记物的实例包括Crx。

光感受器包含视杆细胞和视锥细胞。制备的细胞是否是光感受器可以通过本身已知的方法确认，例如，通过光感受器标记物的表达。光感受器标记物的实例包括视紫红质(视杆细胞)，红/绿视蛋白(视锥细胞)，蓝视蛋白(视锥细胞)，恢复蛋白(视杆细胞，视锥细胞)等。

此外，制备的视网膜层特异性神经细胞是否是神经节细胞可以通过已知方法确认，例如，通过神经节细胞标记物的表达。神经节细胞标记物的实例包括Brn3。

在完成粘附培养后，光感受器前体细胞或光感受器可以分离自视网膜组织。此种分离可以通过本身已知的方法(细胞分选仪等)并且使用针对光感受器前体细胞或光感受器的表面标记物的抗体等进行。此外，在完成培养后，神经节细胞可以分离自视网膜组织。此种分离可以通过本身已知的方法(细胞分选仪等)并且使用针对神经节细胞的表面标记物的抗体等进行。备选地，通过使用，作为多能干细胞，其中标记的基因(例如，荧光蛋白如GFP)已经被敲入编码光感受器前体细胞的标记物(例如，Crx)或光感受器的标记物(例如，恢复蛋白)或神经节细胞的标记物(Brn3)的基因的读框中的细胞，各细胞可以通过本身已知的方法(细胞分选仪等)使用标记基因的表达作为指示物来分离。

<视网膜色素上皮的制备方法>

本发明的第四方面是视网膜色素上皮的制备方法，所述方法包括以下步骤：在各自含有作用于Wnt信号途径的物质(但是不含有作用于Sonichedgehog信号途径的物质)的无血清培养基或含血清的培养基中，对通过上述<视网膜组织的制备方法>获得的视网膜组织进行漂浮培养。作为在上述<视网膜组织的制备方法>中获得的视网膜组织，可以使用包含上述<视网膜组织的制备方法>的第三步中培养的视网膜组织的聚集体。作为第四发明的实施方案，可以提及包括以下步骤(1)至(4)的制备视网膜色素上皮的方法：

(4)第四步，在各自含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中(其中前述无血清培养基和含血清的培养基不含作用于Sonic hedgehog信号途径的物质)对第三步中培养的聚集体进行漂浮培养。

此处，作用于Wnt信号途径的物质的实例包括属于Wnt家族的蛋白，Wnt受体，Wnt受体激动剂，GSK3β抑制剂(例如，6-溴靛玉红-3’-肟(BIO)，CHIR99021，Kenpaullone)等。

用于本发明的第四方面的作用于Wnt信号途径的物质的浓度为，例如，在常见的作用于Wnt信号途径的物质如CHIR99021的情况中，约0.1μM至100μM，优选为约1μM至30μM，更优选为约3μM。

当例如使用人ES细胞时，在第12天或之后、最优选地在第15天添加作用于Wnt信号途径的物质。在此情况中，优选使用的是不含第一步中添加的抑制Wnt信号途径的物质和第三步中添加的作用于Shh信号途径的物质的培养基。

在本发明的第四方面中，通过上述<视网膜组织的制备方法>获得的视网膜组织或含有视网膜组织的聚集体优选地在各自含有作用于Wnt信号途径的物质和作用于激活蛋白信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中培养。

作用于激活蛋白信号途径的物质不受特别限制，只要其可以增强由激活蛋白介导的信号转导。作用于激活蛋白信号途径的物质的实例包括属于激活蛋白家族的蛋白(例如，激活蛋白A，激活蛋白B，激活蛋白C，和激活蛋白AB等)，激活蛋白受体，激活蛋白受体激动剂等。

用于该步中的作用于激活蛋白信号途径的物质的浓度为，例如，在常见的作用于激活蛋白信号途径的物质如重组人/小鼠/大鼠激活蛋白A(R&D systems#338-AC)的情况中，1ng/ml至10ug/ml，优选为约10ng/ml至1ug/ml，更优选为约100ng/ml。

因为因此制备的视网膜色素上皮存在于聚集体的表面，所以其可以通过显微镜观察等容易地观察到。还可能的是，通过以下方式获得高纯度的视网膜色素上皮：对包含视网膜色素上皮的聚集体进行例如分散处理(例如，胰蛋白酶/EDTA处理)之后FACS分选。还可能的是，利用镊子等自聚集体物理地切去视网膜色素上皮，之后培养。在分散或切去后，视网膜色素上皮可以在粘附条件下培养。在粘附培养的情况中，优选使用细胞粘附培养容器，例如，在用细胞外基质等(例如，聚-D-赖氨酸，层粘连蛋白，纤连蛋白)包被处理后的培养容器。粘附培养的培养条件如培养温度、CO₂浓度和O₂浓度可以由本领域普通技术人员容易地确定。在此情况中，所述培养可以在血清、已知的生长因子、促进生长的添加剂和化学物质的存在下进行。已知的生长因子的实例包括EGF，FGF等。促进生长的添加剂的实例包括N2添加物(Invitrogen)，B27添加物(Invitrogen)等。

<使用视网膜组织作为用于评估毒性或药物效力的试剂>

通过本发明的第一至第四方面制备的视网膜组织，视杯样结构，视网膜层特异性神经细胞和视网膜色素上皮也可以用于筛选用于由视网膜组织或视网膜相关细胞的紊乱所致的疾病的治疗药物，或用于细胞治疗的移植材料，用于研究疾病的材料或用于由其他病因所致的细胞损伤的治疗药物的药物开发材料。此外，它们在化学物质等的毒性和药物效力评估中可以用于毒性如光毒性的研究、测试等。

由视网膜组织或视网膜相关细胞的紊乱所致的疾病的实例包括有机汞中毒，氯喹视网膜病(chloroquine retinopathy)，色素性视网膜炎(retinitispigmentosa)，年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration)，青光眼(glaucoma)，糖尿病视网膜病(diabetic retinopathy)，新生儿视网膜病(neonatal retinopathy)等。

<使用视网膜组织，视杯样结构，视网膜层特异性神经细胞和视网膜色素上皮作为用于移植的生物材料>

通过本发明的第一至第四方面制备的视网膜组织，视杯样结构，视网膜层特异性神经细胞和视网膜色素上皮可以用作用于补充受损细胞或自身处于细胞损伤状态的患病组织的移植(例如，用于移植操作)等的生物材料。移植方法的实例包括，但不限于，下述实施例中描述的方法。

以下通过参照比较例和实施例更详细地说明本发明的制备方法。实施例仅显示本发明的范例并且绝不限制本发明的范围。

实施例

(建立RAX敲入人ES细胞)

制备具有在RAX基因座(其是视网膜先祖细胞的标记物基因之一)处敲入的GFP的人ES细胞系。

特异性切割人ES细胞系(KhES-1：由Kyoto University建立的人ES细胞系)的基因组DNA上的RAX基因的锌指核酸酶(ZFN)购买自Sigma-Aldrich Co.LLC。使用解离成单个细胞的人ES细胞并且根据电穿孔方法，共转染编码ZFN的mRNA和搭载GFP和新霉素-抗性基因(其是药物选择基因)的敲入载体，并且将其铺平板于用丝裂霉素C处理的新霉素抗性小鼠成纤维细胞上。从铺平板的第二天起，将G418加入到培养基中并且进行药物选择。挑取获得的抗性克隆的菌落，继续培养，并且通过PCR法和DNA印迹法选择敲入细胞，由此建立RAX::GFP敲入的人ES细胞系。

比较例1：通过使用人ES细胞制备视网膜组织(Matrigel添加条件)

根据“Ueno,M.等PNAS2006”、“Watanabe,K.等Nat Biotech2007”中所述的方法培养RAX::GFP敲入人ES细胞(来源于KhES-1)并用于实验。作为培养基，使用添加有20％KSR(敲除血清置换物；Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。通过使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将ES细胞分散为单个细胞，并且将其漂浮培养于无血清培养基(100μl)中，37℃，5％CO₂，直至每个非细胞粘附性96孔培养板的孔9×10^3个细胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)。在此情况中，作为无血清培养基，使用通过向G-MEM培养基添加20％KSR、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和20μM Y27632获得的无血清培养基。在漂浮培养期间，从自开始漂浮培养起的第2天起，以每体积1/100的量加入Matrigel。其后，定期地进行荧光显微镜观察，同时继续漂浮培养。

作为直至自开始漂浮培养起第25天的荧光显微镜观察的结果，稍微发现表达GFP的细胞，其显示视网膜先祖细胞的诱导(图1A，B)。

比较例2：通过使用人ES细胞制备视网膜组织(Nodal信号途径抑制剂和Matrigel添加条件)

根据“Ueno,M.等PNAS2006”、“Watanabe,K.等Nat Biotech2007”中所述的方法培养RAX::GFP敲入人ES细胞(来源于KhES-1)并用于实验。作为培养基，使用添加有20％KSR(敲除血清置换物；Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。为了通过漂浮培养制备视网膜组织，通过使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将ES细胞分散为单个细胞，并且将其漂浮培养于无血清培养基(100μl)中，37℃，5％CO₂，直至每个非细胞粘附性96孔培养板的孔9×10^3个细胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)。在此情况中，作为无血清培养基，使用通过向G-MEM培养基添加20％KSR、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸、20μM Y27632和抑制Nodal信号途径的物质(10μM SB431542)获得的无血清培养基。在漂浮培养期间，从自开始漂浮培养起的第2天起，以每体积1/100的量加入Matrigel。其后，继续漂浮培养并且在自开始漂浮培养起第18天通过FACS进行表达GFP的细胞的比例的荧光显微镜观察和确认。

结果，稍微发现表达GFP的细胞(图1C，D)。

比较例3：通过使用人ES细胞制备视网膜组织(Wnt信号途径抑制剂和Matrigel添加条件)

根据“Ueno,M.等PNAS2006”、“Watanabe,K.等Nat Biotech2007”中所述的方法培养RAX::GFP敲入人ES细胞(来源于KhES-1)并用于实验。作为培养基，使用添加有20％KSR(敲除血清置换物；Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。为了通过漂浮培养制备视网膜组织，通过使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将ES细胞分散为单个细胞，并且将其漂浮培养于无血清培养基(100μl)中，37℃，5％CO₂，直至每个非细胞粘附性96孔培养板的孔9×10^3个细胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)。在此情况中，作为无血清培养基，使用通过向G-MEM培养基添加20％KSR、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸、20μM Y27632和抑制Wnt信号途径的物质(3μM IWR1e)获得的无血清培养基。在漂浮培养期间，从自开始漂浮培养起的第2天起，以每体积1/100的量加入Matrigel。其后，继续漂浮培养并且在自开始漂浮培养起第18天通过FACS进行表达GFP的细胞的比例的荧光显微镜观察和确认。

结果，与比较例1和2相比，表达GFP的细胞明显增加(图1E，F)。

实施例1：通过使用人ES细胞制备视网膜组织(Wnt信号途径抑制剂和Matrigel、血清添加条件)

根据“Ueno,M.等PNAS2006”、“Watanabe,K.等Nat Biotech2007”中所述的方法培养RAX::GFP敲入人ES细胞(来源于KhES-1)并用于实验。作为培养基，使用添加有20％KSR(敲除血清置换物；Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。为了通过漂浮培养制备视网膜组织，通过使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将ES细胞分散为单个细胞，并且将其漂浮培养于无血清培养基(100μl)中，37℃，5％CO₂，直至每个非细胞粘附性96孔培养板的孔9×10^3个细胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)。在此情况中，作为无血清培养基，使用通过向G-MEM培养基添加20％KSR、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸、20μM Y27632和抑制Wnt信号途径的物质(3μM IWR1e)获得的无血清培养基。在漂浮培养期间，从自开始漂浮培养起的第2天起，以每体积1/100的量加入Matrigel。此外，在自开始漂浮培养起第12天，以每体积1/10的量加入胎牛血清。其后，继续漂浮培养并且在自开始漂浮培养起第18天通过FACS进行表达GFP的细胞的比例的荧光显微镜观察和确认。同时，还在不添加血清的比较例3的条件下进行实验。

虽然在比较例3的条件下表达GFP的细胞的比例为3.2％(图2A，B，图3A)，但是在添加血清的条件下出现了很多表达GFP的细胞(图2C，D)。在通过FACS的分析中，GFP阳性细胞的比例超过30％(图3B)。

实施例2：通过使用人ES细胞制备视网膜组织(添加Wnt信号途径抑制剂和Matrigel、血清和作用于Shh信号的物质的条件)

根据“Ueno,M.等PNAS2006”、“Watanabe,K.等Nat Biotech2007”中所述的方法培养RAX::GFP敲入人ES细胞(来源于KhES-1)并用于实验。作为培养基，使用添加有20％KSR(敲除血清置换物；Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。为了通过漂浮培养制备视网膜组织，通过使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将ES细胞分散为单个细胞，并且将其漂浮培养于无血清培养基(100μl)中，37℃，5％CO₂，直至每个非细胞粘附性96孔培养板的孔9×10^3个细胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)。在此情况中，作为无血清培养基，使用通过向G-MEM培养基添加20％KSR、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸、20μM Y27632和抑制Wnt信号途径的物质(3μM IWR1e)获得的无血清培养基。在漂浮培养期间，从自开始漂浮培养起的第2天起，以每体积1/100的量加入Matrigel。在自开始漂浮培养起第12天，加入胎牛血清(以每体积1/10的量)和作用于Shh信号途径的物质(100nM SAG)。在自开始漂浮培养起第18天通过FACS测量表达GFP的细胞的比例。

当作用于Shh信号途径的物质与血清同时添加时，出现非常多数目的表达GFP的细胞(图2E，F)。由使用FACS的分析，发现表达GFP的细胞的比例达到不少于70％。

发现，与比较例3相比，在添加血清的实施例1的条件下表达GFP的细胞的比例增加至约10倍，并且进一步，在同时添加血清和作用于Shh信号途径的物质的实施例2的条件下，表达GFP的细胞的比例增加至约24倍(图3D)。

实施例3：确认视网膜组织形成

(方法)

利用实施例2和3中制备的具有表达GFP的细胞的聚集体来确认视网膜组织的形成。使用通过向DMEM/F12培养基添加N2添加物，10％(v/v)胎牛血清和0.5μM视黄酸获得的含血清的培养基，从自开始漂浮培养起的第18天起在40％O₂的条件下进行漂浮培养。其后，利用4％多聚甲醛溶液固定聚集体，制备冷冻切片，并且通过免疫染色方法确认组织结构。

结果，在自开始漂浮培养起第60天，发现在最底层中的Brn3和TuJ1阳性的神经节细胞，在最外层和中间层中的Crx和恢复蛋白阳性的光感受器-前体细胞，以及在最外层中的Brn3阳性细胞和在最内层中的Brn3阳性细胞之间的中间神经元先祖细胞如Chx10阳性的双极细胞以有序的方式布置成层(图4A，B，C)。此外，当继续漂浮培养直至第126天时，Crx和恢复蛋白阳性的光感受器-前体细胞积累在最外层中，并且观察到表达在视杆细胞中特异表达的Nrl的细胞和表达在视锥细胞中特异表达的Rxr-γ的细胞。此外，在中间层中观察到表达水平细胞和无长突细胞的前体细胞标记物Ptf1a的细胞(图4D，E，F，G，H，I)。由这些结果，证明可以由人ES细胞高效地制备视网膜组织。

实施例4：将由人ES细胞制备的视网膜组织移植到眼中

在切开眼球的巩膜后，将注射针从巩膜切口插入到玻璃体中以降低眼内压。利用细胞移植针将眼内灌注液从巩膜切口注射到视网膜下空间，以人工地形成浅的视网膜脱离状态。利用细胞移植针或细胞片移植设备将视网膜组织移植到形成的空间中。

实施例5：使用人ES细胞高效地制备视杯样结构

(方法)

使用RAX::GFP敲入人ES细胞，制备视杯样结构。

根据“Ueno,M.等PNAS2006”、“Watanabe,K.等Nat Biotech2007”中所述的方法培养RAX::GFP敲入人ES细胞(来源于KhES-1)并用于实验。作为培养基，使用添加有20％KSR(敲除血清置换物；Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。为了通过漂浮培养形成聚集体，通过使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将ES细胞分散为单个细胞，并且将其悬浮在无血清培养基(100μl)中直至每个非细胞粘附性96孔培养板的孔9×10^3个细胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)，以允许快速形成聚集体，并且进行漂浮培养，37℃，5％CO₂。在此情况中，作为无血清培养基，使用通过向G-MEM培养基添加20％KSR、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸、20μM Y27632和抑制Wnt信号途径的物质(3μM IWR1e)获得的无血清培养基。在漂浮培养期间，从自开始漂浮培养起的第2天起，以每体积1/100的量加入Matrigel。在自开始漂浮培养起第12天，将漂浮的聚集体转移到不含抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中，以每体积1/10的量加入胎牛血清并且培养聚集体。此外，从第15天起，在含有作用于Wnt信号途径的物质(3μM CHIR99021)和作用于Shh信号途径的物质(100nM SAG)的含血清的培养基中进行漂浮培养。

(结果)

当通过上述方法制备时，在自开始漂浮培养起第14天左右在部分的聚集体中出现显示RAX表达的GFP阳性的细胞群体(图5A)，其之后向聚集体的外侧凸起(图5B，C)。当继续漂浮培养时，形成明显的突起(图5D)。此外，当继续漂浮培养时，在由GFP阳性细胞(视网膜先祖细胞)组成的聚集体上形成明显的视杯样结构(图6)。简单地通过显微镜观察聚集体可以清楚地识别此视杯样结构(图6A)。当通过双光子显微镜深入地观察形成在聚集体上的视杯样结构时，发现其具有外部和内部的两层结构(图6C，D)。制备视杯样结构的冷冻切片并进行免疫染色。结果，表达Mitf的视网膜色素上皮的层存在于外部，而Chx10阳性的神经视网膜先祖细胞存在于其内部(图7)。

实施例6：将由人ES细胞制备的视杯样结构移植到眼中

在切开眼球的巩膜后，将注射针从巩膜切口插入到玻璃体中以降低眼内压。利用细胞移植针将眼内灌注液从巩膜切口注射到视网膜下空间，以人工地形成浅的视网膜脱离状态。利用细胞移植针或细胞片移植设备将培养的视杯样结构移植到形成的空间中。

实施例7：利用作用于Notch信号的物质处理人ES细胞来源的视网膜组织

根据“Ueno,M.等PNAS2006”、“Watanabe,K.等Nat Biotech2007”中所述的方法培养CrX::GFP敲入人ES细胞(来源于KhES-1)并用于实验。作为培养基，使用添加有20％KSR(敲除血清置换物；Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。通过使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将ES细胞分散为单个细胞，并且将其漂浮培养于无血清培养基(100μl)中，37℃，5％CO₂，直至每个非细胞粘附性96孔培养板的孔9×10^3个细胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)。在此情况中，作为无血清培养基，使用通过向G-MEM培养基添加20％KSR、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸、20μM Y27632和抑制Wnt信号途径的物质(3μM IWR1e)获得的无血清培养基。从漂浮培养的第2天起，以每体积1/100的量加入Matrigel并且进行漂浮培养。在漂浮培养的第12天，加入胎牛血清(以每体积1/10的量)和作用于Shh信号途径的物质(100nM SAG)并进行漂浮培养以制备视网膜组织。在自开始漂浮培养起的第29天向视网膜组织加入作用于Notch信号的物质(10μM DAPT(γ分泌酶活性抑制剂))，在自开始漂浮培养起的第41天(添加后的第12天)利用荧光显微镜进行观察，并且在自开始漂浮培养起的第43天(添加后的第14天)利用4％多聚甲醛固定，并且制备冷冻切片。对制备的冷冻切片进行针对恢复蛋白(其是光感受器的标记物基因之一)和Brn3(其是神经节细胞的标记物基因之一)的免疫染色，并且比较添加和不添加DAPT的情况之间的结果。

结果，与不添加DAPT时(图8A)相比，在添加DAPT时(图8B)，表达GFP的细胞显著增加。此外，由冷冻切片的免疫染色的结果，发现，当添加DAPT时，恢复蛋白阳性的细胞增加3至5倍(图8C，D)。

这些结果显示光感受器的显著增加。此外，由Brn3的免疫染色的结果发现，通过添加DAPT，神经节细胞也增加(图8E，F)。

实施例8：在冻融后用作用于Notch信号的物质处理人ES细胞来源的视网膜组织

根据“Ueno,M.等PNAS 2006”、“Watanabe,K.等Nat Biotech 2007”中所述的方法培养RAX::GFP敲入人ES细胞(来源于KhES-1)并用于实验。作为培养基，使用添加有20％KSR(敲除血清置换物；Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。为了通过漂浮培养制备视网膜组织，通过使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将ES细胞分散为单个细胞，并且将其漂浮培养于无血清培养基(100μl)中，37℃，5％CO₂，直至每个非细胞粘附性96孔培养板的孔9×10^3个细胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)。在此情况中，作为无血清培养基，使用通过向G-MEM培养基添加20％KSR、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸、20μM Y27632和抑制Wnt信号途径的物质(3μM IWR1e)获得的无血清培养基。从自开始漂浮培养起的第2天起使用添加有Matrigel(以每体积1/100的量)的无血清培养基。自漂浮培养的第2天起以每体积1/100的量添加Matrigel并且进行漂浮培养。在自开始漂浮培养起的第12天添加胎牛血清(以每体积1/10的量)和作用于Shh信号途径的物质(100nM SAG)并且进行漂浮培养以制备视网膜组织。在自开始漂浮培养起的第33天冻融制备的视网膜组织，并且在自开始漂浮培养起的第38天向视网膜组织添加Notch信号作用抑制物质(10μM DAPT)。在自开始漂浮培养起的第49天(添加后的第11天)利用荧光显微镜观察所述组织，并且利用4％多聚甲醛固定，并且制备冷冻切片。对制备的冷冻切片进行针对恢复蛋白(其是光感受器的标记物基因之一)和Brn3(其是神经节细胞的标记物基因之一)的免疫染色，并且比较添加和不添加DAPT的情况之间的结果。

结果，与不添加DAPT时(图9A)相比，在添加DAPT时(图9B)，显著地产生表达GFP的细胞。此外，由冷冻切片的免疫染色的结果发现，当添加DAPT时，产生约5倍的恢复蛋白阳性的细胞(图9C，D)。这些结果显示光感受器的明显产生。此外，由Brn3的免疫染色的结果发现，通过添加DAPT，还产生神经节细胞(图9E，F)。

实施例9：将由人ES细胞制备的视网膜层特异性神经细胞移植到眼中

在切开眼球的巩膜后，将注射针从巩膜切口插入到玻璃体中以降低眼内压。利用细胞移植针将眼内灌注液从巩膜切口注射到视网膜下空间，以人工地形成浅的视网膜脱离状态。利用细胞移植针或细胞片移植设备将视网膜层特异性神经细胞移植到形成的空间中。

实施例10：使用人ES细胞高效地制备视网膜色素上皮

(方法)

根据“Ueno,M.等PNAS 2006”、“Watanabe,K.等Nat Biotech 2007”中所述的方法培养人ES细胞(KhES-1)并用于实验。作为培养基，使用添加有20％KSR(敲除血清置换物；Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。为了通过漂浮培养形成视网膜组织，通过使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将ES细胞分散为单个细胞，并且将其悬浮在无血清培养基(100μl)中直至每个非细胞粘附性96孔培养板的孔9×10^3个细胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)，以允许快速形成聚集体，并且进行漂浮培养，37℃，5％CO₂。在此情况中，作为无血清培养基，使用通过向G-MEM培养基添加20％KSR、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸、20μM Y27632和抑制Wnt信号途径的物质(3μM IWR1e)获得的无血清培养基。从漂浮培养的第2天起，以每体积1/100的量加入Matrigel并进行漂浮培养。在自开始漂浮培养起的第12天，将聚集体转移到不含抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中，以每体积1/10的量加入胎牛血清并培养。从第15天起，在含有作用于Wnt信号途径的物质(3μM CHIR99021)的培养基中进行漂浮培养。

(结果)

当通过上述方法制备时，视网膜色素上皮群体出现在聚集体的几乎全部表面上(图10)。

实施例11：使用人ES细胞制备视网膜色素上皮

(方法)

根据“Ueno,M.等PNAS 2006”、“Watanabe,K.等Nat Biotech 2007”中所述的方法培养人ES细胞(KhES-1)并用于实验。作为培养基，使用添加有20％KSR(敲除血清置换物；Invitrogen)、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸和5至10ng/ml bFGF的DMEM/F12培养基(Invitrogen)。为了通过漂浮培养形成视网膜组织，通过使用0.25％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)将ES细胞分散为单个细胞，并且将其悬浮在无血清培养基(100μl)中直至每个非细胞粘附性96孔培养板的孔9×10^3个细胞(SUMILON球形板，SUMITOMO BAKELITE CO.,LTD.)，以允许快速形成聚集体，并且进行漂浮培养，37℃，5％CO₂。在此情况中，作为无血清培养基，使用通过向G-MEM培养基添加20％KSR、0.1mM2-巯基乙醇、1mM丙酮酸、20μM Y27632和抑制Wnt信号途径的物质(3μM IWR1e)获得的无血清培养基。在漂浮培养期间，从自开始漂浮培养起的第2天起，以每体积1/100的量加入Matrigel。在自开始漂浮培养起的第12天，将聚集体转移到不含抑制Wnt信号途径的物质的无血清培养基中，以每体积1/10的量加入胎牛血清并培养。从第15天起，在含有作用于Wnt信号途径的物质(3μMCHIR99021)和作用于激活蛋白信号途径的物质(重组人/小鼠/大鼠激活蛋白A(R&D systems#338-AC)100ng/ml)的培养基中进行漂浮培养。

(结果)

当通过上述方法制备时，呈现黑色的视网膜色素上皮出现在几乎所有聚集体的表面上。此外，几乎所有聚集体的表面覆盖有视网膜色素上皮(图11)，并且以惊人地高的效率产生视网膜色素上皮。

实施例12：将由人ES细胞制备的视网膜色素上皮移植到眼中

在切开眼球的巩膜后，将注射针从巩膜切口插入到玻璃体中以降低眼内压。利用细胞移植针将眼内灌注液从巩膜切口注射到视网膜下空间，以人工地形成浅的视网膜脱离状态。利用细胞移植针或细胞片移植设备将视网膜色素上皮移植到形成的空间中。

工业实用性

根据本发明，可以高效地制备视网膜组织、视杯样结构、视网膜层特异性神经细胞或视网膜色素上皮。本发明的制备方法非常有用，因为其有效地制备构成视网膜组织的细胞群(如光感受器和视神经)，以用于化学物质等的毒性或药物效力评估、细胞治疗等，并且有效地制备作为“组织材料”的视网膜组织，其用于以下应用目的的测试和处理：使用具有一定组织结构的视网膜组织的毒性或药物效力评估，和用于视网膜组织移植治疗的移植材料。

本申请是基于在日本提交的专利申请号2011-258209，2011-258210，2011-258211，2011-258212，2012-043080，2012-043081，2012-043082和2012-043083，这些申请的内容完整地结合于此。

Claims

1.制备视网膜组织的方法，所述方法包括以下步骤(1)至(3)：

(2)第二步，在含有基膜制备物的无血清培养基中将所述第一步中形成的聚集体进行漂浮培养，和

(3)第三步，在含血清的培养基中将所述第二步中培养的聚集体进行漂浮培养。

2.制备视杯样结构的方法，所述方法包括以下步骤：在各自含有作用于Sonic hedgehog信号途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中，将通过根据权利要求1所述的方法获得的视网膜组织进行漂浮培养。

3.制备视网膜色素上皮的方法，所述方法包括以下步骤：在各自含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中(其中所述无血清培养基和含血清的培养基不含作用于Sonic hedgehog信号途径的物质)，将通过根据权利要求1所述的方法获得的视网膜组织进行漂浮培养。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述含有作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基还包含作用于激活蛋白信号途径的物质。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是灵长类多能干细胞。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述多能干细胞是人多能干细胞。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述基膜制备物是至少一种选自由以下组成的组的细胞外基质分子：层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述第一步至所述第三步在敲除血清置换物存在下进行。

9.制备视网膜层特异性神经细胞的方法，所述方法包括：使包含在来源于灵长类多能干细胞的视网膜组织中的视网膜先祖细胞接触抑制Notch信号途径的物质。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述抑制Notch信号途径的物质是γ分泌酶活性抑制物质。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述抑制Notch信号途径的物质是N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯。

12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中所述灵长类是人。

13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述视网膜层特异性神经细胞是光感受器。

14.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述视网膜层特异性神经细胞是神经节细胞。

15.根据权利要求9至14中任一项所述的方法，其中所述包含在来源于灵长类多能干细胞的视网膜组织中的视网膜先祖细胞是包含在通过以下步骤制备的视网膜组织中的视网膜先祖细胞：

(2)第二步，在含有基膜制备物的无血清培养基中将在所述第一步中形成的聚集体进行漂浮培养，

(3)第三步，在含血清的培养基中将在所述第二步中培养的聚集体进行漂浮培养，

(4)第四步，在各自含有作用于Sonic hedgehog信号途径的物质和作用于Wnt信号途径的物质的无血清培养基或含血清的培养基中，将所述第三步中培养的聚集体进行漂浮培养，以形成视杯样结构，和

(5)对第四步中形成的视杯样结构进行漂浮培养的步骤。

16.用于评估毒性或药物效力的试剂，所述试剂包含通过根据权利要求1至15中任一项所述的方法制备的视网膜组织、视杯样结构、视网膜色素上皮、或视网膜层特异性神经细胞。

17.用于评估测试物质的毒性或药物效力的方法，所述方法包括：使通过根据权利要求1至15中任一项所述的方法制备的视网膜组织、视杯样结构、视网膜色素上皮、或视网膜层特异性神经细胞接触所述测试物质，并且检查所述物质对所述组织、结构或细胞的影响。

18.用于由视网膜组织的紊乱所致的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含通过根据权利要求1至15中任一项所述的方法制备的视网膜组织、视杯样结构、视网膜色素上皮、或视网膜层特异性神经细胞。

19.用于治疗由视网膜组织的紊乱所致的疾病的方法，所述方法包括：移植有效量的通过根据权利要求1至15中任一项所述的方法制备的视网膜组织、视杯样结构、视网膜色素上皮、或视网膜层特异性神经细胞至需要所述移植的靶标。

20.通过根据权利要求1至15中任一项所述的方法制备的视网膜组织、视杯样结构、视网膜色素上皮、或视网膜层特异性神经细胞，其用于治疗由视网膜组织的紊乱所致的疾病。